On the evolution of gene expression and sex - ETH E
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Diss. ETH No. 21486 On the evolution of gene expression and sex chromosomes in dioecious White Campion (Silene latifolia) A dissertation submitted to the ETH ZURICH for the degree of DOCTOR OF SCIENCES presented by Niklaus Zemp MSc ETH Biology, ETH Zurich born June 7, 1984 citizen of Entlebuch (LU) accepted on the recommendation of Prof. Dr. Alex Widmer, examiner Prof. Dr. Gabriel Marais, co-examiner Prof. Dr. Bruce McDonald, co-examiner 2013 Summary Sex chromosomes have attracted the interest of many researchers, and especially of evolutionary biologists, since their discovery more than 100 years ago. These often morphologically distinguishable chromosomes are carriers of evolutionary important genes, such as sex determining genes or genes underlying sexual dimorphism. Sex chromosomes can be found in animals, plants and fungi. Most of the empirical data, however, is available from animal systems in which sex chromosomes are evolutionary old. Plant sex chromosomes, in contrast, are often evolutionary much younger and dioecious species with heteromorphic sex chromosomes may be closely related to species that do not have separate sexes and consequently lack sex chromosomes. This situation facilitates studies of evolutionary changes associated with the origin of separate sexes and sex chromosomes. The aim of my PhD thesis was to investigate the evolution of separate sexes and sex chromosomes in the dioecious Silene latifolia, a plant with evolutionary young heteromorphic sex chromosomes, using RNA-seq, a transcriptome based next generation sequencing method. For the first chapter, we massively increased the numbers of characterized genes located on the sex chromosome using a segregation analysis of RNA-seq data from multiple S. latifolia males (XY) and females (XX). We then determined allele-specific expression levels of these sex-linked genes in male plants and found a substantial reduction of the expression of Y-linked alleles, compared to the X-linked alleles, as a consequence of Y chromosome degeneration. We then could provide evidence that the reduced expression of Y-linked contigs is compensated by a stronger expression of the X-linked alleles that helps equalizing gene dosage between males and females. This phenomenon is known as dosage compensation. Our results suggest that dosage compensation is not restricted to animal systems and has evolved de novo less than 10 million years ago. In the second chapter we identified genes that are predominately expressed in either S. latifolia males or females and then compared these expression patterns with those in the closely related gynodioecious species S. vulgaris. We found that genes with a sex-biased expression in S. latifolia are preferentially accumulated on the sex chromosomes, as postulated theoretically and reported primarily in evolutionary much older animal systems. We further Summary found evidence for X chromosome demasculinization and Y chromosome masculinization that is in line with empirical data from species with old sex chromosomes. Moreover, female-biased expression has predominantly been evolved by up-regulation and male-biased expression by down-regulation in females relative to the expression patterns in the cosexual ancestor. Our results represent the first empirical study that reveal how genes with sex-biased expression have evolved and that sex-biased expression may at least partly reduce sexual conflicts. In the third chapter, we used our RNA-seq data to efficiently identify new candidate reference genes. These are important to adequately normalize quantitative real time (qRT)PCR data. We present the first validated catalogue of reference genes for S. latifolia that allow the investigation of gene expression differences between the two sexes in reproductive (flower buds) and vegetative tissues (rosette leaves). Our qRT-PCR data further revealed a reduced sex-bias in vegetative compared to reproductive tissues for genes located on the S. latifolia sex chromosomes. In the fourth chapter, we investigated how the transcriptome of S. latifolia males and females changed upon infection by the anther-smut fungus Microbotryum violaceum, which induces a partial sex reversal in infected females. We found that a substantial part of the transcriptome was differentially expressed upon infection, and that transcriptomic changes of many genes were highly sex-dependant. Genes with a sex-biased expression in healthy plants were preferentially affected by the infection, in particular genes with a male-biased expression. Genes in infected females were predominantly up-regulated and genes on the sex chromosomes were inferred to contribute substantially to the transcriptional masculinization of the infected females, which is in line with morphological changes caused by the infection. Infected males, in contrast, showed a transcriptional demasculinization, which was not expected based on morphology. Our data revealed that parasites can have strong sex-dependant effects on hosts with separate sexes and that transcriptional changes may be complex, even in the absence of clear morphological changes. This study further showed that recent advances in nucleotide sequencing technology allow the detailed analysis of long-standing questions and hypothesis in species with hitherto unknown genomes, as well as the investigation of fascinating and novel questions. 6 Zusammenfassung Geschlechtschromosomen haben das Interesse von vielen Forschern, darunter vor allem Evolutionsbiologen, seit ihrer Entdeckung vor mehr als 100 Jahren geweckt. Diese morphologisch oft unterscheidbaren Chromosomen tragen evolutionär wichtige Gene, wie zum Beispiel Gene, welche das Geschlecht bestimmen oder die Ausprägung von Geschlechtsunterschieden (Sexualdimorphismus) beeinflussen. Geschlechtschromosomen findet man bei Tieren, Pflanzen und Pilzen. Empirische Daten stammen jedoch vorwiegend von Tieren, deren Geschlechtschromosomen evolutionär alt sind. Pflanzliche Geschlechtschromosomen sind oftmals deutlich jünger und diözische Arten mit heteromorphen Geschlechtschromosomen sind oft nahe verwandt mit zwittrigen Arten ohne Geschlechtschromosomen. Diese Situation erleichtert es, evolutive Veränderungen während der Entwicklung von getrennten Geschlechtern und Geschlechtschromosomen zu untersuchen. Das Ziel meiner Dissertation war die Erforschung der Evolution von getrennten Geschlechtern und Geschlechtschromosomen bei der zweihäusigen weissen Lichtnelke, Silene latifolia, eine Pflanze mit evolutionär jungen, morphologisch unterscheidbaren (heteromorphen) Geschlechtschromosomen. Für diese Untersuchungen wurde die “RNA-seq” Methode verwendet, welche das Transkriptom des Studienorganismus’ mittels modernster Hochdurchsatzverfahren sequenziert. Im ersten Kapitel wird dargestellt, wie wir die Anzahl identifizierter Gene auf den Geschlechtschromosomen massive erhöhen konnten, indem wir eine Segregationsanalyse, basierend auf RNA-seq Daten von mehreren Weibchen (XX) und Männchen (XY), durchführten. Anhand der allel-spezifischen Expression dieser Gene in den männlichen Pflanzen konnten wir eine substanzielle Reduktion der Expression von Allelen auf dem Y Chromosom, relativ zur Expression der Allele auf dem X Chromosom, nachweisen. Diese reduzierte Expression weist auf die Degeneration des Y Chromosoms hin. Darüberhinaus fanden wir, dass die reduzierte Expression der Y Allele mittels einer stärkeren Expression der X-Allele kompensiert wird, wodurch ähnliche Expressionsintensitäten in Männchen und Weibchen erreicht werden. Dieser Mechanismus ist als Dosiskompensation bekannt. Wir konnte erstmals zeigen, dass Dosiskompensation auch bei Pflanzen evolviert ist und dass dies weniger als 10 Millionen Zusammenfassung Jahre gedauert hat. Das zweite Kapitel ist den Genexpressionsunterschieden zwischen männlichen und weiblichen Pflanzen, sowie der Evolution dieser Unterschiede gewidmet. Wir haben zuerst alle Gene, welche in Blütenknospen exprimiert werden, dahingehend untersucht, ob sich das Mass der Genexpression zwischen den Geschlechtern von S. latifolia unterscheidet. Ein grosser Anteil der Gene zeigt eine geschlechtsabhängige Expression und dass Gene mit geschlechtsabhängiger Expression auf den Geschlechtschromosomen angereichert sind, was in der Theorie erwartet wird, jedoch bis anhin nur bei Tieren mit evolutiv alten Geschlechtschromosomen nachgewiesen werden konnte. Im Weiteren fanden wir Hinweise für eine Demaskulinisierung des X Chromosoms, sowie für eine Maskulinisierung des Y Chromosoms was mit empirischen Daten von Systemen mit alten Geschlechtschromosomen vereinbar ist. Durch Vergleiche der Genexpression in der untersuchten diözischen Art mit der Expression derselben Gene in der nahverwandten gynodiözischen Art S. vulgaris konnten wir auch zeigen, dass Gene die vorwiegend in Weibchen durch Hinaufregulierung und Gene die vorwiegend in den Männchen exprimiert sind durch Herunterregulierung in den Weibchen evolvieren. Diese Arbeit ist die erste empirische Studie die zeigt, wie geschlechtsabhängige Genexpression evolviert ist und das geschlechtsabhängige Expression, zu einem gewissen Teil, Konflikte zwischen Männchen und Weichen reduzieren kann. Das dritte Kapitel zeigt auf, wie RNA-seq Daten für die Identifikation von Referenzgenen verwendet werden können. Solche Referenzgene sind notwendig für die Normalisierung von Daten aus “Quantitative Real Time (qRT)-PCR” Experimenten. Wir präsentieren die erste validierte Liste von Referenzgenen für S. latifolia, welche für die Erforschung von Expressionsunterschieden zwischen männlichen und weiblichen Pflanzen in reproduktivem (Knospen) und vegetativem (Rosettenblätter) Gewebe verwendet werden können. Unsere qRT-PCR Resultate weisen im Weiteren für die untersuchten Gene, welche alle auf den Geschlechtschromosomen liegen, auf reduzierte Genexpressionsunterschiede zwischen den Geschlechtern hin. Das vierte Kapitel umfasst eine Studie zum Einfluss des Brandpilzes, (Microbotryum violaceum) auf den Wirt S. latifolia. Eine Infektion mit diesem Pilz löst in weiblichen Pflanzen eine partielle Geschlechtsumwandlung aus. Wir konnten zeigen, dass ein sub- stanzieller Teil des Transkriptoms durch die Infektion verändert wird und dass dieser Effekt stark geschlechtsabhängig ist. Der Pilz modifiziert vorwiegend Gene, welche in gesunden Pflanzen einen geschlechtsabhängige Expression aufweisen, insbesondere jene, die vorwiegend in den Männchen exprimiert werden. Zahlreiche Gene wurden in infizierten Weibchen stärker exprimiert. Gene auf den Geschlechtschromosomen trugen substanziell zur dieser Maskulinisierung des Transkriptoms infizierter Weibchen bei, was mit den beobachtbaren morphol- 8 ogischen Veränderungen durch die Infektion übereinstimmt. Infizierten Männchen zeigten jedoch vorwiegend eine reduzierte Expression von Genen, was zu einer Demaskulinisierung des Transkriptoms führte. Diese Veränderung ist im Gegensatz zu den Weibchen morphologisch nicht deutlich sichtbar. Unsere Daten zeigen, dass ein Parasit in seinem Wirt mit zwei Geschlechtern unterschiedliche Effekte haben kann und dass die hervorgerufenen Veränderungen sehr komplex sein können, auch wenn dies auf Grund der morphologischen Veränderungen nicht zu erwarten wäre. Die grossen Fortschritte der modernen Hochdurchsatzsequenzierung erlauben es uns heute, lange bestehende Hypothesen in Arten mit weitgehend unbekannten Genomen zu testen, sowie auch ganz neue Fragestellungen zu erforschen. 9
