Klinische Aussagekraft des EliA anti-TSH-R Thomas Luther1, Sigrid Sjölander2, Matthias Kast2, Christian Konrad2 1 Medizinisches Labor Ostsachsen, 02625 Bautzen, Germany, 2Thermo Fisher Scientific, Uppsala, Sweden. Bei Fragen kontaktieren Sie bitte: [email protected] Abstract Hintergrund Der Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons (TSH-R) spielt gemeinsam mit dem Thyreoidea-stimulierenden Hormon (TSH) bei der Regulierung der Schilddrüsenfunktion eine zentrale Rolle. Bei diesem Protein handelt es sich um ein primäres Antigen bei der Hyperthyreose Morbus Basedow, und das Vorliegen TSH-Rspezifischer Antikörper ist ein diagnostisches Kriterium für diese Erkrankung. In neueren Studien wurde die Bedeutung vollautomatischer Assays für die ­Messung von TSH-R-spezifischen Antikörpern bei der Diagnose insbesondere von Morbus Basedow erkannt. Ziel Gegenstand der Studie war die Untersuchung der Aussagekraft des vollautomatisierten, quantitativen EliA ® antiTSH-R-Tests (Phadia AB, Uppsala, Schweden), der zur kompetitiven Messung von spezifischen Serumantikörpern gegen die TSH-bindende Domäne des TSH-R entwickelt wurde. Die Leistungsdaten des EliA anti-TSH-R-Tests wurden anhand von 100 klinisch definierten Serumproben von unbehandelten und behandelten Patienten mit Morbus Basedow untersucht. Serumproben von 100 Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis und 200 Patienten mit anderen Erkrankungen dienten als Kontrolle. Zum Vergleich wurden zwei weitere automatisierte Tests zur Messung von anti-TSH-R-Antikörpern von unterschiedlichen Herstellern in die Untersuchung einbezogen. Ergebnisse EliA anti-TSH-R zeigte in der Studie eine hohe Sensitivität von 79 % und eine hervorragende Spezifität von 97,7 %. Werden die innerhalb des grenzwertigen Bereichs liegenden Proben als positiv bewertet, so lag die Sensitivität bei 83 % und die Spezifität bei 97,3 %. Im Vergleich mit den Tests der Hersteller 1 und 2 zeigte EliA anti-TSH-R bei ähnlicher Sensitivität eine höhere Spezifität. Insgesamt lag die Übereinstimmung mit Hersteller 1 bei 93,2 % und mit Hersteller 2 bei 95,3 %. Fazit Der EliA anti-TSH-R-Test zeigte gute klinische Leistungsdaten mit hoher Sensitivität und hervorragender Spezifität. EliA anti-TSH-R unterstützt die Diagnose und Beurteilung von Patienten mit Morbus Basedow. Hintergrund Morbus Basedow Die Hyperthyreose Morbus Basedow ist eine der häufigsten Autoimmunerkrankungen weltweit mit einer jährlichen Inzidenz von 14 bis 80 pro 100.000 Personen pro Jahr1,2. Morbus Basedow tritt bei Frauen häufiger auf als bei Männern (das Verhältnis liegt bei etwa 5 zu 1) und kann in jedem Alter beginnen, auch in der Kindheit3,4. Die Erkrankung wird durch eine unkontrollierte Überproduktion der Schilddrüsenhormone T3 und T4 ausgelöst, was zu den typischen Symptomen wie Thyreotoxikose, Struma und Ophthalmopathie führt. Das wichtigste Autoantigen bei Morbus Basedow ist der Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons (TSH-R)5. Im Vergleich zu den meisten anderen Auto­ immunerkrankungen ermöglicht die Identifizierung dieses spezifischen serologischen Markers eine klarere und genauere Diagnose von Morbus Basedow. Das Vorhandensein von Antikörpern gegen den TSH-Rezeptor ist das Merkmal von Morbus Basedow und dient auch zur Bestätigung der Ursache der Thyreotoxikose1. Antikörper gegen den TSH-Rezeptor sowie Ophthalmopathie und/oder Dermopathie sowie eine diffuse erhöhte Radio­ jodaufnahme der Schilddrüse spielen bei der Diagnose der Erkrankung eine wichtige Rolle1,6. Der Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons Der TSH-Rezeptor ist das zentrale Antigen für Auto­ antikörper bei Morbus Basedow7 und gehört zur großen Proteinfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen eine Rolle spielen7,8. Das Protein besteht aus zwei Hauptuntereinheiten, einer Domäne mit sieben trans­ membranständigen Helixstrukturen und einer extrazellulären Domäne mit neun Leucin-reichen Sequenzen, die durch eine Hinge-Domäne zusammengehalten werden. Wenn das Thyreoidea-stimu­lierende Hormon (TSH) an den TSH-Rezeptor bindet, wird Adenylat­ cyclase aktiviert, um die Umwandlung von Adenosintriphosphat in zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) zu katalysieren, wodurch das Wachstum der Schilddrüse und die Produktion von Schilddrüsenhormonen stimuliert wird. So wie auch TSH, können bei Patienten mit Morbus Basedow Autoantikörper die TSH-Rezeptoren ­ aktivieren, indem sie an die Epitope der TSH-bindenden Domäne der Rezeptoren binden6. Diese sogenannten Thy­reoidea-stimulierenden Antikörper imitieren die Wirkung des TSH und verursachen so die Überproduktion von Schild­drüsenhormonen, was vermutlich wesentlich dazu beiträgt die Erkrankungssymptome auszulösen6. Assaydesigns für die Messung von Autoantikörpern gegen den TSH-Rezeptor Auf dem Markt sind zahlreiche Tests für die Messung von TSH-R-Autoantikörpern zur serologischen Diagnose von Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse erhältlich, die grundsätzlich in zwei Assay-Arten unterteilt werden können: • Bioassays, die auf der Interaktion zwischen Auto­anti­ körpern im Patientenserum und TSH-Rezeptoren auf lebenden Zellen basieren, und • Immunoassays, die auf der Kompetition zwischen dem TSH und den Autoantikörpern bei der Bindung an den TSH-Rezeptor basieren. Bioassays verwenden menschliche Schilddrüsenzellen, die mit human-rekombinanten TSH-Rezeptoren transfi- YY Situation 1 Keine spezifischen anti-TSH-R-Antikörper gegen Epitope der TSH-bindenden Domäne in der Patientenprobe. Bindung des Konjugats an immobilisierten human rekombinanten TSH-Rezeptor (Signal). YY Domänenstruktur TSH-Rezeptor Domänenstruktur DomänenstrukturTSH-Rezeptor TSH-Rezeptor TSH-bindende Domäne TSH-bindende TSH-bindendeDomäne Domäne Hinge-Domäne Hinge-Domäne Hinge-Domäne Transmembrandomäne Transmembrandomäne Transmembrandomäne 2 YYY Capture-Antikörper Capture-Antikörper für die Immobilisierung des Capture-Antikörper für des fürdie dieImmobilisierung Immobilisierung des TSH-R human rekombinanten human humanrekombinanten rekombinantenTSH-R TSH-R YY YY Abbildung 1: Schematische Darstellung des EliA anti-TSH-R-Testdesigns. Y YY Situation 2 Vorliegen von spezifischen anti-TSH-R-Antikörpern gegen Epitope der TSH-bindenden Domäne in der Patientenprobe. Die Bindung des Konjugats an den immobilisierten human rekombinanten TSH-Rezeptor wird gehemmt (kein Signal). YY Konjugat Konjugat β-Galactosidase-markierter, monoklonaler Konjugat β-Galactosidase-markierter, monoklonaler β-Galactosidase-markierter, monoklonaler stimulierender anti-TSH-R-Antikörper stimulierender stimulierenderanti-TSH-R-Antikörper anti-TSH-R-Antikörper YYY Anti-TSH-RAnti-TSH-RAnti-TSH-RAutoantikörper Autoantikörper Autoantikörper White paper: EliA anti-TSH-R Assay ziert und zur Messung der cAMP-Produktion mit Patientenserum inkubiert werden. Solche Assays weisen eine hohe Spezifität auf, sind allerdings auch sehr aufwändig. Daher wird diese Art von Bioassays heute fast ausschließlich zu Forschungszwecken eingesetzt. Bei der ersten Generation von Immunoassays handelte es sich um einen Aufbau mit flüssiger Reaktionsphase unter Verwendung von Extrakten aus porcinen Schilddrüsenmembranen, bei dem die Inhibition der Bindung von radioaktiv markiertem TSH an TSH-Rezeptoren durch Autoantikörper untersucht wurde12. Immunoassays der zweiten Generation verwendeten monoklonale TSH-Rspezifische Capture-Antikörper, die zur Bindung von rekombinant produzierten humanen TSH-Rezeptoren an eine Festphase adsorbiert wurden und die Hemmung der Bindung von markiertem TSH untersuchten13. In einer Weiterentwicklung wurde das markierte TSH durch einen markierten monoklonalen TSH-R-stimulierenden Antikörper ersetzt14. Diese Art von Immunoassay, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt und beim Design des EliA anti-TSH-R eingesetzt, findet in Laboratorien routinemäßig Anwendung, insbesondere weil sie auf automatisierten Systemen erhältlich ist. Die Verwendung monoklonaler TSH-R-stimulierender Antikörper in Ver­bin­ dung mit automatisierten Testsystemen wird gewöhnlich als dritte Generation der anti-TSH-R-Antikörper-Assays bezeichnet. Klinischer Nutzen der TSH-R-Antikörperbestimmung Unter Verwendung von Immunoassays der zweiten und dritten Generation sind Antikörper gegen den TSHRezeptor im Serum fast aller unbehandelten Patienten mit Morbus Basedow zu finden6,10. Zusammen mit anderen klinischen Parametern (z. B. niedriger TSHSpiegel, erhöhte T3- und T4-Spiegel, erhöhte Radiojodaufnahme der Schilddrüse) liefert die Bestimmung der ­anti-TSH-R-­Antikörper eine w ­ eitere Hilfe bei der Abgrenzung von Morbus Basedow von anderen Ursachen einer Thyreotoxikose9,15. Die Konzentration von Antikörpern gegen den TSH-Rezeptor korreliert auch mit der Schwere von Morbus Basedow und dem Grad der Beteiligung der Augen16. Wenn Morbus Basedow-Patienten behandelt werden, fällt die Konzentration der TSH-R-Antikörper gewöhnlich ab; deshalb wird ihre Präsenz bzw. ihr Fehlen als Indikator für die Wirksamkeit der Therapie und zur Remissionsprognose eingesetzt17. Außerdem können anti-TSH-R-Antikörper die Plazenta passieren und bei schwangeren Frauen mit Morbus ­Basedow den Embryo schädigen, weshalb ihr Vorhandensein der Beurteilung des Risikos einer fetalen/neonatalen T ­ hyreotoxikose dient 18. Methoden Testprinzip des EliA anti-TSH-R Kompetitiver Assay zur Messung der Konzentration von Antikörpern gegen den Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons (TSH-R). Technische Validierung Limit of blank (LoB, Leerwertgrenze), Limit of detection (LoD, Nachweisgrenze) und Limit of quantification (LoQ, Bestimmungsgrenze): • LoB, LoD und LoQ wurden basierend auf der CLSIRichtlinie EP17-A219 mit zwei verschiedenen Chargen des EliA anti-TSH-R-Wells in zwei unterschiedlichen Testansätzen auf dem gleichen Phadia® 250 Labor­ system bestimmt. • Zur Bestimmung der LoB wurde eine negative Probe in 33 Wiederholungen in jedem der zwei Testansätze gemessen (Gesamtanzahl der Wiederholungen: 66). • Zur Bestimmung der LoD und LoQ wurden drei negative Proben mit Konzentrationen im 5. Perzentil der Normalverteilung in jedem der zwei Durchläufe in 11 Wiederholungen gemessen (Gesamtanzahl der Wiederholungen: 66). Präzision: Die Präzision wurde an sieben Tagen auf drei Phadia 250 Laborsystemen durch die Messung von drei Patienten­ White paper: EliA anti-TSH-R Assay proben in 21 Testansätzen mit vier Wiederholungen für jede der drei getesteten Chargen des EliA anti-TSH-RWells analysiert. 20 Erwartete Werte: Seren von 400 augenscheinlich gesunden Blutspendern wurden mit einer Charge des EliA anti-TSH-R-Wells auf einem Phadia 250 Laborsystem untersucht. Cut-off des Assays: Der Cut-off des EliA anti-TSH-R wurde auf Grundlage der Analyse zweier unabhängiger Abnahmen von Routine­ seren mit 662 bzw. 875 Proben bestimmt. Kalibrierungsstandard: Der derzeit gültige internationale WHO-Standard „2. in­ter­­nationaler Standard für Thyreoidea-stimulierende Anti­körper“ (2nd International Standard for Thyroid Stimulating Antibody, NIBSC-Code: 08/204) stammt vom National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC)21. Diagnostische Genauigkeit 400 klinisch definierte Serumproben von 100 Patienten mit Morbus Basedow mit und ohne therapeutische Be­­ handlung und 300 Kontrollproben (100 Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis, 50 Patienten mit nicht-auto­ immunen Schilddrüsenerkrankungen, 25 Patienten mit 3 Kolla­­genose, 10 Patienten mit chronisch-entzündlicher Darm­ erkrankung, 10 Patienten mit primär biliärer Zirrhose, 80 Patienten mit Infektionserkrankungen (z. B. HIV, HBV, HCV, 25 Krebspatienten) wurden mit dem EliA anti-TSH-R analysiert. Diese 400 Serumproben sollten einen Querschnitt der Patientenproben darstellen, die im klinischen Labor normalerweise auf anti-TSH-RAntikörper untersucht werden. Die Proben wurden auch mit zwei weiteren automatischen anti-TSH-R-Tests von verschiedenen Herstellern unter Beachtung der entsprechenden Gebrauchsanweisung und Cut-off-Empfehlung analysiert. Die diagnostische Genauigkeit wurde mittels kommerzieller Software (Analyze-it, ­GraphPad Prism 4) bestimmt. EliA anti-TSH-R unterscheidet sich von diesen Tests da­durch, dass er einen grenzwertigen Messbe- reich aufweist. Daher wurde die diagnostische Genauigkeit unter Berücksichtigung der Ergebnisse sowohl im negativen als auch im positiven Grenzbereich errechnet. Zur besseren Vergleichbarkeit der drei Tests wurden die Daten der Receiver-­ Operating-Characteristic-Kurven (ROC-Kurven) verwendet, um die Sensitivität bei einer bestimmten (festgelegten) Spezifität zu vergleichen. Radioimmunoassay In einer weiteren Studie wurden 900 Routineproben mit dem EliA anti-TSH-R und den zwei weiteren automatischen Tests untersucht. Um die Unterschiede zwischen diesen Assays genauer zu analysieren, wurden 93 Proben, die bei einem der drei automatischen Tests einen erhöhten anti-TSH-R-Antikörper-Titer aufwiesen, zusätzlich mit dem BRAHMS TRAK human RIA untersucht. Ergebnisse Kalibrierung des Assays Der EliA anti-TSH-R ist anhand des 2. internationalen WHO-Standards für Thyreoidea-stimulierende Anti­ körper (NIBSC-Code: 08/204) eingestellt, der vom National Insti­tute for Biological Standards and Controls (NIBSC) stammt 21. EliA anti-TSH-R Well Technische Leistungsdaten des EliA anti-TSH-R Siehe Tabelle 1 (LoB, LoD und LoQ), Tabelle 2 (Präzision), Tabelle 3 (erwartete Werte) und Tabelle 4 (Cut-off des Assays). LoB [IU/l] LoD [IU/l] LoQ [IU/l] Charge 1 0,6 1,4 1,5 Charge 2 0,6 1,2 1,2 Ausgewiesener Wert 0,6 1,4 1,5 Tabelle 1: LoB-, LoD- und LoQ-Werte (IU/l) wurden für zwei Chargen von EliA anti-TSH-R-Wells bestimmt, um den Messbereich von 1,5-80 IU/l festzulegen Probe Mittelwert [IU/l] Intra-Assay VK [%] Inter-Assay VK [%] 1 3,2 10,6 11,4 2 25,5 3,4 3,2 3 53,0 3,8 3,8 Tabelle 2: Analyse der Präzision von EliA anti-TSH-R anhand von drei Proben, 252 Messungen pro Probe während sieben Tagen und einer monatlichen Kalibrierung. EliA anti-TSH-R Probenanzahl Median [IU/l] 95 %-Perzentil 98 %-Perzentil 400 1,5 2,6 2,7 Tabelle 3: Erwartete Werte von anti-TSH-R-Antikörpern im Serum von 400 augenscheinlich gesunden Blutspendern bei Analyse mit dem EliA anti-TSH-R. Negativ [IU/l] Grenzwertiger Bereich [IU/l] Positiv [IU/l] < 2,9 2,9 – 3,3 > 3,3 Tabelle 4: Cut-off des Assays: Der Cut-off des EliA anti-TSH-R basiert auf zwei Abnahmen von Routineserum mit 662 bzw. 875 Proben. 4 White paper: EliA anti-TSH-R Assay Klinische Leistungsdaten des EliA anti-TSH-R 50 5 4 Cut-off 3 Grenzwertiger Bereich IU/l 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Abbildung 2: Klinische Leistungsdaten des EliA anti-TSH-R anhand von 400 klinisch definierten Seren: 1 behandelte und unbehandelte Patienten mit Morbus Basedow (n=100); 2 Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis (n=100); 3 Patienten mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen (n=50); 4 Pa­tienten mit Kollagenose (n=25); 5 Patienten mit chronisch-entzündlicher Darmerkrankung (n=10); 6 Patienten mit primär biliärer Zirrhose (n=10); 7 Patienten mit Infektionskrankheit (z. B. HIV, HBV, HCV, n=80); 8 Patienten mit Krebs (n=25). Spezifität [%] Sensitivität [%] LR + LR - PPV NPV EliA anti-TSH-R (Cut-off > 2,9 IU/l) 97,3 83,0 31,31 0,18 0,91 0,95 EliA anti-TSH-R (Cut-off > 3,3 IU/l) 97,7 79,0 33,86 0,22 0,92 0,93 Hersteller 1 (empfohlener Cut-off) 92,0 85,0 10,63 0,16 0,78 0,95 Hersteller 2 (empfohlener Cut-off) 94,0 84,0 14,00 0,17 0,82 0,95 Leistungsdaten bei festgelegter Spezifität: Hersteller 1 97,7* 79,0 33,90 0,22 0,92 0,93 Hersteller 2 97,7* 71,0 30,40 0,30 0,91 0,91 Tabelle 5: Leistungsdaten des EliA anti-TSH-R bei 400 klinisch definierten Seren unter Berücksichtigung der Proben innerhalb des grenzwertigen positiven (Cut-off > 2,9 IU/l) und negativen Bereichs (Cut-off > 3,3 IU/l) – siehe die in Abbildung 2 beschriebene Kohorte (interne Studie). *festgelegte Spezifität bei 97,7; LR +: positive likelihood Ratio; LR -: negative likelihood Ratio; PPV: positiver Vorhersagewert; NPV: negativer Vorhersagewert Übereinstimmung mit dem Radioimmunoassay (RIA) In einer weiteren Studie wurden 900 Routineproben analysiert. Es wurde eine hohe allgemeine Übereinstimmung der drei in Tabelle 5 erwähnten Tests bestätigt. 93 Proben, die in einem der Tests einen erhöhten Titer aufwiesen, wurden zusätzlich mit dem BRAHMS TRAK human RIA untersucht, um die Unterschiede der Titerwerte genauer zu analysieren. Der BRAHMS TRAK human RIA gilt als Goldstandard für die Bestimmung von anti-TSHR-Antikörpern. White paper: EliA anti-TSH-R Assay Im Vergleich zu den Tests von den Herstellern 1 und 2 zeigte der EliA anti-TSH-R die beste Übereinstimmung mit dem BRAHMS TRAK human RIA bei den 93 getesteten Seren (Tabelle 6). Übereinstimmung mit dem RIA EliA anti-TSH-R 0,81 Hersteller 1 0,60 Hersteller 2 0,63 Tabelle 6: Pearson Korrelation verschiedener automatisierter antiTSH-R Assays mit BRAHMS TRAK human RIA bei 93 Seren, die einen erhöhten Titer in einer der automatisierten Assays zeigten. 5 Übereinstimmung mit dem BRAHMS TRAK human KRYPTOR mung von 93,3 % zwischen dem EliA anti-TSH-R und dem BRAHMS TRAK human KRYPTOR. Der EliA anti-TSH-R verwendet das gleiche rekombinante humane TSH-R-Antigen und den gleichen TSHR-­ stimulierenden Antikörper wie der BRAHMS TRAK human K ­RYPTOR-Assay, der ebenfalls von Thermo ­Fisher Scientific angeboten wird. Die Analyse des in Abbildung 2 beschriebenen SerumPanels zeigte eine sehr hohe allgemeine Übereinstim- UK NEQAS-Analysen zur Untersuchung von Serumproben bei allgemeinen Auto­immun­ erkrankungen UK NEQAS-Probe EliA anti-TSH-R [IU/l] Zielergebnis Übereinstimmung Der EliA anti-TSH-R zeigt eine 100-prozentige Überein­ stimmung mit der erwarteten Reaktion in den Serum­ proben des internationalen Ringversuchs UK NEQAS (Tabelle 7). 144-3 145-3 146-3 151-3 152-3 153-3 155-3 156-3 161-3 5,9 4,4 3,5 <0,01 10,9 16,2 3,5 0,5 1,2 Positiv Positiv Positiv Negativ Positiv Positiv Positiv Negativ Negativ + + + + + + + + + Tabelle 7: Der EliA anti-TSH-R zeigt eine 100-prozentige Übereinstimmung mit der erwarteten Reaktion in den Serumproben des UK NEQAS. Fazit Der EliA anti-TSH-R zeigte • bei der Untersuchung von Seren von Patienten mit Morbus Basedow (behandelt und unbehandelt) und von Kontrollproben (unter anderem von Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis) eine hohe Sensitivität und eine hervorragende Spezifität. • beim Vergleich mit automatisierten Tests von zwei anderen Herstellern neben einer vergleichbaren Sensitivität eine höhere Spezifität. • eine hohe allgemeine Übereinstimmung mit dem BRAHMS TRAK human KRYPTOR. • dass er die klinische Diagnose von Morbus Basedow (autoimmun bedingte Hyperthyreose) unterstützen kann. 6 White paper: EliA anti-TSH-R Assay Quellen 1. Menconi F, Marcocci C, Marinò M. Diagnosis and classification of ­Graves' disease. Autoimmun Rev. 2014;13:398-402. 2. Cooper GS, Stroehla BC. The epidemiology of autoimmune diseases. Autoimmun Rev. 2003;2:119-25. 3. McLeod DS, Cooper DS. The incidence and prevalence of thyroid autoimmunity. Endocrine. 2012;42:252-65. 4. Dong YH, Fu DG. 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