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Jahrbuch 2005/2006 | Gilmour, Darren; Knaut, Holger; Nüsslein-Volhard, Christiane | Zellw anderungen im
Embryo des Zebrafisches: W ie Zellen ihren W eg beim Aufbau von Organen finden
Zellwanderungen im Embryo des Zebrafisches: Wie Zellen ihren Weg
beim Aufbau von Organen finden
Cell migration in zebrafish: how cells find their way in building
organs
Gilmour, Darren; Knaut, Holger; Nüsslein-Volhard, Christiane
Max-Planck-Institut für Entw icklungsbiologie, Tübingen
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Die Wanderung einer Zelle im Organismus ist ein komplizierter Prozess, der von einer genau gesteuerten
Aktivität des Zytoskeletts in unterschiedlichen Regionen der Zelle bew irkt w ird. Zellw anderungen sind bei der
W irbeltier-Entw icklung von fundamentaler Bedeutung, da die dreidimensionale Struktur vieler Organe durch
gemeinsame Migration vieler Zelltypen gebildet w ird. Solche Wanderungsprozesse spielen beim Aufbau des
Nervensystems und der Blutgefäße eine große Rolle. Die gemeinsamen Wanderungen von vielen Zellen
unterschiedlicher Herkunft müssen sehr genau koordiniert sein, damit jede einzelne Zelle an den richtigen Ort
gelangt – es ist aber noch sehr w enig darüber bekannt, w ie ein Embryo diese logistische Meisterleistung
vollbringt. Embryonen des Zebrafisches Danio rerio haben viele Eigenschaften, die sie zu einem idealen
Modellorganismus machen, um dieses dynamische Zellverhalten in vivo zu untersuchen: Die EmbryonalEntw icklung verläuft außerhalb des Mutterleibs und sie läuft sehr schnell ab, denn schon innerhalb von 24
Stunden nach der Befruchtung sind die meisten Organsysteme angelegt. Fischembryonen sind außerdem
vollkommen durchsichtig - dies erlaubt, sie mithilfe von hochauflösenden Zeitraffer-Filmen im lebenden Zustand
zu beobachten und zu untersuchen.
Summary
Cell migration in organisms is a complicated process, w hich is accomplished by the finetuned activity of the
cytoskeleton in different regions of the cell. In vertebrates, cell migration plays a fundamental role as the three
dimensional structure of organs is built by the migration of many different cell types: for example during the
development of the nervous system and the blood vessels. It is obvious that these movements of cells from
different origins have to be coordinated to ensure that each cell reaches its destined place. How ever, very
little is know n about how an embryo manages this huge logistic task. Embryos of the zebrafish, Danio rerio,
harbour many characteristics making them the ideal model organism to study this dynamic cell behaviour in
vivo: The embryos develop extremly fast outside the mother organism: 24 hours post fertilisation all important
organ systems have started to form. Moreover, fish embryos are transparent, allow ing high resolution time
lapse microscopy to study and examine living animals.
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Die Wanderung der Keimzellen
Jede Zelle enthält die gesamte Erbinformation eines Tieres, aber nur die Keimbahnzellen können diese
Information an die nächste Generation w eitergeben: Sie sind die Vorläufer der Samen- und Eizellen. Schon
w ährend der frühen Entw icklung des Embryos grenzen sich w enige Zellen als Keimbahnzellen von den übrigen
(somatischen) Zellen des Körpers ab. Sie beginnen sich zu teilen und w andern dann durch den Embryo zu der
Stelle, an der sich später die Geschlechtsorgane (Gonaden) bilden. Obw ohl man durch Untersuchungen in
Fliegen, W ürmern und Mäusen bereits viele Faktoren aufgespürt hat, die bei der Bildung von Keimbahnzellen
eine Rolle spielen, w ar bisher nicht klar, w ie Keimbahnzellen ihren W eg durch den Embryo finden.
In unserem Labor w urde gemeinsam mit der Biotechnologie-Firma Exelixis Deutschland ein groß angelegtes
Mutagenese-Experiment durchgeführt. In diesem Projekt w urde nach Gendefekten gesucht, in denen die
verschiedensten Prozesse der Entw icklung betroffen sind. Eine Mutante w urde isoliert, bei der die Wanderung
der Keimbahnzellen zu den Gonaden nicht normal verläuft, sondern diese sich w ie zufällig im Embryo verteilen.
Da viele Keimbahnzellen in diesen Mutanten auf ihrem Weg zu den Gonaden verloren gehen, w urde diese
Mutante „Odysseus“ getauft (Abb. 1)[2, 3].
Die O dysse us-Muta nte : Ze bra fisch-Em bryone n, 36 Stunde n
a lt, m it e ine m Antik örpe r ge ge n da s k e im ba hnspe zifische
Va sa -P rote in a nge fä rbt. O be re s Bild: Die Ke im ze lle n ha be n
sich in de r Mitte de s Em bryos ne be n de n Som ite n ge sa m m e lt.
Unte re s Bild: In "ody" Em bryone n sind sie e inze ln übe r de n
Em bryo ve rte ilt.
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Durch einen genetischen Trick lassen sich Keimbahnzellen spezifisch mit einem grün fluoreszierenden Protein
(GFP) markieren und so in lebenden Embryonen beobachten. Kurz nach ihrer Entstehung (w ährend der
Gastrulation) lassen sich die Keimbahnzellen passiv zusammen mit anderen Zellen zur Mittellinie treiben. Von
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dort aus w andern sie als lose Gruppe aktiv entlang der Körperachse zu der Stelle, an der sich später die
Gonaden bilden w erden. In Odysseus-Embryonen hingegen können sich Keimbahnzellen zw ar noch bew egen,
w andern aber einzeln und ziellos durch den Embryo (Abb. 1). Hierfür gibt es zw ei mögliche Erklärungen:
Entw eder verhindert die Odysseus-Mutation, dass Keimbahnzellen die Wegw eiser zu den Gonaden erkennen
können, oder die Mutation macht die Wegw eiser unleserlich. In beiden Fällen w ürden die Keimbahnzellen ihre
Orientierung verlieren.
Durch Transplantation von Zellen lassen sich Embryonen herstellen, bei denen mutante Keimzellen im
normalen Embryo w andern und umgekehrt. Dies gibt dem Forscher die Möglichkeit, zw ischen den beiden
genannten Möglichkeiten zu unterschieden. Es zeigte sich, dass Odysseus-Keimbahnzellen blind für die
Wegw eiser zu den Gonaden sind. Und es stellte sich heraus, dass die Mutation in Odysseus ein
Rezeptorprotein auf der Oberfläche der Keimbahnzellen betrifft, das die w egw eisenden Moleküle w ahrnimmt.
Es handelt sich hierbei um einen bekannten Chemokin-Rezeptor mit dem Namen Cxcr4b.
Interessanterw eise
gehört
Cxcr4b
zu
einer
Gruppe
von
Rezeptoren, die
auch
bei ganz
anderen
Zellw anderungen eine Rolle spielt. So nutzen Leukozyten ähnliche Rezeptoren, um Bakterien im Körper
aufzuspüren, zu jagen und dann unschädlich zu machen. Schleimpilze w iederum sind auf diese Rezeptoren in
Hungerzeiten angew iesen, um einander zu finden und Sporen zu bilden. Und in Menschen und Mäusen spielt
Cxcr4 eine w ichtige Rolle bei der Infektion von T-Zellen durch HIV, aber auch bei der Zellw anderung von BZellen und Neuronen.
Ein w ichtiger Hinw eis zur Identifizierung desjenigen Moleküls, w elches der Cxcr4b-Rezeptor als Wegw eiser
benutzt, kam aus der immunologischen Forschung. Dort hatten Studien in Zellkultur und Mäusen gezeigt, dass
SDF-1 (stromal cell derived factor 1) der Kopplungspartner (Ligand) von Cxcr4 ist. Dies legte nahe, dass SDF-1
auch w ährend der Wanderung der Keimbahnzellen der Ligand für Cxcr4b sein könnte. Diese Vermutung w urde
bestätigt: Erstens w ird SDF-1 im Embryo entlang der Wegstrecke von w andernden Keimbahnzellen
angeschaltet und zeichnet so den Wanderw eg der Keimbahnzellen vor. Zw eitens führte eine verminderte
Menge von SDF-1 zu orientierungslosen Keimbahnzellen - ähnlich den odysseus-Keimbahnzellen, denen der
SDF-1- Rezeptor Cxcr4b
fehlt. Und
drittens
können
künstliche
Quellen
von
SDF-1
im Embryo
die
Keimbahnzellen an falsche Stellen locken und so von ihrem natürlichen Wanderw eg abbringen. Bildlich
gesprochen „sehen“ die Keimbahnzellen somit die Wegw eiser-Moleküle SDF-1 mit dem Rezeptor CXCR4b und
finden so ihren W eg durch den Embryo [3].
Das Seitenlinienorgan als Modell für koordinierte Zellbewegungen während der Organbildung
Das mechano-sensorische Seitenlinienorgan besteht aus einer Reihe von Haarzell-Organen, den so genannten
Neuromasten, die in die Haut von Fischen und Amphibien eingebettet sind und den Tieren erlauben,
Vibrationen im umgebenden Wasser zu spüren. Die Neuromasten entstehen aus einer Gruppe von ca. 100
Epithelzellen (Seitenlinien-Vorläuferzellen - auch Primordium genannt), die, ausgehend von einer Plakode
hinter der Ohranlage, entlang der gesamten Körperlänge des Fisches direkt unterhalb der Haut bis zur
Schw anzspitze w andern (Abb. 2). Diese sensorischen Organe sind mit dem Nervensystem durch den
Seitenliniennerv verbunden, der w iederum von Gliazellen ummantelt w ird. Das Seitenlinienorgan stellt damit
ein
hervorragend
geeignetes
Modellsystem
dar,
um
koordinierte
Zellw anderungen
w ährend
der
Organentw icklung zu untersuchen.
W ir haben verschiedene Methoden entw ickelt, die es erlauben, bestimmte Zellgruppen im lebenden
Fischembryo mit fluoreszierenden Farbstoffen sichtbar zu machen. Damit lässt sich die Wanderung der
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verschiedenen beteiligten Zelltypen gleichzeitig im lebenden Fischembryo durch Multicolor-Zeitraffer-Analysen
verfolgen. Dabei fanden w ir, dass alle 3 Zelltypen synchron miteinander w andern. Unsere Experimente zeigen,
dass die Gliazellen den Axonen folgen, w ährend die Axone auch ohne Gliazellen ihren Weg finden [5]. Die
Axone w iederum w erden von der w andernden Plakode mitgezogen [1, 4]. Was sind die molekularen
Grundlagen dieser Leitsignale und w ie sichern diese die koordinierte Wanderung der verschiedenen Zelltypen
des Seitenlinienorgans?
Ma rk ie rung de r wa nde rnde n Se ite nlinie n-Vorlä ufe rze lle n in
le be nde n Ze bra fisch-Em bryone n m it C la udinB-GFP (cldnBGFP ).
Da s obe re Bild ze igt e ine n cldnBGFP e x prim ie re nde n
tra nsge ne n Em bryo im Alte r von 38 Stunde n na ch
Be fruchtung. Da s m e m bra na ssozie rte cldnBGFP wird in vie le n
von de n P la k ode n a bsta m m e nde n Ge we be n e x prim ie rt, z.B.
in de r Na se und im O hr (sie he P fe ilspitze n im Kopfbe re ich).
Da s P rim ordium k a nn a ls sich be we ge nde Ze llgruppe
be oba chte t we rde n, die im m e r wie de r k le ine Ne ste r von Ze lle n
a bse tzt, we lche sich zu Ne urom a ste n e ntwick e ln we rde n (sie he
P fe ile im Körpe rbe re ich). Die unte re Aufna hm e ze igt e ine
Na ha ufna hm e de r wa nde rnde n Spitze de s P rim ordium s.
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Die Wanderung der Gliazellen im Seitenlinienorgan wird durch den ErbB-Signaltransduktionsweg
koordiniert
W ir haben gezeigt, dass die Gliazellen den Axonen folgen [1]. Im bereits erw ähnten Mutagenese-Experiment
konnten w ir eine Anzahl von Mutanten isolieren, bei denen die Glia-Vorläuferzellen nicht mit dem
Seitenliniennerv w andern können. Die Klonierung der verantw ortlichen und in den Mutanten defekten Gene
zeigte, dass diese für die Neuregulin-Rezeptoren erbB3 und erbB2 kodieren [5]. Der Neuregulin-Stoffw echsel
spielt in der Entw icklung einer Reihe menschlicher Krebsarten eine w ichtige Rolle. Inhibitoren der ErbBRezeptoren können als mögliche Krebsmedikamente eingesetzt w erden. Setzt man einen solchen Inhibitor
beim W ildtyp-Zebrafisch ein, so sieht man, dass der ErbB-Stoffw echsel benötigt w ird, um die Ko-Migration von
Glia-Vorläuferzellen mit den w egw eisenden Axonen sicher zu stellen (Abb. 3). Die beiden Rezeptoren w erden
von den Gliazellen hergestellt und befinden sich an deren Zelloberfläche. Sie reagieren auf Signale, die von
den Axonen ausgesendet w erden, und bew irken so, dass die Gliazellen stets in engstem Kontakt mit den
Axonen bleiben [5].
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Stopp de r Glia ze ll-W a nde rung durch Zuga be e ine s ErbBInhibitors. In de r Abbildung ist in le be nde n Fische m bryone n
de r Se ite nlinie nne rv in rot und da s wa nde rnde P rim ordium in
grün m a rk ie rt. Im obe re n Bild sie ht m a n e ine n unbe ha nde lte n
Em bryo, da be i um hülle n grüne Glia ze ll-Vorlä ufe r (we iße r P fe il)
fa st de n ge sa m te m Se ite nlinie nne rv (rote P fe ilspitze ). Im
m ittle re n Bild wurde de r Em bryo m it ErbB-Inhibitor be ha nde lt,
be vor die Glia -Ze lle n ge wa nde rt sind, de sha lb sind k e ine
Glia ze lle n a m Ne rv zu finde n. Im unte re n Bild wurde ErbBInhibitor zu de m Ze itpunk t zuge ge be n, be i de m die
Glia ze llwa nde rung ca . zur Hä lfe a bge la ufe n wa r (we iße
P fe ilspitze ). Da be i k om m t die Glia ze ll-W a nde rung ba ld zum
Stillsta nd (we iße r P fe il), wa s zur Folge ha t, da ss de r
Se ite nlinie nne rv nur zum Te il von Glia ze lle n um hüllt wird (rote
P fe ilspitze ).
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Das Primordium folgt dem Chemokin SDF-1 und zieht den Nerv hinter sich her.
Zu unserer Überraschung fanden w ir, dass in der oben beschriebenen Mutante „Odysseus“ [3], in der die
Keimzellen ihren Weg nicht finden, auch die Plakodenw anderung betroffen ist. Cxcr4b w urde als das
betroffene Gen identifiziert. Der Rezeptor, CXCR4b, w ird in den Plakodenzellen exprimiert. Dieser Rezeptor
erkennt, w ie schon eingangs erläutert, den so genannten „stromal derived factor 1“ (SDF-1), der in Zellen
entlang der Seitenlinie des Embryos hergestellt w ird und den w andernden Zellen so ihren Weg w eist. In
mutanten Embryonen, in denen das Gen für den CXCR4-Rezeptor defekt ist, kann das Primordium nicht
w andern. Auch die Axone w andern nicht. Um zu untersuchen, ob die Axone zu ihrer Wegfindung das gleiche
Signalsystem w ie das Primordium verw enden, w urden durch Zelltransplantationen Embryonen konstruiert, in
denen mutante Axone mit normalen Primordien konfrontiert w aren und umgekehrt. Wenn W ildtyp-Axone mit
Cxcr4b-mutanten Primordiumzellen zusammengebracht w urden, w anderten sie nicht, jedoch konnten Cxcr4mutante Axone in einem W ildtyp-Embryo ganz normal w andern. Damit konnten w ir zeigen, dass die
Wanderung des Nervs nicht direkt von CXCR4 gesteuert w ird, sondern dem Weg des Primordiums folgt. Dies
bedeutet also, dass das w andernde Primordium den Seitenliniennerv mit sich zieht. Die Wegfindung von
Nerven erfolgt demnach in diesem Falle durch die Plakode, die im Übrigen an ihrer Spitze typische
Suchbew egungen ausführt und in die das Axon eingebettet ist, sich quasi festhält (Abb. 4). Axonale
Wegfindung durch eine sie begleitende Zellgruppe w ar zw ar schon früher postuliert, ist aber hier am System
des Seitenlinienorgans des Zebrafisches zum ersten Mal w irklich gezeigt w orden [4].
Dieser neue Mechanismus („tow ing“), bei dem das w andernde Sinnesorgan-Primordium den Nerv, der es
versorgen w ird, hinter sich her zieht, bew irkt eine sichere und fehlerfreie Verbindung von Axon und Zielorgan
auch im w achsenden Organismus.
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Die Ma rk ie rung de s Se ite nlinie nne rvs m it DiD (rot) in
cldnBGFP -tra nsge ne n Ze bra fische m bryone n (grün) ze igt, da ss
de r Ne rv, im P rim ordium e inge be tte t, de n W e g finde t und
da ss da s P rim ordium vora uswa nde rnd de n wa chse nde n Ne rv
m it sich zie ht. Da s Bild link s ze igt de n Ne rv a lle in, da s Bild
re chts ze igt die Doppe lm a rk ie rung m it GFP .
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Editor)Personenerw eiterungPublikationserw eiterungTeaser
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[1] Gilmour, D. T., H. M. Maischein, and C. Nüsslein-Volhard:
Migration and function of a glial subtype in the vertebrate peripheral nervous system.
Neuron 34, 577-588 (2002).
[2] Knaut, H., H. Steinbeisser, H. Schwarz, and C. Nüsslein-Volhard:
An evolutionary conserved region in the 3' UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.
Current Biology 19, 454-466 (2002).
[3] Knaut, H., C. Werz, R. Geisler, and C. Nüsslein-Volhard:
A zebrafish homologue of the chemokine receptor Cxcr4 is a germ-cell guidance receptor.
Nature 421, 279-282 (2003).
[4] Gilmour, D., H. Knaut, H. M. Maischein, and C. Nüsslein-Volhard:
Towing of sensory axons by their migrating target cells in vivo.
Nature Neuroscience 7, 491-492 (2004).
[5] van Bebber, F.:
Neural crest mutants and the effect of glia during differentiation in the zebrafish (Danio rerio).
Dissertation, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, (2005).
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