The Iceberg Concept of Infection
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The Iceberg Concept of Infection Zelluläre Reaktion Zelltod Zytopathischer Effekt (CPE) Reaktion des Wirtes Tod Schwere Erkrankung Moderate oder leichte Symptome Transformation Virusvermehrung ohne erkennbare Schäden oder unvollständige Virusreifung Exposition ohne Rezeptorbindung oder Penetration Asymptomatische Infektion Exposition ohne Infektion Infektion Ansteckung (lat. inficere = hineinbringen), Haften, Eindringen und Vermehrung von Erregern in einem Wirt Monoinfektion - Mischinfektion - Superinfektion z.B. Primärinfektion mit Influenzaviren (Virusgrippe), Sekundärinfektion mit Staphylokokken oder Streptokokken Reinfektion erneute Infektion nach Ausheilung bei geringer Ausprägung einer Immunreaktion Allgemeine Eigenschaften von Krankheitserregern Infektion Pathogenität Virulenz Attenuierung Anhaften, Eindringen und Vermehrung eines Krankheitserregers (Mischinfektion, Superinfektion, Reinfektion) Grundeigenschaft einer Erregerspezies nach Infektion des Wirtes Krankheitssymptome zu verursachen Summe aller krankmachenden Eigenschaften stark variabel, LD50 Virulenzminderung, Abschwächung: Erhalt von Immunogenität und Fähigkeit zur Vermehrung Organtropismus charakteristisch für Viren breite Wirtsspezifität, enge Organspezifität:Tollwutvirus enge Wirtsspezifität, breite Organspezifität: HSV Pathogenität - Virulenz - Infektionskrankheit Wirt Erreger Spezies apathogen resistent nicht resistent (empfänglich) pathogen Stamm Spezies avirulent nicht anfällig Individuum anfällig (Disposition) virulent Infektion Infektionskrankheit Infektionsverlauf Nicht jede Infektion führt zu einer Infektionskrankheit. Die meisten Infektionen verlaufen klinisch inapparent. Klinisch apparente Infektionen werden als Infektionskrankheit bezeichnet. Formen der Infektion Akute Infektion Viruselimination; zeitlich begrenzt, lokal → Antikörperbildung Vorkommen sowohl apparent als auch inapparent (subklinisch) Persistierende Infektion keine (vollständige) Viruselimination nach Primärinfektion Latente Infektion: keine Virusproduktion, lebenslange Infektion, Reaktivierung (Rezidiv, Exazerbation) Chronische Infektion: produktiver Replikationszyklus Transformation Immortalisierung, Tumorentstehung Virus-Zell-Interaktion Infektionstyp Virusproduktion Reaktion der Zelle abortiv - lytisch ++ Zelltod + - temporäre Symbiose variabel/Alterung keine persistierend produktiv latent Transformation -/+ keine Immortalisierung Interaktion bei Virusinfektionen Virus Wirtsorganismus Immunsystem Konsequenzen der Virusinfektion Direkter Effekt: Destruktion Funktionsverlust Indirekter Effekt: Immunpathologie Autoimmunität Immunantwort MHC Glykoproteine Präsentation viraler Peptide an Oberfläche infizierter Zellen & APC T-Zell-Rezeptor (TCR) Erkennung von Fremdantigenen, die von MHC präsentiert werden Proteine des TCR-Komplexes nicht antigenspezifisch Immunglobuline humorale Immunität Antivirale Immunantwort T-Helfer-Zellen Bindung Neutralisation Cytokine Bindung an MHC II auf APC Immunologisch aktive Zellen Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Bindung an MHC I auf virusinfizierten Zellen Fas/ FasL B-Lymphozyten Antikörper zellulär Perf., Gran. humoral Apoptose Aktivierter T-Lymphozyt FasL - Gen TCR Perforin/ Granzym MHC / Viruspeptid Virusinfizierte Zelle Apoptose Antigenerkennung durch T-Zellen Verlaufsformen/Typen viraler Infektionen Akute Infektion* Chronische Infektion * Viruselimination z.B. Hepatitis C Latente Infektion* Immunität Reinfektion * z.B. Masern z.B. Influenza Slow Virus Infektion * z.B. Masern-SSPE * Virus kann isoliert werden Reaktivierung * z.B. Herpesviren * nur Nukleinsäure kann nachgewiesen werden Kriterien für persistierende Virusinfektionen 1. Nicht-lytische Virus-Wirt-Interaktion 2. Versagen der Erkennung von viralen Proteinen durch das Immunsystem des Wirtes Persistenz - Unterlaufen der Immunabwehr • Neutralisierende Antikörper • • AK-vermittelte Zytotoxizität • • • Zytotoxische T-Lymphozyten • • Antigenshift der Glykoproteine blockierende Antikörper (→ Unwirksamkeit neutralisierender Antikörper) limitierte Genexpression (HSV) Verlust von Glykoproteinen (Masern) Antigenshift (Influenza) Infektion von Zellen ohne MHC (neurotrope Viren) Suppression MHC-I (Adenoviren) Delokalisation von MHC (HIVnef) Faktoren, die an der Entstehung persistierender Virusinfektionen beteiligt sind Virale Eigenschaften Mutationen Integration der viralen Nukleinsäure Tropismus Regulation der MHC-Genexpression Zelluläre Eigenschaften Differenzierungsgrad Interferonsynthese Enzymdefekte Immunreaktionen Immundefekte Antigene Modulation Selektion von Virusvarianten Spektrum virusinduzierter Erkrankungen Akute Infektionen Masern, Mumps, Röteln Poliomyelitis, Hepatitis A und E, Windpocken, Virusgrippe, Erkältungskrankheiten Chronische Infektionen produktiv Hepatitis B und C, HIV latent HSV, VZV, HIV langsam (slow virus) SSPE, PML Virusinduzierte Tumoren Cervixkarzinom, Papillome, Nasopharynxkarzinom, Lymphome Virus-Wirt-Interaktion Akute Infektion Lytische Infektion Chronische Infektion Persistierende Infektion Produktiv Latent Reaktivierte Infektion Virämie Transformierende Infektion Transformation z.B. HPV (Papillomiren) Slow Virus Disease z.B. SSPE Virale Pathogenese Zytopathogenität z.B. Poliovirus Immunpathogenese spezifisch Zerstörung virusInfizierter Zielzellen durch CTL z.B. HBV unspezifisch Freisetzung von Zytokinen Fieber z.B. Adeno- & Masernvirus Pathogenität - Virulenz - Infektionskrankheit Wirt Erreger Spezies apathogen resistent nicht resistent (empfänglich) pathogen Stamm Spezies avirulent nicht anfällig Individuum anfällig (Disposition) virulent Infektion Infektionskrankheit Weitere Begriffsbestimmungen Infektiosität Fähigkeit von pathogenen Erregern, in einen Wirt einzudringen, sich dort zu vermehren und sich und weiter auszubreiten. Lebende und tote Vektoren (Träger), die derartige vermehrungsfähige Erreger mit sich tragen, bezeichnet man als infektiös. Kontagiosität Fähigkeit eines Erregers von einem infizierten Organismus direkter Kontakt auf nicht infizierte Organismen überzugehen und eine Infektion auszulösen. Weitere Begriffsbestimmungen Kontagionsindex Richtgröße zur Quantifizierung einer Erkrankungswahrscheinlichkeit an einer Infektion. Epidemiologische Größe, die die Anzahl der tatsächlich Erkrankten angibt, bezogen auf 100 nichtimmune Exponierte. z.B. für Masern, Pocken, Varizellen 95-98 % für Poliomyelitis (und Diphtherie) 10-20 % Manifestationsindex Anzahl der manifest Erkrankten/Anzahl der Infizierten, Empirisch hoch >90% (z.B. Masern, Windpocken, MKS) mittel >1, <90% (z.B. Röteln, Mumps) niedrig <1% (z.B. Poliomyelitis) Transmission von Viren Horizontal • • • • • • • Blutkontakt (HCV, HIV) Speichel (EBV, Mumps) Organe (CMV, HBV) Aerosole ( Masern, Influenza) Arthropoden (FSME, Dengue) Nahrung (HAV, Hantaviren) fäkal-oral (Entero-, Rotaviren) Vertikal • Schwangere - Fetus - pränatal (Röteln, CMV) - konnatal (VZV, HBV) Eintrittspforten • Respirationstrakt (Tröpfcheninfektion, aerogen) • Intestinaltrakt (fäkal-oral) • Blut, Blutprodukte (parenteral) • Biss- und Stichwunden durch Tiere/Insekten Möglichkeiten des Auftretens von Erregern durch infizierte Organismen in der Umwelt Wege Art der Ausscheidung direkter Weg Nasen- und Rachensekrete (Schleimhäute der Atemwege, des Verdauungstraktes, Speicheldrüsen, Tonsillen) Stuhl/Kot Urin Augensekret Muttermilch Genitalsekrete Haut- und Schleimhautveränderungen indirekter Weg Blut (während Virämie) Lebensmittel Abfälle, Kadaver Koch-Henle sche Postulate Jacob Henle, 1840: Lehre vom lebenden Ansteckungsstoff Präzisierung durch Robert Virchow, 1890 1. Der Erreger muss in jedem Fall bei der entsprechenden Krankheit (mikroskopisch) nachweisbar sein (optischer Nachweis). Der Erreger darf nicht bei Gesunden als zufälliger und nicht pathogener Keim vorkommen. 2. Der Erreger muss sich aus dem Patientenmaterial isolieren und in unbelebten Nährböden fortzüchten lassen (kultureller Nachweis). Dabei darf er seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlieren. 3. Der Erreger muss auch nach Reinzüchtung außerhalb des natürlichen Wirts in der Lage sein, die Krankheit in einem empfänglichen Organismus wieder zu erzeugen (Pathogenitätsnachweis). Die Koch-Henle schen Postulate gelten nur für monokausale Infektionskrankheiten. Koch-Henle sche Postulate 1. Der Erreger muss in jedem Fall bei der entsprechenden Krankheit (mikroskopisch) nachweisbar sein (optischer Nachweis). Der Erreger darf nicht bei Gesunden als zufälliger und nicht pathogener Keim vorkommen. 2. Der Erreger muss sich aus dem Patientenmaterial isolieren und in unbelebten Nährböden fortzüchten lassen (kultureller Nachweis). Dabei darf er seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlieren. 3. Der Erreger muss auch nach Reinzüchtung außerhalb des natürlichen Wirts in der Lage sein, die Krankheit in einem empfänglichen Organismus wieder zu erzeugen (Pathogenitätsnachweis). Gegenbeispiele: zu 1. - klinisch gesunde Träger, Dauerausscheider; - Normalflora mit fakultativ pathogenen Keimen zu 2. - Viren zu 3. - Gewebeschäden / Tumorbildung nicht immer experimentell reproduzierbar - latente und persistierende Virusinfektionen Spektrum virusinduzierter Erkrankungen Akute Infektionen Chronische Infektionen produktiv latent langsam (slow virus) Virusinduzierte Tumoren Masern, Mumps, Röteln Poliomyelitis, Hepatitis A und E, Windpocken, Virusgrippe, Erkältungskrankheiten Hepatitis B und C, HIV HSV, VZV, HIV SSPE, PML Cervixkarzinom, Papillome, Nasopharynxkarzinom, Lymphome Parameter von Virusinfektionen Epidemiologie und Durchseuchung Übertragungswege (Ausbreitung) Inkubationszeit und Manifestationsgrad Reaktionen des Immunsystem Rekonvaleszenz und Immunität bzw. Persistenz - Reaktivierung Pathogenetische Stadien von Virusinfektionen Zelle Wirt Infektionskrankheit Adsorption Viruseintritt in den Wirt Inkubationszeit Penetration Primäre Replikation Prodromalstadium Uncoating Virämie Transkription Zell- und Gewebstropismus Generalisation Translation Zell- und Organschäden Assembly Immunreaktion Organmanifestation Maturation Viruspersistenz Freisetzung Slow Virus Disease Rekonvaleszenz Pathogenese der Poliovirus-Infektion 6 8 10 12 14 16 18 20 Pharynx 4 Darm 2 Milz Virusausscheidung im Stuhl Tag 0 Infektion lymphogen GALT Virusvermehrung in Organen hämatogen Leber regionale Lymphknoten GALT Blut-LiquorSchranke Virämie Fieberhafter Infekt Beginn der Antikörper- CSF Synthese Blut-HirnSchranke Meningitis Ausbreitung ins ZNS Nervenzellen Kontrolle der Virusinfektion Enzephalitis Paresen Pathogenetische Stadien von Virusinfektionen Zelle Adsorption Penetration Uncoating Transkription Translation Assembly Maturation Release Infektionskrankheit Inkubationszeit Prodromalstadium Generalisation Organmanifestation Rekonvaleszenz Schwerpunkte der Medizinischen Virologie • Diagnostik und Prophylaxe • • • • • Therapie • • • sog. Kinderkrankheiten, Infektionen der Atemwege HIV, HCV, Viren mit onkogenem Potential Immunsupprimierte Patienten Schwangerschaft HIV, Hepatitis B und C, Herpesviren, Virusgrippe Viruslast-Bestimmung und Resistenz-Testung Emerging Viruses • • • Filoviren, West-Nil-Virus, Virales Hämorrhagisches Fieber SARS-Coronavirus, H5N1- & H7-Influenzaviren Prion-Erkrankungen (TSE) Aufgaben der Medizinische und der experimentellen Virologie • Neue Nachweismethoden • • Struktur-Funktions-Untersuchungen • • • • Reverse Genetics Enzyme (z.B. Protease-Inhibitoren, Caspase-Aktivierung) Fusion & Intergase Gentherapie und Impfstoffentwicklung • • • • PCR, Resistenztestung, Rapid Viral Diagnosis Adenovirale, retrovirale, herpesvirale oder AAV-Vektoren DNA-Impfung (HCV, HIV, etc.) Zelluläre Immunität Epidemiologie und Übertragung • Reservoir, Vektoren, Impfkampagnen Erregerübertragung Art der Übertragung Medien, Wege, etc. Schmier-, Kontaktinfektionen Tröpfcheninfektion (Aerosole) parenteral (iatrogen) Verletzungen (Haut/Schleimhaut) sexuell diaplazentar, intrauterin Stillen über Mund, Nase, Auge (fäkal-oral) oder Haut Nasensekret, Speichel Blut, Blutprodukte Stechmücken, Zecken, Sandflöhe, Bisse Schleimhäute der Genitalien hämatogen - aszendierend Muttermilch - Kontakt germinativ, transovariell Eier bei Mücken, Zecken, Vögel Virusdiagnostik • Zellkultur (Virusisolation) - zytopathischer Effekt in vitro • Antigennachweis - in Patientenmaterial - In Zellkultur (nach Isolation) • Nukleinsäurenachweis - PCR, LCR, bDNA - ISH, Sequenzierung Elektronenmikroskopie ----------------------------------------Bestimmung von Antikörpern - IgM, IgG, (IgA) • • Diagnostisches Spektrum der Medizinischen Virologie Direkter Virusnachweis • • Virusisolation (CPE) Antigennachweis • • • Nukleinsäurenachweis • • Indirekter Nachweis in Zellkultur in Patientenmaterial PCR, (LCR, bDNA) ISH, Sequenzierung • Elektronenmikroskopie • Bestimmung von Antikörpern • IgG, IgM, IgA Antikörpernachweise • • • • • Welche viralen Proteine induzieren Antikörper ? Welche Klasse von Antikörper werden gebildet ? Wann und wie lange sind diese Antikörper im Serum ? Sind die Antikörper spezifisch für einen Erreger ? Welche Antigenquelle ist geeignet - gereinigtes Virus aus Zellkultur - Isolierte Virusproteine (z.B. Hämagglutinin) - synthetisch hergestellte Peptide oder Proteine Serologischer Verlauf einer EBV-Infektion Reaktivierung 2 Wochen 3-4 Monate Jahre Heterophile Antikörper VCA-IgG VCA-IgM EA-Antikörper EBNA-IgG Nachweisverfahren für Antikörper • Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA/EIA) • Immunfluoreszenz • Western - Blot • Neutralisationstest (NT) Hämagglutinationshemmtest (HHT) • • • Komplementbindungsreaktion (KBR) Agglutinationstests Immunoassay Markierung Konjugatantikörper Träger mit AG FITC POD AP Isotope Biotin Antikörper im Patientenserum Enzym-Immuno-Assay Patientenseren negative Kontrolle positive Kontrolle ELISA Y Y AK-produzierende Zellen Antigen an der Festphase Y Y Y Test mit Fang-Ak nativer Zustand des Antigens Y veränderter Zustand des Antigens Y Substrat + Chromogen Y Capture-Assay Immunfluoreszenz FITC-markierte virale Proteine Oberfläche Zytoplasma Kern Nachweis von Virusantigen durch Immunperoxidasereaktion unsichtbare Banden Immunblot i.d.R. Westernblot Verlauf einer HIV-Infektion gp160 gp120 p66 p51/55 gp41 p31 p24 p18 frühe Serokonversion reaktiv späte Infektionsphase Exemplarischer Verlauf der Serokonversion nach Infektion mit HIV-1 43 J., männl. Untersuchungszeitpunkte 1 keine Symptome, 6 Tage nach Infektionsereignis 2 Fieber, Abgeschlagenheit, Lymphknotenschwellung, 23. Tag 3 keine Symptome, 42. Tag 4 keine Symptome, 3 Monate (106. Tag) 5 keine Symptome, 7 Monate (223. Tag) 1 2 3 4 5 Virusnachweis mittels EM Norovirus Calicivirus Astrovirus Adenovirus Virusnachweis mittels CPE Humane Lungenfibroblasten CMV mock infiziert Affen-Nierenzellen Rötelnvirus mock infiziert Antikörperdiagnostik Vorteile • • • • • • lange Erfahrung standardisierbar automatisierbar relativ schnell relativ preiswert quantifizierbar Nachteile • • • • • • Serumpaar notwendig aussageschwach bei Immunsuppression und persistierenden Infektionen und bei Infektionen mit sehr kurzer Inkubationszeit Kreuzreaktivität (Spezifität) Ig-Gabe verfälscht Befunde begrenzt auf Serum und Liquor Leihimmunität bei Neugeborenen Nachweisverfahren für virale Antigene • Ag-ELISA – Rota- & Adenoviren im Stuhl • Direkte Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörper - RSV in Aspiraten, CMV in BAL, etc. • Indirekte Immunperoxidase-Assays - CMV (pp65) in PBL • Kurzzeitkulturen (Shell Vial) und Nachweis viraler Proteine - IE-Proteine der Herpesviren - Strukturproteine respiratorischer Viren In Situ Hybridisierung Chromogen Farbstoff Streptavidin biotinyliertes Enzym (AP) HPV-Gensonde biotinyliert HPV-DNA Genomnachweis in klinischen Proben HPV EBV Genomnachweise • PCR (Polymerase Chain Reaction) • RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) • n-PCR • LCR (Ligase Chain Reaction) • NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) • (b-DNA Technik) PCR Reagenzien • Target - DNA aus Untersuchungsmaterial • 2 für den Erreger spezifische Primer • Nukleotidmix - dNTP's • thermostabile DNA-Polymerase (Taq) • Puffer für Polymerase mit MgCl2 PCR Protokoll • Denaturierung bei 95°C, linear - ss • ca 30 Zyklen • Annealing bei Tm der Primer • Extension bei 72°C ss ---> ds • Denaturierung bei 95°C ds ---> ss • final extension 72°C • 4°C bis zur weiteren Verarbeitung • Denaturierung bei 95°C • Annealing der Primer • Extension bei 72°C • Denaturierung bei 95°C 35-40 Zyklen • final extension 72°C 2. Zyklus 1. Zyklus Auffüllen des Stranges 5 3 doppelstr. Primer (OligoDNA s) DNA/RNA Annealing der Primer Denaturierung bei 95°C Nachweis des PCR-Produktes M 19 20 21 22 23 24 25 26 Fluoreszenz 1000 Kopien 10 Kopien 10 19 25 30 40 Zyklen Diagnostische Parameter einer CMV-Infektion nach Nierentranspantation Geq/ml x 104 Ganciclovir IgG IgM pp65 Fieber 80 20 DNA 20 15 5 10 1,25 5 0,3 0 60 67 74 76 77 81 88 98 95 Tage nach NTX
