Dokument_1. - OPUS Würzburg

Aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie
der Universität Würzburg
Vorstand: Professor Dr. med. M. Frosch
Molekulare Untersuchungen zu Virulenzfaktoren und Klonalität
enterohämorrhagischer Escherichia coli der Serogruppe O103
Inaugural – Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
vorgelegt von
Caren Christine Geitz
aus Würzburg
Würzburg, Januar 2004
Referent:
Professor Dr. rer. nat. H. Schmidt
Koreferent:
Professor Dr. med. C. Wanner
Dekan:
Professor Dr. med. S. Silbernagl
Tag der mündlichen Prüfung: 8. Mai 2004
Die Promovendin ist Ärztin.
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung .................................................................................................... 1
1.1
Epidemiologie ...................................................................................... 2
1.2
Klinik der EHEC-Infektionen................................................................. 5
1.3
Pathogenese........................................................................................ 6
1.4
Pathogenitätsfaktoren .......................................................................... 7
1.4.1
Shiga Toxine ................................................................................. 7
1.4.2
Intimin ......................................................................................... 10
1.4.3
Hämolysine ................................................................................. 11
1.4.4
Katalase-Peroxidase (KatP)........................................................ 11
1.4.5
etp-Gencluster ............................................................................ 12
1.4.6
Serinprotease EspP .................................................................... 13
1.4.7
Metallprotease StcE.................................................................... 13
1.4.8
ToxB ........................................................................................... 13
1.5
Therapie............................................................................................. 14
1.6
Diagnostik .......................................................................................... 16
1.7
Fragestellung ..................................................................................... 17
2
Material und Methoden.............................................................................. 18
2.1
Abkürzungen und Einheiten ............................................................... 18
2.2
Chemikalien und sonstige Materialien................................................ 19
2.1.1
Einzelsubstanzen........................................................................ 19
2.1.2
Kits.............................................................................................. 20
2.1.3
Größenstandards ........................................................................ 20
2.1.4
Enzyme....................................................................................... 20
2.1.5
Sonstige Materialien ................................................................... 20
2.2
Geräte ................................................................................................ 21
2.3
Bakterienstämme ............................................................................... 22
2.3.1
E. coli-Isolate .............................................................................. 22
2.3.2
Laborstämme und Plasmide ....................................................... 22
2.4
Nährböden und -lösungen.................................................................. 22
2.5
Elektrophoresepuffer.......................................................................... 24
2.6
Puffer und Lösungen für Hybridisierungen......................................... 25
2.7
Lösungen zur Färbung der DNA-Hybriden......................................... 26
2.7.1
Waschlösungen .......................................................................... 26
2.7.2
Pufferlösungen............................................................................ 26
2.8
Lösungen und Puffer zur Phageninduktion ........................................ 27
2.9
Polymerase-Kettenreaktion zur Gendetektion (PCR)......................... 28
2.9.1
Reaktionsansätze ....................................................................... 29
2.10 Präparation von Plasmiden ................................................................ 31
2.11 Präparation von Stx-Phagen-DNA ..................................................... 32
2.12 Restriktionen von Plasmid- und Phagen-DNA ................................... 33
2.13 Gelelektrophorese.............................................................................. 34
2.13.1 Herstellung der Agarosegele ...................................................... 34
2.13.2 Elektrophorese............................................................................ 34
2.14 Herstellung der Gensonden ............................................................... 34
2.14.1 Gewinnung der etp–Matrize ........................................................ 34
2.14.2 Gewinnung der katP–Matrize...................................................... 35
2.14.3 Aufreinigung der DNA ................................................................. 35
2.14.4 Markierung der Sonden .............................................................. 36
2.14.5 Herstellung der stx1B-Gensonde ................................................ 36
2.15 Hybridisierungen ................................................................................ 36
2.15.1 DNA-Transfer auf eine Nylonmembran mittels Southern Blot ..... 36
2.15.2 Hybridisierung ............................................................................. 38
3
Ergebnisse ................................................................................................ 39
3.1
Phänotypische Untersuchungen ........................................................ 39
3.1.1
Serotypisierung ........................................................................... 39
3.1.2
Kultur auf SMAC-Agar ................................................................ 39
3.1.3
Kultur auf Blutagar ...................................................................... 40
3.2
Genotypische Untersuchungen .......................................................... 41
3.2.1
Nachweis der stx1- und stx2-Gene ............................................. 41
3.2.2
PCR-Nachweis für eae, E-hlyA und katP.................................... 41
3.2.3
Plasmidanalyse........................................................................... 42
3.2.4
Ergebnisse der RAPD-PCR ........................................................ 43
3.2.5
Phageninduktion ......................................................................... 45
4
Diskussion................................................................................................. 47
4.1
Bedeutung der Pathogenitätsfaktoren................................................ 47
4.2
Klonalität ............................................................................................ 50
4.3
Diagnostik .......................................................................................... 53
4.4
Therapie und Prävention - ein Ausblick.............................................. 56
5
Zusammenfassung.................................................................................... 59
6
Literaturverzeichnis ................................................................................... 60
Einleitung
1 Einleitung
Das fakultativ anaerobe, gramnegative Stäbchenbakterium Escherichia coli
gehört zur Darmflora des Menschen und anderer Wirbeltiere. Einige Serotypen
weisen jedoch pathogene Eigenschaften auf, die diesen natürlichen Darmbewohner zu einem gefährlichen Krankheitserreger wandeln können. Beim Menschen treten neben Enteritiden auch extraintestinale Manifestationen auf, vor
allem Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis, nosokomiale Septikämien,
sowie das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS) und die thrombotischthrombozytopenische Purpura (TTP) können auf E. coli als Erreger zurückzuführen sein [40].
Mit molekularbiologischen Methoden konnte nachgewiesen werden, dass diese
Bakterien verschiedene krankheitsspezifische Pathogenitätsmerkmale erworben haben und dadurch in der Lage sind, z. B. das Blasen- oder Darmepithel zu
kolonisieren, die Blut-Hirnschranke oder intestinale Oberflächen zu durchqueren, sowie Toxine in die Blutbahn einzubringen [39, 63].
Anhand dieser Virulenzmerkmale werden mehrere Pathotypen charakterisiert,
die Verursacher der Darmerkrankungen teilt man dabei in fünf Gruppen ein [45]:
•
Enteropathogene E. coli (EPEC): Sie gelten als klassische Erreger der
Säuglingsdyspepsie und erzeugen im Intestinum charakteristische
„Attaching and Effacing–Läsionen“.
•
Enterotoxinbildende E. coli (ETEC) verursachen Reisediarrhöe durch die
von ihnen gebildeten hitzestabilen und hitzelabilen Enterotoxine.
•
Enteroinvasive E. coli (EIEC) lösen eine ruhrähnliche Enteritis aus und
können in Darmepithelzellen eindringen.
•
Enteroaggregative E. coli (EAEC) werden mit chronischen, wässrigen
Durchfällen bei Kindern (hauptsächlich in Entwicklungsländern) assoziiert, wurden aber auch bei Reisediarrhöe gefunden.
•
Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) treten als Verursacher der
hämorrhagischen Colitis (HC), des hämolytisch-urämischen Syndroms
(HUS) und der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) auf.
1
Einleitung
EHEC wurden 1982 erstmals als humanpathogene Bakterien beschrieben, als
nach dem Genuss von Hamburgern eine größere Anzahl Personen in Michigan
und Oregon (USA) an hämorrhagischer Colitis erkrankten [70]:
Die isolierten E. coli-Stämme, die aufgrund ihrer Oberflächenantigene als
Serotyp O157:H7 identifiziert wurden, produzierten Zytotoxine, die dem Toxin
von Shigella dysenteriae stark ähnelten und toxisch auf Verozellen wirkten.
Daher wurden sie als Verotoxine oder Shiga-like Toxine bezeichnet. Seit 1996
verwendet man aufgrund dieser strukturellen und funktionellen Verwandtschaft
die Bezeichnung Shiga Toxine (Stx) als einheitliche Nomenklatur. Mittlerweile
wurden über 200 verschiedene Serotypen Stx-produzierender E. coli (STEC)
isoliert, lediglich 60 davon standen mit Erkrankungen von Menschen in
Verbindung, die anderen waren bei Tieren, nichterkrankten Ausscheidern oder
in Lebensmittelproben festgestellt worden [1]. Somit stellen die humanpathogenen E. coli, die HC oder HUS verursachen können und über weitere
typische Pathogenitätsfaktoren verfügen (EHEC), eine Untergruppe der STEC
dar [85].
Im Lauf der vergangenen beiden Jahrzehnte gewannen EHEC weltweit zunehmend an Bedeutung, da sie mit rasch steigender Inzidenz sowohl für
sporadische Erkrankungen als auch für größere Ausbrüche verantwortlich
waren. In der Bundesrepublik Deutschland besteht seit 1998 eine amtliche
Meldepflicht für EHEC-Infektionen.
1.1
Epidemiologie
EHEC treten weltweit auf, insbesondere Rinder und sonstige Nutzwiederkäuer
gelten als Hauptreservoir, der Nachweis gelang jedoch auch bei Wildwiederkäuern, Pferden, Kamelen, Kaninchen, Hamstern, Ratten, Geflügel und sogar
bei Fischen und Schildkröten. Bei Schweinen verursachen sie die gefürchtete
Ödemkrankheit [3, 6, 10, 14, 22, 25, 27, 51, 86].
Die Übertragung erfolgt fäkal-oral durch Kontakt mit infizierten Tieren, durch
kontaminierte Rohmilch und Rohmilchprodukte oder unzureichend gegartes
Hackfleisch; weiterhin konnten auch Apfelsaft, Tiefkühlkost, kopfgedüngte
2
Einleitung
Gemüse, Wurstprodukte (Salami, Mettwurst), Sprossen, Speiseeis, Backwaren
mit nicht ausreichend erhitzter Füllung oder Auflage, sowie Trinkwasser als
Infektionsquellen gesichert werden. Schmierinfektionen von Mensch zu Mensch
wurden bei Ausbrüchen in Kindertagesstätten und Familien belegt [63].
Seit Einführung der Meldepflicht gemäß dem Infektionsschutzgesetz (IfSG) von
1998 verzeichnet man auch in Deutschland steigende Fallzahlen von EHECInfektionen, so nahmen die registrierten Meldungen 2001 gegenüber 1999 um
31%, gegenüber 2000 um 18% zu (Abb. 1).
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1999
2000
2001
2002
Abb. 1: Anzahl der gemeldeten EHEC-Fälle in den Jahren 1999 bis 2002 [71].
In der räumlichen Verteilung zeigt sich eine höhere Inzidenz in den westlichen
und südlichen Bundesländern, über 50% der Meldungen und mehr als 60% der
HUS-Erkrankungen betreffen Kinder unter fünf Jahren, wobei die Häufigkeitsgipfel im 1. und 2. Lebensjahr zu verzeichnen sind. Obwohl EHECInfektionen meist eine ähnliche Saisonalität wie die Salmonellen-Enteritis mit
Schwerpunkt in den Sommermonaten zeigen, wurden zwischen November
1995 und April 1996 in Bayern sieben Todesfälle bei 44 HUS-Erkrankungen im
Rahmen einer Epidemie durch das Robert Koch-Institut registriert [71].
3
Einleitung
Durch den häufigen Nachweis von EHEC O157 beim hämolytisch-urämischen
Syndrom gilt dieser Serotyp als „Prototyp“ der HUS-Erreger und andere
Serogruppen wurden wenig beachtet. Inzwischen wurden bei über 100 verschiedenen Subtypen von E. coli die Bildung von Shiga Toxinen nachgewiesen
[39, 44]. Dabei kommt heute den Serogruppen O157, O103, O26 und O145
bisher die größte Bedeutung zu (Abb. 2).
31%
37%
O157
O103
O26
O145
Sonstige
16%
4%
12%
Abb. 2: Prozentualer Anteil verschiedener Serogruppen bei EHEC-Infektionen 2001 [71].
In einer französischen Multicenterstudie wurden 1992 erstmals sechs E. coli
O103:H2-Isolate aus Stuhlproben von 69 Patienten mit manifestem HUS untersucht und mit Stämmen verglichen, die im Rahmen einer epidemiologischen
Studie 1984-87 in Kaninchenzuchten gewonnen worden waren. E. coli O103
ordnete man bis zu diesem Zeitpunkt den EPEC zu, sie traten selten als
humanpathogen relevante Erreger in Erscheinung, waren durch ihre weite
Verbreitung in Tierzucht und Mastbetrieben jedoch für die Veterinärmedizin von
größerer Bedeutung [6, 19, 50].
4
Einleitung
1.2
Klinik der EHEC-Infektionen
Die typische Infektion mit EHEC O157 beginnt mit einer wässrigen Diarrhöe,
nach zwei bis drei Tagen kommen oft blutige Durchfälle hinzu. Mehr als die
Hälfte der Patienten leidet unter Übelkeit und Erbrechen, bei weniger als einem
Drittel tritt Fieber auf, oft werden primär Appendizitis, ischämische Colitis oder
andere
entzündliche
Darmerkrankungen
diagnostiziert.
Das
1955
erstbeschriebene HUS oder Gasser-Syndrom begleitet in ca. 3-15% der Fälle
eine Infektion durch EHEC [24, 98]. Hierbei tritt nach 8 bis 14 Tagen die Trias
von akutem Nierenversagen mit einer mikroangiopathisch-hämolytischen
Anämie und Thrombozytopenie in Erscheinung. Es kommt v. a. bei Kleinkindern
und immungeschwächten Personen in verschiedenen Verlaufsformen vor:
1. Das enteropathische HUS mit nach einem Prodromalstadium plötzlich
einsetzenden Durchfällen und anschließendem Nierenversagen. Dieses
wird zwar typischerweise mit Shigella dysenteriae Typ 1 assoziiert, kann
jedoch auch durch die genannten E. coli-Serotypen ausgelöst werden,
welche eine oder mehrere Varianten der Shiga-Toxine exprimieren.
2. Das nicht-enteropathische HUS, hervorgerufen durch neuramidaseproduzierende Bakterien, z. B. Haemophilus influenzae, Meningokokken
oder diverse Viren.
3. Eine erregerunabhängige Form, bei der eine genetische Prädisposition
der betroffenen Patienten ebenso diskutiert wird, wie die Assoziation mit
bestimmten Medikamenten (Immunsuppressiva) oder Enzymdefekten.
Besonders in diesen pathogenetisch unklaren Fällen ist der Verlauf der
Erkrankung häufig rapide und die Prognose schlecht.
Bei der EHEC-Infektion des Erwachsenen treten dagegen häufiger thrombotisch-thrombozytopenische Purpura auf, die 1925 als Moschkowitz-Syndrom
beschrieben wurden [56]. Durch die generalisierte mikrovaskuläre Ischämie, die
aus der überschießenden Thrombozytenaggregation resultiert, kommt es zu
eher unspezifischen Symptomen wie Enzephalopathien mit Lethargie, Kopfschmerz, Krampfanfällen bzw. fokalneurologischen Zeichen, Sehstörungen
5
Einleitung
durch Beeinträchtigung der Retinadurchblutung, Fieber, sowie Angina pectoris
und
mesenterica.
Die
Nierenbeteiligung
ist
hier
geringer
ausgeprägt.
Laborchemisch fallen Thrombozytenzahlen unter 30.000/µl, Fragmentozyten
(Schistozyten) im Differentialblutbild, ein drastischer Anstieg der harnpflichtigen
Substanzen sowie des indirekten Bilirubins und der Retikulozyten, ein Abfall
des Serum-Haptoglobins, Hämaturie und Proteinurie auf [20].
Differentialdiagnostisch müssen jeweils andere Ursachen der Thrombozytopenie bzw. des akuten Nierenversagens wie z. B. eine medikamentöse
Genese,
das
intravasaler
hepato-renale
Gerinnung
(DIC),
Syndrom,
virale
Septikämien
mit
Infektionskrankheiten,
disseminierter
systemische
Autoimmunvaskulitiden, Eklampsie oder maligne Hyperthermie ausgeschlossen
werden.
1.3
Pathogenese
Bei manifestem HUS und bei TTP kommt es durch Embolisation kleiner
Kapillaren
zur
thrombotischen
Mikroangiopathie
mit
intrarenalen
Zirkulationsstörungen und damit zum akuten Nierenversagen.
Der Weg der Toxine beginnt mit der intestinalen Aufnahme und Passage von
Stx in die Zellen der Darmoberfläche, hier kommt es zur Störung entscheidender Stoffwechselvorgänge (Proteinsynthese, unkontrollierte Freisetzung von
Calcium aus intrazellulären Speichern, Bildung freier Radikale), die letztlich eine
Signalkaskade auslösen, welche zum programmierten Zelltod (Apoptose) führt
[15]. Die lokale Entzündungsreaktion mit Anlagerung von Leukozyten und
Ausschüttung von Mediatoren führt zur weiteren Zellschädigung und Verlust
des enteralen Bürstensaums. Gelangen die Toxine in die Blutbahn, lagern sie
sich innerhalb von ca. 20 Minuten an nichtaktivierte segmentkernige,
neutrophile Leukozyten an und werden mit ihnen u. a. zur Niere transportiert,
dort erfolgt die Abgabe an den mesangialen Apparat [53, 95, 96, 101].
Die Invasion erfolgt dann über denselben Mechanismus wie intestinal, der Verlust der Membranpolarität und die Zerstörung der glomerulären Filterfläche
führen hier jedoch zum „backleak“ der harnpflichtigen Substanzen. Die Vielzahl
6
Einleitung
der Zytokine, die die apoptotischen Nierenzellen ausschütten (TNFα, IL-1, IL-8,
MCP1), sowie die lokale Erhöhung der Toxinkonzentration durch die mobilisierten
Granulozyten
treiben
das
inflammatorische
Geschehen
voran.
Schließlich verstopfen Zelldetritus und abgeschilferte Nierenepithelien das
Tubuluslumen, die chemotaktisch angezogenen neutrophilen Granulozyten
sowie die Fragmente der durch die aufgerauhten Endothelien mechanisch
geschädigten Erythrozyten verstärken die Mikrothrombenbildung und damit die
Ischämie der endkapillären Strombahn [15, 68].
Der Circulus vitiosus aus mechanischer Hämolyse, toxisch-ischämischer
Tubulusnekrose und Urämie schließt sich, darüber hinaus führen die erhöhten
Harnstoffwerte und die thrombotische Mikroangiopathie auch extrarenal zu
einer ZNS-Symptomatik, sowie zur intravasalen Hämolyse und zum Zelluntergang weiterer Organe und es kommt zusätzlich zum sekundären prärenalen
Nierenversagen. Der Verbrauch von Gerinnungsfaktoren durch die initiale
kapilläre Thrombenbildung führt zur generalisierten Blutungsneigung, insgesamt
stellt sich im Maximalfall ein septisches Krankheitsbild mit Multiorganversagen
ein [1, 68].
1.4
Pathogenitätsfaktoren
Shiga-Toxine stellen die wichtigsten Pathogenitätsfaktoren der EHEC dar.
Darüberhinaus sind einige weitere Virulenzdeterminanten beschrieben worden,
welche im folgenden vorgestellt werden.
1.4.1 Shiga Toxine
Bei den Shiga-Toxinen handelt es sich um eine Gruppe entero- und neurotoxischer
Zellgifte,
die
humane
Endothelien
passieren
können
[1].
Die
entsprechenden Allele liegen bei E. coli im Genom von chromosomal
integrierten temperenten lambdoiden Phagen vor [17, 28, 39, 76, 86]. Wird die
Expression der Phagen-DNA durch Zellstress, z. B. durch Mitomycin C, UV-
7
Einleitung
Licht oder Antibiotikagabe gesteigert, wird die produzierte Toxinmenge erhöht
[42, 101, 102]. Da der klinische Verlauf mit dieser vermutlich korreliert, könnte
ein unspezifischer oder nicht testgerechter Einsatz von Antibiotika zur
Behandlung von Diarrhöen ohne entsprechenden Erregernachweis den
klinischen Verlauf einer EHEC-Infektion verschlechtern [74, 106].
Es werden zwei Toxingruppen, Stx1 und Stx2, unterschieden, wobei sich die
Varianten der Stx1-Familie genetisch und serologisch deutlich geringer voneinander unterscheiden, als die Strukturvarianten a-f der Stx2-Gruppe [11, 86,
99, 108]. Die DNA-Sequenzen von Stx1 und Stx2 stimmen zu ca. 60% überein.
Immunologisch unterscheiden sich die Proteine jedoch.
Beide Holotoxine bestehen strukturell aus einer enzymatisch aktiven A-Untereinheit (32 kDa) und einer aus fünf Monomeren (je 7,7 kDa) aufgebauten BUntereinheit. Dieses Pentamer ist in der Lage, an Globotriaosylceramid (Gb3)Rezeptoren, auch bekannt als CD77-B-Zell-Marker des Burkitt-Lymphoms, an
der Oberfläche eukaryontischer Zellen zu binden, Stx2 bindet auch an Gb4. Die
vermehrte Expression der Gb3-Rezeptoren im Bereich des zentralen
Nervensystems, des Pankreas, des glomerulären Apparates sowie der
intestinalen Epithelien korreliert direkt mit den klinischen Auswirkungen der
Infektion [68].
Ebenfalls großen Einfluss auf den Erkrankungsverlauf hat die Zahl der
segmentkernigen, neutrophilen Leukozyten im peripheren Blut [95]. Gelangen
über die enteralen Eintrittspforten Shiga Toxine in die Blutbahn, lagern sie sich
schnell an nichtaktivierte Granulozyten an, mit denen sie u. a. die Niere
erreichen. Durch die 100-fach höhere Bindungsaffinität zu den Gb3-tragenden
Endothelzellen der glomerulären Kapillaren erfolgt dort die problemlose Abgabe
an den mesangialen Apparat. Zusätzlich aktivieren die in die Blutbahn
gelangten bakteriellen Antigene Interleukine und Tumornekrosefaktor α, was
sowohl die Permeabilität der Mukosa erhöht, als auch die Expression von Gb3
an den jeweiligen Zelloberflächen steigert [26, 68, 76].
Einmal rezeptorgebunden, werden die Toxine über einen Endozytosemechanismus in die Zelle geschleust. Ihre biologische Aktivität hängt von der weiteren
intrazellulären Verarbeitung ab. Die Zellen mancher Organe sind zum lysoso-
8
Einleitung
malen Abbau fähig, in Stx-sensiblen Zellen erfolgt letztlich die Freisetzung ins
Zytosol [26, 39, 68, 76, 95].
Während eines retrograden Transports über den Golgi-Apparat zum endoplasmatischen Retikulum wird aus der A-Untereinheit das katalytisch wirksame
A1-Fragment abgespalten, dieses weist sowohl auf molekularer Ebene, als
auch funktionell Ähnlichkeit mit den Pflanzengiften Ricin, Abrin und Modecin
auf. Es fungiert als RNA-N-Glukosidase, deren Interaktionen mit dem GolgiApparat und der ribosomalen 60S-Untereinheit der eukaryontischen Zelle zur
Hemmung der Proteinsynthese führen. Die Folgen sind Induktion der Apoptose,
Zelluntergang
und
dadurch
Zerstörung
der
intestinalen
bzw.
renalen
Oberflächenstruktur [75, 98]. Die Interaktion der bakteriellen Lipopolysaccharide, Zytokine und Leukozyten führt zu einer Entzündungsreaktion mit
zusätzlicher
Schädigung
der
Endothelien
und
Mikrothrombosen
der
mesangialen Kapillaren. Erythrozyten können nicht direkt beeinträchtigt werden,
da sie keine eigene Proteinsynthese betreiben. Die mechanische Schädigung
und die daraus resultierende, häufig fulminant verlaufende Hämolyse entsteht
vielmehr durch die veränderten rheologischen Verhältnisse im Bereich der
endkapillären Strombahn [20, 26, 76].
Trotz des ähnlichen Aufbaus und Wirkprofils zeigt Stx2 eine bis zu 1000-mal
stärkere zytotoxische Potenz gegenüber Endothelzellen humaner Nierengefäße
als Stx1. Während EHEC O157 meist nur Stx2 produzieren und damit häufiger
mit schweren Krankheitsverläufen in Verbindung gebracht werden, zeigen
Nicht-O157-Stämme eine weitaus größere Variabilität in der Toxinherstellung.
Sie bilden vorherrschend Stx1 oder auch beide Toxinformen. So erfolgte 1995
in Würzburg bei einem HUS-Patienten die Isolation eines E. coli O103:H2 aus
einer Stuhlprobe, der sowohl das stx1- als auch das stx2-Gen trägt, zuvor
konnte bei O103 meist nur Stx1 nachgewiesen werden [50, 85]. Dieser EHEC
O103 wurde neben reinen Stx1-Produzenten im Rahmen dieser Arbeit
untersucht.
9
Einleitung
1.4.2 Intimin
Wie alle durchfallauslösenden E. coli, müssen sowohl EHEC als auch EPEC
zunächst die intestinale Mukosa besiedeln. Beide Pathovare verursachen bei
histopathologischer Betrachtung typische „Attaching and Effacing (A/E)“ –
Läsionen mit charakteristischer enger Verbindung zwischen Bakterium und
epithelialer Zellmembran sowie Niedergang des Bürstensaums. Gesteuert werden diese Prozesse durch eine ca. 43 kb große chromosomale Pathogenitätsinsel, die als „locus of enterocyte effacement“ (LEE-Locus) bezeichnet wird und
in deren zentraler Region das eae Gen (für E. coli attachment effacement) lokalisiert ist, welches für das Adhäsin Intimin codiert [22, 61, 108]. Dieses Protein
vermittelt den festen Verbund mit Hilfe des 78 kDa großen „translocated intimin
receptor“ Tir, der benachbart von eae auf dem LEE-Locus codiert ist [18, 30].
Der Kontakt zwischen Bakterien- und Epitheloberfläche stimuliert die Produktion
der ebenfalls LEE-codierten Proteine Tir, EspA, EspB und EspD, dies geschieht
auch unter in vitro-Kulturbedingungen, die denen im Gastrointestinaltrakt
ähneln. Die genannten Proteine werden alle über den sogenannten Typ IIISekretionsweg exportiert [73]. Bei der Bildung eines Translocons entstehen
durch EspC bzw. EspB Poren in der Bakterienhülle und der Oberfläche der
Wirtszelle. Diese Poren werden mit einem hohlen EspA-Filament verbunden.
Über diesen kontinuierlichen Kanal zwischen E. coli und dem Wirtszytosol kann
Tir in die Epithelzelle injiziert und schließlich in die Oberflächenmembran
integriert werden, deren Funktion es dann zerstört. Tir verfügt über drei
funktionelle Regionen: einen extrazellulären Bereich, welcher eine Art Sockel
für die Bindung von Intimin bildet, einen transmembranösen Abschnitt und
schließlich
die
zytoplasmatische
Domäne,
die
durch
Modifikation
der
Signaltransduktion Aktinfilamente und andere Proteine des Zellskeletts unter
dem adhärenten Bakterium sammelt. Durch welchen Prozeß das lösliche
Polypeptid Tir jedoch ein fester Bestandteil der Wirtszellmembran wird, ist
bisher noch nicht geklärt [20, 22, 61].
Mittlerweile wurden mehrere Varianten (α-ε) des ca. 95 kDa großen Intimins
beschrieben, die für die unterschiedlichen Lokalisationen der Infektion im
10
Einleitung
Magen-Darm-Trakt (Ileum, Jejunum bzw. Colon) durch die diversen Pathovare
verantwortlich sein sollen. Während sich bei allen untersuchten eae Genen die
N-terminale Region sehr ähnlich und beständig zeigte, war das C-terminale
Ende (ca. 280 Aminosäuren), das den adhäsiven Teil des Intimins codiert, sehr
variabel. In humanen EPEC-Isolaten wurde meist Intimin α nachgewiesen,
Intimin β und γ tauchten bei mehreren Serogruppen von EPEC und EHEC auf,
Intimin ε entdeckte man bei E. coli O103:H2, es konnte jedoch mittlerweile auch
EHEC anderer Serogruppen zugeordnet werden [21, 22].
1.4.3 Hämolysine
Beutin et al. beschrieben die Zusammenhänge zwischen der Produktion von
Shiga Toxin und der Herstellung eines bis dahin unbekannten Enterohämolysins (E-Hly), dessen Gene sich bei E. coli O157 auf dem 60 MDa großen
Virulenzplasmid pO157 befinden [3, 9].
Sequenzanalysen erbrachten bis zu 60% Homologie zu dem bekannten
chromosomal codierten α-Hämolysin und weiteren porenformenden Zytotoxinen
der RTX (repeats in toxin)–Familie. E. coli mit α-Hämolysin-Produktion zeigen
bei Kultur auf Blutagar nach bereits ca. 4 h ausgeprägte Hämolysehöfe; es
spielt dabei keine Rolle, ob die Nährmedien aus gewaschenen oder ungewaschenen Erythrozyten hergestellt wurden. Im Gegensatz dazu erzeugen EHly-bildende EHEC nur bei Wachstum auf Agar mit gewaschenen Erythrozyten
und nach längerer Kulturdauer (18-24 h) deutlich kleinere, trübe Hämolysehöfe.
Obwohl E-Hly spezifische Antikörper in Rekonvaleszentenseren von Patienten
mit HUS gefunden wurden und E-Hly die Freisetzung von Interleukinen und
Tumornekrosefaktoren
verursacht,
konnte
eine
statistisch
signifikante
Assoziation der E-Hly-Bildung mit EHEC-Erkrankungen nicht gefunden werden
[77, 80].
1.4.4 Katalase-Peroxidase (KatP)
Brunder et al. beschrieben 1996 eine bifunktionelle Katalase-Peroxidase KatP,
die im Gegensatz zu den chromosomal codierten Enzymen HP I (Katalase-
11
Einleitung
Peroxidase) und HP II (Katalase) auf dem Virulenzplasmid codiert ist. Die Rolle
des Enzyms bei der Entwicklung der klinischen Symptomatik ist unklar, es
akkumuliert in Peri- und Zytoplasma der Bakterien und kann sie vor oxidativen
Substanzen schützen. Diese werden z. B. von Makrophagen beim Kontakt mit
Bakterienmaterial produziert. Das gleichzeitige Vorhandensein der beiden
Determinanten E-hly und katP scheint auf EHEC beschränkt zu sein. Die
Abwesenheit von katP bei sorbitfermentierenden EHEC O157, die HC und HUS
auslösen können und rund 60% der EHEC anderer Serogruppen zeigt jedoch,
dass es wahrscheinlich keine zwingende Vorraussetzung zur Ausbildung der
hämorrhagischen Colitis und des HUS darstellt [7, 9, 44].
1.4.5 etp-Gencluster
Mehrere gramnegative Bakterienspezies setzen Exportproteine über einen
zweistufigen Sekretionsweg frei, der als „type II secretion pathway“ bezeichnet
wird. Die Analyse der 5´-Region des oben beschriebenen EHEC-hly-Operons
auf dem großen Virulenzplasmid zeigte 13 open reading frames (ORF), die
große Ähnlichkeit mit entsprechenden Genen von Klebsiella pneumoniae und
Yersinia enterocolitica aufweisen. Dieser Gencluster wurde von Schmidt et al.
1997 als etp (EHEC-type II-pathway) bezeichnet [83].
Mittels PCR und spezifischen Southern Blot-Hybridisierungen wurde daraufhin
seine Verbreitung unter EHEC der Serogruppen O157 und O103, speziell von
Patienten mit manifestem HUS oder Diarrhöe, sowie STEC bovinen Ursprungs
und anderen enteropathogenen E. coli-Gruppen untersucht. Sämtliche E. coli
O157 sowie 60% der EHEC anderer Serogruppen verfügten über diesen
Gencluster. Bei den bovinen STEC-Isolaten konnte er nur bei 10% nachgewiesen werden. Weiterhin scheinen nur Shiga Toxin produzierende E. coli-Gruppen
etp zu exprimieren. Wenn auch die genaue Bedeutung dieses Sekretionswegs
noch geklärt werden muß, eignet sich sein Nachweis, wie der von katP und
EHEC-hly, zur Subtypisierung verschiedener EHEC-Stämme.
12
Einleitung
1.4.6 Serinprotease EspP
Ebenfalls auf dem Virulenzplasmid codiert wird die extrazelluläre Serinprotease
EspP, die eine signifikante Homologie zu der von EPEC sezernierten Protease
EspC aufweist, sowie in geringerem Maß zu IgA1-Proteasen von Haemophilus
influenzae und einigen Neisseria spp. EspP spaltet Pepsin und den humanen
Gerinnungsfaktor V und könnte so zu den beobachteten Schleimhautblutungen
im Gastrointestinaltrakt beitragen. Der Nachweis von Antikörpern gegen die
Protease im Serum STEC-infizierter Kinder könnte auf eine Beteiligung am
Krankheitsgeschehen hinweisen [8].
1.4.7 Metallprotease StcE
Lathem et al. entdeckten 2002 auf dem Virulenzplasmid pO157 die Gene einer
Protease, die den C1-Esterase-Inhibitor (C1-INH) in ca. 60-65 kDa große
Fragmente spaltet. Das als StcE bezeichnete Protein greift keine anderen
Serinprotease-Inhibitoren oder Bestandteile der extrazellulären Matrix an, ist
aber in der Lage, die Aggregation humaner T-Zellen zu veranlassen, während
Makrophagen und Zellen der B-Zell-Linie unbeeinflusst bleiben. StcE wird über
den o.g. EHEC-type-II-pathway sezerniert, die extrazelluläre Konzentration wird
durch einen im LEE codierten Regulator gesteuert. In Stuhlproben eines EHEC
O157:H7-infizierten
Kindes
gelang
sowohl
der
Direkt-
als
auch
der
Aktivitätsnachweis der Protease. Vermutlich ist sie über eine Beteiligung an den
lokal inflammatorischen Vorgängen, welche die Schädigung der epithelialen
Oberflächen, das intestinale Ödem und die Gerinnungsstörungen bewirken,
wirksam [43].
1.4.8 ToxB
Zu Beginn der Infektion besiedeln EHEC die intestinalen Epithelien zunächst
vereinzelt, bevor sie zu Mikrokolonien proliferieren. Mehrere der LEE-codierten
Proteine sind an der initialen Adhärenz beteiligt. Das ebenfalls plasmidcodierte
13
Einleitung
ToxB dagegen, so benannt wegen der strukturellen Ähnlichkeit mit dem von
Clostridium difficile gebildeten Toxin B, ist nach Erkenntnissen von Tatsuno et
al. [94] für die Steigerung der Produktion und Sekretion der über den type IIIpathway transportierten Proteine EspA, EspB und Tir von Bedeutung und
fördert somit die Bildung der Mikrokolonien. Insbesondere die N-terminale
Hälfte weist Homologien mit Adhärenzfaktoren wie Efa1 von E. coli O111:Hund dem Produkt des Gens lifA der EPEC auf. Deletiert man das Gen toxB bei
EHEC O157, wird die Fähigkeit zur Kolonisation eingeschränkt, aber nicht völlig
aufgehoben, weil die Tir-Produktion nicht ausschließlich durch ToxB geregelt
und daher durch den Verlust lediglich vermindert wird. Die Hydrophilie des
Polypeptids lässt darauf schließen, dass es nicht exportiert wird, sondern im
Zytoplasma verbleibt [94].
1.5
Therapie
Vorraussetzung der erfolgreichen Behandlung ist eine möglichst schnelle
Diagnose des EHEC-assoziierten HUS. Die Therapie mit antibiotischen
Substanzen wird kontrovers diskutiert:
Studien zeigten bei Gabe von Trimethoprim-Sulfamethoxazol und β-LactamAntibiotika ein steigendes Risiko, während eine frühzeitige Medikation mit
Fosfomycin innerhalb der ersten 48 h die Ausprägung des HUS signifikant
verringern soll [74, 106]. Tatsächlich scheinen v. a. Antibiotika und Chemikalien,
die in das bakterielle Erbmaterial eingreifen, eine Reaktion auszulösen, in deren
Verlauf es zur Induktion und Vermehrung des chromosomal integrierten Phagen
und damit zur gesteigerten Produktion und Ausschüttung der Toxine, sowie zur
Beschleunigung des Krankheitsverlaufs kommt. Trotz der Gefahr, den Verlauf
zu aggravieren, sollte die empirische, initiale antibiotische Behandlung von
Durchfallerkrankungen vor Erregerisolation nicht völlig verlassen werden, wenn
der Verdacht auf eine Infektion mit Shigella dysenteriae, Vibrio cholera oder
anderen
invasiven
Erregern
vorliegt
und
die
molekularbiologischen Diagnostik nicht gegeben sind [54].
14
Möglichkeiten
einer
Einleitung
Im übrigen ist die Behandlung in erster Linie symptomatisch, mit intravenöser
Flüssigkeits- und Elektrolytsubstitution, extrakorporaler Hämodialyse und
Plasmapherese mit Plasmaersatz. Von fraglichem Wert sind die Gabe von
Steroiden und Antikoagulantien (Heparin, Prostacyclin, Streptokinase). Die
Plasmapherese bzw. der Plasmaaustausch haben den Vorteil, dass man
schädigende Faktoren wie Interleukine, verbrauchte Gerinnungsfaktoren und
Zelldetritus entfernt, während intakte Plasmafaktoren substituiert werden.
Allerdings wurde der Benefit bei kleinen Kindern auch schon kritisch hinterfragt.
Nachteile dieser invasiven Behandlungsmethoden sind Komplikationen des
zentralvenösen Zugangs, Transfusionsreaktionen, die Sensibilisierung gegenüber den Fremdproteinen, die weitere mechanische Schädigung der noch
intakten Blutzellen bei der Dialyse und vor allem die schlechte Verfügbarkeit der
Methoden außerhalb nephrologischer Zentren [26].
Alternativ wurde die hochdosierte Plasmainfusion vorgeschlagen, wobei die
daraus resultierende hohe Volumenbelastung häufig eine subtherapeutische
Plasmapherese erforderlich macht, um eine relative kardiale Insuffizienz mit
Lungenödem und Pumpversagen zu vermeiden [16].
Die Substitution von Thrombozyten zum falschen Zeitpunkt kann die Aggregation und Entstehung von endkapillären Thrombosen fördern, ist jedoch bei
stärkerer Blutungstendenz unumgänglich. Neuerdings werden in diesem
Zusammenhang Behandlungskonzepte mit gerinnungsaktiven Substanzen
diskutiert, wie Protaminsulfat, vWF (rekombinanter von-Willebrand-Faktor), das
Schlangengift Agkistin, Nukleotidtherapie-Derivate (Defibrotide) oder aktiviertes
Protein C (rhAPC, Xigris®), das bisher v. a. bei Sepsis mit disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC) eingesetzt wird [68].
In vitro- und in vivo-Studien mit humanen Antikörpern gegen Stx 1 und 2 (HuMabs) zeigen bei rechtzeitiger Anwendung ein gemindertes Risiko, zentralnervöse Symptome oder periphere Läsionen zu entwickeln. Die Antikörper
neutralisieren sowohl Stx1 als auch Stx2 und könnten blind als „therapeutischer
Cocktail“ bei Verdacht auf durch S. dysenteriae verursachtes oder EHECinduziertes HUS verabreicht werden [57, 58].
15
Einleitung
Durch diese „evidence-based“ Therapiemaßnahmen konnte die Letalität des
infektassoziierten HUS von 90% (unbehandelt) auf ca. 30% gesenkt werden.
Weitere Optionen, z. B. die Zerstörung der Darmepithelien bzw. den Transport
der Toxine durch Antikörperneutralisation zu verhindern, werden erforscht, sind
jedoch noch nicht in klinischer Erprobung [1].
1.6
Diagnostik
E. coli der Serogruppe O157, die bei Kultur auf Sorbit-MacConkey-Agar bis auf
die in Deutschland und der Tschechischen Republik nachgewiesenen sorbitfermentierenden EHEC O157:H- kein Sorbitol fermentieren, gelten durch dieses
Merkmal phänotypisch als leichter detektierbar als pathogene Nicht-O157 [29].
Diese können im Rahmen der Routinediagnostik ohne Nachweis der EHECtypischen Eigenschaften leicht als Humanpathogene übersehen werden. Die
Serotypisierung
der
Oberflächenstrukturen
macht
inzwischen
die
Differenzierung über 190 verschiedener E. coli -Subtypen und dadurch auch die
Isolation aus Probenaufschwemmungen mittels Immunmagnetseparation (IMS)
möglich. Dabei werden mit spezifischen Antikörpern bestückte Latexpartikel der
Probensuspension zugesetzt, die gesuchten Bakterien daran gebunden und im
Anschluß durch Waschschritte separiert und der weiteren Analyse zugeführt.
Klinisch sind bei begründetem HUS/TTP-Verdacht vor allem schnelle Detektionsmethoden mit möglichst ubiquitär vorhandenen Mitteln von Interesse
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) bietet den schnelleren Nachweis von StxBildnern in einem Keimgemisch, läßt jedoch primär keine Aussage über die
Serogruppe des Erregers zu. Ähnlich verhält sich die Situation beim Toxindirektnachweis aus Stuhlproben: Das Vorhandensein eines Toxinbildners wird
ausgeschlossen oder bestätigt, die nähere Identifikation unterbleibt.
Einzelne Kolonien Stx-bildender E. coli können mittels Shigatoxin-Immunoblot
aufgespürt werden: eine Probenlösung wird auf einem Nährboden kultiviert, das
Material auf eine Blotting-Membran übertragen und anschließend nach dem
Southern Blot-Prinzip weiterverarbeitet und mit einer stx-Sonde hybridisiert.
16
Einleitung
1.7
Fragestellung
Nachdem 1994 erstmals die Beteiligung von EHEC der Serogruppe O103:H2
an der Entwicklung eines hämolytisch-urämischen Syndroms beschrieben
worden war und der Anteil Stx-produzierender O103 an der Gesamtzahl der
EHEC-Isolate in den letzten Jahren angestiegen ist, erforderte die offensichtlich
zunehmende Bedeutung dieser Serogruppe die nähere Analyse ihrer Pathogenitätsfaktoren.
In der vorliegenden Arbeit wurden 11 EHEC-Isolate der Serogruppe O103 von
Patienten mit Diarrhöe oder HUS mit molekularbiologischen Methoden charakterisiert. Die Isolate wurden zwischen Dezember 1995 und Dezember 1996 am
Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität Würzburg aus Stuhlproben
gewonnen. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden auch die Virulenzplasmide
der Stämme einer Restriktionsanalyse unterzogen und die auf dem Plasmid
vorhandenen Virulenzmarker analysiert.
Mit den Ergebnissen sollten folgende Fragen beantwortet werden:
1. Welche Rolle spielen die aufgeführten Pathogenitätsfaktoren insbesondere für die Diagnostik von EHEC-Infektionen?
2. Kann man auf eine Verwandtschaftsbeziehung zwischen EHEC O103:H2
und O157:H7 schließen oder ergeben sich Hinweise auf einen gemeinsamen klonalen Ursprung?
3. Welche Empfehlungen haben zur EHEC-Routinediagnostik zu gelten und
wie könnte diese verbessert werden?
17
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1
Abkürzungen und Einheiten
A
Adenin
bp
Basenpaare
C
Cytosin
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EHEC
Enterohämorrhagische E. coli
EPEC
Enteropathogene E. coli
G
Guanin
HUS
Hämolytisch – urämisches Syndrom
kb
Kilobasenpaare
LB
Luria Broth
M
Mol / Liter
mg
Milligramm
ml
Milliliter
mM
Millimol / Liter
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
NBT
Nitroblautetrazoliumsalz 70 %
OD
optische Dichte
PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
RFLP
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
rpm
Umdrehungen / Minute
SDS
Natriumdodecylsulfat
SMAC
Sorbitol-MacConkey-Agar
Stx
Shiga Toxin
stx
Shiga Toxin-Gen
T
Thymidin
TAE
Tris-Essigsäure-EDTA-Puffer
18
Material und Methoden
TBE
Tris-Borsäure-EDTA-Puffer
Tris
Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan
U
Unit
ÜNK
Übernachtkultur
UV
Ultraviolettes Licht
X-Phosphat
5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphat 100 %
2.2
Chemikalien und sonstige Materialien
2.1.1 Einzelsubstanzen
Bezeichnung
Produktname
Hersteller
Agar
Bacto – Agar
Difco Laboratories, Augsburg
Agarose
SeaKem ME Agarose
Biozym Diagnostik, Oldendorf
Bromphenolblau
Merck, Darmstadt
DNase I
Grad I, (bovines Pankreas)
Roche Diagnostics, Mannheim
Ethidiumbromid
Ethidiumbromide
Sigma-Aldrich Chemie,
Deisenhofen
Hefeextrakt
Yeast extract
Gibco BRL, Karlsruhe
Mitomycin C
Sigma-Aldrich Chemie
N-Lauroylsarcosin
N-Lauroylsarcosin (Na-Salz)
Sigma-Aldrich Chemie
Phenol
Roti-Phenol
Carl Roth, Karlsruhe
PEG 8000
Polyethylenglykol 8000
Sigma-Aldrich Chemie
Proteinase K
aus Tritiachium album
Merck
RNase A
Ribonuclease A (bov.
Serva Feinbiochemika,
Pankreas)
Heidelberg
Trypton
Bacto Tryptone
Difco Laboratories
Xylencyanol
Acid Blue
Sigma-Aldrich Chemie
Anorganische und organische Standardchemikalien wurden von den Firmen
Merck, Carl Roth und Serva Feinbiochemika bezogen.
19
Material und Methoden
2.1.2 Kits
DIG DNA Labeling and Detection Kit
Roche Diagnostics
Nucleobond AX 100 Preparation Kit
Macherey & Nagel, Düren
Prep-a-gene-Kit
BioRad, München
QiaQuick Gel Extraction Kit
Qiagen, Hilden
Sorbitol MacConkey Agar
Oxoid, Basingstoke, UK
2.1.3 Größenstandards
Pharmacia LKB Bio-
λ-DNA (500 µg/ml)
technology, Freiburg
1 kb DNA Ladder
Gibco BRL
2.1.4 Enzyme
Ampli Taq DNA Polymerase und Reaktionspuffer
Perkin Elmer Applied
Biosystems, Weiterstadt
Restriktionsenzyme
Roche Diagnostics
Gibco BRL
2.1.5 Sonstige Materialien
3 MM Filterpapier
Whatman, Maidstone, UK
Hybridization Bags
Gibco BRL
Nylonmembran Zeta Probe GT
BioRad
Pipetten und –spitzen
Eppendorff, Hamburg
Reaktionsgefäße:
0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml
Eppendorff
15 ml, 50 ml Falcon-Tubes
Becton-Dickinson, Heidelberg
MicroAmp Reaktionsgefäße
Perkin Elmer Appl. Biosystems
Sterilfilter FP 030/3 0,2 µm
Schleicher Schuell, Dassel
Zentrifugenbecher SS 34, 200 ml GSA
Du Pont, Bad Homburg
20
Material und Methoden
2.2
Geräte
Brutschränke
Thermicon T
Heraeus, Hanau
Elektrophorese-
R. von Keutz Laborgeräte,
kammern
Reiskirchen
BioRad
Feinwaagen
Sartorius, Göttingen
GelCompare Software
Applied Maths, Kortrijk
Hybridisierungsofen
Hybaid Biometra, Heidelberg
Inkubator
Typ B 5060 E
Heraeus
Kühlzentrifugen
RC-5B, RC-2B,
Sorvall
Rotoren SS34, GSA
Model 3K20,
Sigma-Aldrich Chemie
Rotoren 12153,12156
Spektralphotometer
U 2000
Hitachi, Maidenhead, UK
pH-Meter
pH 530
WTW Systems, Weilheim
Scanner
P68E
Mitsubishi Electric Europe,
Ratingen
Sicherheitswerkbank
Laminar Air Flow 100
Gruppo Flow, Italien
Spannungsquelle
Power Pac 300
BioRad
Thermocycler
Gene Amp 2400
Perkin-Elmer
Gene Amp 9600
Videosystem
TFX 35 M
Intas Imaging Instr., Göttingen
Zentrifugen
Ultrazentrifuge TL 100,
Beckman Instruments,
Rotor TLA 45
München
Biofuge 15,
Heraeus
Rotor HFA 22.2
21
Material und Methoden
2.3
Bakterienstämme
2.3.1 E. coli-Isolate
Die untersuchten E. coli O103:H2 Wildtypstämme wurden zwischen Dezember
1995 bis einschließlich Dezember 1996 aus Stuhlproben isoliert, welche die
Gesundheitsämter und Kliniken aus Bamberg, Freiburg, Karlstadt, Memmingen,
München, Regensburg und Würzburg zur Untersuchung auf Stx-bildende E. coli
einsandten. Zur Identifikation dienten die institutseigenen Registrierungsnummern 1858, 2905, 3381, 3386, 3390, 3391, 3942, 5577, 5579, 5714/96 und
7828/95.
Die Serotypisierung der Isolate wurde jeweils von Frau Prof. Dr. S. Aleksic,
Deutsches Zentrum für Enteritiserreger, Hamburg, durchgeführt.
Der E. coli O103:H2 Stamm PMK 3 wurde bereits 1988 in Frankreich isoliert
und im Rahmen einer Studie von Frau Prof. P. Mariani-Kurkdjian, Hospital
Debré, Paris, analysiert und uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Als
weitere Referenzstämme dienten EHEC O157:H7 EDL933, EDL933-cu
(plasmidfrei), sowie EPEC O103:H2 B10 [50, 70].
2.3.2 Laborstämme und Plasmide
Als Donor zur Herstellung der etp-Gensonden diente das Plasmid pE12, das ein
11,9 kb großes pO157-Fragment trägt. Zur Erhöhung der Kopienanzahl wurde
dieses zuvor in den Vektor pK18 kloniert und die entstandenen rekombinanten
Plasmide in den E. coli-Laborstämmen DH5α und HB101 vermehrt [83].
2.4
Nährböden und -lösungen
Allgemeines
In der Regel wurden die verwendeten Reagenzien durch Lösen der
abgewogenen Trockensubstanzen hergestellt. Um den pH-Wert einzustellen,
wurden
die
Chemikalien
zunächst
22
in
ca.
80
%
des
gewünschten
Material und Methoden
Gesamtvolumens gelöst, bevor die entsprechende Säure oder Lauge unter pHMeter-Kontrolle zugegeben wurde. Abweichungen von diesen Methoden
werden im jeweiligen Rezept angegeben.
LB-Medium
Bacto Trypton
10 g
Hefeextract
5g
NaCl
10 g
Das Medium wurde mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt und mit Aqua bidest. auf
1000 ml aufgefüllt. Zur Herstellung von festen Nährböden wurden 16 g Agar je
1000 ml zugegeben.
Blutagarplatten
PBS-Puffer:
NaCl
10,00 g
KCl
0,25 g
KH2PO4
0,25 g
Na2HPO4 x 2 H2O
1,80 g
26,4 g Tryptose Blood Agar-Base wurden in 760 ml Aqua bidest. gelöst,
autoklaviert und im Wasserbad auf ca. 50 °C abgekühlt.
In
der
Zwischenzeit
wurden
40
ml
Erythrozytenkonzentrat
(humane
Erythrozyten) mit 300 rpm bei +4 °C für 20 min. zentrifugiert, der Überstand
anschließend abpipettiert und verworfen.
Das auf diese Weise erhaltene Erythrozytensediment wurde in ca. 15 ml PBS
vorsichtig suspendiert, erneut zentrifugiert (s.o.) und der Waschschritt
wiederholt, bis der Überstand klar wurde. Dann folgte die vorsichtige
Resuspension in 15 ml PBS (s. o.).
23
Material und Methoden
Dem abgekühlten Tryptose Blood Agar-Base wurde nun sterilfiltriertes CaCl2
(Filter Porengröße 0,2 µm) in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt,
dann die gewaschene Erythrozytensuspension vorsichtig beigemischt.
Sorbitol-MacConkey-Agar (SMAC)
Verwendet wurde die handelsübliche Trockenmischung der Firma Oxoid, in
folgender Zusammensetzung:
Pepton
NaCl
20,0 g
5,0 g
Sorbitol
Gallensalzmischung
Neutralrot
Kristallviolett
Agar-Agar
10,0 g
1,5 g
0,003 g
0,0001 g
13,5 g
Es wurden jeweils 50 g der Trockenmischung in 1000 ml erhitztem Aqua bidest.
gelöst und zu mindestens 3 mm starken Platten in Petrischalen gegossen und
für 15 min bei 121 °C autoklaviert.
2.5
Elektrophoresepuffer
Die Gebrauchslösungen wurden aus den hier angegebenen Pufferkonzentraten
hergestellt.
TAE-Puffer 50-fach
Tris-Base
242,20 g
EDTA Na4
19,12 g
Der Puffer wurde mit konzentrierter Essigsäure auf pH 8,0 eingestellt und mit
Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
24
Material und Methoden
TBE-Puffer 10-fach
Tris-Base
108,00 g
Borsäure
55,00 g
EDTA Na4
9,30 g
Der Puffer wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
DNA-Auftraqspuffer
Bromphenolblau
100 µl (Stammlösung 1% w/v)
Xylencyanol
100 µl (Stammlösung 1% w/v)
EDTA
50 µl (Stammlösung 0,5 M)
SDS
10 µl (Stammlösung 10% w/v)
Der Puffer wurde mit Glycerin (50%) auf 1000 ml aufgefüllt.
2.6
Puffer und Lösungen für Hybridisierungen
Die im folgenden genannten Waschlösungen wurden nach Rezepturen des von
der Firma Boehringer zur Verfügung gestellten Manuals hergestellt, die zum
Erreichen der erforderlichen Stringenz benötigten Konzentrationen wurden
durch Verdünnen der Stammlösung mit Aqua bidest. erzielt.
SSC-Puffer, 20-fach
NaCl
175,30 g
Na-Citrat
88,30 g
Der Puffer wurde mit HCl auf pH 7,4 eingestellt und mit Aqua bidest. auf
1000 ml aufgefüllt.
Denaturierungspuffer
NaCl
87,66 g
NaOH
20,00 g
Der Puffer wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
25
Material und Methoden
Renaturierungspuffer
Tris
121,13 g
NaCl
87,66 g
Der Puffer wurde mit HCl auf pH 8,0 eingestellt und mit Aqua bidest. auf
1000 ml aufgefüllt.
Prähybridisierungslösung
N-Lauroylsarcosin
0,10 g
SDS
0,20 g
Blocking-Reagenz
1,00 g
Der Puffer wurde mit SSC-Puffer (5-fach) auf 100 ml aufgefüllt.
Hybridisierungslösung
Zugabe der Sonden-DNA (ca. 30–50 ng/ml) zur Prähybridisierungslösung
2.7
Lösungen zur Färbung der DNA-Hybriden
2.7.1 Waschlösungen
Lösung 1 (unspezifischer Waschschritt)
0,1 g SDS in 100 ml SSC-Puffer 2-fach
Lösung 2 (spezifischer Waschschritt für 95 % Homologie) [52]
0,1 g SDS
in 100 ml SSC-Puffer 0,03-fach
2.7.2 Pufferlösungen
Puffer 1
1 M Tris/HCl pH 7,5
100 ml
1 M NaCl
150 ml
Der Puffer wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
26
Material und Methoden
Puffer 2
0,5 g Blocking-Reagenz in 100 ml Puffer 1 bei 50–70 °C lösen.
Puffer 3
1 M Tris / HCl pH 9,5 100 ml
1 M NaCl
100 ml
1 M MgCl2
50 ml
Der Puffer wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
Konjugatlösung
Tube 8 DIG DNA Labeling and Detection Kit:
20 µl in Puffer 1 lösen.
Färbelösung
Tube 9 und 10 DIG DNA Labeling and Detection Kit:
45 µl NBT
(Tube 9)
35 µl X-Phosphat (Tube 10)
in 10 ml Puffer 3 lösen.
2.8
Lösungen und Puffer zur Phageninduktion
Mitomycin C
0,5 mg / ml in Aqua bidest. (bei +4°C lichtgeschützt lagern)
DNase I
10 mg/ml in 150 mM NaCl
RNase A
10 mg/ml in 50 mM Na-Acetat pH 5,0
27
Material und Methoden
SM-Puffer
NaCl
5,80 g
MgSO4 x 7 H2O
2,00 g
Gelatine
0,10 g
1M Tris/HCl pH 7,5
50 ml
Der Puffer wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
Proteinase K-Reaktionspuffer (2-fach)
1 M Tris/HCl pH 8,0
20 ml
0,5 M EDTA pH 8,0
20 ml
SDS
10 g
Der Puffer wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
Proteinase K
20 mg/ml in Aqua bidest.
3 M Natrium-Acetat
Na-Acetat
82.03 g
Der Puffer wurde mit Essigsäure (25%) auf pH 7,2 eingestellt und mit Aqua
bidest. auf 1000 ml aufgefüllt.
2.9
Polymerase-Kettenreaktion zur Gendetektion (PCR)
Mit diesem Verfahren können DNA-Sequenzen durch Anlagerung spezifischer
Oligonukleotide, sog. Primer, an denaturierte, einsträngige DNA, sog.
Template-
oder
Matrizen-DNA,
und
anschließende
Synthese
der
komplementären DNA-Fragmente durch thermostabile DNA-Polymerase (taqPolymerase) exponentiell vermehrt werden.
Jeder der verwendeten Primer benötigt zur Anlagerung eine für ihn optimale
Bindungstemperatur, die sog. Annealing-Temperatur, die nach folgender
Formel berechnet wird:
28
Material und Methoden
(4°C x (C+G) + 2°C x (A+T)-Paarung zwischen Primer und Matrize) – 5°C.
Die Amplifikation der DNA verläuft nach initialer Denaturierung in 30 Zyklen
folgender Schritte: Denaturierung (Spaltung der Matrizen-DNA), Annealing
(Anlagerung der Primer) und Extension (Neusynthese des ergänzenden DNAStrangs).
2.9.1 Reaktionsansätze
Nach Suspension je einer Bakterienkolonie einer ÜNK auf SMAC-Agar in 50 µl
0,9%iger NaCl-Lösung, wurden 5 µl hiervon folgendem Reaktionsansatz beigegeben:
34 µl Aqua bidest., 5 µl Ampli Taq Reaktionspuffer (10-fach), 3 µl 25 mM MgCl2
Puffer, in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß vermengt mit insgesamt 1 µl der zur
Synthese der Komplementär-DNA benötigten Nukleotide dATP, dCTP, dGTP
und dTTP (10 mM dNTP-Stammlösung, Perkin-Elmer).
Im Anschluß daran wurden je 1 µl Primer 1 und Primer 2 der gesuchten Zielsequenz, sowie 0,4 µl (2 U) Ampli Taq DNA Polymerase zugesetzt. Einem
initialen Denaturierungsschritt bei 94 °C folgten jeweils 30 Annealing-Zyklen,
den Abschluß bildete die Extension der Fragmente bei 72 °C.
Zur Durchführung der RAPD-Analyse (random amplified polymorphic DNA)
wurden 100 ng chromosomaler DNA als Matrize verwendet, die nach der
Methode von Heuvelink et al. präpariert worden war [31]. Dem oben
beschriebenen PCR-Ansatz mussten jedoch 6 statt 3 µl 25mM MgCl2
beigegeben werden, das Volumen wurde durch entsprechende Verringerung an
Aqua bidest. ausgeglichen. Nach dem Hotstart bei 80°C folgten nach
einminütiger
Denaturierung
bei
94°C
35
Annealing-Zyklen
sowie
zweiminütige Extension bei 72°C.
Die spezifischen Primer und Programme sind in Tabelle 1 aufgeführt.
29
die
Material und Methoden
Zielsequenz
stx1
stx2
eae
stx1A phage
stx2A phage
katP
EHEC hlyA
Primer
Primer-Sequenz
KS 7
5’-ccc gga tcc atg aaa aaa aca tta tta ata gc-3’
KS 8
5’-ccc gaa ttc agc tat tct gag tca acg-3’
GK 3
5’-atg aag aag atg ttt atg-3’
GK 4
5’-tca gtc att att aaa ctg-3’
SK 1
5’-ccc gaa ttc ggc aca agc ata agc-3’
SK 2
5’-ccc gga tcc gtc tcg cca gta ttc g-3’
356
5’-gca gga tga ccc tgt aac gaa g-3’
285
5’-cct tcg cca cca cat taa ctg-3’
356
5’-gca gga tga ccc tgt aac gaa g-3’
595
5’-ccg aag aaa aac cca gta aca g-3’
wkat-B
5’-ctt ctt gtt ctg att ctt ctg g-3’
wkat-F
5’-aac tta ttt ctc gca tca tcc c-3’
hlyA 1
5’-ggt gca gca gaa aaa gtt gta g-3’
hlyA 4
5’-tct cgc ctg ata gtg ttt ggt a-3’
RAPD-Profil 1247
PCR-Bedingungen
Produktlänge
Referenz
Denaturierung
Annealing
Extension
94°C, 30 s
52°C, 60 s
72°C, 90 s
285 bp
[79]
94°C, 30 s
52°C, 60 s
72°C, 90 s
260 bp
[29]
94°C, 30 s
52°C, 60 s
72°C, 90 s
863 bp
[78]
94°C, 30 s
52°C, 60 s
72°C, 90 s
400 bp
[84]
94°C, 30 s
52°C, 60 s
72°C, 90 s
640 bp
[84]
94°C, 30 s
56°C, 60 s
72°C, 150 s
2125 bp
[7]
94°C, 30 s
57°C, 60 s
72°C, 90 s
1550 bp
[80]
40°C, 60 s
72°C, 120 s
polymorph
[31]
80°C init.,
5’-aag agc ccg t-3’
94°C, 60 s
Tabelle 1: PCR-Primer und Programme
30
Material und Methoden
2.10 Präparation von Plasmiden
Die Aufreinigung der Plasmid-DNA wurde mit dem Nucleobond AX 100
Preparation Kit der Fa. Macherey und Nagel nach den Angaben des Herstellers
durchgeführt. Die Arbeitsvorschrift basiert auf der Methode von Birnboim und
Doly [5], verwendet wurden die darin enthaltenen Pufferlösungen S1-3, N2, N3,
N5 sowie die zugehörigen AX 100-Kartuschen.
Zur Durchführung der Plasmidpräparation wurde jeweils eine Kolonie der
entsprechenden E.coli-ÜNK auf SMAC-Agar abgenommen und in 100 ml LBMedium suspendiert, die beimpfte Nährlösung über Nacht auf einem
Rotationsschüttler mit 180 rpm bei 37°C bebrütet.
Von diesen Bakterienkulturen wurden anschließend je 30 ml in einem SS34Rotor 15 min bei Raumtemperatur mit 6000 rpm zentrifugiert, der Überstand
verworfen und das zellhaltige Sediment in 4 ml Puffer S1, dem RNase A in
einer Endkonzentration von 100 µg/ml zugesetzt worden war, vorsichtig
aufgenommen. Durch Zugabe von ebenfalls 4 ml Puffer S2 lysierten die
Bakterien. Um die Freisetzung chromosomaler DNA zu vermeiden, wurde der
Reaktionsansatz nur durch vorsichtiges Kippen kurz durchmischt und exakt 5
min bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach präzipitierten Zellfragmente und Partikel chromosomaler Nukleinsäuren
während ca. 10 min Kühlung auf Eis durch Zugabe von 4 ml Puffer S3, der
ebenfalls nur durch mehrmaliges sanftes Invertieren unter die Flüssigkeit
gemischt wurde. Es folgten 40 min Zentrifugation mit 12000 rpm bei 4 °C im
SS34-Rotor, um die gelöste DNA vollständig vom Sediment zu trennen.
Der so erhaltene klare Überstand wurde möglichst ohne Verunreinigungen auf
die zuvor mit Puffer N2 äquilibrierten AX 100-Kartuschen gegeben und,
nachdem die gesamte Flüssigkeit die Kartusche durchlaufen hatte, wurde
zweimal mit je 4 ml Puffer N3 gewaschen. Die Elution der Plasmide in ein
steriles Reaktionsgefäß erfolgte dann durch die zweimalige Zugabe von jeweils
2 ml Puffer N5; die anschließende Fällung der aufgereinigten DNA wurde mit
0,7 ml Isopropanol pro 1 ml Eluat durchgeführt.
Das Flüssigkeitsgemisch musste zur Präzipitation der DNA auf EppendorfGefäße verteilt und 30 min. bei 4°C mit 12000 rpm zentrifugiert werden. Dann
31
Material und Methoden
konnte vorsichtig dekantiert und das Sediment mit 70%igem Ethanol
gewaschen werden.
Nach dem Trocknen der Sedimente im offenen Eppendorf-Gefäß bei
Raumtemperatur wurde die Plasmid-DNA in insgesamt jeweils 30–60 µl Aqua
bidest. aufgenommen und gelöst und die jeweilige Konzentration photometrisch
bestimmt. Dazu wurde die Extinktion in einer Quarzküvette bei 260 nm
gemessen, und der DNA-Gehalt nach folgender Relation berechnet:
E260 = 1 ≈ 50 ng/µl DNA
2.11 Präparation von Stx-Phagen-DNA
200 ml LB-Medium wurden mit zwei bis drei Kolonien der entsprechenden E.
coli O103-Stämme beimpft, die jeweils von einer über Nacht bebrüteten SMACAgarplatte abgenommen worden waren. Die Kulturansätze wurden dann auf
einem Rotationsschüttler mit einer Frequenz von 180 rpm bei 37°C bebrütet.
Bei Erreichen einer OD578 = 0,5 (nach ca. 2 h) erfolgte die Phageninduktion
durch Zugabe von Mitomycin C in einer Endkonzentration von 0,5 µg/ml.
Anschließend wurden die Reaktionsansätze weitere 18 h bei 37°C und 180 rpm
streng vor Licht geschützt inkubiert, in diesem Zeitraum lysierten die Kulturen.
Die dabei entstehenden Zellfragmente wurden nach Überführung der
Bakteriensuspension in sterile GSA-Becher durch 30 min Zentrifugieren mit
12000 rpm bei 4°C in einem Sorvall GSA-Rotor sedimentiert. Der erhaltene
Überstand wurde filtriert und die darin verbliebenen bakteriellen Nukleinsäuren
wurden durch Zugabe von DNase I und RNase A in einer jeweiligen
Endkonzentration von 5 µg/ml durch Inkubation bei 37°C für 45 min eliminiert.
Die Präzipitation der letzten gelösten Zellfragmente erfolgte mit NaCl, das in
einer Endkonzentration von 5,8 g je 100 ml Kulturansatz zugesetzt wurde. Zu
diesem Zweck stellte man die Gefäße 1 h auf Eis, im Anschluss daran erfolgte
ein weiterer Zentrifugationsschritt für 10 min bei 12000 rpm und 4°C. Aus dem
dekantierten Überstand konnten mittels Zugabe von 10 g/100 ml PEG 8000 und
1 h Kühlung in Eiswasser die intakten Bakteriophagen gefällt und durch erneute
32
Material und Methoden
Zentrifugation mit 12500 rpm für 30 min, ebenfalls bei 4°C, sedimentiert
werden.
Der getrocknete Niederschlag wurde in 1 ml SM-Puffer aufgenommen, um
dabei die Einwirkung von Scherkräften auf die DNA zu vermeiden, wurde hierzu
eine Automatikpipette mit gekappten großlumigen Pipettenspitzen (1 ml)
verwendet. Anschließend wurde 1 ml 2-fach konzentrierter Proteinase K-Puffer
zugegeben und die Hüllproteine durch 12 µl gelöste Proteinase K während
einstündiger Inkubation bei 56 °C entfernt.
Die freigewordene Phagen-DNA konnte nun mittels 1:1 Phenol/ChloroformGemisch extrahiert und nach Mischen mit 3 M Natrium-Acetat (pH 7,2) durch je
4 ml gekühltes 100%iges Ethanol gefällt werden. Die Flüssigkeit wurde jeweils
auf vier Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilt und 10 min mit 13000 rpm bei 4°C
zentrifugiert. Die Flüssigkeit wurde verworfen und die Präzipitate mit 70%igem
Ethanol
gewaschen.
Die
nach
vorsichtigem
Dekantieren
getrockneten
Sedimente konnten in insgesamt 80–120 µl Aqua bidest. gelöst und die
Konzentration photometrisch (s. o.) bestimmt werden.
2.12 Restriktionen von Plasmid- und Phagen-DNA
Zur DNA-Restriktion mit EcoRI wurden je Reaktionsansatz ca. 250 ng PlasmidDNA (s. o.) in insgesamt 16 µl Aqua bidest. eingesetzt, danach je 2 µl 10-fach
React III und 2 µl Enzym EcoRI zugegeben.
Die Restriktionen inkubierten jeweils mindestens 2 h bei 37 °C, anschließend
wurden nach der Zugabe von jeweils 2 µl Stop-Mix die gesamten
Reaktionsvolumina zur Elektrophorese auf Agarosegele aufgetragen.
Die Herstellung der Reaktionsansätze mit HindIII erfolgte nach dem gleichen
Prinzip, jedoch fungierte 10-fach React II als Puffer.
Zur Restriktion von stx2-PCR-Produkten wurden jeweils 15 µl PCR-Produkt, 2 µl
Aqua bidest., 2 µl 10-fach React II und 1 µl HaeIII zusammengegeben und
ebenfalls mindestens 2 h bei 37 °C inkubiert.
33
Material und Methoden
2.13 Gelelektrophorese
2.13.1 Herstellung der Agarosegele
Zur Elektrophorese von Plasmid-DNA wurden 0,8%ige Gele aus 800 mg
Agarose in 100 ml TAE-Puffer (1-fach) bzw. TBE-Puffer (0,5-fach) hergestellt.
Die Agarose wurde dazu eingewogen, im gewünschten Puffer aufgekocht und
in einer Stärke von ca. 4 mm in die entsprechenden Gelschlitten gegossen.
0,6%ige Gele zur Elektrophorese von Phagen-DNA wurden nach dem gleichen
Prinzip hergestellt, allerdings mit einer geringeren Konzentration von 600 mg
Agarose in 100 ml TAE (1-fach).
Die Bewertung von PCR-Produkten und ihrer Restriktionen erfolgte nach
Elektrophorese in 1,5%igen TBE-Agarosegelen.
2.13.2 Elektrophorese
Um eine möglichst präzise Auftrennung der Restriktionsfragmente der Plasmidbzw. Phagen-DNA zu erreichen, wurden die Elektrophoresen nach je 5 min.
Einlaufzeit mit 130 V für ca. 15 h bei 30 V durchgeführt und die Gele nach der
Färbung in Ethidiumbromid weiterverarbeitet.
Elektrophoresen von PCR-Produkten erforderten ca. 1,5 h bei 130 V, RAPDAnalysen wurden nach fünfstündiger Auftrennung gefärbt, digitalisiert und
rechnergestützt mittels der GelCompare Software ausgewertet.
2.14 Herstellung der Gensonden
2.14.1 Gewinnung der etp–Matrize
Zur Vermehrung des rekombinanten Plasmids pE12, welches pO157Fragmente aus E. coli EDL 933 beinhaltet, diente E. coli HB 101. Die
Präparation erfolgte aus 50 ml ÜNK mit dem Nucleobond AX 100 Kit. Die durch
34
Material und Methoden
Isopropanol gefällte und mit 70%igem Ethanol gewaschene Plasmid-DNA
wurde in insgesamt 90 µl Aqua bidest. gelöst.
Nach
Restriktion
mit
EcoRI
konnten
zwei
DNA-Banden
durch
Gelelektrophorese über 17 h bei 30 V in 0,6 % TAE-Agarosegelen getrennt
werden. Das gesuchte 11,9 kb große etp-Fragment wurde ausgeschnitten und
jeweils nach Herstellerangaben mit dem QiaQuick Gel Extraction Kit gereinigt,
bzw. mit dem Labeling and Detection Kit markiert.
2.14.2 Gewinnung der katP–Matrize
Zur Herstellung der katP-Sonde wurde mit E. coli EDL933 eine PCR mit den
Primern wkat-B und wkat-F durchgeführt, die Produkte anschließend auf ein
0,6 % TAE-Agarosegel aufgetragen und nach ca. 2 h Elektrophorese mit dem
QiaQuick Gel Extraction Kit extrahiert und schließlich mit dem Labeling and
Detection Kit markiert.
2.14.3 Aufreinigung der DNA
Gemäß der Herstellerangaben des QiaQuick Gel Extraction Kit wurden die aus
dem Gel ausgeschnittenen, ca. 200 mg schweren Fragmente in EppendorfReaktionsgefäße gegeben und mit je 600 µl Puffer QX 1 bei 55 °C im
Wärmeschrank verflüssigt. Danach wurden jedem Ansatz 200 µl Isopropanol
zugesetzt und auf die im Set enthaltenen Spin Columns aufgetragen. Die vom
Hersteller empfohlene pH-Korrektur war dabei nicht erforderlich. Es folgte 1 min
Zentrifugation bei 13000 rpm, die erhaltenen Filtrate wurden verworfen. Im
Anschluß daran konnten zum Waschen jeweils 750 µl PE-Puffer auf die Säulen
gegeben werden, die erneut 1 min mit 13000 rpm abzentrifugiert wurden. Auch
diese Filtrate wurden verworfen, die trockenen Spin Columns erneut
zentrifugiert, auf saubere Eppendorf-Gefäße gesteckt und die gereinigte DNA
wurde mit je 30 µl Aqua bidest. in einem weiteren Zentrifugationsschritt eluiert.
35
Material und Methoden
2.14.4 Markierung der Sonden
Sowohl die etp- als auch die katP-Gensonde wurden mit Hilfe des Dig DNA
Labeling and Detection Kit markiert: Vier Ansätze mit je 10 µl der DNA-Lösung
wurden zunächst im Wasserbad 10 min. bei 100° inkubiert, anschließend sofort
3 min auf Eis gekühlt. Danach erfolgte jeweils die Zugabe von 2 µl
Hexanucleotid-Mix, 2 µl dNTP-Mix, 15 µl Aqua bidest. sowie 1 µl (2 U) KlenowEnzym. Die Ansätze inkubierten nach kurzem Mischen und Anzentrifugieren
über Nacht bei 37°C.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von je 2 µl 0,2 M EDTA (pH 8,0) gestoppt.
Die Fällung wurde mit 2,5 µl 4 M LiCl und 75 µl 100 %igem gekühltem Ethanol
durchgeführt. Die Lösungen inkubierten hierzu 2 h bei -80°C.
2.14.5 Herstellung der stx1B-Gensonde
Das die stx1B-Untereinheit codierende Fragment wurde mittels PCR markiert.
Dazu wurden 4 µl aufgereinigtes PCR-Produkt der Zielsequenz als MatrizenDNA in 34,5 µl Aqua bidest. gegeben, je 1 µl Primer KS 7 und KS 8, 1 µl
Nucleotidmix bestehend aus 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP, 3,5 µl 1
mM Digoxigenin-11-dUTP, 5 µl Ampli Taq Reaktionspuffer (10-fach) sowie
2,5 U Ampli Taq Polymerase zugesetzt.
Die Ansätze wurden dann den bei der Beschreibung der stx1-PCR
angegebenen Zyklen unterworfen, die fertige Sonde zur Hybridisierung mit
Phagen-DNA verwendet.
2.15 Hybridisierungen
2.15.1 DNA-Transfer auf eine Nylonmembran mittels Southern Blot
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Restriktionsprodukte und DNAspezifischer Färbung mit Ethidiumbromid wurden die Agarosegele zur
36
Material und Methoden
Dokumentation sowohl photographiert als auch digital gespeichert. Während
der folgenden Schritte wurden die Gele jeweils vollständig mit den
entsprechenden Lösungen bedeckt und auf einer Wippe bei Raumtemperatur
inkubiert.
Zunächst war die Denaturierung der Plasmid-DNA erforderlich, dazu wurden die
Agarosegele mit dem Puffer DNA I behandelt, wobei die Flüssigkeit nach 15
min. durch frische Lösung ausgetauscht und diese nochmals 45 min belassen
wurde.
Die
Neutralisation
der
Denaturierungsreaktion
erfolgte
durch
den
Renaturierungspuffer DNA II, auch diese Lösung wurde nach Ablauf der ersten
15 min erneuert und wirkte dann weitere 45 min ein.
In der Zwischenzeit wurde ein längerer Streifen Whatman 3 MM Filterpapier,
der in der Breite genau dem vorbereiteten Gel entsprechen sollte, über eine
erhöhte Glasplatte in eine Hybridisierungswanne mit 10-fach SSC-Puffer gelegt.
Auf diesen als Docht fungierenden Streifen folgten zwei weitere in 10-fach SSC
angefeuchtete Blätter 3 MM Papier, die die genaue Größe des Agarosegels
aufwiesen.
Gelegentlich
entstandene
Luftblasen
wurden
vorsichtig
ausgestrichen, um den DNA-Transfer vom Gel auf die Membran nicht zu
beeinträchtigen.
Um später auf der Nylonmembran die gleiche Orientierung wie auf dem Gel und
somit die einwandfreie Identifikation der Proben zu gewährleisten, musste das
Agarosegel mit der Oberseite nach unten auf die Filterpapiere gelegt werden,
direkt darauf folgten die ebenfalls exakt zugeschnittene und in 2-fach SSCPuffer angefeuchtete Nylonmembran und 3 Blätter mit 2-fach SSC getränktem
Filterpapier. Auch hier wurden Luftblasen sorgfältig entfernt.
Den Abschluss bildete ein ca. 5 cm hoher Stapel Zellstoffpapier, der mit einer
Kunststoffplatte abgedeckt, beschwert und ca. 15 h belassen wurde.
Beim Abbau des Southern Blots mußten die Slots des Agarosegels auf der
Nylonmembran markiert werden, dann folgten 5 min. Inkubation in 6-fach SSCPuffer bei Raumtemperatur. Die Membran wurde schließlich zwischen
Filterpapier vorgetrocknet und dann im Hybridisierungsofen 2 h bei 80 °C fixiert.
37
Material und Methoden
2.15.2 Hybridisierung
Die Nylonmembranen wurden zunächst in einem Hybridisierungsbeutel mit
Prähybridisierungslösung 1 h bei 68°C im Wasserbad inkubiert. Die SondenDNA wurde ca. 10 min im Wasserbad aufgekocht, dann für 2 min auf Eis
gestellt und schließlich in einer Endkonzentration von mindestens 30 ng/ml mit
frischer Prähybridisierungslösung zur Nylonmembran gegeben. Die Beutel
verblieben über Nacht bei 60°C im Wasserbad.
Nachdem die Membranen aus der Hybridisierungslösung entfernt wurden,
erfolgte erst ein unspezifischer Waschschritt von zweimal 5 min Dauer in
Lösung 1, danach wurde in zweimal 15 min der spezifische Waschschritt für
95%ige Homologie in Lösung 2 vollzogen.
Zur Färbung der Hybride mußten die Membranen 1 min in Puffer 1 neutralisiert
werden, um dann 30 min bei 60°C in Puffer 2 zu inkubieren. Im Anschluß daran
folgte ein weiterer kurzer Waschschritt in Puffer 1, bevor die Membranen 30 min
bei Raumtemperatur auf einer Wippe in Konjugatlösung behandelt wurden.
Mittels 30 min Waschen in Puffer 1, der nach 15 min erneuert wurde, konnten
unspezifische Konjugate entfernt werden, die Nylonmembranen wurden danach
in ca. 20 ml Puffer 3 äquilibriert.
Zur Durchführung der endgültigen Färbereaktion wurden die Membranen mit 10
ml Färbelösung in Plastikbeutel gegeben und vor Licht geschützt. Erfolgreiche
Hybridisierungen zeigten i. d. R. nach 15-30 min positive Signale, die Färbung
konnte mit Hilfe von Leitungswasser gestoppt und die getrockneten Nylonfilter
streng lichtgeschützt archiviert werden.
Von der fixierten Nylonmembran mussten zunächst die Markerspuren
abgetrennt werden, um mit einer entsprechenden Markersonde nach dem
gleichen Prinzip wie die übertragene DNA behandelt zu werden.
38
Ergebnisse
3 Ergebnisse
Zunächst wurden alle Untersuchungen unter der Annahme durchgeführt, die
isolierten EHEC O103:H2 seien klonalen Ursprungs und möglicherweise nah
mit den bekannten Prototypen der Spezies, E. coli O157:H7, verwandt. Daher
erfolgte zunächst ein Screening auf die vorbeschriebenen Pathogenitätsgene
stx1 und stx2, sowie die stx-flankierenden Phagensequenzen, EHEC-hly, αHämolysin, katP und etp. Darüber hinaus wurde ein Vergleich der durch
Restriktion der isolierten Plasmide erhaltenen „Fingerprints“ durchgeführt.
3.1
Phänotypische Untersuchungen
3.1.1 Serotypisierung
Die O-, H-Serotypisierung der vorliegenden 13 Wildtyp-Isolate wurde routinemäßig durch das Deutsche Zentrum für Enteritiserreger in Hamburg
durchgeführt. Alle Isolate waren dem Serotyp O103:H2 zugehörig, ebenso wie
der EPEC-Kontrollstamm B10.
3.1.2 Kultur auf SMAC-Agar
Bei Übernachtkultur auf Sorbit-MacConkey-Agar (SMAC) bildeten alle E. coli
O103:H2-Stämme rosa gefärbte Kolonien, fermentierten also Sorbitol. Zwischen
EHEC und EPEC fielen dabei keine Unterschiede auf. Der E. coli O157:H7Stamm
EDL933
verhielt
sich
erwartungsgemäß
Sorbitol-negativ,
die
entsprechenden Kolonien blieben weißlich [49].
E. coli O103 können somit auf SMAC nicht von E. coli der physiologischen
Darmflora unterschieden werden, die in der Regel Sorbitol-positiv sind.
39
Ergebnisse
3.1.3 Kultur auf Blutagar
Bei der Kultur auf Blutagar mit gewaschenen Erythrozyten zeigten die 12 EHEC
O103 bereits nach 4 h Bebrütung bei 37°C klare, ausgeprägte Hämolysehöfe,
vergleichbar mit denen des E. coli-typischen α-Hämolysins. Das zugehörige
Hämolysingen α-hlyA war in keinem der Stämme vorhanden, jedoch konnte
mittels PCR das O157-typische EHEC-hly nachgewiesen werden. Der parallel
kultivierte O157:H7-Stamm EDL933 wies hingegen auch nach 18 h Inkubation
die E-Hly-typischen, trüben Lysehöfe mit deutlich geringerer Intensität und
kleinerem Durchmesser auf. Bei dem EPEC-Stamm B10 konnte keinerlei
hämolytische Aktivität abgelesen werden.
Abb. 3: Hämolyseverhalten bei Kultur auf Agar mit gewaschenen Erythrozyten.
Der am oberen Bildrand gezeigte E. coli O157:H7 EDL933-cu ist ein plasmidfreies
Derivat von EDL933, daher fehlt ihm die hämolytische Aktivität. EDL933 zeigt den
typischen enterohämolytischen Phänotyp. Die EHEC O103:H2-Isolate PMK3 und 2905
produzieren große, klare Hämolysehöfe.
40
Ergebnisse
3.2
Genotypische Untersuchungen
3.2.1 Nachweis der stx1- und stx2-Gene
Durch PCR-Analyse konnte bei allen untersuchten Stämmen bis auf den EPECStamm B10 das stx1-Gen nachgewiesen werden, der O103-Stamm 7828 sowie
O157:H7-Stamm EDL933 besaßen zusätzlich stx2. Darüber hinaus ergab die
Untersuchung der stx-flankierenden 5’-Region (s. Abb. 4) bei allen stxtragenden Isolaten auch den Nachweis eines PCR-Produkts mit DNASequenzen chromosomal integrierter Prophagen.
Abb. 4: Schematische Darstellung der stx-flankierenden 5’-Region [84]
Bei Stx2-produzierenden EHEC-Stämmen ist regelmäßig ein tRNA-Gen ileX
stromaufwärts der stx2A-Region nachweisbar, welches Stx1-produzierenden Stämmen
fehlt. Über den Pfeilen ist die Bezeichnung des jeweils verwendeten Primers
angegeben.
3.2.2 PCR-Nachweis für eae, E-hlyA und katP
Die auf dem LEE-Locus liegende Intimin-codierende Gensequenz eae konnte
mittels PCR bei allen untersuchten Isolaten nachgewiesen werden.
Das plasmidkodierte Gen für EHEC-HlyA war in der PCR bei allen Isolaten,
außer dem auch phänotypisch nicht-hämolysierenden EPEC-Referenzstamm
B10 nachweisbar.
41
Ergebnisse
Neben dem O157:H7 Stamm EDL933 war bei sieben der zwölf EHEC O103:H2
Stämme das Gen für KatP vorhanden (s. Tabelle 2). Dies war nicht der Fall bei
fünf der EHEC O103:H2 Stämme (1858, 2905, 3386, 3390, 3391) sowie dem
EPEC-Stamm B10, die katP negativ waren.
3.2.3 Plasmidanalyse
Abb. 5: A: Restriktionsfragmentanalyse der isolierten Plasmide mit EcoRI.
B: Ergebnis der Hybridisierung mit der 12kb-etp-Sonde
Spur M: 1-kb-Leiter; 1: EDL933; 2: PMK3; 3: 3942; 4: 7828; 5: 5577; 6: 5579; 7: 5714;
8: 1858; 9: 3381; 10: 2905; 11: 3386; 12: 3390; 13: 3391.
Aus allen untersuchten Bakterienstämmen konnten Plasmide isoliert werden (s.
Abb. 5). Bei der Restriktion mit EcoRI und anschließender Gelelektrophorese
ergab die Auswertung der Fragmentlängen nahezu identische Bandenmuster
innerhalb der Serogruppe O103, welche sich jedoch deutlich von denen des
EDL933-Plasmids unterschieden. Vier der Isolate (2905, 3386, 3390 und 3391)
wiesen zusätzliche Banden bei ca. 2,8 kb, 4 kb und 9,5 kb auf, bei denen nicht
sicher zwischen einem weiteren kleinen Plasmid oder einem Fragment
differenziert werden konnte und die mit keiner der verwendeten Sonden
hybridisierten.
42
Ergebnisse
Durch spezifische Southern-Blot-Hybridisierung mit der gemäß Kapitel 2.14
hergestellten 12-kb-Gensonde für das etp-Gencluster konnten bei allen
analysierten EHEC die entsprechenden Sequenzen gefunden werden, EPEC
B10 war negativ. Vom O157:H7-Stamm EDL 933 mit seinem kräftigen
Hybridisierungssignal bei ca. 11 kb unterschieden sich alle EHEC O103-Isolate
durch gleichförmige, charakteristische Doppelbanden bei 6,5 kb und 8 kb (s.
Abb. 5).
Die Hybridisierung mit der katP-Sonde bestätigte den PCR-geführten Nachweis
des Katalase-Peroxidase-Gens bei den entsprechenden Stämmen (s. 3.2.4).
3.2.4 Ergebnisse der RAPD-PCR
Die Ergebnisse der RAPD-PCR wurden in einer umfangreicheren Studie
weiterverwendet, in der relevante EHEC und EPEC phylogenetisch untersucht
wurden. Die folgende Abbildung zeigt die mittels RAPD-PCR ermittelte klonale
Übereinstimmungsrate
für
verschiedene
Escherichia
coli-Stämme
der
Serogruppen O26, O55, O103, O111 und O157. Dabei wurden auch die in
dieser Arbeit untersuchten Isolate des Serotyps O103:H2 eingeschlossen [85].
43
Ergebnisse
Abb. 6: Dendrogramm der STEC zur Darstellung der RAPD-Übereinstimmungsrate [85].
Auf der Skala am oberen Bildrand lässt sich der prozentual ausgedrückte
Klonalitätsgrad zwischen verschiedenen Serogruppen und Untergruppen ablesen.
Der Homologiegrad der untersuchten O103:H2-Stämme bei Analyse des
isolierten chromosomalen Erbgutes in der RAPD-PCR ist in Abbildung 6
dargestellt. Er war in allen Fällen größer als 80%. Dabei ergaben sich zwei
Subgruppen, innerhalb derer wiederum der Homologiegrad bei über 95% lag
und in die sich alle getesteten stx1-positiven/stx2-negativen O103-Stämme
eingliederten. Lediglich der in Frankreich isolierte Referenzstamm PMK3 sowie
der am frühesten isolierte Stamm 7828 konnten diesen Subgruppen nicht
zugeordnet werden.
Der Vergleich der RAPD-PCR-Muster von O157:H7 und O103:H2 ergab eine
Ähnlichkeit von etwa 50%.
44
Ergebnisse
3.2.5 Phageninduktion
Zur Isolation des stx-Genmaterials wurde eine Phageninduktion mit Mitomycin
C und anschließende Präparation der Phagen-DNA vorgenommen. Im
Anschluss erfolgte die Restriktion mit HindIII. Hierbei zeigten die Banden der
Gelelektrophorese
für
die
verschiedenen
Isolate
zwar
ebenfalls
eine
Subgruppenbildung, ähnlich der bei der RAPD-PCR. So wiesen die Stämme
2905, 3386, 3390 und 3391 ein nahezu identisches Bandenmuster auf, ebenso
die beiden Stämme 5577 und 5579. Die Restriktion der übrigen Isolate ergab
sehr unterschiedliche Bandenmuster (s. Abb. 6).
Abb. 6: Restriktionsfragmentanalyse der Phagen-DNA nach Induktion und Restriktion mit HindIII.
Spur M: 1-kb-Leiter; 1: Phage λ; 2: 3381; 3: 5577; 4: 5579; 5: 3942; 6: 7828; 7: 2905;
8: 3386; 9: 3391; 10: 3390; 11: 5714; 12: 1858; 13: PMK3; 14: EPEC B10.
45
Ergebnisse
Alle differierten auch deutlich vom Restriktionsmuster des Phagen λ, welcher als
Referenz mitgeführt wurde. Der Versuch, mittels Southern-Blot Hybridisierung
das stx1-tragende Phagenfragment zu lokalisieren, erbrachte keine verwertbaren
Ergebnisse. Möglicherweise wurde bei dieser Untersuchung das Genmaterial
weiterer im Bakteriengenom integrierter, nicht stx-tragender Phagen induziert.
Die Ergebnisse der phänotypischen und genotypischen Untersuchungen sind in
der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.
Isolat
Serotyp
Hämolyse Sorbit
1858
O103:H2
+/α ähnlich
2905
O103:H2
3386
stx1
stx2
eae
e-hly
katP
etp
+
+
∅
+
+
∅
+
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
∅
+
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
∅
+
3391
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
∅
+
3390
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
∅
+
3381
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
+
+
5577
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
+
+
5579
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
+
+
5714
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
+
+
3942
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
+
+
7828
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
+
+
+
+
+
PMK 3
O103:H2
+/α ähnlich
+
+
∅
+
+
+
+
B10
O103:H2
∅
+
∅
∅
+
∅
∅
∅
EDL 933
O157:H7
+
∅
+
+
+
+
+
+
Tabelle 2: Phäno- und genotypische Eigenschaften der untersuchten E. coli Stämme des
Serotyps O103:H2 und der Kontrollstämme EHEC O157:H7 EDL933 und EPEC
O103:H2 B10.
46
Diskussion
4 Diskussion
4.1
Bedeutung der Pathogenitätsfaktoren
Die bei Escherichia coli erstmals beim Serotyp O157:H7 nachgewiesenen
Shiga Toxine lösen durch ihre systemischen Wirkungen im menschlichen
Körper ein breites Spektrum von Erkrankungen bis hin zum lebensbedrohlichen
HUS aus. Obwohl der Begriff EHEC lange Zeit mit dieser Serogruppe
gleichgesetzt wurde, zeigte sich jedoch, dass die Serotypisierung allein zur
Erfassung der Pathogenität nicht ausreicht. Diese wird auch von anderen
Virulenzdeterminanten bestimmt und es können auch Angehörige anderer
Serogruppen Shiga Toxine bilden [1, 17, 92]. Auch die hier untersuchten Wildtyp-Isolate des Serotyps O103:H2 trugen Stx-Gene und wurden bei HUSPatienten isoliert.
In einer deutschen Multicenterstudie konnte bei 95 Kindern mit klinisch
manifestem HUS in 88% der Fälle ein EHEC als Erreger nachgewiesen werden.
Dabei handelte es sich nur zu ca. 60% um E. coli O157:H7. Bei Kleinkindern bis
zu einem Lebensalter von drei Jahren waren Infektionen mit Nicht-O157Stämmen mit einem Anteil von 77% sogar deutlich häufiger [100]. Auch in
zahlreichen weiteren Studien wurden Nicht-O157-Serogruppen, wie z. B. O26,
O111 oder ONT:H19, als HUS-Erreger isoliert [11, 44, 50, 55, 81, 93].
Die Screeninguntersuchungen zur Identifikation von pathogenen EHECStämmen stützen sich neben der Serotypisierung auf weitere phänotypische
Eigenschaften wie z. B. Hämolysemuster oder die fehlende Fähigkeit zur
Sorbitolfermentierung. Bei der Kultur auf SMAC-Agar erwiesen sich unsere
untersuchten
EHEC
O103:H2
aber
wie
apathogene
E.
coli
als
sorbitolfermentierend und verhalten sich damit nicht wie E. coli O157:H7. Damit
bestätigte
sich
die
Annahme,
dass
EHEC
anderer
Serovare
oder
sorbitolfermentierende O157-Stämme mit dieser Methode nicht sicher erfasst
werden können [29, 35].
47
Diskussion
Sowohl bei E. coli O103:H2 als auch bei O157:H7 ist die Hämolyse durch E-hly
determiniert. Dennoch zeigen O103-Stämme eine deutlich schnellere und
ausgeprägtere Hämolyse. Offensichtlich kann die phänotypische Ausprägung
des E-hly unterschiedlich stark ausfallen, bis hin zum Ausbleiben der Hämolyse
bei vorhandenem Gen bei einigen O111-Stämmen [81]. Damit ist die
Aussagekraft phänotypischer Hämolysemuster allein für die Routinediagnostik
nicht ausreichend [80].
Die Einführung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und weiterer molekularbiologischer
Methoden
Pathogenitätsfaktoren
zum
lieferte
Nachweis
genauere
von
Informationen
Genen
über
anderer
genetische
Varianten und Subtypen. Damit stellt sich die Frage, inwieweit diese Methoden
für den Einsatz in der Routinediagnostik von Nutzen sein können. Dabei gilt es,
ein möglichst breites Spektrum bakterieller HUS-Erreger zuverlässig und
schnell zu erfassen, welche die Fähigkeit zur Shiga Toxin-Produktion akquiriert
haben. Neben dem direkten Nachweis von Toxin, z. B. mittels ELISA (enzyme
linked immunosorbent assay), dem chromosomalen Toxingen und dem
ebenfalls
chromosomal
auf
dem
LEE-Locus
codierten
eae,
kommen
plasmidkodierte Pathogenitätsmerkmale wie etp, katP, espP oder E-hly als
Kriterien zur EHEC-Diagnostik in Frage [7, 8, 37, 63, 83].
Bei allen untersuchten EHEC war stx1 mit den begleitenden Phagensequenzen
nachweisbar, O157:H7 EDL933 und O103:H2 7828 verfügten auch über stx2,
erwartungsgemäß war der EPEC B10 stx-frei. Bei E. coli O157 scheint die stx2Eigenschaft als wesentlicher Virulenzfaktor an der Entwicklung eines HUS
beteiligt zu sein, dagegen enthalten die von uns untersuchten Nicht-O157
EHEC nur selten stx2. Dennoch können einige das Vollbild der Erkrankung
auslösen, wie z. B der von uns charakterisierte O103:H2-Stamm 3942. Der
beide Toxinvarianten produzierende O103-Stamm 7828 war bei einem
Patienten mit letalem HUS isoliert worden.
Durch die wesentlich höhere zytotoxische Aktivität von Stx2 im menschlichen
Darm- und Nierengewebe, sind stx2-tragende EHEC wesentlich häufiger für ein
48
Diskussion
HUS verantwortlich, als Erreger, die nur über stx1 oder die Kombination beider
Gene verfügen. Bestimmte Untertypen des Stx2-Gens weisen dabei eine
geringere Pathogenität auf als andere (z. B. Stx2c), einige sind fast nur bei
Erkrankungen von Tieren von Bedeutung (z. B. Stx2d, Stx2e) [3, 15, 63, 86].
Stx1 und Stx2 scheinen sich auch darin zu unterscheiden, wie die Apoptose
ausgelöst wird. So ist Stx2 zur direkten Interaktion mit dem intrazellulären
Protein Bcl-2 fähig, welches die Apoptose inhibiert [76].
Auffällig bei unseren Untersuchungen war, dass der O103-Stamm 3942 in der
PCR stx1-positiv war, jedoch bei später durchgeführten Untersuchungen keine
Toxinproduktion
festgestellt
werden
konnte.
Die
spätere
Restriktions-
fragmentlängen-Analyse des stx1-Gens mit EcoRI zeigte ein 6,5 kb-Fragment
statt des erwarteten 5 kb-Fragments, bei der anschließend durchgeführten PCR
zur Amplifikation des gesamten stx1-Gens war das PCR-Produkt dieses
Stamms ca. 1 kb größer als das der übrigen O103:H2-Stämme. Vermutlich
verhindert diese zusätzliche DNA die Expression von Stx1 [85].
Nachdem die Gensequenz für eae bei allen untersuchten Stämmen,
einschließlich des EPEC-Stammes B10, vorgefunden wurde, erscheint dieses
für EHEC pathognomonische Protein allein zur Differenzierung von anderen
Enteritiserregern nur bedingt geeignet. Möglicherweise ergeben sich jedoch aus
der inzwischen erfolgten Differenzierung in Varianten zukünftig neue Aspekte.
So haben Zhang et al. vier eae-Varianten aus E. coli-Isolaten menschlichen
Ursprungs identifiziert und mit bereits publizierten Intimin-Allelen verglichen.
Dabei zeigte sich eine sehr hohe genetische Varianz vor allem in der 3’-Region,
die den zellbindenden Abschnitt des Intimins codiert. Gleichzeitig lagen
Hinweise vor, das intragenische Rekombination eine wesentliche Rolle bei der
phylogenetischen Entwicklung dieses Bereichs spielt. Zur Einteilung der IntiminVarianten wurde eine eae-Nomenklatur vorgeschlagen und ein differenziertes
PCR-Schema zur Typisierung entwickelt [108].
Bei dem von den O103-Stämmen gebildeten Intimin handelt es sich vorwiegend
um Intimin ε, bei dem Fitzhenry et al. an in vitro-Kulturen menschlicher
Darmepithelien
eine
erhöhte
Affinität
49
zu
lymphassoziierten
Geweben
Diskussion
nachweisen konnten. Dies hat das Intimin ε mit dem Intimin γ der EHEC O157
gemeinsam, unterscheidet es jedoch vom Intimin α der humanen EPECStämme. Vermutlich resultieren die unterschiedlichen Primärlokalisationen der
Darmläsionen aus diesen Eigenschaften [21, 61, 65].
Das EHEC-Plasmid war bei allen EHEC O103:H2 nachweisbar, die
spezifischen plasmidkodierten Eigenschaften espP und katP traten jedoch nur
inkonstant auf. Andere Untersuchungen haben diese Variabilität bestätigt und
z. B. für espP eine Serogruppenspezifität festgestellt. Der EHEC-type-IIpathway etpD war sowohl beim Kontrollstamm EDL933, als auch bei allen
analysierten Stx-produzierenden O103:H2 nachweisbar. Schmidt et al. zeigten
jedoch, dass u. a. EHEC der Serogruppen O26, O111 und O55 dieses Gen
nicht tragen, so dass auch hier der fehlende Nachweis keine diagnostische
Sicherheit gibt [85].
Auch für andere, in der neueren Literatur beschriebene plasmidkodierte
Proteasen wie EspA bis D, StcE sowie das dem Clostridientoxin ähnliche ToxB,
bleibt die diagnostische Relevanz noch zu klären [39, 43, 94].
Nach dem aktuellen Stand der Forschung bleibt der direkte Nachweis des
Toxins oder seines Gens der wesentliche Schritt bei der Erregeridentifikation
und ist damit zur frühzeitigen und zuverlässigen Erkennung einer EHECErkrankung unabdingbar.
Der Nachweis von stx1 bzw. stx2 durch PCR, Colony-Blot oder Southern Blot ist
neben dem direkten Toxinnachweis durch ELISA oder Zytotoxizitätstests
weiterhin der Goldstandard zur Diagnostik potentieller HUS-Erreger [63, 71, 72].
4.2
Klonalität
Bei der Analyse des Genoms mittels RAPD-PCR zeigte sich innerhalb der E.
coli-Serogruppe O103:H2 regelmäßig eine Übereinstimmung von über 80%.
Dabei konnten zwei größere Subgruppen identifiziert werden, innerhalb derer
die Übereinstimmung über 95% betrug. Zu dem in Frankreich isolierten Stamm
PMK3 ähnelten sich die Bandenmuster zu über 90%, während der zu Beginn
50
Diskussion
unserer Versuchsreihe isolierte EHEC 7828 lediglich eine Übereinstimmung mit
den beiden Untergruppen von 80% aufwies. Die Ähnlichkeit der E. coli O103:H2
Stämme mit dem O157-Referenzstamm betrug in der RAPD-Analyse ca. 50%.
Eine ähnlich hohe Klonalität, mit einer ausgeprägteren Anordnung in Clustern
wurde bereits früher für EHEC O157:H7 von Whittam et. al beschrieben [105].
Unsere RAPD-Ergebnisse würden für die These einer klonalen Entwicklung
innerhalb der Serogruppe O103:H2 sprechen, dies wird auch durch eine
epidemiologische Analyse von Prager et al. mit 145 O103-Isolaten mittels
molekularer
Subtypisierung
durch
PFGE,
sowie
Ribo-,
Phagen-
und
Elektrotypisierung unterstrichen [66].
Die Analyse des grossen Plasmids der untersuchten Bakterienstämme zeigte in
den RFLP-Mustern (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) ebenfalls eine
sehr hohe Übereinstimmung bei E. coli der Serogruppe O103, jedoch deutliche
Unterschiede zum untersuchten O157:H7 Referenzstamm EDL933 (s. Abb. 5).
Auch hier ergab sich eine gewisse Clusterbildung, da vier der O103:H2Stämme zusätzliche Signale bei ca. 9,5 kb, 4 kb und 2,8 kb zeigten. Diese
könnten auf das Vorhandensein weiterer kleinerer Plasmide oder zusätzlichen
Genmaterials innerhalb des grossen Plasmids hinweisen.
Die etp-Hybridisierung mit der 12 kb großen Gensonde brachte den
Unterschied zum O157:H7 EDL933 ebenfalls zum Ausdruck, indem sich das
etp-Gencluster aller EHEC O103:H2 nach Fragmentierung des Plasmids mit
EcoRI durch das Vorhandensein typischer Doppelbanden unterschied.
Auf Grund der Vorarbeiten von Schmidt et al. [85] führten wir den PCRNachweis von eae mit den Primern SK1 und SK2 durch. Die PCR mit den
Primerpaaren LP1-LP2 und LP1-LP3, die eigentlich typisch für EPEC und
EHEC-spezifische eae-Sequenzen sind, war in dieser Studie für alle
untersuchten EHEC O103-Stämme negativ geblieben. Hier ist zu diskutieren,
ob EHEC O103:H2 den LEE-Locus mit den abweichenden Intimin-codierenden
Sequenzen entweder im Laufe ihrer Entwicklung akquiriert haben oder sich die
betreffenden Abschnitte durch Mutationen verändert haben [105].
51
Diskussion
Auch scheint die stx1-Genregion von Nicht-O157 STEC einer geringeren
Variabilität in der Basenabfolge unterworfen zu sein, als E. coli O157:H7, was
ebenfalls dafür sprechen könnte, dass diese Region erst später integriert wurde
und einer geringerer Zahl von Rekombinationsvorgängen unterlegen hat [85].
Andererseits waren die Gene der Pathogenitätsfaktoren Stx1 (und in einem Fall
auch von Stx2) mit den begleitenden Phagensequenzen, sowie die der
plasmidcodierten Produkte EHEC-Hämolysin, Intimin und EspP bei allen
untersuchten
Stämmen
nachweisbar,
ihre
chromosomale
bzw.
plasmidgebundene Lokalisation im Genom der E. coli O103:H2 war auch
jeweils kongruent mit O157.
Zusammen mit den übrigen genotypischen und phänotypischen Eigenschaften
würden unsere Analysedaten die These unterstützen, dass innerhalb von
pathogenen E. coli-Serogruppen eine lineare, klonale Abstammung sehr
wahrscheinlich ist. Der als „Prototyp“ betrachtete Serotyp O157 stellt jedoch
nicht notwendigerweise den gemeinsamen klonalen Ursprung dar. Es wird
vermutet, dass erst bestimmte Kombinationen von Virulenzfaktoren zusammen
mit
dem
Vorhandensein
eines
stx-Gens
zur
enterohämorrhagischen
Pathogenität eines E. coli führen. Diese Kombinationen werden dann in
einzelnen Klonreihen vererbt, wobei der grössere Pool von Virulenzfaktoren bei
EHEC O157:H7 möglicherweise dessen weite Verbreitung als HUS-Erreger
ermöglicht hat [93, 104].
Bei der Untersuchung von Daten aus der deutschen Sentinel-Surveillance des
RKI
ergab
sich
eine
hohe
Wahrscheinlichkeit
für
das
gleichzeitige
Vorhandensein des stx2-Gens und des Intimin-Gens bei O157:H7-Isolaten von
Gastroenteritis-Patienten unter 15 Jahren. Dies legt nahe, dass z. B. diese
Kombination beider Gene ein Grund für die häufige Beteiligung von E. coli
O157 an HUS-Erkrankungen darstellt [71, 104]. Auch der Stamm 7828, der ein
HUS mit letalem Ausgang bei einem dreijährigen Mädchen verursacht hatte,
war mit dieser Genkombination ausgestattet.
52
Diskussion
Die Selektion pathogener Keime wird auch durch externe Faktoren begünstigt:
Die hochvirulenten Krankheitserreger scheinen sich in Großmastanlagen und
Tierzuchten leicht verbreiten zu können, so dass das Expositionsrisiko für
Menschen durch die industrialisierte Nahrungsmittelgewinnung ständig wächst.
Epidemiologische Studien in Deutschland zeigten eine Durchseuchung in
Rinderherden von 30% bis zu 80% [27].
Die
Beimengung
von
Antibiotika
in
subtherapeutischer
Dosierung
zu
Futtermitteln zur Steigerung von Größenwachstum und Ertrag könnte die
Selektion hochspezialisierter und teilweise multiresistenter Keime fördern [42].
EHEC genießen unter den genannten Bedingungen mehrere Selektionsvorteile:
Die
überwiegend
extrachromosomal
determinierten
Virulenzfaktoren
ermöglichen über Transduktion und Konjugation den Austausch von Erbgut
zwischen Subgruppen einer Bakterienart und anderen Spezies der Darmflora.
Durch additive Rekombination erreichen diese eine hohe Anpassungsfähigkeit
und können sich so leicht innerhalb eines Tierbestandes ausbreiten.
Unter Stress wie z. B. durch den Einfluss von Chemikalien, Antibiotika, UV-Licht
oder, wie in unseren in vitro-Versuchen, durch Mitomycin C, wird die Induktion,
Bakteriolyse und Freisetzung der lambdoiden Phagen deutlich gesteigert und
im Zuge dessen die Toxinproduktion erhöht. Residente E. coli-Stämme der
Darmflora können durch Aufnahme dieser freigesetzten Phagen-DNA zum
STEC werden [102]. Möglicherweise könnte die Phagenreproduktion durch
geeignete Substanzen, welche Promotorsequenzen der phagencodierenden
Genabschnitte blockieren, unterbunden und somit der horizontale Gentransfer
erschwert werden.
4.3
Diagnostik
Eine schnelle und zuverlässige EHEC-Diagnostik wird im wesentlichen durch
drei Faktoren erschwert:
53
Diskussion
•
Die Zahl der Shiga Toxin produzierenden Bakterienstämme nimmt durch
die
Mobilität
des
genetischen
Materials
zu
und
sie
können
unterschiedlichen Serogruppen angehören [11].
•
EHEC sind gegenüber der apathogenen Begleitflora in Lebensmittel- und
Stuhlproben häufig nur in geringer Konzentration vorhanden.
•
Die Methoden zum spezifischen Nachweis der Toxingene und ihrer
Produkte (z. B. Zytotoxizitätstest, PCR, ELISA) stehen nicht überall zur
Verfügung.
Labortechniken, die auf Identifikation von Oberflächenstrukturen basieren, wie
z. B. immunmagnetische Separation, erfassen lediglich eine bestimmte E. coliSerogruppe, außerdem wird die Spezifität durch mögliche Kreuzreaktionen mit
anderen Enterobakterien weiter verringert. Auch die Detektion verdächtiger
Kolonien über Anzucht auf selektierenden Medien wie SMAC, CT-SMAC oder
Rainbow-Agar
erfordern
dennoch
weiterführende
Untersuchungen
zur
Identifikation Shiga Toxin produzierender Stämme.
Zur mikrobiologischen Diagnostik bei möglicher Infektion mit EHEC wurden
bindende Empfehlungen der nationalen Aufsichtsbehörden, in Deutschland des
Robert Koch-Instituts gemeinsam mit der Deutschen Gesellschaft für Hygiene
und Mikrobiologie, erarbeitet. Diese sehen einen Stufendiagnostikplan zum
Toxinnachweis vor. Zum Screening soll mindestens ein Verfahren zur
Erregerisolierung, sowie eines zum Stx-Direktnachweis angewandt werden.
Erhärtet sich dabei der Verdacht auf eine EHEC-Infektion, bedarf dieser der
Bestätigung durch ein weiteres der im Folgenden aufgeführten Testverfahren.
Auf die Probenvorbereitung (Stuhl, Wasser, Nahrungsmittel o. a.) durch Aufschwemmung oder mechanische Zerkleinerung folgt die Anreicherungskultur,
meist in flüssigen Nährmedien als Übernachtkultur (ca. 12-18 h). Die
anschließende Erregerisolierung kann nach Ausstreichen auf geeigneten
Indikatornährböden erfolgen, parallel dazu sollte der Toxinnachweis durch
ELISA aus der Anreicherungsbouillon versucht werden. Bei entsprechendem
Verdacht kommen als Bestätigungstests in Frage:
54
Diskussion
•
PCR-Nachweis von Shiga Toxin-Genen oder
•
Toxinnachweis mit ELISA bzw. Zytotoxizitätstest (aufwendig).
•
Bei Stx-positivem Bestätigungstest folgt die Identifikation der entsprechenden Kolonie durch Immuno-Blot mit stx-spezifischen Sonden.
Schließlich
kann
der
so
isolierte
Erreger
durch
Serotypisierung
und
Untersuchung weiterer Virulenzfaktoren zur Klärung epidemiologischer Fragen
bzw. der phylogenetischen Abstammung genauer charakterisiert werden. Dies
kann
auf
Grund
der
Kosten
jedoch
nicht
als
Empfehlung
für
die
Routinediagnostik gelten. Es kommen dabei neben den von uns angewandten
Methoden u. a. die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) oder neuerdings die
Multiplex-PCR in Frage. Letztere stellt auf die gleichzeitige Detektion mehrerer
stx-spezifischer sowie eae- und E-hly-codierender Gensequenzen ab. Dabei gilt
es auch, möglichst Varianten der stx-Gene zu erfassen und durch die
Identifikation O157-spezifischer Gensequenzen (z. B. fliC H7) eine Differenzierung zu erreichen [46, 60, 90].
Einzelne Arbeitsschritte sind in kommerziell erhältlichen Kits vereinfacht und
beschleunigt, stehen aber dennoch nicht überall zur Verfügung. Zum direkten
Toxinnachweis wurde vor kurzem ein immun-chromatographischer Nachweis
entwickelt (Duopath®, Merck), der innerhalb von 24 h den Nachweis von stx1
und stx2 direkt aus Lebensmittelproben, bzw. in modifizierter Form auch aus
Stuhlproben, erlaubt [62].
In Einzelfällen ist auch ein serologischer Antikörpernachweis, z. B. gegen
Lipopolysaccharid-Antigene, erforderlich [48, 72].
Aus den genannten Gründen und wegen der sehr niedriger Infektiondosis (ca.
102 Keime) leiden ohne initiale Anreicherung sowohl die Sensitivität als auch
die Spezifität der Nachweisverfahren deutlich. Die kurze Generationszeit von E.
coli (20 min. bei 33-35°C) und die daraus resultierende starke Vermehrung der
Bakterien verbessern die Detektion deutlich.
In den meisten Laboratorien kann die Routinediagnostik so bei optimalem
Ablauf in 36–48 Stunden nach Erhalt der Proben erfolgen. Hinzu kommen
Zeiten zum Transport der Proben sowie zur Befundübermittlung.
55
Diskussion
Damit erfordert eine optimale Diagnostik nach aktuellem Stand zunächst die
rasche Formulierung der Verdachtsdiagnose durch den behandelnden Arzt mit
entsprechender
Probengewinnung,
kurze
Transportzeiten
durch
eine
flächendeckende Versorgung mit entsprechend ausgerüsteten Laboren sowie
zeitlich optimierte Arbeitsabläufe vor Ort.
Zukünftig könnte die Diagnostik bakterieller Gastroenteritiden durch die
Weiterentwicklung der Single Multiplex-PCR zur Identifikation unterschiedlicher
Diarrhöeerreger
verschiedener
E.
coli-Gruppierungen
oder
technische
Verbesserungen der PCR-Methoden beschleunigt werden [46, 67].
4.4
Therapie und Prävention - ein Ausblick
Nachdem
die
Behandlung
von
EHEC-Infektionen,
einschließlich
des
lebensbedrohlichen HUS, bisher nur symptomatisch erfolgen kann, muß die
weitere Forschung auf kausale Therapieansätze abzielen.
Die
Intensivierung
der
Erforschung
der
Pathogenitätsfaktoren
könnte
Angriffspunkte zur Beeinflussung der bakteriellen Fähigkeiten zur Adhärenz,
Invasion und Interaktion bieten [1, 68, 73, 76, 89].
Die Behandlung mit Antibiotika unterschiedlicher Substanzklassen ergab zum
Teil kontroverse Ergebnisse: Einerseits verhielten sich bei einer Untersuchung
von 137 Nicht-O157 E. coli-Isolaten etwa die Hälfte resistent gegen gängige
Antibiotika. Andererseits postulierten Arbeiten anderer Autoren eine erhöhte
Phageninduktion mit verstärkter Stx-Produktion unter medikamentösem Stress
[54, 74, 88, 106, 109].
Solange kein Medikament gefunden wird, das sowohl sicher bakterizid wirkt als
auch die unter Stress einsetzende Phageninduktion vermeidet, ist der Einsatz
antibakterieller Substanzen zur Standardtherapie weiterhin nicht angezeigt. Sie
können
die
Bakterienausscheidung
verlängern
und
die
Toxinbildung
stimulieren, sowie die Selektion resistenter Keime fördern [41].
Versuche
mit
Stx-spezifischen
Antikörpern
(HuMAbs)
ergaben
im
Schweinemodell eine verminderte Ausbildung des Krankheitsbildes mit
56
Diskussion
verbesserter Überlebensrate der infizierten Tiere. Die Anwendung solcher
Antikörper im Sinn einer passiven Immunisierung bei STEC-Verdacht könnte in
Zukunft eine Möglichkeit zur HUS-Prophylaxe liefern [4, 13, 57, 58].
Da die Leukozytenzahl sowie der Aktivierungsgrad der segmentkernigen
Granulozyten in direktem Zusammenhang mit dem Schweregrad des HUS
stehen, könnten Immunsuppressiva und Corticosteroide in die Aktivierung der
körpereigenen
Komplementsysteme
Neutrophilenzahlen
im
peripheren
eingreifen.
Blut
Die
einhergehende
mit
reduzierten
Reduktion
der
Produktion von Interleukinen und freien Radikalen mindert die Zellschädigung,
die septische Reaktion fällt weniger dramatisch aus, die Transportrate der
enteral aufgenommenen Shiga Toxine sinkt [101]. Zu prüfen bleibt, ob nicht
unter einer solchen Therapie die Erregervermehrung im Darm ansteigt und die
Unterdrückung der körpereigenen Abwehr den klinischen Verlauf anderweitig
verschlechtert [23, 97].
Nachdem in den letzten Jahren die Zahl der EHEC-Infektionen und der
endemischen
Ausbrüche
deutlich
zugenommen
hat,
gleichzeitig
aber
mangelnde kausale Therapiemöglichkeiten und die mögliche Schwere des
klinischen Verlaufs weiterhin Probleme aufwerfen, muss auch überlegt werden,
wie durch eine Verbesserung der Prävention die Bevölkerung vor diesen
Erregern geschützt werden kann.
In vielen Fällen lassen sich Nahrungsmittel als Ausgangspunkt der Infektion
sichern, die ausgeprägte Wiederstandsfähigkeit der EHEC mit der daraus
resultierenden niedrigen Infektionsdosis, die genetische Mobilität und ihre
Anspruchslosigkeit gegenüber Umweltbedingungen machen sie zu schwer
eliminierbaren Krankheitserregern.
Der Gedanke, die entsprechenden Tierbestände als Reservoir zu sanieren,
muss verworfen werden. Im Bereich der Tierhaltung müsste überprüft werden,
ob artgerecht und biologisch gehaltene Nutztierbestände eine geringere
Durchseuchung aufweisen. Der vermehrte Einsatz biologischer Düngemittel,
wie z. B. Stalldung, erhöht die Wahrscheinlichkeit der Kontamination auch
pflanzlicher Lebensmittel mit humanpathogenen Erregern.
57
Diskussion
Der wesentliche Faktor zur Unterbrechung der Übertragungsketten von Tier zu
Mensch, sowohl über direkte als auch indirekte Übertragung, ist die strikte
Einhaltung von Hygienevorschriften bei Gewinnung, Verarbeitung, Lagerung,
Transport und Verkauf von Lebensmitteln. In Untersuchungen aus der
fleischverarbeitenden Industrie in den USA wurde nachgewiesen, dass die
Prävalenz von Nicht-O157 STEC erstens saisonal schwankt und zweitens auf
den Häuten und Karkassen der Schlachttiere vor der üblichen Behandlung mit
Waschung und Kühlung eine Durchseuchung von über 90% vorlag. Diese wird
erst durch die genannte Intervention auf unter 20% gemindert [2]. Somit ist auf
Grund der möglichen Restkontamination die Kühllagerung und Einhaltung
ununterbrochener Kühlketten von großer Bedeutung. Bei der Endverarbeitung
müssen Garzeiten und -temperaturen eingehalten werden. Besondere Vorsicht
ist bei hochbelasteten Produkten wie Hackfleisch und Rohmilch geboten.
Größeren Ausbrüchen muß durch eine schnelle Identifizierung und Eliminierung
von Infektionsquellen vorgebeugt werden, dazu ist die Einhaltung der
Meldepflicht
nach
IfSG
sowie
ggf.
die
Klärung
Zusammenhänge durch Referenzlaboratorien erforderlich.
58
epidemiologischer
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Die
vorliegende
Untersuchung
konnte
die
Hypothese
einer
klonalen
Entwicklung von EHEC O103:H2 bestätigen. Die in Clustern angeordnete
Übereinstimmungsrate
der
RAPD-Fragmentierungsmuster
und
der
Plasmidrestriktionen zeigen diese Ähnlichkeit innerhalb der Serogruppe auf,
während Gemeinsamkeiten mit dem O157-Referenzstamm sich auf das
Vorhandensein ähnlicher Virulenzfaktoren beschränken. Diese Varianz der
phänotypischen und genotypischen Eigenschaften zeigte bei der Untersuchung
hinsichtlich
ihrer
Bedeutung
für
diagnostische,
phylogenetische
und
epidemiologische Fragestellungen unterschiedliche Wertigkeiten. Die ständig
fortschreitende Differenzierung der Virulenzdeterminanten kann dabei nicht nur
Ansätze zur Diagnostik sondern auch zur Therapie liefern und muss daher
weiter
verfolgt
werden.
Dennoch
ist
weiterhin
der
Nachweis
des
krankheitsauslösenden Shiga Toxins in der Routinediagnostik vermuteter
EHEC-Erkrankungen
erforderlich,
mittels
differenzierter
Multiplex-PCR-
Methoden können dabei auch Kombinationen relevanter Pathogenitätsfaktoren
in einem Arbeitsgang erfasst werden.
EHEC O103 traten mehrere Jahre nach E. coli O157:H7 als HUS-Erreger in
Erscheinung und haben wahrscheinlich die dazu erforderliche Kombination von
Pathogenitätsfaktoren erst später erworben.
EHEC-Erkrankungen weisen eine steigende Inzidenz auf, können beim
Menschen zu lebensbedrohlichen Krankheitsbildern führen, besitzen aber auch
in der Veterinärmedizin eine hohe Relevanz. Da bisher kausale Therapien
klinisch noch nicht verfügbar sind, muß aktuell vor allem die Prävention durch
Infektionsprophylaxe
und
rasche
Erkennung
Vordergrund stehen.
59
von
Erkrankungsfällen
im
Literaturverzeichnis
6 Literaturverzeichnis
1.
Andreoli, S.P., Trachtman, H., Acheson, D.W., Siegler, R.L., and
Obrig,
T.G.
2002.
Hemolytic
uremic
syndrome:
epidemiology,
pathophysiology and therapy. Pediatr Nephrol 17: 293-298.
2.
Barkocy-Gallagher, G.A., Arthur, T.M., Shackelford, S.D., Wheeler,
T.L., and Koohmaraie, M. 2003. Seasonal prevalence of Shiga toxinproducing E. coli, including O157:H7 and non-O157 serotypes, and
Salmonella in commercial beef processing plants. J Food Prot 66(11):
1978-1986.
3.
Beutin, L., Geier, D., Zimmermann, S., and Karch, H. 1995. Virulence
markers of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli strains originating
form healthy domestic animals of different species. J Clin Microbiol 27:
2559–2564.
4.
Bielaszewska, M., Clarke, I., Karmali, M.A., and Petric, M. 1997.
Localization of intravenously administered verotoxins (Shiga-like toxins)
1 and 2 in rabbits immunized with homologous and heterologous toxoids
and toxin subunits. Infect Immun 65: 2509–2516.
5.
Birnboim, H.C., and Doly, J. 1992. A rapid alkaline extraction procedure
for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7: 15131523.
6.
Blanco, J., Cid, D., Blanco, J.E., Blanco, M., Ruiz Santa Quiteira, J.
A., and de la Fuente, R. 1996. Serogroups, toxins and antibiotic
resistance of Escherichia coli strains isolated from diarrhoeic lambs in
Spain. Vet Microbiol 49(3-4): 209-217.
60
Literaturverzeichnis
7.
Brunder, W., Schmidt, H., and Karch, H. 1996. KatP, a novel catalaseperoxidase encoded by the large plasmid of enterohaemorrhagic
Escherichia coli O157:H7. Microbiology 142: 3305-3315.
8.
Brunder, W., Schmidt, H., and Karch, H. 1997. EspP, a novel
extracellular serine protease of enterohaemorrhagic Escherichia coli
O157:H7 cleaves human coagulation factor V. Mol Microbiol 24(4): 767778.
9.
Brunder, W., Schmidt, H., Frosch, M., and Karch, H. 1999. The large
plasmids of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are highly
variable genetic elements. Microbiology 145: 1005–1014.
10.
Bulte, M., Müller-Wiefel, D.E., Schwarzkopf, A., and Karch, H. 1992.
Detection of verotoxin-producing E. coli (VTEC) in healthy cattle and
swine with the DNA-DNA colony hybridization method. Berl Münch
Tierärztl Wochenschr 103:380-384.
11.
Burk, C., Dietrich, R., Acar, G., Moravek, M., Bulte, M., and
Martlbauer, E. 2003. Identification and characterization of a new variant
of Shiga toxin 1 in Escherichia coli ONT:H19 of bovin origin. J Clin
Microbiol 41(5):2106-2112.
12.
Calderwood, S.B., Auclair, F., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G.T., and
Mekalanos, J.J. 1987. Nucleotide sequence of the Shiga-like toxin
genes of Escherichia coli. Proc Nath Acad Sci U.S.A. 84:4364-4368.
13.
Camguilhem, R., and Milon, A. 1990. Protection of weaned rabbits
against experimental Escherichia coli O103 intestinal infection by oral
formalin-killed vaccine. Vet Microbiol 21(4): 353-362.
61
Literaturverzeichnis
14.
Chauhan, R.S., and Kaushik, R.K. 1991. Isolation of enterotoxigenic E.
coli from camels with diarrhea. Vet Microbiol 29(2): 195-197.
15.
Cherla, R.P., Lee, S.Y., and Tesh, V.L. 2003. Shiga toxins and
apoptosis. FEMS Microbiol Lett 228(2): 159-166.
16.
Coppo, P., Bussel, A., Charrier, S., Adrie, C., Galicier, L., Boulanger,
E., Veyradier, A., Leblanc, T., Alberti, C., Azoulay, E., LeGall, J.R.,
and Schlemmer, B. 2003. High-dose plasma infusion versus plasma
exchange as early treatment of thrombotic-thrombocytopenic purpura /
hemolytic-uremic syndrome. Medicine 82(1): 27-38.
17.
Datz, M., Janetzki-Mittmann, C., Franke, S., Gunzer, F., Schmidt, H.,
and Karch, H. 1996. Analysis of the enterohemorrhagic Escherichia coli
O157 DNA region containing lambdoid phage gene p and Shiga-like
toxin structural genes. Appl Environ Microbiol 62: 791-797.
18.
Deibel, C., Kramer, S., Chakraborty, T., and Ebel, F. 1998. EspE, a
novel secreted protein of attaching and effacing bacteria, is directly
translocated into infected host cells, where it appears as a tyrosinephosphorylated 90 kDa protein. Mol Microbiol 28: 463-474.
19.
Dorn, C.R., Francis, D.H., Angrick, E.J., Willgohs, J.A., Wilson, R.A.,
Collins, J.E., Jenke, B.H., and Shawd, S.J. 1993. Characteristics of
verocytotoxin producing Escherichia coli associated with intestinal
colonization and diarrhea in calves. Vet Microbiol 36(1-2): 149-159.
20.
Elliott, M.A., and Nichols, W.L. 2001. Thrombotic thrombocytopenic
purpura and hemolytic uremic syndrome. Mayo Clin Proc 76:1154-1162.
62
Literaturverzeichnis
21.
Fitzhenry, R.J., Stevens, M.P., Jenkins, C., Wallis, T.S., Heuschkel,
R., Murch, S., Thomson, M., Frankel, G., and Phillips, A.D. 2002.
Human intestinal tissue tropism of intimin epsilon O103 Escherichia coli.
FEMS Microbiol Lett 218: 311-316.
22.
Frankel, G., Phillips, A.D., Rosenshine, I., Dougan, G., Kaper, J.B.,
and Knutton, S. 1998. Enteropathogenic and enterohemorrhagic E. coli:
more subversive elements. Mol Microbiol 30(5): 911-921.
23.
Funatogawa, K., Ide, T., Kirikae, F., Saruta, K., Nakano, M., and
Kirikae, T. 2002. Use of immunoglobulin enriched bovine colostrum
against oral challenge with enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7
in mice. Microbiol Immunol 46(11): 761-766.
24.
Gasser, C., Gautier, E., Steck, A., Siebenmann, R.E., and Oechslin,
R. 1955. Hämolytisch-urämische Syndrome: Bilaterale Nierenrindennekrosen bei akuten erworbenen hämolytischen Anämien. Schweiz Med
Wochenschr 85: 905-909.
25.
Garabal, J.I., Gonzalez, E.A, Vazquez, F., Blanco, J., Blanco, M., and
Blanco, J.E. 1996. Serogroups of Escherichia coli isolated from piglets
in Spain. Vet Microbiol 48(1-2): 113-123.
26.
George, J.N., and Vesely, S. 2001. Thrombotic thrombocytopenic
purpura - Hemolytic uremic syndrome: Diagnosis and treatment.
Cleveland Clin J Med 68: 857-878.
27.
Geue, L., Segura-Alvarez, M., Conraths, F.J., Kuczius, T., Karch, H.,
and Gallien, P. 2002. A long-term study on the prevalence of shiga
toxin-producing Escherichia coli (STEC) on four German cattle farms.
Epidemiol Infect 129(1): 173-185.
63
Literaturverzeichnis
28.
Griffin,
P.M.
1995.
Escherichia
coli
O157:H7
and
other
enterohemorrhagic Escherichia coli. In: M. J. Blaser, P.D. Smith, J.I.
Ravdin, H.B. Greenberg and R.L. Guerrant (eds.). Infections of the
gastrointestinal tract. Raven Press, New York.
29.
Gunzer, F., Böhm, H., Rüssmann, H., Bitzan, M., Aleksic, S., and
Karch, H. 1992. Molecular detection of sorbitol fermenting Escherichia
coli O157 in patients with hemolytic uremic syndrome. J Clin Microbiol
30: 1807–1810.
30.
Hall, G.A., Dorn, C.R, Chanter N., Scotland, S.M., Smith, H.R., and
Rowe, B. 1990. Attaching and effacing lesions in vivo and adhesion to
tissue culture cells of verocytotoxin-producing E. coli belonging to
serogroups O5 and O103. J Gen Microbiol 136(4): 779-786.
31.
Heuvelink, A.E., van de Kar, N.C., Meis, J.F., Monnens, L.A., and
Melchers, W.J. 1995. Characterization of verocytotoxin-producing
Escherichia coli O157 isolates from patients with hemolytic uremic
syndrome in Western Europe. Epidemiol Infect 115:1-14.
32.
Hirano, J., Yoshida, T., Sugiyma, T., Koide, N., Mori, I., and Yokochi,
N. 2003. The effect of Lactobacillus rhamnosus on enterohemorrhagic
Escherichia coli infection of human intestinal cells in vitro. Microbiol
Immunol 47(6): 405-409.
33.
Karch, H., and Bockemühl, J. 1989. Infections by enterohemorrhagic
Escherichia coli (EHEC): a clinical and microbiological problem and a
challenge for the public health service. Immun Infekt 17: 206-211.
34.
Karch, H., and Meyer, T. 1989. Single primer pair for amplifying
segments of distinct Shiga-like-toxin genes by polymerase chain
reaction. J Clin Microbiol 27: 2751-2757.
64
Literaturverzeichnis
35.
Karch, H., Bohm, H., Schmidt, H., Gunzer, F., Aleksic, S., and
Heesemann, J. 1993. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like
toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J Clin
Microbiol 31(5): 1200-1205.
36.
Karch, H., Schmidt, H., and Brunder, W. 1998. Plasmid encoded
determinants of Escherichia coli O157:H7. In „Escherichia coli O157:H7
and Other Shiga Toxin-Producing E. coli Strains”. Kaper, J.B. and
O’Brien, A.D (eds.). pp.183–194. American Society for Microbiology,
Washington DC.
37.
Karch, H., and Köhler, B. 1999. New knowledge of the molecular
biology of enterohemorrhagic Escherichia coli O157. Gesundheitswesen
61: 46-51.
38.
Karch, H., Schubert, S., Zhang, D., Zhang, W., Schmidt, H.,
Ölschläger, T., and Hacker, J. 1999. A genomic island, termed highpathogenicity island, is present in certain non-O157 shiga toxinproducing Escherichia coli clonal lineages. Inf Immun 67: 5994–6001.
39.
Karch, H. 2001. The role of virulence factors in enterohemorrhagic
Escherichia coli (EHEC)-associated hemolytic uremic syndrome. Semin
Thromb Hemost 27: 207-213.
40.
Karmali, M.A., Petric, M., Lim, C., Fleming, P.C., Arbus, G.S., and
Lior, H. 1985. The association between idiopathic hemolytic uremic
syndrome and infection by verotoxin-producing Escherichia coli. J Infect
Dis 151: 775-782
41.
Kimmitt, P.T., Harwood, C.R., and Barer, M.R. 2000. Toxin gene
expression by Shiga toxin-producing E. coli: The role of antibiotics and
the bacterial SOS response. Emerg Infect Dis 6: 458-465.
65
Literaturverzeichnis
42.
Köhler, B., Karch, H., and Schmidt, H. 2000. Antibacterials that are
used as growth promoters in animal husbandry can affect the release of
Shiga toxin 2-converting bacteriophages and Shiga toxin 2 from
Escherichia coli strains. Microbiol 146: 1085-1090.
43.
Lathem, W.W., Grys, T.E., Witowski, S.E., Torres, A.G., Kaper, J.B.,
Tarr, P.I., and Welch, R.A. 2002. StcE, a metalloprotease secreted by
Escherichia coli O157:H7, specifically cleaves C1 esterase inhibitor. Mol
Microbiol 45(2): 277-288.
44.
Law, D. 2000. Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga
toxin-producing E. coli. J Appl Microbiol 88: 729–745.
45.
Levine, M.M. 1987. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic,
enteropathogenic,
enteroinvasive,
enterohemorrhagic
and
enteroadherent. J Infect Dis 155: 377-389.
46.
Lopez-Saucedo, C., Cerna, J.F., Villegas-Sepulveda, N., Thompson,
R., Velazquez, F.R., Torres, J., Tarr, P.I., and Estrada-Garcia, T. 2003.
Single Multiplex polymerase chain reaction to detect diverse loci
associated with diarrheagenic E. coli. Emerg Infect Dis 9(1): 127-131.
47.
Louie, M., de Azavedo, J.C., Handelsman, M.Y., Clark, C.G., Ally, B.,
Dytoc, M., Sherman, P., and Brunton, J. 1993. Expression and
characterization of the eaeA gene product of Escherichia coli serotype
O157:H7. Infect Immun 61: 4085-4092.
48.
Luzzi, I., Tozzi, A.E., Rizzoni, G., Niccolini, A., Benedetti, I., Minelli,
F., and Caprioli, A. 1995. Detection of serum antibodies to the
lipopolysaccharide of Escherichia coli O103 in patients with hemolytic
uremic syndrome. J Infect Dis 171(2): 514-515.
66
Literaturverzeichnis
49.
March, S.B., and Ratnam, S. 1986. Sorbitol-MacConkey medium for
detection of Escherichia coli O157:H7 associated with hemorrhagic
colitis. J Clin Microbiol 23: 869-872.
50.
Mariani-Kurkdjian, P., Denamur, E., Milon, A., Picard, B., Cave, H.,
Lambert-Zechovsky, N., Loirat, C., Goullet, P., Sansonetti, P.J., and
Elion, J. 1993. Identification of a clone of Escherichia coli O103:H2 as a
potential agent of hemolytic uremic syndrome in France. J Clin Microbiol
31(2): 296-301.
51.
Martin, M. L., Shipman, L. D., and Potter, M. E. 1986. Isolation of
Escherichia coli O157:H7 from dairy cattle associated with two cases of
haemolytic uremic syndrome. Lancet 2:1043.
52.
Meinkoth, J., and Wahl, G. 1984. Hybridization of nucleic acids
immobilized on solid supports. Annal Biochem 138: 267-84.
53.
Milon, A., Esslinger, J., and Camguilhem, R. 1990. Adhesion of
Escherichia coli strains isolated from diarrheic weaned rabbits to
intestinal villi and HeLa cells. Infect Immun 58(8): 2690-2695.
54.
Molbak, K., Mead, P.S., and Griffin, P.M. 2002. Antimicrobial therapy in
patients with E. coli O157:H7 infection. JAMA 288(8): 1014-1016.
55.
Morabito, S., Karch, H., Mariani-Kurkdjian, P., Schmidt, H., Minelli,
F., Bingen, E., and Caprioli, A. 1998. Enteroaggregative, Shiga toxinproducing Escherichia coli O111:H2 associated with an outbreak of
hemolytic uremic syndrome. J Clin Microbiol 36: 840–842.
56.
Moschkowitz, E. 1925. An acute febrile pleiochromic anemia with
hyaline thrombosis of the terminal arterioles and capillaries. Arch Intern
Med 36: 89-93.
67
Literaturverzeichnis
57.
Mukherjee, J., Chios, K., Fishwild, D., Hudson, D., O’Donnell, S.,
Rich, S.M., Donohue-Rolfe, A., and Tzipori, S. 2002. Human Stx2specific monoclonal antibodies prevent systemic complications of
Eschericha coli O157:H7 infection. Inf Immun 70: 612-619.
58.
Mukherjee, J., Chios, K., Fishwild, D., Hudson, D., O’Donnell, S.,
Rich, S.M., Donohue-Rolfe, A, and Tzipori, S. 2002. Production and
characterization of protective human antibodies against Shiga Toxin 1.
Inf Immun 70: 5896-5899.
59.
O’Brien, A.D., Lively, T.A., Chang T.W., and Gorbach, S.L. 1983.
Purification of Shigella dysenteria 1 (Shiga)-like toxin from Escherichia
coli O157:H7 strain associated with haemorrhagic colitis. Lancet 2: 573
60.
Osek, J. 2003. Development of a multiplex PCR approach for the
identification of Shiga toxin-producing E. coli strains and their major
virulence factor genes. J Appl Microbiol 95(6): 1217-1225.
61.
Oswald, E., Schmidt, H., Morabito, S., Karch, H., Marchès, O., and
Caprioli, A. 2000. Typing of intimin genes in human and animal
enterohemorrhagic
and
enteropathogenic
Escherichia
coli:
characterization of a new intimin variant. Inf Immun 68: 64-71.
62.
Park, C.H., Kim, H.J., Hixon, D.L., and Bubert, A. 2003. Evaluation of
the duopath verotoxin test for detection of Shiga toxins in cultures of
human stools. J Clin Microbiol 41(6): 2650-2653.
63.
Paton, J.C., and Paton, A.W. 1998. Pathogenesis and diagnosis of
Shiga toxin-producing Escherichia coli Infections. Clin Microbiol Rev
11(3): 450–479.
68
Literaturverzeichnis
64.
Perna, N.T., Mayhew, G.F., Posfai, G., Elliott, M.A., Donnenberg,
M.S., Kaper, J.B., and Blattner, F.R. 1998. Molecular evolution of a
pathogenicity island from enterohemorrhagic E. coli O157:H7. Inf Immun
66: 3810-3817.
65.
Phillips, A.D., Navabpour, S., Hicks, S., Dougan, G., Wallis, T., and
Frankel, G. 2000. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 target
Peyer’ patches in humans and cause attaching/effacing lesions in both
human and bovine intestine. Gut 47: 377-381.
66.
Prager, R., Liesegang, A., Voigt, W., Rabsch, W., Fruth, A., and
Tschäpe, A. 2002. Clonal diversitiy of Shiga toxin-producing E. coli
O103:H2/H- in Germany. Inf Gen Evol 1(4): 265-275.
67.
Pulz, M., Matussek, A., Monazahian, M., Tittel, A., Nikolic, E.,
Hartmann, M., Bellin, T., Buer, J., and Gunzer, F. 2003. Comparison of
a Shiga toxin enzyme-linked immunosorbent assay and two types of
PCR for detection of Shiga toxin-producing E. coli in human stool
specimens. J Clin Microbiol 41(10): 4671-4675.
68.
Raife, T., and Montgomery, R. 2001. New aspects in the pathogenesis
and treatment of thrombotic thrombocytopenic purpura and hemolytic
uremic syndrome. Rev Clin Exp Hematol 5(3):236-261.
69.
Reynaud, A., Cloastre, L., Bernard, J., Laveran, H., Ackermann, H.
W., Licois, D., and Joly, B. 1992. Characteristics and diffusion in the
rabbit of a phage for Escherichia coli O103. Attempts to use this phage
for therapy. Vet Microbiol 30(2-3): 203-212.
70.
Riley, L.W., Remis, R.S., Helgerson, S.D. McGee, H.B., Wells, J.G.,
Davis, B.R., Blake, P.A., and Cohen, M.L. 1983. Hemorrhagic colitis
associated with a rare E. coli serotype. N Engl J Med 308: 681-685.
69
Literaturverzeichnis
71.
Robert Koch-Institut. 2000. Jahresbericht 1999. Gastroenteritiden. Epid
Bull 34: 272-275. (aktualisiert 2003, Epid Bull 22: 171-176.)
72.
Robert Koch-Institut. 2001. Laborgestützte Sentinel-Surveillance von
EHEC- und Salmonellen-Infektionen. Epid Bull 3: 17-19.
73.
Roe, A.J., Hoey, D.E., and Gally, D.L. 2003. Regulation, secretion and
activity of type III-secreted proteins of enterohaemorrhagic Escherichia
coli O157. Biochem Soc Trans 31(1): 98-103.
74.
Safdar, N., Said, A., and Maki, D.G. 2002. Risk of hemolytic uremic
syndrome after antibiotic treatment of E. coli O157:H7 enteritis. JAMA
288(8): 996-1001.
75.
Sandvig, K., and van Deurs, B. 1996. Endocytosis, intracellular
transport and cytotoxic action of Shiga toxin and Ricin. Physiol Rev 76:
949-966.
76.
Sandvig, K. 2001. Shiga toxins. Toxicon 39: 1629-1635.
77.
Schmidt, H., Karch, H., and Beutin, L. 1994. The large-sized plasmids
of enterohemorrhagic E. coli O157 strains encode hemolysins which are
presumably members of the E. coli α-hemolysin family. FEMS Microbiol
Lett 117: 189-196.
78.
Schmidt, H., Plaschke, B., and Franke, S. 1994. Differentiation in
virulence patterns of E. coli possessing eae genes. Med Microbiol
Immunol 183: 23-31.
70
Literaturverzeichnis
79.
Schmidt,
H.,
Rüssmann,
H.,
Schwarzkopf,
A.,
Aleksic,
S.,
Heesemann, J., and Karch, H. 1994. Prevalence of attaching and
effacing Escherichia coli in stool samples from patients and controls. Int J
Med Microbiol Virol Parasitol Infect Dis 281: 201-213.
80.
Schmidt, H., Beutin, L., and Karch, H. 1995. Molecular analysis of the
plasmid-encoded hemolysin of E. coli O157:H7 strain EDL933. Infect
Immun 63: 1055-1061.
81.
Schmidt, H., and Karch, H. 1996. Enterohemolytic phenotypes and
genotypes of Shiga toxin-producing E. coli O111 strains from patients
with diarrhea and hemolytic uremic syndrome. J Clin Microbiol 34: 23642367.
82.
Schmidt, H., Kernbach, C., and Karch, H. 1996. Analysis of the EHEC
hly operon and its location in the physical map of enterohemorrhagic
Escherichia coli O157:H7. Microbiol 141: 907-914.
83.
Schmidt, H., Henkel, B., and Karch, H. 1997. A gene cluster closely
related to type II secretion pathway operons of Gram-negative bacteria is
located on the large plasmid of enterohemorrhagic Escherichia coli O157
strains. FEMS Microbiol Lett 148: 265-272.
84.
Schmidt, H., Scheef, J., Janetzki-Mittmann, C., and Karch, H. 1997.
An ileX tRNA gene is located close to the Shiga toxin 2 operon in
enterohemorrhagic Escherichia coli O157 and non-O157 strains. FEMS
Microbiol Lett 149: 39-44.
85.
Schmidt, H., Geitz, C., Tarr, P. I., Frosch, M., and Karch, H. 1999.
Non-O157:H7
pathogenic
Shiga
toxin-producing
Escherichia
coli:
Phenotypic and genetic profiling of virulence traits and evidence for
clonality. J Inf Dis 179: 115–123.
71
Literaturverzeichnis
86.
Schmidt, H., Scheef, J., Morabito, S., Caprioli, A., Wieler, L.H., and
Karch, H. 2000. A new Shiga toxin 2 variant (Stx2f) from Escherichia coli
isolated from pigeons. Appl Environ Microbiol 66: 1205-1208.
87.
Schmidt, H., Zhang, W.L., Hemmrich, U., Jelacic, S., Brunder, W.,
Tarr, P. I., Dobrindt, U., Hacker, J., and Karch, H. 2001. Identification
and characterization of a novel genomic island integrated at selC in locus
of enterocyte effacement-negative, Shiga toxin-producing E. coli. Infect
Immun 69(11): 6863-6873.
88.
Schroeder, C.M., Meng, J., Zhao, S., Torcolini, J., McDermott, P.F.,
Wagner, D.D., and White, D.G. 2002. Antimicrobial resistance of E. coli
O26, O103, O111, O128 and O145 from animals and humans. Emerg
Infect Dis 8(12).
89.
Shaikh, N., and Tarr, P.I. 2003. Eschericha coli O157:H7 Shiga toxinencoding
bacteriophages:
integration,
excisions,
truncations,
and
evolutionary implications. J Bacteriol 185(12): 3596-3605.
90.
Sharma,
V.K.,
and
Dean-Nystrom,
E.A.
2003.
Detection
of
enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 by using a multiplex
realtime PCR assay of genes encoding intimin and Shiga toxins. Vet
Microbiol 93(3): 247-260.
91.
Stevens, M.P., Marches, O., Campbell, J., Huter, V., Frankel, G.,
Phillips, A.D., Oswald, E., and Wallis, T.S. 2002. Intimin, tir, and shiga
toxin 1 do not influence enteropathogenic responses to shiga toxinproducing Escherichia coli in bovine ligated intestinal loops. Infect Immun
70(2): 945-52.
92.
Tarr, P.I. 1995. Escherichia coli O157:H7: clinical, diagnostic, and
epidemiological aspects of human infection. Clin Infect Dis 20: 1-10.
72
Literaturverzeichnis
93.
Tarr, P.I., and Neill, M.A. 1996. Perspective: The problem of nonO157:H7 Shiga toxin (verocytotoxin)-producing Escherichia coli. J Inf Dis
174: 1136–1139.
94.
Tatsuno, I., Horie, M., Abe, H., Miki, T., Makino, K., Shinagawa, H.,
Taguchi, H., Kamiya, S., Hayashi, T., and Sasakawa, S. 2001. ToxB
gene on pO157 of enterohemorrhagic E. coli O157:H7 is required for full
epithelial cell adherence phenotype. Inf Immun 69(11): 6660-6669.
95.
TeLoo, D.M., Monnens, L.A., van der Velden, T.J., Vermeer, M.,
Preyers, F., Dermacker, P.N., van den Heuvel, L.P., and van
Hinsbergh, V.W. 2000. Binding and transfer of verocytotoxin by
polymorphonuclear leukocytes in hemolytic uremic syndrome. Blood
95(11): 3396-3402.
96.
Tesh, V.L., Ramegowda, B., and Samuel, J.E. 1994. Purified Shiga-like
toxins induce expression of proinflammatory cytokines from murine
peritoneal macrophages. Infect Immun 62: 5085–5094
97.
Tkalcic, S., Zhao, T., Harmon, B.G., Doyle, M.P., Brown, C.A., and
Zhang, X. 2003. Fecal shedding of enterohemorrhagic Escherichia coli in
weaned calves following treatment with probiotic Escherichia coli. J Food
Prot 66(7): 1184-1189.
98.
Todd, W.T.A. 2001. Prospects for the prevention of haemolytic uraemic
syndrome. Lancet 357: 1636-1638.
99.
Unkmeir, A., and Schmidt, H. 2000. Structural analysis of phage-borne
stx genes and their flanking sequences in Shiga toxin-producing
Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1 strains. Infect Immun 68:
4856-4864.
73
Literaturverzeichnis
100.
Verweyen, H.M., Karch, H., Allerberger, F., and Zimmerhackl, L.B.
1999. Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) in pediatric hemolytic
uremic syndrome: A prospective study in Germany and Austria. Infection
27(6): 341-347.
101.
Wagner, P.L., Acheson, D.W., and Waldor, M.K. 2001. Human
neutrophils and their products induce Shiga toxin production by
enterohemorrhagic Escherichia coli. Inf Immun 69: 1934-1937.
102.
Wagner, P.L., Livny, J., Neely, M.N., Acheson, D.W., Friedman, D.I.,
and Waldor, M.K. 2001. Bacteriophage control of Shiga toxin 1
production and release by Escherichi coli. Mol Microbiol 44(4): 957-970.
103.
Wang, G., Whittam, T.S., Berg, C.M., and Berg, D.E. 1993. RAPD-PCR
is
more
sensitive
than
multilocus
enzyme
electrophoresis
for
distinguishing related bacterial strains. Nucleic Acids Res 21: 5930-5933.
104.
Werber, D., Fruth, A., Buchholz, U., Prager, R., Kramer, M. H.,
Ammon, A., and Tschäpe, H. 2003. Strong association between Shiga
toxin-producing Escherichia coli O157 and virulence genes stx2 and eae
as possible explanation for predominance of serogroup O157 in patients
with haemolytic uraemic syndrome. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 22(12):
726-730.
105.
Whittam, T.S. 1998. Evolution of Escherichia coli O157:H7 and other
Shiga toxin-producing E. coli strains. Kaper, J.B. and O’Brien, A.D. (eds.)
pp. 195-209. American Society for Microbiology, Washington DC.
106.
Wong, C.S., Jelacic, S., Habeeb, R.L., Watkins, S.L., and Tarr, P.I.
2000. The risk of the haemolytic uremic syndrome after antibiotic
treatment of Escherichia coli O157:H7 infections. N Engl J Med 342:
1930-1936.
74
Literaturverzeichnis
107.
Zhang, W.L., Bielaszewska, M., Kuczius, T., and Karch, H. 2002.
Identification, characterization, and distribution of a Shiga toxin 1 gene
variant (stx(1c)) in Escherichia coli strains isolated from humans. J Clin
Microbiol 40(4): 1441-1446.
108.
Zhang, W.L., Köhler, B., Oswald, E., Beutin, L., Karch, H., Morabito,
S., Caprioli, A., Suerbaum, S., and Schmidt, H. 2002. Genetic diversity
of intimin genes of attaching and effacing Escherichia coli strains. J Clin
Microbiol 40: 4486-4492.
109.
Zhang, X., McDaniel, A.D., Wolf, L.E., Keusch, G.T., Waldor, M.K.,
and Acheson, D.W. 2000. Quinolone antibiotics induce Shiga toxinencoding bacteriophages, toxin production, and death in mice. J Inf Dis
181: 664-670.
75