Analyse des Mononatriumglutamatgehalts in
Werbung
Deutschhaus-Gymnasium Würzburg Abiturjahrgang 2013 SEMINARARBEIT Rahmenthema des Wissenschaftspropädeutischen Seminars: Lebensmittelchemie Leitfach: Chemie Thema der Arbeit: Analyse des Mononatriumglutamatgehalts in Tomatenprodukten Verfasser/in: Kursleiter/in: Philipp Stephan H. Seefried Abgabetermin: 06.11.2012 Bewertung Note Notenstufe in Worten Punkte Punkte schriftliche Arbeit ×3 Abschlusspräsentation ×1 Summe: Gesamtleistung nach §67 (7) GSO = Summe ÷ 2 (gerundet): Datum und Unterschrift der Kursleiterin bzw. des Kursleiters Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Geschmacksverstärker . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Mononatriumglutamat . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1. Vorkommen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.2. Chemische Einordnung . . . . . . . . . . . . . 1.2.3. Gewinnung und Produktion . . . . . . . . . . 1.2.4. Verbrauchereinschätzung und Risikobewertung 1.3. Wahl der Lebensmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1. Auswahlkriterien . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2. Gewählte Lebensmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 5 5 5 6 6 7 7 8 2. Aufbereitung der Proben 2.1. Vorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. Physikalische Aufbereitung: Zentrifugation 2.3. Chemische Aufbereitung: Derivatisierung . 2.3.1. Durchführung . . . . . . . . . . . . 2.3.2. Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. Probenübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 10 11 12 12 13 15 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. Verwendete Analysegeräte 16 3.1. Der Gaschromatograph . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 3.2. Das Massenspektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.3. Das GC/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4. Analyse 19 4.1. Durchführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.2. Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.3. Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 5. Fehlerdiskussion und Fazit 24 A. Chemikalienverzeichnis und Gefahrstoffkennzeichnung 26 Literaturverzeichnis 28 Eigenständigkeitserklärung 31 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan 1. Einleitung Viele Lebensmittel sind heutzutage Convenience Produkte; vor allem als Student wird man wohl oft auf die einfach zuzubereitende und günstige Kost zurückgreifen. Doch diese Produkte stehen im Verruf voll von ungesunden oder gar gesundheitsschädlichen Zusatzstoffen zu sein. Gerade wenn es darum geht ein Gericht lange haltbar und trotzdem schmackhaft zu machen, werden Geschmacksverstärker und Antioxidantien zuhauf eingesetzt. Viele Hersteller werben damit, ihre Produkte seien „Ohne künstliche Zusatzstoffe“, dennoch warnen Verbraucherschutzorganisationen vor den Zusätzen und werfen den Lebensmittelfabrikanten Etikettenschwindel vor. Zum Beispiel werden statt künstlicher Zusatzstoffe natürliche verwendet, was nicht heißen muss, dass diese nicht künstlich hergestellt wurden. Auch wird mit „Ohne Zusatzstoffe lt. Gesetz“ geworben, ohne dass vielen klar ist, was die gesetzliche Definition eines Zusatzstoffes ist. Die deutsche Gesetzgebung legt nämlich fest: [. . . ] ausgenommen sind Stoffe, die natürlicher Herkunft oder den natürlichen chemisch gleich sind und nach allgemeiner Verkehrsauffassung überwiegend wegen ihres Nähr-, Geruchs- oder Geschmackswertes oder als Genussmittel verwendet werden[. . . ]. [1] Somit fallen künstlich hergestellte (das heißt: nicht der Natur entnommen) Stoffe nicht unter die Definition eines Zusatzstoffes, wenn sie so auch identisch in der Natur vorkommen. Als künstlich gelten sie nur dann, wenn sie nicht irgendwo in der Natur vorhanden sind. So kann man auch dann mit „Ohne künstliche Zusatzstoffe“ werben, wenn man die Zusatzstoffe in einer Fabrik herstellt. Eine andere beliebte Praxis ist es, statt langen chemischen Namen einfach eine ENummer1 anzugeben um so den Käufern keine „Angst einzujagen“. Außerdem gibt es für viele Zusatzstoffe, die mit ihrem chemischen Namen abschreckend wirken, zugelassene Alternativbezeichnungen, die oft viel harmloser klingen (siehe auch Unterabschnitt 1.2.4). Viele Verbraucher fühlen sich dadurch in die Irre geführt. [17] Wenn es natürliche Aromastoffe und Geschmacksverstärker gibt, die auch industriell eingesetzt werden, was ist dann mit natürlichen Produkten, in denen diese schon vorhanden sind? Diese müssen oder können dann nicht angegeben werden. Vergisst man bei all der Verteufelung der Geschmacksverstärker nicht, dass auch die Natur solche Stoffe einsetzt um ihre Erzeugnisse schmackhaft zu machen? Wie stark unterscheiden sich 1 „Die E-Nummer ist [. . . ] das Zeichen dafür, dass für den betreffenden Stoff im Rahmen des Zulassungsverfahrens der Europäischen Union nachgewiesen wurde, dass er auf seine gesundheitliche Unbedenklichkeit überprüft wurde[. . . ].“ [7] 3 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan Lebensmittel aus natürlichen Zutaten von der durchschnittlichen Tütensuppe aus dem Supermarkt? Da meine Familie selbst darauf achtet, möglichst ohne Convenience Produkte auszukommen und Lebensmittel ohne „künstliche Zusatzstoffe“ zu kaufen, hat mich diese Fragestellung persönlich interessiert. Um im Rahmen der Seminararbeit zu bleiben, konzentriere ich mich hier ausschließlich auf Geschmacksverstärker und auf Mononatriumglutamat im Besonderen. 1.1. Geschmacksverstärker Als Geschmacksverstärker werden Stoffe bezeichnet, die unter anderem spezielle Geschmacksnoten wie „Fülle“ oder „Volumen“ beeinflussen. Auch ist es möglich, dass Geschmacksverstärker die Geschwindigkeit verändern, mit dem ein Aromaeindruck entsteht [14] . Obwohl sie oft keinen Eigengeschmack haben, verstärken sie den Wohlgeschmack einer Speise. Diese Geschmacksempfindung wird „Umami“ 2 genannt und existiert zusätzlich zu den bekannten Grundgeschmacksrichtungen süß, salzig, sauer und bitter. [13] Wie alle anderen Lebensmittelzusatzstoffe müssen auch Geschmacksverstärker geprüft und zugelassen werden, bevor sie von der Industrie eingesetzt werden dürfen. Möchte eine Firma einen Stoff zugelassen bekommen, muss sie einen Antrag an die Europäische Kommission stellen. Dieser Antrag beinhaltet unter anderem auch detaillierte Informationen wie etwa Herstellungsprozess, Analysedaten, Verunreinigungen und die biologischen und toxikologischen Daten. Außerdem müssen veröffentlichte und unveröffentlichte Studien, die bestimmte Richtlinien der Objektivität erfüllen, zur Überprüfung vorgelegt sowie weitere Hilfestellung bei der Literaturrecherche zur Verfügung gestellt werden. [5] Nach Einreichung eines solchen Antrags ersucht die Kommission dann die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit um ein Gutachten. Diese legt das Gutachten binnen neun Monaten der Kommission, den europäischen Mitgliedstaaten und dem Antragsteller vor. Außerdem können von der Kommission erweiterte Informationen über den zuzulassenden Stoff angefordert werden. Innerhalb von erneuten neun Monaten wird dann eine Änderung der Liste der zugelassenen Lebensmittelzusatzstoffe von der Kommission dem europäischen Ausschuss vorgelegt. Dieser muss die Änderungen dann noch bewilligen. [4] Zu den Geschmacksverstärkern gehören unter anderem Verbindungen der Gruppen: Glutaminsäure und ihre Salze, Guanylsäure und ihre Salze, Inosinsäure und ihre Salze und Lactate. [6] Da die Salze der Glutaminsäure einige der meist verwendeten Geschmacksverstärker sind, stehen sie besonders in der Kritik, schädlich zu sein. Deshalb ist es interessant, sich dieser genauer anzunehmen. 2 japan., in etwa für „Wohlgeschmack“ 4 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan 1.2. Mononatriumglutamat 1.2.1. Vorkommen O O HO O OH NH2 (a) L-Glutaminsäure O HO OH NH2 (b) D-Glutaminsäure Abbildung 1.1.: Die Enantiomere der Glutaminsäure Glutaminsäure, auch „2-Aminoglutarsäure“, ist eine natürliche chirale Aminosäure. In Abbildung 1.1 sind die Enantiomere der Glutaminsäre in ihrer Neutralform dargestellt, obwohl sie unter physiologischen Bedingungen in der Regel als Zwitterionen3 vorliegen. Die L-Form (Abbildung 1.1(a)) ist in der Natur weit verbreitet und proteinogen4 . Sie kommt in fast allen Proteinen vor, somit auch in vielen Lebensmitteln wie Fleischprodukten oder Weizen- und Maiserzeugnissen. „Beispielsweise enthält Casein 23,6 %, Pepsin 19,8 %, Fleisch-Protein 14,6 % u. Weizen-Protein 31,4 % Glu[taminsäure][. . . ].“ [14] . Glutaminsäure ist wichtig für den Stoffwechsel, das Gehirn und die Entgiftung von Ammoniak. [14] Mononatriumglutamat (Abbildung 1.2), oft nur als „Glutamat“ 5 bezeichnet, ist ein Salz der Glutaminsäure. Es wirkt als Geschmacksverstärker und ist auch in vielen natürlichen Lebensmitteln enthalten. Auch wird es vor allem Fleisch- und Suppenprodukten als Würze und Aromastoff zugesetzt. Üblich ist eine Konzentration von 0,1–0,3 % [14] . Mononatriumglutamat trägt die E-Nummer „E 621“. [6] 1.2.2. Chemische Einordnung Mononatriumglutamat ist wasserlöslich und kommt in durchsichtigen Kristallen vor; aufgehäuft erscheint es weiß. Die Summenformel des Glutamatanions lautet C5 H8 NO4 und das Molekülgewicht beträgt 169 g/mol. Das Natrium wurde nicht mit einbezogen, da Mononatriumglutamat in Lebensmitteln oft gelöst vorliegt. Beim Lösen eines Salzes, zum Beispiel in Wasser, bildet sich eine Hydrathülle um die einzelnen Ionen. Da das Natrium bei den Eigenschaften von Mononatriumglutamat eine untergeordnete Rolle einnimmt, betrachten wir hier nur das Glutamatanion. Der Schmelzpunkt von Mononatriumglutamat liegt bei 165 ◦C, dort zersetzt es sich bereits. Die CAS-Nummer ist 142-47-2; die PubChem ID ist 85314. [3] 3 Ein Zwitterion ist ein Molekül das sowohl positive als auch negative funktionelle Gruppen besitzt, insgesamt aber elektrisch neutral ist. [21] 4 ist am Aufbau von Proteinen beteiligt 5 „Glutamate“ bezeichnet eigentlich allgemein die Gruppe der Ester und Salze der Glutaminsäure, aber Mononatriumglutamat ist die im Alltag am häufigsten vorkommende Verbindung, daher verwende ich die Begriffe im Folgenden synonym. 5 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan 1.2.3. Gewinnung und Produktion Zur industriellen Herstellung von Mononatriumglutamat gibt es mehrere MethoO O den. Es existieren sowohl Wege der Extraktion oder Isolierung als auch großtechHO Na⊕ O nische Syntheseverfahren. Die effizienteste NH2 und heute am weitesten verbreitete Methode ist allerdings die Herstellung durch FerAbbildung 1.2.: Mononatriumglutamat mentation mit Bakterien. Hierfür wurde eine besondere Bakterienkultur Corynebacterium glutamicum gezüchtet, die eine Ausbeute von bis zu 30 % erreicht. [8] 1.2.4. Verbrauchereinschätzung und Risikobewertung Da viele Verbraucher bei dem Namen „Mononatriumglutamat“ hellhörig geworden sind und Produkte, denen es zugesetzt wird, meiden, weichen die Hersteller vermehrt auf andere Bezeichnungen aus. Die Begriffe „Würze“, „Speisewürze“, „Sojawürze“, „gekörnte Brühe“ und „Aroma“ bezeichnen alle einen Stoff namens „Hefeextrakt“ [18] , der zwar nicht direkt Mononatriumglutamat ist, dessen einzige Aufgabe jedoch darin besteht, Mononatriumglutamat freizusetzen. Da Hefeextrakt im Gegensatz zu Mononatriumglutamat nicht als Geschmacksverstärker gilt [18] , tragen viele solcher Produkte irreführende Aufschriften wie „Ohne Geschmacksverstärker lt. Gesetz“ (siehe auch Kapitel 1). Sucht man im Internet nach „Glutamat“ findet man dutzende „Verschwörungsseiten“, die Glutamatkonsum mit verheerendsten Folgen für Psyche und Körper in Verbindung bringen. So wird Glutamat als „Gehirnzerstörer“, „Nervengift“, oder sogar als „Droge“ bezeichnet. Oft fällt auch der Begriff „China-Restaurant-Syndrom“ 6 . Betroffene klagen über Kopf- und Gliederschmerzen und Übelkeit nach dem Verzehr von natriumglutamathaltigen Lebensmitteln. [16] All diese „Verschwörungstheoretiker“ arbeiten mit pseudowissenschaftlichen Methoden und berufen sich zwar ab und an auf Studien, benennen diese aber nie direkt, sodass man die Behauptungen überprüfen könnte. Diese Quellen dienen nicht der objektiven Überprüfung solch schwerwiegender Vorwürfe. Sucht man allerdings in anerkannten wissenschaftlichen Zeitschriften oder Veröffentlichungen, so werden diese Anschuldigungen unhaltbar. Gerade weil es eine so kritische Gruppe gibt, wurde eine Vielzahl an Studien durchgeführt, um den Sachverhalt zu überprüfen. Eine doppel-blinde7 Studie mit 71 Probanden kommt zu dem Schluss: [. . . ] The present study led to the conclusion that ‘Chinese Restaurant Syndrome’ is an anecdote applied to a variety of postprandial illnesses; rigorous and realistic scientific evidence linking the syndrome to MSG [Monosodium Glutamate] could not be found. [24] 6 7 traditionell chinesisches Essen enthält viel Sojasoße, Soja ist reich an Mononatriumglutamat. [19] Sowohl Probanden als auch Versuchsleiter wissen nicht, welche Probanden ein Placebo (Scheinsubstanz ohne Wirkung) und welche die echte Substanz erhalten 6 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan Diverse Studien haben erneut gezeigt, dass Glutamat nur in sehr hohen Mengen (> 30 mg/kg Körpergewicht) einen merklichen Einfluss zeigt. Daher wurde keine maximale tägliche Aufnahmemenge festgelegt: [. . . ] Because human studies failed to confirm an involvement of MSG [Monosododium Glutamate] in “Chinese Restaurant Syndrome” or other idiosyncratic intolerance, the JECFA [Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives] allocated an “acceptable daily intake (ADI) not specified” to glutamic acid and its salts. [. . . ] [25] Zwar sind Glutamate wichtige Neurotransmitter im Gehirn [13] , da aber das Natriumglutamat, das durch die Nahrung aufgenommen wird, die Blut-Hirnschranke nicht überwinden kann [11,10] , hat der Glutamatkonsum keinen maßgeblichen Einfluss auf das Gehirn. Mononatriumglutamat ist vom Bundesinstitut für Risikobewertung als ungefährlich eingestuft worden und darf unter Kennzeichungspflicht ohne Mengenbeschränkung eingesetzt werden: Glutamat ist ein zugelassener Lebensmittelzusatzstoff. [. . . ] Verpackte Lebensmittel, denen Glutamat zugesetzt ist, müssen deshalb nach der LebensmittelKennzeichnungs-Verordnung den Hinweis „Geschmacksverstärker“ tragen, gefolgt von der Verkehrsbezeichnung, d.h. ihrem Stoffnamen oder der entsprechenden E-Nummer (E 620 bis E 625). Die Kennzeichnungspflicht gilt auch für „lose“ Ware sowie für Kantinen- und Gaststättenverpflegung, wo ein entsprechender Hinweis auf der Speisekarte erforderlich ist. [. . . ] [2] 1.3. Wahl der Lebensmittel 1.3.1. Auswahlkriterien Da Mononatriumglutamat in sehr vielen Lebensmitteln enthalten ist (siehe Abschnitt 1.2), kommt eine breite Auswahl zur Analyse in Frage. Durch die sehr unterschiedliche chemische Zusammensetzung verschiedener Lebensmittel (z.B. Fleisch, Fisch, Gemüse, Obst, . . . ), gibt es keine einheitliche Methode zur Extraktion/Derivatisierung von Mononatriumglutamat. Zwar existiert Literatur über die Bestimmung des Mononatriumglutamatgehaltes in Fleischprodukten [23] , doch diese Methoden sind zu kompliziert, um sie in einem Schülerlabor durchzuführen, oder verwenden Chemikalien, die für Schüler nicht zugelassen sind. Um das Verfahren so einfach wie möglich zu halten und nicht mehrere Aufbereitungsmethoden verwenden zu müssen, ist es sinnvoll sich auf eine Art Lebensmittel festzulegen. Suppen eignen sich insofern sehr gut, als dass sie einen recht kleinen Feststoffanteil besitzen und bereits viel Wasser enthalten, dies erleichtert die Aufbereitung. Möchte man mit geringen Mitteln eine Stoffanalyse durchführen, sollte man möglichst darauf achten, dass die Menge des nachzuweisenden Stoffes nicht unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Andernfalls könnte man auf Grund unzureichender Messmethoden zu 7 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan falschen Ergebnissen kommen. Deshalb wählte ich Tomatensuppe, da Tomaten schon von Natur aus einen relativ hohen Glutamatgehalt haben. [12] 1.3.2. Gewählte Lebensmittel Hausgemachte Tomatensuppe Zur Herstellung dieser Suppe wurden nur Tomaten und Kräuter aus dem hauseigenen Garten sowie Pfeffer und Salz verwendet. Es befinden sich also garantiert keinerlei (Glutamat-)Zusätze in ihr. Knorr Feinschmecker „Strauchtomaten Suppe mit Basilikum“ Werbung auf der Packung: [. . . ] Natürlich. . . • ohne geschmacksverstärkende Zusatzstoffe • ohne Konservierungsstoffe (lt. Gesetz) • ohne Farbstoffe Zutatenliste: Zutaten: 54 % Gemüse (42 % Tomatenpulver, 8 % Tomaten, [. . . ]), [. . . ], Hefeextrakt, [. . . ], Aroma, [. . . ]. Abbildung 1.3. Knorr Feinschmecker „Strauchtomaten Suppe mit Basilikum“ 8 Zubereitung: 1. Beutelinhalt mit einem Schneebesen in 1/2 l (500 ml) kaltes Wasser einrühren. Unter Rühren aufkochen. 2. 7–8 Minuten köcheln lassen. Ab und zu umrühren. 8 Quelle:http://knorr.de/de/DE/Produktwelt/Produktdetails/KNORR/ e8260b79-2ed2-49c1-a1c3-038887383a41, aufgerufen am 29.10.12 8 Kapitel 1. Einleitung Philipp Stephan Sonnen Bassermann „Meine Tomaten Cremesuppe“ Werbung auf der Packung: Unser Küchenversprechen . . . natürlich ohne: • künstliche Farbstoffe (lt. Gesetz) • Konservierungsstoffe (lt. Gesetz) • geschmacksverstärkende Zusatzstoffe Zutatenliste: Zutaten: [. . . ], Tomatenmark 32 %, Tomaten 7,8 %, [. . . ], Aroma (enthält Sellerie), [. . . ]. Zubereitung: Im Kochtopf: Bei mittlerer Hitze erwärmen. Ab und zu umrühren, ohne Aufkochen. Guten Appetit! In der Mikrowelle: Suppe in ein mikrowellengeeignetes Gefäß geben und abgedeckt bei 700 Watt 2–3 Min. erwärmen. Guten Appetit! Abbildung 1.4. Sonnen Bassermann „Meine Tomaten Cremesuppe“ 9 Zusammenfassung Somit teste ich eine Suppe, die auf jeden Fall Glutamat enthält (Knorr ), da sowohl „Hefeextrakt“ als auch „Aroma“ angegeben ist. Des weiteren eine Suppe, die garantiert keine zugesetzten Geschmacksverstärker oder Ähnliches enthält, weil sie mit hauseigenen Mitteln hergestellt wurde (Hausgemachte) und eine, bei der nicht ganz klar ist, ob Glutamat (oder besser: ein Glutamaterzeuger) zugesetzt wurde: Sonnen Bassermann. Hier wurde zwar „Aroma“ angegeben, allerdings mit dem Zusatz „enthält Sellerie“, sodass nicht ersichtlich ist, ob es sich um Hefeextrakt handelt. Ich fand leider keine Suppe im Supermarkt, die tatsächlich ohne Glutamat(-Erzeuger) produziert wurde. Alle diese Suppen sollten jedoch auch das natürlich in Tomaten vorkommende Glutamat enthalten. 9 Quelle: http://sonnenbassermann.de/?id=151, aufgerufen am 29.10.12 9 Kapitel 2. Aufbereitung der Proben Philipp Stephan 2. Aufbereitung der Proben Da zur Analyse des Mononatriumglutamats die Gaschromatographie verwendet wird und es deshalb bei sehr hohen Temperaturen verdampft werden muss (siehe auch Abschnitt 3.1), würde es sich bei diesem Analyseschritt zersetzen (siehe Unterabschnitt 1.2.2). Um dies zu verhindern, muss es vor der Analyse derivatisiert10 werden. Bei der Derivatisierung wird das Salz Mononatriumglutamat in eine Neutralverbindung überführt, da sich diese bei deutlich niedrigeren Temperaturen verdampfen lässt als ein Salz. Damit sauber derivatisiert werden kann, durchlaufen die Proben eine Reihe von reinigenden Schritten, bevor Chemikalien hinzugegeben werden. 2.1. Vorbereitung Die gekauften Suppen wurden gemäß ihrer Zubereitungsanweisungen zubereitet, mit der Ausnahme, dass destilliertes Wasser statt normales Leitungswasser verwendet wurde, um die Reinheit zu gewährleisten. Nach der Zubereitung ließ ich sie abkühlen, bevor mit der Aufbereitung (siehe Abschnitt 2.2) begonnen wurde. Die hausgemachte Suppe wurde kalt gelassen, da sie bereits gekocht worden war. Abbildung 2.1.: Einige Suppen vor der Zugabe von Norvalin Bei der Aufbereitung wird zwangsläufig ein Teil des Glutamates verloren gehen. Um bei der Analyse den Glutamatgehalt dennoch quantifizieren zu können, wird parallel zu den normalen Proben jeweils noch eine Version hergestellt in der Norvalin (chemisch: L-αAminovaleriansäure) hinzugegeben wurde. Norvalin ist Glutamat chemisch sehr ähnlich, 10 Derivate sind Abkömmlinge einer chemischen Verbindung, die mit ihr in engem Verwandtschaftsgrad stehen und so zur Charakterisierung herangezogen werden können. [14] 10 Kapitel 2. Aufbereitung der Proben Philipp Stephan hat aber eine andere Masse und eignet sich deshalb gut als Vergleichsgröße. Da man weiß, wie viel Norvalin hinzugegeben wurde, kann man später anhand der Messwerte ungefähr den verarbeitungsbedingten Verlust abschätzen und wegen der chemischen Ähnlichkeit auch auf das Glutamat übertragen. So lässt sich also die Wiederfindungsrate bestimmen. Es wird jedoch auch eine Probe ohne Norvalin getestet, da die Zugabe von Norvalin unter Umständen dazu führen kann, dass kein Glutamat mehr nachgewiesen werden kann. [27] Damit dieser Vergleich funktioniert, sollte ungefähr die gleiche Menge Norvalin wie Glutamat zugegeben werden. Da die angegeben Werte von Glutamat in Suppen stark schwanken (130–1100 mg/250ml) [26] , wurde ein Mittelwert von 200 mg Glutamat pro 100 ml Lösung angenommen. Dieser entspricht der zugegebenen Menge von 160 mg Norvalin pro 100 ml Lösung (siehe Gleichung 2.1 und 2.2). n(Glutaminsäure) = 0,2 g m = = 0,001 36 mol M 147 g/mol m(Norvalin) = M · n = 117 g/mol · 0,001 36 mol = 0,16 g (2.1) (2.2) Es wurden zusätzlich noch zwei Testlösungen angesetzt. Ein mal Glutaminsäure und Norvalin im Stoffmengenverhältnis 1 : 1. Dazu wurden 20 mg Glutaminsäure und 16 mg mit der Präzisionswaage gewogen und mit Hilfe eines Ultraschallbads in einem Erlenmeyerkolben in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. Ebenfalls wurde eine Probe mit ausschließlich 20 mg Glutaminsäure in 20 ml Wasser angefertigt. Diese sollen als Vergleichsprobe dienen. 2.2. Physikalische Aufbereitung: Zentrifugation Um alle Feststoffe aus den Proben zu entfernen wurden diese zentrifugiert, da die Suppen zu dickflüssig für eine Filtration sind. Während der Zentrifugation setzen sich durch die Zentrifugalkraft die schwersten Bestandteile (Feststoffe) im Gefäßboden ab, die leichteren schwimmen auf (Lipide) und es kommt zu einer Phasentrennung, bei der die gewünschte Phase vorsichtig abpipettiert werden kann (siehe Abbildung 2.2). Von allen Proben wurden jeweils 100 ml in große Zentrifugengläser gefüllt. Dabei Abbildung 2.2.: Phasentrennung nach der ist zu beachten, jeweils gleich schwere PaaZentrifugation re zu bilden, und diese genau mit einer Waage auszutarieren, da auch die Zentrifugengläser unterschiedlich schwer sind. Bereits kleine Unterschiede im Gewicht können bei hohen Drehzahlen in einer Zentrifuge zu Unwuchten führen und diese zerstören. Im 11 Kapitel 2. Aufbereitung der Proben Philipp Stephan ersten Durchlauf wurden die Proben 20 min bei 3500 min−1 zentrifugiert. Nachdem Abpipettieren blieben etwa 25 ml übrig, die zwar nicht mehr dickflüssig, aber noch sehr trüb und voller Schwebstoffe waren. Deshalb wurden die Proben erneut für 30 min bei 4000 min−1 zentrifugiert. Es blieben etwa 20 ml, die zwar klar erschienen, aber noch zu unrein für eine erfolgreiche Derivatisierung waren. Deshalb wurden die einzelnen Proben in jeweils 9 × 1,5ml Eppendorfreaktionsgefäße gefüllt und mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge 20 min lang mit 14 000 min−1 zentrifugiert. Dieser Schritt wurde nach dem Abpipettieren noch einmal wiederholt. Nun waren die Proben sauber genug um derivatisiert zu werden. 2.3. Chemische Aufbereitung: Derivatisierung 2.3.1. Durchführung [27,20] Da zur Analyse nur kleine Mengen gebraucht werden, verwendet man zum Abmessen der Volumina Microliterpipetten. Diese weisen eine hohe Präzision auch bei kleinsten Mengen auf. Allerdings muss darauf geachtet werden, den Plastikkopf immer zu wechseln um keine Verunreinigungen in die Chemikalien zu bringen. Folgende Stoffe kommen nacheinander in ein Reaktionsgefäß: 270 µl 30 µl 60 µl 40 µl 600 µl destilliertes Wasser Probe Methanol Pyridin Chlorameisensäuremethylester Da bei einer ersten Messung zwar Norvalin, jedoch keine Glutaminsäure nachgewiesen wurde, wurde im zweiten Durchgang dann 300 µl Probe unverdünnt verwendet, jedoch bei den norvalinversetzten Proben noch eine Version mit der oben angegebenen Verdünnung hergestellt. Nach Verschluss des Reaktionsgefäßes wird es 15 min unter gelegentlichem Schütteln und Entlüften zur Reaktion gebracht. Das Derivat wird nun aus der wässrigen Lösung extrahiert. Dazu wurden 250 µl DiAbbildung 2.3.: Phasentrennung nach der chlormethan hinzugegeben. Es kommt zur Zugabe von Dichlormethan Phasentrennung, das Derivat ist in der unteren organischen Phase des Dichlormethans (es hat eine höhere Dichte) gelöst (siehe Abbildung 2.3). Die obere wässrige Phase wurde mit der Pipette abgenommen und erneut mit Dichlormethan versetzt, um eine 12 Kapitel 2. Aufbereitung der Proben Philipp Stephan höhere Ausbeute zu erzielen. Auch hier wurde die obere Phase abgenommen und die beiden unteren Phasen vereint. In dieser ist nun das Derivat in Dichlormethan gelöst. Als Lösungsmittel für den Gaschromatographen eignet sich n-Hexan sehr gut, da es inert11 gegenüber dem Derivat ist und einen geringen Siedepunkt hat. Deshalb wurde das Dichlormethan unter Stickstoff aus dem Reaktionsgefäß ausgeblasen (beschleunigte Verdunstung). Dazu verwendet man eine Nadel oder Pasteurpipette als Aufsatz auf der Stickstoffflasche. Nach dem das gesamte Dichlormethan verdunstet wurde, wurde der verbliebene Feststoff (das Derivat) in 1 ml n-Hexan gelöst. Vor der Analyse wurden die Proben noch einmal 10 min lang mit 14 000 min−1 zentrifugiert, da feinste Schwebstoffe den Gaschromatographen zerstören können. 2.3.2. Reaktion Im ersten Schritt findet eine Amidierung der Glutaminsäure durch den Chlorameisensäuremethylester statt. Hierbei greift der Stickstoff der Glutaminsäure durch nukleophil an das Kohlenstoffatom des Chlorameisenäuremethylesters an und substituiert dessen Chlorid. Da aber Glutaminäure in wässrigem Milieu als Zwitterion vorliegt, also die Carboxylgruppe deprotoniert und die Aminogruppe protoniert ist, besitzt das Stickstoffatom kein freies Elektronenpaar und ist somit nicht nukleophil. Durch den Zusatz von Pyridin als Base wird die protonierte Aminogruppe deprotoniert, sodass der Aminstickstoff nukleophil am Chlorameisensäuremethylester angreifen kann. Das Pyridin erfüllt allerdings noch einen weiteren Zweck: Es beschleunigt die Reaktion durch eine nukleophile Katalyse. In einem vorgelagerten Schritt greift es nukleophil am Chlorameisensäuremethylester an und setzt das Chlorid frei. Dadurch entsteht ein positiv geladener Carbaminsäureester, der elektrophiler ist als Chlorameisensäure, und so schneller vom Stickstoff der Glutaminsäure angegriffen wird. Als Nebenprodukt entsteht Pyridiniumchlorid. Diese Reaktion ist in Abbildung 2.4 dargestellt. Dieses Pyridiumchlorid katalysiert als Säure den zweiten Schritt der Reaktion: Die Veresterung der Carboxygruppen der Glutaminsäure. Dies ist nötig, da im basischen Milieu die Carbonsäure deprotoniert und somit nicht elektrophil genug für den nukleophilen Angriff eines Alkohols ist. Der Carbonylsauerstoff wird protoniert, wodurch der Kohlenstoff der Carboxylgruppe so elektrophil wird, dass selbst das schwache Nucleophil Methanol mit einer nukleophilen Substitution angreifen und nach Umprotonierung Wasser abspalten kann. Dieser schritt ist in Abbildung 2.5 für eine Carboxygruppe dargestellt, funktioniert aber bei der zweiten genauso. Die hier für Glutaminsäure beschriebene Reaktion läuft ebenso bei Norvalin ab. Es enstehen das in Abbildung 2.6(a) gezeigte Glutaminsäurederivat und das in Abbildung 2.6(b) gezeigte Norvalinderivat. 11 reaktionsträge gegenüber einem potentiellen Reaktionspartner [21] 13 Kapitel 2. Aufbereitung der Proben Philipp Stephan O Cl O Cl O N⊕ CH3 + CH3 O N O O HO OH NH2 O O Cl HO OH O O HN O O N⊕ + HO Cl H OH O N O ⊕ O H CH3 O N CH3 H O O Abbildung 2.4.: Reaktion der Amidierung O O HO N⊕ OH O O HN O⊕ O Cl H HO OH O H O O HN CH3 O O CH3 O O H3 C R O O R O O O O⊕ H2 O + R H H H CH3 O ⊕ CH3 CH3 O H H H O⊕ R CH3 H O H + H⊕ Abbildung 2.5.: Reaktion der Veresterung 14 Kapitel 2. Aufbereitung der Proben O H3 C Philipp Stephan O O O O HN O CH3 H3 C O HN CH3 O O CH3 CH3 O (a) Das Glutaminsäurederivat (b) Das Norvalinderivat Abbildung 2.6.: Die enstandenen Derivate 2.4. Probenübersicht Abbildung 2.7.: Die Proben der Messreihe 1 rein Knorr (Tüte) T Sonnen Bassermann (Dose) D Hausgemacht H gelöste Glutaminsäure G 12 Blindprobe X 1 4 7 10 mit Norvalin TN DN HN GN 2 5 8 11 mit Norvalin, verdünnt TNV DNV HNV GNV 3 6 9 12 13 Tabelle 2.1.: Übersicht über die Proben der Messreihe 2 12 Eine Bildprobe aus reinem n-Hexan, ohne Glutaminsäure 15 Kapitel 3. Verwendete Analysegeräte Philipp Stephan 3. Verwendete Analysegeräte 3.1. Der Gaschromatograph [14,22] Ein Gaschromatograph (oft abgekürzt mit „GC“) trennt die zu analysierenden Verbindungen auf, indem er sie mit Hilfe eines Gases als mobile Phase durch eine Säule 4 leitet, in der die stationäre Phase als Film 2 1 aufgetragen ist. 5 Die Trennsäule (Abbildung 3.1 3 ) besteht aus einer 10–200 m langen, kapillaren Röhre, die meist aus synthetischem Quarzglas hergestellt wird. Die Analyten werden nun mit dem Trägergas durch diese Säule gedrückt. Die Geschwindigkeit, mit der sie Abbildung 3.1.: Schematische Darstellung eines Gaschromatographen13 die Säule durchqueren, hängt von ihrer Verteilung zwischen stationärer und mobiler Phase ab. So brauchen Stoffe um so länger, je besser sie sich in der stationären Phase lösen. Die Wechselwirkungen der Analyten mit der mobilen Phase spielen kaum eine Rolle. Die stationäre Phase kann entweder ein Feststoff wie zum Beispiel ein Gel sein, oder eine Flüssigkeit. In der Organik hat vor allem die Methode mit flüssigen stationären Phasen eine Bedeutung, man spricht auch von Gas-Flüssig-Chromatographie (engl. GLC – Gas Liquid Chromatography). Über einen Injektor (Abbildung 3.1 2 ) werden kleine Mengen der zu untersuchenden Substanz eingespritzt und in die Gasphase überführt. Da die Analyten verdampft werden, ist diese Methode nur für Stoffe anwendbar, die gasförmig oder unzersetzt verdampfbar sind. Ist ein Stoff das nicht, muss er entsprechend derivatisiert werden, siehe auch Abschnitt 2.3. Nachdem die Analyten die Säule mit dem Trägergas durchquert haben, werden sie detektiert (Abbildung 3.1 4 ). Die Zeitspanne die benötigt wurde, die Säule zu durchlaufen, auch Retentionszeit genannt, wird aufgezeichnet (Abbildung 3.1 5 ) und kann mit Literaturwerten verglichen werden, um einen Stoff zu identifizieren. Da diese Methode ungenau ist, und nur funktioniert, wenn sie unter exakt gleichen Bedingungen stattfand, wird ein Gaschromatograph oft in Kopplung mit einem Massenspektrometer betrieben, mit dem ein genauerer Nachweis möglich ist. 13 Quelle: https://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Gaschromatograph.svg, modifiziert 16 Kapitel 3. Verwendete Analysegeräte Philipp Stephan 3.2. Das Massenspektrometer [9,15] Stra hl po si t Strom Ein Massenspektrometer (oft abgekürzt mit „MS“) trennt Ionen gemäß ihrer MasDetektion Faradaysenzahl, also dem Verhältnis von Masse zu Becher sse 46 Ma Ladung (m/z) aufgetrennt. n e Masse 45 on rI Masse 44 e Zuerst wird die zu untersuchende Subiv stanz ionisiert oder fragmentiert. Diesen Teil der Apparatur nennt man auch „Ionenquelle“. Hierfür gibt es mehrere MethoMagnet Verstärker den, die am meisten verbreiteten sind der Elektronenstoß und die chemische IonisatiVerhältnis on. Beim Elektronenstoß wird den MoleküIonenquelle Ausgang len der Substanz durch den Beschuss mit fokussierter Strahl Ionenbeschleuniger schnellen Elektronen so viel Energie überElektronenfalle tragen, dass ihr Ionisierungspotential überIonenreflektor schritten wird und sie in geladene FragmenGaseinlass (von hinten) Glühwendel te zerfallen. Es bilden sich bevorzugt posiAbbildung 3.2.: Schematische Darstellung ei- tive Molekül- und Fragmentionen und unnes Massenspektrometers14 geladene Teilchen. Bei der chemischen Ionisation wird ein Reaktantgas durch Elektronenbeschuss ionisiert, meist Methan oder Ammoniak, welches dann seinerseits die untersuchende Substanz ionisiert, indem ein Proton übertragen wird. [21] Dieses Verfahren ist schonender als ein Elektronenstoß und führt zu weniger Fragmentierung. Die so erhalten geladenen Teilchen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt und gebündelt. Die so beschleunigten Molekülfragmente werden durch einen engen Eingangsspalt in ein magnetisches Feld konstanter Feldstärke geschossen, das senkrecht zu der Feldrichtung des elektrischen Feldes steht. Durch das Magnetfeld werden die Ionen auf Kreisbahnen abgelenkt, deren Radius von der Ladung e, der Masse m, ihrer Geschwindigkeit v und der Magnetfeldstärke B abhängt; siehe Gleichung 3.1, wobei U die Spannung des Beschleunigungsfeldes darstellt. 2·m·U (3.1) e·B Wenn die Feldstärken konstant gehalten werden, beschreiben die Ionen nun einen für ihr Masse-Ladungs-Verhältnis spezifischen Radius und treffen so aufgefächert auf einen Detektor. Nachdem die Signale verstärkt wurden, registriert dieser sowohl das m/z-Verhältnis als auch die Häufigkeit der Einschläge und erstellt so ein Spektrum. Für die meisten erwarteten Fragmente existieren Literaturwerte, sodass mit Hilfe der Massenspektrometrie die Zusammensetzung einer Verbindung sehr genau bestimmt werden kann. r= 14 Quelle: https://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Mass_Spectrometer_Schematic_ DE.svg 17 Kapitel 3. Verwendete Analysegeräte Philipp Stephan 3.3. Das GC/MS Das GC/MS stellt die Kombination von Gaschromatograph und Massenspektrometer dar, indem anstatt eines Detektors bei dem Gaschromatographen direkt das Massenspektrometer angeschlossen wird. Das bietet den großen Vorteil, dass die Proben vor der Aufnahme des Massenspektrums noch zeitlich getrennt werden, was es einfacher macht Verunreinigungen oder Ähnliches auszublenden. Damit diese Technik funktioniert, muss das Massensprektrometer in der Lage sein, mehrmals pro Sekunde ein komplettes Spektrum zu erfassen. [22] 18 Kapitel 4. Analyse Philipp Stephan 4. Analyse Da im Schülerlabor die benötigte GC-Säule nicht vorrätig war, wurden die Messungen freundlicherweise von Herrn Dr. Markus Krischke am Biozentrum der Universität Würzburg durchgeführt und die Ergebnisse zur Verfügung gestellt. Im Folgenden spreche ich davon, dass „Glutamat oder Norvalin nachgewiesen oder gemessen wurde“; gemessen wurde natürlich das Glutaminsäure- beziehungsweise Norvalinderivat, allerdings geht es ja um den Nachweis von Glutamat in Lebensmitteln, eine Messung von Glutaminsäurederivat entspricht somit einem Nachweis von Glutamat in der ursprünglichen Probe. 4.1. Durchführung Zum Einsatz kam eine „Phenominex DB/ZB5“ GC-Säule der Länge 30 m mit einem Durchmesser von 0,25 mm. Davor befand sich eine 5 m lange Vorsäule. Die stationäre Phase bildete ein 0,25 µm dicker Film (5%-Phenyl)-methylpolysiloxan; als mobile Phase wurde Helium eingesetzt. Die eingespritzte Probenmenge betrug 2 µl. Der GC-Ofen wurde wie folgt erhitzt: Als Starttemperatur wurde auf 80 ◦C aufgeheizt, diese Temperatur für 2 min gehalten. Anschließend wurde die Temperatur pro Minute um 20 ◦C erhöht, bis 300 ◦C erreicht waren. Diese Endtemperatur wurde erneut 2 min gehalten. Bei dem Massenspektrometer handelte es sich um ein „Thermo TRACE GC Ultra“ mit einem Dual Stage Quadropol Detektor. 4.2. Auswertung Da man mit einem GC/MS die Masse der ankommenden Teilchen misst, muss man zur Auswertung wissen, nach welchen Massen man sucht. Zum einen sind das die Massen der Moleküle, die man versucht nachzuweisen: Das derivatisierte Glutamat mit 233 u und das derivatisierte Norvalin mit 189 u. Allerdings gilt es hier zu beachten, dass die Moleküle bei der chemischen Ionisation mit einem zusätzlichen Proton (H+ ) ionisiert wurden (siehe Abschnitt 3.2). Gesucht sind also die Massen 234 u beziehungsweise 190 u. Da aber so große ionisierte Moleküle sehr instabil sind, kommt es zur Fragmention. Zwar nicht derartig ausgeprägt wie bei der radikalischen Ionisierung durch einen Elektronenstoß, aber dennoch ist dieser Effekt zu beachten. In Abbildung 4.1 sind die möglichen Molekülfragmente zu sehen, die sich durch Abspalten einer der roten Gruppen bilden können. Für Glutamat sucht man also noch zusätzlich nach den Massen 174 u und 202 u (Abbildung 4.1(a) und 4.1(b)); für Norvalin außerdem nach 174 u und 202 u (Abbildung 4.1(c) und 4.1(d)). 19 Kapitel 4. Analyse Philipp Stephan O O O H3 C CH3 O H3 C CH3 O O HN O O O HN O CH3 O (a) Glutamatfragmente der Masse 174 u (Masse der abgespaltenen Gruppe: 59 u) CH3 O (b) Glutamatfragmente der Masse 202 u (Masse der abgespaltenen Gruppe: 31 u) O O CH3 H3 C O HN O CH3 H3 C O HN O CH3 O (c) Norvalinfragmente der Masse 130 u (Masse der abgespaltenen Gruppe: 59 u) CH3 O (d) Norvalinfragmente der Masse 158 u (Masse der abgespaltenen Gruppe: 31 u) Abbildung 4.1.: Typische Molekülfragmente Ein weiteres Charakteristikum, auf das man bei der Auswertung eines GC/MS-Spektrums achten muss ist die Retentionszeit. Diese beträgt unter den hier angewandten Versuchsbedingungen für das Glutaminsäurederivat 8 min 18 s und für das Norvalinderivat 6 min 28 s. Diese Werte lassen sich in Datenbanken nachschlagen oder durch Referenzmessungen ermitteln. Falls die Referenzmessungen von anderen Systemen stammen, lassen sich die Zeiten mit dem sogenannten „Kovac-Index“ normalisieren und ineinander umrechnen. [21] Die Auswertung der Spektren (zum Beispiel Abbildung 4.2) erfolgt in zwei Schritten: Zum einen lässt sich die ankommende Teilchenzahl am Spektrum des Gaschromatographen (Abbildung 4.2 oben) ablesen. Hier ist die Zeit an der horizontalen, die Menge an der vertikalen Achse aufgetragen. Da das Massenspektrometer alle 0,5 s ein komplettes Spektrum aufnimmt, lässt sich hier das Chromatogramm nach der Masse (beziehungsweise dem Masse-Ladungs-Verhältnis) filtern. So finden wir in Abbildung 4.2 sieben verschiedene Chromatogramme, alle nach unterschiedlichen Massen gefiltert. Von oben herab: schwarz: m/z = 130 rot: m/z = 158 grün: m/z = 190 blau: m/z = 174 gelb-grün: m/z = 202 lila: m/z = 234 blau-grün: TIC (Total Ion Current), entspricht der ungefilterten Gesamtteilchenzahl 20 Kapitel 4. Analyse Philipp Stephan Abbildung 4.2.: Ein typisches Spektrum (Probe 6—Knorr, mit Norvalin, verdünnt) So kann man die gesuchten Fragmente schnell erkennen: Sie müssten einen Peak15 im Chromatogramm ihrer Masse bei der Retentionszeit ihrer Verbindung erzeugen. In Abbildung 4.2 sehen wir einen deutlichen Peak bei den Massen 130, 158 und 190 bei einer Retentionszeit von 6 min 28 s. Die Mengen werden immer in Relation zum Maximum angegeben, sodass bei den Massen 202 und 234 das Untergrundrauschen, verursacht durch andere Verbindungen, etwa Dreivatisierungsreagenzien oder Verunreinigungen, sehr stark zu sehen ist. Um eine Verbindung nun eindeutig zu identifizieren kann man das Massenspektrum einer bestimmten Retentionszeit ansehen: Abbildung 4.2 mitte und unten. Bei einem Massenspektrum ist auf der horizontalen Achse die Masse (genauer: das Masse-LadungsVerhältnis) und auf der Vertikalen die Intensität aufgetragen. Bei dem mittleren Spektrum, das zur Retentionszeit 6 min 28 s aufgenommen wurde, erkennt man sehr schön charakteristische Peaks bei den Massen 130, 158 und 190. Auch hier ist die Skala wieder relativ, sodass bei dem unteren Spektrum zum Zeitpunkt 8 min 18 s das Untergrundrauschen prominent zu Tage tritt. Hier sind keine charakteristischen Peaks zu sehen. 15 signifikanter Spitzenwert des Messsignals über dem Grundrauschen [21] 21 Kapitel 4. Analyse Philipp Stephan Bei diesem Beispiel-Spektrum findet sich nur Norvalin, identifiziert an Hand der Retentionszeit von 6 min 28 s und den charakterischen Fragmentmassen 130, 158 und 190. Glutmat mit einer Retentionszeit von 8 min 18 s und den charakterischen Fragmentmassen 174, 202 und 234 wurde nicht nachgewiesen. Um eine quantitative Analyse durchzuführen würde man in diesem Fall ein Verfahren mit einem internen Standard anwenden. Ein interner Standard bezeichnet einen der eigentlich zu bestimmenden Substanz physiko-chemischen sehr ähnlichen Stoff, der zu einem frühen Verarbeitungsschritt in bekannter Menge hinzugegeben wird. In diesem Fall wäre das, wie in Abschnitt 2.1 erwähnt, Norvalin. Anschließend wird bei der Auswertung des Chromatogramms das Integral16 des zu untersuchenden Stoffes mit dem internen Standard, hier wäre das Glutamat und Norvalin, gemessen und verglichen. So lässt sich auf die ursprüngliche Konzentration zurückrechnen. [21] 4.3. Ergebnisse Knorr rein mit Norvalin mit Norvalin, verdünnt Sonnen Bassermann Hausgemacht rein mit Norvalin mit Norvalin, verdünnt rein mit Norvalin mit Norvalin, verdünnt gelöste Glutaminsäure Blindprobe rein mit Norvalin mit Norvalin, verdünnt rein 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Glutamat Norvalin nein nein nein ja nein nein nein nein nein nein ja ja nein nein nein nein ja ja nein nein nein nein nein ja nein ja Tabelle 4.1.: Die Messergebnisse der Analyse Die Ergebnisse der Auswertung der Analysespektren sind in Tabelle 4.1 abzulesen. In keiner der untersuchten Proben wurde Glutamat gefunden (diesen Umstand werde ich in Kapitel 5 näher behandeln), deshalb wurde im Folgenden auf eine quantitative Analyse verzichtet. Dennoch lassen sich einige interessante Phänomene an diesen Messergebnissen ablesen. 16 Fläche unter dem Graphen 22 Kapitel 4. Analyse Philipp Stephan Das Ergebnis der Probe 1 (Knorr, rein) ist in sofern verwunderlich, als das Norvalin gemessen wurde, allerdings keines zugegeben wurde. Da Norvalin nicht natürlich vorkommt und außerdem bei der Probe 2 (Knorr, mit Norvalin) kein Norvalin gemessen wurde, obwohl es zugesetzt wurde, handelt es sich hier offensichtlich um eine Verwechslung. Dies kann während der Aufbereitung durch das ständige Umfüllen in andere Gefäße oder während der Messung passiert sein. Da der Umstand allerdings ziemlich eindeutig ist, halte ich es für vertretbar, diese Außergewöhnlichkeit nicht weiter zu beachten. Ebenfalls unerwartet ist Probe 13 , die Blindprobe. Hier wurde Norvalin nachgewiesen, obwohl es sich nur um reines n-Hexan handelte. Ich habe beim Abfüllen dieser Probe besonders darauf geachtet, dass keine Verwechslung vorliegt, da sie befüllt, geschlossen und beschriftet wurde, während sich die anderen Proben in der Zentrifuge befanden. Eine Verwechslung bei der eigentlichen Messung ist auch sehr unwahrscheinlich. Zwar findet sich in Probe 11 (gelöste Glutaminsäure, mit Norvalin) wider Erwarten kein Norvalin, doch eine Verwechslung scheidet aus, da bei der Blindprobe die gemessene Gesamtmenge aller Stoffe viel kleiner war, als bei anderen Proben, denen Norvalin zugegeben worden war, zumal diese Probe nicht einmal verdünnt war. Erklären lässt sich die positive Blindprobe durch ein Phänomen, dass man „carry-over“ [21] nennt. Dabei werden kleine Mengen des Analyts von einem Messvorgang auf den nächsten Übertragen und so das Ergebnis verfälscht. In diesem Fall befand sich noch etwas Flüssigkeit der vorherigen Probe in der Einspritzanalge des Gaschromatographen. Ein weiterer Effekt, der sich an einigen der aufgezeichneten Chromatogrammen beobachten lässt, ist das sogenannte „fronting“ [21] . Es bezeichnet die Asymmetrie der Peaks eines Chromatogramms. Normalerweise stellen sich die Peaks eines Chromatogrammss annähernd wie eine Gaußsche Normalverteilung dar (siehe Abbildung 4.3(a)). Dies hängt mit der mittleren Retentionszeit zusammen, die gleichmäßig in beide Richtungen abweicht, da sie durch die Interaktionsgeschwindigkeit des Analyts mit der stationären Phase bestimmt wird. Befindet sich nun so viel Analyt in der GC-Säule, dass die Aufnahmefähigkeit der stationären Phase ausgelastet ist, kann ein Teil des Analyts ungebremst die Säule durchqueren und die „Spitze“ des Peaks verschiebt sich nach vorne (siehe Abbildung 4.3(b)). Fronting tritt bei den Proben 1 (beziehungsweise 2 wegen der Verwechslung), 5 und 8 auf, da all diese Proben Norvalin enhalten, aber nicht verdünnt wurden. So ist Norvalin in so großer Menge vorhanden, dass es zum fronting kommen konnte. Bei den verdünnten Proben mit Norvalin tritt dieser Effekt nicht auf. (a) Normale Peaks (b) Peaks mit fronting Abbildung 4.3.: Unterschiedliche Peaks 23 Kapitel 5. Fehlerdiskussion und Fazit Philipp Stephan 5. Fehlerdiskussion und Fazit Wie bereits in Abschnitt 4.3 angemerkt, wurde in keiner der Proben Glutamat nachgewiesen. Hierfür gibt es mehrere Erklärungsansätze: Zum einen kann es sein, dass tatsächlich keine der Suppen Mononatriumglutamat enthält. Dies ist allerdings höchst unwahrscheinlich, da es in der Branche Gang und Gebe ist, diesen Geschmacksverstärker zuzugeben. Bei der Suppe von Knorr war sogar „Hefeextrakt“ in der Liste der Lebensmittelzusatzstoffe angegeben, sodass zumindest dort etwas Glutamat enthalten sein müsste. Es könnte auch sein, dass zwar in den Suppen Mononatriumglutamat enthalten war, jedoch keines mehr in den Proben. Das verwendete Verfahren geht davon aus, dass das Glutamat im Wasser der Suppen gelöst ist und nimmt keine weiteren Schritte der Extraktion vor. Befindet sich nun aber das Glutamat in Tomatensuppen in irgendeiner Bindung mit anderen Bestandteilen der Tomate, würde es einfach durch die Zentrifugation herausgefiltert. Es besteht auch die Möglichkeit, dass Glutamat in einer Bindung unempfänglich für die Derivatisierungsreaktion wird und so der Nachweis fehlschlägt. Allerdings hätte dann zumindest die Gegenprobe mit gelöstem Glutamat positiv sein müssen, aber dazu später mehr. Denn zum anderen besteht die Möglichkeit, dass zwar Glutamat in den Proben vorhanden war, es nur nicht nachgewiesen wurde. Ist der Glutamatanteil in den Suppen so gering, dass er nicht mit dem GC/MS nachgewiesen werden kann, spricht man von Mengen unterhalb der Nachweisgrenze. Dass wäre in sofern schwierig zu beweisen, als dass mir keine besseren Analyseverfahren zur Verfügung stehen und ich so keine Möglichkeit habe, dieser Theorie nachzugehen. Auch hier hätte allerdings die Gegenprobe ein Resultat erzeugen müssen, da das Norvalin, welches in gleicher (Stoff-)Menge hinzugegeben wurde, einwandfrei nachgewiesen wurde. In diesem Fall kann es also nicht an einer zu hohen Nachweisgrenze liegen. Viel wahrscheinlicher ist es, dass etwas mit der Methode der Derivatisierung oder Analyse fehlerbehaftet war. Da allerdings Nils Zottmann den gleichen Versuch mit Gemüsebrühen durchgeführt hat [27] , schätze ich, dass das Verfahren an sich richtig ist und viel mehr ich einen Fehler bei der Derivatisierung gemacht habe. Dagegen spricht jedoch, dass die Derivatisierung und die Analyse bei Norvalin in beiden Versuchsreihen einwandfrei funktioniert haben, aber bei Glutamat nicht. Grundsätzlich kann also eigentlich kein handwerkliches Problem vorliegen. Gerade weil auf der einen Seite nicht einmal in der Gegenprobe mit reinem Glutamat in Wasser keines nachgewiesen wurde, es sich aber durch den Nachweis von Norvalin gezeigt hat, dass die Methode funktioniert, halte ich einen monokausalen Erklärungsansatz für unzureichend. Vielmehr scheint es nötig, die Suppenproben getrennt von den Gegenproben zu betrachten. Zu diesem Zweck hat Herr Dr. Markus Krischke noch ein- 24 Kapitel 5. Fehlerdiskussion und Fazit Philipp Stephan mal die Derivatisierung mit Chemikalien aus seinem Institut für mich durchgeführt. In diesem Versuchsdurchlauf konnte er Glutamat gut nachweisen. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Glutaminsäure meines Labors verschmutzt war, oder anderweitig nicht einwandfrei. Was die Suppen anbelangt halte ich die Erklärung, dass das Glutamat eine Bindung mit anderen Bestandteilen der Tomate am plausibelsten, da Niels Zottmann das Verfahren nur erfolgreich auf Gemüsebrühen ohne großen Feststoffanteil angewendet hat. Wegen mangelnder Ergebnisse lässt sich so leider keinerlei Antwort auf die ursprüngliche Fragestellung finden, ob in sowohl industriell hergestellten Produkten als auch natürlichen Lebensmitteln Geschmacksverstärker enthalten sind und wie sie sich mengenmäßig unterscheiden. So kann man auch keine Aussage darüber treffen, ob das Bedenken beim Einsatz von Geschmacksverstärkern begründet ist, oder nicht. Festhalten lässt sich jedoch, dass ein Großteil der Gefahren, die Mononatriumglutamat zugeschrieben werden, nicht existieren, beziehungsweise nicht belegt werden konnten. Grundsätzlich macht es Sinn im Hinterkopf zu behalten, dass auch die Natur Geschmacksverstärker einsetzt und man nicht sofort alles unbedacht verteufeln sollte. Ein kritischer Blick auf Lebensmittelzusatzstoffe schadet allerdings nie. 25 Anhang A. Chemikalienverzeichnis und Gefahrstoffkennzeichnung Philipp Stephan A. Chemikalienverzeichnis und Gefahrstoffkennzeichnung Chlorameisensäuremethylester Symbole F — Leicht entzündlich T+ — Sehr giftig R- und S-Sätze R: 11-26-21/22-34 S: (1/2)-26-14-28-36/37/39-45-46-63 O CH3 O Cl Dichlormethan Cl Symbole R- und S-Sätze Xn — Gesundheitsschädlich R: 40 S: 23-24/25-36/37 C H Cl H L-Glutaminsäure O keine Gefahrstoffkennzeichnung O HO OH NH2 n-Hexan Symbole R- und S-Sätze F — Leicht entzündlich R: 11-38-48/20-62-65-67-51/53 Xn — Gesundheitsschädlich S: (2)-9-16-29-33-36/37-61-62 H3 C N — Umweltgefährlich CH3 26 Anhang A. Chemikalienverzeichnis und Gefahrstoffkennzeichnung Philipp Stephan Methanol Symbole F — Leicht entzündlich T — Giftig R- und S-Sätze R: 11-23/24/25-39/23/24/25 S: (1/2)-7-16-36/37-45 H3 C OH Norvalin O keine Gefahrstoffkennzeichnung H3 C OH NH2 Pyridin Symbole R- und S-Sätze F — Leicht entzündlich R: 11-20/21/22 Xn — Gesundheitsschädlich S: (2)-26-28 N Stickstoff N keine Gefahrstoffkennzeichnung N Wasser (destilliert) O keine Gefahrstoffkennzeichnung H H 27 Philipp Stephan Literaturverzeichnis [1] Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB) §2 (3). http://www.gesetze-im-internet.de/lfgb/__2.html, Abruf: 16.09.2012 [2] Hensel, Andreas (Hrsg.) ; Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) (Hrsg.): Überempfindlichkeitsreaktionen durch Glutamat in Lebensmitteln. Version: Juli 2003. http://www.bfr.bund.de/cm/343/ ueberempfindlichkeitsreaktionen_durch_glutamat_in_lebensmitteln.pdf, Abruf: 30.09.12 [3] Monosodiumglutamate Compound Summary. Version: August 2005. //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=85314, 16.09.2012 http: Abruf: [4] Le Maire, B. (Hrsg.): VERORDNUNG (EG) Nr. 1331/2008 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES über ein einheitliches Zulassungsverfahren für Lebensmittelzusatzstoffe, -enzyme und -aromen. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX: 32008R1331:DE:NOT. Version: Dezember 2008. http://eur-lex.europa. eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:354:0001:0006:DE:PDF, Abruf: 18.10.2012 [5] Barroso, José Manuel (Hrsg.): VERORDNUNG (EU) Nr. 234/2011 DER KOMMISSION zur Durchführung der Verordnung (EG) Nr. 1331/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates über ein einheitliches Zulassungsverfahren für Lebensmittelzusatzstoffe, -enzyme und -aromen. http://eur-lex.europa. eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32011R0234:DE:NOT. Version: März 2011. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L: 2011:064:0015:0024:DE:PDF, Abruf: 18.10.2012 [6] Barroso, José Manuel (Hrsg.): VERORDNUNG Nr. 1129/2011 DER KOMMISSION zur Änderung des Anhangs II der Verordnung (EG) Nr. 1333/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates im Hinblick auf eine Liste der Lebensmittelzusatzstoffe der Europäischen Union. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/ LexUriServ.do?uri=CELEX:32011R1129:DE:NOT. Version: November 2011. http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:295: 0001:0177:DE:PDF, Abruf: 11.09.2012 [7] Abel, Georg (Hrsg.) ; Gross, Laura (Hrsg.) ; Verbraucher Initiative e.V. (Hrsg.): Wofür steht die E-Nummer? Version: September 2006. http:// 28 Philipp Stephan www.zusatzstoffe-online.de/information/673.doku.html, Abruf: 16.09.2012. – Website [8] Ault, Addison: The Monosodium Glutamate Story: The Commercial Production of MSG and Other Amino Acids. In: Journal of Chemical Education 81 (2004), 347–355. http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed081p347 [9] Autorenkollektiv (Hrsg.): Organikum – Organisch-chemisches Grundpraktium. 14. Berlin : VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 1975 [10] Bellisle, France: Glutamate and the UMAMI taste: sensory, metabolic, nutritional and behavioural considerations. A review of the literature published in the last 10 years. In: Neuroscience amp; Biobehavioral Reviews 23 (1999), Nr. 3, 423 - 438. http://dx.doi.org/10.1016/S0149-7634(98)00043-8. – DOI 10.1016/S0149– 7634(98)00043–8. – ISSN 0149–7634 [11] Berger, Tamara: Natriumglutamat–Funktion und Bedeutung als Auslöser des Umami–Geschmacks, Universität Wien, Diplomarbeit, 2010. http://othes.univie. ac.at/11039/ [12] Beyreuther, K. ; Biesalski, H. K. ; Fernstrom, J. D. ; Grimm, P. ; Hammes, W. P. ; Heinemann, U. ; Kempski, O. ; Stehle, P. ; Steinhart, H. ; Walker, R.: Consensus meeting: monosodium glutamate–an update. In: European Journal of Clinical Nutrition 61 (2007), p. 304–313. http://dx.doi.org/10.1038/sj.ejcn. 1602526. – DOI 10.1038/sj.ejcn.1602526 [13] Eisenbrand, Gerhard (Hrsg.) ; Schreier, Peter (Hrsg.): RÖMPP Lexikon Lebensmittelchemie. Bd. 9 Lebensmittelchemie. Stuttgart : Georg Thieme Verlag, 1995 [14] Falbe, Jürgen (Hrsg.) ; Regnitz, Manfred (Hrsg.): RÖMPP Chemie Lexikon. Bd. 2 Cm–G. 9. Stuttgart : Georg Thieme Verlag, 1990 [15] Falbe, Jürgen (Hrsg.) ; Regnitz, Manfred (Hrsg.): RÖMPP Chemie Lexikon. Bd. 4 M–Pk. 9. Stuttgart : Georg Thieme Verlag, 1991 [16] Gahl, Antje (Hrsg.) ; Graubner, Stefan (Hrsg.) ; Deutsche Gesellschaft für Ernährung e.V. (Hrsg.): Ist der Geschmacksverstärker Glutamat gesundheitsschädlich? Version: Juni 2003. http://www.dge.de/modules.php?name= News&file=article&sid=189, Abruf: 16.10.2012 [17] Groß, Christiane (Hrsg.) ; foodwatch e. V. (Hrsg.): Maggi: Irreführung mit Geschmacksverstärkern. Version: Februar 2008. http://www.foodwatch.de/presse/ pressearchiv/2008/abgespeistde/index_ger.html, Abruf: 16.09.2012. – Website [18] Groß, Christiane (Hrsg.) ; foodwatch e. V. (Hrsg.): gentlich Hefeextrakt—doch kein Geschmacksverstärker, oder? Was ist eiVersion: Mai 29 Philipp Stephan 2009. http://foodwatch.de/spender__unterstuetzer/ernaehrungsfragen/ frage_des_monats_mai_2009/index_ger.html, Abruf: 16.09.2012. – Website [19] Halpern, Bruce P.: Glutamate and the Flavor of Foods. In: The Journal of Nutrition 130 (2000), Nr. 4, 910. http://jn.nutrition.org/content/130/4/910.short [20] Hušek, Petr ; Šimek, Petr ; Hartvich, Petr ; Zahradníčková, Helena: Fluoroalkyl chloroformates in treating amino acids for gas chromatographic analysis. In: Journal of Chromatography A 1186 (2008), Nr. 1–2, p. 391–400. http://dx. doi.org/10.1016/j.chroma.2007.11.117. – DOI 10.1016/j.chroma.2007.11.117. – ISSN 0021–9673 [21] McNaught, Alan D. (Hrsg.) ; Wilkinson, Andrew (Hrsg.): IUPAC. Compendium of Chemical Terminology. 2. Oxford : Blackwell Scientific Publications, 1997. http: //dx.doi.org/10.1351/goldbook. http://dx.doi.org/10.1351/goldbook [22] Otto, Matthias: Analytische Chemie. 1. Weinheim : Wiley-VCH Verlag, 2011 [23] Rodríguez, M.S. ; González, M.E. ; Centurión, M.E.: Determination of Monosodium Glutamate in Meat Products. In: Journal of the Argentine Chemical Society 92 (2003). http://www.aqa.org.ar/pdf9146/9146art2.pdf [24] Tarasoff, L. ; Kelly, M.F.: Monosodium L-glutamate: A double-blind study and review. In: Food and Chemical Toxicology 31 (1993), Nr. 12, 1019 - 1035. http://dx.doi.org/10.1016/0278-6915(93)90012-N. – DOI 10.1016/0278– 6915(93)90012–N. – ISSN 0278–6915 [25] Walker, Ronald ; Lupien, John R.: The Safety Evaluation of Monosodium Glutamate. In: The Journal of Nutrition 130 (2000), Nr. 4, 1049. http://jn. nutrition.org/content/130/4/1049.short [26] Willms, Heike ; Scholz, Sophie-Mareen ; Bordewick-Dell, Ursula: Glutamatgehalt in Tütensuppen und Bouillons, Fachhochschule Münster, 2012 [27] Zottmann, Nils: Nachweis von Glutamat in Lebensmitteln durch kombinierte Analyse mit Gaschromatograph und Massenspektrometer, Friedrich-Koenig-Gymnasium Würzburg, Facharbeit, Januar 2009 30 Philipp Stephan Eigenständigkeitserklärung Ich habe diese Seminararbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benutzt. Ort Datum Unterschrift 31
