Kurzprogramm AG Stöcker

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FI-Übung
Molekulare Zoologie
AG Stöcker
SS 2005
11. – 22.April
Kursprogramm AG Stöcker
Reinigung und Analyse von proteolytischen Enzymen aus dem Flusskrebs
Der Magensaft des Flusskrebses
Astacus leptodactylus enthält eine
ganze Serie von proteolytischen
Verdauungsenzymen. Am besten
untersucht
sind
die
beiden
Proteasen Astacin und Astacus
Trypsin. Beide Enzyme werden
im Hepatopankreas synthetisiert
und in den Kaumagen (Cardia)
sezerniert, wo sie extrazellulär als
aktive Proteasen bis zur nächsten
Nahrungsaufnahme
gespeichert
werden.
Astacus Trypsin (Mr 25000) gehört wie das Trypsin der Wirbeltiere zur Klasse der Serinproteasen. Die
charakteristischen Reste der katalytischen Triade des Vertebratentrypsins (His57, Asp102 und Ser195) sind
auch im Astacus Trypsin konserviert. Während das Rinder-Trypsin jedoch sechs Disulfidbrücken enthält,
sind im Astacus Trypsin nur drei enthalten. Insgesamt weisen die Aminosäuresequenzen beider Enzyme eine
Identität von ca. 40 % auf.
Die Metalloprotease Astacin (Mr 22600) ist der Prototyp der Astacin-Familie und der MetzinkinSuperfamilie, die mit ihren Mitgliedern in Vertebraten, Invertebraten und Bakterien vertreten ist. Das aus
200 AS bestehende Enzym ist eine Kollagen-spaltende Zink-Endopeptidase. Ein Zinkion im aktiven Zentrum
des Astacins ist für die katalytische Funktion essentiell.
Programm: In diesem Kursteil werden Sie Astacus Trypsin und Astacin aus dem Magensaft von Astacus
leptodactylus isolieren. Zur Gewinnung der Proteasen wird Krebsen Magensaft entnommen. In der bräunlich
gefärbten Flüssigkeit sind ca. 3 mg/ml Astacus Trypsin und ca. 1 mg/ml Astacin enthalten. Dar Magensaft
wird durch Anionenaustausch-Chromatographie und der Affinitäts-Chromatographie aufgetrennt. Das
Ergebnis der einzelnen Reinigungsschritte verfolgen Sie über die spezifische Spaltung von Substraten in
Aktivitätstests. Die Untersuchung der katalytischen Eigenschaften von Astacus Trypsin und Astacin aus
Astacus leptodactylus erfolgt mit Hilfe einer Gelatine-Zymographie, in der Sie die Gelatine-spaltende
Aktivität beider Proteasen überprüfen. Sie bestimmen in kinetischen Tests das pH- und TemperaturOptimum der Enzyme. Außerdem führen Sie Inhibitionstests mit verschiedenen spezifischen Hemmstoffen
durch.
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