Medizinische Muschelproteine

Quelle/Publication: Farbe und Lack
Ausgabe/Issue:
07/2008
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Medizinische Muschelproteine
In der Natur ist Kleben die dominierende Fügetechnik.
Die Bioadhäsion von Molekülen bildet die Basis
bei der Entstehung aller Lebewesen. Es führt
weiter bis zu makroskopischen Klebstoffen tierischen
Ursprungs, die in ihrer Funktion und Form unseren
Klebverbindungen ähneln. Die Medizintechnik will
solche Verbindungen nachahmen.
Der Natur nachempfundene Klebstoffe helfen heilen
Klaus Rischka* und Ingo Grunwald, Bremen
Klebstoffe sind empfindlich gegenüber Wasser. In der Natur
ist die Anwesenheit von Wasser in lebenden Systemen
der Normalfall und die Probleme sind seit Jahrmillionen
gelöst. Die zugrundeliegenden Mechanismen zeigt das
Beispiel der Miesmuschel Mytilus edulis, deren Klebstoff
gut erforscht ist. Daraus lassen sich Erkenntnisse für neue
medizinisch-biomimetische, also die Natur nachahmende
Klebstoffe gewinnen.
Medizinische Klebstoff Stand der Technik
Gängige Techniken zur Fixierung von Weichgeweben
in der Medizin sind Klammern und Nähen. Bei
der cardiovaskularen Chirurgie und bei Eingriffen
an Organen ist Kleben die bessere Technik. Es
gibt derzeit drei chemische Klassen medizinischer
Klebstoffe: Cyanacrylate, Fibrin- und Gelatine-basierende
Formulierungen.
Cyanacrylat-basierende Klebstoffe bestehen aus Octyloder Butyl-2-cyanoacrylat (Abb. 1). Ersteres bildet
stabilere, biegsamere Klebverbindungen und verschließt
Hauteinschnitte, oberflächliche Fleischwunden und
Kopfhautwunden. Nachteilig wirken die Abbauprodukte,
hauptsächlich
Formaldehyd
und
Alkylcyanate,
die Entzündungsreaktionen und Heilungsstörungen
hervorrufen können.
Das Protein Fibrin in Fibrin-basierenden Klebstoffen
entsteht in der Blutgerinnungskaskade aus Fibrinogen
und Thrombin. Anschließend oligomerisiert es und
vernetzt mit dem Enzym Faktor XIII (Abb. 2).
Fibrin-basierende Klebstoffe finden sich u.a. in der
Thorax- und kardiovaskulären Chirurgie. Allerdings
sind die Klebeigenschaften nicht ideal und es
besteht das Risiko der viralen Kontamination, da die
Klebstoffe aus humanem Blut gewonnen werden. Eine
weitere Klebstoffklasse sind Gelatine-basierende Systeme
tierischen Ursprungs. Weitere Klebstoffkomponenten sind
Resorcin und Aldehyde. Typische Anwendungsfelder
sind das Verkleben von Blutgefäßen und Organen. Ein
Nachteil dieses Klebstoffs ist seine geringe Klebfestigkeit.
Außerdem können die toxischen Aldehydkomponenten
das umliegende Gewebe reizen und das Polymer ist
kaum biologisch abbaubar. Zudem bergen tierische
Komponenten das Risiko der Übertragung von Krankheiten
auf den Menschen.
Chivers und Wolowacz [1] verglichen die Klebkräfte
medizinischer Klebstoffe an geklebten Schweinehäuten, knorpeln und -knochen (Tab. 1).
Medizinische Klebstoffe sollen kovalente Bindungen mit
dem umgebenden Gewebe (Adhäsion) und mit sich
selber (Kohäsion) in einer feuchten Umgebung in wenigen
Minuten ausbilden [2]. Dabei muss die biologische Funktion
des geklebten Gewebes unbeeinflusst bleiben. Darüber
hinaus sollte der Klebstoff bioabbaubar sein und die
Abbauprodukte dürfen weder toxisch noch teratogen,
kanzerogen oder mutagen sein.
Kleben im Wasser
Geringe Wassermengen sind beim Klebeprozess
notwendig, um Polymerisationen beispielsweise von
Cyanacrylaten zu initiieren. Auf scheinbar trockenen
Oberflächen sind unter normalen Umweltbedingungen
mehrere Moleküllagen Wasser irreversibel immobilisiert.
Klebstoffe wechselwirken mit ihren polaren Seitenketten
mit diesen Schichten. Größere Mengen von Wasser
führen dagegen zum Versagen von Klebverbindungen.
Abb. 3 zeigt Degradationsmechanismen einer gehärteten
Klebstoffschicht.
Der Klebstoff wird in seiner Kohäsionskraft durch Quellung,
Plastifizierung, Erosion und Hydrolyse geschwächt.
Die Adhäsion zwischen Klebstoff und Festkörper wird
durch überschüssiges Wasser in der Grenzschicht
verringert. Darüber hinaus führt das Kleben in
Anwesenheit von zu viel Wasser zu weniger festen
Klebverbindungen, da die reaktiven polaren Gruppen
mit Wasser wechselwirken und deshalb nicht mehr für
die Adhäsion zur Verfügung stehen. Dieses Problem
besteht sowohl bei den molekularen, in unserem
Körper ständig ablaufenden, bioadhäsiven Phänomenen
als auch bei marinen Organismen.Eine entscheidende
Stoffklasse bei biologischen Klebphänomenen sind
Proteine.
Das
sind
Polymere,
die
sich
aus
Aminosäuren zusammensetzen. Jedes Protein besitzt eine
charakteristische Aminosäurensequenz, die die zwei- und
dreidimensionale Struktur sowie die Funktion bestimmt.
Proteine fungieren im menschlichen Körper z.B. als
Katalysatoren (Enzyme), Transporter (Hämoglobin) oder
Baustoffe (Kollagene).
Der Klebstoff der Miesmuschel
Die gemeine Miesmuschel (Mytilus edulis) bildet
dauerhafte, feste Klebverbindungen in Wasser. Die
Muschel haftet mit Byssusfäden über eine Plaque
(Klebstoffpunkt) am Substrat (Abb. 4). Die Plaque besteht
hauptsächlich aus als Mytilus edulis foot protein (Mefp)
bezeichneten Proteinen und ist das biologische Analogon
zu einem technischen Klebstoff. Die Miesmuschel klebt an
Oberflächen wie Stein, Holz, Schiffsrümpfen aus Stahl und
Kunststoffen wie Polypropylen und Teflon.
Eine zentrale Rolle spielt Mefp-1, das aus Folgen von zehn
Aminosäuren besteht [4]. Diese Dekapeptideinheit (Abb.
5) wiederholt sich etwa 75- bis 80-mal und enthält nach
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der Biosynthese enzymatisch modifizierte Aminosäuren
wie Hydroxyprolin (Hyp) und Dihydroxylphenylalanin
(Dopa). Die polaren Seitenketten schaffen ausgeprägte
Wechselwirkungen zu polaren Molekülen auf den
Substratoberflächen. Mefp-1 ist sowohl für die Adhäsion
als auch für die Kohäsion verantwortlich und kann von der
Klebfestigkeit mit einem Epoxid- oder Cyanacrylat-Klebstoff
verglichen werden.Mefp-2 ist ein cysteinhaltiges Protein mit
im Gegensatz zu Mefp-1 nur in geringen Mengen Dopa
und ohne weitere modifizierte Aminosäuren [5]. Dieses
Protein ist für die Ausbildung der schaumartigen Struktur
des Klebstoffs verantwortlich.
Mefp-3 ist das kleinste Protein im Klebstoff [6] und besitzt
wie Mefp-5 einen hohen Dopa-Anteil [7]. Beide fungieren als
Haftvermittler zu Oberflächen. Mefp-4 [8] stabilisiert ähnlich
wie Mefp-2 die Plaque-Struktur.
Bemerkenswert ist der hohe Dopa-Anteil im Klebstoff,
der sie zur Schlüsselaminosäure sowohl für die
Adhäsion als auch für die Kohäsion [9] macht (Abb.
6). Die Catechol-Untereinheit von Dopa bildet stabile
Metallkomplexe (A), welche die gute Adhäsion auf
metallischen Oberflächen bewirken. Die Hydroxylgruppen
fungieren sowohl als Wasserstoffbrückendonoren als auch
als -akzeptoren (B), was Wechselwirkungen zu polaren
Gruppen auf Substratoberflächen und innerhalb des
Klebstoffs ermöglicht. Entscheidend für die Kohäsion sind
kovalente Vernetzungen, die zum einen durch 1,4-MichaelAdditonen mit Aminogruppen der Lysin-Seitenketten (C)
und zum anderen durch radikalische Dimerisierung
der Catecholreste untereinander (D) entstehen.In der
Natur initiiert eine Catechol-Oxidase die Quervernetzung
enzymatisch (Härtungszeit etwa drei Minuten). In vitro
startet die Härtung durch oxidierende Agenzien wie NaIO4
oder H2O2. Auch Metallionen wie Ferrate oder Manganate
fördern die Quervernetzung [10].
Gewinnung des Miesmuschelklebstoffs
Gängige Methoden zur Gewinnung des Muschelklebstoffs
basieren auf der Extraktion des Proteingemisches aus
dem Byssusfaden. Für ein Gramm Klebstoff sind 10.000
Muscheln notwendig, was eine große Verschwendung
natürlicher Ressourcen bedeutet. Zudem lässt sich damit
reiner Klebstoff nicht isolieren.
Aminosäuresequenzen mit modifizierten Aminosäuren
wie Dopa (aus Tyrosin) und Hyp (aus Prolin)
lassen sich nicht standardmäßig in den klassischen
Expressionssystemen im Labor- oder industriellen Maßstab
herstellen. In der Regel ist die Behandlung der isolierten
Proteine mit Enzymen notwendig, um z.B. Tyrosin
in Dopa umzuwandeln. Des Weiteren müssen sich
Produktionsprozesse von rekombinanten Proteinen für
medizinische Anwendungen an regulatorischen Richtlinien
wie der Good Manufacturing Practice (GMP) orientieren.
Die Festphasenpeptidsynthese ist eine alternative
Methode zur Herstellung kleiner Proteine und Peptide.
Die Verwendung modifizierter Aminosäuren ist hier
unproblematisch. Diese Methode ist jedoch limitiert durch
die Zahl und Sequenz der Aminosäuren des angestrebten
Proteins/Peptids. Die maximale Länge der Sequenzen
beträgt 70 bis 100 Aminosäuren. Längere Sequenzen
lassen sich aber durch chemische Ligation zweier
Peptidfragmente erzielen.
Im Handel ist ein Extrakt aus dem Klebstoff der
Miesmuschel zur Fixierung von Zellen in Laboratorien
erhältlich. Dieses Produkt wurde bereits in vivo an
Kaninchen mit transplantierten Knorpelzellen getestet
[11]. Dabei heilte die mit Muschelproteinen geklebte
Gruppe besser als die mit Fibrin fixierte. Dennoch
sind medizinische Klebstoffe, die auf Muschelproteinen
basieren oder Segmente von diesen enthalten, zurzeit nicht
kommerziell erhältlich.
Synthetischer Muschelklebstoff
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Ansätze
verfolgt, die Potenziale des Muschelklebstoffs und seiner
Einzelkomponenten für den Menschen nutzbar zu machen.
Hybridsysteme, basierend auf synthetischen Polymeren
und der Dopa-Aminosäure, wurden für die Herstellung von
Hydrogelen für medizinische Applikationen synthetisiert.
Diese Gele zeichnen sich durch verbesserte adhäsive und
kohäsive Eigenschaften aus. In allen Fällen wurde die
Dopa-Einheit an Polyethylenglykol (PEG) geknüpft [12].
Copolypeptide aus Dopa und Lysin entstanden und wurden
durch Zugabe von Tyrosinase, Fe3+, H2O2 oder IO4vernetzt [13].
Modelltripeptide von Mefp-1 wurden mit der Sequenz (XTyr-Lys)n (mit X = Gly, Ala, Ser, Leu, Phe, Ile oder Pro)
dargestellt [14].
Dopa-modifizierte verzweigte PEGs dienten zum Kleben
von Schweinehäuten. Bei Zug-Scherproben zeigte
die PEG-Dopa-Kombination eine 3,5-fach höhere
Festigkeit verglichen mit Fibrin-fixierten Proben [15].Auf
Miesmuschelprotein basierende Klebstoffe können ein
alternativer Ansatz bei der Entwicklung neuer medizinischer
Klebstoffe sein. s
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- Dr. Klaus Rischka,
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arbeitet seit 2002 als wissenschaftlicher Mitarbeiter am
Fraunhofer Institut für Fertigstellung und Angewandte
Materialforschung (IFAM) auf dem Gebiet der
Biomolekulares Oberflächen- und Materialdesign. Dabei
befasst er sich u.a. mit der Darstellung peptidbasierter
Klebstoffe und antimikrobieller Oberflächen.
- Dr. Ingo Grunwald,
ist seit 2004 Projektmanager in der Arbeitsgruppe
Biomolekulares Oberflächen- und Materialsdesign am
Fraunhofer Institut für Fertigstellung und Angewandte
Materialforschung (IFAM). Er arbeitet an der Entwicklung
von biomemetischen und bioaktiven Oberflächen.
t Ergebnisse auf einen Blick
- Die
Miesmuschel
bildet
dauerhafte,
feste
Klebverbindungen in Salzwasser. Dabei sorgen Proteine
für gute Haftung an verschiedenen Untergründen.
- In der Natur wird das Kleben enzymatisch initiiert, in vitro
startet die Härtung durch oxidierende Agenzien wie NaIO4
oder H2O2.
- Miesmuschelproteine können ein Ansatz bei der
Entwicklung medizinischer Klebstoffe sein.
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Knorpel
Knochen
Haut
Butyl-2cyanoacrylat
1,0 MPa
1,4 MPa
1,2 MPa
GRF
0,15 MPa
0,20 MPa
0,07 MPa
Fibrin
0,005 MPa
0,011 MPa
0,019 MPa
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Abb. 4: Miesmuschel, haftend an einer antihaft-beschichteten Pfanne
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Abb. 5: Dekapeptiduntereinheit von
Mefp-1
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Abb. 6: Reaktionsmöglichkeiten von
3,4-Dihydroxylphenylalanin
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