1.1 ABSCHNITT 1: ENZYME Einführung Enzyme sind

1.1
ABSCHNITT 1: ENZYME
Einführung
Enzyme sind informationelle Makromoleküle und als solche Instrumente gezielter
Prozeßsteuerung. Sie haben eine katalytische und eine kognitive Funktion. Die
katalytische Funktion kommt in der Beschleunigung der Gleichgewichtseinstellung
einer thermodynamisch möglichen Reaktion zum Vorschein. Kraft ihrer kognitiven
Funktion bauen die Enzyme Stoffwechselketten auf und unterhalten dadurch
dynamische Ordnungsgefüge.
Über die Quantität eines Enzyms in Geweben und Körperflüssigkeiten, über seine
Substrat- und Wirkungsspezifität, über seine Affinität zum Substrat, über seine
Abhängigkeit von der H-Ionen-Konzentration und von der Temperatur, über die
Beeinflußbarkeit seines aktiven Zentrums durch Effektoren erhält man Aufschluß
durch das Studium der Kinetik der von ihm katalysierten Reaktion.
Unter der katalytischen Aktivität (z) eines Enzyms versteht man die Erhöhung des
Umsatzes (z.B. Menge Substrat/Zeiteinheit) einer chemischen Reaktion unter
bestimmten Bedingungen um 1 Mol pro Sekunde (Einheit: Katal; Symbol: kat). Die
katalytische Aktivität ist nicht mit der Reaktionsgeschwindigkeit (Reaktionsgeschwindigkeit: dc/dt (Konzentrationsänderung!/t)) zu verwechseln, läßt sich aber für
definierte Bedingungen daraus berechnen (z = Reaktionsgeschwindigkeit x Volumen).
Im allgemeinen ist die katalytische Aktivität der Menge eines Enzyms direkt
proportional, wobei dann 1 Katal derjenigen Enzymmenge entspricht, die 1 Mol pro
Sekunde umsetzt. Analog der Enzymkonzentration kann die katalytische Aktivität
dann als katalytische Aktivitätskonzentration (b) (kurz: katalytische Konzentration;
Einheit: kat/L) angegeben werden. Weitere abgeleitete Größen der katalytischen
Aktivität sind die spezifische katalytische Aktivität (katalytische Aktivität pro Menge
Protein; Einheit: kat/kg) und die molare katalytische Aktivität (katalytische Aktivität pro
Mol Enzym; Einheit: kat/mol).
Am Beispiel der Proteinase (Peptidase) Trypsin werden Experimente zur
Enzymkinetik unternommen, wobei wir uns, mit Blick auf die Klinik, auch in die
Grundlagen der Enzymdiagnostik einarbeiten wollen.
Grundlage aller enzymkinetischen Untersuchungen ist die Michaelis-MentenVmax x [S]
Gleichung: V0= K + [S] (V0 Initialgeschwindigkeit, Vmax Maximalgeschwindigkeit,
m
Km Michaelis-Menten-Konstante, [S] Substratkonzentration). Ziel des Versuchs ist es,
daß der Umgang mit diserGleichung erlernt wird. Dazu gehören die Berechnung von
Vmax und Km sowie der abgeleitetetn Größe Kcat und Kcat/Km. In einer ergänzenden
Computersimulation von Enzymkinetiken wird der Vorteil einer nicht-linearen
Anpassung der Daten im Vergleich zum Auswerten nach Lineweaver-Burk dargestellt.
Allgemeine Methodik
Die natürlichen Substrate des Trypsins sind Nahrungseiweiße. Deren Spaltung ist
jedoch nicht exakt quantitativ zu verfolgen. Man bedient sich deshalb eines
künstlichen Substrates (chemische Konstitution s. unten). Da die Spezifität von
Trypsin auf Peptidbindungen ausgerichtet ist, die von der Carboxylgruppe des
Arginins ausgehen, behandelt Trypsin das künstliche Substrat BAPA wie eine von
Arginin ausgehende Peptidbindung in einem Eiweiß.
1.2
Substrat:
NH2
HN
C
Nα-Benzoyl-arginin-p-nitroanilid abgekürzt: BAPA
BAPA ist schlecht wasserlöslich.
Durch Zusatz von DMSO
Dimethylsulfoxid) wird es im
Testansatz in Lösung
gebracht.
NH
(CH2 )3
CH
C
O
NH
C
NH
NO
2
O
Trypsin
NH2
HN
C
NH
(CH2 )3
CH
O
NH
C
+
H2 N
NO
2
COOH
Erstes Spaltprodukt
(ungefärbt)
Nα-Benzoyl-arginin
Das zweite Spaltprodukt p-Nitroanilin
ist gelb gefärbt. Seine Entstehung im
Verlauf der Spaltungsreaktion wird
als Zunahme der Extinkltion bei 405
nm quantitativ spektrophotometrisch
bestimmt.
Benzamidin verlangsamt die Trypsin-katalysierte Spaltung von BAPA. Hieraus
resultiert die Aufgabe, Benzamidin als kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitor
zu identifizieren.
1.3
Benzamidin:
NH
C
NH 2
Der Testansatz zur Messung der Geschwindigkeit der Trypsin-katalysierten Spaltung
von BAPA in Abwesenheit des Inhibitors enthält folgende Komponenten:
1. Substrat (BAPA) gelöst in Wasser unter Zusatz von DMSO
2. Puffer (Tris-HCl; pH = 8,0)
3. Enzym (Trypsin gelöst in HCl)
Der Testansatz zur Messung der Geschwindigkeit der Trypsin-katalysierten Spaltung
von BAPA in Gegenwart des Inhibitors enthält folgende Komponenten:
1. Substrat (BAPA) gelöst in Wasser unter Zusatz von DMSO
2. Puffer mit Inhibitor (Tris-HCl mit Benzamidin)
3. Enzym (Trypsin gelöst in HCl)
Anleitungen zum Pipettieren der Testansätze finden Sie jeweils unter
"Spezielle Methodik".
Die Reaktion wird jeweils durch Zugabe des Enzyms zum Substrat-Puffer-Gemisch
gestartet. Sodann wird die den Testansatz enthaltende Küvette in den Lichtweg (405
nm) des Photometers gebracht. Das im Verlauf der Spaltung frei werdende pNitroanilin färbt den Küvetteninhalt gelb. Das fortlaufende Entstehen des Farbstoffes
wird als Zunahme der Extinktion bei 405 nm registriert. Die Extinktionszunahme pro
Zeiteinheit (∆E/Min.) ist ein Maß für die Spaltungsgeschwindigkeit vo.
Aufgabenstellung:
1.
Einfluß verschiedener Substratkonzentrationen [S] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates BAPA
a) Messung der Initialgeschwindigkeit vo bei verschiedenen
Substratkonzentrationen [S]
b) Graphische Darstellung der unter Punkt 1a) ermittelten
Meßergebnisse
c) Berechnung von Vmax, Km, Kcat/Km
1.4
2.
Einfluß eines dem Testansatz zugesetzten Inhibitors (Benzamidin) auf die
Trypsin-katalysierte Spaltung des Substrates BAPA
a) Messung der Initialgeschwindigkeit vo bei verschiedenen
Substratkonzentrationen [S] in Gegenwart des Inhibitors
b) Graphische Darstellung der unter Punkt 2a) ermittelten
Meßergebnisse
c) Berechnung von Vmax und Km
d) Ermittlung und Begründung des Hemmtyps
3.
Einfluß verschiedener Enzymkonzentrationen [E] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates
BAPA
a) Messung der Initialgeschwindigkeit vo bei verschiedenen
Enzymkonzentrationen
b) Graphische Darstellung der unter Punkt 3a) ermittelten
Meßergebnisse
c) Beschreibung des gefundenen Zusammenhanges
Spezielle Methodik
1.
Einfluß verschiedener Substratkonzentrationen [S] auf die
Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des
Substrates BAPA
a) Messung der Initialgeschwindigkeit vo bei verschiedenen
Substratkonzentrationen
Versuchsdurchführung
Pipettiere DMSO/H2O, Tris/HCl und BAPA/DMSO anhand von Pipettierschema 1 in die mit 1 bis 7 numerierten Reagenzgläser. Da die Reaktion
durch Zugabe von Trypsin gestartet wird, erfolgt der Zusatz von Trypsin erst
unmittelbar vor der eigentlichen Messung d.h. nach Abschluß der vorausgehenden Messung.
Nachdem Trypsin zum ersten Reaktionsansatz pipettiert wurde, wird der
Ansatz sofort gut durchmischt und der Inhalt des Reagenzglases in eine
Küvette überführt. Die Küvette wird in den Lichtweg des Photometers (405
nm) gestellt, das Photometer auf den rechten Skalenendpunkt abgeglichen
und die Extinktion über einen Zeitraum von 4 Minuten alle 30 Sekunden
abgelesen. Das im Verlauf der Spaltung freigesetzte p-Nitroanilin wird als
Zunahme der Extinktion bestimmt. Die abgegelesenen Werte werden in ein
Koordinatensystem eintragen:
Ordinate: Extinktion bei 405 nm
Abszisse: Zeit in Minuten
Lege eine Ausgleichsgerade durch die Meßpunkte. Der Anstieg
der Geraden (∆E/min) ist ein Maß für die Initialgeschwindigkeit vo.
1.5
Pipettierschema 1:
Ansatz
1
2
3
4
5
6
7
DMSO/H2O [ml]
2,65
2,35
2,00
1,65
1,35
1,00
0,00
Tris/HCl [ml]
0,80
0,80
0,80
0,80
0,80
0,80
0,80
BAPA/DMSO [ml]
0,35
0,65
1,00
1,35
1,65
2,00
3,00
Trypsin [ml]
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
Gesamtvolumen [ml]
4,00
4,00
4,00
4,00
4,00
4,00
4,00
b) Graphische Darstellung der unter Punkt 1a) ermittelten
Meßergebnisse
Vervollständige folgende Tabelle:
Ansatz
1
2
3
4
5
6
7
[S]
mMol/l
1/[S]
l/mMol
vo
1/vo
∆E/Min
Min/∆E
0,35
0,65
1,00
1,35
1,65
2,00
3,00
- Graphische Darstellung nach Michaelis-Menten: vo gegen [S]
- Graphische Darstellung nach Lineweaver-Burk: 1/vo gegen 1/[S]
c) Ermittlung des Vmax - und Km-Wertes aus dem Lineweaver-BurkDiagramm (Angabe von Vmax in Katal)
d) Berechnung von Kcat und Kcat/Km (Trypsinkonz. 5 µg/ml; Molekulargewicht
24.000 Dalton)
1.6
2.
Einfluß eines dem Testansatz zugesetzten Inhibitors (Benzamidin) auf
Trypsin-katalysierte Spaltung des Substrates BAPA
a) Messung der Initialgeschwindigkeit vo bei verschiedenen Substratkonzentrationen [S] in Gegenwart des Inhibitors
Versuchsdurchführung:
Zur Versuchsdurchführung siehe Erläuterungen zu Punkt 1a).
Pipettierschema 2:
Ansatz
1
2
3
4
5
6
7
DMSO/H2O [ml]
2,90
2,30
1,80
1,30
0,90
0,50
0,00
Inhibitor [ml]
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
BAPA/DMSO [ml]
0,40
1,00
1,50
2,00
2,40
2,80
3,30
Trypsin [ml]
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
0,20
Gesamtvolumen [ml]
4,00
4,00
4,00
4,00
4,00
4,00
4,00
b) Graphische Darstellung der unter Punkt 2a) ermittelten
Meßergebnisse
Vervollständige folgende Tabelle:
Ansatz
1
2
3
4
5
6
7
[S]
mMol/l
1/[S]
l/mMol
vo
1/vo
∆E/Min
Min/∆E
0,40
1,00
1,50
2,00
2,40
2,80
3,30
- Graphische Darstellung nach Michaelis-Menten: vo gegen [S]
- Graphische Darstellung nach Lineweaver-Burk: 1/vo gegen 1/[S]
c) Ermittlung des Vmax - und Km-Wertes aus dem Lineweaver-BurkDiagramm für die inhibierte Reaktion (Angabe von Vmax in Katal)
d) Ermittlung und Begründung des Hemmtyps
die
1.7
3.
Einfluß verschiedener Enzymkonzentrationen [E] auf die Initialgeschwindigkeit vo der Trypsin-katalysierten Spaltung des Substrates BAPA
a) Messung der Initialgeschwindigkeit vo bei verschiedenen
Enzymkonzentrationen
Versuchsdurchführung:
Zur Versuchsdurchführung siehe Erläuterungen zu Punkt 1a).
Die Meßzeit in diesem Versuch beträgt 4 Minuten, wobei jede Minute
abgelesen wird.
Pipettierschema 3:
Ansatz
1
2
3
4
Tris/HCl [ml]
1,30
1,10
0,90
0,70
BAPA-DMSO [ml]
1,50
1,50
1,50
1,50
Trypsin [ml]
0,20
0,40
0,60
0,80
Gesamtvolumen [ml]
3,00
3,00
3,00
3,00
b) Graphische Darstellung der unter Punkt 3a) ermittelten
Meßergebnisse (Bestimmung der Initialgeschwindigkeit vo)
Ordinate: Extinktion bei 405 nm
Abszisse: Zeit in Minuten
Lege eine Ausgleichsgerade durch die Meßpunkte. Der Anstieg
der Geraden (∆E/min) ist ein Maß für die Initialgeschwindigkeit vo .
c) Graphische Darstellung der unter Punkt 3b) ermittelten Meßergebnisse
(Abhängigkeit der Initialgeschwindigkeit vo von der Enzymkonzentration)
Vervollständige folgende Tabelle:
Enzymkonzentration
µg/ml Testansatz
5,33
10,66
16,00
21,33
Initialgeschwindigkeit
∆E/min
Ordinate: Initialgeschwindigkeit (∆E/min)
Abszisse: Enzymkonzentration (µg/ml Testansatz)
d) Beschreibung des gefundenen Zusammenhanges