Untersuchungen zur Funktion des darmspezifischen Cadherin

Untersuchungen zur Funktion des
darmspezifischen Cadherin-17s und zur
Prozessierung des Fat1-Cadherins sowie
dessen Verwendbarkeit als potenzieller
Tumorbiomarker für das Pankreaskarzinom
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
Vorgelegt der
Fakultät für Chemie und Biochemie
Der
Ruhr-Universität Bochum
Von
Nathalie Wojtalewicz, M.Sc.
Bochum. 2013
Die vorliegende Arbeit wurde im Immunologisch-Molekularbiologischen Labor der
Medizinischen Universitätsklinik des Knappschaftskrankenhaus Bochum angefertigt.
Erstgutachter: PD Dr. rer. Nat. I. Schwarte-Waldhoff
Zweitgutachter: Prof. Dr. rer. Nat. R. Heumann
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertations-Arbeit selbstständig und
ohne unerlaubte fremde Hilfe ausgeführt und verfasst habe und dass die Arbeit in
dieser oder ähnlicher Form noch bei keiner anderen Fakultät eingereicht worden ist.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten.
Bochum den 03.06.2013
_____________________________________
(Nathalie Wojtalewicz)
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
1.1
Das Darmepithel: ein hochgradig reguliertes Kompartiment
1.2
Das kolorektale Karzinom
10
1.3
Das Pankreaskarzinom
13
1.4
Das Sekretom kultivierter Karzinomzellen als Quelle zur Identifizierung
14
1.5
neuer
Serumtumorbiomarker
Die
Cadherin-Superfamilie
16
1.5.1.
Cadherin-17
17
1.5.2.
Fat1-Cadherin
19
1.5.3.
Lösliche Cadherine
20
1.6.
Ektodomänen-Shedding
21
1.6.1.
Metalloproteasen
22
1.6.1.1.
Die ADAM-Proteasefamilie
23
2.
Ziel der Arbeit
25
3.
Material und Methoden
3.1.
Material
26
3.1.1.
Primärmaterial
26
3.1.2.
Chemikalien
27
3.1.3.
Lösungen, Medien und Puffer
29
3.1.4.
Antikörper
33
3.1.5.
Primer
35
3.1.6.
Verbrausmaterialien
36
3.1.7.
Geräte
36
3.1.8.
Kit-Systeme
38
7
3.2.
Methoden
39
3.2.1.
Zellkultur
39
3.2.2.
Molekularbiologische Methoden
41
4.
Ergebnisse und Auswertung
4.1.
Suche nach Cadherin-17-Interaktionspartnern zur Abklärung der
63
4.1.1.
Funktion
Optimierung
einer Co-Immunupräzipitation für Cadherin-17 positive
64
4.1.1.1.
Immunkomplexe
Vergleich verschiedener CoIP-Protokolle
64
4.1.1.2.
Optimierung der gewählten CoIP-Methode M1
4.1.1.3.
Test eines in vivo Crosslinks der Proteine mittels DSP
72
4.1.2.
Identifizierung von Interaktionspartner-Kandidaten
78
4.1.2.1.
Vergleich der unterschiedlichen CoIP-Proben
79
4.1.2.2.
Eingrenzung
4.1.3.
Überprüfungvon
vonmöglichen
mRNA-Expressionsdaten
und Recherche
Validierung
Interaktionspartner-Kandidaten
85
4.1.3.1.
Polymere Immunoglobinrezeptor
85
4.1.3.2.
Keratin 8
89
4.2.
Expression und Prozessierung des „Giant Cadherins“ Fat1 in vitro
93
4.2.1.
Vorergebnisse aus meiner Masterarbeit
93
4.2.2.
Charakterisierung der freigesetzten Form von Fat1
94
4.2.3.
Fat1 ist ein glykosyliertes Protein
4.2.4.
Die Metalloprotease ADAM10 ist am Ektodomänen-Shedding von Fat1 101
4.2.5.
beteiligt
Untersuchungen
zur Rolle von ADAM9 und PCSK5 am Fat1 105
4.3.
Ektodomänen-Shedding
Expression
und Prozessierung von Fat1 in vivo
113
4.3.1.
Fat1 und ADAM10 sind in Pankreaskarzinomen überexprimiert
113
4.3.2.
Lösliches Fat1 wird in den Blutkreislauf freigesetzt und ist dort 116
4.3.3.
stabil
Bestimmung
der Fat1-Serumkonzentration von Pankreaskarzinom- 118
möglicher
und Kontrollpatienten
Cadherin-17-Interaktionspartner
6
durch
82
100
9
5.
Diskussion
5.1.
Identifizierung möglicher Cadherin-17-Interaktionspartner zur Analyse 124
5.1.1.
der Proteinfunktion
Erstellung
von Proteinkatalogen
5.1.2.
Immunkomplexen
Massenspektrometrie
Auswertung
der mit
erstellten
IP-Kataloge:
5.1.3.
Datenfülle der Kandidaten
Evaluierung
133
5.1.4.
Schlussfolgerung und Ausblick
143
5.2.
Analysen zur proteolytischen Freisetzung des atypischen Cadherins 137
5.2.1.
Fat1
sowie
zu dessenvonEignung
als imTumorbiomarker
Die duale
Prozessierung
Fat1 in vitro
Pankreassystem für das 139
5.2.2.
Pankreaskarzinom
Das Fat1-Ektodomänen-Shedding ist ein komplexer Prozess
143
5.2.3.
Lösliches Fat1 als möglicher, ergänzender Serumtumorbiomarker
147
6.
Zusammenfassung
151
Literaturverzeichnis
154
Anhang
172
Abkürzungsverzeichnis
186
Danksagung
189
Publikationen und Konferenzbeiträge
191
122
von
Cadherin-17
eine
positiven 124
Eingrenzung
der 129
1. Einleitung
1.1. Das
Darmepithel:
ein
hochgradig
reguliertes
Kompartiment
Die Hauptaufgaben des Intestinaltrakts sind die Verdauung und die Absorption von
Nährstoffen und Wasser. Er ist anatomisch unterteilt in den Dünndarm und den
Dickdarm (Heath, 1996). Beide Kompartimente werden von einem einschichtigen
Epithel ausgekleidet, das sich aus sekretorischen und absorptiven Zellen
zusammensetzt. Zu den sogenannten absorptiven Zellen gehören die Enterozyten
des Dünndarms und die Kolonozyten des Dickdarms. Die sekretorischen Zellen
setzen sich aus den Becherzellen, den Paneth-Zellen, den enteroendokrinen Zellen
und den Tuft-Zellen zusammen. Dazu existieren noch sogenannte Cup-Zellen und
M-Zellen, die bisher noch keiner der beiden Gruppen zugeordnet werden konnten
(Mach et al., 2005; Madara et al., 1985; Gebert und Bartels et al., 1995).
Das Dünndarm-Epithel ist in sogenannten Villi und Krypten angeordnet. Am Grund
der Krypten befinden sich proliferierende Zellen. Durch unterschiedlichste Signale
differenzieren sie zu den oben genannten Zelltypen und migrieren entlang der
Krypt-Villus-Achse in Richtung Darmlumen. Nach etwa vier bis fünf Tagen haben die
Zellen die Villusspitze erreicht, wo sie in die Apoptose übergehen und schließlich in
das Lumen abschilfern. Dies führt zu einer ständigen Erneuerung des Darmepithels
(Hall et al., 1994).
Die
Enterozyten
sind
stark
polarisierte
Zellen.
Sie
besitzen
apikal
die
charakteristische Bürstenfront, die für die Absorption und den Transport der
Nährstoffe von entscheidender Bedeutung ist. Enterozyten machen etwa 80 % der
intestinalen Epithelzellen aus (van der Flier et al., 2009).
7
Das Darmepithel ist nicht nur für die Absorption von Nährstoffen zuständig, es dient
zudem als Barriere zwischen der externen Umwelt und dem internen Milieu
(Keita&Soderholm, 2010). Über der physikalischen Barriere liegt eine schützende
Schleimschicht,
der
sogenannte
Mukus.
Es
besteht
aus
Mucinen
und
Trefoilproteinen, die von den Becherzellen sekretiert werden (Gregorieff et al., 2009;
Noah et al., 2010).
Die Panethzellen in der Kryptenbasis initiieren die Immunität. Sie besitzen große,
apikale
sekretorische
Granula,
die
spezielle
Enzyme,
wie
Lysozym
und
antimikrobielle Peptide enthalten. Sie sind die einzigen differenzierten Zellen, die in
die Krypte hinabwandern und eine Lebenszeit von etwa drei Wochen besitzen
(Bjerknes und Cheng, 1981).
Einen weiteren Sonderfall stellen die enteroendokrinen Zellen dar. Sie befinden sich
nicht im Zellverband, sondern siedeln als individuelle Zellen verteilt im Mukus. Sie
koordinieren die Darmfunktion über die Ausschüttung spezieller Peptidhormone und
machen etwa 1 % der Zellen im intestinalen Lumen aus (Schonhoff et al., 2004).
Die M-Zellen fallen durch ihre ungewöhnliche Membranstruktur auf. Sie befinden sich
über
den
sogenannten
ungewöhnliche
Struktur
Payers
erleichtert
Patches
es
und
ihnen,
lymphoiden
Mikroben
den
Follikeln.
Ihre
Lymphozyten,
Makrophagen und dendritischen Zellen zu präsentieren (Owen & Jones, 1974) (siehe
Abb. 1).
8
Abb. 1: Schematischer Aufbau des intestinalen Dünndarmepithels.
Das Epithel ist unterteilt in Villi und Krypten. Die Stammzellen (orange) differenzieren entweder zu
Paneth-Zellen (violett), M-Zellen (rot), Enterokrinen Zellen (im Mukus), Becherzellen (grün) oder zu
den stark polarisierten Enterozyten (weiß). Mit Ausnahme der Paneth-Zellen und der Stammzellen
wandern alle Zelltypen die Villus-Achse hinauf und werden nach etwa fünf Tagen in das Darmlumen
entlassen. Die Epithelschicht ist von einer schützenden Mukusschicht (hellblau) bedeckt.
9
1.2. Das kolorektale Karzinom
Das kolorektale Karzinom ist die weltweit dritthäufigste Krebsart bei Männern und die
zweithäufigste bei Frauen. Es macht etwa 10 % aller Tumorerkrankungen aus und ist
die
vierthäufigste
Ursache
für
den
Krebstod.
60 %
der
Kolorektal-
karzinomerkrankungen treten in den Industrieländern auf, mit den höchsten
Inzidenzen in Australien/Neuseeland und Westeuropa (Globocan 2008).
In
Deutschland
gab
es
in
den
Jahren
2007/2008
insgesamt
65.040
Darmkrebsneuerkrankungen (Robert-Koch-Institut), dies entspricht etwa 5 % der
Fälle weltweit. Die 5-Jahresüberlebensrate lag in den Jahren 2007/2008 bei etwa
52 % (Robert-Koch-Institut). Eine hohe Früherkennungsrate beeinflusst die Prognose
dabei maßgeblich (siehe Tab. 1). Wichtige Untersuchungen, die eine frühe
Erkennung ermöglichen, sind der Okkult-Bluttest sowie die Koloskopie (Kahi et al.,
2004).
Der Okkult-Bluttest dient zur Indikation von Blut im Stuhl und jeder deutsche
Krankenversicherte im Alter von 50-53 Jahren hat einen Anspruch auf eine jährliche
Untersuchung. Ab 55 Jahren zahlt die Krankenkasse eine Screening-Koloskopie, die
bei unauffälligem Befund nach zehn Jahren, sonst früher, wiederholt werden kann
(Robert-Koch-Institut).
10
Stadium
5-JahresÜberlebensrate
I
80-95 %
II
65-75 %
III
25-60 %
IV
0-7 %
Tab. 1: Abhängigkeit des 5-Jahres-Überlebens vom Tumorstadium bei Diagnose eines
kolorektalen Karzinoms, nach Weitz et al., 2005.
Nach der TNM-Klassifikation kennzeichnet das Stadium I einen Tumor, der die Submukosa oder
bereits die glatte Darmmuskulatur infiltriert hat. Das zweite Stadium beschreibt einen Zustand, in dem
der Tumor tiefer in das Darmgewebe und auch schon in umliegende Organe und Gewebe eindringt.
Stadium III ist definiert durch Metastasen in den regionalen Lymphknoten und das vierte Stadium
zeichnet sich durch Fern-Metastasen aus.
Kolorektalkarzinome entwickeln sich schrittweise aus dem normalen Epithel über
eine Hyperplasie und gutartige Vorläuferstufen zu prämalignen Adenomen und
schließlich zum invasiven, bösartigen Stadium des Karzinoms (Feldmann, 2002).
Dieser Prozess erstreckt sich meist über mehrere Jahre oder sogar Jahrzehnte, in
denen verschiedenste Mutationen akkumulieren (siehe Abb. 2) (Kinzler und
Vogelstein, 1998).
11
Abb. 2: Schematischer Verlauf der Karzinogenese im Kolon nach Schwarte-Waldhoff 2003. Das
Auftreten bestimmter Mutationen korreliert mit den definierten Stufen der Karzinogenese.
Aus dem Darmepithel entsteht durch Funktionsverlust des APC-Gens hyperplastisches Gewebe.
Dieses entwickelt sich durch die Akkumulation weiterer Mutationen zum gutartigen Adenom (grün),
bevor es sich zum malignen Tumor (rot) fortentwickelt.
Bei etwa 70 % der spontanen kolorektalen Karzinome liegt eine Mutation des
Adenomatosis polyposis coli (APC) Gens zu Grunde. Eine biallelische Mutation in
diesem Gen wird oft als Initiationsmutation zur Tumorgenese bezeichnet (Miyosho et
al., 1992; Powell et al., 1992). Eine weitere wichtige Rolle in der Tumorgenese
spielen die „Gatekeeper”, „Caretaker” und „Landscaper“ Gene. Als Gatekeeper
werden
Gene
bezeichnet,
die
das
Wachstum
regulieren.
In
85 %
der
Kolorektaltumore liegen die genetischen Veränderungen hauptsächlich in den
Gatekeeper-Proteinen vor. Zu diesen gehören neben dem APC-Gen auch noch
DCC, p53 und k-ras (Calvert et al., 2002). Caretaker-Gene sind wichtig für die
Stabilität der DNA sowie für deren epigenetische Veränderungen. Beispiele für
Caretaker Gene sind die sogenannten Mismatch-Reparaturgene (Grady, 2004).
12
Zu den Landscapern gehört das von unserer Arbeitsgruppe stark beforschte smad4
(Volmer et al., 2005). Sie verändern die Umgebung der Zellen, sodass sie den Tumor
begünstigt (Playford, 2001).
1.3. Das Pankreaskarzinom
Bauchspeicheldrüsenkrebs
(Pankreaskarzinom)
ist
eine
äußerst
aggressive
Tumorart. Bei einer vergleichsweise geringen Inzidenz wurde seine Letalität Anfang
des 21ten Jahrhunderts weltweit auf 98 % geschätzt (Parkin et al., 2001).
Diese hohe Zahl resultiert vor allen Dingen aus der schlechten Früherkennung, da
Pankreaskrebs erst in späten Stadien spezifische Symptome zeigt. Häufig sind ein
schwaches abdominales Unwohlsein sowie Übelkeit. Nur in seltenen Fällen kommt
es zum Verschluss des Duodenums oder zu gastrointestinalen Blutungen (Hidalgo,
2010). Ein weiterer Grund für die schlechte Prognose beim Pankreaskarzinom ist die
hohe Therapieresistenz.
Die Fünf-Jahres Überlebensrate kann mittels der operativen Entfernung des Tumors
von <5 % auf etwa 20 % gesteigert werden. Allerdings sind nur etwa 10-20 % aller
entdeckten Tumore operabel (Raimondi et al., 2009). In den meisten Fällen handelt
sich bei den Tumoren um duktale Adenokarzinome, deren Grenzen nicht klar
definiert sind - oft reichen lange Tumorfäden vom Haupttumor weg und weit in das
umliegende Gewebe hinein und vom Haupttumor weg (Hruban et al., 2006).
Die genetische Basis dieser Tumore ist komplex und heterogen. Wie beim
kolorektalen Karzinom müssen erst einige Mutationen akkumulieren, damit ein
invasives Karzinom entsteht. Die häufigsten genetischen Veränderungen sind eine
Inaktivierung des CDKN2-Gens (in 95 % aller Tumore), ein konstitutiv aktives k-ras2
(90 %), abnormales p53 (50-75 %) sowie ein Verlust von Smad4 (50 %) (Jones et al.,
2008; Feldmann et al., 2007).
13
1.4. Das Sekretom kultivierter Karzinomzellen als Quelle zur
Identifizierung neuer Serumtumorbiomarker
Die frühe Erkennung von Tumoren ist für eine Verbesserung der Überlebensrate von
großer Bedeutung. Die Entwicklung von einfachen, preisgünstigen und möglichst
nicht-invasiven Screeningmethoden ist ein wichtiges Gebiet in der Tumorforschung;
hierfür sind neue Biomarker notwendig. Auch
für die Überwachung von
Krebspatienten bezüglich des Therapieansprechens, der Rezidiv- und/oder der
Metastasierungserkennung wären zusätzliche bessere Biomarker wünschenswert.
Eine leicht zugängliche Probe für solche Untersuchungen ist das Blut. Die
Gewinnung ist ein wenig belastender Eingriff für den Patienten und kann schnell und
mehrfach durchgeführt werden.
Aufgrund der enormen Komplexität und Dynamik des Blutproteoms stellen sowohl
das Plasma als auch das Serum als Probe eine große analytische Herausforderung
dar. Zwischen dem Protein mit der höchsten und dem mit der niedrigsten Abundanz
liegt ein Konzentrationsunterschied von bis zu zehn Größenordnungen.
Proteine,
die
spezifisch
von
Tumoren
freigesetzt
werden
und
somit
als
Tumorbiomarker fungieren können, werden durch das Blutvolumen stark verdünnt.
Der etablierte Biomarker Carcinoembryonicantigen (CEA) liegt bei gesunden
Probanden beispielsweise in einer Konzentration von in einigen ng/ml vor, während
der ‚Hintergrund‘ der Gesamtproteinmenge etwa 60 - 80 mg/ml Protein im
Gesamtblutplasma, ausmacht (Anderson und Anderson, 2002). Diese Zahlen
verdeutlichen die Schwierigkeit der Identifizierung neuer Marker aus Serum und
Plasma.
Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung neuer Tumorbiomarker, der vom
Immunologisch Mikrobiologischen Labor (IMBL) der Ruhr-Universität Bochum und
14
anderen Laboren weltweit entwickelt wurde, ist die Untersuchung aller Proteine, die
von kultivierten Tumorzellen in vitro freigesetzt werden, das sogenannte Sekretom
(Volmer et al., 2005; Diehl et al., 2007; May, 2009).
Zur Gewinnung dieses „Subproteoms“ werden kultivierte Tumorzellen für einen
definierten Zeitraum in serumfreiem Medium (zur Reduzierung des Hintergrundes)
kultiviert. Die Überstände werden anschließend abgenommen, von Zelltrümmern
befreit und aufkonzentriert. Mithilfe hochsensitiver Methoden, wie beispielsweise der
massenspektrometrischen Analyse, können detaillierte Proteinkataloge erstellt
werden.
Ein
Vergleich
immortalisierten
mit ebenfalls
‚Normalzellen‘
erstellten
ermöglicht
Katalogen
die
aus
kultivierten,
Eingrenzung
möglicher
Tumormarkerkandidaten, die in weiteren Analysen verifiziert werden müssen (KleinScory et al., Manuskript in Arbeit).
Interessanterweise
zeigen
diese
Analysen
einen
hohen
Anteil
von
Transmembranproteinen im Sekretom. Diese können zum einen durch die
proteolytische Freisetzung, dem sogenannten Ektodomänen-Shedding, als auch
über die Freisetzung von Mikrovesikeln beigetragen werden, die das intakte Protein
tragen (Diel et al., 2007; Faca und Hanash, 2008; Gunawardana et al .2009; Van
Kilsdonk 2010).
Das
IMBL
konnte
vor
kurzem
zeigen,
dass
die
Freisetzung
von
Transmembranproteinen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo geschieht und zwar
insbesondere bei Cadherinen. Konkret wurden Formen von E-Cadherin (Weiß et al.,
2011), Cadherin-17 (Weiß et al., in Überarbeitung), und Fat1 gefunden (Wojtalewicz
et al., eingereicht).
15
1.5. Die Cadherin-Superfamilie
Cadherine gehören zu den Zelladhäsionsmolekülen. Viele Arbeiten deuten darauf
hin, dass sie in der Karzinogenese eine wichtige Rolle spielen. So führt in einigen
Tumoren der Verlust der E-Cadherin vermittelten Zell-Zellkontakte zu einer erhöhten
Invasivität und Mobilität der Tumorzellen (zusammengefasst u. a. in: Berx und Van
Roy, 2001; Paredes et al., 2012; Carneiro et al., 2012).
Charakteristisch für diese Proteinfamilie ist das Vorhandensein von mindestens einer
Cadherin-Domäne
(Koch
et
al.,
1999).
Cadherine
sind
transmembrane
Glykoproteine, die in der Lage sind, homophile Kontakte zwischen benachbarten
Zellen
über
extrazellulär
ihre
und
Cadherin-Domänen
werden
durch
auszubilden.
die
Bindung
Diese
von
Domänen
Ca2+-Ionen
liegen
stabilisiert
(Takeichi, 1991). Aufgrund unterschiedlicher molekularer Eigenschaften wird die
Proteinfamilie
der
Cadherine
in
verschiedene
Subfamilien
unterteilt,
wie
beispielsweise die klassischen Cadherine, die desmosomalen Cadherine, die
Protocadherine
und
die
Fat-Cadherine
Tepass et al., 2000; Hirano et al., 2003).
16
(siehe
Abb.
3)
(Gumbiner,
2000;
Abb. 3: Schematische Darstellung einiger Subfamilien der Cadherin-Superfamilie.
Cadherine zeichnen sich durch das Vorhandensein wenigstens einer Cadherin-Domäne (grün) aus.
Sie
besitzen
einen
zytoplasmatischen
Teil
(hellblau)
von
variabler
Größe
und
eine
Transmembrandomäne (rot). Einige Subfamilien interagieren direkt mit dem Zytoskelett (klassische
und desmosomale Cadherine). Neben der Cadherin-Domäne verfügen einige Vertreter noch über
EGF-ähnliche-Domänen (orange), LamininG-Domänen (violett) oder über ein Flamingomotiv
(schwarz).
1.5.1. Cadherin-17
Cadherin-17, auch LI-(liver-intestine)-Cadherin genannt, wurde 1994 in Leber und
Darm von Ratten identifiziert (Berndorff et al., 1994).Beim Menschen ist die
Expression ausschließlich auf den Intestinaltrakt beschränkt (Gessner und Tauber,
2000). Im Gegensatz zu den klassischen Cadherinen besitzt Cadherin-17 sieben
extrazelluläre
Cadherin-Domänen
sowie
eine
20
Aminosäuren
kurze
zytoplasmatische Domäne. Der intrazelluläre Abschnitt weist keine signifikante
17
Sequenzhomologie mit den klassischen Cadherinen auf (Gessner und Tauber, 2000;
Wendeler et al., 2006; Wendeler et al., 2004)
Über die physiologische Funktion ist bisher wenig bekannt. Dantzig et al.
beschreiben eine Peptidtransporterfähigkeit (Dantzig et al., 1994), doch wurde diese
in den letzten 19 Jahren nicht weiter belegt. Ahl et al. beschreiben in einem
mathematischen Model eine mögliche Rolle von Cadherin-17 in der Regulation des
Wasserhaushaltes im Darm (Ahl et al., 2011). Bekannt ist, dass Cadherin-17 in der
Lage ist, homophile Bindungen auszubilden, aber auch heterophile Interaktionen mit
anderen Cadherinen einzugehen (Wendeler et al., 2007; Baumgartner et al., 2008).
Dabei behält es seine adhäsiven Fähigkeiten, anders als die klassischen Cadherine,
auch ohne Interaktion mit Komponenten des Zytoskeletts (Kreft, 1997).
Eine neue Arbeit von Bartolomé et al. beschreibte eine Interaktion von Cadherin-17
mit
dem
α2β1-Integrin,
Kolorektalkarzinomzellen
die
sowie
die
Proliferation
deren
und
Eigenschaft
die
Adhäsion
von
zur
Bildung
von
Lebermetasthasen beeinflusst (Bartolomé et al., 2013).
Eine mögliche karzinogene Funktion des Proteins ist Gegenstand intensiver
Forschung. Einen Hinweis darauf liefern Befunde, dass einige Tumore des
Gastrointestinaltraktes, wie beispielsweise der Leber und des Magens, eine ektope
Expression des eigentlich darmspezifischen Proteins zeigen.
In embryonalen Lebervorläuferzellen von p53- und cmyc+ Mäusen fördert eine
Cadherin-17 Überexpression das Wachstum von Tumoren (Liu et al., 2009). Weitere
Experimente zeigen, dass die Aggressivität hochmetastatischer HCC-Zellen durch
Transfektion von CDH17-siRNA oder Transduktion mit der entsprechenden shRNA
gemildert werden kann (Liu et al., 2009; Ding et al., 2009).
18
Auch bei Magenkrebs wird eine ektope Expression des Cadherins von mehreren
Gruppen beschrieben (Grotzinger, 2001; Ko et al., 2004). Ein hoher Cadherin-17
Level in Magentumoren korreliert mit einem fortgeschrittenen Stadium und ist
assoziiert mit Lymphknoten und einer schlechten Prognose (Ko et al., 2004;
Ito et al., 2005). Im Gegensatz dazu gilt die ektope Expression von Cadherin-17 beim
Pankreaskarzinom als positiver prognostischer Faktor (Takamura et al., 2003).
1.5.2. Fat1-Cadherin
Die etwa 500kDa großen Fat-Cadherine sind hoch konserviert in Vertebraten und
Invertebraten. Fat1 wurde als erster Vertreter dieser Subfamilie 1923 in Drosophila
beschrieben (Mohr, 1923) und ist in diesem System als Tumorsuppressor
charakterisiert (Bryant et al., 1988).
In Säugern wurden inzwischen vier Vertreter der Fat-Cadherine identifiziert (Tanoue
und Takeichi, 2005). Aufgrund von Sequenzvergleichen lassen sie sich in die
Familien der Fat- (Fat4 und Drosophila-fat) und der Fat-like-Cadherine (Fat1, Fat2,
Fat3 und Drosophila-fat-like) unterteilen (Castillejo-Lopez, 2004).
Fat1 verfügt über 34 Cadherin-Domänen. Die sehr große Ektodomäne beinhaltet
zudem vier EGF-, sowie eine LamininG-Domäne. Es folgen eine einfache
Transmembrandomäne sowie ein etwa 400 Aminosäuren langer zytoplasmatischer
Teil, der eine zur Cadherin-Catenin Bindungsstelle von E-Cadherin schwach
homologe Region aufweist (Dunne et al, 1995).
Die physiologische Fat1-Expression ist auf bestimmte proliferierende Epithelgewebe,
wie das Epithel der Lunge, der Niere und der Basalmembran der Haut beschränkt
(Dunne et al., 1995; Cox et al., 2000; Ponassi et al., 1999). Die Expression zeigt
19
ihren
Höhepunkt
in
der
Embryonalentwicklung
und
schwächt
sich
mit
voranschreitendem Alter ab (Tanoue und Takeichi, 2004).
In silico-Analysen zeigen eine Fat1-Expression in verschiedenen Tumorgeweben,
unter anderen auch in Pankreas- und Kolorektaltumoren (Katoh und Katoh, 2006).
Expressionsuntersuchungen bei Brustkrebspatientinnen ergaben stärkere Fat1Signale in Tumoren höheren Grades, was eine Rolle des Cadherins in der
Tumorpathogenese vermuten lässt (Kwaepila et al., 2006).
1.5.3. Lösliche Cadherine
Das erste lösliche Cadherin wurde 1983 von Damsky et al., in Form eines 80 kDa
großen
Fragments
im
Zellkulturüberstand
von
kultivierten
Brustkrebszellen
beschrieben (Damsky et al., 1983). Erst vier Jahre später wurde das Fragment als
eine lösliche Form des E-Cadherins (sE-Cad) identifiziert (Wheelock et al., 1987).
Heute werden Kulturüberstände von Tumorzellen auf der Suche nach neuen
Tumorbiomarkern systematisch analysiert. Dabei fallen vielfach auch die Cadherine
ins Auge.
Vorangegangene Arbeiten im IMBL konnten im Zellkulturüberstand von kultivierten
Kolonkarzinomzellen E-Cadherin (Diel et al., 2007) und Cadherin-17 (Weiß et al.,
Manuskript in Überarbeitung) bereits auf 2D-Gelen zeigen und mit MALDI-TOF
Massenspektrometrie identifizieren (Diehl et al., 2007 und unveröffentlichte
Ergebnisse).
Zudem
zeigten
Zellkulturüberstände
von
kultivierten
Pankreaskarzinomzelllinien in einer Katalogisierung der Sekretomproteine nach
eindimensionaler Gelauftrennung und ESI-MS/MS Massenspektrometrie (Orbitrap)
eine relativ große Menge der Ektodomäne von Fat1.
E-Cadherin ist sowohl im Serum (Weiß et al., 2011), Ascitesfluid (Symowicz et al.,
2007) und Urin (Marimuthu et al., 2011) detektierbar. Auch P-Cadherin kann in
20
Serum (Knudsen et al., 2000), Milch (Soler et al., 2002) und im Sperma
(dePaul et al., 2005) nachgewiesen werden.
Auch Cadherin-17 wird in vivo freigesetzt und kann vermehrt im Serum von Patienten
mit fortgeschrittenen Kolorektalkarzinomen detektiert werden (Weiß et al., Manuskript
in Überarbeitung).
Dies deutet auf eine hohe Stabilität der löslichen Cadherin-Ektodomänen im Blut hin;
ein wichtiges Kriterium für eine Verwendbarkeit als Serummarker.
1.6. Ektodomänen-Shedding
Ein wichtiger Mechanismus, der an der proteolytischen Freisetzung extrazellulärer
Proteindomänen unter anderem von Cadherinen beteiligt ist, ist das sogenannte
Ektodomänen-Shedding (siehe Abb. 4) (Hooper et al., 1992; Pandiella et al., 1992).
Abb. 4: Schematische Darstellung des Ektodomänen-Sheddings.
Ein proteolytisch aktives Enzym trennt die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins
oberhalb der Membran und setzt die Ektodomäne in die Umgebung frei.
Im gesunden Individuum werden etwa 2-4 % aller Oberflächenproteine durch
Ektodomänen-Shedding prozessiert. Ektodomänen-Shedding spielt physiologisch
eine Rolle in der Befruchtung, der Neurogenese und der Entwicklung des Herzens,
21
und ein verstärktes Shedding wurde bei vielen Erkrankungen, wie etwa Asthma,
Alzheimer und Krebs beobachtet (Blobel, 2005).
In Tumoren kann die Freisetzung von Signalmolekülen wie Zytokinen und
Wachstumsfaktoren zu einer verstärkten Proliferation und einer erhöhten parakrinen
Signalwirkung führen (Blobel, 2005). Gleichzeitig zeigen Tumorzellen mit einer
vermehrten Freisetzung von Oberflächenproteinen eine erhöhte Beweglichkeit (Seals
und Courtneidge, 2003).
Ektodomänen-Shedding
ADAM10-vermitteltes
findet
nicht
nur
Ektodomänen-Shedding
auf
der
wird
Zelloberfläche
auch
in
statt.
sogenannten
Multivesikular Bodies (MVBs) beschrieben. Durch Einstülpungen gelangen die
Proteasen (zumeist Metalloproteasen) in die Endosomen und dort können sie in
räumliche Nähe zu ihren Zielproteinen gelangen. Über weitere Einstülpungen
entstehen schließlich die MVBs, deren Vesikel über Exozytose freigesetzt werden
können. Auf diese Weise entstehen mobile Proteasen, die parakrin wirken können
(Stoeck et al., 2006).
1.6.1. Metalloproteasen
Proteasen sind hydrolytische Enzyme, die Proteine prozessieren. Sie werden anhand
ihrer
aktiven
Zentren
Serin/Threoninproteasen,
in
vier
verschiedene
Cysteinproteasen,
Subfamilien
unterteilt:
Aspartatproteasen
die
und
Metalloproteasen (Mecham und Parks, 1998).
Die Familie der Metalloproteasen wurde erstmals 1962 durch Gross und Lapiere
beschrieben. Sie identifizierten ein Protein, das die Tripplehelix des nativen CollagenTyp-I-Proteins degradieren konnte (Gross und Lapiere, 1962).
22
Zwei prominente Subfamilien der Metalloproteasen sind die ADAMs (a disintegrin
and metalloprotease) und die MMPs (matrix metalloprotease).
1.6.1.1.
Die ADAM-Proteasefamilie
Mitglieder der ADAM-Familie zeichnen sich durch eine Reihe konservierter Domänen
aus: Sie besitzen ein Signalpeptid, ein Propeptid, eine Metalloproteasedomäne, die
Disintegrindomäne, eine cysteinreiche Domäne, eine EGF-ähnlichen-Domäne sowie
eine Transmembrandomäne und die zytoplasmatische Domäne.
Die Prodomäne hält das Protein mittels eines Cysteinswitches im inaktiven Zustand
und kann durch Proproteinkonvertasen des Furintyps oder durch Autokatalyse
entfernt werden. Nur etwa 50 % der ADAMs besitzen das katalytische HEXXH-Motiv
in ihrer Proteasedomäne, das für die proteolytische Aktivität essenziell ist.
In vitro ist ein umfangreiches Substratspektrum der Proteasefamilie beschrieben. Die
primären Zielstrukturen sind Ektodomänen von Transmembranproteinen (Blobel,
2005; Duffy et al., 2003).
Bis heute sind 21 funktionell aktive ADAMs im Menschen und insgesamt 40 in
anderen
Organismen
beschrieben
worden
(http://people.virginia.edu/~jw7g/Table_of_the_ADAMs.html).
Die Enzyme sind involviert in diverse biologische Prozesse, wie Befruchtung,
Adhäsion, Migration und Proteolyse (Blobel, 2005). Pathologische Funktionen
werden ihnen in diversen Krankheiten, unter anderem bei rheumatischer Arthritis,
Alzheimer, Asthma und Krebs zugeschrieben (Edwards et al., 2008; Duffy et al.,
2003).
Einige ADAMs werden im Rahmen der Krebsforschung detaillierter untersucht. Eine
Überexpression von ADAM10 in Tumorzellen führt zu einer erhöhen Freisetzung von
Wachstumsfaktoren durch Ektodomänen-Shedding. Dies resultiert in einer erhöhten
23
Proliferation der Tumore (Seals und Courtneidge, 2003). Zudem ist ADAM10 am,
Shedding von E-Cadherin beteiligt und spielt so auch eine entscheidende Rolle in
der Mobilität und Invasivität der Tumorzellen (Maretzky, T. et al., 2005).
Im Tiermodell verursacht eine Überexpression von ADAM9 in Prostataepithelzellen
eine
Hyperplasie
des
Epithelgewebes
Prostatakrebs (Peduto et al., 2005).
24
und
induziert
Vorläuferläsionen
für
2. Ziele der Arbeit
Die vorliegende Arbeit ist zweigeteilt und beide Teile bauen auf Vorarbeiten zu
löslichen Formen von Cadherinen auf.
Im ersten Teil soll versucht werden, Hinweise auf die physiologische Funktion des
darmspezifischen Cadherin-17 zu erarbeiten und damit möglicherweise auch seine
Rolle in der Karzinogenese zu verstehen. Vorangegangene Arbeiten im IMBL haben
gezeigt, dass die Ektodomäne von Cadherin-17 von Kolonkarzinomzellen vermehrt
freigesetzt wird und auch als Serumtumormarker fungieren kann. Sowohl die
Funktion dieser prozessierten Form als auch die des intakten Proteins ist weitgehend
unverstanden.
Hier
sollen
mittels
Co-Immunopräzipitation
und
massenspektrometrischer Analyse mögliche Interaktionspartner von Cadherin-17
identifiziert werden, die die Funktion von Cadherin-17 beleuchten könnten.
Der zweite Teil der Arbeit basiert auf dem Befund, dass die Ektodomäne des
gigantischen Cadherins Fat1 von kultivierten Pankreaskarzinomzelllinien stärker
freigesetzt
wird
als
von
immortalisierten,
aber
ansonsten
‚normalen‘
Pankreasgangzellen (HPDE). Dies macht es zu einem interessanten Biomarker.
Gleichzeitig kann eine Überexpression in Pankreaskarzinomen beobachtet werden,
weswegen die Eignung dieses Proteins als Tumorbiomarker näher untersucht
werden soll.
Zudem
sind
der
Mechanismus
der
proteolytischen
Freisetzung
der
Fat1-Ektodomäne, ebenso wie die beteiligten Proteasen noch unbekannt. Mittels
Inhibitor- und siRNA-Analysen sollen die am Shedding beteiligten Proteasen ermittelt
werden. Dies könnte zu einem besseren Verständnis der molekularen Prozesse in
Pankreaskarzinomen führen.
25
3. Material und Methoden
3.1.
Material
3.1.1. Zelllinien
Zelllinie
LT97-2
Ursprung
Bezugsquelle
Kolon
Zur Verfügung gestellt von
B. Marian, Wien, Österreich
LoVo
Kolon
SW948
Kolon
Zur Verfügung gestellt von
M.Strauss, Berlin
ATCC
SW620
Lymphknotenmetastase eines
ATCC
kolorektalen Adenokarzinoms
LS411
Kolorektalkarzinom
Zur Verfügung gestellt von
M.Strauss, Berlin
LS174T
Kolorektalkarzinom
HT115
Kolonkarzinom
LS513
Blinddarmkarzinom
Zur Verfügung gestellt von M.
Strauss, Berlin
A818-4
Pankreatische Ascites
In unserem Labor gewonnen.
BxPc3
Pankreasadenokarzinom
ATCC
MiaPaCa2
Pankreasadenokarzinom
ATCC
PaCa44
Pankreasadenokarzinom
Zur Verfügung gestellt von M.
Löhr, Heidelberg, Deutschland
Panc1
Pankreaskarzinom
ATCC
HPDE
Humane Pankreasgangzellen
Zur Verfügung gestellt von M.S.
Tsao, Toronto, Kanada
26
MelCV-345
Klon der Melanomzelllinie MelCV
Zur Verfügung gestellt von R.
mit Leervektor
Thorne, Newcastle, Australien
Furinüberexprimierender Klon
Zur Verfügung gestellt von R.
der Melanomzelllinie MelCV
Thorne, Newcastle, Australien
Keratinozyten
Zur Verfügung gestellt von N.
MelCV-Furin
HaCat
Fusenig, Heidelberg
3.1.2. Primärmaterial
Alle verwendeten Gewebe- und Serenproben wurden von Patienten der Onkologie
der Universitätsklinik Bochum erhalten, nachdem die Einverständniserklärung der
einzelnen Patienten erhalten wurde. Die Studie wurde von der lokalen EthikKommision der Ruhr-Universität Bochum genehmigt und gemäß der Deklaration von
Helsinki durchgeführt.
3.1.3. Chemikalien
Chemikalie
Firma
6-Aminohexansäure
Merck
Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (37, 5:1)
Roth
Agarose
Roth
Ammoniumperoxidsulfat (APS)
Merck
Bovines Serumalbumin
Sigma
Bradford Reagenz
Roth
Bromphenolblau
Sigma
CHAPS
AppliChem
DEPC
Roth
Dimethyl pimelimidate (DMP)
Thermo Scientific
di-Natriumhydrogenphosphat
Merk
Dithiobis[succinimidyl]propionate (DSP)
Thermo Scientific
27
Dithiothreitol (DTT)
Sigma
DNA Größenstandard 1 kb Ladder
NEB
dNTP-Mix
NEB
Dynabeads ProteinG
LifeTechnologies
EDTA
Sigma
EGF
R&D Systems
Essigsäure
J.T. Baker
Ethanol
J.T. Baker
Ethidiumbromid
Fluka Biochemika
Ficoll Typ 400
Merck
Formaldehy
Sigma
Formamid
Sigma
Fötales Kälberserum
Biochrom
Geniticin418
Gibco
Glutaraldehyd
Fluka Biochemika
Glycerol
AppliChem
Guanidiniumthiocyanat
AppliChem
Heringssperma DNA
Sigma
Insulin
Sigma
Isopropanol
J.T. Baker
Kaliumchlorid
J.T. Baker
Kaliumdihydrogenphosphat
Merk
Kalziumchlorid
J.T. Baker
L-Glutamin
Gibco
Magermilchpulver
Fluka Biochemika
Magnesiumchlorid
Merck
MOPS
AppliChem
Natriumacetat
J.T. Baker
Natriumchlorid
J.T. Baker
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Roth
Natriumpyruvat
LifeTechnologies
Natriumthiosulfat
Merk
Penicillin/Streptomycin
Gibco
28
Pepstatin A
Sigma
Phenylmethylsulfonylfluorid
Merck
Polyvinylpyrrolidon (PVP 360 k)
Sigma
Proteaseinhibitorcocktail
Roche
Silbernitrat
Fluka Biochemika
Superscript II reverse Transkriptase
LifeTechnologies
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrats
Thermo Scientific
Taq-DNA Polymerase
BioMol
Tetramethylendiamin (TEMED)
Merck
Transferrin
Sigma
Triethanolamin
SigmaAldrich
Tris (Hydroxymethyl-)aminoethan (Tris)
AppliChem
Trypsin-EDTA
Invitrogen
Tween 20
Sigma
Xylencyanid
Sigma
Hartmann
α32P-dATP
Analytics
3.1.4. Lösungen, Medien und Puffer
Zusammensetzung
30 mM Tris
Anode I Puffer
20 % (v/v) Isopropanol
200 mM Tris
Anode II Puffer
20 % (v/v) Isopropanol
100 mM NaCl
10 mM Tris
CHAPS-Proteinlysepuffer
1 mM MgCl2
10% (v/v) Glycerol
1% (w/v) Chaps
29
10 mM Tris/HCl, pH7,2
66 mM EDTA
NDE-Lysepuffer
0,4 % SDS
1 % NP-40
5 g Ficoll (Typ 400)
5 g Polyvinylpyrrolidon (PVP 360K)
Denhardt 50x
5 g BSA
ad 500 ml A.dest, sterilfiltrieren
1 ml 0,1 % Diethylpyrokarbonat
DEPC-H2O
in 1L 1.dest
40 mM Trisacetat
10 mM EDTA
15% (v/v) Glycerol
DNA-Probenpuffer 5x
30 % Ficoll (Typ400)
0,21 % Bromphenolblau
0,21 % Xylencyanid
5 % (v/v) Essigsäure
Entfärbelösung für Kryptonfärbung
0,01 % (v/v) Tween20
in A. dest.
40 % (v/v) Ethanol
Fixierlösung für KryptonTM-Färbung
10 % (v/v) Essigsäure
in A.dest.
25 mM Tris
Kathodenpuffer
40 mM 6-Aminohexansäure
20 % (v/v) Isopropanol
50 % (v/v) Ethanol
Lösung A für Silberfärbung
10 % (v/v) Essigsäure
30 % (v/v) Ethanol
Lösung B für Silberfärbung
0,5 M Natriumacetat (wasserfrei)
0,5 % (v/v) Glutardialdehy
30
0,1 % Natriumthiosulfat
0,01 % (v/v) Formaldehyd (37%ig)
Lösung C für Silberfärbung
0,1 % (w/v) Silbernitrat
2,5% (w/v) Natriumkarbonat
Lösung D für Silberfärbung
2,5 % (w/v) Natriumkarbonat
Lösung E für Silberfärbung
0,01 % (v/v) Formaldehyd (37%ig)
0,05 M EDTA
Lösung F für Silberfärbung
0,2 M MOPS
50 mM Natriumacetat (wasserfrei)
Mops 10x pH 7
10 mM EDTA
ad 1L mit DEPC-H2O,
1,37 M NaCl
27 mM KCl
PBS 10x
15 mM KH2PO4
81 mM Na2HPO4+2H2O
250 mM Tris/HCl, pH 6,8
10 % SDS
Proteinprobenpuffer 5x
500 mM DTT
50 % Glycerin
0,5 % Bromphenolblau
50 % Glycerin
1 mM EDTA
RNA-Probenpuffer 5x
0,2 % Bromphenolblau
in DEPC-H2O
0,5 M Tris-Puffer, pH 6,8
Sammelgelpuffer
31
250 mM Tris, pH 8,3
SDS-PAGE Laufpuffer 10x
1,92 M Glycin
1& SDS
3 M NaCl
SSC-Puffer 10x pH 7
0,3 M Tri-Natriumcitrat
2 M Tris
1 M Essigsäure
TAE 50x
50 mM EDTA
1,5 M Tris Puffer, pH 8,8
Trenngelpuffer
500 ml DMEM
10 % (v/v) FCS
2 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
D10
0,3 mg/ml Glutamin
1 % Natriumpyruvat (0,1 M)
500 ml KFSM-Medium
2 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
0,3 mg/ml Glutamin
Medium für HPDE
1% Natriumpyruvat (0,1 M)
10 µl EGF (4 ng/µl)
100 U/ml Penizillin
100 mg/ml Streptomycin
Medium für LT97-2
2 mM L-Glutamin
1 mM Natrium-Pyruvat
2 % FCS
32
30 ng/ml EGF
10 µg/ml Insulin
2 mg/ml Transferrin
1 µg/ml Hydrocortison
2x10-10 M 3,3',5-Triiodo-L-Thyronine
Natrium-Salz
Fibroblasten-konditioniertes Medium
10 % (v/v) FCS
0,3 mg/ml Glutamin
Antibiotikafreies Medium
1 % Natriumpyruvat (0,1 M)
500 ml DMEM
2 % (v/v) Penicillin/Streptomycin
0,3 mg/ml Glutamin
Serumfreies Medium
1% (v/v) Natriumpyruvat (0,1 M)
0,1% (v/v) Insulin
0,2% (v/v) Transferrin
10 µl Hydrocortison (50 µg/µl)
3.1.5. Antikörper
3.1.5.1.
Primärantikörper
Antigen
Bezeichnung
Spezies
Hersteller
Cadherin-17
EP777
Maus
Cadherin-17
141713
Maus
R&D Systems
1:1000
Cadherin-17
GW22817
Huhn
Sigma Aldrich
1:2000
E-Cadherin
13-1700
Maus
LifeTechnologies
1:2500
Transferrin
109-4134
Kaninchen
Rockland
1:20000
β-Tubulin
T4026
Maus
Sigma Aldrich
1:1000
GAPDH
sc-20357
Kaninchen
Santa-Cruz
1:500
ADAM10
735-749
Kaninchen
Calbiochem
1:500
zur Verfügung gestellt
von R. Geßner, Leipzig
33
Verdünnung
1 µg/100µl IP
ADAM10
panZytokeratin
Keratin 8
Keratin 8
AB19026
Kaninchen
Millipore
1:500
C2562
Maus
Sigma Aldrich
1:1000
8A5D12
Maus
Abcam
1:1000
Kaninchen
Sigma Aldrich
1:1000
AV4202850UG
pIgR
I0286
Kaninchen
Sigma Aldrich
1:500
pIgR
AF2717
Ziege
R&D Systems
1:500
Transduction
β-Catenin
C19220
Maus
Laboratoried BD
1:1000
Company
Fat1 (EZD1)
HPA001869
Kaninchen
Sigma Aldrich
1:750
Fat1 (EZD2)
HPA023882
Kaninchen
Sigma Aldrich
1:1000
zur Verfügung gestellt
Fat1
NTD7
Kaninchen
von R. Thorne,
Newcastle, Australien
zur Verfügung gestellt
Fat1
NTD14
Kaninchen
von R. Thorne,
Newcastle, Australien
zur Verfügung gestellt
Fat1 intra
CTD
Kaninchen
von R. Thorne,
1:500
Newcastle, Australien
zur Verfügung gestellt
Fat1 intra
34B
Kaninchen
von R. Thorne,
1:500
Newcastle, Australien
zur Verfügung gestellt
Fat1 intra
34E
Kaninchen
von R. Thorne,
Newcastle, Australien
34
1:500
3.1.5.2.
Antigen
Sekundärantikörper
Bezeichnung Spezies
Hersteller
Verdünnung
Neutravidin-HRP
31030
Pierce
anti-Ziege IgG
IRDye800
Esel
Biomol
1:15.000
anti Kaninchen IgG
IRDye800
Esel
Biomol
1:15.000
anti-Maus IgG
IRDye800
Esel
Biomol
1:15.000
anti-Huhn IgG
IRDye800
Ziege
Biomol
1:15.000
anti-Kaninchen IgG
AF680
Ziege
LifeTechnologies
1:30.000
anti-Maus IgG
AF680
Ziege
LifeTechnologies
1:30.000
anti-Ziege IgG
AF680
Kaninchen LifeTechnologies
1:30.000
anti-Ziege IgG
DyLight 800
Esel
anti-Maus IgG
DyLight 800
Ziege
anti-Kaninchen IgG
DyLight 800
Ziege
Rockland
Thermo
Scientific
Thermo
Scientific
3.1.6. Primer
Oligonukleotid
Sequenz
pIgR sense
ACGTCGACCGAGTTTCAATC
pIgR antisense
CTGGACTGGAGCAGGAAGTC
ADAM9 sense
GCAGGAATGGCATTTGTGGG
ADAM9 antisense
CCCAGCGTCCACCAACTTAT
PCSK5 sense
GCAAGCAACGAGAACAAGCA
PCSK5 antisense
CCCAAACAAACACAGAGCCG
JUP sense
JUP antisense
35
1:15.000
1:15.000
1:15.000
3.1.7. Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterial
Firma
Amicon Ultra Zentrifuge filters Ultracell 3k
Millipore
Nylonmembran Hybond N
Amersham
PVDF-Membran Immobilion FL
Millipore
Sterilfilter (Porengröße 0,2 µm)
Pall Medical
Whatman-Papier
Schleicher & Schuell
3-8 % Tris-Acetatgele
LifeTechnologies
4-12 % Bis-Trisgele
LifeTechnologies
MES-Gelelektrophoresepuffer
LifeTechnologies
Trisacetat-Gelelekrophoresepuffer
LifeTechnologies
MaxiSorp flat-bottom 96 well Platten
Nunc, Roskilde,
Dänemark
3.1.8. Geräte
Gerät
Firma
Analysewaage
Sartorius
Ausschwing-Rotor 630
Surespin
Autoflow CO2 water-Jacketed Incubator
Nuair
Biofuge Pico
Heraeus Instruments
Elektrophoreseapparatur vor SDS-PAGE
Biorad
Geltrockner
Biotec-Fischer
Heizblock
UniEquip
Horizontale Elektrophoreseapparatur
Gibco BRL
Hybridisierungsflaschen
Schott
Hybridisierungsofen
UniEquip
KL2-Schüttler
Edmund Bühler
Megafuge 1.0R
Heraeus Instruments
Mikroskop Aciovert 25
Zeiss
Mikrowelle
Bosch
MultiLabel Tester
Hidex
36
NanoDrop 2000 Spektrometer
Thermo Scientific
Odyssey Infrarot-Imaging System
Li-Cor
PCR-Cycler Trio Thermoblock
Biometra
Phosphorimager Screens
Packard Bioscience
Pipetten
Labsystems
Rotantu96R
Hettich
SemiDry Blotter Pegasus
Phase
Spannungsgeber Elektrophoresis Power Supply
Consort
Spannungsgeber Elektrophoresis Power Supply
Pharmacia
SpeedVac SC110
Savant
Sterilbank
Nuair
Szintillationszähler LB122
Berthold
Taumelschüttler
Heidolph
Ultrazentrifugenröhrchen Discovery 905E
Sorvall
UV-Ofen
TTF Labortechnik
UV-Kammer Multimage Light Cabinet
Alpha Innotech
Corporation
Vortex Genie 2
Scientific Industries
Waage
Sartorius
Wasserbad
GFL
X-Cell Sure Lock Elekrophorese-Apparatur
Invitrogen
Zentrifuge 5415 C
Eppendorf
Zentrifuge 5417 C
Eppendorf
Zentrifuge 5417 R
Eppendorf
Zentrifuge 905E
Sorvall
Dynal MPC-S Magnetic particle Concentrator
Lifesciences
37
3.1.9. Kit-Systeme
Kitsystem
Firma
Thermo Fisher
Dharmafect 1
Scientific
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
Applied Biosystems
Proteome Lab Spin Column Ig-12 HC
Beckman Coulter
Qiaex Gel Extraction Kit (150)
Qiagen
RNeasy Mini Kit (250)
Qiagen
Glycoprotein Deglycosylation Kit
Calbiochem
38
3.2.
Methoden
3.2.1. Zellkultur
3.2.1.1. Auftauen humaner Zelllinien
Alle verwendeten Zelllinien wurden in FCS/DMSO (9:1) im Stickstofftank gelagert. Nur
die HPDE wurden in KFSM-Medium ohne Supplement mit 10 % DMSO gelagert.
Zunächst wurden die Zellen im Wasserbad (37 °C) unter vorsichtigem Schütteln
vollständig aufgetaut. 10 ml D10-Medium wurden tropfenweise auf die Zellen gegeben,
die anschließend pelletiert wurden (5 min, RT, 800 rpm). Dies sorgte dafür, dass der
Einfrierzusatz DMSO ausgewaschen wurde. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen
in Medium resuspendiert und anschließend in der gewünschten Dichte auf neue Platten
übertragen. Alle Zellen, außer den LT97-2 und den HPDE wurden in D10 inkubiert. Die
LT97-2 Zellen wurden in F12-Hams und die HPDE in KFSM-Medium mit Supplement
kultiviert. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und 10 % CO2. Die HPDE-Zellen wurden bei
5 % CO2 inkubiert.
3.2.1.2. Passagieren humaner Zellen
Vor dem Passagieren wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 2 ml
Trypsin/EDTA (T/E) versetzt, um die Zell-Zell- bzw. Zell-Platten-Verbindung zu lösen. Die
Zellen wurden 10 min im Brutschrank bei 37 °C inkubiert, ehe sie von der Platte gelöst und in
10 ml D10 aufgenommen wurden. Das im Medium enthaltene FCS stoppt dabei das Trypsin.
Nachdem die Zellen sedimentiert wurden (5 min, 37 °C, 800 rpm), wurden die Zellen
ausgesät und mit ihrem spezifischen Medium kultiviert.
3.2.1.3. Proteaseinhibitoren
Um die am Fat1-Shedding beteiligten Proteasen identifizieren zu können, wurden der
Breitbandinhibitor Batimastat (Tocris Bioscience), sowie der Inhibitor GI254023X
(Arbeitsgruppe Ludwig, Aachen), der ADAM10 deutlich sensitiver inhibiert als
39
ADAM17, verwendet. Für den Versuch wurden die Zellen auf 6 cm Platten gebracht
und auf eine Konfluenz von etwa 60 % herangezogen. Anschließend wurden sie mit
4 ml Medium überschichtet, dass entweder 10 µM Batimastat oder 5µM GI254023X
enthielt. Zur Kontrolle diente DMSO. Die Überstände wurden nach 48 h geerntet. Die
Aufkonzentration erfolgte hier mit Hilfe von Amicon Ultra Zentrifuge filters Ultracell Konzentratoren (3 kDa Porengröße) auf ein Volumen von etwa 70 µl (1 ½ h,
3800 rpm, 4 °C). Die Proben wurden bei -20 °C gelagert.
3.2.1.4. Knockdown mittels transienter Transfektion
Ausgehend von den Ergebnissen der Inhibitoren und der Analyse von Proteom/Expressionskatalogen wurden die Proteasen ADAM10, ADAM9 und PCSK5 als
Targets für einen siRNA-vermittelten Knockdown (Dharmacon) ausgewählt.
Für die Transfektion wurden die Zellen auf 6 cm-Platten gebracht und bis zu einer
Konfluenz von etwa 30 % herangezogen. Einen Tag vor der Transfektion wurden die
Zellen auf Antibiotikum-freies Medium umgesetzt. Die siRNA wurde in RNase freiem
Wasser gelöst, sodass eine 20 µM Stammlösung erhalten wurde. Für den Versuch
wurden 200 µl 2 µM siRNA mit derselben Menge serum- und antibiotikafreies
Medium vermischt. Für die Transfektion wurden 12 µl das Reagenz DharmaFECT1
pro Schale verwendet und mit 388 µl serum- und antibiotikafreies Medium versetzt.
Beide Lösungen wurden vorsichtig durchmischt und inkubiert (5 min, RT). Nach
erneuter Inkubation (20 min, RT) wurden 3,2 ml antibiotikafreies D10-Medium hinzu
gegeben wurde.
Für einen Doppel-, bzw. Dreifachknockdown wurden identische Mengen der
einzelnen siRNAs eingesetzt und die benötigte Menge Dharmafect1 angepasst.
40
Von
den
Zellen
wurde
das
gesamte
Medium
entfernt
und
durch
das
Transfektionsmedium ersetzt und die Zellen für 48 h transfiziert. Anschließend wurde
das Transfektionsmedium entfernt und durch serumfreies Medium ersetzt. Nach der
ersten Ernte der Überstände nach 48 h wurden die Zellen ein weiteres Mal für 48 h
mit serumfreien Medium überschichtet. Nach der Ernte der Überstände wurden die
Zellen lysiert, um den Knockdown einmal auf Proteinebene und einmal auf RNAEbene zu überprüfen. Die Aufkonzentration erfolgte hier mit Hilfe von Amicon Ultra
Zentrifuge filters Ultracell -Konzentratoren (3 kDa Porengröße) auf ein Volumen von
etwa 70 µl.
3.2.1.5. In vivo Crosslinking mittels DSP
Zur Identifizierung möglicher Cadherin-17-Interaktionspartner wurde auch der
homobifunktionale Crosslinker dithiobis- (succinimidyl proprionate) (DSP) verwendet.
Dieses Molekül besitzt eine Länge von12 Å. Es ist zellmembrangängig und in der
Lage, kurzweilige und labile Proteininteraktionen zu fixieren. Der Vorteil dieses
Linkermoleküls ist zudem, dass seine Disulfidbrücke mittel β-Mercaptoethanol wieder
gelöst werden kann, sodass die Zusammensetzung der Proteinkomplexe später via
Western Blot analysiert werden können.
Für den Versuch wurden die Zellen zu einer Konfluenz von etwa 90 % herangezogen
und sofort auf Eis gestellt. Sie wurden zweimal mit kaltem PBS/Ca/Mg (0,1M CaCl2,
1M MgCl2) gewaschen und anschließend für 2 h mit 2 mM DSP-Lösung in
PBS/Ca/Mg inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10 ml kaltem 20 mM Tris (pH 7,4) in
PBS/Ca/Mg gestoppt (15 min, 4°C). Nach Entfernung der Stopplösung wurden die
Zellen noch einmal mit PBS/Ca/Mg gewaschen und anschließend lysiert.
41
3.2.2. Molekularbiologische Methoden
3.2.2.1. Gewinnung von Sekretomen
Für die Gewinnung der Sekretome wurden die Zellen zunächst dreimal mit
zusatzfreiem Medium gewaschen. Anschließend wurden 10 ml serumfreies Medium
auf die Zellen gegeben. Dies sollte verhindern, dass die vorhandene Menge FCS
spätere Proteinanalysen behindern könnte. Das Medium wurde nach 4 h entfernt und
durch frisches, serumfreies Medium ersetzt, da die Zellen immer noch ein wenig FCS
an ihre Umgebung abgeben. Die Zellen wurden 48 h Stunden inkubiert. Das Medium
wurde abgenommen und schnell auf Eis gekühlt. Die im Überstand befindlichen
Zellen und Zelltrümmer wurden entfernt (10 min, 1000 rpm, 4 °C), ehe der Überstand
sterilfiltriert (0,2 µm) und mit Proteaseinhibitoren (siehe Tab. 2) versetzt wurde. Die
Inhibitoren sollen verhindern, dass im Überstand befindliche Proteasen die Proteine
degradieren.
Proteaseinhibitor
Volumen [µl]
PI (Roche)
160
PMSF (10 mg/ml)
82
Pepstatin A
10
(7 µM)
Tab. 2: Benötigte Volumina der verwendeten Proteaseinhibitoren für 10 ml Medium.
Anschließend wurden die Proben mit Hilfe von Vivaspin-Konzentratoren (5 kDa
Porengröße) auf das gewünschte Endvolumen aufkonzentriert (3800 rpm, 4 °C),
aliquotiert und bei -20 °C (kurz) bzw. -80 °C (lang) gelagert.
42
3.2.2.2. Proteinextraktion
Um die Proteine im Western Blot analysieren zu können, wurden die Zellen lysiert. Vor der
Proteinextraktion wurden die Zellen zunächst dreimal mit PBS gewaschen und mit 400 µl
(10 cm Schale) bzw. 100 µl (6 cm Schale) CHAPS-Lysepuffer bzw. NDE-Lysepuffer versetzt.
Die Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß überführt und im Überkopfschüttler lysiert (CHAPS:
90 min, 4 °C; NDE: 60 min, 4 °C). Die Zellreste wurden pelletiert (10 min 14000 rpm, 4 °C)
und die Überstände abgenommen. Die Proben wurden aliquotiert und bei -20 °C (kurz) bzw.
-80 °C (lang) gelagert.
3.2.2.3. RNA-Extraktion
Für die RNA-Extraktion wurde das RNeasy Mini-Kit (Qiagen) verwendet. Das Prinzip
des Kits ist die Aufreinigung von RNAs, die länger sind, als 200 Basen, mithilfe einer
silica-basierten Membran. Eine Erklärung für die Bindung der RNA an die Membran
ist ein Aussalzungseffekt, der solange auftritt, wie durch Hochsalz-Bedingungen und
Ethanol Wasser entzogen wird. Durch die Zugabe eines Niedrigsalz-Puffers kann
diese Bindung anschließend wieder gelöst werden.
Zur RNA-Gewinnung
werden die Zellen mit einem hoch denaturierenden
guanidinthiocyanat-haltigen Puffer lysiert. Dieser Puffer inaktiviert augenblicklich
RNasen und sichert so die Aufreinigung der intakten RNA. Anschließend werden die
Proben mit einer Schredder-Säule homogenisiert. Der Probe wird Ethanol zugefügt,
um bessere Bindungsbedingungen zu schaffen. Die Elution der Probe erfolgte mit
30 µl RNase-freiem Wasser. Die Elution wurde ein zweites Mal mit derselben Probe
durchgeführt, um die Ausbeute zu erhöhen. Die Konzentrationen wurden
anschließend am NanoDrop 2000 (Thermo Fischer) bestimmt. Die Proben wurden
bei -20 °C gelagert.
43
3.2.2.4. Proteinbestimmung nach Bradford
Die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford (Bradford, 1976) basiert auf
der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G250 an Proteine in saurer
Lösung. Diese Bindung führt zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von
465 nm zu 595 nm (Compton und Jones, 1985). Die Extinktion der Lösung bei
595 nm ist direkt proportional zur Proteinkonzentration. Da der Protein-FarbstoffKomplex einen hohen Extinktionskoeffizienten besitzt, weist diese Methode eine
enorme Sensitivität auf. Der Komplex bildet sich in etwa zwei Minuten nach der
Farbstoffzugabe und bleibt für etwa Stunde stabil.
Für die Proteinbestimmung wird eine Dreifachmessung in Mikrotiterplatten
durchgeführt. Hierfür werden Aliquots der Proben (2 µl Sekretom bzw. 5 µl Lysat 1:10
verdünnt) in Wasser zu einem Gesamtvolumen von 160 µl verdünnt. Der
erwartenden Probenkonzentration entsprechend wurde zudem eine Eichreihe mit
BSA (Bovines Serumalbumin) angesetzt. Die Probenlösung wurden mit 40 µl
Bradfordreagenz versetzt und anschließend gut durchmischt. Die Extinktion bei
595 nm wurde ein einem Spektralphotometer gemessen. Die Proteinmenge der
Proben wurde anhand der Eichreihe errechnet. Als Referenz diente Bradford
Reagenz.
3.2.2.5. Präzipitation Cadherin-17 positiver Immunkomplexe
Für die Identifizierung möglicher Cadherin-17-Interaktionspartner wurden die Lysate
von
Cadherin-17
positive
Zelllinien
als
Ausgangsbasis
für
eine
Co-
Immunopräzipitation (CoIP) mittels paramagnetischer Beads durchgeführt. Die
Methode ist einfach, schnell und funktioniert ohne Zentrifugation und Filtration,
wodurch Scherkräfte verringert werden. Sie zeichnet sich durch einen verringerten
44
Proteinverlust
und
eine
vernachlässigbare
Pufferübertragung
zwischen
den
einzelnen Waschschritten aus (Sousa et al., 2011).
Zunächst wurden vier unterschiedliche IP-Protokolle untereinander verglichen:
Methode 1 (M1): Die Beads wurden zunächst zweimal mit 0,1 M Natriumacetat pH5,0
gewaschen. Die gewünschte Menge Antikörper wurde mit den Beads inkubiert
(75 min, RT). Nach einem Pufferwechsel zu Triethanolamin wurden die Antikörper
mittels des chemischen Crosslinkers Dimethyl pimelimidate (DMP) an den Beads
kovalent befestigt. Die Reaktion wurde mit 50 mM Tris pH 7,4 gestoppt (15 min, RT)
und die Beads in PBS-T aufgenommen. Anschließend wurden 30 µl Beads mit 30 µg
Lysat inkubiert (ÜN, 4 °C). Nach der Inkubation wurden die Proben dreimal mit
kaltem PBS gewaschen und die Proben in 10 µl 2x Proteinprobenpuffer
aufgenommen.
Methode 2 (M2): Zunächst wurde das Lysat mit gewaschen Beads (3x, 0,1M
Natriumacetat pH 5,0) versetzt (40 min, RT), um spätere unspezifische Bindungen
der Proteine mit den Beads zu verringern. Dieses Lysat wurde anschließend mit der
gewünschten Menge Antikörper versetzt und inkubiert (ÜN, 4 °C).
Frische Beads wurden wie in der Methode 1 gewaschen und zu dem AntikörperLysat-Gemisch gegeben (40 min, RT). Die Proben wurden anschließend 3x mit
kaltem PBS gewaschen und schließlich mit 10 µl 2x Proteinprobenpuffer versetzt.
Methode 3 (M3): Wie Methode 3, nur wurde der Proben-Antikörper-Beads Schritt auf
80 min verlängert.
45
Methode 4 (M4): Das Protokoll stammt nicht aus dem IMBL, sondern wurde nach
einem generellen IP-Protokol von Thermo Fisher modifiziert:
Die Zellen wurden mit IP-Lysepuffer versetzt und anschließend wurden 250 µg Lysat
mit weiteren 250 µl IP-Lysepuffer und mit 3 µg Antikörper versetzt (ÜN 4 °C).
Anschließend wurden 10 µl gewaschene Beads (2x IP-Lysepuffer) hinzugeben und
das Gemisch inkubiert (1 h, RT). Die Proben wurden dreimal mit IP-Lysepuffer
gewaschen und anschließend mit Elutionspuffer eluiert. Dieser musste anschließend
mit 1M Tris pH 9,5 neutralisiert werden.
Nach ersten Tests wurde nur noch die Methode M1 mit leichten Modifikationen
verwendet. Allen PBS-IP-Puffern wurden0,1M CaCl2, 1M MgCl2 zugesetzt und den
Waschpuffern
noch
Stabilisierung
von
zusätzlich
Cadherin-17
0,05 %
und
Tween-20.
das
Das
Tween-20
Kalzium
sorgt
für
dient
der
stringentere
Waschbedingungen.
3.2.2.6. SDS-Gelelektrophorese
Die
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE)
ermöglicht
es,
Proteine
in
Abhängigkeit von ihrer Masse und ihrer Ladung aufzutrennen. Die Proteine wandern
in einem Spannungsfeld mit konstanter Geschwindigkeit, die von ihrer Ladung und
ihrem Molekulargewicht (und somit nach ihrer Größe) abhängt, durch ein Gel. Das
Gel besteht aus einem Polymer von Acrylamid und N,N’-Methylenbisacrylamid. Um
eine Proteintrennung unabhängig vom Ladungszustand zu erreichen, wird sowohl
den Gelen als auch den Proben SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) zugesetzt. Hierbei
handelt es sich um ein Detergenz, welches die Proteine denaturiert. Die SDSMoleküle können über ihre unpolare Domäne mit unpolaren Seitenketten der
46
Proteine interagieren. Durch diese Assoziation verleiht SDS allen Molekülen eine
negative Ladung, die zur Proteingröße proportional ist. Somit verläuft die
Auftrennung im Gel nur noch nach der Größe. Da SDS nicht in der Lage ist,
kovalente Bindungen zu lösen, müssen Disulfidbrücken durch den Zusatz von βMercaptoethanol reduziert werden.
3.2.2.6.1. Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese
Die diskontinuierliche SDS-PAGE (Laemmli, 1970) erlaubt eine Fokussierung des
Proteingemisches vor der Auftrennung im Gel. Dies ermöglicht eine gute optische
Trennung von Proteinen mit kleinen Massendifferenzen in scharfen Banden. Um dies
zu erreichen, wird ein zwölfprozentiges Trenngel (pH8,8) mit einem weitmaschigen
fünfprozentigen Sammelgel (pH 6,8) überschichtet. Der Ansatz für vier Gele ist
Tabelle 3 zu entnehmen.
Tab.3:
Chemikalie
Trenngel
Sammelgel
Wasser [ml]
6,6
2,825
Upper Tris [ml]
5
-
Lower Tris [ml]
-
1,25
Acrylamid [ml]
8,1
0,825
SDS (10 %) [µl]
200
50
TMED [µl]
15
7,5
APS (10 %) [µl]
150
75
Zusammensetzung
der
Polyacrylamidgele.
Die
angegebenen
Mengen
ergeben
insgesamt 4 Gele.
TEMED katalysiert die Bindung der freie Radikale des Polymerisationsinitiators APS
und dient somit der Verstärkung der Vernetzung von Acrylamid/Bisacrylamid. Das
Trenngel wurde in die Elektrophoreseapparatur gefüllt und mit Isopropanol
überschichtet, um eine glatte Oberfläche zu erhalten. Nachdem das Trenngel
47
auspolymerisiert war, wurde das Isopropanol zugegeben und die Oberfläche des
Trenngels kurz mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde das
Sammelgel eingefüllt und der Kamm eingesetzt. Nachdem das Sammelgel
polymerisiert war, wurde das Gel in die Elektrophoreseapparatur eingesetzt und
Elektrophoresepuffer zugegeben. Der Kamm wurde entfernt. Die Geltaschen wurden
mit 30-75 µg Lysat/Gewebeextrakt oder aufgearbeitete Serumproben bzw. 8 µg
Sekretom in 5x-Proteinprobenpuffer befüllt. Zuvor wurden die Proben für 5 min bei 95
°C erhitzt. Zunächst wurden 55 V für 15 min angelegt, um eine Fokussierung der
Proben an der Grenze zwischen Trenn- und Sammelgel zu erreichen. Die
Gelelektrophorese lief anschließend bei 135 V für 90 min.
3.2.2.6.2. Gradientengelelektrophorese
Sehr große Proteine sind mit dem in 2.2.2.5.1 beschriebenen PAGE-Verfahren nicht
auftrennbar. Sie würden nicht effizient in das Gel einlaufen. Um ein Analyse großer
Proteine zu gewährleisten, aber gleichzeitig auch mittelgroße Proteine mit
analysieren zu können, wurden 3-8 % Tris-Acetat-Gradienten-Gele (Invitrogen)
verwendet. Diese Gele basieren auf einem Tris-Acetat-Puffer-System (pH 7.0) und
enthalten kein SDS. SDS wird hier mit dem Tris-Acetet-Puffer (Invitrogen)
zugegeben. Für die massenspektrometrische Analyse der IP-Proben wurden 4-12 %
bis-Tris-Gradientengele verwendet, da die kommerzielle Herstellung der Gele die
Vergleichbarkeit der identifizierten Proteinhöhe gewährleistet. Die Gelelektrophorese
wurde mit MES-Puffer (Invitrogen) durchgeführt.
Die Proteine bewegen sich in diesen Gelen, bis die Vernetzung zu stark ist und sie
stecken bleiben. Zudem ermöglicht das Gradientengel eine bessere Auftrennung von
Proteinen mit ähnlichem Molekulargewicht als ein Polyacrylamid-Gel mit einer festen
Konzentration. Für die Gelelektrophorese wurden der Kamm sowie ein Schutzkleber
48
entfernt und das Gel anschließend in die Apparatur eingebaut. Es wurde Tris-AcetatLaufpuffer bzw. MES-Laufpuffer hinzugegeben. Die Taschen wurden mit 30-75 µg
Lysat-/Gewebe-/Serumprotein bzw.8 µg Sekretomprotein in 5x Protein-Probenpuffer
beladen. Zuvor wurden die Proben für 5 min bei 95 °C erhitzt. Die Gelelektrophorese
wurde bei 150 V für 90 min durchgeführt.
3.2.2.7. Western Blot
Um die durch PAGE aufgetrennten Proteine analysieren zu können, wurden sie mit
einem Semidry-Blot-System auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran
wurde zunächst für 1-2 Minuten in Isopropanol aktiviert und anschließend in Anode-IPuffer äquilibriert. In der Zwischenzeit wurden die Gele in Kathodenpuffer gelegt, um
sie zu äquilibrieren. Zwei dicke, in Kathoden-Puffer getränkte Whatman-Papiere
wurden auf die Kathodenplatte des Semi-dry Blotters gelegt. Darauf folgten in dieser
Reihenfolge: das Gel, die äquilibrierte PVDF-Membran und je ein dickes in Anode-Ibzw. Anode-II-Puffer getränktes Whatman-Papier. Es ist darauf zu achten, dass der
gesamte Aufbau luftblasenfrei war, da diese den Transfer behindern würden. Die
FastBlot-Anode wurde aufgelegt und mit einem geringen Gewicht beschwert. Der
Blot der kleiner Proteine erfolgte bei 2 mA/cm² für 45 min und der großer Proteine bei
1,25 mA/cm² für 120 min.
3.2.2.8. Immundetektion
Nach beendetem Transfer wurde die Membran mit 5 % Magermilchpulver in PBS
blockiert (1 h, RT). Dies ist notwendig, um noch vorhandene freie Bindungsstellen
der Membran zu blockieren und somit den Hintergrund zu reduzieren.
Nach Antikörperdetektion wurden die Membranen mit PBS-T gewaschen (3x 10 min,
RT). Nach der Sekundärantikörperinkubation (45 min, RT) wurden die Membranen
49
erneut gewaschen (3x 5 min, RT). Die Sekundärantikörper waren mit einem
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, der mit dem Odyssey-System von Li-Cor angeregt
und eingelesen werden kann. Die Fluoreszenz kann so ohne zwischengeschaltete
Enzymreaktion detektiert werden und erlaubt eine quantitative Aussage über die
Proteinmenge.
3.2.2.9. Proteinfärbung
Proteine können auch unspezifisch direkt im Gel durch Anfärbung sichtbar gemacht
werden. Bei den hier verwendeten Methoden handelt es sich um die Silberfärbung
nach Heukeshoven sowie eine Kryptonfärbung.
3.2.2.9.1. Silberfärbung nach Heukeshoven
Das Prinzip der Silberfärbung nach Heukeshoven (Heukeshoven und Dernick, 1988)
beruht auf einer selektiven Reduktion von Proteinen komplexierter Silberionen durch
Formaldehyd. Es entstehen Silberkeime, die während der Entwicklung des Gels die
Reduktion weiterer Silberionen katalysieren.
Die Gele wurden nach der Elektrophorese bzw. nach dem Western Blot in
Fixierlösung A gegeben und über Nacht inkubiert. Nach Inkubation in Lösung B (12h, RT) wurden die Gele mit destilliertem Wasser gewaschen (2x 10 min) und mit
Lösung C inkubiert (20 min, RT). Die Entwicklung erfolgte in Lösung E solange, bis
die gewünschte Farbintensität erreicht wurde. Anschließend wurde die Reaktion
durch Lösung F abgestoppt (20 min, RT) und noch einmal mit Wasser gewaschen
(10 min, RT). Anschließend konnten die Gele eingescannt und getrocknet werden.
50
3.2.2.9.2. Kryptonfärbung
Bei
der
KryptonTM-Proteinfärbung
(Pierce)
handelt
es
sich
um
eine
Fluoreszenzfärbung für SDS-PAGE Gele. Die Proteine werden hier mit einem
Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. Dieser wird durch Infrarotlicht angeregt und emittiert
Licht in einer Wellenlänge von 680 nm. Dieses Licht kann mit dem Odyssey System
(Li-Cor) detektiert werden. Während die Silberfärbung nach Heukeshoven sensitiver
ist, hat die KryptonTM-Färbung den Vorteil, dass sie mit einer anschließenden
massenspektrometrischen Analyse der gefärbten Proteine kompatibel ist.
Für die Färbung wurde das Gel zunächst in der Fixierlösung inkubiert (2x 10 min)
und mit Wasser gewaschen (5 min, RT). Es folgte die Inkubation mit der Färbelösung
(1 h, RT) und das anschließende Entfärben des Gels mittels Entfärbelösung (5 min,
RT). Nachdem die Gele mit destilliertem Wasser gewaschen wurden (2x 7 min)
wurden sie am Odyssey-System von Li-Cor eingelesen.
3.2.2.10. Ausschneiden
von
Gelbanden
für
die
massenspektrometrische Analyse
Die massenspektromentrische Analyse von Proteinen erlaubt eine Antikörperunabhängige Identifizierung. Zur Analyse der IP wurde die gesamte Proteinspur in 15
Scheibchen geschnitten. Bei den Fat1-Analysen wurde die mögliche Fat1-Bande
gezielt ausgeschnitten. Nach einem tryptischen Verdau können die dadurch
entstehenden Peptide werden in einem Massenspektrometer untersucht und mittels
Datenbanksuchen definierten Proteinen zugeordnet.
Für die massenspektrometrische Analyse einzelner Gelbanden wurde zunächst ein
Gradientengel angefertigt. Die Taschen wurden mit 4 µg Sekretom, 30 µg Lysat, den
IP-Proben bzw. 10 µg Serumprotein in 5x Proteinprobenpuffer befüllt. Die
51
Gelelektrophorese wurde wie in 2.2.2.6.2 beschrieben durchgeführt. Anschließend
wurde das Gel wie in 3.2.2.9.2 beschrieben kryptongefärbt. Die Banden wurden
vorsichtig mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und bei -80 °C gelagert
oder direkt zum Kooperationspartner in Freiburg (Cadherin-17) bzw. zum MPI der
Ruhr-Universität Bochum (Fat1) verschickt.
3.2.2.11. cDNA-Synthese
Für die Herstellung von Sonden für die Hybridisierung der Northern Blots musste
eine cDNA-Synthese durchgeführt werden. Dafür wurde die gesamte erhaltene
mRNA einer Zelllinie mithilfe der RNA-abhängigen DNA-Polymerase (reverse
Transkriptase) in cDNA (complememtary DNA) umgeschrieben. Es wurden oligo dTPrimer verwendet, die mit dem Poly-A-Ende der mRNA hybridisieren. Die
verwendete Polymerase war die SuperScript II RNase H- Reverse Transkriptase
(Invitrogen). Das Protokoll für einen 80 µl Ansatz ist in Tabelle 4 dargestellt.
50 µM Oligo dT
4 µl
dNTP-Mix 10 mM (jeweils)
4 µl
20 µg RNA
X µl
H2O dest.
44-xµl
5 Minuten bei 65 °C
Auf Eis abkühlen
5x Firststrand Buffer
16 µl
0,1 mM DTT
8 µl
2 Minuten bei 42 °C
SuperScript II
50 Minuten bei 42 °C
15 Minuten bei 70 °C
Auf Eis abkühlen
Tab.4: 80 µl Ansatz für eine cDNA-Synthese.
52
4 µl
Die Konzentration der cDNA wurde anschließend mit dem NanoDrop 2000 (Thermo
Fischer) bestimmt und die cDNA bei -20 °C gelagert.
3.2.2.12. Sondengenerierung für Northern Blot
Für die Herstellung spezifischer cDNA-Sonden wurden zunächst genspezifische
Primer mithilfe des Programms Vector NTI ausgewählt. Die zur Konstruktion
benötigte Gensequenz wurde von der Gendatenbank des National Center for
Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) bezogen. Anhand der erhaltenen
Sequenz wurde ein Primerpaar mit jeweils 20 Basenpaaren ermittelt, welches ein
genspezifisches Produkt von 250 bis 350 Basenpaaren amplifiziert. Es wurde dabei
auf einen GC-Gehalt um 50 %, geringe Abweichungen in den Schmelzpunkten der
Primer und eine Cytosin- oder Guaninbase am 3’ Ende geachtet. Die Primer wurden
durch die Firma Operon synthetisiert.
Der PCR-Ansatz für die Herstellung von cDNA-Sonden ist der Tabelle 5 und das
dazugehörige PCR-Programm, der Tabelle 6 zu entnehmen.
PCR-Puffer 10-fach
5 µl
dNTP-Mix (jeweils 10 mM)
1 µl
5’ spezifischer Primer
1 µl
3’ spezifischer Primer
1 µl
cDNA
2 µl
Taq-DNA Polymerase (Biorad)
0,4 µl
H2O dest.
39,6 µl
Tab. 5: PCR-Ansatz für die cDNA-Sonden Synthese.
53
1
94 °C
2 Minuten
2
52 °C
3 Minuten
3
72 °C
2 Minuten
4
94 °C
2 Minuten
5
35 x zu Schritt 2
6
52 °C
3 Minuten
7
72 °C
10 Minuten
8
4 °C
∞
Tab.6: PCR-Programm für die cDNA-Sonden Synthese.
Die Proben wurden anschließend mit 5x DNA-Probenpuffer versetzt und in einem
zweiprozentigen
Agarosegel
aufgetrennt.
Die
entsprechende
Bande
wurde
ausgeschnitten und die PCR-Produkte mithilfe des Qiaex Gel Extraction Kit von
Qiagen eluiert. Die Konzentration wurde am NanoDrop 2000 (Thermo Fischer)
bestimmt.
3.2.2.13. DNA-Gelelektrophorese
Aufgrund der negativen Ladung des Phosphat-Rückgrats kann die DNA durch eine
horizontale Gelelektrophorese anhand ihrer Größe aufgetrennt werden. Durch den
Vergleich mit DNA-Längenstandards bekannter Größe ist die Länge des Fragments
abschätzbar.
Die Anfärbung der DNA geschah durch Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-6phenylphenanthridiniumbromid, EtBr). Einzelne EtBr-Moleküle interkalieren zwischen
die Basen der DNA (bis zu 3 Moleküle pro 10 Basen), wodurch sich das
Anregungsspektrum des Moleküls verändert. Dies erhöht die Fluoreszenz der
Substanz bei Anregung durch UV-Licht bei 312 nm stark. Dabei emittierte EtBr Licht
54
im orange-roten Bereich bei 590 nm, was zu einem leuchtenden Signal an den
Stellen führt, an denen sich DNA befindet.
Für die Herstellung eines zweiprozentigen Agarosegels wurden 2 g Agarose in
100 ml 1xTAE-Puffer bis zur vollständigen Auflösung in der Mikrowelle erhitzt.
Nachdem die Lösung auf etwa 60 °C abgekühlt war, wurden 3 µl EtBr zugegeben,
die Lösung in den Gelträger der horizontalen Gelelektrophoresekammer gegossen
und mit einem Kamm mit der gewünschten Taschengröße versehen. Die 50µl PCRAnsätze wurden mit 12 µl 5x DNA Probenpuffer versetzt und auf das Gel
aufgetragen. Vom verwendeten DNA-Größenstandard (1kB DNA-Ladder, New
England BioLabs) wurden 10 µl aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in 1x TAEPuffer bei 130 V bis zum Erreichen der gewünschten Laufstrecke. Die zu
isolierenden DNA-Banden wurden mit einem Skalpell unter UV-Licht ausgeschnitten
und in ein Eppendorfgefäß überführt. Die DNA wurde mit dem Qiaex Gel-Extraktion
Kit eluiert.
3.2.2.14. DNA-Elution aus Agarose-Gelen
Für die Gelelution der DNA wurde das QIAEX II Gel Extraktion Kit der Firma Qiagen
verwendet. Dieses Verfahren beruht, ebenso wie die Säulen zur RNA-Präparation
auf der Bindung von Nukleinsäuren an Silika (siehe 3.2.2.3), hier an Silikapartikel
anstelle der Silikamembran bei der DNA-Präparation.
Das Gelstück im Eppendorfgefäß wurde gewogen und mit 300 µl Buffer QX1 pro
100 µg Gel und 10 µl Qiaex II Suspension versetzt. Die weitere Extraktion erfolgte
nach den Herstellerangaben aus dem Handbuch. Die DNA wurde zweimal mit Buffer
EB eluiert. Die Konzentrationsbestimmung wurde wieder mit dem NanoDrop 2000
(ThermoFischer) durchgeführt.
55
3.2.2.15. RNA-Gelelektrophorese
Für den Northern Blot muss die RNA zunächst mittels Agarose-Gelelektrophorese
abhängig von ihrer Länge aufgetrennt werden. Zur Beurteilung der Qualität wurden
die unter UV-Strahlung sichtbaren Banden der 28S- und 18S-rRNA verwendet.
Für die Herstellung eines einprozentigen denaturierenden Agarose-Gels in 1 %
MOPS (3-Morpholino-1-propansulfonsäure) wurde 1 g Agarose eingewogen und in
87,5 ml DEPC-H2O in einem Mikrowellengerät bis zur vollständigen Auflösung erhitzt.
Nach dem Abkühlen der Lösung auf etwa 60 °C wurden 10 ml 10x MOPS und 2,5 ml
Formaldehyd
zugefügt.
Gelelektrophoreseträger
Die
Lösung
gegossen,
wurde
welcher
in
in
die
einen
horizontalen
RNA-
Gelelektrophoresekammer
eingesetzt worden war. Zu gering konzentrierte RNA-Proben wurden zunächst in
einer SpeedVac (Savant) eingeengt. Von jeder RNA-Probe wurden 6 µg mit 5 µl
Formamid, 2µl Formaldehyd und 1µl 10x MOPS versetzt und für 10 Minuten bei
65 °C erhitzt. Anschließend wurden 0,7 µl einer Ethidiumbromid-Lösung und 1µl
RNA-Ladepuffer zugegeben. Das komplette Probenvolumen wurde auf das Gel
aufgetragen. Die Gelelektrophorese lief bei 75 V in 1x MOPS für 90 Minuten. Unter
UV-Strahlung wurde RNA sichtbar gemacht.
3.2.2.16. Northern Blot
Der Begriff Northern Blot wurde in Analogie an das 1975 von Edwin Southern
(Southern, 1975) entwickelte Southern Blot Verfahren gewählt da beim Northern Blot
DNA statt RNA geBlottet. Das Grundprinzip des Transfers ist allerdings das Gleiche.
Um die aufgetrennten RNA-Fragmente weiter untersuchen zu können, werden sie
auf eine feste Membran übertragen. Anders als bei Proteinen wird hier keine
Spannung angelegt. Der Transfer findet mit dem KapillarBlot-Verfahren statt. Dabei
56
werden die RNA-Moleküle durch Kapillarkräfte auf die Membran übertragen, indem
der Blot-Puffer durch eine dicke Schicht aus Papiertüchern durch das Gel und die
Membran gesaugt wird.
Vor dem Blotten musste das Formaldehyd aus dem Gel durch Waschen mit DEPCH2O entfernt werden. Die Nylonmembran (Hybond N, Amersham) und das Gel
wurden anschließend für 20 Minuten in 20x SSC-Puffer äquilibriert. Anschließend
wurde der Blot aufgebaut. In eine Schale wurde 20x SSC-Puffer gegeben und ein
dünnes Wattman-Papier mit beiden Enden eingetaucht. Auf dieses Papier wurden
das Gel und die Membran gelegt. Zwei weitere Scheiben Wattman-Papier, sowie
Papiertücher wurden darüber gelegt und der Aufbau mit einer Flasche beschwert.
Der Transfer fand über Nacht statt. Die Membran wurde anschließend kurz mit UVLicht bestrahlt, um die RNA durch Cross-Links fest an die Nylonmembran zu binden.
Nachdem die Blots fünf Minuten in 2x SSC-Puffer geschwenkt wurden, konnten sie
für die Hybridisierung verwendet werden.
3.2.2.17. Herstellung radioaktiv markierter cDNA-Sonden
Für die Detektion der auf die Nylonmembran aufgebrachten RNA wurden radioaktiv
markierte cDNA-Sonden verwendet. Die Herstellung der Sonden erfolgte mit
zufälligen Hexanukleotiden als Primer mit dem Megaprime DNA Labeling System
(Amersham). Als radioaktives Nukleotid wurde α32P-dATP (Hartmann Analytics)
eingesetzt. Für die Reaktion wurden 25 ng der jeweiligen DNA-Sonde in 8µl DEPCH2O eingesetzt. Die Sonde wurde mit 2,5 µl High TE-Puffer und 2,5 µl PrimerMischung 5 Minuten aufgekocht und bei Raumtemperatur abgekühlt. Von den
unmarkierten Nukleotiden (dCTP, dGTP, dTTP, ) wurden je 2 µl eingesetzt.
Anschließend wurden 2,5 µl Reaktionspuffer, 1 µl Klenow-Fragment und 2,5 µl α32PdATP (3000 mCi/mmol) zugegeben. Die Markierungsreaktion erfolgte im Heizblock
57
für 30 Minuten bei 37 °C. Das Klenow-Fragment ist durch seine 5’.3’-PolymeraseAktivität
in
der
Lage
einen
neuen
DNA-Strang
zu
synthetisieren,
wenn
einzelsträngige DNA als Template vorliegt. Bei dieser Reaktion wird das α 32P-dATP
in den neuen cDNA-Strang eingebaut und es entsteht eine radioaktive Sonde. Die
Reaktion wurde mit 2,5 µl 0,2 M EDTA gestoppt. Durch Zentrifugation (5 min, 700g)
durch Chromaspin-Säulen (Clontech) wurden die freien Nukleotide entfernt. Das
Prinzip dieser Säulen ist die Gelfiltration.
Zur Messung der Aktivität wurde 1 µl Sonde mit 200 µl H2O im Szintillationszähler
gemessen. Der Rest der Sonde wurde zur Denaturierung für 5 Minuten aufgekocht
und schnell auf Eis abgekühlt. Sie konnte nun für die Hybridisierung verwendet
werden.
3.2.2.18. Hybridisierung
Für die radioaktive Hybridisierung wurden die Northern Blots mit der RNA-Seite nach
innen
in
die
Hybridisierungsflaschen
gegeben
und
mit
10 ml
der
Vorhybridisierungslösung (siehe Tabelle 7) für mindestens 1 ½ Stunden bei 50 °C im
Hybridisierungsofen
inkubiert.
Die
Heringssperma-DNA
in
der
Vorhybridisierungslösung, die zur Blockierung von unspezifischen Reaktionen dient,
wurde vor der Verwendung ebenfalls denaturiert.
Formamid
5,5 ml
Denhardt 50 x
1 ml
Dextransulfat 50 x
1 ml
20 % SDS
1 ml
Heringssperma DNA
160 µl
5 M NaCl
1 ml
Tab. 7: Vorhybridisierungslösung für einen Ansatz.
58
Anschließend wurde die radioaktiv markierte Sonde zum Northern Blot gegeben,
wobei darauf zu achten war, dass diese nicht direkt auf den Blot, sondern in die
Lösung
pipettiert
wurde.
Die
Blots
wurden
über
Nacht
bei
50 °C
im
Hybridisierungsofen inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Northern Blot einmal kurz
und einmal 30 min mit 2x SSC und 0,5 % SDS und dann noch zweimal 30 min mit
0,5x SSC und 0,5 % SDS gewaschen. Die Membranen wurden getrocknet, in Folien
eingeschweißt und die Radioaktivität gemessen. Anschließend wurden sie auf
Phosphorimager Screens exponiert. Die Expositionsdauer lag je nach Signalstärke
zwischen ein und fünf Tagen.
3.2.2.19. Herstellung von Tumorgewebeextrakten
Das IMBL verfügt über Gewebeproben von verschiedenen Tumoren und zum Teil
korrespondierenden Normalgeweben. Diese Proben werden bei -80 °C gelagert. Zur
Analyse der Proteinzusammensetzung wurde zunächst ein kleines Stück Gewebe
abgebrochen. Unter ständigem Einsatz von flüssigem Stickstoff wurde es zu einem
feinen Pulver gemahlen und anschließend mit entsprechender Menge NDE-Puffer
versetzt (1 h, 4 °C). Die vollständige Kühlung der Proben und Reaktionsutensilien ist
wichtig, da sonst der proteolytische Abbau vieler Gewebekomponente eingeleitet
wird. Unlösliche Bestandteile wurden anschließend durch Zentrifugation (15 min,
14000 rpm) entfernt und die Proben aliquotiert. Es folgte eine Proteinbestimmung
nach Bradford.
59
3.2.2.20. Anreicherung
von
Serumskomponenten
mittels
differenzieller Zentrifugation
Vorangegangene Versuche mit Sekretomen haben gezeigt, dass sich die mit ca. 450
kDa sehr große Ektodomäne des Protocadherins Fat1 auch durch eine
Ultrazentrifugation anreichern lässt. Diese Idee wurde auch für den Versuch der
Anreicherung des Proteins aus Serumproben verwendet. Dafür wurden 2,5 ml Serum
mit 1x PBS auf 15 ml aufgefüllt und zentrifugiert (10 min, 300 g, 4 °C), um
Zelltrümmer im Serum zu entfernen. Der Überstand wurde in UZ-Röhrchen überführt
und in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (16.500 g, 20 min, 4 °C). Die Überstände
wurden in neue UZ-Röhrchen überführt und erneut zentrifugiert (117.000 g, 90 min,
4°C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 800 µl PBS durch Vortexen
gelöst. Die Proben wurden erneut auf 15 ml aufgefüllt und noch einmal zentrifugiert
(117.000 g, 90 min, 4 °C). Die Überstände wurden verworfen und das Pellet
vorsichtig getrocknet und in 100 µl 1x PBS aufgenommen. Anschließend wurde eine
Proteinbestimmung nach Bradford durchgeführt.
Da bei dieser Durchführung die Bradford-Ergebnisse oft negativ waren, wurde das
Protokoll modifiziert. Es wurde nun berücksichtigt, dass der hier verwendete Rotor
ein
Anderer
war,
als
in
den
vorangegangenen
Experimenten
zur
Exosomenpräparation aus Sekretomen. Um dieselbe Wirkung zu erzielen, musste
die Zentrifugationsdauer auf 5 Stunden erhöht werden. Zudem wurde der letzte
Zentrifugationsschritt weggelassen. Dieser diente lediglich dazu, Verunreinigungen
der Exosomenpräparation zu entfernen. Da Fat1 zu diesen Verunreinigungen gehört
und angereichert werden sollte, wurde auf den letzten Waschschritt verzichtet.
Von den Proben wurden 12 µg bzw. 50 µg aufgetragen und per Western Blot auf das
Protein Fat1 untersucht. Zudem wurden 10 µg für eine Analyse aufgetragen.
60
3.2.2.21. ELISA für lösliches Fat1
Der ELISA wurde in weißen MaxiSorp flat-bottom 96 well Platten durchgeführt, die
nach Herstellerangaben für eine Antikörperbeschichtung besonders geeignet sind.
Für den Fat1-Sandwich-ELISA wurde der Fat1-Antikörper NTD-7, der die
extrazellulären Cadherin-Domänen 11 und 12 erkennt (Sadeqzadeh et al., 2011), als
Fänger-Antikörper ausgewählt. Nach Antigenbindung erfolgt die Detektion mit dem
Fat1-Antikörper
NTD14,
der
die
Cadherin-Domäne
12
erkennt
(Sadeqzadeh et al., 2011). Dieser wird durch einen HRP-gekoppelten Antikörper
detektiert, der eine Farbreaktion katalysiert. Die Reaktion erzeugt ein Signal, das
proportional zur Menge des gebundenen Antigens ist.
Der ELISA wurde zuvor in der Arbeitsgruppe Thorne (Newcastle, Australien) anhand
von Zellkulturüberständen von Fat1-positiven und Knockdown Zelllinien validiert
(siehe auch Wojtalewicz et al., Manuskript eingereicht).
Für den ELISA wurden zunächst 100µl des monoklonalen Fängerantikörpers
(50 µg/ml, Karbonat-/Bikarbonatpuffer pH9,6) inkubiert (ÜN, 4 °C). Anschließend
wurden die Platten dreimal mit 0,1 % Tween-20 (v/v) in PBS gewaschen. Dafür
wurde jedes Well mit einer Spritzflasche gespült und die gesamte Platte
anschließend ausgeklopft, um die Flüssigkeit zu entfernen. Nach dem letzten
Waschschritt wurde die Platte noch zentrifugiert, um letzte Flüssigkeitsreste zu
entfernen, sodass nachfolgende Lösungen nicht weiter verdünnt werden.
Anschließend erfolgte die Blockierung mit 5 % Magermilchpulver in 0,1 % Tween20/PBS (2 h, RT), ehe die Platte erneut wie oben beschrieben, gewaschen wurde.
Für die Probeninkubation wurden die Seren zehnfach in 1 % CHAPS/PBS verdünnt.
Die
Seren
wurden
von
Patienten
61
der
Medizinischen
Klinik
des
Knappschaftskrankenhauses der Universitätsklinik Bochum gewonnen. Die Proben
wurden von Salwa Kübler im Rahmen ihrer Doktorarbeit (Kübler) gesammelt und die
klinischen Daten der Patienten in einer Access-Datenbank zusammengefasst. Alle
Seren wurden aliquotiert und bei -80 °C gelagert. Für den ELISA wurden möglichst
frische Aliquots verwendet und kurz vor der Verwendung aufgetaut.
Nach der Probeninkubation (2 h, RT) wurde die Platte viermal gewaschen und der
Detektionsaktikörper NTD-14, (0,05 µg/ml in 2 % Magermilchpulver/PBS) inkubiert
(2 h, RT). Die Wells wurden erneut gewaschen und anschließend mit 50 µl 5 µg/ml
Neutravidin-HRP inkubiert (2 h, RT). Die Messung der Seren erfolgte mit Hilfe von 50
µl des SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrats (Thermo, Fisher
Scientific). Dieses Substrat wird durch HRP katalytisch umgewandelt und emittiert
dabei Licht. Dieser Prozess der Chemolumineszenz ermöglicht einen sensitiven
Nachweis. Für die Inkubation wurde die Platte für eine Minute geschüttelt. Die
Detektion des Signals erfolgte im Luminometer.
62
4. Ergebnisse und Auswertung
4.1.
Suche nach Cadherin-17-Interaktionspartnern zur Abklärung der
Funktion
Cadherin-17
ist
im
Menschen
unter
physiologischen
Bedingungen
ein
darmspezifisches Protein (Gessner und Tauber, 2000) mit noch unbekannter
Funktion. Eine ektope Expression in Tumoren des Gastrointestinaltraktes geht häufig
mit einer onkogenen Eigenschaft einher (Liu et al., 2009; Dong et al., 2009;
Ko et al., 2004, Ito et al., 2005).
Cadherin-17 wird in unserer Arbeitsgruppe seit einigen Jahren intensiv untersucht.
So konnten wir zeigen, dass seine Ektodomäne von kultivierten Darmkarzinomzellen
in relativ großen Mengen freigesetzt wird. Diese Freisetzung geschieht auch in vivo,
sodass die Ektodomäne im Serum nachgewiesen werden kann. ELISA-Analysen des
Serums von Patienten mit Kolorektalkarzinomen ergaben eine signifikante Erhöhung
der detektierbaren Cadherin-17-Ektodomäne bei Patienten ab UICC-Stadium-III
(Weiß et al., Manuskript in Überarbeitung). Es ist vorstellbar, dass auch diese
freigesetzte Ektodomäne eine andere Funktion hat, möglicherweise auch eine
antagonistische, zum intakten Membranprotein, ähnlich wie dies für das lösliche
E-Cadherin beschrieben ist (Damsky et al., 1983).
Im Rahmen dieser Arbeit sollen über die Identifizierung möglicher Interaktionspartner
Erkenntnisse zur Funktion von Cadherin-17 gewonnen werden. Dafür werden
zunächst
verschiedene
Co-Immunpräzipitations-(CoIP)-Protokolle
untereinander
verglichen. Anschließend soll die Methode weiter optimiert werden, um eine
möglichst
gute
Anreicherung
von
Cadherin-17
63
und
seinen
möglichen
Interaktionspartnern
zu
erreichen.
Die
Proben
sollen
dann
mittels
Massenspektrometrie analysiert und die erhaltenen Kataloge weiter evaluiert werden.
Über die Identifizierung möglicher Interaktionspartner können Hinweise auf die
molekularen Prozesse gewonnen werden, in die Cadherin-17 involviert ist. Dies
könnte nicht nur helfen, seine physiologische Funktion zu ergründen, sondern
darüber
hinaus
auch
Hinweise
liefern,
warum
manche
Tumore
des
Gastrointestinaltraktes dieses Protein ektop exprimieren.
4.1.1. Optimierung
einer
Co-Immunopräzipitation
für
Cadherin-17
positive Immunkomplexe
In unserer Arbeitsgruppe existieren verschiedene CoIP-Protokolle mit ProteinG
gekoppelten paramagnetischen Beads, da eine IP oft an das zu untersuchende
Protein und die zu untersuchende Fragestellung angepasst werden muss. Die
Methode ist einfach, schnell und funktioniert ohne Zentrifugation und Filtration. Sie
zeichnet sich im Vergleich zur Verwendung von Agarosebeads und Säulensystemen
durch
einen
verringerten
Proteinverlust
und
eine
vernachlässigbare
Pufferübertragung zwischen den einzelnen Waschschritten aus (Sousa et al., 2011).
4.1.1.1. Vergleich von vier unterschiedlichen CoIP-Protokollen
Im ersten Schritt wurden die Immunpräzipitate aus vier verschiedenen Protokollen
unter Verwendung zweier unterschiedlicher Cadherin-17 Antikörper miteinander
verglichen. Als Negativ-Kontrolle dienten Beads, an die kein Antikörper gekoppelt
war.
Im ersten Protokoll (M1) werden die Antikörper mittels eines chemischen
Crosslinkers kovalent an die Beads gekoppelt. Dies soll verhindern, dass die
64
Antikörper sich in den nachfolgenden Analysen von den Beads lösen. Die AntikörperAntigen-Inkubation erfolgte über Nacht (üN).
Methode 2 (M2) arbeitet mit einem Preclearing-Schritt des Lysats, um unspezifische
Bindungen zu vermeiden. Ein weiterer Unterschied zur Methode 1 ist, dass die
Antikörper erst mit der Probe inkubiert (üN) werden, und anschließend eine Bindung
an die Beads erfolgt.
Methode 3 (M3) unterscheidet von Methode 2 in einer längeren Inkubationszeit der
Proben-Antikörper-Beads Mischung.
Die letzte Methode (M4) verwendet andere Binde- und Waschpuffer. Die Probe wird
zuerst mit dem Antikörper inkubiert (üN), anschließend werden die Beads
hinzugefügt.
Die beiden verwendeten Antikörper sind ein kommerziell erhältlicher monoklonaler
Antikörper der Firma R&D-Systems (MAB1032) und der monoklonale Antikörper
EP777, der von unserem Kooperationspartner Herrn Dr. Gessner (Leipzig) zur
Verfügung
gestellt
wurde.
Der
EP777-Antikörper
hat
bereits
in
einem
Cadherin-17-ELISA, der im IMBL entwickelt wurde (Weiß et al., Manuskript in
Überarbeitung), gute Ergebnisse gezeigt. Die IPs wurden aus LoVo-Zelllysaten
erstellt, die eine sehr starke Cadherin-17 Expression aufweisen.
Die Analyse der mit den vier Protokollen und zwei Antikörpern erhaltenen IP-Proben
erfolgte mittels Western Blot (siehe Abb. 5).
65
Abb. 5: Western Blot-Analyse von vier IP-Proben (M1-M4) und deren Kontrollproben (K1-K4).
Als
Kontrolle
dienten
die
Beads
ohne
Antikörper.
Alle
Methoden
wurden
mit
beiden
Cadherin-17-Antikörpern durchgeführt. Die durch die IP erhaltenen Ausbeuten wurden anschließend
mit dem Signal des Ausgangslysats (L) verglichen. Insgesamt wurden 30 µg Lysat (L) und die
IP-Probe aus der identischen Menge aufgetragen. Für den Western Blot wurde der Cadherin-17
Antikörper von Genway verwendet. Da dieser aus dem Huhn stammt, sollte nach der
Zweitantikörperdetektion kein Signal des IP-Antikörpers zu beobachten sein. Als Kontrolle der Reinheit
dienten GAPDH- und β-Tubulin (TUBB1)- Western Blots.
Die Signale wurden mit dem Odyssey System der Firma Li-Cor ausgewertet (InfrarotReader) und ergaben die höchste Cadherin-17-Ausbeute bei der Methode M1 mit
dem EP777 Antikörper (~40 %).
β-Tubulin und GAPDH wurden als Kontrolle für die Spezifität der Immunpräzipitation
gewählt, da von beiden Proteinen keine Cadherin-17-Interaktion erwartet wird und
sie in großen Mengen in der Zelle vorkommen.
66
Die Methoden M2 und M3 zeigen ein deutlich erkennbares Signal bei etwa 50 kDa.
Dabei handelt es sich um die schwere Kette der verwendeten IP-Antikörper. Sowohl
die eingesetzten Cadherin-17-Antikörper als auch der β-Tubulin Antikörper stammen
aus der Maus. Da wir im IMBL nur über diesen einen β-Tubulin Antikörper verfügen,
werden nach der Detektion auch die Antikörperkomponente der IP-Antikörper
sichtbar. Dies macht das Lysat als Kontrollprobe unerlässlich, um das echte
β-Tubulin-Signal unterhalb des 50 kDa-Signals der IP-Antikörpers zu identifizieren.
Die Proben M2 und M3 zeigen wahrscheinlich ein leichtes β-Tubulin-Signal.
Nur die Kontrollproben der Methoden M2 und M3 zeigen ein GAPDH-Signal, was
darauf hindeutet, dass die ProteinG-Beads mit dem Protein interagieren.
Die Methode M4 zeigt weder ein spezifisches Cadherin-17-Signal noch eine
Kreuzreaktion.
Alle IP-Proben zeigen ein deutlich verringertes Cadherin-17-Signal im Vergleich zum
Ausgangslysat. Um zu testen, bei welchem Schritt der Proteinverlust stattgefunden
hat, wurden die nicht-gebundenen Proben sowie die ersten Proben der insgesamt
drei Waschschritte mittels Western Blot analysiert (siehe Abb. 6):
67
Abb. 6: Untersuchung der ungebunden (nb), sowie der ersten Waschprobe (w) der einzelnen
IP-Protokolle zur Kontrolle der IP-Effizienz.
Die ungebundene Probe (nb) sowie die eingeengte Probe des ersten Waschschrittes (w) wurden im
Western Blot mit 30 µg Ausgangslysat verglichen.
Alle ungebundenen Proben zeigen immer noch ein Cadherin-17-Signal, was darauf
hindeutet, dass das Verhältnis zwischen Antikörper und Antigen noch nicht optimal
ist. Nur zwei Waschproben zeigen noch ein schwaches Cadherin-17-Signal, woraus
geschlossen werden kann, dass die Bedingungen nicht zu stringent gewählt wurden.
Die Summe der Signalstärken der IP-Probe und der entsprechenden ungebundenen
Probe erreicht noch nicht die Cadherin-17-Signalstärke des Ausgangslysats. Dies
könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Elutionsbedingungen nicht stringent genug
68
gewählt
wurden
und
Antikörper-Antigenkomplex
bei
der
anschließenden
gelelektrophoretischen Analyse in den Geltaschen hängen bleiben.
Die Methoden M2 und M3 zeigen mit dem R&D-Antikörper kein β-Tubulin-Signal in
der ungebundenen Probe. Die anderen beiden Proben mit demselben Antikörper
zeigen ein schwaches β-Tubulin-Signal.
Dies könnte darauf hindeuten, dass β-Tubulin unspezifisch an das Fc-Fragment der
IP-Antikörper bindet und damit eine spätere Bindung an das Protein G behindert.
Dies könnte auch eine Erklärung für die schwächeren Cadherin-17-Signale in den
IPs M2 und M3 sein.
Für alle weiteren IP-Analysen wurde schließlich die Methode M1 sowie der
EP777-Antikörper gewählt. Mit dieser Methode stört der Antikörper die späteren
Analysen kaum. Zudem zeigten diese Proben die geringsten Verunreinigungen durch
β-Tubulin und GAPDH.
4.1.1.2. Optimierung der gewählten CoIP-Methode M1
Zur weiteren Verbesserung der Methode wurde eine Antikörper-Titration der Beads
vorgenommen. Bisher wurde für jede IP 0,5 µg Antikörper verwendet und zur
Optimierung sollte eine Titrationsreihe von 0,25 µg bis 1,5 µg Antikörper getestet
werden. Die Cadherin-17 Ausbeuten der IPs im Vergleich zur Ausgangsmenge im
Lysat wurden anschließend per Western Blot überprüft (Abb. 7a).
Gleichzeitig wurde die ungebundene Antikörperlösung aufkonzentriert und mittels
Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend mit KryptonTM (Pierce)
gefärbt. Auf diese Weise kann die Sättigung der Beads überprüft werden: Sobald
eine Probe ein Antikörpersignal zeigt, tritt die Sättigung der ProteinG-Bindungsstellen
auf (siehe Abb. 7b).
69
Abb.7: Optimierung der Cadherin-17 IP mittels Antikörpertitration.
100 µl Beads wurden mit steigender Antikörperkonzentration inkubiert. Anschließend wurden die
Cadherin-17-Ausbeuten via Western Blot (A) und die Antikörperbindung und die Beads via
Kryptonfärbung (B) mittels des Odyssey-Systems der Firma Li-Cor ausgewertet. Als Kontrolle dienten
30 µg Lysat (a) bzw. 1 µg Antikörper (b).
Die Auswertung der prozentualen Cadherin-17-Ausbeuten ergab mit 49 % den
besten Wert bei der Verwendung von 1 µg Antikörper. Bei dieser Antikörpermenge
verbleibt ein kleiner Teil frei im Überstand (B).
Um eine möglichst hohe Ausbeute und geringe Kreuzreaktion des ProteinG zu
ermöglichen wird in allen nachfolgenden Versuchen mit einer Antikörpermenge von
1 µg pro 100 µl Beads gearbeitet.
Nach diesen Vorversuchen wurde eine erste IP-Analyse massenspektrometrisch
untersucht. Die Proteine wurden per Gelelektrophorese getrennt. Das Gel wurde
anschließend mit KryptonTM (Pierce) gefärbt und die Spur in 15 Scheibchen
70
geschnitten,
die
jeweils
einem
tryptischen
Verdau,
gefolgt
von
der
massenspektrometrischen Analyse, unterzogen wurden. Dieses Vorgehen bewirkt
eine höhere Sensitivität der Analyse und ermöglicht eine ungefähre Größenkontrolle
der identifizierten Proteine.
Abbildung 8 zeigt das mittels KryptonTM gefärbte Gel einer CoIP-Probe und dem
korrespondierenden Ausgangslysat.
Abb.
8:
Kryptongefärbtes
Gel
und
Western
Blot
zweier
korrespondierender
Versuchsdurchläufe.
Es wurden zwei Cadherin-17 Co-IPs parallel durchgeführt. Beide Proben wurden mit dem
Ausgangslysat (L) mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Das schwarze Gitter kennzeichnet die
Schnitte, die das Gel in 15 Scheibchen teilten. Da die Lysatspur sehr viel Protein enthielt, musste sie
in einer niedrigeren Intensität erneut eingelesen werden (Lh). Der Western Blot der Probe diente zur
Kontrolle, ob die IP funktioniert hat. Die IP erfolgte aus 30 µg Lysat. Für die Kryptonfärbung wurden
10 µg Lysat eingesetzt, während im Western Blot 30 µg eingesetzt wurden.
71
Während die IP-Probe im kryptongefärbten Gel einige gut definierte Banden zeigt, ist
in der Lysatprobe (L) aufgrund der enormen Proteinmenge kein Bandenmuster mehr
erkennbar. Erst, als das Gel noch einmal in einer geringeren Intensität eingelesen
wurde (Lh), sind klare Banden erkennbar. Der Western Blot zeigt, dass mittels der IP
Cadherin-17 isoliert werden konnte.
Der leichte Höhenunterschied zwischen den Banden im Blot und im kryptongefärbten
Gel kommt dadurch zustande, dass es sich um zwei verschiedene Gele handelt und
beide Gele während der Prozedur an unterschiedlichen Stellen gerissen waren.
Die bisherigen Ergebnisse liefern eine gute Basis, um die IP-Bedingungen weiter zu
verbessern, um eine höhere Ausbeute zu erzielen. Der Erfolg einer IP hängen oft von
vielen Faktoren ab, wie beispielsweise dem verwendeten Antikörper, der Zeit, dem
pH-Wert der verwendeten Puffer, und der Pufferzusammensetzung. Während ich von
den im Labor vorhandenen Antikörpern den geeignetsten ermitteln konnte, besteht
bei den anderen Faktoren noch viel Spielraum. Gleichzeitig können chemische
Linkermoleküle eingesetzt werden, um Verbindungen zu stabilisieren.
4.1.1.3. Test eines in vivo Crosslinks der Proteine mittels DSP
Durch Co-Immunopräzipitation werden bevorzugt starke Interaktionen zwischen
Proteinen aufgedeckt. Um mögliche kurzzeitige und schwache Interaktionen zu
erfassen, wurde vor der IP ein in vivo-Crosslink nach Zlatic et al. durchgeführt (Zlatic
et al., 2010).
In diesem Versuch wurden Zellen bei einer Konfluenz von 80 % mit einer
Dithiobis[succinimidyl]propionate (DSP)-Lösung inkubiert. Es handelt sich hierbei um
einen homobifunktionalen Crosslinker mit einer Länge von 12 Å. Er ist
zellmembrangängig und kann kurzfristige und labile Proteininteraktionen fixieren. Der
72
Vorteil
dieses
Linkermoleküls
ist
zudem,
dass
seine
Disulfidbrücke
mit
β-Mercaptoethanol wieder gelöst werden kann, sodass die Zusammensetzung der
Proteinkomplexe später im Western Blot analysiert werden kann.
Für die IP wurde zudem ein Ca2+ und Mg2+-haltiger Bindepuffer verwendet.
Kalziumionen stabilisieren die Cadherin-Domänen. Dies könnte die IP-Ausbeuten
erhöhen, aber auch dazu führen, dass mehr Interaktionspartner identifiziert werden.
Zudem
wurde
anstelle
der
LoVo-Karzinomzelllinie
nun
die
LT97-2
Kolonadenomzelllinie verwendet. Diese Zellen haben den Vorteil, dass sie noch recht
gut differenziert sind und eher dem intestinalen Epithel entsprechen. Unter anderen
können sie im konfluenten Zustand polarisieren und bilden somit eine apikale und
eine basolaterale Region aus (Leuhuber et al., 2006).
Zunächst wurde die Methode anhand von E-Cadherin und dem Interaktionspartner
β-Catenin getestet (siehe Abb. 9).
73
Abb. 9: Test des Crosslinkers DSP anhand von E-Cadherin (Cdh1) und seinem bekannten
Interaktionspartner β-Catenin (CTNNB1).
LT97-2 Zellen wurden mit dem chemischen Crosslinker DSP inkubiert (CL). Als Kontrolle wurde eine
weitere Schale nach demselben Protokoll, aber ohne DSP behandelt (K). Anschließend wurden eine
E-Cadherin und eine β-Catenin-CoIP aus beiden Lysaten durchgeführt. Die IP-Proben wurden im
Western Blot analysiert (A) und die Signale mithilfe des Odyssey-Programms der Firma Li-Cor
ausgewertet (B).
Die Signale der Ausgangslysate wurden jeweils als eins gesetzt und alle detektierten
IP-Signale auf dieses normiert.
74
Mit
Crosslink
wurde
in
beiden
Fällen
(E-Cadherin
und
β-Catenin) mehr
immunpräzipitiertes Protein gefunden, aber der Interaktionspartner wurde nicht
verstärkt copräzipitiert.
Die E-Cadherin-IP aus dem Crosslink-Lysat zeigt sogar trotz der Erhöhung der
präzipitierten E-Cadherin Menge weniger β-Catenin. Die erhöhte Menge an
E-Cadherin könnte darauf zurückzuführen sein, dass E-Cadherin homophile
Zell-Zellkontakte ausbildet (Takeichi, 1990) und somit durch den Crosslink
E-Cadherin direkt und indirekt aus der Probe präzipitiert werden kann.
Auch wenn in diesem Ansatz keine Anreicherung der Interaktionspartner zu
beobachten war, wurde das crossgelinkte Lysat der Zelllinien LT97-2 und LoVo auch
für eine Cadherin-17-CoIP verwendet (Abb. 10 A). Zudem wurde der Zusatz von
Tween-20 im Waschpuffer getestet um so Kreuzreaktionen entgegen zu wirken
(Abb. 10 B).
75
Abb. 10: A) Eine Cadherin-17-IP aus crossgelinktem Lysat ist möglich und härtere
Waschbedingungen beeinträchtigen die Isolierung nicht (B).
Die IP-Proben wurden per Western Blot kontrolliert. Zur Kontrolle dienten 30 µg der Ausgangsproben.
Die IP erfolgte aus Zelllysaten der Zelllinien LoVo und LT97-2, das mit DSP behandelt wurde (CL),
2+
sowie der Kontrollprobe (K). Alle Puffer enthielten 0,1 mM Ca
2+
und 0,01 mM Mg . Zusätzlich wurden
unterschiedliche Konzentrationen des Detergenz Tween-20 (T) getestet.
Es ist deutlich zu sehen, dass die Crosslinkprobe durchgehend ein schwächeres
Cadherin-17-Signal zeigt. Dies konnte auch schon bei den vorangegangenen IPs aus
dem crossgelinkten Lysat beobachtet werden. Eine Silberfärbung des Gels (Daten
nicht gezeigt) zeigte in diesen Proben große Proteinmengen, die in den Geltaschen
verblieben waren. Dies deutet darauf hin, dass nicht alle Crosslinkmoleküle vor der
Gelauftrennung gespalten worden waren. Darum wurde für die weiteren Versuche
die Inkubationszeit des denaturierenden Proteinprobenpuffers verdoppelt. Die
Zugabe von Kalzium- und Magnesiumionen zum Inkubations- und Waschpuffer hat
insgesamt
zu
einer
Verstärkung
des
Cadherin-17-Signals
geführt.
Die
Antikörpererkennung konnte also erhöht oder das Cadherin selbst stabilisiert werden.
76
Zudem zeigte die IP-Probe aus dem Crosslink-Lysat ein schwaches GAPDH-Signal,
das durch die Verwendung von Tween-20 im Waschpuffer verschwindet. Gleichzeitig
beeinflusst es die Signalstärke von Cadherin-17 nicht.
Nach
diesen
Versuchen
wurden
noch
drei
weitere
IP-Proben
zur
massenspektrometrischen Analyse geschickt:
1. eine IP unter denselben Bedingungen, wie die erste, nur diesmal aus LT97-2 Lysat
und nicht aus LoVo-Lysat.
2. eine IP aus unbehandeltem LT97-2 Lysat mit Kalzium im Inkubations- und
Waschpuffer und 0,05% Tween-20 im Waschpuffer.
3. eine IP aus crossgelinktem LT97-2 Lysat mit Kalzium im Inkubations- und
Waschpuffer, sowie 0,05% Tween-20 im Waschpuffer.
Die 50 abundantesten Proteine aus allen vier massenspektrometrisch analysierten
IP-Proben zusammen mit den Werten aus dem jeweiligen Ausgangslysat sind im
Anhang zu finden. Im Folgenden werden die erhaltenen Kataloge ausgewertet, um
mögliche Interaktionspartner von Cadherin-17 zu identifizieren.
77
4.1.2. Identifizierung von Interaktionspartner-Kandidaten
Der
tryptische
Verdau
der
Gelscheibchen,
die
anschließende
massenspektrometrische Analyse und die Datenbanksuchen wurden im Rahmen
unserer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. Bettina Warscheid
(Freiburg) von Frau Dr. Silke Oeljeklaus im Rahmen einer gemeinsamen
Drittmittelförderung der Deutschen Krebshilfe, erstellt. Die Freiburger Kollegen
lieferten Excel-Dateien, die folgende Informationen enthielten:
Information
Bedeutung
IPI-Nummer
Identifikationsnummer des „International Protein Index“
Proteinname
Uniprotidentifikation
Identifikationsnummer der Uniprot-Datenbank
Molekulares
Das erwartete Molekulargewicht des Proteins, ohne
Gewicht
Modifikationen
Sequenzabdeckung
Angegeben in %
Posterior Error
Probability (PEP)
Dieser Wert liefert einen Anhaltspunkt für die Zuverlässigkeit
der Proteinidentifizierung. Je kleiner der Wert ist, umso höher
ist die Wahrscheinlichkeit einer richtigen Identifizierung.
Anzahl der MS/MS-Fragmentierungen eines Proteins. Mithilfe
dieses Wertes können Rückschlüsse auf die Abundanz eines
Spectral Counts
(SC)
Proteins in der Probe geschlossen werden: je höher die
Anzahl der SC, umso höher ist die Abundanz des Proteins in
einer Probe im Vergleich zu einer anderen Probe. Dieser Wert
kann allerdings nicht zum Vergleich verschiedener Proteine in
ein und derselben Probe herangezogen werden.
Gensymbol
Inklusive veralteten Namen und Synonymen
Tab. 8: Informationen der massenspektrometrischen Datensätze.
Proteine, die in der IP gegenüber dem Lysat mehr Spectral Counts (SCs) aufwiesen,
gelten als angereichert und stellen mögliche Cadherin-17-Interaktionspartner dar.
78
Diese ‚Anreicherung‘ kommt dadurch zustande, dass der Hintergrund in der IP-Probe
gegenüber der Ausgangsprobe reduziert wurde.
4.1.2.1. Vergleich der unterschiedlichen IP-Proben
Es wurden insgesamt vier IPs analysiert. Als Vergleichsproben dienten drei Lysate,
die als Ausgangsprobe für die jeweilige IP verwendet wurden (siehe Tab. 9).
Probe
Zelllinie
Identifizierte
Bedingungen
Proteine
Normales Zelllysat,
IP1
LoVo
Bindepuffer: PBS
398
Waschpuffer: PBS
Lysat 1
LoVo
Normales Zelllysat
1065
Normales Zelllysat,
IP2
LT97-2
Bindepuffer: PBS
388
Waschpuffer: PBS
Lysat 2
LT97-2
Normales Zelllysat
990
Normales Zelllysat, Bindepuffer
IP3
LT97-2
PBS+Ca2++Mg2+
Waschpuffer: PBS+Ca2++Mg2++0,05% Tween-
351
20
Zelllysat mit in vivo Crosslink
IP4
LT97-2
Bindepuffer PBS+Ca2++Mg2+
Waschpuffer: PBS+Ca2++Mg2++0,05% Tween-
610
20
Lysat 3
LT97-2
Zelllysat mit in vivo Crosslink
1811
Tabelle 9: Auflistung aller massenspektrometrischen Proben.
Die kryptongefärbten Gelbilder haben bereits eine deutlich verringerte Proteinmenge
in
den
IP-Proben
gegenüber
dem
Ausgangslysat
gezeigt.
Auch
die
massenspektrometrische Analyse zeigt deutlich mehr identifizierte Proteine im
Ausgangslysat, als in der jeweiligen IP.
79
Die identifizierten Proteine der IP-Proben wurden nach ihren Gensymbolen sortiert
und die Übereinstimmungen zwischen ihnen bestimmt (siehe Tab. 10).
Anzahl
Nur in
Überein-
Überein-
Überein-
Überein-
identifizierter
dieser IP
stimmungen
stimmungen
stimmungen
stimmungen
Proteine
identifiziert
mit IP 1
mit IP2
mit IP3
mit IP 4
IP1
398
105
-
224
149
221
IP2
388
69
224
-
165
245
IP3
351
70
149
165
-
249
IP4
610
106
221
245
249
-
Tab. 10: Vergleich der Übereinstimmungen zwischen den einzelnen IPs.
Die addierten Zahlen der einzelnen Übereinstimmungen unterscheiden sich von der Gesamtanzahl,
da einige Proteine in mehr als nur einer IP übereinstimmen. Für die genaue Aufteilung siehe Abb. 11.
IP4 zeigt die höchste Zahl identifizierter Proteine insgesamt und auch die höchste
Anzahl individueller Proteine. Dies ist wahrscheinlich auf den chemischen Crosslinker
DSP zurück zu führen, der alle Proteine fixiert, die sich in ausreichender räumlicher
Nähe befinden.
IP1 zeigt mit 105/398 relativ mehr Proteine, die nur in dieser IP gefunden wurden.
Dies beruht vermutlich darauf, dass diese Probe aus LoVo-Karzinomzellen, die
anderen drei Proben aus LT97-2 Adenomzellen gewonnen wurden.
Abbildung 11 zeigt die genaue Aufteilung der einzelnen Übereinstimmungen
zwischen den einzelnen IPs. Es wurden nun auch Übereinstimmungen mit mehr als
einer weiteren IP berücksichtigt.
80
Abb.11: Vergleich aller identifizierten Proteine der vier untersuchten IP-Proben.
Insgesamt wurden in vier IPs 820 verschiedene Proteine identifiziert. Davon wurden 350 nur in einer
IP (blau) identifiziert , 239 wurde in zwei IPs gefunden (rot), 124 in insgesamt drei IPs (grün) und 107
Proteine in allen vier IPs (violett) identifiziert.
350 (42,7 %) der insgesamt 820 in allen IPs identifizierten Proteine wurden nur in
einer IP identifiziert. Dies zeigt eine große Diversität zwischen den einzelnen
Präparationen. Trotzdem kamen immer noch 107 Proteine (13 %) in allen IPs vor.
Bei den IPs 2 und 3 wurden größere Übereinstimmungen erwartet. Beide Proben
wurden aus derselben Zelllinie, aus unterschiedlichen Lysatpräparationen gewonnen.
81
Diese Diversität könnte auf die Zugabe von Kalziumionen zum Binde- und
Waschpuffer zurückzuführen sein.
Um
die
Kandidaten
für
eine
weitere
Validierung
möglicher
Cadherin-17-Interaktionspartner weiter eingrenzen zu können, wird in den nächsten
Schritten das größte Augenmerk auf alle Proteine gelegt, die in mindestens drei IPs
angereichert waren.
Die einzige Ausnahme bildet der polymere Immunoglobinrezeptor (pIgR). Dieser
wurde in der ersten IP identifiziert. Die massenspektrometrische Analyse dieser IP
fand zeitlich früher statt, als die der anderen Proben und die Validierung wurde
begonnen, bevor die anderen Daten zur Verfügung standen.
4.1.2.2. Eingrenzung möglicher Cadherin-17-Interaktionspartner durch
Recherche und die Überprüfung von mRNA-Expressionsdaten
Zunächst wurden alle Proteine identifiziert, die in mindestens 3 IPs vorkommen und
zumindest in der crossgelinkten IP angereichert waren. Das führte zu 97 Kandidaten.
Alle identifizierten Proteine wurden in Bezug auf ihre Expression auf mRNA-Ebene
überprüft.
Dies
geschah
unter
Verwendung
der
im
Labor
vorhandenen
Expressionsprofile aus Arrayprofiling-Analysen (Agilent). Eine mRNA galt als
„signifikant exprimiert“, wenn in der Signalstärke ein Wert von 50 überschritten
wurde. Auf diese Weise wurde die Liste auf 72 reduziert. Die aussortierten 25
Kandidaten sind wohl als Kontaminanten zu werten.
Da der Fokus der Cadherin-17-Interaktionspartnersuche auf der Identifizierung
physiologischer Interaktionspartner liegt, wurde die Liste im nächsten Schritt mit den
Daten von BioGPS verglichen. In dieser Datenbank werden aktuelle Informationen zu
einzelnen Genen aus verschiedenen Datenquellen wie NCBI und Ensembl
82
zusammengetragen
und
können
einfach
und
schnell
abgerufen
werden
(Wu et al., 2009). Um sicherzugehen, dass es sich bei den Kandidaten nicht um ein
zellkulturspezifisches Artefakt handelt, wurden sie mit dieser Datenbank abgeglichen.
Zeigte ein Kandidat keine Expression im Gastrointestinaltrakt und/oder in
gastrointestinalen Tumoren, wurde er aus der Liste entfernt.
Gleichzeitig wurden die Scheibchen kontrolliert, in denen die Proteine identifiziert
wurden. Auf diese Weise kann überprüft werden, ob die Proteine dort sind, wo sie
hingehören und Kontaminanten einzelner Scheibchen identifiziert werden. Dies
ermöglichte die Reduzierung möglicher Kandidaten auf 15.
Zu diesen 15 Kandidaten wurde anschließend eine umfassende PubMed-Recherche
durchgeführt. Dabei wurden auf die Funktion, die Lokalisation in der Zelle und auf
bisher bekannten Interaktionspartnern der Kandidaten geachtet und anschließend
mit bekannten Informationen zu Cadherin-17 verglichen. So wurde beispielsweise
überprüft, ob eine basolaterale Expression des möglichen Interaktionspartners
bekannt ist, da Cadherin-17 nur dort exprimiert wird. Bei der Funktion wurden
besonders auf einen Einfluss auf den Darmwasserhaushalt, sowie auf eine
Transporterfunktion geachtet.
Schließlich blieben fünf Proteine in der engeren Auswahl; ihre in den verschiedenen
Proben gemessenen SCs sind zusammen mit denen für Cadherin-17 in der Tabelle
11 zusammengefasst.
83
Anzahl Spectral Counts (SC)
Gensymbol
Protein Name
IP1 Lysat IP2 Lysat IP3 IP4 Lysat
CDH17
Cadherin-17
22
17
42
KRT18
Keratin 18
28
22
8
KRT8;
Keratin-8
37
36
16
1
3
2
12
56
55
49
11
2
1
11
6
2
1
5
5
1
6
6
11
2
9
1
3
2
3
9
9
9
9
1
Transmembrane
TMED10;
emp24 domaincontaining protein
10;
EPCAM
KRT19
Epithelial adhesion
molecule;
Keratin 19
Tab. 11: Liste der sechs möglichen Cadherin-17-Interaktionspartnerkandidaten inklusive der in
der Massenspektrometrie gemessenen Spectral Counts (SC).
Es wurde das Verhältnis der SC im IP zu Lysat betrachtet, um eine „Anreicherung“ der Kandidaten in
der IP gegenüber dem Lysat zu überprüfen.
IP2 zeigt besonders viele SCs zu Cadherin-17, sowohl in der IP als auch im Lysat.
Dies zeigt, dass der Cadherin-17-Gehalt der Ausgangsprobe schon deutlich höher
war, als in den anderen Lysaten. Dies könnte auf eine höhere Konfluenz
zurückzuführen sein, da für die Crosslinkprozedur kein konfluenter Zellrasen
verwendet werden durfte. Auch die LoVo Zellen wurden bei einer Konfluenz von etwa
90 % geerntet, da diese Zellen bei einer vollen Zellkulturschale schnell in die
Apoptose übergehen.
Die IPs 3 und 4, in denen Kalziumionen zum Binde- und Waschpuffer hinzugefügt
wurden, zeigen sehr gute Werte für Cadherin-17 in der IP-Probe.
Schließlich wurden die Keratine als mögliche Interaktionspartner für die weitere
Validierung
ausgewählt,
da
diese
84
die
solidesten
Daten
in
der
massenspektrometrischen Analyse zeigten. Alle drei Vertreter zeigen in den IPs eine
Anreicherung bzw. einmal genauso viele SC wie das Lysat. Zudem zeigten sie
ausschließlich SCs in den Scheibchen, die ihrem Molekulargewicht zugeordnet
waren.
4.1.3. Validierung von möglichen Interaktionspartner-Kandidaten
Für die Validierung möglicher Interaktionspartner wird hauptsächlich die Methode der
CoIP mit anschließender Western Blot Kontrolle verwendet. Zunächst wurde
versucht, den Kandidaten in einer Cadherin-17-CoIP aus Zelllysat via Western Blot
zu detektieren. Zudem wird in einer CoIP gegen den möglichen Interaktionspartner
versucht, Cadherin-17 nachzuweisen.
4.1.3.1.
pIgR
Der polymere Immunoglobulinrezeptor (pIgR) pIgR wurde nur in der ersten IP aus
LoVo-Zelllysat identifiziert. In dieser Probe war er gegenüber dem Lysat stark
angereichert. pIgR wird, wie Cadherin-17 an der Zellmembran von intestinalen
Epithelzellen exprimiert. Das Protein kann dimeres IgA binden und wird von der
basolateralen Membran über Endosomen zur apikalen Membran transportiert. Dieser
Transport ist auch ohne die Bindung von dimeren IgA möglich. Es folgt eine
proteolytische
Freisetzung
der
Ektodomäne
an
der
apikalen
Seite
(Phalipon und Corthésy, 2003).
pIgR konnte als einziger Kandidat nur in der ersten IP identifiziert werden. Die IP
stammt aus LoVo-Zelllysat und es ist möglich, dass der pIgR in den LT97-2 Zellen
nicht exprimiert wird. Zudem könnte es sich um eine tumorspezifische Interaktion
handeln, da die LoVo-Zellen aus einem Karzinom gewonnen wurden, während die
LT97-2-Zellen aus einem kolorektalen Adenom stammen.
85
Um dies zu klären, wurden zunächst ein Northern und ein Western Blot erstellt, um
die Expression des Proteins zu überprüfen (siehe Abb. 12).
Abb. 12: Überprüfung der pIgR-Expression in allen Cadherin-17 positiven Zelllinien.
Alle Cadherin-17 positive Zelllinien, die im IMBL zur Verfügung stehen, wurden A) per Northern Blot
und B) per Western Blot auf die Expression von pIgR geprüft. Neben den Lysaten wurden auch die
Sekretome auf die lösliche Variante des pIgRs getestet. Es wurden 6 µg RNA bzw. 50 µg Lysat und
8 µg Sekretom aufgetragen.
Überraschenderweise zeigen die LoVo-Zellen nur ein sehr schwaches pIgR-Signal
im Northern Blot. Lediglich das Sekretom zeigt ein auswertbares Signal, wenn auch
deutlich schwächer als bei den anderen untersuchten Zelllinien. Die LT97-2 zeigen
ein stärkeres Signal, als die LoVos. Es ist somit verwunderlich, dass in den
86
Katalogen der IPs aus LT97-2 Lysat kein pIgR identifiziert werden konnte. In den
HT115 und den LS411 Zellen ist das Signal sehr stark, sodass für weitere
Untersuchungen mittels CoIP auch diese beiden Zelllysate verwendet werden.
Zudem wurde eine IP aus Sekretomproben durchgeführt, um abzuschätzen, ob die
mögliche Interaktion zwischen Cadherin-17 und pIgR nur über die extrazelluläre
Domäne stattfindet. Die sehr starken pIgR Signale im Sekretom zeigen, dass die
Ektodomäne vermehrt freigesetzt wird (siehe Abb. 13).
Abb. 13: Cadherin-17 und pIgR-CoIP aus verschiedenen Zelllysaten und Sekretomen.
Für die IP wurden 30 µg Lysat (L) und 15 µg Sekretom (S) verwendet. Als Kontrolle dienten 30 µg
HT115-Lysat. Beide Proteine wurden in unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen detektiert, sodass ein
Übereinanderlegen der Bilder möglich ist.
87
In beiden IPs konnten die Ausgangsproteine erfolgreich präzipitiert werden.
Allerdings zeigt keine Probe der Cadherin-17-IP ein pIgR-Signal. Dagegen konnte in
der pIgR-IP aus LT97-2 Lysat ein schwaches Cadherin-17-Signal detektiert werden.
Die starken Signale in der pIgR-CoIP nach der Detektion mit Cadherin-17 sind
Kreuzreaktionen des Cadherin-17-Antikörpers mit den sehr starken pIgR-Signalen
aus der ersten Detektion.
Der Versuch wurde einige Male wiederholt und in keiner pIgR-IP konnte das
Cadherin-17-Signal reproduziert werden. Ebenso zeigte die Cadherin-17 CoIP nie
ein pIgR-Signal (siehe Abb. 14).
Abb. 14: Cadherin-17 und pIgR-IP aus LT97-2 Lysat.
Die IPs wurden aus 30 µg Lysat erstellt, die auch als Kontrolle auf den Western Blot aufgetragen
wurden. Zur zusätzlichen Kontrolle dienten Beads ohne Antikörper (leer), sowie Beads, an die
Kaninchen-IgGs gekoppelt wurden.
Alle durchgeführten Versuche schließen pIgR somit als Interaktionspartner aus.
Vielmehr könnte es sich bei pIgR um eine Verunreinigung handeln, da das Protein
auch in der Bronchialflüssigkeit vorkommt (Pilette et al., 2003). Dieser Verdacht
wurde
bestätigt,
als
später
die
genaue
88
Scheibchenzuordnung
der
massenspektrometrischen Analyse betrachtet wurde. Alle pIgR-Signale wurden
ausschließlich in einem Scheibchen gefunden, das einer deutlich geringeren
Proteingröße entspricht als für das Ausgangsprotein und auch die prozessierte Form
von pIgR zu erwarten wäre.
4.1.3.2.
Keratin 8
Nach den massenspektrometrischen Daten erscheint Keratin 8 als ein sehr
vielversprechender Interaktionspartnerkandidat, der in allen vier IPs gefunden wurde.
Keratin 8 ist das Haupttyp-II-Keratin des Darms. Es sorgt zusammen mit Keratin 18
für den Erhalt und die Stabilisierung des intestinalen Epithels (Chu und Weiss, 2002).
Für eine mögliche Interaktion mit Cadherin-17 spricht zudem, dass Keratin 8 negative
Mäuse häufig unter Durchfall leiden und Probleme im Ionentransport und
Wasserhaushalt aufweisen (Toivola et al., 2004). Dies passt mit dem in silico Modell
von Ahl et al zusammen, die Cadherin-17 eine Aufgabe im Wasserhaushalt
zusprechen (Ahl et al., 2011).
Neben Keratin 18 ist Keratin 19 ein weiterer häufiger Interaktionspartner von
Keratin8, besonders im intestinalen Epithel (Coulombe und Omary, 2002).
Da neben Keratin 8 auch andere Keratine in den Katalogen deutlich angereichert
waren, wurde zunächst eine IP mit einem pan-Zytokeratinantikörper durchgeführt
(siehe Abb. 15).
89
Abb. 15: Western Blot Analyse einer Cadherin-17-CoIP und einer pan-Zytokeratin-CoIP aus
LT97-2-Lysat und LoVo-Lysat.
Als Kontrolle wurden Beads ohne Antikörper verwendet. Die CoIP erfolgte aus 30 µg Lysat mit (L) und
ohne (K) chemischen Crosslinker aus zwei unterschiedlichen Lysaten.
Beide Western Blots zeigen, dass die IP in beiden Fällen funktioniert hat. Während
die Cadherin-17-IP zudem starke Keratin-Signale zeigt, kann in keiner Keratin-IP ein
Cadherin-17-Signal detektiert werden. Die Kontrollproben sind in beiden Fällen leer,
die Beads alleine erzeugen keinen Hintergrund, sie binden keines der beiden
Proteine.
90
Dass die Keratin-IPs in beiden Fällen kein Cadherin-17 zeigen kann daran liegen,
dass die Interaktion nur an der Plasmamembran stattfinden dürfte, sprich nur ein
recht geringer Teil der Keratinmoleküle ist auch wirklich in Verbindung mit einem
Cadherin-17-Molekül. Gleichzeitig war die Keratin-IP weniger effizient, als die
Cadherin-17-IP. Somit könnten die Mengen unterhalb der Nachweisgrenzen liegen.
Der pan-Zytokeratin Antikörper zeigt ein Bandendoublett in den Cadherin-17-Proben.
Es wurden also zwei Keratine in der CoIP präzipitiert. Um einzugrenzen, ob es sich
dabei um Keratin 8 handelt, wurde eine weitere IP mit einem Keratin 8-spezifischen
Antikörper erstellt. Gleichzeitig wurden entsprechende IPs aus einem Lysat
Cadherin-17 negativer Zellen (SW620) erstellt, um sicherzugehen, dass die Signale
nicht durch eine Kreuzreaktion des EP777 Antikörpers zustande kommen (siehe
Abb. 16).
Abb. 16: Western Blot verschiedener Co-IPs aus LT97-2 und SW620 Lysat.
Es wurden 30 µg Lysat (L) für jede IP eingesetzt und als Kontrolle direkt auf das Gel geladen. Mit
jedem Lysat wurden zwei Cadherin-17-IPs mit unterschiedlichen Antikörpern sowie eine Keratin 8-IP
durchgeführt.
Zusätzlich zur üblichen Cadherin-17-CoIP mit dem EP777-Antikörper wurde noch
eine IP mit dem R&D-Antikörper durchgeführt. Leider zeigen die Co-IP-Ergebnisse
aus dem Cadherin-17 negativen Lysat ebenfalls deutliche Keratin 8-Signale in der
91
vermeintlichen Cadherin-17-IP. Die Keratin 8-Signale werden offenbar durch eine
Kreuzreaktion mit dem EP777-Antikörper verursacht.
Viele mögliche weitere Kandidaten könnten aus den umfangreichen Listen gezogen
werden. Wahrscheinlich sollten die Suchkriterien noch etwas abgeändert werden, da
nach den bisherigen Kriterien temporäre Bindungspartner, die wahrscheinlich nur in
der IP4 auftauchen, nicht beachtet werden. Eine Überprüfung weiterer Kandidaten ist
allerdings aufwendig und problematisch, daher wird der Ansatz im Rahmen dieser
Doktorarbeit nicht weiter verfolgt.
In früheren Arbeiten des IMBLs wurde Cadherin-17 im Zellkulturüberstand von
kultivierten Kolonkarzinomzellen identifiziert und daraufhin der Mechanismus des
Ektodomänen-Sheddings untersucht (Weiß et al., Manuskript in Überarbeitung).
Gleichzeitig tauchte die Frage nach der Funktion des Proteins im Organismus auf,
die
bisher kaum untersucht
wurde.
Diese
Fragestellung wurde
im
oben
beschriebenen Ansatz untersucht.
Derweil wurden wir auf ein weiteres Cadherin, das sogenannte Fat1, aufmerksam,
das in großen Mengen in Sekretomen von kultivierten Pankreaskarzinomzellen
gefunden wurde. Gleichzeitig zeigte die immortalisierte Pankreaskontrollzelllinie eine
deutlich geringere Menge des Proteins. Der zweite Teil der Doktorarbeit dreht sich
darum, die Expression und Prozessierung von Fat1 in vitro und in vivo zu
untersuchen.
92
4.2.
Expression und Prozessierung des „Giant Cadherins“ Fat1 in vitro
4.2.1. Vorabergebnisse aus meiner Masterarbeit
Ausgangspunkt für die Untersuchungen zu Fat1 war die massenspektrometrische
Katalogisierung der Sekretome der fünf Pankreaskarzinomzelllinien A818-4, BxPc3,
MiaPaCa2,
PaCa44
und
Panc1
sowie
der
immortalisierten
humanen
Pankreasgangzelllinie HPDE. Während meiner Masterarbeit konnte ich im Western
Blot Signale für das Fat1-Protein im Sekretom der Zelllinien zeigen, deren
Intensitäten den SCs in der massenspektrometrischen Analyse entsprachen.
Abbildung 17 zeigt das Sequenzmapping aller in der Massenspektrometrie
identifizierten Peptide aus dem Sekretom der Zelllinien Panc1:
Abb. 17: Sequenzmapping aller massenspektrometrisch identifizierter Fat1-Peptide im
Panc1-Sekretom.
Alle identifizierten Peptide wurden in roter Schrift hervorgehoben. Die Transmembrandomäne wurde
grün unterlegt. Es wurden 25 µg Panc1-Sekretom gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde
anschließend in 29 Scheibchen geschnitten, die separat untersucht wurden.
93
Alle in der Massenspektrometrie identifizierten Peptide liegen oberhalb der
Transmembrandomäne,
also
in
der
großen
extrazellulären
Fat1-Domäne.
Dementsprechend lag die Vermutung nahe, dass Fat1 wie E-Cadherin und
Cadherin-17 als lösliche Form durch Ektodomänen-Shedding in das Sekretom
freigesetzt wird. Allerdings sind zu hydrophobe und zu stark geladene Peptide in der
massenspektrometrischen Analyse nur schwer detektierbar. Theoretisch könnte eine
starke Phosphorylierung der intrazellulären Domäne dazu geführt haben, dass keine
Peptide aus dieser identifiziert wurden.
Das intakte Transmembranprotein könnte auch in Form von Vesikeln in den
Zellkulturüberstand gelangt sein. Um diese Fragestellung weiter untersuchen zu
können, sind Antikörper nötig, die jeweils intrazelluläre und extrazelluläre Domänen
erkennen. Zum Abschluss meiner Masterarbeit waren keine Antikörper gegen die
humane intrazelluläre Domäne von Fat1 verfügbar. In der Zwischenzeit publizierte
die Arbeitsgruppe von Dr. Rick Thorne in Newcastle (Australien) eine Arbeit über die
Prozessierung des humanen Fat1s in Keratinozyten und Melanomzellen, in der ein
Set von dort hergestellten monoklonalen Antikörpern beschrieben wurde. Unsere
Anfrage nach einer Bereitstellung dieser Antikörper wurde positiv beantwortet und
stellte den Beginn unserer Kooperation dar.
4.2.2. Charakterisierung der freigesetzten Form von Fat1
Zur weiteren Abklärung, ob es sich bei dem im Sekretom detektierbaren Fat1 um die
lösliche Form, also um die Ektodomäne handelt, wurden Antikörper gegen die
intrazelluläre und gegen die extrazelluläre Fat1-Domäne mit Sekretom, Lysat und
Exosomen der PaCa44-Zelllinie getestet (siehe Abb. 19).
94
Abb. 19: Ein Western Blot mit PaCa44 Sekretom (S), Lysat (L) und Exosomen (E) wurde mit
einem Antikörper gegen intrazelluläre und extrazelluläre Fat1-Domänen inkubiert.
8 µg Sekretom, 75 µg Lysat und 5 µg Exosomen wurden auf ein Gel aufgetragen. Die Proben wurden
zunächst mit einem Fat1-Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne (CTD, rot) und anschließend mit
einem Antikörper gegen eine extrazelluläre Domäne (EZD2, grün) inkubiert. Anschließend wurden
beide Kanäle übereinandergelegt, um einen besseren Höhenvergleich zu gewährleisten (merge).
Die Detektion mit dem Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne zeigt nur im Lysat
ein Signal oberhalb der 460 kDa-Markerbande (die eine starke Kreuzreaktion
produziert). In der Sekretom- und der Exosomenprobe ist eine Fat1-Detektion nur mit
dem Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne möglich.
Dies zeigt, dass es sich bei der im Sekretom vorhandenen Form von Fat1 um die
lösliche Ektodomäne handelt, die durch Ektodomänen-Shedding freigesetzt werden
könnte.
Das deutliche Fat1 Signal in den Exosomen bedeutet offenbar nicht, dass Fat1 in der
Volle-Länge-Form in Vesikeln vorliegt, da der Antikörper gegen die intrazelluläre
Domäne kein Signal zeigt. Dass die lösliche Form in der Exosomenprobe gefunden
wird durch die Aufreinigungsmethode der differenziellen Zentrifugation verursacht,
bei der die große Fat1-Ektodomäne ebenfalls pelletiert wird.
Das Lysat zeigt nach Inkubation mit dem Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne
eine deutliche Bande, die höher liegt als das Signal in Sekretom und Exosomen.
95
Diese Bande entspricht wahrscheinlich dem Volle-Länge-Protein. Gleichzeitig ergibt
die Inkubation mit dem extrazellulären Antikörper in der Lysatpräparation eine Bande
auf der Höhe des Sekretomsignals.
Die Doppelbande im Lysat ähnelt den Ergebnissen von Sadeqzadeh et al., die in
Keratinozyten und Melanomzellen eine duale Prozessierung des Fat1-Proteins
beschreiben (Sadeqzadeh et al., 2011) (siehe Abb. 20).
Abb. 20: Schematische Darstellung der beiden Fat1-Isoformen.
Neben der unprozessierten Form, einem etwa 505 kDa, bzw. in seiner glykosylierten Form etwa
575 kDa großen Protein, existiert ein prozessiertes Heterodimer, bestehend aus einem Großteil der
Ektodomäne (p515/gp 482), sowie dem sogenannten C-terminalen Restfragment, dass den
membrannahen
Teil
der
Ektodomäne,
die
Transmembrandomäne
sowie
die
gesamte
zytoplasmatische Domäne beinhaltet (p09/85). Beide Ketten sind nicht-kovalent gebunden. Die
Volle-Länge-Form
und
das
Heterodimer
können
(Sadezadeh et al., 2011).
96
zeitgleich
auf
einer
Zelle
existieren
Gleichzeitig konnten sie mittels einer IP mit einem Antikörper gegen die intrazelluläre
Domäne ein weiteres Fragment von etwa 65 kDa ausmachen, das sogenannte p65.
Sadeqzadeh et al. vermuten, dass dieses Fragment nach einer proteolytische
Abspaltung der extrazellulären Domäne an der Zellmembran zurück bleibt
(Sadeqzadeh et al., 2011). Während Furin als Protease der dualen Prozessierung
identifiziert werden konnte, ist die Protease, die zur Freisetzung der Ektodomäne und
zu dem p65 führt, bisher unbekannt.
Um
genauer
zu
überprüfen,
ob
die
duale
Prozessierung
auch
in
den
Pankreaskarzinomzellen vorkommt, wurden alle Lysate der PankreaskarzinomZelllinien, der Pankreaskontrollzelllinie HPDE, sowie der Melanomzelllinie HaCat und
zum
Vergleich
die
von
Sadeqzadeh
et
al
verwendeten
MelCV-Zelllinien
(Sadeqzadeh et al., 2011) im Western Blot untersucht (siehe Abbildung 21).
Abb. 21: Lysatpanel der Pankreaskarzinomzelllinien und HPDE im Vergleich mit der
Melanomzelllinie HaCat, sowie den MelCV-345, die mit einem Leervektor transfiziert wurden
und den MelCV-Furin, die die Serinprotease Furin überexprimieren.
Jeweils 75 µg Lysatprotein wurden aufgetragen. Der Blot wurde zunächst mit einem Antikörper gegen
die intrazelluläre Domäne von Fat1 (34B) und anschließend mit einem Antikörper gegen die
extrazelluläre Domäne (EZD2) inkubiert. Eine Sekretomprobe (S) diente als Vergleichsprobe zu den
Lysaten. Der Mengenabgleich erfolgte mit β-Tubulin (TUBB1).
97
Alle Lysatproben, außer Panc1 zeigen mit dem Antikörper gegen die intrazelluläre
Domäne ein deutliches Fat1-Signal, das deutlich oberhalb der 460 kDa-Markerbande
liegt. Die Sekretomprobe zeigt wie erwartet kein Signal. Die Inkubation mit dem
extrazellulären Antikörper zeigt bei allen Proben eine Doppelbande im Lysat. Die
untere Bande im Lysat befindet sich wie im vorherigen Blot etwa auf der Höhe des
Sekretomsignals, während die obere Bande der mit dem Antikörper gegen die
intrazelluläre Domäne detektierten Bande entspricht.
Dieses Muster entspricht demjenigen in den Lysaten von HaCat und MelCV-Zellen.
Somit scheint in den Pankreaskarzinomzellen ebenfalls die duale Prozessierung von
Fat1 stattzufinden.
Die Pankreaskarzinomzellen zeigen gleichstarke Signale in den jeweiligen
Doppelbanden, wobei tendenziell das untere Signal stärker ist. Interessanterweise
zeigen die HPDE deutlich mehr Volle-Länge.Protein, als das prozessierte
Heterodimer.
Eine Darstellung der Fragmente p85 und p65 war mit unseren Methoden nicht
möglich. Darum wurde im Rahmen unserer Kooperation mit der Arbeitsgruppe aus
Newcastle IP-Analysen der Pankreaskarzinomzelllinien durch Frau Dr. Elham
Sadeqzadeh erstellt. Sie verwendete dabei Antikörper gegen eine intrazelluläre
Domäne und eine extrazelluläre Domäne von Fat1 (siehe Abb. 22).
Die schon vorher gezeigten Doppelbanden des Volle-Länge-Proteins (p505) und des
Heterodimers
(p485)
sind
auch
in
diesem
Versuch
deutlich
erkennbar.
Interessanterweise zeigt nur die Zelllinie BxPc3 deutliche Signale für die Fat1Fragmente p85 und p65. Schwache Signale sind noch in der Zelllinie A818-4 zu
98
erahnen. Die Zelllinien PaCa44 und MiaPaCa2 zeigen, wie die Panc1 keine Signale
für diese kleinen C-terminalen Restfragmente (Daten nicht gezeigt).
Die fehlenden Signale könnten ein Hinweis darauf sein, dass die C-terminalen
Restfragmente weiter prozessiert werden. Da das Gelsystem für große Proteine
ausgelegt wurde, sind die Banden im niedrigen Molekulargewichtbereich diffus.
Abb. 22: IP-Analyse von Fat1 an der Zelloberfläche.
Die IP wurde von Dr. Elham Sadeqzadeh im Rahmen unserer Kooperation mit monoklonalen
Antikörpern gegen eine extrazelluläre Domäne von Fat1 (NTD7) und eine intrazelluläre Domäne von
Fat1 (CTD7) durchgeführt. Als Kontrolle dienten Protein A/G-Agarose Beads, die mit den
entsprechenden Lysaten inkubiert wurden. Die Western Blots wurden zunächst mit Neutravidin
inkubiert, um die oberflächenmarkierten Proteine darzustellen. Anschließend erfolgte die Inkubation
mit einem Antikörper gegen eine extrazelluläre Domäne und gegen eine intrazelluläre Domäne von
Fat1.
99
4.2.3. Fat1 ist ein glykosyliertes Protein.
Alle Western Blots zeigen Fat1-Signale, die höher liegen, als nach der theoretischen
Größe der Aminosäuresequenz zu erwarten ist. Die Masse des unmodifizierten
Proteins beträgt etwa 506 kDa. Die Masse für die komplette extrazelluläre Sequenz
beträgt etwa 460 kDa. Die Western Blot-Ergebnisse zeigen, dass auch das Signal
der freigesetzten Ektodomäne noch deutlich über der 460 kDa Markerbande des
verwendeten HiMark Proteinmarkers liegt. Diese Größenverschiebung legt die
Vermutung nahe, dass Fat1 ähnlich wie anderer Cadherine glykosyliert sein könnte.
Mithilfe eines Deglykosylierungskits kann die Glykosylierung von Fat1 mittels
Western Blot bestätigt werden (siehe Abb. 23).
Abb. 23: Fat1 ist ein glykosyliertes Protein.
Je 8 µg Sekretom und 75 µg Lysat wurden aufgetragen und mit einem Antikörper gegen die
extrazelluläre Domäne von Fat1 (ECD2) inkubiert. Die Signale der deglykosylierten Proben (+) wurden
mit denen der Ausgangsproben (-) verglichen.
Beide Proben, die mit dem Enzymcoktail zur Deglykosylierung behandelt wurden,
zeigen deutlich kleinere Banden als die unbehandelten Ausgangsproben. Dieses
Ergebnis zeigt auf Western Blot-Ebene, dass Fat1 wie andere Cadherine ein
glykosyliertes Protein ist.
100
4.2.4. Die Metalloprotease ADAM10 ist am Ektodomänen-Shedding von
Fat1 beteiligt.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit habe ich die Pankreaskarzinomzelllinien A818-4,
MiaPaCa2, PaCa44 und Panc1, sowie die Kontrollzelllinie HPDE und auch die
MelCV-345 Zellen mit dem Breitbandinhibitor Batimastat und dem ADAM10spezifischen Inhibitor GI245023X behandelt. Um die Wirksamkeit der Inhibitoren zu
testen, wurde neben der Fat1-Ektodomäne, die E-Cadherin-Ektodomäne im
Sekretom untersucht. Das lösliche E-Cadherin kann in diesem Versuch als Kontrolle
dienen, weil es ein bekanntes ADAM10-Target ist (Maretzky et al., 2005) (siehe Abb.
24).
Abb. 24: Metalloproteasen sind am Fat1-Shedding in Pankreaskarzinomzellen beteiligt.
Kultivierte Pankreaskarzinomzellen und die Melanomzelllinie MelCV-345 wurden mit serumfreien
Medium und Proteaseinhibitoren (Batimastat (B)10µM, GI245023X (GI) 5 µM) kultiviert. Als Kontrolle
(K) dienten 20 µl DMSO. Die Sekretome wurden nach zwei Tagen geerntet und und 8 µg für die
Western Blot-Analyse aufgetragen. Transferrin diente als Ladungskontrolle.
Die Signalstärken der Ektodomäne von Fat1 in inhibitorhaltigen Sekretomen wurde
mit dem Odyssey-Reader gemessen. In den Zelllinien HPDE, MiaPaca2 und PaCa44
kann eine deutliche Reduktion der Fat1 Ektodomäne beobachtet werden. Der
Versuch wurde insgesamt dreimal wiederholt. Alle Proben wurden mit Transferrin als
101
Ladungskontrolle abgeglichen und anschließend auf den Wert der Kontrollprobe
normiert (siehe Abb. 25).
Abb. 25: Grafische Auswertung der Inhibitorversuche.
Zur Kontrolle der Inhibitorwirkung werden die E-Cadherin-Signale der Inhibitorproben ebenfalls mittels
Western Blot ausgewertet. Es fehlen die E-Cadherin-Werte für die Zelllinien MiaPaCa2 und MelCV345, da dort keine verwertbaren E-Cadherin Signale zu sehen waren. Alle Proben wurden auf die
Kontrollprobe normiert. Der Versuch wurde insgesamt dreimal durchgeführt.
Von den insgesamt sechs untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien zeigen vier eine
reduzierte Menge der Fat1-Ektodomäne im Sekretom nach Behandlung mit den
Inhibitoren. Die Zellen A818-4 und BxPc3 zeigen den geringsten bis gar keinen
Effekt der Proteaseinhibitoren auf das Shedding. Allerdings zeigen diese Zelllinien
auch nur einen geringen Effekt der Inhibitoren auf das Shedding von E-Cadherin.
Den stärksten Effekt von Batimastat auf das Fat1-Ektodomänen-Shedding zeigt die
Zelllinie PaCa44: Die Menge der Ektodomäne wird auf etwa 30 % (Fat1) bzw. 20 %
(E-Cadherin) im Vergleich zur Kontrollprobe reduziert.
Da der Inhibitor GI254023X in den eingesetzten Konzentrationen auch andere
ADAMs
und
Mitglieder
der
Matrixmetalloproteasefamilie
inhibiert
(Ludwig et al., 2005), wurden die Zelllinien Panc1 und PaCa44 mit einem siRNA-Pool
gegen ADAM10 behandelt. Auf diese Weise soll die Beteiligung der Protease am
102
Fat1 Ektodomänen Shedding mit einer unabhängigen Methode spezifisch überprüft
werden. Der Knockdown war erfolgreich und auch noch 96 h nach der Transfektion
stark ausgeprägt (siehe Abb. 26).
Abb. 26: Überprüfung des ADAM10-Knockdowns.
Die Zellen wurden mit 30 nMol ADAM10siRNA smartpool von Dharmacon bzw. 30 nMol nonTarget
siRNA transfiziert. Anschließend wurden sie mit serumfreien Medium überschichtet und die
Überstände nach 48h geerntet. Die Zellen wurden erneut überschichtet und die zweite Ernte des
Überstands erfolgte nach 96 h. Zur Kontrolle des Knockdowns wurden 75 µg Lysat mittels Western
Blot (A) analysiert und die Ergebnisse mit dem Li-Cor System der Firma Odyssey ausgewertet und
grafisch dargestellt (B).
Diese beiden Zelllinien wurden gewählt, weil sie deutliche Fat1-Signale und den
größten Effekt der Inhibitoren auf das Ektodomänen-Shedding zeigen.
Der Knockdown führte zu einer ADAM10 Reduktion im Lysat der Zelllinien PaCa44
und Panc1 auf 10-20 % gegenüber der Kontrollproben und war auch 96 h nach der
103
Transfektion wirksam. Abbildung 27 zeigt, dass diese deutliche ADAM10-Reduktion
zu einer moderaten Reduktion der Fat1-Ektodomäne im Sekretom führte, die nach
96 h stärker ausgeprägt war (~50 %).
Abb. 27: Fat1 wird von ADAM10 geshedded.
Nach der Transfektion mit 30 nMol ADAM10siRNAsmartPool bzw. KontrollsiRNA wurden die Zellen für
zweimal zwei Tage serumfrei kultiviert. Anschließend wurden 8 µg Sekretom mittels Western Blot
untersucht (A) und die Signale grafisch ausgewertet (B). Transferrin diente als Ladungskontrolle.
Der Gehalt des löslichen E-Cadherins im Sekretom konnte auf etwa 50 % reduziert
werden.
Diese
Versuche
verwendeten
belegen,
dass
das
Pankreaskarzinomzelllinien,
Fat1-Ektodomänen-Shedding
mit
Ausnahme
von
in
den
A818-4
von
Metalloproteasen vermittelt wird. Für die Zelllinien PaCa44 und Panc1 konnte zudem
mittels siRNA-Analysen eine Beteiligung von ADAM10 am Ektodomänen-Shedding
gezeigt werde.
104
4.2.5. Untersuchungen zur Rolle von ADAM9 und PCSK5 am Fat1Ektodomänen-Shedding
Trotz eines sehr guten ADAM10-Knockdowns könnte die Fat1-Menge in den
untersuchten Zelllinien nur um etwa 50 % reduziert werden, während die
Metalloproteaseinhibitoren für eine Reduktion des Fat1-Ektodomänen-Sheddings um
etwa 80 % sorgten. Dies lässt vermuten, dass die Fat1-Ektodomäne, ähnlich wie
andere Cadherine, von verschiedenen Proteasen freigesetzt wird. Zur Eingrenzung
möglicher Kandidaten wurden zunächst die mRNA-Expressionsdaten aus einem
Profiling-Ansatz (Affymetrix Plattform, freundlicherweise von der Fa. Schering zur
Verfügung gestellt) der verwendeten Zelllinien überprüft (siehe Tabelle 12).
HPDE
A818-4
BxPc3
MiaPaCa2
Panc1
PaCa44
ADAM10
7,63
9,93
9,40
7,49
7,92
8,87
ADAM17
8,72
8,86
7,38
8,69
8,79
8,99
ADAM15
7,51
7,62
8,31
7,76
7,32
7,38
ADAM9
11,16
11,67
11,64
11,32
10,25
11,82
Tab.12: mRNA-Expressionsdaten einiger ADAM-Proteine.
Eine mRNA gilt als zuverlässig exprimiert, wenn die Signalstärke >5 ist. Die vollständige Liste der
ADAMs ist im Anhang zu finden.
Es ist auffällig, dass ADAM9 in allen Zelllinien die am höchsten exprimierte
ADAM-Protease ist. Daher wurde in den Zelllinien Panc1 und PaCa44 ein ADAM9
Knockdown durchgeführt, um eine mögliche Beteiligung dieser Protease am Fat1Ektodomänen-Shedding zu überprüfen. Zudem wurde ein Doppelknockdown von
ADAM10 und ADAM9 durchgeführt. Dadurch sollte getestet werden, ob die beiden
Proteasen sich in ihrer Wirkung auf das Fat1-Shedding ergänzen oder regulieren.
(siehe Abb. 28).
105
Abb. 28: Effekte des ADAM10, ADAM9 und Doppelknockdowns auf das Fat1- und
E-Cadherin-Shedding in den Zelllinien Panc1 (A) und PaCa44 (B).
Die Zellen wurden für 48 h mit 30 nMol siRNA inkubiert. Beim Doppelknockdown wurden jeweils
30 nMol der jeweiligen siRNA verwendet. Anschließend wurden die Zellen für zwei Tage serumfrei
kultiviert, die Überstände wurden geerntet und die Zellen erneut für zwei Tage serumfrei kultiviert.
8 µg Sekretom wurden anschließend mittels Western Blot analysiert und mit dem Odyssey-System
der Firma Li-Cor ausgewertet. Dargestellt sind die normierten Intensitäten aus zwei unabhängigen
Versuchen.
In beiden Zelllinien zeigt der ADAM9-Knockdown nur einen geringen Effekt auf das
Fat1-Shedding (Reduktion der Ektodomäne auf ~90 % in Panc1 und ~80 % in
PaCa44). Der Effekt auf das E-Cadherin-Shedding ist stärker.
Der
ADAM10/ADAM9
Doppelknockdown
zeigt
widersprüchliche
Ergebnisse.
Während er bei den Panc1-Zellen fast keinen Effekt auf das Fat1-Shedding zeigt,
106
scheinen sich bei den PaCa44-Zellen die Effekte der Einfachknockdowns zu
addieren.
Das E-Cadherin-Shedding ist in beiden Zellen durch den Doppelknockdown
verstärkt. Diese Verstärkung ist in den Panc1-Zellen allerdings nur beim 48h-Wert
und bei den PaCa44 nur beim 96 h-Wert zu beobachten.
Die Metalloproteaseinhibitoren sorgten nur in einigen Zelllinien für eine deutliche
Reduktion des Ektodomänen-Sheddings (besonders PaCa44). In anderen Zelllinien
ist die Freisetzung der Ektodomäne von den Metalloproteaseinhibitoren kaum
beeinflusst. Neben den Metalloproteasen sind auch Serinproteasen bekannte
Sheddasen von Oberflächenproteinen. So ist beispielsweise bekannt, dass
Kallikrein-7
für
die
Freisetzung
von
Desmoglein
verantwortlich
ist
(Ramani et al., 2008).
Unsere australischen Kooperationspartner hatten bereits vermutet, dass auch in den
Melanomzelllinien die Fat1-Ektodomäne über Shedding freigesetzt wird. Im Rahmen
der Kooperation führten wir Sekretomanalysen der MelCV-345-Zelllinie und der
MelCV-Furin-Zelllinie durch. Wir konnten nicht nur das Ektodomänen-Shedding
bestätigen, sondern auch eine um etwa 50 % verstärkte Freisetzung der Fat1Ektodomäne in den Furin-überexprimierenden MelCV-Zellen zeigten (siehe Abb. 29).
Abb. 29: 8 µg Sekretom (S) und 75 µg Lysat (L) der Zelllinien MelCV-345 und MelCV-Furin
wurden im Western Blot mit einem Fat1-Antikörper gegen eine extrazelluläre Domäne inkubiert
(EZD2).
107
Um der Frage nachzugehen, ob das Shedding am Volle-Länge-Protein, oder am
Heterodimer stattfindet, wurde die spezifische Fat1-Bande des MelCV-345
Sekretoms nach der Auftrennung mittels Gelelektrophorese ausgeschnitten und von
Frau Dr. Hanna Diehl im Rahmen einer Kooperation mit dem Molekularen Proteomic
Center der Ruhr-Universität Bochum massenspektrometrisch analysiert.
Das Sequenzmapping der dadurch erhaltenen Peptide ergab, wie erwartet, nur
Peptide der extrazellulären Domäne von Fat1. Interessanterweise gingen die
Proteine dabei deutlich tiefer, als bis zu der von Sadeqzadeh et al. beschriebenen
Furin-Prozessierungsstelle,
(Sadeqzadeh et
al.,
die
zum
2011).
Pankreaskarzinomzelllinien
Heterodimer
Auch
ergab
alle
Peptide
führt
(siehe
Anhang)
Sequenzmappinganalysen
unterhalb
der
der
möglichen
Furinprozessierungsstelle.
Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass das Fat1-Shedding eher am VolleLänge-Protein stattfindet und das es möglicherweise auch durch Serinproteasen wie
Furin verursacht werden kann.
Bei der Betrachtung der mRNA-Expressionsdaten verschiedener Serinproteasen
(Affimetrix-Plattform) in unserem Zelllinienset fällt PCSK5 ins Auge (siehe Tab. 13).
Protease
HPDE
A818-4
BxPc3
MiaPaCa2
PaCa44
Panc1
Furin
6,53
6,58
6,56
6,39
7,06
6,64
PCSK5
2,97
6,43
6,25
3,38
7,43
3,14
PCSK7
7,74
7,69
7,68
7,51
7,66
7,63
PCSK9
8,91
5,47
9,32
5,01
8,57
5,37
Tab13: mRNA-Expressionsdaten einiger PCSK5-Proteine
Eine mRNA gilt als zuverlässig exprimiert, wenn die Signalstärke >5 ist. Die vollständige Liste der
PCSKs ist im Anhang zu finden.
108
Unser gesamtes Zelllinienset zeigt vergleichbare mRNA-Mengen für Furin (auch
bekannt als PCSK3) und PCSK7. Die Protease PCSK9 zeigt die höchsten
Expressionswerte der PCSK-Proteine, wenn auch nur in den Linien HPDE, BcPc3
und PaCa44.
Ins Auge fällt PCSK5: Diese Protease wird als einzige nur von den Zelllinien A818-4,
BxPc3 und PaCa44 exprimiert. Diese Zelllinien zeigten die prominenteste p485
Fat1-Bande
im
Western
Blot.
Gleichzeitig
ist
sie
die
einzige
der
vier
PCSK-Proteasen, die in den HPDE nicht exprimiert wird. Diese Zelllinie zeigte
hauptsächlich das Volle-Länge-Protein. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass in
unserem Zelllinienset die Prozessierung des volle Länge Proteins in das Heterodimer
nicht durch Furin, sondern durch die PCSK5 geschieht.
Die Untersuchungen der australischen MelCV-Zellen zeigten zudem, dass die Furin
eine Rolle im Fat1-Ektodomänen Shedding spielen könnte. Besonders die Zelllinien
BxPc3 und A818-4 zeigten in den vorangegangenen Versuchen keinen Effekt der
Metalloproteaseinhibitoren auf das Ektodomänen-Shedding. Um eine Beteiligung der
PCSK5
an
der
Prozessierung
von
Fat1
zu
untersuchen,
wurde
ein
PCSK5-Knockdown in den Zelllinien BxPC3 und PaCa44 durchgeführt (siehe
Abb.30).
109
Abb. 30: Ein PCSK5-Knockdown führt zu einem leicht verstärkten Fat1-EktodomänenShedding.
Die Zelllinien BxPC3 und PaCa44 wurden mit 30 nMol PCSK5 siRNApool (Dharmacon) für 48 h
inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 2x 48 h mit serumfreien Medium inkubiert. 8 µg
Sekretom wurden mittels Western Blot ausgewertet und die Signale mithilfe des Li-Cor Systems der
Firma Odyssey analysiert. Dargestellt sind die normierten Intensitäten für die Fat1 Signale im
Sekretom in zwei unabhängigen Versuchen.
Eine Darstellung von Fat1 im Lysat war leider nicht möglich, sodass dort eine
mögliche Veränderung der Signalstärke der einzelnen Fat1-Formen nicht überprüft
werden konnte.
Bei der Untersuchung der Sekretome zeigte sich überraschenderweise, dass der
PCSK5-Knockdown eher zu einer leichten Verstärkung des Fat1-EktodomänenSheddings (+ 5-20 %) führt.
Interessanterweise scheint die Protease am E-Cadherin Shedding beteiligt zu sein:
Die Menge des löslichen E-Cadherins wurde durch den PCSK5-Knockdown in
beiden Zelllinien auf 75 % reduziert. Eine Beteiligung von PCSK5 am E-CadherinShedding wurde bisher nicht beschrieben.
Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob die bisher untersuchten Proteasen
vielleicht Teil einer Proteasekaskade sind, die zum Fat1-Shedding führt. Um dies zu
110
klären, wurden alle drei Proteasen in Mehrfachknockdowns in der Zelllinie PaCa44
kombiniert (siehe Abb. 31).
Abb. 31: Der Knockdown aller drei untersuchten Proteasen führt zu einer verstärkten
Reduktion der Fat1-Ektodomäne.
Die Western Blot-Signale der Sekretome wurden mit dem Odyssey-Programm von Li-Cor ausgewertet
und auf die Kontrollprobe normiert.
48 h nach der Transfektion zeigt der ADAM10/ADAM9-Doppelknockdown einen
stärkeren
Effekt
auf
das
ADAM10/PCSK5-Knockdown
Fat1-Ektodomänen-Shedding
(~-25 %)
und
der
(~-40 %)
als
der
ADAM9/PCSK5-Knockdown
(~-30 %).
96 h nach der Transfektion zeigt ADAM10/PCSK5-Knockdown die stärkste Reduktion
der Fat1-Ektodomäne im Sekretom (~-70 %). Beim ADAM9/PCSK5-Kndockdown ist
sogar
wieder
mehr
Fat1-Ektodomäne
detektierbar,
während
der Wert
im
ADAM10/ADAM9-Knockdown annähernd stabil blieb.
Interessanterweise zeigt der Dreifachknockdown von ADAM9, ADAM10 und PCSK5
48h nach der Transfektion keinen Effekt, während 96 h nach Beendigung der
111
Transfektion die Fat1-Ektodomäne auf 25 % reduziert wurde. Dieser Reduktion ist
ähnlich stark, wie die Wirkung der Metalloproteaseinhibitoren.
Die zeitliche Verschiebung des Effekts des Dreifachknockdowns auf das Fat1Ektodomänen-Shedding kann verschiedene Gründe haben. Zum einen bedeutet die
Knockdownprozedur Stress für die Zellen.
Eine weitere Möglichkeit für die zeitliche Verzögerung des Knockdowneffektes
könnte eine mögliche regulatorische Wirkung insbesondere zwischen ADAM10 und
PCSK5 beim Fat1-Ektodomänen-Shedding in der Zelllinie PaCa44 sein.
Aufgrund eines zu hohen Hintergrundes der jeweiligen Antikörper im Western Blot,
konnte der Knockdown dort nicht überprüft werden, sodass die Auswertung mittels
Northern Blot stattfand. Da nicht alle präparierten Proben eine ausreichende RNAMenge aufwiesen, war eine quantitative Auswertung nicht möglich. Qualitativ zeigen
alle Proben einen Knockdowneffekt der einzelnen siRNAs (Daten im Anhang).
Die Beteiligung von PCSK5 und ADAM9 am Ektodomänen-Shedding von Fat und
ihre Position in einer möglichen Proteasekaskade mit ADAM10 muss durch weitere
Experimente abgesichert werden.
112
4.3.
Expression und Prozessierung von Fat1 in vivo
Wir im IMBL nutzen den Sekretomansatz zur Identifizierung von möglichen
Serumtumorbiomarkern. Zu diesem Zwecke wurde die Katalogisierung der
Sekretome unserer Pankreaskarzinomzelllinien und HPDE durchgeführt. Bis zu
diesem Punkt konnte ich zeigen, dass Fat1 in vitro in den Zelllinien hoch exprimiert
ist und (unter anderem von ADAM10) gescheddet wird. Gleichzeitig zeigen die
Karzinomzelllinien mehr Shedding, als die Kontrollzelllinie.
Um die Eignung von Fat1 als Biomarker weiter zu analysieren, soll die Expression in
vivo im Gewebe bestimmt werden. Lösliche Formen von Fat1 könnten im Serum von
Tumorpatienten auftreten, wenn Fat1 in Tumoren höher exprimiert ist als im
korrespondierenden Normalgewebe und/oder wenn die zuständige(n) Sheddase(n)
höher exprimiert oder aktivier sind. Im nachfolgenden Abschnitt sollen diese Aspekte
weiter untersucht werden.
4.3.1. Fat1 und ADAM10 sind in Pankreaskarzinomen überexprimiert.
Zunächst
wurde
Pankreaskarzinomen
die
und
mRNA-Expression
von
korrespondierenden
Fat1
und
Normalgeweben
ADAM10
mittels
in
der
umfangreichen mRNA-Profile, die von zwei Arbeitsgruppen publiziert wurden,
überprüft: Badea et al. haben 39 korrespondierende Tumor-/Normalgewebeproben
untersucht (Badea et al., 2008), während bei Pei et al. 36 Pankreaskarzinomgewebeproben und 16 Normalgewebekontrollen analysiert wurden (Pei et al., 2009).
Die Analyse dieser Datensätze geschah im Rahmen unserer Kooperation mit der
Arbeitsgruppe von Dr. Rick Thorne (Newcastle, Australien) und wurde von
Dr. Charles deBock durchgeführt (siehe Abb. 32).
113
Abb. 32: mRNA-Expressionsdaten von Fat1 und ADAM10 in Gewebeproben von Pei et al. und
Badea et al. (Pei et al., 2009; Badea et al., 2008).
Die Daten von Pei et al. wurden aus 36 Pankreaskarzinomgewebeproben (T) und 16 gesunden
Gewebekontrollen (N) gewonnen, während für den Badea Datensatz 39 korrespondierende Tumor/Normalgewebeproben verwendet wurden. Die Daten wurden von Dr Charles deBock ausgewertet.
Sowohl Fat1 als auch ADAM10 zeigen in beiden Probenkohorten eine signifikante
Erhöhung
der
Expression
in
den
Tumorproben
im
Vergleich
zu
den
Normalgewebeproben. Dies ist für die anderen Fat-Cadherine nicht zu beobachten
(Daten nicht gezeigt). Die Überprüfung von Gewebeextrakten im Western Blot zeigt,
dass dieser Unterschied auch auf Proteinebene beobachtbar ist (siehe Abb.33).
Abb. 33: Gewebeextraktionen von drei korrespondierenden Pankreastumor- und Normalgewebeproben zeigen eine erhöhte Fat1-Expression in den Tumorproben.
Es wurden 75 µg Gewebeextrakt aufgetragen, das aus kryogefrorenem Tumor und Normalgewebe
gewonnen wurde. Anschließend erfolgte eine Detektion gegen die extrazelluläre Domäne von Fat1
(ECD2). Eine Detektion gegen die intrazelluläre Domäne, sowie gegen ADAM10 war nicht möglich.
114
Die drei untersuchten korrespondierenden Gewebepaare stammen aus männlichen
Patienten mit einem Pankreaskarzinom des Stadiums UICC IIB. Alle drei
Probenpaare zeigen eine erhöhte Fat1-Expression im Tumor im Vergleich zu den
korrespondierenden Normalgeweben. Interessanterweise gilt dies fast ausschließlich
für die prozessierte Form. Nur das erste Probenpaar zeigt eine deutlich erkennbare
Doppelbande, die an das Muster in den Zelllysaten erinnert.
Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass es sich bei dem unteren Fat1-Signal in
den Tumorproben um die Ektodomäne handelt, da eine Detektion mit einem
Antikörper gegen die intrazelluläre Domäne nicht möglich war. Somit konnten die
Proben auch nicht auf das intrazelluläre Fragment des Heterodimers, das bei etwa
65 kDa liegt, getestet werden.
Im
IMBL
konnte
Gewebeproben
bereits
sehr
zuvor
schnell
beobachtet
gescheddet
werden,
wird,
sobald
dass
die
E-Cadherin
Kühlkette
in
kurz
unterbrochen wurde (Doktorarbeit Jakob Weiß, RUB 2011). Die Ektodomäne war
dann erstaunlich stabil. Bei den Tumorproben handelt es sich um ältere
Gewebeproben (aus den Jahren 2003-2004), die bereits häufiger für die Gewinnung
von Extrakten verwendet wurden.
Auch wenn nicht genau geklärt werden kann, in welcher Form Fat1 im Gewebe
vorliegt, ist eine Erhöhung der Fat1-Expression auch auf Proteinebene erkennbar.
Ein Nachweis von ADAM10 auf Proteinebene war in den Gewebeproben nicht
möglich, da die kommerziell verfügbaren Antikörper nicht genügend spezifisch sind.
Eine erhöhte ADAM10-Expression in Tumoren könnte auch ein Hinweis auf ein
vermehrtes Fat1-Ektodomänen-Shedding sein. Zudem scheint die gesheddete Form
in vitro stabil zu sein. Bei E-Cadherin und Cadherin-17 hatten wir zuvor beobachtet,
115
dass
die
Ektodomänen
auch
in
vivo
nicht
weiter
prozessiert
wurden
(Weiß et al., 2011, Weiß et al., Manuskript in Überarbeitung). Deswegen sollte
getestet werden, ob die lösliche Fat1-Ektodomäne auch im Serum nachweisbar ist
und möglicherweise von Patienten mit einem Pankreaskarzinom in höheren
Konzentrationen detektierbar ist.
4.3.2. Lösliches Fat1 wird in den Blutkreislauf freigesetzt und ist dort stabil.
Aufgrund seiner Größe kann Fat1 mittels differenzieller Zentrifugation angereichert
werden. Das im IMBL vorhandene Protokoll zur Anreicherung von Membranvesikeln
aus Zellkulturüberstand wurde auf Serumproben angepasst. Das Serum wurde dafür
zunächst mit PBS verdünnt und anschließend dreimal mit steigender g-Zahl
zentrifugiert. Das Pellet wurde in PBS aufgenommen und die Proteine anschließend
im Western Blot untersucht. Insgesamt wurden zehn Kontrollseren und elf Seren von
Pankreaskarzinompatienten untersucht. Nur zwei Patientenseren zeigten deutliche
Signale auf der Höhe der Ektodomäne von Fat1 (siehe Abb. 34).
Abb. 34: Fat1 ist detektierbar im Serum von Patienten mit Pankreaskarzinom.
2,5 µl Serum von je zwei Patienten mit Pankreaskarzinom (T) und zwei Patienten mit negativem
Tumorbefund (K) und wurden mittels differenzieller Zentrifugation behandelt, um die große Fat1
Ektodomäne anzureichern. Anschließend wurden 25 µg auf per Western Blot analysiert und mit einem
Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne (ECD2) inkubiert. 8 µg PaCa44-Sekretom (S) dienten als
Positivkontrolle.
Um sicher zu gehen, dass die detektierten Signale in Abbildung 29 wirklich Fat1 und
keine Kreuzreaktion mit einem möglicherweise abundanten Serumprotein sind,
116
wurden Scheibchen aus der entsprechenden Höhe ausgeschnitten und von Hanna
Diehl am Medizinischen Proteomcenter (MPC) der Universität Bochum mittels
Massenspektrometrie untersucht. Als Kontrolle für die Schnitthöhe diente auch hier
wieder das PaCa44-Sekretom.
Die massenspektrometrische Analyse konnte im PaCa44-Sekretom 64 Fat1-Peptide
detektieren. Die Schnitthöhe für die Gelscheibchen war somit richtig gewählt worden.
Die Probe T2 zeigte sieben, die Probe T1 drei Fat1-spezifische Peptide. Die
Kontrollproben wurden nicht untersucht. Bei den im Western Blot identifizierten
Signalen handelt es sich somit tatsächlich um Fat1.
4.3.3. Bestimmung der Fat1-Serumkonzentration von Pankreaskarzinomund Kontrollpatienten
Um die Brauchbarkeit von Fat1 als Tumorbiomarker weiter zu testen, wurde ein von
der
Arbeitsgruppe
von
Rick
Thorne
(Newcastle,
Australien)
entwickelter
Sandwich-ELISA im Rahmen unserer Kooperation für die Anwendung auf Seren
getestet und weiter optimiert.
Die Optimierung geschah in Zusammenarbeit mit Dr. Jakob Weiß, der schon
erfolgreich einen Cadherin-17 spezifischen ELISA für die Serenanwendung
entwickelt hatte.
Für den ELISA wurden zunächst 96-well Platten (weiß, MaxiSorp®, flat-bottom
96-well plates, Nunc, Roskilde, Dänemark) über Nacht bei 4 °C mit 100 µl des
monoklonalen Fat1-Antikörpers NTD7 (50 µg/ml, in Karbonat/Bikarbonatpuffer pH
9,6) gecoated. Um Hintergrundsignale zu minimieren, wurde die Inkubation der
Blockierungslösung (5 % Magermilch-Pulver/PBS+0,1 % Tween-20) von einer
Stunde auf zwei erhöht. In einem ersten Versuch geschah die Probeninkubation über
117
Nacht. Dies führte allerdings zu einem sehr starken Hintergrundsignal, weswegen die
Inkubation auf zwei Stunden bei Raumtemperatur reduziert wurde. Die Detektion des
monoklonalen biotinylierten Detektionsantikörpers NTD14 (0,05 µg/ml in 2 %
Magermilchpulver/PBS+0,1 % Tween 20) ergab bei einer Inkubation über Nacht die
besten Ergebnisse. Nach der Inkubation mit 5 µg/ml Neutravidin-HRP (Pierce,
Darmstadt, Deutschland) für zwei Stunden bei Raumtemperatur, wurde jedes Well
mit 50 µl Substrat (SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity) inkubiert und die
Signalstärke anschließend gemessen.
Die Optimierung des ELISAs geschah zunächst mit Seren, in die PaCa44 Sekretom
in steigender Proteinmenge eingefpgt wurde. Gleichzeitig wurde dasselbe Serum mit
steigenden Proteinmengen MiaPaCa2-Sekretom gemessen. In diesem Sekretom war
Fat1 nicht nachweisbar. Es diente somit zur Negativkontrolle (Daten nicht gezeigt).
Das IMBL verfügt über eine Serumbank mit Proben von Karzinompatienten
(überwiegend Kolon und Pankreas) und Kontrollproben von Patienten der Klinik ohne
Tumorbefund (überwiegend überprüft mittels Koloskopie). Für den ELISA wurden
30 Serumproben von Patienten mit Pankreaskarzinomen sowie 28 Kontrollproben,
untersucht (siehe Abbildung 35).
118
Abb. 35: Fat1 ist im Serum detektierbar.
Es wurden 28 Kontrollseren von Patienten ohne Tumorbefund und 30 Seren von Patienten mit
Pankreastumoren im ELISA untersucht. Die eingezeichnete Linie markiert den Median der
Probengruppen. Die Patientendaten sind im Anhang zu finden.
Die
Untersuchung
dieser
kleinen
Probenkohorte
ergab
nur
für
wenige
Tumorpatientenseren deutlich erhöhte Fat1-Werte. Die beiden Seren, mit Signalen
im Western Blot zeigten im ELISA die höchsten Werte. Einige weitere Proben hatten
leicht erhöhte Werte gegenüber dem Großteil der Proben; dies war allerdings sowohl
bei den Tumor- als auch bei den Kontrollproben zu beobachten.
Der angezeigte Unterschied im Mittelwert ist nicht signifikant. Der Median ist in der
Tumorgruppe sogar geringfügig niedriger als in der Kontrollgruppe.
119
Somit ist das lösliche Fat1 im Serum nachweisbar und zeigt in wenigen
Tumorpatienten erhöhte Werte. Es ist allerdings offensichtlich als Screeningmarker
wenig geeignet.
Eine der Beschränkungen des klinisch verwendbaren Tumormarkers CA19-9 ist die
Tatsache, dass das Antigen nur von Individuen mit einem Lewis-Lung positiven
Genotyp gebildet werden kann. Diesen Genotyp zeigen etwa 90 % der eurasischen
Bevölkerung, sodass bei etwa 10 % der Patienten mit einem Pankreaskarzinom
niemals ein erhöhter CA19-9 Wert auftreten kann. Bei diesen Patienten steht somit
kein Marker für eine Verlaufskontrolle zur Verfügung. Um einen möglichen Mehrwert
von löslichen Fat1 im Serum zu bestimmen, wurden die existierenden CA19-9 Werte
der untersuchten Tumorpatientenseren gegen die Fat1-Werte aufgetragen (siehe
Abbildung 36).
120
Abb. 36: Fat1 und CA19-9 korrelieren nicht im Serum von Pankreaskrebspatienten.
Für die 30 untersuchten Patientenseren wurden die CA19-9-Werte herausgesucht. Beide Werte
wurden gegeneinander aufgetragen. Die dünne Linie markiert den Cut-off für den Tumormarker
CA19-9, der bei 37 U/ml liegt. CA19-9 wurde in den Log10-Werten der detektierten U/ml aufgetragen,
wohingegen bei Fat1 der Log10-Wert der ermittelten Intensitäten aufgetragen wurde.
Es ist keine Korrelation zwischen beiden Proteinen erkennbar (r=0,0069).
Interessanterweise zeigen die zwei Proben mit den höchsten Werten für das lösliche
Fat1 nur geringe CA19-9-Werte.
Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass Fat1 als Teil eines Biomarkerpanels für die
Verlaufskontrolle von Pankreaskarzinompatienten eingesetzt werden kann. Die
Überprüfung eines größeren Probenpanels ist notwendig, um diesen Punkt weiter zu
testen. Da wir nur über eine begrenzte Probenmenge im IMBL verfügen, war eine
Ausweitung der Experimente im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich.
121
5. Diskussion
In der hier vorgelegten Arbeit habe ich mich mit zwei Themen beschäftigt, die beide
auf
den
in
meiner
Masterarbeit
durchgeführten
Analysen
zum
Ektodomänen-Shedding der beiden Cadherine Cadherin-17 und Fat1 aufbauen.
Es wurden zum einen Untersuchungen zu möglichen Interaktionspartnern des
darmspezifischen Cadherin-17s durchgeführt. Bereits in früheren Analysen hatten wir
zeigen können, dass die lösliche Ektodomäne von Cadherin-17 in vergleichsweise
großen Mengen in vitro und in vivo freigesetzt wird. Dr. Jakob Weiß entwickelte nicht
nur einen spezifischen Sandwich-ELISA für lösliches Cadherin-17, sondern konnte
auch zeigen, dass die Cadherin-17-Ektodomäne möglicherweise als diagnostischer
Marker for kolorektale Karzinome dienen könnte (Weiß et al., Manuskript in
Überarbeitung).
Mögliche
funktionelle
Auswirkungen
der
Freisetzung
der
Cadherin-17 Ektodomäne sind ebenso wie eine physiologische Funktion des
unprozessierten Proteins noch unbekannt.
Diese Aspekte sollten durch die Identifizierung von Interaktionspartnern näher
beleuchtet werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit habe ich durch CoImmunopräzipitation
und
anschließende
massenspektrometrische
Analyse
Cadherin-17-positiver Immunkomplexe nach möglichen Interaktionspartnern gesucht.
Ich habe die CoIP-Methode für die Isolierung Cadherin-17-positiver Immunkomplexe
optimiert und die copräzipitierten Proteine von insgesamt vier Durchgängen mit
Massenspektrometrie
identifizieren
lassen.
Die
durch
Massenspektrometrie
erhaltenen Kataloge habe ich mit denen der Ausgangslysatpräparationen und
untereinander verglichen und nach verschiedenen Kriterien weiter analysiert, um die
große Zahl der Kandidaten einzugrenzen. Beispielhaft wurde die Interaktion von
Cadherin-17
mit
zwei
Kandidaten,
122
dem
sogenannten
polymerischen
Immunoglobinrezeptor (pIgR) und Keratin 8 im Detail untersucht; beide Proteine
interagieren jedoch nicht spezifisch mit Cadherin-17.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden umfangreiche Untersuchungen zum Mechanismus
des
Fat1-Ektodomänen-Sheddings
durchgeführt.
Bereits
während
meiner
Masterarbeit konnte ich eine Freisetzung des Proteins in den Überstand kultivierter
Tumorzellen zeigen. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich den Mechanismus des
Ektodomänen-Sheddings von Fat1 untersucht und zeige eine Beteiligung der
Proteasen ADAM10, ADAM9 und PCSK5 an der Freisetzung von Fat1. PCSK5 ist
möglicherweise an der sogenannten klassischen Prozessierung von Fat1 beteiligt,
die zu einem membrangebundenen Heterodimer führt. Die Unterscheidung der durch
die duale Prozessierung, sprich der durch Ektodomänen-Shedding und der durch die
klassische Prozessierung, entstehenden Produkte von Fat1 haben wir in enger
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Rick Thorne (Newcastle, Australien)
bearbeitet. Schließlich zeige ich, dass die Freisetzung von Fat1 durch EktodomänenShedding auch in vivo in Patienten mit Pankreaskarzinomen erfolgt und dass die
lösliche Fat1-Ektodomäne in Serum stabil ist. Die mögliche Eignung dieser
Ektodomäne als Tumorbiomarker bei Pankreaskarzinompatienten wurde anhand
einer kleinen Serensammlung mittels eines Sandwich-ELISAs untersucht.
123
5.1.
Identifizierung
möglicher
Cadherin-17-Interaktionspartner
zur
Analyse der Proteinfunktion
5.1.1. Erstellung
von
Proteinkatalogen
von
Cadherin-17
positiven
Immunkomplexen mit Massenspektrometrie
Die Identifizierung von Proteininteraktionen hat sich als eines der wichtigsten Mittel
herausgestellt, um die Funktion eines Proteins in der Zelle zu ergründen. Die
Methode basiert auf dem Verständnis, dass die meisten Proteine nicht alleine (Gavin
et al., 2002), sondern als Teil eines Proteinkomplexes wirken, der je nach äußeren
Bedingungen variieren kann (Figeys, 2002). Die Funktion eines Proteins kann dabei
je nach Interaktionspartner und Lokalisation variieren (Jeffery, 1999).
Es existieren viele Techniken zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen in
der Zelle. Zwei häufig genutzte Methoden sind das Yeast two Hybrid-System (Y2H)
sowie
die
massenspektrometrische
Analyse
von
affinitätsgereinigten
Proteinkomplexen (Fields und Song, 1989).
Für das Y2H-System werden die möglichen Interaktionspartner mit der DNA-Bindeund der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert. Bei einer
Interaktion
wird
ein
Reportergen
aktiviert,
das
leicht
zu
detektierten
ist,
beispielsweise das lacZ-Gen (Gietz et al., 1997). Der Hauptkritikpunkt an dieser
Methode ist die hohe Falsch-positiv-Rate von etwa 50 % (Deane et al., 2002).
Gründe
dafür
sind
wahrscheinlich,
dass
die
zu
untersuchenden
Proteine
überexprimiert sind und die Analyse in der oft „untypischen“ Hefeumgebung
durchgeführt wird (Abu-Farha et al., 2008). Zudem kann es durch die Fusionierung
mit den Transkriptionsfaktordomänen zu einer Strukturveränderung des Proteins
kommen.
124
Für die Nutzung der massenspektrometrischen (MS) Analyse von Proteinkomplexen
waren die Entwicklung der Elektrosprayionisierung (ESI) durch John Bennett Fenn
(Fenn et al., 1989) und des matrix associated laser desorption/ionization (MALDI)Verfahrens durch Tanaka Koichi (Koichi et al., 1988) notwendig. Durch diese
Methoden war es erst möglich, große und geladene Biomoleküle in die Gasphase zu
überführen. Ebenfalls essenziell war der Aufbau großer Sequenzdatenbanken, die
die
Grundlage
für
die
anschließende
Proteinidentifizierung
durch
den
bioinformatischen Abgleich mit den in der Massenspektrometrie bestimmten
Peptidmassen bilden (Abu-Farha et al., 2008).
Der große Vorteil dieser Analyse liegt in der Sensitivität: Bereits geringe femtomolare
Mengen eines Proteins können identifiziert werden, es ist also keine Überexpression
nötig (Figeys et al., 2001). Gleichzeitig führt dies zu einer enormen Datenmenge,
deren Sortierung eine große Herausforderung darstellt.
Für die MS-Analyse von Proteinkomplexen werden die zu untersuchenden Proteine
oft mit einem Marker, einem sogenannten Tag versehen und zusammen mit den
möglichen Interaktionspartnern über diesen Tag auch isoliert. Nach einer
Auftrennung, beispielsweise mittels Gelelektrophorese, werden die Proteine meistens
mit
Trypsin
in
Peptide
gespalten
und
anschließend
per
MS
analysiert
(Abu-Farha et al., 2008).
Für diese Doktorarbeit wurde auf die Verwendung eines Tags verzichtet, da wir im
IMBL über gute monoklonale Antikörper gegen Cadherin-17 verfügen, die zum Teil
bereits in einem Sandwich-ELISA bewährt hatten. Ohne die Verwendung eines Tags
konnten wir Konformationsänderungen und die Behinderung möglicher Interaktionen
durch das Tag umgehen. Die ersten Western Blot-Analysen haben gezeigt, dass eine
Isolierung von Cadherin-17 ohne Tag möglich ist.
125
Zunächst habe ich verschiedene Co-IP-Protokolle und zwei Antikörper miteinander
verglichen und mich schließlich für den EP777-Antikörper entschieden, der uns
freundlicherweise von unserem Kooperationspartners Dr. Reinhard Gessner (Leipzig)
bereitgestellt wurde. Neben der höheren Cadherin-17–Ausbeute in der IP
verursachte dieser Antikörper im Vergleich zu dem kommerziell erhältlichen
Antikörper (R&D) auch geringere Verunreinigungen des Immunpräzipitats durch
Kreuzreaktionen.
Die möglichen Kreuzreaktionen der verwendeten Antikörper wurde mithilfe der
Proteine β-Tubulin und GAPDH überprüft. Besonders eine Interaktion von
Cadherin-17
und
GAPDH,
einem
Enzym
der
Glykolyse,
halten
wir
für
unwahrscheinlich, da hier weder die räumliche Nähe gegeben ist, noch ein Hinweis
auf einen Einfluss von Cadherin-17 auf die Glykolyse besteht.
Insgesamt habe ich vier CoIP-Protokolle miteinander verglichen. In einem Protokoll
wurden die Antikörper mittels des chemischen Linkers DMP kovalent an die
verwendeten paramagnetischen Beads gebunden; bei den anderen Protokollen
erfolgte die Bindung der Antikörper ausschließlich nicht-kovalent über die ProteinGMoleküle auf den Beads. Ich habe ich mich für das Protokoll entschieden, bei dem
die Antikörper chemisch an die Beads gekoppelt wird, damit diese die spätere
sensitive MS-Analyse nicht stören.
Um zu überprüfen, ob durch die IP wirklich eine Aufreinigung Cadherin-17 positiver
Immunkomplexe gelungen ist, wurden Proteine in einem Gel mittels der
Silberfärbung nach Heukeshoven oder mit KryptonTM (Pierce) angefärbt. Die
IP-Proben zeigten dabei eine stark verringerte Proteinmenge im Vergleich zur
Ausgangsprobe (vgl. Abb. 8), was eine erfolgreiche Aufreinigung bestätigt.
126
Während der Optimierung der Methode war mir aufgefallen, dass in den Kontroll-IPs,
die mit den reinen Beads, ohne gekoppelten Antikörper durchgeführt wurden,
vermehrte Kreuzreaktionen auftreten. Diese könnten durch eine Interaktion von
Lysatproteinen mit den ProteinG-Molekülen erfolgen. Aus diesem Grund, und um die
Cadherin-17 Ausbeute zu erhöhen, habe ich eine Antikörpertitration durchgeführt.
Bei der gewählten Antikörpermenge von 1 µg/100µl Beads konnte eine Sättigung der
Beads sowie die höchste Ausbeute beobachtet werden; darum wurde diese
Konzentration bei allen weiteren CoIPs verwendet.
Für die Analyse wollten wir gut differenzierte Darmepithelzellen verwenden, da das
Hauptaugenmerk dieser Arbeit auf physiologischen Interaktionspartnern lag. Wir
hatten uns für die Zelllinie CaCo2 entschieden: Diese Zelllinie ist in der Lage, im
konfluenten
Zustand
unter
anderem
strukturelle
Charakteristika,
wie
den
Bürstensaum und Tight Junctions, von Enterozyten des Dünndarms anzunehmen
(Pinto et al., 1983). Leider stellte sich unsere CaCo2-Zelllinie im weiteren Verlauf als
LoVo-Zellinie
heraus.
Dabei
handelt
es
sich
um
stark
dedifferenzierte
Kolonkarzinomzelllinie. Dies ist der Hauptgrund, warum im weiteren Verlauf der
Experimente hauptsächlich die Kolonadenomzelllinie LT97-2 verwendet wurde, die
immer noch gut differenziert ist.
Im weiteren Verlauf wurden die CoIP-Bedingungen weiter optimiert. Es ist bekannt,
dass Cadherin-17 kalziumabhängig homophile Zell-Zellkontakte ausbilden kann
(Berndorff et al., 1994; Kreft et al., 1996). Um auszuschließen, dass der Entzug von
Ca2+ während der IP-Waschschritte zu einer Konformationsänderung führt und somit
Interaktionspartner verloren gehen, wurden allen IP-Puffern Kalziumionen zugesetzt.
Ich konnte zeigen, dass durch die Zugabe von 0,1 mM Ca2+ auch im Western Blot zu
einer „Verstärkung“ des Cadherin-17-Signals in der IP-Probe führte. Es wurde somit
127
die Bindefähigkeit des Antikörpers verstärkt. Gleichzeitig kann die Verstärkung des
Signals darauf zurückzuführen sein, dass nicht nur direkt an Antikörper gebundene
Cadherin-17-Moleküle, sondern auch indirekt durch homophile Bindung weitere
Cadherin-17-Moleküle präzipitiert werden. Cadherin-17 ist, wie andere Cadherine
auch, in der Lage, homophile Dimere auszubilden (Wendeler et al., 2007;
Baumgartner et al., 2008) und auf diese Weise auch Cadherin-17-Proteine isoliert
werden, die an keinen freien Antikörper mehr binden konnten.
Im letzten Ansatz wurde schließlich ein in vivo Crosslinking nach Zlatic et al.
durchgeführt (Zlatic et al., 2010), um auf diese Weise schwache und temporäre
Bindungen zu fixieren. Dafür wurde der membrangängige Crosslinker DSP
eingesetzt, der alle Proteine kovalent aneinander bindet, die sich in genügend
räumlicher Nähe befinden.
Vortests mit einer β-Catenin-IP hatten gezeigt, dass der bekannte Interaktionspartner
E-Cadherin mit der CoIP-Methode nach Crosslinking isoliert werden kann.
Für die Cadherin-17-CoIPs ergaben Western Blot-Analysen der crossgelinkten
Proben, dass durch diese chemische Modifizierung das Antikörperepitop nicht
verdeckt wird und sogar eine Anreicherung von Cadherin-17 erreicht werden konnte.
Auch hier könnte der Grund wieder eine Interaktion von Cadherin-17 mit weiteren
Cadherin-17 Molekülen sein.
Insgesamt wurden ein CoIP-Katalog aus LoVo-Zelllysat und drei CoIP-Kataloge aus
LT97-2-Zelllysat erstellt. Als Vergleich dienten Kataloge der korrespondierenden
Ausgangsproben. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien gewählt, um die
Wahrscheinlichkeit einer falsch-positiven Identifizierung zu minimieren.
128
5.1.2. Auswertung der erstellten IP-Kataloge: Eine Eingrenzung der
Datenfülle
Die einzelnen IPs enthielten knapp 400 identifizierte Proteine, die IP aus dem
crossgelinkten Lysat zeigte über 600 identifizierte Proteine. Insgesamt konnten in
den vier erstellten CoIP-Proteinkatalogen 820 unterschiedliche Proteine identifiziert
werden. Im Vergleich dazu wurden im Durchschnitt in jedem einzelnen Lysatkatalog
im Durchschnitt 1.500 verschiedene Proteine identifiziert. Wie die silber- und
kryptongefärbten Gele zeigten, enthielten die Lysatproben enorme Proteinmengen.
Da zu große Proteinmengen die massenspektrometrische Analyse behindern
können, wurden nur 10 µg Protein, sprich ein Drittel der für die IP eingesetzten
Proteinmenge, für die Analyse verwendet. Dies lieferte immer noch deutlich mehr
identifizierte Proteine in den Lysaten. Gleichzeitig wurden in den IP-Katalogen für
Cadherin-17 und andere Proteine (die möglichen Interaktionspartner) ähnliche
Mengen an Spectral Counts (S) gefunden, während sehr viele Proteine in den IPKatalogen gar nicht, oder mit reduzierter SC-Zahl auftraten. Dies zeigt deutlich, dass
es gelungen ist, immunaufgereinigte Proben zu erstellen.
Die 200 Proteine, die in der crossgelinkten IP im Vergleich zu den anderen IPs
zusätzlich identifiziert wurden, sind ein deutlicher Hinweis darauf, dass der
chemische Crosslinker Proteine aneinander gebunden hat.
Trotz einer Aufreinigung der Proben durch die IP stellen die 800 identifizierten
Proteine noch eine enorme Datenmenge dar, in der es die sprichwörtliche
Stecknadel
im
Heuhaufen,
die
Cadherin-17-Interaktionspartner, zu identifizieren gilt.
129
möglichen
spezifischen
Für die Validierung wurden die Kataloge zuerst einzeln betrachtet und anschließend
untereinander verglichen:
Alle Kataloge enthielten Proteine, die am Translationsmechanismus beteiligt sind,
beispielsweise ribosomale- und Heatshock-Proteine. Diese Proteine kommen in sehr
großen Mengen in der Zelle vor, sodass es sehr wahrscheinlich ist, dass sie bei der
IP nicht vollständig entfernt werden konnten.
Die hohe Sensitivität der massenspektrometrischen Analyse führt dazu, dass
Kontaminanten
nachgewiesen
werden,
die
während
der
einzelnen
Präparationsschritte in die Probe gelangten. Nach der IP wurden die Proben
gelelektrophoretisch aufgetrennt und anschließend in 15 Scheibchen geschnitten, die
später einzeln untersucht wurden. Proteine, die sich über alle diese 15 Scheibchen
einer Probenpräparation erstreckten, beispielsweise Keratin 2, das ein großer
Bestandteil der Haut und der Haare ist (Beveridge und Lucas, 1944), wurden als
Kontaminanten deklariert.
Eine
weitere
Größenkontrolle.
Möglichkeit
In
jeder
zur
Identifikation
Analyse
wurde
von
durch
Kontaminanten
die
war
Verwendung
die
eines
Proteinmarkers die zu einem Scheibchen gehörende Proteingröße bestimmt. War ein
Protein bei der Analyse in einem Scheibchen zu finden, das 50 kDa von einer
bekannten Größe abwich, wurde es als Kontaminante deklariert.
Als weitere Kontrolle wurden mRNA-Expressionsdaten mit herangezogen, die im
IMBL von Heiko Becker für die der Zelllinie LT97-2 erstellt worden waren. Dieses
Profiling wurde mit „Whole genome arrays“ (Agilent Plattform) durchgeführt und ist
ein sensitives Verfahren. Ein Protein, dessen mRNA nicht nachgewiesen werden
konnte, stellt vermutlich ebenfalls eine Kontaminante dar.
130
Die daraus resultierende, immer noch enorme, Datenmenge wurde anschließend
durch einen Abgleich mit der Datenbank BioGPS bewertet. BioGPS ist eine
Datenbank, die unter anderem Expressionsprofile von Proteinen in unterschiedlichen
Gewebetypen zusammenfasst (Wu et al., 2009). Um sicherzugehen, dass es sich bei
den möglichen identifizierten Interaktionspartnern nicht um ein zellkulturspezifisches
Artefakt handelt, wurden alle identifizierten Proteine mit dieser Datenbank
abgeglichen. Zeigte ein Kandidat keine Expression im Gastrointestinaltrakt und/oder
in gastrointestinalen Tumoren, wurde er aus der Liste der möglichen Kandidaten
entfernt.
Schließlich wurde eine ausführliche Literaturrecherche durchgeführt, in der das
Hauptaugenmerk auf die Lokalisation und die Funktion der Proteine gelenkt wurde.
Cadherin-17 wird im intestinalen Epithel nur an der basolateralen Zellseite exprimiert.
Proteine, deren beschriebene Lokalisation ausschließlich an der apikalen Seite der
Zelle lag, wurden aussortiert.
Bei den Funktionen der möglichen Kandidaten wurde auf Parallelen zu den für
Cadherin-17 diskutierten Funktionen geachtet. Interessant waren somit alle Proteine,
die eine Aufgabe in der Regulation des Wasserhaushalts übernehmen, sowie solche,
die Transporterfunktionen ausüben. Dantzig et al. vermutete bereits 1994 eine
Peptid-Transporterfunktion von Cadherin-17 (Dantzig et al.,, 1994). Ahl et al.
postulierte aufgrund eines mathematischen Modells zur Cadherin-17 abhängigen
Breite des Interzellulärspalts eine Aufgabe von Cadherin-17 in der Regulation des
Wasserhaushaltes (Ahl et al., 2011).
Zudem wurden mögliche tumorfördernde Wirkungen der ektopen Cadherin-17
Expression berücksichtigt.
131
Auf diese Weise wurden folgende fünf Kandidaten zur weiteren Validierung
ausgewählt: Die Keratine Keratin 8, Keratin 18 und Keratin 19, das Transmembrane
emp24 Domäne beinhaltende Protein 10 (TMED10) sowie das Adhäsionsmolekül
EpCam.
Keratin 8 ist das Haupttyp-II-Keratin des Darms. Es sorgt zusammen mit Keratin 18
für den Erhalt und die Stabilisierung des intestinalen Epithels (Chu und Weiss, 2002).
Für eine mögliche Interaktion mit Cadherin-17 spricht neben der Lokalisation, dass
Keratin
8-negative-Mäuse
häufig unter Durchfall leiden und
Probleme im
Ionentransport und Wasserhaushalt aufweisen (Toivola et al., 2004). Dies passt mit
dem in silico Modell von Ahl et al. zusammen, die Cadherin-17 eine Aufgabe im
Wasserhaushalt zusprechen (Ahl et al., 2011).
Neben Keratin 18 ist Keratin 19 ein weiterer häufiger Interaktionspartner von Keratin
8, besonders im intestinalen Epithel (Coulombe und Omary, 2002).
Wie Cadherin-17 auch ist EpCam von den Tight Junctions und den Desmosomen
ausgeschlossen (Balzar et al., 1999) und kann kalziumabhängig Zell-Zellkontakte
ausbilden (Litvinov et al., 1994). Es spielt zudem eine Rolle in der Gewebe- und
Zellorganisation (Cirulli et al., 1989). Allerdings konnte beobachtet werden, dass
seine Anwesenheit sich eher destruktiv auf Cadherin vermittelte Zell-Zellkontakte
auswirkt (Litvinov et al., 1997).
TMED10 ist ein bisher kaum erforschtes Protein. Es werden dem transmembranen
Protein aber eine retrograde und anterograde Transporterfunktion zugesprochen
(Blum und Lepier, 2008)
132
5.1.3. Evaluierung der Kandidaten
Der erste Kandidat, dessen mögliche Interaktion mit Cadherin-17 detailliert überprüft
wurde, war der polymere Immunoglobinrezeptor (pIgR).
Das Protein kam ausschließlich in der ersten IP aus LoVo-Zelllysat vor, die zeitlich
vor den Anderen analysiert wurde. Somit gab es zu diesem Zeitpunkt noch keine
Möglichkeit der systematischen Auswertung.
pIgR stellte einen sehr interessanten Kandidaten dar. pIgR wird, wie Cadherin-17 an
der Zellmembran von intestinalen Epithelzellen exprimiert. Das Protein kann dimeres
IgA binden und wird von der basolateralen Membran über Endosomen zur apikalen
Membran transportiert. Dieser Transport ist auch ohne die Bindung von dimeren IgA
möglich (Phalipon und Corthésy, 2003). Dies brachte Cadherin-17 mit dem
Immunsystem in Verbindung. Wir vermuteten, dass das Cadherin eine Rolle dabei
spielen könnte, das pIgR zur basolateralen Membran zu leiten, da dieser
Mechanismus nach wie vor unbekannt ist. Zudem passte eine Interaktion mit einem
Transporter für dimeres IgA auch zu der von Dantzig et al. beschriebenen
Peptidtransporterfunktion (Dantzig et al., 1994).
CoIPs im Western Blot haben die Interaktion letztlich nicht bestätigt. Zudem ergab
eine Auswertung der Scheibchenzuordnung im Nachhinein, dass das Protein
ausschließlich
in
einem
Scheibchen
zu
finden
war,
dessen
zugehöriges
Molekulargewicht mehr als 50 kDa unter dem des unprozessierten pIgRs und seiner
prozessierten Formen lag. Es handelt sich wahrscheinlich um eine Verunreinigung
des Scheibchens.
Keratin 8 zeigte von allen Proteinen die solidesten Daten im Vergleich der
massenspektrometrischen
Kataloge.
Es
133
war
in
allen
IPs
gegenüber
den
entsprechenden Lysatkontrollen angereichert, auch als die Waschbedingungen
stringenter wurden. Es wird hauptsächlich in der Leber und im Darm exprimiert, was
sehr gut mit der Expression von Cadherin-17 zusammenpasst. Besonders
interessant war die Rolle im Darmelektrolythaushalt, die eine Verbindung zu der
Arbeit von Ahl et al. 2011 herstellte, die Cadherin-17 in Verbindung mit dem
Darmwasserhaushalt brachte.
Nachdem erste CoIPs mit einem pan-Zytokeratin-Antikörper sehr gute Ergebnisse
zeigte, konnte eine spätere Vergleichs-Keratin 8-IP aus Cadherin-17 negativen Lysat
zeigen, dass der EP777-Antikörper mit den Keratinen kreuzreagiert.
5.1.4. Schlussfolgerung und Ausblick
Die Negativergebnisse der beiden Validierungen zeigen, wie kritisch die erstellten
massenspektrometrischen Kataloge betrachtet werden müssen.
Zunächst
einmal
steht
die
Frage
im
Raum,
ob
aus
den
Listen
gute
Cadherin-17-Interaktionspartner-Kandidaten enthalten und wie diese ausfindig
gemacht werden können?
Es ist gut möglich, dass die bisherigen Kriterien für und gegen einen möglichen
Interaktionspartner zu stringent waren. Die hohe Diversität zwischen den einzelnen
Proben zeigt, dass ein möglicher Interaktionspartner vielleicht auch nur in zwei der
vier untersuchten IP-Proben auftreten könnte.
Ebenfalls zu klären bleibt, wie wichtig die Zugabe von Ca 2+ für eine Interaktion von
Cadherin-17 mit möglichen anderen Proteinen ist. Da die homophile Interaktion mit
anderen
Cadherin-17-Ektodomänen
ein
kalziumabhängiger
Prozess
ist
(Berndorff et al., 1994; Kreft et al., 1996), ist anzunehmen, dass die Stabilisierung der
Konformation von Cadherin-17 durch Kalzium ein essenzieller Schritt für spätere
134
Interaktionen mit anderen Proteinen ist. Sollte Ca2+ für eine Interaktion essenziell
sein, so waren die gewählten Parameter definitiv zu harsch, da der Zusatz in den
ersten beiden Katalogen fehlte und dieser Partner somit durch das Raster fiel. In
späteren
Analysen
sollte
somit
ein
verstärktes
Augenmerk
auf
die
82
Übereinstimmungen zwischen den IPs3 und 4 gerichtet werden, da nur in diesen
Proben Ca2+ zu den Puffern zugefügt wurde.
Für die weitere Validierung anderer Interaktionspartner könnte zudem eine
Wiederholung der IP aus crossgelinktem Lysat. Nur die IP4 hätte das Potenzial,
schwache und kurzfristige Interaktionspartner zu identifizieren. Kandidaten, die nur in
IP4 auftauchten, wurden bisher nicht berücksichtigt. Die hohe Diversität zwischen
den einzelnen Präparationen zeigt, wie wichtig diese Vergleichskataloge sind, um
falsch positive Ergebnisse zu identifizieren.
Dies wirft die entscheidende Frage auf: Wie können unspezifische Interaktionen
erkannt werden?
Das Ergebnis der Immunpräzipitation aus dem Cadherin-17 negativen Zelllysat hat
gezeigt, dass der Antikörper Kreuzreaktionen mit den Keratinen eingeht. Es ist nicht
auszuschließen, dass ein Teil der 107 Übereinstimmungen zwischen allen vier
untersuchten IPs auf diese Kreuzreaktion zurückzuführen ist. Um das Erkennen
dieser unspezifischen Interaktionen zu erleichtern, wäre eine IP aus Cadherin-17
negativen Lysat nötig. Auf die Vergleichslysatprobe kann in diesem Ansatz verzichtet
werden, da in diesem Ansatz nur die Kreuzreaktionen des Antikörpers identifiziert
werden sollen.
Und zum Schluss bleibt auch die Frage, ob diese unspezifischen Interaktionen
unterbunden werden können?
135
Dafür müsste die IP weiter optimiert werden, beispielsweise durch härtere
Waschbedingungen. Auch möglich wäre eine Zugabe von etwas Magermilchpulver
oder PBS zum IP-Bindepuffer, wie es in einigen kommerziell erhältlichen Kits (bsp.
Sigma) der Fall ist. Auf diese Weise könnten mögliche Kreuzreaktionen der Beads
verringert und der Hintergrund weiter reduziert werden.
Die von Bartolomé et al. beschriebene Interaktion zwischen Cadherin-17 und den
Proteinen α2β1 Integrin, JUP, CTNND1 und CTNNB1 (Bartolomé et al., 2013) konnte
ich mit meinen Datensätzen nicht bestätigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der Erstellung der vier IP-Kataloge und
den drei Lysat-Vergleichskatalogen eine breite Grundlage zur Identifizierung
möglicher Cadherin-17-Interaktionspartner geschaffen wurde. Wichtig ist eine
bessere Identifizierung unspezifischer Interaktionen, beispielsweise über eine
Vergleichs-IP aus Cadherin-17 negativem Lysat, sowie eine weitere Optimierung der
IP, um unspezifische Bindungen zu unterdrücken.
136
5.2.
Analysen
zur
proteolytischen
Freisetzung
des
atypischen
Cadherins Fat1 sowie zu dessen Eignung als Tumorbiomarker für das
Pankreaskarzinom
Fat1 gehört zu den Fat-Cadherinen, den wohl größten Vertretern der CadherinSuperfamilie. Fat wurde ursprünglich in Drosophila identifiziert (Mohr, 1923), wo es
als Tumorsuppressor beschrieben sind: Mutationen in diesem Gen führen unter
anderem
zu
einem
hyperplastischen
Wachstum
der
Imaginalscheibe
im
Larvenstadium, aus der sich normalerweise die Flügel des adulten Insekts ausbilden
(Bryant et al., 1988). Neuere Analysen haben gezeigt, dass das Drosophila-fat das
Wachstum durch Wirkung auf den Hippo-Signalweg regulieren kann, der eine
hochkonservierte
Kinasekaskade
darstellt
(Bennett
und
Harvey,
2006;
Silva et al., 2006).
Die Funktion von Fat1 ist im Menschen kaum untersucht und verstanden. Ein Grund
hierfür ist wahrscheinlich die enorme Größe des Proteins, die jegliche molekulare
Analyse enorm erschwert. Rückschlüsse können aus dem Expressionsmuster
gezogen werden. Beim Menschen wird die stärkste Fat1-Expression während der
Embryonalentwicklung beobachtet (Ponassi et al., 1999; Cox et al., 2000). Im adulten
Gewebe wird Fat1, mit wenigen Ausnahmen wie dem Gehirn und den Podozyten der
Niere
nur
wenig
oder
nicht
exprimiert
(zusammengefasst
in
Sadeqzadeh et al., 2013).
In vielen Tumoren ist die Fat1-Expression verändert, auch wenn das Bild nicht
einheitlich ist. Beispielsweise ist das Protein in Brustkarzinomen (Kwaepila et al.,
2005), Melanomen (Sadeqzadeh et al., 2011), Leukämie (deBock et al., 2012) und
137
Pankreaskarzinomen überexprimiert, was eine tumorfördernde Eigenschaft von Fat1
vermuten lässt.
Interessanterweise
Tumorsuppressor
schreiben andere
zu,
basierend
Studien dem
auf
Protein eine
Beobachtungen
eines
Rolle
als
Verlustes
der
Heterozygotie und homozygote Depletionen des Gens in Oralkarzinomen und
Astrozytomen (Chosdol et al., 2009; Nakaya et al., 2007).
Zudem wurde Korrelation zwischen dem Verlust von membranständigen Fat1 und
steigender
Aggressivität
von
Gallengangkarzinomen
beschrieben
(Settakorn et al., 2005).
Im IMBL stießen wir ursprünglich durch die massenspektrometrische Katalogisierung
der
freigesetzten
Proteine
im
konditionierten
Medium
von
kultivierten
Pankreaskarzinomzellen und der Kontrollzelllinie HPDE auf Fat1. Bereits während
meiner Masterarbeit konnte ich im Western Blot bestätigen, dass das Protein in das
Sekretom freigesetzt wird. Zwischenzeitlich wurde von der Arbeitsgruppe von
Dr. Rick Thorne (Newcastle, Australien) eine Arbeit publiziert, in der die klassische
Prozessierung (analog zur Prozessierung von Fat1-Proteinen in anderen Spezies) zu
einem membranständigen Heterodimer beschrieben wird. In dieser Arbeit wurde eine
Palette selbstproduzierter Antikörper gegen extrazelluläre, aber auch intrazelluläre
Fat1-Epitope verwendet. Aus unserer Anfrage auf eine Bereitstellung dieser
Antikörper entwickelte sich eine produktive, freundliche Kooperation, die in dieser
Arbeit beschriebenen Analysen zu Fat1 außerordentlich bereicherte.
138
5.2.1. Die
duale
Prozessierung
von
Fat1
in
vitro
im
Pankreas-
karzinomsystem
Anders als die klassischen Cadherine kommt Fat1 nicht nur als einkettiges,
mebranständiges Protein in seiner vollen Länge vor. Es wurde beschrieben, dass
Fat1 innerhalb des sekretorischen Systems proteolytisch prozessiert und das
entstandene Heterodimer an der Zellmembran exprimiert wird. Das Heterodimer
besteht aus einem Großteil der Ektodomäne (gp 485) und einem C-terminalen
Restfragment (p85), die nicht-kovalent verbunden sind.
Im Melanom spielt bei dieser sogenannten klassischen Prozessierung Furin eine
entscheidende Rolle. So konnten Sadeqzadeh
et al. mittels einer Furin-
Überexpression einen Großteil der Volle-Länge-Fat1-Moleküle in die heterodimere
Form überführen. Gleichzeitig konnten sie ein kleineres C-terminales Restfragment
(p65) identifizieren und vermuten, dass dieses p65 nach der proteolytischen
Abspaltung
der
Ektodomäne
mittels
(Sadeqzadeh et al., 2011) (siehe Abb. 37).
139
Ektodomänen-Shedding
zurückbleibt
Abb. 37: Schematische Darstellung der dualen Prozessierung von Fat1.
Das volle Länge Protein wird dual prozessiert. Zum einen wird es bei der sogenannten klassischen
Prozessierung in ein gp 485 und ein p90 Fragment gespalten, die an der Zelloberfläche nicht-kovalent
aneinander binden und so ein Heterodimer formen. Zum Anderen erfolgt die Freisetzung einer
Ektodomäne (gp510), sodass ein kleines C-terminales Restfragment (p65) an der Zelloberfläche
zurück bleibt.
Die Publikation von Sadeqzadeh et al. half uns die Doppelbande zu verstehen, die
ich während meiner Masterarbeit in den Lysaten der Pankreaskarzinomzelllinien
beobachten konnte. Wir waren uns unschlüssig, ob es sich bei der kleineren Bande
um eine Isoform des Proteins, oder um die reine Ektodomäne handelte, da die untere
Bande des Doublets sich auf derselben Höhe befand, wie das Signal für die
Ektodomäne im Sekretom.
140
Mithilfe der sehr guten Antikörper der Arbeitsgruppe von Dr. Rick Thorne konnte ich
im Rahmen dieser Doktorarbeit zeigen, dass neben dem Fat1-Volle-Länge-Protein
auch das Heterodimer auf der Zellmembran unseres Zelllinienpanels existiert.
Interessanterweise zeigte die Kontrolllinie HPDE mehr Volle-Länge-Protein, als das
Heterodimer, während die Pankreaskarzinomzelllinien vergleichbare Mengen beider
Fat1-Formen zeigten. Die stärkste Expression zeigten dabei die Zelllinien BxPc3 und
PaCa44. Von Dr. Elham Sadeqzadeh im Rahmen unserer Kooperation erstellte IPs
der einzelnen Fat1-Fragmente aus den Pankreaskarzinomzelllinien konnten die
C-terminalen Restfragmente p85 und p65 allerdings nur in den Zelllinie BxPc3 und
A818-4 zeigen. Da besonders die Linien Panc1 und PaCa44 ein sehr starkes
Ektodomänen-Shedding zeigten, hatten wir dort deutliche p65 Signale erwartet. Es
könnte sein, dass beide Restfragmente weiter prozessiert werden und dass dieses
Fragment
weitere
Funktionen
in
der
Zelle
einnimmt,
da
durch
Immunfluoreszenzanalysen ein Signal für die intrazellulare Fat1-Domäne in den
Zellkernen
von
MV3-Melanomzellen
identifiziert
werden
konnte
(Sadeqzadeh et al., 2011). Dieser Punkt wurde allerdings im Rahmen dieser Arbeit
nicht weiter verfolgt.
Um
zu
überprüfen,
ob
das
Fat1-Volle-Länge-Protein
auch
in
Pankreaskarzinomzelllinien von Furin zum Heterodimer prozessiert wird, wurden
zunächst
die
mRNA-Expressionsprofile
unseres
Zelllinienpanels
(Affymetrix)
untersucht. Dies ergab, dass alle verwendeten Pankreaskarzinomzelllinien Furin
exprimieren. Bei der Analyse der Daten fiel aber eher die PCSK5 ins Auge, die
ausschließlich eine Expression in den Linien BxPc3 und PaCa44 zeigt. In beiden
Zelllinien
tritt
die
prominenteste
p430-Fat1-Bande
von
allen
untersuchten
Pankreaskarzinomzelllinien auf. Es ist möglich, dass die duale Prozessierung von
141
Fat1 im Pankreassystem nicht durch Furin, sondern eher durch PCSK5 geschieht.
Leider war es nicht möglich, die Lysatsignale in PCSK5-siRNA-Versuchen
auszuwerten. Dafür ergaben spätere Sekretomanalysen ein vermehrtes Shedding in
Zellen, die mit PCSK5-siRNA behandelt wurden (siehe Abschnitt 5.2.2.). Dies könnte
ein Hinweis auf eine Rolle von PCSK5 bei der ‚klassischen Prozessierung‘ sein, da
wir vermuten, dass das Fat1-Ektodomänen-Shedding am Volle-Länge-Protein
geschieht. Wenn PCSK5 das Volle-Länge-Protein nicht mehr in das Heterodimer
überführt, so sind mehr Ziele für die am Ektodomänen-Shedding beteiligte Protease
vorhanden, sodass es zu einem verstärkten Shedding kommen kann. Es sind
allerdings noch die Analysen entsprechender Lysatpräparationen nötig, um diesen
Punkt zu festigen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich das Fat1-Ektodomänen-Shedding sowohl in
unserem Zelllinienpanel als auch in den von der Arbeitsgruppe Thorne verwendeten
Melanomzelllinien einwandfrei bestätigen. Gerade auch die Verwendung des
Antikörpers gegen ein intrazelluläres Epitop hat im Western Blot bestätigt, dass das
Volle-Länge-Protein zwar im Zelllysat, nicht aber im Sekretom nachweisbar ist. Ich
konnte somit ausschließen, dass das Volle-Länge-Protein über Freisetzung von
Vesikeln in den Zellkulturüberstand gelangt.
Des Weiteren konnten wir durch eine massenspektrometrische Analyse der
spezifischen Fat1-Gelbande aus verschiedenen Zelllinien und anschließendem
Sequenzmapping zeigen, dass sowohl in unserem Zelllinienpanel, als auch in der
Melanomzelllinie MelCV-345 die identifizierten Peptide über die von Sadeqzadeh et
al vermutete Furin-Schnittstelle hinaus gehen. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf,
dass das Ektodomänen-Shedding wahrscheinlich am Volle-Länge-Protein stattfindet.
142
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die duale Prozessierung von Fat1 auch in
Pankreaskarzinomzellen und der immortalisierten Pankreasgangzelllinie HPDE
beobachtet werden kann. Der Weg der ‚klassischen Prozessierung‘ führt zu einem
membrangebundenen
Heterodimer,
während
die
Fat1-Ektodomäne
durch
Ektodomänen-Shedding in eine lösliche Form überführt und freigesetzt wird. Beide
Prozesse
gehen
wahrscheinlich
vom
Volle-Länge-Protein
aus,
da
das
Sequenzmapping der Ektodomäne aus konditioniertem Medium auch Peptide zeigte,
die über die mögliche Furin-Schnittstelle hinaus gehen.
5.2.2. Das Fat1-Ektodomänen-Shedding ist ein komplexer Prozess
Der Hauptfokus des zweiten Teils meiner Doktorarbeit lag auf der Untersuchung des
Mechanismus der Freisetzung der Fat1-Ektodomäne und der daran beteiligten
Proteasen.
Vorangegangene Arbeiten unserer und anderer Arbeitsgruppen zeigen, dass das
Ektodomänen-Shedding von Mitgliedern der Cadherin-Superfamilie unter anderem
durch
Metalloproteasen
(Maretzky et al., 2005)
als
vermittelt
auch
wird.
So
Cadherin-17
sind
(Weiß
sowohl
et
al.,
E-Cadherin
Manuskript
in
Überarbeitung) Ziele der Disintegrin- und Metalloprotease ADAM10.
Um die Beteiligung von Metalloproteasen am Fat1-Ektodomänen-Shedding zu
überprüfen,
wurden
die
Zellen
mit
serumfreien
Medium,
das
den
Breitbandmetalloproteaseinhibitor Batimastat enthielt, inkubiert. Die anschließende
Überprüfung der konditionierten Medien mittels Western Blot ergab eine Reduktion
der Fat1-Ektodomäne den Zelllinien HPDE (-55 %), BxPc3 (-20 %), MiaPaCa2
(55 %), PaCa44 (-80 %) und Panc1 (-40 %). Auch in der parallel untersuchten
Zelllinie MelCV-345 konnte ich eine Reduktion der Fat1-Ektodomäne (-40 %) nach
143
Inkubation mit Batimastat beobachten. Dies zeigt deutlich, dass Metalloproteasen am
Fat1-Ektodomänen-Shedding beteiligt sind.
Um die am Ektodomänen Shedding beteiligte Protease weiter eingrenzen zu können,
wurde zudem der Inhibitor GI245023X eingesetzt, der ADAM10 sensitiver inhibiert,
als ADAM17. Auf diese Weise soll überprüft werden, ob ADAM10 eine Rolle beim
Fat1-Ektodomänen Shedding spielt. Auch dieser Inhibitor wurde dem serumfreien
Medium der Zellen zugefügt und hier konnte eine Reduktion der Ektodomäne in den
Zelllinien HPDE (-50 %), MiaPaCa2 (-70 %), PaCa44 (-70) und Panc1 (-35 %)
beobachtet werden.
Allerdings inhibiert der Inhibitor GI245023X in der eingesetzten Konzentration auch
andere
ADAMS
und
Mitglieder
der
Matrixmetalloproteasefamilie
(Ludwig et al., 2005), sodass nicht sicher gesagt werden kann, dass ADAM10 am
Fat1-Ektodomänen Shedding beteiligt ist. Aus diesem Grund sollten die Zelllinien
Panc1 und PaCa44, die über das stärkste Fat1-Ektodomänen-Shedding verfügen,
mit siRNA gegen ADAM10 behandelt werden, um die Beteiligung der Protease am
Fat1-Ektodomänen-Shedding mit einer unabhängigen Methode spezifisch zu
überprüfen.
Zur
Identifizierung
vielversprechender
Kandidaten
wurden
erneut
die
mRNA-Expressionsprofile unseres Zellliniensets untersucht. Dort zeigten die
Proteasen ADAM10, ADAM15 und ADAM17 gute Expressionswerte. Am auffälligsten
war aber die Protease ADAM9, die von allen Zellen die am stärksten exprimierte
Disintegrin- und Metalloprotease war.
Somit wurden siRNA-Pools gegen ADAM10 und das hochexprimierte ADAM9
eingesetzt.
Während der ADAM9-Knockdown lediglich zu einer Reduzierung der Fat1Ektodomäne im Sekretom um etwa 10-25 % führte, zeigte der ADAM10-Knockdown
144
eine Reduktion von bis zu 50 %. Ein Doppelknockdown beider Proteasen führte nur
im Falle der PaCa44 zu einer Addition der Einzelknockdowneffekte.
ADAM9 ist in der Lage ADAM10 über Ektodomänen-Shedding freizusetzen
(Tousseyn et al., 2009). Zudem zeigen Inhibitorstudien, dass bei einer Inhibierung
von ADAM9, ADAM10-vermitteltes Ektodomänen-Shedding verstärkt werden kann
(Moss
et
al.,
2011).
Dies
scheint
in
vitro
in
den
untersuchten
Pankreaskarzinomzelllinien nicht stattzufinden. Vielmehr führte der Knockdown zu
einer leichten Reduktion der detektierbaren Menge Fat1-Ektodomäne in den
untersuchten Zelllinien PaCa44 und Panc1.
Metalloproteasen
sind
nicht
die
einzigen
Proteasen,
die
am
Fat1-Ektodomänen-Shedding beteiligt sind. Dies wird besonders in den Zelllinien
A8184 und BxPc3 deutlich, in denen der der Breitbandinhibitor Batimastat nur für
eine geringe Reduktion des Sheddings sorgte. Gleichzeitig zeigen die BxPc3 Zellen
im Sekretom ein sehr starkes Fat1-Signal, sie verfügen also über eine starke
Shedding-Aktivität. Dies legt die Vermutung nahe, dass an der Prozessierung auch
andere Vertreter der Proteasefamilie, beispielsweise die Serinproteasen, beteiligt
sein
könnten.
In
einem
unabhängigen
Ansatz
fiel
uns
auf,
dass
die
MelCV-Melanomzellen nach Überexpression von Furin ein um etwa 50 % verstärktes
Ektodomänen-Shedding von Fat1 zeigen. Da der mRNA-Datenabgleich mit den
Affymetrix-Daten der Pankreaskarzinomlinien ergab, dass alle Linien unseres Sets
Furin exprimieren, wäre eine Beteiligung von Furin am Fat1-Ektodomänen-Shedding
möglich. Die bisher durchgeführten Tests von Serinproteaseinhibitoren zeigten aber
keine verwertbaren Signale (Daten nicht gezeigt).
145
Aufgrund der möglichen Beteiligung von PCSK5 an der ‚klassischen Prozessierung‘
von Fat1 wurden auch für PCSK5 alleine und in Kombination mit ADAM10 und
ADAM9
Knockdownversuche
durchgeführt.
Dabei
ergaben
sich
in
den
Sekretomanalysen interessante Ergebnisse:
Der PCSK5-Knockdown alleine führte zu einem leicht verstärkten EktodomänenShedding. Erst in Kombination mit einem ADAM10-Knockdown konnte die Menge
Fat1-Ektodomäne in der Zelllinie PaCa44 um etwa 55 % reduziert werden. Dieser
Effekt
ist
noch
stärker
als
der
des
einfachen
ADAM10
bzw.
des
ADAM10/ADAM9- Doppelknockdowns.
Ein Dreifachknockdown aller untersuchten Proteasen führte sogar zu einer Reduktion
der detektierten Fat1-Ektodomäne um etwa 70 %. Der Effekt war somit ähnlich
ausgeprägt wie die Hemmung durch den Breitbandinhibitor Batimastat, mit dem ich
die detektierbare Fat1-Menge im Sekretom um fast 80 % reduzieren konnte.
Der Mechanismus des Fat1-Sheddings scheint ein hochregulierter Prozess zu sein,
an dem mehrere Proteasen beteiligt sind.
Es ist möglich, dass Furin auch in der Lage ist, die Fat1-Ektodomäne freizusetzen.
Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass das vermehrte Fat1-Shedding in
den MelCV-Zellen auf einen unphysiologischen Nebeneffekt der starken retroviral
transduzierten Überexpression von Furin zurückzuführen ist. Furin-KnockdownVersuche waren im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fat1 von der Protease ADAM10
freigesetzt wird. Es gibt eine schwache Verknüpfung mit ADAM9, die sowohl in Form
einer Proteasekaskade, als auch aufgrund einer direkten Beteiligung am Shedding
146
erfolgen kann. Zudem scheint die Protease PCSK5 in den Vorgang des
Ektodomänen Sheddings involviert zu sein, auch wenn der genaue Mechanismus
noch in weiteren Experimenten zu klären bleibt. Wir vermuten, dass PCSK5 an der
Prozessierung des Volle-Länge-Proteins zum Heterodimer beteiligt ist und ein
Knockdown dieser Protease somit zu einer Vermehrung der potenziellen ADAM10Ziele führt.
Die Ergebnisse der Metalloproteaseinhibitorversuche zeigen anhand des kaum
reduzierten Sheddings in den Zelllinien A818-4 und BxPc3, dass auch andere
Proteasen am Fat1-Ektodomänen Shedding beteiligt sein dürften.
5.2.3. Lösliches Fat1 als möglicher, ergänzender Serumtumorbiomarker
Unsere Arbeitsgruppe am IMBL analysiert seit einigen Jahren die Sekretome von
kultivierten Karzinomzelllinien zur Identifizierung von freigesetzten Proteinen als
mögliche Kandidaten für Serummarker. Für einen tatsächlichen Nachweis solcher
Kandidaten im Serum von Karzinompatienten wurde bereits vor einigen Jahren durch
Salwa Kübler im Rahmen ihre Doktorarbeit eine große Serenbank erstellt (Kübler).
Bei
der
Sekretomanalyse
zeigte
sich,
dass
Ektodomänen-Shedding
von
Transmembranproteinen erhebliche Proteinmengen zum Sekretom beitragen kann.
Prominente Komponenten sind Cadherine, von denen wir bereits zwei Vertreter auf
ihre Eignung als Tumorbiomarker überprüft haben:
Die Ektodomäne von E-Cadherin ist im Blutkreislauf stabil und Patienten mit einem
fortgeschrittenen Karzinom weisen erhöhte Level von löslichem E-Cadherin auf
(Weiß et al., 2011). Auch lösliches Cadherin-17 kann in Seren von Patienten mit
einem Kolorektalkarzinom vermehrt detektiert werden (Weiß et al., Manuskript in
Überarbeitung). Da die Expression von Cadherin-17 in Tumoren gegenüber dem
147
Normalgewebe nicht erhöht (Su et al., 2008) und die von E-Cadherin meist sogar
reduziert ist (van Aken et al., 2001), geht eine verstärkte Freisetzung vermutlich auf
eine höhere Shedding-Aktivität in Tumoren zurück.
In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass Fat1 ein abundantes Protein im Sekretom
von kultivierten Pankreaskarzinomzelllinien ist. Zusätzlich zeigten Analysen von zwei
unterschiedlichen
mRNA-Expressionsdatensets
aus
Pankreaskarzinom-
und
Normalgewebe (Pei et al., 2009; Badea et al., 2008), dass Fat1 auch in vivo verstärkt
von Tumoren exprimiert wird.
Diese Überexpression konnte ich auch auf Proteinebene in einem kleinen Panel
durch die Analyse von Gewebeextrakten aus kryokonservierten Pankreastumoren
und korrespondierendem Normalgewebe bestätigen.
Zudem konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass ADAM10 am Shedding von Fat1
beteiligt ist; eine Protease, die laut der Datensets von Badea et al. und Pei et al.
ebenfalls in Pankreaskarzinomen überexprimiert wird.
Aus diesen Gründen vermuteten wir, dass bei Patienten mit Pankreaskarzinom
möglicherweise auch lösliches Fat1 im Serum nachweisbar sein könnte.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die Fat1-Ektodomäne auch
in vivo freigesetzt wird und im Blutkreislauf stabil ist: In zwei Patientenseren war das
lösliche Fat1 sogar im Western Blot nachweisbar. Zudem konnte ein SandwichELISA in enger Kooperation mit der Arbeitsgruppe Thorne etabliert werden. Diesen
nutzten wir für die Untersuchung einer kleinen Serenkohorte und konnten zeigen,
dass in sechs von 30 untersuchten Seren von Tumorpatienten ein erhöhter
Fat1-Level detektiert werden konnte. Die Erhöhung korrelierte dabei nicht mit dem
Tumorstadium.
148
Dies
zeigt,
dass
trotz
der
Überexpression
von
Fat1
und
ADAM10
in
Pankreastumoren im Vergleich zum korrespondierenden Normalgewebe, ein
erhöhter Level von löslichem Fat1 nicht sehr häufig ist.
Als allgemeiner Screening-Marker für Pankreaskarzinome ist Fat1 somit ungeeignet.
Die Sensitivität, also die Rate der als Karzinomträger korrekt identifizierten
Individuen, ist in unserer Probenkohorte sehr gering. Bei sechs Patienten mit einem
erhöhten Fat1-Wert in einer Gruppe von 30 errechnet sich eine Sensitivität von 20 %.
Gleichzeitig zeigten drei der 28 Kontrollpatienten einen leicht erhöhten Fat1-Wert im
Vergleich zum Mittelwert der Probenkohorte. Somit beträgt die Spezifität, die
Wahrscheinlichkeit, dass der Test bei einem Gesunden negativ ausfällt, 89 %. Im
Vergleich dazu zeigt der etablierte Tumormarker für Pankreaskarzinome CA19-9 in
unserer Serumkohorte eine Sensitivität von 86 %. Da wir keine Angaben zu den
CA19-9-Werten der Kontrollpatienten hatten, konnten wir die Spezifität nicht
bestimmen. Eine Analyse von 2007 sprach CA19-9 aber eine mittlere Spezifität von
82 % zu (Goonetileke und Siriwardena, 2007).
Kann trotzdem ein Nutzen aus löslichem Fat1 als Biomarker gezogen werden?
CA19-9
zeigt
als
Tumorbiomarker
einige
Nachteile:
Als
Produkt
des
Lewis-Lung-Antigens wird CA19-9 von bis zu 10 % der kaukasischen und etwa 20 %
der afrikanischen Bevölkerung nicht exprimiert. Zudem können erhöhte CA19-9Werte auch in Patienten mit Pankreatitis, Leberzirrhose und verschiedenen anderen
Adenokarzinomen,
beispielsweise
Kolorektalkarzinomen
gemessen
werden
(Vestergaard et al., 1999; Tempero et al., 1987). Dies führt zu einer Limitierung der
diagnostischen Verwendbarkeit, sodass auch CA19-9 nicht zum Screening
eingesetzt werden kann (Ballehaninna und Chamberlain, 2011). Aus diesen Gründen
149
ist die Suche nach Markern, die in Kombination mit CA19-9 eingesetzt werden
können, ein stark beforschtes Gebiet.
Aus diesem Grund haben wir die CA19-9 und die Fat1 Werte unserer Probenkohorte
verglichen: Beide Proteine korrelieren nicht miteinander. Gleichzeitig zeigten aber
vier Patienten mit einem CA19-9 Wert unterhalb des Cut-offs einen erhöhten
Fat1-Wert, der bei zwei Patienten sogar enorm hoch war. Auch wenn nur die beiden
höchsten Fat1-Werte gewertet werden, erreichen wir durch die Kombination beider
Marker in unserer Probenkohorte eine Sensitivität von 93 %.
Aufgrund der bisher kleinen Probenkohorte sind diese Ergebnisse bisher nicht
signifikant. Auch fehlen noch Analysen, ob Level von löslichem Fat1 von der
Tumorlast, der Progression, von Metastasen oder durch ein Therapieansprechen
beeinflusst werden. Es sind offensichtlich Analysen größerer Probenkohorten nötig,
um die Ergebnisse dieser Arbeit weiter zu überprüfen. Bisher allerdings erscheint das
lösliche
Fat1
als
ein
vielversprechender
neuer
Serummarker-Kandidat
Überprüfung und zur Verlaufskontrolle von Lewis-Antigen negativen Patienten.
150
zur
6. Zusammenfassung:
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Themen bearbeitet, die auf
vorangegangene Arbeiten zu Cadherinen des IMBLs aufbauen: Im ersten Teil wurde
nach Interaktionspartnern des darmspezifischen Cadherins Cadherin-17, das von
unserer Arbeitsgruppe in Form des löslichen Cadherin-17s als Serummarker für
kolorektale Karzinome vorgeschlagen wurde, gesucht. Der zweite Teil drehte sich um
Analysen zur dualen Prozessierung, und besonders des Ektodomänen-Sheddings
des gigantischen Cadherins Fat1; zusätzlich wurde die Verwendbarkeit des löslichen
Fat1s als Serummerakrer für Pankreaskarzinome überprüft.
Mittels der Suche nach Interaktionspartnern sollten Hinweise auf die physiologische
Funktion von Cadherin-17 und der Auswirkung seiner proteolytischen Prozessierung
gesucht werden. Dies basiert darauf, dass Proteine in den meisten Fällen nicht
alleine, sondern als Teil eines Proteinkomplexes wirken. Mittels Immunpräzipitation
und der anschließenden massenspektrometrischen Analyse der Immunkomplexe
wurden Kataloge möglicher Cadherin-17-Interaktionspartner erstellt. Aus vier
unabhängigen Präparationen konnten Listen mit rund 800 möglichen Kandidaten
erstellt werden. Diese Liste wurden über einen Vergleich untereinander und mit
korrespondierenden
Lysatpräparationen,
sowie
dem
Datenabgleich
mit
mRNA-Expressionsdaten und einer ausführlichen Paperrecherche ausgewertet.
Exemplarisch wurden die Kandidaten pIgR und Keratin 8 als Interaktionspartner von
Cadherin-17 überprüft. Während pIgR sich als eine Kontamination in der Präparation
heraus stellte, handelt es sich bei Keratin 8 wahrscheinlich um eine unspezifische
Bindung
des
verwendeten
Cadherin-17-IP-Antikörpers.
Trotz
dieser
Negativ-Ergebnisse stellt der Ansatz eine gute Basis zur Identifikation möglicher
151
Interaktionspartner
dar,
auch
wenn
die
bisherigen
Ergebnisse
Verbesserungsmöglichkeiten aufzeigen, beispielsweise durch die Verwendung einer
IP aus Cadherin-17-negativem Zelllysat oder einer weiteren Optimierung der IP
selbst, zur Vermeidung weiterer unspezifischer Bindungen.
Ähnlich, wie Cadherin-17 würde Fat1 mittels massenspektrometrischer Analysen von
konditionierten
Medien
kultivierter
Karzinomzellen,
in
diesem
Fall
Pankreaskarzinomzellen, identifiziert. Es bildet einen nicht unerheblichen Anteil am
gesamten Sekretomproteom und wird vermehrt von den Karzinomzellen, im
Vergleich zur immortalisierten Kontrollzellinie freigesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit
wurden die unterschiedlichesten prozessierten Formen des Proteins mit Hilfe von
Antikörpern gegen extrazelluläre und besonders gegen intrazelluläre Epitope, die uns
im Rahmen einer zu diesem Projekt etablierten Kooperation mit der Arbeitsgruppe
von Rick Thorne (Newcastle, Australien) zur Verfügung gestellt wurden, weiter
charakterisiert. So konnte ich zeigen, dass die sogenannte duale Prozessierung, die
von Thorne und anderen beschrieben wurde un zu einem nicht-kovalent gebundenen
membranständigen Fat1-Heterodimer und einer löslichen Ektodmäne und einem Cterminalen Restfragment (p65) führt, auch in Pankreaskarzinomzelllinien stattfindet.
Fat1 wird also, wie andere Cadherine auch, durch Ektomänen-Shedding in eine
lösliche Form gebracht. Mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und siRNA-Knockdown
experimenten konnte ich zeigen, dass besonders ADAM10 und zu einem Teil auch
ADAM9 eine Rolle beim Fat1-Ektodomänen-Shedding spielen. Gleichzeitig weisen
Sequenzmapping-Analysen massenspektrometrisch untersuchter Proben darauf hin,
dass das Ektodomänen-Shedding am Volle-Länge-Protein stattfindet, da die
identifizierten Peptide noch unterhalb der Furinschnittstelle liegen, die zum
Heterodimer führt.
152
Die Rolle der Furintyp Protease PCSK5 an der dualen Prozessierung von Fat1 bleibt
in weiteren Experimenten zu überprüfen.
Bioinformatische Auswertungen umfangreicher publizierter mRNA-Profildaten aus
menschlichen Pankreaskarzinomen und korrespondierendem Normalgewebe durch
unseren Kooperationsparter haben gezeigt, dass in vivo sowohl Fat1 als auch seine
Sheddase ADAM10 in Pankreaskarzinomen überexprimiert sind. Die Überexpression
konnte auch durch Western Blots von drei Probenpaaren kryokonservierter
Gewebeproben auf Proteinebene bestätigt werden.
Auch konnte ich in einzelnen Serumproben von Pankreaskarzinompatienten das
lösliche Fat1 im Western Blot nachweisen, woraufhin wir mit Unterstützung der
australischen Arbeitsgruppe einen ELISA etabliert und für die Messung einer kleinen
Serumkohorte verwendet haben. Trotz der bisher geringen Sensitivität (20%) von
Fat1 als Serummarker, zeigten vier Proben mit hohem Fat1-Level keinen erhöhten
CA19-9-Level. CA19-9 ist der einzige klinisch gebräuchliche Serummarker zur
Verlaufskontrolle bei Pankreaskarzinomen und wird von Patienten ohne LewisAntigen nicht exprimiert; dies führt dazu, dass der Marker für etwa 10% der Patienten
nutzlos ist. Ob Fat1 in der Lage ist, diese Lücke als Teil eines Markerpanels zu füllen,
bleibt in weiteren Analysen mit größeren Kollektiven und konsekutiven Serumproben
zu überprüfen.
153
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171
Anhang
Die nachfolgenden Tabellen beinhalten jeweils die 50 abundantesten Proteine jeder
CoIP sowie die korrespondierenden Werte der Ausgangsproben. Kontaminanten, die
sich über alle Scheibchen erstreckt haben, wurden vorher aussortiert.
Seq.
SC
SC
PEP-Wert
Cov. [%]
IP1 Lyast1
Proteinname
MW [kDa]
Gensymbol
Filamin B
281,63
49,5
0
112
280
FLNB; FLN1L
Keratin 4
63,91
47,5
0
71
2
KRT4; CYK4
Keratin 13
49,588
51,5
2,95E-251
68
2
KRT13
Fatty acid synthase
273,42
37,3
0
56
115
FASN; FAS
Myosin-9
226,53
38,4
0
39
68
MYH9
Keratin 8
53,704
61,1
0
37
36
Filamin-A
280,74
35,3
0
37
151
ATP synthase subunit beta
56,559
63,9
0
36
81
Annexin A1
38,714
57,8
9,56E-287
31
23
Keratin 18
Heat Shock 70 kDa protein
8
Cadherin-17
48,057
57,4
3,81E-302
28
22
70,897
50,8
0
27
152
92,204
25,5
4,86E-251
22
17
KRT8; CYK8
FLNA; FLN;
FLN1
ATP5B; ATPMB;
ATPSB
ANXA1;
ANX1
KRT18; CYK18
HSPA8;
HSC70
CDH17
40S ribosomal protein S18
17,718
53,3
1,49E-59
19
20
Clathrin heavy chain 1
191,61
27,9
0
17
45
60S ribosomal protein L23a
17,695
51,9
4,05E-98
15
34
ATP-citrate synthase
120,84
31,7
0
15
55
Serum albumin
71,704
16,7
3,07E-67
15
17
Prohibitin-2
33,296
56,9
3,14E-159
13
17
40S ribosomal protein SA
33,313
26,7
1,12E-157
13
12
73,68
41,8
0
12
61
RPS18
CLTC; CLH17;
CLTCL2
RPL23A
ACLY
ALB; GIG20;
GIG42
PHB2; BAP;
REA
RPSA;LAMBR;
LAMR1
HSPA9; GRP75;
HSPA9B
Stress-70 protein,
mitochondrial
Transferrin receptor protein
1
Keratin 19
84,87
31,6
4,79E-222
12
34
TFRC
44,091
48,5
4,75E-208
12
3
Alpha-amylase 1
57,767
12,9
1,47E-79
12
Eukaryotic translation
initiation factor 3 subunit A
166,57
8,3
2,64E-48
11
12
40S ribosomal protein S4,
29,597
42,6
1,94E-109
10
28
45,26
51,9
1,43E-292
10
66
99,028
17
3,80E-59
10
12
KRT19
AMY1A;
AMY1;
EIF3A;
EIF3S10
RPS4X;
CCG2
ALDOA;
ALDA
EIF3B;
Fructose-bisphosphate
aldolase A
Eukaryotic translation
172
initiation factor 3 subunit B
EIF3S9
Keratin 78
56,865
15,8
8,74E-44
10
Protein S100-A9
13,242
32,5
2,56E-27
9
Myosin light polypeptide 6
Cullin-associated NEDD8dissociated protein 1
26,707
32,4
1,35E-96
9
17
KRT78; K5B
S100A9;
CAGB
MYL6
136,37
20,9
1,15E-163
9
50
CAND1
Histone H4
11,367
50,5
2,43E-28
9
6
25,792
22,5
1,83E-34
9
11,428
38,8
2,46E-84
8
11
157,9
30,1
0
8
119
112,92
24,8
2,57E-224
8
44
51,028
30
3,15E-129
8
19
72,777
32,4
5,69E-180
8
16
Histone H2A
15,144
24,5
3,39E-41
8
8
40S ribosomal protein S19
Dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase
48 kDa subunit
Transitional endoplasmic
reticulum ATPase
16,06
27,6
4,96E-17
7
5
H2AFX;
H2AX
RPS19
50,8
18,4
3,26E-40
7
6
DDOST
89,321
38,7
0
7
58
VCP
Annexin A11
45,728
33,3
2,06E-128
7
22
Peroxiredoxin-6
25,035
36,6
2,80E-81
7
16
Zymogen granule protein 16
homolog B
22,739
23,1
1,19E-39
7
ZG16B
Esophagin
18,154
28,4
1,26E-23
7
SPRR3;
SPRC
7
69,283
23,1
6
10
RPN2
4
38,05
17,3
6
6
5
17,256
46,2
6
7
1
34,362
28,3
6
19
CALU
RPL26L1;
RPL26P1
RPL5
Salivary acidic proline-rich
phosphoprotein 1/2
ATP synthase subunit g,
mitochondrial
Leucine-rich PPR motifcontaining protein
Neutral alpha-glucosidase
AB
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein K
Dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase
subunit 1
Dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase
subunit 2
Calumenin, isoform CRA
60S ribosomal protein L26like 1
60S ribosomal protein L5
HIST1H4A;
H4/A; H4FA
PRH1;
PRH2
ATP5L
LRPPRC;
LRP130
GANAB;
G2AN
HNRNPK;
HNRPK
RPN1
ANXA11;
ANX11
PRDX6;
AOP2
Tab. 14: Die 50 abundantesten Proteine der IP1 ermittelt anhand der Spectral Counts (SC). Als
Vergleich dienen die SCs des korrespondierenden Lysats.
173
Proteinname (englisch)
MW [kDa]
Seq.
Cov. [%]
PEP-Wert
SC
IP2
SC
Lysat
2
Gensymbol
Myosin-9
Fatty acid synthase;[Acylcarrier-protein] Sacetyltransferase
Cadherin-17
226,53
47,6
0
64
117
MYH9
273,42
40,6
0
55
163
FASN; FAS
92,204
46,5
0
42
56
CDH17
Elongation factor 2
95,337
46,7
0
24
84
Clathrin heavy chain 1
191,61
16,1
4,97E-162
21
27
EEF2; EF2
CLTC; CLH17;
CLTCL2
57,936
57,3
0
19
98
PKM2; PK2;
69,842
47,8
9,16E-207
18
28
XRCC6; G22P1
56,559
69,8
0
18
42
ATP5B; ATPMB
Filamin B
281,63
52,4
0
16
181
FLNB
Keratin 8
53,704
32,7
5,95E-68
16
11
Leukocyte elastase inhibitor
42,741
48,5
4,52E-122
15
22
KRT8; CYK8
SERPINB1;
ELANH2
113
22,5
1,29E-227
15
37
ATP1A1
16,445
57,5
5,65E-32
14
12
RPS16
40S ribosomal protein S18
Very-long-chain specific
acyl-CoAdehydrogenase
Fatty acid-binding protein,
liver
Heat shock protein 75 kDa
Heat shock cognate 71 kDa
protein
Annexin A2
17,718
53,9
1,33E-46
13
12
RPS18
75,209
32,1
9,64E-144
13
23
ACADVL; VLCAD
15,092
86,6
4,65E-234
13
76
FABP1; FABPL
80,109
35,2
4,47E-141
13
22
TRAP1; HSP75
70,897
45,2
0
13
53
HSPA8; HSC70
40,411
69,7
0
13
86
ANXA2; ANX2
60S ribosomal protein L3
Glucose-6-phosphate
isomerase
ATP synthase subunit alpha
46,108
24,8
6,58E-13
11
1
RPL3
64,324
20,2
8,58E-81
11
1
GPI
59,75
28,2
9,06E-152
11
13
ATP5A1; ATP5A
Myosin light polypeptide 6
Heat shock protein beta1FLJ52243, highly similar to
Heat-shock protein beta-1
ATP-dependent DNA
helicase 2 subunit 2
Aspartyl-tRNA synthetase
26,707
35,3
9,12E-78
10
11
MYL6
22,782
67,8
6,43E-96
10
23
HSPB1; HSP27
82,704
26,6
1,78E-101
10
22
XRCC5; G22P2
57,136
21,6
8,46E-44
9
Keratin 19
Myosin regulatory light
chain MRCL3 variant
40S ribosomal protein S3
44,091
37,2
5,65E-78
9
9
KRT19
20,457
66,7
3,18E-82
9
12
MYL12A; MLCB
26,688
53,1
2,72E-106
9
15
RPS3
Alpha-1-antitrypsin
46,736
25,8
2,60E-56
8
SERPINA1
Keratin 18
Protein disulfide-isomerase
A6
Asparagine synthetase
[glutamine-hydrolyzing]
48,057
23
1,46E-40
8
KRT18; CYK18
53,9
27
5,07E-109
8
6
PDIA6; TXNDC7
64,369
15,7
1,79E-26
8
5
ASNS; TS11
Pyruvate kinase isozymes
M1/M2
ATP-dependent DNA
helicase 2 subunit 1
ATP synthase subunit beta
Sodium/potassiumtransporting ATPase alpha1 chain
40S ribosomal protein S16
174
DARS; PIG40
Elongation factor 1-gamma
Guanine nucleotide-binding
protein subunit beta-2-like 1
40S ribosomal protein S4
56,149
10,1
1,54E-32
8
6
EEF1G; EF1G
35,076
23,3
4,02E-48
8
7
GNB2L1; HLC7
29,597
34,6
1,31E-55
8
9
RPS4X;CCG2
Cystatin-A
Dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase
48 kDa subunit
Histone H2A
11,006
68,4
9,97E-45
7
CSTA; STF1
50,8
16,2
3,41E-38
7
DDOST
15,144
24,5
7,22E-22
7
6
H2AFX; H2AX
40S ribosomal protein S13
Eukaryotic initiation factor
4A-I
Septin-2
17,222
39,1
2,52E-31
7
4
RPS13
46,153
32,5
3,83E-131
7
4
EIF4A1
45,46
28,5
1,02E-66
7
4
SEPT2
60S ribosomal protein L11
Actin-related protein 2/3
complex subunit 4
40S ribosomal protein S19
20,252
24,2
4,59E-30
7
7
RPL11
21,588
36,9
5,97E-36
7
7
ARPC4
16,06
49,7
1,58E-18
7
11
RPS19
Elongation factor 1-delta
71,407
16,1
1,78E-67
7
15
EEF1D
Epiplakin
555,61
23,8
3,17E-182
7
22
EPPK1
Serotransferrin
77,049
9,5
2,69E-41
6
TF
AP-1 complex subunit mu-2
Trifunctional enzyme
subunit beta
48,209
13,2
8,52E-28
4
AP1M2
51,294
8,4
2,57E-10
4
HADHB
Tab. 15: Die 50 abundantesten Proteine der IP2 ermittelt anhand der Spectral Counts (SC). Als
Vergleich dienen die SCs des korrespondierenden Lysats.
175
Proteinname
MW [kDa]
Seq.
Cov. [%]
PEP-Wert
SCI
P3
SC
Lysat
3
Gensymbol
Cadherin-17
92,204
47,4
0
55
11
CDH17
Clathrin heavy chain 1
[Acyl-carrier-protein] Sacetyltransferase
Alpha-tubulin 6
Sodium/potassiumtransporting ATPase alpha1 chain
191,61
42,4
0
49
118
CLH17; CLTC
273,42
51
0
33
280
FAS; FASN
49,895
52,6
4,40E-201
30
90
TUBA1C; TUBA6
113
34,1
0
29
39
ATP1A1
Heat shock 84 kDa
83,263
61
0
28
136
Elongation factor 1-alpha 1
50,14
47,8
1,90E-221
27
110
HSP90AB1;
HSP90B
EEF1A;EEF1A1
Chaperonin 60
61,054
64,9
0
25
173
HSP60; HSPD1
Tubulin beta-7 chain
47,766
61
3,58E-199
24
56
TUBB2B
L-lactate dehydrogenase
39,837
85,9
0
22
140
LDHA; PIG19
Elongation factor Tu
49,874
51,2
3,19E-178
21
33
TUFM
ATP synthase subunit alpha
59,75
43,2
9,90E-240
19
44
ATP5A; ATP5A1
Annexin A4
36,085
70,1
0
19
30
ANXA4; ANX4
Actin
Puromycin-sensitive
aminopeptidase
Annexin A2
41,792
79,7
0
17
158
ACTB; ACTG
103,28
26
6,48E-122
17
16
NPEPPS; PSA
40,411
59,7
0
16
34
ANX2; ANX2L4
Coatomer subunit gamma
3-hydroxy-3-methylglutaryl
coenzyme A synthase
GCN1-like protein 1
Bifunctional aminoacyltRNA synthetase
6-phosphofructokinase type
C
CCT-alpha
97,717
27,8
6,13E-97
15
27
COPG; COPG1
56,635
40,9
3,62E-166
15
59
HMGCS2
292,74
20,4
1,45E-242
14
54
GCN1L1
170,6
28,4
1,45E-242
14
37
EPRS; GLNS
85,595
44,5
0
14
45
PFKF; PFKP
60,343
39,2
1,60E-133
13
28
CCT1; CCTA
6-phosphofructokinase
85,018
42,9
0
12
51
PFKL
Elongation factor 2
DNA-dependent protein
kinase catalytic subunit
ATP synthase subunit beta
70 kDa mitochondrial
autoantigen of primary
biliary cirrhosis
Heat shock 70 kDa protein
9
Cullin-associated and
neddylation-dissociated
protein 1
CCT-eta
95,337
57,9
0
12
115
EEF2; EF2
469,08
15,3
0
11
45
HYRC; HYRC1
56,559
43,3
4,14E-227
11
48
ATP5B; ATPMB
68,996
22,6
1,01E-70
11
4
DLAT; DLTA
73,68
59,2
0
10
55
GRP75; HSPA9
136,37
23,3
1,67E-118
10
33
CAND1
59,366
41,3
2,86E-265
10
26
CCT7; CCTH
Keratin 19
44,091
37,8
4,15E-123
9
1
KRT19
Alpha-coat protein
139,32
20,8
2,18E-172
8
31
COPA
Sulfid
Cell proliferation-inducing
gene 21 protein
49,96
30
3,27E-134
8
9
CGI-44; SQRDL
35,076
86,1
4,32E-264
8
25
GNB2L1; HLC7
176
Acute morphine
dependence-related protein
2
General vesicular transport
factor p115
Beta-coat protein
58,024
25
1,45E-171
8
19
CCT6; CCT6A
109,19
10,4
1,44E-62
8
6
USO1; VDP
102,49
14,6
2,71E-64
8
10
COPB2
Cellular myosin heavy chain
226,53
48
0
7
191
MYH9
Beta-coat protein
107,14
15
2,19E-119
7
19
COPB; COPB1
CYPLI
L-lactate dehydrogenase B
chain
130 kDa leucine-rich protein
Pyruvate dehydrogenase
E1 component subunit beta
Glycogen phosphorylase
Phosphoenolpyruvate
carboxykinase
60S acidic ribosomal
protein
37 kDa laminin receptor
precursor
Medium tumor antigenassociated 61 kDa protein
Alpha-tubulin 1
Glycine
hydroxymethyltransferase
57,278
22,8
2,21E-57
7
5
CYP51; CYP51A1
36,638
75,4
0
6
39
LDHB
157,9
36,7
8,95E-246
6
62
LRP130; LRPPRC
39,233
42,6
1,83E-108
6
7
PDHB; PHE1B
96,695
29,9
1,29E-108
6
31
PYGB
70,729
28,8
2,71E-95
6
20
PCK2; PEPCK2
34,273
52,7
1,61E-117
6
20
RPLP0
33,313
39,3
9,01E-74
6
14
LAMBR; LAMR1
65,308
29,7
2,98E-145
6
11
PPP2R1A
49,924
49,6
7,69E-176
6
10
TUBA1; TUBA4A
55,992
27,2
1,02E-68
6
6
SHMT2
Tab. 16: Die 50 abundantesten Proteine der IP3 ermittelt anhand der Spectral Counts (SC). Als
Vergleich dienen die SCs des korrespondierenden Lysats.
177
MW [kDa]
Seq.
Cov. [%]
PEP-Wert
SC
IP4
SC
Lysat
3
Gensymbol
273,42
51
0
109
280
FAS; FASN
226,53
48
0
82
191
MYH9
39,837
85,9
0
79
140
LDHA; PIG19
532,4
26,9
0
54
99
DHC1; DNCH1
191,61
42,4
0
53
118
CLH17; CLTC
Cadherin-17
92,204
47,4
0
49
11
CDH17
MYH14 variant protein
232,01
27,8
0
43
34
FP17425; MYH14
60 kDa chaperonin
DNA-dependent protein
kinase catalytic subunit
Elongation factor 1-alpha 1
61,054
64,9
0
41
173
HSP60; HSPD1
469,08
15,3
0
29
45
HYRC; HYRC1
50,14
47,8
1,90E-221
28
110
Heat shock 84 kDa
83,263
61
0
27
136
GCN1-like protein 1
292,74
20,4
1,45E-242
27
54
EEF1A; EEF1A1
HSP90AB1;
HSP90B
GCN1L1
LDH heart subunit
36,638
75,4
0
26
39
LDHB
Filamin B
281,63
51,7
0
26
168
FLNB; FLN1L
18 kDa phosphoprotein
18,502
80,7
2,30E-274
25
82
CFL; CFL1
CCT-gamma
Bifunctional aminoacyltRNA synthetase;
Villin-1
6-phosphofructokinase type
C
130 kDa leucine-rich protein
Aldehyde dehydrogenase
family 18 member A1
Elongation factor Tu,
GDP-D-mannose
dehydratase
Heat shock 70 kDa protein
8
Alu corepressor 1
60,533
33,2
2,08E-65
23
23
CCT3; CCTG
170,6
28,4
1,45E-242
19
37
EPRS; GLNS
92,694
43
1,21E-202
19
46
VIL; VIL1
85,595
44,5
0
18
45
PFKF; PFKP
157,9
36,7
8,95E-246
18
62
LRP130; LRPPRC
87,301
46,7
1,27E-268
18
44
ALDH18A1; GSAS
49,874
51,2
3,19E-178
17
33
TUFM
41,949
57
3,98E-87
17
8
GMDS
70,897
66,1
0
16
87
HSC70; HSP73
22,026
56,1
1,53E-156
15
36
ACR1; PRDX5
Annexin A4
36,085
70,1
0
14
30
ANXA4
6-phosphofructokinase
Heat shock 70 kDa protein
9
Alpha-coat protein
85,018
42,9
0
14
51
PFKL
73,68
59,2
0
13
55
GRP75; HSPA9
139,32
20,8
2,18E-172
13
31
COPA
Isocitrate dehydrogenase
50,909
36,5
6,30E-154
13
23
IDH2
28 kDa heat shock protein
22,782
75,6
7,45E-130
13
22
HSP27; HSP28
Cyclophilin A
Cullin-associated and
neddylation-dissociated
protein 1
Myosin light chain 6
18,012
78,2
6,77E-213
13
53
CYPA; PPIA
136,37
23,3
1,67E-118
12
33
CAND1
26,707
30,3
2,43E-136
12
21
MYL6
Actin-binding protein 280
280,74
8,8
8,87E-70
12
8
FLN; FLN1
T-complex protein 1 subunit
60,343
39,2
1,60E-133
11
28
CCT1; CCTA
Proteinname
[Acyl-carrier-protein] Sacetyltransferase
Cellular myosin heavy
chain, type A
L-lactate dehydrogenase
Cytoplasmic dynein 1 heavy
chain 1
Clathrin heavy chain 1
178
alpha
40S ribosomal protein S3
B-cell receptor-associated
protein 31
40S ribosomal protein S13
Sulfide:quinone
oxidoreductase
Cell proliferation-inducing
gene 21 protein
Pyruvate dehydrogenase
E1 component subunit beta
Phosphoenolpyruvate
carboxykinase
Long-chain acyl-CoA
synthetase 5
ATP synthase subunit O
29,945
48,9
2,48E-151
11
17
FTE1; MFTL
34,752
34,8
6,43E-111
11
8
BCAP31
17,222
45,7
2,40E-50
11
13
RPS13
49,96
30
3,27E-134
10
9
CGI-44; SQRDL
35,076
86,1
4,32E-264
10
25
GNB2L1; HLC7
39,233
42,6
1,83E-108
10
7
PDHB; PHE1B
70,729
28,8
2,71E-95
10
20
PCK2; PEPCK2
82,262
29,2
8,01E-87
10
15
ACS5; ACSL5
23,277
57,3
1,50E-141
10
12
ATP5O; ATPO
60S ribosomal protein L17
Natural killer cell-enhancing
factor A
Dolichyldiphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase
48 kDa subunit
Cytokeratin-19
14,865
62,1
8,89E-143
10
13
RPL23
22,11
76,9
1,17E-96
10
39
PAGA; PAGB
50,8
35,3
1,55E-96
10
5
DDOST
44,091
37,8
4,15E-123
9
1
KRT19
Tab. 17: Die 50 abundantesten Proteine der IP4 ermittelt anhand der Spectral Counts (SC). Als
Vergleich dienen die SCs des korrespondierenden Lysats.
179
Die nachfolgenden Tabellen enthalten die mRNA-Expressionsdaten zu allen ADAMs
und PCSK-Proteine, die in den Pankreaskarzinomzelllinien und HPDE identifiziert
werden konnte.
Gensymbol
HPDE
A1814
BxPc3
Panc1
Paca44
MiaPaCa2
ADAM10
7,63
9,93
9,41
7,49
7,92
8,87
ADAM11
4,42
4,45
4,64
5,11
5,21
5,39
ADAM12
4,22
4,38
4,50
4,55
4,68
4,87
ADAM15
7,51
7,62
8,31
7,32
7,38
7,76
ADAM17
8,72
8,86
7,38
8,79
8,99
8,69
ADAM18
2,58
2,59
2,59
2,75
2,66
2,96
ADAM19
4,19
6,69
4,98
5,07
8,19
4,49
ADAM2
2,32
2,38
2,30
2,44
2,38
2,42
ADAM20
4,48
4,77
4,72
4,68
4,70
4,93
ADAM21
3,93
3,70
3,72
3,79
3,83
4,42
ADAM21
3,24
3,06
3,35
3,23
3,30
3,43
ADAM22
4,72
5,40
4,37
5,37
4,41
6,21
ADAM23
5,02
6,13
5,41
5,45
5,26
5,61
ADAM28
5,07
4,85
6,05
5,38
5,63
5,48
ADAM29
3,43
3,40
3,20
3,51
3,38
3,56
ADAM30
4,02
4,16
4,10
4,28
4,29
4,55
ADAM32
2,42
2,44
2,68
2,55
2,61
2,88
ADAM33
6,17
6,45
6,32
6,20
6,13
5,96
ADAM3A
2,53
2,65
2,58
2,66
2,61
2,85
ADAM5P
3,06
3,07
3,05
3,13
3,14
3,52
ADAM6
3,38
3,60
3,55
3,62
3,60
3,91
ADAM7
3,31
3,29
3,33
3,28
3,48
3,78
ADAM8
6,35
5,47
8,40
5,04
7,68
5,90
ADAM9
11,16
11,67
11,64
10,25
11,83
11,32
ADAMDEC1
2,52
2,70
2,60
2,56
2,76
2,77
ADAMTS1
6,58
3,50
8,42
4,04
6,66
3,71
ADAMTS10
5,47
5,53
5,61
5,80
5,60
6,12
ADAMTS12
4,28
4,48
9,14
4,55
4,73
4,84
ADAMTS13
5,74
5,94
5,91
6,18
5,97
6,11
ADAMTS14
3,86
4,13
4,17
4,19
4,21
4,57
ADAMTS15
3,38
3,57
3,56
3,73
3,48
3,89
ADAMTS16
4,02
3,98
4,16
4,22
3,93
4,44
ADAMTS17
5,16
3,46
3,64
3,62
4,52
3,92
ADAMTS18
3,26
3,25
3,37
3,36
3,73
3,60
ADAMTS19
3,05
3,24
3,05
3,08
3,14
3,33
ADAMTS2
4,08
4,21
4,24
4,21
4,10
4,82
ADAMTS20
2,47
2,67
3,43
2,72
2,61
2,69
180
ADAMTS3
2,72
2,58
2,60
2,63
2,57
2,61
ADAMTS4
4,72
5,01
4,74
5,23
5,07
5,42
ADAMTS5
2,68
2,65
2,65
2,85
2,63
2,90
ADAMTS6
3,18
3,04
3,36
3,24
3,47
3,37
ADAMTS7
5,27
5,15
5,46
5,77
5,62
5,78
ADAMTS8
5,15
4,50
4,72
4,99
4,98
4,90
ADAMTS9
3,95
4,05
4,10
4,23
4,20
4,19
ADAMTSL1
4,38
4,46
4,39
4,65
4,72
4,54
ADAMTSL2
3,52
3,55
3,52
3,56
3,59
3,81
ADAMTSL3
4,18
4,26
4,13
4,46
4,35
4,56
ADAMTSL4
4,72
4,49
5,35
4,81
4,67
5,09
ADAMTSL5
4,36
4,55
4,67
4,95
4,77
5,10
Tab. 18: mRNA-Expressionsdaten aller ADAM-Proteine, die in den in dieser Arbeit verwendeten
Pankreaskarzinomzelllinien und HPDE exprimiert werden.
Eine mRNA gilt als zuverlässig exprimiert, wenn die Signalstärke >5 ist.
Gensymbol HPDE A1814 BxPc3 Panc1 Paca44 MiaPaCa2
PCSK1
2,60
2,36
2,47
2,28
2,35
2,44
PCSK1N
5,27
4,71
4,46
5,60
4,41
6,49
PCSK2
3,38
3,40
3,41
3,63
3,47
3,79
FURIN
6,53
6,58
6,56
6,64
7,06
6,39
PCSK4
5,79
6,12
5,96
6,15
6,11
6,50
PCSK5
2,97
6,43
6,25
3,15
7,43
3,38
PCSK6
7,13
7,97
7,87
5,26
5,17
6,84
PCSK7
7,74
7,69
7,68
7,64
7,66
7,51
PCSK9
8,91
5,47
9,32
5,37
8,57
5,01
Tab. 19: mRNA-Expressionsdaten aller PCSK-Proteine, die in den in dieser Arbeit verwendeten
Pankreaskarzinomzelllinien und HPDE exprimiert werden.
Eine mRNA gilt als zuverlässig exprimiert, wenn die Signalstärke >5 ist.
181
Die nachfolgende Abbildungen zeigen die Originaldaten der Northern Blots die zur
Überprüfung des ADAM9-Knockdowns und des PCSK5-Knockdowns erstellt wurden,
sowie die Sequenzabdeckung einer massenspektrometrischen Analyse der Fat1Bande aus einer Sekretompräparation der Zelllinie MelCV-345:
Abb. 38: Northern Blot der siRNA-Versuche.
Sofern vorhanden, wurden 6 µg RNA aufgetragen. Proben, deren RNA-Menge zu gering waren,
wurden nicht aufgetragen. Als Kontrolle (K) wurden die Zellen für 48 h mit 30 nMol nonTarget-siRNA
(Dharmacon) inkubiert. Es wurden Einfachknockdowns für ADAM9 (A9) und PCSK5 (P5) sowie
Mehrfachknockdowns der beiden Proteasen und in Kombination mit ADAM10 (A10) durchgeführt. Da
bei einigen Durchgängen die RNA-Konzentration der Proben zu gering war, konnten diese nicht
analysiert werden, sodass die anderen Proben als improvisierte Kontrolle wirken.
182
Abb. 39: Sequenzabdeckung der massenspektrometrisch identifizierten Fat1-Peptide aus dem
Sekretom der Zelllinie MelCV-345.
Alle identifizierten Proteine sind in grünen Buchstaben markiert. Die mögliche Furin-Schnittstelle ist mit
einem
schwarzen
Strich
und
die
Transmembrandomäne
mit
einem
schwarzen
Kasten
gekennzeichnet. Es ist deutlich erkennbar, dass die identifizierten Peptide über die mögliche
Furin-Schnittstelle (Sadeqzadeh et al., 2011) hinaus gehen.
183
Die nachfolgende Tabellen enthalten die Daten aller Patienten, deren Serum im
Rahmen des Fat1-ELISAs verwendet wurde:
a) Pankreaskarzinompatienten
UICC-Stadium
Fat1
CA19-9
Alter
Geschlecht
IB
0,96
202,6
66
W
IIA
1,19
104,8
46
W
IIA
1,26
64
W
IIA
2,02
585
62
M
IIA
1,66
67,3
76
W
IIB
50,85
11,7
68
M
IIB
4,01
2
82
W
IIB
19,14
105,6
66
W
IIB
1,05
1.000
73
M
IIB
0,98
1.977
66
M
III
1,29
54
W
IIIB
1,40
3.897,00
65
W
IV
5,54
4.605,50
71
M
IV
1,09
1.627
54
M
IV
11,41
20.001
61
W
IV
1,72
20.000
87
M
IV
1,43
716,7
48
M
IV
1,32
1.317
39
W
IV
1,82
2,3
33
M
IV
1,69
60
M
IV
1,17
191,9
82
M
IV
1,29
67,5
68
M
IV
1,50
1,729
76
M
IV
1,12
41.051,00
51
M
IV
2,20
2.438
23
W
IV
6,08
15.767
81
M
IV
1,11
18.378
53
W
IV
1,49
16
61
M
IV a
1,58
80
M
IV
1,58
82
M
12.223
184
b) Kontrollpatienten
Kontrolle
Fat1
K
CA19-9
Alter
Geschlecht
2,54
72
M
K
2,55
81
W
K
5,55
30
M
K
1,31
79
M
K
1,54
43
M
K
1,27
33
M
K
1,24
67
M
K
2,02
65
M
K
2,67
79
M
K
1,46
52
M
K
1,18
68
W
K
1,40
64
M
K
7,78
57
M
K
1,37
48
M
K
1,55
52
M
K
1,16
83
W
K
1,83
17
W
K
2,30
75
W
K
1,67
37
W
K
2,14
72
W
K
1,36
81
M
K
2,11
30
W
K
3,59
69
W
K
2,36
32
M
K
1,14
W
K
1,16
M
0,5
0,6
50,5
4,9
6,7
185
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ADAM
a disintegrin an metalloprotease
APC
Adenomatosis polyposis coli
APS
Ammoniumperoxodisulfat
ATCC
American Type Culture Collection
bp
Basenpaare
cDNA
complementary DNA
CEA
Carcinoembryonicantigen
CHAPS
(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamino]-propansulfat)
CoIP
Co-Immunopräzipitation
C-terminal
Carboxyterminal
D10
Dulbeccos modified Eagles medium mit 10% FCS
dATP
2'Desoxyriboadenosin-5'-Triphosphat
DEPC
Diethylprocarbonat
DMEM
Dulbeccos modified Eagles Medium
DMP
Dimethyl pimelimidate
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTP
2'Desoxyribonukleotid-5'-Triphosphat
DSP
Dithiobis[succinimidyl]propionate
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGF
Epidermal growth factor
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
186
FCS
Fetal calf serum
KFSM
Keratinocyte serum-free medium
GAPDH
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
HPDE
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line
IP
Immunopräzipitation
Kb
Kilobase
kDa
kilo Dalton
MMP
Matrixmetalloprotease
MOPS
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
mRNA
messenger RNA
MVB
multivesicular bodies
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR
polymerase chain reaction
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
RNA
Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
SDS
Sodiumdodecylsulfat
shRNA
small hairpin RNA
siRNA
small interfering RNA
SSC
Standard Saline Citrate
Tab.
Tabelle
TEA
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TEMED
Tetramethylethylethylendiamin
Tris
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UICC
Union international contre le cancer
UV
Ultraviolett
187
V
Volt
v/v
volume per volume (Volumenanteil)
w/v
weight per volume (Gewichtsanteil)
188
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau PD. Dr. Irmgard Schwarte-Waldhoff für die
Möglichkeit, meine Doktorarbeit in ihrer Arbeitsgruppe anzufertigen und für die
hervorragende Betreuung der Arbeit. Sie erlaubte mir eine sehr eigenständige
Bearbeitung meiner Themen und war jederzeit bereit Fragen und Probleme zu
diskutieren. Ich danke ihr auch besonders dafür, dass sie ein Treffen mit den
Kooperationspartnern in Newcastle (Australien) möglich gemacht hat.
Danke auch an Herrn. Prof. Dr. Rolf Heumann für die freundliche Bereitschaft, das
Zweitgutachten dieser Arbeit zu übernehmen.
Ich möchte mich auch bei allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des IMBL für
das wundervolle Arbeitsklima und die gute Zusammenarbeit bedanken. Ganz
besonders Bedanken möchte ich mich bei Dr. Jakob Weiß, der mir jederzeit mit Rat
und Tat zur Seite stand. Danke auch an Dr. Heiko Becker für die Einführung in die
RNA-Profiling-Daten. Frau Dr. Susanne Klein-Scory danke ich für die methodischen
Ratschläge und die Unterstützung bei der Auswertung der massenspektrometrischen
Daten. Kamila Adamczyk und Bassel Malas möchte ich für die Hilfs- und
Diskussionsbereitschaft danken. Zudem bedanke ich mich bei Sabine Hoppe, Maike
Platzek und besonders Christina Eilert-Micus für die Bereitschaft, mir mit Rat und Tat
zur Seite zu stehen.
Ein herzliches Dankeschön möchte ich Herrn Dr. Rick Thorne für die gute Betreuung
während
meines Besuchs
in
seiner Arbeitsgruppe,
die Bereitstellung
der
Fat1-Antikörper und auch der tatkräftigen Unterstützung bedanken. Danke auch an
Dr. Charles deBock für die Diskussionsbereitschaft und Betreuung.
189
Ebenfalls herzlich bedanke ich mich bei Frau Dr. Silke Oeljeklaus für die Erstellung
und Zusammenstellung der Proteinkataloge zur Identifikation möglicher Cadherin17-Interaktionspartner.
Herrn Prof. Dr. Schmiegel danke ich für die finanzielle Unterstützung und das
Interesse an meiner Arbeit.
Herzlich danken möchte ich auch Herrn PD Dr. Reinhard Gessner für die
Bereitstellung des EP777-Antikörpers.
Danken möchte ich auch Herrn Prof. Dr. Andreas Ludwig für die Bereitstellung des
ADAM10-Inhibitors.
Frau Anette Sommer und Herrn Hans-Dieter Pohlenz möchte ich für die
Bereitstellung
der
mRNA-Profilingdaten
(Affymetrix)
der
verwendeten
Pankreaskarzinomzelllinien und HPDE danken.
Danke auch an Frau Dr. Hanna Diehl für die massenspektrometrischen Analysen der
Serumproben.
Danke an alle meine Freunde, besonders Lisa Feyerabend, Carina Tepper und
Rafael Klosowski mit deren Unterstützung ich immer rechnen konnte.
Meinen Eltern und meinem Bruder danke ich von ganzen Herzen für die liebevolle
Unterstützung und ihrem Interesse an meiner Arbeit.
190
Publikationen und Konferenzbeiträge
Nathalie Wojtalewicz, Elham Sadeqzadeh, Jakob Weiß, Mahnaz Moradian Tehrani,
Susanne Klein-Scory, Stephan Hahn, Wolff Schmiegel, Uwe Warnken, Charles E.
deBock, Martina Schnölzer, Rick F. Thorne, Irmgard Schwarte-Waldhoff
Secretome analysis for biomarker discovery reveals high levels of soluble Fat1
cadherin released from pancreatic cancer cells. (Eingereicht beim Journal of
Molecular Medicine)
Jakob Weiß, Susanne Klein-Scory, Nathalie Wojtalewicz, Hanna Diehl, Ingo Stricker,
Johanna Mundig, Wolff Schmiegel, Andreas Ludwig, Reinhard Gessner, Irmgard
Schwarte-Waldhoff
Adam10-mediated ectodomain shedding of the intestine-specific cadherin-17 is
associated with increased serum levels of sCad-17 in colorectal cancer
patients. (Manuskript in Überarbeitung)
Susanne Klein-Scory, Mahnaz MoredianTherani, Nathalie Wojtalewicz , Christina
Eilert-Micus, Sabine Hoppe, Uwe Warnken, Agnes Hotz-Wagenblatt, Wolff
Schmiegel, Stephan A Hahn, Martina Schnölzer, Irmgard Schwarte-Waldhoff
Proteomics analysis of pancreatic cancer secretomes – implications for
biomarkers. (Manuskript in Arbeit)
Elham Sadeqzadeh , Charles deBock , Nathalie Wojtalewicz , Matthew Dun , Nathan
Smith , Irmgard Schwarte-Waldhoff, Dr. Rick Thorne
Furin processing dictates ectodomain shedding of human FAT1 cadherin.
(Eingereicht beim Journal of Biological Chemistry)
191
Konferenzbeiträge:
Nathalie Wojtalewicz, Mahnaz Moradian, Susanne Klein-Scory, Jakob Weiß, Uwe
Warnken, Wolff Schmiegel, Martina Schnölzer, Irmgard Schwarte-Waldhoff (2010)
The ectodomain of the giant cadherin Fat1 is released via ectodomainshedding and is stable in conditioned media and in blood.
(3rd Annual Meeting of NGFN‐Plus and NGFN‐Transfer in the Program of Medical
Genome Research, Berlin)
Nathalie Wojtalewicz, Jakob Weiß, Silke Oeljeklaus, Bettina Warscheid, Reinhard
Gessner, Wolff Schmiegel, Irmgard Schwarte-Waldhoff (2012)
On search for a function of the intestinal specific cadherin-17 via mass
spectrometric identification of interaction partners.
(1st International Meeting of the German Society for Cell Biology: Molecular concepts
in epithelial differentiation, pathogenesis and repair, Leipzig)
192