Die Bedeutung der induzierbaren NO

Ruhr-Universität-Bochum
Prof. Dr. med. Georg Hofmockel
Dienstort: Stadtkrankenhaus Worms gGmbh
Klinik für Urologie und Kinderurologie
______________________________________________________________________
DIE BEDEUTUNG DER INDUZIERBAREN
NO-SYNTHASE ALS PROGNOSEFAKTOR BEIM
UROTHELKARZINOM DER HARNBLASE
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität-Bochum
vorgelegt von
Carsten Wach
aus Hagen
2005
Dekan:
Prof. Dr. med. Gert Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. Georg Hofmockel
Korreferent: Prof. Dr. med. Jürgen Pannek
Tag der mündlichen Prüfung: 26.01.2006
Meinen Eltern Lore und Reinhold Wach
Meiner lieben Ehefrau Nicole
1 Inhaltsverzeichnis
3
1
Inhaltsverzeichnis
1
Inhaltsverzeichnis.................................................................................................... 3
2
Einleitung ................................................................................................................ 5
2.1
Epidemiologie und Ätiologie............................................................................ 5
2.2
TNM-Klassifikation der Urothelkarzinome...................................................... 7
2.3
Therapie und Prognose des Urothelkarzinomes ............................................... 8
2.4
Nitrit-Oxide-Synthease (NOS) im Stickstoffmetabolismus ........................... 10
2.5
Problemstellung .............................................................................................. 14
3
Material und Methode ........................................................................................... 16
3.1
Material........................................................................................................... 16
3.2
Material für die Immunhistochemie ............................................................... 18
3.3
Klinische Stadieneinteilung und Histopathologie........................................... 21
3.4
Methoden ........................................................................................................ 21
3.5
Vorversuch zur Bestimmung der Antikörperkonzentration............................ 22
3.6
Antigen Retrieval............................................................................................ 23
3.7
Färbetechnik und verwendete Materialien...................................................... 24
3.8
Auswertung der Schnitte................................................................................. 26
3.9
Statistische Analyse ........................................................................................ 30
4
Ergebnisse ............................................................................................................. 31
4.1
Korrelation des Tumorstadiums mit der Prognose ......................................... 37
4.2
Korrelation des Tumorgrades mit der Prognose ............................................. 45
4.3
Korrelation der iNOS-Expression mit der Prognose ...................................... 48
5
Diskussion ............................................................................................................. 59
6
Zusammenfassung ................................................................................................. 79
7
Literatur ................................................................................................................. 81
1 Inhaltsverzeichnis
8
4
Anhang .................................................................................................................. 98
8.1
Abbildungsverzeichniss .................................................................................. 98
8.2
Tabellenverzeichnis ...................................................................................... 101
8.3
Danksagung .................................................................................................. 102
8.4
Lebenslauf..................................................................................................... 103
2 Einleitung
2
5
Einleitung
2.1 Epidemiologie und Ätiologie
Das Urothelkarzinom ist der häufigste maligne Tumor der ableitenden Harnwege,
welcher in 92-96% vom Übergangsepithel (=Transitionalzellkarzinom) ausgeht und ein
papilläres oder solides Wachstum zeigen kann.
Das Urothelkarzinom ist eine Erkrankung überwiegend im höheren Lebensalter. Der
Altersgipfel liegt zwischen dem 65. und 70. Lebensjahr. Die Geschlechtsrelation beträgt
3:1 zulasten des männlichen Geschlechtes (Wingo et al., 1995).
Das Blasenkarzinom stellt in den USA und in den meisten westeuropäischen Ländern
mit 2-3% aller Krebserkrankungen die fünfthäufigste Tumorerkrankung beim Mann
(bezogen
auf
alle
Tumorneuerkrankungen)
nach
dem
Bronchialkarzinom
Kolonkarzinom, Prostatakarzinom und Bauchspeicheldrüsenkarzinom dar. Die Inzidenz
beträgt in den westlichen Industrienationen 30 Fälle pro 100.000 Einwohner und Jahr,
wobei in epidemiologischen Studien, im Gegensatz zum Magen- und kolorektalen
Karzinom, in den letzten 50 Jahren die Inzidenz um 50% zugenommen hat. Jeder fünfte
Amerikaner, der älter als 75 Jahre alt ist, stirbt an einem Harnblasentumor (Thrasher
und Crawford, 1993).
Bereits 1895 hatte der Chirurg Rehn bei Anilinfarbarbeitern gehäuft Harnblasentumore
beobachtet (Wong und Raabe, 2000). Im Jahre 1938 konnte in einem Tierexperiment
der Nachweis erbracht werden, dass aromatische Amine einen Blasentumor induzieren
können. Die Latenzzeit zwischen Einwirkung der Noxen und Entwicklung des
Karzinoms beträgt wenigstens 20 Jahre. Aromatische Amine wirken kanzerogen,
nachdem sie in der Leber hydroxyliert und glukoronidiert werden. Anschließend werden
diese Amine dann über die N-Acetyltransferase inaktiviert. Menschen, die genetisch
bedingt schnell azetylieren (Schnellazetylierer), haben ein geringeres Risiko als
Langsamazetylierer (Lower et al., 1979).
2 Einleitung
6
Raucher haben ein vierfach höheres Risiko im Vergleich zu Nichtrauchern an einem
Blasentumor zu erkranken (Morrison et al., 1984). Das Risiko nimmt mit der Dauer
des Konsums und der Anzahl der Zigaretten zu (Augustin et al., 1988). Ein
spezifisches Karzinogen für diese Genese konnte nicht ermittelt werden. Es gilt aber als
gesichert, dass Nitrosamine und Naphtaline, die sich im Zigarettenrauch befinden,
ursächlich daran beteiligt sind.
Eine urothelkarzinogene Wirkung konnte ebenfalls für einige Pharmaka beschrieben
werden. Als klassisches Beispiel ist hier das Phenacetin, welches pharmakologisch zu
der Gruppe der Non-Steroidal Antiinflammatory-Drugs (NSAID) zählt, zu nennen. Für
Phenacetin konnte eine karzinogene Wirkung auf das Urothel nachgewiesen werden
(Castelao et al., 2000). Diese Substanz besitzt eine chemisch verwandte Struktur zu den
oben genannten Anilinderivaten (Piper et al., 1985).
Patienten, welche mit Cyclophosphamid, einem Zytostatikum, behandelt wurden, hatten
bis zur Einführung von Natrium 2-mercaptoethansulfonat (Mesna) 1 , ein etwa um den
Faktor neun erhöhtes Risiko an einem Urothelkarzinom zu erkranken (Morrison et al.,
1984). Auch hierbei spielen wieder Metabolite, wie zum Beispiel Acrolein, eine Rolle
für die Tumorentstehung (Cohen et al., 1992). Ebenso ist eine karzinogene Wirkung
für das Chlornaphazin bewiesen, welches bis 1963 als Polyzythaemie-Therapeutikum
eingesetzt wurde. Alle oben genannten Karzinogene können Urothelkarzinome beim
Menschen induzieren, wobei Intensität und Dauer ihrer Exposition positiv mit dem
Erkrankungsrisiko korrelieren (Rübben, 1998).
Nur etwa 5% der in Europa beobachteten Harnblasenkarzinome sind Adenokarzinome
und Plattenepithelkarzinome. Eine erhöhte Inzidenz für Plattenepithelkarzinome konnte
für
Patienten mit einer chronischen Zystitis, zum Beispiel als Folge eines
Dauerkatheters oder eines Blasensteines, nachgewiesen werden (Kantor et al., 1984;
Locke et al., 1985).
Weiterhin scheinen Infektionskrankheiten wie Bilharziose
maßgeblich zu der Entwicklung eines Urothelkarzinomes beizutragen. In Ägypten,
1
hierbei handelt es sich um ein so genanntes Antidot gegen Oxazaphosphorine (Cyclophosphamid),
welche die Zytotoxizität für das Urothel signifikant herabsetzen.
2 Einleitung
7
einem Hochrisikogebiet für Schistosoma haematobium, kommt das Urothelkarzinom
überdurchschnittlich häufig vor. Hier wird eine infektbedingte Nitrosaminbildung
postuliert (Tricker et al., 1989).
2.2 TNM-Klassifikation der Urothelkarzinome
Die histopathologische Klassifizierung der Tumorausbreitung richtet sich nach der
TNM-Klassifikation gemäß Union internationale contre le cancer (UICC). Diese basiert
auf der Größe und Ausdehnung des Primärtumors (T), dem Fehlen bzw. Vorhandensein
von regionären Lymphknotenmetastasen (N) und dem Fehlen oder Vorhandensein von
Fernmetastasen (M).
Der Malignitätsgrad (Differenzierungsgrad) der Tumorzellen wurde durch die
Weltgesundheitsorganisation (WHO) 1973 festgelegt. Es finden sich häufig innerhalb
eines Tumors unterschiedliche Differenzierungsgrade, wobei man sich bei der
Beurteilung an dem Befund mit der am stärksten abweichenden Zellmorphologie
orientiert. Der Differenzierungsgrad eines Tumors korreliert mit dem Tumorstadium
und der Überlebenszeit (Richie et al., 1989).
Beim Blasenkarzinom sind im Wesentlichen zunächst die Infiltrationstiefe und der
Malignitätsgrad von Bedeutung. Die Infiltrationstiefe ist entscheidend für das
therapeutische Vorgehen, wohingegen der Malignitätsgrad eine zusätzliche Information
zur Aggressivität des Tumors liefert. (Spruck et al., 1994).
2 Einleitung
8
Abbildung 1 : T-Stadien des Urothelkarzinomes (Alken und Walz, 1998)
2.3 Therapie und Prognose des Urothelkarzinomes
Bei den urothelialen Karzinomen unterscheidet man im Wesentlichen zwischen zwei
Gruppen, den oberflächlichen und den muskelinvasiven Tumoren. Diese Aufteilung ist
notwendig, da sich die oberflächlichen Tumore von den muskelinvasiven Tumoren
hinsichtlich ihrer Prognose und Therapie erheblich unterscheiden.
Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung sind etwa 60-70% der entdeckten Tumore auf die
Mukosa (pTa) und Submukosa (pT1) beschränkt und entsprechen somit einem
oberflächlichen Blasenkarzinom.
Innerhalb der Gruppe der oberflächlichen Tumore kann wiederum eine Aufteilung
vorgenommen werden, wobei sich hier drei Gruppen bilden lassen, deren Prognosen
deutlich voneinander abweichen. Diese risikoadaptierte Aufteilung der Gruppen gilt in
erster Linie für monofokale Primärtumore. Für Rezidivtumore und multifokale Tumore
wird man aggressivere Therapiestrategien vorziehen, da diese Tumore insgesamt ein
höheres Progressionsrisiko besitzen.
2 Einleitung
9
Die erste der drei genannten Gruppen wird durch die pTa G1 Tumore gebildet. Diese
hat ein sehr geringes Risiko zur Tumorprogression mit einer Überlebensrate von etwa
95%. Als Therapie reicht hier meistens eine organerhaltende transurethrale Resektion
(TUR) des Tumors aus.
Die zweite Gruppe wird durch die pTa G2 und pT1 G1/G2 Tumore gebildet. Das Risiko
der Tumorprogression ist hier mit einer Tumorüberlebensrate von ca. 80 % schon
deutlich schlechter als in der ersten Gruppe. Eine alleinige transurethrale Resektion
(TUR) reicht hier oft nicht aus und muss häufig durch eine lokale Chemo- oder
Immuntherapie ergänzt werden. Kommt es unter dieser Therapie zum Progress der
Erkrankung,
so muss ein radikalchirurgisches Vorgehen in Form einer radikalen
Zystektomie diskutiert werden.
Die dritte und somit letzte Gruppe wird durch die pT1 G3 Tumore und Carcinoma in
situ (pTis) Tumore gebildet, welche die schlechteste Prognose innerhalb der
oberflächlichen Tumore mit einer 5-Jahresüberlebensrate von etwa 60% haben.
Weiterhin wird diese Gruppe auch durch die höchste Metastasierungs- und
Progressionsrate der oberflächlichen Tumore definiert. Beim primären Auftreten eines
pT1 G3 Tumors nach erfolgter R0 Resektion in der transurethrale Resektion (TUR)
kann zunächst eine intravesikale Instillationstherapie mit BCG (Bacille-CalmetteGuerin) oder einem Zytostatikum wie zum Beispiel Mitomycin erfolgen, welche zu
einer signifikanten Reduktion der Rezidivrate führt (Shelly et al., 2000; Meyer et al.,
2002).
Bleibt dieser Versuch erfolglos, so ist eine radikale Zystektomie mit Harnableitung zu
erwägen. Es gibt aber für diese Hochrisikogruppe keinen einheitlichen Konsens für die
Therapie beim Auftreten des Primärtumores (Stöckle et al., 1986). Führt man bei diesen
Patienten rechtzeitig eine Zystektomie durch, so beträgt die 5-Jahresüberlebensrate
90%.
Wird ein isolierter pTis Tumorbefall der Harnblase nachgewiesen, so ist zunächst ein
Therapieversuch mit BCG Instillationstherapie indiziert. Bleibt dieser erfolglos, so muss
im weiterem Verlauf die Entfernung der Harnblase diskutiert werden.
2 Einleitung
10
Innerhalb der Gruppe der oberflächlichen Tumore kommt es nach transurethraler
Resektion (TUR) in etwa 60-80% der Fälle zu einem Rezidiv, wobei rund 80% dieser
Rezidive im ersten Jahr nach Diagnosestellung auftreten. Etwa 10-20% der Rezidive
gehen einher mit einer Tumorprogression. Unter Tumorprogression versteht man ein
Fortschreiten der Erkrankung in Bezug auf das Tumorstadium und das Grading
einhergehend mit einer Prognoseverschlechterung. Die Wahrscheinlichkeit, ein Rezidiv
zu erleiden, steigt mit der Anzahl der durchgemachten Rezidive. Multifokales
Wachstum, besonders in Kombination mit pTis und Entdifferenzierung, sind ungünstige
Prognoseindikatoren, da diese Karzinome vermehrt zu Rezidiven neigen und eine
höhere
Progressionswahrscheinlichkeit
besitzen.
Diese
Gruppe
geht
überdurchschnittlich häufig in ein muskelinvasives Karzinom über. Die 5Jahresüberlebensrate der oberflächlichen Blasenkarzinome insgesamt liegt etwa bei
70% (Prout et al., 1992).
Anders verhält es sich bei den muskelinvasiven Tumoren (pT2-4), bei denen
ein
radikalchirurgisches Vorgehen in Form einer radikalen Zystektomie und konsekutiver
Urinableitung indiziert ist. Die 5-Jahresüberlebensrate beträgt in den Stadien pT2 und
pT3a ohne Nachweis von Lymphknoten- oder Fernmetastasen 70% (Montie et al.,
1984; Freiha, 1988; Pagano et al., 1992). Im Tumorstadium pT3b beträgt die 5Jahresüberlebensrate nur noch 40-60% (Skinner et al., 1998). Noch schlechter ist sie
bei
Patienten
mit
Jahresüberlebensrate
Lymphknotenmetastasen.
von
unter
15%
Hierbei
ausgegangen
muss
von
werden.
einer
Liegt
5eine
Fernmetastasierung vor, so geht die Prognose in Bezug auf die 5-Jahrsüberlebensrate
gegen 0% (Lampel und Thüroff, 1998).
2.4 Nitrit-Oxide-Synthease (NOS) im Stickstoffmetabolismus
In der Vergangenheit hat es sich herausgestellt, dass die TNM-Klassifikation zur
Identifikation des individuellen Risikos eines Blasentumorpatienten für ein Rezidiv oder
einen Progress der Erkrankung unzureichend ist. Häufig kommt es bei gleichen
Tumorstadien zu völlig unterschiedlichen Krankheitsverläufen. Die Ursache für dieses
tumorbiologische Verhalten ist noch ungeklärt. Aus diesem Grunde ist es Gegenstand
2 Einleitung
11
der Forschung, TNM-unabhängige Prognosemarker zu entwickeln, mit welchen die
individuelle Prognose des erkrankten Patienten definiert werden kann. Es wurden in der
Vergangenheit Teilerfolge mit der Zulassung von NMP22 (nuclear matrix protein) 2 ,
FDP (fibrin/fibrinogen degradation product) 3 und BTA (bladder tumor antigen) 4 durch
die FDA (Food and Drug Administration) 5 erzielt, wobei diese Biomarker jedoch nur in
Teilen die Kriterien eines TNM-unabhängigen Prognoseparameters erfüllen konnten.
Mit zunehmendem Verständnis für die physiologischen Zusammenhänge und
Regelungsmechanismen von Angiogenesefaktoren, Onkogenen, Adhäsionsmolekülen,
zellzyklusregulierenden Genen und deren Genprodukten werden derzeit diese Faktoren
gerade auch im Hinblick auf die Prognose einer Tumorerkrankung untersucht. Die
bereits zugelassenen Biomarker sind bereits Produkte dieser Forschung. Ein Parameter,
welcher im Zusammenhang mit sämtlichen tumorbiologischen Prozessen genannt wird,
ist das Stickstoffmonoxid (NO). Für NO gilt als gesichert, dass es eine zentrale Rolle in
der Tumorangiogenese und deren Regulation spielt, welche für das Tumorwachstum
obligatorisch ist. Weiterhin konnten diesem Molekül zytotoxische Eigenschaften und
Aufgaben als second messenger zugeordnet werden. Aus diesem Grunde wurde in der
vorliegenden Arbeit
versucht, die Nitrit-Oxide-Synthease (NOS), also das Enzym,
welches NO produziert, als möglichen TNM-unabhängigen Marker für die individuelle
Prognose von Blasentumorpatienten zu untersuchen.
Das Enzym NOS katalysiert die Bildung von Stickstoffmonoxid aus der Aminosäure
Arginin. Hierbei wird mit Hilfe von
NOS aus L-Arginin zunächst L-Citrullin
hergestellt.
Oxidationsvorgang
Da
es
Tetrahydrobopterin,
Caldomodulin
sich
um
einen
handelt,
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat
benötigt
(Nathan
und
Xie,
1994).
Als
wird
dafür
(NADPH)
und
Produkt
dieses
Oxidationsvorganges entsteht dann Stickstoffmonoxid (NO).
Nitrit-Oxid (NO), ein lösliches, freies und gasförmiges Radikal, welches eine unpaarige
Elektronenbindung besitzt und somit ein reaktionsfreudiges Radikal ist, nimmt an der
2
Zellkernmatrixprotein
Fibrin/Fibirinogen Spaltprodukte
4
Blasentumorantigen
5
Behörde, die in den USA für die Zulassung von Medikamenten verantwortlich ist.
3
2 Einleitung
12
physiologischen Regulierung einer Vielzahl von Organsystemen teil (Nathan, 1992;
Burnett,
1995).
Besonders
erwähnenswert
ist
hier
die
Schlüsselrolle
von
Stickstoffmonoxid (NO) beim Tumorwachstum, wobei die einzelnen Stoffwechselwege
noch nicht völlig geklärt sind. Durch die kompakte Struktur des Moleküls, die
Diffusions- und chemische Reaktionsbereitschaft, konnte eine Wirkung von NO als
second messenger, als Neurotransmitter und in höheren Konzentrationen sogar als
Zytotoxin nachgewiesen werden (Tozer und Everett, 1997).
Abbildung 2: Synthese von NO durch Nitrit-Oxide-Synthease (Tozer und Everett, 1997)
Es existieren drei verschiedene Isoformen der Stickstoffmonoxidsynthease, eine
endotheliale Form (eNOS), eine Form des neuronalen Gewebes (nNOS) und die
induzierbare Form (iNOS) (Sessa, 1994). Während die endotheliale (eNOS) und
neuronale (nNOS) Isoform für die Bildung freies Kalzium und/oder Caldomodulin
benötigt, geschieht die Bildung von NO durch die induzierbare Nitrit-Oxide-Synthease
(iNOS) kalziumunabhängig im Entzündungsgewebe. Das Kalzium ist bei der
induzierbaren Form fest mit dem Enzym verankert (Ziche und Morbidelli, 2000).
Die Aktivität des Isoenzymes iNOS und dessen Stoffwechselwege werden im Tumorund im Entzündungsgewebe durch Endotoxine und/oder Zytokine induziert (Moncada,
1992). Auf der einen Seite wirkt das Produkt NO in hohen Konzentrationen zytotoxisch
und/oder zytostatisch im Tumorgewebe, auf der anderen Seite benötigen menschliche
Monozyten offensichtlich L-Arginin/NOS-abhängige Vorgänge, um Gefäßwachstum zu
2 Einleitung
13
induzieren und somit bei der Tumorprogression mitzuwirken. Es liegt somit auf der
Hand, dass iNOS eine wichtige Rolle im Tumorwachstum und Metabolismus spielt. Als
aktueller Gegenstand der Forschung wird zur Zeit der Effekt von NO auf den vascular
endothelial growth factor (VEGF), einem wichtigen Angiogenesefaktor, untersucht.
Dabei haben Ziche und Morbidelli, 2000 herausgefunden, dass NO zu einer Erhöhung
von VEGF führt, welcher für die Tumorangiogenese von herausragender Bedeutung ist
(siehe Abbildung 3).
Abbildung 3:
Dass
es
Einfluss von NO auf die Neoangiogenese im Tumorgewebe (modifiziert nach Ziche und
Morbidelli, 2000 )
zwischen
NOS-Expression
und
Tumorprogression
einen
statistisch
signifikanten Zusammenhang gibt, konnte bei ZNS-Tumoren (Cobbs et al., 1995), bei
gynäkologischen
Tumoren
wie
Ovarialkarzinom
(Thomsen
et
zum
al.,
Beispiel
1994;
dem
Thomsen
Mamma-Karzinom
et
al.,
1995),
und
beim
Nierenzellkarzinom (Jansson et al., 1998), beim Prostatakarzinom und beim
Blasentumor (Klotz et al., 1999) hinreichend belegt werden.
2 Einleitung
14
2.5 Problemstellung
In mehreren der oben genannten Studien konnte ein direkter Zusammenhang zwischen
iNOS- Expression und Tumorstadium und/oder Grading belegt werden. Deshalb wurde
in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung der induzierbaren Nitrit-Oxide-Synthease
(iNOS) als potentieller Prognosefaktor für den klinischen Verlauf hinsichtlich der
tumorspezifischen Überlebenszeit, der rezidivfreien Zeit und der progressionsfreien Zeit
beim Urothelkarzinom der Harnblase untersucht. Hierbei war es von Bedeutung, ob
beim Blasentumor die Expression von iNOS im Hinblick auf die Prognose eine
Relevanz zeigt, die im besten Falle unabhängig von Tumorstadium und Malignitätsgrad
ist.
Die Identifikation prognostischer Faktoren beim Blasenkarzinom dient dem Ziel, über
die Charakterisierung des biologischen Potentials der Erkrankung eine individuelle
Therapie zu ermöglichen. Es hat sich in der Vergangenheit gezeigt, dass konventionelle
Parameter
wie
T-Stadium,
Differenzierungsgrad,
multifokales
Auftreten,
Rezidivhäufigkeit und Zeitintervall zwischen den Rezidiven als alleinige Parameter
keine individuelle Vorhersage für den Erkrankungsverlauf des Patienten zulassen.
Hierbei kann nur von einer statistischen Wahrscheinlichkeit ausgegangen werden, mit
der zum Beispiel der Progress der Erkrankung eintritt. Das ist jedoch für den Einzelfall
meistens unzureichend. Gegenstand der aktuellen Forschung ist es daher in
zunehmendem
Maß,
Wachstumsfaktoren,
Onkogene,
Suppressorgene,
Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, Zellzyklusregulatoren
und Angiogenesefaktoren auf ihre klinische Wertigkeit als prognostische Faktoren zu
untersuchen. Ein unabhängiger Parameter könnte so zusätzlich zu der bereits bekannten
TNM-Klassifikation sowie dem Grading das individuelle Risikopotential für einen
Progress oder ein Rezidiv der Erkrankung erfassen. Die Therapie könnte dann
entsprechend risikoadaptiert erfolgen.
Mit einer präzisen individuellen Prognosestellung kann man Patienten, die ein hohes
Risiko aufweisen, ein weiteres Rezidiv und/oder einen Progress zu entwickeln, besser
identifizieren und sie gegebenenfalls rechtzeitig behandeln. Patienten mit
einem
2 Einleitung
15
geringeren biologischen Malignitätspotential könnte dann möglicherweise ein
radikalchirurgischer Eingriff, wie zum Beispiel die Zystektomie, erspart werden.
Weiterhin könnte dadurch die Früherkennung eines Rezidives verbessert werden und
die Patienten entsprechend eher und häufiger einer Nachsorgeuntersuchung unterzogen
werden.
Ebenfalls kann ein TNM-unabhängiger Marker zu einer verbesserten Patientenauswahl
bei einer adjuvanten Chemotherapie, einer mit erheblichen Nebenwirkungen behafteten
Therapieoption nach Zystektomie, führen. Wünschenswert wäre hier auch ein Marker,
der Auskunft über den Erfolg einer Chemotherapie gibt. Man hat dort schon Teilerfolge
mit dem p53-Status verbuchen können (Cote et al., 1997). In dieser prospektiven
randomisierten Studie war ein positiver Effekt der MVAC-Chemotherapie nur bei
Patienten mit verändertem p53-Status nachweisbar.
Die Anforderungen, welche an einen TNM-unabhängigen Marker gestellt werden, sind
recht hoch. Obligat ist hierbei eine hohe Spezifität und Sensivität. Eine einfache,
reproduzierbare und kostengünstige Bestimmung ist ebenfalls wünschenswert. Der
Kostenaspekt kann Ausgaben, die durch einen validen Biomarker eingespart werden
würden, wieder relativieren. Derzeit erfüllt keiner der in der Literatur untersuchten
Marker
hinreichend
die
erforderlichen
Kriterien
für
einen
unabhängigen
Prognoseparameter beim Blasenkarzinom. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die
Bedeutung
der
Expression
der
induzierbaren
Nitrit-Oxide-Synthease
im
Blasentumorgewebe als potentiellen Prognosefaktor beim Urothelkarzinom zu
überprüfen.
3 Material und Methode
3
16
Material und Methode
3.1 Material
In der vorliegenden retrospektiven Studie wurden Gewebeproben von 115 Patienten (91
Männer; 24 Frauen) mit einem Durchschnittsalter von 66 Jahren (Minimum = 33 Jahre,
Maximum = 84 Jahre) untersucht. Alle Patienten sind im Zeitraum von 1992 bis 1998
an der Urologischen Universitätsklinik am Marienhospital Herne in kurativer oder
palliativer Absicht operiert worden. Die Tumore waren in allen Blasenregionen
lokalisiert. Bei allen Patienten konnte vor dem Eingriff eine Blaseninfektion
ausgeschlossen werden.
In der abschließenden Histologie hatten 56 Patienten [48,7%] einen pTa-Tumor, 29
[25,2%] einen pT1, 22 [19,1%] einen pT2 und 8 [7 %] einen pTis-Tumor.
Patientenaufteilung nach dem Tumorstadium
60
pTa
50
pT1
pT2
40
pTis
Fälle
30
20
10
0
pTa
pT1
pT2
Tumorstadium
Abbildung 4: Patientenaufteilung nach dem Tumorstadium
pTis
3 Material und Methode
17
Die Aufteilung in Bezug auf den Malignitätsgrad für n = 107 Patienten 6 lässt sich wie
folgt beschreiben: Es hatten 36 Patienten [31,3%] einen G1-Tumor, 51 Patienten
[44,3%] einen G2-Tumor und 20 Patienten [17,4%] einen G3-Tumor.
Patientenaufteilung nach dem Grading
60
G1
G2
50
G3
40
Fälle 30
20
10
0
G1
G2
G3
Differenzierungsgrad
Abbildung 5: Patientenaufteilung nach dem Differenzierungsgrad
Das Gewebe wurde in Formalin fixiert und in dem Pathologischen Institut der RuhrUniversität Bochum in Paraffin eingebettet. Diese Paraffinblöckchen wurden mir dann
freundlicherweise von Herrn Professor Dr. Morgenroth, Direktor des Pathologischen
Institutes der Ruhr-Universität-Bochum, zur Verfügung gestellt. Die Klassifizierung der
Tumore erfolgte anhand von Hämatoxylin/Eosin-gefärbten Präparaten nach der TNMKlassifizierung durch die Mitarbeiter von Prof. Dr. Morgenroth.
6
Anmerkung: pTis Tumore wurden separat gerechnet (107 + 8 pTis entsprechen der Gesamtzahl 115
Patienten)
3 Material und Methode
18
Zur Auswertung des Krankheitsverlaufes der Patienten wurden die behandelnden
Urologen und Hausärzte angeschrieben und ihnen Fragebögen zugesandt. Die dabei
erhobenen Daten ermöglichten die Bestimmung der rezidivfreien Zeit, der Anzahl der
Rezidive und der Überlebenszeit. Die Todesursache Blasenkarzinom wurde nur
angenommen, wenn dieses ausdrücklich durch den Fragebogen vom niedergelassenen
Urologen oder Hausarzt bestätigt wurde. Patienten mit einem relevanten Zweitkarzinom
wurden nicht in die Studie aufgenommen. Weiterhin wurden diese Daten durch die
retrospektive Auswertung der stationären Krankenakten der Urologischen Klinik
ergänzt. Der Krankheitsverlauf konnte so nahezu lückenlos rekonstruiert werden.
Der Nachbeobachtungszeitraum betrug zwischen 2 und 81 Monaten – bei einem
Durchschnittswert von 62,4 Monaten. Bis März 2000 verstarben 32 [27,8%] Patienten
an ihrer Erkrankung, bei weiteren 6 [5,2%] verstorbenen Patienten stand die
Todesursache in keinem Zusammenhang mit der Grunderkrankung.
3.2 Material für die Immunhistochemie
Antikörper:
iNOS
ABR (Affinity Bio Reagents)
14818 West 6th Avenue, Suite 10A
Golden, CO 80401, USA
Biotinylated Anti Rabbit IgG
Vector-Laboratories INC
Burlingame CA, USA
3 Material und Methode
19
Puffer:
137,0 mM NaCl
PBS
2.7 mM KCl
8.1 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
pH 7,3
alle: Merck Eurolap Bochum, BRD
Citratpuffer 10mM
Citronensäure-Monohydrat
Chemikalien:
DAB
(Diaminobenzidine)-Tabletten Sigma/ Deisenhofen, BRD
PBSA
10% Albumin, Bovine Fraction Vph 7
in PBS
Sigma/Deisenhofen, BRD
H2O2 30%
Merck Eurolap Bochum, BRD
Methanol/ 1% H2O2
1% H2O2 in kaltem Methanol
ABC-Reagenz (Vectastatin)
Vector-Laboratories INC
Burlingame CA, USA
3 Material und Methode
Normal goat serum
20
Vector-Laboratories INC
Burlingame CA, USA
IgG
Sigma/Deisenhofen, BRD
NaCl
Fischer-Chemicals Nidderau, BRD
Material für die histologische Färbung und Dauerkonservierung:
Hämatoxyilin
Merck Eurolap Bochum, BRD
Histoclear
Shandon/Frankfurt a. M., BRD
Histomount
Shandon/Frankfurt a. M., BRD
Objektträger (Superfrost Plus)
Metzler-Gläser
mit Spezialbeschichtung
Deckgläser
Metzler-Gläser
Geräte:
Mikroprozessor pH-Meter 763
Siemens München, BRD
3 Material und Methode
21
Mikrowelle
NE 464/65 Panasonic 500W
Heizrührer
Heiddorf
Mikrotom
Weichert/Jung Mod. HV40
Kühlplatte
Bavimed
3.3 Klinische Stadieneinteilung und Histopathologie
Die klinische Stadieneinteilung der Tumore erfolgte unter Berücksichtigung der
gängigen Literatur nach der TNM-Klassifikation (Helpap, 1993). Die dazu benötigten
Daten
(klinisch-pathologische
pathologischer
Ausdehnung
Lymphknotenstatus:
pN)
des
Primärtumors:
wurden
den
pT,
klinisch-
postoperativen
histopathologischen Berichten entnommen. Die histopathologische Einteilung der
Präparate erfolgte im Einklang mit den Richtlinien der Weltgesundheitsorganisation
(WHO). Konform dieser Richtlinien wurden die hochdifferenzierten Karzinome als
Grad-1-Tumore, mäßig differenzierte als Grad-2-Tumore und entdifferenzierte
(anaplastische) Karzinome als Grad-3-Tumore bezeichnet. Die histopathologische
Untersuchung erfolgte im Pathologischen Institut der Ruhr-Universität-Bochum.
3.4 Methoden
Herstellung der immunhistochemisch gefärbten Schnitte
Durch immunhistochemische Färbetechniken können sehr spezifisch bestimmte
Antigene in einzelnen Zellen oder Gewebeteilen nachgewiesen werden. Hierbei wird
auf das zu untersuchende Gewebe ein spezifischer Antikörper
(1. Antikörper)
3 Material und Methode
22
aufgebracht, der mit dem zu untersuchenden
Antigen
(iNOS) reagiert. Da diese
Reaktion alleine lichtmikroskopisch nicht sichtbar ist, ist es erforderlich, dass man einen
biotinylierten Zweitantikörper (welcher sich spezifisch an den Erstantikörper bindet)
aufbringt. Dieser bildet einen Komplex mit einem Avidin markierten Enzym, wobei ein
Avidin vier Biotinmoleküle bindet. Diese Reaktion ist irreversibel und führt zur
Signalvervierfachung (siehe Abbildung 6). Das gewünschte Antigen kann nun durch
eine Peroxidasereaktion sichtbar gemacht werden.
Abbildung 6: Immunhistochemischer Nachweis von iNOS beim Urothelkarzinom
3.5 Vorversuch zur Bestimmung der Antikörperkonzentration
Um die optimale Konzentration für den Antikörper zu finden und somit ein gutes
Färbungsergebnis zu erzielen, waren mehrere Vorversuche notwendig. Hierbei wurde
der
unten
beschriebene
Versuch
mit
unterschiedlichen
primären
Antikörperkonzentrationen (1:250, 1:500, 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000)
durchgeführt und das Ergebnis unter dem Lichtmikroskop beurteilt. Hierbei zeigte sich,
3 Material und Methode
23
dass zwischen den Präparaten mit einer Antikörperverdünnung von 1:250 und 1:800
hinsichtlich der Färbung kein wesentlicher Unterschied besteht und dass die Färbung ab
einer Antikörperverdünnung von 1:1000 deutlich schlechter wird. Keine Färbung
konnte bei 1:4000 nachgewiesen werden. Alle weiteren Hauptversuche wurden deshalb
dann mit der 1:800 Konzentration fortgesetzt. Die vom Hersteller empfohlene
Konzentration beträgt 1:500.
3.6 Antigen Retrieval
Als Standard für die dauerhafte Konservierung von Gewebe hat sich die Fixierung in
Formalinlösung bewährt. Der Vorteil der Formalinfixation ist, neben der nahezu
unbegrenzten Haltbarkeit, eine gute Konservierung der funktionellen Struktur, welche
für die histologische Beurteilung wichtig ist. In den letzten Jahrzehnten hat die
Immunhistochemie enorme Fortschritte gemacht. Formalin beeinflusst leider die
Struktur des fixierten Gewebes auf molekularer Ebene, so dass es zur reversiblen
Änderung der Proteinstruktur kommt. Diese Veränderung geht einher mit einer
fehlerhaften Antikörperbindung. Es kommt deshalb häufig zur schwachen oder
fehlenden Bindung, die dann in der Konsequenz zu Fehlinterpretationen führt (Shi et
al., 1997). Als Ursache fanden Fraenkel-Conrat und Olcott heraus, dass es hierbei zu
Querverbindungen (Cross-Links) zwischen Formalin und der Proteinstruktur kommt
(Fraenkel-Conrat und Olcott, 1948). Diese Cross-Links sind jedoch unter
Temperaturen von 120 OC im alkalischen Milieu nahezu reversibel. Aufgrund dieser
Entdeckung wurde das sogenannte Antigen Retrieval entwickelt. Da das AntigenRetrieval-Verfahren nicht standardisiert ist, mussten in einer Test-battery die
verschiedenen Möglichkeiten wie Puffer, ph-Wert sowie Dauer und Temperatur der
Behandlung ausgetestet werden.
Ursächlich vermuteten Morgan und Mitarbeiter (Morgan et al., 1994), dass sich ein
Calcium-Komplex wie ein Käfig um das Antigen legt, wobei dieses dann durch
Antikörper nicht erreicht werden kann. Erst nachdem ein Calcium-Chelator, wie zum
Beispiel ein Citrat-Puffer, zugegeben und das Präparat in der Mikrowelle in diesem
3 Material und Methode
24
Puffer erhitzt wurde, konnten diese Antigene demaskiert werden. Aus diesem Grunde
wurde im Rahmen der Vorversuche eine Test-battery nach der Vorlage von Shi et al.,
1997 zum Austesten der optimalen Freilegung der Epitope erstellt. Dabei wurde jeweils
eine Serie gleicher histologischer Schnitte in einem Citrat-Puffer mit einem ph-Wert
von 2,6 und 8 bei ca. 100 0C in der Mikrowelle oder bei 90 0C im Wasserbad inkubiert.
Dabei stellte sich heraus, das die Färbung und somit das Bindeverhalten des primären
Antikörpers in einem 10 mM Citrat-Puffer über eine Inkubationszeit von 2x10 Minuten
optimiert werden konnte. Dieses wurde nun standardisiert für die weiteren Versuche
fortgeführt.
3.7 Färbetechnik und verwendete Materialien
Das in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe wurde auf dem Mikrotom
in 5 μm dünne Scheiben geschnitten, auf einen spezialbeschichteten Objektträger
(Superfrost Plus Objektträger (OT)) gezogen und anschließend bei 25 0C über 24 h bei
Raumtemperatur fixiert. Die Entparaffinierung erfolgte dann über einen Zeitraum von
2x20 Minuten in Histoclear©, wobei die Schnitte anschließend in einer absteigenden
Ethanolreihe (99%, 90%, 70%, 50%)
für je 3 Minuten und abschließender Spülung
von 2x3 Minuten in Aqua dest. rehydriert wurden. Eine Freilegung der Epitope
(Antigen Retrieval) für den primären Antikörper erfolgte in einem 10 mM Citrat-Puffer
(pH 6.0) für 2x10 Minuten in der Mikrowelle bei etwa 100 0C. Nachdem die Proben
mindestens 20 Minuten auskühlten, wurden sie 2x3 Minuten in PBS (Pufferlösung)
gespült.
Die Blockierung der endogenen Peroxidase erfolgte durch eine
zwanzigminütige Inkubation
zugesetzt
wurde.
Diese
in einer 50% Methanollösung, welcher 0,3% H2O2
Blockierung
soll
die
unspezifische
Reaktion
des
Avidinkomplexes mit der endogenen Peroxidase verhindern. Im Anschluss wurde
erneut mit PBS-Puffer gespült. Um die Bindung des Erstantikörpers an unspezifische
Epitope zu vermeiden, wurden die Schnitte für 30 Minuten mit einem 10% Anti-Bovine
Albumin (BSA-Serum) (1000 mg BSA auf 9 ml PBS) inkubiert. Diese unspezifische
Bindung, die eine Hintergrundfärbung hervorruft, kann durch spezifische Bindung des
Zweitantikörpers an das Gewebe oder auch durch elektrische Anziehung zwischen
3 Material und Methode
25
geladenen Gruppen des Antikörpers und Bestandteile des Gewebes entstehen. Es wurde,
wie auch in den folgenden Inkubationen, 450 μl Lösung pro Objektträger verwendet
und die Inkubation in wasserdampfgesättigter Atmosphäre durchgeführt. Nach der
Blockierung wurde das BSA-Serum abgekippt und ohne weitere Waschschritte der
Erstantikörper (iNOS)
im Verhältnis 1:800 (entsp. 0,86 μg/ml) auf den Schnitt
gegeben. Der Erstantikörper wurde entsprechend der oben genannten Verdünnung in
10% BSA gelöst. Alle Präparate wurden mit derselben Charge gefärbt. Gleichzeitig
wurde eine Kontrolle für denselben Tumorschnitt erstellt, die statt des Erstantikörpers
Immunoglobin G (IgG) ebenfalls im Verhältnis 1:800 (entsprechend 0,9 μg/ml) enthielt.
Im weiteren Verlauf wurde dann mit den Kontrollen verfahren wie mit den
Erstantikörperschnitten. Durch den Zusatz von Albumin konnte die Anzahl der
unspezifischen Bindungen weiter reduziert und zusätzlich die Oberflächenspannung
minimiert werden, was eine gleichmäßigere Verteilung des primären Antikörpers
gewährleistet.
Anschließend folgte die Inkubation über 12 h bei einer Temperatur von 8 0C, die mit
einer zweimaligen Spülung in PBS für 5 Minuten abgeschlossen wurde. Dieser
Waschvorgang erfolgte jeweils für die Präparate mit dem primären Antikörper und der
Kontrolle in getrennten Küvetten. Danach wurde das Gewebe mit einem sekundären
Antikörper (entsprechend 7,5 μg/ml Goat anti Rabbit) für 30 Minuten bei
Raumtemperatur (nachfolgend als RT bezeichnet) inkubiert. Nach der Entfernung des
nicht gebundenen Antikörpers durch zweimalige Spülung in PBS wurde nun das ABCReagenz (Avidin-biotinylated-peroxidase-complex) auf alle Objektträger (OT) gebracht
und bei RT für 30 Minuten inkubiert. In einem weiteren Schritt wurde erneut zweimal
mit PBS gespült. Nun erfolgte die Inkubation mit DAB (3,3 Diaminobenzidin,
Konzentration 0,5 mg/ml PBS mit 0,01 % H2O2) über 3 Minuten, wobei durch diesen
Prozess erst die Bindung des Erstantikörpers lichtmikroskopisch sichtbar gemacht
wurde. Die Präparate wurden dann zweimal in Aqua dest. gespült und die Schnitte dann
mit Hämatoxilin/Eosin (HE) gegengefärbt. Vor der endgültigen Eindeckelung mit
Histomount als Dauerpräparat für die lichtmikroskopische Auswertung wurden die
Objektträger (OT)
in einer aufsteigenden Alkoholreihe (50%, 70%, 90%, 99%)
rehydriert und für 20 Minuten in Histoclear gelegt.
3 Material und Methode
26
3.8 Auswertung der Schnitte
Das fertige zur Dauerkonservierung eingedeckelte Präparat wurde nach dem
Färbevorgang mit einen Computerscanner eingelesen, elektronisch auf DINA4
vergrößert und ausgedruckt. Dadurch konnte ein vergrößerter Umriss erstellt werden
(Positiv-Kopie).
Abbildung 7: Original Positiv-Kopie
Der Schnitt wurde dann im Mikroskop bei einer 400-fachen Vergrößerung begutachtet
und alle Tumorareale (sowohl gefärbte als auch ungefärbte) in die zuvor erstellte
Positiv-Kopie eingezeichnet. In einem zweiten Schritt wurden danach die Präparate
erneut durchgesehen und nur solche Tumorareale in die Positiv-Kopie eingezeichnet,
die eingefärbt waren. Diese wurden mit einer anderen Farbe in die Positiv-Kopie
eingezeichnet. Anschließend wurde eine durchsichtige Folie, mit Millimeterpapier, auf
die Positiv-Kopie gelegt und die gesamte Tumorfläche bestimmt und notiert. Analog
wurde mit dem eingefärbten Tumorgewebe vorgegangen.
Der Anteil des eingefärbten Tumorgewebes (in Prozent) wurde nun nach der unten
genannten Formel errechnet, wobei man als Ergebnis die eingefärbte Tumorfläche
prozentual zum Gesamttumor des Schnittes erhält.
3 Material und Methode
27
100 x Fläche des eingefärbten Tumors
X [%] =
----------------------------------------------------------------------------
Fläche des gesamten Tumors
Abbildung 8: Formel zur Berechung des prozentualen Anteils der eingefärbten Tumorfläche
Dieses Auswertungsverfahren hat mehrere Vorteile:
•
Bei der ersten Durchsicht der immunhistochemisch gefärbten Schnitte ist
aufgefallen, dass bestimmte Tumorzellareale immer gefärbt waren, was eine
gezielte Zellzählung unmöglich machte. Man hätte dann Areale erhalten, die
entweder 100% positiv oder 100% negativ gewesen wären. Um so eine
repräsentative Auswertung zu erhalten, hätte man das ganze Präparat
durchsuchen müssen, was aber mit der Positivmethode deutlich schneller und
genauer ist.
•
Die Anfertigung einer Positiv-Kopie ermöglicht eine systematische Auswertung
des ganzen Präparates.
3 Material und Methode
Abbildung 9: Immunhistochemische iNOSFärbung eines papillären
Blasentumors in 300-facher
Vergrößerung
28
Abbildung 10: Immunhistochemische iNOSFärbung eines papillären
Blasentumors in 400-facher
Vergrößerung mit zentralem
Tumorzapfen
Abbildung 11: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 200-facher
Vergrößerung
3 Material und Methode
Abbildung 12: Immunhistochemische iNOSFärbung eines papillären
Blasentumors in 400-facher
Vergrößerung
29
Abbildung 13: Immunhistochemische iNOSFärbung eines papillären
Blasentumors in 200-facher
Vergrößerung mit ungefärbtem
Tumorareal (Mitte)
Abbildung 14: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 400-facher
Vergrößerung
3 Material und Methode
30
3.9 Statistische Analyse
Die prognostische Relevanz der einzelnen Parameter wurde mit Hilfe von univariaten
statistischen Verfahren überprüft. Unter einem univariaten statistischen Verfahren
versteht man eine Überprüfung der Signifikanz eines potentiellen prognostischen
Parameters ohne die Berücksichtigung eventuell anderer vorhandener prognostischer
Parameter. Hierzu eignet sich besonders ein Verfahren, das von den zwei Biostatistikern
E. M. Kaplan und Paul Meier 1958 entwickelt wurde (Kaplan et al., 1958). Ein
weiterer Vorteil dieses Schätzverfahrens liegt in der Berücksichtigung der
Informationen aller Patienten (auch der unvollständigen Angaben) (Weiß, 2001). Ein
Nachteil dieses Verfahrens ist allerdings, dass diese Schätzung zum Ende des
Beobachtungszeitraumes ungenau wird, da zunehmend weniger Patienten für die
statistische Analyse zur Verfügung stehen. Neben dem oben genannten Kaplan-MeierVerfahren
wurden
noch
der
log-rank-Test,
auch
bekannt
als
paarweiser
Gruppenvergleich nach Cox (Cox 1972), und der Tarone-Test angewendet (Tarone
1975). Der log-rank-Test kam unter der Voraussetzung zum Einsatz, dass ein
Patientenkollektiv in Bezug auf einen potentiellen prognostischen Parameter in zwei
Gruppen unterteilt werden konnte und der unterschiedliche postoperative Verlauf dieser
zwei Gruppen untersucht werden sollte. Der Tarone-Test wird dagegen angewandt,
wenn ein Patientenkollektiv bezüglich der Ausprägung des Schweregrades eines
Parameters in mehr als zwei Gruppen unterteilt werden kann, und ein Trend in diesen
Gruppen in Bezug auf den postoperativen Verlauf untersucht werden soll. Es wird dabei
überprüft, ob die Zunahme bzw. Abnahme der Ausprägung eines Parameters mit einer
Verschlechterung bzw. Verbesserung des postoperativen Verlaufs einhergeht.
Für alle oben genannten statistischen Tests galt als Kriterium der statistischen
Signifikanz p < 0,05. Die Auswertung erfolgte unter der Zuhilfenahme von SPSS 9.0
für Windows der Firma SPSS GmbH München.
4 Ergebnisse
31
4
Ergebnisse
Um
eine
Bewertung
der
induzierbaren
Nitrit-Oxide-Synthease
(iNOS)
als
prognostischer Marker beim Urothelkarzinom vornehmen zu können, wurden insgesamt
115 Patienten analysiert. Der Krankheitsverlauf dieser Patienten wurde im Hinblick auf
die Gesamtüberlebenszeit, der tumorspezifischen Überlebenszeit, der rezidivfreien Zeit
und der Neigung zum Tumorprogress über einen Nachbeobachtungszeitraum von
durchschnittlich 62,4 Monaten (Minimum 2 Monate, Maximum 81 Monate) bezüglich
eines möglichen Zusammenhangs mit der induzierbaren Nitrit-Oxide-Synthease (iNOS)
untersucht. Die Patienten waren im Durchschnitt 66 Jahre alt, der jüngste Patient war 33
Jahre alt, der älteste Patient war 84 Jahre. Im untersuchten Zeitraum starben 27,8% der
Patienten an ihrem Tumorleiden. In weiteren rund 5% aller untersuchten Fälle konnte
die
Todesursache
der
Verstorbenen
in
keinem
Zusammenhang
mit
der
Grunderkrankung gesehen werden.
Die Gesamtüberlebenszeit wird als die Zeit von der Histologiegewinnung bis zum
Tod des Patienten definiert, und zwar unabhängig von der Todesursache. Stirbt ein
Patient beispielsweise an einem Herzinfarkt oder Autounfall, so wird das Ereignis
ebenfalls gewertet. Die mittlere Gesamtüberlebenszeit beträgt 50 Monate (Minimum 2
Monate, Maximum 81 Monate).
In Abhängigkeit vom Tumorstadium betrug die mittlere Gesamtüberlebenszeit bei
Patienten mit einem pTa-Tumor 70,8 Monate, bei einem pT1-Tumor 56,6 Monate, bei
einem pT2-Tumor 46,8 Monate und bei einem pTis-Tumor 64,5 Monate.
Die mittlere Gesamtüberlebensrate in Abhängigkeit vom Tumorgrad konnte bei einem
G1-Tumor mit 72,7 Monate, bei einem G2-Tumor mit 59,9 Monate und bei einem G3Karzinom mit 47,3 Monate ermittelt werden.
4 Ergebnisse
32
Weiterhin wurde die Gesamtüberlebenszeit bei unterschiedlichen iNOS-Expressionen
im Tumor untersucht. Hierbei wurden zunächst 4 Gruppen gebildet (Gruppe 1: 0-25 %,
Gruppe 2: 26-50%, Gruppe 3: 51-75% und Gruppe 4 76-100% iNOS-Expression). Es
wurde darauf geachtet, dass jede Gruppe etwa gleich groß war. Da die Gruppe 4 die
meisten Patienten enthielt, wurde sie nochmals unterteilt (vgl. Tabelle 1). Alle Gruppen
waren nun in Bezug auf ihre Größe vergleichbar.
Tabelle 1: Mittlere Gesamtüberlebenszeit bei unterschiedlicher iNOS-Expression
iNOS-Expression in Prozent
Gesamtüberlebenszeit in Monaten
0-25
66,0
26-50
52,0
51-75
67,4
76-90
57,1
91-100
65,2
Die mittlere Gesamtüberlebenszeit betrug in der Gruppe mit einer iNOS-Expression 025% 66,0 Monate und in der Gruppe 26-50% iNOS-Expression 52,0 Monate. Bei einer
Expression von 51-75% wurde eine Überlebensrate von 67,4 Monaten ermittelt,
wohingegen bei einer Expression von 76-90% die Überlebenszeit bei 57,1 Monaten lag.
In der letzten Gruppe (91-100% iNOS-Expression) betrug die Überlebenszeit 65,2
Monate (vgl. Tabelle 1)
Das tumorspezifische Überleben ist das Zeitintervall, welches von der Erstdiagnose
eines Tumorleidens bis zum Tod durch das Tumorleiden vergeht. Es werden somit alle
Patienten erfasst, bei welchen die Todesursache als Folge des Tumorleidens als
gesichert gilt.
4 Ergebnisse
33
Die rezidivfreie Zeit wird als Zeitraum zwischen Histologiegewinnung und Auftreten
des ersten lokalen Rezidives in der Blase gewertet. In der vorliegenden Arbeit konnte
ein Mittel von 37,2 Monaten ermittelt werden (Minimum 1 Monat, Maximum 81
Monate).
Tabelle 2: Mittlere rezidivfreie Zeit bei unterschiedlichen Tumorstadien und Differenzierungsgraden
Tumorstadium/Differenzierungsgrad
Rezidivfreie Zeit
in Monaten
pTa
50,1
pT1
50,4
pT2
44,8
pTis
37,8
G1
58,7
G2
44,1
G3
42,9
Bei Patienten mit einem pTa-Tumor konnte eine durchschnittliche rezidivfreie Zeit von
50,1 Monaten ermittelt werden, wohingegen Patienten mit einem pT1-Tumor
durchschnittlich 50,4 Monate rezidivfrei blieben. Im Tumorstadium pT2 betrug die Zeit
bis zum Auftreten des ersten Rezidives im Schnitt 44,8 Monate, in der pTis-Gruppe nur
37,8 Monate.
Bei Patienten mit einem G1-Karzinom konnte eine mittlere rezidivfreie Zeit von 58,7
Monaten errechnet werden, bei den G2-Karzinomen 44,1 Monate und bei G3Karzinomen 42,9 Monate (vgl. Tabelle 2).
4 Ergebnisse
34
Tabelle 3: Rezidivfreie Zeit bei unterschiedlichen iNOS-Konzentrationen
iNOS Expression in %
Rezidivfreie Zeit in Monaten
0-25
62,0
26-50
52,5
51-75
41,0
76-90
35,0
91-100
42,5
Die rezidivfreie Zeit für eine iNOS-Expression von 0-25% betrug 62,0 Monate, für
Patienten mit einer iNOS-Expression von 26-50% 52,5 Monate. Bei einer iNOSExpression von 51-57% konnte eine rezidivfreie Zeit von 41,0 Monaten errechnet
werden. Die kürzeste Zeit (35,0 Monate) bis zum Auftreten des ersten Rezidives wurde
in der Gruppe mit einer iNOS-Expression von 76-90% ermittelt. In der Gruppe mit
einer iNOS-Expression zwischen 91-100% betrug die rezidivfreie Zeit 42,5 Monate
(vgl. Tabelle 3)
Unter der progressionsfreien Zeit versteht man die Zeit, welche bis zum Auftreten
eines Rezidives, das mit einer
Befundverschlechterung einhergeht, verstreicht.
Diagnostiziert man bei einem Patienten beispielsweise initial einen pTa G1-Tumor und
es wird nach 6 Monaten ein Tumor pT1 G2 oder eine neu aufgetretene
Fernmetastasierung festgestellt, so bezeichnet man diesen Vorgang als Progression der
Erkrankung. Die Zeit, die inzwischen vergangen ist, ohne dass ein Progress aufgetreten
ist, wird somit als progressionsfreie Zeit bezeichnet. Sie betrug im Mittel 46,6 Monate
(Minimum 1 Monat, Maximum
81 Monate). Bei dem pTa-Stadium lag die
progressionsfreie Zeit bei 68,8 Monaten, bei dem pT1-Tumor dahingegen bei 55,1
Monaten. Die progressionsfreie Zeit betrug 46,8 Monate für das pT2-Stadium und 55
Monate für das pTis-Stadium.
4 Ergebnisse
35
Bei G1-Tumoren wurde eine progressionsfreie Zeit von 72,7 Monaten ermittelt, bei
G2-Tumoren von 58,1 Monaten. Nach durchschnittlich 44,3 Monaten kam es beim G3Karzinom zum Progress (vgl. Tabelle 4).
Tabelle 4: Progressionsfreie Zeit bei unterschiedlichen Tumorstadien und Differenzierungsgraden
Tumorstadium/Differenzierungsgrad
Progressionsfreie Zeit
in Monaten
pTa
68,8
pT1
55,1
pT2
46,8
pTis
55,0
G1
72,7
G2
58,1
G3
44,3
Betrachtet man die progressionsfreie Zeit in Abhängigkeit von unterschiedlichen iNOSKonzentrationen, so kann für die Gruppe mit einer Expression von 0-25% eine
durchschnittliche progressionsfreie Zeit von 64,8 Monaten, in der Gruppe mit einer
iNOS-Expressionsrate von 26-50% von 52,1 Monaten und bei einer Expressionsrate
von 51-75% von 62,6 Monaten nachgewiesen werden. In der Gruppe mit einer iNOSExpressionsrate von 76-90% lag die progressionsfreie Zeit bei 52,6 Monaten, in der
Gruppe mit der höchsten iNOS-Expression (91-100%) bei 63,4 Monaten (vgl. Tabelle
5).
4 Ergebnisse
36
Tabelle 5: Progressionsfreie Zeit bei unterschiedlichen iNOS-Konzentrationen
iNOS Expression in %
Progressionsfreie Zeit in Monaten
0-25
64,8
26-50
52,1
51-75
62,6
76-90
52,6
91-100
63,4
Abbildung 15 zeigt den Zusammenhang zwischen der prozentualen iNOS-Expression
im Tumorgewebe (gruppiert) und die Anzahl der Probanden innerhalb dieser Gruppen,
geordnet nach Tumorstadien.
Bei Patienten mit einem pTa-Tumor zeigte sich bei 14 Patienten eine iNOSExpressionsrate zwischen 0-25% (Gruppe I), 7 Patienten exprimierten iNOS in 26-50%
(Gruppe II) ihrer Tumorzellen, 8 Patienten dahingegen in 51-75% (Gruppe III). Bei 13
Patienten konnte eine iNOS-Expression von 76-90% (Gruppe IV) nachgewiesen
werden. In der letzten Gruppe mit einer Expressionsrate von 91-100% (Gruppe V)
konnte der Nachweis bei 14 Patienten erbracht werden.
Bei den pT1-Tumoren konnten 7 Patienten der ersten Gruppe (iNOS-Expression
zwischen 0-25%) zugeordnet werden. Die zweite Gruppe (iNOS-Expression zwischen
26-50%) wurde durch 8 Patienten gebildet. In den Gruppen III (51-75 % iNOSExpressionsrate) und Gruppe IV (76-90% iNOS-Expressionsrate) konnten jeweils 4
Patienten, in der fünften Gruppe (iNOS-Expression 91-100%) 6 Patienten zugeordnet
werden.
Es konnten 8 Patienten mit einem pT2-Tumor der ersten Gruppe (0-25% iNOSExpression), 6 Patienten der zweiten Gruppe (26-50% iNOS-Expression) und jeweils 2
Patienten der dritten bzw. vierten Gruppe (iNOS-Expression 51-75%, bzw. 76-90%)
4 Ergebnisse
37
zugeordnet werden. In der Gruppe fünf (iNOS-Expression 91-100%) waren es 6
Patienten.
In der Gruppe der pTis-Karzinome konnte in den oben genannten Gruppen I und II kein
Patient, in der Gruppe III und IV jeweils ein Patient und in der Gruppe V 6 Patienten
zugeordnet werden.
iNOS-Expression bei den einzelnen Tumorstadien
16
Anzahl der Fälle
14
12
pTa
pT1
pT2
pTis
10
8
6
4
2
0
0-25
26-50
51-75
76-90
91-100
Expression iNOS in %
Abbildung 15: iNOS-Expression bei den einzelnen Tumorstadien
4.1 Korrelation des Tumorstadiums mit der Prognose
Die kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit
für die verschiedenen Tumorstadien
wird in Abbildung 16 dargestellt. Der
Beobachtungszeitraum der 115 Patienten erstreckte sich über 81 Monate. Nach 81
Monaten lebten im Stadium pTa noch 63,7%, im Stadium pT1 noch 43,6% der
Patienten. Die schlechteste Überlebenszeit wurde im Stadium pT2 mit 14,3% ermittelt.
Im Stadium pTis lebten noch 66,6% der Patienten nach 81 Monaten.
4 Ergebnisse
38
Die Überlebenskurven zeigen einen hochsignifikanten Zusammenhang mit den
unterschiedlichen Tumorstadien (Tarone-Test, p = 0,002).
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
Tumorstadium
,8
pTis
,6
pT2
,4
pT1
,2
pTa
0,0
0
20
40
60
80
100
Gesamtüberlebenszeit (Monate)
Abbildung 16:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit für die
verschiedenen Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier Kurve (Tarone-Test,
p=0,002)
In Abbildung 17 wird die Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit gruppiert nach
verschiedenen Tumorkonstellationen dargestellt. Die Gruppierung richtet sich nach den
in Kapitel 1 erwähnten Gruppen oberflächlicher Blasentumore für ein geringes
(pTaG1), mittleres (pTa G2/3; pT1 G1/2) und hohes (pT1 G3; pTis) Progressionsrisiko.
Hinzugefügt wurde auch eine Vergleichsgruppe mit einem muskelinvasiven Tumor
(pT2 G1-G3). In der Gruppe mit einem geringen Progressionsrisiko lebten noch 71,7%
der Patienten nach 81 Monaten, wohingegen in der Gruppe mit einem
mittleren
Progressionsrisiko nur noch 43,7% im gleichen Zeitraum überlebten. In der Gruppe mit
einem hohen Progressionsrisiko (pT1 G3, pTis) überlebten 57,8% der Patienten den
4 Ergebnisse
39
oben genannten Nachbeobachtungszeitraum von 81 Monaten, bei Patienten mit einem
muskelinvasiven (pT2) Tumor überlebten nur 14,3% diesen Zeitraum. Die Kurven
zeigen hier eine hohe Signifikanz (Tarone-Test, p=0,0022).
Abbildung 17: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit für verschiedene
Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test, p= 0,0022)
Abbildung 18 zeigt den Zusammenhang zwischen verschiedenen Tumorstadien und der
tumorspezifischen Überlebenszeit. Hierbei ist, im Gegensatz zum Gesamtüberleben,
der Tod durch die Tumorerkrankung der Endpunkt. Im Stadium pTa konnte bei 69,8
% ein Überleben während des Nachbeobachtungszeitraumes von 81 Monaten
festgestellt werden, im Gegensatz zu 67,2% im Stadium pT1. Bei Patienten mit einem
pT2-Tumor wurde eine tumorspezifische Überlebenszeit von 15,0%, im Stadium pTis
von 66,6% beobachtet. Die Kurven zeigen eine hochsignifikante Differenzierung
zwischen den unterschiedlichen Tumorstadien (Tarone-Test, p=0,0011).
4 Ergebnisse
40
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
Tumorstadium
,8
pTis
,6
pT2
,4
pT1
,2
pTa
0,0
0
20
40
60
80
100
tumorspezifische Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 18: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit für
verschiedene
Tumorstadien,
dargestellt
als
Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0011)
Die Abbildung 19 zeigt die Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die
tumorspezifische Überlebenszeit für verschiedene Tumorkonstellationen. In der
Gruppe mit dem niedrigsten Progressionsrisiko der oberflächlichen Blasentumore
konnte bei einem Nachbeobachtungszeitraum von 81 Monaten ein Überleben für 71,2
% der Patienten errechnet werden. In der Gruppe mit einem mittleren Risiko sind es bei
81 Monaten Nachbeobachtungszeitraum 72,6% der untersuchten Probanden. In der
Gruppe mit dem hohen Risiko lebten dahingegen nur noch 57,8%
im gleichen
Nachbeobachtungszeitraum. Bei Patienten, bei denen ein muskelinvasiver Tumor
diagnostiziert wurde, lebten lediglich noch 15,8% der Patienten nach 81 Monaten.
Insgesamt zeigen die Kurven auch hier im Tarone-Test eine hohe Signifikanz (p=
0,0016).
4 Ergebnisse
41
1 ,2
G ru p p e n
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
p T2 G 1 /G 2
1 ,0
,8
p T1 G 3
p Tis
,6
,4
p Ta G 2 /G 3
p T1 G 1 /G 2
,2
p Ta G 1
0 ,0
0
20
40
60
80
100
tu m o r s p e zifis c h e Ü b e r le b e n s ze it ( M o n a te )
Abbildung 19:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit für
verschiedene Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test,
p= 0,0016)
Abbildung 20 zeigt den Zusammenhang zwischen den unterschiedlichen Tumorstadien
und der progressionsfreien Überlebenszeit. Bei Patienten mit einem pTa-Tumor sind
nach einem Nachbeobachtungszeitraum von 81 Monaten 70,0 %, mit einem pT1Tumor 60,0%, mit einem pT2-Tumor 15,2% sowie mit einem pTis-Tumor 52,5% ohne
Progress ihrer Erkrankung. Auch hier zeigen die Kurven einen signifikanten TaroneTest mit einem p-Wert von 0,0145.
4 Ergebnisse
42
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
Tumorstadium
,8
pTis
,6
pT2
,4
pT1
,2
pTa
0,0
0
20
40
60
80
100
progressionsfreie Überlebenszeit (Monaten)
Abbildung 20:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test, p=
0,0145)
In Abbildung 21 ist die progressionsfreie Überlebenswahrscheinlichkeit gruppiert nach
den in Kapitel 1 erwähnten Gruppen oberflächlicher Blasentumore mit geringem,
mittlerem und hohem Progressionsrisiko dargestellt. Weiterhin wurde eine Gruppe mit
muskelinvasiven Karzinomen (pT2 G1-G3) hinzugefügt. In der Gruppe mit geringem
Risiko zeigten 85,3% der Patienten nach 81 Monaten keinen Progress, wohingegen
56,2% der untersuchten Patienten mit einem mittleren Progressionsrisiko, 53,1% mit
einem hohen Progressionsrisiko und nur 15,2% mit einem muskelinvasiven Tumor
keinen Progress zeigten. Insgesamt zeigen die Überlebenskurven auch hier eine
statistische Signifikanz mit eine p-Wert von 0,0071 im Tarone-Test.
4 Ergebnisse
43
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1 ,2
G ru p p e n
p T1 G 1 /G 2
1 ,0
,8
p T1 G 3
p Tis
,6
,4
p Ta G 2 /G 3
p T1 G 1 /G 2
,2
p Ta G 1
0 ,0
0
20
40
60
80
100
p r o g r e s s io n s fr e ie Ü b e r le b e n s ze it ( M o n a te )
Abbildung 21:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0071)
Abbildung 22 zeigt die Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Zeit
für verschiedene Tumorstadien. Bei Patienten mit einem pTa-Tumor waren 45,5%, mit
einem pT1- Tumor 57,5%, mit einem pT2-Karzinom 15,2 % und mit einem pTisKarzinom 31,2 % nach 81 Monaten Nachbeobachtungszeit rezidivfrei.
Diese Kurven zeigen keine statistische Signifikanz. Der p-Wert des Tarone-Tests
beträgt 0,8211.
4 Ergebnisse
44
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
Tumorstadium
,8
pTis
,6
pT2
,4
pT1
,2
pTa
0,0
0
20
40
60
80
100
rezidivfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 22: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test, p=
0,8211).
In Abbildung 23 werden die in Kapital 1 gebildeten Gruppen oberflächlicher
Blasentumore mit geringem, mittlerem und hohem Risiko eines Progresses hinsichtlich
der rezidivfreien Zeit untersucht. In der Gruppe mit geringem Rezidivrisiko waren noch
47,1%, mit mittlerem Risiko 46,6%, mit einem hohen Progressionsrisiko 44,3% sowie
15,2 % mit muskelinfiltrierendem Karzinom im Nachbeobachtungszeitraum von 81
Monaten rezidivfrei. Die Unterschiede der Kurven zeigen auch hier keine statistische
Signifikanz im Tarone-Test. Der p-Wert beträgt 0,2043.
4 Ergebnisse
45
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1 ,2
G ru p p e n
p T2 G 1 /G 2
1 ,0
,8
p T1 G 3
p Tis
,6
,4
p Ta G 2 /3
p T1 G 1 /2
,2
p Ta G 1
0 ,0
0
20
40
60
80
100
r e zid iv fr e ie Ü b e r le b e n s ze it ( M o n a te )
Abbildung 23 Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test,
p= 0,2043).
4.2 Korrelation des Tumorgrades mit der Prognose
In Abbildung 24 wird der Zusammenhang zwischen der tumorspezifischen
Überlebenszeit und dem Differenzierungsgrad der Tumore dargestellt. Insgesamt
wurden 107 Patienten untersucht, da pTis Tumore als Sonderform herausfallen (n=8).
Nach 81 Monaten Nachbeobachtungszeit lebten noch 70,1% der Patienten mit einem
G1-Tumor, 61,2% mit einem G2-Tumor
und 43,1% mit einem G3-Tumor. Der
Malignitätsgrad stellte sich dabei als signifikanter prognostischer Parameter dar
(Tarone-Test, p=0,0020)
4 Ergebnisse
46
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
,8
Tumorgrad
,6
Grad 3
,4
Grad 2
,2
Grad 1
0,0
0
20
40
60
80
100
tumorspezifische Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 24:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit für
verschiedene Differenzierungsgrade, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (TaroneTest, p= 0,0020)
In der in Abbildung 25 wird der Zusammenhang zwischen dem Malignitätsgrad und
der progressionsfreien Überlebenszeit der Patienten dargestellt. Nach 81 Monaten
wiesen 83,8% der Patienten mit einem G1-Karzinom, 48,4% derjenigen mit einem G2Karzinom und 44,2% derjenigen mit einem G3-Karzinom keinen Progress der
Erkrankung auf.
Insgesamt stellte sich ein hochsignifikanter Zusammenhang zwischen den
unterschiedlichen Differenzierungsgraden dar (Tarone-Test, p=0,0025).
4 Ergebnisse
47
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
,8
Tumorgrad
,6
Grad 3
,4
Grad 2
,2
Grad 1
0,0
0
20
40
60
80
100
progressionsfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 25: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit für
verschiedene Differenzierungsgrade, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test,
p=0,0025)
In Abbildung 26 wird der Zusammenhang zwischen der rezidivfreien Überlebenszeit
der Patienten und verschiedenen Differenzierungsgraden dargestellt. Nach 81 Monaten
sind 46,9% der Patienten mit einem G1-Tumor, 40,3% mit einem G2-Tumor und 45,1
% mit einem G3-Tumor noch rezidivfrei. Der Differenzierungsgrad eines Tumors stellte
sich in Bezug auf die rezidivfreie Zeit als nicht signifikanter Parameter dar (TaroneTest, p=0,0870).
4 Ergebnisse
48
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
,8
Tumorgrad
,6
Grad 3
,4
Grad 2
,2
Grad 1
0,0
0
20
40
60
80
100
rezidivfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 26:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für
verschiedene Differenzierungsgrade, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (Tarone-Test,
p= 0,0870).
Zusammenfassung:
In
den
oben
genannten
Berechnungen
konnte
ein
statistisch
signifikanter
Zusammenhang zwischen Gesamtüberlebenszeit, tumorspezifischer Überlebenszeit
sowie der progressionsfreien Überlebenszeit und dem Tumorstadium wie auch dem
Malignitätsgrad nachgewiesen werden. Es ist folglich davon auszugehen, dass das
untersuchte Patientenkollektiv repräsentativ ist.
Für die rezidivfreie Zeit konnte weder in Bezug auf den Malignitätsgrad noch auf das
Tumorstadium eine statistische Korrelation nachgewiesen werden.
4.3 Korrelation der iNOS-Expression mit der Prognose
4 Ergebnisse
49
Die Expression von iNOS zeigte im Tumorgewebe ein breites Spektrum (Tabelle 6),
wobei normales Urothelgewebe keine Färbereaktion zeigte. Der errechnete Mittelwert
der Expressionsrate betrugt 58,8%.
Tabelle 6: Häufigkeit verschiedener iNOS-Expressionsraten
iNOS Expressionsrate
Häufigkeit
n=Anzahl d. Fälle
in %
0 - 25%
29
25,2
26 - 50%
21
18,3
51 - 75%
15
13,0
76- 90%
19
16,5
91 - 100%
31
27,0
Gesamt
115 Fälle
100,0 %
Dieser errechnete Mittelwert der Expressionsrate von 58,8% wurde auf 60% gerundet
und dies als Grenzwert für 2 Gruppen, deren Werte unterhalb bzw. oberhalb davon
liegen, herangezogen. Diese beiden Gruppen werden nun hinsichtlich ihrer Gesamtüberlebenszeit verglichen (vgl. Abbildung 27).
Für die Gruppe mit einer iNOS-Expression von weniger als 60% zeigte sich, dass
39,0% der Probanden innerhalb der Nachbeobachtungszeit von 81 Monaten verstarben,
im Gegensatz zu 21,0% in der Gruppe mit einer iNOS-Expression von mehr als 60%.
Die Überlebenskurven zeigen keinen signifikanten Unterschied (log-rank Test, p=
0,4416).
4 Ergebnisse
50
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,0
,8
,6
iNOS-Expression
,4
> 60%
,2
< 60%
0,0
0
20
40
60
80
100
Gesamtüberlebenszeit (Monate)
Abbildung 27:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die
Gesamtüberlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. > 60%), dargestellt als KaplanMeier-Kurve (log-rank-Test, p= 0,4416)
Abbildung 28 veranschaulicht die tumorspezifische Überlebenszeit verschiedener
iNOS- Expressionsraten. Innerhalb des Nachbeobachtungszeitraumes von 81 Monaten
wiesen 42,1% der Patienten mit einer iNOS-Expression von weniger als 60% ein
Rezidiv auf, während dies in der Gruppe über 60% Expression 63,5% waren. Es ergab
sich kein signifikanter Unterschied (log-rank Test, p=0,1613).
4 Ergebnisse
51
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
iNOS-Expression
,4
> 60%
,3
,2
< 60%
,1
0,0
0
20
40
60
80
100
tumorspezifische Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 28 Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. > 60%), dargestellt als KaplanMeier-Kurve (log-rank Test, p= 0,1613).
Die in Abbildung 29 gezeigte Überlebensfunktion verdeutlicht den Zusammenhang
zwischen der rezidivfreien Zeit der Probanden und der iNOS-Expression.
Hierbei zeigte sich in der Gruppe mit einer Expression von weniger als 60% iNOSExpression, dass 40,5% der Probanden über den Zeitraum von 81 Monaten rezidivfrei
waren. In der Vergleichsgruppe mit einer iNOS-Expression von mehr als 60% waren
dagegen nur noch 33,7% rezidivfrei. Es zeigte sich somit ein Trend für eine erhöhte
Rezidivneigung bei einer iNOS Expression > 60% (log-rank Test, p=0,0621).
4 Ergebnisse
52
1,2
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
iNOS-Expression
,4
> 60%
,3
,2
< 60%
,1
,0
0
20
40
60
80
100
rezidivfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 29: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. > 60%), dargestellt als KaplanMeier-Kurve (log-rank Test, p=0,0621)
Die in Abbildung 30 gezeigten Kurven verdeutlichen den Zusammenhang zwischen der
progressionsfreien Überlebenszeit der Patienten und der iNOS-Expression. In der ersten
Gruppe (iNOS-Expression > 60%) blieben 60,6% der untersuchten Patienten über einen
Zeitraum von 81 Monaten ohne Progress. In der Referenzgruppe (iNOS-Expression
<60%) waren dies nur 39,9%. Die Kurven zeigen insgesamt keinen signifikanten
Unterschied (log-rank Test, p=0,3141).
4 Ergebnisse
53
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,2
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
iNOS-Expression
,4
> 60%
,3
,2
< 60%
,1
,0
0
20
40
60
80
100
progressionsfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 30 Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. >60%), dargestellt als Kaplan-MeierKurve (log-rank Test, p=0,3141).
Zur weiteren Differenzierung wurden noch weitere unterschiedliche Grenzwerte von
20%, 40% und 80% iNOS-Expression eingesetzt und jeweils eine Gruppe unterhalb und
oberhalb dieses Grenzwertes gebildet. Das Vorgehen erfolgte hier analog zur oben
genannten iNOS-Expressionsrate von 60%. Diese Gruppen wurden nun hinsichtlich der
tumorspezifischen Überlebenszeit, der rezidivfreien Zeit und der progressionsfreien Zeit
miteinander verglichen. Diese Ergebnisse werden in Tabelle 7 dargestellt.
Eine signifikante Korrelation zeigt sich auch unter Verwendung anderer Grenzwerte
nicht.
4 Ergebnisse
54
Tabelle 7: Prognostische Relevanz verschiedener iNOS-Grenzwerte (log-rank Test)
iNos-Grenzwert
iNOS 20%
iNOS 40%
iNOS 80%
Progressionsfreie ÜLZ 7
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Rezidivfreie ÜLZ 7
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Tumorspez. ÜLZ 7
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Zur Identifizierung weiterer Zusammenhänge wurden die verschiedenen Tumorstadien
und Differenzierungsgrade jeweils einzeln in Bezug auf die tumorspezifische
Überlebenszeit, die rezidivfreie Zeit und die progressionsfreie Zeit untersucht. Dabei
wurde innerhalb eines jeden Tumorstadiums bzw. Differenzierungsgrades eine Gruppe
mit einer iNOS-Expression von weniger als 60% mit einer Gruppe von mehr als 60%
iNOS-Expression verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 für die verschiedenen
Tumorstadien dargestellt. Hierbei konnte nur eine prognostische Relevanz der iNOSExpression für das pTa-Stadium bezüglich des rezidivfreien Überlebens errechnet
werden. Der log-rank Test wurde hier mit p=0,014 errechnet. Für alle anderen
Tumorstadien konnte keine statistische Signifikanz nachgewiesen werden.
Tabelle 8:
Prognostische Relevanz der iNOS-Expressionsrate (< bzw. > 60%) bezüglich des
Tumorstadiums ( log-rank Test)
Tumorstadium
pTa
pT1
pT2
pTis
n.s.[ 8 ]
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[8]
Rezidivfreie ÜLZ7
p= 0,014
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Tumorspez. ÜLZ7
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Progressionsfreie ÜLZ7
7
8
ÜLZ: Überlebenszeit
n.s. : nicht signifikant
4 Ergebnisse
55
Abbildung 31 zeigt den Zusammenhang zwischen der rezidivfreien Zeit für Patienten
mit dem Tumorstadium pTa und der iNOS-Expression (n=56). In der Gruppe mit einer
iNOS-Expression von weniger als 60% blieben 75,0% der Patienten im Zeitraum von
81 Monaten rezidivfrei. In der Gruppe über 60% iNOS-Expression sind es mit 30,3%
der Patienten deutlich weniger. Die Kurven zeigen im log-rank-Test einen signifikanten
Unterschied (p= 0,0142).
1,2
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,1
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
iNOS-Expression
,4
> 60%
,3
,2
< 60%
,1
0,0
0
20
40
60
80
rezidivfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 31:
Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die
rezidivfreie Zeit für das
Tumorstadium pTa bei verschiedenen iNOS-Expressionsraten (< bzw. > 60%),
dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p= 0,0142) (n=56).
In Tabelle 9 ist die prognostische Relevanz innerhalb der verschiedenen
Differenzierungsgrade für eine iNOS-Expression von mehr bzw. weniger als 60%
angegeben. Hierbei konnte keine Signifikanz für die tumorspezifische Überlebenszeit,
die rezidivfreie Zeit und die progressionsfreie Zeit ermittelt werden.
4 Ergebnisse
Tabelle 9:
56
Prognostische Relevanz der iNOS-Expressionsrate (< bzw. > 60%) bezüglich des
Differenzierungsgrades (log-rank Test)
Malignitätsgrad
G1
G2
G3
Progressionsfreie ÜLZ[]
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Rezidivfreie ÜLZ[]
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[].
Tumorspez. ÜLZ[]
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
In Tabelle 10 wird der Zusammenhang zwischen der tumorspezifischen Überlebenszeit,
der rezidivfreien Zeit sowie der progressionsfreien Zeit und der iNOS-Expression
dargestellt, und zwar gruppiert nach verschiedenen Tumorkonstellationen mit einem
geringen, mittleren und hohen Progressrisiko (vgl. Seite 38-39, Abbildung 17).
Innerhalb einer jeden Gruppe wurde wiederum eine Aufteilung hinsichtlich der iNOSExpressionrate größer oder kleiner 60% vorgenommen. Hierbei konnte kein
signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen ermittelt werden. Lediglich
bei der rezidivfreien Zeit innerhalb der Gruppe mit niedrigem Progressionsrisiko (pTa
G1) konnte ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
4 Ergebnisse
Tabelle 10:
57
Überlebenswahrscheinlichkeit
für
verschiedene
Tumorkonstellationen
mit
unterschiedlichem Progressionsrisiko in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit,
die rezidivfreie Zeit und die progressionsfreie Zeit für eine iNOS-Expressionsrate von <
bzw. > 60% (log-rank Test), *=statistisch signifikant.
Progressionsrisiko
Tumor-
tumorspezifische
rezidivfreie
progressionsfreie
Konstellation
Überlebenszeit
Zeit
Überlebenszeit
p-Werte log-rank
p-Werte log-rank
p-Werte log-rank
Niedrig
pTa G1
n.s.[]
0,0142*
n.s.[]
Mittel
pTa G2/3
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[ ]
pT1 G1/2
Hoch
pT1 G3
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Muskelinvasiv
pT2 G1-G3
n.s.[]
n.s.[]
n.s.[]
Tabelle 11 gibt den Zusammenhang zwischen verschiedenen Gruppen von
Differenzierungsgraden und der iNOS-Expression wieder, und zwar in Bezug auf das
tumorspezifische Überleben, die rezidivfreie Zeit und die progressionsfreie Zeit. Hierbei
zeigte sich in der Gruppe der wenig bis mittel differenzierten Karzinome (G1 und G2)
(n=87) ein Trend für eine erhöhte Rezidivneigung bei Karzinomen mit weniger als 60%
iNOS-Expression (Rezidivhäufigkeit 53,2% versus 32,5%) (vgl. Abbildung 32).
4 Ergebnisse
Tabelle 11:
58
Überlebenswahrscheinlichkeit für verschiedene Gruppen von Differenzierungsgraden in
Bezug
auf die tumorspezifische Überlebenszeit, die rezidivfreie Zeit und die
progressionsfreie Überlebenszeit für eine iNOS-Expressionsrate von < bzw. > 60 %
(log-rank-Test), **=möglicher Trend.
Gruppe von
tumorspezifische
Differenzierungs-
Überlebenszeit
rezidivfreie Zeit
progressionsfreie
graden
p-Werte log-rank
G1+G2
(n=87)
n.s.[8]
0,0562**
n.s .[8]
G3
(n=20)
n.s.[8]
n.s.[8]
n.s. [8]
Überlebenszeit
p-Werte log-rank
p-Werte log-rank
1,2
kumulierte Überlebenswahrscheinlichkeit
1,1
1,0
,9
,8
,7
iNOS-Expression
,6
> 60%
,5
,4
< 60%
,3
0
20
40
60
80
100
rezidivfreie Überlebenszeit (Monate)
Abbildung 32: Überlebenswahrscheinlichtweit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für die
Gruppe der Differenzierungsgrade G1 und G2 bei verschiedenen Expressionsraten (<
bzw. > 60%), dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p= 0,0562).
5 Diskussion
5
59
Diskussion
Bei der Nitrit-Oxide-Synthease (im Folgenden als NOS bezeichnet) handelt es sich um
ein Enzym, welches aus der Aminosäure L-Arginin über einen Oxidationsvorgang
Stickstoffmonoxid (NO) und L-Citrullin katalysiert.
Hierbei werden NADPH (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate), Calmodulin,
Tetrahydroboterin und Sauerstoff (O2) benötigt (Nathan, 1992; Nathan und Xie, 1994;
Tozer und Everett, 1997). Für dieses Enzym konnten drei verschiedene Isoformen
nachgewiesen werden (Sessa, 1994), welche sich in ihrem Metabolismus und
Vorkommen im Gewebe erheblich unterscheiden. Bei der endothelialen Form (eNOS),
lokalisiert auf Chromosom 7, und der neuronalen Form
(nNOS), lokalisiert auf
Chromosom 12, wird für den Oxidationsprozess Calcium und Calmodulin benötigt
(Sessa, 1994). Das Fehlen dieser beiden Substanzen wirkt als limitierender Faktor für
die Produktion von NO. Bei der induzierbaren Form (iNOS) dagegen, lokalisiert auf
Chromosom 17, wird Calcium und Calmodulin locker gebunden. Die NO-Produktion ist
somit unabhängig von diesen beiden Faktoren (Nathan und Xie, 1994).
Dem Produkt Stickstoffmonoxid aus diesem Oxidationsprozess kommt eine ganz
besondere Bedeutung zu. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um ein freies
gasförmiges Radikal mit einer freien Elektronenbindung. Dadurch ist dieses Molekül
sehr reaktionsfreudig und somit bestrebt, möglichst schnell eine Verbindung mit
anderen Molekülen einzugehen. Weiterhin besitzt dieses Molekül eine sehr geringe
Halbwertzeit und somit eine kurze biologische Verfügbarkeit. Zu erwähnen ist hier auch
noch eine hohe Diffusionsbereitschaft, welche durch die kompakte Bauart des Moleküls
bedingt ist. Genau diese drei Eigenschaften (geringe Halbwertzeit, kurze biologische
Verfügbarkeit
und
Reaktionsfreudigkeit)
machen
dieses
Molekül
zu
einem
ausgezeichneten second-messenger und Neurotransmitter (Tozer und Everett, 1997;
Tozer und Everett, 1997; Ziche und Morbidelli, 2000).
Die Funktion von Stickstoffmonoxid ist recht vielfältig Es konnten in hoher
Konzentration zytotoxische Eigenschaften nachgewiesen werden (Esumi und
5 Diskussion
60
Tannenbaum, 1994). Lejeune et al. konnten den Nachweis erbringen, dass NO eine
Rolle in der Tumor induzierten Immunsupprimierung (Lejeune et al., 1994) spielt. Sie
nahmen dabei einen durch
NO vermittelten antiproliverativen Effekt auf T-
Lymphozyten an. Jenkins et al. gehen von einer durch NO vermittelten
konzentrationsabhängigen pro- und anti-Tumor-Aktivität aus, wobei NO offensichtlich
an einer Signalkaskade für die Gefäßneubildung teilnimmt (Jenkins et al., 1995). Ziche
und Morbidelli konnten für NO nachweisen, dass es die Funktion
eines
Hauptmediators innerhalb der Tumorangiogenese übernimmt, welcher wichtige
Schlüsselstellen, wie die Expression der zwei wichtigen Gefäßmediatoren vascular
endothelial cell growth factor (VEGF) und fibroblast growth factor (FGF) kontrolliert
(Ziche und Morbidelli, 2000).
Mehrere Studien haben gezeigt, dass NO-abhängige Vorgänge in bestimmten Tumoren
im Vergleich zum Normalgewebe heraufgeregelt werden. Das Wachstum solider
Tumore wird im wesentlichen durch die Interaktion zwischen gefäßbildenden Zellen
wie Endothelzellen (Fukumura und Jain, 1998; Ziche und Morbidelli, 2000), glatten
Gefäßmuskelzellen, Makrophagen (Nathan und Xie, 1994) und natürlich den
Tumorzellen selbst bestimmt (Thomsen et al., 1994). In allen dieser Zellen konnte eine
pathologische endogene Produktion von NOS-Isoformen im Vergleich zum gesunden
Referenzgewebe nachgewiesen werden.
Eine Expression unter der Nachweisgrenze im Tumorgewebe konnte für iNOS
(Kalzium unabhängig) durch Thomsen et al. für gynäkologische Tumore (Ovar und
Uteruskarzinom) festgestellt werden. Für eNOS und nNOS wurde hingegen eine hohe
Aktivität im schlecht differenzierten Tumorgewebe gezeigt. Im tumorfreien Gewebe
konnte dagegen kein eNOS und nNOS nachgewiesen werden. Da der iNOS-Nachweis
nicht gelang, lag der Schluss nahe, dass vor allem Kalzium abhängige NOS Formen wie
eNOS und nNOS in diesem Tumorgewebe exprimiert werden (Thomsen et al., 1994).
iNOS und eNOS konnten in gesunden Darmepithelzellen durch Immunhistochemie
nachgewiesen werden, wohingegen in Darmtumorzellen kein iNOS nachgewiesen
werden konnte. Die Expression von eNOS wurde in Tumorzellen in 66% der Fälle
deutlich reduziert und in 34% nicht nachgewiesen. Der verwendete Antikörper war
derselbe, wie er in der vorliegenden Arbeit benutzt wurde (Moochhala et al., 1996).
5 Diskussion
61
Jansson et al., 1998 konnten durch eine Aktivitätsbestimmung der NOS-Isoenzyme in
Nierenzellkarzinomzelllinien (HN4 und HN51) und kultivierten menschlichen
proximalen Tubuluszellen feststellen, dass sowohl Nierentumorgewebe als auch
gesundes Nierengewebe Kalzium-abhängige NOS-Isoformen wie eNOS und nNOS
exprimieren. Die höchste Aktivität bei den Nierentumoren konnte bei G1-Karzinomen
gemessen werden, die geringste Aktivität bei G3-Karzinomen. Es wurde somit eine
inverse Korrelation zwischen NOS-Aktivität und Differenzierungsgrad ermittelt. Die
calcium-unabhängige NOS-Isoform (iNOS) zeigte sowohl beim Nierenzellkarzinom, als
auch im gesunden Referenzgewebe keine Enzymaktivität (Jansson et al., 1998).
Stimulierte man kultivierte menschliche proximale Tubuluszellen mit Zytokinen, so
konnte eine deutliche Erhöhung der Expression sowohl der kalzium-unabhängigen, als
auch der kalzium-abhängigen NOS-Isoenzyme festgestellt werden.
Ein immunhistochemischer Nachweis von iNOS im Prostatakarzinomgewebe konnte
durch Klotz et al. erbracht werden. Diese Autoren zeigten, dass sich Tumorepithelzellen
anfärbten. Gesundes Prostatagewebe färbte sich hingegen nicht an. Es konnte jedoch
kein Zusammenhang zwischen Differenzierungsgrad und iNOS-Expression gezeigt
werden (Klotz et al., 1998).
Für das Urothelkarzinom der Harnblase konnten Klotz et al., 1999 an 18 Patienten
belegen, dass Blasentumorepithelzellen sich in der Immunhistochemie mit einem iNOSAntikörper stark positiv färbten. Die tumorfreien Regionen zeigten dagegen eine sehr
schwache Färbung. Für eNOS und nNOS konnte keine Färbung in Tumorepithelien
gefunden
werden.
Hinsichtlich
einer
Korrelation
zum
Tumorstadium
oder
Differenzierungsgrad sahen Klotz et al. keinen Zusammenhang (Klotz et al., 1999).
Swana et al. konnten bei 18 Patienten nachweisen, dass iNOS sich sowohl im
Blasentumorgewebe, als auch in den umgebenden Entzündungszellen befand.
Tumorfreies Blasengewebe zeigte jedoch keine Färbung (Swana et al., 1999). Ganz im
Gegensatz zu Thomsen und Mitarbeitern (Thomsen et al., 1994; Thomsen et al., 1995)
konnten diese Autoren keine Korrelation zwischen iNOS-Biosynthese und Tumorgrad
nachweisen.
Wolf et al. konnten bei 100 Patienten den iNOS-Nachweis im Blasentumorgewebe
erbringen, wobei im tumorfreien Gewebe kein iNOS nachgewiesen werden konnte.
5 Diskussion
62
Diese Arbeitsgruppe verwendete denselben Antikörper wie in der vorliegenden Arbeit.
Es färbten sich vorwiegend die Epithelschichten, insbesondere der papillären
Tumoranteile. Weiterhin konnte man auch hier keine Korrelation zum Tumorstadium
oder Grading finden (Wolf et al., 2000).
Wie die Darstellung der Ergebnisse in der Literatur zeigt, weist das Verhalten der
iNOS-Expression im Tumorgewebe
ein breit gefächertes, teilweise sogar
widersprüchliches Bild auf. Das Expressionsverhalten von iNOS scheint für jedes
Organ sowohl in Bezug auf benignes Gewebe als auch auf Tumore spezifisch zu sein.
In der vorliegenden Studie zeigten alle Präparate eine iNOS-Färbung mit einer
Streubreite von 0%-100% bei einem Mittelwert von 58,8%. Wie auch in den oben
genannten Arbeiten von Jannson et al., 1998; Swana et al., 1999; Klotz et al., 1999
und Wolf et al., 2000 konnte keine Korrelation der iNOS-Expression zum
Tumorstadium oder zum Grading nachgewiesen werden. In der immunhistochemischen
Färbung stellte sich ein recht inhomogenes Bild mit zum Teil schwach bis ungefärbten
Tumorarealen dar (vgl. Abbildung 13), wobei auch gefärbte Tumorinseln im ansonsten
ungefärbten Tumorgewebe vorkamen (vgl. Abbildung 10). Besonders bei papillären,
gut differenzierten Tumoren konnte eine starke Färbung des Epithels nachgewiesen
werden, wobei sie in anderen Bereichen desselben Präparates völlig fehlen oder
schwach ausgeprägt sein konnte (vgl. Abbildung 12). Die Färbung als solche stellte sich
als homogen bis granulär dar.
Vergleicht man nun die Arbeiten von Swana et al., 1999; Klotz et al., 1999 und Wolf
et al., 2000 mit der vorliegenden Arbeit, so zeigt sich ein konkordantes Färbeverhalten.
In allen Arbeiten färbten sich nur die Tumorareale, die tumorfreien Areale blieben
ungefärbt. Alle Arbeiten beschreiben außerdem eine starke Anfärbung des
Tumorepithels, was auch durch die vorliegende Arbeit bestätigt wurde. Weiterhin
konnte in keiner der oben genannten Arbeiten, einschließlich der vorliegenden Arbeit,
eine Korrelation von iNOS-Expression und Tumorstadium bzw. Differenzierungsgrad
nachgewiesen werden (Klotz et al., 1999; Swana et al., 1999; Wolf et al., 2000). Alle
diese Argumente sprechen für die Theorie der organspezifischen Expression von iNOS.
Bisher gibt es zahlreiche Arbeiten, die sich, wenn auch im Rahmen kleiner Fallzahlen,
mit Metabolismus und Ausprägung von iNOS im Tumorgewebe beschäftigen. Es gibt
5 Diskussion
63
jedoch keine einzige Untersuchung, welche sich speziell mit der iNOS-Isoform als
prognostischem Parameter beim Urothelkarzinom der Harnblase auseinandersetzt.
Thomsen et al., 1994 konnten beim Mamma-Karzinom und bei gynäkologischem
Tumorgewebe, wenn auch mit kleinen Fallzahlen, belegen, dass zwischen der NOSExpression kalziumunabhängiger Isoformen und dem Tumordifferenzierungsgrad eine
inverse Korrelation besteht. Ekmekcioglu et al. konnten für das metastasierte maligne
Melanom nachweisen, dass in der Gruppe mit einer iNOS-Expression eine deutlich
schlechtere Prognose hinsichtlich des tumorspezifischen Überlebens besteht als in der
Vergleichsgruppe ohne iNOS-Expression (Ekmekcioglu et al., 2000). Die vorliegende
Arbeit beschäftigt sich mit der Frage nach iNOS als möglichen TNM- unabhängigen
Prognoseparameter für das Harnblasenkarzinom.
Etwa 80% der Urothelkarzinome der Harnblase werden in einem frühen Tumorstadium
entdeckt (pTa, pT1). Nach einer kompletten transurethralen Resektion eines
oberflächlichen Blasentumores entwickeln etwa 60-80% der Patienten ein Rezidiv,
wobei 80% der Rezidive innerhalb eines
Jahres auftreten. Etwa 20% dieser
Tumorrezidive entwickeln einen Tumorprogress, dass heißt, sie gehen in ein invasives
Blasenkarzinom über. Diese Patienten würden somit von einer frühzeitigen
Identifikation und anschließender aggressiver Therapie profitieren. Die mittlere
Überlebenszeit bei T4-Tumoren oder im metastasierten Stadium beträgt 6 Monate.
Die TNM-Klassifikation, der Differenzierungsgrad (Heney et al., 1983), die
Infiltrationstiefe (Dalesio et al., 1983), eine Lymphknotenmetastasierung (Anderstrom
et al., 1980), ein papilläres oder solides Tumorwachstum, Multifokalität (Fitzpatrick et
al., 1986), häufige Rezidive und vor allem ein Carcinoma in situ (Althausen et al.,
1976) haben sich beim Harnblasenkarzinom hinsichtlich der Prognose als wichtige
Parameter etabliert. Leider hat sich herausgestellt, dass es bei Patienten mit dem
gleichen histologischen Ergebnis häufig zu völlig unterschiedlichen Verläufen kommt.
Ein individuelles Risikomanagement ist bis zum heutigen Tag nicht möglich.
Mehrere Autoren haben versucht nach der ersten elektronenmikoskopischen Darstellung
der muscularis mucosa 1983 (Dixon und Gosling, 1983), den Grad der Invasion dieser
Schicht als Marker für die Aggressivität eines Tumors zu verwenden. Hierbei wurde die
muscularis mucosa in drei Untergruppen entsprechend der Eindringtiefe des Tumors
5 Diskussion
64
(pT1a, pT1b, pT1c) unterteilt In 6% der Fälle mit einem pT1a-Tumor konnten (Smits et
al., 1998) einen Progress der Erkrankung nachweisen, bei dem Stadium pT1b war bei
33% ein Progress zu verzeichnen, im Stadium pT1c waren es immerhin schon 55%. Die
Prognose des Patienten verschlechterte sich mit der Eindringtiefe des Tumors (Angulo
et al., 1995).
Der Goldstandard der Therapie des oberflächlichen Blasentumors ist zur Zeit die
transurethrale Resektion (TUR) des Tumors und, je nach histologischem Befund, eine
lokale Chemotherapie. Allerdings berücksichtigt dieses Vorgehen nur zum Teil die
unterschiedliche Prognose bei den einzelnen Tumorkonstellationen. Ein pTa-Tumor
weist ein wenig aggressives Progressionsverhalten auf, während Tumorkonstellationen
wie pT1 G3 oder pTis durch ein teilweise sehr ausgeprägtes, kaum kalkulierbares
Progressionsverhalten charakterisiert werden (Herr, 1997). Eine exakte Einteilung des
histopathologischen Stadiums ist zwar obligat für die weitere Therapieplanung, aber
die Materialgewinnung
im Rahmen einer TUR ist eine nicht selten mit Fehlern
behaftete Methode. Wird zum Beispiel ein pTa-Tumor reseziert und es verbleibt noch
ein pTis-Tumor, welcher zystoskopisch schwierig zu diagnostizieren ist, so wird unter
Umständen für den Patienten der falsche Therapieansatz gewählt. Man schätzt, dass
etwa 34% des durch TUR-Blase gewonnenen histologischen Materials nicht mit dem
histopathologischen Befund im Zystektomiepräparat übereinstimmt. Hierbei besteht die
Gefahr des Understaging bei höheren Tumorstadien wie pT2-pT4 und das Risiko des
Overstaging bei Tumorstadien wie pT1-pT2 (Sanchez-Chapado et al., 1995).
Das biologische Potential eines Tumors hinsichtlich der Progression und der
Rezidivwahrscheinlichkeit lässt sich nicht nur durch das Tumorstadium, sondern auch
durch den Differenzierungsgrad eines Tumors abschätzen. Insgesamt nimmt das
Progressionsrisiko und das Rezidivrisiko von den niedrigen Differenzierungsgraden
(G1) zu den höheren Differenzierungsgraden (G3) zu (de Vere White und Stapp,
1998).
Tumorstadium und Differenzierungsgrad haben sich in der Praxis hinsichtlich der
prognostischen Aussagekraft etabliert. Trotzdem kommt es bei gleichem Tumorstadium
und Differenzierungsgrad zu unterschiedlichen Krankheitsverläufen. Man kann heute
anhand einer Sammelstatistik nur sagen, wieviel Prozent einer Population ein Rezidiv
5 Diskussion
65
oder einen Progress der Erkrankung erleiden. Eine individuelle Aussage, ob der
betreffende Patient zu dieser Risikogruppe gehört oder nicht, ist jedoch bis jetzt nicht
möglich.
Wünschenswert
ist
hier
ein
Parameter,
welcher
eine
eindeutige
Entscheidungsmöglichkeit bietet (Risiko ja/nein) und gleichzeitig TNM-unabhängig ist.
Mit der raschen Entwicklung der Molekularbiologie haben in den letzten 10 Jahren die
Möglichkeiten
der
Untersuchung
einer Vielzahl molekularer Faktoren stark
zugenommen. Zur Zeit sind bereits in den USA drei Marker zum Patientenmonitoring
von Blasentumorpatienten durch die Food und Drug Administration (FDA) zugelassen.
Einer dieser Parameter, der Marker NMP-22 (nuclear matrix protein), besitzt sogar die
Zulassung zum Patientenscreening (Burchardt et al., 2000).
NMP-22 ist ein organspezifischer Antikörper, welcher spezifisch an die nukleare Matrix
bindet. Als Nachweismaterial wird hier Urin benötigt. Carpinito et al. konnten bei 667
Patienten nachweisen, dass die Konzentration von NMP-22 bei Patienten mit einem
Blasentumor signifikant höher ist als bei einer gesunden Vergleichsgruppe (Carpinito
et al., 1996). NMP-22 ist zur Zeit mit einer Sensitivität zwischen 68-100% und einer
Spezifität zwischen 61-85% (Zippe et al., 1999) einer der Marker, welcher den
Testkriterien (hohe Spezifität und Sensitivität) recht nahe kommt. Allerdings können
recht häufig
falsch positive Ergebnisse bei Urolithiasis (50%) und BPH (15%)
nachgewiesen werden.
Ein weiterer von der FDA zugelassener Test ist der fibrin/fibrinogen degradation
product–Test (FDP). Es handelt sich hierbei
um einen Urin-Stix-Test mit einer
Sensitivität von 82% und einer Spezifität von 86-96%, bei dem Fibrin/Fibrinogen
Spaltprodukte im Urin nachgewiesen werden, welche bei Blasentumorpatienten
vermehrt auftreten (Schmetter et al., 1997). Der Hersteller hat dieses Produkt wieder
vom Markt genommen, da die Antikörper eine gewisse Instabilität zeigen und somit die
Messergebnisse verfälschen.
Bei dem Bladder-Tumor-Antigen (BTA) handelt es sich um ein membranständiges
Antigen, welches unter der Zuhilfenahme eines Latexagglutinationstestes im Urin
nachgewiesen werden kann. Dieses membranständige Antigen wird nur durch
Blasentumore gebildet und korreliert gut mit Tumorstadium und Differenzierungsgrad
(Conn et al., 1987). Dieser Test erfüllt mit einer Spezifität von 72-95% und einer
5 Diskussion
66
Sensitivität 54-83% die Testkriterien jedoch nur mittelmäßig. Aus diesem Grunde ist
bereits ein modifizierter BTA-Test (BTA-Trak) auf den Markt gekommen, welcher eine
höhere Sensitivität und Sensibilität aufweisen soll.
Diesen drei (NMP-22, FDP, BTA) von der FDA zugelassenen Tests ist aufgrund einer
verhältnismäßig schlechten Sensibilität und Spezifität sowie Problemen bei der
Antiköperkonstanz ein Durchbruch in der urologischen Routine noch nicht gelungen.
Allerdings kann die Sensivität und Spezifität deutlich durch eine Kombination mit
einem anderen diagnostischen Verfahren, zum Beispiel mit der Urinzytologie,
verbessert werden. Trotzdem kann die individuelle Einschätzung der Rezidiv- und
Progressionswahrscheinlichkeit eines Blasentumorpatienten durch die zur Zeit
bekannten Tests nur unzureichend vorgenommen werden. Aus diesem Grunde sind
weitere Biomarker Gegenstand der aktuellen Forschung.
Die beiden ältesten Marker dieser Art und bislang schon recht gut untersuchten
Antikörper sind Ki-67 und Proliferation-cell-nuclear-antigen (PCNA). Es handelt sich
hierbei um zwei Antikörper, die mit jeweils einem Antigen in Zusammenhang mit der
Zellproliferation reagieren (Gerdes et al., 1983). In mehreren Studien korreliert eine
vermehrte Expression von Ki-67
mit höherem Tumorstadium, schlechterer
Differenzierung, höhere Rezidivrate und Progressionsrate beim Blasenkarzinom (Bush
et al., 1991; Fontana et al., 1992). Ein Problem für diesen Marker ist noch die fehlende
Standardisierung des Analyseverfahrens, welches jedoch obligatorisch für eine klinische
Anwendung ist.
Für PCNA zeigt sich zwar eine enge Korrelation mit invasiven und entdifferenzierten
Blasentumoren (Chen et al., 1997). Hierbei fehlt jedoch der Nachweis als unabhängiger
prognostischer Marker.
Die Gruppe der Onkogene ist eine weitere große Gruppe, denen eine karzinogene
Eigenschaft zugeschrieben wird. Es handelt sich dabei um Retroviren, die in der Lage
sind, in Menschen und Tieren (Säugetiere, Vögel und andere Wirbeltiere) Tumore zu
induzieren oder kultivierte Zellen neoplastisch zu transformieren (Brandau und Böhle,
2000). Protoonkogene kodieren die für die Zellteilung notwendigen Proteine,
5 Diskussion
67
Rezeptoren und Wachstumsfaktoren, wobei die Zelle immer auf einen Cocktail aus
verschiedenen
miteinander
kommunizierenden
Wachstumsfaktoren
und
Protoonkogenen angewiesen ist. Kommt es nun zum Beispiel durch die oben genannten
Karzinogene zur Mutation der für diese Wachstumsfaktoren oder Proteine zuständigen
Protoonkogene, so nennt man sie Onkogene.
Mit dem Urothelkarzinom assoziiert sind vor allem Onkogene der c-erb-B2, c-ras, cmyc, mdm2 und c-jun-Gruppe.
Für das Onkogen c-erb-B2 (Her-2/neu), ein transmembranöses Glycoprotein mit
struktureller Ähnlichkeit zum endothelial growth factor Rezeptor (EGF-Rezeptor), gibt
es widersprüchliche Aussagen. Es gibt Autoren, welche eine Korrelation zu höheren
Differenzierungsgraden (Gorgoulis et al., 1995) und tumorspezifischem Überleben
(Sato et al., 1992) beim Urothelkarzinom gefunden haben. Autoren wie Mellon et al.,
1996 bestreiten die prognostische Aussagekraft von c-erb-B2 beim Urothelkarzinom.
Für die ras-Onkogene (c-H-ras, c-K-ras, p21-ras) konnte in mehreren Studien sowohl
eine Korrelation mit stärker enddifferenzierten Tumoren wie G2 und G3 Tumoren
(Viola et al., 1985), als auch zum Tumorprogress und zur Rezidivrate (Kroft et al.,
1994) nachgewiesen werden.
Ein Wiederauftreten der oberflächlichen Blasentumore mit Verschlechterung des
Grading und des Tumorstadiums und mit Zunahme der Rezidive (Del Senno et al.,
1989) konnte in mehreren Studien für die c-myc-Onkogene belegt werden (Master et
al., 1988).
Untersucht wurde auch mdm2, ein Protein, welches p53 durch eine Bindung
inaktivieren kann. Bei p53 handelt es sich um ein Zellzyklusprotein, dessen Aufgabe
darin besteht, ein Apoptoseprogramm bei Zellen mit einem DNA-Schaden einzuleiten,
um eine maligne Entartung zu verhindern. Findet diese Bindung zwischen mdm2 und
p53 statt, so wäre zu erwarten, dass bei diesen Patienten ein höheres Risiko für ein
Karzinom entsteht. Es gibt eine Arbeit, die zwar belegt, dass etwa 20-30% der
Blasentumore mdm2-positiv sind (Lianes et al., 1994). Eine Korrelation zum
Tumorstadium oder Differenzierungsgrad konnte allerdings nicht nachgewiesen werden
(Shiina et al., 1999).
5 Diskussion
68
Weiterhin konnten Tiniakos et al., 1994 durch immunhistochemische Verfahren
zeigen, dass eine Zunahme von c-jun-Onkogenen mit einer Zunahme der Invasivität
der Harnblasenkarzinome einhergeht. Ebenfalls fanden sie heraus, dass c-jun die
Bildung von epidermal-growth-factor (EGF)- Rezeptoren fördert.
Auf jeder Zelle befindet sich eine Vielzahl von Molekülen, welche antigene
Eigenschaften haben. Diese Oberflächenmoleküle erfüllen vorwiegend Aufgaben in der
Zellkommunikation oder Zelladhäsion. Veränderungen dieser Oberflächenmoleküle
sind oft Folge einer intrazellulären Proliferation oder Veränderungen der zellulären
Morphologie, welche zum Beispiel durch eine Tumorerkrankung der Zelle verursacht
werden können.
Diese so genannten Adhäsionsmoleküle stellen eine weitere Gruppe von Biomarkern
dar.
Zu dieser Gruppe gehören die Cadherine und die Integrine. Diese
Adhäsionsmoleküle spielen eine wichtige Rolle bei der interzellulären Adhäsion und
Kommunikation. Sie bestehen in erster Linie aus drei Komponenten, einem
intrazellulären Anteil, einem transmembranösen Anteil und einem extrazellulären
Anteil. Für die Adhäsion mit anderen Zellen ist in erster Linie der extrazelluläre Anteil
verantwortlich. Ein Verlust dieser Adhäsionsfähigkeit geht bei der Tumorzelle
potentiell mit einer Metastasierung einher.
Beim oberflächlichen Blasenkarzinom konnten Mialhe et al. nachweisen, dass rund
60% der untersuchten Patienten positiv für ein defektes E-Cadherin waren, in der
Kontrollgruppe
mit
invasiven
Blasenkarzinomen
konnte
dagegen
in
der
Immunhistochemie bei etwa 75% der Fälle ein defektes oder fehlendes E-Cadherin
nachgewiesen werden (Mialhe et al., 1997). Eine vermehrte Expression von defekten
Cadherinen war assoziiert mit einer Verkürzung der rezidivfreien Zeit und einer
Verminderung der tumorspezifischen Überlebenszeit (Lipponen und Eskelinen, 1995).
Weiterhin konnte eine Korrelation zu Tumorstadium, Differenzierungsgrad und
Fernmetastasierung festgestellt werden (Syrigos et al., 1995). Cadherine konnten sich
allerdings in der multivariaten Analyse als prognostischer Parameter nicht behaupten
(Lipponen und Eskelinen, 1995; Shimazui et al., 1996).
5 Diskussion
69
Ein weiteres Adhäsionsprotein ist das Integrin, welches auf der Membranoberfläche der
Zelle lokalisiert ist. Es gibt Untersuchungen über einzelne Subklassen von IntegrinMolekülen, wie zum Beispiel ß-4-Integrin, bei denen ebenfalls eine Korrelation der
Expression mit Tumorstadium und Differenzierungsgrad
nachgewiesen wurde
(Harabayashi et al., 1999).
Zu einer weiteren Gruppe von Oberflächenantigenen werden die Blutgruppenantigene
der AB0 und Lewis Gruppe gezählt. Historisch wurden diese Blutgruppenantigene
zunächst auf den Erythrozyten entdeckt und später dann auch im Urothel nachgewiesen,
wobei hier etwa 80% aller Individuen ABO und Lewis-Antigene exprimieren (Stein et
al., 1998). Während das ABO-Antigen bei den Urothelkarzinomen keine Rolle spielt, so
hat man für das Lewis-X-Antigen festgestellt, dass man es in etwa 90% aller
Harnblasenkarzinome unabhängig von Tumorstadium und Malignitätsgrad nachweisen
kann (Sheinfeld et al., 1990). Für den Nachweis des Lewis-X-Antigens wurde eine
deutlich höhere Sensivität in der Tumorerkennung als in der Routinezytologie (85%
versus 61%) belegt. Kombiniert man nun beide Parameter, so kommt man auf eine
Sensitivität von über 90%, wobei der Nachweis von Lewis-X-Antigenen einen Vorteil
bei der Diagnostik von hochdifferenzierten Karzinomen aufweist, welche in der
Routinezytologie häufig übersehen werden (Golijanin et al., 1995).
Weiterhin gibt es einige tumorassozierte Proteine, von denen einige (M344, 19A211,
DD23 und T138) recht gut untersucht sind. Sie haben alle die Eigenschaft, nur im
Tumorurothel nachweisbar zu sein, da sie ein Produkt der Tumorsynthese sind. Der
Nachweis kann hier immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern erfolgen. Für
das im Zytosol nachweisbare M344 wurde eine inverse Korrelation
mit dem
Tumorgrad und Tumorstadium beim Harnblasenkarzinom nachgewiesen (Fradet und
Cordon-Cardo, 1997). Die Expression von 19A211 korreliert mit einer niedrigen,
hingegen die Expression von T138 mit einer hohen Rezidivrate (Allard et al., 1995).
Für Urothelkarzinome der Harnblase mit einer hohen T138-Expression konnte der
Nachweis einer deutlich höheren Progressionsrate verbunden mit
einer erhöhten
Metastasierungsneigung erbracht werden. Ravery et al. konnten weiterhin T138 als
unabhängigern prognostischen Marker für den Progress und die Aggressivität T138
5 Diskussion
70
positiver Urothelkarzinome nachweisen (Ravery et al., 1995). T138 und 19A211 gelten
als viel versprechende Biomarker, wobei noch weitere Untersuchungen zur Bewertung
als prognostische Marker notwendig sind.
Während des Tumorwachstums findet in der Zelle eine erhöhte Replikationsleistung mit
Synthese von m-RNA und DNA statt. Dieser Wachstumsprozess unterliegt
der
Kontrolle eines komplizierten Netzwerkes von interagierenden Wachstumsfaktoren und
Zellzyklusproteinen wie p53, pRb, p15, p16, p21 und cyclin. Diese Zellzyklusproteine
wurden alle mehr oder weniger auf ihre Funktion als Biomarker untersucht.
Während die Protoonkogene durch Aktivierung zur Krebsentstehung beitragen,
geschieht bei den so genannten Tumorsupressorgenen genau das Gegenteil. Sie
unterbrechen die Zellproliferation, wodurch der Zelle die Möglichkeit zur
Differenzierung gegeben wird. Zu den weiteren Aufgaben gehören ebenso DNAReparatur-
und
Appopotosemechanismen.
Im
Zusammenhang
mit
dem
Urothelkarzinom der Harnblase sind hierbei drei Genloci bekannt. Diese beinhalten p53
auf dem Chromosom 17p (Harris und Hollstein, 1993), das Retinoblastoma Gen (Rb
Gen) auf dem Chromosom 13q und die Gene p15, p16 und p21 auf dem Chromosom
9p.
Besonders untersucht wurde und wird das p53, ein nukleäres Phosphorprotein und
zellulärer Transkriptionsfaktor. Es ist gewissermaßen ein „Genomwächterprotein“.
Seine Aufgabe ist, zu verhindern, dass eine defekte DNA weiter repliziert wird
(Vogelstein et al., 2000). Wird ein Replikationsfehler festgestellt, so wird die Zelle
durch den Einfluss von p53 in der G1-Phase des Zellzyklus „eingefroren“ (G1-Arrest)
und zwar so lange, bis der Schaden behoben ist (Kastan et al., 1991). Ist der Schaden
irreparabel, wird ein Apoptoseprogramm eingeleitet (Ryan et al., 1993). So soll
verhindert werden, dass das defekte Genom weiter auf die Tochterzellen übertragen
wird.
Eine Mutation des p53-Gens kann bei vielen fortgeschrittenen Tumorerkrankungen
nachgewiesen werden (Hollstein et al., 1993). Diese Mutationen führen zur Bildung
von abnormalen p53-Proteinen, welche eine verlängerte Halbwertzeit besitzen und sich
dadurch immunhistochemisch nachweisen lassen.
5 Diskussion
71
Fujimoto et al. konnten belegen, dass invasive, schlechtdifferenzierte und metastasierte
Urothelkarzinome eine deutlich höhere p53-Mutationsrate zeigen, als oberflächliche,
gut differenzierte (Fujimoto et al., 1992; Sarkis et al., 1993).
Ebenfalls konnte eine enge Korrelation von VEGF 9 und einer p53-Akkumulation
festgestellt werden, wobei Urothelkarzinome der Harnblase mit einer hohen Expression
von p53 und VEGF eine schlechte Prognose aufwiesen. Weiterhin konnten Cote et al.
belegen, dass
Patienten mit einem positiven p53-Status eher von einer
M-VAC
Chemotherapie profitierten, als die Referenzgruppe (Cote et al., 1997).
Für die Inaktivierung von p53 gibt es mehrere Ursachen. Es kann zum Beispiel eine
Deletion beider Allele stattfinden, ein Allel kann bei der Replikation verloren gehen und
das andere durch eine Mutation inaktiviert werden. Diesen Vorgang bezeichnet man
auch als „two-hit“ Hypothese. Ebenso gibt es den Fall, dass es zur dominanten
phänotypischen Expression einer p53-Mutation im heterozygoten Zustand kommt. Die
p53-Mutation ist ein sehr häufiges Ereignis, das bei fast 50% aller Tumore
nachgewiesen werden konnte (Brandau und Böhle, 2000). Kommt zu einer p53Mutation noch der Verlust des nachgeschalteten Zellzyklusenzymes p21 hinzu, so
haben Urothelkarzinome der Harnblase eine deutlich schlechtere Prognose als
Urothelkarzinome mit normaler p21 Expression, da nun die Kontrollfunktion G1- und
S–Phase völlig fehlt (Niehans et al., 1999). Es kann jetzt zur ungehinderten
Zellproliferation kommen, wobei in diesen Fall die klinischen Daten zur Zeit kontrovers
diskutiert werden.
Das Rb-Gen und sein Genprodukt, ebenfalls ein Phosphorprotein, spielen eine
entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellzyklus. Sein Genprodukt verhindert
über die Bindung an Transkriptionsfaktoren wie E2F die Expression von Genen, welche
im Zellzyklus den Übergang von der G1- in die S-Phase steuern, und zügelt dadurch die
Zellteilung (Nevins et al., 1997). Takahashi et al. konnten
an Rb-negativen
Blasentumorzelllinien (HTB9) zeigen, dass unter dem Einfluss des Rb-Gens die
Fähigkeit zur Koloniebildung herabgesetzt wird. Ebenso konnte er eine deutlich
niedrigere Wachstumsrate und ein schwächeres Tumorwachstum belegen (Takahashi
9
VEGF ist einer der wichtigsten Angiogenesefaktoren (vacular endothelial cell growth factor)
5 Diskussion
72
et al., 1991). Beim muskelinfiltrierenden Blasenkarzinom konnte eine Rb-Negativität
von bis zu 80% belegt werden, oberflächliche Tumore sind dagegen selten negativ
(Presti et al., 1991; Cordon-Cardo et al., 1992). Mehrere Studien gehen von einem
signifikanten Überlebensvorteil für Patienten mit normaler Rb-Expression aus (Kroft,
1994; Knowles, 1995).
Neben den Zellzyklusproteinen, Onkogenen, tumorassoziierten Antigenen und
Proliferations-Antigenen gibt es noch die Gruppe der Wachstumsfaktoren wie EGF
(Epidermal Growth Factor), TGF-ß (Transforming growth factor-beta), FGF (fibroblast
growth factor)
und VEGF (vascular endothelial growth factor), welche im
Wesentlichen an der Regulation von Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zelltod
beteiligt sind. Es gibt hier umfangreiche Untersuchungen zur Bewertung der einzelnen
Faktoren als potentieller Biomarker für das Urothelkarzinom.
Für die prognostische Relevanz des epidermal growth factors (EGF) gibt es
unterschiedliche, teilweise widersprüchliche Untersuchungen. Einmal konnte zwischen
der EGF-Konzentration im normalen Blasengewebe und Blasentumorgewebe kein
signifikanter Unterschied nachgewiesen werden (Matilla et al., 1988). Bei anderen
Autoren wiederum zeigte sich eine signifikante Erniedrigung der EGF-Expression bei
Patienten mit Blasentumoren (Messing, 1990). Eine Korrelation zu Tumorstadium,
Differenzierungsgrad und Überlebensrate konnte nicht nachgewiesen werden (Matilla
et al., 1990; Messing, 1990; Ravery et al., 1997).
Der
transforming
growth
Faktor
beta
(TGF-ß)
besitzt
sowohl
eine
proliferationsfördernde als auch proliferationshemmende Eigenschaft, welche vom
Zelltyp abhängig ist. Bei insgesamt 75 Patienten konnte im Immunoassay eine erhöhte
Expression der TGF-ß Serumwerte bei Patienten mit einem Blasenkarzinom
nachgewiesen werden, welche durch eine weitere Studie mittels Immunhistochemie
bestätigt wurde (Eder et al., 1996; Izadifar et al., 1999). Eine Korrelation zum
Differenzierungsgrad oder Tumorstadium konnte nicht gezeigt werden. Eine TGF-α
Expression konnte bei etwa 60% der untersuchten Harnblasenkarzinome nachgewiesen
werden, wobei eine Korrelation zwischen TGF-α und der tumorspezifischen
Überlebensrate gezeigt wurde (Ravery et al., 1997). Thogersen et al. konnten diese
Korrelation jedoch nicht bestätigen (Thogersen et al., 1999).
5 Diskussion
73
Die Angiogenese ist ein wichtiger Schritt bei der Wundheilung, dem Tumorwachstum
sowie der Bildung und Invasion von Metastasen (Fidler und Ellis, 1994; Folkman,
1995). Diese Schritte der Gefäßneubildung sind sehr komplex und erfordern eine
aufwendige Interaktion zwischen den ortständigen Zellen und den nicht ortständigen
Endothelzellen.
Bereits 1993 stellten Pipili-Synetos et al., 1993 einen Zusammenhang zwischen NO
und der Angiogenese her. Des Weiteren konnte im Laborversuch mit menschlichen
Lymphozyten eine Angiogenese nur unter der Anwesenheit von L-Arginin, einer
metabolischen Vorstufe des NO-Stoffwechsels, stattfinden (Leibovicz et al., 1994).
Durch die Inhibition von L-Arginin konnte bei Magengeschwüren eine deutliche
Verzögerung des Heilungsprozesses nachgewiesen werden, wobei Brzozowski et al. als
Ursache eine Hemmung der Angiogenese vermuteten, welche wesentlicher Bestandteil
der Phase II der Wundheilung ist (Brzozowski et al., 1995).
Die Voraussetzung für eine Gefäßeinsprossung im Tumorgewebe ist sowohl eine
anhaltende Vasodilatation als auch eine Permebilitätserhöhung des betroffenen
Gefäßabschnittes (Ziche et al., 2000), die durch NO vermittelt wird. Der
experimentelle Beweis für den Zusammenhang zwischen einer verlängerten
Vasodilatation und der Gefäßneubildung konnte in mehreren Studien belegt werden
(Ziche et al., 1990; Morbidelli et al., 1998).
Stickstoffmonoxid erfüllt also bei der Tumorangiogenese zwei Funktionen, zum einen
induziert es eine initiale Vasodilatation, zum anderen wirkt es unter dem Einfluss von
VEGF auf die Angiogenese (Ziche et al., 2000).
Mehr als zwanzig angiogenetische und anti-angiogenetische Faktoren konnten bis
heute identifiziert werden. Morbidelli et al. demonstrierten erstmals 1996 den Einfluss
von NO sowohl auf die DNA-Synthese als auch auf die Proliferation und Migration in
Koronarendothelzellen in vitro (Morbidelli et al., 1996).
Eine Schlüsselrolle in der Gefäßneubildung kommt im Wesentlichen den
Wachstumsfaktoren VEGF und bFGF zu. Der basic fibroblast growth factor (bFGF)
stimuliert die Wanderung von Endothelzellen im endothelialen Gewebe.
Bei dem vascular endothelial growth factor (im folgenden VEGF genannt) handelt es
sich um einen wirksamen und spezifischen Wachstumsfaktor für die Proliferation von
5 Diskussion
74
Endothelzellen in der Angiogenese. Mehrere Studien haben belegt, dass das selektive
Blockieren dieses Wachstumsfaktors zu einer Reduktion des Tumorwachstums führt
(Kim et al., 1993; Asano et al., 1995). Es scheint so, das NOS ein obligat wichtiges
Substrat oder Co-Faktor für die Expression von VEGF ist, denn Ziche et al., 1997
konnten in Kaninchen-Kornea nachweisen, dass die Bildung von VEGF 10 durch ein LArginin 11 Analogon verhindert werden konnte. Die durch bFGF 12 induzierte
Angiogenese blieb bei dieser Versuchsanordnung dagegen unbeeinflusst und konnte
somit nicht gehemmt werden. Die durch VEGF am Rezeptor verursachten Effekte sind
noch nicht hinreichend geklärt, jedoch konnte unter dem Einfluss von VEGF auf NO
eine Vasodilatation und Zunahme der Permeabilität im Gefäß nachgewiesen werden
(Ku et al., 1993; Wu et al., 1996). Es gilt als relativ sicher, dass die durch VEGF
induzierte Angiogenese im Tumor sehr eng mit dem NO-Stoffwechsel vernetzt ist und
dort eine Interaktion zwischen den beiden Stoffwechselzyklen stattfindet. Ziche et al.,
1997 konnten weiterhin in vivo nachweisen, das bei dem HNC (human head and neck
cancer) eine erhöhte NOS Aktivität zu einer vermehrten Gefäßneubildung verbunden
mit einer Erhöhung der micro vessel density (MVD) führt. Ebenfalls konnte eine
erhöhte Korrelation zu Lymphknotenmetastasen feststellt werden. Ziche und
Morbidelli konnten diese Ergebnisse auch für Adenokarzinomzelllinien der Mamma
belegen (Ziche und Morbidelli, 2000).
Bereits Crew et al. konnten den Nachweis erbringen, dass Patienten mit einem
Blasentumor eine signifikant höhere Expression von VEGF im Urin aufwiesen als eine
Vergleichsgruppe mit gesunden Patienten (Crew et al., 1999). Weiterhin korrelierte die
VEGF-Expression mit dem Tumorstadium und der rezidivfreien Zeit. Für den
Wachstumsfaktor bFGF konnte eine erhöhte Expression in fortgeschrittenen
Tumorstadien gezeigt werden.
10
11
12
VEGF (vascular endothelial cell growth factor) ist ein endothelialer Wachstumsfaktor, dem eine
starke angiogenetische Wirkung in vivo zugeschrieben wird.
Arginin ist das Ausgangsprodukt für die NO-Synthese (vgl. Abbildung 2)
bFGF (basic fibroblast growth factor)
5 Diskussion
75
Diese beiden Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass der Tumorangiogenese,
welche durch die Expression von Gefäßwachstumsfaktoren wie VEGF und bFGF erst
induziert wird, bei der Tumorausbreitung eine sehr wichtige Rolle zukommt, welche
die Prognose des Patienten maßgeblich mitbestimmt. Hierzu konnten Bochner et al.,
1995 bei 126 Patienten mit muskelinvasiven Tumoren über den Grad der
Mikrovaskularisation
im
Blasentumorgewebe
Rückschlüsse
auf
deren
Mortalitätswahrscheinlichkeit ziehen. Neoangiogenese und somit Mikrovaskularisation
lässt sich lichtmikroskopisch über die micro vessel density (MVD) erfassen. Patienten
mit einer hohen MVD haben über einen Zeitraum von 5 Jahren eine zweifach erhöhte
Mortalität (Bochner et al., 1995). Eine Studie von Dickinson et al. konnte das Ergebnis
bestätigen (Dickinson et al., 1994). Die MVD konnte sich allerdings
in der
multivariaten Analyse als unabhängiger prognostischer Faktor nicht bestätigen (Hawke
et al., 1998). Andere Autoren gehen sogar so weit und werten die Blutgefäßdichte
(MVD) als TNM- unabhängigen, prognostischen Parameter beim Harnblasenkarzinom
(Philp et al., 1996; Chaudhary et al., 1999).
Miodonski et al. konnten nachweisen, dass ein signifikanter Unterschied in der
Gefäßmorphologie zwischen dem oberflächlichen Blasentumor und dem invasiven
Karzinom besteht (Miodonski et al., 1998). Diese unterschiedliche Gefäßmorphologie
führen andere Autoren auf zwei verschiedene angiogenetische Stoffwechselwege zurück
(O´Brien et al., 1995), wobei die Gefäßanordnung bei einem oberflächlichen
Blasentumor eine ganz andere Struktur aufweist als bei einem invasiven Tumor.
Mizutani et al. konnten weiterhin belegen, dass Patienten mit einem oberflächlichen
Blasentumor vermehrt VEGF exprimieren, wohingegen sich bei Patienten mit einem
invasiven Blasentumor eine stark vermehrte Expression von PDECGF (palet-derivedendothelial-cell-growth-factor) zeigten. Für PDECGF konnte eine signifikante
Korrelation zu Tumorstadium und Progression nachgewiesen werden (Mizutani et al.,
1997). Ebenfalls fanden O´Brian et al. heraus, dass es neben dem PDECGF eine CoStimulation für den bFGF (basic fibroblast growth factor) beim invasiven Blasentumor
gibt (O’Brien et al., 1997).
Oberflächliche Blasentumore haben normalerweise eine papilläre Morphologie, die
durch eine gut organisierte Gefäßstruktur geprägt ist. Invasive Tumore haben dagegen
5 Diskussion
76
eine eher unorganisierte Gefäßstruktur mit solidem Tumorwachstum und Nekrosen
(O´Brien et al., 1995). Es scheint so, dass das exophytische, papilläre Wachstum beim
oberflächlichen Blasentumor durch die von VEGF vermittelte Gefäßanordnung entsteht
(Miodonski et al., 1998). Es liegt auf der Hand, dass die Invasion des Blasentumors in
die Muscularis durch eine Veränderung des Gefäßwachstums induziert wird. Hierfür
kann möglicherweise eine Veränderung der Expression der Gefäßwachstumsfaktoren
eine entscheidende Rolle spielen. Kommt es zum Anstieg von PDECGF (palet-derivedendothelial-cell-growth-factor) und bFGF, neigt der Tumor zur Invasion in die tieferen
Schichten der Harnblase.
Ergänzt man die oben genannten Ergebnisse durch die Resultate von Ziche et al., so
ergibt sich ein interessantes Bild: Ziche et al. konnten nachweisen, dass die Produktion
von VEGF zur Erhöhung von Stickstoffmonoxid führt, welches durch die NOS
synthetisiert wird. Für das Produkt NO konnte ein direkter Einfluss auf die Angiogenese
nachgewiesen werden (Ziche et al., 1994). Ein Einfluss
von bFGF auf die
NO
vermittelte Angiogenese konnte dagegen nicht nachgewiesen werden (Morbidelli et al.,
1996; Ziche et al., 1997; Hood et al., 1998); Ziche et al., 1997) konnten belegen, dass
eine Erhöhung der VEGF-Expression zu einer Erhöhung der NOS-Expression führt. Die
durch b-FGF vermittelte Angiogenese dagegen ist NO- unabhängig.
Geht man nun davon aus, dass eine erhöhte VEGF-Expression ebenfalls zu einer
Erhöhung der NO-Produktion im Blasentumorgewebe führt, so müssten iNOS und
VEGF hinsichtlich der Überlebenszeit, der rezidivfreien Zeit und der progressionsfreien
Zeit ein annähernd gleiches Expressionsverhalten zeigen, und zwar nur bei
oberflächlichen Karzinomen wie pTa- und pT1-Tumoren, da deren Morphologie, wie
von Miodonski et al. postuliert, durch die VEGF induzierte Angiogenese bestimmt wird
(Miodonski et al., 1998). Kann zum Beispiel eine Korrelation von VEGF zum
rezidivfreien Überleben nachgewiesen werden, so muss dieses auch für die induzierbare
Nitrit-Oxide-Synthease gelten, also dem Enzym, welches NO katalysiert. Einen
Zusammenhang zwischen NO-Produktion und VEGF-Expression konnten Ziche et al.
bereits 1994 belegen (Ziche et al., 1994). Für VEGF konnte von mehreren Autoren
eine positive Korrelation zu Rezidivrate und Tumorgrad beim Blasenkarzinom
5 Diskussion
77
nachgewiesen werden (Crew et al., 1997; Ogura et al., 1998; Crew et al., 1999;
Kausch und Böhle, 2000).
In der vorliegenden Arbeit kann ein Zusammenhang zwischen der iNOSExpressionsrate und dem rezidivfreien Überleben innerhalb des Tumorstadiums pTa,
also einem oberflächlichen, papillären Tumor, festgestellt werden. Es zeigt sich, dass
die Patienten mit einer iNOS-Expressionsrate von kleiner 60% eine deutlich geringere
Neigung für ein Rezidiv haben als die der Vergleichsgruppe. Bei einer erhöhten iNOSExpression im oberflächlichen Tumorstadium pTa kann somit eine Korrelation zur
höheren Rezidivrate nachgewiesen werden (Abbildung 31). Darüber hinaus wurde in
dieser Arbeit keine signifikante Korrelation der iNOS-Expression mit dem
tumorspezifischen Überleben gefunden (Abbildung 28).
Vergleicht man diese Ergebnisse mit der aktuellen Literatur, so ist festzustellen, dass
eine Erhöhung der VEGF-Expression zu einer Erhöhung der iNOS-Expression und
somit des Produktes NO führt. So kann in der vorliegenden Arbeit für iNOS eine
Korrelation mit der Rezidivrate beim oberflächlichen Karzinom nachgewiesen werden.
Crew et al., 1997, Ogura et al., 1998 und Kausch und Böhle, 2000 konnten für
VEGF bei oberflächlichen Blasentumoren ebenfalls eine Korrelation zum rezidivfreien
Überleben nachweisen.
Weiterhin konnte durch die vorliegende Arbeit eine fehlende Korrelation von iNOS
mit dem tumorspezifischem Überleben belegt werden. Auch für VEGF kamen Edgren
et al. zu dem Schluss, dass zwischen VEGF und tumorspezifischem Überleben keine
Korrelation besteht (Edgren et al., 1999). Für VEGF konnte durch Kausch und Böhle,
2000 eine Korrelation zum Tumorgrad festgestellt werden. Für iNOS konnte dieses in
der vorliegenden Arbeit nicht belegt werden. Es gibt also gewisse Indizien, welche in
Einklang mit der aktuellen Literatur einen Zusammenhang zwischen VEGF- und iNOSExpression vermuten lassen.
In der vorliegenden Studie konnte erstmals für iNOS im Tumorstadium pTa ein Trend
für eine erhöhte Neigung zu Rezidiven bei Tumoren mit einer Expression von größer
60% nachgewiesen werden. Weiterhin wurde eine prognostische Relevanz hinsichtlich
des rezidivfreien Überlebens innerhalb des Stadiums pTa nachgewiesen. Bei
Blasentumoren mit einem niedrigen und mittleren Malignitätsgrad (G1- und G2-
5 Diskussion
78
Tumore) wurde ebenfalls ein Trend zu einer erhöhten Neigung zu Rezidiven für
Patienten mit einer iNOS-Expression von mehr als 60% ermittelt.
Eine möglichst exakte Definition der individuellen Rezidivwahrscheinlichkeit kann
dazu führen, dass bei Patienten mit dem hohen Risiko eines Rezidives oder Progresses
eine entsprechend engmaschigere Nachbeobachtung vorgenommen wird. Bei Patienten
mit einem geringen Risiko könnten diese Zeiträume verlängert werden. In einer Zeit des
zunehmenden Kostendrucks auf der einen Seite und einem hohen Qualitätsanspruch auf
der anderen Seite wäre dies sowohl aus ökonomischer Sicht als auch unter dem Aspekt
eines effektiveren therapeutischen Vorgehens ein wesentlicher Vorteil für den
Blasentumorpatienten.
Ohne Zweifel werden in der Zukunft Tumormarker eine relevante Rolle in der Therapie,
Prognose und Früherkennung von Karzinomen spielen. Allerdings erfüllen die zurzeit in
der Diskussion stehenden Parameter ihre für einen zuverlässigen, in der Routine
einzusetzenden Marker obligaten Testkriterien, wie hohe Spezifität oder Sensibilität,
nur unzureichend. Weiterhin fehlt es für diese Marker derzeit
an ausreichenden
klinischen, randomisierten, prospektiven Studien, in denen das Verhalten eines
Tumormarkers über einen längeren Nachbeobachtungszeitraum untersucht wird.
6 Zusammenfassung
6
79
Zusammenfassung
Die Prognose von Patienten mit einem Urothelkarzinom der Harnblase ist sehr
unterschiedlich. Es haben sich zwar Parameter wie das Tumorstadium (TNMKlassifikation) und der Malignitätsgrad als Prognosefaktoren etabliert. Diese sind
jedoch in vielen Fällen nicht ausreichend, um Hochrisikopatienten bezüglich
Progression oder Rezidivhäufigkeit zu identifizieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war
es daher, die Wertigkeit der induzierbaren Nitrit-Oxide-Synthease (iNOS), einem für
die
Tumorangiogenese
wichtigen
Enzym,
als
potentiellen
unabhängigen
Prognoseparameter für das Harnblasenkarzinom zu bestimmen.
Das im Rahmen einer transurethralen Resektion gewonnene Blasentumorgewebe von
insgesamt 115 Patienten wurde immunhistochemisch untersucht. Auf diese Weise
wurde die Expression von iNOS im Tumorgewebe ermittelt. Der weitere
Krankheitsverlauf der Patienten wurde im Rahmen einer retrospektiven Analyse
ausgewertet. Der Nachbeobachtungszeitraum betrug durchschnittlich 62,5 Monate. Die
Parameter Tumorstadium, Malignitätsgrad, verschiedene Tumorkonstellationen und
iNOS-Expression wurden anhand des Kaplan-Meier-Verfahrens hinsichtlich der
rezidivfreien und progressionsfreien Zeit sowie des tumorspezifischen Überlebens
statistisch ausgewertet (log-rank-Test bzw. Test nach Tarone).
Als Ergebnis zeigte sich, dass Blasentumorgewebe eine Expression von iNOS aufweist,
während bei normalem Blasengewebe keine Anfärbung festzustellen war. In der
univariaten statistischen Analyse stellten Tumorstadium und Malignitätsgrad
signifikante
prognostische
Parameter
dar,
was
auf
ein
repräsentatives
Patientenkollektiv hinweist. Für die Expression von iNOS zeigte sich lediglich für das
rezidivfreie Überleben ein Trend zu höherer Rezidivneigung (iNOS-Expression >
60%). Eine signifikante prognostische Relevanz der iNOS-Expression ergab sich für
die Rezidivfreiheit im Tumorstadium pTa (iNOS > 60%: kürzere rezidivfreie Zeit).
Weiterhin konnte für die Gruppe der hoch- bis mäßig differenzierten Blasentumore (G1
und G2) ein Trend hinsichtlich des rezidivfreien Überlebens ermittelt werden (iNOS >
60%: mehr Rezidive).
6 Zusammenfassung
Schlussfolgernd
ist
80
festzustellen,
dass
Patienten
mit
einem
oberflächlichen
Urothelkarzinom der Harnblase im Stadium pTa mit einer iNOS-Expressionsrate von
>60% ein höheres Risiko für ein Rezidiv aufweisen als die Vergleichsgruppe. Somit
könnte die iNOS-Expression einen zusätzlichen unabhängigen Prognoseparameter für
diese Risikogruppe darstellen. Weitere prospektive Untersuchungen sind notwendig,
um diese Einschätzung zu bestätigen.
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8 Anhang
8
98
Anhang
8.1 Abbildungsverzeichniss
Abbildung 1 : TNM-Stadien des Urothelkarzinomes (Alken und Walz, 1998) ....................................... 8
Abbildung 2:
Synthese von NO durch Nitrit-Oxide-Synthease (Tozer und Everett, 1997) ................ 12
Abbildung 3:
Einfluss von NO auf die Neoangiogenese im Tumorgewebe (modifiziert nach Ziche und
Morbidelli, 2000 )........................................................................................................... 13
Abbildung 4:
Patientenaufteilung nach dem Tumorstadium ................................................................. 16
Abbildung 5:
Patientenaufteilung nach dem Differenzierungsgrad........................................................ 17
Abbildung 6:
Immunhistochemischer Nachweis von iNOS beim Urothelkarzinom.............................. 22
Abbildung 7:
Original Positiv-Kopie...................................................................................................... 26
Abbildung 8:
Formel zur Berechung des prozentualen Anteils der eingefärbten Tumorfläche.............. 27
Abbildung 9:
Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 300-facher
Vergrößerung.................................................................................................................... 28
Abbildung 10: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 400-facher
Vergrößerung mit zentralem Tumorzapfen ...................................................................... 28
Abbildung 11: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 200-facher
Vergrößerung.................................................................................................................... 28
Abbildung 12: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 400-facher
Vergrößerung.................................................................................................................... 29
Abbildung 13: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 200-facher
Vergrößerung mit ungefärbtem Tumorareal (Mitte)......................................................... 29
Abbildung 14: Immunhistochemische iNOS-Färbung eines papillären Blasentumors in 400-facher
Vergrößerung.................................................................................................................... 29
Abbildung 15: iNOS-Expression bei den einzelnen Tumorstadien .......................................................... 37
Abbildung 16: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit für die
verschiedenen Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier Kurve
(Tarone-Test, p=0,002) .................................................................................... 38
8 Anhang
99
Abbildung 17: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit für verschiedene
Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0022).................................................................................................. 39
Abbildung 18: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit für
verschiedene Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p=0,0011)................................................................................................... 40
Abbildung 19 : Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit für
verschiedene Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0016).................................................................................................. 41
Abbildung 20: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0145).................................................................................................. 42
Abbildung 21: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0071).................................................................................................. 43
Abbildung 22: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorstadien, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,8211)................................................................................................. 44
Abbildung 23: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für
verschiedene Tumorkonstellationen, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,2043).................................................................................................. 45
Abbildung 24: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit für
verschiedene Differenzierungsgrade, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0020).................................................................................................. 46
Abbildung 25: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit für
verschiedene Differenzierungsgrade, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p=0,0025)................................................................................................... 47
Abbildung 26: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für
verschiedene Differenzierungsgrade, dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(Tarone-Test, p= 0,0870).................................................................................................. 48
Abbildung 27: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit bei verschiedenen
Expressionsraten von iNOS (< bzw. > 60%), dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve
(log-rank-Test, p= 0,4416) ............................................................................................... 50
Abbildung 28: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. > 60%), dargestellt als
Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p= 0,1613). ........................................................... 51
8 Anhang
100
Abbildung 29: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. > 60%), dargestellt als
Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p=0,0621) ............................................................. 52
Abbildung 30: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit bei
verschiedenen Expressionsraten von iNOS (< bzw. >60%), dargestellt als
Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p=0,3141). ............................................................. 53
Abbildung 31: Überlebenswahrscheinlichkeit in Bezug auf die rezidivfreie Zeit für das Tumorstadium
pTa bei verschiedenen iNOS-Expressionsraten (< bzw. > 60%), dargestellt als
Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p= 0,0142). .......................................................... 55
Abbildung 32: Überlebenswahrscheinlichtweit in Bezug auf die rezidivfreie Überlebenszeit für die
Gruppe der Differenzierungsgrade G1 und G2 bei verschiedenen Expressionsraten
(< bzw. > 60%), dargestellt als Kaplan-Meier-Kurve (log-rank Test, p= 0,0562) ........... 58
8 Anhang
101
8.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Mittlere Gesamtüberlebenszeit bei unterschiedlicher iNOS-Expression ............................... 32
Tabelle 2: Mittlere rezidivfreie Zeit bei unterschiedlichen Tumorstadien und Differenzierungsgraden 33
Tabelle 3: Rezidivfreie Zeit bei unterschiedlichen iNOS-Konzentrationen............................................ 34
Tabelle 4: Progressionsfreie Zeit bei unterschiedlichen Tumorstadien und Differenzierungsgraden ..... 35
Tabelle 5: Progressionsfreie Zeit bei unterschiedlichen iNOS-Konzentrationen.................................... 36
Tabelle 6: Häufigkeit verschiedener iNOS-Expressionsraten ................................................................. 49
Tabelle 7: Prognostische Relevanz verschiedener iNOS-Grenzwerte (log-rank Test)............................ 54
Tabelle 8: Prognostische Relevanz der iNOS-Expressionsrate (< bzw. > 60%) bezüglich
desTumorstadiums (log-rank Test) ........................................................................................ 54
Tabelle 9: Prognostische Relevanz der iNOS-Expressionsrate (< bzw. > 60%) bezüglich des
Differenzierungsgrades (log-rank Test) ................................................................................. 56
Tabelle 10: Überlebenswahrscheinlichkeit für verschiedene Tumorkonstellationen mit unterschiedlichem
Progressionsrisiko in Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit, die rezidivfreie Zeit
und die progressionsfreie Zeit für eine iNOS-Expressionsrate von < bzw. > 60% (log-rank
Test). .................................................................................................................................. 57
Tabelle 11: Überlebenswahrscheinlichkeit für verschiedene Gruppen von Differenzierungsgraden in
Bezug auf die tumorspezifische Überlebenszeit, die rezidivfreie Zeit und die
progressionsfreie Überlebenszeit für eine iNOS-Expressionsrate von < bzw. > 60 % (logrank-Test)............................................................................................................................... 58
8 Anhang
102
8.3 Danksagung
Herrn Professor Dr. med. G. Hofmockel, Chefarzt der Urologischen Klinik des
Stadtkrankenhauses Worms, danke ich für die Vergabe des Themas und die Betreuung
bei der Durchführung.
Für die Betreuung bei der technischen Durchführung der Versuche möchte ich ganz
herzlich Frau Dr. rer. nat. Annette Kassen, ehemals Leiterin des wissenschaftlichen
Urologischen Labors der Urologischen Universitätsklinik Herne, und Frau Dorothea
Weiss, MTA, danken, die immer mit konstruktiven Vorschlägen die technische
Durchführung der Arbeit erleichtert haben.
Herrn Prof. Dr. Morgenroth, Leiter des Pathologischen Institutes, und Herrn Dr. med.
Burger möchte ich für das Überlassen des Tumormateriales und die Hilfe bei der
histologischen Begutachtung danken.
Herrn Dr. med. F. Brands, Facharzt für Urologie, möchte ich für die die Mitbetreuung
der Arbeit unter klinischen Gesichtspunkten und die Hilfe bei der statistischen
Auswertung ganz herzlich danken.
Zum Schluss möchte ich mich bei meinen Eltern, Lore und Reinold Wach bedanken.
Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.
Meiner lieben Ehefrau Nicole möchte ich für die zahlreichen Korrekturen und die
Geduld danken, die sie während dieser Zeit aufgebracht hat.
Weiterer Dank gilt Sandra Steffl (Korrektur), Petra Zinnen (Recherche) und den
Mitarbeitern des Archivs im Marienhospital in Herne.
Weiterhin möchte ich mich nochmals ganz herzlich bei Herrn Prof. Dr. med. Senge,
emeritierter Direktor der Urologischen Klinik des Marienhospitals in Herne, für die zur
Verfügungstellung des Labors und dessen Infrastruktur bedanken.
8 Anhang
103
8.4 Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Geburtstag:
Anschrift:
Familienstand:
Eltern:
Carsten Wach
16.08.73
Spatzenweg 12
58256 Ennepetal
verheiratet
Lore Wach (geb. Tycner), Sekretärin, Reinhold Wach,Techniker
Schulbildung:
08/1980-6/1984
07/1984-06/1993
06/1993
Grundschule Wassermaus Ennepetal
Reichenbachgymnasium Ennepetal
Allgemeine Hochschulreife
Hochschulbildung und beruflicher Werdegang:
10/1994
Beginn des Studiums an der Ruhr-Universität-Bochum
08/1996
Ärztliche Vorprüfung
08/1997
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2000
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/2000
Praktisches Jahr: Universitätsklinik–Marienhospital-Herne
(Wahlfach Urologie) und Medizin Spital Limmattal (Universität Zürich)
05/2001
Abschluss des Studiums mit dem dritten Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
06/2001
AIP Urologische Klinik Allgem. Krankenhaus Hagen CA Dr. Hahn
01/2002
AIP Chirurgische Klinik Allg. Krankenhaus Hagen CA Prof. Dr. Stegemann
01/2003-dato
Assistentenstelle Helios-Klinik Schwelm, Urologische Klinik CA Dr. Meyer
Famulaturen und Fortbildungen:
02/1997
Famulatur Orthopädie Universitätsklinik Josefshospital Bochum (1 Monat )
09/1997
Famulatur Urologie Allgemeines Krankenhaus Hagen (1 Monat)
03/1998
Famulatur Innere Medizin Allgemeines Krankenhaus Hagen (1 Monat)
07/1998-08/1998
Famulatur Chirurgie Oshakati Regional Hospital Namibia (2 Monate)
09/1998
Famulatur Anästhesie Oshakati Regional Hospital Namibia (1 Monat)
SS 1999
Kursus der EKG-Diagnostik Prof. Dr. Barmeier Bergmannsheil Bochum.
09/2001
Strahlenschutzkurs (Einführung, Grund-und Spezialkurs)
05/2001
Kursus der Abdominalsonographie
12/2003
Fachkunde Rettungsdienst