Dokument_37.

Untersuchungen zur Wirkung von neuen
anti-inflammatorischen Substanzen
zur Behandlung von COPD anhand eines Maus-Modells
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Katrin Schuh
aus Neustadt an der Aisch
Als Dissertation genehmigt
von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
27.März 2009
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Geoffrey Lee
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Dr. h.c. Kay Brune
Der Beginn aller Wissenschaften ist das Erstaunen, dass die Dinge sind, wie sie sind.
Aristoteles
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................V
ZUSAMMMENFASSUNG ......................................................................................... VII
SUMMARY
1
IX
EINLEITUNG ..................................................................................................1
1.1
CHRONISCH OBSTRUKTIVE LUNGENERKRANKUNG (COPD) ....................... 1
1.1.1
DEFINITION .............................................................................................................. 1
1.1.2
EPIDEMIOLOGIE ........................................................................................................ 2
1.1.3
ÄTIOLOGIE ............................................................................................................... 3
1.1.3.1
TABAKRAUCH .................................................................................................... 3
1.1.3.2
GENETISCHE FAKTOREN..................................................................................... 3
1.1.3.3
ANDERE FAKTOREN ........................................................................................... 4
1.1.4
PATHOGENESE .......................................................................................................... 5
1.1.4.1
PULMONALE ENTZÜNDUNG ................................................................................ 5
1.1.4.2
PROTEASEN-ANTIPROTEASEN-DYSBALANCE ..................................................... 9
1.1.4.3
OXIDATIVER STRESS ........................................................................................ 10
1.1.4.4
GESTEIGERTE APOPTOSERATEN PULMONALER STRUKTURZELLEN ................... 11
1.1.5
PHARMAKOTHERAPIE VON COPD.......................................................................... 12
1.2
SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE DER MAP KINASEN ............................. 15
1.3
AUFLÖSUNG DER INFLAMMATION ............................................................... 18
1.4
TIERMODELLE DER COPD ........................................................................... 20
1.5
ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT...................................................................... 22
2
MATERIAL UND METHODEN.......................................................................23
2.1
MATERIAL ..................................................................................................... 23
2.1.1
CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN .................................................................... 23
2.1.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN ................................................................................... 24
2.1.3
PRIMER UND SONDEN ............................................................................................. 24
2.1.4
ANTIKÖRPER .......................................................................................................... 25
2.1.5
KÄUFLICH ERWORBENE SYSTEME .......................................................................... 25
2.1.6
GERÄTE UND SOFTWARE ........................................................................................ 26
2.2
METHODEN .................................................................................................... 27
i
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1
ISOLIERUNG VON PBMC AUS HUMANEM VOLLBLUT ............................................. 27
2.2.2
GEWINNUNG VON MONOZYTEN ............................................................................. 27
2.2.3
BEHANDLUNG UND STIMULATION VON ISOLIERTEN PBMC ................................... 27
2.2.4
QUANTIFIZIERUNG VON MRNA MITTELS REAL-TIME RT-PCR............................... 28
2.2.5
ELISA.................................................................................................................... 28
2.2.5.1
ZYTOKINMESSUNG
IN
ÜBERSTÄNDEN
VON
ZELLKULTUR
UND
BRONCHOALVEOLÄRER LAVAGE ...................................................................... 28
2.2.5.2
DETEKTION VON
PHOSPHORYLIERTER P44/P42
MAPK UND P38 MAPK
MITTELS ELISA ............................................................................................... 29
2.2.6
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE BESTIMMUNG
VON PP38 UND PERK1/2
MITTELS PHOSPHOSPEZIFISCHER ANTIKÖRPER ....................................................... 29
2.2.7
MAUSMODELL DER AKUTEN LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHÄDIGUNG ................. 30
2.2.7.1
VERSUCHSTIERE ............................................................................................... 30
2.2.7.2
BEHANDLUNGSPROTOKOLL .............................................................................. 30
2.2.7.3
BRONCHOALVEOLÄRE LAVAGE........................................................................ 31
2.2.7.4
LUNGENENTNAHME UND KOLLAGENASEVERDAU ............................................ 32
2.2.7.5
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITÄT
DER
MYELOPEROXIDASE ......................................................................................... 32
2.2.7.6
HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER LUNGE ............................................. 33
2.2.7.7
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN .......................................... 33
2.2.7.8
ALBUMINBESTIMMUNG IN DER BRONCHOALVEOLÄREN LAVAGE ..................... 34
2.2.7.9
MESSUNG DER LUNGENFUNKTION ................................................................... 34
2.2.8
3
DATENAUSWERTUNG ............................................................................................. 35
ERGEBNISSE ................................................................................................36
3.1
IN VITRO UNTERSUCHUNGEN ........................................................................ 36
3.1.1
ZEITKINETIK DER IL-2 EXPRESSION ....................................................................... 36
3.1.2
EFFEKTE VON U0126 AUF DIE AKTIVIERUNG VON ERK IN PBMC......................... 36
3.1.3
DOSIS-ABHÄNGIGE INHIBITION DER ZYTOKIN-INDUKTION DURCH U0126
IN
PBMC.................................................................................................................... 38
3.2
MAUSMODELL DER AKUTEN LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHÄDIGUNG ... 39
3.2.1
WIRKUNGEN DES MEK1/2 INHIBITORS U0126 IN VIVO .......................................... 39
3.2.1.1
AKTIVIERUNG VON P44/42 MAPK IM LUNGENGEWEBE................................... 39
ii
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.2
BEHANDLUNG
MIT
U0126
REDUZIERT
LPS-INDUZIERTE
ZELLEINWANDERUNG....................................................................................... 40
3.2.1.3
EINFLUSS VON U0126 AUF DIE AKTIVITÄT DER MYELOPEROXIDASE ............... 41
3.2.1.4
DOSIS-ABHÄNGIGE
INHIBITION
DES
LPS-INDUZIERTEN
LUNGENSCHADENS ........................................................................................... 42
3.2.1.5
ZYTOKIN-UND
CHEMOKINLEVEL
IN
DER
BRONCHOALVEOLÄREN
LAVAGE ........................................................................................................... 43
3.2.1.6
HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DES LUNGENGEWEBES ................................ 44
3.2.1.7
EINFLUSS VON U0126 AUF ALBUMINSPIEGEL IN BRONCHOALVEOLÄREN
LAVAGE ........................................................................................................... 46
3.2.1.8
3.2.2
EFFEKTE VON U0126 AUF DIE LUNGENFUNKTION ............................................ 47
EFFEKTE ANDERER ANTI-INFLAMMATORISCHER SUBSTANZEN ............................... 48
3.2.2.1
VERGLEICH
VON INTRA TRACHEALER UND INTRA PERITONEALER
GABE
VON DEXAMETHASON ...................................................................................... 48
3.2.2.2
PROPHYLAKTISCHE UND
THERAPEUTISCHE
GABE VON DEXAMETHASON
UND ROSCOVITINE............................................................................................ 49
3.2.3
ROLLE DER ADAPTIVEN IMMUNITÄT BEI DER PATHOGENESE DER COPD ............... 51
3.2.3.1
ZEITKINETIK DER INFLAMMATORISCHEN LUNGENSCHÄDIGUNG ANHAND
VON YETI MÄUSEN........................................................................................... 51
4
3.2.3.2
ΒEHANDLUNG VON YETI-MÄUSEN MIT Α-IFN-Γ- ANTIKÖRPER ....................... 56
3.2.3.3
NEUTRALISATION VON IFN-Γ MIT ANTIKÖRPERN IN BALB/C MÄUSEN ............ 58
DISKUSSION .................................................................................................71
4.1
WIRKUNGEN DES MEK1/2-INHIBITORS U0126 IN VITRO ........................... 71
4.2
U0126 REDUZIERT LPS-INDUZIERTE LUNGENSCHÄDIGUNG IN VIVO ........ 73
4.3
WIRKUNGEN VON ROSCOVITINE UND DEXAMETHASON AUF DIE AKUTE
LPS-INDUZIERTE LUNGENSCHÄDIGUNG ............................................. 77
4.4
DIE PATHOGENETISCHE ROLLE DER ADAPTIVEN IMMUNITÄT BEI COPD 79
4.4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
INFLAMMATORISCHEN
REAKTION
INFOLGE
LPS-EXPOSITION ................................................................................................... 79
4.4.2
IFN-Γ-NEUTRALISATION REDUZIERT LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHADEN .......... 80
5
LITERATURVERZEICHNIS ...........................................................................84
6
ANHANG ......................................................................................................97
6.1
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................... 97
iii
INHALTSVERZEICHNIS
6.2
7
TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................... 99
VERÖFFENTLICHUNGEN ...........................................................................100
iv
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
VERWENDETE ABKÜRZUNG
BEZEICHNUNG
AA
Arachidonsäure
BAL
Bronchoalveoläre Lavage
CCL
Chemokin (C-C Motiv) Ligand
CCR
Chemokin (C-C Motiv) Rezeptor
CDK
cyclin-dependent kinase
COX
Cyclooxygenase
CXCL
Chemokin (C-X-C Motiv) Ligand
CXCR
Chemokin (C-X-C Motiv) Rezeptor
DHA
Docosahexaensäure
DUSP
Dual-Specifity-Protein-Phosphatase
ED50
Effective dose 50%
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EPA
Eicosapentaensäure
ERK1/2
Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 und 2
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting
FEV1
Einsekundenkapazität
(engl.:
Forced
Expiratory
Volume in 1 second)
GeoMean
geometrische
Mittel
der
Fluoreszenzintensität
(geometric mean fluorescence intensity)
GOLD
Global Iniative for Chronic Obstructive Lung Disease
H 2O 2
Wasserstoffperoxid
HTAB
Hexadecyltrimethylammoniumbromid
i.p.
intra peritoneal
i.t.
intra tracheal
IC50
Inhibitory concentration 50%
IFN
Interferon
IFN-γ-eYFP
Interferon-γ-enhanced Yellow Fluorescent Protein
v
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
VERWENDETE ABKÜRZUNG
BEZEICHNUNG
IL
Interleukin
KC
Keratinocyte-derived Chemokine
LPS
Lipopolysaccharid
LX
Lipoxin
MAPK
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MEK
MAPK/ERK Kinase
MIP
Macrophage Inflammatory Protein
MKP
MAP-Kinase-Phosphatase
ml
Milliliter
MMP
Matrixmetalloproteinase
MPO
Myeloperoxidase
NF-κB
Nukleärer Faktor κ B
O 2- •
Superoxidanion
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells
Penh
enhanced Pause
PMN
Polymorphnukleäre(r) Neutrophil(e)
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
ROS
reactive oxygen species
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction
SLPI
sekretorischer Leukozytenprotease Inhibitor
TMB
Tetramethylbenzidin
TNF
Tumor Nekrosis Faktor
Tabelle 1
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
vi
ZUSAMMENFASSUNG
ZUSAMMMENFASSUNG
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist weltweit die häufigste chronische
Erkrankung des Respirationstraktes und Hauptursache für chronische Morbidität und
Mortalität. Sie stellt inzwischen die vierthäufigste Todesursache in Industrienationen dar.
Laut Definition der Weltgesundheitsorganisation (WHO) handelt es sich um eine Erkrankung,
die durch eine nicht reversible Einschränkung des Atemstroms gekennzeichnet ist. Diese
Limitation des Atemflusses verläuft meist progressiv und ist assoziiert mit einer abnormalen
Immunantwort der Lunge auf schädigende Partikel und Gase. Der Krankheitsbegriff COPD
umfasst die chronisch obstruktive Bronchitis, das pulmonale Emphysem und die chronische
Entzündung in den kleinen Atemwegen und dem Lungenparenchym. Die lokale Inflammation
wird dominiert durch neutrophile Granulozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten.
Zigaretten- und Tabakrauch, die als Hauptrisikofaktor für die Pathogenese von COPD gelten,
enthalten hohe Mengen Lipopolysaccharid (LPS). Die Zielsetzung dieser Arbeit war es
deshalb, verschiedene neue anti-inflammatorische Substanzen auf ihre Wirksamkeit anhand
eines inhalativen Tiermodells der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung zu untersuchen.
Im ersten Teil der Arbeit wurde der MEK1/2 Inhibitor U0126 in vitro in isolierten humanen
peripheren mononukleären Zellen (PBMC) untersucht. Mittels Durchflusszytometrie konnte
bestätigt werden, dass U0126 selektiv den ERK MAP Kinase Signalweges blockiert. Der
Effekt des MEK1/2 Inhibitors auf die Zytokinfreisetzung in stimulierten humanen PBMCs
wurde
mit
Hilfe
des
ELISA
Verfahrens
untersucht.
Die
Freisetzung
des
pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α sowie von IL-2 konnte durch die Blockade von
MEK1/2 dosis-abhängig inhibiert werden.
Die potenziell anti-inflammatorischen Wirkungen von U0126 in vitro wurden anschließend in
einem in vivo Modell bestätigt. In Balb/c Mäusen wurde durch die Exposition gegenüber
einem LPS-Aerosol eine akute Entzündung der Lungen hervorgerufen, was dem klinischen
Bild einer Exazerbation von COPD entspricht. Die Inhalation von LPS führte zu einem
Einstrom von neutrophilen Granulozyten in die bronchoalveoläre Lavage, begleitet von der
Freisetzung des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α und den Chemokinen KC und MIP-2.
Im
Zusammenhang
mit
erhöhter
Neutrophilie
konnte
auch
eine
erhöhte
Myeloperoxidase-Aktivität im Lungengewebe nachgewiesen werden. Albuminbestimmungen
in der BAL sowie histologische Untersuchungen bestätigten eine pulmonale Schädigung
infolge der LPS-Inhalation. Die intra peritoneale Applikation des MEK1/2 Inhibitors konnte
vii
ZUSAMMENFASSUNG
sowohl in vitro als auch im Lungengewebe selektiv die Aktivierung der ERK MAPK
hemmen. U0126 reduzierte dosis-abhängig den inflammatorischen Zelleinstrom sowie
Zytokin-
und
Chemokinfreisetzung
in
die
bronchoalveoläre
Lavage.
Auch
die
Lungenschädigung konnte durch die prophylaktische Gabe des MEK1/2 Inhibitors signifikant
verringert werden. Die Spirometrie ergab nach Applikation von U0126 lediglich eine
geringfügige Verbesserung der Lungenfunktion.
Im zweiten Teil wurden das Glucocorticoid Dexamethason und der CDK Inhibitor
Roscovitine auf ihre prophylaktischen und therapeutischen Wirkungen im LPS-Modell
untersucht. Das potent anti-entzündliche Dexamethason konnte, intra tracheal appliziert, die
LPS-induzierte Lungenschädigung sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch signifikant
reduzieren. Roscovitine fördert die Apoptoseinduktion von Neutrophilen und deshalb war
lediglich die therapeutische Applikation effektiv.
Im letzten Teil wurde die Rolle der adaptiven Immunität bei der Pathogenese von COPD
untersucht. Zunächst erfolgte anhand bizistronischer IFN-γ Reportermäuse (Yeti) eine
Charakterisierung der Zeitkinetik der inflammatorischen Reaktion infolge LPS-Inhalation.
Während 6 bis 24 Stunden nach der LPS-Inhalation das Infiltrat hauptsächlich aus
Neutrophilen bestand, bildeten zusätzlich Lymphozyten 72h nach der Inhalation eine große
Population in der BAL. FACS Analysen ergaben, dass ein Großteil der CD8+ Lymphozyten
72h nach der Exposition IFN-γ produzierten, was ein Th1/Tc1 Profil implizierte.
Die Rolle von IFN-γ bei dem LPS-induzierten Lungenschaden sollte durch die
Neutralisierung von IFN-γ mittels monoklonalen Antikörpern untersucht werden. Die
prophylaktische Gabe der Antikörper reduzierte signifikant die Neutrophilie sowie die Anzahl
der CD4+ und CD8+ Lymphozyten in BAL und Lunge. Auch histologisch sowie durch
Albuminbestimmungen konnte bestätigt werden, dass die Neutralisierung von IFN-γ die
Lungenschädigung infolge LPS-Exposition signifikant reduzierte.
Sowohl die MEK1/2 Blockade durch U0126 als auch die Neutralisation von IFN-γ stellen
potentielle neue Therapieoptionen für COPD dar. Der MAP Kinase Inhibitor U0126
vermittelt seine Effekte vermutlich über eine reduzierte Neutrophilie sowie reduzierte
Zytokin- und Chemokinfreisetzung. Die Reduktion des Lungenschadens durch Gabe von
anti-IFN-γ wird vermutlich, neben Modulation der Aktivierung von T-Zellen und des T-ZellRezeptors, durch immunmodulatorische Regulation der Rekrutierung von Neutrophilen als
auch der Aktivierung von Makrophagen verursacht.
viii
SUMMARY
SUMMARY
Among chronic respiratory diseases COPD (chronic obstructive pulmonary disease) is
globally most frequent and a major cause of chronic morbidity and mortality. By now COPD
is the fourth leading cause of death in industrialized countries. According to the world health
organisation (WHO), it is a disease state characterized by a limitation of airflow that is not
fully reversible. The airflow limitation is usually progressive and associated with an abnormal
inflammatory response of the lungs to noxious particles and gases. The term COPD
encompasses chronic obstructive bronchitis, with obstruction of small airways, emphysema
and chronic inflammation of the small airways and lung parenchyma. The local inflammation
is predominated by neutrophils, furthermore macrophages and T lymphocytes are found in the
alveolar walls of COPD patients. Tobacco and cigarette smoke, the major risk factors for
COPD, contain high levels of lipopolysaccharide (LPS), a cell wall component of gramnegative bacteria, which is a potent inflammatory stimulus. Therefore the aim of this study
was to evaluate the potential efficacy of various drug candidates using a murine model of
acute LPS-induced lung injury.
In the first part of this thesis, the MEK1/2 inhibitor U0126 was analyzed in vitro using
isolated human primary cells. The specificity of U0126 blocking selectively ERK MAPK
pathway was analyzed by flow cytometry. ELISA analyses revealed a dose-dependent
inhibition of cytokine release of pro-inflammatory TNF-α and IL-2 by U0126.
The potential anti-inflammatory actions of U0126 were subsequently confirmed in an in vivo
model. Balb/c mice were exposed to aerosolized LPS in order to induce an acute
inflammatory response of the lungs that mirrors an acute exacerbation of clinical COPD.
Exposure to LPS led to massive influx of inflammatory cells, primarily neutrophils, into
bronchoalveolar lavage accompanied by increased levels of pro-inflammatory cytokine
TNF-α and neutrophil chemotactic chemokines KC and MIP-2 in BAL fluid. Concomitant
with elevated lung neutrophilia increased activity of myeloperoxidase was determined.
Analysis of albumin levels in BAL fluid and histological examination of lung tissue
confirmed pulmonary injury due to LPS challenge. Activation of ERK MAPK was selectively
inhibited both in vitro and in lung tissue by intraperitoneal application of U0126. The
inhibitor effectively reduced inflammatory cell influx as well as cytokine and chemokine
release into BAL fluid in a dose-dependent manner. Furthermore MEK1/2 inhibition
successfully attenuated lung injury and in part enhanced lung function.
ix
SUMMARY
In the second part of this thesis, the therapeutic and prophylactic actions of glucocorticoid
dexamethasone and CDK inhibitor roscovitine were approved using the LPS model.
Intratracheally administered dexamethasone effectively abated LPS-induced lung injury both
prophylactically and therapeutically. Since roscovitine promotes neutrophil apoptosis, only
therapeutic effects of the compound were detectable.
Furthermore another aim of the study was to determine the role of adaptive immunity in
COPD. To this end a time course of the inflammatory response in lungs due to LPS inhalation
was determined using bicistronic IFN-γ reporter mice (Yeti). Whereas inflammatory influx
primarily consisted of neutrophils 6 and 24 hours after LPS challenge, lymphocytes
represented a notable population 72 hours later. FACS analyses detected the majority of CD8+
lymphocytes as IFN-γ producing, indicating a Th1/Tc1 pattern.
In order to examine the role of IFN-γ in acute lung injury neutralization of IFN-γ by
monoclonal antibody was accomplished. The administration of anti-IFN-γ prior to LPS
challenge reduced neutrophilia and numbers of CD4+ and CD8+ lymphocytes in BAL fluid
and lung tissue. Moreover histological analyses and determination of albumin levels revealed
diminished lung injury due to LPS inhalation by neutralizing IFN-γ.
Since effective anti-inflammatory pharmacotherapy for COPD is still not available, ERK
inhibition by U0126 as well as neutralization of IFN-γ may represent new treatment
opportunities for COPD. We could show, that the anti-inflammatory action of U0126 may be
mediated by reduced lung neutrophilia and hyperpermeability, as well as decreased levels of
pro-inflammatory cytokines and chemokines. Reduction of lung injury by neutralizing IFN-γ
may be caused, aside from its modulation of T cell and TCR activation, by
immunomodulatory regulation of PMN recruitment and macrophage functions.
x
EINLEITUNG
1 Einleitung
1.1 Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)
1.1.1 Definition
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (englisch: Chronic Obstructive Pulmonary
Disease; COPD) ist laut Weltgesundheitsorganisation (WHO) ein Krankheitszustand, der
durch eine nicht oder nur teilweise reversible Einschränkung des Atemflusses
charakterisiert ist. Diese Limitation des Atemflusses verläuft in den meisten Fällen
progressiv und ist assoziiert mit einer inadäquaten entzündlichen Immunantwort der
Lungen auf schädigende Partikel oder Gase (Barnes 2000). Das Krankheitsbild ist
gekennzeichnet
durch
massive
Schleimproduktion
in
den
Atemwegen,
damit
einhergehender chronischer Husten und zunehmender Atemnot bei körperlicher
Belastung. Bei der COPD handelt es sich um ein komplexes Symptomgebilde, das
pathophysiologisch verschiedene krankhafte Konditionen subsumiert: chronische
Bronchitis, Atemwegsobstruktion und das pulmonale Emphysem.
Chronische Bronchitis ist gemäß WHO definiert als vermehrte Sekretproduktion der
Bronchien mit produktivem Husten über mindestens drei Monate eines Jahres in zwei
aufeinander folgenden Jahren. Diese vermehrte Schleimproduktion ist bedingt durch eine
Hypertrophie der Schleimdrüsen. Die mit der chronischen Bronchitis assoziierte
Entzündung ist im Epithel der zentralen Atemwege lokalisiert und korreliert mit
weitgehender Zerstörung des Flimmerepithels sowie verminderter mukoziliärer Clearance
(Hogg 2004). Die Schleimproduktion trägt allerdings nicht maßgeblich zum Fortschreiten
der Atemwegsobstruktion bei.
Hingegen ist die chronisch-obstruktive Bronchiolitis hauptverantwortlich für die
Limitation des Atemflusses. Diese Entzündung betrifft die kleinen, membranösen
Bronchiolen (< 2mm im Durchmesser) der peripheren Atemwege und wird im Englischen
mit dem Begriff „Small Airway Disease“ beschrieben. Die Einschränkung des
Atemflusses ist auf drei Mechanismen begründet: den Verlust von elastischen Fasern in
den Alveolen, luminale Okklusion durch Mukusproduktion der Becher Zellen und die
Verdickung der Alveolarwand. Letztere ist auf die verstärkte Einwanderung von
1
EINLEITUNG
Entzündungszellen, Hyperplasie der glatten Muskulatur und zunehmende Fibroisierung
zurückzuführen (Barnes 2004).
Im fortgeschrittenen Krankheitsstadium spielt neben den erwähnten Vorgängen in der
Bronchusperipherie das pulmonale Emphysem eine pathogenetische Rolle bei der
Atemwegsobstruktion. Es handelt sich morphologisch um eine irreversible Ausweitung
der Atemwege distal der terminalen Bronchiolen, deren zugrunde liegender Mechanismus
ein Elastizitätsverlust durch Zerstörung des Lungenparenchyms ist. Eine mögliche
Ursache
des
Emphysems
ist
eine
Dysbalance
zwischen
proteolytischer
und
proteasehemmender enzymatischer Aktivität. Hauptverantwortlich für die Entwicklung
eines Emphysems ist in den meisten Fällen der inhalative Tabakkonsum.
Gemäß der Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) wird COPD
in vier Schweregrade eingeteilt (GOLD Stufe 1-4). Das entscheidende Kriterium zur
Einteilung ist die spirometrisch ermittelte Ausprägung der Lungenfunktionsstörung. Das
Hauptaugenmerk wird pragmatisch vor allem auf das forcierte Einsekundenvolumen
gelegt. Allerdings sollten auch klinische Zeichen wie Husten, Dyspnoe und Auswurf
optionale Berücksichtigung finden, da die individuellen Auswirkungen der Erkrankung
nicht nur vom Ausmaß der Atemflusslimitation, sondern auch vom Schweregrad der
Symptome, wie Atemnot oder Einschränkung der körperlichen Belastung, abhängen.
1.1.2 Epidemiologie
COPD ist weltweit die häufigste chronische Erkrankung des Respirationstraktes und
Hauptursache für chronische Morbidität und Mortalität. In Europa wie auch in den USA
gilt COPD als vierthäufigste Todesursache und wird nach neuesten Einschätzungen der
WHO im Jahre 2020 weltweit sogar auf dem dritten Platz rangieren. Laut der European
Lung Foundation ist COPD unter den führenden Todesursachen die einzige, deren
Inzidenz weltweit weiterhin zunimmt. Soziökonomisch stellt COPD hohe finanzielle
Anforderungen: der durch COPD bedingte Produktivitätsausfall beläuft sich in Europa auf
jährlich 28,5 Milliarden Euro. In den USA wurden 2007 die resultierenden finanziellen
Folgen von COPD auf eine Summe von 42,6 Milliarden US-Dollar geschätzt (Fromer und
Cooper 2008).
Rund 14% der über 40-Jährigen und sogar rund 27% der über 70-Jährigen leiden an
chronisch obstruktiver Lungenerkrankung. Während bei den über 60-Jährigen Männer
2
EINLEITUNG
überproportional häufiger betroffen sind, gleichen sich die Prävalenzen in jüngeren
Generationen (zwischen 30-50 Jahre) bei Frauen und Männern an, was vermutlich auf ein
verändertes Rauchverhalten junger Frauen zurückzuführen ist (Buist et al. 2008).
1.1.3 Ätiologie
1.1.3.1 Tabakrauch
Der Hauptrisikofaktor weltweit für die Entwicklung von COPD ist das Zigarettenrauchen.
In Industriestaaten ist die Mortalität von COPD in 73% der Fälle auf das Tabakrauchen
zurückzuführen, in Ländern mit mittlerem und niedrigem Durchschnittseinkommen in ca.
40% der Erkrankungen (Mannino und Buist 2007). Allerdings entwickeln nur ca. 20% der
Raucher einen raschen Abfall des FEV1, was letztlich zu schweren (GOLD-3) und sehr
schweren Formen (GOLD-4) von COPD führt. Hingegen findet man bei jedem Raucher
pulmonale Entzündungszeichen und bei jenen, die fortgeschrittene Level der Erkrankung
erreichen, scheint diese Entzündungsreaktion verstärkt zu sein (Curtis et al. 2007).
Pfeifen- und Zigarrenrauchen führen ebenfalls zu erhöhten Morbiditäts- und
Mortalitätsraten (Iribarren et al. 1999). Auch Passivrauchen kann durch die Inhalation von
Partikeln und Gasen zur Entstehung einer COPD beitragen (Yin et al. 2007).
1.1.3.2 Genetische Faktoren
Da nur bei einer Minderheit der Raucher eine rasche Verminderung der Lungenfunktion
beobachtet werden kann, liegt die Vermutung nahe, dass genetische Faktoren das
individuelle
Erkrankungsrisiko
modulieren.
Beispielsweise
sind
klare
Prävalenzunterschiede verschiedener ethnischer Abstammungen belegt, so entwickeln ca.
15% der weißen Raucher gegenüber 5% der asiatischen Raucher eine COPD. Weitere
Hinweise einer genetischen Prädisposition liefern Familienstudien von Patienten mit
early-onset-COPD (Silverman et al. 1998).
Patienten mit α1-Antitrypsin-Mangel (homozygoter ZZ-Phänotyp) sind prädisponiert zur
Ausbildung eines frühen panlobulären Emphysems, dessen Risiko durch Rauchen noch
verstärkt wird (Barnes 2000; Kohnlein und Welte 2008). Durch ein α1-Antitrypsin-Defizit
unterliegt das Lungengewebe einem verstärkten proteolytischen Abbau durch die
3
EINLEITUNG
neutrophile Elastase. Allerdings weisen weniger als ein Prozent der COPD-Patienten
einen α1-Antitrypsin-Mangel auf.
Genpolymorphismen eines weiteren Proteaseinhibitors, dem α1-Antichymotrypsin,
werden ebenfalls mit der Entstehung von COPD assoziiert (Poller et al. 1992).
Andere
Untersuchungen
belegten,
dass
Polymorphismen
von
Genen
der
Matrixmetalloproteinasen MMP1 und MMP9 an der Abnahme der Lungenfunktion
beteiligt sind (Joos et al. 2002). Ebenfalls im Fokus der Untersuchungen sind TIMP-2
(Tissue Inhibitor of Matrixmetalloproteinase 2) Genpolymorphismen, die mit der
Pathogenese von COPD in Verbindung gebracht werden (Hirano et al. 2001).
Eine Studie belegt, dass das Erkrankungsrisiko für COPD in einer taiwanesischen
Population durch einen Polymorphismus in der Promotorregion des TNF-α-Gens, welcher
mit einer erhöhten TNF-α Produktion assoziiert ist, zehnfach erhöht ist (Huang et al.
1997). Allerdings konnte diese These durch eine Untersuchung in einem britischen
Kollektiv nicht bestätigt werden.
Die mikrosomale Epoxidhydrolase ist ein Enzym, das in der Metabolisierung von
schädigenden Epoxiden in der Lunge, welche in hohem Maße im Zigarettenrauch
enthalten sind, eine wichtige Rolle spielt. Genetische Defekte dieser enzymatischen
Detoxifikation könnten Raucher für die Entwicklung von Atemflussobstruktion und
Emphysem prädisponieren (Smith und Harrison 1997).
1.1.3.3 Andere Faktoren
Neben dem Hauptrisikofaktor Rauchen spielen auch andere inhalative Noxen eine Rolle.
Berufliche Exposition gegenüber Stäuben, Dämpfen oder Chemikalien bergen ein
unterschätztes Risiko für die Ausbildung einer COPD (Trupin et al. 2003). In
Entwicklungsländern überschreitet eine, im Vergleich zu Industriestaaten, erhöhte
Innenraumbelastung häufig eine kritische Schwelle, oberhalb derer das Risiko für eine
COPD-Erkrankung wächst. Verantwortlich sind vor allem das Kochen und Heizen mit Öl,
Holz, Kohle oder anderer Biomasse in schlecht belüfteten Räumen, was insbesondere
Frauen als Risikogruppe erklärt (Torres-Duque et al. 2008).
Virale und bakterielle Infektionen könnten zur Pathogenese und Progression von COPD
sowie zur Emphysembildung beitragen und sind hauptverantwortlich für akute
4
EINLEITUNG
Verschlechterungen (Exazerbation) der Erkrankung. (Seemungal et al. 2001; Sethi et al.
2006). Auch eine erhöhte Zahl an kindlichen respiratorischen Infektionen ist mit einer
verminderten Lungenfunktion im Erwachsenenalter assoziiert (Barker et al. 1991).
1.1.4 Pathogenese
1.1.4.1 Pulmonale Entzündung
Die Inhalation von Tabakrauch oder anderen reizenden Stoffen verursacht eine
entzündliche Reaktion des Lungengewebes, eine normale Immunantwort, die allerdings
bei COPD Patienten inadäquat verstärkt ausfällt. Charakteristische pathologische
Veränderungen bei einer COPD betreffen vor allem die proximalen und peripheren
Atemwege sowie das Lungenparenchym. An der chronischen Entzündung sind sowohl
Zelltypen des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems beteiligt. Neutrophile
Granulozyten, Makrophagen sowie CD8+ Lymphozyten beherrschen die lokale
Immunreaktion (Barnes et al. 2003).
Makrophagen
Makrophagen gelten aufgrund ihrer ausgeprägten Phagozytosefähigkeit als besonders
effektive Zellen der angeborenen Immunität. Sie reifen aus zirkulierenden Monozyten
heran, welche das Lungengewebe auf chemotaktischen Reiz durch CCL2 (auch MCP-1)
infiltrieren. In der bronchoalveolären Lavage bilden Makrophagen die Mehrheit an
Entzündungszellen, unabhängig davon, ob es sich bei den Patienten um Nichtraucher,
gesunde Raucher oder Raucher mit Atemwegserkrankungen handelt (Kuschner et al.
1996).
Zu
den
Sauerstoffspezies,
von
Makrophagen
chemotaktische
sezernierten
Mediatoren
zählen
Faktoren,
inflammatorische
reaktive
Zytokine,
Schleimdrüsenaktivatoren und eine Vielzahl an Matrixmetalloproteinasen (MMP). Da
letztere durch ihre elastolytische und kollagenolytische Aktivität wesentlich für die
Zerstörung der extrazellulären Matrix und Emphysembildung im Rahmen der COPD
verantwortlich sind, fokussiert sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf Makrophagen
als Quelle von MMPs. Zahlreiche Studien konnten die Vermutung, dass Makrophagen
die pulmonale Entzündung durch die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren
orchestrieren, rechtfertigen. Beispielsweise konnten Finlay et al. (1997) zeigen, dass
5
EINLEITUNG
Alveolarmakrophagen von Emphysematikern größere Mengen an elastinolytischen
Matrix-Metalloproteinasen transkribieren und sezernieren als Makrophagen von
Kontrollpersonen.
Im
Tiermodell
induzierte
sowohl
die
Gabe
von
Alveolarmakrophagen, als auch die Überexpression vom MMP1 die Emphysembildung
(Snider et al. 1986; Shiomi et al. 2003). Auch an der Rekrutierung von Neutrophilen
sind Makrophagen beteiligt: durch Inhalation von Tabakrauch oder anderen Reizstoffen
aktiviert, sezernieren sie daraufhin chemotaktische Faktoren wie CXCL1 (auch Gro-α)
und CXCL8 (auch IL-8) (Traves et al. 2004). Makrophagen sind darüber hinaus auch an
der Entwicklung von akuten Exazerbationen, meist verursacht durch bakterielle
Infektionen, beteiligt. Für die Bekämpfung jener Infektionen ist eine intakte
Makrophagenfunktion von essentieller Bedeutung.
Neutrophile
In vivo Studien, die Neutrophile mit der Pathogenese von COPD in Verbindung bringen,
sind zahlreich. Untersuchungen von induziertem Sputum und Bronchiallavage
demonstrieren konsistent erhöhte Mengen von Neutrophilen und Enzymen neutrophilen
Ursprungs, sowohl bei stabiler COPD, als auch während akuter Exazerbationen
(Thompson et al. 1989; Peleman et al. 1999).
Neutrophile Granulozyten sind durch charakteristisch segmentierte Zellkerne und
intrazelluläre Granula gekennzeichnet. Sie sind Teil der angeborenen Immunabwehr und
Quelle reaktiver Sauerstoffspezies, inflammatorischer Zytokine sowie Enzyme, wie der
neutrophilen Elastase oder Myeloperoxidase (Hiemstra et al. 1998). Polymorphnukleäre
Neutrophile zirkulieren in hoher Zahl im Blut und besitzen die Fähigkeit zur gezielten
Wanderung an den Ort der Infektion (Chemotaxis). Sie verlassen in einem mehrstufigen,
durch Chemokine und Adhäsionsmoleküle vermittelten Prozess, der Diapedese, den
Blutstrom und treten in das entzündete Gewebe ein. Eine erhöhte Zahl an Neutrophile
korreliert direkt mit einer erhöhten Produktion der CXC-Chemokine CXCL1 und CXCL8,
welche an den auf Neutrophilen exprimierten Rezeptor CXR2 binden (Barnes 2008b).
Nach Aktivierung sezernieren Neutrophile die Serinproteasen Elastase und Proteinase 3.
Diese Serinproteasen induzieren den Abbau extrazellulärer Matrix des Lungengewebes,
und reduzieren die ziliäre Schlagfrequenz und vermindern somit die mukoziliäre
Clearance. (Hiemstra et al. 1998). Die ausgeschütteten Mediatoren induzieren eine
6
EINLEITUNG
Mukus-Hypersekretion sowohl über einen akut sekretagogen Effekt, als auch über eine
Steigerung der bronchialen Schleimproduktion (O'Donnell et al. 2006). Die neutrophile
Elastase wird eng mit der Emphysembildung assoziiert. Im Tiermodell konnte gezeigt
werden, dass die Gabe von gereinigter neutrophiler Elastase ein Emphysem verursacht,
während hingegen eine Defizienz der endogenen Serinprotease einen Schutz vor
Emphysembildung infolge Zigarettenrauchexposition bietet (Snider et al. 1986; Shapiro et
al. 2003). Auch in Studien von COPD Patienten konnte man die neutrophile Elastase in
emphysematösem Lungengewebe sowie eine Korrelation zwischen Schwere des
Emphysems und Elastasespiegeln neutrophiler Granulozyten nachweisen (O'Donnell et al.
2006).
Abbildung 1
Pathogenese der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung
(aus (Barnes 2008b)
Die Inhalation von Zigarettenrauch und anderen Noxen aktiviert Epithelzellen und Makrophagen zur Freisetzung von
chemotaktischen Faktoren, die Entzündungszellen, wie Neutrophile, Monozyten und T-Lymphozyten in das
Lungengewebe locken. Diese Entzündungszellen sezernieren Proteasen, die den Elastinabbau, Schleim-Hypersekretion
und die Emphysembildung fördern. Transforming Growth Factor β (TGF-β) stimuliert die Proliferation von
Fibroblasten, was zur Fibroisierung der kleinen Atemwege führt.
7
EINLEITUNG
T-Lymphozyten
In den Atemwegen und im Lungenparenchym von COPD Patienten imponieren erhöhte
CD3+ T-Zellzahlen, wohingegen CD8+ T-Zellen gegenüber CD4+ T-Zellen dominieren
(Saetta et al. 1998). Allerdings ist deren Rolle in der Pathogenese von COPD noch nicht
vollständig geklärt. Die Lymphozytenpopulation ist zu einem T-Helfer 1 (Th1) /
zytotoxischen T-Zellen (Tc1) Phänotyp polarisiert (Grumelli et al. 2004). Die Tc1 Zellen
sezernieren IFN-γ und exprimieren CXCR3, was impliziert, dass sie durch
CXCR3-bindende Chemokine CXCL9 (auch MIG genannt), CXCL10 (auch IP-10) und
CXCL11 (auch I-TAC) in das Lungengewebe rekrutiert werden, die ihrerseits in hohen
Mengen in Atemwegen von COPD Patienten präsent sind (Saetta et al. 2002; Costa et al.
2008). Diese CXCR3 Liganden unterdrücken die Signalweiterleitung über CCR3, dem
Rezeptor von CCL11 (Eotaxin), dies stellt eine mögliche Erklärung für eine supprimierte
eosinophile Entzündung bei COPD dar (Xanthou et al. 2003). Im Sputum von COPD
Patienten ist im Vergleich zu Gesunden die Produktion von CCL5 (RANTES) erhöht.
CCL5 ist ebenfalls in der Lage T-Zellen über CCR5 in das Lungengewebe anzulocken
und könnte somit ebenfalls an der T-Zell-Rekrutierung beteiligt sein (Costa et al. 2008).
CD8+ Zellen können das Lungeninterstitium durch die Freisetzung von lytischen
Substanzen, wie Granzym B oder Perforin, potenziell direkt schädigen. Eine Studie
konnte nachweisen, dass CD8+ Zellen, die aus dem Sputum von COPD Patienten
gewonnen wurden, höhere Perforin-Expressionsraten und eine erhöhte zytotoxische
Aktivität im Vergleich zu Kontrollbedingungen aufwiesen (Chrysofakis et al. 2004). Auch
eine Erhöhung der Apoptoseraten von Pneumozyten vom Typ 1 korreliert mit erhöhten
CD8+ Zellzahlen in den Alveolarwänden, was möglicherweise zur Emphysembildung
beiträgt (Majo et al. 2001).
Die Tc1- und Th1-vermittelte Entzündung ist vermutlich selbst perpetuierend, da IFN-γ
die Freisetzung von CXCR3 Liganden stimuliert, welche wiederum weitere Tc1- und
Th1-Zellen in das Entzündungsgeschehen der Lunge anlocken (Saetta et al. 2002).
Eine relativ neu beschriebene Untergruppe von CD4+ T-Zellen sind die T-Helfer 17
Zellen
(Th17),
die
bislang
mit
der
Progression
von
T-Zell-vermittelten
Autoimmunerkrankungen, wie Rheumatoider Arthritis oder Multipler Sklerose assoziiert
wurden, aber auch ein Rolle bei der Pathogenese von COPD spielen (Harrison et al.
2008). Th17-Zellen sezernieren IL-17 und IL-17F, welche die Freisetzung von CXCL1
und CXCL8 aus Atemwegsepithelzellen induzieren. Sie nehmen somit ebenfalls Anteil an
8
EINLEITUNG
der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten und fördern die neutrophile Entzündung.
Die Th17-Zell-Differenzierung unterliegt einem autoregulatorischem Mechanismus via
IL-21 unter Beteiligung von IL-23 (Bettelli et al. 2007)
1.1.4.2 Proteasen-Antiproteasen-Dysbalance
Parallel zu den Vorgängen in den kleinen Bronchiolen spielt das Emphysem eine wichtige
pathogenetische
Rolle
bei
der
Atemwegsobstruktion.
Die
Protease/Antiprotease-Hypothese erklärt die Ursache der Emphysementstehung in einem
Übergewicht
proteolytischer
Aktivität
gegenüber
antiproteolytischen
Schutzmechanismen. Aus Entzündungszellen sezernierte Proteasen werden nicht
vollständig von entsprechend protektiven Antiproteasen antagonisiert, was in einer
erhöhten Proteolyse von Lungenbindegewebe (v.a. Elastinabbau) und Emphysembildung
mündet.
Diese These wird durch die Entdeckung des Zusammenhangs von α1-Antitrypsin-Mangel
und Emphysembildung gestützt. α1-Antitrypsin agiert als Inhibitor der neutrophilen
Elastase, ein potent elastolytisches Enzym, dessen intratracheale Gabe im Tierversuch
Emphysem induziert (Janoff et al. 1977). Genetisch bedingter α1-Antitrypsin-Mangel ist
nur bei einem geringen Prozentsatz der COPD Erkrankten nachgewiesen. Man geht davon
aus, dass auch Rauchen zu einer funktionellen Defizienz von α1-Antitrypsin mittels
Oxidation durch der im Zigarettenrauch enthaltenen Oxidantien führen kann (Gadek et al.
1979). Auch die Aktivität des sekretorischen Leukozytenprotease-Inhibitors (SLPI), einer
potenten Antiprotease der neutrophilen Elastase, scheint vermindert zu sein.
Neuere Untersuchungen fokussieren sich auf die Bedeutung von Makrophagen und den
von ihnen ausgeschütteten Proteasen in der Emphysementstehung. Makrophagen
sekretieren
verschiedene
Kathepsine,
wie
auch
die
elastinolytischen
Matrixmetalloproteasen MMP2, MMP9 und MMP12. Die matrixabbauende Aktivität von
MMP wird durch endogene Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrixmetalloproteinase
(TIMP) antagonisiert. Ein Mangel an TIMP3 bewirkt ein progredientes destruktives
Emphysem, was die Bedeutung der MMP für die Entwicklung einer COPD unterstreicht
(Shapiro und Ingenito 2005). In emphysematösem Lungengewebe von COPD Patienten
wurden erhöhte MMP2- und MMP9-Spiegel nachgewiesen (Ohnishi et al. 1998), im
9
EINLEITUNG
Tierversuch ist MMP12 für die Entstehung von Zigarettenrauch-induziertem Emphysem
erforderlich (Hautamaki et al. 1997).
1.1.4.3 Oxidativer Stress
Neben der chronischen Entzündung und dem Protease/Antiprotease-Ungleichgewicht
wird auch dem oxidativen Stress eine wichtige pathogenetische Rolle bei COPD
zugeschrieben. Man geht ähnlich der Protease/Antiprotease-Dysbalance von einem
verschobenen Oxidantien/Antioxidantien-Gleichgewicht aus. Beide sind jedoch eng
miteinander verknüpft, da einerseits oxidativer Stress Antiproteasen inaktiviert und
andererseits proinflammatorische Abbauprodukte der Proteasen neue Oxidantien
generieren (Hogg und Senior 2002).
Die Quellen freier Radikale und Oxidantien sind sowohl exogener, v.a. Tabakrauch und
Luftverschmutzung, als auch endogener Art. Entzündungszellen, wie Neutrophile,
Makrophagen oder Epithelzellen werden durch inflammatorische Zytokine aktiviert und
produzieren sowie sezernieren reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS).
Dies sind vor allem Superoxidanion (O2-•) und Wasserstoffperoxid (H2O2), welche durch
freies Eisen katalysiert, das schädigende hochreaktive Hydroxylradikal (•OH) bilden
können.
Zigarettenrauch ist eine komplexe Mixtur aus über 4700 chemischen Substanzen darunter
auch hohe Konzentrationen an Oxidantien und freien Radikalen (>1015 Partikel/Zug)
(Pauwels
et
al.
2001).
Neben
dem
Superoxidanion
findet
sich
vor
allem
Stickstoffmonoxid (NO) in der Gasphase, welche sehr schnell zu hochreaktiven
Peroxynitrit reagieren. Die freien Radikale in der Teerphase sind eher organischer Natur,
wie langlebige Semiquinon-Radikale, die wiederum mit Superoxidanion zur Bildung von
Hydroxylradikal und H2O2 reagieren können.
Reaktive Sauerstoffspezies gelten als hochreaktiv und oxidieren Phospholipide von
Zellmembranen kettenreaktionsartig durch Lipidperoxidation. Die Peroxidation mehrfach
ungesättigter
Fettsäuren
beeinträchtigt
Membranfunktionen,
inaktiviert
membrangebundene Rezeptoren und Enzyme und erhöht die Gefäßpermeabilität,
Prozesse, die mit der Pathogenese zahlreicher Formen von Lungenschädigungen assoziiert
werden (MacNee 2001). Oxidativer Stress aktiviert den pro-inflammatorischen
Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor κ B (NF-κB), der multiple inflammatorische Gene
10
EINLEITUNG
reguliert, darunter CXCL1, CXCL8, MMP9 und Transforming Growth Factor β (TGF-β).
Diese tragen zusammen zur neutrophilen Entzündung, Emphysembildung und Fibrose der
kleinen Atemwege bei (Barnes 2008a). Darüber hinaus reduziert oxidativer Stress die
Aktivität der Histondeacetylase 2 (HDAC2), was einerseits zu einer verstärkten
Expression inflammatorischer Gene und andererseits zu einer Reduktion der
anti-inflammatorischen Potenz von Glucocorticoiden bei COPD führt (Barnes 2006).
Hinweise auf erhöhten oxidativen Stress in den Lungen von COPD Erkrankten sind
zahlreich. Im exhalierten Atemkondensat, Sputum und im Blutkreislauf finden sich
erhöhte Konzentrationen von Wasserstoffperoxid und den Lipidperoxidationsprodukten
8-Isoprostan und Ethan (Dekhuijzen et al. 1996; Montuschi et al. 2000; Paredi et al.
2000). Neutrophile und Makrophagen der bronchoalveolären Lavage von Rauchern und
COPD Patienten mit Exazerbationen weisen gesteigerte Level an Superoxidanion und
Wasserstoffperoxid auf (Rahman et al. 1996; Morrison et al. 1999). Darüber hinaus ist
Zigarettenrauchen mit erhöhten Myeloperoxidase-Spiegeln in Neutrophilen assoziiert,
welche die Umsetzung von H2O2 zu Superoxidanion und Hypochlorsäure katalysiert.
Dies korreliert wiederum mit dem Maß an pulmonaler Dysfunktion und deutet auf eine
Beteiligung des Myeloperoxidase-vermittelten oxidativen Stresses an der Pathogenese
von COPD hin.
1.1.4.4 Gesteigerte Apoptoseraten pulmonaler Strukturzellen
Eine fehlgesteuerte Regulation der Apoptose, die ein gestörtes Gleichgewicht zwischen
Elimination und Proliferation alveolärer Epithel- und Endothelzellen verursacht und
letztlich zu Lungenschädigungen und Emphysem führt, kann neben den bereits
beschriebenen drei Mechanismen in der Pathogenese von COPD von Bedeutung sein.
Bei der Apoptose, die auch als programmierter Zelltod bezeichnet wird, aktiviert die
Zelle ein internes Zerstörungsprogramm, das innerhalb weniger Stunden zur
umfassenden Elimination führen kann. Der programmierte Zelltod ist kritisch für die
Erhaltung der normalen Gewebehomöostase und steht im Gleichgewicht mit
Proliferation und Differenzierung. Die für die Apoptose verantwortliche intrazelluläre
Maschinerie ist abhängig von Adenosintriphosphat (ATP) und beruht auf Caspasen,
einer Familie von Proteasen. Initiatorcaspasen können über zwei unterschiedliche Wege
aktiviert werden: über den extrinsischen und über den intrinsischen apoptotischen
11
EINLEITUNG
Signalweg. Caspase-8 ist die entscheidende Initiatorcaspase des extrinsischen
Signalwegs, der durch Stimulation von Todesrezeptoren ausgelöst wird. Die
Todesrezeptoren bilden eine Untergruppe der Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor
Superfamilie, diese umfasst beispielsweise den TNF-Rezeptor 1, Fas (CD95) und
Rezeptoren, die den TNF-ähnlichen Apoptose induzierenden Liganden (TRAIL) binden.
Der intrinsische oder mitochondriale apoptotische Signalweg reagiert als Antwort auf
eine übermäßige physikalische oder chemische Belastung mit der Freisetzung des
Elektronentransportproteins Cytochrom C aus den Mitochondrien. Dies induziert die
Bildung
eines
oligomeren
Komplexes
aus
Cytochrom
C
und
Apaf-1
(apoptotic protease-activating factor 1). Dieser Komplex, der als Apoptosom bezeichnet
wird, unterstützt die katalytische Aktivierung der Initiatorcaspase-9, die dadurch in die
Lage versetzt wird, Effektorcaspasen zu spalten und Apoptose auszulösen (Demedts et
al. 2006). Zusätzlich zu diesen Caspase-abhängigen Signalwegen konnte gezeigt werden,
dass Proteasen wie Granzym B Caspasen direkt prozessieren und aktivieren können
(Darmon et al. 1995).
Zahlreiche Studien belegen erhöhte Zahlen von apoptotischen alveolären Epithel- und
Endothelzellen in emphysematösem Lungengewebe von COPD Patienten (SeguraValdez et al. 2000; Kasahara et al. 2001; Yokohori et al. 2004), was auf eine erhöhte
Apoptoserate und/oder eine verminderte Phagozytose der apoptotischen Körperchen
schließen lässt (Walsh, 2008). Darüber hinaus bietet das entzündete Lungengewebe bei
COPD den Neutrophilen, als vorherrschenden Effektorzellen, eine Umgebung, die die
Apoptose verzögert und somit das pro-inflammatorische Potential verstärkt. Zu diesen
Bedingungen tragen neben Hypoxie und bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) erhöhte
Konzentrationen an pro-inflammatorischen Mediatoren, wie GM-CSF (GranulozytenMakrophagen-koloniestimulierender Faktor) und Leukotrien B4, bei.
1.1.5 Pharmakotherapie von COPD
Die derzeitige therapeutische Behandlung von COPD beschränkt sich bisher lediglich
auf eine Minderung der Symptome, da bis heute keine pharmakologische Therapie
existiert, mit der sich die Progression von COPD aufhalten lässt (Barnes 2005). Die
einzig effektive Methode liegt in der Vermeidung von Risikofaktoren, wie dem
Tabakrauchen. Diese präventive Maßnahme kann das Fortschreiten der Erkrankung
12
EINLEITUNG
verhindern und zu einer symptomatischen Besserung führen. Zur medikamentösen
Nikotinentwöhnung eignen sich alle galenischen Formen der Nikotinersatztherapie
(Kaugummis, Pflaster, Sublingualtabletten). Auch eine Reihe von anderen Arzneistoffen
anderer Stoffgruppen erhöhen die Erfolgsquote, beispielsweise das Antidepressivum
Bupropion und der partielle α4β2-Nikotinrezeptor-Agonist Vareniclin.
Als
medikamentöse
Standardtherapie
werden
Bronchodilatoren
wie
β2-Sympathomimetika, Anticholinergika und Theophyllin eingesetzt, welche zu einer
Reduktion der Atemnot am Tage und in der Nacht, zu einer Besserung der
Lungenfunktion, einer Steigerung der Lebensqualität und einer Reduktion von
Exazerbationen führen (Man et al. 2003). Kurzwirksame β2-Sympathomimetika, wie
Salbutamol oder Fenoterol zeichnen sich durch einen schnellen Wirkungseintritt aus und
eignen sich daher als inhalatives Bedarfstherapeutikum bei akuter Atemnot. Die
langwirksamen β2-Agonisten werden im Gegensatz dazu aufgrund ihrer langanhaltenden
Wirkdauer zweimal täglich als Dauertherapie eingesetzt. Sie bewähren sich durch ihre
Effektivität vor allem bei stabiler COPD und verbessern nächtliche Symptome sowie
körperliche Belastbarkeit (Grove et al. 1996). Anticholinergika (z.B. Ipratropiumbromid,
Tiotropiumbromid) wirken durch Vagusblockade bronchodilatativ, vermindern die
Schleimsekretion und verringern das Dyspnoe-Empfinden. Darüberhinaus bessern sie
die körperliche Leistungsfähigkeit und reduzieren Exazerbationen bei Patienten mit
COPD (Disse et al. 1999). Das Methylxanthin Theophyllin weist eine schwächere
bronchiendilatierende Wirkung auf und gilt daher, auch aufgrund seiner engen
therapeutischen Breite, als Mittel der zweiten oder dritten Wahl. Interessanterweise
konnte eine Studie kürzlich belegen, dass geringe Dosen von Theophyllin die Aktivität
der HDAC2 steigern können. Theophyllin könnte somit die Steroidresistenz von COPD
neutralisieren
und
in
Kombination
mit
Glucocorticoiden
deren
suppressive,
anti-inflammatorische Effekte potenzieren (Cosio et al. 2004).
Trotz des erfolgreichen Einsatzes der inhalativen Glucocorticoide in der Therapie von
Asthma ist die Rolle von Glucocorticoiden im Management von stabiler COPD auf
spezifische Indikationen beschränkt. Glucocorticoide sind nicht in der Lage, den Abfall
des FEV1 im Langzeitverlauf zu modifizieren (Vestbo et al. 1999). Die Erklärung liegt
vermutlich darin, dass Glucocorticoide ihre Wirkung unter anderem durch Rekrutierung
der Histondeacetylase-2 (HDAC2) zu aktivierten Transkriptionskomplexen vermitteln,
wodurch aktivierte pro-inflammatorische Gene ausgeschaltet werden. Der durch das
13
EINLEITUNG
Rauchen bedingte oxidative und nitrative Stress beeinträchtigt durch die Bildung von
Peroxynitrit die HDAC2 nachhaltig in ihrer Funktion und verhindert somit den
suppressiven Effekt der Glucocorticoide (Barnes 2006). Inhalativ applizierte
Corticosteroide werden bei schweren und sehr schweren Formen von COPD (% FEV1 <
50%) angewendet, da sie in der Lage sind, Häufigkeit und Stärke von akuten
Exazerbationen zu reduzieren und damit die Lebensqualität zu verbessern (Larj und
Bleecker 2004). Darüber hinaus kommen bei akuten Verschlechterungen kurzfristig
auch systemische Steroide und Antibiotika zum Einsatz.
In Anbetracht der fehlenden Möglichkeit einer effektiven pharmakologischen Therapie
für COPD, sind die Suche nach neuen Zielstrukturen und die Entwicklung neuer
anti-inflammatorisch
wirkender
Substanzen
von
dringlicher
Bedeutung.
Trotz
zunehmenden Verständnisses von pathophysiologischen Mechanismen von COPD
wurde bisher nur ein geringer Teil an neuen Erkenntnissen in die Entwicklung effektiver
Pharmakotherapie umgesetzt. Neue prospektive Therapieansätze bietet die Entwicklung
von
Mediator-Antagonisten
und
von
neuen
anti-inflammatorischen
Behandlungsstrategien.
Angriffspunkte für neue Therapien finden sich auf molekularer Ebene der
Entzündungsmediatoren, die durch Inhibition oder Rezeptorantagonismus in ihrer
Entzündungsvermittlung
gehemmt
werden.
Die
Inhibition
des
potent
pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α mittels rekombinanter Antikörper, wie
Infliximab oder Adalimumab zeigte, im Gegensatz zum erfolgreichen Einsatz bei
rheumatoider Arthritis oder Asthma bronchiale, keinen therapeutischen Benefit bei
COPD (Rennard et al. 2007). Die therapeutische Blockade der Zytokine IL-1β, IL-6 und
IL-17 sowie CXCR1/2-, CXCR3-, und CCR5-Chemokin-Rezeptor-Antagonisten
befinden sich derzeit noch in prä-klinischer Erprobung.
Eine im Tierversuch wie auch bei Probanden bereits erfolgreich getestete Substanzklasse
bilden die Phosphodiesterase-Inhibitoren, insbesondere der Phosphodiesterase 4 (PDE4)
Inhibitor Roflumilast. Durch Hemmung der PDE4 verursacht dieser eine Anreicherung
an
zyklischem
Adenosinmonophosphat
(cAMP),
wodurch
die
Synthese
von
Entzündungsmediatoren und chemotaktischen Substanzen reduziert wird (Barnes 2005).
Aufgrund des ungünstigen Nebenwirkungspotentials durch unselektive PDE Blockade
ist allerdings eine weitergehende Substratspezifizieung unerlässlich.
14
EINLEITUNG
NF-κB als Transkriptionsfaktor inflammatorischer Gene stellt ein weiteres potentielles
Target für die antientzündliche Therapie dar. Niedermolekulare Inhibitoren von IKK2
(inhibitor of NF-κB kinase (IKK) 2) wurden bereits in Tiermodellen von COPD
untersucht, allerdings mit kontroverser Ergebnislage (Birrell et al. 2006).
Mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPK) gehören zu einer Enzymfamilie, die an der
Regulation einer Vielzahl physiologischer Prozesse beteiligt und während chronischer
Entzündung von erheblicher Bedeutung sind ist. In alveolären Makrophagen von COPD
Patienten liegt p38 MAPK in aktivierter Form vor, so dass auf eine Bedeutung dieses
Signalweges bei COPD geschlossen werden kann (Renda et al. 2008). Verschiedene
kleinmolekulare nicht-peptidische Inhibitoren der p38 MAPK, wie SB203580,
SB239063 und RWJ67657 wurden in den letzten Jahren entwickelt und werden in
klinische Studien untersucht.
Die Antagonisierung von Proteasen verfolgt das Ziel, die proteolytische Schädigung des
Lungengewebes zu stoppen. Dies geschieht einerseits durch den Ersatz endogener
Antiproteasen wie α1-Antitrypsin oder SLPI. Ein anderer Ansatz liegt in der
Entwicklung von Inhibitoren aktiver Proteasen, vor allem der neutrophilen Elastase und
Matrixmetalloproteinase. Allerdings zeigen klinische Studien bislang nicht den
gewünschten Effekt.
Da der Entzündungsprozess der COPD gegenüber dem anti-inflammtorischen Potenzial
der Glucocorticoide weitgehend resistent ist, fokussieren sich therapeutische Strategien
nunmehr auf die Umkehr dieser Resistenz. Hierfür eignet sich beispielsweise
Theophyllin, welches in der Lage ist, in niedrigen Dosen die Aktivität der HDAC2 zu
erhöhen. Auch der Einsatz von Antioxidantien als Induktoren der HDAC2 ist denkbar.
Als logische Folgerung wird auch die Entwicklung von neuen HDAC2 Aktivatoren
angestrebt.
1.2 Signaltransduktionskaskade der MAP Kinasen
Mitogen-aktivierte Proteinkinasen sind eine Gruppe von Serin/Threonin spezifischen
Proteinkinasen und regulieren diverse Prozesse, welche von Proliferation und
Differenzierung bis zu Apoptose reichen. Aktiviert durch eine Reihe von Stimuli,
werden durch MAP Kinasen zahlreiche Proteine phosphoryliert, darunter befinden sich
15
EINLEITUNG
unter anderem Transkriptionsfaktoren, wie NF-κB oder Aktivator Protein 1 (AP-1),
zytoskeletale Proteine, Kinasen und andere Enzyme.
Eine MAPK-Kaskade besteht aus drei sequentiell agierenden Proteinkinasen, die jeweils
nach Aktivierung über membranständige Rezeptoren durch Phosphorylierung an
spezifischen Aminosäureresten aktiviert werden. Im Falle der beiden erstaktivierten
Enzyme, der MAP Kinase Kinase Kinase (MAPKKK) und MAP Kinase Kinase
(MAPKK), sind dies durch eine einzelne Aminosäuren getrennte Serin- und
Threoninreste, bei der MAP Kinase (MAPK) dagegen ein Threonin- und ein Tyrosinrest,
die dual phosphoryliert werden. Die regulatorische Inaktivierung der MAP Kinasen
erfolgt mittels Dephosphorylierung durch MAP Kinase-Phosphatasen (MKP), die zur
Familie der Dual-Specifity-Protein-Phosphatasen (DUSP) gehören.
Abbildung 2
MAPK-Signaltransduktionskaskaden
aus (Liu et al. 2007)
Extrazelluläre Stimuli aktivieren GTPase-vermittelt (RAS, RAC, CDC42) die MAPK Signalwege. Die Aktivierung
verläuft jeweils über eine dreistufige Phosphorylierungskaskade (MAPKKK, MAPKK, MAPK). Die aktivierten
MAPKs (ERK, JNK, p38) translozieren in den Nukleus und phosphorylieren dort eine Reihe von
Transkriptionsfaktoren. Der ERK Signalweg wird vor allem durch Wachstumsfaktoren, JNK und p38 Kaskaden eher
durch Stress und inflammatorische Zytokine aktiviert.
16
EINLEITUNG
Bis heute sind drei MAP Kinasen ausführlicher charakterisiert worden, die jeweils in
einer gut definierbaren Signalkette involviert sind. Zu diesen gehören die
Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 und 2 (ERK1/2 auch p44/42MAPK genannt),
die c Jun-N-terminale Kinase (JNK) und p38 mitogen-aktivierte Proteinkinase (Cobb
und Goldsmith 1995). Während die ERK Signalkaskade vorwiegend mit der Regulation
der Zellproliferation assoziiert ist und vor allem durch Wachstumsfaktoren aktiviert
wird, gelten p38 MAPK und JNK als so genannte Stresskinasen. Sie werden durch eine
Reihe von extrinsischen und intrinsischen Stress-Stimuli aktiviert, dazu zählen
oxidativer Stress, UV-Strahlung, Hitze sowie pro-inflammatorische Zytokine, wie
TNF-α und IL-1β (Liu et al. 2007).
Die MAP Kinase p38 wird eng mit chronischer Entzündung assoziiert und ist im Bezug
auf Entzündungsantworten eine der meist untersuchten Kinasen. Auch eine Beteiligung
in der Pathogenese von COPD liegt nahe. Zahlreiche in vivo Untersuchungen belegen
eine Rolle von p38 MAPK in der LPS-induzierten Lungenschädigung: Neutrophilie,
Zytokin- und Chemokinproduktion sowie Bronchokonstriktion scheinen durch p38
vermittelt zu sein (Kim et al. 2006; Liu et al. 2008; Medicherla et al. 2008). Kürzlich
wurde
nachgewiesen,
dass
COPD
Patienten
in
Alveolarmakrophagen
sowie
Endothelzellen erhöhte Mengen von aktivierter p38 MAPK aufweisen (Renda et al.
2008).
Im Asthma-Modell der IL-13-induzierten pulmonalen Inflammation ist die ERK1/2
Signalkaskade nachgewiesenermaßen von entscheidender Bedeutung (Lee et al. 2006).
Die Rolle von ERK bei COPD scheint hingegen nicht vollständig geklärt. Es konnte
bereits in in vitro Studien gezeigt werden, dass durch Blockade von MEK1/2, der
vorgelagerten Kinase von ERK1/2, die Freisetzung von pro-inflammatorischen
Zytokinen aus LPS-stimulierten pulmonalen Makrophagen und Monozyten inhibiert
werden kann. Interessanterweise konnte durch Inhibition von p38 ebenfalls die
Zytokinfreigabe aus Monozyten, nicht dagegen aus Makrophagen, reduziert werden
(Tudhope et al. 2008). Diese Beobachtungen implizieren nicht nur eine Beteiligung von
p38 MAPK, sondern auch eine beachtliche Rolle des ERK1/2 Signalweges an
Makrophagen-vermittelten Entzündungen, wie im Falle der COPD vorliegend.
17
EINLEITUNG
1.3 Auflösung der Inflammation
Die umfassende Auflösung einer akuten Entzündung (im Englischen: Resolution of
Inflammation) und die Rückkehr zur Homöostase ist für gesundes und intaktes Gewebe
von essentieller Bedeutung. Dieser Prozess kann auf zellulärer Ebene durch das
Verschwinden von polymorphnukleärer Leukozyten und auf makroskopischen Level
durch die Rekonstruktion der Gewebearchitektur und Wiederherstellung der
Gewebefunktion definiert werden (Willoughby et al. 2000). Die von Celsus und Galenus
postulierten fünf Kardinalzeichen calor (Überwärmung), rubor (Rötung), dolor
(Schmerz), tumor (Schwellung) und functio laesa (gestörte Funktion) beschreiben die
Abweichungen von gesunder Gewebehomöostase während einer akuten Entzündung.
Bei einer typischen akuten Inflammation handelt es sich um eine bemerkenswert
konservierte zeitliche Abfolge von Ereignissen. Nach einem initialen Anstieg der
Plasmaexsudation akkumulieren polymorphnukleäre Leukozyten als erste Front von
Entzündungszellen im entzündeten oder infizierten Gewebe. Diese zirkulierenden
neutrophilen oder eosinophilen Granulozyten migrieren auf chemotaktischen Reiz via
transzellulärer Diapedese durch das Endothelium in das verletzte Gewebe. Jene
aktivierten Leukozyten neutralisieren und eliminieren potenziell schädliche Stimuli
mittels Phagozytose. Die Entfernung des auslösenden Stimulus beendet die weitere
Synthese pro-inflammatorischer Mediatoren, wie Eicosanoiden, Chemokinen und
Zytokinen.
Weiterhin
werden
Faktoren
freigesetzt,
die
die
fortschreitende
Leukozyteninfiltration und Ödembildung unterbinden. Da neutrophile und eosinophile
Granulozyten das ohnehin bereits entzündete Gewebe zusätzlich schädigen können,
werden sie kontrolliert und effektiv entsorgt. Eine Möglichkeit wäre die systemische
Rezirkulation, allerdings stellt die Apoptose der Leukozyten den weitaus wichtigeren
Eliminationsweg dar. Zellen, die ihre Funktion als Phagozyten beendet haben, werden
dem programmierten Zelltod unterzogen. Die Apoptose der polymorphnukleären
Leukozyten führt zu erniedrigten Level von pro-inflammatorischen Zytokinen am
Entzündungsort. Der initialen Akkumulation von Neutrophilen schließt sich eine
verzögerte Infiltration von Monozyten an. Diese differenzieren zu Makrophagen und
entfernen die verbleibenden apoptotischen polymorphnukleären Leukozyten mittels
nicht-phlogistischer
pro-inflammatorischen
Phagozytose,
Mediatoren
d.h.
sowie
ohne
weitere
Stimulation
der
Formation
von
Bildung
von
anti-inflammatorischen Substanzen, wie z.B. Transforming Growth Factor (TGF)-β,
18
EINLEITUNG
Lipoxin A4 und IL-10 (Lucas et al. 2003; Freire-de-Lima et al. 2006). Die Makrophagen
verlassen nach der Elimination apoptotischer Leukozyten das Gewebe entweder durch
Apoptose oder über das lymphatische System.
Eine wesentliche Erkenntnis der Forschung auf dem Gebiet der Entzündung der letzten
Jahre ist, dass sowohl Evolution als auch die Resolution aktive Vorgänge der
inflammatorischen Antwort sind. Bei der Auflösung einer Inflammation werden
spezifische molekulare Ereignisse aktiviert, die zur Entfernung inflammatorischer Zellen
und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beitragen. Bestimmte Lipidmediatoren
werden zu definierten Zeitpunkten der entzündlichen Immunantwort generiert und
hemmen sowohl die Infiltration von Granulozyten, als auch aktivieren und
beschleunigen die Auflösung der Entzündung. Diese Lipidmediatoren leiten sich von
den
mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren
(polyunsaturated
fatty
acids,
PUFA)
Arachidonsäure (AA) und den ω-3 PUFA Eicosapentaensäure (EPA) sowie
Docosahexaensäure (DHA) ab. Diese so genannten Lipoxine und Resolvine agieren als
endogene
Rezeptoragonisten
und
besitzen
anti-inflammatorische
sowie
auflösungsfördernde Eigenschaften.
Lipoxine stellen eine Gruppe von Lipidmediatoren dar, die sich aus der Arachidonsäure
ableiten. Lipoxin A4 (LXA4) und Lipoxin B4 (LXB4) agieren als potente „Stopp-Signale“
für die PMN-Infiltration in das entzündete Gewebe. Darüber hinaus stimulieren
Lipoxine die Rückkehr der vaskulären Permeabilität zur Homöostase und wurden
kürzlich als potente anti-ödematogene Mediatoren entdeckt (Menezes-de-Lima et al.
2006). Lipoxine tragen zur Auflösung der Entzündung bei, indem sie sowohl die
nicht-phlogistische Rekrutierung von mononukleären Zellen als auch die Aufnahme von
apoptotischen PMN durch Makrophagen stimulieren (Maderna et al. 2005).
Zell-Zell-Kontakte gelten als Initiatoren der Lipoxin-Biosynthese.
Resolvine sind oxidierte Metaboliten der ω-3 Fettsäuren Eicosapentaensäure und
Docosahexaensäure und werden über enzymatische Stoffwechselwege generiert. Die
Terminologie Resolvin oder resolution-phase interaction products geht auf Prof. Charles
N. Serhan und Kollegen zurück, die jene Substanzen in entzündlichen Exsudaten
entdeckten. Die Gruppe der 18R Resolvine der E Serie beinhaltet das stereospezifische
Resolvin E1, welches aus EPA biosynthetisiert wird. In vaskulären Endothelzellen, die
durch Acetylsalicylsäure acetylierte COX-2 Enzyme enthalten wird EPA umgesetzt und
daraufhin in Neutrophilen unter Beteiligung der 5-Lipoxygenase zu Resolvin E1 oxidiert
19
EINLEITUNG
(Bannenberg et al. 2007). Resolvin D1 und D2 gehören zu den 17S Resolvinen der D
Serie und werden analog zu Resolvin E aus Docosahexaensäure, allerdings auch in
Abwesenheit von Acetylsalicylsäure, biosynthetisiert. Die stereospezifischen Resolvine
weisen deutliche anti-inflammatorische und immunregulatorische Eigenschaften im
pico- bis nanomolaren Bereich auf. Die Lipidmediatoren sind wie die Lipoxine aktiv an
der Auflösung einer Entzündung beteiligt und agieren als potente Regulatoren der PMNTransmigration.
Arzneistoffe wie COX-Inhibitoren besitzen zwar potente anti-inflammatorische
Eigenschaften, sie verzögern allerdings die Entzündungsauflösung und gelten daher als
resolution-toxic (Serhan 2007). Glucocorticoide hingegen sind sowohl effektiv
anti-inflammatorisch und fördern überdies die Entzündungsauflösung durch Induktion
der PMN-Apoptose und Phagozytoseaktivität von Makrophagen (Gilroy et al. 2004).
CDK-Inhibitoren wie R-Roscovitine (Seliciclib) bieten einen neuen anti-entzündlichen
Therapieansatz. Sie induzieren die Apoptose von Neutrophilen und beschleunigen so die
Resolution (Hallett et al. 2008).
1.4 Tiermodelle der COPD
Um die Pathogenese von Erkrankungen weitergehend zu erforschen, sind Tierversuche
bzw. Tiermodelle oftmals unerlässlich. Sie ermöglichen es, Abläufe und Mechanismen
im Krankheitsgeschehen nachzuvollziehen und aufgestellte Hypothesen zu überprüfen.
Tiermodelle der COPD sind in vielerlei Hinsicht nicht unproblematisch, zum einen weil
es sich bei COPD nicht um eine einzige, scharf definierte Erkrankung handelt und zum
anderen weil sie deutlich symptomorientiert definiert wird. Bei COPD eröffnen
Tiermodelle die Möglichkeit molekulare und zelluläre Mechanismen der Pathogenese,
insbesondere die abnormale Immunantwort in den Atemwegen und der Lunge auf
schädliche Partikel und Gase besser zu verstehen. Um Mechanismen des angeborenen
und des adaptiven Immunsystems zu untersuchen favorisiert man als Versuchstiere
Mäuse, da sie einzigartige Möglichkeiten der genetischen Manipulation bieten und
überdies schon langjährige Erfahrungen mit der Maus als Versuchstier bestehen.
Darüber hinaus unterstützen Tiermodelle die Entwicklung neuer Wirkstoffe und
Therapiemöglichkeiten, indem prospektive Strategien auf ihre Wirksamkeit überprüft
20
EINLEITUNG
werden können und somit eine Art Rahmenbedingung für rationales und sicheres Design
von klinischen Studien schaffen.
Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die zum Ziel haben in Mausmodellen
charakteristische Krankheitsbedingungen von COPD nachzuahmen. Einerseits nutzte
man die Instillation von Gewebe degradierenden Enzymen, um emphysemähnliche
Läsionen des Lungengewebes hervorzurufen (Snider 1986). Daneben wurden Techniken
der genetischen Modifizierung angewandt, um einen mit COPD vergleichbaren
Phänotyp in der Maus zu erzeugen (Shapiro 2000). Eine weitere Alternative an
Tiermodellen
der
COPD
bieten
Expositionsmodelle.
Da
Zigarettenrauch
als
Hauptrisikofaktor für die Entstehung von COPD gilt, wurde ein besonderes Augenmerk
auf Tiermodelle basierend auf der Inhalation von Zigarettenrauch oder seinen
wichtigsten Derivaten, wie Lipopolysaccharid gerichtet.
Das Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) ist integraler und essentieller Bestandteil von
Zellwänden von gramnegativen Bakterien und gilt als potenter inflammatorischer
Stimulus. Sein Vorkommen ist ubiquitär, besonders hohe Konzentration finden sich in
organischen Stäuben und dem Zigarettenrauch (Hasday et al. 1999). LPS besteht aus
einem Polysaccharidanteil (O-Antigen, äußere Kernregion, innere Kernregion) und dem
hoch konservierten Lipid A Teil. LPS vermittelt seine inflammatische Potenz über
Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) und CD14 Interaktion. CD14 ist ein Glykoprotein, das
sowohl in membranständiger Form auf Monozyten, Makrophagen und Neutrophilen,
sowie in löslicher Form im Plasma vorkommt. Vermittelt wird die Bindung von LPS an
CD14 durch das LPS Binding Protein (LBP), einem Akute-Phase-Plasmaprotein
(Hailman et al. 1996). CD14 und LBP wiederum sind essentiell für die Aktivierung von
TLR4. Dies resultiert in einer Aktivierung von NF-κB sowie der MAPK Signalkaskade
und somit letztlich in der Produktion von TNF-α sowie weiteren pro-inflammatorischen
Zytokinen (Togbe et al. 2007).
Verschiedene Studien konnten nachweisen, dass die Inhalation von LPS eine akute und
chronische pulmonale Entzündung verursacht. Diese Entzündung geht einher mit
massiver Neutrophilie, der Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und
Chemokinen, Ödembildung sowie reduzierter Lungenfunktion (Vernooy et al. 2002;
Brass et al. 2003).
21
EINLEITUNG
1.5 Zielsetzung dieser Arbeit
In Anbetracht mangelnder spezifischer Therapiemöglichkeiten der chronisch obstruktiven
Lungenerkrankung war das Ziel dieser Arbeit, neue potentielle pharmakotherapeutische
Ansätze auf ihre Wirksamkeit zu untersuchen. Hierzu wurden verschiedene Substanzen
sowohl in vitro als auch in vivo getestet. Das für die in vivo Untersuchungen verwendete
Inhalationsmodell
der
akuten
LPS-induzierten
Lungenschädigung
imitierte
die
pathophysiologischen Vorgänge während einer akuten Exazerbation von COPD.
Aus der Literatur ist bekannt, dass der ERK MAPK Signalweg eine bedeutende Rolle bei
IL-13-induzierten asthmaähnlichen Entzündung spielt. Darüber hinaus konnte gezeigt
werden, dass im Tiermodell die Blockade von p38 MAPK effektiv die LPS-induzierte
Atemwegsentzündung reduzierte. Eine Hypothese dieser Arbeit war, dass auch die ERK
Signaltransduktionskaskade
eine
entscheidende
Rolle
bei
der
LPS-vermittelten
Lungenschädigung spielt und die Blockade dieses Signalweges anti-inflammatorische
Effekte haben könnte. Um dies zu untersuchen, wurde im ersten Teil der vorliegenden
Arbeit der MEK1/2 Inhibitor U0126 auf seine Wirkungen im Tiermodell der akuten
LPS-induzierten Lungenschädigung untersucht. In diesem in vivo Modell waren unter
anderem als Kennzeichen für die Entzündung die Zahl an Immunzellen und die
Zytokinkonzentration in der bronchoalveolären Lavage (BAL) von Interesse.
Chronische inflammatorische Erkrankungen sind im Gegensatz zu akuten Prozessen nicht
selbst auflösbar. Ein wichtiges Ziel der Forschung auf dem Gebiet chronischer
Inflammation ist es, pharmakotherapeutisch nicht nur anti-inflammatorisch einzugreifen,
sondern auch aktiv die Auflösung einer Entzündung zu fördern. Da dieser Ansatz nicht
durch die prophylaktische Gabe von Substanzen sondern vielmehr durch die
therapeutische
Applikation
verfolgt
werden
kann,
wurden
das
Glucocorticoid
Dexamethason und der CDK-Inhibitor Roscovitine auf ihre therapeutische Wirkung im
LPS-Modell untersucht.
Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der adaptiven Immunität bei
COPD untersucht. Das Zytokin IFN-γ gilt als Schlüsselmediator der Th1-vermittelten
Immunantwort. Mit Hilfe von bizistronischen IFN-γ-Reportermäusen (Yeti-Mäuse) wurde
der durch LPS-Inhalation generierte Phänotyp der Immunantwort analysiert. Darüber
hinaus wurden die Effekte der Neutralisierung von IFN-γ mittels Antikörpern sowohl in
Reportermäusen als auch in Balb/c Mäusen im LPS-Modell evaluiert.
22
MATERIAL UND METHODEN
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien und Biochemikalien
SUBSTANZ
BEZUGSQUELLE
Dexamethason
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
EDTA-Dinatriumsalz, Dihydrat
Applichem (Darmstadt, D)
Eosin
Roth (Karlsruhe,D)
FCS
PAN-Biotech GmBH (Aidenbach, D)
Formaldehyd, ca.36%
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
Hämatoxillin
Roth (Karlsruhe,D)
Hank´s Lösung
Apotheke des Universitätsklinikums (Erlangen, D)
HBSS 10x
Invitrogen (Karlsruhe,D)
HEPES 1M
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
Histofix
(4%
Formaldehydlösung, Roth (Karlsruhe,D)
phosphatgepuffert)
Histopaque®- 1077
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
Isopropanol
Applichem (Darmstadt, D)
Kollagenase D
Roche Diagnostics (Mannheim, D)
LPS aus E.coli Serotyp 026:B6
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
Methanol
Applichem (Darmstadt, D)
PMSF
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
Rolipram
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
Rotihistol
Roth (Karlsruhe,D)
RPMI-1640
Invitrogen (Karlsruhe,D)
U0126
Tocris (Ellisville, USA)
Saponin
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
HTAB
Sigma-Aldrich (Steinheim, D)
23
MATERIAL UND METHODEN
Roscovitine
LC Laboratories (Woburn, USA)
PBS
Invitrogen (Karlsruhe,D)
Tabelle 2
Substanzen
2.1.2 Verbrauchsmaterialien
BEZEICHNUNG
HERSTELLER
384-well Platten
ABgene (Surrey, UK)
96-well-NUNC™-Immuno Platte (Microtiterplatten NUNC (Rosklide, DK)
für ELISA)
BD InSyte™ Venenverweilkanüle, 24G
BD Biosciences (Heidelberg, D)
EDTA-Monovetten, S-Monovette
Sarstedt (Nümbrecht, D)
Venenpunktionsbesteck (Venofix)
Braun (Melsungen, D)
Tabelle 3
Verbrauchsmaterialien
Sämtliches Zellkulturmaterial wurde, falls nicht anderweitig genannt, bei BD Biosciences
(Heidelberg, D) erworben.
2.1.3 Primer und Sonden
Die Primer und Sonden für humanes β-Aktin und humanes MKP-1 stammten von
Biomol GmbH (Hamburg, D). Assay on Demand (AOD) Primer wurden von Applied
Biosystems (Darmstadt, D) bezogen.
ZIELGEN
h β-Aktin
VORWÄRTSPRIMER
TCA CCC ACA CTG
RÜCKWÄRTSPRIMER
CAG CGG AAC CGC TCA
TGC CCA TCT ACG A TTG CCA ATG
G
h MKP-1
h DUSP-2, -3, -4
Tabelle 4
SONDE
6FAM-Atg CCC XT CCC
CCA TgC CAT CCT gCg T
p
TGG TTC AAC GAG
GGC AGA TGG TGG CAG AGG AAG GGT GTT TGT
GCC ATT G
ACC
CCA CTG CA GG
AOD (Assay ID: HS00358879, Hs00187940, Hs00154826)
Verwendete Primer
24
MATERIAL UND METHODEN
2.1.4 Antikörper
BEZEICHNUNG
BEZUGSQUELLE
Anti-Phospho-ERK1/2 (T202/Y204):Alexa Fluor® BD Biosciences (Heidelberg,D)
488
Anti-Phospho-p38
MAPK
(T180/Y182):Alexa BD Biosciences (Heidelberg,D)
Fluor® 488
Alexa Fluor® 488 Mouse IgG1, κ Isotyp Ctrl (FC)
BioLegend (San Diego. USA)
LEAF™ purified anti-mouse IFN-γ
BioLegend (San Diego. USA)
Clone R4-6A2
LEAF™ purified rat IgG1, κ Isotype control clone BioLegend (San Diego. USA)
RTK2071
PE anti-mouse CD4
BioLegend (San Diego. USA)
PE anti-mouse CD8a
BioLegend (San Diego. USA)
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε
BioLegend (San Diego. USA)
Streptavidin-Alexa Fluor® 488
Invitrogen (Karlsruhe, D)
Biotin anti-mouse IFN-γ
BioLegend (San Diego. USA)
Tabelle 5
Verwendete Antikörper
2.1.5 Käuflich erworbene Systeme
BEZEICHNUNG
HERSTELLER
Mouse MIP-2 und KC DuoSet
R&D Systems (Wiesbaden-Nordenstadt, D)
OptEIA Sets Human IL-2 und TNF-α
BD Biosciences (Heidelberg, D)
OptEIA Sets Mouse IL-10 und TNF-α
BD Biosciences (Heidelberg, D)
PathScan Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) Cell Signaling (Danvers, USA)
Sandwich ELISA Kit
PathScan Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Cell Signaling (Danvers, USA)
Sandwich ELISA Kit
QuantiTect™ Probe RT-PCR Kit
Qiagen (Hilden, D)
RNeasy™ Mini Kit
Qiagen (Hilden, D)
Tabelle 6
Käuflich erworbene Systeme
25
MATERIAL UND METHODEN
Falls nicht anderweitig angegeben, wurden alle Kits entsprechend den Herstellerangaben
verwendet.
2.1.6
Geräte und Software
BEZEICHNUNG
HERSTELLER
ABI Prism 7900
Applied Biosystems (Darmstadt, D)
BD FACScan™ und BD CellQuest™ Software
BD Biosciences (Heidelberg, D)
Biophotometer
Eppendorf (Hamburg, D)
Cytospinzentrifuge Shandon Cytospin 4
Thermo Scientific (Waltham, USA)
ELISA Reader und Washer
Dynatech (West Sussex, UK)
Mikroskop Axioplan mit Axiophot Kamerasystem
Zeiss (Oberkochen, D)
Microtom
Sysmex F-520 Hämatologie-Analysator
Sysmex (Norderstedt, D)
Vernebelungapparatur Nebulizer Control-5
Buxco (Wilmington, USA)
Zentrifugen 5417R und 5810
Eppendorf (Hamburg, D)
Tabelle 7
Geräte und Software
26
MATERIAL UND METHODEN
2.2 Methoden
2.2.1 Isolierung von PBMC aus humanem Vollblut
Peripher mononukleäre Zellen (B-Zellen, T-Zellen, Monozyten und NK-Zellen) wurden
aus
venösem
EDTA-Blut
von
gesunden
freiwilligen
Spendern
mittels
Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Hierzu wurden die Blutproben zu gleichen Teilen
mit Hank´s Lösung verdünnt, vorsichtig auf Histopaque-1077 geschichtet und 20 min bei
742*g ohne Bremsvorgang zentrifugiert. Während Erythrozyten und Granulozyten das
Histopaque mit einer definierten Dichte von 1,077g/ml passieren und sedimentieren,
sammeln sich mononukleäre Zellen in der Interphase an. Dieser sichtbare PBMC-reiche
Film an der Oberfläche des Histopaques wurde abgenommen und zweimal mit Hank`s
Lösung gewaschen (jeweils 5min bei 515*g). Die Zellzahl an isolierten mononukleären
Zellen wurde mittels eines Hämozytometers (Sysmex) bestimmt. Anschließend wurden
die Zellen zu einer Dichte von 1*106 Zellen/ml in RPMI-1640 Medium resuspendiert. Die
Zellen wurden in 24-well-Zellkulturplatten in Volumina von jeweils 500µl ausgesät und
über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
2.2.2 Gewinnung von Monozyten
PBMC wurden in RPMI-1640-Medium bei 37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert.
Monozyten
können
aufgrund
ihrer
adhärierenden
Eigenschaften
von
den
non-adhärierenden Lymphozyten durch Mediumwechsel separiert werden.
2.2.3 Behandlung und Stimulation von isolierten PBMC
Die Zellen wurden in 500µl-Volumina in einer Dichte von 1*106 Zellen/ml über Nacht
bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Im Anschluss wurden die Zellen mit verschiedenen
Konzentrationen an U0126 (in DMSO gelöst) für 30 Minuten ebenfalls unter den obigen
Bedingungen inkubiert. Die darauf folgende Stimulation erfolgte mit α-CD3/CD28
Dynabeads® (2µl/well) oder TPA (50ng/ml). Monozyten wurden mit LPS (1mg/ml)
stimuliert. Zu den entsprechenden Zeitpunkten wurden zur Bestimmung von
Zytokin-Proteinen die Überstände abgenommen und bei -20°C gelagert. Die Zellen
wurden mit RLT-Lyse-Puffer lysiert und bis zur RNA-Isolation bei -80°C gelagert.
27
MATERIAL UND METHODEN
2.2.4 Quantifizierung von mRNA mittels real-time RT-PCR
Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gilt als eine sehr
sensitive Methode zur Detektion geringer Mengen an mRNA. Aus Zell-Lysaten wurde
mittels RNeasy® Mini Kit gemäß Vorschrift RNA isoliert. Es wurde eine sog. „One-step
real time RT-PCR“ unter Verwendung von QuantiTect Probe RT-PCR-Kits durchgeführt.
Die Expression von relevanten Genen wurde in Relation zu β-Aktin mittels TaqMan
Assay in einem ABI Prism 7900-Gerät gemessen. Eine relative Quantifizierung der
mRNA-Menge erfolgte durch Verwendung der ∆∆Ct-Methode. β-Aktin wurde als
interner Standard (sog. Housekeeping-Gen) eingesetzt, um die erhaltenen mRNA-Level
auf β-Aktin zu normalisieren: Ct(β-Aktin) - Ct(Zytokin) = ∆Ct. Der erhaltene Wert wurde
um den ∆Ct Wert der Kontrolle bereinigt, welche mRNA Level von unstimulierten Zellen
darstellt: ∆Ct - ∆Ct (Kontrolle) = ∆∆Ct. Die Berechnung der relativen mRNA-Menge
erfolgte dann als 2-∆∆Ct. (Applied Biosystems User Bulletin 2; ABI PRISM 7700
Sequence Detection System, 1997).
2.2.5 ELISA
2.2.5.1 Zytokinmessung in Überständen von Zellkultur und bronchoalveolärer
Lavage
Zur Bestimmung der Proteinmenge in Überständen von PBMC und muriner BAL wurden
ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) Analysen durchgeführt. Quantitative
Zytokinmessungen (h-TNF-α, h-IL-2, m-TNF-α, m-MIP-2, m-KC and m-IL-10) erfolgten
durch Sandwich-ELISA unter Verwendung von kommerziell erhältlichen ELISA Kits
(BD
Biosciences,
R&D
Systems).
Die
Durchführung
erfolgte
gemäß
den
Herstellerangaben. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 450nm mit einer
Referenzwellenlänge von 570nm mit Hilfe eines Photometers für Mikrotiterplatten
(Dynatech) bestimmt. Die quantitative Auswertung der Proben erfolgte unter Verwendung
der jeweiligen aus sieben Messpunkten bestehenden Standardkurven.
28
MATERIAL UND METHODEN
2.2.5.2 Detektion von phosphorylierter p44/p42 MAPK und p38 MAPK mittels
ELISA
Zur Bestimmung der Menge an aktivierter ERK und p38 MAPK in Lungenhomogenisaten
wurden ein PathScan® Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) Sandwich ELISA Kit
sowie ein PathScan® Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Sandwich ELISA Kit (Cell
Signaling) verwendet. Diese basieren als Sandwich-ELISA auf dem Prinzip der
Festphasenadsorption
(Solid-Phase-Technik),
ein
Phospho-p44/42
bzw.
p38
MAPK-Kaninchen-Antikörper liegt bereits in adsorbierter Form an den Mikrotiterplatten
vor. Es werden endogene Level der p44/p42 bzw. p38 MAPK mittels MAPK
Detektionsantikörpern detektiert, sobald diese bei Thr202/Tyr204 (ERK) bzw.
Thr180/Tyr182 (p38) phosphoryliert sind. Ein Meerrettichperoxidase-konjugierter
Antikörper sowie TMB Substrat werden hinzugefügt, um eine Farbreaktion zu erzeugen.
Die optische Dichte, die bei 450nm photometrisch ermittelt wird, ist direkt proportional
zur Menge an phosphorylierter p44/p42 MAPK bzw. p38 MAPK.
2.2.6 Durchflusszytometrische Bestimmung von pp38 und pERK1/2 mittels
phosphospezifischer Antikörper
Die FACS-Analyse (fluorescence activated cell sorting) ermöglicht die Charakterisierung
von Antigenen auf und in einer Zelle mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern,
darüber hinaus sind Zellen hinsichtlich Größe und Granularität durch unterschiedliche
Streulichtemissionen differenzierbar. Entlang der Achse des einfallenden Lichtes wird die
Durchlichtbrechung erfasst (FSC, Forward Scatter), die eine Aussage über die relative
Zellgröße zulässt. Senkrecht dazu wird das Seitwärtsstreulicht registriert (SSC, Side
Scatter), das proportional zur Zellgranularität ist. Drei weitere Detektoren (FL1-3)
nehmen spezifisch die unterschiedlichen Emissionswellen der eingesetzten Fluorochrome
in definierten Bereichen auf.
Die Bestimmung von phosphorylierten Mengen der beiden MAP Kinasen p38 und
ERK1/2
in
humanen
PBMC
erfolgte
durchflusszytometrisch
mit
Hilfe
von
phosphospezifischen Antikörpern. Der Versuchsablauf wurde an das etablierte Verfahren
von Krutzik und Nolan (Krutzik und Nolan 2003) adaptiert.
Humane frisch isolierte PBMC wurden in einer Dichte von 1*106Zellen/ml in Volumina
von jeweils 1ml in 5ml Rundbodenröhrchen ausgesät und über Nacht im Brutschrank
29
MATERIAL UND METHODEN
inkubiert. Die Zellen wurden mit U0126 (1µM) vorbehandelt und nach 30 min bei 37°C,
5%CO2 mit TPA (50ng/ml) stimuliert. Nach 15 min wurden die Zellen mit Formaldehyd
(Endkonzentration 1,5%) fixiert. Die Permeabilisierung der Zellpellets erfolgte mit 1ml
100% eiskaltem Methanol unter starkem Vortexen und anschließender 30-minütiger
Inkubation bei 4°C. Nach zweimaligem Waschen mit FACS-Puffer (PBS mit 1% FCS)
wurden die Zellen mit den entsprechenden Mengen an Antikörpern (α-pp38, α-pERK1/2
und Isotypkontrolle) versetzt und 1 h bei RT unter Lichtabschluss inkubiert. Nach
erneutem Waschvorgang wurden die Zellen in 500µl FACS-Puffer aufgenommen und am
Durchflusszytometer vermessen.
2.2.7 Mausmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung
2.2.7.1 Versuchstiere
Für die meisten in vivo Untersuchungen dienten männliche Balb/c Mäuse (Harlan,
Borchen, D) als Versuchstiere. Bizistronische IFN-γ-eYFP (IFN-γ-enhanced Yellow
Fluorescent Protein), sog. Yeti Mäuse (Stetson et al. 2003) wurden freundlicherweise von
Prof.
A.
Gessner
(Mikrobiologisches
Institut,
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg) zur Verfügung gestellt. Die Tiere waren zu Beginn der Experimente
im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 22-25g. Sie wurden unter konstanten
Bedingungen (Temperatur 20 ± 2°C, Luftfeuchtigkeit 40-60%, 12h Tag-Nacht-Rhythmus)
gehalten und hatten freien Zugang zu Futter (Altromin, Lage, D) sowie Trinkwasser. Alle
Tierversuche
wurden
unter
Berücksichtigung
des
deutschen
Tierschutzgesetzes
durchgeführt und durch die Regierung von Mittelfranken genehmigt.
2.2.7.2 Behandlungsprotokoll
Zur Untersuchung prophylaktischer Wirkungen von Substanzen wurden U0126
(30mg/kg), Dexamethason (2,5mg/kg), Rolipram (10mg/kg) und Roscovitine (10mg/kg)
2h vor LPS-Vernebelung i.p. oder i.t. verabreicht. Die prophylaktische intra tracheale
Gabe erforderte eine geringere Dosierung von Dexamethason (1mg/kg). Sollten
therapeutische Wirkungen der Substanzen untersucht werden, erfolgte die Applikation 6h
nach der LPS-Provokation. Die Substanzen wurden in PBS unter Zusatz von 5% DMSO
30
MATERIAL UND METHODEN
gelöst, es wurden Volumina von 200µl i.p. und 50µl i.t. appliziert. Die Gabe von PBS und
DMSO diente als Kontrollbedingung.
Bei den Versuchen zur IFN-γ-Neutralisierung wurden LEAF™ purified anti-mouse IFN-γ
und LEAF™ purified rat IgG1 κ Isotype control Antikörper verabreicht. Es wurde jeweils
250µl Antikörper (1mg/ml) mit 150µl PBS verdünnt und somit 400µl i.p. 24h vor der
LPS-Inhalation appliziert.
Die LPS-Provokation erfolgte durch Vernebelung einer LPS-Lösung (10mg LPS in NaCl,
1,5mg/ml) mit Hilfe einer Vernebelungsapparatur. Die Inhalation umfasste 5-6 Zyklen,
bestehend aus 10 min Vernebelung und 5 min Trocknung. Naive Mäuse dienten als
Negativkontrollen. Als Positivkontrollen wurden Tiere mit Vehikel behandelt und
inhalierten LPS. Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Tiermodell der akuten
LPS-induzierten Lungenschädigung diente nicht als Modell der COPD, sondern spiegelte
vielmehr die pathophysiologischen Vorgänge während einer akuten Exazerbation der
Erkrankung wider.
Die Tötung der Tiere erfolgte durch Inhalation von CO2 je nach Versuchsablauf 2h, 6h,
24h oder 72h nach LPS-Vernebelung.
2.2.7.3 Bronchoalveoläre Lavage
Die Trachea der getöteten Tiere wurde durch Entfernung von Haut und Fell, sowie von
umliegendem Gewebe, exponiert und mit einer 24G Kanüle punktiert. Die Lungen
wurden pro Tier 6x mit 0,5ml HBSS, versetzt mit 100mM Na-EDTA und 10mM HEPES
Puffer, gespült. Die Rückgewinnungsrate lag durchschnittlich bei 80-90%. Die so
erhaltene BAL wurde bei 300*g 5 min zentrifugiert und die Überstände für spätere
Proteinbestimmungen bei -20°C gelagert. Die Zellpellets wurden in 2ml RPMI 1640
Medium resuspendiert und mit Hilfe eines Hämozytometers die Gesamtzellzahl an
Leukozyten ermittelt. Zur differentiellen Analyse der Zellzusammensetzung wurden pro
Tier 100µl dieser Zellsuspension mit Hilfe einer Cytospin Zentrifuge bei 64*g für 5 min
und mittlerer Beschleunigung auf Objekträger aufgebracht. Diese wurden mit Diff-Quik
gefärbt und nach dem Trocknen mit DPX Mounting Medium gedeckelt. Die
Differentialanalyse der Zellzusammensetzung erfolgte durch mikroskopische Auszählung
aufgrund morphologischer Kriterien von mindestens 400 Zellen pro Objekträger.
31
MATERIAL UND METHODEN
2.2.7.4 Lungenentnahme und Kollagenaseverdau
Unmittelbar nach der BAL wurde nach Öffnung des Brustkorbes die komplette Lunge
entnommen. Ex vivo erfolgte bei Bedarf die Trennung der Lungenflügel: der linke
Lungenflügel
wurde
zur
histologischen
Untersuchung
(s.
2.2.7.7)
in
4% Formaldehydlösung gelagert, ein kleiner Lungenlappen zur Untersuchung der
Myeloperoxidaseaktivität (s. 2.2.7.6) sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren,
während die restlichen Lungenlappen zur Weiterverarbeitung in RPMI 1640 Medium
gelagert wurden. Die Zellen wurden aus dem Gewebe durch enzymatischen Verdau mit
Kollagenase D (0,253U/mg, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, D) isoliert. Hierzu
wurden die Lungenlappen mechanisch zerkleinert, mit 2ml Kollagenaselösung (1mg/ml
Kollagenase in RPMI 1640 Medium) versetzt und daraufhin 2h bei 37°C inkubiert. Das
verdaute Gewebe wurde durch ein 40µm Zellsieb gefiltert, mit 5ml PBS gewaschen und
bei 300*g 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 2ml RPMI 1640 resuspendiert
und die Zellzahl mittels eines Hämozytometers bestimmt.
2.2.7.5 Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Myeloperoxidase
Sofort nach der Lungenentnahme aus dem Brustkorb wurde ein kleiner rechter
Lungenlappen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Im Anschluß erfolgte eine
mechanische Homogenisierung mit einem Gewebezerkleinerer. Das Homogenat wurde
nach Zugabe von Phosphatpuffer (0,05M Na3PO4, pH 5,4) bei 20000*g für 10 min bei
4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in Phospatpuffer mit
0,5% HTAB resuspendiert. Anschließend wurden die Proben dreimal in Folge in
flüssigem Stickstoff eingefroren und sofort wieder aufgetaut. Nach erneutem
Zentrifugationsschritt wurden die Überstände abgenommen, diese wurden zur
Aktivitätsbestimmung der Myeloperoxidase mit Wasserstoffperoxid und TMB (BD
Biosciences, Heidelberg, D) versetzt. Die Farbreaktion wurde zu definierten Zeitpunkten
durch Zugabe von 1M Phosphorsäure gestoppt und die optische Dichte bei einer
Wellenlänge von 450nm gemessen.
32
MATERIAL UND METHODEN
2.2.7.6 Histologische Untersuchungen der Lunge
Ganze Lungen oder der linke Lungenlappen wurden nach der Entnahme in 4%
Formaldehydlösung (Histofix, Roth, Karlsruhe D) überführt und 24h bei 4°C unter
Lichtabschluss fixiert. Durch eine aufsteigende Isopropanolreihe wurden die Organe
entwässert und entfettet, bevor sie in Paraffin eingebettet wurden. Nach dem Aushärten
(über Nacht, 4°C) wurden an einem Microtom 4µm dicke Schnitte angefertigt. Diese
wurden zunächst zweimal mit Rotihistol (Roth, Karlsruhe, D) gewaschen und durch eine
absteigende Isopropanolreihe rehydriert. Die Färbung erfolgte mit Hämatoxillin (5min)
und Eosin (1min), danach wurden die Schnitte durch eine aufsteigende Alkoholreihe
erneut dehydriert und nach zweimaligem Waschen mit Rotihistol mit Roth-Histokitt
(Roth, Karlsruhe, D) gedeckelt. Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch. Die
bronchiale Inflammation wurde mit Hilfe eines semiquantitativen Score beschrieben
durch Myou et al. ausgewertet. Das Ausmaß der Entzündung wurde in fünf Kategorien
eingeteilt: 0, normale Lungenstruktur; 1, wenige inflammatorische Zellen; 2, ein Ring von
entzündlichen Zellen 1 Zelllage dick; 3, ein Ring von entzündlichen Zellen 2–4 Zellen
tief; 4, ein Ring von entzündlichen Zellen >4 Zellen dick. Der Score wurde durch eine
verblindete Analyse ermittelt.
2.2.7.7 Durchflusszytometrische Untersuchungen
Zur Oberflächenfärbung werden 0,1 - 1*106 Zellen, die aus bronchoalveolärer Lavage
sowie durch Kollagenase-Verdau aus Lungengewebe gewonnen wurden, zunächst mit
gereinigtem anti-Maus CD32/CD16 Fc-Block Antikörper 10min bei RT inkubiert, um
unspezifische Antikörperbindungen zu verhindern. Anschließend wurden die Zellen mit
entsprechend in FACS Puffer verdünnten Fluoreszenzantikörpern für 30min bei 4°C
inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit FACS Puffer wurden die Zellpellets in 500µl
FACS Puffer resuspendiert und vermessen.
Wurde neben extrazellulären Antigenen zusätzlich intrazellulär gefärbt, ging eine
Restimulation der Zellen voraus. Hierfür wurden die Zellen mit TPA (25ng/ml) und
Ionomycin (1µM) stimuliert und in Gegenwart von Brefeldin A (25µg/ml) 4h bei 37°C,
5% CO2 inkubiert. Nach einem Waschschritt erfolgte die oben beschriebene
Oberflächenfärbung mit α-CD3, α-CD4 sowie α-CD8 monoklonalen Antikörpern. Im
Anschluß wurden die Zellen zweimal mit FACS Puffer gewaschen und über Nacht bei
33
MATERIAL UND METHODEN
4°C mit 2% Formaldehydlösung fixiert. Die fixierten Zellen wurden zweimal mit Saponin
Puffer
(0,5% Saponin
in
FACS
Puffer)
gewaschen
und
mit
biotinyliertem
α-IFN-γ Antikörper für 30min bei 4°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurden die
Zellen mit Streptavidin-Alexa Fluor®488-konjugiert für 30 min bei 4°C inkubiert. Die
Zellen wurden erneut zweimal mit Saponin Puffer gewaschen, in 300µl FACS Puffer
resuspendiert und vermessen. Als Kontrollbedingungen dienten ungefärbte Zellen.
2.2.7.8 Albuminbestimmung in der bronchoalveolären Lavage
Zum quantitativen Nachweis von Albumin im Überstand der BAL wurde ein Bradford
Assay durchgeführt. Hierzu wurden 5µl Überstand mit 795µl bidestilliertem Wasser
verdünnt und mit 200µl Farbstoff-Konzentrat (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad
Laboratories GmbH, München, D) versetzt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur
erfolgte die photometrische Vermessung bei 595nm in einem Bio-Photometer. Die
Auswertung erfolgte anhand einer Standardkurve (Kalibrationsbereich 1-25µg/ml). Als
Leerwert diente eine Wasser bidest -Farbstoff-Konzentrat-Mischung.
2.2.7.9 Messung der Lungenfunktion
Die Messung der Lungenfunktion erfolgte durch die nicht-invasive Methode der
Ganzkörperplethysmographie an wachen Mäusen 2h nach der LPS-Verneblung. Bei
diesem Vefahren sitzt die Maus frei beweglich in einer Kammer, durch die ein
kontinuierlicher Luftstom fließt und die mit einem hochempfindlichen Druckabnehmer
(Buxco Electronics, Troy, New York, USA) verbunden ist. Dieser registriert kurzfristige
Druckänderungen in der Kammer. Die Einatmung der Mäuse erzeugt einen Unterdruck
und die Ausatmung einen Überdruck in der Kammer. Diese Druckänderungen werden in
Abhängigkeit von der Zeit kontinuierlich aufgezeichnet und von der Software aus den
gemessenen Werten für jeden Atemzyklus der so genannte Penh-Wert (enhanced Pause)
berechnet. Dieser dimensionslose Wert korreliert mit dem Atemwegswiderstand. Durch
eine Provokation der Tiere mit zunehmenden Konzentrationen an Metacholin
(1-50mg/ml) wird eine Bronchokonstriktion verursacht, die zu einer Erhöhung des Penh
in Abhängigkeit der Lungenfunktion führt.
34
MATERIAL UND METHODEN
2.2.8 Datenauswertung
Die Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM).
Signifikanzberechnungen gegenüber den Kontrollen wurden mittels des ungepaarten
beidseitigen Student’s t-Test bestimmt. Alle statistischen Analysen, die Berechnung der
EC50, ED50 bzw. IC50 und die Erstellung der Dosis-Wirkungskurven und der
Diagramme wurden mit der Software Graph Pad Prism 5.0 durchgeführt. Ein
Signifikanzniveau mit einem p-Wert von p<0,05 wurde als signifikant (*), mit
p<0,01 (**) und p < 0,001 (***) als hochsignifikant definiert.
35
ERGEBNISSE
3 Ergebnisse
3.1 In vitro Untersuchungen
3.1.1 Zeitkinetik der IL-2 Expression
Interleukin-2 wird aktiv aus CD4+ T-Zellen freigesetzt. IL-2 ist lokaler Wachstumsfaktor
für infiltrierende T-Lymphozyten und stimuliert Wachstum, Differenzierung und das
Überleben pulmonaler cytotoxischer T-Zellen. Nach Stimulation von isolierten
Blutlymphozyten mit anti-CD3/CD28 Beads kam es zeitabhängig zu einem schnellen
Anstieg der IL-2 Expression mit einem Maximum nach ca. 8h. Nach 24h war ein leichter
Abfall der Expressionsraten zu verzeichnen (Abb.3).
x-fache Expression
1000000
100000
10000
1000
100
10
1
0
4
8
12
16
20
24
Zeit [h]
Abbildung 3
Zeitkinetik der IL-2 Expression
PBMC wurden aus humanem Blut isoliert und mit anti-CD3/CD28 Beads stimuliert. Nach definierten Zeitpunkten
wurden die Zellen lysiert, mRNA isoliert und mittels real-time RT-PCR die Expression von IL-2 bestimmt. Die Werte
wurden auf β-Aktin normalisiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus drei freiwilligen Spendern.
3.1.2 Effekte von U0126 auf die Aktivierung von ERK in PBMC
Die spezifische Wirksamkeit von U0126 wurde durch die Analyse von phosphorylierten
MAPK in mit TPA stimulierten humanen Primärzellen mittels Durchflusszytometrie
untersucht. Durch die Blockade der MAPKK MEK1/2 durch U0126 wird die
Phosphorylierung von ERK inhibiert. Die aktivierten phosphorylierten Isoformen von
ERK und p38 wurden intrazellulär mit phosphospezifischen Antikörpern angefärbt.
36
ERGEBNISSE
Durch
Vorbehandlung
mit
U0126
konnte
das
geometrische
Mittel
der
Fluoreszenzintensität (geometric mean fluorescence intensity, GeoMean) im Vergleich
zu unbehandelten Zellen signifikant reduziert werden, was geringere Level an pERK
durch U0126 anzeigt (p=0,049) (Abb.4A). Die Aktivität von p38 wurde durch die
Behandlung mit U0126 nicht gehemmt, es konnten keine Unterschiede des GeoMeans
im Vergleich zu Negativkontrollen detektiert werden (Abb.4B). Dies war graphisch in
Histogrammen detektierbar: Die Fluoreszenzverteilung der Kontrollen ist in grau
hinterlegt, die schwarze Linie zeigt die Verteilung der behandelten Zellen. Bei beiden
Färbungen war ohne Stimulation der Verlauf der Histogramme für unbehandelte Zellen
und mit U0126 vorbehandelte Zellen annähernd deckungsgleich (Abb.4C, E). Nach 15minütiger Stimulation war eine deutliche Linksverschiebung des Histogrammes der
Fluoreszenzverteilung der mit U0126 behandelten Zellen zu erkennen (Abb.4D). Der
Verlauf der Histogramme für p38 zeigte hingegen auch nach Stimulation keine
Veränderung zwischen Kontrollen und vorbehandelten Zellen (Abb.4F)
A
60
40
*
20
15
geo mean pp38
80
geo mean pERK
B
unstimuliert
15 min stimuliert
0
10
5
0
Kontrolle U0126
C
Abbildung 4
Kontrolle U0126
D
Kontrolle U0126
E
Kontrolle U0126
F
Blockade der ERK Aktivierung durch U0126
Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut von gesunden Spendern wurden durch Dichtegradientenzentrifugation
isoliert, mit U0126 vorinkubiert und mit TPA stimuliert. Die Zellen wurden fixiert, mit phosphospezifischen
Antikörpern anti-pERK (A) und anti-pp38 (B) intrazellulär gefärbt und durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt
ist die geometrische mittlere Fluoreszenzintensität ± SEM aus 3 unabhängigen Versuchen. Signifikante Unterschiede
zwischen der Wirkung der Substanz und unbehandelten Kontrollen sind mit * (p<0,05) gekennzeichnet.
37
ERGEBNISSE
3.1.3 Dosis-abhängige Inhibition der Zytokin-Induktion durch U0126 in
PBMC
In einem nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob die spezifische Inhibition von
pERK die Zytokin-Induktion beeinflusst. Wie bereits aus der Literatur bekannt, führt
LPS-Stimulation in Makrophagen-Zelllinien und humanen Monozyten zu einer ERK
Aktivierung (Scherle et al. 1998) und darüber hinaus aktiviert auch CD3/CD28
Kostimulation die MAPK (Chialda et al. 2005). Infolge dessen wurden im Rahmen
dieser Arbeit humane Monozyten und Lymphozyten in Gegenwart verschiedener
Konzentrationen von U0126 mit LPS bzw. anti-CD3/CD28-beads stimuliert. Zur IC50
Bestimmung von U0126 wurde die Inhibition der Zytokin-Induktion von IL-2 und
TNF-α herangezogen und in Form einer Dosis-Wirkunskurve dargestellt. U0126
inhibierte die Induktion von TNF-α im Überstand von stimulierten Monozyten
konzentrationsabhängig (IC50=214,6nM) (Abb.5A, B). Desgleichen wurde die
Freisetzung von IL-2 aus stimulierten Lymphozyten mit zunehmenden Konzentrationen
von U0126 gehemmt (IC50=85,37nM) (Abb.5C, D).
38
C
15000
1000
10000
100
100
0
00
10
0
30
10
30
3
10
ko
nt
ro
lle
D
150
IL-2 [%]
30
00
10
00
0
N
eg
30
at
0
iv
00
ko
nt
ro
lle
N
eg
B
150
TNF [%]
U0126 [nM]
Po
si
tiv
0
00
30
00
10
10
00
30
0
10
0
U0126 [nM]
30
at
00
iv
0
ko
nt
ro
lle
Po
si
tiv
ko
30
0
3
0
10
5000
1
500
1
IL-2 [pg/ml]
A
1500
nt
ro
lle
TNF [pg/ml]
ERGEBNISSE
50
50
0
0
0
1
2
3
4
5
0
1
log conc. U0126 [nM]
Abbildung 5
2
3
4
5
log conc. U0126 [nM]
Konzentrationsabhängigkeit von U0126 auf Zytokininhibition in humanen PBMC
Isolierte PBMC wurden mit steigenden Konzentrationen von U0126 vorbehandelt (1µm-30mM) und zur Messung von
TNF-α Level mit LPS (A, B), zur Bestimmung von IL-2 Mengen (C, D) mit anti-CD3/CD28-beads stimuliert. 24h
später wurden die Überstände abgenommen und ELISA Messungen durchgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte der
Zytokinspiegel ± SEM dreier Probanden. Die mittlere inhibitorische Konzentration IC50 von U0126 wurde mittels
Dosis-Wirkungskurven der normalisierten Cytokinspiegel dreier Spender ermittelt (TNF: IC50 = 214,6; IL-2:
IC50 = 85,37).
3.2 Mausmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung
3.2.1 Wirkungen des MEK1/2 Inhibitors U0126 in vivo
3.2.1.1 Aktivierung von p44/42 MAPK im Lungengewebe
Zur Untersuchung der pharmakodynamischen Aktivität erfolgte zunächst die Messung
von phosphorylierter ERK im Lungengewebe. Eine Aktivierung von p44/42 wurde mit
Hilfe eines kommerziell erhältlichen Sandwich-ELISA mit der Detektion von endogenen
Spiegeln phosphorylierter MAPK nachgewiesen. Die Provokation mit einem LPSAerosol resultierte in einen signifikanten Anstieg an pERK (p=0,044) (Abb.6A) und
39
ERGEBNISSE
somit in einer Aktivierung der MAPK im Lungengewebe. Hingegen wiesen Lungen von
mit U0126 vorbehandelten Tieren eine signifikant reduzierte optische Dichte auf
(p=0,04), was geringere Mengen an pERK implizierte (Abb.6A). Die Aktivität von p38
hingegen wurde durch U0126 nicht gehemmt. Lungen von Tieren, die mit U0126
behandelt wurden, wiesen einen mit der Positivkontrolle vergleichbaren Level an
phosphorylierter p38 MAPK auf (Abb.6B).
B
A
1.5
*
1.0
*
OD450nm
OD450nm
0.8
1.0
0.5
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
Negativkontrolle
Abbildung 6
Positivkontrolle
U0126
Negativkontrolle
Positivkontrolle
U0126
Detektion von phosphorylierter p44/42 MAPK mittels Sandwich-ELISA
Die Mäuse wurden 2h vor der LPS-Inhalation mit U0126 (30mg/kg) oder Vehikel i.p. behandelt. 2h später wurden die
Tiere getötet und die Lungen wurden entnommen. Nach der Homogenisation wurden die Lungenlysate
ultrazentrifugiert und die Überstände zur Detektion von pERK und pp38 mittels Sandwich-ELISA analysiert.
Dargestellt ist als optische Dichte ± SEM (A: n=6, B: n=3 Tiere/Gruppe) die Absorption bei 450nm. Statistisch
signifikante Unterschiede bei *(p<0,05) im Vergleich zur Positivkontrolle.
3.2.1.2 Behandlung mit U0126 reduziert LPS-induzierte Zelleinwanderung
Um die Effekte der MEK1/2 Inhibition auf die akute LPS-induzierte Lungenschädigung
zu validieren, wurde die bronchoalveoläre Lavage 24h nach LPS-Vernebelung
durchgeführt und die differentielle Zellzusammensetzung quantifiziert. Die Endotoxin
Exposition führte zu einem massiven Einstrom von Entzündungszellen in das
Lungengewebe. Im Vergleich zu unbehandelten Tieren lag eine hochsignifikante
20-fache Erhöhung der totalen Zellenzahl der BAL seitens der provozierten Mäuse vor
(Abb.7A) (p<0,0001). Die Behandlung mit U0126 führte zu einer signifikanten
Reduktion der Gesamtzellzahl der BAL (Abb.7A) (p=0,009).
40
ERGEBNISSE
B
A
***
**
6
Neutrophile [1x10 6]
Gesamtzellzahl [1x10 6]
5
4
3
2
1
0
4
2
0
Negativkontrolle
Positivkontrolle
U0126
Negativkontrolle
C
Positivkontrolle
U0126
D
0.25
0.20
*
0.15
0.10
0.05
0.00
Negativkontrolle
Abbildung 7
Positivkontrolle
U0126
Lymphoyzten Zellzahl [1x10 6]
Monozyten Zellzahl [1x10 6]
***
***
**
0.08
*
0.06
0.04
0.02
0.00
Negativkontrolle
Positivkontrolle
U0126
U0126 reduziert zelluläre Infiltration in die BAL
Die Mäuse wurden 2h vor LPS-Vernebelung mit U0126 (30mg/kg) i.p. oder Vehikel (5% DMSO in PBS) behandelt.
24h später wurden die Tiere getötet und die BAL durchgeführt. Es erfolgten Gesamtzellzahlbestimmung sowie
differentielle Zellzahlanlaysen, um Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten zu quantifizieren. Dargestellt sind
absolute Zellzahlen ± SEM (A, B, C n=10 Tiere/Gruppe; D n=4 Tiere/Gruppe). Signifikante Unterschiede zwischen
der Wirkung der Substanz und Positivkontrollen sind mit * (p<0,05), **(p<0,01) und *** (p<0,001) gekennzeichnet.
Der Einwanderungstrom infolge LPS-Provokation bestand vornehmlich aus neutrophilen
Granulozyten (p<0,0001), und zu geringeren Anteilen aus Makrophagen und
Lymphozyten
(p=0,022).
Die
prophylaktische
Gabe
von
U0126
führte
zu
hochsignifikant reduzierten Neutrophilzahlen (p<0,001) gegenüber den Positivkontrollen
(Abb.7B). Darüber hinaus reduzierte die MEK1/2 Inhibition signifikant die
Makrophagen- und Lymphozyteninfiltration in das Lungengewebe (Abb.7C, D)
(p=0,046, p=0,026).
3.2.1.3 Einfluss von U0126 auf die Aktivität der Myeloperoxidase
Die Myeloperoxidase (MPO) ist den primären Granula neutrophiler Granulozyten
gespeichert. Eine Erhöhung der Konzentration von MPO in der BAL wird als Indikator
der in vivo-Aktivierung von neutrophilen Granulozyten gewertet. Zur Untersuchung der
Enzymaktivität wurden Mäuse mit 30 mg/kg U0126 behandelt und einem LPS-Aerosol
41
ERGEBNISSE
exponiert. Nach 24h wurden die Lungen entnommen und die Aktivität der MPO
photometrisch bestimmt. LPS-Inhalation verursachte bei Tieren der Positivkontrolle eine
signifikante Erhöhung der Aktivität der MPO (p=0,024). Durch die Vorbehandlung mit
dem MEK1/2 Inhibitor konnte die Aktivität der MPO im Lungengewebe im Vergleich
zu Kontrollbedingungen signifikant (p=0,044) reduziert werden (Abb.8).
0.5
*
*
OD450nm
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Negativkontrolle
Abbildung 8
Positivkontrolle
U0126
Einfluss von U0126 auf die Aktivität der Myeloperoxidase
Balb/c Mäuse wurden mit U0126 (30mg/kg) oder Vehikel 2h vor LPS-Inhalation behandelt. 24h später wurden die
Tiere getötet und die Lungen entnommen. Unbehandelte Tiere fungierten als Negativkontrolle. Als Nachweisreaktion
für die Aktivität der Myeloperoxidase wurde die Umsetzung von TMB und Wasserstoffperoxid verwendet und nach
dem Abstoppen der Farbreaktion mit Phosphorsäure wurde die Absorption bei 450nm gemessen. Dargestellt sind die
Mittelwerte der optischen Dichte ± SEM mit 4 Tieren pro Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen den
behandelten Tieren und der Positivkontrolle sind mit *(p<0,05) gekennzeichnet.
3.2.1.4 Dosis-abhängige Inhibition des LPS-induzierten Lungenschadens
Um die Dosisabhängigkeit des inhibitorischen Potentials von U0126 in vivo zu
evaluieren, wurden drei verschiedene Konzentrationen des selektiven MEK1/2 Inhibitors
U0126 (3, 10 and 30mg/kg) getestet. Analog zu 3.2.1.1 wurden die Tiere 2h vor LPSInhalation mit U0126 behandelt und 24h später getötet, die BAL gewonnen und
Zellzahlen bestimmt. Der MEK1/2 Inhibitor zeigte bei den niedrigen Konzentrationen
von 3mg/kg und 10mg/kg lediglich einen schwachen inhibitorischen Effekt (Abb.9A).
Hingegen führte die Applikation von U0126 in einer Konzentration von 30 mg/kg zu
einer signifikanten Abnahme der Gesamtzellzahl (p=0,024). Die berechnete effektive
Dosis mit halbmaximaler Wirkung (ED50) lag bei 20,56 mg/kg. Darüber hinaus zeigte
sich auch die Zahl an Neutrophilen in der BAL als dosisabhängig signifikant reduziert
(Abb.9B) (p<0,05).
42
ERGEBNISSE
A
B
6
6
*
4
2
Neutrophile [1x10 6]
Gesamtzellzahl [1x106]
8
2
eg
at
iv
ko
nt
ro
lle
Po
si
tiv
ko
nt
ro
lle
3m
g/
kg
U
01
26
10
m
g/
kg
U
01
26
30
m
g/
kg
U
01
26
N
N
Abbildung 9
*
0
eg
at
iv
ko
nt
ro
lle
Po
si
tiv
ko
nt
ro
lle
3m
g/
kg
U
01
26
10
m
g/
kg
U
01
26
30
m
g/
kg
U
01
26
0
4
Dosisabhängigkeit des inhibitorischen Potentials von U0126
Die Tiere wurden 2h vor LPS-Provokation mit U0126 (3, 10 oder 30mg/kg) oder Vehicle (PBS mit 5% DMSO) i.p.
behandelt. 24h später wurde nach dem Tod die BAL durchgeführt und Gesamtzellzahl und Neutrophilanzahl
bestimmt. Es wird ein repräsentatives Experiment gezeigt (n=4 Mäuse/Gruppe). Dargestellt sind Mittelwerte der
Zellzahlen ± SEM. Statistische Unterschiede zur Positivkontrolle sind durch *(p<0,05) gekennzeichnet.
3.2.1.5 Zytokin-und Chemokinlevel in der bronchoalveolären Lavage
Die Schlüsselrolle des inflammatorischen Zytokins TNF-α sowie den Chemokinen KC
(Keratinocyte-derived Chemokine) und MIP-2 (Macrophage Inflammatory Protein 2)
bei der LPS-induzierten Lungenschädigung ist weitreichend belegt. Um dies im akuten
in vivo-Modell zu evaluieren, wurde die BAL 2h nach der Aerosol-Provokation
gewonnen und Zytokin- und Chemokingehalt bestimmt. LPS-Inhalation führte zu
signifikant erhöhter Zytokinfreigabe in die BAL im Vergleich zu unbehandelten Tieren
(TNF-α: p<0.0001; KC; p= 0,004; MIP-2: 0,016). Prophylaktische Applikation des
MEK1/2-Inhibitors U0126 reduzierte signifikant den Gehalt an TNF-α (p=0,008)
(Abb.10A), KC (p=0,015) (Abb.10B), sowie MIP-2 (p=0,049) (Abb.10C) in der BAL im
Vergleich zu Positivkontrollen.
43
ERGEBNISSE
A
***
25
B
**
4
KC [ng/ml]
TNF [ng/ml]
*
**
5
20
15
10
5
3
2
1
0
Negativkontrolle
Positivkontrolle
0
U0126
Negativkontrolle
Positivkontrolle
U0126
C
MIP-2 [ng/ml]
4
*
*
3
2
1
0
Negativkontrolle
Abbildung 10
Positivkontrolle
U0126
Effekt von U0126 auf Zytokin- und Chemokinlevel in der BAL
Die Mäuse wurden 2h vor LPS-Inhalation mit U0126 (30mg/kg) oder Vehikel i.p. behandelt. 2h nach der Provokation
wurden die Tiere getötet und die BAL durchgeführt. Die Spülflüssigkeit wurde zentrifugiert und die Überstände für
ELISA Messungen verwendet. Die Level von TNF-α (p=0,008) (A), KC (p=0,015) (B), sowie MIP-2 (p=0,049) (C)
wurden jeweils mit Standard Sandwich ELISA Verfahren mit einem Detektionslimit von 15,6 pg/ml pro Zytokin
bestimmt. Dargestellt sind repräsentative Daten dreier Versuche als Mittelwerte ± SEM (n=4). Statistisch signifikante
Unterschiede verglichen mit Positivkontrollen sind mit *(p<0,05), **(p<0,01) und ***(p<0,001) gekennzeichnet.
3.2.1.6 Histologische Untersuchung des Lungengewebes
Um die Wirkung von U0126 auf das Lungengewebe zu untersuchen, wurden 24h nach
LPS Exposition die Lungen fixiert, Paraffinschnitte angefertigt und mittels HämatoxilinEosin (HE) angefärbt. Die Mäuse der Negativkontrolle wurden nicht mit LPS behandelt.
Aus
diesem
Grund
zeigten
die
mikroskopischen
Aufnahmen
eine
normale
Lungenstruktur (Abb. 11A, B). Neben mit Endothel ausgekleideten Blutgefäßen waren
zwei Bronchiolen mit Bronchialepithel im Querschnitt zu erkennen. Diese Strukturen
waren
von
Bindegewebe
mit
Stromazellen
umgeben,
wie
den
400fachen
Vergrößerungen zu entnehmen ist.
44
ERGEBNISSE
Abbildung 11
Histologische Untersuchung der Lunge
Zunächst wurde männlichen Balb/c Mäusen das Vehikel oder 30 mg/kg U0126 i.p. injiziert und 2 h später wurden sie
vernebeltem LPS ausgesetzt. Die Tiere der Negativkontrolle wurden nicht mit LPS behandelt. Nach 24 h wurden die
Lungen mit 4% Histofix fixiert, Paraffinschnitte angefertigt, mit Hämatoxilin-Eosin gefärbt und mittels
Lichtmikroskopie histologisch ausgewertet (A, C, F 200fache Vergrößerung; B, D, F 400fache Vergrößerung).
Dargestellt sind repräsentative Lungenschnitte von Negativkontrolltieren (A, B), von Positivkontrollen (C, D) und von
Tieren die mit U0126 vorbehandelt wurden (E, F). Der Maßstabsbalken entspricht 100µm.
Im Gegensatz dazu führte die LPS Exposition bei den mit Vehikel behandelten Mäusen
zu einer massiven Invasion von Entzündungszellen in die Lunge (Abb.11C, D). Das
Infiltrat von Zellen ließ sich bei näherer Betrachtung zum Großteil als Granulozyten
identifizieren. Die Applikation von U0126 (30mg/kg) 2h vor LPS-Exposition reduzierte
signifikant die Zahl an sichtbaren Entzündungszellen (Abb.11E, F). Es waren nur noch
wenige Neutrophile zwischen den epithelialen Strukturen der Atemwege und den
45
ERGEBNISSE
Gefäßen nachweisbar. Auffallende Veränderungen des Lungengewebes, die auf eine
mögliche Toxizität von U0126 schließen ließen, wurden nicht beobachtet.
Entzündungsscore
4
**
3
2
1
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
Abbildung 12
U0126
Quantifizierung der pulmonalen Entzündung
Die erhaltenen Lungenschnitte (repräsentative Exemplare in Abb.13 dargestellt) wurden lichtmikroskopisch mit Hilfe
eines semiquantitativen Scores hinsichtlich ihrer Entzündungsquantität verblindet ausgewertet. Dargestellt sind die
Mittelwerte ± SEM der Entzündungskategorie (1 kaum Entzündung, 4 schwere Entzündung, siehe 2.2.7.6) (n=12).
Statistische Signifikanzen zwischen Verumgruppe und Positivkontrolle ist mit **(p<0,01) gekennzeichnet.
Die Quantifizierung der Inflammation der Lungen erfolgte mit Hilfe eines
semiquantitativen Scores beschrieben durch Myou (Myou et al. 2003) (Abb.12). Die
Lungenschnitte der unbehandelten Negativkontrollen zeigten eine weitgehend normale
Lungenstruktur ohne Anzeichen von Entzündung. Die LPS Exposition führte zu einer
starken Infiltration von Entzündungszellen in das Lungengewebe, was zu der Vergabe
von hohen Entzündungsscores führte. Hauptsächlich handelte es sich um einwandernde
Neutrophile. Hingegen wiesen die Lungenschnitte von mit U0126 vorbehandelten Tieren
eine signifikant schwächere Inflammation als die Präparate der Positivkontrollen auf,
was sich in der Einordnung in eine niedrigere Entzündungswertigkeit widerspiegelte. Es
waren peribronchial signifikant reduzierte Zahlen an Entzündungszellen respektive
neutrophile Granulozyten nachweisbar (p=0,007).
3.2.1.7 Einfluss von U0126 auf Albuminspiegel in bronchoalveolären Lavage
Als normaler Bestandteil des Alveolarfilms ist eine Erhöhung der Konzentration von
Albumin in der BAL als Hinweis für eine Permeabilitätserhöhung infolge einer
Schädigung der alveolo-endothelialen Barriere und somit einer Lungenschädigung zu
deuten. Die Albuminbestimmung erfolgte im BAL Überstand aus den Versuchen, die
bereits unter 3.2.1.1 und 3.2.1.3 beschrieben sind. Die Exposition von Tieren gegenüber
46
ERGEBNISSE
einem LPS-Aerosol führte zu einem Übertritt von Albumin in die Lavage verglichen zu
naiven Tieren, welche nur geringe Mengen an Albumin aufwiesen. Hingegen konnte die
i.p. Applikation von U0126 in einer Konzentration von 30mg/kg die Albuminspiegel in
der BAL und somit die Permeabilität der bronchoalveolären Barriere signifikant
reduzieren (Abb.13A) (p=0,047). Bei Betrachtung der niedrigeren Konzentrationen
(3 und 10mg/kg) fällt auf, dass jene nur zu leichten Veränderungen der Albuminmenge
in der BAL in der Lage waren und somit dem Effekt eine Dosisabhängigkeit zugrunde
liegt (Abb.13B) (p=0,038).
A
B
600
400
*
300
200
100
Albumin [µg/ml]
Albumin [µg/ml]
500
400
*
200
0
N
eg
U0126
at
iv
ko
nt
ro
lle
Po
si
tiv
ko
nt
ro
lle
3m
g/
kg
U
01
26
10
m
g/
kg
U
01
26
30
m
g/
kg
U
01
26
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
Abbildung 13
Einfluss von U0126 auf die Albuminspiegel in der BAL
Die Überstände der aus den Versuchen 3.2.1.1 und 3.2.1.3 gewonnenen BAL wurde mit Hilfe eines Bradfordassays
auf ihren Albumingehalt untersucht. Dargestellt sind Mittewerte ± SEM. Statistisch signifikante Unterschiede der mit
U0126 (30mg/kg) behandelteten Tiere im Vergleich zu Positivkontrollen ist mit *(p<0,05) gekennzeichnet.
3.2.1.8 Effekte von U0126 auf die Lungenfunktion
Die Messung der Lungenfunktion dient als diagnostisches Verfahren zum Nachweis von
Atemflussbehinderung und Emphysem. Auch im Tiermodell von COPD ist der
Nachweis der respiratorischen Funktion von großem Interesse. Das Verfahren der
Ganzkörperplethysmographie wurde angewandt, um die Lungenfunktion zu evaluieren
und Veränderungen des Parameters Penh wurden zur Bestimmung der Reaktivität heran
gezogen. U0126 in einer Konzentration von 30mg/kg wurden den Tieren 2h vor der
LPS-Inhalation i.p. appliziert und 2h nach der LPS-Exposition erfolgte die
47
ERGEBNISSE
Ganzkörperplethysmographie. Als Kontrollen dienten sowohl naive Mäuse, als auch
Tiere, die dem LPS-Aerosol ausgesetzt wurden. Die Negativkontrollen zeigten über den
Zeitverlauf der Metacholin-Provokation nur einen sehr schwachen Anstieg des Penh.
Dagegen
führte
die
LPS-Inhalation
zu
einem
starken
kontinuierlichen
konzentrationsabhängigen Anstieg des Penh. Durch Vorbehandlung mit U0126 wiesen
die Tiere deutlich niedrigere Penh-Werte auf als die Positivkontrollen, allerdings waren
die Unterschiede nur für die niedrigen Konzentrationen von Metacholin (1 und 3mg/kg)
und PBS signifikant (Abb.14) (p=0,024, p=0,026, p=0,021).
Positivkontrolle
U0126
Negativkontrolle
5
Penh
4
3
2
1
*
*
*
l
50
m
g/
m
m
g/
m
l
l
ch
M
ch
M
ch
M
30
10
m
g/
m
m
g/
m
l
M
ch
1
3
m
g/
m
PB
S
ch
M
Abbildung 14
l
0
Effekte von U0126 auf die Lungenfunktion
Zunächst wurde Balb/c Mäusen 30 mg/kg U0126 i.p. injiziert und 2 h später wurden sie sowie Tiere der
Positivkontrolle vernebeltem LPS ausgesetzt. Die Tiere der Negativkontrolle wurden nicht mit LPS behandelt. 2h
nach der Inhalation erfolgte die Bestimmung der Lungenfunktion durch Ganzkörperplethysmographie. Dargestellt
sind die Mittelwerte des Penh ± SEM von jeweils 3 Tieren/Gruppe. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen
Positivkontrolle und Verumgruppe ist durch *(p<0,05) gekennzeichnet.
3.2.2 Effekte anderer anti-inflammatorischer Substanzen
3.2.2.1 Vergleich von intra trachealer und intra peritonealer Gabe von
Dexamethason
Trotz der effizienten intra peritonealen Gabe von U0126, wurde in Vorversuchen
zunächst die geeignete Applikationsroute für die prophylaktische Gabe des
Glucocorticoids Dexamethason evaluiert. Balb/c Mäuse wurden 2h vor der
LPS-Inhalation entweder mit 2,5mg/kg i.p. oder 1mg/kg i.t. behandelt. 24h später wurde
nach Tötung der Tiere die der BAL gewonnen und Cytospins angefertigt. Nach
48
ERGEBNISSE
Bestimmung der Gesamtzellzahl wurde deutlich, dass sich die prophylaktische
intra tracheale Gabe von Dexamethason gegenüber der intra peritonealen Route als
effektiver herausstellte. Die i.t. Applikation führte zu signifikant reduzierter Infiltration
von Entzündungszellen in die BAL verglichen mit der Positivkontrolle (p=0,004)
(Abb.15A). Hingegen konnte die i.p. Gabe von Dexamethason die Gesamtzellzahl nur in
geringerem Ausmaß reduzieren. Die Auswertung der zellulären Zusammensetzung
zeigte ein ähnliches Bild, durch die intra tracheale Gabe von Dexamethason waren
signifikant reduzierte Neutrophilzahlen nachweisbar im Vergleich zu Positivkontrollen
(p=0,003) (Abb.15B), die i.p. Gabe hingegen führte lediglich zu geringer Reduktion an
infiltrierenden Granulozyten. Auch die Zahl der Makrophagen konnte durch die
intra tracheale Behandlung in eindeutigerem Maße erniedrigt werden als es durch
intra peritoneale Applikation möglich war.
B
A
Positivkontrolle
Dexamethason i.t.
Dexamethason i.p.
5
Zellzahl [1x106]
Gesamtzellzahl [1x10 6]
6
4
3
**
2
1
0
Positivkontrolle Dexamethason i.t. Dexamethason i.p.
Abbildung 15
4
**
2
0.2
0.1
0.0
Neutrophile
Makrophagen
Lymphozyten
Vergleich von i.t. und i.p. Applikation von Dexamethason
Balb/c Mäuse wurden 2h vor LPS-Inhalation mit Dexamethason i.p. (2,5mg/kg) oder i.t. (1mg/kg) behandelt. 24h
später wurden die Tiere getötet, die Lungen lavagiert und Gesamtzellzahl sowie differentielle Zellzusammensetzung
detektiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SEM (n=3 Mäuse/Gruppe). Statistisch signifikante Unterschiede
zwischen Positivkontrolle und i.t. Gabe von Dexamethason ist mit **(p<0,01) gekennzeichnet.
3.2.2.2 Prophylaktische und therapeutische Gabe von Dexamethason und
Roscovitine
In weiteren Versuchen wurde der Einfluss der prophylaktischen und der therapeutischen
Gabe
von
anti-inflammatorischen
Substanzen
auf
die
akute
LPS-induzierte
Lungenschädigung untersucht. Nachdem für die prophylaktische i.t. Gabe von
Dexamethason eine Reduktion der Zellzahl in der BAL nachgewiesen werden konnte,
war nun von Interesse, ob dies auch bei therapeutischer Gabe der Fall ist. Darüber hinaus
49
ERGEBNISSE
sollte der Effekt von Roscovitine (10mg/kg), einem spezifischen CDK-Inhibitor
(cyclin-dependent kinase) sowohl bei prophylaktischer als auch bei therapeutischer Gabe
evaluiert werden.
Prophylaktische Applikation wurde als 2h vor der LPS-Inhalation, 6h nach der
Exposition wurde als therapeutische Gabe festgelegt. Als Kontrolle wurde zu den
jeweiligen Zeitpunkten PBS i.t. appliziert. 24h nach der LPS-Vernebelung wurden die
Mäuse getötet, die BAL durchgeführt und die Gesamtzellzahl der Lavage bestimmt. Die
Abbildung 17 zeigt, dass sowohl die prophylaktische als auch die therapeutische Gabe
von Dexamethason die Zellzahl der BAL signifikant verringert. Bei prophylaktischer
Gabe konnte die Zellzahl verglichen mit der PBS-Kontrolle (Positivkontrolle -2h)
signifikant um 48% von 2,7 Millionen auf 1,4 Millionen gesenkt werden (p=0,027).
Auch therapeutisch eingesetzt resultierte eine signifikante Reduktion der Zellzahl um
57%
durch
Dexamethason
(p=0,008)
im
Vergleich
zu
Kontrollbedingungen
(Positivkontrolle +6h). Bei Roscovitine zeigte sich ein differenzierteres Bild, die
prophylaktische Gabe von Roscovitine führte zu keiner Veränderung der Zellzahl
gegenüber der Positivkontrolle. Hingegen konnte nach therapeutischer Verabreichung
von Roscovitine eine signifikante Reduktion der Zellzahl um 60% gegenüber
Kontrollbedingungen (Positivkontrolle +6h) detektiert werden (p=0,023) (Abb.16).
Gesamtzellzahl [1x106]
5
4
3
#
**
*
2
1
Abbildung 16
+6
h
R
os
c
ov
i
tin
e
so
n
+6
h
+6
h
tiv
ko
Po
si
D
ex
a
nt
ro
lle
tin
e
ov
i
m
et
ha
-2
h
-2
on
R
os
c
m
et
ha
s
ex
a
D
Po
si
tiv
ko
nt
ro
lle
-2
h
h
0
Prophylaktische und therapeutische Gabe von Dexamethason und Roscovitine
Balb/c Mäuse wurden 2h vor der LPS Inhalation und 6h danach mit Dexamethason (1 mg/kg) oder Roscovitine
(10 mg/kg) intra tracheal behandelt. Die Positivkontrollen wurden zu den jeweiligen Zeitpunkten mit PBS behandelt.
Nach 24h erfolgten die Tötung sowie die BAL. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. Statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen und der jeweiligen Positivkontrolle des Zeitpunktes ist mit
*(p<0,05), **(p<0,01) und #(p<0,05) gekennzeichnet.
50
ERGEBNISSE
3.2.3 Rolle der adaptiven Immunität bei der Pathogenese der COPD
3.2.3.1 Zeitkinetik der inflammatorischen Lungenschädigung anhand von Yeti
Mäusen
Um zu untersuchen, ob das Modell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung eine
Th1-vermittelte Immunantwort der infiltrierenden Lymphozyten in die Lunge generiert,
wurde das Modell an Yeti-Mäusen angewandt. Bei Yeti Mäusen (ein Akronym für
yellow fluorescent protein-enhanced transcript for interferon-γ) handelt es sich um
bizistronische IFN-γ Reporter Mäuse, die ein in vivo „Tracking“ auf Zellebene von
IFN-γ-exprimierenden T-Zellen ohne in vitro Restimulation erlauben. Die Mäuse
wurden jeweils 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet.
Die Exposition von Yeti Mäusen gegenüber dem LPS Aerosol führte zu einem hoch
signifikanten Einstrom von Entzündungszellen in die bronchoalveoläre Lavage, der zu
den späteren Zeitpunkten hin schwächer wurde. 6h nach der LPS Inhalation war ein
21-facher Anstieg der Zellzahl von 0,15 Millionen Zellen der Negativkontrolle auf 3,15
Millionen Zellen festzustellen (p<0,0001). 24h nach der LPS-Exposition war ebenfalls
eine signifikante Infiltration inflammatorischer Zellen detektierbar (p=0,0002). Tiere,
die 72h nach der LPS-Inhalation getötet wurden, wiesen ebenfalls einen signifikanten
Einstrom an Entzündungszellen auf, allerdings waren die Zellzahlen niedriger als zu den
beiden früheren Zeitpunkten (p<0,0001) (Abb.17A).
Die Untersuchung der zellulären Zusammensetzung der BAL ergab, dass nach 6h und
24h nach der LPS-Inhalation hauptsächlich neutrophile Granulozyten und nur wenige
Monozyten
und
Lymphozyten
in
die
Atemwege
eingewandert
sind.
Die
Lymphozyteneinwanderung nahm über den Zeitverlauf zu und erreichte 72h nach der
LPS-Inhalation ihr Maximum (Abb.17B).
51
ERGEBNISSE
B
A
***
3
***
***
2
1
Zellzahl [1x10 6]
Zellzahl [1x10 6]
4
6
5
4
3
2
Negativkontrolle
6h
24h
72h
0.6
0.4
0.2
0.0
0
Negativkontrolle
Abbildung 17
6h
24h
Neutrophile
72h
Monozyten
Lymphozyten
Zeitkinetik des LPS-Modells anhand von Yeti Mäusen
Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und die Lungen wurden lavagiert. Die
Gesamtzellzahlen (A) wurden bestimmt und differentielle Zellzahlbestimmungen anhand von Cytospins (B)
durchgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen unbehandelten
Mäusen und der Gruppe des Zeitpunktes ist mit ***(p<0,001) (n=12 Tiere/Gruppe) gekennzeichnet.
Zur durchflusszytometrischen Differenzierung wurden neben fluoreszenzmarkierten
α-CD3-Antikörpern
auch
α-CD4-
und
α-CD8-Antikörper
eingesetzt,
um
IFN-γ-produzierende Zellen in der bronchoalveolären Lavage zu detektieren. Die
Lymphozyteneinwanderung nahm über den Zeitverlauf hin zu und war nach 72h am
meisten ausgeprägt. CD4+ T-Zellen waren zu allen Zeitpunkten zu annäherend gleichen
Teilen IFN-γ produzierend, also IFN+, und IFN- (Abb.18A). CD8+ T-Zellen waren 6h
und 24h nach der Inhalation ebenfalls zu annährend gleichen Anteilen IFN+ bzw. IFN-.
Hingegen waren zum Zeitpunkt 72h eine deutlich größere Population von CD8+
Lymphozyten IFN-γ produzierend im Vergleich zu einer deutlich kleineren Zahl
IFN-CD8+ T-Zellen (Abb.18B).
52
ERGEBNISSE
A
BAL CD3+/CD4+/IFN
Zellzahl
30000
IFN+
IFN-
20000
10000
0
Neg.kontrolle
6h
24h
72h
Neg.kontrolle
6h
24h
72h
B
BAL CD3+/CD8+/IFN
Zellzahl
40000
30000
20000
10000
0
Abbildung 18
Mäusen
Charakterisierung der Lymphozytenpopulation in der BAL anhand von Yeti
Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und die Lungen wurden lavagiert. Die aus BAL
gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 (A) bzw. α-CD3/ α-CD8 (B) differenziert.
Im Anschluß erfolgte die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+ oder CD8+ Zellen mittels FACS-Analyse.
Dargestellt sind die absolute Zellzahlen als Mittelwerte ± SEM (n=12 Tiere/Gruppe).
Zur
Bestimmung
der
vaskulären
Hyperpermeabilität,
als
Marker
für
Lungenschädigungen, wurde im Überstand der bronchoalveolären Lavage der
Albumingehalt bestimmt. LPS-Exposition führte zu einem signifikanten Anstieg der
Albuminkonzentration in der BAL. Nach 6h konnte ein Maximum an Albumin detektiert
werden im Vergleich zur Negativkontrolle (p= 0,007). Auch nach 24h konnten ebenfalls
signifikant
erhöhte
Albuminkonzentration
gemessen
werden
(p=0,003).
Der
Albumingehalt nahm im Zeitverlauf kontinuierlich ab, so dass sich die Level nach 72h
im Vergleich zu den Werten der 6h-Gruppe annähernd halbiert hatten (p=0,01)
(Abb.19).
53
ERGEBNISSE
Albumin [µg/ml]
800
**
600
**
400
**
200
0
Neg.kontrolle
Abbildung 19
6h
24h
72h
Albumingehalt im BAL Überstand von Yeti Mäusen im LPS-Modell
Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und die Lungen wurden lavagiert. Im Überstand
der Bal wurde mit Hilfe eines Bradford Assays der Albumingehalt bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (n=4
Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen der jeweiligen Gruppe zur Negativkontrolle sind mit **(p<0,01) dargestellt.
Zur Bestimmung der Aktivität der Myeloperoxidase im Lungengewebe wurden die Tiere
zu den jeweiligen Zeitpunkten nach der LPS-Exposition getötet und ein kleiner rechter
Lungenlappen entnommen. Die Inhalation von LPS führte zu einem signikikanten
Anstieg der MPO-Aktivität in den 6h und 24h-Gruppen (p=0,021 und p=0,0003)
(Abb.20). Die Aktivität der Myeloperoxidase nahm über den Zeitverlauf hin ab und
erreichte nach 72h annähernd das Niveau der Negativkontrollen.
0.4
*
OD[450nm]
0.3
***
0.2
0.1
0.0
Neg.kontrolle
Abbildung 20
6h
24h
72h
Myeloperoxidase-Aktivität in Lungen von Yeti Mäusen nach LPS-Inhalation
Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und jeweils ein kleiner Lungenlappen wurde
entnommen. Unbehandelte Tiere fungierten als Negativkontrolle. Als Nachweisreaktion für die Aktivität der
Myeloperoxidase wurde die Umsetzung von TMB und Wasserstoffperoxid verwendet und nach dem Abstoppen der
Farbreaktion mit Phosphorsäure wurde die Absorption bei 450nm gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte der
optischen Dichte ± SEM mit 5 Tieren pro Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen den LPS-behandelten Tieren
und der Negativkontrolle sind mit *(p<0,05) oder ***(p<0,001) gekennzeichnet.
Zur histologischen Untersuchung wurden die Lungen entweder nach 6h, 24h oder nach
72h fixiert und Paraffinschnitte wurden angefertigt. Die LPS-Inhalation führte zu einem
54
ERGEBNISSE
signifikanten Einstrom von Entzündungszellen zu allen Zeitpunkten im Vergleich zu
unbehandelten Tieren der Negativkontrolle (p<0,001) (Abb.21 und 22). Zu den beiden
früheren Zeitpunkten 6 und 24 Stunden bestand das Infiltrat hauptsächlich aus
Neutrophilen. Die semiquantitive Auswertung der Schnitte ergab, dass die Entzündung
über den Zeitverlauf abnahm, während nach 6 und 24 Stunden (Abb.21B, C und 22)
annähernd vergleichbare Entzündungszeichen nachweisbar waren, konnte 72h eine
geringere Entzündungswertigkeit detektier werden (Abb.21D, 22).
In Abbildung 21 sind repräsentative Lungenschnitte der jeweiligen Gruppen dargestellt.
Abbildung 21 Histologische Untersuchung des Lungengewebes von Yeti-Mäusen 6h, 24h und 72h
nach LPS-Inhalation
Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und jeweils der linke Lungenlappen wurde
entnommen. Die Negativkontrollen blieben unbehandelt. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm
dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Schnitte der Negativkontrolle
(A), der 6h-Gruppe (B), der 24h-Gruppe(C) sowie ein Präparat der 72h-Gruppe (D) in jeweils 200-facher
Vergrößerung. Der Maßstabsbalken entspricht 100µm.
Die semiquantitative Auswertung der Entzündungswertigkeit ist in Abbildung 22
dargestellt.
55
ERGEBNISSE
Entzündungsscore
4
***
***
3
***
2
1
0
Neg.kontrolle
Abbildung 22
6h
24h
72h
Quantifizierung der pulmonalen Entzündung von Yeti-Mäusen
Die erhaltenen Lungenschnitte (repräsentative Exemplare in Abb.22 dargestellt) wurden lichtmikroskopisch mit Hilfe
eines semiquantitativen Scores hinsichtlich ihrer Entzündungsquantität verblindet ausgewertet. Dargestellt sind die
Mittelwerte ± SEM der Entzündungskategorie (1 kaum Entzündung, 4 schwere Entzündung, siehe 2.2.7.6) (n=12).
Statistische Signifikanzen zwischen den jeweiligen Zeitpunkten und Negativkontrolle sind mit ***(p<0,001)
gekennzeichnet.
3.2.3.2 Βehandlung von Yeti-Mäusen mit α-IFN-γ- Antikörper
Die Eigenschaft der Yeti Mäuse, dass eYEP (enhanced yellow fluorescent protein) nach
Transkription und Sekretion von IFN-γ in den Zellen zurückbleibt, eröffnet die
Möglichkeit einer Visualisierung der Immunantwort durch IFN-γ-produzierende Zellen.
Durch die Applikation eines neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ konnte der
Einfluss von IFN-γ auf die akute LPS-induzierte Lungenschädigung verfolgt werden.
Die Mäuse wurden 24h vor der LPS-Exposition mit anti-Maus-IFN-γ-Antikörper oder
anti-Maus-IgG1-Isotyp i.p. behandelt und 24h nach der Inhalation getötet, lavagiert und
die Lungen wurden entnommen. Die Differenzierung der aus BAL und Lungengewebe
gewonnenen Zellen erfolgte durch zweifache Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4
oder α-CD3/ α-CD8 und anschließender durchflussztometrischer Analyse.
Die Gesamtzellzahlen von BAL und Lunge sowie die zelluläre Zusammensetzung der
Lavage sind in Abbildung 23 dargestellt.
56
ERGEBNISSE
B
A
50
Lunge Zellzahl [1x10 6]
BAL Zellzahl [1x10 6]
4
3
2
1
40
30
20
10
0
0
Isotyp
anti-IFN
Isotyp
anti-IFN
C
4
Isotyp
anti-IFN
Zellzahl [1x10 6]
3
2
0.10
0.05
0.00
Neutrophile
Abbildung 23
Makrophagen
Lymphozyten
Effekte der IFN-γ-Neutralisierung in Yeti-Mäusen 24h nach LPS-Inhalation
Yeti-Mäuse wurden i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem
LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie -entnahme. Es erfolgten die Bestimmung der
Gesamtzellzahl von BAL (A) und Lunge (B). Zusätzlich wurde die zelluläre Zusammensetzung der Lavageflüssigkeit
durch mikroskopische Untersuchung von Cytospins analysiert (C). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für 3 Tiere
pro Gruppe.
Die Behandlung mit α-IFN-γ führte im Vergleich zur Isotypkontolle zu höheren
Gesamtzellzahlen in der BAL (Abb.23A) sowie zu geringfügiger Zellzahlerhöhung in
der Lunge, deren Unterschied allerdings keine Signifikanz erreichte (Abb.23B).
Hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung der Lavage ergaben sich keine
signifikanten Unterschieder der Zellzahlen von Neutrophilen, Makrophagen und
Lymphozyten nach Neutralisierung von IFN-γ im Vergleich zur Isotypkontrolle
(Abb.23C)
Abbildung
24
zeigt
die
quantitative
Auswertung
der
durchflusszytometrischen Analyse von BAL und Lunge. Dargestellt sind CD4+ oder
CD8+ T-Zellen im Lymphozyten-Gate (CD3+).
57
A
B
20000
15000
BAL CD3+/CD8+/IFN+
Zellzahl
BAL CD3+/CD4+/IFN+
Zellzahl
ERGEBNISSE
15000
10000
5000
10000
5000
0
0
Isotyp
anti-IFN
50000
Lunge CD3+/CD8+/IFN+
Zellzahl
D
Lunge CD3+/CD4+/IFN+
Zellzahl
C
100000
80000
60000
40000
20000
0
anti-IFN
Isotyp
anti-IFN
40000
30000
20000
10000
0
Isotyp
Abbildung 24
Isotyp
anti-IFN
Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge
nach IFN-γ-Neutralisierung und 24h nach LPS-Exposition in Yeti-Mäusen
Die aus BAL und Lungenverdau gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit
α-CD3/ α-CD4 bzw. α-CD3/ α-CD8 differenziert. Im Anschluß erfolgte die Detektion von
IFN-γ-produzierenden CD4+ oder CD8+ Zellen mittels FACS-Analyse. Dargestellt sind die
Mittelwerte ± SEM der erhaltenen Zellzahlen (n=3 Mäuse/Gruppe).
Die IFN-γ-Neutralisation führte zu keinen signifikanten Effekten hinsichtlich der CD4+
und CD8+ Zellzahlen in der BAL (Abb.24A, B). Auch in der Lunge resultierte die
Behandlung mit α-IFN-γ zu keine signifikanten Veränderungen der CD4+/IFN+
Lymphozytenpopulation (Abb.24C). Betrachtete man sich hingegen die Population der
CD8+IFN-γ-produzierenden Zellen, so fällt auf, dass die Neutralisierung von IFN-γ zu
einer deutlicheren Reduktion der Zellzahl von ca. 32000 Zellen der Isotypkontrolle auf
ca. 21000 führte. Vermutlich konnte aufgrund der niedrigen Tierzahl keine Signifikanz
festgestellt werden (Abb.24D).
3.2.3.3 Neutralisation von IFN-γ mit Antikörpern in Balb/c Mäusen
In weiteren Versuchen wurde die Neutralisierung von IFN-γ nun im Wildtypsystem an
Balb/c Mäusen untersucht. Hierfür war nun eine Restimulation der Zellen aus BAL und
Lungen ex vivo erforderlich. Die Tiere wurden 24h vor der LPS-Exposition mit
58
ERGEBNISSE
anti-Maus-IFN-γ-Antikörper, anti-Maus-IgG1-Isotyp oder Vehikel (PBS) i.p. behandelt.
24h oder 72h nach der Inhalation wurden die Tiere getötet, lavagiert und die Lungen
entnommen. Nach der Restimulation erfolgte die Oberflächenantigenfärbung mit α-CD3
und α-CD4 oder α-CD3 und α-CD8. Im Anschluß wurden die fixierten Zellen
intrazellulär mit Streptavidin-konjugiertem α-IFN-Antikörper gefärbt und mittels
Durchflusszytometrie analysiert.
Tötung 24h nach LPS-Inhalation
Betrachtete man sich zunächst die Gesamtzellzahlen 24h nach der LPS-Inhalation, so
ließ sich feststellen, dass die LPS-Exposition zu einer hochsignifikanten Erhöhung der
Zellzahl von unter 0,4 Millionen auf über 3,5 Millionen Zellen in der BAL führte, wie
der Vergleich der unbehandelten Mäuse mit den LPS behandelten Tieren zeigte
(p<0,0001). Die Behandlung mit dem neutralisierenden Antikörper führte nach 24h
ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg der Zellzahl in der BAL. Erwartungsgemäß
resultierte die intra peritoneale der Isotyp-Kontrolle in einer mit der Positivkontrolle
vergleichbaren Gesamtzellzahl (Abb.25A)
Die LPS Inhalation führte nach 24h ebenfalls zu einem hochsignifikanten Anstieg der
Zellzahlen in der Lunge, vergleicht man unbehandelte Mäuse mit den Positivkontrollen
(p=0,0003). Die Gesamtzellzahlen der Lungen von Tieren, die mit α-IFN-γ-Antikörper
oder mit der entspechenden Isotypkontrolle behandelt wurden, unterscheiden sich nicht
von den LPS-Kontrollen (Abb.25B).
59
ERGEBNISSE
B
A
20
Gesamtzellzahl [1x10 6]
Gesamtzellzahl [1x10 6]
6
***
4
2
***
15
10
5
0
Negativkontrolle
Positivkontrolle
anti-IFN
***
Negativkontrolle
Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
*
anti-IFN
Isotyp
0.3
0.2
0.1
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
1.0
MPO Aktivität [%]
Zellzahl [1x10 6]
Negativkontrolle Positivkontrolle
D
C
6
5
4
3
0.4
0
Isotyp
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0
Neutrophile
Abbildung 25
Makrophagen
Lymphozyten
Effekte der IFN-γ-Neutralisation 24h nach der LPS-Inhalation
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie -entnahme. Es erfolgten
die Bestimmung der Gesamtzellzahl von BAL (A) und Lunge (B), sowie die Bestimmung der
Myeloperoxidaseaktivität in der Lunge (D). Zusätzlich wurde die zelluläre Zusammensetzung der Lavageflüssigkeit
durch mikroskopische Untersuchung von Cytospins analysiert (C). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für 8 Tiere
pro Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen der Gesamtzellzahl bzw. eines bestimmten Zelltyp zwischen LPSund Negativkontrolle sind mit * (p<0,05) *** (p<0,001) gekennzeichnet.
Hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung der BAL ließen sich ähnliche Verhältnisse
wie bei der Gesamtzellzahl der Lavage feststellen. Da das Infiltrat 24h nach der
LPS-Inhalation hauptsächlich aus neutrophilen Granulozyten besteht, bildeten diese die
zahlenmäßig umfassendste Gruppe. LPS-exponierte Tiere wiesen signifikant höhere
Neutrophilzahlen als unbehandelte Tiere auf (p=0,002) (Abb.25C). Verglichen mit der
Positivkontrolle fanden sich in der BAL der mit α-IFN-γ-Antikörper behandelten Tiere
signifikant
höhere
Neutrophilzahlen
(p=0,037)
(Abb.25C).
Hinsichtlich
der
Makrophagenzahl ließen sich keine wesentlichen Unterschiede konstatieren. Auch
hinsichtlich der Lymphozyten bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen
Kontrollen und Verumgruppe.
Die Aktivität der Myeloperoxidase in der Lunge wird als Marker der in vivo-Aktivierung
von neutrophilen Granulozyten gewertet. Die Datenlage korrelierte allerdings nicht mit
den Ergebnissen, die die quantitativen Auswertung der Gesamtzellzahl und differentielle
Zellzahlen ergaben (Abb.25D).
60
ERGEBNISSE
Die durchflusszytometrische Analyse der zweifachen Oberflächenfärbung und
intrazellulären Färbung detektierte die IFN-γ Produktion von CD4+ und CD8+ Zellen
A
B
20000
10000
BAL CD3+/CD8+/IFN+
Zellzahl
BAL CD3+/CD4+/IFN+
Zellzahl
sowohl in der bronchoalveolären Lavage als auch im Lungengewebe.
15000
10000
5000
0
6000
4000
2000
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
D
C
0.15
Lunge CD3+/CD8+/IFN+
Zellzahl [1x10 6]
2.0
Lunge CD3+/CD4+/IFN+
Zellzahl [1x10 6]
8000
1.5
1.0
0.5
0.10
**
0.05
0.00
0.0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Abbildung 26 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge
nach IFN-γ-Neutralisation und 24h nach LPS-Exposition
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie –entnahme. Die aus
BAL und Lungenverdau gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 bzw.
α-CD3/ α-CD8 differenziert. Nach der Fixierung erfolgte im Anschluß die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+
oder CD8+ Zellen durch intrazelluläre Färbung mit α-IFN-γ. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der erhaltenen
Zellzahlen (n=6 Mäuse/Gruppe): Statistische signifikante Unterschiede zwischen Behandlung mit α-IFN-γ und
Positiv- bzw. Isotypkontrollen ist mit **(p<0,01) gekennzeichnet.
Die Abbildung 26 zeigt die quantitative Auswertung der FACS Analyse. Dargestellt sind
jeweils CD4+/IFN+ und CD8+/IFN+ Zellen im Lymphozyten-Gate (CD3+). In der BAL
konnten nach LPS-Stimulation sowohl eine erhöhte Anzahl von CD4+ als auch CD8+
IFN-γ-produzierende Zellen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen nachgewiesen
werden (Abb.26A, B). Die Applikation des neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ
führte 24h nach der LPS-Expostion zu einer geringen Abnahme der CD4+/IFN+ Zellen
und zu einer deutlicheren Abnahme der CD8+/IFN+ Zellen in der BAL. Allerdings
erreichten die Unterschiede zur Positivkontrolle bei beiden Färbungen keine Signifikanz.
61
ERGEBNISSE
Bei Betrachtung der Isotypkontrolle konnte festgestellt werden, dass in der BAL keine
Unterschiede zur Positivkontrolle bezüglich der CD4+/IFN+ Zellen bestanden.
Im Lungengewebe konnten die Applikation von IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern
bzw. die Gabe von Isotypen keine Veränderungen der Anzahl von CD4+/IFN+
Lymphozyten
bewirken.
Die
Zellzahlen
entsprachen
annähernd
jenen
der
Positivkontrolle (Abb.26C). Die Zellzahl der IFN-γ-produzierenden CD8+ Lymphozyten
konnte hingegen durch die Applikation des neutralisierenden Antikörpers 24h vor der
LPS-Inhalation gegenüber der LPS-Kontrolle signifikant verringert werden (p=0,0067)
(Abb.26D). Verglich man diesen Wert mit der Isotypkontrolle, so errreichte auch hier
der Unterschied eine Signifikanz (p=0,0028), so dass falsch positive Ergebnisse
ausgeschlossen werden konnten.
Die Abbildung 27 zeigt repräsentative histologische Präparate der Lungen. Die
Inflammation wurde mit Hilfe eines Scores in verblindeter Manier quantitativ ermittelt.
Tiere der Negativkontrolle zeigten eine weitgehend normale Lungenstruktur, während
bei Tieren die LPS exponiert wurden, deutliche Infiltration polymorphnukleärer Zellen
sowie Anzeichen pulmonaler Entzündung vorlagen (Abb.27A, B). Interessanterweise
wiesen die Schnitte von Lungen der Tiere, die mit dem neutralisierenden Antikörper
behandelt wurden geringere Entzündungszeichen auf. Es konnte in diesen Präparaten im
Vergleich zu LPS-Kontroll-Tieren ein signifikant reduziertes Ausmaß der Infiltration
von Entzündungszellen, ödematösen Veränderungen der Alveolarwände sowie
verringerte
Schwellung
der
alveolärer
Epithelzellen
detektiert
werden
(Abb.27B, C; Abb.28A,) (p=0,025), die sich in insgesamt geringeren Entzündungsscores
äußerten. Die Isotypkontrollen hingegen wiesen ähnlich wie die LPS-Kontrollen
deutliche Anzeichen einer pulmonalen Inflammation auf, was sich in einer entsprechend
hohen Einordnung in die Entzündungswertigkeit widerspiegelte. Im Vergleich zwischen
Verumtieren und Isotypkontrollen zeigte sich der Unterschied dieser Wertigkeit als
signifikant (p= 0,005) (Abb.27C, D; Abb.28A).
62
ERGEBNISSE
Abbildung 27
Histologische Untersuchung des Lungengewebes
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenentnahme. Die Negativkontrollen
blieben unbehandelt. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit
H&E angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Schnitte der Negativkontrolle (A), Positivkontrolle (B), der mit
α-IFN-γ-behandelten Tiere (C) sowie ein Präparat der Isotypkontrolle (D) in jeweils 200-facher Vergrößerung. Der
Maßstabsbalken entspricht 100µm.
Die Untersuchung von Albuminspiegeln im Überstand der BAL ergab ein ähnliches Bild
(Abb.28B). LPS-Exposition von Vehikel-behandelten und Isotyp-behandelten Tieren
führte verglichen mit Negativkontrollen zu einem beträchtlichen Anstieg der
Albuminkonzentration (Abb.28B). Durch die Applikation von IFN-γ-neutralisierenden
Antikörpern konnte die Albuminkonzentration leicht gesenkt werden, als Anzeichen für
geringere vaskuläre Permeabilität, wenn auch der Unterschied keine Signifikanz
erreichte.
63
ERGEBNISSE
*
**
1000
Albumin [µg/ml]
Entzündungsscore
4
3
2
1
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
800
600
400
200
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Abbildung 28 Veränderungen der Lungenhistologie und der Albuminspiegel in der BAL nach
IFN-γ-Neutralisierung 24h nach der LPS-Inhalation
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie –entnahme. (A) Die
Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die
quantitative Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch unter Zuhilfenahme eines Scores nach Myou. (B) Im zellfreien
Überstand der BAL wurde mittels eines Bradford-Assays der Albumingehalt bestimmt. Dargestellt sind jeweils die
Mittelwerte ± SEM (A: n= 8 Tiere/Gruppe; B: n= 6 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen sind mit *(p<0,05) und
**(p<0,01) gekennzeichnet.
Tötung 72h nach LPS-Inhalation
Wurden die Mäuse 72h nach der LPS-Exposition getötet, so ließen sich deutlich
niedrigere Gesamtzellzahlen in der BAL detektieren als 24h nach der Inhalation. Die
Vernebelung von LPS führte zu einem Anstieg der Gesamtzellzahl in der BAL auf 1,8
Millionen Zellen gegenüber 0,24 Millionen Zellen der unbehandelten Tiere. Durch die
i.p. Behandlung mit neutralisierenden α-IFN-γ-Antikörpern konnte die Einwanderung
von Entzündungszellen in die BAL signifikant auf 1,3 Millionen Zellen reduziert werden
(p=0,003) (Abb.29A). Die Behandlung mit der Isotypkontrolle ergab ähnliche
Zellzahlen wie die Positivkontrolle.
Auch in der Lunge waren 72h nach LPS-Inhalation deutlich weniger Zellen nachweisbar
als 24h nach der Exposition. Die Verneblung von LPS resultierte in einer leichten
Erhöhung der Zellzahlen der Positivkontrollen im Vergleich zu unbehandelten
Negativkontrollen (Abb.29B). Die Behandlung mit α-IFN-γ-Antikörpern führte zu
keiner Veränderung der Lungenzellzahl, die Applikation der Isotypkontrolle resultierte
einer leichten Erhöhung der Zellzahl gegenüber der LPS-Kontrollen, deren Unterschied
allerdings keine statistische Signifikanz erreichte. Gegenüber der Behandlung mit
α-IFN-γ-Antikörpern zeigte sich hingegen die Erhöhung als signifikant (p=0,042).
64
A
B
2.5
20
Lunge Zellzahl [1x10 6]
BAL Zellzahl [1x10 6]
ERGEBNISSE
2.0
**
1.5
1.0
0.5
0.0
*
15
10
5
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
Abbildung 29
anti-IFN
Isotyp
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Effekte der IFN-γ-Neutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenlavage sowie -entnahme. Es erfolgten
die Bestimmung der Gesamtzellzahl von BAL (A) und Lunge (B). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (n=8
Tiere/Gruppe). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Positivkontrollen und α-IFN-γ-behandelten Tieren (A)
bzw. zwischen Isotypkontrollen und α-IFN-γ-behandelten Tieren (B) ist mit *(p<0,05) und **(p<0,01)
gekennzeichnet.
Abbildung 30 zeigt die zelluläre Zusammensetzung der BAL. Verglichen mit naiven
Tieren erfolgte nach LPS-Exposition ein Anstieg an Neutrophilen von ca.
0,003 Millionen auf 0,92 Millionen. Durch die Applikation des neutralisierenden
Antikörpers gegen IFN-γ konnte die Zahl der neutrophilen Granulozyten im Infiltrat
signifikant auf 0,62 Millionen Zellen gesenkt werden (Abb.30A) (p=0,009). Die
Behandlung der Mäuse mit der IgG1-Kontrolle hingegen führte zu keiner Änderungen
der Zellzahl gegenüber den Positivkontrollen. Während Lymphozyten 24h nach LPSExposition eine eher untergeordnete Rolle spielten, sind nach 72h Stunden merklich
Lymphozyten in der BAL nachweisbar. Im Vergleich zu unbehandelten Tieren konnte
ein deutlicher Anstieg auf 0,14 Millionen Zellen nach LPS-Inhalation verzeichnet
werden. Die vorherige Behandlung der Tiere mit α-IFN-γ erwies sich als effizient die
Zahlen an infiltrierenden Lymphozyten gegenüber der LPS-Kontrolle hochsignifikant zu
reduzieren (Abb.30B) (p<0.0001). Auch hinsichtlich der Lymphozytenzahl wiesen die
Isotypkontrollen mit den Positivkontrollen vergleichbare Zahlen auf. Auch die Zahl an
Makrophagen in der BAL konnte durch die Behandlung mit α-IFN-γ gegenüber den
LPS-Kontrollen
signifikant
reduziert
werden
(p=0,012)
(Abb.30C).
Die
Makrophagenzahl der IgG1-Kontrollen unterschied sich nicht merklich von jener der
LPS-Kontrollen.
65
ERGEBNISSE
**
0.5
0.0
Makrophagen Zellzahl [1x10 6]
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
0.20
0.15
0.10
***
0.05
0.00
C
D
1.0
0.5
0.8
0.6
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotypkontrolle
0.4
*
OD[450nm]
Neutrophile Zellzahl [1x10 6]
1.0
Lymphoyzten Zellzahl [1x10 6]
B
A
1.5
0.4
0.2
0.3
0.2
0.1
0.0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
0.0
Abbildung 30 Zelluläre Zusammensetzung der BAL und Myeloperoxidaseaktivität 72h nach der
LPS-Inhalation
Die zelluläre Zusammensetzung der Lavageflüssigkeit wurde 72h nach der LPS-Exposition durch mikroskopische
Untersuchung von Cytospins analysiert. Die Zellzahl von Neutrophilen (A), Lymphozyten (B) und Makrophagen
wurde durch Auszählung von mindestens 400 Zellen/Tier bestimmt. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der
Myeloperoxidaseaktivität in der Lunge (D). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für 8 Tiere pro Gruppe.
Signifikante Unterschiede eines bestimmten Zelltyp zwischen LPS-Kontrollen und α-IFN-γ-behandelten Tieren sind
mit*(p<0,05), **(p<0,01) und *** (p<0,001) gekennzeichnet.
In Korrelation zu reduzierten Neutrophilenzahlen in der BAL nach α-IFN-γ-Behandlung
zeigte sich auch eine verringerte Myeloperoxidaseaktivität im Vergleich zu
Positivkontrollen (Abb.30D), allerdings statistisch nicht signifikant.
Abbildung 31 zeigt die quantitative Auswertung der Durchflusszytometrie.
66
ERGEBNISSE
A
B
4000
BAL CD3+/CD8+/IFN+
Zellzahl
BAL CD3+/CD4+/IFN+
Zellzahl
15000
10000
*
5000
2000
***
1000
0
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Negativkontrolle Positivkontrolle
Isotyp
C
D
0.8
0.20
Lunge CD3+/CD8+/IFN+
Zellzahl [1x10 6]
Lunge CD3+/CD4+/IFN+
Zellzahl [1x10 6]
3000
0.6
0.4
**
0.2
0.0
anti-IFN
Isotyp
0.15
0.10
**
**
0.05
0.00
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Abbildung 31 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge
nach IFN-γ-Neutralisierung und 72h nach LPS-Exposition
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenlavage sowie –entnahme. Die aus
BAL und Lungenverdau gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 bzw.
α-CD3/ α-CD8 differenziert. Nach der Fixierung erfolgte im Anschluß die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+
oder CD8+ Zellen durch intrazelluläre Färbung mit α-IFN-γ. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der erhaltenen
Zellzahlen (n=7 (C,D) oder n=8 (A.,B) Mäuse/Gruppe): Statistische signifikante Unterschiede zwischen Behandlung
mit α-IFN-γ und Positivkontrollen sind mit *(p<0,05), **(p<0,01) und *** (p<0,001) gekennzeichnet.
Nach Restimulation ex vivo erfolgte zunächst die zweifache Oberflächenfärbung und
nach Fixierung der Zellen der BAL und Lunge, die intrazelluläre Färbung von IFN-γ
sowie die anschließende FACS-Analyse. Dargestellt sind jeweils dreifach positive
Zellen, d.h. CD4+/IFN-γ+ und CD8+/IFN-γ+ im Lymphozyten-Gate (CD3+). In der BAL
konnten nach LPS-Exposition eine deutlich höhere Zahl an CD4+ und CD8+ IFN-γproduzierenden Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Tieren nachgewiesen werden.
Die Applikation der IFN-γ-neutralisierenden Antikörpers 24h vor der LPS-Inhalation
führte zu signifikant reduzierten Mengen CD4+ IFN-γ-produzierenden Zellen (p=0,017)
(Abb.31A) und darüber hinaus zu einer hochsignifikanten Reduktion von einwandernden
CD8+ IFN-γ-produzierenden Zellen in die BAL (p=0,0003) (Abb.31B). Falsch positive
Ergebnisse konnten bei beiden Färbungen ausgeschlossen werden, da die Applikation
des Isotypes IgG1 keine signifikanten Unterschiede zu Positivkontrollbedingungen
ergab.
67
ERGEBNISSE
Auch im Lungengewebe zeigte sich die Neutralisierung von IFN-γ als hocheffizient. Die
durchflusszytometrische
Analyse
CD4+ IFN-γ-produzierenden
detektierte
Zellen
nach
signifikant
Applikation
geringere
von
α-IFN-γ
Zahlen
an
gegenüber
LPS-Kontrollen (p= 0,003) (Abb.31C). Darüber hinaus waren im Lungengewebe auch
signifikant reduzierte CD8+/IFN-γ+ Zellzahlen nach IFN-γ Neutralisierung nachweisbar
(p=0,008) (Abb.31D). Verglich man die Werte der Isotyp- und der Positivkontrollen so
zeigten sich bei beiden Färbungen in der Lunge nur leichte Unterschiede, die keine
Signifikanz erreichten, so dass auch hier falsch positive Ergebnisse ausgeschlossen
werden konnten.
Als Marker für eine vaskuläre Permeabilitätserhöhung wurde der Albumingehalt im
Überstand der BAL gemessen. LPS-Exposition führte zu einer Erhöhung der
Albuminspiegel verglichen mit unbehandelten Negativkontrollen (Abb.32). Durch
Behandlung der Mäuse mit IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern waren gegenüber
Kontrollbedingungen hochsignifikant reduzierte Albuminkonzentrationen in der BAL
detektierbar (p=0,0002) (Abb.32). Hingegen zeigte die Behandlung mit der
IgG1-Kontrolle
keinen
präventiven
Effekt
auf
die
Lungenschädigung,
die
nachgewiesenen Albuminspiegel entsprachen im Ausmaß jenen der Positivkontrolle
Albumin [µg/ml]
800
600
***
400
200
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
anti-IFN
Isotyp
Abbildung 32 Veränderungen des Albuminspiegel in der BAL nach IFN-γ-Neutralisierung 72h
nach der LPS-Inhalation
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenlavage. Im zellfreien Überstand der
BAL wurde mittels eines Bradford-Assays der Albumingehalt bestimmt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte ±
SEM (n= 6 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen zwischen α-IFN-γ-Behandlung und Positivkontrollen sind mit
***(p<0,001) gekennzeichnet
Analog zu den Untersuchungen 24h nach LPS-Vernebelung wurden auch nach 72h
histologische Analysen der Lunge durchgeführt, um die Effekte der IFN-γ
Neutralisierung auf die Inflammation zu evaluieren. Die Entzündung wurde auch hier
68
ERGEBNISSE
mittles eines semiquantitativen Scores nach Myou quantifiziert. Abbildung 33 zeigt die
in verblindeter Weise ermittelte Entzündungswertigkeit. Tiere der Negativkontrollen
wiesen eine weitgehend normale Lungenstruktur ohne Entzündungszeichen auf,
während LPS-Exposition der Tiere zu deutlichen Anzeichen pulmonaler Inflammation
führte (Abb.34A, B). Die Lungenschnitte zeigten massiven Einstrom inflammatorischer
Zellen, ödematöse Veränderungen der Alveolarwände sowie Schwellung alveolärer
Epithelzellen. Dies führte zur Einordnung in eine höher Entzündungswertigkeit der
Positivkontrollen im Vergleich zu den naiven Tieren (Abb.33). Hingegen fielen bei
Betrachtung der Präparate der mit α-IFN-γ-behandelten Mäuse deutlich weniger
Anzeichen einer pulmonalen Entzündung und ein signifikant reduzierter Influx an
inflammatorischen Zellen auf (Abb.34C). Dies äußerte sich dementsprechend in der
Einordnung in eine signifikant niedrigere Entzündungswertigkeit (p=0,002) (Abb.33).
Die Isotypkontrollen hingegen wiesen ähnlich wie die LPS-Kontrollen deutliche
Anzeichen einer pulmonalen Inflammation auf (Abb.33, Abb.34D).
Entzündungsscore
4
**
3
2
1
0
Negativkontrolle Positivkontrolle
Abbildung 33
anti-IFN
Isotyp
Semiquantitative Auswertung der Lungenhistologie nach IFN-γ Neutralisierung
.Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenentnahme. Die Lungen wurden in 4%
Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die quantitative Auswertung
erfolgte lichtmikroskopisch unter Zuhilfenahme eines Scores nach Myou. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte ±
SEM (n= 8 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen zwischen α-IFN-γ-Behandlung und Positivkontrollen sind mit
**(p<0,01) gekennzeichnet
69
ERGEBNISSE
Abbildung 34
Histologische Untersuchung des Lungengewebes 72h nach LPS-Inhalation
Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden
die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenentnahme. Die Negativkontrollen
blieben unbehandelt. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit
H&E angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Schnitte der Negativkontrolle (A), Positivkontrolle (B), der mit
α-IFN-γ-behandelten Tiere (C) sowie ein Präparat der Isotypkontrolle (D) in jeweils 200-facher Vergrößerung. Der
Maßstabsbalken entspricht 100µm.
70
DISKUSSION
4 Diskussion
Trotz der enormen globalen Auswirkungen von COPD existieren keine medikamentösen
Therapiemöglichkeiten, für die ein Aufhalten der Progression oder eine Reduktion der
Mortalität gezeigt werden konnte. In den letzten Jahren waren, im Vergleich zu den
beachtlichen Fortschritten im Asthma Management, nur sehr wenige therapeutische
Innovationen zur Behandlung von COPD zu verzeichnen. Rationale Therapien hängen
von der Aufklärung an der Inflammation beteiligter zellulärer und molekularer
Mechanismen ab. Die pathophysiologischen Vorgänge bei COPD sind allerdings nicht
vollends bekannt und da zahlreiche verschiedene Zelltypen, wie Neutrophile, T-Zellen
und Makrophagen, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von COPD spielen, ist es nötig
ihre konkrete Rolle zu definieren (Barnes 2004). Beispielsweise werden sowohl
neutrophile Granulozyten und deren Serinproteasen als Mediatoren der Zigarettenrauchinduzierten Lungenschädigung diskutiert, kontrovers dazu wird diese Aufgabe durch
andere Studien Makrophagen und MMP zu geschrieben (Hill et al. 2000). Darüber hinaus
ist die Rolle der Lymphozyten in der Pathogenese von COPD nach wie vor unklar.
Während eine Korrelation des Schweregrades der Erkrankung mit der Zahl an T-Zellen in
emphysematösen Lungen beschrieben ist, bleibt der endgültige Stimulus der
T-Zell-Aktivierung und Rekrutierung fragwürdig (Finkelstein et al. 1995).
In Anbetracht mangelnder Therapiemöglichkeiten wurden in der vorliegenden Arbeit
mögliche pharmakotherapeutische Ansätze auf ihre Wirksamkeit anhand eines
Tiermodells der LPS-induzierten Lungenschädigung geprüft. Im Speziellen lag der Fokus
auf Effekten von U0126, einem MAP Kinase Inhibitor, Dexamethason und Roscovitine,
einem CDK-Inhibitor, auf die pulmonale Entzündung. Des Weiteren sollte die Rolle der
adaptiven Immunität in der Pathogenese von COPD durch Neutralisierung von IFN-γ
geklärt werden.
4.1 Wirkungen des MEK1/2-Inhibitors U0126 in vitro
Auf
der
Suche
nach
anti-inflammatorischen
Wirkstoffen
mit
neuartigen
Wirkmechanismen wurde die niedermolekulare Substanz U0126 entdeckt. Für U0126
konnte initial ein funktioneller Antagonismus der transkriptionellen Aktivität des
71
DISKUSSION
Transkriptionsfaktors AP-1 nachgewiesen werden. Später wurde gezeigt, dass via
nicht-kompetetiver Inhibition der dual-spezifischen Kinasen MEK1 und MEK2 die
Phosphorylierung von ERK blockiert wird (Favata et al. 1998). U0126 inhibiert MEK1/2
direkt durch Blockade der katalytischen Aktivität des aktiven Enzyms.
Abbildung 35
Chemische Struktur von U0126
MEK1/2 ist die vorgeschaltete MAP Kinase Kinase der ERK MAP Kinase in der
ERK-Signaltransduktionskaskade,
die
ERK
mittels
Phosphorylierung
aktiviert.
Verschiedene extrazelluläre Stimuli, wie Wachstumsfaktoren und inflammatorische
Zytokine und verschiedene Stresssignale aktivieren die drei MAP Kinase Signalwege
ERK, p38 und JNK. Durch Phosphorylierung verschiedener Transkriptionsfaktoren
sowie Regulation der Zytokinproduktion spielt die aktivierte ERK MAPK eine wichtige
Rolle im Entzündungsprozess (Cobb und Goldsmith 1995).
Studien konnten belegen, dass die Stimulation mit dem Phorbolester TPA in humanen
Zelllinien zu einer Aktivierung der ERK und p38 MAP Kinasen führt (Franklin und
Kraft 1997; Katsuyama et al. 2001). In humanen Primärzellen konnten ähnliche
Ergebnisse
festgestellt
werden,
nach
der
Stimulation
mit
TPA
wurden
durchflusszytometrisch hohe Mengen phosphorylierter und aktivierter ERK und p38
MAPK detektiert. Der Inhibitor U0126 blockierte selektiv MEK1/2 und inhibierte die
Aktivierung von ERK, nicht jedoch von p38 MAPK. Diese Spezifität des Inhibitors
wurde auch durch zahlreiche andere Studien bestätigt (Favata et al. 1998; Scherle et al.
1998; Davies et al. 2000).
Das pro-inflammatorische Zytokin TNF-α verfügt über ein breites Spektrum an
entzündlichen Effekten, die für COPD relevant sind. Es konnte gezeigt werden, dass die
Produktion von TNF-α in LPS-stimulierten Monozyten von MAP Kinasen abhängig ist
und durch spezifische ERK und p38 MAPK Inhibitoren blockiert werden kann (Foey et
al. 1998). Dies konnte in dieser Arbeit in isolierten humanen PBMCs bestätigt werden.
Der MEK1/2 Inhibitor U0126 war in der Lage, die Zytokinproduktion von TNF-α
72
DISKUSSION
dosis-abhängig zu inhibieren. Der errechnete IC50 Wert von 0,21µM bestätigte
Ergebnisse einer früheren Studie, in der ebenfalls die TNF-α Produktion in Monozyten
mittels U0126 inhibiert wurde (Scherle et al. 1998).
Interleukin-2 wird von CD4+ Lymphozyten produziert und ist lokaler Wachstumsfaktor
für T-Zellen, da es autokrin aktivierend wirkt. Für die vollständige Aktivierung von
CD4+ Zellen ist eine Kostimulation nötig. CD28 ist ein gut charakterisierter
Kostimulator und ist konstitutiv auf der T Zell-Oberfläche exprimiert. Die Expression
von IL-2 in isolierten humanen Blutlymphozyten wurde durch Kostimulation mit
α-CD3/CD28 rasch induziert. In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass durch
Kostimulation mit CD28 die ERK MAP Kinase aktiviert und die IL-2 Produktion
hochreguliert werden kann (Schneider et al. 1995; Schaeffer und Weber 1999;
Kogkopoulou et al. 2006). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen dieser
Arbeitsgruppe (Chialda et al. 2005) konnte durch Blockade von ERK mit dem MEKInhibitor U0126 die IL-2-Induktion dosis-abhängig mit einem IC50-Wert von 0,9µM
gehemmt werden.
In Korrelation mit zahlreichen anderen Studien zeigen diese Ergebnisse die hohe Affinität
und Spezifität von U0126 für MEK1/2 im Vergleich zu anderen Kinasen. Die zelluläre
Wirksamkeit des Inhibitors auf die Induktion der Zytokine TNF-α und IL-2 in vitro in
humanen PBMCs zeigt ein anti-entzündliches Potential für die Substanz an. Diese Daten
waren der Anlass mögliche anti-inflammatorische Effekte in vivo in einem Mausmodell
der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung zu evaluieren.
4.2 U0126 reduziert LPS-induzierte Lungenschädigung in vivo
Nach der Inhibition der Aktivierung von ERK in vitro war von Interesse, ob der
Inhibitor U0126 eine Wirkung in einem in vivo Modell der akuten LPS-induzierten
Lungenschädigung
aufwies.
Dieses
Modell
ist
geeignet,
um
die
akuten
Entzündungsprozesse der Lunge zu untersuchen, die zu Beginn der Erkrankung und
während akuter Exazerbationen von COPD auftreten. Mäuse wurden vernebeltem LPS,
das als bioaktiver Bestandteil im Zigarettenrauch enthalten ist, exponiert. Diese lokale
Art der Applikation wurde gewählt, da eine systemische Administration eine
Endotoxinämie und Symptome eines septischen Schocks zur Folge hat.
73
DISKUSSION
Zur Aufklärung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen der
Erkrankung sind Tiermodelle von COPD von großer Bedeutung. Darüber hinaus sind sie
auch ideal zur Entwicklung neuer spezifischer Therapeutika geeignet. Es existieren eine
Vielzahl an Tiermodellen von COPD (beschrieben in Kapitel 1.4), die charakteristische
Merkmale der Erkrankung, wie Inflammation und Obstruktion der Atemwege sowie
Emphysembildung, imitieren.
Der MAP Kinase Signaltransduktionskaskade wird eine große Bedeutung in der
Pathogenese der akuten LPS-induzierten Lungenentzündung zugeschrieben. Kürzlich
konnte eine Reihe von Studien zeigen, dass p38 MAPK eine bedeutende Rolle bei der
LPS-induzierten Lungenschädigung spielt. Durch pharmakologische p38 MAPK
Inhibition mit SB203580 konnte die pulmonale inflammatorische Reaktion signifikant
reduziert werden. Darüber hinaus konnten Zytokin- und Chemokinproduktion sowie die
Aktivierung von NF-κB inhibiert werden (Liu et al. 2008). Ähnliche Resultate lieferten
Untersuchungen mit Compound 37, einem spezifischen p38 α, β Inhibitor, dessen
Applikation
dosis-abhängig
die
LPS-induzierte
Bronchokonstriktion
und
die
Rekrutierung von Neutrophilen in das Lungengewebe und den bronchoalveolären Raum
reduzierte. Des Weiteren konnten die TNF-Induktion und TNF-Signale blockiert werden
(Schnyder-Candrian et al. 2005). Diese Ergebnisse deuten auf eine Beteiligung von p38
MAPK an der Vermittlung von pulmonaler Neutrophilie, Induktion der Zytokin- und
Chemokinproduktion sowie bronchialer Obstruktion hin.
Die Bedeutung der ERK MAPK hingegen ist weitestgehend unklar. In einem
Asthma-Modell in IL-13-überexprimierenden Mäusen reduzierte die Gabe eines
weiteren MEK1/2 Inhibitors PD98059 die IL-13-induzierte pulmonale Inflammation,
was eine Beteiligung des ERK-Signalweges implizierte (Lee et al. 2006). Duan und
Mitarbeiter konnten zeigen, dass U0126 (ebenfalls in der Konzentration von 30mg/kg)
anti-inflammatorische Effekte in einem Ovalbumin-induzierten Asthma-Modell aufwies
(Duan et al. 2004).
In dieser Arbeit sollte nun belegt werden, dass auch die ERK MAP Kinase an der
Entstehung des LPS-induzierten Lungenschadens beteiligt ist und die Blockade durch
U0126 anti-entzündliche Effekte aufweist.
Es ist weit reichend belegt, dass die Applikation des potenten Stimulus LPS zu einer
Entzündung der Atemwege, begleitet von inflammatorischem Zelleinstrom, führt. Die
kurzfristige Exposition zu LPS ist mit einer rapiden Infiltration von neutrophilen
74
DISKUSSION
Granulozyten assoziiert, die bis ca. 24h nach Provokation ihren Höhepunkt erreicht und
72h später deutlich abgeschwächt vorliegt (Vernooy et al. 2001). In Übereinstimmung
mit diesen Resultaten induzierte die Inhalation von LPS einen massiven Einstrom
inflammatorischer Immunzellen, primär Neutrophile, der 24h nach der Inhalation stark
ausgeprägt war. Neutrophile Granulozyten bilden die erste Front an Entzündungszellen.
Sie zirkulieren im Blut und wandern entlang eines Gradienten an Chemokinen gezielt in
das entzündete Gewebe. Es ist bekannt, dass LPS die Produktion verschiedener
inflammatorischer Zytokine und Chemokine induziert (Strieter et al. 1999). Im Zuge des
Einstroms von Neutrophilen und Makrophagen nach LPS-Provokation konnte ein
deutlicher Anstieg von TNF-α und den Chemokinen MIP-2 und KC in die
bronchoalveoläre Lavage beobachtet werden. Dies spiegelt auch die klinische Situation
wider, wo in bronchoalveolärer Lavage und Bronchialbiopsien von COPD Patienten
Neutrophilie und erhöhte Spiegel inflammatorischer Zytokine und Chemokine, wie IL-8
und MCP-1 nachgewiesen werden (Chung 2001).
Neben der Blockade der Phosphorylierung von ERK in humanen Primärzellen, konnte
U0126 die Aktivierung von ERK MAPK auch in murinen Lungen signifikant inhibieren.
Die Administration von U0126 reduzierte effektiv die inflammatorische Zellinfiltration
in die bronchoalveoläre Lavage von LPS-exponierten Mäusen. Darüber hinaus führte die
Inhibition von ERK MAPK zu einer verringerten Produktion des pro-inflammatorischen
Zytokins TNF-α und den Chemokinen KC und MIP-2. Die aus der MEK1/2 Blockade
resultierende Reduktion jener Chemokine könnte somit mutmaßlich zur verringerten
Neutrophilie des Lungengewebes beitragen.
Gleichzeitig mit erhöhtem Einstrom von Neutrophilen in die Lunge war eine erhöhte
Aktivität der Myeloperoxidase im Lungengewebe nachweisbar. Eine Reihe von Studien
zeigten, dass MPO eine wichtige Rolle im oxidativen antimikrobiellen System von
neutrophilen Granulozyten spielt und dass eine Erhöhung der Konzentration von MPO
in der BAL als Indikator der in vivo-Aktivierung von neutrophilen Granulozyten
gewertet wird (Winterbourn et al. 2000; Klebanoff 2005). Durch die Behandlung mit
U0126 konnte die MPO-Aktivität in Lungen von LPS-exponierten Mäusen deutlich
reduziert werden. Dass die Blockade von ERK sowohl die Neutrophilie als auch die
MPO-Aktivität in der Lunge reduzierte, bestätigt die Effizienz des eingesetzten
Inhibitors.
75
DISKUSSION
Eine Erhöhung der alveolären epithelialen Permeabilität ist ein charakteristisches
Kennzeichen von verschiedenen Lungenerkrankungen, wie Asthma bronchiale oder
COPD. LPS schädigt endotheliale und epitheliale Zellen und fördert die pulmonale
Hyperpermeabilität (Li et al. 1998). Es konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der
Hyperpermeabilität der Lunge die akute Lungenschädigung mindern kann (Speyer et al.
2003). Albumin, als wichtigstes Plasmaprotein, ist normaler Bestandteil des
Alveolarfilms und eine Erhöhung der Konzentration in der bronchoalveolären Lavage
stellt einen Hinweis auf Schädigung der alveolo-endothelialen Barriere dar (Low et al.
1978). In dieser Arbeit führte die LPS-Inhalation von Mäusen zu erhöhten
Albuminspiegeln in der BAL, was eine Schädigung des Endothels und Epithels indiziert.
Durch die Gabe von U0126 konnten die durch LPS induzierten erhöhten
Proteinkonzentrationen deutlich reduziert werden. So ist anzunehmen, dass die
Reduktion der Hyperpermeabilität der Lunge zu den therapeutischen Effekten des
Inhibitors beitragen könnte.
Emphysematöse Veränderungen und die Zerstörung von parenchymalen Strukturen des
Lungengewebes sind typische Kennzeichen von COPD. Diese morphologischen
Veränderungen sind meist begleitet von einer massiven Infiltration von Immunzellen.
Infolge chronischer Stimulation mit LPS handelt es sich hierbei um Makrophagen und
Lymphozyten, akute Provokation mit LPS resultiert hingegen in der Einwanderung von
Neutrophilen. Dies konnte durch unsere Ergebnisse bestätigt werden. Die histologische
Analyse zeigte, dass sich nach der Applikation von U0126 die Lungenschädigung und
Neutrophilie als deutlich reduziert darstellte. Dies bekräftigte die Resultate der
bronchoalveolären Lavage und deutet darauf hin, dass die pulmonale Infiltration von
neutrophilen Granulozyten von der ERK MAPK abhängig sein könnte.
Der Verlust der Lungenfunktion ist ein charakteristisches Merkmal von COPD und die
Spirometrie stellt ein wesentliches diagnostisches Verfahren dar. Es dient zur Erfassung
des
Schweregrades
der
Erkrankung
und
hilft
so
bei
der
Auswahl
der
Behandlungsoptionen. Da der FEV1 bei COPD im Zeitverlauf schneller abnimmt als bei
gesunden Patienten, fungiert die Messung der Lungenfunktion als Monitor für die
Progression der Erkrankung. Lefort und Kollegen zeigten, dass die Gabe von LPS in
einem akuten Modell innerhalb von 2h eine rasche Bronchokonstriktion erzeugte, die
nach ca. 5 Stunden zu einem basalen Niveau zurückkehrte. Zeitgleich wurde eine
Hyperreaktivität des Bronchialsystems gegenüber Metacholin detektiert, in Korrelation
76
DISKUSSION
mit submaximalen Neutrophilenzahlen in den Atemwegen. Nach 24h konnten maximale
Zahlen an Neutrophilen nachgewiesen werden, allerdings zeigte der Atemwegswiderstand
basale Werte (Lefort et al. 2001). In Korrelation mit diesen Erkenntnissen konnte eine
Erhöhung des PenH Wertes 2h nach der Inhalation von LPS festgestellt werden. Durch
die vorherige Gabe von U0126 konnte der Atemwegswiderstand gesenkt werden, also die
Lungenfunktion verbessert werden.
Zusammenfassend zeigt dieser Teil der Arbeit, dass der ERK MAPK Signalweg eine
entscheidende Rolle bei der LPS-induzierten Lungenschädigung spielt. Es konnte
gezeigt werden, dass die Blockade von ERK durch den MEK/2 Inhibitor U0126 den
Lungenschaden signifikant reduzierte. Vermutlich wird dieser anti-inflammatorische
Effekt von U0126 sowohl durch reduzierte Neutrophilie und Hyperpermeabilität, als
auch durch verringerte Zytokin-und Chemokinspiegel vermittelt.
Da einige p38 MAPK Inhibitoren (SB-242235, RWJ-67657 und VX-745) bereits in
klinischen Studien zur Behandlung anderer inflammatorischer Erkrankungen untersucht
werden, könnte, in Anbetracht fehlender effektiver Pharmakotherapeutika, die ERK
Inhibition eine mögliche neue alternative Therapieoption für COPD darstellen.
4.3 Wirkungen von Roscovitine und Dexamethason auf die akute
LPS-induzierte Lungenschädigung
Im Vergleich zu akuten entzündlichen Prozessen sind chronische Entzündungen, wie bei
COPD vorliegend, nicht selbst auflösbar. Ein pharmakotherapeutisches Ziel ist es, nicht
nur anti-inflammatorisch einzugreifen, sondern auch aktiv die Auflösung der Entzündung
zu fördern. Hierzu wurden das Glucocorticoid Dexamethason und der CDK-Inhibitor
Roscovitine auf ihre therapeutische Wirkung im LPS-Modell untersucht.
Glucocorticoide sind nicht in der Lage die chronische Inflammation von COPD zu
unterdrücken und gelten, durch diese so genannte Steroidresistenz, nicht als Mittel der
ersten Wahl. Allerdings sind Glucocorticoide neben ihrer grundsätzlichen hohen
anti-inflammatorischen Potenz auch potenziell auflösungsfördernd.
77
DISKUSSION
In einem Rattenmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung konnte gezeigt
werden, dass durch die Applikation des Glucocorticoids Budesonid die zelluläre
Infiltration inhibiert werden konnte (Birrell et al. 2005). Ähnliche Ergebnisse ergab auch
diese Arbeit, da sowohl durch die prophylaktische als auch die therapeutische Gabe von
Dexamethason die pulmonale inflammatorische Reaktion und Neutrophilie infolge
LPS-Exposition inhibiert werden konnte. Glucocorticoide vermitteln einerseits ihre
anti-entzündlichen
Wirkungen
über
die
Transrepression
NF-κB-abhängiger
pro-inflammatorischer Targetgene, darunter auch pro-inflammatorische Zytokine,
Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle. Darüber hinaus induzieren Glucocorticoide
eine Erhöhung der Phagozytoseleistung von apoptotischen Neutrophilen durch
Makrophagen, erhöhen allerdings gleichzeitig die Lebensdauer von Neutrophilen.
Hingegen vermitteln Glucocorticoide neuesten Erkenntnissen zufolge eine Induktion der
Expression von Annexin 1 und dessen Rezeptor (AXLR), der auch als Rezeptor für das
auflösungsförderne LXA4 fungiert. Die Folgen erhöhter Annexin 1-Produktion sind
reduzierte neutrophile Transmigration, Erhöhung neutrophiler Apoptoseraten und
Förderung der Phagozytose (Perretti und D'Acquisto 2009). Dies gibt eine mögliche
Erklärung der auflösungsfördernden Eigenschaften und der im LPS-Modell beobachteten
anti-inflammatorischen Effekte von Dexamethason.
CDK-Inhibitoren induzierten die Apoptose von inflammatorischen Zellen und fördern
somit die Resolution der Entzündung. Vermutlich wird dies durch eine „Downregulation“
von Mcl-1 vermittelt, ein Schlüsselprotein, das Apoptose-regulierend (u.a. von
Neutrophilen) wirkt (Raje et al. 2005). Die therapeutische Applikation von Roscovitine
führte zu einer Reduktion des inflammatorischen Zelleinstroms in die BAL, nicht jedoch
die prophylaktische Gabe. In Korrelation mit diesen Ergebnissen, wurde am Modell der
Bleomycin-induzierten Lungenschädigung gezeigt, dass die Gabe von Roscovitine zum
Zeitpunkt maximaler Entzündung diese reduzierte und die Auflösung der Inflammation
förderte (Rossi et al. 2006). So ist anzunehmen, dass nur die therapeutische Gabe von
Roscovitine zu einer Modulation der Apoptose von neutrophilen Granulozyten führt,
somit die inflammatorischen Reaktion im LPS-Modell reduziert und letztlich die
Resolution der Entzündung fördert.
Einige CDK-Inhibitoren befinden sich bereits in klinischer Prüfung zur Behandlung von
Prostata- und Lungenkrebs (Senderowicz 2003). Sie besitzen darüber hinaus Potential als
alternative Therapie von Erkrankungen, die mit erhöhter oder persistierender
78
DISKUSSION
inflammatorischer Immunantwort assoziiert sind, wie beispielsweise COPD, Einsatz zu
finden.
4.4 Die pathogenetische Rolle der adaptiven Immunität bei COPD
4.4.1 Charakterisierung
der
inflammatorischen
Reaktion
infolge
LPS-Exposition
Tabak- und Zigarettenrauch, die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von COPD,
enthalten hohe Mengen des potenten inflammatorischen Stimulus LPS (Hasday et al.
1999). Es ist bekannt, dass die Inhalation von LPS eine akute und chronische
Entzündung, begleitet von inflammatorischem Zelleinstrom und der Freisetzung von
pro-inflammatorischen Zytokinen, verursacht (Brass et al. 2003). Die LPS-Exposition
über einen längeren Zeitraum führt zu einem Einstrom von Makrophagen und CD8+
Lymphozyten in die peripheren Atemwege, die kurzfristige Exposition hingegen zum
Einstrom
von
Neutrophilen
und
Makrophagen
(Vernooy
et
al.
2002).
In
Übereinstimmung mit der Literatur (Ferretti et al. 2003) führte die Exposition von
Yeti-Mäusen gegenüber einem LPS-Aerosol zu einem deutlichen Einstrom von
Immunzellen in die BAL, dessen Höhepunkt sechs Stunden nach der LPS Provokation
erreicht war, gefolgt von einem zweiten „Peak“, der 24 Stunden später detektiert werden
konnte. Das zelluläre Infiltrat bestand zu den beiden frühen Zeitpunkten hauptsächlich
aus neutrophilen Granulozyten, während 72 Stunden nach der Inhalation ein deutlicher
Einstrom an Lymphozyten messbar war.
Zeitgleich mit der erhöhten neutrophilen Infiltration der frühen Zeitpunkte war eine
Zunahme der Myeloperoxidase-Aktivität in der Lunge nachweisbar, als Marker für die
Aktivierung von neutrophilen Granulozyten (Klebanoff 2005).
Auch die schädigende Wirkung von LPS auf die alveolo-endotheliale Barriere konnte in
Abhängigkeit der Zeit bestätigt werden. Erhöhte Albuminkonzentrationen in der BAL
infolge LPS-Inhalation waren zu allen Zeitpunkten nachweisbar, zeigten sich jedoch
über die Zeit hinweg als kontinuierlich abnehmend.
Die aktive Teilnahme von T-Zellen an der inflammatorischen Reaktion in den
Atemwegen ist hinreichend belegt. Im Lungenparenchym von COPD Patienten konnten
79
DISKUSSION
erhöhte Mengen von CD4+ und CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden, mit einer
Dominanz der CD8+ Lymphozyten (Saetta et al. 1998). Grumelli und Mitarbeiter
konnten nachweisen, dass jene CD4+ und CD8+ Zellen scheinbar vollständig aktiviert
sind, in gleicher Art und Weise wie dies nach Antigenpräsentation der Fall ist (Grumelli
et al. 2004). Die T-Lymphozyten zeigen überwiegend ein T Helfer 1 (Th1)/
zytotoxisches T 1 (Tc1) Muster mit verstärkter IFN-γ Produktion. Ebenso wiesen
Panzner und Mitarbeiter eine gesteigerte IFN-γ Sekretion in Bronchialbiopsien von
COPD - Patienten nach (Panzner et al. 2003).
Bizistronische IFN-γ-eYFP Reporter Mäuse (Yeti), welche die direkte Identifizierung
von vitalen IFN-γ exprimierenden Zellen ermöglichen, wiesen 72 Stunden nach der
LPS-Inhalation
maximale
Lymphozyteninfiltration
in
die
BAL
auf.
Die
Lymphozytenpopulation bestand aus CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen. Ein
überwiegender Anteil der CD8+ Lymphozyten konnte als eYFP+ respektive als
IFN-γ-produzierend
detektiert
werden,
was
eine
Th1-Immunantwort
bei
der
LPS-induzierten Lungenschädigung implizierte. Dies korreliert mit der kürzlich
erwiesenen gesteigerten IFN-γ-Geninduktion bei COPD und bestätigt somit ein
Th1-Paradigma der beteiligten T-Zellen (Di Stefano et al. 2004).
4.4.2 IFN-γ-Neutralisation reduziert LPS-induzierten Lungenschaden
Die Rolle von IFN-γ bei inflammatorischen Prozessen in der Lunge ist nicht vollständig
geklärt. IFN-γ ist ein charakteristisches Zytokin der Typ 1 Immunantwort und
CD8+ Lymphoyzten sind neben CD4+ T-Zellen die hauptsächliche Quelle, aber auch
natürliche Killerzellen und Makrophagen sind in der Lage IFN-γ zu produzieren. Neben
seiner antiviralen Aktivität ist IFN-γ eng mit der Induktion der Apoptose von
Makrophagen und T-Zellen assoziiert (Dalton et al. 1993; Farrar und Schreiber 1993).
Darüber hinaus induziert IFN-γ andere Zytokine und deren Rezeptoren, die mit
immunmodulatorischen und pro-inflammatorischen Prozessen assoziiert sind, wie
TNF-α, IP-10 oder RANTES (Boehm et al. 1997; Schroder et al. 2004).
Die Inhalation von LPS von Yeti Mäusen resultierte in einer Infiltration von
eYFP+ CD8+ Lymphozyten in die BAL, was gleichzeitig mit einer erhöhten
Lungenschädigung assoziiert war. Durch die Neutralisation von IFN-γ sollte evaluiert
80
DISKUSSION
werden, ob und inwiefern IFN-γ bei der LPS-induzierten Lungenschädigung eine
kausale Rolle spielt.
Der Einsatz von IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern erfolgte bereits zur Untersuchung
diverser Tiermodelle in verschiedenen Studien. Beispielsweise konnte durch die Gabe
von α-IFN-γ die Hypoxie-induzierte Lungenschädigung im Tiermodell reduziert werden
(Yamada et al. 2004). Auch die Mortalität des septischen Schockes infolge
Endotoxinämie konnte durch die Neutralisation von IFN-γ reduziert werden (Heinzel
1990).
Eine regulatorische Rolle für IFN-γ für die inflammatorische Reaktion des unteren
Respirationstraktes infolge LPS-Exposition wurde kürzlich demonstriert. Die Inhalation
von LPS führte in IFN-γ-defizienten Mäusen zu einer reduzierten Einwanderung von
PMN (Burch et al. 2006). Dies korreliert mit den Ergebnissen der IFN-γ-Neutralisation.
Die Applikation von neutralisierenden Antikörpern hemmte den inflammatorischen
Zelleinstrom in die BAL und das Lungengewebe 72 Stunden nach der LPS-Exposition.
Die Behandlung reduzierte die Infiltration neutrophiler Granulozyten in die
bronchoalveoläre Lavage. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass in humanen
Neutrophilen IFN-γ die Expression von TLR4, einem essentiellen Rezeptor für das
LPS Signaling, erhöht (Pearl-Yafe et al. 2007). Dieser Prozess ist gefolgt von
gesteigerter Zytokinproduktion sowie Phagozytoseaktivität und somit wird durch IFN-γ
die neutrophile Immunantwort infolge LPS-Provokation gefördert. In Korrelation mit
den Ergebnissen der IFN-γ-Neutralisation ist anzunehmen, dass IFN-γ ein wichtiger
Regulator des angeborenen Immunsystems, womöglich durch die Beteiligung an der
Rekrutierung von Neutrophilen ist und somit eine entscheidende Rolle in der akuten
LPS-induzierten Lungenschädigung spielen könnte.
Zahlreiche Studien konnten in Bronchialbiopsien von Rauchern mit oder ohne COPD
eine gesteigerte Expression von T-Lymphozyten und erhöhte Zahlen aktivierter
Makrophagen nachweisen (Di Stefano et al. 2001; Saetta et al. 2001; Saetta et al. 2002).
Es ist anzunehmen, dass neben der Modulation der T-Zell-Rezeptor-Expression und
T-Zell-Aktivierung, die vermehrte Anwesenheit von IFN-γ+ Zellen womöglich eine
Rolle in der Immunmodulation von Makrophagenfunktionen bei COPD spielt. IFN-γ
aktiviert ruhende Makrophagen und induziert die Synthese einer Reihe von Rezeptoren
für Pathogenbindung, katabolischer Enzyme, Transkriptionsfaktoren und Zytokine, die
Teil
des
angeborenen
Immunsystems
sind
(Gallin
et
al.
1995).
Jene
81
DISKUSSION
immunmodulatorische Rolle beinhaltet darüber hinaus die Aktivierung von Phagozyten
und vermehrte Rekrutierung von aktivierten Makrophagen (Antoniou et al. 2003).
Während akuter Exazerbationen können aktivierte Makrophagen durch Freisetzung von
IL-12 T-Zellen und Makrophagen stimulieren, was letztlich wiederum zu einer
Erhöhung der IFN-γ-Expression führt. LPS Inhalation führte zu vermehrter Infiltration
von Makrophagen und Lymphozyten in die BAL. Die Applikation von α-IFN-γ
reduzierte die Zahl der Makrophagen und CD4+ und CD8+ Lymphozyten in BAL und
Lungengewebe. Durch die Regulation bzw. Unterdrückung der modulatorischen
Aktivität von IFN-γ könnte somit die lokale Inflammation, vermutlich durch verringerte
Rekrutierung von Makrophagen und Unterdrückung der T-Zell-Antwort, reduziert
werden.
Finkelstein beschrieb sowohl eine Korrelation zwischen pulmonaler Zerstörung und
Anzahl der T-Lymphozyten bei Rauchern, als auch eine verstärkte pulmonale
Schädigung, die mit erhöhten Zahlen von Alveolarmakrophagen assoziiert war
(Finkelstein et al. 1995). Emphysematöse Veränderungen und Zerstörung von
Lungenparenchym, verbunden mit inflammatorischer Zellinfiltration sind typische
Charakteristika
von
COPD.
Emphysembildung
und
andere
pathologische
Veränderungen der Lunge stehen in kausalem Zusammenhang mit der lokalen
Entzündung (Hogg et al. 2004; Donaldson et al. 2005). Die Überexpression von IFN-γ
verursachte in Mäusen Emphysembildung mit Vergrößerung der Alveolen und
einhergehender makrophagozytärer und neutrophiler Inflammation sowie Expression
von MMP (Wang et al. 2000). Die Neutralisation von IFN-γ mit monoklonalen
Antikörpern reduzierte die durch LPS induzierte pulmonale Inflammation und den
inflammatorischen Zelleinstrom, so dass histologisch geringere Entzündungszeichen
nachweisbar waren. Diese Ergebnisse könnten, im Zusammenhang mit der reduzierten
Zellinfiltration
in
der
BAL,
für
eine
bedeutende
regulative
Rolle
des
pro-inflammatorischen Zytokins IFN-γ bei der LPS-induzierten Lungenschädigung
sprechen.
Neben reduzierter pulmonaler Entzündung konnte durch die Applikation von
neutralisierenden Antikörpern gegen IFN-γ die vaskuläre Hyperpermeabilität 72h nach
LPS-Exposition reduziert werden. Die durch LPS-Inhalation induzierte Schädigung der
alveolo-endothelialen Barriere führte zu einer Permeabilitätserhöhung und zum Übertritt
von Albumin in die BAL. Dieser Effekt konnte durch die Gabe von α-IFN-γ gehemmt
82
DISKUSSION
werden, was vermutlich zu den anti-inflammatorischen Wirkungen der Neutralisation
von IFN-γ bei der LPS-induzierten Lungenschädigung beiträgt.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass IFN-γ eine bedeutende Rolle in der
Pathogenese von COPD zuteil wird. Die Neutralisation von IFN-γ durch monoklonale
Antikörper konnte die durch LPS induzierte Lungenschädigung reduzieren. Vermittelt
wurde dieser anti-inflammatorische Effekt mutmaßlich durch eine Reduktion des
Neutrophilen- und Makrophageneinstroms. Inadäquat erhöhte membranolytische CD8+
T-Zellen sowie eine verringerte CD4+/CD8+ Ratio in den Lungen von COPD Patienten
sind zahlreich belegt. Eine Studie von Enelow demonstrierte, dass die Aktivierung und
Akkumulation von CD8+ T-Zellen aus der Stimulation durch ein „Auto-Antigen“,
verursacht vermutlich durch das Rauchen, resultiert und eine direkte Lungenschädigung
die Folge ist (Enelow et al. 1998). Die Neutralisation von IFN-γ senkte die Zahl der
CD8+ Lymphozyten, woraus letztlich vermutlich auch eine verminderte pulmonale
Inflammation infolge LPS-Exposition resultierte. Möglicherweise wird durch die
Neutralisation von IFN-γ die abnormale inflammatorische Reaktion des unteren
Respirationstraktes positiv auf ein nicht-entzündliches Niveau herunterreguliert.
Allerdings ist die inadäquate Reaktion der Lungen bei COPD vermutlich multifaktoriell
bedingt und weiterführende Untersuchungen sind nötig, um die Interaktionen von
Mediatoren und inflammatorischen Mechanismen zu beleuchten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen der Neutralisation von IFN-γ ein mögliches
Potenzial zur Behandlung von COPD. Die Neutralisation von Zytokinen gilt als ein
vielversprechender Ansatz zu Behandlung von COPD. Monoklonale Antikörper gegen
TNF-α
werden
beispielsweise
bereits
erfolgreich
zur
Behandlung
anderer
inflammatorischer Erkrankungen, wie Rheumatoider Arthritis eingesetzt und der Einsatz
bei COPD und Asthma Patienten ist derzeit in klinischer Prüfung (Yamagata und
Ichinose 2006).
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96
ANHANG
6 Anhang
6.1 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1
Pathogenese der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung .........................7
Abbildung 2
MAPK-Signaltransduktionskaskaden..............................................................16
Abbildung 3
Zeitkinetik der IL-2 Expression........................................................................36
Abbildung 4
Blockade der ERK Aktivierung durch U0126 .................................................37
Abbildung 5
Konzentrationsabhängigkeit von U0126 auf Zytokininhibition in
humanen PBMC.................................................................................................39
Abbildung 6
Detektion von phosphorylierter p44/42 MAPK mittels SandwichELISA .................................................................................................................40
Abbildung 7
U0126 reduziert zelluläre Infiltration in die BAL ...........................................41
Abbildung 8
Einfluss von U0126 auf die Aktivität der Myeloperoxidase ...........................42
Abbildung 9
Dosisabhängigkeit des inhibitorischen Potentials von U0126.........................43
Abbildung 10
Effekt von U0126 auf Zytokin- und Chemokinlevel in der BAL ...................44
Abbildung 11
Histologische Untersuchung der Lunge ...........................................................45
Abbildung 12
Quantifizierung der pulmonalen Entzündung.................................................46
Abbildung 13
Einfluss von U0126 auf die Albuminspiegel in der BAL.................................47
Abbildung 14
Effekte von U0126 auf die Lungenfunktion .....................................................48
Abbildung 15
Vergleich von i.t. und i.p. Applikation von Dexamethason ............................49
Abbildung 16
Prophylaktische und therapeutische Gabe von Dexamethason und
Roscovitine..........................................................................................................50
Abbildung 17
Zeitkinetik des LPS-Modells anhand von Yeti Mäusen..................................52
Abbildung 18
Charakterisierung der Lymphozytenpopulation in der BAL anhand
von Yeti Mäusen.................................................................................................53
Abbildung 19
Albumingehalt im BAL Überstand von Yeti Mäusen im LPS-Modell ..........54
Abbildung 20
Myeloperoxidase-Aktivität in Lungen von Yeti Mäusen nach LPSInhalation............................................................................................................54
Abbildung 21
Histologische Untersuchung des Lungengewebes von Yeti-Mäusen 6h,
24h und 72h nach LPS-Inhalation ....................................................................55
Abbildung 22
Quantifizierung der pulmonalen Entzündung von Yeti-Mäusen...................56
Abbildung 23
Effekte der IFN-γ-Neutralisierung in Yeti-Mäusen 24h nach LPSInhalation............................................................................................................57
Abbildung 24
Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus
BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisierung und 24h nach LPSExposition in Yeti-Mäusen ................................................................................58
Abbildung 25
Effekte der IFN-γ-Neutralisation 24h nach der LPS-Inhalation ...................60
97
ANHANG
Abbildung 26
Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus
BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisation und 24h nach LPSExposition ...........................................................................................................61
Abbildung 27
Histologische Untersuchung des Lungengewebes ...........................................63
Abbildung 28
Veränderungen der Lungenhistologie und der Albuminspiegel in der
BAL nach IFN-γ-Neutralisierung 24h nach der LPS-Inhalation...................64
Abbildung 29
Effekte der IFN-γ-Neutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation .................65
Abbildung 30
Zelluläre Zusammensetzung der BAL und Myeloperoxidaseaktivität
72h nach der LPS-Inhalation ............................................................................66
Abbildung 31
Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus
BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisierung und 72h nach LPSExposition ...........................................................................................................67
Abbildung 32
Veränderungen des Albuminspiegel in der BAL nach IFN-γNeutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation ................................................68
Abbildung 33
Semiquantitative Auswertung der Lungenhistologie nach IFN-γ
Neutralisierung...................................................................................................69
Abbildung 34
Histologische Untersuchung des Lungengewebes 72h nach LPSInhalation............................................................................................................70
Abbildung 35
Chemische Struktur von U0126........................................................................72
98
ANHANG
6.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen.....................................................vi
Tabelle 2
Substanzen ..........................................................................................................24
Tabelle 3
Verbrauchsmaterialien ......................................................................................24
Tabelle 4
Verwendete Primer ............................................................................................24
Tabelle 5
Verwendete Antikörper .....................................................................................25
Tabelle 6
Käuflich erworbene Systeme.............................................................................25
Tabelle 7
Geräte und Software..........................................................................................26
99
VERÖFFENTLICHUNGEN
7 Veröffentlichungen
Schuh K., Pahl A. Inhibition of the MAP kinase ERK protects from lipopolysaccharideinduced lung injury; Biochemical Pharmacology, akzeptiert Februar 2009
Schuh K, Pahl.A, Gessner A. Lipopolysaccharide induced lung inflammation is inhibited
by
neutralisation
of
IFN-γ,
in
Vorbereitung.
100
VERÖFFENTLICHUNGEN
101