Etablierung, Validierung und Standardisierung neuer - gfid-ev
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Laborzentrum Bremen Etablierung, Validierung und Standardisierung neuer durchflusszytometrischer Methoden Gregor Rothe Bremer Zentrum für Laboratoriumsmedizin GmbH & LADR GmbH MVZ Bremen Laborzentrum Bremen Methodische Grundlagen Si gn al wa nd le r FSC 670 nm FL-3 580 nm FL-2 FL-1 520 nm 488 nm PM T SSC 488 nm Laser Zellen Laborzentrum Bremen Prinzip der korrelierten Zellanalyse Histogramm eindimensional 10000 P r o b e „Dot Plot“zweidimensional Fl1+/Fl2+ Fl1-/Fl2- Fl1+/Fl2- 10 100 1000 10000 100 0 Fluoreszenz 2 10 PMT 2 Fluoreszenz 2 1000 Fl1-/Fl2+ PMT 1 0 Laser 0 10 100 1000 10000 Fluoreszenz 1 0 10 100 1000 10000 Fluoreszenz 1 Laborzentrum Bremen Durchflusszytometrische Werkzeuge Materialien • Peripheres Blut • Knochenmark • Bronchoalveolarlavage • Liquor • (vereinzelte) Lymphknoten • Aszites etc. Färbungen • Immunphänotypisierung – CD-Marker – Intrazelluläre Antigene • Biochemische Färbungen – RNA / DNA – Enzyme Laborzentrum Bremen Grundlegende Methoden der Zytometrie • Konzentrationsbestimmung von nur immunologisch erfassbaren Zellen (z.B. CD4/CD8 T-Zellen, CD34 Vorläuferzellen) • Charakterisierung mikroskopisch nicht sicher einzuordnender Zellen (Linie, Reifung, Klonalität, Zählung unter Therapie) • Erfassung krankheitsspezifischer Abnormitäten (T-Zellaktivierung, Anergie von Monozyten, Dysplasien, Funktionsstörungen) Laborzentrum Bremen Strategien zur Erweiterung des diagnostischen Repertoires Zertifzierte Tests • CD4+ T-Zellen („Immunstatus“) • CD34+ Vorläuferzellen • HLA-B27 • Restleukozyten in Blutprodukten • CD38 auf T-Zellen • HLA-DR auf Monozyten Klinisch etablierte Methoden • Leukämischer Blastenschub • Minimale Resterkrankung • Prämaligne Erkrankungen • Angeborene Immundefekte • CVID • Cross-Match-Analytik • Antigen-spezifische T-Zellen Klinische Forschung • • • • Dendritische Zellen Allo- und Autoantikörper Basophilenaktivierung Prothrombotische Syndrome • Transplantationsmonitoring • Multi-Drug-Resistance Integration in analytischen Prozess Multizentrische Validation von Assays Publikation von Protokollen Akkreditierung Konsensusbildung Optimierung und „Proof of Principle“ Laborzentrum Bremen Klinisch getriebene Herausforderungen Zirkulierende endotheliale Progenitorzellen als Korrelate kardiovaskulärer Ereignisse Werner N et al., N Engl J Med 2005;353:999-1007 Kinetik und Viabiliät zirkulierender Endothelzellen als prognostische Prediktoren bei Mammakarzinomen unter antiangiogener Therapei Mancuso P et al., Blood 2006;108:452-459 Therapie-assoziierte Veränderungen bei minimaler Resterkrankung nach kindlichen akuten lymphatischen Leukämien Gaipa G et al., Leukemia 2005;19:49-56 Komplexe Expressionsmuster als Korrelate der Myelodysplasie bei ungeklärten Zytopenien Kussick SJ et al., Am J Clin Pathol 2005;124:170-181 Diagnostische Charakterisierung von CD34+ Zellen bei niedriggradigen Myelodysplasien Ogata K et al., Blood 2006;108:1037-1044 Laborzentrum Bremen Klinische Validierung der Wirksamkeit diagnostischer Tests Hernandez JS et al. Arch Pathol Lab Med 2003 Laborzentrum Bremen Probleme der klinischen Methodenetablierung an aktuellen Beispielen • Charakterisierung prämaligner Veränderungen – Myelodysplasie – Klonale B-Zellproliferationen – Klonale Gammopathien • Basophilenaktivierung in der Allergiediagnostik • Zirkulierende endotheliale Progenitorzellen – Kardiovaskuläre Erkrankungen – Inflammation – Neovaskularisation bei Tumoren Laborzentrum Bremen Aberrante Expressionensdichten bei AML Laborzentrum Bremen Definition aberranter Phänotypen bei Myelodysplastischen Syndromen Van de Loosdrecht AA et al., Blood 2008 Laborzentrum Bremen MDS-Score und Klinik Van de Loosdrecht AA et al., Blood 2008 Laborzentrum Bremen Analyse von Reifung und Klonalität bei B-Zellen Laborzentrum Bremen MARGINAL ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, sIg, FMC7, bcl-2 (CD5, CD10, CD23, bcl-6 neg) NODAL MALT CLL CD19, CD20, CD23, sIg+/-, CD5 (CD79 CD10, CD22, FMC7 neg) HCL CD19, CD20, CD22, sIg++, CD11c, CD25, CD103 (CD5, CD10, CD23 neg) T LYMPHOMAS SEZARY CD3, CD2, CD5, CD4, CD7+/-(CD8 neg) LARGE CELLS ANAP¨LASTIC CD2, CD4, CD3+/-, CD30 PERIPHERAL CD2, CD3, CD5, CD4 ANGIOCENTRIC CD2, CD5, CD4 ou CD8, CD56 INTESTINAL CD3, CD7, CD103 MANTLE ZONE CD19, CD20, CD22, CD79, CD5, CD43, bcl-1 (CD10, CD23 neg) BURKITT CD19, CD20, CD22, CD79, sIg, CD10, DR, bcl-6 (CD5, CD23, Tdt neg) INTESTINAL OR LUNG MALT Follicular, mantle zone, marginal zone SLVL Circulating marginal zone cells FOLLICULAR CD19, CD20, CD22, CD79, sIg, CD10 (CD5, CD23, CD43 neg) CENTROBLASTIC or IMMUNOBLASTIC Large cell Lymphomas CD19, CD20,CD79, CD22++, CD79, CD10+/(CD5 neg) Bene MC et al., ELN 2005 WALDENSTROM CD19, CD20, CD22, CD79 cIg, FMC7 (CD5, CD10, CD23 neg) MYELOMA cIg, CD56, CD45, CD38, CD138 (CD19, CD20, CD22 neg) Prävalenz CLL-artiger monoklonaler B-Zell-Lymphozytosen Marti G et al., Br J Haematol 2007 Laborzentrum Bremen Monoclonale B-Lymphozytose und Progression zu B-CLL Rawstron AC et al., NEJM 2008 Laborzentrum Bremen Sirohi B and Powles R, Lancet 2004 Molekulare Pathogenese des Multiplen Myeloms Laborzentrum Bremen Zytoplasmatische Klonaliätsanalyse bei Plasmazellen Laborzentrum Bremen Laborzentrum Bremen Rawstron AC et al., Blood 2002 Aberrante Plasmazellen und Prognose bei MGUS und SMM Perez-Persona E et al., Blood 2007 Laborzentrum Bremen Neoplastische Plasmazellen im KM bei Immunfixations-negativen Patienten Davies FE et al., Best Pract Res Clin Haematol 2002 Laborzentrum Bremen Basophilenfunktion und IgE-vermittelte Immunantwort Kawakami T et al., Nat Rev Immunol 2002 Laborzentrum Bremen Ebo DG et al., Clin Cytometry 2008 Expression von CD63 und CD203c in der Analyse der Basophilenaktivierung Laborzentrum Bremen Diskordanz von Basophilenaktivierungstests deWeck AL et al., Int Arch Allerg Immunol 2008 Laborzentrum Bremen Ebo DG et al., Clin Cytometry 2008 Monitoring der Desensibilisierung bei Wespengiftallergie Laborzentrum Bremen Ebo DG et al., Clin Cytometry 2008 Sensitivität und Spezifität von Basophilenaktivierungstests Laborzentrum Bremen Kawamoto A & Losordo DW, TCM 2008 Endotheliale Progenitorzellen und postnatale Neovaskularisation Laborzentrum Bremen Klinik zirkulierender endothelialer Progenitorzellen • Reduziert bei aktiver rheumatoider Arthritis (Grisar J et al., Circulation 2005) • Erhöht bei Sepsis und Korrelation zum Überleben (Rafat N et al., Circulation 2007) • Gesteigert bei progredienten soliden Tumoren (Beerepoot LV et al., Ann Oncol 2004) • Negative Korrelation zu kardiovaskulären Ereignissen bei KHK (Werner N et al., N Engl J Med 2005) Laborzentrum Bremen Antigene zur Erfassung zirkulierender endothelialer Zellen Strijbos MH et al., Br J Cancer 2008 Laborzentrum Bremen Methodenvergleich zur Quantifizierung von CEC im peripheren Blut Van Craenenbroeck EMF et al., J Immunol Methods 2008 Laborzentrum Bremen Methodenvergleich zur Quantifizierung von CEC im peripheren Blut Van Craenenbroeck EMF et al., J Immunol Methods 2008 Laborzentrum Bremen Multidimensionale Gating-Strategien für die Detektion von CEC Jacques N et al., J Immunol Methods 2008 Laborzentrum Bremen Zelluläre Diagnostik - Chancen und Limitationen • Privilegierter Bereich der Diagnostik – „In Haus“-Adaptation von neuen Targets durch weit offene Analyseplattformen – Vergütung des Messprinzips unabhängig vom diagnostischen Beitrag • Regulativ und kommerziell bedrohter Bereich – Akkreditierung fordert dokumentierten klinischen Nutzen – IVD-Richtlinien fordern Assayvalidierung für hausübergreifenden Testeinsatz • Indikationsspektrum im Umbruch begriffen – Die gesteigerte Sensitivität der Erkennung pathologischer Veränderung definiert Herausforderungen an die Klinik – Komplexe Methoden erfordern verstärkte Anstrengung an die Standardisierung, Validierung und Effektivitätsbeurteilung von Testsytemen Laborzentrum Bremen Professionalisierung der Zellulären Diagnostik Labororganisation • Strukturierte Testimplementation • Akkreditierung Befundinformation Präanalytik • Nachvollziehbare Befundung • Transparenz • Probenidentifikation • Stabilisierung Testformate Prozessierung • Biophysikalische Kalibration • Objektive Datenextraktion • Prozesssicherheit • Dokumentation Laborzentrum Bremen
