Detektion der Heliobacter Pylori Infektion über einen

LSC
Applikationsnote 26
Überarbeitet von Dr. Ronald Edler
Juni 2005
Detektion der Heliobacter Pylori Infektion über einen 14CHarnstoff Atemtest
Dr. Nigel Bird, Universität Sheffield, Abteilung Surgical and Anaesthetic Sciences, Royal
Hallamshire Krankenhaus, Sheffield, UK S102JF
Einleitung
Für den größten Teil dieses Jahrhunderts
galt die medizinische Meinung, vertreten
durch den kroatischen Physiker Karl
Schwarz,
dass
ohne
Säure
kein
Magengeschwür
auftritt.
Daher
konzentrierte sich bislang die Therapie auf
die
Reduktion,
Entfernung
oder
Unterdrückung unerwünschter Magensäure
Sekretion, allerdings oft mit begrenztem
Erfolg. Doch 1984 konnten Marshall und
Mitarbeiter1,2) zeigen, dass ein Organismus
der sich als Heliobacter entpuppte
zumindest teilweise wenn nicht sogar
vollständig für die Entwicklung von
Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren
verantwortlich war. Der Organismus wurde
Heliobacter pylori genannt. Aus diesem
Grund wurde daraufhin eine Therapie auf
der Basis von Antibiotika (allein oder in
Kombination mit Säurehemmern) mit
spektakulärem Erfolg eingesetzt.3,4)
häufig mehrere Biopsien erforderlich. Es
wurde eine einfachere Biopsie entwickelt,
der CLO (Campylobacter Like Organism)
Test, wobei die Probe auf einem Glasträger
gehalten wird. Auf dem Glasträger
befindet sich ein immobilisiertes Gel mit
Harnstoff und einem Indikator. Die
Harnstoffaktivität des Organismus baut
den Harnstoff ab und bewirkt eine
Verschiebung des pH-Wertes, welcher
durch eine Farbänderung des Indikators
detektiert wird. Abgesehen von der
Einfachheit des Tests leidet dieser Test
unter den Nachteilen die mit allen Biopsien
verbunden
sind.
Daneben
kann
Magensäureunterdrückung,
Magen
Atrophie
und
Kontamination
mit
Gallenflüssigkeit zu falsch Positiven
führen.
Die Messung von 14CO2 in der
ausgeatmeten Luft nach der Einnahme
einer mit 14C markierten Mahlzeit wurde
seit vielen Jahren für die Diagnose
verschiedener Krankheiten verwendet. Die
Entwicklung eines Atemtests für H. pylori
nach diesem Prinzip war deshalb eine
logische
Folge
und
signifikante
Verbesserung gegenüber anderen Tests.
Das Prinzip dieses Tests wird in Abbildung
1 auf der folgenden Seite gezeigt. Die
infizierte Person erhält ein Getränk mit
14
C-markiertem
Harnstoff.
Die
ausgeatmete Luft der Person wird
gesammelt und im Szintillationszähler auf
den Gehalt an 14C untersucht. Bei
infizierten Personen wird der Harnstoff zu
Ammoniak und Kohlendioxid abgebaut
und
das
entstehende
markierte
Kohlendioxid sollte im Szintillationszähler
gemessen werden können.
Methoden zur Detektion der H. Pylori
Infektion
Das Anlegen von Kulturen dieses
Organismus über Biopsien am Magen
erwies sich als außergewöhnlich schwierig
und war deshalb für die Routine nicht
geeignet. Deshalb wurde der Nachweis
einer H. pylori Infektion ursprünglich mit
konventionellen histologischen Techniken
über Biospien, erhalten während der
Endoskopie
von
Magen
und
Zwölffingerdarm, durchgeführt. Allerdings
wurde von Simor und Mitarbeitern
berichtet, dass die Empfindlichkeit dieser
Methode gering sei.5) und da H. pylori
dazu tendiert ungleichmäßige Kolonien auf
der Magenschleimhaut zu bilden, sind
1
14
14
C-Harnstoff
H2N
H2N
14
C=O
CO2
Urease
2 NH3
+
14
CO2
Abb. 1: Prinzip des Harnstoff Atemtests
in der Flüssigkeit absorbiert wird. Der
Schlauch enthält Silicagel um Wasser in
der Atemluft zu absorbieren und um
versehentliche
Aufnahme
von
Szintillationscocktail aus dem Glasvial zu
vermeiden. Wenn das Hyamin neutralisiert
ist, wird dies durch einen Farbumschlag
des Phenolphthaleins angezeigt. Dies ist
der Fall, wenn 2 mmol ausgeatmetes CO2
gesammelt wurden. Die Sammlung von
CO2 wird jetzt gestoppt.
Nun wird dem Patienten eine flüssige
Mahlzeit (150ml) mit 250 Kcal, die acht
Gramm Fett enthält, gegeben. Nach fünf
Minuten wird dem Patienten 37 KBq von
14
C markiertem Harnstoff in der gleichen
flüssigen Mahlzeit gegeben. Das erste
Getränk wird mit dem Ziel gegeben, die
Entleerung
des
Mageninhaltes
zu
verzögern, damit die markierte Probe im
zweiten Getränk für mindestens fünf
Minuten
in
Kontakt
mit
der
Magenschleimhaut und vorhandenen H.
pylori Organismen bleibt. Atemproben
werden 15, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten
nach der Mahlzeit genommen. Zu den
Proben wird 20ml Emulsifier Safe gegeben
und die Proben eine Stunde im Dunkeln
aufbewahrt.
Bei nicht infizierten Personen kommt es zu
keinem Abbau des Harnstoffs und da
dieser
in
keinen
wesentlichen
biochemischen Systemen vorkommt, wird
er über den Urin ausgeschieden. Der
wesentliche Vorteil von diesem Test ist die
Tatsache, dass er nicht nur einfach und
preiswert durchzuführen ist, sondern dass
eine Infektion in jedem beliebigen Teil des
Magens zu einem positiven Resultat führt.
Andere Urease produzierende Organismen
wie Proteus und Klebsiella bilden
vergleichsweise sehr kleine Mengen an
Urease und werden nur selten im Magen
gefunden, weshalb keine ernsthafte Gefahr
für falsch positive Resultate besteht.
Materialien und Methoden
Nach einer sechs Stunden Fastenzeit wird
eine Basislinie der ausgeatmeten Luft
gezählt. Die Probe wird gesammelt, indem
gleichmäßig in einen Schlauch ausgeatmet
wird. Der Schlauch endet in einem 20 ml
Glasvial für Szintillationsmessungen,
welches
4ml
0,5M
Hyamin
(Benzethoniumhydroxid) und 0,5 ml
0,04M Phenolphthalein
als Indikator
enthält. Die Spitze des Schlauches befindet
sich unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche
im Glasvial, damit alles ausgeatmete 14CO2
2
Danach erfolgt eine Messung im
PerkinElmer LAS TriCarb 2100TR für 10
Minuten, vergleichbar mit dem TriCarb
2800TR der aktuellen TriCarb Serie.
zeigen, dass der Test extrem empfindlich
ist. Eine Infektion kann bereits 15 Minuten
nach der Einnahme der 14C markierten
Harnstoffprobe nachgewiesen werden.
Therapierte Patienten zeigen nach kurzer
Behandlung Messwerte die nur noch
geringfügig oberhalb der Basislinie liegen.
Resultate und Diskussion
Tabelle 1 zeigt die Mittelwerte in einem
99% Vertrauensbereich sowohl für positive
als auch negative Patienten. Die Daten
Positiver Harnstoff Atemtest
DPM Mittel
Standardabweichung
des Mittelwertes
99%
Vertrauensbereich
15
477,7
91,1
Probennahmezeit (Minuten)
20
30
40
50
683,2
903,9
980,5
1100,9
122,2
212,6
198,1
233,5
283,0
379,6
660,4
596,6
703,3
60
1133,1
236,4
712,3
Negativer Harnstoff Atemtest
DPM Mittel
Standardabweichung
des Mittelwertes
99%
Vertrauensbereich
15
47,5
11,5
20
43,3
7,5
37,4
24,4
Probennahmezeit (Minuten)
30
40
50
39,9
35,0
38,2
3,8
4,4
4,8
12,5
12,9
14,0
60
38,3
4,3
12,6
Tabelle 1: Messergebnisse von positiven und negativen Patienten
absorbiert ist. Dies wurde auch angezeigt
durch eine Rückkehr zu einer blauen Farbe
des Indikators nach längerem stehen der
Probe. Andere getestete Cocktails führten
teilweise zu einer stark gelblichen Färbung
mit entsprechend großen Quencheffekten.
Emulsifier Safe zeigte keine dieser
Probleme und brauchte wenige Zeit um die
Lumineszenz abklingen zu lassen.
Es wurden drei Szintillationscocktails von
verschiedenen Anbietern (zwei davon jetzt
zu PerkinElmer LAS gehörig) getestet.
Dabei zeigte sich, dass nur wenige
Cocktails in dem basischen Medium keine
oder nur geinge Lumineszenz zeigen. Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen werden
in Tabelle 2 und 3 auf der nächsten Seite
gezeigt. Optiphase Safe zeigte recht hohe
Chemilumineszenz und Verluste an
gelöstem CO2. Ein gleiches Verhalten
würden auch Ultima Gold Cocktails
zeigen. Diese Cocktails sind im leicht
sauren gepuffert um Chemilumineszenz in
basischen Proben zu unterdrücken und
können daher zu Verlusten von CO2
führen, wenn dieses in basischen Lösungen
3
Nur Cocktail
Optiphase Safe
Anderer Cocktail
Emulsifier Safe
Blanks
Optiphase Safe
Anderer Cocktail
Emulsifier Safe
370 KBq Standard
Optiphase Safe
Anderer Cocktail
Emulsifier Safe
tSIE
392
594
404
CPM
32
26
21
DPM
34
27
22
Lumineszenz
50
4
0
297
236
191
176
19
24
191
21
27
80
7
0
363
237
193
10078
21247
21205
10780
20205
20449
21
0
0
Tabelle 2: Performance verschiedener Cocktails
1 Stunde
4 Stunden
12 Stunden
24 Stunden
48 Stunden
72 Stunden
96 Stunden
E
E
E
E
E
E
E
Zeit nach der Zugabe des Cocktails
DPM
Lum %
DPM
113
15
A
157
111
8
A
138
108
3
A
127
104
1
A
118
103
0
A
115
104
1
A
108
103
0
A
101
Lum %
51
47
38
23
18
2
0
Tabelle 3: Abklingen der Chemilumineszenz in Emulsifier Safe (E) und
einem anderen (A) Cocktail
Zusammenfassung
Der 14C markierte Harnstoff Atemtest ist
eine kostengünstige, zuverlässige und
empfindliche Methode als Test auf eine H.
pylori Infektion. Durch Verwendung
geringerer Dosen (zum Beispiel 37 KBq)
und einer längeren Sammlung des
ausgeatmeten
CO2
kann
die
Empfindlichkeit beibehalten aber die
Exposition durch radioaktive Isotope auf
ein Minimum beschränkt werden. Stubbs
und Marshall6) berechneten dass die
maximale effektive Äquivalentdosis für
den 37 KBq 14CO2 Atemtest bei 0,08
mSv/MBq liegt, was einer elfstündigen
Belastung
mit
der
natürlichen
Backgroundstrahlung gleichzusetzen ist.
Der Umfang von Patientenuntersuchungen
bleibt zur Zeit unklar. Während Tests vor
einer Behandlung empfohlen werden, ist
noch unklar in welchem Umfang auch
Tests nach einer Behandlung sinnvoll sind.
Die Ergebnisse bei einigen Patienten
zeigten nach einmaliger Behandlung mit
Antibiotika, dass die Werte bei den
Atemtests noch über den Werten von H.
pylori negativen Patienten liegen können.
In diesen Fällen muss von der Möglichkeit
einer noch vorhandenen Restinfektion
ausgegangen werden. Die Konsequenzen
daraus sind noch unklar und die
ökonomischen
Konsequenzen
einer
nochmaligen Antibiotika Behandlung oder
einem
erneuten
Geschwür
mit
erforderlicher Endoskopie und weiterer
Behandlung sind ungelöst.
4
Heliobacter pylori, NEJM 332,
139-142 (1995).
4.) M. A. Mendall, T. C. Northfield;
Transmission of Heliobacter pilori,
Gut 37, 30-34 (1995).
5.) A. E. Simor, N. B. Cooter, D. E.
Low; Comparison of four stains
and a urease test for rapid detection
of Heliobacter pylori in gastric
biopsies. Eur. J. Microbiol. &
Infect. Dis. 9, 350-352 (1990).
6.) J. B. Stubbs, B. J. Marshall;
Radiation dose estimates for the
14Carbon-labeled urea breath test,
J. Nuclear Med, 34, 5 (1993).
Literatur
1.) B. J. Marshall, H. Royce, D. I.
Annear et al.; Original isolation of
Campylobacter pyloridis from
human gastric mucosa. Microbiol.
Lett. 25, 83-88 (1984).
2.) B. J. Marshall, J. R. Warren;
Unidentified curved bacilli in the
stomach of patients with gastritis
and peptic ulceration. Lancet i,
1311-1314 (1984).
3.) J. J. Sung, S. C. Chung, T. K. W.
Ling et al.; Antibacterial treatment
of gastric ulcers associated with
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