Dokument_4.

Aus der Nuklearmedizinischen Klinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. T. Kuwert
Biodistribution und Analyse von 68Ga-markierten RGDMultimeren an tumortragenden Nacktmäusen mit Hilfe
der Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Scarlett Margot Annelies Wrubel
aus
Rostock
Gedruckt mit der Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. Torsten Kuwert
Koreferent:
Prof. Dr. rer. nat. Olaf Prante
Tag der mündlichen Prüfung:
19.03.2012
für meine Eltern
Dietlind und Falko Wrubel
Inhaltsverzeichnis
1 ZUSAMMENFASSUNG
6
2 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG
10
2.1 RADIOAKTIVITÄT
10
2.2 POSITRONENEMISSIONSTOMOGRAPHIE (PET)
14
2.3 TUMORANGIOGENESE
16
2.4 INTEGRINE UND IHRE BEDEUTUNG IM TUMORGEWEBE
16
2.5 RGD-MULTIMERE
18
2.6 ZIEL
21
3 MATERIAL UND METHODEN
23
3.1 MATERIAL
23
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.1.6
3.1.7
3.1.8
3.1.9
23
23
24
24
24
24
24
24
25
CHEMIKALIEN
LÖSUNGEN UND PUFFER
RGD-MULTIMERE
ZELLEN UND INTEGRINE
ANÄSTHETIKUM
RADIOAKTIVE STOFFE
MÄUSE
TUMORIMPLANTATION
GERÄTE
3.2 METHODEN
26
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.6
3.2.7
3.2.8
26
26
27
28
28
28
29
32
GALLIUM-68
ISOLIERUNG/ELUTION VON GALLIUM-68
68
GA-MARKIERUNG VON DOTA-RGD-VERBINDUNGEN
BESTIMMUNG DER RADIOCHEMISCHEN REINHEIT
BESTIMMUNG DER RADIOAKTIVITÄT
IN-VITRO-UNTERSUCHUNGEN
BINDUNGSSTUDIEN (BINDING ASSAY)
IN-VIVO-UNTERSUCHUNGEN
4 ERGEBNISSE
36
4.1 STABILITÄT DER TRACER IN HUMANEM SERUM
36
4.2 LOGD7,4-WERT
38
4.3 BINDUNGSSTUDIE (BINDING ASSAY)
39
4.4 EXPERIMENTE AN DER KLEINTIER-PET (µ
µPET)
42
4.5 BIOVERTEILUNG
45
4.5.1 BIOVERTEILUNG VON [68GA]DOTA-RGD-1
4.5.2 BIOVERTEILUNG VON [68GA]DOTA-RGD-4
4.5.3 BIOVERTEILUNG VON [68GA]DOTA-RGD-16
45
48
51
5 DISKUSSION UND BEWERTUNG DER ERGEBNISSE
54
5.1 STABILITÄT DER TRACER IN VITRO
54
5.2 LOGD7,4-WERT
54
5.3 REZEPTORBINDUNGSSTUDIEN
55
5.4 BIOVERTEILUNG
56
6 LITERATURVERZEICHNIS
62
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
67
8 DANKSAGUNG
68
9 LEBENSLAUF
69
6
1 Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Die Tumorangiogenese spielt für die Früherkennung von Tumoren und deren
Metastasen eine wichtige Rolle. Während dieses Vorgangs sind Funktionsproteine, speziell Integrine, hoch exprimiert und stellen daher ein molekulares
Target für die Bildgebung von Tumorgefäßen dar. Als hoch-affine Moleküle, die
an die Integrine binden, sind seit langem cyclische Pentapeptide bekannt, die
die RGD-Sequenz tragen; diese eignen sich als DOTA-Konjugate für die Radiomarkierung mit dem Positronenstrahler Gallium-68. Im Zentrum dieser Arbeit
steht die Erforschung einer Serie von fünf
68
Ga-markierten DOTA-RGD-Peptid-
Multimeren (Monomer, Dimer, Tetramer, Oktamer, Hexadecimer) hinsichtlich
ihrer Eigenschaften als Radiopharmaka für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in vitro und in vivo. Die gewonnenen Erkenntnisse sind wertvoll
für die präklinische Bewertung der Eignung dieser Radioliganden für die Bildgebung von Tumoren mit Hilfe der PET.
Methoden
Die Überprüfung der Stabilität der Radiopeptide erfolgte durch Inkubation in
humanem Serum, Erfassung des LogD7,4-Wertes und Untersuchung mittels
Radioliganden-Bindungsstudie an ανβ3, ανβ5 und HT29 Zellen. Für diese Untersuchungen wurden sowohl die
68
Ga-markierten Peptide, sowie
125
I-markiertes
Echistatin als Radioligand in den Bindungsstudien verwendet. Es wurden insgesamt 72 Mäuse für die Bioverteilung von [68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTARGD-4 und [68Ga]DOTA-RGD-16 untersucht, wobei 10 Mäuse, zusätzlich in der
Kleintier-PET (µPET) getestet wurden.
Ergebnisse und Beobachtungen
Es zeigte sich, dass alle fünf [68Ga]DOTA-RGD-Multimere hydrophile Verbindungen sind, deren Hydrophilie mit zunehmender Molekülmasse abnimmt.
Die Stabilität der Tracer im Serum ist für die Verbindungen [68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-2 und [68Ga]DOTA-RGD-4 sehr hoch (> 94%, 90 min). Leider
zeigten [68Ga]DOTA-RGD-8 (< 60%, 60 min) und [68Ga]DOTA-RGD-16 (< 17%,
60 min) eine verminderte Stabilität im Serum in vitro. Die Bioverteilung in vivo
zeigte, dass [68Ga]DOTA-RGD-1 und [68Ga]DOTA-RGD-4 zwei geeignete Verbindungen, zur spezifischen Darstellung von Tumoren, über die Bindung an
Integrinen, sind. Dabei zeigte [68Ga]DOTA-RGD-4 den Vorteil einer hohen
Retention im Tumor, die mit einer besseren Bindungsfähigkeit, im Vergleich
7
zum Monomer, in vitro korreliert. Im Gegensatz dazu besitzt [68Ga]DOTA-RGD1 eine schnellere Clearance aus dem Tumorareal, was die Bildgebung von
Tumoren in der µPET erschweren kann. Die Hypothese, dass [68Ga]DOTARGD-4 eine höhere Bindungsfähigkeit für Integrine zeigt als das Monomer,
konnte ebenso mit Hilfe von Bindungsstudien an ανβ3 in vitro nachgewiesen
werden. Hier zeigen die höheren [68Ga]DOTA-RGD-Multimere ([68Ga]DOTARGD-8 und [68Ga]DOTA-RGD-16) eine weitere Steigerung der Avidität für ανβ5Integrin, ähnlich zu den Bindungsdaten über ανβ3. Dieser Trend konnte für
[68Ga]DOTA-RGD-16 im Rahmen von Bioverteilungsstudien und µPET-Experimenten in vivo nicht bestätigt werden, da die Ergebnisse eine Instabilität der
Substanz in vivo vermuten lässt.
Praktische Schlussfolgerungen
Der Ansatz, über [68Ga]DOTA-RGD-Multimere eine verbesserte Tumordiagnostik mit Integrin-spezifischen Tracern zu begründen, erscheint aussichtsreich. Da
68
Ga-markierte Verbindungen einfach darstellbar sind und somit
sehr gut verfügbar sein können, kann es langfristig möglich werden, Tumore
und deren Metastasen in sehr frühen Stadien mit Hilfe der PET zu
diagnostizieren.
8
Biodistribution and analysis of 68Ga-labeled RGD multimers
using tumor-bearing nude mice by means of small-animal
positron emission tomography
Abstract
Background and Aims
Tumor angiogenesis plays an important role in early identification of cancer and
tumor metastasis. Functional proteins, especially integrins, are highly expressed
during this process and therefore represent a molecular target for imaging of
tumor vessels by positron emission tomography (PET). Cyclic pentapeptides
bearing the RGD sequence are commonly known as highly affine molecules
which bind to Integrins; those DOTA-conjugated ligands are suited for
radiolabelling with the positron emitter
characterization of a series of five
68
Ga. The major focus of this work is the
68
Ga-labelled DOTA-RGD-peptide multimers
(monomer, dimer, tetramer, octamer, hexadecimer) with respect to their
properties in vivo and in vitro as radiopharmaceuticals for positron emission
tomography (PET). The found conclusions are valuable for the preclinical
assessment for the suitability of these radioligands for imaging tumors by PET.
Methods
The examination of the stability of the radiopeptides was accomplished by
incubation in human serum, identification of the LogD7,4-value and analysis
through radioligand binding assay with ανβ3, ανβ5 and HT29-cells. For these
analyses the
68
Ga-labelled peptides and
125
I-labeled echistatin were used as
radioligand in the binding assays. A sum of 72 mice were used for the
biodistribution
study
of
[68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-4
and
[68Ga]DOTA-RGD-16 when 10 mice were subjected to in vivo imaging studies
by small-animal PET (µPET).
Results
It was shown that all of the five [68Ga]DOTA-RGD-multimers are hydrophilic
compounds with hydrophilicities decreasing with increasing molecule mass. The
stability of the tracer in serum is sufficiently high for the multimers [68Ga]DOTARGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-2
68
and
[68Ga]DOTA-RGD-4
(>94%,
90min).
68
Unfortunately [ Ga]DOTA-RGD-8 (<60%, 60min) and [ Ga]DOTA-RGD-16
(<17%, 60min) show a decreased stability in serum in vitro. The biodistribution
data in vivo showed that [68Ga]DOTA-RGD-1 and [68Ga]DOTA-RGD-4 are
9
appropriate compounds for specific imaging of tumors by binding on integrins.
Thereby, [68Ga]DOTA-RGD-4 revealed higher tumor retention in vivo which
correlated with the improved binding properties in vitro in comparison to the
tetramer. In contrast, there is the fast clearance from the tumor area for
[68Ga]DOTA-RGD-1 which may complicate the imaging of tumors by smallanimal PET. The prediction that [68Ga]DOTA-RGD-4 has a higher affinity for
integrins when compared to the monomer was approved by ανβ3-binding studies
in vitro. They show for the higher [68Ga]DOTA-RGD-multimers ([68Ga]DOTARGD-8 and [68Ga]DOTA-RGD-16) a further increase of binding avidity towards
ανβ5 integrin, similar to the situation for the ανβ3 binding results. This trend could
not be confirmed for [68Ga]DOTA-RGD-16 in vivo within analysis of the
biodistribution and small-animal PET experiments since the results suggested
an instability of the substance in vivo.
Conclusions
The approach one could launch an improved tumor diagnostic with
[68Ga]DOTA-RGD-multimers with integrin-specific tracers appears to be
promising. Given that
68
Ga-labeled multimers are easily synthesized and
therefore highly available, there could be a possibility in the long term that
cancer and its metastases are diagnosed in a very early state with the help of
PET.
10
2 Einleitung und Zielsetzung
Diese Arbeit beschäftigt sich mit radioaktiv markierten Multimeren, deren
Eigenschaft es ist, an Gewebestrukturen zu binden und diese bildlich mittels
Positronen-Emissions-Tomographie
(PET)
darzustellen.
Zum
besseren
Verständnis werden in den folgenden Kapiteln die Radioaktivität (Kapitel 1.1.),
Positronenemissionstomographie
(Kapitel
1.2.),
Integrine
(Kapitel
1.3.),
Tumorangiogenese (Kapitel 1.4.) und RGD-Multimere (Kapitel 1.5.) erläutert.
2.1
Radioaktivität
Für das Verständnis der Radioaktivität ist der Grundaufbau eines Atoms sehr
wichtig. Ein Atom besteht im Normalzustand, vereinfacht dargestellt in
Abbildung 1, aus einem Kern, in welchem sich Protonen (positiv geladene
Teilchen) und Neutronen (neutral geladene Teilchen) zu gleichen Teilen
befinden. Um diesen Kern befinden sich Elektronen (negativ geladene
Teilchen).
Elektron
Proton
Neutron
Atomkern
Abbildung 1. Graphische Darstellung eines Atoms im Atommodell nach Rutherford [5]
Die chemische Formel zur Darstellung der Verteilung von Protonen und
Neutronen lautet:
Massenzahl
Chemisches Symbol
Ordnungszahl
Die Massenzahl gibt die Gesamtmasse des Elements an und setzt sich aus der
Masse der Protonen und Neutronen zusammen. Elektronen besitzen eine
11
vernachlässigbare Masse. Die Ordnungszahl spiegelt die Protonenanzahl im
Kern eines Atoms wieder.
Die
Verdeutlichung
der
Systematik
erfolgt
am
Beispiel
des
in
der
Nuklearmedizin genutzten Nuklids Gallium-68. Es ergibt sich folgende
Bezeichnung des Elements:
68
Ga
31
Die Notation zeigt, dass Gallium-68 31 Protonen und 37 Neutronen im Kern
vereint.
Nach Außen hat ein Atom im Normalzustand eine neutrale Ladung. Das
bedeutet, dass sich genauso viele Elektronen wie Protonen in einem Atom
befinden. Hat ein Atom eine negative oder positive Ladung ist es ionisiert.
Diesen Zustand erreicht ein Atom indem es negativ oder positiv geladene
Teilchen abgibt oder aufnimmt. Kommt es zu einem Missverhältnis von
Protonen und Neutronen im Kern des Atoms entsteht ein instabiler Zustand.
Durch Zerfall versucht der Kern einen stabilen Zustand zu erzeugen, indem er
Protonen oder Neutronen umwandelt und hierbei Energie freisetzt. Dabei
entsteht radioaktive Strahlung.
Man unterscheidet 3 Arten des radioaktiven Zerfalls. Diese werden mit den
griechischen Buchstaben: α, β und γ gekennzeichnet. Wesentlicher Unterschied
in der Einteilung sind Teilchenart und damit die Materialdurchdringungstiefe, die
in Abbildung 2 dargestellt ist. Wobei α-Strahlung am Wenigsten in der Lage ist
Material zu durchdringen (ein Blatt Papier ist ausreichend) und γ-Strahlung am
Meisten (Bleiummantelung nötig) [39].
Die Einteilung erfolgt außerdem nach Art des Zerfalls. Elemente mit gleicher
Protonenzahl aber unterschiedlicher Neutronenzahl nennt man Isotope. Isotope
mit neutronenarmen Kernen neigen zu Positronenzerfall, währenddessen
neutronenreiche Kerne eher einen β-Zerfall durchführen. Bekannte in der
Nuklearmedizin genutzte Isotope sind zum Beispiel Gallium-68 mit einer
Halbwertszeit von t½ = 68 Minuten und Fluor-18 mit einer Halbwertszeit von t½ =
110 Minuten. Die Halbwertszeit ist dabei die Zeitspanne in der sich die Menge
eines radioaktiven Stoffes auf die Hälfte reduziert hat, wobei die andere Hälfte
in ein anderes radioaktives Nuklid umgewandelt wird.
12
Papier
Metallblech
Bleimantel
Abbildung 2. Graphischer Vergleich der Eindringtiefe von α-, β- und γ-Strahlung [1]
Die Art der Radioaktivität eines Elements wird bestimmt durch die Veränderung
im Kern. Im Folgenden wird auf unterschiedliche Strahlungsarten zum besseren
Verständnis von Radioaktivität eingegangen. α-Strahlung ist definiert durch, wie
in Abbildung 3 zu sehen ist, die Aussendung eines α-Teilchens, welches 2
Protonen und 2 Neutronen besitzt – der so genannte Helium-4-Atomkern.
Typische α-Strahler sind Uran oder Radium. Die Eindringtiefe in Materie ist
gering. So wird α-Strahlung von 0,1 mm Wasser oder 10 cm Luft vollständig
abgeschirmt [39].
Helium-4-Atomkern
Atomkern
Abbildung 3. Darstellung des α-Zerfalls modifiziert nach [2]
β-Strahlung hingegen ist eine ionisierende Strahlung. Sie beinhaltet die
Aussendung von Elektronen oder Positronen (positive geladene Teilchen mit
der vernachlässigbaren Masse eines Elektrons) aus dem Atomkern eines
13
Elements. Dabei unterscheidet man zwischen dem β--Zerfall (Aussendung von
Elektronen; Abbildung 4) und β+-Zerfall (Aussendung von Positronen). Im Falle
des β--Zerfalls besitzt der Atomkern einen Neutronenüberschuss, was dazu
führt, dass eine Umwandlung eines Neutrons in ein Proton, ein Elektron und ein
Antineutrino erfolgt. Dabei verbleibt das Proton (p) im Kern und das Elektron
wird zusammen mit dem Antineutrino in Form von β--Strahlung freigesetzt [40].
Atomkern
Abbildung 4. Darstellung des β -Zerfalls modifiziert nach [4]
-
Die andere Form des β-Zerfalls besteht aus der Umwandlung eines Protons in
ein Neutron, ein Positron und ein Neutrino. Das Neutron verbleibt im Kern,
während dessen das Positron und das Neutrino den Kern in Form von
sogenannter β+-Strahlung verlassen [40]. Die 3. Gruppe der Strahlungsarten ist
die γ-Strahlung. Sie entsteht nach einem Kernzerfall wie bei der α- oder βStrahlung. Im Anschluss an den Kernzerfall befindet sich der Kern oft in einem
angeregten Zustand. Um einen stabilen Zustand zu erreichen, gibt der Kern
diese diskrete Energie in Form von Photonen mit definierter Energie ab
(Gammastrahlung), wie in Abbildung 5 dargestellt [40].
Atomkern
Abbildung 5. Darstellung des Gamma-Zerfalls eines angeregten Kerns modifiziert nach [6]
14
Weiterhin kann γ-Strahlung auch durch Wechselwirkung eines Teilchens mit
dem dazugehörigen Antiteilchen entstehen. Dabei kommt es zur sogenannten
Annihilation – der Paarvernichtung. Durch radioaktiven Zerfall im Sinne eines
β+-Zerfalls kommt es zur Entsendung eines Positrons aus dem Atomkern.
Anschließend kommt es wie in Abbildung 6 zu sehen ist zu einem
Zusammentreffen von dem Positron mit einem Elektron und zur Bildung eines
Positroniumatoms,
bevor
die
Vernichtungsenergie
in
Form
von
zwei
hochenergetischen Photonen (γ-Quanten) frei wird, die sich in einem Winkel
von 180° voneinander weg bewegen (Abbildung 6) [30, 39, 40]. Dieses Prinzip
wird für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) genutzt.
Abbildung 6. Darstellung der Vernichtung (Annihilation) eines Positrons [3]
2.2
Positronenemissionstomographie (PET)
Die
hohe
Nachfrage
nach
minimal
invasiven
Techniken
im
Bereich
medizinischer Diagnostik und Therapie, treibt auch die Forschung der
molekularen Wissenschaft immer weiter an [14]. Mit der Entwicklung der
Magnetresonanztomographie (MRT), der Computertomographie (CT) und der
Positronenemissionstomographie
(PET)
ist
es
möglich
geworden,
Gewebeveränderungen im Körper eines Menschen – beziehungsweise eines
Lebewesens – darzustellen und somit qualitativ hochwertige Bildgebung
anzubieten [36, 41].
Innerhalb dieser Forschung hat die Nuklearmedizin einen besonderen Stand,
weil es mit ihr möglich ist funktionelle Gewebediagnostik zu betreiben [37]. Mit
Hilfe der PET gelingt es die Funktion eines Gewebes zu untersuchen, indem
man die Verteilung eines radioaktiv markierten Tracers im Körper misst und so
Rückschlüsse auf die Funktion des Gewebes ziehen kann. Das bietet deutliche
15
Vorteile gegenüber der MRT oder dem CT, welche nur den Zustand eines
Gewebes wiedergeben können. Durch die hohe Sensitivität der PET können
funktionelle Vorgänge im Körper bereits visualisiert werden, wenn im MRT oder
CT noch keine Veränderung sichtbar ist. Der Nuklearmedizin gelingt es, die
radioaktiven Isotope verschiedener Elemente wie Jod, Fluor oder Gallium für
die Diagnostik und die Therapie in der Medizin zu nutzen. Wichtige Nuklide, die
für die PET genutzt werden, sind Gallium-68 mit einer Halbwertszeit von 68
Minuten, Fluor-18 mit einer Halbwertszeit von 110 Minuten, Stickstoff-13 mit
einer
Halbwertszeit
von
9,93
Minuten
und
Kohlenstoff-11
mit
einer
Halbwertszeit von 20,3 Minuten. Dabei wird vor allem 2-[18F]Fluor-2-desoxyglucose ([18F]FDG) genutzt, um stoffwechselreiche Bereiche des Körpers, wie
zum Beispiel Tumore, darzustellen.
Allen Nukliden ist gemein, dass sie Positronen aussenden und γ-Strahlung
erzeugen. Wie bereits erwähnt wird das Prinzip der Annihiliation bei der PET
genutzt. Die anfallende Vernichtungsstrahlung (511 keV) kann mittels
Detektoren, wie in Abbildung 7 zu sehen ist, gemessen werden.
Abbildung 7. Darstellung der Detektion 2 gleichzeitig ausgesandter Photonen [7]
Dabei ist zu beachten, dass nur die γ-Quanten erfasst werden, die gleichzeitig
von den Detektoren gemessen werden. Da die Detektoren häufiger zeitlich
nahe liegende γ-Quanten erfassen, die aber nicht in einer Projektionslinie,
16
sprich im 180° Winkel zueinander, liegen, muss eine Koinzidenzabfrage
erfolgen. Diese legt ein Zeitfenster fest, in dem man annimmt, dass 2 Photonen
gleichzeitig
gemessen
worden
sind.
Zusätzlich
werden
Effekte,
wie
Schwächung oder Streuung der Gamma-Photonen in der Bildverarbeitung
berücksichtigt [30]. Die beständige Weiterentwicklung im Bereich der PET hat
dazu geführt, dass es heute möglich ist, die Funktion der einzelnen Gewebe
genau darzustellen und dass das Zusammenspiel von PET mit dem CT einen
hohen Stellenwert in der Tumordiagnostik einnimmt. Dies ist deshalb von
Bedeutung, weil die Darstellung der Funktion eines Gewebes es ermöglicht,
Rückschlüsse auf deren (Fehl-)Entwicklung zu ziehen.
2.3
Tumorangiogenese
Die Gefäßbildung, die Tumore für ihre Vaskularisierung induzieren, spielt eine
entscheidende Rolle für deren Wachstum und Ausbreitung [21]. Daher versucht
man mit Hilfe von Radiotracern, die spezifisch an Oberflächenstrukturen von
Gefäßen binden, diese bildlich darzustellen [19, 20]. Als Tumorangiogenese
bezeichnet man die Einsprossung von Gefäßen, ausgelöst durch Tumorzellen,
in das umliegende Gewebe [20]. Laut Folkman, der als erster die
Tumorangiogenese als Basis für die Metastasierung beschrieb [19, 20], sind
Tumorzellen in der Lage, in das Geschehen benachbarter Endothelzellen
einzugreifen und Wachstum zu induzieren.
So ist es dem Tumor möglich, ein eigenes Gefäßsystem aufzubauen, sich
selbst zu versorgen und auszubreiten. Dies ist die Grundlage für Folkmans
Hypothese, dass Tumore, die sehr gut in der Lage sind eine eigene
Angiogenese zu induzieren, ein aggressiveres Wachstum aufweisen [19]. Um
eine Gefäßneubildung zu erreichen, müssen Zelladhäsionsmoleküle, u.a.
sogenannte Integrine, vom Tumor ausgehende Integrinbindungsmotive an sich
binden. Die Familie der Integrine spielen eine bedeutende Rolle in der
Metastasierung von Tumoren [9, 22].
2.4
Integrine und ihre Bedeutung im Tumorgewebe
Integrine sind heterodimere transmembrane Adhäsionsmoleküle [9]. Dies
bezeichnet Strukturen, die sich auf der Oberfläche von Gewebszellen befinden
und mit der extrazellulären Matrix interagieren. Sie stehen mit anderen Zellen
oder Zellbestandteilen in Verbindung, um Signale, zum Beispiel für die
17
Zellmigration, von außen aufzunehmen und nach intrazellulär weiterzuleiten [8,
12, 28]. Sie sind wichtige transmembrane Signalträger [28].
Außer
den
Integrinen
Zelladhäsionsmolekülen:
gibt
es
noch
drei
Selektine,
weitere
Cadherine
Subtypen
und
von
der
Immunglobulinsubfamilie zugehörige Strukturen.
Abbildung 8. Darstellung eines Integrins mit Verankerung in der Zellmembran [35]
Der Aufbau eines Integrins, wie in Abbildung 8 dargestellt, besteht immer aus
einer β-Kette (β-subunit), an die unterschiedlich viele α-Ketten (α-subunit)
binden können. Daher unterscheidet man verschiedene Familien von
Integrinen. Sie erfassen eine Familie von über 23 verschiedenen nichtkovalenten, heterodimeren Komplexen, die alle aus einer β-Kette und
mindestens einer α-Kette aufgebaut sind [8]. Alle Untereinheiten bestehen aus
Glykoproteinen, welche eine schwere extrazelluläre Kette, eine transmembrane
Kette und eine vergleichsweise kleine zytoplasmatische Kette aufweisen. Diese
Untereinheiten sind in der Zellmembran verankert.
Integrine sind bedeutende Strukturen in der Zellinteraktion [8] und folglich in der
Tumorentwicklung [9]. Ausführlich untersuchte Integrine im Rahmen der
Tumorangiogenese sind die Strukturen der ανβ Gruppe. Sie sind die am besten
charakterisierten Zelladhäsionsmoleküle [8, 26].
Integrine sind als molekulare Targets für bildgebende Verfahren von
Bedeutung, da während der Tumorangiogenese deren Expression hochreguliert
ist (Abbildung 9) [12, 15, 29] und eine Vielzahl radioaktiv markierter
18
Bindungsmotive in der Radiopharmazie entwickelt werden, die mit hoher
Affinität an Integrine binden und somit die Tumorangiogenese in der PET
darstellen können [18].
Abbildung 9. Darstellung der Bedeutung der Integrine für die Tumorangiogenese mit a) Bildung
von Signalstoffen durch den Tumor; b) Aktivierung von Integrinen und Induktion der
Angiogenese; c) Ausbildung eines Gefäßsystems und Metastasenzellstreuung [12]
Dabei spielt die bereits erwähnte ανβ-Gruppe der Integrine eine große Rolle.
ανβ3 wird häufig an der Oberfläche von vaskulären glatten Muskelzellen
(Gefäße), Osteoklasten (Knochen), Endothelzellen (Gefäße) und Tumorzellen
exprimiert. Organe, die diese Zellen besitzen, also gut durchblutete Organe und
Tumore, sind mit einer erhöhten Integrinexpression konfrontiert [29]. Hier knüpft
das für diese Arbeit wichtige Bindungsmotiv, bestehend aus Arginin-GlycinAsparaginsäure (RGD), an [29].
2.5
RGD-Multimere
Das Bindungsmotiv RGD, bestehend aus Arginin, Glycin und Asparaginsäure
(Arg-Gly-Asp),
ist
eine
Peptidsequenz,
welche
in
der
Lage
ist,
an
Oberflächenstrukturen (den Integrinen), die auf Tumorgefäßen während der
Angiogenese hoch exprimiert sind, zu binden [10, 18]. In den letzten Jahren
19
wurde eine Vielzahl radiomarkierter cyclischer Pentapeptide als potentielle
Radioliganden für die Integrine entwickelt. In diversen Vorarbeiten durch Li, Z.
B. [33], Decristoforo, C. [16], Beer A. J. [13], Haukkala, J. [27] und Wängler, C.
[42], die sich auf die Erstarbeiten durch Aumailley, M. [11] aus dem Jahr 1991
stützen, welcher die ersten zyklischen RGD-Peptide entwickelte, wurden
zyklische RGD-Peptide sowohl mit
64
Cu,
18
F, als auch mit
68
Ga markiert. Der
Übersichtsarbeit von Haubner und Decristoforo aus dem Jahr 2009 [24] ist zu
entnehmen, dass das Integrin ανβ3 während der Tumorausbreitung und –
metastasierung hoch exprimiert ist und sich deshalb sehr gut als Target zur
Darstellung der Tumorangiogenese eignet. Ihre Bemühungen konzentrieren
sich dabei auf die Entwicklung regiospezifisch radiomarkierter Peptide,
basierend auf Arg-Gly-Asp (RGD), mit hoher Avidität und Selektivität gegenüber
ανβ3 zum besseren Tumortargeting [24].
Dabei wies die Verbindung [18F]Galakto-RGD eine sehr gute Stabilität auf und
verbesserte Eigenschaften bezüglich der Ausscheidung des Tracers über die
Niere; insgesamt zeigt die Bioverteilung des Tracers ein vorteilhaftes
Tumor/Blut-Verhältnis im präklinischen Tiermodel [25]. Daraus lässt sich
ableiten, dass [18F]Galakto-RGD sehr spezifisch an Integrin ανβ3. Dieser Tracer
ist in umfangreicher Arbeit sehr häufig an Patientenkollektiven verwendet
worden, um in vivo die Integrinexpression für die Tumorbildgebung in der PET
zu nutzen [23]. In unserer Arbeitsgruppe wurde ebenso ein glycosylierter Tracer
entwickelt, der in präklinischen Modellen charakterisiert ist [34].
Die Entwicklung von RGD-Multimeren ist sehr wichtig, da man festgestellt hat,
dass RGD-Multimere in der Lage sind spezifisch an Integrine zu binden, was in
der PET sehr gut dargestellt werden kann und je höherwertig die RGDMultimere sind, umso mehr steigt ihre Avidität. Bisherige Arbeiten über
multimere RGD-Peptide beschreiben die folgenden Ergebnisse: Wie in der
Arbeit durch Haukkala et al. beschrieben [27], wurde [68Ga]DOTA-RGD und
seine Bindung an ανβ3 und ανβ5 erfolgreich untersucht, indem er die Aufnahme
von [68Ga]DOTA-RGD in artheriosklerotische Plaques an Mäusen testete. Dabei
fanden
sie
heraus,
dass
der
Tracer
[68Ga]DOTA-RGD
gut
in
die
artheriosklerotischen Plaques aufgenommen wurde, was die Theorie der
Integrinspezifität von RGD unterstützte. Für die Bedeutung der RGD-MultimerForschung sind die Ergebnisse von Dijkgraaf et al. von besonderer Bedeutung
[17, 18]. In seiner 2010 veröffentlichten Arbeit untersuchte seine Arbeitsgruppe
20
die Multimere [68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTA-RGD-2 und [68Ga]DOTA-RGD4 in vitro und in vivo im Kleintier-PET mit subkutan wachsenden SK-RC-52
xenotransplantierten Zellen und kam zu dem Schluss, dass die Integrin-Avidität
und die Aufnahme von [68Ga]DOTA-RGD in den Tumor, nach 2 Stunden, vom
Monomer (3.30 ± 0.30 %ID/g) über das Dimer (5.24 ± 0.27 %ID/g) bis zum
Tetramer (7.11 ± 0.67 %ID/g) anstieg [18]. Dies lässt den Schluss zu, dass je
höherwertig die RGD-Peptide sind, desto höher ist ihre Avidität für Integrine
vom Typ ανβ3 und ανβ5. Diese Feststellung wird durch Li et al. unterstützt, der,
allerdings mit Kupfer-64 markierte, Tetramere und Oktamere, anhand von
U87MG Glioblastoma xenotransplantierten Zellen, im c-neu TumormausModell, mit Hilfe der Kleintier-PET, untersuchte [33].
Daher ist es von Nutzen höherwertige RGD-Peptide herzustellen und zu
untersuchen. Die Möglichkeit radioaktive Liganden an DOTA-RGD-Peptide zu
binden, macht man sich wissenschaftlich und diagnostisch zu Nutze. In dieser
Arbeit wurden, neben den in der Arbeitsgruppe bekannten Gallium-68markierten Verbindungen DOTA-RGD-1 (Abbildung 10; [42]), DOTA-RGD-2
und DOTA-RGD-4 (Abbildung 11; [42]), erstmalig die Verbindungen DOTARGD-8 und DOTA-RGD-16 (Abbildung 12; [42]) mit Ga-68 radiomarkiert und in
vitro und in vivo untersucht. Alle von Wängler et al. entwickelten RGDMultimere wurden anhand einer komplexen chemischen Synthese unter
Verwendung spezieller Linker zugänglich gemacht und konnten mit Gallium-68
radiomarkiert werden [42]; die Vorläufermoleküle (DOTA-Peptide) wurden von
Wängler et al. für die Experimente im Rahmen dieser Arbeit zur Verfügung
gestellt.
Abbildung 10. Darstellung von DOTA-RGD-1 [42]
21
Abbildung 11. Darstellung von DOTA-RGD-4 [42]
Abbildung 12. Darstellung von DOTA-RGD-16 [42]
2.6
Ziel
Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von [68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-4
und
[68Ga]DOTA-RGD-16
hinsichtlich
ihrer
Bindungsfähigkeit zum Integrin ανβ3 und der Bioverteilung und zusätzlich
[68Ga]DOTA-RGD-2 und [68Ga]DOTA-RGD-8 bezüglich ihrer Stabilität in vitro,
ihrer Lipophilie und dem Verhalten in der Bindungsstudie an HT29 Zellen und
ανβ5. Zur Ermittlung der In-vivo-Eigenschaften der Tracer wurden 10
22
tierexperimentelle Untersuchungen mit Hilfe der PET durchgeführt und die
Bioverteilung nach postmortaler Sektion der Versuchstiere bestimmt. Für die
vergleichende Bewertung der Ergebnisse wurden Daten über die In-vitroBindungsfähikeit für ανβ3 hinzugezogen, sowie vorhandene Daten über die
Bioverteilung der Multimere zusätzlich beachtet.
Ausgangspunkt der Arbeit ist die Vermutung, dass die Bindungsfähigkeit der
Multimere [68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTA-RGD-4 und [68Ga]DOTA-RGD-16
abhängig ist von der zugrundeliegenden molekularen Struktur. Das lässt den
Schluss zu, dass das Multimer [68Ga]DOTA-RGD-16 den niedrigsten Ki-Wert für
die Integrinbindung in vitro aufzeigen müsste im Vergleich zu den kleineren
Peptiden wie [68Ga]DOTA-RGD-1 und [68Ga]DOTA-RGD-4. Die Entwicklung der
[68Ga]DOTA-RGD-Multimere erfolgte in der AG Wängler an der LMU München
und zielte insbesondere darauf ab, einen Test durchzuführen, um die Grenze
der Multimerisierung und Erhöhung der Bindungsfähigkeit zu erfassen. Dabei ist
allerdings zu beachten, dass die Stabilität der Tracer im Serum eine zusätzliche
Rolle für die Bewertung der Tracer spielt und die Verteilung und die Biokinetik in
vivo ebenso für die Beurteilung der Tracer hinzugezogen werden muss.
Das Ziel ist es, vergleichende Untersuchungen zwischen Multimer und
Monomer zu unternehmen und zu ermitteln, ob und inwiefern das größte
[68Ga]DOTA-RGD-Multimer, in diesem Fall das hexadecimere [68Ga]DOTARGD-16, jenes ist, welches im Tumor am besten aufgenommen und im
Kleintier-PET (µPET) für die Tumordetektion besonders gut geeignet ist.
23
3 Material und Methoden
Das folgende Kapitel Material und Methoden unterteilt sich in 2 große
Unterkapitel. Im ersten Teil werden alle genutzten Materialien beschrieben.
Dabei geht es, neben den verwendeten Lösungen/Chemikalien, um die im
Tierversuch eingesetzten Mäuse und das verwendete Tumormodell. Alle
eingesetzten Geräte sind ebenfalls aufgeführt.
Im zweiten Teil erfolgt die Aufführung und Erläuterung aller angewandten
Methoden mit Herstellung der verwendeten [68Ga]DOTA-RGD-Verbindungen,
sowie die Darstellung aller In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen.
3.1
Material
3.1.1 Chemikalien
Tabelle 3.1. Chemikaliengebrauch zur Bestimmung des LogD7,4-Wertes und der Synthese der
radioaktiv markierten RGD-Multimere
Name
Salzsäure
Formel/Konzentration
0,1 N HCl
4 N HCl
80% Aceton/Salzsäure 0,15 M HCl 80% Aceton/HCl 0,15 M HCl
97,5% Aceton/Salzsäure 0,05 N HC 97,5% Aceton/HCl 0,05 N HCl
Wasser
H20
Natriumacetat
250 mM NaOAc
Natriumhydrogencarbonat
0,1 M NaHCO3
Methanol-Dichlormethan
MeOH-CH2Cl2
1-Octanol
Citronensäure
0,1 M
3.1.2 Lösungen und Puffer
Tabelle 3.2. Hergestellte Lösungen zur Untersuchung der Bioverteilung in vitro und zur Analyse
der Bindungsstudien
Lösung
Humanes Serum
Phosphatpuffer PBS
Albumin Fraction Bovine
Coating Buffer pH 7,4
Blocking Buffer
Binding Buffer
Zusammensetzung/Quelle
gesunder Proband
Invitrogen
Roth GmbH Charge 408100128, 50g M = 69000 g/mol
500 ml H2O
1,97 g Tris-HCl
4,35 g NaCl
73,5 mg CaCl2
25 mg MgCl2
99 mg MnCl2
NaOH (pH Einstellung)
Coating Buffer + 1% BSA
Coating Buffer + 0,1% BSA
24
3.1.3 RGD-Multimere
Insgesamt wurden 5 verschiedene DOTA-RGD-Multimere zur Untersuchung
verwendet: ein monomeres DOTA-RGD-1 und vier Multimere DOTA-RGD-2,
DOTA-RGD-4, DOTA-RGD-8 und DOTA-RGD-16. Diese wurden durch Frau Dr.
Carmen Wängler an der Universität München synthetisiert und für die
Experimente im Rahmen der vorliegenden Arbeit zur Verfügung gestellt.
3.1.4 Zellen und Integrine
Tabelle 3.3. Verwendete Zellen und Integrine
Zellen
Zelllinie HT29
(humane Kolonkarzinomzellen)
ανβ5
ανβ3
Zelllinie U87MG
(humane Glioblastomzellen)
Herkunft
ATCC: HTB-38
Millipore
Millipore
ATCC: HTB-14
3.1.5 Anästhetikum
Tabelle 3.4. Verwendetes Narkosemittel und dessen Herkunft
Narkotikum
Herkunft
Isofluran (1-Chloro-2,2,2Abbott GmbH&CoKG,
triflouroethyldifluoromethylether) 65205 Wiesbaden NI-B506
3.1.6 Radioaktive Stoffe
Tabelle 3.5. Verwendete Nuklide und deren Herkunft
Nuklid
Gallium-68
Gallium-68
Herkunft
68Ge/68Ga Radionuklid-Generator Kopfklinik
68Ge/68Ga Radionuklid-Generator Nuklearmedizin
125
I-Echistatin Amersham, GE Healthcare
3.1.7 Mäuse
Für die Tierversuche wurden männliche Nacktmäuse (NMRI/nu von Harlan) im
Alter von ca. 3 Monaten benutzt. Diese wurden in pathogenfreier Zucht zu je 5
Mäusen in Käfigen im Tierstall des Franz-Penzoldt-Zentrums an der Universität
gehalten. Insgesamt wurden 62 Mäuse für die Untersuchung der Bioverteilung
und 10 Mäuse für die PET-Untersuchungen verwendet.
3.1.8 Tumorimplantation
Die
verwendeten
Tumorzellen
entstammten
der
humanen
malignen
epithelialen Glioblastom Zelllinie U87MG (ATCC: HTB-14). 2 Wochen vor den
Versuchsreihen
wurden
die
Tumorzellen
(2
Mio/Maus)
unter
25
Isoflurankurznarkose subkutan in die rechte Schulterregion der U87MG Tumortragenden Nacktmaus injiziert. Nach 2 bis 3 Wochen wiesen die Mäuse eine
durchschnittliche Tumorgröße mit einen Durchmesser von 4-5 mm auf.
3.1.9 Geräte
Tabelle 3.6. Geräteauflistung zur Synthese und Analyse der verwendeten Lösungen, Puffer,
Verbindungen
Versuchsabschnitt
Material
Überprüfung und Analyse HPLC
des synthetisierten
Dünnschichtchromatograph
[68Ga]DOTA-c(RGDfC)
Polygram SIL GIUV
Synthese
Gallium-68
pH Indikatorstreifen
Ga-Generator Kopfklinik
68
68
Ga-Generator
Nuklearmedizin (ISI)
Aktivimeter M2311
Bioverteilung
Versuchsvorbereitung
Organentnahme
µPET (Kleintier-PET)
Gamma Counter Typ 1470
Wizard
Analysenwaage Sartorius Typ
BP 2215
Waage Labor UG 440-43IV
Ultraschallbad Sonorex Typ
RK 31
Eppendorf Cups Typ Twist Top
Vials
Cat# 15590
Cat# 15510
Eppendorf Cups Deckel Typ
Standard 50-1000 µl
Eppendorf Röhren Typ REF
55.484
Einmal-Mikropipetten Typ DIN
ISO 7550
Pinzette
Uhrglasplatten
Knochenschere
Einwegskalpell No. 10/11
Haltung/Narkose der
Maus
Heizmatte
Hersteller,
Produktnummer
Agilent HP1100
Packard, Canberry
Company
Carl Roth GmbH , REF
805021
Roth
Labor Nuklearmedizin
Kopfklinik
Labor Nuklearmedizin
(ISI)
Labor Nuklearmedizin
Kopfklinik
Siemens
Perkin Elmer
Sartorius AG Göttingen
Kern
Bandelin Electronic
Sorenson Bioscience,
Inc.
Eppendorf AG
SARSTEDT
DURAN
Labor Nuklearmedizin
Kopfklinik
Labor Nuklearmedizin
Kopfklinik
Labor Nuklearmedizin
Kopfklinik
feather disposable
scalpel, FEATHER
Terra Temp 8W, JBL
GmbH
Art.Nr.: 7114400V01
26
Narkosegerät
Bindungsstudie
(Binding Assay)
Penlon Sigma Delta,
Intermed, Zevenaar
Holland
Maxisorp
C96 Maxisorp
nunc immuno plate
Pipettenröhrchen
Sarstedt (200 µl);
epT.I.P.S. Standard/Bulk
(0,1-10µl); VWR (501000µl)
Sarstedt (55.484)
Eppendorf
Eppendorf
Machery-Nagel
Countröhrchen
Zentrifuge 5810
Zentrifuge 5417R
Wiegepapier 100 Blatt
9,00x11,5 cm
Schüttler Titramax 100
Magnet Rotator Hytrel HTR
8068 UL 94-V0
3.2
Heidolph
Goldfish
Methoden
3.2.1 Gallium-68
Wie bereits vorangegangen beschrieben, wurde zur Untersuchung der
c(RGDfC)-Multimere das radioaktive Nuklid Gallium-68 genutzt, welches ein
Positronenstrahler mit der Halbwertszeit von 68 min ist. Trotz der kurzen
Halbwertszeit ist es aufgrund des Generatorprinzips sehr gut verfügbar und
lässt das experimentelle Arbeiten mit den einzelnen Verbindungen gut zu.
3.2.2 Isolierung/Elution von Gallium-68
Wir hatten das Gallium-68 im Labor der Kopfklinik nach Anleitung von
Zhernosekov et al. mit Hilfe eines Ge/Ga-Generators zur Verfügung [43].
Der
Ge/68Ga-Radionuklid-Generator produzierte den kurzlebigen γ-Strahler
68
68
Ga (t1/2 = 68 min). Dabei ist zu beachten, dass das produzierte Eluat
signifikante Mengen des langlebigen
68
Ge enthalten kann. Der Generator ließ
sich nicht beliebig oft hintereinander eluieren, da der Zerfall des Germanium-68
die Verfügbarkeit von Gallium-68 begrenzte. Die Dauer von 2,5 Stunden musste
eingehalten werden, damit wieder ausreichend
68
Ga zur Verfügung stand
beziehungsweise eluiert werden konnte [43].
Der
68
Ge/68Ga-Radionuklid-Generator war auch deshalb sehr effizient, weil er
bis zu einem Jahr benutzt werden kann, bevor nicht mehr genügend
68
Ge zur
Verfügung steht. In manchen Fällen wurde im Rahmen dieser Arbeit das
68
Ga
aus einem Generator in der Nuklearmedizin (Standort: ISI) automatisiert eluiert.
27
Wie in Tabelle 3.7. beschrieben waren folgende Schritte zur Isolierung/Elution
des 68Ga nötig:
Tabelle 3.7.. Isolierung/Elution von Gallium-68 aus Germanium-68 mittels eines Radionuklid
Generators
Herstellung des Gallium-68
1. Rekonfiguration der Kartusche mit 1 ml 4N HCl
und 1 ml H2O über den 3-Wegehahn
direkte Einspritzung von 8 ml 0,1 N HCl in den Generator
Fixierung der festen Phase
2. Luft mittels Spritze in die Kartusche nachdrücken
3. Zugabe von 1ml 80% Aceton/0,15 HCl-Gemisch über den 3-Wege-Hahn
Waschen der Kartusche
4. Benetzung der 3-Wege-Hahn Kartusche und anschließende vollständige
Gabe von 400 µl 97,6% Aceton/0,05N HCl Lösung
5. Luft mittels Spritze in die Kartusche nachdrücken
3.2.3
68
Ga-Markierung von DOTA-RGD-Verbindungen
Zur Herstellung der
68
Ga-markierten zyklischen RGD-Verbindungen wurde der
komplexbildende Chelator DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10tetraessigsäure) verwendet, da dieser sehr stabile Komplexe mit Metallionen
wie dreiwertigem Gallium eingeht. In der chemischen Synthese von Wängler et
al wird der DOTA-Chelator an die RGD-Sequenz gebunden [42]. Anschließend
wird das DOTA-Peptid Gallium-68 in Form von [68Ga]GaCl3 inkubiert, wobei die
radiochemische Ausbeute für den entstehenden [68Ga]DOTA-Komplex nahezu
quantitativ ist [27, 42].
Zur Markierung der DOTA-RGD-Verbindungen wurden die in Tabelle 3.8. und
3.9. beschriebenen Schritte durchgeführt.
Tabelle 3.8. Markierung von DOTA-Verbindungen mit Gallium-68 aus der Kopfklinik
Herstellung
1. 20 nmol DOTA-RGD-Verbindung + 50 µl 250 mM NaOAc + 200 µl [68Ga]GaCl3Eluat (in 50 mM HCl/97,6% Aceton)
pH= 4-5
2. 10 min bei 90°C inkubieren
3. Neutralisation mit 100-150 µl 0,1M NaHCO3 bis pH 7/8 erreicht ist
Tabelle 3.9. Markierung von DOTA-RGD-Verbindungen mit Gallium-68 aus der Nuklearmedizin
(ISI)
Herstellung
1. 20 nmol DOTA-RGD-Verbindung + 150 µl 1,25 M NaOAc + 200 µl [68Ga]GaCl3Eluat (in 0,6 M HCl)
2. 10 min bei 90°C inkubieren
3. Neutralisation mit 150 µl 1 M NaHCO3 bis pH 7/8 erreicht ist
28
3.2.4 Bestimmung der radiochemischen Reinheit
Nach
der
Synthese
der
[68Ga]DOTA-RGD-Verbindung
wurde
mittels
Radiodünnschichtchromatographie (DC), wie in Tabelle 3.10. zu sehen oder
HPLC (Chromolith C8, 10-50% AcN (=0,1% TFA) in 5 min, 4 ml/min) die
radiochemische Reinheit überprüft, um eine möglichst hohe Ausbeute und
Reinheit des Markierungsproduktes zu garantieren. Verlief die Synthese nicht
erfolgreich, wurde das alte Produkt verworfen und eine neue Synthese
angestrebt, die nochmals überprüft wurde.
Tabelle 3.10. Kontrolle der hergestellten
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
68
Ga-Verbindung mittels DC und HPLC
Kontrollabfolge
Auftropfen der Verbindung auf eine DC-Platte Polysil mittels Kapillare
Trocknen lassen
Befüllen der Chromatographiekammer mit 0,1 M Citronensäure als Laufmittel
Senkrechtes Einsetzen der DC-Platte in die Kammer
Abwarten bis das Laufmittel mehr als die Hälfte der Platte hoch gelaufen ist
Entfernung aus der Kammer und anschließende vollständige Trocknung der Platte
Auftragen des Endpunktes und Auswertung am Computer unter Instant Manager
Bei bestätigter Reinheit der [68Ga]DOTA-RGD-Verbindung von > 90% wurde
der pH-Wert mittels Indikatorstreifen getestet. Durch Auftropfen einer geringen
Menge der Lösung auf den Teststreifen sollte ein pH zwischen 6,5 und 7,5
erreicht werden.
3.2.5 Bestimmung der Radioaktivität
Die Bestimmung der Radioaktivität der [68Ga]DOTA-RGD-Verbindung erfolgte
im Aktivimeter nach erfolgreicher Synthese.
3.2.6 In-vitro-Untersuchungen
Im folgenden Kapitel werden die In-vitro-Untersuchungen erläutert. Zu diesen
gehören die Überprüfung der Stabilität der Tracer anhand der Inkubation in
humanem Serum, Ermittlung des LogD7,4-Wertes und die Durchführung der
Bindungsstudien im Verdrängungsexperiment (Binding Assay).
3.2.6.1 Stabilität der Tracer in humanem Serum
Zur Überprüfung der Stabilität der Tracer in humanem Serum (200 µl humanes
Serum + 50 µl Gallium-68-markiertes Peptid (ca. 4 MBq)), wurden diese zum
Zeitpunkt t0 in Serum gebracht. Anschließend wurden sie zu den Zeitpunkten t0,
t1, t2, t3, t4, t5 und t6 unter Zugabe von 100 µl MeOH-Dichlormethan gemischt,
29
zentrifugiert und der Überstand analysiert. Zu den Zeitpunkten t0 = 0 min, t1 = 5
min, t2 = 15 min, t3 = 30 min, t4 = 45 min, t5 = 60 min und t6 = 90 min wurde
dieser Überstand mit Hilfe des HPLC-Chromatographen untersucht.
3.2.6.2 LogD7,4 Bestimmung
Der LogD-Wert gibt die Verteilung eines Radiopharmakons im Wasser-OktanolGemisch an. Dies gibt Auskunft über deren Hydro- beziehungsweise Lipophilie.
Dazu wurde zuerst ein 1:1 Gemisch aus Oktanol und PBS pH=7,4 hergestellt.
Dabei wurden 25 kBq der
Ga-Verbindung (in 1 µl PBS)
68
mit 500 µl PBS
verdünnt und anschließend 500 µl Oktanol in einem Eppendorf Röhrchen für 1
min ausgiebig gemischt. Danach wurde zentrifugiert (12000 rpm für 2 min). Die
zwei dadurch aufgetrennten Phasen wurden getrennt in je 3 Röhrchen zu 100 µl
pipettiert und die Radioaktivität der im Gamma-Counter gemessen. Die
gemessene Countrate ist proportional zu der Konzentration für die zu
untersuchende Substanz co für die Oktanol-Phase und der Konzentration cP für
die PBS-Phase. Der D7,4-Wert ergab sich aus dem Quotienten dieser beiden
Konzentrationen.
D7,4 = co/cP
Der dekadische Logarithmus des Verteilungskoeffizienten ist der LogD7,4-Wert.
Positive LogD7,4-Werte, die größer als 3 sind, zeigen sehr lipophile Substanz
an, bei negativen Werten handelt es sich um hydrophile Substanzen.
3.2.7 Bindungsstudien (Binding Assay)
Um
die
Bindungsfähigkeit
der RGD-Verbindungen
in
vitro
weiter
zu
untersuchen, wurden sie mit HT29-Zellen oder ανβ5 inkubiert. Dabei wurde
untersucht,
ob
125
I-Echistatin
mit
Hilfe
eines
RGD-Multimers
konzentrationsabhängig verdrängt werden konnte.
3.2.7.1 Bindungsstudien mit 125I-Echistatin an HT29 Zellen zur
Charakterisierung der Bindungsfähigkeit der RGD-Multimere
In den Bindungsstudien sollte im Verdrängungsexperiment unter Verwendung
des hochaffinen Radioliganden
125
I-Echistatin die Bindungsfähigkeit der RGD-
Multimere ermittelt werden. Da HT29-Zellen eine bekannte Expression von
ανβ5-Integrin besitzen, wurden diese Zellen für die Experimente eingesetzt [31].
Um die spezifische Bindung der RGD-Multimere zu testen, wurden die RGDMultimere RGD-1, RGD-2, RGD-4, RGD-8, und RGD-16 an diesen Zellen
30
konzentrationsabhängig in Anwesenheit des Radioliganden inkubiert. In
Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde bereits die Ki-Werte von RGD-1, RGD-2,
RGD-4, RGD-8 und RGD-16 das ανβ3-Integrin, sowie an U87MG-Zellen
überprüft. Diese Ergebnisse dienten als Vergleich für die Auswertung.
3.2.7.1.1 Versuchsaufbau und Versuchsablauf
Für den Versuch benötigt man HT29 Zellen, die vor Versuchsbeginn in eine
96well-Platte ausgesät worden (2 Mio Zellen/96well-Platte). Anschließend ging
man nach dem in Tabelle 3.11. beschriebenen Schema vor. Die Herstellung der
Lösungen erfolgt nach den in Tabelle 3.12. und 3.13. beschriebenen Schemata.
Tabelle 3.11. Versuchsaufbau der Bindungsstudie
Versuchsaufbau
1.
Zentrifugieren der Platte bei 850 rpm für 2 min
2.
Überstand absaugen
3.
Platte mit 200 µl/well Blocking Buffer waschen*
4.
Blocking unter Schütteln für 15 min bei Raumtemperatur mit 200 µl/well Blocking
Buffer
5.
1x Waschen* mit 200 µl/well Binding Buffer
6.
Zugabe von 90 µl/well RGD in 8 verschiedenen Konzentrationen in Binding
Buffer**
7.
Zugabe von 10 µl/well 125I-Echistatin (370 Bq, 0,05 nM)
8.
Inkubation auf dem Schüttler für 60 min bei Raumtemperatur
9.
2x waschen* mit 200 µl/well Bindung Buffer
10. Ablösen der Zellen mit 200 µl/well 2N NaOH (37°C)
11. Pipettieren der Zelllösungen in Minieppis und Überführen in Countröhrchen
12. Messung im γ-Counter
* Waschen: Platte bei 850 rpm zentrifugieren für 2 min, anschließend Überstand absaugen,
Puffer auf den Zellen verteilen, im Schüttler kurz aufsuspendieren, danach zentrifugieren bei
850 rpm für 2 min und Überstand absaugen
** Konzentrationen für RGD1, RGD2, RGD4: 50 µM, 5µM, 500 nM, 250 nM, 50 nM, 5 nM, 0,5
nM, 0,05 nM
** Konzentrationen für RGD8, RGD16: 5 µM, 500 nM, 50 nM, 5 nM, 2,5 nM, 0,5 nM, 0,05 nM,
0,005 nM
Tabelle 3.12. Herstellung der Lösungen für RGD1, RGD2, RGD4: L0 = 5mM
Lösung
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
Konzentration
Herstellung
Gesamtmenge
50 µM
4 µl L0 + 396 BB*
400 µl
5 µM
35 µl L1 + 315 BB*
350 µl
500 nM
35 µl L2 + 315 BB*
350 µl
250 nM
17,5 µl L2 + 332,5 BB*
350 µl
50 nM
35 µl L3 + 315 BB*
350 µl
5 nM
35 µl L5 + 315 BB*
350 µl
0,5 nM
35 µl L6 + 315 BB*
350 µl
0,05 nM
35 µl L7 + 315 BB*
350 µl
*BB: Binding Buffer
31
Tabelle 3.13.. Herstellung der Lösungen für RGD8, RGD16: L0 = 5µM
Lösung
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
Konzentration
Herstellung
Gesamtmenge
5 µM
4 µl L0 + 396 BB
400 µl
500 nM
35 µl L1 + 315 BB
350 µl
50 nM
35 µl L2 + 315 BB
350 µl
5 nM
35 µl L3 + 315 BB
350 µl
2,5 nM
17,5 µl L3 + 332,5 BB
350 µl
0,5 nM
35 µl L4 + 315 BB
350 µl
0,05 nM
35 µl L6 + 315 BB
350 µl
0,005 nM
35 µl L7 + 315 BB
350 µl
*BB: Binding Buffer
3.2.7.2 Bindungsstudien mit 125I-Echistatin zur Charakterisierung der
Bindungsfähigkeit der RGD-Multimere an immobilisiertem ανβ5
Untersucht wurde ganz gezielt ανβ5, um diese Ergebnisse mit den Ergebnissen
von Bindungsstudien an HT29 Zellen zu vergleichen.
3.2.7.2.1 Versuchsablauf und Versuchsaufbau
Vor dem Versuch mussten über Nacht (ca. 8 Stunden bei 4°C) die
Multiwellplatten mit dem Integrin
ανβ5 in „Coating Buffer“ beschichtet
(gecoated) werden. Dazu wurden 2 Aliquots à 7,1 µl (50 ng ανβ5 in 100µl
Wasser) mit 7,4 ml Coating Buffer verdünnt. Anschließend wurden aus dieser
Lösung 100 µl pro well einer 96-Well-Platte pipettiert und die Well-Platte über
Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Für die Untersuchung wurde folgender
Versuchsablauf, wie in Tabelle 3.14. erläutert, vorgegeben:
Tabelle 3.14. Versuchsaufbau/Versuchsablauf der Bindungsstudie
Ablauf
Platte aus dem Kühlschrank nehmen und den Überstand absaugen
Blocken mit 200 µl Blocking Buffer/well für 2h bei Raumtemperatur
2x Waschen* der Platte mit 200 µl/well Binding Buffer
90 µl der RGD Verbindung zugeben und 15 min bei Raumtemperatur
vorinkubieren lassen
(RGD Konzentrationen wie im Vorfeld beschrieben ansetzen)
5.
Zugabe von 10 µl/well 125I-Echistatin
6.
Inkubation für 3h bei Raumtemperatur
7.
3x Waschen* mit Binding Buffer
8.
Ablösen mit 200 µl/well 2N NaOH (37°C)
9.
Überstand in Countröhrchen pipettieren
10. Messung im γ-Counter
1.
2.
3.
4.
*Waschen: Vorsichtiges
Überstandes
Pipettieren
und
anschließendes
vorsichtiges
Absaugen
des
32
3.2.8 In-vivo-Untersuchungen
Die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche wurden ausnahmslos unter einer
gültigen Tierversuchsgenehmigung der Regierung Mittelfranken (Aktenzeichen:
54.2532.1-15/08) durchgeführt.
3.2.8.1 Untersuchung und Durchführung der Bioverteilung von
[68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTA-RGD-4, [68Ga]DOTA-RGD-16 in der
U87MG-Tumor-tragenden Nacktmaus mit und ohne µPET
Im Folgenden werden Versuchsaufbau, -ablauf und –ende von [68Ga]DOTARGD-1, [68Ga]DOTA-RGD-4 und [68Ga]DOTA-RGD-16 im Tierexperiment mit
der U87MG-Tumor-tragenden Nacktmaus erläutert.
3.2.8.1.1 Versuchsaufbau
Die Untersuchung der Bioverteilung mit µPET erfolgte an je 2 aufeinander
folgenden Versuchstagen. Insgesamt versuchten wir pro Tag bis zu 10
männliche NMRI-Nacktmäuse mit makroskopisch sichtbarem Tumor auf ihr
Bioverteilungsverhalten in Hinblick auf die Multimere [68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-4 und [68Ga]DOTA-RGD-16 zu untersuchen.
Für die Untersuchung der Bioverteilung der [68Ga]DOTA-RGD-Multimere mit
Hilfe der µPET wurden insgesamt zehn U87MG Tumor-tragende Nacktmäuse
verwendet (Tabelle 3.16). Die 10 Tiere wurden in 2 Gruppen unterteilt – in eine
Kontroll- und eine coinjizierte Gruppe. Zur Kontrollgruppe (n=6) gehörten
Mäuse ohne Coinjektion mit cRGDfV. Zur coinjizierten Gruppe (n=4) gehörten
die Mäuse, die neben dem Radiotracer eine Coinjektion des ανβ3-Integrinaffinen Peptids c(RGDfV) mit der Dosis 12,5 mg/kg (ca. 500 µg c(RGDfV) pro
Tier) erhielten; und unter diesen Bedingungen von einer Sättigung der ανβ3Integrin-Bindungsstellen im Tumorareal ausgegangen werden kann. Die
Bedingungen dieser Coinjektion definieren die unspezifische Bindung der
Tracer in vivo im Rahmen dieser Arbeit.
Zur Untersuchung der Bioverteilung, anhand von Sektionen, wurden insgesamt
62
Mäuse
untersucht,
wovon
22
Mäuse
aufgrund
von
fehlerhafter
Versuchsdurchführung für die Auswertung nicht genutzt werden konnten
(Tabelle 3.17). Die Einteilung in Gruppen erfolgte nach den Zeitpunkten 10, 30,
60 und 90 Minuten nach Tracerinjektion. Pro Zeitpunkt wurden immer 2 bis 3
Mäuse getötet. Weiterhin wurde zum Zeitpunkt t(Ex) = 60 Minuten, neben der
bereits bestehenden Tiergruppe „Kontrolle“, eine Tiergruppe von coinjizierten
33
Tieren – die Tiergruppe „Coinjektion“ – gebildet. Dies ermöglichte den direkten
Vergleich von Kontroll- und coinjizierten Tieren für die Ermittlung der
spezifischen Bindung zum Zeitpunkt von 60 Minuten nach Tracerinjektion. Zur
weiteren Auswertung des Versuches wurden ausgewogene Röhrchen für die
Organentnahme und die Untersuchung am Gamma-Counter vorbereitet.
3.2.8.1.2 Bestimmung von Organentnahme- und gewichtung
Um das Gewicht der einzelnen Organe/-teile bestimmen zu können, wurden die
Röhrchen vor und nach der Befüllung mit den Organproben ausgewogen. Dies
geschah mit einer Analysenwaage, die Unterschiede im Milligramm-Bereich
wahrnimmt.
Pro
Maus
wurden
je
30
Röhrchen
(10
Organe
in
Dreifachbestimmung) für µPET und 33 Röhrchen (11 Organe) ohne µPET
beschriftet und ausgewogen.
Tabelle 3.15. Auflistung der zu entnehmenden Organe mit Entnahme-Ort
Organe
Blut
Lunge
Leber
Herz
Milz
Niere
Tumor
Gehirn
Darm
Muskel
Femur
Entnahmeort/-art
Herznahe Gefäße
Lungenlappen
Teil
komplett
komplett
Teil
komplett
komplett
Teil
Teil
Teil
3.2.8.1.3 Narkotisierung, Präparation und Injektion der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus
Als Betäubungsmittel wurde das Inhalationsnarkotikum Isofluran verwendet und
als O2-Isofluran-Gemisch (Initial: 5% Isofluran-O2-Gemisch, für ca. 1 bis 2
Minuten) verabreicht. Zur Einleitung der Narkose wurden die Versuchstiere
einzeln in eine Narkosekammer gelegt. Nach Erreichen eines tiefen
Narkoseschlafes mit Ausbleiben einer Reaktion auf Schmerzreize, wurden
diese aus der Kammer genommen, gewogen und anschließend auf eine
Heizmatte gelegt, um einer Auskühlung vorzubeugen. Zur Narkosefortführung
wurde dem Versuchstier eine Narkosemaske (3% - 4% Isofluran-O2-Gemisch
für 3 bis 4 Minuten) angelegt, um die Injektion vornehmen zu können. Die
34
Injektion der [68Ga]DOTA-RGD-Verbindung erfolgte in die Maus-SchwanzVene. Nach Auffinden der Vene und Überprüfung der Lage der Nadel in der
Vene mit einer 0,9% Natriumchloridlösung, wurde die Lösung (ca. 100 µl/Tier
und eine Radioaktivität von 5,4 (MW)
± 2,9 (SD) MBq/Tier für die
Versuchstiergruppe mit Kleintier-PET und einer Radioaktivität von 4,16 (MW) ±
1,96 (SD) MBq/Tier für die Versuchstiergruppe ohne Kleintier-PET (MW:
Mittelwert; SD: Standardabweichung)) unter Inhalationsnarkose in die MausSchwanz-Vene injiziert. Abschließend fand eine Markierung des Tieres durch
Anbringen einer Versuchszahl statt.
68
Tabelle 3.16. Verteilung der Gallium-markierten RGD-Multimere auf die Versuchstiere
(Versuchtiergruppe mit Kleintier-PET)
RGD-Verbindung
Tiergruppe „Kontrolle“ Tiergruppe „Coinjektion“
[68Ga]DOTA-RGD-1
2 Tiere
1 Tier
[68Ga]DOTA-RGD-4
3 Tiere
2 Tiere
[68Ga]DOTA-RGD-16
1 Tier
1 Tier
68
Tabelle 3.17. Verteilung der Gallium-markierten RGD-Multimere auf die Versuchstiere
(Versuchstiergruppe ohne Kleintier-PET)
RGD-Verbindung
Tiergruppe „Kontrolle“ Tiergruppe „Coinjektion“
[68Ga]DOTA-RGD-1
16 Tiere
2 Tier
[68Ga]DOTA-RGD-4
9 Tiere
2 Tiere
[68Ga]DOTA-RGD-16
8 Tiere
3 Tier
Nach
der
Injektion
von
[68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-4
und
[68Ga]DOTA-RGD-16 wurden die Tiere unter Narkose 60 min im µPET
untersucht. Für die Tierversuche ohne µPET-Messungen wurden die Tiere nach
der Injektion der [68Ga]DOTA-RGD-Verbindung zum Aufwachen ruhen gelassen
für die Dauer der Untersuchung zurück in ihren Käfig gesetzt. Die coinjizierten
Versuchstiere erhielten zusätzlich zu der Radiotracer-Injektion eine Injektion mit
c(RGDfV) in Lösung (500 µg/Tier). Dies ist gemäß den Vorarbeiten der
Arbeitsgruppe ausreichend, um die vorhandenen Integrin-Bindungsplätze im
Tumor zu sättigen und somit die unspezifische Bindung der [68Ga]DOTA-RGDVerbindungen im Tiermodell zu definieren [34].
3.2.8.1.4 Versuchsverlauf und Versuchsende
Bei der Untersuchung der Bioverteilung mit µPET erfolgte nach 60 Minuten der
Exitus mit Organentnahme. Der Endpunkt der Untersuchung ohne µPET betrug
wie bereits beschrieben 10, 30, 60 und 90 Minuten. Bei allen Untersuchungen,
35
erfolgte die Tötung der Tiere unter Narkose durch zervikale Dislokation.
Nacheinander wurden die benötigten Organe (Blut, Lunge, Leber, Niere, Herz,
Milz, Gehirn, Tumor, Muskel, Darm und Femur) entnommen (siehe Tabelle
3.15), soweit möglich dreigeteilt und in je 3 Röhrchen gegeben, die
anschließend im γ-Counter gemessen und von Hand mittels (Analysenwaage
Sartorius Typ BP 2215) ausgewogen wurden.
36
4 Ergebnisse
4.1
Stabilität der Tracer in humanem Serum
In den Abbildungen 13 bis 17 sind die [68Ga]DOTA-RGD1, 2, 4, 8 und 16 im
zeitlichen Verlauf dargestellt. In Abbildung 18 erfolgt in einer graphischen
Auswertung eine Zusammenfassung der einzelnen Chromatogramme.
t = 90 Min
68
Abbildung 13. Zeitlicher Verlauf der Stabilität der Tracer ([ Ga]DOTA-RGD-1) in vitro in
humanem Serum; zum Zeitpunkt t=90 min sind 96% des Ausgangsstoffes erhalten
t = 90 Min
68
Abbildung 14. Zeitlicher Verlauf der Stabilität der Tracer ([ Ga]DOTA-RGD-2) in vitro in
humanem Serum; zum Zeitpunkt t=90 min sind 94% des Ausgangsstoffes erhalten
t = 90 Min
68
Abbildung 15. Zeitlicher Verlauf der Stabilität der Tracer ([ Ga]DOTA-RGD-4) in vitro in
humanem Serum; zum Zeitpunkt t=90 min sind 95% des Ausgangsstoffes erhalten
t1=30 Min
t2=60 Min
68
Abbildung 16. Zeitlicher Verlauf der Stabilität der Tracer ([ Ga]DOTA-RGD-8) in vitro in
humanem Serum im Vergleich; zum Zeitpunkt t1=30 min sind 91% und t2=60 min sind 60% des
Ausgangsstoffes erhalten
37
t1=30 Min
t2=45 Min
t3=60 Min
68
Abbildung 17. Zeitlicher Verlauf der Stabilität der Tracer ([ Ga]DOTA-RGD-16) in vitro in
humanem Serum im Vergleich; zum Zeitpunkt t1 sind 93%, t2 sind 36% und t3 sind 17% des
Ausgangsstoffes erhalten
In Abbildung 18 ist der prozentuale Anteil der intakten [68Ga]DOTA-RGDMultimere im humanen Serum in Abhängigkeit von der Zeit t in Minuten
dargestellt.
Zusätzlich
erfolgte
eine
graphische
Darstellung
mittels
Chromatogramm (Abbildung 13 bis 17).
Prozentualer Anteil an
RGD-M ultimeren
in humanem Se rum
100
[68Ga]DOTA-RGD-1
[68Ga]DOTA-RGD-2
[68Ga]DOTA-RGD-4
[68Ga]DOTA-RGD-8
[68Ga]DOTA-RGD-16
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
t in M inuten
68
Abbildung 18. Graphische Darstellung der Stabilität der Tracer [ Ga]DOTA-RGD-1,
68
68
68
68
[ Ga]DOTA-RGD-2, [ Ga]DOTA-RGD-4, [ Ga]DOTA-RGD-8, [ Ga]DOTA-RGD-16 in vitro
(Inkubation in humanem Serum)
Dabei ist zu erkennen, dass die Multimere [68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTARGD-2 und [68Ga]DOTA-RGD-4 nach 90 Minuten zu 96% (Abbildung 13), 93%
(Abbildung 14) und 95% (Abbildung 15) intakt vorhanden sind. Im Vergleich
38
nimmt der Anteil von intaktem [68Ga]DOTA-RGD-8 nach 45 Minuten bereits
stetig ab (Abbildung 16 zu den Zeitpunkten t1 = 30 min und t2 = 60 min) und
[68Ga]DOTA-RGD-16 nach 30 Minuten (Abbildung 17 zu den Zeitpunkten t1 = 30
min, t2 = 45 min und t3 = 60 min). Nach 90 Minuten sind beide Verbindungen in
ihrer ursprünglichen Form nur noch zu 60 % beziehungsweise zu 17%
nachweisbar.
4.2
LogD7,4-Wert
Der LogD7,4-Wert wird als Indikator für die Lipophilie beziehungsweise für die
Hydrophilie genutzt.
Tabelle 4.1. Auflistung der LogD7,4-Werte (MW: Mittelwert und SD: Standardabweichung) zur
68
68
Interpretation des Oktanol-/PBS-Koeffizienten der Multimere [ Ga]DOTA-RGD-1, [ Ga]DOTA68
68
68
RGD-2, [ Ga]DOTA-RGD-4, [ Ga]DOTA-RGD-8 und [ Ga]DOTA-RGD-16
Multimer
MW LogD7,4
SD LogD7,4
Zahl der unabhängigen
Versuche (n)
68
-3,65
0,29
3
68
-3,72
0,11
3
68
-3,40
0,17
3
68
-1,84
0,40
3
-2,03
0,05
3
[ Ga]DOTA-RGD-1
[ Ga]DOTA-RGD-2
[ Ga]DOTA-RGD-4
[ Ga]DOTA-RGD-8
68
[ Ga]DOTA-RGD-16
-5
LogD7,4-Wert
-4
-3
-2
-1
-1
6
-8
[
68
G
a]
D
O
TA
-R
-R
G
D
G
D
-4
G
D
O
TA
-R
68
[
G
a]
D
O
TA
68
[
G
a]
D
O
TA
68
[
G
a]
D
O
TA
68
[
G
a]
D
-R
-R
G
D
G
D
-2
-1
0
Abbildung 19. Graphische Darstellung des Oktanol-/PBS-Koeffizienten der Multimere
68
68
68
68
[ Ga]DOTA-RGD-1 (n=3), [ Ga]DOTA-RGD-2 (n=3), [ Ga]DOTA-RGD-4 (n=3), [ Ga]DOTA68
RGD-8 (n=3) und [ Ga]DOTA-RGD-16 (n=3)
Die LogD7,4-Werte in der Tabelle 4.1 spiegeln die graphisch dargestellten
Mittelwerte (in Abbildung 19) wider. Dabei zeigt sich, dass die Multimere
39
[68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-2
und
[68Ga]DOTA-RGD-4
einen
LogD7,4-Wert im Bereich -3,55 ± 0,15 aufweisen. [68Ga]DOTA-RGD-8 hebt sich
mit einem LogD7,4-Wert von -1,8 ± 0,4 deutlich von den Werten der niedrigeren
Multimere ab. Diese Abweichung wird von [68Ga]DOTA-RGD-8 durch
[68Ga]DOTA-RGD-16 mit einem ähnlichen LogD7,4-Wert von -2,02 untermauert.
Insgesamt wurden die Experimente für jede Testverbindung in einer 3-fach
Bestimmung durchgeführt.
4.3
Bindungsstudie (Binding Assay)
Wie bereits vorausgehend beschrieben, wurden die DOTA-RGD-Multimere (vgl.
Abbildung
10-12)
auf
ihre
Bindungsfähigkeit
bezüglich
des
ανβ5-
Integrinrezeptors geprüft. Zum einen unter Zuhilfenahme des reinen Proteins,
welches auf Platten beschichtet wurde, so dass die ανβ5-Bindung direkt im
Verdrängungsexperiment mit
125
I-Echistatin getestet wurde und zum anderen
durch die Verwendung von HT29-Zellen. Diese besitzen neben anderen
Integrinrezeptoren der Gruppe ανβ ebenfalls den ανβ5-Rezeptor.[31, 32]
In dem Bindungsexperiment für ανβ5-Rezeptoren ist zu erkennen, dass eine
deutliche Zunahme der Bindungsfähigkeit in der Reihe Monomer bis
Hexadecimer (DOTA-RGD-1 bis -16) festzustellen ist (Abbildung 20, Tabelle
4.2).
Tabelle 4.2. Kompetitive Verdrängung von I-Echistatin an ανβ5 (dreifache Wiederholung bei 7
verschiedenen aufsteigenden Konzentrationen (n=3 für DOTA-RGD-1, DOTA-RGD-2, DOTARGD-4, DOTA-RGD-8 und DOTA-RGD-16); mit Darstellung des Mittelwertes (MW) und
Standardabweichung (SD))
125
Verbindung
DOTA-RGD-1
DOTA-RGD-2
DOTA-RGD-4
DOTA-RGD-8
DOTA-RGD-16
Ki Werte
18,82 nM
24,80 nM
13,48 nM
2,71 nM
14,43 nM
3,53 nM
3,29 nM
4,27 nM
2,46 nM
0,67 nM
1,07 nM
1,00 nM
0,40 nM
0,40 nM
0,45 nM
MW±
±SD
19,0 ± 7,0 nM
6,9 ± 6,5 nM
3,2 ± 1,3 nM
0,82 ± 0,19 nM
0,38 ± 0,02 nM
40
I]-Echistatin (%)
100
gebundenes [
ανβ 5
40
DOTA-RGD-1
DOTA-RGD-2
80
DOTA-RGD-4
DOTA-RGD-8
60
125
DOTA-RGD-16
20
0
-12
-11
-10
-9
-8
-7
conc [logM]
-6
-5
-4
Abbildung 20. Kompetitive Verdrängung von I-Echistatin an ανβ5 mit Hilfe der DOTA-RGDMultimere DOTA-RGD-1, DOTA-RGD-2, DOTA-RGD-4, DOTA-RGD-8, DOTA-RGD-16 in
aufsteigender Konzentration (dreifache Wiederholung bei 7 bzw. 8 verschiedenen
aufsteigenden Konzentrationen (n=3 für DOTA-RGD-1, DOTA-RGD-2, DOTA-RGD-4, DOTARGD-8 und DOTA-RGD-16); mit Darstellung des Mittelwertes (MW) und Standardabweichung
(SD) dargestellt ist MW ± SD; n = Anzahl der Versuche pro RGD-Verbindung)
125
Für DOTA-RGD-16 sind deutlich geringere Konzentrationen notwendig (siehe
Tabelle 4.2; RGD-16 Ki=0.38 ± 0.02 nM), um
I-Echistatin von ανβ5-
125
Rezeptoren verdrängen zu können. Im Vergleich hierzu besitzt DOTA-RGD-1
unter gleichen Assay-Bedingungen einen Ki von 19 ± 7 nM. Abbildung 20 stellt
dazu
die
Abhängigkeit
der
Konzentration
Verbindungen in Bezug zur Bindung von
der
einzelnen
DOTA-RGD-
125
I-Echistatin dar, welches mit
zunehmender Konzentration der DOTA-RGD-Verbindungen verdrängt wird. So
ergeben sich Kurven, die mit zunehmender Konzentration der DOTA-RGDVerbindungen für das gebundene
nahezu kein
125
I-Echistatin eine Verdrängung zeigen, bis
125
I-Echistatin gebunden vorliegt. Dabei zeigt sich, dass bei DOTA-
RGD-16 eine viel kleinere Konzentration notwendig ist, um dieselbe Menge
125
I-
Echistatin vom ανβ5 Rezeptor zu verdrängen, als bei allen anderen
Verbindungen. Alle Ki-Werte wurden mittels nicht-linearer Regression mit dem
Algorithmus „One Site - Heterologous with depletion“ Unter Verwendung der
Software PRISM (Vers. 5.04, GraphPad) berechnet. Die konstanten Parameter
zur Berechnung lauteten: Kd = 0,7724 nM; spezifische Aktivität: SpAct = 4021
cpm/fmol; Volumen: V = 0,1 ml).
41
Das Bindungsexperiment an HT29 Zellen unterscheidet sich im direkten
Vergleich mit dem Experiment am reinen ανβ5-Rezeptor deutlich. Wie in
Abbildung 21 und Tabelle 4.3. dargestellt, sind viel höhere Konzentrationen der
einzelnen DOTA-RGD-Verbindungen notwendig, um überhaupt
125
I-Echistatin
verdrängen zu können. DOTA-RGD-4 ist in diesem Zusammenhang die
Verbindung, die die niedrigste Konzentration braucht, um die Bindung von
125
I-
Echistatin an HT29-Zellen verdrängen zu können.
125
Tabelle 4.3. Kompetitive Verdrängung von
I-Echistatin an HT29-Zellen (zweifache
Wiederholung bei 8 verschiedenen aufsteigenden Konzentrationen (n=2) mit Darstellung des
Mittelwertes (MW) und Standardfehler (SEM)
Verbindung
Ki Werte
MW+SEM
DOTA-RGD-1
8361 nM
6,4 ± 2,0 µM
4426 nM
DOTA-RGD-2
353,5 nM
339 ± 21 nM
323,7 nM
DOTA-RGD-4
186,3 nM
97 ± 4,8 nM
199,9 nM
DOTA-RGD-8
440 nM
419 ± 45 nM
358,1 nM
DOTA-RGD-16
467,1 nM
368 ± 99 nM
719,8 nM
I]-Echistatin (%)
100
gebundenes [
HT29
40
DOTA-RGD-1
DOTA-RGD-2
80
DOTA-RGD-4
DOTA-RGD-8
60
125
DOTA-RGD-16
20
0
-12
-10
-8
conc (logM)
125
-6
-4
Abbildung 21. Kompetitive Verdrängung von
I-Echistatin an HT29-Zellen mit Hilfe der
DOTA-RGD-Multimere DOTA-RGD-1, DOTA-RGD-2, DOTA-RGD-4, DOTA-RGD-8, DOTARGD-16 in aufsteigender Konzentration (dargestellt ist MW ± SD bei n=2; n = Anzahl der
Versuche pro RGD-Verbindung)
42
4.4
Experimente an der Kleintier-PET (µ
µPET)
Die
Untersuchung
der
Bioverteilung
und
bildlichen
Darstellung
der
Tracerverteilung mit Hilfe der µPET fand an 2 aufeinander folgenden
Versuchstagen statt und zeigt, dass es sowohl in der Niere als auch im Tumor
Peptide kommt (Abbildung 22). Dabei lässt sich mit Hilfe der µPET ein
Unterschied
zwischen
[68Ga]DOTA-RGD-1,
[68Ga]DOTA-RGD-4
und
[68Ga]DOTA-RGD-16 feststellen.
68
Abbildung 22. Zeitlicher Verlauf der Verteilung der
Ga-markierten RGD-Multimere
68
68
68
[ Ga]DOTA-RGD-1, [ Ga]DOTA-RGD-4 und [ Ga]DOTA-RGD-16 in der µPET von der
U87MG Tumor-tragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t1=4,5 min; t2=27,5 min; t3=55 min
68
und tCoinjektion=55 min nach Tracerinjektion (injizierte Radioaktivität für [ Ga]DOTA-RGD-1 =
68
6,1(MW) ± 2,6 (SD)MBq (n=3), für [ Ga]DOTA-RGD-4 = 4,6(MW) ± 2,3(SD) MBq (n=5) und für
68
[ Ga]DOTA-RGD-16 = 5,1(MW) ± 4,6(SD)MBq (n=2)) (n = Anzahl der untersuchten Tiere)
43
Die bildliche Anreicherung der [68Ga]DOTA-RGD-Verbindung in der Niere
scheint
µPET
im
deutlich
hervorzutreten
und
liegt
laut
Bildmaterial
wahrscheinlich über der Anreicherung im Tumor. Während sich das
[68Ga]DOTA-RGD-1 weniger und nicht so schnell im Tumor anreichert wie das
[68Ga]DOTA-RGD-4,
ist
für
[68Ga]DOTA-RGD-16
das
eine
deutliche
Anreicherung in Niere und Leber zu beobachten, so dass die Anreicherung im
Tumor für das Hexadecimer in dem vermessenen Tier nicht klar abzugrenzen
ist. Weiterhin fällt auf, dass [68Ga]DOTA-RGD-1 und [68Ga]DOTA-RGD-4
während der Untersuchung eine zunehmende Anreicherung im Tumor zeigen.
Dagegen erscheint die Tumoranreicherung von [68Ga]DOTA-RGD-16 im
zeitlichen Verlauf nicht ganz so deutlich. Man meint, eine Abnahme der
Radioaktivität im Bereich des Tumors nach 55 Minuten zu erkennen (Abbildung
22). In der durch Coinjektion von cRGDfV (0,5 mg/Tier) untersuchten
Tiergruppe (in Abbildung 22 als „Blocking“ gekennzeichnet) der Verbindungen
[68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTA-RGD-4 und [68Ga]DOTA-RGD-16 kann man
deutlich den Unterschied erkennen zu den Tieren, die nur den Tracer injiziert
bekamen. Alle 3 coinjizierten Tiere weisen eine Verminderung der Anreicherung
des jeweiligen coinjizierten Tracers im Tumorgewebe auf (Abbildung 22 und
23).
60 min p.i. Kontrolle (n=6)
60 min p.i. Coinjektion (n=4)
% ID/g
6
4
2
6
G
D
-1
[
68
G
a]
D
O
TA
-R
-R
68
[
G
a]
D
O
TA
68
[
G
a]
D
O
TA
-R
G
D
G
D
-4
-1
0
68
68
Abbildung 23. Vergleich der Aufnahme der Ga-markierten RGD-Multimere [ Ga]DOTA-RGD68
68
1, [ Ga]DOTA-RGD-4 und [ Ga]DOTA-RGD-16 zwischen Kontrollgruppe (Tiere, die nur den
Radiotracer injiziert bekamen) und coinjizierte Tiere (Tiere, die die Coinjektion mit cRGDfV
erhalten haben) zum Zeitpunkt tEx= 60 Minuten (Darstellung MW±SEM)(n = Anzahl der
untersuchten Tiere)
Im Anschluss an die Untersuchung der 10 Tiere in der µPET erfolgte deren
Sektion und Bestimmung der Bioverteilung zum Zeitpunkt tEX = 60 Minuten.
44
Vergleicht
man
die dabei gewonnenen Daten
der zwei
Tiergruppen
(Kontrollgruppe (n=6) und coinjizierte Gruppe (n=4)), so fällt auf, dass die
„coinjizierten“ Tiere ebenfalls eine niedrige Aufnahme der Radioaktivität in der
Niere aufweisen. Die höchste Anreicherung im Tumor ergab sich mit
[68Ga]DOTA-RGD-16 mit 4,25 ± 0,75 % ID/g, gefolgt von [68Ga]DOTA-RGD-1
mit 4,17 ± 0,83 % ID/g und [68Ga]DOTA-RGD-4 mit 3,23 ± 0,45 % ID/g.
Tabelle 4.4. Organ-Bioverteilung der nur mit Radiotracer injizierten Tiere (ohne Coinjektion mit
68
cRGDfV) (Kontrollgruppe; n=6) mit [ Ga]DOTA-RGD-1 (n=2; injizierte Aktivität (MW±SEM)= 7,0
68
± 2,1 MBq), [ Ga]DOTA-RGD-4 (n=3; injizierte Aktivität (MW±SEM) = 6,0 ± 1,4 MBq) und
68
[ Ga]DOTA-RGD-16 (n=1; injizierte Aktivität (MW±SEM) = 9,7 MBq) nach Sektion im
Anschluss an die µPET-Untersuchung zum Zeitpunkt t(Ex)= 60 Minuten (n = Anzahl der
untersuchten Tiere)
Organ
68
[ Ga]DOTA-RGD-1
in %ID/g; n=2
MW SEM
68
[ Ga]DOTA-RGD-4
in %ID/g; n=3
MW SEM
68
[ Ga]DOTA-RGD-16
in %ID/g; n=1
MW SEM
Blut
4,49
± 1,17
3,67
± 0,56
1,67
± 0,03
Lunge
4,99
± 1,66
2,43
± 0,47
2,97
± 0,08
Leber
2,50
± 0,32
1,34
± 0,17
11,88
± 0,38
Niere
54,74
± 13,71
41,63
± 4,68
69,26
± 8,75
Herz
2,54
± 0,26
1,65
± 0,28
1,43
± 0,14
Milz
1,81
± 0,34
1,57
± 0,17
9,83
± 0,21
Tumor (U87MG)
4,17
± 0,83
3,23
± 0,45
4,25
± 0,75
Hirn
0,37
± 0,09
0,23
± 0,06
0,11
± 0,004
Muskel
1,51
± 0,35
0,67
± 0,11
0,53
± 0,03
Darm
3,56
± 0,88
1,63
± 0,14
2,86
± 0,10
Tabelle 4.5. Organ-Bioverteilung der mit cRGDfV coinjizierten Tiere („coinjizierte“ Gruppe; n=4)
68
68
mit [ Ga]DOTA-RGD-1 (n=1; injizierte Aktivität (MW±SEM) = 4,25 MBq), [ Ga]DOTA-RGD-4
68
(n=2; injizierte Aktivität(MW±SEM) = 3,28 ± 0,96 MBq) und [ Ga]DOTA-RGD-16 (n=1; injizierte
Aktivität (MW±SEM) = 1,32 MBq) nach Sektion im Anschluss an die µPET-Untersuchung zum
Zeitpunkt t(Ex)= 60 Minuten (n = Anzahl der untersuchten Tiere)
Organ
68
68
68
[ Ga]DOTA-RGD-1
[ Ga]DOTA-RGD-4
[ Ga]DOTA-RGD-16
in %ID/g; n=1
MW SEM
in %ID/g; n=2
MW SEM
in %ID/g; n=1
MW SEM
Blut
1,25
± 0,56
3,58
± 0,27
0,64
± 0,05
Lunge
1,71
± 0,52
2,25
± 0,13
2,02
± 0,02
Leber
0,9
± 0,35
1,03
± 0,07
4,36
± 0,09
Niere
7,93
± 4,02
95,61
± 5,09
54,98
± 6,29
Herz
0,7
± 0,05
1,56
± 0,10
0,5
± 0,04
Milz
1,68
± 1,28
1,12
± 0,06
2,93
± 0,24
Tumor (U87MG)
0,77
± 0,34
2,73
± 0,37
1,52
± 0,05
Hirn
0,10
± 0,01
0,17
± 0,01
0,04
± 0,00
Muskel
0,80
± 0,36
0,67
± 0,08
0,16
± 0,02
Darm
0,78
± 0,09
1,28
± 0,12
0,66
± 0,07
45
Auffallend ist, dass [68Ga]DOTA-RGD-1 hohe Konzentrationen in Blut, Lunge
und Darm vorweisen kann, während [68Ga]DOTA-RGD-4 eine Konzentration,
die der des Tumors nahe kommt, nur im Blut vorweisen kann. [68Ga]DOTARGD-16 hat unterschiedliche Konzentration in allen entnommenen Organen.
Die mit Abstand höchsten Anreicherungen finden sich bei allen Verbindungen in
der Niere.
100
60
20
15
[68 Ga]DOTA-RGD-1 Kontrolle
[68 Ga]DOTA-RGD-1 Coinjektion
[68 Ga]DOTA-RGD-4 Kontrolle
% ID/g
[68 Ga]DOTA-RGD-4 Coinjektion
[68 Ga]DOTA-RGD-16 Kontrolle
10
[68 Ga]DOTA-RGD-16 Coinjektion
5
ar
m
D
M
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l
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B
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t
0
68
Abbildung 24. Graphische Darstellung der Bioverteilung der Ga-markierten DOTA-RGD68
68
68
Multimere [ Ga]DOTA-RGD-1, [ Ga]DOTA-RGD-4 und [ Ga]DOTA-RGD-16 nach einer
µPET-Untersuchung zum Zeitpunkt t(EX)= 60 Minuten nach Tracerinjektion für die Tiergruppe
„Kontrolle“ (n=6) und zum Zeitpunkt t(EX)= 60 Minuten in der Tiergruppe „Coinjektion“ (n=4);
(MW±SEM); n = Anzahl der untersuchten Tiere
Zur näheren Untersuchung der Ergebnisse wurde anschließend eine größere
Gruppe
von
Versuchstieren
ausschließlich
für
die
Bioverteilung
der
[68Ga]DOTA-RGD-Multimere untersucht, unabhängig von einem vorherigen
Experiment an der µPET-Kamera.
4.5
Bioverteilung
Die Bioverteilung der einzelnen [68Ga]DOTA-RGD-Multimere wird in den
kommenden Abschnitten ausführlich dargestellt. Wie im vorherigen Abschnitt
beschrieben wurde die Radioaktivität der [68Ga]DOTA-RGD-Verbindungen zum
Todeszeitpunkt in den einzelnen Organen gemessen.
4.5.1 Bioverteilung von [68Ga]DOTA-RGD-1
Zur Untersuchung der Bioverteilung (Tabelle 4.6. und Abbildung 25) von
[68Ga]DOTA-RGD-1 wurden zum Zeitpunkt t(Ex) = 10 Minuten an vier
Versuchstieren die Radioaktivität in den einzelnen Organen nach Sektion
bestimmt. Es ergab sich eine Anreicherung von durchschnittlich 2,56% ID/g im
Tumorgewebe, welches den zweithöchsten Wert nach der Niere mit 3,39% ID/g
46
Gewebe darstellt. Sehr starke Anreicherungen von [68Ga]DOTA-RGD1 zu
diesem Zeitpunkt waren außerdem in der Lunge (2,46% ID/g) und im Muskel
(2,09% ID/g) zu verzeichnen. Im Blut ergab sich nur eine Radioaktivität von
1,48% ID/g. Es lässt sich feststellen, dass in allen anderen Organen eine
deutlich geringere Radioaktivität von < 1% ID/g Gewebe gemessen wurde. Zum
Zeitpunkt t(Ex) = 30 Minuten wurden 5 Versuchstiere untersucht. Dabei ließ sich
für den Tumor eine mittlere Radioaktivität von 0,86 %/g Gewebe messen und
für die Niere von 1,97% ID/g Gewebe. Weitere Werte fanden sich wie zuvor
ebenfalls beschrieben in Lunge (0,84% ID/g) und Blut (0,75% ID/g). Die
Radioaktivität ist gegenüber dem Wert für 10 Minuten p.i. für alle Gewebe
deutlich gefallen (Muskel: 0,29% ID/g) Alle anderen Messwerte sind auf < 0,5%
ID/g Gewebe gefallen. Zum Zeitpunkt t(EX) = 60 Minuten zeigt die Niere einen
mittleren Wert von 1,3% ID/g Gewebe an. Im Tumorgewebe wurde ein Wert von
0,65% ID/g, dicht gefolgt vom Lungengewebe von 0,56% ID/g gemessen. Es
zeigt sich für die restlichen Organe eine annähernde Stabilisierung der
Messwerte um den Wert 0,5% ID/g Gewebe. Einzig das Hirngewebe erreicht zu
keinem Zeitpunkt einen Wert > 0,5% ID/g. Zum Zeitpunkt t(EX) = 90 min ist der
Wert für die Niere auf 1,09% ID/g abgesunken und für das Tumorgewebe auf
0,25% ID/g. Lunge (0,36% ID/g), Milz und Darm (0,30% ID/g) weisen höhere
Radioaktivitäten als das Tumorgewebe auf.
68
Tabelle 4.6. Organische Bioverteilung für [ Ga]DOTA-RGD-1 im Gewebe der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus nach Tracerinjektion (injizierte Radioaktivität pro Tier = 4,83 (MW) ± 1,6
(SD) MBq) für die Tiergruppe „Kontrolle“ zu den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30, 60 und 90 Minuten,
aufgelistet sind Mittelwerte (MW) ± SEM in % ID/g (n = Anzahl der untersuchten Tiere, siehe
Tabelle)
Organ
10 Minuten
% ID/g; n=4
MW SEM
30 Minuten
% ID/g; n=5
MW SEM
60 Minuten
% ID/g; n=5
MW SD
90 Minuten
% ID/g; n=2
MW SEM
Blut
1,48
± 0,13
0,75
± 0,06
0,30
± 0,03
0,22
± 0,01
Lunge
2,47
± 0,44
0,84
± 0,05
0,57
± 0,05
0,36
± 0,01
Leber
0,63
± 0,05
0,40
± 0,04
0,35
± 0,04
0,23
± 0,01
Niere
3,39
± 0,44
1,98
± 0,12
1,30
± 0,07
1,09
± 0,06
Herz
1,0
± 0,11
0,35
± 0,04
0,18
± 0,02
0,13
± 0,01
Milz
0,75
± 0,06
0,43
± 0,03
0,36
± 0,04
0,30
± 0,01
Tumor (U87MG)
2,53
± 0,57
0,86
± 0,11
0,65
± 0,06
0,25
± 0,08
Hirn
0,41
± 0,21
0,05
± 0,01
0,04
± 0,01
0,02
± 0,00
Muskel
2,09
± 0,32
0,30
± 0,05
0,52
± 0,15
0,11
± 0,01
Darm
0,97
± 0,15
0,49
± 0,05
0,41
± 0,05
0,30
± 0,03
Femur
0,85
± 0,14
0,34
± 0,05
0,31
± 0,06
0,20
± 0,01
47
4
10 min p.i. Kontrolle (n=4)
30 min p.i. Kontrolle (n=5)
2
2.0
60 min p.i. Kontrolle (n=5)
% ID/g
90 min p.i. Kontrolle (n=2)
1.5
1.0
0.5
Fe
m
ur
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M
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B
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0.0
68
Abbildung 25. Graphische Darstellung der zeitlichen Elimination von [ Ga]DOTA-RGD-1 im
entnommenen Gewebe der U87MG-Tumor-tragenden Nacktmaus nach Tracerinjektion
(injizierte Radioaktivität pro Tier = 4,83 (MW) ± 1,6 (SD)MBq) für die Tiergruppe „Kontrolle“ zu
den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30, 60 und 90 Minuten, dargestellt in der Abbildung sind Mittelwerte ±
SEM in % ID/g (n = Anzahl der untersuchten Tiere, siehe Legende)
4
10 min p.i. Kontrolle (n=4)
30 min p.i. Kontrolle (n=5)
2
2.0
60 min p.i. Kontrolle (n=5)
90 min p.i. Kontrolle (n=2)
% ID/g
60 min p.i. Coinjektion (n=2)
1.5
1.0
0.5
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B
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t
0.0
68
Abbildung 26. Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-1 im Tiermodell der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30, 60, 90 Minuten (Tiergruppe „Kontrolle“)
und 60 Minuten (Tiergruppe „Coinjektion“); Dargestellt in der Abbildung sind MW ± SEM bei
n=18 (n = Anzahl der untersuchten Tiere) und einer injizierten Radioaktivität von 4,5 (MW) ±
1,7 (SD) MBq (grün: Vergleich Traceraufnahme Niere 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit
Tiergruppe „Coinjektion“; rot: Vergleich Traceraufnahme Tumor 60 min p.i. Tiergruppe
„Kontrolle“ mit Tiergruppe „Coinjektion“
Zusammenfassend ist für [68Ga]DOTA-RGD-1 zu sagen, dass sich die
Anreicherung im Tumor, geschlossen aus der
68
Ga-Aktivität, mit Verlängerung
der Verweildauer im Organismus der Maus, vermindert. Deutlich zu beobachten
ist die schnelle Ausscheidung der Verbindung – nahezu in allen entnommenen
48
Geweben über die Hälfte – zwischen 10 bis 30 Minuten. Vergleicht man beide
Tiergruppen miteinander zum Zeitpunkt t(Ex) = 60 Minuten so fällt auf, dass die
c(RGDfV)-coinjizierte Tiergruppe gegenüber der Tiergruppe, die nur den Tracer
erhalten hat, eine Verminderung der Traceraufnahme im Tumorgewebe zeigt
(Abbildung 26, rote Markierung und Abbildung 27; Tabelle 4.7). Im Tumor sinkt
die Traceraufnahme um 67,7% von 0,65% ID/g auf 0,21% ID/g. In Leber, Milz,
Muskel, Darm und Femur sind ebenfalls deutliche Unterschiede festzustellen. In
diesen Organen sinkt die Radioaktivität nahezu immer um 50% in der
Tiergruppe coinjizierte Tiere.
[68Ga]DOTA-RGD-1
Organ
60 min p.i.
„Kontrolle“
(% ID/g)
MW SEM
Blut
Lunge
Leber
Niere
Herz
Milz
Tumor
Hirn
Muskel
Darm
Femur
0,30
0,57
0,35
1,30
0,18
0,36
0,65
0,04
0,52
0,41
0,31
1.50
60 min p.i. Kontrolle (n=5)
% ID/g
1.25
60 Min p.i. Coinjektion (n=2)
1.00
1.0
0.5
M
ilz
Tu
m
or
H
ir n
M
us
ke
l
D
ar
m
Fe
m
ur
B
lu
t
Lu
ng
e
Le
be
r
N
ie
re
H
er
z
0.0
± 0,03
± 0,05
± 0,04
± 0,07
± 0,02
± 0,04
± 0,06
± 0,01
± 0,15
± 0,05
± 0,06
60 min p.i.
„Coinjektion“
(% ID/g)
MW SEM
0,24
0,45
0,13
1,28
0,14
0,09
0,21
0,01
0,23
0,20
0,16
± 0,07
± 0,06
± 0,01
± 0,09
± 0,03
± 0,01
± 0,06
± 0,00
± 0,03
± 0,03
± 0,04
Abbildung 27. und Tabelle 4.7. Graphische und tabellarische Darstellung der organischen
68
Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-1 (60 min p.i.) im Vergleich Tiergruppe „Kontrolle“ (n=5,
injizierte Radioaktivität pro Tier = 4,83 (MW) ± 1,6 (SD)MBq) mit Tiergruppe „Coinjektion“ (n=2,
injizierte Radioaktivität: 2,26 (MW) ± 0,23 (SD) MBq)), Dargestellt in der Tabelle sind Mittelwerte
(MW) ± SEM in % ID/g (n= Anzahl der untersuchten Tiere, siehe Legende)
4.5.2 Bioverteilung von [68Ga]DOTA-RGD-4
Für [68Ga]DOTA-RGD-4 haben sich im Rahmen der Untersuchung folgende
Werte ergeben (Tabelle 4.8 und Abbildung 28). Zum Zeitpunkt t(EX) = 10
Minuten standen 2 Versuchstiere zur Untersuchung bereit. In der Niere und im
Tumor wurden die höchsten Radioaktivitäten mit 10,42% IDNiere/g und 2,18%
IDTumor/g gemessen. Es folgen die Organe Lunge (1,76% ID/g), Darm (1,67%
ID/g), Milz (1,41% ID/g), Blut (1,12% ID/g) und Femur (1,04% ID/g) mit
deutlichem Abstand. Die restlichen Organe pendeln sich unter einem Wert <
0,8% ID/g ein (Tabelle 4.8., Abbildung 28). Zum Zeitpunkt t(EX) = 30 Minuten
wurden 4 Versuchtiere untersucht. Die Radioaktivität im Tumor ist mit 2,07%
ID/g die zweithöchste nach der Niere mit 9,7% ID/g. In den Organen Femur
(1,71% ID/g), Muskel (1,47% ID/g) und Lunge (1,56% ID/g) ist die Radioaktivität
leicht vermindert. In allen weiteren Organen liegt die Radioaktivität < 1% ID/g.
49
Im Gehirn ist nur geringfügig Radioaktivität messbar mit 0,071% ID/g. Zum
Zeitpunkt t(EX) = 60 Minuten wurden 3 Versuchstiere untersucht, deren
Radioaktivität deutlich gleichmäßiger verteilt ist. Tumor (0,994% ID/g), Lunge
(0,961% ID/g), Milz (1,017% ID/g), Darm (0,94% ID/g) und Femur (0,894% ID/g)
haben annähernd dieselbe Radioaktivität aufgenommen. Die Niere mit einer
Radioaktivität von 12,04% ID/g hat den mit Abstand höchsten Wert (Abbildung
28).
68
Tabelle 4.8. Organische Bioverteilung für [ Ga]DOTA-RGD-4 im Gewebe der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus nach Tracerinjektion (injizierte Radioaktivität pro Tier = 4,7(MW) ±
2,7(SD) MBq) für die Tiergruppe „Kontrolle“ zu den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30 und 60 Minuten,
aufgelistet sind Mittelwerte (MW) ± SEM in % ID/g (n = Anzahl der untersuchten Tiere, siehe
Tabelle)
Organ
10 Minuten
(% ID/g); n=2
MW
SEM
30 Minuten
(% ID/g); n=4
MW
SEM
60 Minuten
(% ID/g); n=3
MW
SEM
Blut
1,12
± 0,07
0,81
± 0,1
0,47
± 0,07
Lunge
1,76
± 0,13
1,57
± 0,15
0,96
± 0,05
Leber
0,64
± 0,04
0,92
± 0,09
0,57
± 0,02
Niere
10,42
± 0,75
10,10
± 0,62
12,04
± 0,75
Herz
0,70
± 0,06
0,57
± 0,08
0,38
± 0,05
Milz
1,14
± 0,02
1,10
± 0,14
1,02
± 0,09
Tumor (U87MG)
2,18
± 0,15
2,07
± 0,23
1,00
± 0,12
Hirn
0,09
± 0,01
0,07
± 0,01
0,10
± 0,04
Muskel
0,73
± 0,15
1,85
± 0,42
0,92
± 0,31
Darm
1,67
± 0,24
1,17
± 0,17
0,94
± 0,12
Femur
1,04
± 0,20
1,71
± 0,25
0,89
± 0,27
% ID/g
16
12
8
4
10 min. p.i. Kontrolle (n=2)
30 min p.i. Kontrolle (n=4)
60 min p.i. Kontrolle (n=3)
2
1
68
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0
Abbildung 28. Graphische Darstellung der zeitlichen Elimination von [ Ga]DOTA-RGD-4 im
entnommenen Gewebe der U87MG-Tumor-tragenden Nacktmaus nach Tracerinjektion
(injizierte Radioaktivität pro Tier = 4,7(MW) ± 2,7(SD) MBq) für die Tiergruppe „Kontrolle“ zu
den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30 und 60 Minuten, Dargestellt in der Abbildung sind Mittelwerte (MW)
± SEM in % ID/g (n = Anzahl der untersuchten Tiere, siehe Legende)
50
16
12
8
4
10 min. p.i. Kontrolle (n=2)
30 min p.i. Kontrolle (n=4)
60 min p.i. Kontrolle (n=3)
% ID/g
60 min p.i. Coinjektion (n=2)
2
1
ur
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0
68
Abbildung 29. Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-4 im Tiermodell der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30, 60 Minuten (Tiergruppe „Kontrolle“) und
60 Minuten (Tiergruppe „Coinjektion“); Dargestellt in der Abbildung sind MW ± SEM bei n=11 (n
= Anzahl der untersuchten Tiere) und einer injizierten Radioaktivität von 4,3 (MW) ± 2,6 (SD)
MBq (grün: Vergleich Traceraufnahme Niere 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit Tiergruppe
„Coinjektion“; rot: Vergleich Traceraufnahme Tumor 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit
Tiergruppe „Coinjektion“
Im Unterschied zur Tiergruppe „Kontrolle“ nimmt die coinjizierte Tiergruppe, aus
welcher zwei Tiere untersucht wurden, zum Zeitpunkt t(Ex) = 60 Minuten im
Tumor wenig Radioaktivität auf (Abbildung 29 und 30; Tabelle 4.9).
[68Ga]DOTA-RGD-4
20
Organ
60 min p.i. Kontrolle (n=3)
60 min p.i. Coinjektion (n=2)
15
% ID/g
10
5
3
2
1
B
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N
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H
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M
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D
ar
m
Fe
m
ur
0
Blut
Lunge
Leber
Niere
Herz
Milz
Tumor
Hirn
Muskel
Darm
Femur
60 min p.i.
„Kontrolle“
(% ID/g)
MW SEM
0,47 ± 0,07
0,96 ± 0,05
0,57 ± 0,02
12,04 ± 0,75
0,38 ± 0,05
1,02 ± 0,09
1,00 ± 0,12
0,10 ± 0,04
0,92 ± 0,31
0,94 ± 0,12
0,89 ± 0,27
60 min p.i.
„Coinjektion“
(% ID/g)
MW SEM
0,69 ± 0,07
1,78 ± 0,41
0,30 ± 0,02
12,41 ± 0,44
0,74 ± 0,07
0,33 ± 0,02
0,74 ± 0,14
0,05 ± 0,01
0,97 ± 0,14
0,66 ± 0,05
0,34 ± 0,03
Abbildung 30. und Tabelle 4.9. Graphische und tabellarische Darstellung der organischen
68
Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-4 (60 min p.i.) im Vergleich Tiergruppe „Kontrolle“ (n=5,
injizierte Radioaktivität pro Tier = 4,7(MW) ± 2,7(SD) MBq) mit Tiergruppe „Coinjektion“ (n=2,
injizierte Radioaktivität pro Tier = 2,4 (MW) ± 1,3 (SD) MBq)), Dargestellt in der Tabelle sind
Mittelwerte (MW) ± SEM in % ID/g (n= Anzahl der untersuchten Tiere, siehe Legende)
Untersucht wurden 2 Tiere. Die Radioaktivität in der Tiergruppe „Coinjizierte
Tiere“ fällt gegenüber der Tiergruppe „Kontrolle“ nach 60 min p.i. um 25% von
0,99% ID/g auf 0,74% ID/g. In der Lunge steigt die Radioaktivität in der
coinjizierten Tiergruppe deutlich an. Eine Steigerung von 84% gegenüber der
Kontrollgruppe ist hier zu verzeichnen (IDTiergruppe „Kontrolle“ 0,96 % ID/g, IDTiergruppe
„Coinjektion“ 1,78
% ID/g).
51
Die Traceraufnahme in der Niere erreicht nahezu gleiche Werte von 12 % ID/g
in den Tiergruppen „Coinjizierte Tiere“ und „Kontrolle“.
4.5.3 Bioverteilung von [68Ga]DOTA-RGD-16
In
die
Untersuchung
von
[68Ga]DOTA-RGD-16
wurden
insgesamt
11
Versuchstiere einbezogen und zu den Zeitpunkten t(EX) = 30, 60 und 90 Minuten
Daten erhoben (Tabelle 4.10 und Abbildung 31). Es wurde eine Gruppe von 3
Mäusen,
als
coinjizierte
Tiergruppe
verwendet,
um
diese
mit
den
Kontrolltiergruppen zu vergleichen.
68
Tabelle 4.10. Organ-Bioverteilung für [ Ga]DOTA-RGD-16 im Gewebe der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus nach Tracerinjektion (injizierte Radioaktivität pro Tier = 3,9 (MW) ± 1,4
(SD) MBq) für die Tiergruppe „Kontrolle“ zu den Zeitpunkten t(Ex)= 30, 60 und 90 Minuten,
aufgelistet in der Tabelle sind Mittelwerte (MW) ± SEM in % ID/g (n = Anzahl der untersuchten
Tiere)
Organ
30 Minuten
(% ID/g), n=3
MW SEM
60 Minuten
(% ID/g); n=3
MW SEM
90 Minuten
(% ID/g); n=2
MW SEM
Blut
0,57
±0,04
0,46
±0,02
0,33
±0,03
Lunge
1,96
±0,38
4,58
±1,95
1,71
±0,08
Leber
4,33
±0,08
8,32
±0,32
9,60
±0,34
Niere
41,26
±2,28
114,56
±4,75
102,86
±6,59
Herz
1,42
±0,41
1,14
±0,09
1,04
±0,11
Milz
3,92
±0,16
7,41
±0,28
9,07
±0,23
Tumor (U87MG)
1,07
±0,10
2,14
±0,20
1,67
±0,41
Hirn
0,08
±0,02
0,05
±0,00
0,05
±0,00
Muskel
1,70
±0,66
0,33
±0,03
0,26
±0,04
Darm
1,30
±0,06
1,81
±0,11
1,07
±0,17
Femur
1,03
±0,08
1,13
±0,01
0,96
±0,04
Zum Zeitpunkt t(EX) = 30 Minuten, n = 3 ergab sich eine sehr hohe Radioaktivität
von 41,26% ID/g für die Niere. Die Leber mit ID = 4,33% ID/g und Milz mit
3,92% ID/g zeigen ebenfalls eine deutliche Traceranreicherung. Der Tumor
erreicht mit 1,07 % ID/g nur eine relativ niedrige Aufnahme, wie in Abbildung 31
deutlich zu erkennen ist. Zum Zeitpunkt t(EX) = 60 Minuten, n = 3 kann man
erneut eine deutlich hohe Radioaktivität in der Niere erkennen; 114,56% ID/g
(Abbildung 31 und 32). Mit großem Abstand folgen Leber (8,32% ID/g), Milz
(7,41% ID/g) und Lunge (2,72% ID/g). Im Tumorgewebe fand sich nachfolgend
eine Radioaktivität von 2,14% ID/g. Alle anderen Organe erreichten eine
Radioaktivität unter 1% ID/g (Abbildung 31 und 32).
Zum Zeitpunkt t(EX) = 90 Minuten, n = 2 wurde eine hohe Radioaktivität von
102,86% ID/g in der Niere festgestellt (Abbildung 31). Wie in den vorherigen
52
Ergebnissen bestätigt sich hier die Folge der Organe. Die nächst
höhere
Radioaktivität weist die Leber (9,59% ID/g) auf, gefolgt von der Milz mit 9,07%
ID/g gefolgt von der Lunge mit 1,71% ID/g. Der Tumor hat eine mittlere
Radioaktivität von 1,67% ID/g (90 min p.i.). Alle übrigen untersuchten Organe
hatten eine Radioaktivität von unter 1% ID/g (Ausnahme: Darm mit 1,07% ID/g).
120
30 min. p.i. Kontrolle (n=3)
80
60 min. p.i. Kontrolle (n=3)
40
90 min. p.i. Kontrolle (n=2)
% ID/g
10
5
ur
Fe
m
D
ar
m
l
M
us
ke
H
irn
or
Tu
m
ilz
M
H
er
z
e
N
ie
r
er
Le
b
Lu
ng
e
B
lu
t
0
68
Abbildung 31. Graphische Darstellung der zeitlichen Elimination von [ Ga]DOTA-RGD-16 im
entnommenen Gewebe der U87MG-Tumor-tragenden Nacktmaus nach Tracerinjektion
(injizierte Radioaktivität pro Tier = 3,9 (MW) ± 1,4 (SD) MBq) für die Tiergruppe „Kontrolle“ zu
den Zeitpunkten t(Ex)= 30, 60 und 90 Minuten, Dargestellt in der Abbildung sind Mittelwerte (MW)
± SEM in % ID/g (n = Anzahl der untersuchten Tiere, siehe Legende)
120
30 min. p.i. Kontrolle (n=3)
80
60 min. p.i. Kontrolle (n=3)
40
90 min. p.i. Kontrolle (n=2)
60 min p.i. Coinjektion (n=3)
% ID/g
10
5
68
m
ur
Fe
ar
m
D
el
M
us
k
irn
H
or
Tu
m
M
ilz
er
z
H
e
ie
r
N
Le
be
r
Lu
ng
e
B
lu
t
0
Abbildung 32. Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-16 im Tiermodell der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t(Ex)= 30, 60, 90 Minuten (Tiergruppe „Kontrolle“) und
60 Minuten (Tiergruppe „Coinjektion“); Dargestellt in der Abbildung sind MW ± SEM bei n=11 (n
= Anzahl der untersuchten Tiere) und einer injizierten Radioaktivität von 3,4 (MW) ± 1,5 (SD)
MBq (grün: Vergleich Traceraufnahme Niere 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit Tiergruppe
„Coinjektion“; rot: Vergleich Traceraufnahme Tumor 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit
Tiergruppe „Coinjektion“
53
Die Experimente zur Inhibierung der Traceraufnahme von [68Ga]DOTA-RGD-16
im Tumor zum Zeitpunkt t(EX) = 60 Minuten (n = 3) lieferte folgende Ergebnisse
(Abbildung 32 und 33; Tabelle 4.11): In der Tiergruppe der coinjizierten Tiere
fand sich die höchste Ansammlung von [68Ga]DOTA-RGD-16 in der Niere mit
108,6% ID/g. Gefolgt von der Leber (7,53% ID/g), Milz (5,74% ID/g) und der
Lunge (1,58% ID/g). Der Tumor erreichte eine Radioaktivität von 1,23% ID/g.
Alle anderen Organe zeigten einen Wert unter 1% ID/g. Die coinjizierten Tiere
zeigen eine erniedrigte Traceraufnahme im Tumor um 42,5% gegenüber der
Tiergruppe „Kontrolle“ (Abbildung 32 und 33).
Organ
[68Ga]DOTA-RGD-16
150
60 min p.i. Kontrolle (n=3)
125
60 min p.i. Coinjektion (n=3)
ar
m
Fe
m
ur
ke
l
60 Min
Coinjektion
(% ID/g)
MW SEM
0,64 ± 0,03
1,58 ± 0,12
7,53 ± 0,24
108,6 ± 5,15
0,87 ± 0,10
5,74 ± 0,49
1,23 ± 0,10
0,07 ± 0,02
0,31 ± 0,02
0,55 ± 0,03
0,82 ± 0,04
D
irn
H
us
M
ilz
m
or
Tu
B
Lu
M
t
ng
e
Le
be
r
N
ie
re
H
er
z
75
10
8
6
4
2
0
lu
% ID/g
100
Blut
Lunge
Leber
Niere
Herz
Milz
Tumor
Hirn
Muskel
Darm
Femur
60 Min
Kontrolle
(% ID/g)
MW SEM
0,46 ± 0,02
4,58 ± 1,95
8,32 ± 0,32
114,56 ± 4,75
1,14 ± 0,09
7,41 ± 0,28
2,14 ± 0,20
0,05 ± 0,00
0,33 ± 0,03
1,81 ± 0,11
1,13 ± 0,01
Abbildung 33. und Tabelle 4.11. Graphische und tabellarische Darstellung der organischen
68
Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-16 (60 min p.i.) im Vergleich Tiergruppe „Kontrolle“ (n=5,
injizierte Radioaktivität pro Tier = 3,9 (MW) ± 1,4 (SD) MBq) mit Tiergruppe „Coinjektion“ (n=2,
injizierte Radioaktivität pro Tier = 2,0 (MW) ± 0,7 (SD) MBq)), Dargestellt in der Tabelle sind
Mittelwerte (MW) ± SEM in % ID/g (n= Anzahl der untersuchten Tiere, siehe Legende)
54
5 Diskussion und Bewertung der Ergebnisse
5.1
Stabilität der Tracer in vitro
Die Untersuchung der Stabilität der [68Ga]DOTA-RGD-Multimere, [68Ga]DOTARGD-1 [68Ga]DOTA-RGD-2, [68Ga]DOTA-RGD-4, [68Ga]DOTA-RGD-8 und
[68Ga]DOTA-RGD-16 in humanem Serum in vitro lässt darauf schließen, dass
die Größe der Multimere eine Rolle für deren Stabilität spielt. [68Ga]DOTA-RGD16 weist mit Abstand die größte Instabilität auf, da es nach nur 30 Minuten in
zwei neue unbekannte Verbindungen zerfällt und sich dieser Prozess danach
weiter fortsetzt. Nach 90 Minuten ist die Ausgangssubstanz nicht mehr mit Hilfe
der Chromatographie-Methode nachweisbar. [68Ga]DOTA-RGD-8 bleibt 45
Minuten lang stabil bevor es nach 60 Minuten ebenfalls fragmentiert.
[68Ga]DOTA-RGD-1, [68Ga]DOTA-RGD-2 und [68Ga]DOTA-RGD-4 sind zu allen
Zeitpunkten während der Inkubation in humanem Serum bei 37°C, wie in
Abbildung 18 dargestellt, stabil. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass mit
zunehmender Größe der [68Ga]DOTA-RGD-Multimere die Stabilität der
Verbindungen nachlässt. Ein Grund für dieses Ergebnis könnte eine komplexe
Interaktion mit im Serum befindlichen Enzymen (z.B. Peptidasen) sein, die die
chemischen Verbindungen spalten. Dies gilt jedoch nur als Vermutung, da die
Größenabhängigkeit der Instabilität auch chemischer Natur sein kann; so ist
beispielsweise die Hydrolyseempfindlichkeit großer Moleküle in Lösung höher
als die kleiner Peptide.
5.2
Der
LogD7,4-Wert
LogD7,4-Wert
identifiziert
die
[68Ga]DOTA-RGD-Multimere
erwartungsgemäß als hydrophile Substanzen mit einem
negativen LogD7,4-
Wert, wobei sich die Hydrophilie mit zunehmender Größe der [68Ga]DOTARGD-Verbindung verringert. Es ist ein plötzlicher Anstieg des LogD7,4-Wertes
von -4 für [68Ga]DOTA-RGD-4 auf -2 für [68Ga]DOTA-RGD-8 zu verzeichnen,
was mit der molekularen Struktur und deren Instabilität zusammenhängen
könnte, da [68Ga]DOTA-RGD-8 ein größeres Molekül ist als [68Ga]DOTA-RGD4. Die zunehmende Größe ist ein Maß für den Lipophiliegewinn und ermöglicht
die höhere Löslichkeit in hydrophober Umgebung.
55
5.3
Rezeptorbindungsstudien
Die Auswertung der Rezeptorbindungsstudien lässt vermuten, dass die Avidität
der DOTA-RGD-Verbindungen für ανβ5 größer ist als für HT29-Zellen. Im
Bindungsexperiment an reinem ανβ5 lässt sich feststellen, dass [68Ga]DOTARGD-16 mit höherer Avidität an den Rezeptor bindet als die anderen
untersuchten RGD-Multimere.
Dies galt für die HT29 Zellen nicht. Es waren zum einen hohe Konzentrationen
nötig, um eine Verdrängung von
125
I-Echistatin zu erhalten und zum anderen ist
in diesem Fall das tetramere DOTA-RGD-4 diejenige Verbindung, die die
höchste Avidität zu ανβ5 zeigte. Daraus könnte man eventuell schließen, dass
DOTA-RGD-4, da dieses in der geringsten Konzentration an die HT29 Zellen
bindet, eventuell unselektiv an andere Integrine bindet und so
125
I-Echistatin
besser verdrängt als alle anderen Verbindungen.
Es lässt sich folgern, dass alle DOTA-RGD-Verbindungen spezifisch am ανβ5Rezeptor
binden
und
die
Avidität
der
DOTA-RGD-Verbindungen
mit
zunehmender Größe der Struktur steigt, da die Bindungsmöglichkeiten
ebenfalls ansteigen.
Zur Prüfung der Bindungsfähigkeit des anderen Integrins der ανβ-Gruppe, das
ανβ3, welches für die Tumorangiogenese eine wichtige Rolle spielt, wurden
bereits Versuche in der Erlanger Arbeitsgruppe durchgeführt [42]. Hier wurde
der bereits etablierte
I-Echistatin-Bindungsassay an mit ανβ3-Rezeptor
125
beschichteten Platten verwendet [34, 38]. Diese Ergebnisse sind in Abbildung
34 dargestellt und erlauben einen direkten Vergleich mit den Bindungsdaten am
ανβ5-Rezeptor. Es ist zu erkennen, dass alle 5 RGD-Verbindungen mit ähnlicher
Avidität an ανβ3 und ανβ5 binden. Auch für die Bindung an ανβ3 erfolgt eine
deutliche Abnahme der nötigen Konzentration für die höheren Multimere um
125
I-Echistatin zu verdrängen. Dennoch lassen sich Unterschiede zwischen den
Bindungskurven feststellen. So haben die Verbindungen DOTA-RGD-1 und
DOTA-RGD-2 für ανβ5 eine deutlich höhere Avidität als für ανβ3 (Tabelle 5.1).
Dagegen ist es für DOTA-RGD-4, DOTA-RGD-8 und DOTA-RGD-16 genau
umgekehrt. Dies könnte eine Rolle für die Interpretation der Traceranreicherung
in vivo spielen, da die Expression der Integrine zwischen den Subtypen ebenso
unterschiedlich ausfallen kann.
56
Tabelle 5.1. Kompetitive Verdrängung von
I-Echistatin an ανβ3 (Tabelle von [42]) und ανβ5
(dreifache Wiederholung mit 8 verschiedenen aufsteigenden Konzentrationen (n=3);mit
Darstellung des Mittelwertes (MW) und Standardabweichung (SD))
125
Ligand
RGD-1
RGD-2
RGD-4
RGD-8
RGD-16
Ki
34nM
37nM
26nM
13nM
15nM
12nM
1,3nM
1,4nM
1,3nM
0,32nM
0,36nM
0,29nM
0,28nM
0,29nM
0,22nM
MW±SD
Ligand
32 ± 6nM
RGD-1
13 ± 2nM
RGD-2
1,3 ± 0,1nM
RGD-4
0,32 ± 0,04nM
RGD-8
0,26 ± 0,04nM
RGD-16
100
c(RGDfC)
RGD 1
RGD 2
RGD 4
RGD 8
RGD 16
75
50
25
0
-13 -12 -11 -10
-9
-8
MW±
±SD
19,0 ± 7,0 nM
6,9 ± 6,5 nM
3,2 ± 1,3 nM
0,82 ± 0,19 nM
0,38 ± 0,02 nM
α νβ 5
-7
conc [log M]
-6
-5
-4
ge bunde ne s [ 1 2 5I]-Echistatin (%)
gebundenes [ 125I]-Echistatin (%)
α vβ3
Ki Werte
18,82 nM
24,80 nM
13,48 nM
2,71 nM
14,43 nM
3,53 nM
3,29 nM
4,27 nM
2,46 nM
0,67 nM
1,07 nM
1,00 nM
0,40 nM
0,40 nM
0,45 nM
100
RGD-1
RGD-2
80
RGD-4
RGD-8
60
RGD-16
40
20
0
-12
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
conc [logM]
Abbildung 34. Rezeptorbindungsstudien der DOTA-RGD-Multimere DOTA-RGD-1, DOTARGD-2, DOTA-RGD-4, DOTA-RGD-8, DOTA-RGD-16 an ανβ3 (linke Abbildung) (Grafik von
[42]) und an ανβ5 (rechte Abbildung) als Verdrängungsexperiment unter Verwendung des
125
Radioliganden
I-Echistatin (dreifache Wiederholung bei 7 bzw. 8 verschiedenen
aufsteigenden Konzentrationen (n=7 für DOTA-RGD-1, DOTA-RGD-2, DOTA-RGD-4); (n=8 für
DOTA-RGD-8 und DOTA-RGD-16); mit Darstellung des Mittelwertes (MD) und
Standardabweichung (SD) dargestellt ist MW ± SD; n = Anzahl der Versuche pro RGDVerbindung)
5.4
Bioverteilung
[68Ga]DOTA-RGD-1 ist bezüglich der Stabilität der Tracer in humanem Serum
verglichen mit den anderen beiden [68Ga]DOTA-RGD-Multimeren [68Ga]DOTARGD-4 und [68Ga]DOTA-RGD-16 ein sehr stabiles Molekül. Dies spiegelt sich in
der Bioverteilung ebenso wider. Nach nur 10 Minuten erreicht es bereits seine
höchste Konzentration in allen Organen. Wie in Abbildung 36 zu erkennen ist,
weilt die Verbindung nur sehr kurzfristig in den einzelnen Geweben. Das könnte
darauf schließen lassen, dass eine sehr rasche Aufnahme über die
57
Integrinrezeptoren und auch eine sehr schnelle Elimination für dieses relativ
kleine Peptid erfolgt.
Die Blockade der Integrine durch einen Überschuss an cRGDfV scheint im
Tumor sehr erfolgreich zu sein mit einer Reduktion der Traceraufnahme um
nahezu 68% von 0,65% ID/g auf 0,21% ID/g. Dies zeigt die Expression der
Integrine im Tumorareal, die auch in anderen Organen zu finden sind, wie in der
Milz, im Muskel, der Leber und dem Knochen. Da ανβ3 häufig an der Oberfläche
von vaskulären glatten Muskelzellen (Gefäße), Osteoklasten (Knochen),
Endothelzellen (Gefäße) und Tumorzellen exprimiert werden, sind gerade
Organe, die diese Zellen besitzen, also gut durchblutete Organe mit einer
erhöhten Integrinexpression konfrontiert und sollten folglich gut auf die
Coinjektion ansprechen [29]. Die endogene Expression des Integrins konnte im
Rahmen der Arbeit anhand der Daten über die Bioverteilung der Tracer in Milz,
Leber, Muskel und Knochen durchaus nachvollzogen werden.
In der Niere hingegen scheint die Coinjektion der hohen Dosis von cRGDfV die
Traceraufnahme nicht zu beeinflussen; hier ist der Traceruptake im Vergleich
zur Kontrollgruppe nicht vermindert (Abbildung 36: grüne dargestellte Balken).
Dies lässt vermuten, dass andere Mechanismen, neben der Rezeptorvermittelten
Aufnahme,
die
Traceraufnahme
von
[68Ga]DOTA-RGD-1
begünstigen oder die normale Elimination über die Niere erhöht ist.
4
10 min p.i. Kontrolle (n=4)
30 min p.i. Kontrolle (n=5)
2
2.0
60 min p.i. Kontrolle (n=5)
90 min p.i. Kontrolle (n=2)
% ID/g
60 min p.i. Coinjektion (n=2)
1.5
1.0
0.5
68
ur
Fe
m
D
ar
m
M
us
ke
l
H
irn
or
Tu
m
ilz
M
H
er
z
ie
re
N
Le
be
r
ng
e
Lu
B
lu
t
0.0
Abbildung 36. Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-1 im Tiermodell der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30, 60, 90 Minuten (Tiergruppe „Kontrolle“)
und 60 Minuten (Tiergruppe „Coinjektion“); Dargestellt in der Abbildung sind MW ± SEM bei
n=18 (n = Anzahl der untersuchten Tiere) und einer injizierten Radioaktivität von 4,5 (MW) ±
1,7 (SD) MBq (grün: Vergleich Traceraufnahme Niere 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit
Tiergruppe „Coinjektion“; rot: Vergleich Traceraufnahme Tumor 60 min p.i. Tiergruppe
„Kontrolle“ mit Tiergruppe „Coinjektion“
58
Im Gegensatz dazu zeigt [68Ga]DOTA-RGD-4 eine deutliche Abweichung in der
Bioverteilung. Der Traceruptake ist in allen Geweben über längere Zeit (30
Minuten) nahezu unverändert.
Die spezifische Traceraufnahme im Tumor scheint für das Tetramer gegenüber
[68Ga]DOTA-RGD-1 erhöht zu sein. Bei [68Ga]DOTA-RGD-1 ist nach 10
Minuten eine Erhöhung der Radioaktivität im Tumor gegenüber der Lunge um
3% nachweisbar. Dieser Unterschied beträgt bei [68Ga]DOTA-RGD-4 rund 20%,
was die These untermauert, dass höherwertige RGD-Multimere wie das
tetramere [68Ga]DOTA-RGD-4 in vivo eine höhere Retention im Tumor
aufweisen. [68Ga]DOTA-RGD-4 bindet, wie in Abbildung 37 zu sehen ist, im
Tumor mit deutlich längerer Retention als [68Ga]DOTA-RGD-1. Zum Zeitpunkt
t(EX)= 30 Minuten sind 2,07% ID/g für [68Ga]DOTA-RGD-4 gegenüber 0,86%
ID/g für [68Ga]DOTA-RGD-1 zu messen. Erst nach 60 Minuten sinkt die
Radioaktivität von [68Ga]DOTA-RGD-4 im Tumor deutlich um 50% auf 1,0%
ID/g. Das lässt vermuten, dass es der [68Ga]DOTA-RGD-4-Verbindung gelingt,
stabilere Ligand-Rezeptor-Komplexe zu bilden als [68Ga]DOTA-RGD-1.
Weiterhin ist die Eliminierung der Substanz nach 30 Minuten nicht so deutlich
wie bei [68Ga]DOTA-RGD-1. So scheint es im Muskel und im Femur eher so zu
sein, dass eine verzögerte Aufnahme des Tetramers erfolgt. Nach 30 Minuten
steigert sich der 10-Minuten-Wert im Muskel um ca. 153% und im Femur um
64%.
[68Ga]DOTA-RGD-4 zeigt, wie theoretisch bereits vermutet, eine größere
Retention und eine höhere Bindungsfähigkeit im Tumor in vivo.
Im Versuch mit den Tieren, die eine Coinjektion mit cRGDfV erhalten haben,
zeigt sich die Aufnahme von [68Ga]DOTA-RGD-4 im Tumor nur um rund 26%
vermindert (60 min p.i.). In fast allen Organen scheint in den coinjizierten
Tieren, im Gegensatz zu den Kontrolltieren, weniger Traceraufnahme in den
einzelnen Geweben stattzufinden als für [68Ga]DOTA-RGD-1. Ein Grund für
diese Beobachtung könnte eine höhere unspezifische Bindung für multimere
Liganden in den hoch-permeablen Gefäßen von Tumoren sein, da diese
unspezifische Bindung ein niedrigeres Ausmaß für kleine Peptide, wie cRGDfV,
im Vergleich zu Multimeren, haben könnte.
59
16
12
8
4
10 min. p.i. Kontrolle (n=2)
30 min p.i. Kontrolle (n=4)
60 min p.i. Kontrolle (n=3)
% ID/g
60 min p.i. Coinjektion (n=2)
2
1
Fe
m
ur
ar
m
D
el
M
us
k
irn
H
Tu
m
or
M
ilz
er
z
H
re
ie
N
be
r
Le
t
lu
B
Lu
ng
e
0
68
Abbildung 37. Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-4 im Tiermodell der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t(Ex)= 10, 30, 60 Minuten (Tiergruppe „Kontrolle“) und
60 Minuten (Tiergruppe „Coinjektion“); Dargestellt in der Abbildung sind MW ± SEM bei n=11 (n
= Anzahl der untersuchten Tiere) und einer injizierten Radioaktivität von 4,3 (MW) ± 2,6 (SD)
MBq (grün: Vergleich Traceraufnahme Niere 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit Tiergruppe
„Coinjektion“; rot: Vergleich Traceraufnahme Tumor 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit
Tiergruppe „Coinjektion“
Die Ergebnisse von [68Ga]DOTA-RGD-16 lassen sich vermutlich nicht ohne
Vorsicht mit denen der beiden anderen Verbindungen [68Ga]DOTA-RGD-1 und
[68Ga]DOTA-RGD-4
vergleichen,
da
die
Bioverteilung,
aufgrund
der
verminderten Stabilität des Hexadecimers in humanem Serum in vitro und damit
eventuell auch im Blut in vivo, erschwert sein kann.
Trotz der verminderten Stabilität des Hexadecimers in vitro, lässt sich der Trend
in vivo für die mehrwertigen RGD-Verbindungen fortführen. [68Ga]DOTA-RGD16 wird ebenfalls über einen längeren Zeitraum in den Tumor aufgenommen
und nach 90 Minuten ist die Radioaktivität immer noch nicht unter die Werte
zum Zeitpunkt 30 Minuten nach Injektion gesunken. Das Maximum der
Radioaktivität im Tumor wird erst nach 60 Minuten erreicht. In Leber und Milz ist
die maximale Aufnahme nach 90 Minuten sichtbar. Da die Substanz in der Invitro-Analyse der Stabilität im Serum bereits nach 45 Minuten erheblich
degradiert war, bleibt es fraglich, ob wirklich intaktes [68Ga]DOTA-RGD-16 für
die Aufnahme in den Tumor in vivo sorgt oder ob Fragmente ebenso Tumoraffin binden können.
Im Versuch mit den coinjizierten Tieren zeigte sich eine deutliche Verminderung
der Traceraufnahme nach 60 Minuten p.i. in fast allen Geweben (Abbildung 38),
bis auf die Niere und im Blut. Dies kann darauf hinzudeuten, dass trotz der
60
Instabilität von [68Ga]DOTA-RGD-16 eine Rezeptor-spezifische Aufnahme in
den Tumor und andere Gewebe erfolgt ist und in der Gruppe der coinjizierten
Tiere die Traceraufnahme inhibiert ist.
120
30 min. p.i. Kontrolle (n=3)
80
60 min. p.i. Kontrolle (n=3)
40
90 min. p.i. Kontrolle (n=2)
60 min p.i. Coinjektion (n=3)
% ID/g
10
5
Fe
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B
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t
0
68
Abbildung 38. Bioverteilung von [ Ga]DOTA-RGD-16 im Tiermodell der U87MG-Tumortragenden Nacktmaus zu den Zeitpunkten t(Ex)= 30, 60, 90 Minuten (Tiergruppe „Kontrolle“) und
60 Minuten (Tiergruppe „Coinjektion“); Dargestellt in der Abbildung sind MW ± SEM bei n=11 (n
= Anzahl der untersuchten Tiere) und einer injizierten Radioaktivität von 3,4 (MW) ± 1,5 (SD)
MBq (grün: Vergleich Traceraufnahme Niere 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit Tiergruppe
„Coinjektion“; rot: Vergleich Traceraufnahme Tumor 60 min p.i. Tiergruppe „Kontrolle“ mit
Tiergruppe „Coinjektion“
Abschließend lässt sich feststellen, dass die weitere präklinische Verwendung
der
68
Ga-markierten RGD-Multimere für die Zukunft sehr viel Potential besitzt.
Die hohe Bindungsfähigkeit zu den Integrinen macht die RGD-Multimere zu
sehr guten Tracern für die PET in der Tumordiagnostik. Trotz der Instabilität der
Multimere [68Ga]DOTA-RGD-8 und [68Ga]DOTA-RGD-16 in vitro ist ein
deutlicher
Trend
bezüglich
der
Aufnahme
der
Tracer
und
deren
Bindungsfähigkeit zu den Integrinen in Abhängigkeit der Höherwertigkeit zu
sehen. So würde es sich in Hinblick der guten und zeitlich ansteigenden
Traceraufnahme von [68Ga]DOTA-RGD-16 in den Tumor lohnen, [68Ga]DOTARGD-8 in vivo ebenfalls zu untersuchen, da es in der Untersuchung der
Stabilität der Tracer in vitro deutlich länger stabil blieb. Betrachtet man
allerdings alle in dieser Arbeit untersuchten RGD-Multimere, so erscheint zum
aktuellen Zeitpunkt das [68Ga]DOTA-RGD-4 das am viel versprechendste
[68Ga]DOTA-RGD-Multimer zu sein, da es sowohl stabil in vitro ist als auch in
vivo eine vorteilhafte Retention Tumor zeigt. Prinzipiell ist die Entwicklung
61
höherwertiger RGD-Multimere für die PET-Bildgebung der Integrinexpression
sehr wichtig und nützlich, wie fortlaufende Studien der letzten Jahre von
Wängler et al., Dijkgraaf et al. und Li et. al und viele andere zeigen [18, 33, 42].
Um zukünftig die Tumordiagnostik mit der PET voran zu treiben, ist es
lohnenswert RGD-Multimere weiter zu entwickeln und insbesondere den Aspekt
der Stabilität im Serum zu beachten. Daher erscheint es sinnvoll, das Oktamer
sowie das Hexadecimer chemisch zu stabilisieren, um deren In-vivo-Stabilität
zu verbessern und primär auch die Frage zu klären, ob [68Ga]DOTA-RGD-16 in
vivo instabil ist? Diese Frage soll anhand von Metabolitenstudien, die über den
Umfang dieser Arbeit hinausgehen, radiochemisch-analytisch anhand von
Gewebeextrakten nach Tracerinjektion untersucht werden.
Insgesamt stellen RGD-Multimere eine sehr gute Option in der Tumordiagnostik
dar, da die hier verwendeten Derivate zudem mit Ga-68 sehr einfach markierbar
sind. Mit der Weiterentwicklung der RGD-Multimere als nuklearmedizinische
Tracer sollte es in Zukunft möglich sein, die Integrinexpression in der PET zu
quantifizieren
und
dies
beispielsweise
für
die
Vorhersagbarkeit
von
Therapieansprechen in der nuklearmedizinischen Tumordiagnostik zu nutzen.
62
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67
7 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Erläuterung
ATCC
American Type Culture Collection
(Einrichtung zur Erfassung, Produktion und Erhaltung
von Mikroorganismen/Zelllinien)
Arg-Gly-Asp Arginin-Glycin-Aspartat
AS
Aminosäure
BSA
Bovines Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
CT
Computertomographie
DC
Dünnschichtchromatographie
DOTA
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
LogD
Logarithmus des D-Wertes
MRT
Magnetresonanztomografie
MW
Mittelwert
n
Anzahl der untersuchten Tiere/Proben
NaOAc
Natriumacetat
PET
Positronen-Emissions-Tomographie
p.i.
post injectionem (nach der Injektion)
RGD
Arginin-Glycin-Aspartat
rpm
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
SD
Standardabweichung
SEM
Standardfehler
t(EX)
time(Exitus) (Todeszeitpunkt)
% ID/g
Prozent der injizierten Dosis pro Gewebemasse in
Gramm
68
8 Danksagung
Ich möchte ganz herzlich der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. rer. nat. Olaf Prante
danken, die mir uneingeschränkt Möglichkeiten zur Forschung und Niederschrift
meiner Dissertation eingeräumt und mich auf dem gesamten Weg immer
unterstützt haben.
Insbesondere möchte ich dabei Prof. Dr. rer. nat. Olaf Prante, Dr. rer. nat.
Simone Maschauer und Bianca Weigel danken, die mir mit Rat und Tat
jederzeit zur Seite standen, mich unterstützten und mir halfen, Probleme zu
lösen, die sich während meiner Arbeit immer wieder stellten.
Weiterhin danke ich Prof. Dr. med. Kuwert, dass er mich unterstützt, mir die
Mittel zur Verfügung gestellt und mir erlaubt hat, in der von ihm geleiteten Klinik
zu arbeiten und zu forschen.
Desweiteren möchte ich meinen Eltern Dr. Falko Wrubel und Dietlind Wrubel
danken, die mich immer in meinem Lebensweg unterstützt und mir Mut
gemacht haben, meine Ziele zu verwirklichen.
Weiterer Dank gebührt meiner Großmutter Annelies Wrubel, die mir von
Kindesbeinen beigebracht hat, mich von niemandem aufhalten zu lassen.
Abschließend möchte ich mich bei Michael Schöberl bedanken, der immer an
meiner Seite steht und jeden Weg mit mir geht.
69
9 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Geburtsdatum/-ort:
Familienstand:
Eltern:
Geschwister:
Scarlett Margot Annelies Wrubel
23. Mai 1984, Rostock
ledig
Dietlind Wrubel (geb. Reimann) und Dr. Falko Wrubel
Willi Wrubel
Ausbildung
06/2003 Abitur
Johann-Wolfgang-von-Goethe-Gymnasium, Chemnitz
10/2004 - 06/2011 Studium der Humanmedizin
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
02/2010 – 01/2011 Praktisches Jahr
02/2010-06/2010
06/2010-08/2010
08/2010-10/2010
10/2010-01/2011
Medizinische Klinik 1, Universitätsklinikum Erlangen
Kent & Canterbury Hospital, Canterbury, Großbritannien
Chirurgische Klinik mit Poliklinik, Universitätsklinikum Erlangen
Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie, Universitätsklinikum
Erlangen
seit 12/2008 Experimentelle Doktorarbeit an der Klinik für Nuklearmedizin
Beruflicher Werdegang
10/2003 – 08/2004 Freiwilliges Soziales Jahr, Jugendaufbauwerk Berlin
10/2003 - 03/2004
04/2004 - 08/2004
DRK Sozialstation Limbach-Oberfrohna
Neurologische Klinik, Klinikum Chemnitz
03/2005 – 02/2010 Studentische Hilfskraft, Direktionssekretariat
Medizinische Klinik 1, Universitätsklinikum Erlangen
seit 07/2011 Ärztin, Klinikum am Europakanal, Klinik für Psychiatrie,
Psychotherapie, Sucht und Psychosomatik
Auslandserfahrungen
08/2000 – 07/2001 Austauschjahr, Umatilla High School, Oregon, USA
06/2010 – 08/2010 Praktisches Jahr, Chirurgie Tertial, Canterbury,
Großbritannien
Sprachkenntnisse
Englisch verhandlungssicher
02/2003
Level 2 Certificate in Advanced English, University of Cambridge
Französisch Grundkenntnisse