vts_7834_11319 - oparu

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
des
Universitätsklinikums Ulm
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Steffen Stenger
Interaktion von humanen Makrophagen und
Mycobacterium tuberculosis bei Hypoxie
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie der
Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
vorgelegt von
Daniel Nickel, Altdöbern
Ulm, Mai 2011
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: Prof. Dr. Steffen Stenger
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Stefan Kochanek
Tag der Promotion: 16.12.2011
II
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
III
1.
Einleitung
1
1.1.
Normoxie und Hypoxie
1
1.2.
Die angeborene Immunabwehr
1
1.3.
Adaption von Makrophagen an hypoxische Bedingungen
2
1.3.1.
Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor-1
2
1.3.2.
Makrophagen als Effektorzellen unter Hypoxie
3
1.4.
Tuberkulose
3
1.4.1.
Epidemiologie
3
1.4.2.
Makrophagen bei der Immunabwehr gegen Mykobakterien
5
1.4.3.
Tuberkulose und Tumornekrosefaktor
5
1.4.4.
Evasionsmechanismen von Mycobacterium tuberculosis
6
1.4.5.
Das tuberkulöse Granulom
8
1.4.6.
Hypoxie im Granulomen
9
1.5.
Ziele der Arbeit
11
2.
Material und Methoden
12
2.1.
Material
12
2.1.1.
Reagenzien und Chemikalien
12
2.1.2.
Arbeitsgeräte
15
2.1.3.
Verbrauchsmaterialien
17
2.1.4.
Bakterien
18
2.1.5.
Medien und Puffer
18
2.1.6.
Waschmedium für infizierte Makrophagen
18
2.2.
Methoden
20
2.2.1.
Zellbiologie
20
2.2.2.
Viabilität der Mykobakterien
22
2.2.3.
Proteinbiochemie
25
2.2.4.
Molekularbiologie
27
3.
Ergebnisse
31
3.1.
Einfluss der Sauerstoffspannung auf die Vermehrung extrazellulärer
Mykobakterien
31
I
Inhaltsverzeichnis
3.1.1.
Metabolische Soffwechselaktivität
31
3.1.2.
Extrazelluläres Wachstum
32
3.2.
Einfluss der Sauerstoffspannung auf die Infektion von Makrophagen mit
Mycobacterium tuberculosis
33
3.2.1.
Viabilität von Makrophagen
33
3.2.2.
Phagozytose von Mykobakterien
35
3.2.3.
Zytokinproduktion
35
3.2.4.
Intrazelluläres Wachstum von Mycobacterium tuberculosis
38
3.3.
Mechanismus der Makrophagen-Aktivierung durch Hypoxie
40
3.3.1.
Untersuchung der Regulation des Vitamin D Rezeptors
40
3.3.2.
Untersuchung der Regulation von Cathelicidin
41
3.3.3.
Untersuchung der Regulation von humanem β-Defensin-2
43
4.
Diskussion
45
4.1.
Makrophagen und die Rolle der Hypoxie
45
4.2.
Einfluss von Hypoxie auf die Vitalität von Mycobacterium tuberculosis
46
4.3.
Intrazelluläres Wachstum von Mykobakterien unter Hypoxie
48
Zusammenfassung
54
Literaturverzeichnis
55
Danksagung
66
II
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AM
Alveolarmakrophage
AMP
antimikrobielle Peptide
APZ
Antigenpräsentierende Zellen
BAL
bronchoalveoläre Lavage
BSA
Rinderserumalbumin
CD
cluster of differentiation
CAMP
Cathelicidin antimicrobial peptid
CRAMP
Cathelicidin related antimicrobial
peptid
cDNS
zu RNA komplementäre
Desoxiribonukleinsäure
cpm
Zählung pro Minute
DZ
Dendritische Zelle
DFO
Desferrioxamin-Mesylat
DRK
Deutsches Rotes Kreuz
dNTP
2’-Desoxyribonukleosid-5’triphosphat
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
Enzymgekoppelter
Immunadsorptionstest
FACS
Durchflusszytometrie
FKS
fötales Kälberserum
FITC
Fluorescein-Isothiocyanat
GM-CSF
Granulozyten Monozyten-Kolonie
stimulierender Faktor
hBD-2
humanes -Defensin 2
HEPES
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-iperazinyl]Ethansulfonsäure
HIV
humanes Immundefiziens-Virus
HRP
Meerrettichperoxidase
IFN-γ
Interferon-γ
III
Abkürzungsverzeichnis
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
KbE
Koloniebildende Einheit
kDa
Kilodalton
LPS
Lipopolysacharide von Escherichia
coli
M.tb
Mycobacterium tuberculosis
MHC
Haupthistokkompatibilitätskomplex
MOI
multiplicity of infection
mRNA
messenger ribonucleic acid
NO
Stickstoffmonoxid
NK-Zelle
Natürliche Killerzelle
OADC
Ölsäure, Albumin, Dextrose,
Katalase
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBMC
mononukleäre Zellen des
peripheren Blutes
PBS
Phophat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PE
Phycoerythrin
PFA
Paraformaldehyd
PI
Propidiumiodid
PPD
standardisiertes Antigengemisch
hergestellt aus M.tb
PVDF
Polyvinylidendifluorid
rhu
rekombinant human
RNS
Ribonukleinsäure
RNS
reaktive Stickstoffspezies
ROS
reaktive Sauerstoffspezies
RT
reverse Transkription
SDS
Sodium Dodecylsulfat
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TNF
Tumornekrosefaktor
UpM
Umdrehung pro Minute
IV
Abkürzungsverzeichnis
WB
Western blot
V
Einleitung
1. Einleitung
1.1. Normoxie und Hypoxie
Die Erdatmosphäre setzt sich aus ca. 78% Stickstoff (N2), ca. 21% Sauerstoff (O2)
und ca. 1% Edelgasen zusammen, und wird als Normoxie bezeichnet. In der
zellbiologischen Forschung wird meist diese Sauerstoffkonzentration verwendet.
21% O2 entsprechen jedoch nicht der Sauerstoffkonzentration, die im Gewebe
vorliegt. Diese liegt mit 3-9% O2 deutlich darunter [53]. Der Normbereich des
Sauerstoffgehalts in Bereichen des Sauerstofftransportsystems liegt bei:
21% in der Trachealluft
14% in der alveolären Luft
13% im arteriellen Blut
5% im venösen Blut
5%, im extrazellulären Raum
0,6% im intrazellulären Raum.
Die Unterversorgung von Geweben mit Sauerstoff bezeichnet man als Hypoxie.
Die Sauerstoffkonzentrationen liegen dabei unterhalb von 3%. Hypoxische
Bedingungen sind insbesondere bei erkrankten Geweben zu finden, wie
beispielsweise entzündete Gewebe, maligne Tumore, arteriosklerotische Plaques,
Wunden, rheumatoide Arthritis und bakterielle Infektionen [27, 53, 66].
1.2. Die angeborene Immunabwehr
Pathogene versuchen im Wirtsorganismus Orte zu besiedeln, an denen sie
replizieren und den Wirt schädigen. Der Invasion stellen sich in erster Linie
physikalische und chemische Barrieren entgegen. Somit besitzen die Haut und
Schleimhäute einen protektiven Charakter. Oberflächenepithelien bilden Säuren,
Enzyme und kationische Oligopeptide mit mikrobizider Wirkung. Übergangsstelle
zur zellulären Immunabwehr sind Surfactant-Proteine und das Komplementsystem
Sie lagern sich auf die Oberflächen der Pathogene und bewirken so deren
Opsonisierung. Dadurch wird die Aufnahme der Krankheitserreger durch
Phagozyten erleichtert. Ein wichtiger Vertreter der Phagozyten sind Makrophagen.
Sie sind gewebsständig und nutzen Muster-Erkennungs-Rezeptoren um Pathogen
assoziierte Molekulare-Muster zu erkennen. Die Aufnahme der Pathogene erfolgt
über einen aktiven Prozess, in dem die Zellmembran um das Pathogen herum
geschlossen wird. Es entsteht ein Vesikel, genannt frühes Phagosom. Den
1
Einleitung
weiteren Weg des Phagosoms bestimmt ein Reifungsprozess und mündet letztlich
in der Fusion mit einem anderen intrazellulären Vesikel, dem Lysosom. Es
entsteht das Phagolysosom [59]. In diesem finden sich hydrolytische Enzyme wie
Proteasen, Lipasen, Galactosidasen und Nukleasen, die am Abbau der
aufgenommenen Erreger beteiligt sind. Der membranständige ATPase-Komplex
(V-Typ) transportiert Protonen (H+) in das Lumen des Vesikels, wodurch ein
saures Milieu (pH <5) entsteht, das die Enzyme aktiviert und die Bakterien
verdaut.
Die
prozessierten
Antigene
werden
über
Haupthistokompatibilitätskomplex II (MHC II) an spezifische T-Zellen präsentiert
und leiten dadurch die erworbene Immunantwort ein.
1.3. Adaption von Makrophagen an hypoxische Bedingungen
Der niedrige O2-Gehalt in entzündetem Gewebe erfordert die Anpassung der dort
ansässigen Zellen. Deshalb reagieren die Monozyten, als Vorläufer der
Makrophagen und die Makrophagen selbst, mit veränderter Genexpression. Das
Überleben der Zelle steht dabei im Vordergrund, insbesondere die ATPVersorgung muss in hypoxischen Bereichen gesichert werden. Die Zellen stellen
dabei auf Energiegewinn durch Glykolyse um. Die dafür notwendigen Enzyme und
Transportproteine werden verstärkt exprimiert [27, 80, 88].
1.3.1. Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor-1
Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1) übernimmt eine
große
Rolle
bei
der
Adaption
von
Makrophagen
an
ihrer
hypoxische
Wirkungsstätte. HIF-1 ist ein Heterodimer und setzt sich aus zwei Helix-Loop-Helix
Proteinen zusammen [87, 108]. Die Untereinheit HIF-1wird unter normoxischen
Bedingungen durch eine Vielzahl an Mechanismen posttranslational gesteuert.
Unter sauerstoffarmen Bedingungen fallen diese Mechanismen aus und HIF1bleibt stabil. Es wandert in den Zellkern, bindet dort an die HIF-1-Untereinheit,
welche konstitutiv exprimiert wird und bildet den aktiven Transkriptionsfaktor HIF1. Dieser bindet gezielt an Hypoxie-Antwort-Elemente in den Promotorbereichen
verschiedenster Gene und leitet die Transkription ein. Es werden dann Prozesse
wie Angiogenese, Glukosemetabolismus und Zellproliferation reguliert.
2
Einleitung
1.3.2. Makrophagen als Effektorzellen unter Hypoxie
Es muß nicht nur das Überleben der Makrophagen gewährleistet werden, sondern
auch deren Funktionen bei der Immunabwehr [20]. Durch die hypoxischen
Bedingungen kommt es zu einer erhöhten Zelloberflächenrezeptor-Expression, die
Zytokinsekretion ist erhöht und die Phagozytose ist beeinträchtigt (Abb. 1).
antimikrobielle
Effektormechanismen
Phagozytose
Hypoxie
Viabilität
Zytokine
Abb. 1: Hypoxie beeinflusst Funktionen von Makrophagen
Des Weiteren zeichnen sich Makrophagen durch eine erhöhte Expression der
induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) [53] aus. Die Aminosäure LArginin wird im Beisein von reduziertem Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat
(NADPH) von iNOS in einem katalytischen Prozess zu Stickstoffmonoxid (NO)
umgewandelt und dient der protektiven Immunabwehr [23].
1.4. Tuberkulose
1.4.1. Epidemiologie
Die Tuberkulose wird durch Mycobacterium tuberculosis (M.tb) verursacht und ist
eine
der
bedeutendsten
Weltgesundheitsorganisation
Infektionskrankheiten.
von
2010
werden
Im
1,3
aktuellen
Millionen
Bericht
der
Todesfälle
aufgeführt. Die Zahl der Neuinfektionen lag bei 9,4 Millionen [105]. Die Pandemie
betrifft vor allem die Entwicklungsländer. In diesen Gebieten kommt erschwerend
die humane Immundefiziens-Virus (HIV)-Problematik hinzu, da die fehlende
erworbene Immunantwort die Progression der Tuberkulose ermöglicht [25]. 0,4
Millionen HIV-Infizierte sind 2010 an einer Tuberkulose verstorben.
3
Einleitung
Nach der Inhalation infektiöser Aerosole erkranken ca. 10 % der Patienten an
einer Primär-Tuberkulose. Es wird geschätzt, dass etwa ein Drittel der
Weltbevölkerung latent mit M.tb infiziert ist [18]. Etwa. 10% der latent Infizierten
entwickeln eine aktive Tuberkulose (Abb. 2).
14 *106
aktive TB
Infektionen
2,3 *107
PPD +
latente
Infektionen
1,7 *106
TB Tote
4,4 *107
PPD -
Abb. 2: Einschätzungen der WHO zur aktuellen Verteilung der Tuberkuloseerkrankungen
weltweit. (grobe maßstabsgetreue Verteilung der einzelnen Sektionen)
Derzeit stehen 2 standardisierte Verfahren zur Diagnostik einer latenten Infektion
zur Verfügung. Zum einen handelt es sich um eine intrakutanen Tuberkulintest
nach Mendel-Mantoux. Ein Standardgemisch an mykobakteriellen Antigenen,
(PPD purified protein derivative), wird dem Patienten intrakutan gespritzt. Hatte
der Patient Kontakt mit M.tb, kommt es zur Wechselwirkung zwischen
Makrophagen
und
spezifischen
Gedächtnis-T-Lymphozyten.
Weitere
Makrophagen wandern an die Infektionsstelle und es kommt zu einer Induration
und einer makroskopisch sichtbaren Reaktion auf der Haut.
Das zweite Verfahren ist der Interferon-gamma (IFN-) Freisetzungstest (IGRA).
Hierbei reagieren spezifische T-Zellen aus Vollblut mit M.tb-Antigenen und
sezernieren IFN-welches in einem Enzyme-linked Immunosorbant Assay
(ELISA) gemessen wird.
In Deutschland sind die Tuberkulose-Fälle seit Jahren rückläufig. Für das Jahr
2009 wurden 4432 Erkrankungen gemeldet, das entspricht einer Inzidenz von 5,4
Neuerkrankungen pro 100000 Einwohnern [79]. Eine zunehmende Problematik
sind die von multiresistenten Erregern ausgelösten MDR- (multi drug resistant)
und XDR-(extremely drug resistant) Tuberkulosen.
4
Einleitung
1.4.2. Makrophagen bei der Immunabwehr gegen Mykobakterien
Die Tuberkulose wird durch Inhalation M.tb-haltiger Aerosole übertragen [45]. In
den Alveolen werden die Mykobakterien von Alveolarmakrophagen (AM)
phagozytiert. Oberflächenrezeptoren der Makrophagen wie Komplementrezeptor 3
und Mannoserezeptor, CD14, Scavenger Rezeptor, Surfactant Protein A,
Mannose-binding Lectin und Dendritic Cell-Specific Intracellular adhesion
molecule-3-Grabbing
Non-integrin
(DC-SIGN)
detektieren
M.tb
[86].
Die
phagozytierten Mykobakterien im Phagosom werden nach der Fusion mit einem
Lysosom im sauren Milieu getötet, abgebaut und die Antigene prozessiert.
Die
Abtötung
der
intrazellulären
Mykobakterien
erfolgt
durch
folgende
Mechanismen:
1. toxische Stickstoff- und Sauerstoffintermediate [15]
2. Cathelicidin (antimikrobielle Peptide) [56]
3. humanes -Defensin 2 (hBD-2, antimikrobielle Peptide ) [55, 64]
4. Autophagozytose (Abbau zelleigener Bestandteile) [39]
5. ubiquitinierte Peptide im Autophagolysosom (Ort des Abbaus zelleigener
Bestandteile) [2]
Antimikrobielle Peptide (AMPs) wie Cathelicidin und hBD-2 sind induzierbare
AMPs und werden erst nach entsprechender Signalgebung exprimiert. Es handelt
sich um Oligopeptide (<50 Aminosäuren), die auf Grund ihrer amphipathischen
und kationischen Eigenschaften unspezifisch an Bakterienwände mit anionische
Phospholipiden binden und sie durchdringen. Dadurch wird die Lyse der Bakterien
hervorgerufen. Darüber hinaus verfügen sie über chemotaktische Eigenschaften.
Cathelicidin wird als Propeptid hCAP-18 exprimiert und nach proteolytischer
Bearbeitung entsteht das antimikrobiell aktive Peptid. Charakteristisch für hBD-2,
welches zu den β-Defensinen gehört, sind 3 strukturvermittelnde Disulfidbrücken
zwischen spezifischen Cysteinresten. Inwieweit die Sauerstoffspannung Einfluss
auf die Expression dieser AMP hat, ist bisher nicht bekannt.
1.4.3. Tuberkulose und Tumornekrosefaktor
Die Phagozytose von M.tb durch Makrophagen löst die Sezernierung von
Zytokinen und Chemokinen aus. Eine besondere Rolle in der Immunantwort
gegen Tuberkulose nimmt dabei das Zytokin Tumornekrosefaktor (TNF) ein. TNF
wird von membranständigen TNF Rezeptor 1 (TNFR 1) oder TNFR 2 gebunden
5
Einleitung
und löst damit diverse Signalkaskaden aus. Es kommt zur Aktivierung des
entzündungsfördernden Transkriptionsfaktor Nuklearer Faktor 'kappa-leichteKette-Verstärker' von aktivierten B-Zellen (NF-B) (Abb. 3).
Entzündung
Adhösionsmoleküle
Aktivierung von
Abwehrmechanismen in Mϕ
Chemokinexpression
Migration und Reifung von DCs
TNF
Wachstum intrazellulärer
virulenter M.tb
Granulomformation
MonozytenRekrutierung
Apoptose infizierter Mϕ
T-ZellRekrutierung
Abb. 3: Funktionen von TNF bei der Infektion mit M.tb
Des Weiteren ist TNF in Kombination mit IFN- an der Aktivierung antimikrobieller
Mechanismen muriner Makrophagen beteiligt, welche mit der Bildung von
reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) einhergeht [23].
Außerdem werden durch TNF die Expression von Adhäsionsmoleküle und
Chemokinen verstärkt, wodurch vermehrt DZ, T-Zellen und Monozyten rekrutiert
werden und Granulome entstehen [91]. Durch TNF kann es zudem zur ApoptoseInduktion infizierter Zellen kommen. TNF ist aber auch für verstärktes
intrazelluläres Wachstum in AMs verantwortlich [26, 54].
Veränderungen der Wirtsimmunität, sei es durch eine HIV Infektion [18], die
Anwendung
von
TNF
neutralisierenden
Antikörpern
beispielsweise
bei
rheumatoider Arthritis [47] oder andere immunsupprimierende Einflüsse führen zu
einem erhöhten Risiko der Tuberkuloseerkrankung.
1.4.4. Evasionsmechanismen von Mycobacterium tuberculosis
Obwohl Makrophagen mit vielfältigen antibakteriellen Effektormechanismen
ausgestattet sind, hat M.tb im Laufe der Evolution Evasionsmechanismen
entwickelt, um der angeborenen Immunantwort auszuweichen und in infizierten
Menschen Jahrzehnte zu persistieren. Von besonderer Bedeutung ist dabei der
6
Einleitung
Aufbau der mykobakteriellen Zellwand. Die lipidreiche Zellwand besteht zu großen
Teilen aus Mykolsäuren und Mykosiden. Mykoside sind mykolsäurehaltige
Glykolipide, wie zum Beispiel der Virulenzfaktor Trehalose-6,6-Dimykolat [35], der
durch die Inhibierung der Ca2+-induzierten Fusion von phagosomalen Vesikeln
den Abbau von M.tb verhindert [90]. Das Glykolipid Lipoarabinomannan (LAM) ist
ebenfalls ein wichtiger Bestandteil der Mykobakterienzellwand, welcher die
Signaltransduktion beeinträchtigt, die IFN- induzierte Gentranskription blockiert
[14] und die Phagosomenreifung inhibiert [16, 98].
Weitere Strategien, die von M.tb genutzt werden, um die Phagosomenreifung zu
verhindern sind:
 Die
Sekretion
der
Lipid-Phosphatase
SapM
in
das
Zytosol
des
Makrophagen [84]. Dadurch wird das zur Phagosomreifung notwendige
Membran-Verkehr regelnde Lipid Phosphatidylinositol-3-Phosphat (PI3P)
dephosphoryliert, womit die Pathogendegradierung verhindert wird [99].
 Die Protein-Tyrosin-Phosphatasen A und B werden ebenfalls von M.tb
sekretiert [37] und inhibieren die Phagosom-Lysosom Fusion, indem das
Regulatorprotein VPS33B dephosphoryliert wird [4].
 Die Serin/Threonin Kinase G (PknG) verhindert ebenfalls die PhagosomLysosom-Verschmelzung [101].
 M.tb manipuliert außerdem die Wirtszelle so, dass das Zellmembranprotein
Coronin1, auch TACO genannt, an die Membran des mykobakteriellen
Phagosoms rekrutiert wird. Es kommt zum Ca2+-Influx und die Calciumabhängige Phosphatase Calcineurin wird aktiviert und verhindert die
Phagosom-Lysosom-Verschmelzung [43].
7
Einleitung
1.4.5. Das tuberkulöse Granulom
Nach der Inhalation von M.tb (Abb. 4A) werden diese durch AM phagozytiert.
O2
A
B
Makrophage
T-Zelle
O2
B-Zelle
neutrophiler Granulozyt
Fibroblast
Mycobacterium tuberculosis
C
Abb. 4: Etablierung eines Granuloms nach Infektion mit M.tb und der damit verbundenen
Veränderung der Sauerstoffbedingungen. A) Aufnahme von M.tb. B) Modell eines Granuloms.
C) Interaktion von Makrophagen und M.tb innerhalb des Granuloms.
Durch die Antigene von M.tb wird ein inflammatorischer Prozess in Gang gesetzt.
Es kommt zur Ausschüttung von pro-inflammatorischem TNF durch die
Makrophagen, und dadurch zur Migration und Reifung von Dendrititschen Zellen
(DZ). Die DZ nehmen Mykobakterien auf, um sie zu degradieren und deren
Antigene zu prozessieren. Über die ableitenden Lymphbahnen wandern die DZ in
die Hiluslymphknoten, um dort den naiven T-Zellen Proteinantigene über MHC Iund MHC II-Moleküle, sowie Lipidantigene über CD1-Moleküle zu präsentieren [5,
7]. Bis die Effektor T-Zellen ihre Aufgaben am Infektionsort wahrnehmen,
vergehen ca. 15 bis 18 Tage [17]. In dieser Zeit haben die phagozytierten M.tb
eine hohe Replikationsrate. Die stimulierten T-Zellen proliferieren und wandern
entlang des Zytokingradienten von TNF und Chemokin (C-C Motiv) Ligand 5
8
Einleitung
(CCL5) [91, 67] zum Ort der Infektion, um dort als CD4+ Effektor-T-Zellen (TH1
Zellen) die infizierten Makrophagen mittels IFN- zu aktivieren und die
antimikrobiellen Effektormechanismen in infizierten Makrophagen zu aktivieren.
Neben CD4+ T-Zellen entstehen auch CD8+ zytotoxische T-Zellen. Diese Zellen
charakterisieren sich ebenfalls durch IFN- Sezernierung [46] und können
zusätzlich
intrazelluläre
Mykobakterien
mittels
Granulysin-
und
Perforinausschüttung abtöten [93].
Nach Aktivierung der zellulären Immunantwort am Infektionsort kommt es neben
der T-Zellrekrutierung auch zur Einwanderung weiterer Monozyten [91]. Es
entsteht ein Granulom. Es baut sich ein organisiertes Zellkonglomerat auf,
welches durch die infizierten Makrophagen im Zentrum charakterisiert ist (Abb.
4C). Die verschiedenen T-Zellpopulationen liegen im äußeren Bereich des
Granuloms. Es akkumulieren außerdem Neutrophile und B-Zellen in tuberkulöse
Granulome (Abb. 4B). Die entstandene Balance aus Wirtsabwehr- und
Erregermechanismen, welche die latente Tuberkulose charakterisiert, ist jedoch
sehr fragil. Veränderungen der Wirtsimmunität, sei es durch eine HIV Infektion
[18], die Anwendung von TNF neutralisierenden Antikörpern beispielsweise bei
rheumatoider Arthritis [47] oder andere immunsupprimierende Einflüsse führen zu
einem erhöhten Risiko der Reaktivierung der persistierenden Mykobakterien.
1.4.6. Hypoxie im Granulomen
Der Sauerstoffgehalt am Ort der Interaktion zwischen Zellen des Immunsystems
und dem Erreger innerhalb des Granuloms hat einen wichtigen Einfluss auf die
Biologie von M.tb [36, 10, 100]. Der Einfluss von Hypoxie auf latente Tuberkulose
[83] wurde in verschiedensten Tiermodellen, wie Maus [100, 96], Kaninchen [58],
Meerschwein und Affe [100] untersucht. Dabei wurde in allen Tiermodellen, mit
Ausnahme der Maus, hypoxische Bedingungen in den tuberkulösen Granulomen
nachgewiesen [100].
Ob M.tb in Granulomen als aktiv teilende Mykobakterien vorhanden sind, oder sich
in einem Ruhezustand der als Dormanz bezeichnet wird [75] vorliegen, ist noch
unklar. So finden sich in ein und demselben Individuum aktive und dormante
Formen [44, 22]. In Untersuchungen von granulomatösen Resektionen aus
Tuberkulose erkrankten Patienten zeigten sich unterschiedliche Zustandsformen
von M.tb. [97].
9
Einleitung
Es ist anzunehmen, dass neben der Leistungsfähigkeit des Immunsystems eines
latent infizierten Patienten, auch der Sauerstoffgehalt am Infektionsort eine
entscheidende Rolle bei der Immunantwort gegen Tuberkulose spielt. Ob die
Sauerstoffspannung Einfluss auf die angeborene Immunantwort gegen M.tb hat,
wurde in dieser vorliegenden Arbeit näher untersucht.
10
Einleitung
1.5. Ziele der Arbeit
Nach der Inhalation wird M.tb von Makrophagen phagozytiert und die erworbene
Immunantwort initiiert. Es entwickeln sich Granulome, die durch niedrigere O2Spannung charakterisieren sind.
Unsere Hypothese war, dass die O2-Spannung die Immunabwehr moduliert und
dadurch das Wachstum von M.tb in Makrophagen beeinflusst.
Diese Hypothese wurde überprüft, in dem humane Makrophagen mit virulenten
Mykobakterien infiziert wurden und folgende Parameter bestimmt wurden:
Phagozytose, Zytokinfreisetzung, Expression von antimikrobiellen Peptiden und
intrazelluläres Überleben.
Übergeordnetes Ziel der durchgeführten Experimente war es, unser Verständnis
über die Interaktion von humanen Makrophagen und M.tb bei Hypoxie zu
vertiefen.
11
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Reagenzien und Chemikalien

2-Propanol (Isopropanol)
Roth, Karlsruhe

3
Amersham Biosciences,
H-Uracil
Freiburg

Ammoniumchlorid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ammoniumperoxodisulfat
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Amphotericin B
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

aqua dest
B. Braun, Petzold GmbH

Auramin-Rhodamin
Merck, Darmstadt

BacLight
Molecular Probes

DFO
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Dimethylsulfoxid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Dithiothreitol
Roth, Karlsruhe

Entwicklerlösung (ECL plus)
GE Healthcare, Wien

Ethylendiamintetraessigsäure
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Ficoll-Paque-Plus
GE Healthcare, Wien

Fötales Kälberserum
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Glycerol
Roth, Karlsruhe

Glycin
Merck, Darmstadt

H2SO4
Roth, Karlsruhe

HCl
Roth, Karlsruhe

2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]Ethansulfonsäure (HEPES)
Biochrom, UK

Humanserum AB
Cambrex, USA

Isopropanol
Roth, Karlsruhe

L-Glutamin
Seromed, Berlin

Mercapto-Ethanol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Merretich-Peroxidase (biotinyliert)
Invitrogen, Darmstdt

Methanol
Roth, Karlsruhe

Middlebrook 7H9 Medium
BD, Heidelberg

Middlebrook OADC
BD, Heidelberg
12
Material und Methoden

Milchpulver
Roth, Karlsruhe

Natriumazid
Roth, Karlsruhe

Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe

Natriumdeoxycholat
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Natrium-Dodecylsulfat
Roth, Karlsruhe

Natriumhydrogencarbonat
Merck, Darmstadt

NP-40
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Paraformaldehyd
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

PBS
PAA, Österreich

Penicillin
Biochrom, UK

Phenylmethylsulfonylfluorid
Roth, Karlsruhe

Protease-Inhibitor-Cocktail Tabletten
Roche, Mannheim

Proteinmarker
Fermentas, St. Leon-Rot

Rifampicin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Rinderserumalbumin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)
Roth, Karlsruhe

RPMI 1640
Invitrogen, Darmstadt

Saponin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Sepharose Protein G-4B
Invitrogen, Darmstadt

Sodium Dodecylsulfat
Roth, Karlsruhe

Streptavidin
Invitrogen, Karlsruhe

Streptomycin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Tetramethylbenzidin
Thermo Scientific,USA

Tetramethylethylendiamin
Roth, Karlsruhe

Trichlormethan (Chloroform)
Roth, Karlsruhe

Tris
Roth, Karlsruhe

Triton-X-100
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Trizol
Invitrogen, Darmstadt

Trypanblau
Lonza, Schweiz

Tween-20
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Tween-80
Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Urea
Roth, Karlsruhe
13
Material und Methoden
2.1.1.1. Kits, Reagenzmischungen und Enzyme

DNase I
New England Biolabs, USA

dNTPs
Roche, Mannheim

Human IL-10 Duo Set (ELISA)
R&D, Wiesbaden

LDH Zytotoxizitäts-Detektions-Kit
Clontech, USA

LightCycler FastStart DNA Master
Roche, Mannheim
nfSYBR Green I

Neubauer Zählkammer
Marienfeld, LaudaKönigshofen

oligo(d)t Primer für PCR

PageRuler
New England Biolabs, USA
(vorgefärbte Standard Proteinmischung)

Fermentas, St. Leon-Rot
Reverse Transkriptase und
5-fach Reaktionspuffer
Fermentas. St. Leon-Rot
2.1.1.2. Antikörper und Zytokine

anti-hu-CCL-5 biotinyliert
R&D, Wiesbaden

anti-hu-CCL-5 coating
R&D, Wiesbaden

anti-hu-CD14-APC
Caltag, Hamburg

anti-hu-CD3-PE
Caltag, Hamburg

anti-hu-HIF-1a
BD, Heidelberg

anti-hu-IL-12 biotinyliert
R&D, Wiesbaden

anti-hu-IL-12 coating
eBioscience, USA

anti-hu-MHCII-FITC
Invitrogen, Darmstadt

anti-Maus-HRP
Cell Signalling Technologie

anti-TNF biotinyliert
ENDOGEN, USA

anti-TNF coating
ENDOGEN, USA

Maus IgG2a-APC
Caltag, Hamburg

Maus IgG2a-PE
Caltag, Hamburg

Maus IgG2b-FITC
Invitrogen, Darmstadt

rhu CCL-5
R&D, Wiesbaden

rhu GM-CSF
Leukine, USA

rhu IL-12
R&D, Wiesbaden

rhu TNF-α
Strathmann, Hamburg
14
Material und Methoden
2.1.1.3. Synthetische Oligonukleotide

hBD-2 forward
5´-GGT GTT TTT GGT GGT ATA GGC G-3´

hBD-2 reverse
5´-AGG GCA AAA GAC TGG ATG ACA-3´

Cathelicidin forward
5´-GGA CCC AGA CAC GCC AAA-3´

Cathelicidin reverse
5´-GCA CAC TGT CTC CTT CAC TGT GA-3´

VDR forward
5´-AAG GAC AAC CGA CGC CAC T-3´

VDR reverse
5´-ATC ATG CCG ATG TCC ACA CA-3´

h36B4 forward
5´- CCACGCTGCTGAACATGCT -3´

h36B4 reverse
5´- TCGAACACCTGCTGGATGAC -3´
Die verwendeten Primer wurden von der Firma Thermo Scientific in Ulm
hergestellt.
2.1.2. Arbeitsgeräte

Beta-Counter
Berthold, München

Blotting-Apparatur B33
Biometra, Göttingen

Entwickler Curix60
AGFA, Belgien

FACScalibur Durchflusszytometer
BD, Heidelberg

Gelkammer Minigel-Twin
Biometra, Göttingen

Hypoxiekammer
Töpffer GmbH, Stuttgart

Inkubator 6000
Heraeus, Bonn

Lichtmikroskop 40CFL
Zeiss, Jena

Lichtmikroskop CH-2
Zeiss, Jena

LightCycler 3.5.3
Roche, Mannheim

Mikrotiterplatten-Photometer
Biochrom, UK

Power Pac P25
Biometra, Göttingen

Rollenmischer SRT1
Stuart Scientific

Rollerinkubator Incudrive
Schütt, Göttingen

Thermoblock 5320
Eppendorf, Hamburg

Ultraschallwasserbad
Elma, Singen

Wasserbad
Köttermann, Uetze/Hänigsen

Zentrifuge 5417R
Eppendorf, Hamburg

Zentrifuge 5810R
Eppendorf, Hamburg
15
Material und Methoden
Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurden in einer Hypoxiekammer
durchgeführt (Abb. 5A).
A
Abluftsystem
Hypoxiekammer
B
SauerstoffSteuereinheit
C
D
Schleuse
Inkubationsschrank
Abb. 5: Hypoxiekammer im S3-Labor. A) Hypoxiekammer mit Neoprenhandschuhen und
Anschluss an das Entlüftungssystem im S3-Labor. B) Steuereinheit der Sauerstoffspannung. C)
Schleuse zum Einbringen der Arbeitsmaterialien in die Kammer. D) Inkubationsschrank und
Heizung zur Durchführung von Zellkulturexperimenten innerhalb der Hypoxiekammer.
16
Material und Methoden
Die
Hypoxiekammer
ermöglicht
es
dem
Experimentator
eine
definierte
Atmosphäre zu schaffen. Innerhalb der Kammer wird der Sauerstoff der
Erdatmosphäre durch das Hintergrundgas Stickstoff verdrängt. Neben der
Regulierung (Abb. 5B) des Sauerstoffs ist es notwendig, Zellkulturbedingungen in
der Kammer zu gewährleisten. Deshalb wird neben Stickstoff auch CO 2 in die
Kammer geleitet und die Temperatur mittels einer Heizung (Abb. 5D) auf 37ºC
gehalten. Zusätzlich ist in der Kammer ein Inkubationsschrank eingerichtet. Dieser
besteht aus einem Regalsystem, in denen die Zellen inkubiert werden können und
in dem auch der „feuchte Kammereffekt“ realisiert wird. Die Zellen und
Reagenzien und weitere benötigte Arbeitsmaterialien werden über eine Schleuse
(Abb. 5C) in die Kammer eingeführt. Dies ist notwendig, um den Sauerstoffgehalt
in der Kammer konstant zu halten. Damit innerhalb der Kammer auch mit dem
virulenten Mycobacterium tuberculosis Stamm H37Rv gearbeitet werden kann, ist
die Kammer über ein Abluftsystem an die Sicherheitsstandards eines S3Sicherheitslabors angepasst. Die Arbeit in der Kammer wird durch einen Einsatz
für Neoprenhandschuhe ermöglicht.
2.1.3. Verbrauchsmaterialien

7H11 Kulturplatten
Nährbodenküche, Institut für
Medizinische Mikrobiologie
und Hygiene,
Universitätsklinikum Ulm

8-Chamberslides
Nunc, Langenselbold

Deckgläser 24x50mm
Marienfeld, LaudaKönigshofen

Einmalfilter, 0,22μm
Millipore, Darmstadt

Einmalspritzen
BD, Heidelberg

ELISA-Platten (96 well)
Nunc, Langenselbold

FACS-Röhrchen
Sarstedt, Nürnbrecht

PVDF-Membran
Millipore, Darmstadt

Reaktionsgefäße 0,5, 1,5 ml und 2 ml
Eppendorf, Hamburg

Roller-Flaschen
Greiner, Frickenhausen

Schraubröhrchen, 1,5ml
Roth, Karlsruhe

Schraubröhrchen, 15ml
BD, Heidelberg
17
Material und Methoden

Schraubröhrchen, 50ml
BD, Heidelberg

Whatman-Papier
Amersham, Freiburg

Zellkulturflaschen, 75cm2
BD, Heidelberg

Zellkulturplatten, 24 well
BD, Heidelberg

Zellkulturplatten, 6 well
BD, Heidelberg

Zellkulturplatten, 96 well
Nunc, Langenselbold
2.1.4. Bakterien

Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene,
Universitätsklinikum Ulm
2.1.5. Medien und Puffer
2.1.5.1. Zellkulturmedium für PBMC

RPMI 1640, 10 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin, 60 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml
Streptomycin und 5% hitzeinaktiviertes Humanserum.
2.1.5.2. Medium für die bronchoalveoläre Lavage (BAL-Medium)

RPMI 1640, 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 5,6 μg/ml Amphotericin B
und 10% nicht hitzeinaktiviertes Humanserum. Dieses Medium wurde für
alle Experimente mit infizierten Makrophagen verwendet.
2.1.5.3. Waschmedium für die Isolation von PBMC aus Buffy-Coats

400 ml PBS, 100 ml RPMI 1640 mit 10 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin, 60
µg/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 2% FCS (Waschserum)
2.1.6. Waschmedium für infizierte Makrophagen

8 ml PBS, 2 ml BAL-Medium
2.1.6.1. Standardzellkulturbedingungen

Heraeus-Inkubator, 37°C,20% O2, 5% CO2
2.1.6.2. Medium für die Anzucht von Mykobakterien (7H9-Medium)

2,35g 7H9 BBL Middlebrook, 5ml Glycerol, 50ml OADC, 1,25ml einer 20%
Tween 80 Lösung, mit aqua bidest auf 500 ml auffüllen (pH 6,8), steril
filtrieren.
18
Material und Methoden
2.1.6.3. Blockierungspuffer für ELISA

CCL-5: PBS, 1% BSA, 0,05% NaN3

IL-10/IL-25: PBS, 1% BSA

TNF: PBS, 2% BSA
2.1.6.4. Waschpuffer für ELISA

CCL-5/IL-10: PBS, 0,05% Tween 20

IL-12: PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween 20

TNF: PBS, 0,1% BSA, 0,2% Tween 20
2.1.6.5. Stoplösung für ELISA

0,18 M H2SO4
2.1.6.6. Durchflusszytometrie-Puffer

PBS, 2 % FCS, 0,1 % NaN3
2.1.6.7. Puffer für HIF-1 Westernblot

Lysispuffer: 7 M Urea, 1% SDS, 10% Glycerol, 10 mM Tris (auf pH 6,8
einstellen), 1 Tablette Complete Protease Inhibitor Cocktail, 0,09g PMSF,
38,85 mg DTT, mit aqua bidest auf 50 ml auffüllen

Trenngel (12%) aqua bidest (2,3 ml), Rotiphorese Gel 30 (1,3 ml), 1,5 M
Tris-HCl pH 8,8 (1,3 ml), 10%-iges SDS (0,05 ml), APS (0,05ml), TEMED
(0,003 ml)

Sammelgel: aqua bidest (1,4 ml), Rotiphorese Gel 30 (0,33 ml), 1 M TrisHCl pH 6,8 (0,25 ml), 10%-iges SDS (0,02 ml), APS (0,02ml), TEMED
(0,002 ml)

SDS-Laufpuffer: 50 mM Tris, 384 mM Glycin, 0,1% SDS, aqua bidest

Blotting-Puffer: 25 mM Tris, 192 mM Glycin, aqua bidest

Waschpuffer: 10 mM Tris/HCl pH 7,4, 0,15 mM NaCl, 0,2% Tween 20, aqua
bidest

Blockierungspuffer: 3% Magermilch in Waschpuffer gelöst

Probenpuffer: 125mM Tris/HCl, pH 7,8, 20% Glycerol, 4% SDS,
Mercapthoethanol (1ml), 100mM DTT, Bromphenolblau 0,2mg/ml
19
Material und Methoden
2.2. Methoden
2.2.1. Zellbiologie
2.2.1.1. Isolierung von PBMC aus Buffy-Coats
PBMC wurden mittels Dichte-Gradienten Zentrifugation aus Buffy-Coats des
Deutschen Roten Kreuzes (DRK) isoliert. Die Buffy-Coats wurden mit PBS auf
200ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Anschließend wurden 25 ml der Blutsuspension
vorsichtig auf 15 ml des Dichtegradienten Ficoll-Paque Plus (1,077 g/L) pipettiert.
Das Zentrifugieren des 50 ml Falcon-Tubes erfolgt für 30 min bei 1600 UpM mit
ausgeschalteter Bremse, um Scherkräfte zu verhindern. Das im Ficoll enthaltene
Natrium-Ditrizoat führt effizient zur Aggregation und damit zur Sedimentation der
Erythrozyten. Die schwache Hypertonie des Ficolls erhöht die Dichte von
Granulozyten, so dass auch diese Zellpopulation sedimentieren. Lymphozyten,
Monozyten und Thrombozyten konzentrieren sich in einer schmalen Interphase
zwischen Ficoll und Plasma. Um die Zellen von Ficoll und Thrombozyten zu
befreien, wurde die Interphase in ein neues 50 ml Falcon-Tube überführt und bei
1800 UpM für 10 min pelletiert. Es folgten weitere Waschschritte bei 1300 UpM,
1000 UpM, für 10 min und 3x bei 800 UpM für je 8min. Schließlich wurden die
Zellen in einer Zählkammer gezählt. Die Zelldichte wurde auf 100x106 Zellen/ml
mit Zellkulturmedium eingestellt.
2.2.1.2. Generierung von Makrophagen aus PBMC
Im Gegensatz zu anderen PBMC adhärieren Monozyten an Plastik, wodurch sie
sich gut von den übrigen Leukozyten trennen. Hierbei wurde eine Zellsuspension
bestehend aus 80x106 PBMC gelöst in 6 ml Zellkulturmedium in einer 75 cm2
Kulturflasche ausgesät und 60 min unter Standardkulturbedingungen inkubiert. Die
nicht adhärierenden Lymphozyten wurden durch vorsichtiges Klopfen der
Kulturflaschen und bei gleichzeitigem Waschen mit 5 ml PBS entfernt. Dieser
Arbeitsschritt wurde 3-mal ausgeführt. Um eine synchronisierte Reifung der
adhärenten Monozyten zu gewährleisten, wurden diese mit GranulozytenMakrophagen Kolonie stimulierendem Faktor (GM-CSF, 1000U/ml) in 7 ml
kompletten Medium mit 5 % Humanserum für 5-6 d bei 37°C inkubiert. Die
gereiften Makrophagen wurden durch kräftiges Resuspendieren und durch 20minütige Inkubation mit dem Calcium-Chelator EDTA (1mM) vom Plastik gelöst.
20
Material und Methoden
Die Makrophagen wurden bei 1300 UpM für 10 min zentrifugiert und in BALMedium resuspendiert.
2.2.1.3. Charakterisierung von Makrophagen mittels Durchflusszytometrie
Um
die
aufgereinigten
Zellpopulationen
zu
definieren,
wurde
die
Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting; FACS) verwendet.
Hierbei werden die Zellen durch eine Kapillare an einem Laser vorbeigeführt. Die
Beschaffenheit der Zelle beeinflusst das resultierende Streulicht, welches von
Detektoren gemessen wird. Das emittierte Licht lässt auf die analysierte Zelle
schließen. So unterscheiden sich z.B. T-Zellen von Makrophagen in ihren
Vorwärts-Seitwärts-Streulichtmustern. Die Größe einer Zelle verändert das
Vorwärts-Streulicht und die Granularität einer Zelle das Seitwärts-Streulicht. Dies
Unter Verwendung von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern wird die Expression
von Antigenen in einer Zellsuspension näher definiert. Es sind mehrere Laser im
Durchflusszytometer installiert, die die Fluorochrome anregen. Das emittierte Licht
wird von Detektoren registriert. Makrophagen sind durch die Oberflächenproteine
von MHC II und CD14 charakterisiert. Mögliche Kontaminationen der generierten
Makrophagen mit T-Zellen, welche sich durch den Oberflächenproteinkomplex
CD3 charakterisieren, wurden bestimmt. Durch die Verwendung spezifischer
Antikörper gegen MHC II, CD14 und CD3 wurden in ausgewählten Experimenten
die Reinheit und die Reifung der generierten Makrophagen überprüft (CD3<10%).
2.2.1.4. Anzucht von Mycobacterium tuberculosis
Zur Kultur von M.tb (virulenter Stamm H37Rv) wurden Rollkulturflaschen mit 7H9
Medium befüllt, mit einem Inokulum von H37Rv angeimpft und unter ständigem
Drehen der Kulturflaschen in einem beheizbaren Rollerinkubator bei 37ºC
bebrütet. Die Bakterien der logarithmisch wachsenden Kulturen wurden geerntet
und als Aliquots in PBS mit 10% Glycerol bei -70°C eingefroren. Die Konzentration
an Mykobakterien wurde mittels Plattierung einer Verdünnungsreihe auf 7H11
Platten und der Bestimmung der KBE nach 14-tägiger Bebrütung ermittelt. Mittels
BacLight-Färbung der Mykobakterien wurde die Vitalität der Bakterien bestimmt,
welche über 90% war. Um in Infektionsversuchen die Infektionsrate der
Makrophagen konstant zu halten, wurden die M.tb-Aliquots wegen ihrer Neigung
zur Aggregatebildung 10 min im Ultraschall-Wasserbad bei 37°C beschallt. Die
Aggregat-freien Mykobakterien wurden anschließend in Kulturmedium verdünnt
21
Material und Methoden
und in der gewünschten Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection; MOI)
verwendet.
2.2.2. Viabilität der Mykobakterien
Die BacLight Färbung besteht aus den Farbstoffen Sytol 9 und Propidiumiodid (PI)
und ermöglicht die Differenzierung von toten und lebendigen Mykobakterien.
Beide Farbstoffe interkalieren in die DNA, jedoch kann Propidiumiodid nur dann
Zellwände passieren, wenn diese defekt sind (tote Bakterien). PI verdrängt das
Sytol 9 in diesen Bakterien. Bei der Quantifizierung der Vitalität der Mykobakterien
mittels
Fluoreszenzmikroskop
leuchten
lebendige
Zellen
grün
(Emmisionsmaximum von Sytol 9: 500 nm) und die toten Zellen rot
(Emissionsmaximum von PI: 635 nm). Eine definierte Menge an M.tb werden im
37°C warmen Wasserbad 10 min beschallt. Danach werden 100µl der
Bakteriensuspension mit 50 µl BacLight-Färbelösung gemischt und 15 min bei
Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Es folgen drei Waschschritte mit 1ml PBS
bei 3200 UpM für 20 min. Das Pellet wird in Zellkulturmedium mit 10% FKS
aufgenommen und auf einem Objektträger aufgebracht und mittels Nagellack
luftdicht versiegelt. Anschließend erfolgt die Analyse am Fluoreszenzmikroskop.
2.2.2.1. Phagozytose durch Makrophagen
BAL-Medium wurde in die Kammern von 8-chamberslides vorgelegt und je 1,5x105
Makrophagen pro Kammer verteilt. Das Gesamtvolumen betrug dabei 200 µl. Die
adhärenten Makrophagen wurden 30 min bei 1% oder 20% Sauerstoff inkubiert,
um sie an die Sauerstoffspannungen zu adaptieren. Anschließend erfolgte die
Infektion mit M.tb. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Makrophagen mit 300
µl PBS gewaschen, um extrazelluläre Mykobakterien zu entfernen. Es folgte ein
20-minütiger
Fixierungsschritt
mit
4%
Paraformaldehyd
(PFA).
Um
die
Phagozytoserate der Makrophagen zu bestimmen, wurden die intrazellulären
Mykobakterien
mit
Auramin-Rhodamin
gefärbt.
Pro
Spender
und
Sauerstoffbedingung wurden 200 Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 630facher Vergrößerung analysiert.
22
Material und Methoden
2.2.2.2. Auramin-Rhodamin-Färbung von Mykobakterien.
Die infizierten Makrophagen und Mykobakterien werden nach 24 h Inkubation mit
PFA (Endkonzentration 4%) in einer 8-chamberslides 20 min fixiert. Anschließend
folgt die Lufttrocknung des Objektträgers. Dieser wird dann 15 min in einer
Auramin-Rhodamin-Lösung im Dunkeln inkubiert. Es folgt ein 10 minütiger
Waschschritt mit Wasser. Die Zellen werden dann mittels Entfärbelösung für ca. 2
min entfärbt. Danach werden die Zellkerne mittels Kaliumpermanganat 5 min
gegengefärbt. Nach dem Waschen wird das Präparat luftgetrocknet und mit
Aquatex eingedeckelt.
2.2.2.3. Messung der Stoffwechselaktivität extrazellulärer M.tb
Die Stoffwechselaktivität von M.tb wurde durch die Inkorporation der PyrimidinBase Uracil in die RNA untersucht. Die Messung des radioaktiv markiertem 3HUracil an einem Beta-Counter spiegelt das Maß an Stoffwechselaktivität in M.tb
wider. Die Mykobakterien wurden für 10min bei 37°C im Ultraschall-Wasserbad
beschallt. Anschließend wurden 2x106 Mykobakterien in einem Volumen von 90 μl
7H9 Medium in eine 96-well Platte pipettiert. Als Positivkontrolle für den inhibierten
Stoffwechsel von M.tb wurde das Tuberkulostatikum Rifampicin (2 µg/ml)
verwendet. Die 96-well Platten wurden anschließend für 3 d bei 20%, 3% oder 1%
Sauerstoff inkubiert. Danach wurden die Mykobakteriensuspensionen mit 1 μCi
3
H-Uracil für weitere 24 h inkubiert. Danach wurden die Mykobakterien durch eine
8%-ige Paraformaldhydlösung abgetötet und 30 min inkubiert. Anschließend
erfolgte die Messung der 3H-Uracil Aufnahme am Beta-Counter.
2.2.2.4. Untersuchung des intrazellulären Wachstums von Mycobacterium
tuberculosis
Für die Untersuchung des intrazellulären Wachstums von M.tb wurden 2 wells mit
je 3x106 Makrophagen in einer 6 well Platte in einem Volumen von je 3 ml BALMedium verteilt und infiziert (MOI 5). Nach 16-18 Stunden wurden die Überstände
abgenommen und die Zellen dreimal mit 2 ml PBS gespült, um anschließend die
adhärenten Makrophagen mit PBS/EDTA (1 mM) für 20 min bei Raumtemperatur
zu inkubieren. Die Zellen wurden geerntet, bei 1300 UpM für 10 min pelletiert und
zweimal mit Waschmedium gewaschen und in BAL-Medium aufgenommen. Im
Anschluss wurden 1x105 Makrophagen in 300 µl in 24 well Platten verteilt. Die
Zellen wurden dann bei 20%, 3% oder 1% Sauerstoffspannung für 6 d inkubiert.
23
Material und Methoden
Zur Lyse der Zellen wurden jedem Ansatz 30 µl Saponin (Endkonzentration 0,3%)
gegeben und für 10 min inkubiert. Die Lysate wurden resuspendiert, geerntet und
10 min im Ultraschallbad beschallt. Anschließend wurden Verdünnung (pur, 1:10,
1:100, und 1:1000) hergestellt und auf 7H11 Platten mit Impfösen ausplattiert. Die
Platten wurden 14 d bei Standardkulturbedingungen inkubiert und die Anzahl an
Koloniebildenden Einheiten bestimmt.
2.2.2.5. Viabilität von Makrophagen
Um
die
Viabilität
von
Makrophagen
zu
analysieren,
wurde
ein
Laktatdehydrogenase-Aktivitätsassay mit einem Laktatdehydrogenase (LDH)
Cytotoxicity Detection Kit durchgeführt. Das stabile zytoplasmatische Enzym dringt
beim
Zelltod
durch
die
permeabilisierte
Zellmembran
ins
Medium.
Die
Aktivitätsmessung von LDH ermöglicht die Bestimmung des Anteils an vitalen
Zellen. Dafür wurden pro Sauerstoffbedingung je eine 24-well Platte präpariert.
Pro Ansatz wurden 1x105 Makrophagen in einem Gesamtvolumen von 500 µl/well
verteilt. Es wurden die Ansätze mit und ohne Infektion mit M.tb in Triplikaten
vorbereitet. Die Makrophagen wurden dann jeweils bei 20%
oder 1%
Sauerstoffspannung inkubiert und infiziert. Nach 6 Tagen Inkubationzeit wurden
die Positiv-Kontrollen mit Triton X-100 (Endkonzentration 1%) für 10 min inkubiert.
Anschließend
wurden
200
µl
Überstand
in
ein
autoklaviertes
1,5
ml
Schraubröhrchen überführt und 10 min bei 1300 UpM zentrifugiert. In der
Zwischenzeit wurde das Reaktionsgemisch des Kits frisch angesetzt (für 100
Ansätze: 11,25 ml Farblösung und 250 µl Katalysatorlösung). 100 µl der
zentrifugierten Überstände wurden in eine 96 well Rundbodenplatte überführt und
mit 100 µl des frischen Reaktionsgemisches versetzt. Die Umwandlung von
Tetrazoliumsalz zum farbigen Formazansalz erfolgte in einem 20-30-minütigen
Inkubationsschritt bei Raumtemperatur, im Dunkeln. Die Mykobakterien der
Reaktionsüberstände
wurden
zur
Abtötung
mit
100
µl
einer
8%-igem
Paraformaldehydlösung für 20 min in einer 96-well ELISA-Platte inkubiert.
Anschließend wurde die Absorbtion bei der Wellenlänge von 492 nm und der
Referenzwellenlänge von 620 nm gemessen. Der Anteil an viablen Zellen
errechnete sich wie folgt:
1.)
Mittelwert d. Triplikate (infiziert o. uninfiziert) – Mittelwert d. Mediumkontrollen
=X
Mittelwert d. Triplikate der Positiv-Kontrolle – Mittelwert d. Mediumkontrollen
24
Material und Methoden
2.) X * 100 = Y%
3.) 100% – Y% = Anteil an viablen Zellen
2.2.3. Proteinbiochemie
2.2.3.1. Westernblot-Analyse
Zum Nachweis von HIF-1 wurden 1-2x106 Makrophagen in einer 24 well Platte
für 24 h bei 20% oder 1% Sauerstoff inkubiert. Der Überstand wurde
abgenommen, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 200 µl
Lysispuffer lysiert. Die Zelllysate wurden in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und
ca. 10 s gevortext und 30 min bei 80ºC erhitzt. Anschließend folgte ein
Zentrifugationsschritt für 10 min bei 4ºC und 14000 UpM. 25 µl der Überstände
wurden mit 5 µl Probenpuffer versetzt und in die Taschen des Sammelgels
geladen. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurde mit einem 12%-igen
Trenngel bei 30 mA für 90 min durchgeführt. Für den anschließenden
Blottingschritt im horizontalen Semi-dry Blot-System wurde eine PVDF-Membran
kurz in Methanol inkubiert und umgehend in Wasser gewaschen, um sie zu
hydrophilisieren. Die Membran wurde anschließend in Blotpuffer equilibriert. Auf 3
in Blotpuffer getränkte Whatmannpapiere wurde die PVDF-Membran gelegt (Abb.
6),
Anode
Filterpapier
PVDF-Membran
SDS-PAGE-Gel
Filterpapier
Kathode
Abb. 6: Semidry Western blot Anordnung
darauf das Gel aus der PAGE und zum Abschluß drei in Blotpuffer getränkte
Whatmannpapiere.
Der
gesamte
Aufbau
sollte
luftblasenfrei
sein.
Der
Proteintransfer verläuft über ein senkrecht zum Gel gerichtetes elektrisches Feld
und wurde für mindestens 1,5 h bei 300 mA durchgeführt. Die Proteine sind durch
25
Material und Methoden
das SDS negativ geladen und wandern deshalb durch das Gel Richtung Pluspol.
Dabei werden sie an die PVDF-Membran gebunden. Die Membran wurde danach
30 sec in Methanol geschwenkt und 15 min luftgetrocknet. Anschließend musste
die Membran in Waschpuffer 3x5 min gewaschen werden, um sie danach 1 h bei
Raumtemperatur in Blockierungspuffer zu inkubieren. Es folgten erneut 3
Waschschritte. Die Membran wurde mit dem Primärantikörper anti-HIF-1,
welcher in Blockierungspuffer 1:1000 verdünnt ist, über Nacht bei 4ºC auf einem
Rollermixer inkubiert. Die Membran wurde 3x5 min gewaschen. Die Detektion des
Primärantikörpers
erfolgte
mit
dem
anti-Maus
HRP-konjugierten
Sekundärantikörper. Die Membran wurde nicht länger als 2 h mit dem
Sekundärantikörper inkubiert. Erneut folgten Waschschritte und die anschließende
1-minütige
Inkubation
mit
Entwicklungslösung.
Die
Entwicklung
eines
lichtempfindlichen Films erfolgte in der Dunkelkammer.
2.2.3.2. Messung der Zytokinfreisetzung
Zur Messung von Zytokinen wurden 5x105 Makrophagen pro well in 24-well
Platten verteilt und 1 h bei Standardkulturbedingungen adhäriert. Anschließend
erfolgte die Stimulation der Zellen mit Extrakt aus M.tb (10 µg/ml) oder LPS (100
pg/ml) (Abb. 7).
Mϕ
stimulieren/infizieren
24 h Inkubation bei 20%
oder 1% Sauerstoff
Überstände abnehmen
und Sterilkontrollen
durchführen
mit Zellüberständen
inkubieren (1-2 h)
mit Blockierungspuffer
blockieren (1-2 h)
ELISA-Platten mit coating
Antikörpern inkubieren
(ü.N.)
mit biotinylierte
Antikörper inkubieren (12 h)
mit StreptavidinPeroxidase –Komplex
inkubieren (20-30 min)
mit Substrat entwickeln,
mit Stoplösung abrechen
und am ELISA-Reader
messen
Abb. 7: Zytokinmessung in Zellüberständen mittels ELISA
Zusätzlich wurden die Makrophagen mit M.tb infiziert. Als Kontrolle fungierten
Ansätze mit unbehandelten Makrophagen. Nach 24-stündiger Inkubation wurden
die Überstände abgenommen und mit 1 ml Spritzen und Spritzenfilter (0,2 µm)
26
Material und Methoden
steril filtriert. Zur Sterilkontrolle wurden 10 µl des Überstandes auf 7H11 Platten
plattiert und 14 Tage inkubiert.
Die Durchführung der ELISAs erforderte zwischen den Arbeitsschritten stets
Waschschritte. Für die Standardreihen wurden rekombinante humane Proteine
verwendet.
Als
Substrat
diente Tetramethylbenzidin.
Den Zeitpunkt
des
Abstoppens der Entwicklung wurde anhand der Färbung des Standards
abgeschätzt. Die Entwicklungszeit sollte aber innerhalb von max. 30 min beendet
werden. Die Analyse der ELISAs erfolgte mit einer Wellenlänge von 450 nm und
der Referenzwellenlänge 620 nm. Die Auswertung erfolgte in EXCEL.
2.2.4. Molekularbiologie
2.2.4.1. RNA Isolation
In einer 6-well Platte wurden 2-mal 3x106 Makrophagen ausgesät und entweder
mit M.tb (MOI 5) infiziert oder blieben uninfiziert. Diese Zellen wurden 16-18 h bei
Standardkulturbedingungen
inkubiert.
Anschließend
wurden
extrazelluläre
Mykobakterien mit PBS weggewaschen und die adhärenten Makrophagen mit
PBS/EDTA (1mM) geerntet. Es folgten drei Waschschritte mit Waschmedium bei
1300 UpM für 10 min. Die geernteten Zellen wurden jeweils in 1,8 ml BAL-Medium
aufgenommen. Der Verlust an Makrophagen nach dem Ernten beträgt ca. 50%.
Es wurden jeweils 0,75x106 infizierte und uninfizierte Makrophagen in zwei 24 well
Platten verteilt (Abb. 8).
Mϕ
stimulieren/infizieren
24 h Inkubation bei
20% oder 1%
Sauerstoff
Zelllyse mittels Trizol
Waschen der RNA
Präzipitation der RNA
Phasentrennung
Lösen der RNA
Verwendung für
quantitative
LightCycler PCR
Abb. 8: Isolation der RNA
27
Material und Methoden
Nach 24 h Inkubation bei 20% oder 1% Sauerstoff wurde der Überstand
abgenommen und die Zellen mit 500 µl Trizol lysiert. Dieses Reagenz tötet die
Mykobakterien, RNasen und andere Enzyme werden inaktiviert und das
enthaltene Phenol löst die DNA. Um die RNA abzutrennen, wurden 100 µl
Chloroform hinzugegeben, kräftig geschüttelt und 3 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Danach wurden folgte die Phasentrennung mittels Zentrifugation für 15
min bei 4ºC und 10600 UpM. Die obere farblose, wässrige Phase enthält die RNA
und 200 µl wurden in ein 1,5 ml Eppendorftube mit 167 µl Isopropanol überführt,
gevortext und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert um die RNA zu präzipitieren.
Die Zentrifugation für 15 min bei 4ºC und 14000 UpM beendet den
Präzipitationsschritt. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen, verworfen und
das kaum sichtbare RNA-Pellet mit 500 µl 80%-igem Ethanol für 10 min bei 4ºC
und 14000 UpM gewaschen. Das Ethanol wurde vorsichtig abgenommen und das
RNA-Pellet luftgetrocknet. Anschließend wurde das RNA Pellet in 30 µl RNase
freiem Wasser gelöst.
2.2.4.2. Generierung von cDNA
Aus der isolierten RNA wurde mittels einer reversen Transkriptase (RT) ein
einzelsträngiger komplementärer DNA-Strang synthetisiert. Dabei wurde zunächst
eine mögliche DNA-Kontamination mittels DNase-Verdau entfernt.
Standardansatz eines DNA-Verdaus:
30 µl RNA
9 µl 5 fach Reaktionspuffer
1 µl DNaseI
Der DNA-Verdau wurde 30 min bei 37ºC im Thermocycler durchgeführt. Die
Inaktivierung der DNaseI erfolgte für 10 min bei 65ºC.
Die DNA-freie RNA wurde auf bei 4ºC gelagert. Anschließend wurde eine RT
durchgeführt.
Standardansatz einer RT:
40 µl Reaktionsgemisch des DNA-Verdaus
2 µl oligo(dT) Primer
28
Material und Methoden
Die oligo (dT)-Primeranlagerung wurde 10 min bei 70ºC im Thermocycler
durchgeführt.
2 µl dNTPs
1 µl Reverse Transkriptase
Die RT erfolgte bei bei 42ºC für 50 min im Thermocycler. Die Lagerung der cDNA
erfolgte bei -20ºC.
2.2.4.3. Quantitative Genexpressionsanalyse mittels LightCycler
Polymerase-Kettenreaktion
Für die quantitative LightCycler (PCR) ist das Prinzip der PolymeraseKettenreaktion (PCR) weiterentwickelt worden und ermöglicht die Quantifizierung
der Genexpression aus mRNA gewonnener cDNA. Der in DNA interkalierende
Farbstoff SYBR Green lagert sich in die synthetisierte doppelsträngige DNA ein.
Mittels
Fluoreszenzmessung
wird
nach
jedem
PCR-Zyklus
die
Fluoreszenzintensität gemessen. Die Zunahme an PRC-Produkt resultiert in der
Zunahme der Fluoreszenz. Während der exponentiellen Phase der PCR wird die
korrekte Quantifizierung möglich, da zu diesem kurzen Zeitpunkt die optimalen
Reaktionsbedingungen herrschen.
Ansatz der quantitativen LightCycler PCR in einer 20 µl LightCycler Kapillare:
11 µl DNase-freies Wasser
2 µl Primermix (10 µM) (gesuchtes Gen)
4 µl SYBR Green PCR MasterMix
3 µl cDNA
Parallel dazu wurden die entsprechenden Ansätze für das Housekeeping-Gen
h36B4 angesetzt, dessen konstante Expression als Bezugswert genommen
wurde.
PCR-Programm:
10 min
95ºC
10 s
95ºC (Denaturierung)
10 s
60ºC (Primeranlagerung)
6s
72ºC (Elongation)
29
Material und Methoden
Für die PCR wurden die Kapillaren im LightCycler 3.5.3 durchgeführt. Die Größe
der
PCR-Produkte
wurden
zu
Beginn
der
Experimente
in
einer
Agarosegelelektrophorese überprüft.
Die x-fache Expression der untersuchten Gene wurden relativ zur normoxischen
Mediumkontrolle nach der ΔΔCt Methode errechnet.
2.2.4.4. Statistische Auswertungen
Die statistischen Analysen wurden mit Excel durchgeführt. Der Student t-Test
wurde angewandt, um statistische Unterschiede zwischen verschiedenen
Versuchansätzen zu berechnen. Als Signifikanzniveau wurde p ≤ 0,05 definiert.
Die dargestellten Graphen zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus
mindestens drei verschiedenen, voneinander unabhängigen Experimenten. Die
Graphen
mit
dargestellten
Rohdaten
der
einzelnen
Experimente
haben
repräsentativen Charakter.
2.2.4.5. Verwendete Computerprogramme
Es wurden folgende Computerprogramme genutzt.
Tabelle 1: Genutzte Computerprogramme
Programm
Hersteller
Anwendung
Cell quest
BD
Analyse und Auswertung
von Zytometriedaten
Excel
Windows Inc.
Verarbeitung von Daten
Statistische Auswertung
LightCycler
Roche
Analyse von LightCycler
Daten
Power Point
Windows Inc.
Erstellen von Graphiken
Word
Windows Inc.
Erstellen von TextDokumenten
30
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1. Einfluss der Sauerstoffspannung auf die Vermehrung
extrazellulärer Mykobakterien
3.1.1. Metabolische Soffwechselaktivität
Zur Untersuchung der Interaktion zwischen M.tb und humanen Makrophagen
unter sauerstoffarmen Bedingungen, wurde zunächst die Auswirkung von
reduzierter
Sauerstoffspannung
auf
die
metabolische
Stoffwechselaktivität
extrazellulärer Mykobakterien untersuchen. Die metabolische Stoffwechselaktivität
der Mykobakterien wurde durch die Analyse des in die RNA eingebauten
radioaktiv-markierten Uracils bestimmt. Es zeigte sich, dass die metabolische
Stoffwechselaktivität bei 3% O2 (58083 ± 13365 cpm) gegenüber 20% O2 (267608
± 15263 cpm) signifikant reduziert war (Abb. 9A).
B
A
p<0,0001
Uracil-Aufnahme (cpm x 104)
30
20
n.s.
O2- Spannung 20%
Rifampicin
-
p<0,0001
20
10
3H
10
3H
Uracil-Aufnahme (cpm x 104)
30
3%
20%
3%
-
+
+
n.s.
O2- Spannung 20%
Rifampicin
-
1%
20%
1%
-
+
+
Abb. 9: Stoffwechselaktivität von M.tb bei Hypoxie. M.tb. wurden für 72 h bei 20%, 3% (A),
oder 1% (B) Sauerstoff inkubiert und anschließend mit radioaktiv markiertem Uracil versetzt. Nach
weiteren 24 h wurde die Menge an eingebautem Uracil bestimmt. Es wurden in 5 unabhängigen
Experimenten jeweils Triplikate angesetzt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte mit der
zugehörigen SD.
31
Ergebnisse
Bei 1% O2 (78557 ± 16650 cpm) war die Menge an eingebauten Uracil im
Gegensatz zu 20% O2 (234407 ± 28422 cpm) ebenfalls reduziert und zeigt eine
Reduzierung der metabolischen Stoffwechselaktivität (Abb. 9B) auf. Im Mittel
wurde eine 4,6-fache Abnahme der Stoffwechselaktivität bei 3% O2 und eine 3fache Abnahme bei 1% O2 ermittelt. Die Rifampicin-Kontrollen lagen unabhängig
von der Sauerstoffspannung bei ca. 20000 cpm.
Diese Daten zeigen, dass die Sauerstoffkonzentration den Stoffwechsel von
extrazellulären M.tb beeinflusst.
3.1.2. Extrazelluläres Wachstum
In den vorherigen Experimenten wurde gezeigt, dass die metabolische Aktivität
der extrazellulären Mykobakterien bei 3% O2 und 1% O2 reduziert ist. Um zu
untersuchen, ob die Bakterien unter sauerstoffarmen Bedingungen absterben,
wurde das extrazelluläre Wachstum gemessen. Dazu wurden 100 Koloniebildende Einheiten M.tb ausplattiert und für 14 d bei 20%, 3% und 1%
Sauerstoffspannung inkubiert. Die Anzahl der Kolonien unterschieden sich
zwischen 20% O2 und 3% O2 nicht signifikant (20% O2 37 ± 8 versus 3% und 35 ±
8; p=0,25). Die Kolonien unter hypoxischen Bedingungen waren jedoch wesentlich
als die Kolonien unter normoxischen Bedingungen (Abb. 10B). Ein vergleichbares
Ergebnis (Abb. 10A) zeigte sich auch bei der Untersuchung mit 20% (KBE=31 ± 2)
versus 1% (KBE=33 ± 4) Sauerstoffspannung (n=3, p=0,26).
A
B
40
n.s.
KBE
30
20
10
20%
1%
O2-Spannung
20% O2
O2-Spannung
1% O2
O2-Spannung
Abb. 10: Wachstum extrazellulärer M.tb unter hypoxischen Bedingungen. M.tb wurde plattiert
und bei 20% oder 1% Sauerstoff inkubiert. Nach 14 d wurden die Kolonien gezählt. (A)
Zusammenfassung von 3 unabhängigen Experimenten. Dargestellt sind jeweils der Mittelwert ±SD.
(B) Repräsentative Fotografien von Kulturplatten nach 14 d Inkubation.
32
Ergebnisse
Diese Ergebnisse zeigen, dass die reduzierte Sauerstoffspannung die Viabilität
von M.tb nicht beeinflusst. Es liegt die Vermutung nahe, dass es durch eine
Reduktion des Sauerstoffs, zu einem reduzierten Wachstum extrazellulärer M.tb
kommt.
3.2. Einfluss der Sauerstoffspannung auf die Infektion von
Makrophagen mit Mycobacterium tuberculosis
3.2.1. Viabilität von Makrophagen
Zur Bestätigung, dass Makrophagen ihren Stoffwechsel unter hypoxischen
Bedingungen adaptieren, wurde der Transkriptionsfaktor HIF-1, welcher nur
unter Stressbedingungen nachweisbar ist, gemessen. Mittels Westernblot-Analyse
wurde die Stabilisierung von HIF-1in Makrophagen unter 20%, 3% und 1%
Sauerstoffspannung untersucht. Als Positivkontrolle wurde der Eisenchalator
Desferrioxaminmesylat (DFO) verwendet. DFO entzieht der Prolylhydroxylase das
nötige Eisen und macht es damit unbrauchbar für die Hydroxylierung von HIF1Dadurch
wird
der
Abbau
von
HIF-1inhibiert.
HIF-1wurde
als
Surrogatmarker für sauerstoffarme Bedingungen betrachtet.
Es zeigte sich, dass nur unter 1% Sauerstoffspannung und mit DFO HIF-1
stabilisiert wurde (Abb. 11). Daraus resultierte die Frage, ob Makrophagen unter
Hypoxie überleben.
20% O2
3% O2
1% O2
DFO
HIF-1
120 kDa
6
Abb. 11: Expression von HIF-1 unter sauerstoffarmen Bedingungen. 1x10 Makrophagen
wurden bei 20%, 3% und 1% Sauerstoffspannung für 24 h inkubiert. Die Stabilisierung von HIF-1
wurde mittels Westernblot analysiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Beispiel von 3
unabhängigen Experimenten.
Um
die
Interaktion
von
Makrophagen
und
M.tb
unter
niedrigen
Sauerstoffbedingungen zu untersuchen, wurde zunächst die Viabilität der
Makrophagen überprüft. Es wurden uninfizierte und infizierte Makrophagen in 24
well Platten verteilt und für 6 Tage bei 1% Sauerstoffspannung in der
Hypoxiekammer
oder
bei
Standardkulturbedingungen
33
inkubiert.
Die
Ergebnisse
Zellkulturüberstände wurden anschließend in einem LaktatdehydrogenaseAktivitätsassay analysiert.
Es wurden weder bei uninfizierten Makrophagen (85% ± 8,8% vs. 84,8% ± 14%)
noch bei infizierten Makrophagen (72,3% ± 12,3% vs. 72,8% ± 20,2%) signifikante
Unterschiede in der Viabilität der Makrophagen beobachtet (Abb. 12).
A
B
uninfiziert
infiziert
100
100
80
80
Mф Viabilität (%)
Mф Viabilität (%)
n.s.
60
40
20
n.s.
60
40
20
20%
1%
O2-Spannung
20%
1%
O2-Spannung
D
10 µm
1% O2-Spannung
20% Spannung
C
Abb. 12: Viabilität von Makrophagen unter sauerstoffarmen Bedingungen. Uninfizierte (A) und
mit M.tb (MOI5) infizierte (B) Makrophagen wurden für 6 d inkubiert. Die Zellüberstände wurden in
einem Laktatdehydrogenase-Aktivitätsassay analysiert. Die Grafik zeigt die Zusammenfassung von
4 unabhängigen Experimenten. Die Balken geben den Mittelwert ± SD an. C und D zeigen
repräsentative Abbildungen von uninfizierten und infizierten Makrophagen.
34
Ergebnisse
3.2.2. Phagozytose von Mykobakterien
Nachdem gezeigte wurde, dass M.tb und Makrophagen unter sauerstoffarmen
Bedingungen überleben, wurde in den folgenden Schritten die Interaktion von M.tb
und Makrophagen untersucht. Als erstes wurde die Phagozytose von M.tb
bestimmt. Dazu wurden Makrophagen bei 20%- oder 1% Sauerstoffspannung mit
MOI 0,1, 1 und 10 infiziert, 24 h inkubiert und anschließend mit AuraminRhodamin gefärbt. Die Zellen wurden dann am Fluoreszenzmikroskop analysiert.
Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Aufnahme der
Mykobakterien (Abb. 13).
A
B
n.s.
100
20% O2-Spannung
10µm
10µm
1% O2-Spannung
Phagozytose (%)
80
60
n.s.
40
20
n.s.
0.1
20% O2-Spannung
1% O2-Spannung
1
MOI
10
Abb. 13: Einfluss der Sauerstoffspannung auf die Phagozytose von
M.tb durch
Makrophagen. Makrophagen wurden mit M.tb infiziert. Zur Bestimmung der Phagozytose wurden
die Zellen mit Auramin-Rhodamin gefärbt. In jedem Experiment wurden 200 Zellen ausgezählt. A)
Repräsentative Abbildungen von infizierten Makrophagen (MOI1). B) Zusammenfassung von 3
unabhängigen Experimenten. Die Balken zeigen den Mittelwert ± SD.
3.2.3. Zytokinproduktion
Nach der Untersuchung der Phagozytose, wurde im Folgenden überprüft, ob die
Sauerstoffspannung Einfluss auf die Produktion der Zytokine TNF, IL-12, IL-10
und
des
Chemokins
CCL5
hat.
Die
Makrophagen
wurden
bei
20%
Sauerstoffspannung oder 1% Sauerstoffspannung inkubiert, stimuliert oder mit
M.tb infiziert. Nach 24 h wurden die Kulturüberstände abgenommen und mittels
des immunologischen Nachweisverfahrens ELISA analysiert.
35
Ergebnisse
Es zeigte sich nach der Stimulation mit M.tb-Extrakt kein signifikanter Unterschied
in der Produktion von TNF(Abb. 14A).
A
Mtb-Extrakt
LPS
p<0,005
12000
1000
n.s.
10000
800
TNF (pg/ml)
TNF (pg/ml)
8000
6000
600
400
4000
200
2000
20%
1%
O2- Spannung
MOI 0,5
600
n.s.
MOI 5
10000
MOI 50
14000
n.s.
12000
500
8000
10000
TNF (pg/ml)
400
TNF (pg/ml)
p<0,05
300
TNF (pg/ml)
B
20%
1%
O2- Spannung
6000
4000
200
8000
6000
4000
2000
100
2000
20%
1%
O2- Spannung
20%
1%
O2- Spannung
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 14: Einfluss von Sauerstoffspannungen auf die Produktion von TNF in Makrophagen.
5
5x10 Makrophagen wurden für 24 h inkubiert und stimuliert bzw. infiziert. Die Kulturüberstände
wurden mittels ELISA analysiert. A) TNF-Produktion von Makrophagen nach Stimulation mit 10
µg/ml M.tb-Extrakt. Die Balken geben den Mittelwert ± SEM aus 6 unabhängigen Experimenten an.
TNF-Produktion von Makrophagen nach Stimulation mit 100 pg/ml LPS. Die Balken geben den
Mittelwert ±SEM aus 6 unabhängigen Experimenten an. B) TNF-Produktion von Makrophagen
nach Infektion mit M.tb. Die Balken geben den Mittelwert ± SEM aus 6 unabhängigen
Experimenten an.
Jedoch war die TNF-Produktion nach Stimulation mit LPS reduziert (Abb. 14A).
Nach Infektion mit M.tb ergab sich ein signifikanter Anstieg (20% O2 6124 pg/ml ±
1335 pg/ml vs.1% O2 7312 pg/ml ± 1815 pg/ml) (Abb. 14B). Generell war,
unabhängig von der Sauerstoffspannung, durch die Steigerung der MOI eine
Steigerung der TNF-Freisetzung zu beobachten.
Im Gegensatz dazu hatte die Sauerstoffspannung keinen Einfluss auf die
Freisetzung von IL-12 (nicht gezeigt).
36
Ergebnisse
IL-10 zeigte, unabhängig von der Stimulation oder Infektion, ebenfalls keine
signifikanten Unterschiede (Abb. 15).
A
Mtb-Extrakt
200
n.s.
IL-10 (pg/ml)
150
100
50
20%
1%
O2- Spannung
B
MOI 5
60
MOI 50
200
n.s.
n.s.
50
40
IL-10 (pg/ml)
IL-10 (pg/ml)
150
30
100
20
50
10
20%
1%
O2- Spannung
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 15: Einfluss von Sauerstoffspannungen auf die Produktion von IL-10 in Makrophagen.
5
5x10 Makrophagen wurden in 24 well Platten verteilt und für 24 h inkubiert und stimuliert bzw.
infiziert. Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA analysiert. A) IL-10-Produktion von
Makrophagen nach Stimulation mit 10 µg/ml M.tb-Extrakt. Die Balken geben den Mittelwert ± SEM
aus 6 unabhängigen Experimenten an. B) IL-10-Produktion von Makrophagen nach Infektion mit
MOI 5 und 50. Die Balken geben den Mittelwert ± SEM aus 6 unabhängigen Experimenten an.
37
Ergebnisse
Das Chemokin CCL5 wurde von Makrophagen nach Stimulation mit M.tb-Extrakt
und nach Infektion mit Mykobakterien unabhängig von der Sauerstoffspannung
sekretiert (Abb. 16).
A
Mtb-Extrakt
n.s.
1600
CCL-5 (pg/ml)
1200
800
400
20%
1%
O2- Spannung
B
MOI 5
350
MOI 50
n.s.
2500
n.s.
300
CCL-5 (pg/ml)
CCL-5 (pg/ml)
2000
250
1500
200
150
1000
100
500
50
20%
1%
O2- Spannung
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 16: Einfluss von Sauerstoffspannungen auf die Produktion von CCL5 in Makrophagen.
5
5x10 Makrophagen wurden in 24 well Platten verteilt, für 24 h inkubiert und stimuliert bzw. infiziert.
Die Kulturüberstände wurden mittels ELISA analysiert. A) CCL5-Produktion von Makrophagen
nach Stimulation mit 10 µg/ml M.tb-Extrakt. Die Balken geben den Mittelwert ± SEM aus 4
unabhängigen Experimenten an. B) CCL5-Produktion von Makrophagen nach Infektion mit M.tb.
Die Balken geben den Mittelwert ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten an.
3.2.4. Intrazelluläres Wachstum von Mycobacterium tuberculosis
Die Sauerstoffspannung hatte keinen Einfluss auf die Phagozytose und die
Zytokinproduktion. Als funktionelle Endstrecke der Makrophagen-Aktivierung
wurde jetzt das intrazelluläre Wachstum von M.tb untersucht.
38
Ergebnisse
Dazu wurden Makrophagen mit M.tb infiziert und bei unterschiedlichen
Sauerstoffspannungen für 6 Tage inkubiert. Anschließend folgte die Plattierung
der Lysate, um das intrazelluläre Wachstum der Mykobakterien ermitteln zu
können.
Bei 20% und 3% O2 war das Wachstum von M.tb vergleichbar (Abb. 17A u. B).
Jedoch zeigte sich bei 1% Sauerstoffspannung eine deutliche Abnahme des
intrazellulären Wachstums um 47% (Abb. 17 C-D).
A
B
n.s.
8
6
7
n.s.
5
4
5
KBE (x106)
KBE (x106)
6
4
3
3
2
2
1
1
20% 3%
O2-Spannung
20%
3%
O2-Spannung
C
D
3
6
p<0,0005
p<0.0005
5
2
KBE (x106)
KBE (x106)
4
3
2
1
1
20% 1%
O2-Spannung
20%
1%
O2-Spannung
Abb. 17: Intrazelluläres Wachstum von M.tb in Makrophagen. Makrophagen wurden infiziert
(MOI5) und nach 6 d die Anzahl intrazellulärer Bakterien gemessen. Die Grafiken in A (6 Spender)
und C (12 Spender) zeigen die Rohdaten. Die Grafiken B und D zeigen die Zusammenfassung der
Daten als Mittelwerte ± SEM.
39
Ergebnisse
3.3. Mechanismus der Makrophagen-Aktivierung durch Hypoxie
Als möglicher Mechanismus für das reduzierte intrazelluläre Wachstum wurden
folgende Möglichkeiten geprüft.
 Expression des Vitamin D Rezeptors (VDR)
 Expression von Cathelicidin
 Expression des hBD-2
3.3.1. Untersuchung der Regulation des Vitamin D Rezeptors
Als erstes wurde mittels quantitativer LightCycler PCR untersucht, ob die
reduzierte Sauerstoffspannung einen Einfluss auf die Regulation des VDR hat.
Dabei wurden Makrophagen und für 24 h bei 20% oder 1% Sauerstoffspannung
inkubiert. Unbehandelte Makrophagen unter normoxischen Bedingungen dienten
als Kontrolle. Die niedrige Sauerstoffspannung hatte keinen Einfluss auf die VDR
Expression in uninfizierten Makrophagen (Abb. 18). Bei infizierten Makrophagen
wurde bei 1% O2 eine signifikante Steigerung (p=0,03) der VDR Expression
gegenüber 20% O2 ermittelt.
A
B
infiziert
7
7
6
6
5
5
VDR mRNA (x-fach)
VDR mRNA (x-fach)
uninfiziert
4
3
n.s.
2
p<0,05
4
3
2
1
1
20%
1%
O2- Spannung
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 18: Expression des VDR bei Hypoxie. Uninfizierte und infizierte Makrophagen wurden für
24 h inkubiert und die Transkriptionsrate von VDR mittels quantitativer LightCycler PCR analysiert.
Die relative Genexpression von VDR wurde im Verhältnis zum Kontrollansatz, welcher auf 1
gesetzt wurde, errechnet. Die Balken geben den Mittelwert der VDR Expression in (A) uninfizierten
und (B) infizierten (MOI 5) Makrophagen und die SEM an. Es wurden je 7 unabhängige
Experimente durchgeführt.
40
Ergebnisse
Als zusätzliche Messgröße wurde die direkte Gegenüberstellung der arbiträren
Einheiten (AE) durchgeführt. Der Vorteil dieser Darstellungsweise liegt in der
Unabhängigkeit des Bezugswertes des uninfizierten Ansatzes. Dieser muss in
dieser Berechnung nicht beachtet werden und vermittelt den direkten Vergleich
von Hypoxie und Normoxie. Es zeigt sich im direkten Vergleich der infizierten
Makrophagen unter den beiden Sauerstoffvarianten eine 2-fach erhöhte VDRExpression unter sauerstoffarmen Bedingungen (Abb. 19) (1% O2 AE=2,1E+09 ±
3,8E+08 versus 20% O2 AE=1,2E+09 ± 1,9E+08).
9
3,0x10
3,
p<0,05
9
VDR (AE)
2,0x10
2,
9
1,0x10
1,
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 19: Expression von VDR bei Hypoxie. Infizierte Makrophagen wurden für 24 h inkubiert und
die VDR Expression mittels quantitativer LightCycler PCR analysiert. Dargestellt sind die arbiträren
Einheiten der Transkriptionsrate. Die Balken geben den Mittelwert der VDR Expression in
infizierten Makrophagen ± SEM an. Es wurden 7 unabhängige Experimente durchgeführt.
3.3.2. Untersuchung der Regulation von Cathelicidin
Es ist bekannt, dass das antimikrobielle, kationische Peptid Cathelicidin
Pathogene wie M.tb abtötet (56). Daher wurde in den folgenden Experimenten
untersucht, ob unter niedriger Sauerstoffspannung die Cathelicidin-Expression
erhöht wird und sich dadurch die Reduktion des intrazellulären Wachstums von
M.tb beobachten lässt. Um dies zu untersuchen, wurden die Makrophagen bei
20% O2 und 1% O2 für 24 h inkubiert und anschließend die Expression mittels
quantitativer
LightCycler
PCR
bestimmt.
Die
Cathelicidin-Expression
in
uninfizierten Makrophagen unterscheiden sich nicht. Bei infizierten Makrophagen
41
Ergebnisse
zeigte sich eine signifikante Reduktion der Cathelicidin mRNA unter hypoxischen
Bedingungen (Abb. 20).
A
B
infiziert
uninfiziert
1,5
2,0
Cathelicidin mRNA (x-fach)
Cathelicidin mRNA (x-fach)
p<0,05
1,0
0,5
1,5
n.s.
1,0
0,5
20%
1%
O2- Spannung
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 20: Expression von Cathelicidin bei Hypoxie. Uninfizierte und infizierte Makrophagen
wurden für 24 h inkubiert und die Transkriptionsrate von Cathelicidin mittels quantitativer
LightCycler PCR analysiert. Die relative Genexpression von Cathelicidin wurde im Verhältnis zum
Kontrollansatz, welcher auf 1 gesetzt wurde, errechnet. Die Balken geben den Mittelwert der
Cathelicidin-Expression in A) uninfizierten (7 unabhängige Experimente) und B) infizierten
Makrophagen (MOI 5) (8 unabhängige Experimente) ± SEM an.
Die Betrachtung der Cathelicidin-Expression in der Darstellung der AE zeigt im
direkten Vergleich der infizierten Makrophagen bei 1 % O2 eine signifikant
Cathelicidin (AE)
reduzierte Cathelicidin-Expression (n=8, p=0,005) (Abb. 21).
1,4x10
10
1,2x10
10
1,0x10
p<0,005
10
8,0x10
9
6,0x10
9
4,0x10
9
2,0x10
9
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 21: Expression von Cathelicidin bei Hypoxie. Makrophagen wurden für 24 h inkubiert und
die arbiträren Einheiten nach quantitativer LightCycler PCR berechnet. Die Balken geben den
Mittelwert der Cathelicidin Expression in infizierten Makrophagen ± SEM an. Es wurden 8
unabhängige Experimente durchgeführt.
42
Ergebnisse
3.3.3. Untersuchung der Regulation von humanem β-Defensin-2
Neben Cathelicidin gibt es noch eine weitere Gruppe von antimikrobiellen
Peptiden, die Defensine. Ein Vertreter dieser Gruppe ist das humane β-Defensin-2
(hBD-2), welches eine antimykobakterielle Wirkung hat. Beim Vergleich der hBD-2
Expression von uninfizierten (Abb. 22A) und infizierten Makrophagen (Abb. 22B),
wurden die Makrophagen bei 20% O2 und 1% O2 für 24 h inkubiert und die
Transkriptionsrate mittels quantitativer LightCycler PCR bestimmt. Die Infektion
der Makrophagen mit Mykobakterien führte unter sauerstoffarmen Bedingungen
zu einer gesteigerten Expression von hBD-2 (Abb. 22). Die Expression von hBD-2
war unter 1% O2 (mRNA=5,1 ± 2,2) 3,6-fach höher als unter 20% O2 (mRNA=1,4 ±
0,35).
A
B
uninfiziert
infiziert
8
n.s.
hBD-2 mRNA (x-fach)
hBD-2 mRNA (x-fach)
2
1
20%
1%
O2- Spannung
p<0,05
6
4
2
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 22: Expression von hBD-2 bei Hypoxie. Uninfizierte und infizierte Makrophagen wurden für
24 h inkubiert und die Transkriptionsrate von hBD-2 mittels quantitativer LightCycler PCR
analysiert. Die relative Genexpression von hBD-2 wurde im Verhältnis zum Kontrollansatz, welcher
auf 1 gesetzt wurde, errechnet. Die Balken geben den Mittelwert der hBD-2 Expression in A)
uninfizierten (6 unabhängige Experimente) und B) infizierten Makrophagen (MOI 5) (14
unabhängige Experimente) ± SEM an.
43
Ergebnisse
Die Expressionsrate von hBD-2 mittels AE zeigte unter 1% Sauerstoffspannung
AE=2,3E+09 ± 7,1E+08. Bei 20% Sauerstoffspannung wurden AE=1,1E+09 ±
3,3E+08 ermittelt. In 14 unabhängigen Experimenten ergab sich somit eine
signifikanter Unterschied von p=0,01 (Abb. 23).
4,0x10
4,
9
3,0x10
3,
9
2,0x10
2,
9
1,0x10
1,0
9
hBD-2 (AE)
p<0,05
20%
1%
O2- Spannung
Abb. 23 Expression von hBD-2 bei Hypoxie. Makrophagen wurden für 24 h inkubiert und die
arbiträren Einheiten nach quantitativer LightCycler PCR berechnet. Die Balken geben den
Mittelwert der hBD-2 Expression in infizierten Makrophagen ± SEM an. Es wurden 14 unabhängige
Experimente durchgeführt.
Zusammengefasst betrachtet zeigen diese Ergebnisse, dass das reduzierte
mykobakterielle Wachstum in Makrophagen bei Hypoxie unter dem Einfluss des
AMP hBD-2 steht.
44
Diskussion
4. Diskussion
Die hier dargestellten Experimente zeigen, dass Hypoxie das intrazelluläre
Wachstum von M.tb. hemmt. Als möglicher Abwehrmechanismus wurde die
erhöhte Expression des antimikrobiellen Peptids hBD-2 aufgezeigt.
4.1. Makrophagen und die Rolle der Hypoxie
Erster Schlüsselbefund und Grundvoraussetzung für alle folgenden Experimente
war der Nachweis, dass humane Makrophagen bei niedriger Sauerstoffspannung
überleben.
Die
ausgeprägte
Toleranz
von
Makrophagen
gegenüber
Sauerstoffmangel ist nicht nur für die von uns verwendeten primären Zellen
charakteristisch, sondern findet sich auch bei verschiedenen Zelllinien, sowohl
humaner als auch muriner Herkunft [21, 38, 42, 107]. Demzufolge spielt die
Apoptose von infizierten Makrophagen, die das intrazelluläre Wachstum von
Mykobakterien reduzieren [65] in unseren Experimenten keine Rolle.
Andererseits sind die von uns gewählten Bedingungen (1% O2-Spannung)
geeignet, um eine biologische Wirkung auf den Makrophagen-Stoffwechsel zu
erzielen.
Beweis
hierfür
ist
die
Stabilisierung
der
-Untereinheit
des
Transkriptionsfaktor HIF-1. Auch wenn die Stabilisierung von HIF-1 nicht
spezifisch für eine sauerstoffarme Umgebung ist, wird dadurch- dass wir
ansonsten ideale Nährstoff-und Kulturbedingungen anbieten- gezeigt, dass die
Umstellung des Stoffwechsels durch den niedrigen Gehalt an Sauerstoff erzielt
wird (Abb. 11).
Andere Mechanismen, wie die Stimulation mit LPS [106] oder die Infektion mit
humanen Pathogenen, wie Staphylococcus aureus, Escherichia coli oder Candida
albicans [104] führen zwar ebenfalls zur Hochregulation von HIF-1, spielen aber
naturgemäß in unseren Experimenten keine Rolle. Insbesondere wurde eine
Kontamination unserer Reagenzien mit LPS experimentell durch den LimulusAmöbozyten-Lysat-Test ausgeschlossen.
Ob auch die Infektion mit M.tb zu einer Stabilisierung von HIF-1 in Makrophagen
führt, konnte in dieser Arbeit nicht untersucht werden, da die erforderliche
Infrastruktur im S3-Sicherheitslabor nicht zur Verfügung steht.
45
Diskussion
4.2.
Einfluss von Hypoxie auf die Vitalität von Mycobacterium
tuberculosis
Die latente Tuberkulose ist von hohem wissenschaftlichem Interesse, da latent
Infizierte ein erhebliches Reservoir für Neuinfektionen darstellen.
Die Verwendung einer Hypoxiekammer ermöglicht die Nachahmung der
sauerstoffarmen Bedingungen im Granulom. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass
M.tb unter hypoxischen Bedingungen überlebt.
Schon frühere Arbeiten zeigten, dass Mykobakterien sich an eine sauerstoffarme
Umgebung und bei gradueller Abnahme der Sauerstoff-Spannung in einer
mehrwöchigen Kultur bis zu 0,2% O2-Spannung adaptieren [19, 89]. In beiden
Fällen blieb die Viabilität der Bakterien erhalten und das Wachstum war bei
Normalisierung der O2-Zufuhr reversibel. Auch andere Formen von Stress, wie
Nahrungsmangel, niedriger pH-Wert und RNS induzieren eine Phase des nicht
replikativen Wachstums [9, 34, 31]. Demzufolge widersetzt sich M.tb widrigen
Umweltbedingungen, in dem es den Metabolismus auf ein zum Überleben
erforderliches Minimum reduziert.
Die Reduktion von Metabolismus und Replikation der Mykobakterien unter
hypoxischen Bedingungen, spiegelt sich auch in den Ergebnissen von in vivo
Modellen wider. Sauerstoffreduzierte Tierhaltung führte bei M.tb-infizierten
Kaninchen und Meerschweinen zu einer verlangsamten Progression des
Krankheitsverlaufes [76]. In Hochebenen Perus wurde gezeigt, dass die Prävalenz
der
M.tb-Infektionen
abnimmt
[69].
Diese
Beobachtung
wird
mit
dem
abnehmenden Sauerstoffgehalt in höheren Lagen erklärt. Dabei wird deutlich,
dass der Sauerstoff eine entscheidende Rolle für den Krankheitsverlauf der
Tuberkulose spielt.
Diese Erkenntnisse eröffnen alternativ Strategien zur Therapie der Tuberkulose,
die auch heute noch eine große Herausforderung darstellt. Ziel muss es sein,
Antibiotika zu entwickeln, welche nicht-replikative Mykobakterien angreifen. Dies
ist gerade bei den potentesten verfügbaren Tuberkulostatika –Rifampizin und
Isozianid- nur eingeschränkt der Fall [70].
Dieses Konzept wird derzeit durch den Einsatz von Metronidazol, ein Antibiotikum
welches gegen Anaerobier eingesetzt wird, erprobt. Während dieses etablierte
Antibiotikum nicht auf logarithmisch wachsende Mykobakterien wirkt, zeigt es
einen selektiven bakteriziden Effekt auf latente Bakterien [103]. Auch wenn
46
Diskussion
Metronidazol bei der Therapie der murinen Tuberkulose keinen signifikanten
Vorteil zur Standardtherapie erbrachte [49, 12], sind die theoretischen Evidenzen
ausreichend supportiv, um die Entwicklung dieser Substanz als Tuberkulostatikum
weiter zu verfolgen.
Die bemerkenswerte Resistenz von M.tb gegen Sauerstoffmangel, wird durch
mehrere Besonderheiten des mykobakteriellen Stoffwechsels möglich. Zunächst
ist der ATP-Vorrat in der Latenzphase entsprechend des geringeren Bedarfs
reduziert [34]. Des Weiteren stellen die Bakterien ihre Energiegewinnung auf den
unter diesen Bedingungen effizienteren Glyoxylatzyklus um. Hierbei werden
Kohlenhydrate
und
Energie
aus
Fettsäuren
generiert,
was
durch
die
Hochregulation des Schlüsselenzyms Isozitratlyase ermöglicht wird [61].
Während dieser Adaptationsvorgang eine energetische Minimalversorgung
sichert, erfordert das Überleben unter den hostilen Umweltbedingungen ein
komplettes Umschalten des genetischen Programms. Dies wird durch das
Anschalten des Zwei-Komponenten-Regulators DosR-DosS/T (dormancy survival
regulator) erreicht [71]. Es kommt dadurch zur Steuerung einer Vielzahl von
Genen, unter anderem von pfkB, welches für eine Phosphofructokinase codiert,
acr, welches für ein Chaperon aus der Familie kleiner Hitzeschockproteine (small
heat shock proteins) codiert oder auch narK2 und narX die an der
sauerstoffunabhängigen Nitratatmung in M.tb beteiligt sind [71].
Ein zusätzliches davon unabhängiges genetisches Programm, welches bei
anhaltender Hypoxie aktiviert wird (enduring hypoxic response), führt zur
Transkription von über 230 Genen, die unter physiologischen Bedingungen
ausgeschaltet
bleiben
[82].
Dies
betrifft
hauptsächlich
Gene,
die
am
Lipidstoffwechsel, dem Zellwandaufbau, an intermidiären Stoffwechselprozessen
und regulatorischen Prozessen beteiligt sind.
Demzufolge hat M.tb spezifische Mechanismen entwickelt, um im sauerstoffarmen
Milieu zu überleben. Diese Besonderheit ermöglicht es, den Bakterien über
Jahrzehnte in hypoxischen Granulomen zu überleben, um jederzeit bereit zu sein,
bei einer eintretenden Abwehrschwäche seine zerstörerische Aktivität wieder
aufzunehmen.
47
Diskussion
4.3.
Intrazelluläres Wachstum von Mykobakterien unter Hypoxie
Nachdem wir gezeigt hatten, dass sowohl Makrophagen als auch Mykobakterien
unter sauerstoffarmen Bedingungen ihren Stoffwechsel umstellen, ohne ihre
Vitalität einzubüßen, folgten Experimente, mit M.tb-infizierten Makrophagen. Es
wurde gezeigt, dass die Mykobakterien bei einer Sauerstoffspannung, wie sie in
tuberkulösen Granulomen vorliegt, schlechter wuchsen. Entscheidend an dieser
Beobachtung ist, dass ein erheblicher Unterschied zu den unter idealen aber
artifiziellen Bedingungen eines Zellkulturinkubators gefunden wurde. Mit Hilfe
unseres aufwendigen Systems von konstanten hypoxischen Bedingungen in einer
geschlossenen Kammer, erweitern wir frühere Arbeiten über die Interaktion von
Mykobakterien und Makrophagen. Hier hatte sich bei 5% Sauerstoffspannung
ebenfalls eine Reduktion des intrazellulären Wachstums gezeigt, wohingegen das
extrazelluläre Wachstum unverändert blieb [63]. Der Vergleich dieser Arbeiten
zeigt auf, dass beginnend bei einer Sauerstoffspannung von 5% eine Umstellung
des
bakteriellen
Stoffwechsels
initiiert
wird,
die
bei
zunehmender
Sauerstoffreduktion fortgesetzt wird. Auch wenn vergleichbare Studien wegen des
technischen und infrastrukturellen Aufwandes kaum vorliegen, ist das reduzierte
intrazelluläre Wachstum von Pathogenen unter Hypoxie ein generelles Phänomen.
Auch Leishmania amazonensis vermehrt sich kaum in Makrophagen oder DZ,
wenn die Sauerstoffversorgung begrenzt wird [21, 11]. Ähnlich wie bei den hier
vorgestellten Experimenten mit M.tb, war auch im Leishmanien-Modell die
Aufklärung der molekularen Mechanismen problematisch. Folgende Mechanismen
wären denkbar und plausibel:
1.) Modulation der Zytokinfreisetzung
2.) Erhöhte Freisetzung von ROS und RNS
3.) Erhöhte Sensibilität gegenüber IFN-
4.) Erhöhte Expression von AMP
1. Infizierte Makrophagen sezernieren vor allem TNF, IL-12, IL-10 IL-15 und eine
Vielzahl von Chemokinen, wie beispielsweise CCL5 die alle das intrazelluläre
Wachstum von M.tb beeinflussen könnten. Insbesondere im Kontext der
Tuberkulose ist allen voran TNF zu berücksichtigen, da es auf mehreren Ebenen
die Interaktion von Makrophagen und Mykobakterien dirigiert [91]:
Der TNF-Rezeptor-knockout führt in der Maus zu einer verstärkten Progression
der Tuberkulose [32]. Im Gegensatz dazu fördert TNF in vitro das Wachstum
48
Diskussion
virulenter Mykobakterien in AM [26]. Ergänzend zu diesem Befund, wurde nach
medikamentöser TNF-Inhibierung vermindertes Wachstum von M.tb beobachtet
[41, 3]. Aktiviert durch den synergistischen Effekt von TNF und IFN- können
antimikrobielle Mechanismen das Wachstum von Mykobakterien in Makrophagen
der Maus inhibieren [23]. Im Mausmodell konnten sich die Bakterien verstärkt
ausbreiten, nachdem TNF mittels Antikörper neutralisiert wurde [32]. Menschen
mit der Autoimmunerkrankung Rheumatoide Arthritis, werden mit Infliximab
behandelt, um das übermäßige proinflammatorische TNF zu neutralisieren. Diese
Patienten haben ein erhöhtes Risiko an Tuberkulose zu erkranken [47].
Eine Ursache dafür liegt in der verminderten antimikrobiellen Aktivität der T EMRAZellen, welche als CD8+ Effektor Gedächtnis T-Zellen beschrieben werden. Diese
zytotoxischen Lymphozyten erfahren eine komplementvermittelte Lyse durch die
Bindung der TNF-Antikörper an das membranständige TNF dieser Zellen [13].
Für unsere Überlegungen über das intrazelluläre Wachstum und Überleben von
M.tb in Makrophagen unter sauerstoffarmen Bedingungen ist TNF allerdings nicht
relevant, da es- unabhängig von der verfügbaren Menge an Sauerstoff- in hoher
Konzentration im Zellkulturmedium nachzuweisen war. Ähnliche Befunde wurden
auch für IL-12, IL-10 und CCL5 erhoben, so dass die Zytokinfreisetzung durch
M.tb-Infektion insgesamt weitgehend unabhängig von der Verfügbarkeit von
Sauerstoff erfolgt.
2. Stickstoffradikale haben eine Schlüsselfunktion für die Abtötung von
intrazellulären Bakterien, insbesondere von M.tb. Eine iNOS knock out Maus kann
eine Infektion mit M.tb nicht kontrollieren, es kommt zu einem schweren
Krankheitsverlauf und zum Tod [60]. Eine latente Infektion mit Leishmania major
ist durch die Produktion von RNS in DZ und Makrophagen kontrollierbar [92]. Die
Induktion von NOS steht dabei im engen Zusammenhang mit der CD4 + T-Zellvermittelten IFN--Aktivierung der Makrophagen. IFN--knock out Mäuse sind nicht
in der Lage RNS zu produzieren und versagen damit bei der Immunabwehr gegen
M.tb
mittels
mikrobizider
RNS
[31].
Bronchoalveoläre
Lavagen
von
Tuberkulosepatienten weisen aktivierte, iNOS-exprimierende AM auf, die NO
produzieren [68]. Zudem kommt es bei Hypoxie zur erhöhten iNOS Expression
und NO Produktion [62].
Trotz der unumstrittenen Dominanz von Stickstoffradikalen bei der Immunabwehr
in der Maus ist die Bedeutung beim Menschen weniger klar. Insbesondere ist die
49
Diskussion
Messung
von
sezerniertem
NO
in
Zellkulturüberständen
von
aktivierten
Makrophagen problematisch [95]. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit auf eine
Untersuchung
dieser
Effektormoleküle
verzichtet.
Methodische
Weiterentwicklungen sowie Untersuchungen auf mRNA-Ebene werden in Zukunft
jedoch
dazu
beitragen,
die
Freisetzung
von
Stickstoffradikalen
unter
verschiedenen Sauerstoffspannungen miteinander zu vergleichen.
3. Das proinflammatorische Zytokin IFN- hat bei der Immunantwort gegen M.tb
eine zentrale Rolle. Dies wird auch in der Diagnostik genutzt, um mittels IGRA
eine Tuberkuloseinfektion zu erkennen.
IFN- ist insbesondere bei der Aktivierung antimikrobieller Effektormechanismen
(RNS) in infizierten Makrophagen beteiligt [24, 95]. Bei IFN--defizienten Mäusen
kommt es daher zu einem äußerst progressiven Krankheitsverlauf [31].
Dahingehend sind auch Menschen mit einer IFN-Defizienz anfälliger für eine
Mykobakterieninfektion [31]. Zudem ist die IFN-Sezernierung notwendig, um
eine Reaktivierung einer latenten M.tb-Infektion zu verhindern [85]. Exogen
zugeführtes IFN- konnte jedoch keine erhöhte antimikrobielle Aktivität in
Makrophagen, weder bei Normoxie noch bei Hypoxie, hervorrufen [63].
Die Produktion von IFN-durch CD4+ T-Zellen [17, 29] ist notwendig, um eine
Infektion mit Mykobakterien kontrollieren zu können. Die Inaktivierung dieser
Zellpopulation führt in
der Maus zu
einem
dramatischen Anstieg des
mykobakteriellen Wachstums [72]. HIV-Patienten die unter einer CD4+-Defizienz
leiden, sind daher anfälliger zusätzlich an einer Tuberkulose zu erkranken [30].
Grundlage
für
phagozytierter,
eine
effektive
mykobakterieller
T-Zellantwort
ist
Antigene.
Bei
die
Antigenpräsentation
hypoxisch
inkubierten
Makrophagen und DZ wurden unterschiedliche Ergebnisse in der Expression der
kostimulatorischen
Moleküle
CD80/CD86
und
der
antigenpräsentierenden
Moleküle MHC II und CD1a gemessen [52, 11, 42]. Im murinen Modell wurde eine
verstärkte Immunantwort unter erhöhter IFN--Sezernierung durch Makrophagen
bei Hypoxie registriert [1]. Darüber hinaus führt die Aktivierung von CD4+ T-Zellen
bei hypoxischen Bedingungen zu einer erhöhten IFN--Sezernierung [81].
In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf die Effektormechanismen der
angeborenen Immunantwort, so dass der oben ausgeführte Aspekt nicht
berücksichtigt wurde. Derzeit laufende Experimente untersuchen die Bedeutung
50
Diskussion
von T-Zellen und IFN- auf die Makrophagen-Aktivierung unter verschiedenen
Sauerstoffspannungen.
4. Der Leitbefund der vorgelegten Arbeit ist das reduzierte intrazelluläre
Wachstum von M.tb unter hypoxischen Bedingungen. In diesem Zusammenhang
haben wir die Expression von AMP untersucht, welche vom angeborenen
Immunsystem genutzt werden, um Pathogene zu bekämpfen.
Cathelicidin ist ein AMP, welches sich durch seine antimykobakterielle Wirkung
auszeichnet [56]. In unseren Experimenten konnten wir jedoch nur eine reduzierte
Expression von Cathelicidin nachweisen (Abb. 12). Granulozyten der Maus
weisen,
bedingt
durch
Hypoxie,
eine
erhöhte
Expression
von
CRAMP
(cathelicidin-related antimicrobial peptid) auf und sind somit in der Lage eine
Streptokokkokeninfektion
abzuwehren
[73].
Ebenso
wurde
humanen
Keratinozyten eine erhöhte Cathelicidin-Expression unter dem Einfluss von
Hypoxie zugesprochen [74].
Die Aktivierung von TLR2/1 ist notwendig, um bei Monozyten und Makrophagen
eine antimikrobiellen Antwort auszulösen. Im murinen System zeichnet sich diese
durch die Produktion von NO aus. Im humanen System konnten RNS und ROS
ausgeschlossen werden [95]. Nach der TLR-Aktivierung mit mykobakteriellen
Lipopeptiden bilden der Vitamin D Rezeptor (VDR) und das intrazelluläre 1,25Dihydroxyvitamin D (Vitamin D) einen Komplex, der als Transkriptionsfaktor an die
drei Bindestellen für den VDR in der Promotorregion des Cathelicidin-Gens CAMP
bindet und die Cathelicidin-Expression induziert [55].
Unter Hypoxie kommt es zur Hochregulation von TLR2 [51]. Dies könnte für den
weiteren
Verlauf
des
Vitamin
D
vermittelten
antimykobakteriellen
Effektormechanismus förderlich sein.
Die antimikrobielle Aktivität von M.tb-infizierten Makrophagen bei Hypoxie und das
damit einhergehende reduzierte Wachstum kann neben Cathelicidin auch durch
ein weiteres AMP hervorgerufen werden. Wir zeigen in dieser Arbeit eine Hypoxiebedingte Hochregulation des AMP hBD-2 (Abb. 20). HBD-2 ist nicht nur wirksam
gegen gram-positive und gram-negative Bakterien sowie gegen Pilze wie Candida
albicans [40], sondern spielt ebenfalls eine Rolle in der Abwehr gegen M.tb. Es
zeigte sich, dass hBD-2 mit Mykobakterien assoziiert ist [48, 78]. Außerdem
konnte hBD-2 eine antimykobakterielle Wirkung zugewiesen werden [55]. Darüber
51
Diskussion
hinaus
hat
HBD-2
chemotaktische
Eigenschaften,
die
auf
Zellen
des
Immunsystems wirken [33].
Die Expression von hBD-2 unterliegt neben dem Einfluss von TNF, welches nach
Infektion mit M.tb produziert wird, auch dem Einfluss von NF-B. Dieser
Transkriptionsfaktor besitzt in der Promotorregion von hBD-2 zwei Bindungsstellen
[50, 55]. Neben Infektionen und Entzündungssignale induziert auch Hypoxie die
IB-Kinase vermittelte Degradation des NF-B Inhibitors IB [77]. Zusätzlich
kommt es zu Wechselwirkungen zwischen den Transkriptionsfaktoren NF-B und
HIF-1 [94].
Um ein besseres Verständnis für den Einfluss der Hypoxie auf die Immunantwort
zu gewinnen, müssen weitere Experimente folgen. Dabei wäre es interessant die
Kolokalisation von hBD-2 und Mykobakterien zu dokumentieren. Dazu sind
folgende experimentelle Zugangswege denkbar:
 Neben einem geeigneten Antikörper für die Immunhistologie wäre die
Transfektion von Makrophagen möglich, um zu bestimmen, ob hBD-2 bei
Hypoxie produziert wird.
 Mittels Bortezomib, einem in der Klinik angewandten Proteasom-Inhibitor,
ist es möglich den Einfluss von NF-B an der hBD-2 Expression in
Makrophagen zu unterbinden. Im weiteren Verlauf dieses Experimentes
sollte nach Inkubation unter Hypoxie die CFU von M.tb bestimmt werden,
um letztlich Hinweise auf den Mechanismus des reduzierten Wachstums
vermittelt durch hBD-2 zu bekommen.
 Weitere Untersuchungsansätze könnten mit der direkten Inhibierung von
NF-B durch Helenalin oder RTA 402 durchgeführt werden.
 Untersuchungen mit siRNA knock down können die Produktion von hBD-2
verhindern, um die antimykobakteriellen Effekt aufzuklären.
Die vorgelegten Daten in dieser Arbeit enthalten Hinweise auf den Einfluss von
Hypoxie im Zusammenhang mit antimikrobiellen Effektormechanismen gegen eine
M.tb-Infektion. Zusätzlich zum AMP hBD-2 sind hypoxische Bedingungen dafür
verantwortlich, dass es in der Zelle zur Induktion von Autophagie kommt [8]. Durch
den Prozess der Autophagie ist die Abtötung von Mykobakterien in Makrophagen
möglich [39]. Zudem wurde in einer Studie ein erhöhter Spiegel an Superoxidanion
52
Diskussion
unter Hypoxie gemessen [63]. Somit kann man annehmen, dass die durch
Hypoxie gesteigerte Produktion von ROS ebenfalls zur Wachstumsreduktion von
Mykobakterien in humanen Makrophagen beiträgt.
Hypoxie beeinflusst, über die AMP-Expression hinaus, eine Vielzahl an
Effektormechanismen.
Inwieweit
diese
zur
Reduktion
des
intrazellulären
Wachstums von M.tb beitragen gilt es zukünftig zu untersuchen.
Die latente Tuberkulose ist ein weltweites Problem, da durch die große Anzahl an
betroffenen Menschen ein enormes Potential einer Aktivierung der TuberkuloseErkrankung besteht. Die hypoxischen Bedingungen am Infektionsort, so zeigt
diese Arbeit, tragen durch die erhöhte Expression des AMP hBD-2 in infizierten
Makrophagen dazu bei, eine wirksame immunprotektive Abwehr gegen M.tb zu
gewährleisten (Abb. 24).
Normoxie
Hypoxie
Viabilität
Viabilität
Phagozytose
Phagozytose
M.tb-Wachstum
M.tb-Wachstum
?
Zytokine/Chemokine
TNF
IL-10
IL-12
Zytokine/Chemokine
CCL-5
TNF
IL-10
IL-12
CCL-5
mRNA VDR
mRNA VDR
mRNA LL-37
mRNA LL-37
mRNA hBD-2
mRNA hBD-2
Abb. 24: Interaktion von humanen Makrophagen und M.tb unter hypoxischen Bedingungen
53
Zusammenfassung
Zusammenfassung
M.tb besitzt die bemerkenswerte Fähigkeit in hypoxischen Granulomen jahrelang
zu persistieren. Den Großteil ihres Lebens verbringen diese Bakterien, wie auch
ihre Wirtszellen unter sauerstoffarmen Bedingungen. Dieser Aspekt wurde in der
Vergangenheit kaum berücksichtigt, da praktisch alle immunologischen Studien
unter
atmosphärischen
und
damit
unlimitierten
Sauerstoffspannungen
durchgeführt wurden.
Ziel dieser Arbeit war es daher, die sauerstoffarmen Bedingungen eines
tuberkulösen
Granuloms
experimentell
nachzustellen
und
grundlegende
immunologische Befunde zu erheben.
In
einer
geschlossenen
Hypoxiekammer,
mit
Anschluss
an
das
Unterdrucksystems des S3-Sicherheitssystems, wurde die Interaktion humaner
Makrophagen und M.tb bei Hypoxie untersucht.
Niedrige Sauerstoffspannungen reduzierten das intrazelluläre Wachstum von M.tb
Eine reduzierte Phagozytose und die Hochregulation der Zytokinfreisetzung
wurden als Mechanismus für das reduzierte Wachstum ausgeschlossen. Im
Gegensatz dazu zeigen unsere Daten, dass die Limitation von Sauerstoff zu einer
erhöhten Expression von hBD-2 führt, welches antimikrobielle Aktivität gegen
Bakterien besitzt.
Die hier vorgelegte Arbeit betont somit die Notwendigkeit, die Sauerstoffspannung
als entscheidende Variable für immunologische Untersuchungen über WirtPathogen-Interaktion zu berücksichtigen. Die Manipulation des verfügbaren
Sauerstoffs, z.B. in infiziertem Gewebe durch biochemische Neutralisierung oder
systemisch durch eine imitierte Höhenlufttherapie, stellt möglicherweise eine neue
Strategie zur Behandlung der notorisch schwer zu therapierenden latenten
Tuberkulose dar.
54
Literaturverzeichnis
Literaturverzeichnis
1.
Acosta-Iborra B, Elorza A, Olazabal I M, Martin-Cofreces N B, Martin-Puig
S, Miro M, Calzada M J, Aragones J, Sanchez-Madrid F, Landazuri M O:
Macrophage
oxygen
sensing
modulates
antigen
presentation
and
phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1
alpha transcription factor. J.Immunol., 182: 3155-3164 (2009)
2.
Alonso S, Pethe K, Russell D G, Purdy G E: Lysosomal killing of
Mycobacterium mediated by ubiquitin-derived peptides is enhanced by
autophagy. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 104: 6031-6036 (2007)
3.
Angele M K, Schwacha M G, Smail N, Catania R A, Ayala A, Cioffi WG,
Chaudry I H. Hypoxemia in the absence of blood loss upregulates iNOS
expression and activity in macrophages. Am. J. Physiol.: 276: C285-290
(1999)
4.
Bach H, Papavinasasundaram K G, Wong D, Hmama Z, Av-Gay Y:
Mycobacterium
tuberculosis
virulence
is
mediated
by
PtpA
dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell.Host
Microbe, 3: 316-322 (2008)
5.
Baena A, Porcelli S A: Evasion and subversion of antigen presentation by
Mycobacterium tuberculosis. Tissue Antigens, 74, 189–204 (2009)
6.
Barry C E,3rd, Boshoff H I, Dartois V, Dick T, Ehrt S, Flynn J, Schnappinger
D, Wilkinson R J, Young D: The spectrum of latent tuberculosis: rethinking
the biology and intervention strategies. Nat.Rev.Microbiol., 7: 845-855
(2009)
7.
Bastian M, Braun T, Bruns H, Röllinghoff M, Stenger S: Mycobacterial
lipopeptides elicit CD4+ CTLs in Mycobacterium tuberculosis-infected
humans. J. Immunol. 180: 3436-3446 (2008)
8.
Bellot G, Garcia-Medina R, Gounon P, Chiche J, Roux D, Pouyssegur J,
Mazure N M: Hypoxia-induced autophagy is mediated through hypoxiainducible factor induction of BNIP3 and BNIP3L via their BH3 domains.
Mol.Cell.Biol., 29: 2570-2581 (2009)
9.
Betts J C, Lukey P T, Robb L C, McAdam R A, Duncan K: Evaluation of a
nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by
gene and protein expression profiling. Mol.Microbiol., 43: 717-731 (2002)
55
Literaturverzeichnis
10. Boshoff H I, Barry C E,3rd: Tuberculosis - metabolism and respiration in the
absence of growth. Nat.Rev.Microbiol., 3: 70-80 (2005)
11. Bosseto M C, Palma P V, Covas D T, Giorgio S: Hypoxia modulates
phenotype, inflammatory response, and leishmanial infection of human
dendritic cells. APMIS, 118: 108-114 (2010)
12. Brooks J V, Furney S K, Orme I M: Metronidazole therapy in mice infected
with tuberculosis. Antimicrob.Agents Chemother., 43: 1285-1288 (1999)
13. Bruns H, Meinken C, Schauenberg P, Harter G, Kern P, Modlin R L, Antoni
C, Stenger S: Anti-TNF immunotherapy reduces CD8+ T cell-mediated
antimicrobial activity against Mycobacterium tuberculosis in humans.
J.Clin.Invest., 119: 1167-1177 (2009)
14. Chan J, Fan X D, Hunter S W, Brennan P J, Bloom B R:
Lipoarabinomannan, a possible virulence factor involved in persistence of
Mycobacterium tuberculosis within macrophages. Infect.Immun., 59: 17551761 (1991)
15. Chan J, Xing Y, Magliozzo R S, Bloom B R: Killing of virulent
Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen intermediates produced by
activated murine macrophages. J.Exp.Med., 175: 1111-1122 (1992)
16. Clemens D L, Lee B Y, Horwitz M A: Deviant expression of Rab5 on
phagosomes
containing
the
intracellular
pathogens
Mycobacterium
tuberculosis and Legionella pneumophila is associated with altered
phagosomal fate. Infect.Immun., 68: 2671-2684 (2000)
17. Cooper
A
M:
Cell-mediated
immune
responses
in
tuberculosis.
Annu.Rev.Immunol., 27: 393-422 (2009)
18. Corbett E L, Watt C J, Walker N, Maher D, Williams B G, Raviglione M C,
Dye C: The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions
with the HIV epidemic. Arch.Intern.Med., 163: 1009-1021 (2003)
19. Corper H J, Cohn M L: The viability and virulence of old cultures of tubercle
bacille. Studies in twelve-year broth culture maintained at incubator
temperature. Am.Rev.Tuberc., 28:856-808 (1933)
20. Cramer T, Yamanishi Y, Clausen B E, Forster I, Pawlinski R, Mackman N,
Haase V H, Jaenisch R, Corr M, Nizet V, Firestein G S, Gerber H P, Ferrara
N, Johnson R S: HIF-1alpha is essential for myeloid cell-mediated
inflammation. Cell, 112: 645-657 (2003)
56
Literaturverzeichnis
21. Degrossoli A, Giorgio S: Functional alterations in macrophages after
hypoxia selection. Exp.Biol.Med.(Maywood), 232: 88-951 (2007)
22. Dheda K, Booth H, Huggett J F, Johnson M A, Zumla A, Rook G A: Lung
remodeling in pulmonary tuberculosis. J.Infect.Dis., 192: 1201-1209 (2005)
23. Ding AH, Nathan CF, Stuehr DJ: Release of reactive nitrogen intermediates
and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages.
Comparison of activating cytokines and evidence for independent
production. J Immunol 141:2407-2412 (1988)
24. Doi T, Ando M, Akaike T, Suga M, Sato K, Maeda H:Resistance to nitric
oxide in Mycobacterium avium complex and its implication in pathogenesis.
Infect. Immun., 61: 1980-1989 (1993)
25. Dye C, Scheele S, Dolin P, Pathania V, Raviglione M C: Consensus
statement. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence,
and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project.
JAMA, 282: 677-686 (1999)
26. Engele M, Stößel E, Castiglione K, Schwerdtner N, Wagner M, Bölcskei P,
Röllinghoff M, Stenger S: Induction of TNF in human alveolar macrophages
as a potential evasion mechanism of virulent Mycobacterium tuberculosis.
J. Immunol., 168: 1328-1337 (2002)
27. Fang H Y, Hughes R, Murdoch C, Coffelt S B, Biswas S K, Harris A L,
Johnson R S, Imityaz H Z, Simon M C, Fredlund E, Greten F R, Rius J,
Lewis C E: Hypoxia-inducible factors 1 and 2 are important transcriptional
effectors in primary macrophages experiencing hypoxia. Blood, 114: 844859 (2009)
28. Fisher M A, Plikaytis B B, Shinnick T M: Microarray analysis of the
Mycobacterium
tuberculosis
transcriptional
response
to
the
acidic
conditions found in phagosomes. J.Bacteriol., 184: 4025-4032 (2002)
29. Flesch I E, Kaufmann S H: Activation of tuberculostatic macrophage
functions by gamma interferon, interleukin-4, and tumor necrosis factor.
Infect. Immun., 58: 2675-2677
30. Flynn JL, Chan J. Tuberculosis: latency and reactivation. Infect. Immun., 69:
4195-4201 (2001)
57
Literaturverzeichnis
31. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA, Bloom BR. An
essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium
tuberculosis infection. J. Exp. Med., 178: 2249-2254 (1993)
32. Flynn J L, Goldstein M M, Chan J, Triebold K J, Pfeffer K, Lowenstein C J,
Schreiber R, Mak T W, Bloom B R: Tumor necrosis factor-alpha is required
in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis in
mice. Immunity, 2: 561-572 (1995)
33. Ganz
T:
Defensins:
antimicrobial
peptides
of
innate
immunity.
Nat.Rev.Immunol., 3: 710-720 (2003)
34. Gengenbacher M, Rao S P, Pethe K, Dick T: Nutrient-starved, nonreplicating Mycobacterium tuberculosis requires respiration, ATP synthase
and isocitrate lyase for maintenance of ATP homeostasis and viability.
Microbiology, 156: 81-87 (2010)
35. Glickman M S, Jacobs W R,Jr: Microbial pathogenesis of Mycobacterium
tuberculosis: dawn of a discipline. Cell, 104: 477-485 (2001)
36. Gomez J E, McKinney J D: M. tuberculosis persistence, latency, and drug
tolerance. Tuberculosis (Edinb), 84: 29-44 (2004)
37. Grundner C, Ng H L, Alber T: Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine
phosphatase PtpB structure reveals a diverged fold and a buried active site.
Structure, 13: 1625-1634 (2005)
38. Guida E, Stewart A: Influence of hypoxia and glucose deprivation on tumour
necrosis factor-alpha and granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor expression in human cultured monocytes. Cell.Physiol.Biochem., 8:
75-88 (1998)
39. Gutierrez M G, Master S S, Singh S B, Taylor G A, Colombo M I, Deretic V:
Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium
tuberculosis survival in infected macrophages. Cell, 119: 753-766 (2004)
40. Harder J, Schröder J M: Psoriatic scales: a promising source for the
isolation
of
human
skin-derived
antimicrobial
proteins.
J
Leukoc
Biol.:77:476-486 (2005)
41. Haraguchi S, Day N K, Kamchaisatian W, Beigier-Pompadre M, Stenger S,
Tangsinmankong N, Sleasman J W, Pizzo S V, Cianciolo GJ. LMP-420, a
small-molecule inhibitor of TNF-alpha, reduces replication of HIV-1 and
Mycobacterium tuberculosis in human cells. AIDS Res. Ther., 3:8 (2006)
58
Literaturverzeichnis
42. Jantsch J, Chakravortty D, Turza N, Prechtel A T, Buchholz B, Gerlach R G,
Volke M, Glasner J, Warnecke C, Wiesener M S, Eckardt K U,
Steinkasserer A, Hensel M, Willam C: Hypoxia and hypoxia-inducible
factor-1 alpha modulate lipopolysaccharide-induced dendritic cell activation
and function. J.Immunol., 180: 4697-4705 (2008)
43. Jayachandran R, Sundaramurthy V, Combaluzier B, Mueller P, Korf H,
Huygen K, Miyazaki T, Albrecht I, Massner J, Pieters J: Survival of
mycobacteria in macrophages is mediated by coronin 1-dependent
activation of calcineurin. Cell, 130: 37-50 (2007)
44. Karakousis P C, Yoshimatsu T, Lamichhane G, Woolwine S C,
Nuermberger E L, Grosset J, Bishai W R: Dormancy phenotype displayed
by extracellular Mycobacterium tuberculosis within artificial granulomas in
mice. J.Exp.Med., 200: 647-657 (2004)
45. Kaufmann S H: How can immunology contribute to the control of
tuberculosis? Nat.Rev.Immunol., 1: 20-30 (2001)
46. Kaufmann S H: CD8+ T lymphocytes in intracellular microbial infections.
Immunol.Today, 9: 168-174 (1988)
47. Keane J, Gershon S, Wise R P, Mirabile-Levens E, Kasznica J,
Schwieterman W D, Siegel J N, Braun M M: Tuberculosis associated with
infliximab, a tumor necrosis factor alpha-neutralizing agent. N.Engl.J.Med.,
345: 1098-1104 (2001)
48. Kisich K O, Heifets L, Higgins M, Diamond G: Antimycobacterial agent
based on mRNA encoding human beta-defensin 2 enables primary
macrophages
to
restrict
growth
of
Mycobacterium
tuberculosis.
Infect.Immun., 69: 2692-2699 (2001)
49. Klinkenberg L G, Sutherland L A, Bishai W R, Karakousis P C:
Metronidazole lacks activity against Mycobacterium tuberculosis in an in
vivo hypoxic granuloma model of latency. J.Infect.Dis., 198: 275-283 (2008)
50. Kota S, Sabbah A, Chang T H, Harnack R, Xiang Y, Meng X, Bose S: Role
of human beta-defensin-2 during tumor necrosis factor-alpha/NF-kappaBmediated innate antiviral response against human respiratory syncytial
virus. J. Biol. Chem., 283: 22417-22429 (2008)
59
Literaturverzeichnis
51. Kuhlicke J, Frick J S, Morote-Garcia J C, Rosenberger P, Eltzschig H K:
Hypoxia inducible factor (HIF)-1 coordinates induction of Toll-like receptors
TLR2 and TLR6 during hypoxia. PLoS One, 2: e1364 (2007)
52. Lahat N, Rahat M A, Ballan M, Weiss-Cerem L, Engelmayer M, Bitterman
H: Hypoxia reduces CD80 expression on monocytes but enhances their
LPS-stimulated TNF-alpha secretion. J.Leukoc.Biol., 74: 197-205 (2003)
53. Lewis J S, Lee J A, Underwood J C, Harris A L, Lewis C E: Macrophage
responses to hypoxia: relevance to disease mechanisms. J.Leukoc.Biol.,
66: 889-900 (1999)
54. Lin P L,Plessner H L, Voitenok N N, Flynn J L: Tumor necrosis factor and
tuberculosis. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 12: 22-25 (2007)
55. Liu P T, Schenk M, Walker V P, Dempsey P W, Kanchanapoomi M,
Wheelwright M, Vazirnia A, Zhang X, Steinmeyer A, Zugel U, Hollis B W,
Cheng G, Modlin R L: Convergence of IL-1beta and VDR activation
pathways in human TLR2/1-induced antimicrobial responses. PLoS One, 4:
e5810 (2009)
56. Liu P T, Stenger S, Li H, Wenzel L, Tan B H, Krutzik S R, Ochoa M T,
Schauber J, Wu K, Meinken C, Kamen D L, Wagner M, Bals R, Steinmeyer
A, Zugel U, Gallo R L, Eisenberg D, Hewison M, Hollis B W, Adams J S,
Bloom B R, Modlin R L: Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated
human antimicrobial response. Science, 311: 1770-1773 (2006)
57. Makino Y, Nakamura H, Ikeda E, Ohnuma K, Yamauchi K, Yabe Y,
Poellinger L, Okada Y, Morimoto C, Tanaka H: Hypoxia-inducible factor
regulates survival of antigen receptor-driven T cells. J.Immunol., 171: 65346540 (2003)
58. Manabe Y C, Kesavan A K, Lopez-Molina J, Hatem C L, Brooks M,
Fujiwara R, Hochstein K, Pitt M L, Tufariello J, Chan J, McMurray D N,
Bishai W R, Dannenberg A M,Jr, Mendez S: The aerosol rabbit model of TB
latency, reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome.
Tuberculosis (Edinb), 88: 187-196 (2008)
59. Mayorga L S, Bertini F, Stahl P D: Fusion of newly formed phagosomes
with endosomes in intact cells and in a cell-free system. J.Biol.Chem., 266:
6511-6517 (1991)
60
Literaturverzeichnis
60. MacMicking J D, North R J, LaCourse R, Mudgett J S, Shah S K, Nathan C
F: Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against
tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 94: 5243-5248 (1997).
61. McKinney J D, Honer zu Bentrup K, Munoz-Elias E J, Miczak A, Chen B,
Chan W T, Swenson D, Sacchettini J C, Jacobs W R,Jr, Russell D G:
Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice
requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase. Nature, 406: 735-738
(2000)
62. Melillo G, Taylor LS, Brooks A, Cox GW, Varesio L: Regulation of inducible
nitric
oxide
synthase
expression
in
IFN-gamma-treated
murine
macrophages cultured under hypoxic conditions. J. Immunol., 157: 26382644 (1996)
63. Meylan P R, Richman D D, Kornbluth R S: Reduced intracellular growth of
mycobacteria in human macrophages cultivated at physiologic oxygen
pressure. Am. Rev. Respir. Dis., 145:947-953
64. Miyakawa Y, Ratnakar P, Rao A G, Costello M L, Mathieu-Costello O,
Lehrer R I, Catanzaro A: In vitro activity of the antimicrobial peptides human
and
rabbit
defensins
and
porcine
leukocyte
protegrin
against
Mycobacterium tuberculosis. Infect.Immun., 64: 926-932 (1996)
65. Molloy A, Laochumroonvorapong P, Kapplan G: Apoptosis, but not
necrosis, of infected monoycytes is coupled with killing of intracellular
bacillus calmette-guérin. J.Ex.Med., 180:1499-1509 (1994)
66. Murdoch C, Muthana M, Lewis C E: Hypoxia regulates macrophage
functions in inflammation. J.Immunol., 175: 6257-6263 (2005)
67. Murphy W J, Taub D D, Anver M, Conlon K, Oppenheim J J, Kelvin D J,
Longo D L: Human RANTES induces the migration of human T
lymphocytes into the peripheral tissues of mice with severe combined
immune deficiency. Eur.J.Immunol., 24: 1823-1827 (1994)
68. Nathan C F: Inducible Nitric Oxide Synthase in the Tuberculous Human
Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 166:
130-131 (2002)
69. Olender S, Saito M, Apgar J, Gillenwater K, Bautista C T, Lescano A G,
Moro P, Caviedes L, Hsieh E J, Gilman R H: Low prevalence and increased
61
Literaturverzeichnis
household clustering of Mycobacterium tuberculosis infection in high
altitude villages in Peru. Am.J.Trop.Med.Hyg., 68: 721-727 (2003)
70. Paramasivan CN, Sulochana S, Kubendiran G, Venkatesan P, Mitchison
DA: Bactericidal action of gatifloxacin, rifampin and isoniazid on logarithmicand stationary-phase cultures of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob.
Agents Chemother., 49:627-631 (2005)
71. Park H D, Guinn K M, Harrell M I, Liao R, Voskuil M I, Tompa M, Schoolnik
G K, Sherman D R: Rv3133c/dosR is a transcription factor that mediates
the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. Mol.Microbiol., 48:
833-843 (2003)
72. Pedrazzini T, Hug K, Louis J A: Importance of L3T4+ and Lyt-2+ cells in the
immunologic control of infection with Mycobacterium bovis strain bacillus
Calmette-Guérin in mice. Assessment by elimination of T cell subsets in
vivo. J Immunol., 139: 2032-2027 (1987)
73. Peyssonnaux C, Boutin A T, Zinkernagel A S, Datta V, Nizet V, Johnson R
S: Critical role of HIF-1alpha in keratinocyte defense against bacterial
infection. J.Invest.Dermatol., 128: 1964-1968 (2008)
74. Peyssonnaux C, Datta V, Cramer T, Doedens A, Theodorakis E A, Gallo R
L, Hurtado-Ziola N, Nizet V, Johnson R S: HIF-1alpha expression regulates
the bactericidal capacity of phagocytes. J.Clin.Invest., 115: 1806-1815
(2005)
75. Pieters J: Mycobacterium tuberculosis and the macrophage: maintaining a
balance. Cell.Host Microbe, 3: 399-407 (2008)
76. Rich A R, Follis R H JR.: The effect of low oxygen tension upon the
development of experimental tuberculosis. Bull John Hopkins Hosp 71:345–
363 (1942)
77. Rius J, Guma M, Schachtrup C, Akassoglou K, Zinkernagel A S, Nizet V,
Johnson R S, Haddad G G, Karin M: NF-kappaB links innate immunity to
the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1alpha.
Nature, 453: 807-811 (2008)
78. Rivas-Santiago B, Schwander S K, Sarabia C, Diamond G, Klein-Patel M E,
Hernandez-Pando R, Ellner J J, Sada E: Human {beta}-defensin 2 is
expressed and associated with Mycobacterium tuberculosis during infection
of human alveolar epithelial cells. Infect.Immun., 73: 4505-4511 (2005)
62
Literaturverzeichnis
79. Robert-Koch-Institut. Aktiv gegen Tuberkulose-Strategien im Licht neuer
Entwicklungen. Epidem.Bull. 11: 81-88 (2011)
80. Roiniotis J, Dinh H, Masendycz P, Turner A, Elsegood C L, Scholz G M,
Hamilton J A: Hypoxia prolongs monocyte/macrophage survival and
enhanced glycolysis is associated with their maturation under aerobic
conditions. J.Immunol., 182: 7974-7981 (2009)
81. Roman J, Rangasamy T, Guo J, Sugunan S, Meednu N, Packirisamy G,
Shimoda LA, Golding A, Semenza G, Georas S N: T-cell activation under
hypoxic conditions enhances IFN-gamma secretion. Am. J. Respir. Cell.
Mol. Biol., 42: 123-128 (2009)
82. Rustad T R, Harrell M I, Liao R, Sherman D R: The enduring hypoxic
response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One, 3: e15021 (2008)
83. Rustad T R, Sherrid A M, Minch K J, Sherman D R: Hypoxia: a window into
Mycobacterium tuberculosis latency. Cell.Microbiol., 11: 1151-1159 (2009)
84. Saleh M T, Belisle J T: Secretion of an acid phosphatase (SapM) by
Mycobacterium tuberculosis that is similar to eukaryotic acid phosphatases.
J.Bacteriol., 182: 6850-6853 (2000)
85. Scanga C A, Mohan V P, Joseph H, Yu K, Chan J, Flynn J L: Reactivation
of latent tuberculosis: variations on the Cornell murine model. Infect
Immun., 67: 4531-4538 1999
86. Schäfer G, Jacobs M, Wilkinson R J, Brown G D: Non-opsonic recognition
of Mycobacterium tuberculosis by phagocytes. J.Innate Immun., 1: 231-243
(2008)
87. Semenza G L: Involvement of oxygen-sensing pathways in physiologic and
pathologic erythropoiesis. Blood., 114: 2015-2019 (2009)
88. Semenza G L, Roth P H, Fang H M, Wang G L: Transcriptional regulation of
genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.
J.Biol.Chem., 269: 23757-23763 (1994)
89. Sherman D R, Voskuil M, Schnappinger D, Liao R, Harrell M I, Schoolnik G
K: Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene
encoding alpha -crystallin. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 98: 7534-7539 (2001)
90. Spargo B J, Crowe L M, Ioneda T, Beaman B L, Crowe J H: Cord factor
(alpha,alpha-trehalose 6,6'-dimycolate) inhibits fusion between phospholipid
vesicles. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 88: 737-740 (1991)
63
Literaturverzeichnis
91. Stenger S: Immunological control of tuberculosis: role of tumour necrosis
factor and more. Ann.Rheum.Dis., 64 Suppl 4: iv24-8(2005)
92. Stenger S, Donhauser N, Thüring H, Röllinghoff M, Bogdan C. Reactivation
of latent leishmaniasis by inhibition of inducible nitric oxide synthase. J Exp
Med., 183: 1501-1514 (1996)
93. Stenger S, Hanson D A, Teitelbaum R, Dewan P, Niazi K R, Froelich C J,
Ganz T, Thoma-Uszynski S, Melian A, Bogdan C, Porcelli S A, Bloom B R,
Krensky A M, Modlin R L: An antimicrobial activity of cytolytic T cells
mediated by granulysin. Science, 282: 121-125 (1998)
94. Taylor C T: Interdependent roles for hypoxia inducible factor and nuclear
factor-kappaB in hypoxic inflammation. J.Physiol., 586: 4055-4059 (2008)
95. Thoma-Uszynski S, Stenger S, Takeuchi O, Ochoa M T, Engele M, Sieling
P A, Barnes P F, Rollinghoff M, Bolcskei P L, Wagner M, Akira S, Norgard
M V, Belisle J T, Godowski P J, Bloom B R, Modlin R L: Induction of direct
antimicrobial activity through mammalian toll-like receptors. Science, 291:
1544-1547 (2001)
96. Tsai M C, Chakravarty S, Zhu G, Xu J, Tanaka K, Koch C, Tufariello J,
Flynn J, Chan J: Characterization of the tuberculous granuloma in murine
and human lungs: cellular composition and relative tissue oxygen tension.
Cell.Microbiol., 8: 218-232 (2006)
97. Vandiviere H M, Loring W E, Melvin I, Willis S: The treated pulmonary
lesion and its tubercle bacillus.
II. The death and resurrection.
Am.J.Med.Sci., 232: 30-37 (1956)
98. Vergne I, Chua J, Deretic V: Tuberculosis toxin blocking phagosome
maturation inhibits a novel Ca2+/calmodulin-PI3K hVPS34 cascade.
J.Exp.Med., 198: 653-659 (2003)
99. Vergne I, Chua J, Lee H, Lucas M, Belisle J, Deretic V: Mechanism of
phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 102: 4033-4038 (2005)
100. Via L E, Lin P L, Ray S M, Carrillo J, Allen S S, Eum S Y, Taylor K, Klein E,
Manjunatha U, Gonzales J, Lee E G, Park S K, Raleigh J A, Cho S N,
McMurray D N, Flynn J L, Barry C E,3rd: Tuberculous granulomas are
hypoxic in guinea pigs, rabbits, and nonhuman primates. Infect.Immun., 76:
2333-2340 (2008)
64
Literaturverzeichnis
101. Walburger A, Koul A, Ferrari G, Nguyen L, Prescianotto-Baschong C,
Huygen K, Klebl B, Thompson C, Bacher G, Pieters J: Protein kinase G
from pathogenic mycobacteria promotes survival within macrophages.
Science, 304: 1800-1804 (2004)
102. Wayne L G, Lin K Y: Glyoxylate metabolism and adaptation of
Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions.
Infect.Immun., 37: 1042-1049 (1982)
103. Wayne L G, Sramek H A: Metronidazole is bactericidal to dormant cells of
Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob.Agents Chemother., 38: 2054-2058
(1994)
104. Werth N, Beerlage C, Rosenberger C, Yazdi A S, Edelmann M, Amr A,
Bernhardt W, von Eiff C, Becker K, Schafer A, Peschel A, Kempf V A:
Activation of hypoxia inducible factor 1 is a general phenomenon in
infections with human pathogens. PLoS One, 5: e11576 (2010)
105. World Health Organization: WHO Report 2010 Global tuberculosis control
106. Yao S Y, Soutto M, Sriram S: Bacterial cell wall products increases
stabilization of HIF-1 alpha in an oligodendrocyte cell line preconditioned by
cobalt chloride or desferrioxamine. J.Neuroimmunol., 200: 17-26 (2008)
107. Yun J K, McCormick T S, Villabona C, Judware R R, Espinosa M B,
Lapetina E G: Inflammatory mediators are perpetuated in macrophages
resistant to apoptosis induced by hypoxia. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 94:
13903-13908 (1997)
108. Zarember K A, Malech H L. HIF-1alpha: a master regulator of innate host
defenses? J. Clin. Invest., 115: 1702-1704 (2005)
65
Danksagung
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich ganz besonders bei meinem Doktorvater Prof.
Dr. Steffen Stenger bedanken. Er hat mich bei der Arbeit stets unterstützt,
gefördert und gefordert. Aber auch außerhalb des Dienstes an der Wissenschaft
hat er mir mit Rat und Tat zur Seite gestanden.
Großen Dank richte ich auch an Herrn Prof. Dr. Stefan Kochanek, der sich
freundlicherweise bereit erklärt hat, diese Arbeit zu begutachten.
Darüber hinaus geht mein Dank an die weiteren Mitwirkenden des Instituts für
Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums Ulm, wie Frau
Prof. Dr. Spellerberg, Herrn Prof. Dr. Essig, Frau Dr. Fieser, Frau Dr. ForsbachBirk und Herrn PD Dr. van Zandbergen. Besonders erwähnen möchte ich Herrn
Dr. Poppert, der mich zu Beginn in Ulm gut unterstützte.
Für den guten Draht zu allen TAs des Instituts möchte ich mich auch bedanken.
Man konnte stets auf ihre Hilfe bauen.
Dann sind da natürlich noch Kiki, Nina, Max, Michi, Valeska, Anja, Claudia, Benny,
Martin, Steffi und Daniel. Die gesamte alte, wie neue Besatzung des MyTbLabs
hab ich ins Herz geschlossen und ich erinnere mich gern an die schöne Zeit im
Labor ums Labor und ums Labor herum. Zusammen Ergebnisse besprechen,
Hilfsbereitschaft und zusammen lachen, das gab´s mit dem Team immer. Lieben
Dank an Heiko, der in allen Belangen immer ein offenes Ohr hat(te).
Natürlich möchte ich mich auch ganz herzlich bei meinen Eltern bedanken, die
mich immer unterstützt haben und mich auch aus der Ferne mit guten
Ratschlägen versorgten. Auch an meine (fast) Schwiegereltern ein herzliches
Dankeschön.
Zum Schluss möchte ich natürlich auch meiner Verlobten Mareile ganz herzlich
danken. Ihre große Unterstützung, ihr Verständnis und ihre Nähe haben mich
permanent bei der Promotion begleitet und mir den Rücken gestärkt.
66