Biophotonik Fluoreszenzdiagnostik von Krebserkrankungen

Biophotonik
Fluoreszenzdiagnostik
von Krebserkrankungen
Susanne Liedtke, Jürgen Popp, IPHT Jena, Karl-Heinz Schönborn,
World of Medicine AG, Berlin, Peter Schubert, R-Biopharm AG, Darmstadt
Um gegen Krebs vorgehen zu können, ist das möglichst frühzeitige Erkennen der Erkrankung notwendig. Die Fluoreszenzdiagnostik spielt dabei
eine große Rolle, bietet allerdings noch immer Entwicklungspotential.
Zwei Verbünde aus der zweiten Förderphase des Forschungsschwerpunkts Biophotonik untersuchen neue Diagnoseverfahren mit dem
Werkzeug Licht für die Früherkennung von Haut- und Darmkrebs.
Der Helle oder auch Weiße Hautkrebs ist
eine weitgehend unterschätzte Krankheit.
Dabei treten in Deutschland jährlich etwa
80 000 neue Fälle auf, das sind 90%
aller Hautkrebs-Neuerkrankungen. Als Hellen Hautkrebs bezeichnet man bestimmte
Formen von Tumoren der Haut, die in
der Regel nicht dunkel oder schwarz pigmentiert sind und hauptsächlich durch zu
intensive, jahrelange Sonnenbelastung der
Haut entstehen. Zum Hellen Hautkrebs
gehören u.a. das Basalzellkarzinom (auch
Basaliom genannt) oder das spinozelluläre
Karzinom (auch Spinaliom, Plattenephitelkarzinom oder Stachelzellkrebs genannt),
aber auch Hautkrebsfrühformen wie die
aktinischen Keratosen (auch solare Keratosen genannt).
Die anfänglich sichtbaren Hautveränderungen, die durch die Hauttumoren und
ihre Frühformen hervorgerufen werden,
werden von den Patienten zunächst oft
nicht bemerkt oder nicht ernst genommen, was in vielen Fällen einen frühzeitigen Arztbesuch verhindert. Vor allem bei
jüngeren Menschen wurde dem Weißen
Hautkrebs bisher zu wenig Beachtung
geschenkt. Doch Forscher der Mayo-Klinik
in Minnesota, USA, haben auch bei unter
50-jährigen ein steigendes Hautkrebsrisiko festgestellt. Die Zahl der Basaliomerkrankungen stieg von 18,2 pro 100 000
Menschen (Zeitraum 1976 bis 1979) auf
29,1 (2000 bis 2003). Beim Spinaliom
stieg die Rate von 0,9 auf 4,1 pro 100 000
an. Britische Forscher kamen auf ähnliche
Ergebnisse. Sie machen die fortschreitende Zerstörung der Ozonschicht sowie ein
verändertes Verhalten beim Sonnenbaden
dafür verantwortlich. Da auch diese vermeintlich harmlosen Hautkrebsvarianten
ein gefährliches Gesundheitsrisiko darstel58 Photonik 1/2007
Bild 1: Brustkrebszelle
len – so kann sich etwa das Basalzellkarzinom im fortgeschrittenen Stadium örtlich
ausbreiten, unkontrolliert wachsen und im
Extremfall das Gewebe in den betroffenen
Hautarealen massiv zerstören, während
aktinische Keratosen ohne Behandlung in
ein spinozelluläres Karzinom übergehen,
das im schlimmsten Fall Metastasen in
anderen Organen verursachen kann – ist
eine sichere Früherkennung von größter
Bedeutung.
Hier setzt der Forschungsverbund „Nichtlineare Fluoreszenztomographie“ (FluoTOM) an, den das BMBF im Rahmen des
Forschungsschwerpunktes Biophotonik seit
Mitte 2005 fördert. Das hierin erforschte
Diagnosesystem kommt ohne künstliche
Marker, chirurgische Eingriffe und radiologische Belastung aus, grenzt die verschie-
(Bild: R-Biopharm AG)
denen Tumor(vor-)stadien jedoch eindeutig
voneinander ab. Es soll dem Arzt in Echtzeit serielle Schnittbilder in der gewohnten Darstellung histologischer Präparate
liefern, mit deren Hilfe er einen Tumor
hinsichtlich seiner Ausdehnung, Position
und Aggressivität bewerten kann. Die
neue Methode basiert auf der nicht-linearen Anregung endogener, körpereigener
Chromophore im Gewebe mittels kurzer
Laserimpulse, wobei die Lokalisierung und
Eindringtiefe eine Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung erfordern (s. Kasten). Damit
erlaubt das FluoTOM-Verfahren erstmals
auch die Bewertung tief liegender Gewebeschichten auf der Basis dreidimensionaler Informationen.
Der Verbund setzt dabei auf endogene
Marker-Fluorophore, deren Fluoreszenz-
Biophotonik
Bild 2: Querschnitt durch die Haut mit
den verschiedenen Schichten. Für die
Beurteilung des Tumors ist es wichtig, zu
erkennen, ob er bereits in die Basalschicht
eingedrungen ist und sich von dort ausbreiten kann.
signale sich signifikant mit der Bösartigkeit des Gewebes verändern. Zur Zeit
werden mehrere Marker hinsichtlich ihrer
Signifikanz bewertet und verglichen. Parallel dazu laufen Untersuchungen zu ihrer
morphologischen Koordination. Neben
der Signifikanz der Marker ist von entscheidender Bedeutung, wie selektiv und
spezifisch die pathologische Bewertung
der spektralen Daten ist. Durch geeignete
Algorithmen müssen die beträchtlichen
Störeinflüsse durch individuelle und altersbedingte Unterschiede sowie Störfaktoren
aus der Gewebeoptik eliminiert werden.
Um im Sinne des Patienten breit verwertbare diagnostische Aussagen zu
erhalten, fordern die Mediziner neben
der Unterscheidung in gut- und bösartige
Tumore (sogenannte Dignitätsbewertung)
ausdrücklich auch die Bestimmung des
Entwicklungsstadiums des gefundenen
Tumors (Staging). Im Mittelpunkt steht
hier die Frage, ob ein bösartig entartetes
Gewebsvolumen komplett oberhalb der
Basalmembran (s. Bild 2) liegt oder bereits
in diese eingedrungen ist. Im ersteren
Fall handelt es sich um ein carcinoma in
situ ohne Verbindung mit dem Blut- und
Lymphkreislauf, im letzteren Fall um einen
manifesten Tumor mit dem Risiko einer
Metastasierung. Daher ist eine Lagebestimmung der bösartigen Strukturen im
Gewebe ein zentrales Ziel des Forschungsvorhabens. Zu diesem Zweck laufen im
Projekt Arbeiten zur Gewinnung eines
morphologischen Bildes auf der Basis einer
OCT-Anordnung (Optische Kohärenztomographie) und zur Kombination dieses Messprinzips mit der fluoreszenzdiagnostischen
Dignitätsbewertung.
Dieses komplexe Aufgabenspektrum wird
mit verteilten Schwerpunkten in dem Verbundprojekt „FluoTOM“ von industriel-
len, universitären und klinischen Partnern
bearbeitet. Der Schwerpunkt „funktionale
Spektroskopie“ ist bei der Lasertechnik
Berlin GmbH und dem Lehrstuhl für Photonik der Universität Potsdam angesiedelt,
der Schwerpunkt „morphologische Koordination und Bildgebung“ bei der World
of Medicine AG. Die klinischen Partner der
Universität Magdeburg und der ElisabethKlinik Berlin liefern die Befundung und
Referenzierung zu den Ergebnissen.
In der gegenwärtigen Forschungsphase
werden die gewonnenen Erkenntnisse
mit dem Ziel zusammengeführt, gemeinsam einen am Menschen einsetzbaren
Laboraufbau zu erstellen, der sowohl den
physikalisch-technischen als auch den klinischen Verfahrensanforderungen genügt.
Er wird zunächst im Bereich der Haut
Anwendung finden, soll später aber auch
auf den Einsatz in der Hals-Nasen-OhrenHeilkunde und der Gynäkologie, in einem
weiteren Schritt dann auch für endoskopische Untersuchungen im Bereich der
Gastro-Enterologie, der Urologie und der
Bronchoskopie zugeschnitten werden.
Neben dem Nutzen für die Patienten wird
die FluoTOM-Diagnostik auch wirtschaftliche Vorteile bieten: Das Einsparpotential
für die Krankenkassen ergibt sich vor allem
aus der Vermeidung von bisher notwendigen Verdachts-Biopsien und weniger und
leichteren erforderlichen operativen Eingriffen.
Mit Tumorformen, die im Magen-DarmTrakt auftreten, beschäftigen sich die Firmen und Wissenschaftler des seit August
2006 geförderten Verbundes „TumorVision - Fluoreszenz-vermittelter Nachweis
von Markerenzymen zur in vivo Visualisierung von Tumoren und deren Vorstufen“.
Hintergrund ist, dass die Entstehung von
Krebs ein mehrstufiger Prozess ist, von
anfänglichen Zellentartungen zu invasiven,
Zwei-Photonen-Anregung
Bei der ZweiphotonenAbsorption werden von
einem Atom oder Molekül
gleichzeitig zwei Photonen
absorbiert (siehe Abb.
A). Da beide gleichzeitig
vorhanden sein müssen,
hängt dieser Effekt von
der zweiten Potenz des
eingestrahlten Lichtes ab.
Eine derartige nichtlineare
Abhängigkeit lässt sich für
Anwendungen nutzen,
bei denen nur in einem
winzigen Raumbereich
eine Reaktion im System
ausgelöst werden soll, z.B.
in der Mikroskopie. Durch
die Verwendung eines fsTi:Saphir-Lasers mit einer
Anregungswellenlänge im
NIR-Spektralbereich von
800-960 nm können nun
Fluorophore im Bereich
von 400-490 nm (Absorption von zwei Laserphotonen) und deren rotverschobene Fluoreszenz
detektiert werden. Da die
simultane Absorption von
zwei bzw. drei Photonen
nur in einem sehr kleinen Volumensegment des
fokussierten Laserstrahls
erfolgen kann, resultiert
hieraus eine sehr gute
Prinzip der Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung: A: Anregungsschema der Zwei-Photonen-Fluoreszenzspektroskopie
(Bild: M.Schmitt, Uni Jena); B: Küvette gefüllt mit fluoreszierenden Farbstoff, angeregt mit einem einzelnen Photon
(Anregung von oben, rechts) und zwei Photonen eines
intensiven Femtosekundenlasers (Anregung von unten,
links). Man erkennt sehr deutlich, dass die Zwei-Photonenfluoreszenz auf den Fokus des Anregungslasers reduziert ist
(Bild aus www.loci.wisc.edu/multiphoton/mp.html)
Lokalisierung der Fluoreszenz und damit ein inhärenter 3D-Effekt. Da die
Fluorophore nicht durch
ein energiereiches, sondern durch die simultane
Absorption
mehrerer
niederenergetischer Photonen angeregt werden,
können lebende Proben
schonender untersucht
werden Die Multipho-
tonen-Bildgebung mittels
NIR-Femtosekundenlaser
zeichnet sich außerdem
durch eine hohe Eindringtiefe aus und ermöglicht
damit die Darstellung
von Geweben mit hoher
räumlicher
Auflösung
sowie hohem Kontrast. Sie
eignet sich daher besonders für die nichtinvasive
Gewebediagnostik.
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Biophotonik
metastasierenden Tumoren. Die Heilungschancen nehmen ab, je weiter dieser Prozess schon fortgeschritten ist. Daher ist es
wichtig, schon die beginnende Entartung
von Zellen zu erkennen. Das zeigt auch ein
Blick auf die Zahlen: Darmkrebs gehört in
Deutschland zu den häufigsten Tumorformen. Jährlich erkranken nach Angaben der
Deutschen Krebshilfe 66 000 Menschen
neu an Darmkrebs, 30 000 Menschen sterben jedes Jahr daran. Damit ist Darmkrebs
die zweithäufigste Krebstodesursache in
Deutschland. Die Deutsche Krebshilfe geht
davon aus, dass die Hälfte der Todesfälle durch eine konsequente DarmkrebsFrüherkennung vermieden werden könnte
und dass 85% aller Darmkrebsfälle geheilt
werden können, wenn alle Warnzeichen
rechtzeitig beachtet werden.
Alle bisher angewendeten DiagnoseMethoden für Darmkrebs haben jedoch
einen entscheidenden Nachteil: Mikroskopisch kleine Tumore, noch ohne morphologische Veränderung der Schleimhaut,
die sich noch mit minimalem chirurgischen
Aufwand entfernen lassen, können konventionelle Endoskopieverfahren nicht
immer aufspüren.
Doch aggressive Krebszellen, die tödliche Metastasen bilden, unterscheiden
sich durch ihren Stoffwechsel von anderen, weniger gefährlichen Tumorzellen.
Der Verbund TumorVision setzt daher auf
die Darstellung tumorspezifischer enzymatischer Reaktionen mit Hilfe der Fluoreszenzendoskopie. So findet man auch
Veränderungen, die aufgrund der Morphologie nicht zu erkennen sind.
Als Marker für diese neuartige Darmkrebsdiagnostik dienen zwei Moleküle, die in
Tumorzellen in besonderem Maße produziert werden und enzymatisch aktiv sind:
DNaseX und Transketolase-like 1 (TKTL1).
a
Bild 3: Das Prinzip der Smart Probes: Oben
geschlossene, unten offene Haarnadelstruktur. Der Farbstoff MR121 ist rot, die
Guanosinreste sind blau dargestellt.
Der Nachweis von DNaseX ermöglicht eine
allgemeine Krebsfrüherkennung. DNaseX
gehört zu den Desoxyribonukleasen. Das
sind Enzyme, die DesoxyribonukleinsäureMolekülketten (DNA) in kürzere Molekülketten oder Einzelbausteine zerlegen und
bei Wachstums- und Absterbeprozessen
(z.B. beim programmierten Zelltod, der
Apoptose) eine wichtige Rolle spielen. Beim
Nachweis von DNaseX knüpft TumorVision
an die erfolgreichen Arbeiten des Ver-
bundes „Smart Probes“ an, den das BMBF
in der ersten Förderphase des Forschungsschwerpunktes Biophotonik gefördert hat
(s. Photonik 2/2004). Die dort entwickelten
„Smart Probes“ sind kurze DNA-Abschnitte
in Form einer Haarnadelschleife (HairpinStruktur), die an einem Ende mit einem
Fluoreszenz-Farbstoff markiert sind, der
allerdings über Guanosin-Reste gedämpft
wird. Trifft eine solche Smart Probe auf
DNaseX, wird sie geschnitten und damit
geöffnet (Bild 3). Durch diese Öffnung
kann der Farbstoff ungehindert fluoreszieren, weil die Nähe zu den Guanosin-Resten
damit nicht mehr gegeben ist. Das Fluorenzenz-Signal zeigt an, wo DNaseX und
damit Krebsgewebe, vorhanden ist.
TKTL1 dient als Marker zur Klassifizierung
der Tumore. Wissenschaftler der Darmstädter R-Biopharm AG, die den Verbund
TumorVision koordiniert, haben nachgewiesen, dass im Gegensatz zu gutartigen
Wucherungen bösartige Krebszellen ihre
Energie nicht aus dem sauerstoffabhängigen „Verbrennen“ von Zucker zu Kohlendioxid und Wasser gewinnen, sondern
ausschließlich aus der Vergärung von Glukose zu Milchsäure (Bild 4).
Die Vergärung von Glukose zu Milchsäure
ist normalerweise eine Ausweichreaktion
des Körpers, wenn zu wenig Sauerstoff
zur Verfügung steht. Bestimmte Tumorzellen betreiben aber auch dann Vergärung, wenn an Sauerstoff kein Mangel
herrscht (ein bereits vor mehr als 80 Jahren
von dem deutschen Nobelpreisträger Otto
Warburg beschriebenes Phänomen). Das
bisher unbekannte Enzym TKTL1 spielt
dabei eine entscheidende Rolle. Seine
Aktivität und der damit verbundene Vergärungsstoffwechsel tragen maßgeblich
dazu bei, dass Krebszellen aggressiv werden, in andere Gewebe einwandern und
b
Bild 4: Glucose-Stoffwechsel in einer normalen Zelle (a) und in einer aggressiven Tumorzelle (b)
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Biophotonik
a
b
[3] JS. Langbein, M. Zerilli et al., Expression of transketolase TKTL1 predicts colon and urothelial cancer
patient survival: Warburg effect reinterpreted,
British Journal of Cancer, Februar 2006, 94(4),
578-85
Kontakt
Bild 5: Mammakarzinom-Präparate. TKTL1-negativer nicht-invasiver Tumor mit guter Prognose (a). Stark TKTL1-positiver invasiver Tumor (b, rotviolette Färbung)
(Bild: Prof. Gitsch, Universitätsklinik Freiburg)
Metastasen bilden. Mit dem Anschalten
der Vergärung in den Tumorzellen werden
diese zudem gleichzeitig resistent gegenüber vielen Chemotherapeutika. Mit zunehmender Entartung der Krebszellen steigt
der Gehalt an TKTL1 signifikant an. Dieser Zusammenhang konnte bereits in 16
verschiedenen Tumortypen nachgewiesen
werden, ist also nicht spezifisch für eine
bestimmte Krebsart, sondern kennzeichnend für viele aggressive Tumore.
Schon heute gibt es Diagnosemethoden,
die sich am Gehalt an TKTL1 orientieren.
Über einen hochspezifischen TKTL1-Antikörper lassen sich Gewebeschnitte mit
gängigen Färbemethoden anfärben, wobei
die Intensität der TKTL1-Färbung direkt
mit der Invasivität der Tumore bzw. der
Überlebensrate der Patienten korreliert
(Bild 5). TumorVision arbeitet nun daran,
den Nachweis der TKTL1-Konzentration
direkt im Körper des Patienten, also ohne
Umweg über eine Biopsie, zu führen. Ein
erster Schritt auf diesem Weg ist es, bei
der Auswertung von Biopsie-Material den
„Umweg“ über die Antikörperkopplung
wegzulassen und den Nachweis direkt
über spezifische Substrate zu führen, die
durch die intrinsischen Enzymaktivitäten
von einem nicht fluoreszierenden zu einem
fluoreszierenden Farbstoff aktiviert werden. So könnte man während einer Operation überprüfen, welche Gewebeteile noch
zu dem aggressiven Tumor gehören und
entfernt werden müssen.
Für das Erreichen des eigentlichen Ziels,
nämlich einer endoskopischen Identifizierung von aggressiven Tumoren direkt im
Patienten, müssen die Wissenschaftler aber
noch eine entscheidende Hürde nehmen:
Der Fluoreszenzmarker muss so gestaltet
sein, dass er, nachdem der Patient ihn
geschluckt hat, nach einer gewissen Zeit
die Membran der Zellen passieren und so
zum Wirkungsort der Enzyme gelangen
kann.
Dann kann ein neuartiges endoskopisches
Fluoreszenzdetektionssystem zum Einsatz
kommen, dessen Grundlagen der Verbund
TumorVision derzeit erforscht. Derzeit
basieren endoskopische Fluoreszenzdiagnoseverfahren zur Tumorfrüherkennung
auf der Autofluoreszenz endogener Fluorophore oder auf der Fluoreszenz exogener Marker der ersten Generation. Das
sind natürlich vorkommende Stoffe, die
zwei Eigenschaften miteinander verbinden: Sie fluoreszieren bzw. lassen sich zur
Fluoreszenz anregen und sie reichern sich
spezifisch in Tumorgewebe an. Ein Beispiel
dafür ist die 5-Aminolävulinsäure (5-ALA),
die auch in der Photodynamischen Therapie eingesetzt wird. Die bisher für die intrakorporale Fluoreszenzdiagnostik eingesetzten endoskopischen Systeme bestehen aus
Hochleistungslichtquellen basierend auf
Kurzbogenlampen, speziellen Endoskopen,
die bereits im Körper das Anregungslicht filtern und Kamerasystemen, die eine
besondere Empfindlichkeit im Fluoreszenzwellenlängenbereich aufweisen.
Die Darstellung der beschriebenen Enzymaktivitäten erfordert neben einer hohen
Lichtleistung vor allem hohe Lichtintensitäten sowie die Berechung nicht abbildender Optik (zum Beispiel effiziente Lichtleiter). TumorVision setzt daher für die
Zukunft auf Anregungslichtsysteme auf der
Basis von LEDs oder Laserdioden sowie auf
optoelektronische Halbleitersysteme zur
Fluoreszenzvisualisierung (CCDs, CMOS).
Damit werden langfristig die Krebs-Vorsorgeuntersuchungen qualitativ verbessert
und die Heilungsraten deutlich erhöht.
Auch wenn sich das Projekt zunächst auf
die Verbesserung der Tumordiagnostik im
Verdauungstrakt konzentriert, wird das
System voraussichtlich auch auf andere
Krebsarten anwendbar sein.
Prof. Dr. Jürgen Popp
Sprecher Forschungsschwerpunkt Biophotonik
Institutsleiter
Institut für Photonische
Technologien (IPHT)
Albert-Einstein-Str. 9
D-07745 Jena
Tel 03641/206 024
Fax 03641/206 399
[email protected]
www.biophotonik.org
Susanne Liedtke
Öffentlichkeitsarbeit
Institut für Photonische
Technologien (IPHT)
Albert-Einstein-Str. 9
D-07745 Jena
Tel 03641/206 024
Fax 03641/206 399
[email protected]
www.biophotonik.org
Dr. Karl-Heinz Schönborn
Verbundkoordinator
Forschungsverbund
FluoTOM
W.O.M. World of
Medicine AG
Kaiserin-Augusta-Allee 113
D-10553 Berlin
Tel. 030/3 37 74 483
Fax 030/3 37 74 491
[email protected]
www.womcorp.com
Dr. Peter Schubert
Verbundkoordinator
Forschungsverbund
TumorVision
R-Biopharm AG
Landwehrstraße 54
D-64293 Darmstadt
Tel. 06151/8102-37
Fax 06151/8102-40
[email protected]
www.r-biopharm.de
Literaturhinweise
[1] J.F. Coy, D. Dressler, J. Wilde, P. Schubert, Mutations in the transketolase-like gene TKTL1: clinical
implications for neurodegenerative diseases, diabetes and cancer, Clin Lab. 2005;51(5-6):257-73.
[2] J.S. Langbein et al., Overexpression of DnaseX in
bladder carcinomas, Manuscript in preparation
www.photonik.de
Webcode 1005
Photonik 1/2007
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