Untersuchungen zur Wirkung von neuen anti-inflammatorischen Substanzen zur Behandlung von COPD anhand eines Maus-Modells Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Katrin Schuh aus Neustadt an der Aisch Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 27.März 2009 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Geoffrey Lee Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Dr. h.c. Kay Brune Der Beginn aller Wissenschaften ist das Erstaunen, dass die Dinge sind, wie sie sind. Aristoteles INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................V ZUSAMMMENFASSUNG ......................................................................................... VII SUMMARY 1 IX EINLEITUNG ..................................................................................................1 1.1 CHRONISCH OBSTRUKTIVE LUNGENERKRANKUNG (COPD) ....................... 1 1.1.1 DEFINITION .............................................................................................................. 1 1.1.2 EPIDEMIOLOGIE ........................................................................................................ 2 1.1.3 ÄTIOLOGIE ............................................................................................................... 3 1.1.3.1 TABAKRAUCH .................................................................................................... 3 1.1.3.2 GENETISCHE FAKTOREN..................................................................................... 3 1.1.3.3 ANDERE FAKTOREN ........................................................................................... 4 1.1.4 PATHOGENESE .......................................................................................................... 5 1.1.4.1 PULMONALE ENTZÜNDUNG ................................................................................ 5 1.1.4.2 PROTEASEN-ANTIPROTEASEN-DYSBALANCE ..................................................... 9 1.1.4.3 OXIDATIVER STRESS ........................................................................................ 10 1.1.4.4 GESTEIGERTE APOPTOSERATEN PULMONALER STRUKTURZELLEN ................... 11 1.1.5 PHARMAKOTHERAPIE VON COPD.......................................................................... 12 1.2 SIGNALTRANSDUKTIONSKASKADE DER MAP KINASEN ............................. 15 1.3 AUFLÖSUNG DER INFLAMMATION ............................................................... 18 1.4 TIERMODELLE DER COPD ........................................................................... 20 1.5 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT...................................................................... 22 2 MATERIAL UND METHODEN.......................................................................23 2.1 MATERIAL ..................................................................................................... 23 2.1.1 CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN .................................................................... 23 2.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN ................................................................................... 24 2.1.3 PRIMER UND SONDEN ............................................................................................. 24 2.1.4 ANTIKÖRPER .......................................................................................................... 25 2.1.5 KÄUFLICH ERWORBENE SYSTEME .......................................................................... 25 2.1.6 GERÄTE UND SOFTWARE ........................................................................................ 26 2.2 METHODEN .................................................................................................... 27 i INHALTSVERZEICHNIS 2.2.1 ISOLIERUNG VON PBMC AUS HUMANEM VOLLBLUT ............................................. 27 2.2.2 GEWINNUNG VON MONOZYTEN ............................................................................. 27 2.2.3 BEHANDLUNG UND STIMULATION VON ISOLIERTEN PBMC ................................... 27 2.2.4 QUANTIFIZIERUNG VON MRNA MITTELS REAL-TIME RT-PCR............................... 28 2.2.5 ELISA.................................................................................................................... 28 2.2.5.1 ZYTOKINMESSUNG IN ÜBERSTÄNDEN VON ZELLKULTUR UND BRONCHOALVEOLÄRER LAVAGE ...................................................................... 28 2.2.5.2 DETEKTION VON PHOSPHORYLIERTER P44/P42 MAPK UND P38 MAPK MITTELS ELISA ............................................................................................... 29 2.2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE BESTIMMUNG VON PP38 UND PERK1/2 MITTELS PHOSPHOSPEZIFISCHER ANTIKÖRPER ....................................................... 29 2.2.7 MAUSMODELL DER AKUTEN LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHÄDIGUNG ................. 30 2.2.7.1 VERSUCHSTIERE ............................................................................................... 30 2.2.7.2 BEHANDLUNGSPROTOKOLL .............................................................................. 30 2.2.7.3 BRONCHOALVEOLÄRE LAVAGE........................................................................ 31 2.2.7.4 LUNGENENTNAHME UND KOLLAGENASEVERDAU ............................................ 32 2.2.7.5 BESTIMMUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT DER MYELOPEROXIDASE ......................................................................................... 32 2.2.7.6 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER LUNGE ............................................. 33 2.2.7.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN .......................................... 33 2.2.7.8 ALBUMINBESTIMMUNG IN DER BRONCHOALVEOLÄREN LAVAGE ..................... 34 2.2.7.9 MESSUNG DER LUNGENFUNKTION ................................................................... 34 2.2.8 3 DATENAUSWERTUNG ............................................................................................. 35 ERGEBNISSE ................................................................................................36 3.1 IN VITRO UNTERSUCHUNGEN ........................................................................ 36 3.1.1 ZEITKINETIK DER IL-2 EXPRESSION ....................................................................... 36 3.1.2 EFFEKTE VON U0126 AUF DIE AKTIVIERUNG VON ERK IN PBMC......................... 36 3.1.3 DOSIS-ABHÄNGIGE INHIBITION DER ZYTOKIN-INDUKTION DURCH U0126 IN PBMC.................................................................................................................... 38 3.2 MAUSMODELL DER AKUTEN LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHÄDIGUNG ... 39 3.2.1 WIRKUNGEN DES MEK1/2 INHIBITORS U0126 IN VIVO .......................................... 39 3.2.1.1 AKTIVIERUNG VON P44/42 MAPK IM LUNGENGEWEBE................................... 39 ii INHALTSVERZEICHNIS 3.2.1.2 BEHANDLUNG MIT U0126 REDUZIERT LPS-INDUZIERTE ZELLEINWANDERUNG....................................................................................... 40 3.2.1.3 EINFLUSS VON U0126 AUF DIE AKTIVITÄT DER MYELOPEROXIDASE ............... 41 3.2.1.4 DOSIS-ABHÄNGIGE INHIBITION DES LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHADENS ........................................................................................... 42 3.2.1.5 ZYTOKIN-UND CHEMOKINLEVEL IN DER BRONCHOALVEOLÄREN LAVAGE ........................................................................................................... 43 3.2.1.6 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DES LUNGENGEWEBES ................................ 44 3.2.1.7 EINFLUSS VON U0126 AUF ALBUMINSPIEGEL IN BRONCHOALVEOLÄREN LAVAGE ........................................................................................................... 46 3.2.1.8 3.2.2 EFFEKTE VON U0126 AUF DIE LUNGENFUNKTION ............................................ 47 EFFEKTE ANDERER ANTI-INFLAMMATORISCHER SUBSTANZEN ............................... 48 3.2.2.1 VERGLEICH VON INTRA TRACHEALER UND INTRA PERITONEALER GABE VON DEXAMETHASON ...................................................................................... 48 3.2.2.2 PROPHYLAKTISCHE UND THERAPEUTISCHE GABE VON DEXAMETHASON UND ROSCOVITINE............................................................................................ 49 3.2.3 ROLLE DER ADAPTIVEN IMMUNITÄT BEI DER PATHOGENESE DER COPD ............... 51 3.2.3.1 ZEITKINETIK DER INFLAMMATORISCHEN LUNGENSCHÄDIGUNG ANHAND VON YETI MÄUSEN........................................................................................... 51 4 3.2.3.2 ΒEHANDLUNG VON YETI-MÄUSEN MIT Α-IFN-Γ- ANTIKÖRPER ....................... 56 3.2.3.3 NEUTRALISATION VON IFN-Γ MIT ANTIKÖRPERN IN BALB/C MÄUSEN ............ 58 DISKUSSION .................................................................................................71 4.1 WIRKUNGEN DES MEK1/2-INHIBITORS U0126 IN VITRO ........................... 71 4.2 U0126 REDUZIERT LPS-INDUZIERTE LUNGENSCHÄDIGUNG IN VIVO ........ 73 4.3 WIRKUNGEN VON ROSCOVITINE UND DEXAMETHASON AUF DIE AKUTE LPS-INDUZIERTE LUNGENSCHÄDIGUNG ............................................. 77 4.4 DIE PATHOGENETISCHE ROLLE DER ADAPTIVEN IMMUNITÄT BEI COPD 79 4.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER INFLAMMATORISCHEN REAKTION INFOLGE LPS-EXPOSITION ................................................................................................... 79 4.4.2 IFN-Γ-NEUTRALISATION REDUZIERT LPS-INDUZIERTEN LUNGENSCHADEN .......... 80 5 LITERATURVERZEICHNIS ...........................................................................84 6 ANHANG ......................................................................................................97 6.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................... 97 iii INHALTSVERZEICHNIS 6.2 7 TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................... 99 VERÖFFENTLICHUNGEN ...........................................................................100 iv ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VERWENDETE ABKÜRZUNG BEZEICHNUNG AA Arachidonsäure BAL Bronchoalveoläre Lavage CCL Chemokin (C-C Motiv) Ligand CCR Chemokin (C-C Motiv) Rezeptor CDK cyclin-dependent kinase COX Cyclooxygenase CXCL Chemokin (C-X-C Motiv) Ligand CXCR Chemokin (C-X-C Motiv) Rezeptor DHA Docosahexaensäure DUSP Dual-Specifity-Protein-Phosphatase ED50 Effective dose 50% ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EPA Eicosapentaensäure ERK1/2 Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 und 2 FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FEV1 Einsekundenkapazität (engl.: Forced Expiratory Volume in 1 second) GeoMean geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität (geometric mean fluorescence intensity) GOLD Global Iniative for Chronic Obstructive Lung Disease H 2O 2 Wasserstoffperoxid HTAB Hexadecyltrimethylammoniumbromid i.p. intra peritoneal i.t. intra tracheal IC50 Inhibitory concentration 50% IFN Interferon IFN-γ-eYFP Interferon-γ-enhanced Yellow Fluorescent Protein v ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VERWENDETE ABKÜRZUNG BEZEICHNUNG IL Interleukin KC Keratinocyte-derived Chemokine LPS Lipopolysaccharid LX Lipoxin MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MEK MAPK/ERK Kinase MIP Macrophage Inflammatory Protein MKP MAP-Kinase-Phosphatase ml Milliliter MMP Matrixmetalloproteinase MPO Myeloperoxidase NF-κB Nukleärer Faktor κ B O 2- • Superoxidanion PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells Penh enhanced Pause PMN Polymorphnukleäre(r) Neutrophil(e) PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid ROS reactive oxygen species RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkription-Polymerase Chain Reaction SLPI sekretorischer Leukozytenprotease Inhibitor TMB Tetramethylbenzidin TNF Tumor Nekrosis Faktor Tabelle 1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen vi ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMMENFASSUNG Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist weltweit die häufigste chronische Erkrankung des Respirationstraktes und Hauptursache für chronische Morbidität und Mortalität. Sie stellt inzwischen die vierthäufigste Todesursache in Industrienationen dar. Laut Definition der Weltgesundheitsorganisation (WHO) handelt es sich um eine Erkrankung, die durch eine nicht reversible Einschränkung des Atemstroms gekennzeichnet ist. Diese Limitation des Atemflusses verläuft meist progressiv und ist assoziiert mit einer abnormalen Immunantwort der Lunge auf schädigende Partikel und Gase. Der Krankheitsbegriff COPD umfasst die chronisch obstruktive Bronchitis, das pulmonale Emphysem und die chronische Entzündung in den kleinen Atemwegen und dem Lungenparenchym. Die lokale Inflammation wird dominiert durch neutrophile Granulozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten. Zigaretten- und Tabakrauch, die als Hauptrisikofaktor für die Pathogenese von COPD gelten, enthalten hohe Mengen Lipopolysaccharid (LPS). Die Zielsetzung dieser Arbeit war es deshalb, verschiedene neue anti-inflammatorische Substanzen auf ihre Wirksamkeit anhand eines inhalativen Tiermodells der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung zu untersuchen. Im ersten Teil der Arbeit wurde der MEK1/2 Inhibitor U0126 in vitro in isolierten humanen peripheren mononukleären Zellen (PBMC) untersucht. Mittels Durchflusszytometrie konnte bestätigt werden, dass U0126 selektiv den ERK MAP Kinase Signalweges blockiert. Der Effekt des MEK1/2 Inhibitors auf die Zytokinfreisetzung in stimulierten humanen PBMCs wurde mit Hilfe des ELISA Verfahrens untersucht. Die Freisetzung des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α sowie von IL-2 konnte durch die Blockade von MEK1/2 dosis-abhängig inhibiert werden. Die potenziell anti-inflammatorischen Wirkungen von U0126 in vitro wurden anschließend in einem in vivo Modell bestätigt. In Balb/c Mäusen wurde durch die Exposition gegenüber einem LPS-Aerosol eine akute Entzündung der Lungen hervorgerufen, was dem klinischen Bild einer Exazerbation von COPD entspricht. Die Inhalation von LPS führte zu einem Einstrom von neutrophilen Granulozyten in die bronchoalveoläre Lavage, begleitet von der Freisetzung des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α und den Chemokinen KC und MIP-2. Im Zusammenhang mit erhöhter Neutrophilie konnte auch eine erhöhte Myeloperoxidase-Aktivität im Lungengewebe nachgewiesen werden. Albuminbestimmungen in der BAL sowie histologische Untersuchungen bestätigten eine pulmonale Schädigung infolge der LPS-Inhalation. Die intra peritoneale Applikation des MEK1/2 Inhibitors konnte vii ZUSAMMENFASSUNG sowohl in vitro als auch im Lungengewebe selektiv die Aktivierung der ERK MAPK hemmen. U0126 reduzierte dosis-abhängig den inflammatorischen Zelleinstrom sowie Zytokin- und Chemokinfreisetzung in die bronchoalveoläre Lavage. Auch die Lungenschädigung konnte durch die prophylaktische Gabe des MEK1/2 Inhibitors signifikant verringert werden. Die Spirometrie ergab nach Applikation von U0126 lediglich eine geringfügige Verbesserung der Lungenfunktion. Im zweiten Teil wurden das Glucocorticoid Dexamethason und der CDK Inhibitor Roscovitine auf ihre prophylaktischen und therapeutischen Wirkungen im LPS-Modell untersucht. Das potent anti-entzündliche Dexamethason konnte, intra tracheal appliziert, die LPS-induzierte Lungenschädigung sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch signifikant reduzieren. Roscovitine fördert die Apoptoseinduktion von Neutrophilen und deshalb war lediglich die therapeutische Applikation effektiv. Im letzten Teil wurde die Rolle der adaptiven Immunität bei der Pathogenese von COPD untersucht. Zunächst erfolgte anhand bizistronischer IFN-γ Reportermäuse (Yeti) eine Charakterisierung der Zeitkinetik der inflammatorischen Reaktion infolge LPS-Inhalation. Während 6 bis 24 Stunden nach der LPS-Inhalation das Infiltrat hauptsächlich aus Neutrophilen bestand, bildeten zusätzlich Lymphozyten 72h nach der Inhalation eine große Population in der BAL. FACS Analysen ergaben, dass ein Großteil der CD8+ Lymphozyten 72h nach der Exposition IFN-γ produzierten, was ein Th1/Tc1 Profil implizierte. Die Rolle von IFN-γ bei dem LPS-induzierten Lungenschaden sollte durch die Neutralisierung von IFN-γ mittels monoklonalen Antikörpern untersucht werden. Die prophylaktische Gabe der Antikörper reduzierte signifikant die Neutrophilie sowie die Anzahl der CD4+ und CD8+ Lymphozyten in BAL und Lunge. Auch histologisch sowie durch Albuminbestimmungen konnte bestätigt werden, dass die Neutralisierung von IFN-γ die Lungenschädigung infolge LPS-Exposition signifikant reduzierte. Sowohl die MEK1/2 Blockade durch U0126 als auch die Neutralisation von IFN-γ stellen potentielle neue Therapieoptionen für COPD dar. Der MAP Kinase Inhibitor U0126 vermittelt seine Effekte vermutlich über eine reduzierte Neutrophilie sowie reduzierte Zytokin- und Chemokinfreisetzung. Die Reduktion des Lungenschadens durch Gabe von anti-IFN-γ wird vermutlich, neben Modulation der Aktivierung von T-Zellen und des T-ZellRezeptors, durch immunmodulatorische Regulation der Rekrutierung von Neutrophilen als auch der Aktivierung von Makrophagen verursacht. viii SUMMARY SUMMARY Among chronic respiratory diseases COPD (chronic obstructive pulmonary disease) is globally most frequent and a major cause of chronic morbidity and mortality. By now COPD is the fourth leading cause of death in industrialized countries. According to the world health organisation (WHO), it is a disease state characterized by a limitation of airflow that is not fully reversible. The airflow limitation is usually progressive and associated with an abnormal inflammatory response of the lungs to noxious particles and gases. The term COPD encompasses chronic obstructive bronchitis, with obstruction of small airways, emphysema and chronic inflammation of the small airways and lung parenchyma. The local inflammation is predominated by neutrophils, furthermore macrophages and T lymphocytes are found in the alveolar walls of COPD patients. Tobacco and cigarette smoke, the major risk factors for COPD, contain high levels of lipopolysaccharide (LPS), a cell wall component of gramnegative bacteria, which is a potent inflammatory stimulus. Therefore the aim of this study was to evaluate the potential efficacy of various drug candidates using a murine model of acute LPS-induced lung injury. In the first part of this thesis, the MEK1/2 inhibitor U0126 was analyzed in vitro using isolated human primary cells. The specificity of U0126 blocking selectively ERK MAPK pathway was analyzed by flow cytometry. ELISA analyses revealed a dose-dependent inhibition of cytokine release of pro-inflammatory TNF-α and IL-2 by U0126. The potential anti-inflammatory actions of U0126 were subsequently confirmed in an in vivo model. Balb/c mice were exposed to aerosolized LPS in order to induce an acute inflammatory response of the lungs that mirrors an acute exacerbation of clinical COPD. Exposure to LPS led to massive influx of inflammatory cells, primarily neutrophils, into bronchoalveolar lavage accompanied by increased levels of pro-inflammatory cytokine TNF-α and neutrophil chemotactic chemokines KC and MIP-2 in BAL fluid. Concomitant with elevated lung neutrophilia increased activity of myeloperoxidase was determined. Analysis of albumin levels in BAL fluid and histological examination of lung tissue confirmed pulmonary injury due to LPS challenge. Activation of ERK MAPK was selectively inhibited both in vitro and in lung tissue by intraperitoneal application of U0126. The inhibitor effectively reduced inflammatory cell influx as well as cytokine and chemokine release into BAL fluid in a dose-dependent manner. Furthermore MEK1/2 inhibition successfully attenuated lung injury and in part enhanced lung function. ix SUMMARY In the second part of this thesis, the therapeutic and prophylactic actions of glucocorticoid dexamethasone and CDK inhibitor roscovitine were approved using the LPS model. Intratracheally administered dexamethasone effectively abated LPS-induced lung injury both prophylactically and therapeutically. Since roscovitine promotes neutrophil apoptosis, only therapeutic effects of the compound were detectable. Furthermore another aim of the study was to determine the role of adaptive immunity in COPD. To this end a time course of the inflammatory response in lungs due to LPS inhalation was determined using bicistronic IFN-γ reporter mice (Yeti). Whereas inflammatory influx primarily consisted of neutrophils 6 and 24 hours after LPS challenge, lymphocytes represented a notable population 72 hours later. FACS analyses detected the majority of CD8+ lymphocytes as IFN-γ producing, indicating a Th1/Tc1 pattern. In order to examine the role of IFN-γ in acute lung injury neutralization of IFN-γ by monoclonal antibody was accomplished. The administration of anti-IFN-γ prior to LPS challenge reduced neutrophilia and numbers of CD4+ and CD8+ lymphocytes in BAL fluid and lung tissue. Moreover histological analyses and determination of albumin levels revealed diminished lung injury due to LPS inhalation by neutralizing IFN-γ. Since effective anti-inflammatory pharmacotherapy for COPD is still not available, ERK inhibition by U0126 as well as neutralization of IFN-γ may represent new treatment opportunities for COPD. We could show, that the anti-inflammatory action of U0126 may be mediated by reduced lung neutrophilia and hyperpermeability, as well as decreased levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines. Reduction of lung injury by neutralizing IFN-γ may be caused, aside from its modulation of T cell and TCR activation, by immunomodulatory regulation of PMN recruitment and macrophage functions. x EINLEITUNG 1 Einleitung 1.1 Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) 1.1.1 Definition Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (englisch: Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD) ist laut Weltgesundheitsorganisation (WHO) ein Krankheitszustand, der durch eine nicht oder nur teilweise reversible Einschränkung des Atemflusses charakterisiert ist. Diese Limitation des Atemflusses verläuft in den meisten Fällen progressiv und ist assoziiert mit einer inadäquaten entzündlichen Immunantwort der Lungen auf schädigende Partikel oder Gase (Barnes 2000). Das Krankheitsbild ist gekennzeichnet durch massive Schleimproduktion in den Atemwegen, damit einhergehender chronischer Husten und zunehmender Atemnot bei körperlicher Belastung. Bei der COPD handelt es sich um ein komplexes Symptomgebilde, das pathophysiologisch verschiedene krankhafte Konditionen subsumiert: chronische Bronchitis, Atemwegsobstruktion und das pulmonale Emphysem. Chronische Bronchitis ist gemäß WHO definiert als vermehrte Sekretproduktion der Bronchien mit produktivem Husten über mindestens drei Monate eines Jahres in zwei aufeinander folgenden Jahren. Diese vermehrte Schleimproduktion ist bedingt durch eine Hypertrophie der Schleimdrüsen. Die mit der chronischen Bronchitis assoziierte Entzündung ist im Epithel der zentralen Atemwege lokalisiert und korreliert mit weitgehender Zerstörung des Flimmerepithels sowie verminderter mukoziliärer Clearance (Hogg 2004). Die Schleimproduktion trägt allerdings nicht maßgeblich zum Fortschreiten der Atemwegsobstruktion bei. Hingegen ist die chronisch-obstruktive Bronchiolitis hauptverantwortlich für die Limitation des Atemflusses. Diese Entzündung betrifft die kleinen, membranösen Bronchiolen (< 2mm im Durchmesser) der peripheren Atemwege und wird im Englischen mit dem Begriff „Small Airway Disease“ beschrieben. Die Einschränkung des Atemflusses ist auf drei Mechanismen begründet: den Verlust von elastischen Fasern in den Alveolen, luminale Okklusion durch Mukusproduktion der Becher Zellen und die Verdickung der Alveolarwand. Letztere ist auf die verstärkte Einwanderung von 1 EINLEITUNG Entzündungszellen, Hyperplasie der glatten Muskulatur und zunehmende Fibroisierung zurückzuführen (Barnes 2004). Im fortgeschrittenen Krankheitsstadium spielt neben den erwähnten Vorgängen in der Bronchusperipherie das pulmonale Emphysem eine pathogenetische Rolle bei der Atemwegsobstruktion. Es handelt sich morphologisch um eine irreversible Ausweitung der Atemwege distal der terminalen Bronchiolen, deren zugrunde liegender Mechanismus ein Elastizitätsverlust durch Zerstörung des Lungenparenchyms ist. Eine mögliche Ursache des Emphysems ist eine Dysbalance zwischen proteolytischer und proteasehemmender enzymatischer Aktivität. Hauptverantwortlich für die Entwicklung eines Emphysems ist in den meisten Fällen der inhalative Tabakkonsum. Gemäß der Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) wird COPD in vier Schweregrade eingeteilt (GOLD Stufe 1-4). Das entscheidende Kriterium zur Einteilung ist die spirometrisch ermittelte Ausprägung der Lungenfunktionsstörung. Das Hauptaugenmerk wird pragmatisch vor allem auf das forcierte Einsekundenvolumen gelegt. Allerdings sollten auch klinische Zeichen wie Husten, Dyspnoe und Auswurf optionale Berücksichtigung finden, da die individuellen Auswirkungen der Erkrankung nicht nur vom Ausmaß der Atemflusslimitation, sondern auch vom Schweregrad der Symptome, wie Atemnot oder Einschränkung der körperlichen Belastung, abhängen. 1.1.2 Epidemiologie COPD ist weltweit die häufigste chronische Erkrankung des Respirationstraktes und Hauptursache für chronische Morbidität und Mortalität. In Europa wie auch in den USA gilt COPD als vierthäufigste Todesursache und wird nach neuesten Einschätzungen der WHO im Jahre 2020 weltweit sogar auf dem dritten Platz rangieren. Laut der European Lung Foundation ist COPD unter den führenden Todesursachen die einzige, deren Inzidenz weltweit weiterhin zunimmt. Soziökonomisch stellt COPD hohe finanzielle Anforderungen: der durch COPD bedingte Produktivitätsausfall beläuft sich in Europa auf jährlich 28,5 Milliarden Euro. In den USA wurden 2007 die resultierenden finanziellen Folgen von COPD auf eine Summe von 42,6 Milliarden US-Dollar geschätzt (Fromer und Cooper 2008). Rund 14% der über 40-Jährigen und sogar rund 27% der über 70-Jährigen leiden an chronisch obstruktiver Lungenerkrankung. Während bei den über 60-Jährigen Männer 2 EINLEITUNG überproportional häufiger betroffen sind, gleichen sich die Prävalenzen in jüngeren Generationen (zwischen 30-50 Jahre) bei Frauen und Männern an, was vermutlich auf ein verändertes Rauchverhalten junger Frauen zurückzuführen ist (Buist et al. 2008). 1.1.3 Ätiologie 1.1.3.1 Tabakrauch Der Hauptrisikofaktor weltweit für die Entwicklung von COPD ist das Zigarettenrauchen. In Industriestaaten ist die Mortalität von COPD in 73% der Fälle auf das Tabakrauchen zurückzuführen, in Ländern mit mittlerem und niedrigem Durchschnittseinkommen in ca. 40% der Erkrankungen (Mannino und Buist 2007). Allerdings entwickeln nur ca. 20% der Raucher einen raschen Abfall des FEV1, was letztlich zu schweren (GOLD-3) und sehr schweren Formen (GOLD-4) von COPD führt. Hingegen findet man bei jedem Raucher pulmonale Entzündungszeichen und bei jenen, die fortgeschrittene Level der Erkrankung erreichen, scheint diese Entzündungsreaktion verstärkt zu sein (Curtis et al. 2007). Pfeifen- und Zigarrenrauchen führen ebenfalls zu erhöhten Morbiditäts- und Mortalitätsraten (Iribarren et al. 1999). Auch Passivrauchen kann durch die Inhalation von Partikeln und Gasen zur Entstehung einer COPD beitragen (Yin et al. 2007). 1.1.3.2 Genetische Faktoren Da nur bei einer Minderheit der Raucher eine rasche Verminderung der Lungenfunktion beobachtet werden kann, liegt die Vermutung nahe, dass genetische Faktoren das individuelle Erkrankungsrisiko modulieren. Beispielsweise sind klare Prävalenzunterschiede verschiedener ethnischer Abstammungen belegt, so entwickeln ca. 15% der weißen Raucher gegenüber 5% der asiatischen Raucher eine COPD. Weitere Hinweise einer genetischen Prädisposition liefern Familienstudien von Patienten mit early-onset-COPD (Silverman et al. 1998). Patienten mit α1-Antitrypsin-Mangel (homozygoter ZZ-Phänotyp) sind prädisponiert zur Ausbildung eines frühen panlobulären Emphysems, dessen Risiko durch Rauchen noch verstärkt wird (Barnes 2000; Kohnlein und Welte 2008). Durch ein α1-Antitrypsin-Defizit unterliegt das Lungengewebe einem verstärkten proteolytischen Abbau durch die 3 EINLEITUNG neutrophile Elastase. Allerdings weisen weniger als ein Prozent der COPD-Patienten einen α1-Antitrypsin-Mangel auf. Genpolymorphismen eines weiteren Proteaseinhibitors, dem α1-Antichymotrypsin, werden ebenfalls mit der Entstehung von COPD assoziiert (Poller et al. 1992). Andere Untersuchungen belegten, dass Polymorphismen von Genen der Matrixmetalloproteinasen MMP1 und MMP9 an der Abnahme der Lungenfunktion beteiligt sind (Joos et al. 2002). Ebenfalls im Fokus der Untersuchungen sind TIMP-2 (Tissue Inhibitor of Matrixmetalloproteinase 2) Genpolymorphismen, die mit der Pathogenese von COPD in Verbindung gebracht werden (Hirano et al. 2001). Eine Studie belegt, dass das Erkrankungsrisiko für COPD in einer taiwanesischen Population durch einen Polymorphismus in der Promotorregion des TNF-α-Gens, welcher mit einer erhöhten TNF-α Produktion assoziiert ist, zehnfach erhöht ist (Huang et al. 1997). Allerdings konnte diese These durch eine Untersuchung in einem britischen Kollektiv nicht bestätigt werden. Die mikrosomale Epoxidhydrolase ist ein Enzym, das in der Metabolisierung von schädigenden Epoxiden in der Lunge, welche in hohem Maße im Zigarettenrauch enthalten sind, eine wichtige Rolle spielt. Genetische Defekte dieser enzymatischen Detoxifikation könnten Raucher für die Entwicklung von Atemflussobstruktion und Emphysem prädisponieren (Smith und Harrison 1997). 1.1.3.3 Andere Faktoren Neben dem Hauptrisikofaktor Rauchen spielen auch andere inhalative Noxen eine Rolle. Berufliche Exposition gegenüber Stäuben, Dämpfen oder Chemikalien bergen ein unterschätztes Risiko für die Ausbildung einer COPD (Trupin et al. 2003). In Entwicklungsländern überschreitet eine, im Vergleich zu Industriestaaten, erhöhte Innenraumbelastung häufig eine kritische Schwelle, oberhalb derer das Risiko für eine COPD-Erkrankung wächst. Verantwortlich sind vor allem das Kochen und Heizen mit Öl, Holz, Kohle oder anderer Biomasse in schlecht belüfteten Räumen, was insbesondere Frauen als Risikogruppe erklärt (Torres-Duque et al. 2008). Virale und bakterielle Infektionen könnten zur Pathogenese und Progression von COPD sowie zur Emphysembildung beitragen und sind hauptverantwortlich für akute 4 EINLEITUNG Verschlechterungen (Exazerbation) der Erkrankung. (Seemungal et al. 2001; Sethi et al. 2006). Auch eine erhöhte Zahl an kindlichen respiratorischen Infektionen ist mit einer verminderten Lungenfunktion im Erwachsenenalter assoziiert (Barker et al. 1991). 1.1.4 Pathogenese 1.1.4.1 Pulmonale Entzündung Die Inhalation von Tabakrauch oder anderen reizenden Stoffen verursacht eine entzündliche Reaktion des Lungengewebes, eine normale Immunantwort, die allerdings bei COPD Patienten inadäquat verstärkt ausfällt. Charakteristische pathologische Veränderungen bei einer COPD betreffen vor allem die proximalen und peripheren Atemwege sowie das Lungenparenchym. An der chronischen Entzündung sind sowohl Zelltypen des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems beteiligt. Neutrophile Granulozyten, Makrophagen sowie CD8+ Lymphozyten beherrschen die lokale Immunreaktion (Barnes et al. 2003). Makrophagen Makrophagen gelten aufgrund ihrer ausgeprägten Phagozytosefähigkeit als besonders effektive Zellen der angeborenen Immunität. Sie reifen aus zirkulierenden Monozyten heran, welche das Lungengewebe auf chemotaktischen Reiz durch CCL2 (auch MCP-1) infiltrieren. In der bronchoalveolären Lavage bilden Makrophagen die Mehrheit an Entzündungszellen, unabhängig davon, ob es sich bei den Patienten um Nichtraucher, gesunde Raucher oder Raucher mit Atemwegserkrankungen handelt (Kuschner et al. 1996). Zu den Sauerstoffspezies, von Makrophagen chemotaktische sezernierten Mediatoren zählen Faktoren, inflammatorische reaktive Zytokine, Schleimdrüsenaktivatoren und eine Vielzahl an Matrixmetalloproteinasen (MMP). Da letztere durch ihre elastolytische und kollagenolytische Aktivität wesentlich für die Zerstörung der extrazellulären Matrix und Emphysembildung im Rahmen der COPD verantwortlich sind, fokussiert sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf Makrophagen als Quelle von MMPs. Zahlreiche Studien konnten die Vermutung, dass Makrophagen die pulmonale Entzündung durch die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren orchestrieren, rechtfertigen. Beispielsweise konnten Finlay et al. (1997) zeigen, dass 5 EINLEITUNG Alveolarmakrophagen von Emphysematikern größere Mengen an elastinolytischen Matrix-Metalloproteinasen transkribieren und sezernieren als Makrophagen von Kontrollpersonen. Im Tiermodell induzierte sowohl die Gabe von Alveolarmakrophagen, als auch die Überexpression vom MMP1 die Emphysembildung (Snider et al. 1986; Shiomi et al. 2003). Auch an der Rekrutierung von Neutrophilen sind Makrophagen beteiligt: durch Inhalation von Tabakrauch oder anderen Reizstoffen aktiviert, sezernieren sie daraufhin chemotaktische Faktoren wie CXCL1 (auch Gro-α) und CXCL8 (auch IL-8) (Traves et al. 2004). Makrophagen sind darüber hinaus auch an der Entwicklung von akuten Exazerbationen, meist verursacht durch bakterielle Infektionen, beteiligt. Für die Bekämpfung jener Infektionen ist eine intakte Makrophagenfunktion von essentieller Bedeutung. Neutrophile In vivo Studien, die Neutrophile mit der Pathogenese von COPD in Verbindung bringen, sind zahlreich. Untersuchungen von induziertem Sputum und Bronchiallavage demonstrieren konsistent erhöhte Mengen von Neutrophilen und Enzymen neutrophilen Ursprungs, sowohl bei stabiler COPD, als auch während akuter Exazerbationen (Thompson et al. 1989; Peleman et al. 1999). Neutrophile Granulozyten sind durch charakteristisch segmentierte Zellkerne und intrazelluläre Granula gekennzeichnet. Sie sind Teil der angeborenen Immunabwehr und Quelle reaktiver Sauerstoffspezies, inflammatorischer Zytokine sowie Enzyme, wie der neutrophilen Elastase oder Myeloperoxidase (Hiemstra et al. 1998). Polymorphnukleäre Neutrophile zirkulieren in hoher Zahl im Blut und besitzen die Fähigkeit zur gezielten Wanderung an den Ort der Infektion (Chemotaxis). Sie verlassen in einem mehrstufigen, durch Chemokine und Adhäsionsmoleküle vermittelten Prozess, der Diapedese, den Blutstrom und treten in das entzündete Gewebe ein. Eine erhöhte Zahl an Neutrophile korreliert direkt mit einer erhöhten Produktion der CXC-Chemokine CXCL1 und CXCL8, welche an den auf Neutrophilen exprimierten Rezeptor CXR2 binden (Barnes 2008b). Nach Aktivierung sezernieren Neutrophile die Serinproteasen Elastase und Proteinase 3. Diese Serinproteasen induzieren den Abbau extrazellulärer Matrix des Lungengewebes, und reduzieren die ziliäre Schlagfrequenz und vermindern somit die mukoziliäre Clearance. (Hiemstra et al. 1998). Die ausgeschütteten Mediatoren induzieren eine 6 EINLEITUNG Mukus-Hypersekretion sowohl über einen akut sekretagogen Effekt, als auch über eine Steigerung der bronchialen Schleimproduktion (O'Donnell et al. 2006). Die neutrophile Elastase wird eng mit der Emphysembildung assoziiert. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass die Gabe von gereinigter neutrophiler Elastase ein Emphysem verursacht, während hingegen eine Defizienz der endogenen Serinprotease einen Schutz vor Emphysembildung infolge Zigarettenrauchexposition bietet (Snider et al. 1986; Shapiro et al. 2003). Auch in Studien von COPD Patienten konnte man die neutrophile Elastase in emphysematösem Lungengewebe sowie eine Korrelation zwischen Schwere des Emphysems und Elastasespiegeln neutrophiler Granulozyten nachweisen (O'Donnell et al. 2006). Abbildung 1 Pathogenese der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (aus (Barnes 2008b) Die Inhalation von Zigarettenrauch und anderen Noxen aktiviert Epithelzellen und Makrophagen zur Freisetzung von chemotaktischen Faktoren, die Entzündungszellen, wie Neutrophile, Monozyten und T-Lymphozyten in das Lungengewebe locken. Diese Entzündungszellen sezernieren Proteasen, die den Elastinabbau, Schleim-Hypersekretion und die Emphysembildung fördern. Transforming Growth Factor β (TGF-β) stimuliert die Proliferation von Fibroblasten, was zur Fibroisierung der kleinen Atemwege führt. 7 EINLEITUNG T-Lymphozyten In den Atemwegen und im Lungenparenchym von COPD Patienten imponieren erhöhte CD3+ T-Zellzahlen, wohingegen CD8+ T-Zellen gegenüber CD4+ T-Zellen dominieren (Saetta et al. 1998). Allerdings ist deren Rolle in der Pathogenese von COPD noch nicht vollständig geklärt. Die Lymphozytenpopulation ist zu einem T-Helfer 1 (Th1) / zytotoxischen T-Zellen (Tc1) Phänotyp polarisiert (Grumelli et al. 2004). Die Tc1 Zellen sezernieren IFN-γ und exprimieren CXCR3, was impliziert, dass sie durch CXCR3-bindende Chemokine CXCL9 (auch MIG genannt), CXCL10 (auch IP-10) und CXCL11 (auch I-TAC) in das Lungengewebe rekrutiert werden, die ihrerseits in hohen Mengen in Atemwegen von COPD Patienten präsent sind (Saetta et al. 2002; Costa et al. 2008). Diese CXCR3 Liganden unterdrücken die Signalweiterleitung über CCR3, dem Rezeptor von CCL11 (Eotaxin), dies stellt eine mögliche Erklärung für eine supprimierte eosinophile Entzündung bei COPD dar (Xanthou et al. 2003). Im Sputum von COPD Patienten ist im Vergleich zu Gesunden die Produktion von CCL5 (RANTES) erhöht. CCL5 ist ebenfalls in der Lage T-Zellen über CCR5 in das Lungengewebe anzulocken und könnte somit ebenfalls an der T-Zell-Rekrutierung beteiligt sein (Costa et al. 2008). CD8+ Zellen können das Lungeninterstitium durch die Freisetzung von lytischen Substanzen, wie Granzym B oder Perforin, potenziell direkt schädigen. Eine Studie konnte nachweisen, dass CD8+ Zellen, die aus dem Sputum von COPD Patienten gewonnen wurden, höhere Perforin-Expressionsraten und eine erhöhte zytotoxische Aktivität im Vergleich zu Kontrollbedingungen aufwiesen (Chrysofakis et al. 2004). Auch eine Erhöhung der Apoptoseraten von Pneumozyten vom Typ 1 korreliert mit erhöhten CD8+ Zellzahlen in den Alveolarwänden, was möglicherweise zur Emphysembildung beiträgt (Majo et al. 2001). Die Tc1- und Th1-vermittelte Entzündung ist vermutlich selbst perpetuierend, da IFN-γ die Freisetzung von CXCR3 Liganden stimuliert, welche wiederum weitere Tc1- und Th1-Zellen in das Entzündungsgeschehen der Lunge anlocken (Saetta et al. 2002). Eine relativ neu beschriebene Untergruppe von CD4+ T-Zellen sind die T-Helfer 17 Zellen (Th17), die bislang mit der Progression von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen, wie Rheumatoider Arthritis oder Multipler Sklerose assoziiert wurden, aber auch ein Rolle bei der Pathogenese von COPD spielen (Harrison et al. 2008). Th17-Zellen sezernieren IL-17 und IL-17F, welche die Freisetzung von CXCL1 und CXCL8 aus Atemwegsepithelzellen induzieren. Sie nehmen somit ebenfalls Anteil an 8 EINLEITUNG der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten und fördern die neutrophile Entzündung. Die Th17-Zell-Differenzierung unterliegt einem autoregulatorischem Mechanismus via IL-21 unter Beteiligung von IL-23 (Bettelli et al. 2007) 1.1.4.2 Proteasen-Antiproteasen-Dysbalance Parallel zu den Vorgängen in den kleinen Bronchiolen spielt das Emphysem eine wichtige pathogenetische Rolle bei der Atemwegsobstruktion. Die Protease/Antiprotease-Hypothese erklärt die Ursache der Emphysementstehung in einem Übergewicht proteolytischer Aktivität gegenüber antiproteolytischen Schutzmechanismen. Aus Entzündungszellen sezernierte Proteasen werden nicht vollständig von entsprechend protektiven Antiproteasen antagonisiert, was in einer erhöhten Proteolyse von Lungenbindegewebe (v.a. Elastinabbau) und Emphysembildung mündet. Diese These wird durch die Entdeckung des Zusammenhangs von α1-Antitrypsin-Mangel und Emphysembildung gestützt. α1-Antitrypsin agiert als Inhibitor der neutrophilen Elastase, ein potent elastolytisches Enzym, dessen intratracheale Gabe im Tierversuch Emphysem induziert (Janoff et al. 1977). Genetisch bedingter α1-Antitrypsin-Mangel ist nur bei einem geringen Prozentsatz der COPD Erkrankten nachgewiesen. Man geht davon aus, dass auch Rauchen zu einer funktionellen Defizienz von α1-Antitrypsin mittels Oxidation durch der im Zigarettenrauch enthaltenen Oxidantien führen kann (Gadek et al. 1979). Auch die Aktivität des sekretorischen Leukozytenprotease-Inhibitors (SLPI), einer potenten Antiprotease der neutrophilen Elastase, scheint vermindert zu sein. Neuere Untersuchungen fokussieren sich auf die Bedeutung von Makrophagen und den von ihnen ausgeschütteten Proteasen in der Emphysementstehung. Makrophagen sekretieren verschiedene Kathepsine, wie auch die elastinolytischen Matrixmetalloproteasen MMP2, MMP9 und MMP12. Die matrixabbauende Aktivität von MMP wird durch endogene Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrixmetalloproteinase (TIMP) antagonisiert. Ein Mangel an TIMP3 bewirkt ein progredientes destruktives Emphysem, was die Bedeutung der MMP für die Entwicklung einer COPD unterstreicht (Shapiro und Ingenito 2005). In emphysematösem Lungengewebe von COPD Patienten wurden erhöhte MMP2- und MMP9-Spiegel nachgewiesen (Ohnishi et al. 1998), im 9 EINLEITUNG Tierversuch ist MMP12 für die Entstehung von Zigarettenrauch-induziertem Emphysem erforderlich (Hautamaki et al. 1997). 1.1.4.3 Oxidativer Stress Neben der chronischen Entzündung und dem Protease/Antiprotease-Ungleichgewicht wird auch dem oxidativen Stress eine wichtige pathogenetische Rolle bei COPD zugeschrieben. Man geht ähnlich der Protease/Antiprotease-Dysbalance von einem verschobenen Oxidantien/Antioxidantien-Gleichgewicht aus. Beide sind jedoch eng miteinander verknüpft, da einerseits oxidativer Stress Antiproteasen inaktiviert und andererseits proinflammatorische Abbauprodukte der Proteasen neue Oxidantien generieren (Hogg und Senior 2002). Die Quellen freier Radikale und Oxidantien sind sowohl exogener, v.a. Tabakrauch und Luftverschmutzung, als auch endogener Art. Entzündungszellen, wie Neutrophile, Makrophagen oder Epithelzellen werden durch inflammatorische Zytokine aktiviert und produzieren sowie sezernieren reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS). Dies sind vor allem Superoxidanion (O2-•) und Wasserstoffperoxid (H2O2), welche durch freies Eisen katalysiert, das schädigende hochreaktive Hydroxylradikal (•OH) bilden können. Zigarettenrauch ist eine komplexe Mixtur aus über 4700 chemischen Substanzen darunter auch hohe Konzentrationen an Oxidantien und freien Radikalen (>1015 Partikel/Zug) (Pauwels et al. 2001). Neben dem Superoxidanion findet sich vor allem Stickstoffmonoxid (NO) in der Gasphase, welche sehr schnell zu hochreaktiven Peroxynitrit reagieren. Die freien Radikale in der Teerphase sind eher organischer Natur, wie langlebige Semiquinon-Radikale, die wiederum mit Superoxidanion zur Bildung von Hydroxylradikal und H2O2 reagieren können. Reaktive Sauerstoffspezies gelten als hochreaktiv und oxidieren Phospholipide von Zellmembranen kettenreaktionsartig durch Lipidperoxidation. Die Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren beeinträchtigt Membranfunktionen, inaktiviert membrangebundene Rezeptoren und Enzyme und erhöht die Gefäßpermeabilität, Prozesse, die mit der Pathogenese zahlreicher Formen von Lungenschädigungen assoziiert werden (MacNee 2001). Oxidativer Stress aktiviert den pro-inflammatorischen Transkriptionsfaktor Nukleärer Faktor κ B (NF-κB), der multiple inflammatorische Gene 10 EINLEITUNG reguliert, darunter CXCL1, CXCL8, MMP9 und Transforming Growth Factor β (TGF-β). Diese tragen zusammen zur neutrophilen Entzündung, Emphysembildung und Fibrose der kleinen Atemwege bei (Barnes 2008a). Darüber hinaus reduziert oxidativer Stress die Aktivität der Histondeacetylase 2 (HDAC2), was einerseits zu einer verstärkten Expression inflammatorischer Gene und andererseits zu einer Reduktion der anti-inflammatorischen Potenz von Glucocorticoiden bei COPD führt (Barnes 2006). Hinweise auf erhöhten oxidativen Stress in den Lungen von COPD Erkrankten sind zahlreich. Im exhalierten Atemkondensat, Sputum und im Blutkreislauf finden sich erhöhte Konzentrationen von Wasserstoffperoxid und den Lipidperoxidationsprodukten 8-Isoprostan und Ethan (Dekhuijzen et al. 1996; Montuschi et al. 2000; Paredi et al. 2000). Neutrophile und Makrophagen der bronchoalveolären Lavage von Rauchern und COPD Patienten mit Exazerbationen weisen gesteigerte Level an Superoxidanion und Wasserstoffperoxid auf (Rahman et al. 1996; Morrison et al. 1999). Darüber hinaus ist Zigarettenrauchen mit erhöhten Myeloperoxidase-Spiegeln in Neutrophilen assoziiert, welche die Umsetzung von H2O2 zu Superoxidanion und Hypochlorsäure katalysiert. Dies korreliert wiederum mit dem Maß an pulmonaler Dysfunktion und deutet auf eine Beteiligung des Myeloperoxidase-vermittelten oxidativen Stresses an der Pathogenese von COPD hin. 1.1.4.4 Gesteigerte Apoptoseraten pulmonaler Strukturzellen Eine fehlgesteuerte Regulation der Apoptose, die ein gestörtes Gleichgewicht zwischen Elimination und Proliferation alveolärer Epithel- und Endothelzellen verursacht und letztlich zu Lungenschädigungen und Emphysem führt, kann neben den bereits beschriebenen drei Mechanismen in der Pathogenese von COPD von Bedeutung sein. Bei der Apoptose, die auch als programmierter Zelltod bezeichnet wird, aktiviert die Zelle ein internes Zerstörungsprogramm, das innerhalb weniger Stunden zur umfassenden Elimination führen kann. Der programmierte Zelltod ist kritisch für die Erhaltung der normalen Gewebehomöostase und steht im Gleichgewicht mit Proliferation und Differenzierung. Die für die Apoptose verantwortliche intrazelluläre Maschinerie ist abhängig von Adenosintriphosphat (ATP) und beruht auf Caspasen, einer Familie von Proteasen. Initiatorcaspasen können über zwei unterschiedliche Wege aktiviert werden: über den extrinsischen und über den intrinsischen apoptotischen 11 EINLEITUNG Signalweg. Caspase-8 ist die entscheidende Initiatorcaspase des extrinsischen Signalwegs, der durch Stimulation von Todesrezeptoren ausgelöst wird. Die Todesrezeptoren bilden eine Untergruppe der Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor Superfamilie, diese umfasst beispielsweise den TNF-Rezeptor 1, Fas (CD95) und Rezeptoren, die den TNF-ähnlichen Apoptose induzierenden Liganden (TRAIL) binden. Der intrinsische oder mitochondriale apoptotische Signalweg reagiert als Antwort auf eine übermäßige physikalische oder chemische Belastung mit der Freisetzung des Elektronentransportproteins Cytochrom C aus den Mitochondrien. Dies induziert die Bildung eines oligomeren Komplexes aus Cytochrom C und Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor 1). Dieser Komplex, der als Apoptosom bezeichnet wird, unterstützt die katalytische Aktivierung der Initiatorcaspase-9, die dadurch in die Lage versetzt wird, Effektorcaspasen zu spalten und Apoptose auszulösen (Demedts et al. 2006). Zusätzlich zu diesen Caspase-abhängigen Signalwegen konnte gezeigt werden, dass Proteasen wie Granzym B Caspasen direkt prozessieren und aktivieren können (Darmon et al. 1995). Zahlreiche Studien belegen erhöhte Zahlen von apoptotischen alveolären Epithel- und Endothelzellen in emphysematösem Lungengewebe von COPD Patienten (SeguraValdez et al. 2000; Kasahara et al. 2001; Yokohori et al. 2004), was auf eine erhöhte Apoptoserate und/oder eine verminderte Phagozytose der apoptotischen Körperchen schließen lässt (Walsh, 2008). Darüber hinaus bietet das entzündete Lungengewebe bei COPD den Neutrophilen, als vorherrschenden Effektorzellen, eine Umgebung, die die Apoptose verzögert und somit das pro-inflammatorische Potential verstärkt. Zu diesen Bedingungen tragen neben Hypoxie und bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) erhöhte Konzentrationen an pro-inflammatorischen Mediatoren, wie GM-CSF (GranulozytenMakrophagen-koloniestimulierender Faktor) und Leukotrien B4, bei. 1.1.5 Pharmakotherapie von COPD Die derzeitige therapeutische Behandlung von COPD beschränkt sich bisher lediglich auf eine Minderung der Symptome, da bis heute keine pharmakologische Therapie existiert, mit der sich die Progression von COPD aufhalten lässt (Barnes 2005). Die einzig effektive Methode liegt in der Vermeidung von Risikofaktoren, wie dem Tabakrauchen. Diese präventive Maßnahme kann das Fortschreiten der Erkrankung 12 EINLEITUNG verhindern und zu einer symptomatischen Besserung führen. Zur medikamentösen Nikotinentwöhnung eignen sich alle galenischen Formen der Nikotinersatztherapie (Kaugummis, Pflaster, Sublingualtabletten). Auch eine Reihe von anderen Arzneistoffen anderer Stoffgruppen erhöhen die Erfolgsquote, beispielsweise das Antidepressivum Bupropion und der partielle α4β2-Nikotinrezeptor-Agonist Vareniclin. Als medikamentöse Standardtherapie werden Bronchodilatoren wie β2-Sympathomimetika, Anticholinergika und Theophyllin eingesetzt, welche zu einer Reduktion der Atemnot am Tage und in der Nacht, zu einer Besserung der Lungenfunktion, einer Steigerung der Lebensqualität und einer Reduktion von Exazerbationen führen (Man et al. 2003). Kurzwirksame β2-Sympathomimetika, wie Salbutamol oder Fenoterol zeichnen sich durch einen schnellen Wirkungseintritt aus und eignen sich daher als inhalatives Bedarfstherapeutikum bei akuter Atemnot. Die langwirksamen β2-Agonisten werden im Gegensatz dazu aufgrund ihrer langanhaltenden Wirkdauer zweimal täglich als Dauertherapie eingesetzt. Sie bewähren sich durch ihre Effektivität vor allem bei stabiler COPD und verbessern nächtliche Symptome sowie körperliche Belastbarkeit (Grove et al. 1996). Anticholinergika (z.B. Ipratropiumbromid, Tiotropiumbromid) wirken durch Vagusblockade bronchodilatativ, vermindern die Schleimsekretion und verringern das Dyspnoe-Empfinden. Darüberhinaus bessern sie die körperliche Leistungsfähigkeit und reduzieren Exazerbationen bei Patienten mit COPD (Disse et al. 1999). Das Methylxanthin Theophyllin weist eine schwächere bronchiendilatierende Wirkung auf und gilt daher, auch aufgrund seiner engen therapeutischen Breite, als Mittel der zweiten oder dritten Wahl. Interessanterweise konnte eine Studie kürzlich belegen, dass geringe Dosen von Theophyllin die Aktivität der HDAC2 steigern können. Theophyllin könnte somit die Steroidresistenz von COPD neutralisieren und in Kombination mit Glucocorticoiden deren suppressive, anti-inflammatorische Effekte potenzieren (Cosio et al. 2004). Trotz des erfolgreichen Einsatzes der inhalativen Glucocorticoide in der Therapie von Asthma ist die Rolle von Glucocorticoiden im Management von stabiler COPD auf spezifische Indikationen beschränkt. Glucocorticoide sind nicht in der Lage, den Abfall des FEV1 im Langzeitverlauf zu modifizieren (Vestbo et al. 1999). Die Erklärung liegt vermutlich darin, dass Glucocorticoide ihre Wirkung unter anderem durch Rekrutierung der Histondeacetylase-2 (HDAC2) zu aktivierten Transkriptionskomplexen vermitteln, wodurch aktivierte pro-inflammatorische Gene ausgeschaltet werden. Der durch das 13 EINLEITUNG Rauchen bedingte oxidative und nitrative Stress beeinträchtigt durch die Bildung von Peroxynitrit die HDAC2 nachhaltig in ihrer Funktion und verhindert somit den suppressiven Effekt der Glucocorticoide (Barnes 2006). Inhalativ applizierte Corticosteroide werden bei schweren und sehr schweren Formen von COPD (% FEV1 < 50%) angewendet, da sie in der Lage sind, Häufigkeit und Stärke von akuten Exazerbationen zu reduzieren und damit die Lebensqualität zu verbessern (Larj und Bleecker 2004). Darüber hinaus kommen bei akuten Verschlechterungen kurzfristig auch systemische Steroide und Antibiotika zum Einsatz. In Anbetracht der fehlenden Möglichkeit einer effektiven pharmakologischen Therapie für COPD, sind die Suche nach neuen Zielstrukturen und die Entwicklung neuer anti-inflammatorisch wirkender Substanzen von dringlicher Bedeutung. Trotz zunehmenden Verständnisses von pathophysiologischen Mechanismen von COPD wurde bisher nur ein geringer Teil an neuen Erkenntnissen in die Entwicklung effektiver Pharmakotherapie umgesetzt. Neue prospektive Therapieansätze bietet die Entwicklung von Mediator-Antagonisten und von neuen anti-inflammatorischen Behandlungsstrategien. Angriffspunkte für neue Therapien finden sich auf molekularer Ebene der Entzündungsmediatoren, die durch Inhibition oder Rezeptorantagonismus in ihrer Entzündungsvermittlung gehemmt werden. Die Inhibition des potent pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α mittels rekombinanter Antikörper, wie Infliximab oder Adalimumab zeigte, im Gegensatz zum erfolgreichen Einsatz bei rheumatoider Arthritis oder Asthma bronchiale, keinen therapeutischen Benefit bei COPD (Rennard et al. 2007). Die therapeutische Blockade der Zytokine IL-1β, IL-6 und IL-17 sowie CXCR1/2-, CXCR3-, und CCR5-Chemokin-Rezeptor-Antagonisten befinden sich derzeit noch in prä-klinischer Erprobung. Eine im Tierversuch wie auch bei Probanden bereits erfolgreich getestete Substanzklasse bilden die Phosphodiesterase-Inhibitoren, insbesondere der Phosphodiesterase 4 (PDE4) Inhibitor Roflumilast. Durch Hemmung der PDE4 verursacht dieser eine Anreicherung an zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP), wodurch die Synthese von Entzündungsmediatoren und chemotaktischen Substanzen reduziert wird (Barnes 2005). Aufgrund des ungünstigen Nebenwirkungspotentials durch unselektive PDE Blockade ist allerdings eine weitergehende Substratspezifizieung unerlässlich. 14 EINLEITUNG NF-κB als Transkriptionsfaktor inflammatorischer Gene stellt ein weiteres potentielles Target für die antientzündliche Therapie dar. Niedermolekulare Inhibitoren von IKK2 (inhibitor of NF-κB kinase (IKK) 2) wurden bereits in Tiermodellen von COPD untersucht, allerdings mit kontroverser Ergebnislage (Birrell et al. 2006). Mitogenaktivierte Proteinkinasen (MAPK) gehören zu einer Enzymfamilie, die an der Regulation einer Vielzahl physiologischer Prozesse beteiligt und während chronischer Entzündung von erheblicher Bedeutung sind ist. In alveolären Makrophagen von COPD Patienten liegt p38 MAPK in aktivierter Form vor, so dass auf eine Bedeutung dieses Signalweges bei COPD geschlossen werden kann (Renda et al. 2008). Verschiedene kleinmolekulare nicht-peptidische Inhibitoren der p38 MAPK, wie SB203580, SB239063 und RWJ67657 wurden in den letzten Jahren entwickelt und werden in klinische Studien untersucht. Die Antagonisierung von Proteasen verfolgt das Ziel, die proteolytische Schädigung des Lungengewebes zu stoppen. Dies geschieht einerseits durch den Ersatz endogener Antiproteasen wie α1-Antitrypsin oder SLPI. Ein anderer Ansatz liegt in der Entwicklung von Inhibitoren aktiver Proteasen, vor allem der neutrophilen Elastase und Matrixmetalloproteinase. Allerdings zeigen klinische Studien bislang nicht den gewünschten Effekt. Da der Entzündungsprozess der COPD gegenüber dem anti-inflammtorischen Potenzial der Glucocorticoide weitgehend resistent ist, fokussieren sich therapeutische Strategien nunmehr auf die Umkehr dieser Resistenz. Hierfür eignet sich beispielsweise Theophyllin, welches in der Lage ist, in niedrigen Dosen die Aktivität der HDAC2 zu erhöhen. Auch der Einsatz von Antioxidantien als Induktoren der HDAC2 ist denkbar. Als logische Folgerung wird auch die Entwicklung von neuen HDAC2 Aktivatoren angestrebt. 1.2 Signaltransduktionskaskade der MAP Kinasen Mitogen-aktivierte Proteinkinasen sind eine Gruppe von Serin/Threonin spezifischen Proteinkinasen und regulieren diverse Prozesse, welche von Proliferation und Differenzierung bis zu Apoptose reichen. Aktiviert durch eine Reihe von Stimuli, werden durch MAP Kinasen zahlreiche Proteine phosphoryliert, darunter befinden sich 15 EINLEITUNG unter anderem Transkriptionsfaktoren, wie NF-κB oder Aktivator Protein 1 (AP-1), zytoskeletale Proteine, Kinasen und andere Enzyme. Eine MAPK-Kaskade besteht aus drei sequentiell agierenden Proteinkinasen, die jeweils nach Aktivierung über membranständige Rezeptoren durch Phosphorylierung an spezifischen Aminosäureresten aktiviert werden. Im Falle der beiden erstaktivierten Enzyme, der MAP Kinase Kinase Kinase (MAPKKK) und MAP Kinase Kinase (MAPKK), sind dies durch eine einzelne Aminosäuren getrennte Serin- und Threoninreste, bei der MAP Kinase (MAPK) dagegen ein Threonin- und ein Tyrosinrest, die dual phosphoryliert werden. Die regulatorische Inaktivierung der MAP Kinasen erfolgt mittels Dephosphorylierung durch MAP Kinase-Phosphatasen (MKP), die zur Familie der Dual-Specifity-Protein-Phosphatasen (DUSP) gehören. Abbildung 2 MAPK-Signaltransduktionskaskaden aus (Liu et al. 2007) Extrazelluläre Stimuli aktivieren GTPase-vermittelt (RAS, RAC, CDC42) die MAPK Signalwege. Die Aktivierung verläuft jeweils über eine dreistufige Phosphorylierungskaskade (MAPKKK, MAPKK, MAPK). Die aktivierten MAPKs (ERK, JNK, p38) translozieren in den Nukleus und phosphorylieren dort eine Reihe von Transkriptionsfaktoren. Der ERK Signalweg wird vor allem durch Wachstumsfaktoren, JNK und p38 Kaskaden eher durch Stress und inflammatorische Zytokine aktiviert. 16 EINLEITUNG Bis heute sind drei MAP Kinasen ausführlicher charakterisiert worden, die jeweils in einer gut definierbaren Signalkette involviert sind. Zu diesen gehören die Extracellular Signal-Regulated Kinases 1 und 2 (ERK1/2 auch p44/42MAPK genannt), die c Jun-N-terminale Kinase (JNK) und p38 mitogen-aktivierte Proteinkinase (Cobb und Goldsmith 1995). Während die ERK Signalkaskade vorwiegend mit der Regulation der Zellproliferation assoziiert ist und vor allem durch Wachstumsfaktoren aktiviert wird, gelten p38 MAPK und JNK als so genannte Stresskinasen. Sie werden durch eine Reihe von extrinsischen und intrinsischen Stress-Stimuli aktiviert, dazu zählen oxidativer Stress, UV-Strahlung, Hitze sowie pro-inflammatorische Zytokine, wie TNF-α und IL-1β (Liu et al. 2007). Die MAP Kinase p38 wird eng mit chronischer Entzündung assoziiert und ist im Bezug auf Entzündungsantworten eine der meist untersuchten Kinasen. Auch eine Beteiligung in der Pathogenese von COPD liegt nahe. Zahlreiche in vivo Untersuchungen belegen eine Rolle von p38 MAPK in der LPS-induzierten Lungenschädigung: Neutrophilie, Zytokin- und Chemokinproduktion sowie Bronchokonstriktion scheinen durch p38 vermittelt zu sein (Kim et al. 2006; Liu et al. 2008; Medicherla et al. 2008). Kürzlich wurde nachgewiesen, dass COPD Patienten in Alveolarmakrophagen sowie Endothelzellen erhöhte Mengen von aktivierter p38 MAPK aufweisen (Renda et al. 2008). Im Asthma-Modell der IL-13-induzierten pulmonalen Inflammation ist die ERK1/2 Signalkaskade nachgewiesenermaßen von entscheidender Bedeutung (Lee et al. 2006). Die Rolle von ERK bei COPD scheint hingegen nicht vollständig geklärt. Es konnte bereits in in vitro Studien gezeigt werden, dass durch Blockade von MEK1/2, der vorgelagerten Kinase von ERK1/2, die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen aus LPS-stimulierten pulmonalen Makrophagen und Monozyten inhibiert werden kann. Interessanterweise konnte durch Inhibition von p38 ebenfalls die Zytokinfreigabe aus Monozyten, nicht dagegen aus Makrophagen, reduziert werden (Tudhope et al. 2008). Diese Beobachtungen implizieren nicht nur eine Beteiligung von p38 MAPK, sondern auch eine beachtliche Rolle des ERK1/2 Signalweges an Makrophagen-vermittelten Entzündungen, wie im Falle der COPD vorliegend. 17 EINLEITUNG 1.3 Auflösung der Inflammation Die umfassende Auflösung einer akuten Entzündung (im Englischen: Resolution of Inflammation) und die Rückkehr zur Homöostase ist für gesundes und intaktes Gewebe von essentieller Bedeutung. Dieser Prozess kann auf zellulärer Ebene durch das Verschwinden von polymorphnukleärer Leukozyten und auf makroskopischen Level durch die Rekonstruktion der Gewebearchitektur und Wiederherstellung der Gewebefunktion definiert werden (Willoughby et al. 2000). Die von Celsus und Galenus postulierten fünf Kardinalzeichen calor (Überwärmung), rubor (Rötung), dolor (Schmerz), tumor (Schwellung) und functio laesa (gestörte Funktion) beschreiben die Abweichungen von gesunder Gewebehomöostase während einer akuten Entzündung. Bei einer typischen akuten Inflammation handelt es sich um eine bemerkenswert konservierte zeitliche Abfolge von Ereignissen. Nach einem initialen Anstieg der Plasmaexsudation akkumulieren polymorphnukleäre Leukozyten als erste Front von Entzündungszellen im entzündeten oder infizierten Gewebe. Diese zirkulierenden neutrophilen oder eosinophilen Granulozyten migrieren auf chemotaktischen Reiz via transzellulärer Diapedese durch das Endothelium in das verletzte Gewebe. Jene aktivierten Leukozyten neutralisieren und eliminieren potenziell schädliche Stimuli mittels Phagozytose. Die Entfernung des auslösenden Stimulus beendet die weitere Synthese pro-inflammatorischer Mediatoren, wie Eicosanoiden, Chemokinen und Zytokinen. Weiterhin werden Faktoren freigesetzt, die die fortschreitende Leukozyteninfiltration und Ödembildung unterbinden. Da neutrophile und eosinophile Granulozyten das ohnehin bereits entzündete Gewebe zusätzlich schädigen können, werden sie kontrolliert und effektiv entsorgt. Eine Möglichkeit wäre die systemische Rezirkulation, allerdings stellt die Apoptose der Leukozyten den weitaus wichtigeren Eliminationsweg dar. Zellen, die ihre Funktion als Phagozyten beendet haben, werden dem programmierten Zelltod unterzogen. Die Apoptose der polymorphnukleären Leukozyten führt zu erniedrigten Level von pro-inflammatorischen Zytokinen am Entzündungsort. Der initialen Akkumulation von Neutrophilen schließt sich eine verzögerte Infiltration von Monozyten an. Diese differenzieren zu Makrophagen und entfernen die verbleibenden apoptotischen polymorphnukleären Leukozyten mittels nicht-phlogistischer pro-inflammatorischen Phagozytose, Mediatoren d.h. sowie ohne weitere Stimulation der Formation von Bildung von anti-inflammatorischen Substanzen, wie z.B. Transforming Growth Factor (TGF)-β, 18 EINLEITUNG Lipoxin A4 und IL-10 (Lucas et al. 2003; Freire-de-Lima et al. 2006). Die Makrophagen verlassen nach der Elimination apoptotischer Leukozyten das Gewebe entweder durch Apoptose oder über das lymphatische System. Eine wesentliche Erkenntnis der Forschung auf dem Gebiet der Entzündung der letzten Jahre ist, dass sowohl Evolution als auch die Resolution aktive Vorgänge der inflammatorischen Antwort sind. Bei der Auflösung einer Inflammation werden spezifische molekulare Ereignisse aktiviert, die zur Entfernung inflammatorischer Zellen und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beitragen. Bestimmte Lipidmediatoren werden zu definierten Zeitpunkten der entzündlichen Immunantwort generiert und hemmen sowohl die Infiltration von Granulozyten, als auch aktivieren und beschleunigen die Auflösung der Entzündung. Diese Lipidmediatoren leiten sich von den mehrfach ungesättigten Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids, PUFA) Arachidonsäure (AA) und den ω-3 PUFA Eicosapentaensäure (EPA) sowie Docosahexaensäure (DHA) ab. Diese so genannten Lipoxine und Resolvine agieren als endogene Rezeptoragonisten und besitzen anti-inflammatorische sowie auflösungsfördernde Eigenschaften. Lipoxine stellen eine Gruppe von Lipidmediatoren dar, die sich aus der Arachidonsäure ableiten. Lipoxin A4 (LXA4) und Lipoxin B4 (LXB4) agieren als potente „Stopp-Signale“ für die PMN-Infiltration in das entzündete Gewebe. Darüber hinaus stimulieren Lipoxine die Rückkehr der vaskulären Permeabilität zur Homöostase und wurden kürzlich als potente anti-ödematogene Mediatoren entdeckt (Menezes-de-Lima et al. 2006). Lipoxine tragen zur Auflösung der Entzündung bei, indem sie sowohl die nicht-phlogistische Rekrutierung von mononukleären Zellen als auch die Aufnahme von apoptotischen PMN durch Makrophagen stimulieren (Maderna et al. 2005). Zell-Zell-Kontakte gelten als Initiatoren der Lipoxin-Biosynthese. Resolvine sind oxidierte Metaboliten der ω-3 Fettsäuren Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure und werden über enzymatische Stoffwechselwege generiert. Die Terminologie Resolvin oder resolution-phase interaction products geht auf Prof. Charles N. Serhan und Kollegen zurück, die jene Substanzen in entzündlichen Exsudaten entdeckten. Die Gruppe der 18R Resolvine der E Serie beinhaltet das stereospezifische Resolvin E1, welches aus EPA biosynthetisiert wird. In vaskulären Endothelzellen, die durch Acetylsalicylsäure acetylierte COX-2 Enzyme enthalten wird EPA umgesetzt und daraufhin in Neutrophilen unter Beteiligung der 5-Lipoxygenase zu Resolvin E1 oxidiert 19 EINLEITUNG (Bannenberg et al. 2007). Resolvin D1 und D2 gehören zu den 17S Resolvinen der D Serie und werden analog zu Resolvin E aus Docosahexaensäure, allerdings auch in Abwesenheit von Acetylsalicylsäure, biosynthetisiert. Die stereospezifischen Resolvine weisen deutliche anti-inflammatorische und immunregulatorische Eigenschaften im pico- bis nanomolaren Bereich auf. Die Lipidmediatoren sind wie die Lipoxine aktiv an der Auflösung einer Entzündung beteiligt und agieren als potente Regulatoren der PMNTransmigration. Arzneistoffe wie COX-Inhibitoren besitzen zwar potente anti-inflammatorische Eigenschaften, sie verzögern allerdings die Entzündungsauflösung und gelten daher als resolution-toxic (Serhan 2007). Glucocorticoide hingegen sind sowohl effektiv anti-inflammatorisch und fördern überdies die Entzündungsauflösung durch Induktion der PMN-Apoptose und Phagozytoseaktivität von Makrophagen (Gilroy et al. 2004). CDK-Inhibitoren wie R-Roscovitine (Seliciclib) bieten einen neuen anti-entzündlichen Therapieansatz. Sie induzieren die Apoptose von Neutrophilen und beschleunigen so die Resolution (Hallett et al. 2008). 1.4 Tiermodelle der COPD Um die Pathogenese von Erkrankungen weitergehend zu erforschen, sind Tierversuche bzw. Tiermodelle oftmals unerlässlich. Sie ermöglichen es, Abläufe und Mechanismen im Krankheitsgeschehen nachzuvollziehen und aufgestellte Hypothesen zu überprüfen. Tiermodelle der COPD sind in vielerlei Hinsicht nicht unproblematisch, zum einen weil es sich bei COPD nicht um eine einzige, scharf definierte Erkrankung handelt und zum anderen weil sie deutlich symptomorientiert definiert wird. Bei COPD eröffnen Tiermodelle die Möglichkeit molekulare und zelluläre Mechanismen der Pathogenese, insbesondere die abnormale Immunantwort in den Atemwegen und der Lunge auf schädliche Partikel und Gase besser zu verstehen. Um Mechanismen des angeborenen und des adaptiven Immunsystems zu untersuchen favorisiert man als Versuchstiere Mäuse, da sie einzigartige Möglichkeiten der genetischen Manipulation bieten und überdies schon langjährige Erfahrungen mit der Maus als Versuchstier bestehen. Darüber hinaus unterstützen Tiermodelle die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Therapiemöglichkeiten, indem prospektive Strategien auf ihre Wirksamkeit überprüft 20 EINLEITUNG werden können und somit eine Art Rahmenbedingung für rationales und sicheres Design von klinischen Studien schaffen. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die zum Ziel haben in Mausmodellen charakteristische Krankheitsbedingungen von COPD nachzuahmen. Einerseits nutzte man die Instillation von Gewebe degradierenden Enzymen, um emphysemähnliche Läsionen des Lungengewebes hervorzurufen (Snider 1986). Daneben wurden Techniken der genetischen Modifizierung angewandt, um einen mit COPD vergleichbaren Phänotyp in der Maus zu erzeugen (Shapiro 2000). Eine weitere Alternative an Tiermodellen der COPD bieten Expositionsmodelle. Da Zigarettenrauch als Hauptrisikofaktor für die Entstehung von COPD gilt, wurde ein besonderes Augenmerk auf Tiermodelle basierend auf der Inhalation von Zigarettenrauch oder seinen wichtigsten Derivaten, wie Lipopolysaccharid gerichtet. Das Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) ist integraler und essentieller Bestandteil von Zellwänden von gramnegativen Bakterien und gilt als potenter inflammatorischer Stimulus. Sein Vorkommen ist ubiquitär, besonders hohe Konzentration finden sich in organischen Stäuben und dem Zigarettenrauch (Hasday et al. 1999). LPS besteht aus einem Polysaccharidanteil (O-Antigen, äußere Kernregion, innere Kernregion) und dem hoch konservierten Lipid A Teil. LPS vermittelt seine inflammatische Potenz über Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) und CD14 Interaktion. CD14 ist ein Glykoprotein, das sowohl in membranständiger Form auf Monozyten, Makrophagen und Neutrophilen, sowie in löslicher Form im Plasma vorkommt. Vermittelt wird die Bindung von LPS an CD14 durch das LPS Binding Protein (LBP), einem Akute-Phase-Plasmaprotein (Hailman et al. 1996). CD14 und LBP wiederum sind essentiell für die Aktivierung von TLR4. Dies resultiert in einer Aktivierung von NF-κB sowie der MAPK Signalkaskade und somit letztlich in der Produktion von TNF-α sowie weiteren pro-inflammatorischen Zytokinen (Togbe et al. 2007). Verschiedene Studien konnten nachweisen, dass die Inhalation von LPS eine akute und chronische pulmonale Entzündung verursacht. Diese Entzündung geht einher mit massiver Neutrophilie, der Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, Ödembildung sowie reduzierter Lungenfunktion (Vernooy et al. 2002; Brass et al. 2003). 21 EINLEITUNG 1.5 Zielsetzung dieser Arbeit In Anbetracht mangelnder spezifischer Therapiemöglichkeiten der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung war das Ziel dieser Arbeit, neue potentielle pharmakotherapeutische Ansätze auf ihre Wirksamkeit zu untersuchen. Hierzu wurden verschiedene Substanzen sowohl in vitro als auch in vivo getestet. Das für die in vivo Untersuchungen verwendete Inhalationsmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung imitierte die pathophysiologischen Vorgänge während einer akuten Exazerbation von COPD. Aus der Literatur ist bekannt, dass der ERK MAPK Signalweg eine bedeutende Rolle bei IL-13-induzierten asthmaähnlichen Entzündung spielt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass im Tiermodell die Blockade von p38 MAPK effektiv die LPS-induzierte Atemwegsentzündung reduzierte. Eine Hypothese dieser Arbeit war, dass auch die ERK Signaltransduktionskaskade eine entscheidende Rolle bei der LPS-vermittelten Lungenschädigung spielt und die Blockade dieses Signalweges anti-inflammatorische Effekte haben könnte. Um dies zu untersuchen, wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit der MEK1/2 Inhibitor U0126 auf seine Wirkungen im Tiermodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung untersucht. In diesem in vivo Modell waren unter anderem als Kennzeichen für die Entzündung die Zahl an Immunzellen und die Zytokinkonzentration in der bronchoalveolären Lavage (BAL) von Interesse. Chronische inflammatorische Erkrankungen sind im Gegensatz zu akuten Prozessen nicht selbst auflösbar. Ein wichtiges Ziel der Forschung auf dem Gebiet chronischer Inflammation ist es, pharmakotherapeutisch nicht nur anti-inflammatorisch einzugreifen, sondern auch aktiv die Auflösung einer Entzündung zu fördern. Da dieser Ansatz nicht durch die prophylaktische Gabe von Substanzen sondern vielmehr durch die therapeutische Applikation verfolgt werden kann, wurden das Glucocorticoid Dexamethason und der CDK-Inhibitor Roscovitine auf ihre therapeutische Wirkung im LPS-Modell untersucht. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der adaptiven Immunität bei COPD untersucht. Das Zytokin IFN-γ gilt als Schlüsselmediator der Th1-vermittelten Immunantwort. Mit Hilfe von bizistronischen IFN-γ-Reportermäusen (Yeti-Mäuse) wurde der durch LPS-Inhalation generierte Phänotyp der Immunantwort analysiert. Darüber hinaus wurden die Effekte der Neutralisierung von IFN-γ mittels Antikörpern sowohl in Reportermäusen als auch in Balb/c Mäusen im LPS-Modell evaluiert. 22 MATERIAL UND METHODEN 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien und Biochemikalien SUBSTANZ BEZUGSQUELLE Dexamethason Sigma-Aldrich (Steinheim, D) EDTA-Dinatriumsalz, Dihydrat Applichem (Darmstadt, D) Eosin Roth (Karlsruhe,D) FCS PAN-Biotech GmBH (Aidenbach, D) Formaldehyd, ca.36% Sigma-Aldrich (Steinheim, D) Hämatoxillin Roth (Karlsruhe,D) Hank´s Lösung Apotheke des Universitätsklinikums (Erlangen, D) HBSS 10x Invitrogen (Karlsruhe,D) HEPES 1M Sigma-Aldrich (Steinheim, D) Histofix (4% Formaldehydlösung, Roth (Karlsruhe,D) phosphatgepuffert) Histopaque®- 1077 Sigma-Aldrich (Steinheim, D) Isopropanol Applichem (Darmstadt, D) Kollagenase D Roche Diagnostics (Mannheim, D) LPS aus E.coli Serotyp 026:B6 Sigma-Aldrich (Steinheim, D) Methanol Applichem (Darmstadt, D) PMSF Sigma-Aldrich (Steinheim, D) Rolipram Sigma-Aldrich (Steinheim, D) Rotihistol Roth (Karlsruhe,D) RPMI-1640 Invitrogen (Karlsruhe,D) U0126 Tocris (Ellisville, USA) Saponin Sigma-Aldrich (Steinheim, D) HTAB Sigma-Aldrich (Steinheim, D) 23 MATERIAL UND METHODEN Roscovitine LC Laboratories (Woburn, USA) PBS Invitrogen (Karlsruhe,D) Tabelle 2 Substanzen 2.1.2 Verbrauchsmaterialien BEZEICHNUNG HERSTELLER 384-well Platten ABgene (Surrey, UK) 96-well-NUNC™-Immuno Platte (Microtiterplatten NUNC (Rosklide, DK) für ELISA) BD InSyte™ Venenverweilkanüle, 24G BD Biosciences (Heidelberg, D) EDTA-Monovetten, S-Monovette Sarstedt (Nümbrecht, D) Venenpunktionsbesteck (Venofix) Braun (Melsungen, D) Tabelle 3 Verbrauchsmaterialien Sämtliches Zellkulturmaterial wurde, falls nicht anderweitig genannt, bei BD Biosciences (Heidelberg, D) erworben. 2.1.3 Primer und Sonden Die Primer und Sonden für humanes β-Aktin und humanes MKP-1 stammten von Biomol GmbH (Hamburg, D). Assay on Demand (AOD) Primer wurden von Applied Biosystems (Darmstadt, D) bezogen. ZIELGEN h β-Aktin VORWÄRTSPRIMER TCA CCC ACA CTG RÜCKWÄRTSPRIMER CAG CGG AAC CGC TCA TGC CCA TCT ACG A TTG CCA ATG G h MKP-1 h DUSP-2, -3, -4 Tabelle 4 SONDE 6FAM-Atg CCC XT CCC CCA TgC CAT CCT gCg T p TGG TTC AAC GAG GGC AGA TGG TGG CAG AGG AAG GGT GTT TGT GCC ATT G ACC CCA CTG CA GG AOD (Assay ID: HS00358879, Hs00187940, Hs00154826) Verwendete Primer 24 MATERIAL UND METHODEN 2.1.4 Antikörper BEZEICHNUNG BEZUGSQUELLE Anti-Phospho-ERK1/2 (T202/Y204):Alexa Fluor® BD Biosciences (Heidelberg,D) 488 Anti-Phospho-p38 MAPK (T180/Y182):Alexa BD Biosciences (Heidelberg,D) Fluor® 488 Alexa Fluor® 488 Mouse IgG1, κ Isotyp Ctrl (FC) BioLegend (San Diego. USA) LEAF™ purified anti-mouse IFN-γ BioLegend (San Diego. USA) Clone R4-6A2 LEAF™ purified rat IgG1, κ Isotype control clone BioLegend (San Diego. USA) RTK2071 PE anti-mouse CD4 BioLegend (San Diego. USA) PE anti-mouse CD8a BioLegend (San Diego. USA) PE/Cy5 anti-mouse CD3ε BioLegend (San Diego. USA) Streptavidin-Alexa Fluor® 488 Invitrogen (Karlsruhe, D) Biotin anti-mouse IFN-γ BioLegend (San Diego. USA) Tabelle 5 Verwendete Antikörper 2.1.5 Käuflich erworbene Systeme BEZEICHNUNG HERSTELLER Mouse MIP-2 und KC DuoSet R&D Systems (Wiesbaden-Nordenstadt, D) OptEIA Sets Human IL-2 und TNF-α BD Biosciences (Heidelberg, D) OptEIA Sets Mouse IL-10 und TNF-α BD Biosciences (Heidelberg, D) PathScan Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) Cell Signaling (Danvers, USA) Sandwich ELISA Kit PathScan Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Cell Signaling (Danvers, USA) Sandwich ELISA Kit QuantiTect™ Probe RT-PCR Kit Qiagen (Hilden, D) RNeasy™ Mini Kit Qiagen (Hilden, D) Tabelle 6 Käuflich erworbene Systeme 25 MATERIAL UND METHODEN Falls nicht anderweitig angegeben, wurden alle Kits entsprechend den Herstellerangaben verwendet. 2.1.6 Geräte und Software BEZEICHNUNG HERSTELLER ABI Prism 7900 Applied Biosystems (Darmstadt, D) BD FACScan™ und BD CellQuest™ Software BD Biosciences (Heidelberg, D) Biophotometer Eppendorf (Hamburg, D) Cytospinzentrifuge Shandon Cytospin 4 Thermo Scientific (Waltham, USA) ELISA Reader und Washer Dynatech (West Sussex, UK) Mikroskop Axioplan mit Axiophot Kamerasystem Zeiss (Oberkochen, D) Microtom Sysmex F-520 Hämatologie-Analysator Sysmex (Norderstedt, D) Vernebelungapparatur Nebulizer Control-5 Buxco (Wilmington, USA) Zentrifugen 5417R und 5810 Eppendorf (Hamburg, D) Tabelle 7 Geräte und Software 26 MATERIAL UND METHODEN 2.2 Methoden 2.2.1 Isolierung von PBMC aus humanem Vollblut Peripher mononukleäre Zellen (B-Zellen, T-Zellen, Monozyten und NK-Zellen) wurden aus venösem EDTA-Blut von gesunden freiwilligen Spendern mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Hierzu wurden die Blutproben zu gleichen Teilen mit Hank´s Lösung verdünnt, vorsichtig auf Histopaque-1077 geschichtet und 20 min bei 742*g ohne Bremsvorgang zentrifugiert. Während Erythrozyten und Granulozyten das Histopaque mit einer definierten Dichte von 1,077g/ml passieren und sedimentieren, sammeln sich mononukleäre Zellen in der Interphase an. Dieser sichtbare PBMC-reiche Film an der Oberfläche des Histopaques wurde abgenommen und zweimal mit Hank`s Lösung gewaschen (jeweils 5min bei 515*g). Die Zellzahl an isolierten mononukleären Zellen wurde mittels eines Hämozytometers (Sysmex) bestimmt. Anschließend wurden die Zellen zu einer Dichte von 1*106 Zellen/ml in RPMI-1640 Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in 24-well-Zellkulturplatten in Volumina von jeweils 500µl ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. 2.2.2 Gewinnung von Monozyten PBMC wurden in RPMI-1640-Medium bei 37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert. Monozyten können aufgrund ihrer adhärierenden Eigenschaften von den non-adhärierenden Lymphozyten durch Mediumwechsel separiert werden. 2.2.3 Behandlung und Stimulation von isolierten PBMC Die Zellen wurden in 500µl-Volumina in einer Dichte von 1*106 Zellen/ml über Nacht bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Im Anschluss wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an U0126 (in DMSO gelöst) für 30 Minuten ebenfalls unter den obigen Bedingungen inkubiert. Die darauf folgende Stimulation erfolgte mit α-CD3/CD28 Dynabeads® (2µl/well) oder TPA (50ng/ml). Monozyten wurden mit LPS (1mg/ml) stimuliert. Zu den entsprechenden Zeitpunkten wurden zur Bestimmung von Zytokin-Proteinen die Überstände abgenommen und bei -20°C gelagert. Die Zellen wurden mit RLT-Lyse-Puffer lysiert und bis zur RNA-Isolation bei -80°C gelagert. 27 MATERIAL UND METHODEN 2.2.4 Quantifizierung von mRNA mittels real-time RT-PCR Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gilt als eine sehr sensitive Methode zur Detektion geringer Mengen an mRNA. Aus Zell-Lysaten wurde mittels RNeasy® Mini Kit gemäß Vorschrift RNA isoliert. Es wurde eine sog. „One-step real time RT-PCR“ unter Verwendung von QuantiTect Probe RT-PCR-Kits durchgeführt. Die Expression von relevanten Genen wurde in Relation zu β-Aktin mittels TaqMan Assay in einem ABI Prism 7900-Gerät gemessen. Eine relative Quantifizierung der mRNA-Menge erfolgte durch Verwendung der ∆∆Ct-Methode. β-Aktin wurde als interner Standard (sog. Housekeeping-Gen) eingesetzt, um die erhaltenen mRNA-Level auf β-Aktin zu normalisieren: Ct(β-Aktin) - Ct(Zytokin) = ∆Ct. Der erhaltene Wert wurde um den ∆Ct Wert der Kontrolle bereinigt, welche mRNA Level von unstimulierten Zellen darstellt: ∆Ct - ∆Ct (Kontrolle) = ∆∆Ct. Die Berechnung der relativen mRNA-Menge erfolgte dann als 2-∆∆Ct. (Applied Biosystems User Bulletin 2; ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, 1997). 2.2.5 ELISA 2.2.5.1 Zytokinmessung in Überständen von Zellkultur und bronchoalveolärer Lavage Zur Bestimmung der Proteinmenge in Überständen von PBMC und muriner BAL wurden ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) Analysen durchgeführt. Quantitative Zytokinmessungen (h-TNF-α, h-IL-2, m-TNF-α, m-MIP-2, m-KC and m-IL-10) erfolgten durch Sandwich-ELISA unter Verwendung von kommerziell erhältlichen ELISA Kits (BD Biosciences, R&D Systems). Die Durchführung erfolgte gemäß den Herstellerangaben. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 450nm mit einer Referenzwellenlänge von 570nm mit Hilfe eines Photometers für Mikrotiterplatten (Dynatech) bestimmt. Die quantitative Auswertung der Proben erfolgte unter Verwendung der jeweiligen aus sieben Messpunkten bestehenden Standardkurven. 28 MATERIAL UND METHODEN 2.2.5.2 Detektion von phosphorylierter p44/p42 MAPK und p38 MAPK mittels ELISA Zur Bestimmung der Menge an aktivierter ERK und p38 MAPK in Lungenhomogenisaten wurden ein PathScan® Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) Sandwich ELISA Kit sowie ein PathScan® Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) Sandwich ELISA Kit (Cell Signaling) verwendet. Diese basieren als Sandwich-ELISA auf dem Prinzip der Festphasenadsorption (Solid-Phase-Technik), ein Phospho-p44/42 bzw. p38 MAPK-Kaninchen-Antikörper liegt bereits in adsorbierter Form an den Mikrotiterplatten vor. Es werden endogene Level der p44/p42 bzw. p38 MAPK mittels MAPK Detektionsantikörpern detektiert, sobald diese bei Thr202/Tyr204 (ERK) bzw. Thr180/Tyr182 (p38) phosphoryliert sind. Ein Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper sowie TMB Substrat werden hinzugefügt, um eine Farbreaktion zu erzeugen. Die optische Dichte, die bei 450nm photometrisch ermittelt wird, ist direkt proportional zur Menge an phosphorylierter p44/p42 MAPK bzw. p38 MAPK. 2.2.6 Durchflusszytometrische Bestimmung von pp38 und pERK1/2 mittels phosphospezifischer Antikörper Die FACS-Analyse (fluorescence activated cell sorting) ermöglicht die Charakterisierung von Antigenen auf und in einer Zelle mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, darüber hinaus sind Zellen hinsichtlich Größe und Granularität durch unterschiedliche Streulichtemissionen differenzierbar. Entlang der Achse des einfallenden Lichtes wird die Durchlichtbrechung erfasst (FSC, Forward Scatter), die eine Aussage über die relative Zellgröße zulässt. Senkrecht dazu wird das Seitwärtsstreulicht registriert (SSC, Side Scatter), das proportional zur Zellgranularität ist. Drei weitere Detektoren (FL1-3) nehmen spezifisch die unterschiedlichen Emissionswellen der eingesetzten Fluorochrome in definierten Bereichen auf. Die Bestimmung von phosphorylierten Mengen der beiden MAP Kinasen p38 und ERK1/2 in humanen PBMC erfolgte durchflusszytometrisch mit Hilfe von phosphospezifischen Antikörpern. Der Versuchsablauf wurde an das etablierte Verfahren von Krutzik und Nolan (Krutzik und Nolan 2003) adaptiert. Humane frisch isolierte PBMC wurden in einer Dichte von 1*106Zellen/ml in Volumina von jeweils 1ml in 5ml Rundbodenröhrchen ausgesät und über Nacht im Brutschrank 29 MATERIAL UND METHODEN inkubiert. Die Zellen wurden mit U0126 (1µM) vorbehandelt und nach 30 min bei 37°C, 5%CO2 mit TPA (50ng/ml) stimuliert. Nach 15 min wurden die Zellen mit Formaldehyd (Endkonzentration 1,5%) fixiert. Die Permeabilisierung der Zellpellets erfolgte mit 1ml 100% eiskaltem Methanol unter starkem Vortexen und anschließender 30-minütiger Inkubation bei 4°C. Nach zweimaligem Waschen mit FACS-Puffer (PBS mit 1% FCS) wurden die Zellen mit den entsprechenden Mengen an Antikörpern (α-pp38, α-pERK1/2 und Isotypkontrolle) versetzt und 1 h bei RT unter Lichtabschluss inkubiert. Nach erneutem Waschvorgang wurden die Zellen in 500µl FACS-Puffer aufgenommen und am Durchflusszytometer vermessen. 2.2.7 Mausmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung 2.2.7.1 Versuchstiere Für die meisten in vivo Untersuchungen dienten männliche Balb/c Mäuse (Harlan, Borchen, D) als Versuchstiere. Bizistronische IFN-γ-eYFP (IFN-γ-enhanced Yellow Fluorescent Protein), sog. Yeti Mäuse (Stetson et al. 2003) wurden freundlicherweise von Prof. A. Gessner (Mikrobiologisches Institut, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg) zur Verfügung gestellt. Die Tiere waren zu Beginn der Experimente im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 22-25g. Sie wurden unter konstanten Bedingungen (Temperatur 20 ± 2°C, Luftfeuchtigkeit 40-60%, 12h Tag-Nacht-Rhythmus) gehalten und hatten freien Zugang zu Futter (Altromin, Lage, D) sowie Trinkwasser. Alle Tierversuche wurden unter Berücksichtigung des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt und durch die Regierung von Mittelfranken genehmigt. 2.2.7.2 Behandlungsprotokoll Zur Untersuchung prophylaktischer Wirkungen von Substanzen wurden U0126 (30mg/kg), Dexamethason (2,5mg/kg), Rolipram (10mg/kg) und Roscovitine (10mg/kg) 2h vor LPS-Vernebelung i.p. oder i.t. verabreicht. Die prophylaktische intra tracheale Gabe erforderte eine geringere Dosierung von Dexamethason (1mg/kg). Sollten therapeutische Wirkungen der Substanzen untersucht werden, erfolgte die Applikation 6h nach der LPS-Provokation. Die Substanzen wurden in PBS unter Zusatz von 5% DMSO 30 MATERIAL UND METHODEN gelöst, es wurden Volumina von 200µl i.p. und 50µl i.t. appliziert. Die Gabe von PBS und DMSO diente als Kontrollbedingung. Bei den Versuchen zur IFN-γ-Neutralisierung wurden LEAF™ purified anti-mouse IFN-γ und LEAF™ purified rat IgG1 κ Isotype control Antikörper verabreicht. Es wurde jeweils 250µl Antikörper (1mg/ml) mit 150µl PBS verdünnt und somit 400µl i.p. 24h vor der LPS-Inhalation appliziert. Die LPS-Provokation erfolgte durch Vernebelung einer LPS-Lösung (10mg LPS in NaCl, 1,5mg/ml) mit Hilfe einer Vernebelungsapparatur. Die Inhalation umfasste 5-6 Zyklen, bestehend aus 10 min Vernebelung und 5 min Trocknung. Naive Mäuse dienten als Negativkontrollen. Als Positivkontrollen wurden Tiere mit Vehikel behandelt und inhalierten LPS. Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Tiermodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung diente nicht als Modell der COPD, sondern spiegelte vielmehr die pathophysiologischen Vorgänge während einer akuten Exazerbation der Erkrankung wider. Die Tötung der Tiere erfolgte durch Inhalation von CO2 je nach Versuchsablauf 2h, 6h, 24h oder 72h nach LPS-Vernebelung. 2.2.7.3 Bronchoalveoläre Lavage Die Trachea der getöteten Tiere wurde durch Entfernung von Haut und Fell, sowie von umliegendem Gewebe, exponiert und mit einer 24G Kanüle punktiert. Die Lungen wurden pro Tier 6x mit 0,5ml HBSS, versetzt mit 100mM Na-EDTA und 10mM HEPES Puffer, gespült. Die Rückgewinnungsrate lag durchschnittlich bei 80-90%. Die so erhaltene BAL wurde bei 300*g 5 min zentrifugiert und die Überstände für spätere Proteinbestimmungen bei -20°C gelagert. Die Zellpellets wurden in 2ml RPMI 1640 Medium resuspendiert und mit Hilfe eines Hämozytometers die Gesamtzellzahl an Leukozyten ermittelt. Zur differentiellen Analyse der Zellzusammensetzung wurden pro Tier 100µl dieser Zellsuspension mit Hilfe einer Cytospin Zentrifuge bei 64*g für 5 min und mittlerer Beschleunigung auf Objekträger aufgebracht. Diese wurden mit Diff-Quik gefärbt und nach dem Trocknen mit DPX Mounting Medium gedeckelt. Die Differentialanalyse der Zellzusammensetzung erfolgte durch mikroskopische Auszählung aufgrund morphologischer Kriterien von mindestens 400 Zellen pro Objekträger. 31 MATERIAL UND METHODEN 2.2.7.4 Lungenentnahme und Kollagenaseverdau Unmittelbar nach der BAL wurde nach Öffnung des Brustkorbes die komplette Lunge entnommen. Ex vivo erfolgte bei Bedarf die Trennung der Lungenflügel: der linke Lungenflügel wurde zur histologischen Untersuchung (s. 2.2.7.7) in 4% Formaldehydlösung gelagert, ein kleiner Lungenlappen zur Untersuchung der Myeloperoxidaseaktivität (s. 2.2.7.6) sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren, während die restlichen Lungenlappen zur Weiterverarbeitung in RPMI 1640 Medium gelagert wurden. Die Zellen wurden aus dem Gewebe durch enzymatischen Verdau mit Kollagenase D (0,253U/mg, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, D) isoliert. Hierzu wurden die Lungenlappen mechanisch zerkleinert, mit 2ml Kollagenaselösung (1mg/ml Kollagenase in RPMI 1640 Medium) versetzt und daraufhin 2h bei 37°C inkubiert. Das verdaute Gewebe wurde durch ein 40µm Zellsieb gefiltert, mit 5ml PBS gewaschen und bei 300*g 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 2ml RPMI 1640 resuspendiert und die Zellzahl mittels eines Hämozytometers bestimmt. 2.2.7.5 Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Myeloperoxidase Sofort nach der Lungenentnahme aus dem Brustkorb wurde ein kleiner rechter Lungenlappen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Im Anschluß erfolgte eine mechanische Homogenisierung mit einem Gewebezerkleinerer. Das Homogenat wurde nach Zugabe von Phosphatpuffer (0,05M Na3PO4, pH 5,4) bei 20000*g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in Phospatpuffer mit 0,5% HTAB resuspendiert. Anschließend wurden die Proben dreimal in Folge in flüssigem Stickstoff eingefroren und sofort wieder aufgetaut. Nach erneutem Zentrifugationsschritt wurden die Überstände abgenommen, diese wurden zur Aktivitätsbestimmung der Myeloperoxidase mit Wasserstoffperoxid und TMB (BD Biosciences, Heidelberg, D) versetzt. Die Farbreaktion wurde zu definierten Zeitpunkten durch Zugabe von 1M Phosphorsäure gestoppt und die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450nm gemessen. 32 MATERIAL UND METHODEN 2.2.7.6 Histologische Untersuchungen der Lunge Ganze Lungen oder der linke Lungenlappen wurden nach der Entnahme in 4% Formaldehydlösung (Histofix, Roth, Karlsruhe D) überführt und 24h bei 4°C unter Lichtabschluss fixiert. Durch eine aufsteigende Isopropanolreihe wurden die Organe entwässert und entfettet, bevor sie in Paraffin eingebettet wurden. Nach dem Aushärten (über Nacht, 4°C) wurden an einem Microtom 4µm dicke Schnitte angefertigt. Diese wurden zunächst zweimal mit Rotihistol (Roth, Karlsruhe, D) gewaschen und durch eine absteigende Isopropanolreihe rehydriert. Die Färbung erfolgte mit Hämatoxillin (5min) und Eosin (1min), danach wurden die Schnitte durch eine aufsteigende Alkoholreihe erneut dehydriert und nach zweimaligem Waschen mit Rotihistol mit Roth-Histokitt (Roth, Karlsruhe, D) gedeckelt. Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch. Die bronchiale Inflammation wurde mit Hilfe eines semiquantitativen Score beschrieben durch Myou et al. ausgewertet. Das Ausmaß der Entzündung wurde in fünf Kategorien eingeteilt: 0, normale Lungenstruktur; 1, wenige inflammatorische Zellen; 2, ein Ring von entzündlichen Zellen 1 Zelllage dick; 3, ein Ring von entzündlichen Zellen 2–4 Zellen tief; 4, ein Ring von entzündlichen Zellen >4 Zellen dick. Der Score wurde durch eine verblindete Analyse ermittelt. 2.2.7.7 Durchflusszytometrische Untersuchungen Zur Oberflächenfärbung werden 0,1 - 1*106 Zellen, die aus bronchoalveolärer Lavage sowie durch Kollagenase-Verdau aus Lungengewebe gewonnen wurden, zunächst mit gereinigtem anti-Maus CD32/CD16 Fc-Block Antikörper 10min bei RT inkubiert, um unspezifische Antikörperbindungen zu verhindern. Anschließend wurden die Zellen mit entsprechend in FACS Puffer verdünnten Fluoreszenzantikörpern für 30min bei 4°C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit FACS Puffer wurden die Zellpellets in 500µl FACS Puffer resuspendiert und vermessen. Wurde neben extrazellulären Antigenen zusätzlich intrazellulär gefärbt, ging eine Restimulation der Zellen voraus. Hierfür wurden die Zellen mit TPA (25ng/ml) und Ionomycin (1µM) stimuliert und in Gegenwart von Brefeldin A (25µg/ml) 4h bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Nach einem Waschschritt erfolgte die oben beschriebene Oberflächenfärbung mit α-CD3, α-CD4 sowie α-CD8 monoklonalen Antikörpern. Im Anschluß wurden die Zellen zweimal mit FACS Puffer gewaschen und über Nacht bei 33 MATERIAL UND METHODEN 4°C mit 2% Formaldehydlösung fixiert. Die fixierten Zellen wurden zweimal mit Saponin Puffer (0,5% Saponin in FACS Puffer) gewaschen und mit biotinyliertem α-IFN-γ Antikörper für 30min bei 4°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurden die Zellen mit Streptavidin-Alexa Fluor®488-konjugiert für 30 min bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden erneut zweimal mit Saponin Puffer gewaschen, in 300µl FACS Puffer resuspendiert und vermessen. Als Kontrollbedingungen dienten ungefärbte Zellen. 2.2.7.8 Albuminbestimmung in der bronchoalveolären Lavage Zum quantitativen Nachweis von Albumin im Überstand der BAL wurde ein Bradford Assay durchgeführt. Hierzu wurden 5µl Überstand mit 795µl bidestilliertem Wasser verdünnt und mit 200µl Farbstoff-Konzentrat (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D) versetzt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die photometrische Vermessung bei 595nm in einem Bio-Photometer. Die Auswertung erfolgte anhand einer Standardkurve (Kalibrationsbereich 1-25µg/ml). Als Leerwert diente eine Wasser bidest -Farbstoff-Konzentrat-Mischung. 2.2.7.9 Messung der Lungenfunktion Die Messung der Lungenfunktion erfolgte durch die nicht-invasive Methode der Ganzkörperplethysmographie an wachen Mäusen 2h nach der LPS-Verneblung. Bei diesem Vefahren sitzt die Maus frei beweglich in einer Kammer, durch die ein kontinuierlicher Luftstom fließt und die mit einem hochempfindlichen Druckabnehmer (Buxco Electronics, Troy, New York, USA) verbunden ist. Dieser registriert kurzfristige Druckänderungen in der Kammer. Die Einatmung der Mäuse erzeugt einen Unterdruck und die Ausatmung einen Überdruck in der Kammer. Diese Druckänderungen werden in Abhängigkeit von der Zeit kontinuierlich aufgezeichnet und von der Software aus den gemessenen Werten für jeden Atemzyklus der so genannte Penh-Wert (enhanced Pause) berechnet. Dieser dimensionslose Wert korreliert mit dem Atemwegswiderstand. Durch eine Provokation der Tiere mit zunehmenden Konzentrationen an Metacholin (1-50mg/ml) wird eine Bronchokonstriktion verursacht, die zu einer Erhöhung des Penh in Abhängigkeit der Lungenfunktion führt. 34 MATERIAL UND METHODEN 2.2.8 Datenauswertung Die Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Signifikanzberechnungen gegenüber den Kontrollen wurden mittels des ungepaarten beidseitigen Student’s t-Test bestimmt. Alle statistischen Analysen, die Berechnung der EC50, ED50 bzw. IC50 und die Erstellung der Dosis-Wirkungskurven und der Diagramme wurden mit der Software Graph Pad Prism 5.0 durchgeführt. Ein Signifikanzniveau mit einem p-Wert von p<0,05 wurde als signifikant (*), mit p<0,01 (**) und p < 0,001 (***) als hochsignifikant definiert. 35 ERGEBNISSE 3 Ergebnisse 3.1 In vitro Untersuchungen 3.1.1 Zeitkinetik der IL-2 Expression Interleukin-2 wird aktiv aus CD4+ T-Zellen freigesetzt. IL-2 ist lokaler Wachstumsfaktor für infiltrierende T-Lymphozyten und stimuliert Wachstum, Differenzierung und das Überleben pulmonaler cytotoxischer T-Zellen. Nach Stimulation von isolierten Blutlymphozyten mit anti-CD3/CD28 Beads kam es zeitabhängig zu einem schnellen Anstieg der IL-2 Expression mit einem Maximum nach ca. 8h. Nach 24h war ein leichter Abfall der Expressionsraten zu verzeichnen (Abb.3). x-fache Expression 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0 4 8 12 16 20 24 Zeit [h] Abbildung 3 Zeitkinetik der IL-2 Expression PBMC wurden aus humanem Blut isoliert und mit anti-CD3/CD28 Beads stimuliert. Nach definierten Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert, mRNA isoliert und mittels real-time RT-PCR die Expression von IL-2 bestimmt. Die Werte wurden auf β-Aktin normalisiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM aus drei freiwilligen Spendern. 3.1.2 Effekte von U0126 auf die Aktivierung von ERK in PBMC Die spezifische Wirksamkeit von U0126 wurde durch die Analyse von phosphorylierten MAPK in mit TPA stimulierten humanen Primärzellen mittels Durchflusszytometrie untersucht. Durch die Blockade der MAPKK MEK1/2 durch U0126 wird die Phosphorylierung von ERK inhibiert. Die aktivierten phosphorylierten Isoformen von ERK und p38 wurden intrazellulär mit phosphospezifischen Antikörpern angefärbt. 36 ERGEBNISSE Durch Vorbehandlung mit U0126 konnte das geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität (geometric mean fluorescence intensity, GeoMean) im Vergleich zu unbehandelten Zellen signifikant reduziert werden, was geringere Level an pERK durch U0126 anzeigt (p=0,049) (Abb.4A). Die Aktivität von p38 wurde durch die Behandlung mit U0126 nicht gehemmt, es konnten keine Unterschiede des GeoMeans im Vergleich zu Negativkontrollen detektiert werden (Abb.4B). Dies war graphisch in Histogrammen detektierbar: Die Fluoreszenzverteilung der Kontrollen ist in grau hinterlegt, die schwarze Linie zeigt die Verteilung der behandelten Zellen. Bei beiden Färbungen war ohne Stimulation der Verlauf der Histogramme für unbehandelte Zellen und mit U0126 vorbehandelte Zellen annähernd deckungsgleich (Abb.4C, E). Nach 15minütiger Stimulation war eine deutliche Linksverschiebung des Histogrammes der Fluoreszenzverteilung der mit U0126 behandelten Zellen zu erkennen (Abb.4D). Der Verlauf der Histogramme für p38 zeigte hingegen auch nach Stimulation keine Veränderung zwischen Kontrollen und vorbehandelten Zellen (Abb.4F) A 60 40 * 20 15 geo mean pp38 80 geo mean pERK B unstimuliert 15 min stimuliert 0 10 5 0 Kontrolle U0126 C Abbildung 4 Kontrolle U0126 D Kontrolle U0126 E Kontrolle U0126 F Blockade der ERK Aktivierung durch U0126 Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut von gesunden Spendern wurden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert, mit U0126 vorinkubiert und mit TPA stimuliert. Die Zellen wurden fixiert, mit phosphospezifischen Antikörpern anti-pERK (A) und anti-pp38 (B) intrazellulär gefärbt und durchflusszytometrisch bestimmt. Dargestellt ist die geometrische mittlere Fluoreszenzintensität ± SEM aus 3 unabhängigen Versuchen. Signifikante Unterschiede zwischen der Wirkung der Substanz und unbehandelten Kontrollen sind mit * (p<0,05) gekennzeichnet. 37 ERGEBNISSE 3.1.3 Dosis-abhängige Inhibition der Zytokin-Induktion durch U0126 in PBMC In einem nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob die spezifische Inhibition von pERK die Zytokin-Induktion beeinflusst. Wie bereits aus der Literatur bekannt, führt LPS-Stimulation in Makrophagen-Zelllinien und humanen Monozyten zu einer ERK Aktivierung (Scherle et al. 1998) und darüber hinaus aktiviert auch CD3/CD28 Kostimulation die MAPK (Chialda et al. 2005). Infolge dessen wurden im Rahmen dieser Arbeit humane Monozyten und Lymphozyten in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von U0126 mit LPS bzw. anti-CD3/CD28-beads stimuliert. Zur IC50 Bestimmung von U0126 wurde die Inhibition der Zytokin-Induktion von IL-2 und TNF-α herangezogen und in Form einer Dosis-Wirkunskurve dargestellt. U0126 inhibierte die Induktion von TNF-α im Überstand von stimulierten Monozyten konzentrationsabhängig (IC50=214,6nM) (Abb.5A, B). Desgleichen wurde die Freisetzung von IL-2 aus stimulierten Lymphozyten mit zunehmenden Konzentrationen von U0126 gehemmt (IC50=85,37nM) (Abb.5C, D). 38 C 15000 1000 10000 100 100 0 00 10 0 30 10 30 3 10 ko nt ro lle D 150 IL-2 [%] 30 00 10 00 0 N eg 30 at 0 iv 00 ko nt ro lle N eg B 150 TNF [%] U0126 [nM] Po si tiv 0 00 30 00 10 10 00 30 0 10 0 U0126 [nM] 30 at 00 iv 0 ko nt ro lle Po si tiv ko 30 0 3 0 10 5000 1 500 1 IL-2 [pg/ml] A 1500 nt ro lle TNF [pg/ml] ERGEBNISSE 50 50 0 0 0 1 2 3 4 5 0 1 log conc. U0126 [nM] Abbildung 5 2 3 4 5 log conc. U0126 [nM] Konzentrationsabhängigkeit von U0126 auf Zytokininhibition in humanen PBMC Isolierte PBMC wurden mit steigenden Konzentrationen von U0126 vorbehandelt (1µm-30mM) und zur Messung von TNF-α Level mit LPS (A, B), zur Bestimmung von IL-2 Mengen (C, D) mit anti-CD3/CD28-beads stimuliert. 24h später wurden die Überstände abgenommen und ELISA Messungen durchgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte der Zytokinspiegel ± SEM dreier Probanden. Die mittlere inhibitorische Konzentration IC50 von U0126 wurde mittels Dosis-Wirkungskurven der normalisierten Cytokinspiegel dreier Spender ermittelt (TNF: IC50 = 214,6; IL-2: IC50 = 85,37). 3.2 Mausmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung 3.2.1 Wirkungen des MEK1/2 Inhibitors U0126 in vivo 3.2.1.1 Aktivierung von p44/42 MAPK im Lungengewebe Zur Untersuchung der pharmakodynamischen Aktivität erfolgte zunächst die Messung von phosphorylierter ERK im Lungengewebe. Eine Aktivierung von p44/42 wurde mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Sandwich-ELISA mit der Detektion von endogenen Spiegeln phosphorylierter MAPK nachgewiesen. Die Provokation mit einem LPSAerosol resultierte in einen signifikanten Anstieg an pERK (p=0,044) (Abb.6A) und 39 ERGEBNISSE somit in einer Aktivierung der MAPK im Lungengewebe. Hingegen wiesen Lungen von mit U0126 vorbehandelten Tieren eine signifikant reduzierte optische Dichte auf (p=0,04), was geringere Mengen an pERK implizierte (Abb.6A). Die Aktivität von p38 hingegen wurde durch U0126 nicht gehemmt. Lungen von Tieren, die mit U0126 behandelt wurden, wiesen einen mit der Positivkontrolle vergleichbaren Level an phosphorylierter p38 MAPK auf (Abb.6B). B A 1.5 * 1.0 * OD450nm OD450nm 0.8 1.0 0.5 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 Negativkontrolle Abbildung 6 Positivkontrolle U0126 Negativkontrolle Positivkontrolle U0126 Detektion von phosphorylierter p44/42 MAPK mittels Sandwich-ELISA Die Mäuse wurden 2h vor der LPS-Inhalation mit U0126 (30mg/kg) oder Vehikel i.p. behandelt. 2h später wurden die Tiere getötet und die Lungen wurden entnommen. Nach der Homogenisation wurden die Lungenlysate ultrazentrifugiert und die Überstände zur Detektion von pERK und pp38 mittels Sandwich-ELISA analysiert. Dargestellt ist als optische Dichte ± SEM (A: n=6, B: n=3 Tiere/Gruppe) die Absorption bei 450nm. Statistisch signifikante Unterschiede bei *(p<0,05) im Vergleich zur Positivkontrolle. 3.2.1.2 Behandlung mit U0126 reduziert LPS-induzierte Zelleinwanderung Um die Effekte der MEK1/2 Inhibition auf die akute LPS-induzierte Lungenschädigung zu validieren, wurde die bronchoalveoläre Lavage 24h nach LPS-Vernebelung durchgeführt und die differentielle Zellzusammensetzung quantifiziert. Die Endotoxin Exposition führte zu einem massiven Einstrom von Entzündungszellen in das Lungengewebe. Im Vergleich zu unbehandelten Tieren lag eine hochsignifikante 20-fache Erhöhung der totalen Zellenzahl der BAL seitens der provozierten Mäuse vor (Abb.7A) (p<0,0001). Die Behandlung mit U0126 führte zu einer signifikanten Reduktion der Gesamtzellzahl der BAL (Abb.7A) (p=0,009). 40 ERGEBNISSE B A *** ** 6 Neutrophile [1x10 6] Gesamtzellzahl [1x10 6] 5 4 3 2 1 0 4 2 0 Negativkontrolle Positivkontrolle U0126 Negativkontrolle C Positivkontrolle U0126 D 0.25 0.20 * 0.15 0.10 0.05 0.00 Negativkontrolle Abbildung 7 Positivkontrolle U0126 Lymphoyzten Zellzahl [1x10 6] Monozyten Zellzahl [1x10 6] *** *** ** 0.08 * 0.06 0.04 0.02 0.00 Negativkontrolle Positivkontrolle U0126 U0126 reduziert zelluläre Infiltration in die BAL Die Mäuse wurden 2h vor LPS-Vernebelung mit U0126 (30mg/kg) i.p. oder Vehikel (5% DMSO in PBS) behandelt. 24h später wurden die Tiere getötet und die BAL durchgeführt. Es erfolgten Gesamtzellzahlbestimmung sowie differentielle Zellzahlanlaysen, um Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten zu quantifizieren. Dargestellt sind absolute Zellzahlen ± SEM (A, B, C n=10 Tiere/Gruppe; D n=4 Tiere/Gruppe). Signifikante Unterschiede zwischen der Wirkung der Substanz und Positivkontrollen sind mit * (p<0,05), **(p<0,01) und *** (p<0,001) gekennzeichnet. Der Einwanderungstrom infolge LPS-Provokation bestand vornehmlich aus neutrophilen Granulozyten (p<0,0001), und zu geringeren Anteilen aus Makrophagen und Lymphozyten (p=0,022). Die prophylaktische Gabe von U0126 führte zu hochsignifikant reduzierten Neutrophilzahlen (p<0,001) gegenüber den Positivkontrollen (Abb.7B). Darüber hinaus reduzierte die MEK1/2 Inhibition signifikant die Makrophagen- und Lymphozyteninfiltration in das Lungengewebe (Abb.7C, D) (p=0,046, p=0,026). 3.2.1.3 Einfluss von U0126 auf die Aktivität der Myeloperoxidase Die Myeloperoxidase (MPO) ist den primären Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert. Eine Erhöhung der Konzentration von MPO in der BAL wird als Indikator der in vivo-Aktivierung von neutrophilen Granulozyten gewertet. Zur Untersuchung der Enzymaktivität wurden Mäuse mit 30 mg/kg U0126 behandelt und einem LPS-Aerosol 41 ERGEBNISSE exponiert. Nach 24h wurden die Lungen entnommen und die Aktivität der MPO photometrisch bestimmt. LPS-Inhalation verursachte bei Tieren der Positivkontrolle eine signifikante Erhöhung der Aktivität der MPO (p=0,024). Durch die Vorbehandlung mit dem MEK1/2 Inhibitor konnte die Aktivität der MPO im Lungengewebe im Vergleich zu Kontrollbedingungen signifikant (p=0,044) reduziert werden (Abb.8). 0.5 * * OD450nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Negativkontrolle Abbildung 8 Positivkontrolle U0126 Einfluss von U0126 auf die Aktivität der Myeloperoxidase Balb/c Mäuse wurden mit U0126 (30mg/kg) oder Vehikel 2h vor LPS-Inhalation behandelt. 24h später wurden die Tiere getötet und die Lungen entnommen. Unbehandelte Tiere fungierten als Negativkontrolle. Als Nachweisreaktion für die Aktivität der Myeloperoxidase wurde die Umsetzung von TMB und Wasserstoffperoxid verwendet und nach dem Abstoppen der Farbreaktion mit Phosphorsäure wurde die Absorption bei 450nm gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte der optischen Dichte ± SEM mit 4 Tieren pro Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen den behandelten Tieren und der Positivkontrolle sind mit *(p<0,05) gekennzeichnet. 3.2.1.4 Dosis-abhängige Inhibition des LPS-induzierten Lungenschadens Um die Dosisabhängigkeit des inhibitorischen Potentials von U0126 in vivo zu evaluieren, wurden drei verschiedene Konzentrationen des selektiven MEK1/2 Inhibitors U0126 (3, 10 and 30mg/kg) getestet. Analog zu 3.2.1.1 wurden die Tiere 2h vor LPSInhalation mit U0126 behandelt und 24h später getötet, die BAL gewonnen und Zellzahlen bestimmt. Der MEK1/2 Inhibitor zeigte bei den niedrigen Konzentrationen von 3mg/kg und 10mg/kg lediglich einen schwachen inhibitorischen Effekt (Abb.9A). Hingegen führte die Applikation von U0126 in einer Konzentration von 30 mg/kg zu einer signifikanten Abnahme der Gesamtzellzahl (p=0,024). Die berechnete effektive Dosis mit halbmaximaler Wirkung (ED50) lag bei 20,56 mg/kg. Darüber hinaus zeigte sich auch die Zahl an Neutrophilen in der BAL als dosisabhängig signifikant reduziert (Abb.9B) (p<0,05). 42 ERGEBNISSE A B 6 6 * 4 2 Neutrophile [1x10 6] Gesamtzellzahl [1x106] 8 2 eg at iv ko nt ro lle Po si tiv ko nt ro lle 3m g/ kg U 01 26 10 m g/ kg U 01 26 30 m g/ kg U 01 26 N N Abbildung 9 * 0 eg at iv ko nt ro lle Po si tiv ko nt ro lle 3m g/ kg U 01 26 10 m g/ kg U 01 26 30 m g/ kg U 01 26 0 4 Dosisabhängigkeit des inhibitorischen Potentials von U0126 Die Tiere wurden 2h vor LPS-Provokation mit U0126 (3, 10 oder 30mg/kg) oder Vehicle (PBS mit 5% DMSO) i.p. behandelt. 24h später wurde nach dem Tod die BAL durchgeführt und Gesamtzellzahl und Neutrophilanzahl bestimmt. Es wird ein repräsentatives Experiment gezeigt (n=4 Mäuse/Gruppe). Dargestellt sind Mittelwerte der Zellzahlen ± SEM. Statistische Unterschiede zur Positivkontrolle sind durch *(p<0,05) gekennzeichnet. 3.2.1.5 Zytokin-und Chemokinlevel in der bronchoalveolären Lavage Die Schlüsselrolle des inflammatorischen Zytokins TNF-α sowie den Chemokinen KC (Keratinocyte-derived Chemokine) und MIP-2 (Macrophage Inflammatory Protein 2) bei der LPS-induzierten Lungenschädigung ist weitreichend belegt. Um dies im akuten in vivo-Modell zu evaluieren, wurde die BAL 2h nach der Aerosol-Provokation gewonnen und Zytokin- und Chemokingehalt bestimmt. LPS-Inhalation führte zu signifikant erhöhter Zytokinfreigabe in die BAL im Vergleich zu unbehandelten Tieren (TNF-α: p<0.0001; KC; p= 0,004; MIP-2: 0,016). Prophylaktische Applikation des MEK1/2-Inhibitors U0126 reduzierte signifikant den Gehalt an TNF-α (p=0,008) (Abb.10A), KC (p=0,015) (Abb.10B), sowie MIP-2 (p=0,049) (Abb.10C) in der BAL im Vergleich zu Positivkontrollen. 43 ERGEBNISSE A *** 25 B ** 4 KC [ng/ml] TNF [ng/ml] * ** 5 20 15 10 5 3 2 1 0 Negativkontrolle Positivkontrolle 0 U0126 Negativkontrolle Positivkontrolle U0126 C MIP-2 [ng/ml] 4 * * 3 2 1 0 Negativkontrolle Abbildung 10 Positivkontrolle U0126 Effekt von U0126 auf Zytokin- und Chemokinlevel in der BAL Die Mäuse wurden 2h vor LPS-Inhalation mit U0126 (30mg/kg) oder Vehikel i.p. behandelt. 2h nach der Provokation wurden die Tiere getötet und die BAL durchgeführt. Die Spülflüssigkeit wurde zentrifugiert und die Überstände für ELISA Messungen verwendet. Die Level von TNF-α (p=0,008) (A), KC (p=0,015) (B), sowie MIP-2 (p=0,049) (C) wurden jeweils mit Standard Sandwich ELISA Verfahren mit einem Detektionslimit von 15,6 pg/ml pro Zytokin bestimmt. Dargestellt sind repräsentative Daten dreier Versuche als Mittelwerte ± SEM (n=4). Statistisch signifikante Unterschiede verglichen mit Positivkontrollen sind mit *(p<0,05), **(p<0,01) und ***(p<0,001) gekennzeichnet. 3.2.1.6 Histologische Untersuchung des Lungengewebes Um die Wirkung von U0126 auf das Lungengewebe zu untersuchen, wurden 24h nach LPS Exposition die Lungen fixiert, Paraffinschnitte angefertigt und mittels HämatoxilinEosin (HE) angefärbt. Die Mäuse der Negativkontrolle wurden nicht mit LPS behandelt. Aus diesem Grund zeigten die mikroskopischen Aufnahmen eine normale Lungenstruktur (Abb. 11A, B). Neben mit Endothel ausgekleideten Blutgefäßen waren zwei Bronchiolen mit Bronchialepithel im Querschnitt zu erkennen. Diese Strukturen waren von Bindegewebe mit Stromazellen umgeben, wie den 400fachen Vergrößerungen zu entnehmen ist. 44 ERGEBNISSE Abbildung 11 Histologische Untersuchung der Lunge Zunächst wurde männlichen Balb/c Mäusen das Vehikel oder 30 mg/kg U0126 i.p. injiziert und 2 h später wurden sie vernebeltem LPS ausgesetzt. Die Tiere der Negativkontrolle wurden nicht mit LPS behandelt. Nach 24 h wurden die Lungen mit 4% Histofix fixiert, Paraffinschnitte angefertigt, mit Hämatoxilin-Eosin gefärbt und mittels Lichtmikroskopie histologisch ausgewertet (A, C, F 200fache Vergrößerung; B, D, F 400fache Vergrößerung). Dargestellt sind repräsentative Lungenschnitte von Negativkontrolltieren (A, B), von Positivkontrollen (C, D) und von Tieren die mit U0126 vorbehandelt wurden (E, F). Der Maßstabsbalken entspricht 100µm. Im Gegensatz dazu führte die LPS Exposition bei den mit Vehikel behandelten Mäusen zu einer massiven Invasion von Entzündungszellen in die Lunge (Abb.11C, D). Das Infiltrat von Zellen ließ sich bei näherer Betrachtung zum Großteil als Granulozyten identifizieren. Die Applikation von U0126 (30mg/kg) 2h vor LPS-Exposition reduzierte signifikant die Zahl an sichtbaren Entzündungszellen (Abb.11E, F). Es waren nur noch wenige Neutrophile zwischen den epithelialen Strukturen der Atemwege und den 45 ERGEBNISSE Gefäßen nachweisbar. Auffallende Veränderungen des Lungengewebes, die auf eine mögliche Toxizität von U0126 schließen ließen, wurden nicht beobachtet. Entzündungsscore 4 ** 3 2 1 0 Negativkontrolle Positivkontrolle Abbildung 12 U0126 Quantifizierung der pulmonalen Entzündung Die erhaltenen Lungenschnitte (repräsentative Exemplare in Abb.13 dargestellt) wurden lichtmikroskopisch mit Hilfe eines semiquantitativen Scores hinsichtlich ihrer Entzündungsquantität verblindet ausgewertet. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Entzündungskategorie (1 kaum Entzündung, 4 schwere Entzündung, siehe 2.2.7.6) (n=12). Statistische Signifikanzen zwischen Verumgruppe und Positivkontrolle ist mit **(p<0,01) gekennzeichnet. Die Quantifizierung der Inflammation der Lungen erfolgte mit Hilfe eines semiquantitativen Scores beschrieben durch Myou (Myou et al. 2003) (Abb.12). Die Lungenschnitte der unbehandelten Negativkontrollen zeigten eine weitgehend normale Lungenstruktur ohne Anzeichen von Entzündung. Die LPS Exposition führte zu einer starken Infiltration von Entzündungszellen in das Lungengewebe, was zu der Vergabe von hohen Entzündungsscores führte. Hauptsächlich handelte es sich um einwandernde Neutrophile. Hingegen wiesen die Lungenschnitte von mit U0126 vorbehandelten Tieren eine signifikant schwächere Inflammation als die Präparate der Positivkontrollen auf, was sich in der Einordnung in eine niedrigere Entzündungswertigkeit widerspiegelte. Es waren peribronchial signifikant reduzierte Zahlen an Entzündungszellen respektive neutrophile Granulozyten nachweisbar (p=0,007). 3.2.1.7 Einfluss von U0126 auf Albuminspiegel in bronchoalveolären Lavage Als normaler Bestandteil des Alveolarfilms ist eine Erhöhung der Konzentration von Albumin in der BAL als Hinweis für eine Permeabilitätserhöhung infolge einer Schädigung der alveolo-endothelialen Barriere und somit einer Lungenschädigung zu deuten. Die Albuminbestimmung erfolgte im BAL Überstand aus den Versuchen, die bereits unter 3.2.1.1 und 3.2.1.3 beschrieben sind. Die Exposition von Tieren gegenüber 46 ERGEBNISSE einem LPS-Aerosol führte zu einem Übertritt von Albumin in die Lavage verglichen zu naiven Tieren, welche nur geringe Mengen an Albumin aufwiesen. Hingegen konnte die i.p. Applikation von U0126 in einer Konzentration von 30mg/kg die Albuminspiegel in der BAL und somit die Permeabilität der bronchoalveolären Barriere signifikant reduzieren (Abb.13A) (p=0,047). Bei Betrachtung der niedrigeren Konzentrationen (3 und 10mg/kg) fällt auf, dass jene nur zu leichten Veränderungen der Albuminmenge in der BAL in der Lage waren und somit dem Effekt eine Dosisabhängigkeit zugrunde liegt (Abb.13B) (p=0,038). A B 600 400 * 300 200 100 Albumin [µg/ml] Albumin [µg/ml] 500 400 * 200 0 N eg U0126 at iv ko nt ro lle Po si tiv ko nt ro lle 3m g/ kg U 01 26 10 m g/ kg U 01 26 30 m g/ kg U 01 26 0 Negativkontrolle Positivkontrolle Abbildung 13 Einfluss von U0126 auf die Albuminspiegel in der BAL Die Überstände der aus den Versuchen 3.2.1.1 und 3.2.1.3 gewonnenen BAL wurde mit Hilfe eines Bradfordassays auf ihren Albumingehalt untersucht. Dargestellt sind Mittewerte ± SEM. Statistisch signifikante Unterschiede der mit U0126 (30mg/kg) behandelteten Tiere im Vergleich zu Positivkontrollen ist mit *(p<0,05) gekennzeichnet. 3.2.1.8 Effekte von U0126 auf die Lungenfunktion Die Messung der Lungenfunktion dient als diagnostisches Verfahren zum Nachweis von Atemflussbehinderung und Emphysem. Auch im Tiermodell von COPD ist der Nachweis der respiratorischen Funktion von großem Interesse. Das Verfahren der Ganzkörperplethysmographie wurde angewandt, um die Lungenfunktion zu evaluieren und Veränderungen des Parameters Penh wurden zur Bestimmung der Reaktivität heran gezogen. U0126 in einer Konzentration von 30mg/kg wurden den Tieren 2h vor der LPS-Inhalation i.p. appliziert und 2h nach der LPS-Exposition erfolgte die 47 ERGEBNISSE Ganzkörperplethysmographie. Als Kontrollen dienten sowohl naive Mäuse, als auch Tiere, die dem LPS-Aerosol ausgesetzt wurden. Die Negativkontrollen zeigten über den Zeitverlauf der Metacholin-Provokation nur einen sehr schwachen Anstieg des Penh. Dagegen führte die LPS-Inhalation zu einem starken kontinuierlichen konzentrationsabhängigen Anstieg des Penh. Durch Vorbehandlung mit U0126 wiesen die Tiere deutlich niedrigere Penh-Werte auf als die Positivkontrollen, allerdings waren die Unterschiede nur für die niedrigen Konzentrationen von Metacholin (1 und 3mg/kg) und PBS signifikant (Abb.14) (p=0,024, p=0,026, p=0,021). Positivkontrolle U0126 Negativkontrolle 5 Penh 4 3 2 1 * * * l 50 m g/ m m g/ m l l ch M ch M ch M 30 10 m g/ m m g/ m l M ch 1 3 m g/ m PB S ch M Abbildung 14 l 0 Effekte von U0126 auf die Lungenfunktion Zunächst wurde Balb/c Mäusen 30 mg/kg U0126 i.p. injiziert und 2 h später wurden sie sowie Tiere der Positivkontrolle vernebeltem LPS ausgesetzt. Die Tiere der Negativkontrolle wurden nicht mit LPS behandelt. 2h nach der Inhalation erfolgte die Bestimmung der Lungenfunktion durch Ganzkörperplethysmographie. Dargestellt sind die Mittelwerte des Penh ± SEM von jeweils 3 Tieren/Gruppe. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Positivkontrolle und Verumgruppe ist durch *(p<0,05) gekennzeichnet. 3.2.2 Effekte anderer anti-inflammatorischer Substanzen 3.2.2.1 Vergleich von intra trachealer und intra peritonealer Gabe von Dexamethason Trotz der effizienten intra peritonealen Gabe von U0126, wurde in Vorversuchen zunächst die geeignete Applikationsroute für die prophylaktische Gabe des Glucocorticoids Dexamethason evaluiert. Balb/c Mäuse wurden 2h vor der LPS-Inhalation entweder mit 2,5mg/kg i.p. oder 1mg/kg i.t. behandelt. 24h später wurde nach Tötung der Tiere die der BAL gewonnen und Cytospins angefertigt. Nach 48 ERGEBNISSE Bestimmung der Gesamtzellzahl wurde deutlich, dass sich die prophylaktische intra tracheale Gabe von Dexamethason gegenüber der intra peritonealen Route als effektiver herausstellte. Die i.t. Applikation führte zu signifikant reduzierter Infiltration von Entzündungszellen in die BAL verglichen mit der Positivkontrolle (p=0,004) (Abb.15A). Hingegen konnte die i.p. Gabe von Dexamethason die Gesamtzellzahl nur in geringerem Ausmaß reduzieren. Die Auswertung der zellulären Zusammensetzung zeigte ein ähnliches Bild, durch die intra tracheale Gabe von Dexamethason waren signifikant reduzierte Neutrophilzahlen nachweisbar im Vergleich zu Positivkontrollen (p=0,003) (Abb.15B), die i.p. Gabe hingegen führte lediglich zu geringer Reduktion an infiltrierenden Granulozyten. Auch die Zahl der Makrophagen konnte durch die intra tracheale Behandlung in eindeutigerem Maße erniedrigt werden als es durch intra peritoneale Applikation möglich war. B A Positivkontrolle Dexamethason i.t. Dexamethason i.p. 5 Zellzahl [1x106] Gesamtzellzahl [1x10 6] 6 4 3 ** 2 1 0 Positivkontrolle Dexamethason i.t. Dexamethason i.p. Abbildung 15 4 ** 2 0.2 0.1 0.0 Neutrophile Makrophagen Lymphozyten Vergleich von i.t. und i.p. Applikation von Dexamethason Balb/c Mäuse wurden 2h vor LPS-Inhalation mit Dexamethason i.p. (2,5mg/kg) oder i.t. (1mg/kg) behandelt. 24h später wurden die Tiere getötet, die Lungen lavagiert und Gesamtzellzahl sowie differentielle Zellzusammensetzung detektiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ±SEM (n=3 Mäuse/Gruppe). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Positivkontrolle und i.t. Gabe von Dexamethason ist mit **(p<0,01) gekennzeichnet. 3.2.2.2 Prophylaktische und therapeutische Gabe von Dexamethason und Roscovitine In weiteren Versuchen wurde der Einfluss der prophylaktischen und der therapeutischen Gabe von anti-inflammatorischen Substanzen auf die akute LPS-induzierte Lungenschädigung untersucht. Nachdem für die prophylaktische i.t. Gabe von Dexamethason eine Reduktion der Zellzahl in der BAL nachgewiesen werden konnte, war nun von Interesse, ob dies auch bei therapeutischer Gabe der Fall ist. Darüber hinaus 49 ERGEBNISSE sollte der Effekt von Roscovitine (10mg/kg), einem spezifischen CDK-Inhibitor (cyclin-dependent kinase) sowohl bei prophylaktischer als auch bei therapeutischer Gabe evaluiert werden. Prophylaktische Applikation wurde als 2h vor der LPS-Inhalation, 6h nach der Exposition wurde als therapeutische Gabe festgelegt. Als Kontrolle wurde zu den jeweiligen Zeitpunkten PBS i.t. appliziert. 24h nach der LPS-Vernebelung wurden die Mäuse getötet, die BAL durchgeführt und die Gesamtzellzahl der Lavage bestimmt. Die Abbildung 17 zeigt, dass sowohl die prophylaktische als auch die therapeutische Gabe von Dexamethason die Zellzahl der BAL signifikant verringert. Bei prophylaktischer Gabe konnte die Zellzahl verglichen mit der PBS-Kontrolle (Positivkontrolle -2h) signifikant um 48% von 2,7 Millionen auf 1,4 Millionen gesenkt werden (p=0,027). Auch therapeutisch eingesetzt resultierte eine signifikante Reduktion der Zellzahl um 57% durch Dexamethason (p=0,008) im Vergleich zu Kontrollbedingungen (Positivkontrolle +6h). Bei Roscovitine zeigte sich ein differenzierteres Bild, die prophylaktische Gabe von Roscovitine führte zu keiner Veränderung der Zellzahl gegenüber der Positivkontrolle. Hingegen konnte nach therapeutischer Verabreichung von Roscovitine eine signifikante Reduktion der Zellzahl um 60% gegenüber Kontrollbedingungen (Positivkontrolle +6h) detektiert werden (p=0,023) (Abb.16). Gesamtzellzahl [1x106] 5 4 3 # ** * 2 1 Abbildung 16 +6 h R os c ov i tin e so n +6 h +6 h tiv ko Po si D ex a nt ro lle tin e ov i m et ha -2 h -2 on R os c m et ha s ex a D Po si tiv ko nt ro lle -2 h h 0 Prophylaktische und therapeutische Gabe von Dexamethason und Roscovitine Balb/c Mäuse wurden 2h vor der LPS Inhalation und 6h danach mit Dexamethason (1 mg/kg) oder Roscovitine (10 mg/kg) intra tracheal behandelt. Die Positivkontrollen wurden zu den jeweiligen Zeitpunkten mit PBS behandelt. Nach 24h erfolgten die Tötung sowie die BAL. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen und der jeweiligen Positivkontrolle des Zeitpunktes ist mit *(p<0,05), **(p<0,01) und #(p<0,05) gekennzeichnet. 50 ERGEBNISSE 3.2.3 Rolle der adaptiven Immunität bei der Pathogenese der COPD 3.2.3.1 Zeitkinetik der inflammatorischen Lungenschädigung anhand von Yeti Mäusen Um zu untersuchen, ob das Modell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung eine Th1-vermittelte Immunantwort der infiltrierenden Lymphozyten in die Lunge generiert, wurde das Modell an Yeti-Mäusen angewandt. Bei Yeti Mäusen (ein Akronym für yellow fluorescent protein-enhanced transcript for interferon-γ) handelt es sich um bizistronische IFN-γ Reporter Mäuse, die ein in vivo „Tracking“ auf Zellebene von IFN-γ-exprimierenden T-Zellen ohne in vitro Restimulation erlauben. Die Mäuse wurden jeweils 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet. Die Exposition von Yeti Mäusen gegenüber dem LPS Aerosol führte zu einem hoch signifikanten Einstrom von Entzündungszellen in die bronchoalveoläre Lavage, der zu den späteren Zeitpunkten hin schwächer wurde. 6h nach der LPS Inhalation war ein 21-facher Anstieg der Zellzahl von 0,15 Millionen Zellen der Negativkontrolle auf 3,15 Millionen Zellen festzustellen (p<0,0001). 24h nach der LPS-Exposition war ebenfalls eine signifikante Infiltration inflammatorischer Zellen detektierbar (p=0,0002). Tiere, die 72h nach der LPS-Inhalation getötet wurden, wiesen ebenfalls einen signifikanten Einstrom an Entzündungszellen auf, allerdings waren die Zellzahlen niedriger als zu den beiden früheren Zeitpunkten (p<0,0001) (Abb.17A). Die Untersuchung der zellulären Zusammensetzung der BAL ergab, dass nach 6h und 24h nach der LPS-Inhalation hauptsächlich neutrophile Granulozyten und nur wenige Monozyten und Lymphozyten in die Atemwege eingewandert sind. Die Lymphozyteneinwanderung nahm über den Zeitverlauf zu und erreichte 72h nach der LPS-Inhalation ihr Maximum (Abb.17B). 51 ERGEBNISSE B A *** 3 *** *** 2 1 Zellzahl [1x10 6] Zellzahl [1x10 6] 4 6 5 4 3 2 Negativkontrolle 6h 24h 72h 0.6 0.4 0.2 0.0 0 Negativkontrolle Abbildung 17 6h 24h Neutrophile 72h Monozyten Lymphozyten Zeitkinetik des LPS-Modells anhand von Yeti Mäusen Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und die Lungen wurden lavagiert. Die Gesamtzellzahlen (A) wurden bestimmt und differentielle Zellzahlbestimmungen anhand von Cytospins (B) durchgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen unbehandelten Mäusen und der Gruppe des Zeitpunktes ist mit ***(p<0,001) (n=12 Tiere/Gruppe) gekennzeichnet. Zur durchflusszytometrischen Differenzierung wurden neben fluoreszenzmarkierten α-CD3-Antikörpern auch α-CD4- und α-CD8-Antikörper eingesetzt, um IFN-γ-produzierende Zellen in der bronchoalveolären Lavage zu detektieren. Die Lymphozyteneinwanderung nahm über den Zeitverlauf hin zu und war nach 72h am meisten ausgeprägt. CD4+ T-Zellen waren zu allen Zeitpunkten zu annäherend gleichen Teilen IFN-γ produzierend, also IFN+, und IFN- (Abb.18A). CD8+ T-Zellen waren 6h und 24h nach der Inhalation ebenfalls zu annährend gleichen Anteilen IFN+ bzw. IFN-. Hingegen waren zum Zeitpunkt 72h eine deutlich größere Population von CD8+ Lymphozyten IFN-γ produzierend im Vergleich zu einer deutlich kleineren Zahl IFN-CD8+ T-Zellen (Abb.18B). 52 ERGEBNISSE A BAL CD3+/CD4+/IFN Zellzahl 30000 IFN+ IFN- 20000 10000 0 Neg.kontrolle 6h 24h 72h Neg.kontrolle 6h 24h 72h B BAL CD3+/CD8+/IFN Zellzahl 40000 30000 20000 10000 0 Abbildung 18 Mäusen Charakterisierung der Lymphozytenpopulation in der BAL anhand von Yeti Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und die Lungen wurden lavagiert. Die aus BAL gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 (A) bzw. α-CD3/ α-CD8 (B) differenziert. Im Anschluß erfolgte die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+ oder CD8+ Zellen mittels FACS-Analyse. Dargestellt sind die absolute Zellzahlen als Mittelwerte ± SEM (n=12 Tiere/Gruppe). Zur Bestimmung der vaskulären Hyperpermeabilität, als Marker für Lungenschädigungen, wurde im Überstand der bronchoalveolären Lavage der Albumingehalt bestimmt. LPS-Exposition führte zu einem signifikanten Anstieg der Albuminkonzentration in der BAL. Nach 6h konnte ein Maximum an Albumin detektiert werden im Vergleich zur Negativkontrolle (p= 0,007). Auch nach 24h konnten ebenfalls signifikant erhöhte Albuminkonzentration gemessen werden (p=0,003). Der Albumingehalt nahm im Zeitverlauf kontinuierlich ab, so dass sich die Level nach 72h im Vergleich zu den Werten der 6h-Gruppe annähernd halbiert hatten (p=0,01) (Abb.19). 53 ERGEBNISSE Albumin [µg/ml] 800 ** 600 ** 400 ** 200 0 Neg.kontrolle Abbildung 19 6h 24h 72h Albumingehalt im BAL Überstand von Yeti Mäusen im LPS-Modell Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und die Lungen wurden lavagiert. Im Überstand der Bal wurde mit Hilfe eines Bradford Assays der Albumingehalt bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (n=4 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen der jeweiligen Gruppe zur Negativkontrolle sind mit **(p<0,01) dargestellt. Zur Bestimmung der Aktivität der Myeloperoxidase im Lungengewebe wurden die Tiere zu den jeweiligen Zeitpunkten nach der LPS-Exposition getötet und ein kleiner rechter Lungenlappen entnommen. Die Inhalation von LPS führte zu einem signikikanten Anstieg der MPO-Aktivität in den 6h und 24h-Gruppen (p=0,021 und p=0,0003) (Abb.20). Die Aktivität der Myeloperoxidase nahm über den Zeitverlauf hin ab und erreichte nach 72h annähernd das Niveau der Negativkontrollen. 0.4 * OD[450nm] 0.3 *** 0.2 0.1 0.0 Neg.kontrolle Abbildung 20 6h 24h 72h Myeloperoxidase-Aktivität in Lungen von Yeti Mäusen nach LPS-Inhalation Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und jeweils ein kleiner Lungenlappen wurde entnommen. Unbehandelte Tiere fungierten als Negativkontrolle. Als Nachweisreaktion für die Aktivität der Myeloperoxidase wurde die Umsetzung von TMB und Wasserstoffperoxid verwendet und nach dem Abstoppen der Farbreaktion mit Phosphorsäure wurde die Absorption bei 450nm gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte der optischen Dichte ± SEM mit 5 Tieren pro Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen den LPS-behandelten Tieren und der Negativkontrolle sind mit *(p<0,05) oder ***(p<0,001) gekennzeichnet. Zur histologischen Untersuchung wurden die Lungen entweder nach 6h, 24h oder nach 72h fixiert und Paraffinschnitte wurden angefertigt. Die LPS-Inhalation führte zu einem 54 ERGEBNISSE signifikanten Einstrom von Entzündungszellen zu allen Zeitpunkten im Vergleich zu unbehandelten Tieren der Negativkontrolle (p<0,001) (Abb.21 und 22). Zu den beiden früheren Zeitpunkten 6 und 24 Stunden bestand das Infiltrat hauptsächlich aus Neutrophilen. Die semiquantitive Auswertung der Schnitte ergab, dass die Entzündung über den Zeitverlauf abnahm, während nach 6 und 24 Stunden (Abb.21B, C und 22) annähernd vergleichbare Entzündungszeichen nachweisbar waren, konnte 72h eine geringere Entzündungswertigkeit detektier werden (Abb.21D, 22). In Abbildung 21 sind repräsentative Lungenschnitte der jeweiligen Gruppen dargestellt. Abbildung 21 Histologische Untersuchung des Lungengewebes von Yeti-Mäusen 6h, 24h und 72h nach LPS-Inhalation Yeti Mäuse wurden 6h, 24h oder 72h nach der LPS Inhalation getötet und jeweils der linke Lungenlappen wurde entnommen. Die Negativkontrollen blieben unbehandelt. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Schnitte der Negativkontrolle (A), der 6h-Gruppe (B), der 24h-Gruppe(C) sowie ein Präparat der 72h-Gruppe (D) in jeweils 200-facher Vergrößerung. Der Maßstabsbalken entspricht 100µm. Die semiquantitative Auswertung der Entzündungswertigkeit ist in Abbildung 22 dargestellt. 55 ERGEBNISSE Entzündungsscore 4 *** *** 3 *** 2 1 0 Neg.kontrolle Abbildung 22 6h 24h 72h Quantifizierung der pulmonalen Entzündung von Yeti-Mäusen Die erhaltenen Lungenschnitte (repräsentative Exemplare in Abb.22 dargestellt) wurden lichtmikroskopisch mit Hilfe eines semiquantitativen Scores hinsichtlich ihrer Entzündungsquantität verblindet ausgewertet. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Entzündungskategorie (1 kaum Entzündung, 4 schwere Entzündung, siehe 2.2.7.6) (n=12). Statistische Signifikanzen zwischen den jeweiligen Zeitpunkten und Negativkontrolle sind mit ***(p<0,001) gekennzeichnet. 3.2.3.2 Βehandlung von Yeti-Mäusen mit α-IFN-γ- Antikörper Die Eigenschaft der Yeti Mäuse, dass eYEP (enhanced yellow fluorescent protein) nach Transkription und Sekretion von IFN-γ in den Zellen zurückbleibt, eröffnet die Möglichkeit einer Visualisierung der Immunantwort durch IFN-γ-produzierende Zellen. Durch die Applikation eines neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ konnte der Einfluss von IFN-γ auf die akute LPS-induzierte Lungenschädigung verfolgt werden. Die Mäuse wurden 24h vor der LPS-Exposition mit anti-Maus-IFN-γ-Antikörper oder anti-Maus-IgG1-Isotyp i.p. behandelt und 24h nach der Inhalation getötet, lavagiert und die Lungen wurden entnommen. Die Differenzierung der aus BAL und Lungengewebe gewonnenen Zellen erfolgte durch zweifache Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 oder α-CD3/ α-CD8 und anschließender durchflussztometrischer Analyse. Die Gesamtzellzahlen von BAL und Lunge sowie die zelluläre Zusammensetzung der Lavage sind in Abbildung 23 dargestellt. 56 ERGEBNISSE B A 50 Lunge Zellzahl [1x10 6] BAL Zellzahl [1x10 6] 4 3 2 1 40 30 20 10 0 0 Isotyp anti-IFN Isotyp anti-IFN C 4 Isotyp anti-IFN Zellzahl [1x10 6] 3 2 0.10 0.05 0.00 Neutrophile Abbildung 23 Makrophagen Lymphozyten Effekte der IFN-γ-Neutralisierung in Yeti-Mäusen 24h nach LPS-Inhalation Yeti-Mäuse wurden i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie -entnahme. Es erfolgten die Bestimmung der Gesamtzellzahl von BAL (A) und Lunge (B). Zusätzlich wurde die zelluläre Zusammensetzung der Lavageflüssigkeit durch mikroskopische Untersuchung von Cytospins analysiert (C). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für 3 Tiere pro Gruppe. Die Behandlung mit α-IFN-γ führte im Vergleich zur Isotypkontolle zu höheren Gesamtzellzahlen in der BAL (Abb.23A) sowie zu geringfügiger Zellzahlerhöhung in der Lunge, deren Unterschied allerdings keine Signifikanz erreichte (Abb.23B). Hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung der Lavage ergaben sich keine signifikanten Unterschieder der Zellzahlen von Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten nach Neutralisierung von IFN-γ im Vergleich zur Isotypkontrolle (Abb.23C) Abbildung 24 zeigt die quantitative Auswertung der durchflusszytometrischen Analyse von BAL und Lunge. Dargestellt sind CD4+ oder CD8+ T-Zellen im Lymphozyten-Gate (CD3+). 57 A B 20000 15000 BAL CD3+/CD8+/IFN+ Zellzahl BAL CD3+/CD4+/IFN+ Zellzahl ERGEBNISSE 15000 10000 5000 10000 5000 0 0 Isotyp anti-IFN 50000 Lunge CD3+/CD8+/IFN+ Zellzahl D Lunge CD3+/CD4+/IFN+ Zellzahl C 100000 80000 60000 40000 20000 0 anti-IFN Isotyp anti-IFN 40000 30000 20000 10000 0 Isotyp Abbildung 24 Isotyp anti-IFN Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisierung und 24h nach LPS-Exposition in Yeti-Mäusen Die aus BAL und Lungenverdau gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 bzw. α-CD3/ α-CD8 differenziert. Im Anschluß erfolgte die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+ oder CD8+ Zellen mittels FACS-Analyse. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der erhaltenen Zellzahlen (n=3 Mäuse/Gruppe). Die IFN-γ-Neutralisation führte zu keinen signifikanten Effekten hinsichtlich der CD4+ und CD8+ Zellzahlen in der BAL (Abb.24A, B). Auch in der Lunge resultierte die Behandlung mit α-IFN-γ zu keine signifikanten Veränderungen der CD4+/IFN+ Lymphozytenpopulation (Abb.24C). Betrachtete man sich hingegen die Population der CD8+IFN-γ-produzierenden Zellen, so fällt auf, dass die Neutralisierung von IFN-γ zu einer deutlicheren Reduktion der Zellzahl von ca. 32000 Zellen der Isotypkontrolle auf ca. 21000 führte. Vermutlich konnte aufgrund der niedrigen Tierzahl keine Signifikanz festgestellt werden (Abb.24D). 3.2.3.3 Neutralisation von IFN-γ mit Antikörpern in Balb/c Mäusen In weiteren Versuchen wurde die Neutralisierung von IFN-γ nun im Wildtypsystem an Balb/c Mäusen untersucht. Hierfür war nun eine Restimulation der Zellen aus BAL und Lungen ex vivo erforderlich. Die Tiere wurden 24h vor der LPS-Exposition mit 58 ERGEBNISSE anti-Maus-IFN-γ-Antikörper, anti-Maus-IgG1-Isotyp oder Vehikel (PBS) i.p. behandelt. 24h oder 72h nach der Inhalation wurden die Tiere getötet, lavagiert und die Lungen entnommen. Nach der Restimulation erfolgte die Oberflächenantigenfärbung mit α-CD3 und α-CD4 oder α-CD3 und α-CD8. Im Anschluß wurden die fixierten Zellen intrazellulär mit Streptavidin-konjugiertem α-IFN-Antikörper gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Tötung 24h nach LPS-Inhalation Betrachtete man sich zunächst die Gesamtzellzahlen 24h nach der LPS-Inhalation, so ließ sich feststellen, dass die LPS-Exposition zu einer hochsignifikanten Erhöhung der Zellzahl von unter 0,4 Millionen auf über 3,5 Millionen Zellen in der BAL führte, wie der Vergleich der unbehandelten Mäuse mit den LPS behandelten Tieren zeigte (p<0,0001). Die Behandlung mit dem neutralisierenden Antikörper führte nach 24h ebenfalls zu einem deutlichen Anstieg der Zellzahl in der BAL. Erwartungsgemäß resultierte die intra peritoneale der Isotyp-Kontrolle in einer mit der Positivkontrolle vergleichbaren Gesamtzellzahl (Abb.25A) Die LPS Inhalation führte nach 24h ebenfalls zu einem hochsignifikanten Anstieg der Zellzahlen in der Lunge, vergleicht man unbehandelte Mäuse mit den Positivkontrollen (p=0,0003). Die Gesamtzellzahlen der Lungen von Tieren, die mit α-IFN-γ-Antikörper oder mit der entspechenden Isotypkontrolle behandelt wurden, unterscheiden sich nicht von den LPS-Kontrollen (Abb.25B). 59 ERGEBNISSE B A 20 Gesamtzellzahl [1x10 6] Gesamtzellzahl [1x10 6] 6 *** 4 2 *** 15 10 5 0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN *** Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp * anti-IFN Isotyp 0.3 0.2 0.1 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp 1.0 MPO Aktivität [%] Zellzahl [1x10 6] Negativkontrolle Positivkontrolle D C 6 5 4 3 0.4 0 Isotyp 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 Neutrophile Abbildung 25 Makrophagen Lymphozyten Effekte der IFN-γ-Neutralisation 24h nach der LPS-Inhalation Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie -entnahme. Es erfolgten die Bestimmung der Gesamtzellzahl von BAL (A) und Lunge (B), sowie die Bestimmung der Myeloperoxidaseaktivität in der Lunge (D). Zusätzlich wurde die zelluläre Zusammensetzung der Lavageflüssigkeit durch mikroskopische Untersuchung von Cytospins analysiert (C). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für 8 Tiere pro Gruppe. Signifikante Unterschiede zwischen der Gesamtzellzahl bzw. eines bestimmten Zelltyp zwischen LPSund Negativkontrolle sind mit * (p<0,05) *** (p<0,001) gekennzeichnet. Hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung der BAL ließen sich ähnliche Verhältnisse wie bei der Gesamtzellzahl der Lavage feststellen. Da das Infiltrat 24h nach der LPS-Inhalation hauptsächlich aus neutrophilen Granulozyten besteht, bildeten diese die zahlenmäßig umfassendste Gruppe. LPS-exponierte Tiere wiesen signifikant höhere Neutrophilzahlen als unbehandelte Tiere auf (p=0,002) (Abb.25C). Verglichen mit der Positivkontrolle fanden sich in der BAL der mit α-IFN-γ-Antikörper behandelten Tiere signifikant höhere Neutrophilzahlen (p=0,037) (Abb.25C). Hinsichtlich der Makrophagenzahl ließen sich keine wesentlichen Unterschiede konstatieren. Auch hinsichtlich der Lymphozyten bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen Kontrollen und Verumgruppe. Die Aktivität der Myeloperoxidase in der Lunge wird als Marker der in vivo-Aktivierung von neutrophilen Granulozyten gewertet. Die Datenlage korrelierte allerdings nicht mit den Ergebnissen, die die quantitativen Auswertung der Gesamtzellzahl und differentielle Zellzahlen ergaben (Abb.25D). 60 ERGEBNISSE Die durchflusszytometrische Analyse der zweifachen Oberflächenfärbung und intrazellulären Färbung detektierte die IFN-γ Produktion von CD4+ und CD8+ Zellen A B 20000 10000 BAL CD3+/CD8+/IFN+ Zellzahl BAL CD3+/CD4+/IFN+ Zellzahl sowohl in der bronchoalveolären Lavage als auch im Lungengewebe. 15000 10000 5000 0 6000 4000 2000 0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp D C 0.15 Lunge CD3+/CD8+/IFN+ Zellzahl [1x10 6] 2.0 Lunge CD3+/CD4+/IFN+ Zellzahl [1x10 6] 8000 1.5 1.0 0.5 0.10 ** 0.05 0.00 0.0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Abbildung 26 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisation und 24h nach LPS-Exposition Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie –entnahme. Die aus BAL und Lungenverdau gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 bzw. α-CD3/ α-CD8 differenziert. Nach der Fixierung erfolgte im Anschluß die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+ oder CD8+ Zellen durch intrazelluläre Färbung mit α-IFN-γ. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der erhaltenen Zellzahlen (n=6 Mäuse/Gruppe): Statistische signifikante Unterschiede zwischen Behandlung mit α-IFN-γ und Positiv- bzw. Isotypkontrollen ist mit **(p<0,01) gekennzeichnet. Die Abbildung 26 zeigt die quantitative Auswertung der FACS Analyse. Dargestellt sind jeweils CD4+/IFN+ und CD8+/IFN+ Zellen im Lymphozyten-Gate (CD3+). In der BAL konnten nach LPS-Stimulation sowohl eine erhöhte Anzahl von CD4+ als auch CD8+ IFN-γ-produzierende Zellen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen nachgewiesen werden (Abb.26A, B). Die Applikation des neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ führte 24h nach der LPS-Expostion zu einer geringen Abnahme der CD4+/IFN+ Zellen und zu einer deutlicheren Abnahme der CD8+/IFN+ Zellen in der BAL. Allerdings erreichten die Unterschiede zur Positivkontrolle bei beiden Färbungen keine Signifikanz. 61 ERGEBNISSE Bei Betrachtung der Isotypkontrolle konnte festgestellt werden, dass in der BAL keine Unterschiede zur Positivkontrolle bezüglich der CD4+/IFN+ Zellen bestanden. Im Lungengewebe konnten die Applikation von IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern bzw. die Gabe von Isotypen keine Veränderungen der Anzahl von CD4+/IFN+ Lymphozyten bewirken. Die Zellzahlen entsprachen annähernd jenen der Positivkontrolle (Abb.26C). Die Zellzahl der IFN-γ-produzierenden CD8+ Lymphozyten konnte hingegen durch die Applikation des neutralisierenden Antikörpers 24h vor der LPS-Inhalation gegenüber der LPS-Kontrolle signifikant verringert werden (p=0,0067) (Abb.26D). Verglich man diesen Wert mit der Isotypkontrolle, so errreichte auch hier der Unterschied eine Signifikanz (p=0,0028), so dass falsch positive Ergebnisse ausgeschlossen werden konnten. Die Abbildung 27 zeigt repräsentative histologische Präparate der Lungen. Die Inflammation wurde mit Hilfe eines Scores in verblindeter Manier quantitativ ermittelt. Tiere der Negativkontrolle zeigten eine weitgehend normale Lungenstruktur, während bei Tieren die LPS exponiert wurden, deutliche Infiltration polymorphnukleärer Zellen sowie Anzeichen pulmonaler Entzündung vorlagen (Abb.27A, B). Interessanterweise wiesen die Schnitte von Lungen der Tiere, die mit dem neutralisierenden Antikörper behandelt wurden geringere Entzündungszeichen auf. Es konnte in diesen Präparaten im Vergleich zu LPS-Kontroll-Tieren ein signifikant reduziertes Ausmaß der Infiltration von Entzündungszellen, ödematösen Veränderungen der Alveolarwände sowie verringerte Schwellung der alveolärer Epithelzellen detektiert werden (Abb.27B, C; Abb.28A,) (p=0,025), die sich in insgesamt geringeren Entzündungsscores äußerten. Die Isotypkontrollen hingegen wiesen ähnlich wie die LPS-Kontrollen deutliche Anzeichen einer pulmonalen Inflammation auf, was sich in einer entsprechend hohen Einordnung in die Entzündungswertigkeit widerspiegelte. Im Vergleich zwischen Verumtieren und Isotypkontrollen zeigte sich der Unterschied dieser Wertigkeit als signifikant (p= 0,005) (Abb.27C, D; Abb.28A). 62 ERGEBNISSE Abbildung 27 Histologische Untersuchung des Lungengewebes Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenentnahme. Die Negativkontrollen blieben unbehandelt. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Schnitte der Negativkontrolle (A), Positivkontrolle (B), der mit α-IFN-γ-behandelten Tiere (C) sowie ein Präparat der Isotypkontrolle (D) in jeweils 200-facher Vergrößerung. Der Maßstabsbalken entspricht 100µm. Die Untersuchung von Albuminspiegeln im Überstand der BAL ergab ein ähnliches Bild (Abb.28B). LPS-Exposition von Vehikel-behandelten und Isotyp-behandelten Tieren führte verglichen mit Negativkontrollen zu einem beträchtlichen Anstieg der Albuminkonzentration (Abb.28B). Durch die Applikation von IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern konnte die Albuminkonzentration leicht gesenkt werden, als Anzeichen für geringere vaskuläre Permeabilität, wenn auch der Unterschied keine Signifikanz erreichte. 63 ERGEBNISSE * ** 1000 Albumin [µg/ml] Entzündungsscore 4 3 2 1 0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp 800 600 400 200 0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Abbildung 28 Veränderungen der Lungenhistologie und der Albuminspiegel in der BAL nach IFN-γ-Neutralisierung 24h nach der LPS-Inhalation Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 24h später erfolgte die Lungenlavage sowie –entnahme. (A) Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die quantitative Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch unter Zuhilfenahme eines Scores nach Myou. (B) Im zellfreien Überstand der BAL wurde mittels eines Bradford-Assays der Albumingehalt bestimmt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte ± SEM (A: n= 8 Tiere/Gruppe; B: n= 6 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen sind mit *(p<0,05) und **(p<0,01) gekennzeichnet. Tötung 72h nach LPS-Inhalation Wurden die Mäuse 72h nach der LPS-Exposition getötet, so ließen sich deutlich niedrigere Gesamtzellzahlen in der BAL detektieren als 24h nach der Inhalation. Die Vernebelung von LPS führte zu einem Anstieg der Gesamtzellzahl in der BAL auf 1,8 Millionen Zellen gegenüber 0,24 Millionen Zellen der unbehandelten Tiere. Durch die i.p. Behandlung mit neutralisierenden α-IFN-γ-Antikörpern konnte die Einwanderung von Entzündungszellen in die BAL signifikant auf 1,3 Millionen Zellen reduziert werden (p=0,003) (Abb.29A). Die Behandlung mit der Isotypkontrolle ergab ähnliche Zellzahlen wie die Positivkontrolle. Auch in der Lunge waren 72h nach LPS-Inhalation deutlich weniger Zellen nachweisbar als 24h nach der Exposition. Die Verneblung von LPS resultierte in einer leichten Erhöhung der Zellzahlen der Positivkontrollen im Vergleich zu unbehandelten Negativkontrollen (Abb.29B). Die Behandlung mit α-IFN-γ-Antikörpern führte zu keiner Veränderung der Lungenzellzahl, die Applikation der Isotypkontrolle resultierte einer leichten Erhöhung der Zellzahl gegenüber der LPS-Kontrollen, deren Unterschied allerdings keine statistische Signifikanz erreichte. Gegenüber der Behandlung mit α-IFN-γ-Antikörpern zeigte sich hingegen die Erhöhung als signifikant (p=0,042). 64 A B 2.5 20 Lunge Zellzahl [1x10 6] BAL Zellzahl [1x10 6] ERGEBNISSE 2.0 ** 1.5 1.0 0.5 0.0 * 15 10 5 0 Negativkontrolle Positivkontrolle Abbildung 29 anti-IFN Isotyp Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Effekte der IFN-γ-Neutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenlavage sowie -entnahme. Es erfolgten die Bestimmung der Gesamtzellzahl von BAL (A) und Lunge (B). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (n=8 Tiere/Gruppe). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Positivkontrollen und α-IFN-γ-behandelten Tieren (A) bzw. zwischen Isotypkontrollen und α-IFN-γ-behandelten Tieren (B) ist mit *(p<0,05) und **(p<0,01) gekennzeichnet. Abbildung 30 zeigt die zelluläre Zusammensetzung der BAL. Verglichen mit naiven Tieren erfolgte nach LPS-Exposition ein Anstieg an Neutrophilen von ca. 0,003 Millionen auf 0,92 Millionen. Durch die Applikation des neutralisierenden Antikörpers gegen IFN-γ konnte die Zahl der neutrophilen Granulozyten im Infiltrat signifikant auf 0,62 Millionen Zellen gesenkt werden (Abb.30A) (p=0,009). Die Behandlung der Mäuse mit der IgG1-Kontrolle hingegen führte zu keiner Änderungen der Zellzahl gegenüber den Positivkontrollen. Während Lymphozyten 24h nach LPSExposition eine eher untergeordnete Rolle spielten, sind nach 72h Stunden merklich Lymphozyten in der BAL nachweisbar. Im Vergleich zu unbehandelten Tieren konnte ein deutlicher Anstieg auf 0,14 Millionen Zellen nach LPS-Inhalation verzeichnet werden. Die vorherige Behandlung der Tiere mit α-IFN-γ erwies sich als effizient die Zahlen an infiltrierenden Lymphozyten gegenüber der LPS-Kontrolle hochsignifikant zu reduzieren (Abb.30B) (p<0.0001). Auch hinsichtlich der Lymphozytenzahl wiesen die Isotypkontrollen mit den Positivkontrollen vergleichbare Zahlen auf. Auch die Zahl an Makrophagen in der BAL konnte durch die Behandlung mit α-IFN-γ gegenüber den LPS-Kontrollen signifikant reduziert werden (p=0,012) (Abb.30C). Die Makrophagenzahl der IgG1-Kontrollen unterschied sich nicht merklich von jener der LPS-Kontrollen. 65 ERGEBNISSE ** 0.5 0.0 Makrophagen Zellzahl [1x10 6] Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp 0.20 0.15 0.10 *** 0.05 0.00 C D 1.0 0.5 0.8 0.6 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotypkontrolle 0.4 * OD[450nm] Neutrophile Zellzahl [1x10 6] 1.0 Lymphoyzten Zellzahl [1x10 6] B A 1.5 0.4 0.2 0.3 0.2 0.1 0.0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp 0.0 Abbildung 30 Zelluläre Zusammensetzung der BAL und Myeloperoxidaseaktivität 72h nach der LPS-Inhalation Die zelluläre Zusammensetzung der Lavageflüssigkeit wurde 72h nach der LPS-Exposition durch mikroskopische Untersuchung von Cytospins analysiert. Die Zellzahl von Neutrophilen (A), Lymphozyten (B) und Makrophagen wurde durch Auszählung von mindestens 400 Zellen/Tier bestimmt. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der Myeloperoxidaseaktivität in der Lunge (D). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für 8 Tiere pro Gruppe. Signifikante Unterschiede eines bestimmten Zelltyp zwischen LPS-Kontrollen und α-IFN-γ-behandelten Tieren sind mit*(p<0,05), **(p<0,01) und *** (p<0,001) gekennzeichnet. In Korrelation zu reduzierten Neutrophilenzahlen in der BAL nach α-IFN-γ-Behandlung zeigte sich auch eine verringerte Myeloperoxidaseaktivität im Vergleich zu Positivkontrollen (Abb.30D), allerdings statistisch nicht signifikant. Abbildung 31 zeigt die quantitative Auswertung der Durchflusszytometrie. 66 ERGEBNISSE A B 4000 BAL CD3+/CD8+/IFN+ Zellzahl BAL CD3+/CD4+/IFN+ Zellzahl 15000 10000 * 5000 2000 *** 1000 0 0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Negativkontrolle Positivkontrolle Isotyp C D 0.8 0.20 Lunge CD3+/CD8+/IFN+ Zellzahl [1x10 6] Lunge CD3+/CD4+/IFN+ Zellzahl [1x10 6] 3000 0.6 0.4 ** 0.2 0.0 anti-IFN Isotyp 0.15 0.10 ** ** 0.05 0.00 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Abbildung 31 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisierung und 72h nach LPS-Exposition Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenlavage sowie –entnahme. Die aus BAL und Lungenverdau gewonnenen Zellen wurden durch Oberflächenfärbung mit α-CD3/ α-CD4 bzw. α-CD3/ α-CD8 differenziert. Nach der Fixierung erfolgte im Anschluß die Detektion von IFN-γ-produzierenden CD4+ oder CD8+ Zellen durch intrazelluläre Färbung mit α-IFN-γ. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der erhaltenen Zellzahlen (n=7 (C,D) oder n=8 (A.,B) Mäuse/Gruppe): Statistische signifikante Unterschiede zwischen Behandlung mit α-IFN-γ und Positivkontrollen sind mit *(p<0,05), **(p<0,01) und *** (p<0,001) gekennzeichnet. Nach Restimulation ex vivo erfolgte zunächst die zweifache Oberflächenfärbung und nach Fixierung der Zellen der BAL und Lunge, die intrazelluläre Färbung von IFN-γ sowie die anschließende FACS-Analyse. Dargestellt sind jeweils dreifach positive Zellen, d.h. CD4+/IFN-γ+ und CD8+/IFN-γ+ im Lymphozyten-Gate (CD3+). In der BAL konnten nach LPS-Exposition eine deutlich höhere Zahl an CD4+ und CD8+ IFN-γproduzierenden Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Tieren nachgewiesen werden. Die Applikation der IFN-γ-neutralisierenden Antikörpers 24h vor der LPS-Inhalation führte zu signifikant reduzierten Mengen CD4+ IFN-γ-produzierenden Zellen (p=0,017) (Abb.31A) und darüber hinaus zu einer hochsignifikanten Reduktion von einwandernden CD8+ IFN-γ-produzierenden Zellen in die BAL (p=0,0003) (Abb.31B). Falsch positive Ergebnisse konnten bei beiden Färbungen ausgeschlossen werden, da die Applikation des Isotypes IgG1 keine signifikanten Unterschiede zu Positivkontrollbedingungen ergab. 67 ERGEBNISSE Auch im Lungengewebe zeigte sich die Neutralisierung von IFN-γ als hocheffizient. Die durchflusszytometrische Analyse CD4+ IFN-γ-produzierenden detektierte Zellen nach signifikant Applikation geringere von α-IFN-γ Zahlen an gegenüber LPS-Kontrollen (p= 0,003) (Abb.31C). Darüber hinaus waren im Lungengewebe auch signifikant reduzierte CD8+/IFN-γ+ Zellzahlen nach IFN-γ Neutralisierung nachweisbar (p=0,008) (Abb.31D). Verglich man die Werte der Isotyp- und der Positivkontrollen so zeigten sich bei beiden Färbungen in der Lunge nur leichte Unterschiede, die keine Signifikanz erreichten, so dass auch hier falsch positive Ergebnisse ausgeschlossen werden konnten. Als Marker für eine vaskuläre Permeabilitätserhöhung wurde der Albumingehalt im Überstand der BAL gemessen. LPS-Exposition führte zu einer Erhöhung der Albuminspiegel verglichen mit unbehandelten Negativkontrollen (Abb.32). Durch Behandlung der Mäuse mit IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern waren gegenüber Kontrollbedingungen hochsignifikant reduzierte Albuminkonzentrationen in der BAL detektierbar (p=0,0002) (Abb.32). Hingegen zeigte die Behandlung mit der IgG1-Kontrolle keinen präventiven Effekt auf die Lungenschädigung, die nachgewiesenen Albuminspiegel entsprachen im Ausmaß jenen der Positivkontrolle Albumin [µg/ml] 800 600 *** 400 200 0 Negativkontrolle Positivkontrolle anti-IFN Isotyp Abbildung 32 Veränderungen des Albuminspiegel in der BAL nach IFN-γ-Neutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenlavage. Im zellfreien Überstand der BAL wurde mittels eines Bradford-Assays der Albumingehalt bestimmt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte ± SEM (n= 6 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen zwischen α-IFN-γ-Behandlung und Positivkontrollen sind mit ***(p<0,001) gekennzeichnet Analog zu den Untersuchungen 24h nach LPS-Vernebelung wurden auch nach 72h histologische Analysen der Lunge durchgeführt, um die Effekte der IFN-γ Neutralisierung auf die Inflammation zu evaluieren. Die Entzündung wurde auch hier 68 ERGEBNISSE mittles eines semiquantitativen Scores nach Myou quantifiziert. Abbildung 33 zeigt die in verblindeter Weise ermittelte Entzündungswertigkeit. Tiere der Negativkontrollen wiesen eine weitgehend normale Lungenstruktur ohne Entzündungszeichen auf, während LPS-Exposition der Tiere zu deutlichen Anzeichen pulmonaler Inflammation führte (Abb.34A, B). Die Lungenschnitte zeigten massiven Einstrom inflammatorischer Zellen, ödematöse Veränderungen der Alveolarwände sowie Schwellung alveolärer Epithelzellen. Dies führte zur Einordnung in eine höher Entzündungswertigkeit der Positivkontrollen im Vergleich zu den naiven Tieren (Abb.33). Hingegen fielen bei Betrachtung der Präparate der mit α-IFN-γ-behandelten Mäuse deutlich weniger Anzeichen einer pulmonalen Entzündung und ein signifikant reduzierter Influx an inflammatorischen Zellen auf (Abb.34C). Dies äußerte sich dementsprechend in der Einordnung in eine signifikant niedrigere Entzündungswertigkeit (p=0,002) (Abb.33). Die Isotypkontrollen hingegen wiesen ähnlich wie die LPS-Kontrollen deutliche Anzeichen einer pulmonalen Inflammation auf (Abb.33, Abb.34D). Entzündungsscore 4 ** 3 2 1 0 Negativkontrolle Positivkontrolle Abbildung 33 anti-IFN Isotyp Semiquantitative Auswertung der Lungenhistologie nach IFN-γ Neutralisierung .Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenentnahme. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die quantitative Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch unter Zuhilfenahme eines Scores nach Myou. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte ± SEM (n= 8 Tiere/Gruppe). Statistische Signifikanzen zwischen α-IFN-γ-Behandlung und Positivkontrollen sind mit **(p<0,01) gekennzeichnet 69 ERGEBNISSE Abbildung 34 Histologische Untersuchung des Lungengewebes 72h nach LPS-Inhalation Zunächst wurden männliche Balb/c Mäuse i.p. mit α-IFN-γ oder IgG1-Isotypkontrolle behandelt. 24h später wurden die Tiere vernebeltem LPS exponiert und weitere 72h später erfolgte die Lungenentnahme. Die Negativkontrollen blieben unbehandelt. Die Lungen wurden in 4% Histofix fixiert, paraffiniert, 4µm dicke Schnitte angefertigt und mit H&E angefärbt. Die Abbildung zeigt repräsentative Schnitte der Negativkontrolle (A), Positivkontrolle (B), der mit α-IFN-γ-behandelten Tiere (C) sowie ein Präparat der Isotypkontrolle (D) in jeweils 200-facher Vergrößerung. Der Maßstabsbalken entspricht 100µm. 70 DISKUSSION 4 Diskussion Trotz der enormen globalen Auswirkungen von COPD existieren keine medikamentösen Therapiemöglichkeiten, für die ein Aufhalten der Progression oder eine Reduktion der Mortalität gezeigt werden konnte. In den letzten Jahren waren, im Vergleich zu den beachtlichen Fortschritten im Asthma Management, nur sehr wenige therapeutische Innovationen zur Behandlung von COPD zu verzeichnen. Rationale Therapien hängen von der Aufklärung an der Inflammation beteiligter zellulärer und molekularer Mechanismen ab. Die pathophysiologischen Vorgänge bei COPD sind allerdings nicht vollends bekannt und da zahlreiche verschiedene Zelltypen, wie Neutrophile, T-Zellen und Makrophagen, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von COPD spielen, ist es nötig ihre konkrete Rolle zu definieren (Barnes 2004). Beispielsweise werden sowohl neutrophile Granulozyten und deren Serinproteasen als Mediatoren der Zigarettenrauchinduzierten Lungenschädigung diskutiert, kontrovers dazu wird diese Aufgabe durch andere Studien Makrophagen und MMP zu geschrieben (Hill et al. 2000). Darüber hinaus ist die Rolle der Lymphozyten in der Pathogenese von COPD nach wie vor unklar. Während eine Korrelation des Schweregrades der Erkrankung mit der Zahl an T-Zellen in emphysematösen Lungen beschrieben ist, bleibt der endgültige Stimulus der T-Zell-Aktivierung und Rekrutierung fragwürdig (Finkelstein et al. 1995). In Anbetracht mangelnder Therapiemöglichkeiten wurden in der vorliegenden Arbeit mögliche pharmakotherapeutische Ansätze auf ihre Wirksamkeit anhand eines Tiermodells der LPS-induzierten Lungenschädigung geprüft. Im Speziellen lag der Fokus auf Effekten von U0126, einem MAP Kinase Inhibitor, Dexamethason und Roscovitine, einem CDK-Inhibitor, auf die pulmonale Entzündung. Des Weiteren sollte die Rolle der adaptiven Immunität in der Pathogenese von COPD durch Neutralisierung von IFN-γ geklärt werden. 4.1 Wirkungen des MEK1/2-Inhibitors U0126 in vitro Auf der Suche nach anti-inflammatorischen Wirkstoffen mit neuartigen Wirkmechanismen wurde die niedermolekulare Substanz U0126 entdeckt. Für U0126 konnte initial ein funktioneller Antagonismus der transkriptionellen Aktivität des 71 DISKUSSION Transkriptionsfaktors AP-1 nachgewiesen werden. Später wurde gezeigt, dass via nicht-kompetetiver Inhibition der dual-spezifischen Kinasen MEK1 und MEK2 die Phosphorylierung von ERK blockiert wird (Favata et al. 1998). U0126 inhibiert MEK1/2 direkt durch Blockade der katalytischen Aktivität des aktiven Enzyms. Abbildung 35 Chemische Struktur von U0126 MEK1/2 ist die vorgeschaltete MAP Kinase Kinase der ERK MAP Kinase in der ERK-Signaltransduktionskaskade, die ERK mittels Phosphorylierung aktiviert. Verschiedene extrazelluläre Stimuli, wie Wachstumsfaktoren und inflammatorische Zytokine und verschiedene Stresssignale aktivieren die drei MAP Kinase Signalwege ERK, p38 und JNK. Durch Phosphorylierung verschiedener Transkriptionsfaktoren sowie Regulation der Zytokinproduktion spielt die aktivierte ERK MAPK eine wichtige Rolle im Entzündungsprozess (Cobb und Goldsmith 1995). Studien konnten belegen, dass die Stimulation mit dem Phorbolester TPA in humanen Zelllinien zu einer Aktivierung der ERK und p38 MAP Kinasen führt (Franklin und Kraft 1997; Katsuyama et al. 2001). In humanen Primärzellen konnten ähnliche Ergebnisse festgestellt werden, nach der Stimulation mit TPA wurden durchflusszytometrisch hohe Mengen phosphorylierter und aktivierter ERK und p38 MAPK detektiert. Der Inhibitor U0126 blockierte selektiv MEK1/2 und inhibierte die Aktivierung von ERK, nicht jedoch von p38 MAPK. Diese Spezifität des Inhibitors wurde auch durch zahlreiche andere Studien bestätigt (Favata et al. 1998; Scherle et al. 1998; Davies et al. 2000). Das pro-inflammatorische Zytokin TNF-α verfügt über ein breites Spektrum an entzündlichen Effekten, die für COPD relevant sind. Es konnte gezeigt werden, dass die Produktion von TNF-α in LPS-stimulierten Monozyten von MAP Kinasen abhängig ist und durch spezifische ERK und p38 MAPK Inhibitoren blockiert werden kann (Foey et al. 1998). Dies konnte in dieser Arbeit in isolierten humanen PBMCs bestätigt werden. Der MEK1/2 Inhibitor U0126 war in der Lage, die Zytokinproduktion von TNF-α 72 DISKUSSION dosis-abhängig zu inhibieren. Der errechnete IC50 Wert von 0,21µM bestätigte Ergebnisse einer früheren Studie, in der ebenfalls die TNF-α Produktion in Monozyten mittels U0126 inhibiert wurde (Scherle et al. 1998). Interleukin-2 wird von CD4+ Lymphozyten produziert und ist lokaler Wachstumsfaktor für T-Zellen, da es autokrin aktivierend wirkt. Für die vollständige Aktivierung von CD4+ Zellen ist eine Kostimulation nötig. CD28 ist ein gut charakterisierter Kostimulator und ist konstitutiv auf der T Zell-Oberfläche exprimiert. Die Expression von IL-2 in isolierten humanen Blutlymphozyten wurde durch Kostimulation mit α-CD3/CD28 rasch induziert. In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass durch Kostimulation mit CD28 die ERK MAP Kinase aktiviert und die IL-2 Produktion hochreguliert werden kann (Schneider et al. 1995; Schaeffer und Weber 1999; Kogkopoulou et al. 2006). In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe (Chialda et al. 2005) konnte durch Blockade von ERK mit dem MEKInhibitor U0126 die IL-2-Induktion dosis-abhängig mit einem IC50-Wert von 0,9µM gehemmt werden. In Korrelation mit zahlreichen anderen Studien zeigen diese Ergebnisse die hohe Affinität und Spezifität von U0126 für MEK1/2 im Vergleich zu anderen Kinasen. Die zelluläre Wirksamkeit des Inhibitors auf die Induktion der Zytokine TNF-α und IL-2 in vitro in humanen PBMCs zeigt ein anti-entzündliches Potential für die Substanz an. Diese Daten waren der Anlass mögliche anti-inflammatorische Effekte in vivo in einem Mausmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung zu evaluieren. 4.2 U0126 reduziert LPS-induzierte Lungenschädigung in vivo Nach der Inhibition der Aktivierung von ERK in vitro war von Interesse, ob der Inhibitor U0126 eine Wirkung in einem in vivo Modell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung aufwies. Dieses Modell ist geeignet, um die akuten Entzündungsprozesse der Lunge zu untersuchen, die zu Beginn der Erkrankung und während akuter Exazerbationen von COPD auftreten. Mäuse wurden vernebeltem LPS, das als bioaktiver Bestandteil im Zigarettenrauch enthalten ist, exponiert. Diese lokale Art der Applikation wurde gewählt, da eine systemische Administration eine Endotoxinämie und Symptome eines septischen Schocks zur Folge hat. 73 DISKUSSION Zur Aufklärung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen der Erkrankung sind Tiermodelle von COPD von großer Bedeutung. Darüber hinaus sind sie auch ideal zur Entwicklung neuer spezifischer Therapeutika geeignet. Es existieren eine Vielzahl an Tiermodellen von COPD (beschrieben in Kapitel 1.4), die charakteristische Merkmale der Erkrankung, wie Inflammation und Obstruktion der Atemwege sowie Emphysembildung, imitieren. Der MAP Kinase Signaltransduktionskaskade wird eine große Bedeutung in der Pathogenese der akuten LPS-induzierten Lungenentzündung zugeschrieben. Kürzlich konnte eine Reihe von Studien zeigen, dass p38 MAPK eine bedeutende Rolle bei der LPS-induzierten Lungenschädigung spielt. Durch pharmakologische p38 MAPK Inhibition mit SB203580 konnte die pulmonale inflammatorische Reaktion signifikant reduziert werden. Darüber hinaus konnten Zytokin- und Chemokinproduktion sowie die Aktivierung von NF-κB inhibiert werden (Liu et al. 2008). Ähnliche Resultate lieferten Untersuchungen mit Compound 37, einem spezifischen p38 α, β Inhibitor, dessen Applikation dosis-abhängig die LPS-induzierte Bronchokonstriktion und die Rekrutierung von Neutrophilen in das Lungengewebe und den bronchoalveolären Raum reduzierte. Des Weiteren konnten die TNF-Induktion und TNF-Signale blockiert werden (Schnyder-Candrian et al. 2005). Diese Ergebnisse deuten auf eine Beteiligung von p38 MAPK an der Vermittlung von pulmonaler Neutrophilie, Induktion der Zytokin- und Chemokinproduktion sowie bronchialer Obstruktion hin. Die Bedeutung der ERK MAPK hingegen ist weitestgehend unklar. In einem Asthma-Modell in IL-13-überexprimierenden Mäusen reduzierte die Gabe eines weiteren MEK1/2 Inhibitors PD98059 die IL-13-induzierte pulmonale Inflammation, was eine Beteiligung des ERK-Signalweges implizierte (Lee et al. 2006). Duan und Mitarbeiter konnten zeigen, dass U0126 (ebenfalls in der Konzentration von 30mg/kg) anti-inflammatorische Effekte in einem Ovalbumin-induzierten Asthma-Modell aufwies (Duan et al. 2004). In dieser Arbeit sollte nun belegt werden, dass auch die ERK MAP Kinase an der Entstehung des LPS-induzierten Lungenschadens beteiligt ist und die Blockade durch U0126 anti-entzündliche Effekte aufweist. Es ist weit reichend belegt, dass die Applikation des potenten Stimulus LPS zu einer Entzündung der Atemwege, begleitet von inflammatorischem Zelleinstrom, führt. Die kurzfristige Exposition zu LPS ist mit einer rapiden Infiltration von neutrophilen 74 DISKUSSION Granulozyten assoziiert, die bis ca. 24h nach Provokation ihren Höhepunkt erreicht und 72h später deutlich abgeschwächt vorliegt (Vernooy et al. 2001). In Übereinstimmung mit diesen Resultaten induzierte die Inhalation von LPS einen massiven Einstrom inflammatorischer Immunzellen, primär Neutrophile, der 24h nach der Inhalation stark ausgeprägt war. Neutrophile Granulozyten bilden die erste Front an Entzündungszellen. Sie zirkulieren im Blut und wandern entlang eines Gradienten an Chemokinen gezielt in das entzündete Gewebe. Es ist bekannt, dass LPS die Produktion verschiedener inflammatorischer Zytokine und Chemokine induziert (Strieter et al. 1999). Im Zuge des Einstroms von Neutrophilen und Makrophagen nach LPS-Provokation konnte ein deutlicher Anstieg von TNF-α und den Chemokinen MIP-2 und KC in die bronchoalveoläre Lavage beobachtet werden. Dies spiegelt auch die klinische Situation wider, wo in bronchoalveolärer Lavage und Bronchialbiopsien von COPD Patienten Neutrophilie und erhöhte Spiegel inflammatorischer Zytokine und Chemokine, wie IL-8 und MCP-1 nachgewiesen werden (Chung 2001). Neben der Blockade der Phosphorylierung von ERK in humanen Primärzellen, konnte U0126 die Aktivierung von ERK MAPK auch in murinen Lungen signifikant inhibieren. Die Administration von U0126 reduzierte effektiv die inflammatorische Zellinfiltration in die bronchoalveoläre Lavage von LPS-exponierten Mäusen. Darüber hinaus führte die Inhibition von ERK MAPK zu einer verringerten Produktion des pro-inflammatorischen Zytokins TNF-α und den Chemokinen KC und MIP-2. Die aus der MEK1/2 Blockade resultierende Reduktion jener Chemokine könnte somit mutmaßlich zur verringerten Neutrophilie des Lungengewebes beitragen. Gleichzeitig mit erhöhtem Einstrom von Neutrophilen in die Lunge war eine erhöhte Aktivität der Myeloperoxidase im Lungengewebe nachweisbar. Eine Reihe von Studien zeigten, dass MPO eine wichtige Rolle im oxidativen antimikrobiellen System von neutrophilen Granulozyten spielt und dass eine Erhöhung der Konzentration von MPO in der BAL als Indikator der in vivo-Aktivierung von neutrophilen Granulozyten gewertet wird (Winterbourn et al. 2000; Klebanoff 2005). Durch die Behandlung mit U0126 konnte die MPO-Aktivität in Lungen von LPS-exponierten Mäusen deutlich reduziert werden. Dass die Blockade von ERK sowohl die Neutrophilie als auch die MPO-Aktivität in der Lunge reduzierte, bestätigt die Effizienz des eingesetzten Inhibitors. 75 DISKUSSION Eine Erhöhung der alveolären epithelialen Permeabilität ist ein charakteristisches Kennzeichen von verschiedenen Lungenerkrankungen, wie Asthma bronchiale oder COPD. LPS schädigt endotheliale und epitheliale Zellen und fördert die pulmonale Hyperpermeabilität (Li et al. 1998). Es konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion der Hyperpermeabilität der Lunge die akute Lungenschädigung mindern kann (Speyer et al. 2003). Albumin, als wichtigstes Plasmaprotein, ist normaler Bestandteil des Alveolarfilms und eine Erhöhung der Konzentration in der bronchoalveolären Lavage stellt einen Hinweis auf Schädigung der alveolo-endothelialen Barriere dar (Low et al. 1978). In dieser Arbeit führte die LPS-Inhalation von Mäusen zu erhöhten Albuminspiegeln in der BAL, was eine Schädigung des Endothels und Epithels indiziert. Durch die Gabe von U0126 konnten die durch LPS induzierten erhöhten Proteinkonzentrationen deutlich reduziert werden. So ist anzunehmen, dass die Reduktion der Hyperpermeabilität der Lunge zu den therapeutischen Effekten des Inhibitors beitragen könnte. Emphysematöse Veränderungen und die Zerstörung von parenchymalen Strukturen des Lungengewebes sind typische Kennzeichen von COPD. Diese morphologischen Veränderungen sind meist begleitet von einer massiven Infiltration von Immunzellen. Infolge chronischer Stimulation mit LPS handelt es sich hierbei um Makrophagen und Lymphozyten, akute Provokation mit LPS resultiert hingegen in der Einwanderung von Neutrophilen. Dies konnte durch unsere Ergebnisse bestätigt werden. Die histologische Analyse zeigte, dass sich nach der Applikation von U0126 die Lungenschädigung und Neutrophilie als deutlich reduziert darstellte. Dies bekräftigte die Resultate der bronchoalveolären Lavage und deutet darauf hin, dass die pulmonale Infiltration von neutrophilen Granulozyten von der ERK MAPK abhängig sein könnte. Der Verlust der Lungenfunktion ist ein charakteristisches Merkmal von COPD und die Spirometrie stellt ein wesentliches diagnostisches Verfahren dar. Es dient zur Erfassung des Schweregrades der Erkrankung und hilft so bei der Auswahl der Behandlungsoptionen. Da der FEV1 bei COPD im Zeitverlauf schneller abnimmt als bei gesunden Patienten, fungiert die Messung der Lungenfunktion als Monitor für die Progression der Erkrankung. Lefort und Kollegen zeigten, dass die Gabe von LPS in einem akuten Modell innerhalb von 2h eine rasche Bronchokonstriktion erzeugte, die nach ca. 5 Stunden zu einem basalen Niveau zurückkehrte. Zeitgleich wurde eine Hyperreaktivität des Bronchialsystems gegenüber Metacholin detektiert, in Korrelation 76 DISKUSSION mit submaximalen Neutrophilenzahlen in den Atemwegen. Nach 24h konnten maximale Zahlen an Neutrophilen nachgewiesen werden, allerdings zeigte der Atemwegswiderstand basale Werte (Lefort et al. 2001). In Korrelation mit diesen Erkenntnissen konnte eine Erhöhung des PenH Wertes 2h nach der Inhalation von LPS festgestellt werden. Durch die vorherige Gabe von U0126 konnte der Atemwegswiderstand gesenkt werden, also die Lungenfunktion verbessert werden. Zusammenfassend zeigt dieser Teil der Arbeit, dass der ERK MAPK Signalweg eine entscheidende Rolle bei der LPS-induzierten Lungenschädigung spielt. Es konnte gezeigt werden, dass die Blockade von ERK durch den MEK/2 Inhibitor U0126 den Lungenschaden signifikant reduzierte. Vermutlich wird dieser anti-inflammatorische Effekt von U0126 sowohl durch reduzierte Neutrophilie und Hyperpermeabilität, als auch durch verringerte Zytokin-und Chemokinspiegel vermittelt. Da einige p38 MAPK Inhibitoren (SB-242235, RWJ-67657 und VX-745) bereits in klinischen Studien zur Behandlung anderer inflammatorischer Erkrankungen untersucht werden, könnte, in Anbetracht fehlender effektiver Pharmakotherapeutika, die ERK Inhibition eine mögliche neue alternative Therapieoption für COPD darstellen. 4.3 Wirkungen von Roscovitine und Dexamethason auf die akute LPS-induzierte Lungenschädigung Im Vergleich zu akuten entzündlichen Prozessen sind chronische Entzündungen, wie bei COPD vorliegend, nicht selbst auflösbar. Ein pharmakotherapeutisches Ziel ist es, nicht nur anti-inflammatorisch einzugreifen, sondern auch aktiv die Auflösung der Entzündung zu fördern. Hierzu wurden das Glucocorticoid Dexamethason und der CDK-Inhibitor Roscovitine auf ihre therapeutische Wirkung im LPS-Modell untersucht. Glucocorticoide sind nicht in der Lage die chronische Inflammation von COPD zu unterdrücken und gelten, durch diese so genannte Steroidresistenz, nicht als Mittel der ersten Wahl. Allerdings sind Glucocorticoide neben ihrer grundsätzlichen hohen anti-inflammatorischen Potenz auch potenziell auflösungsfördernd. 77 DISKUSSION In einem Rattenmodell der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung konnte gezeigt werden, dass durch die Applikation des Glucocorticoids Budesonid die zelluläre Infiltration inhibiert werden konnte (Birrell et al. 2005). Ähnliche Ergebnisse ergab auch diese Arbeit, da sowohl durch die prophylaktische als auch die therapeutische Gabe von Dexamethason die pulmonale inflammatorische Reaktion und Neutrophilie infolge LPS-Exposition inhibiert werden konnte. Glucocorticoide vermitteln einerseits ihre anti-entzündlichen Wirkungen über die Transrepression NF-κB-abhängiger pro-inflammatorischer Targetgene, darunter auch pro-inflammatorische Zytokine, Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmoleküle. Darüber hinaus induzieren Glucocorticoide eine Erhöhung der Phagozytoseleistung von apoptotischen Neutrophilen durch Makrophagen, erhöhen allerdings gleichzeitig die Lebensdauer von Neutrophilen. Hingegen vermitteln Glucocorticoide neuesten Erkenntnissen zufolge eine Induktion der Expression von Annexin 1 und dessen Rezeptor (AXLR), der auch als Rezeptor für das auflösungsförderne LXA4 fungiert. Die Folgen erhöhter Annexin 1-Produktion sind reduzierte neutrophile Transmigration, Erhöhung neutrophiler Apoptoseraten und Förderung der Phagozytose (Perretti und D'Acquisto 2009). Dies gibt eine mögliche Erklärung der auflösungsfördernden Eigenschaften und der im LPS-Modell beobachteten anti-inflammatorischen Effekte von Dexamethason. CDK-Inhibitoren induzierten die Apoptose von inflammatorischen Zellen und fördern somit die Resolution der Entzündung. Vermutlich wird dies durch eine „Downregulation“ von Mcl-1 vermittelt, ein Schlüsselprotein, das Apoptose-regulierend (u.a. von Neutrophilen) wirkt (Raje et al. 2005). Die therapeutische Applikation von Roscovitine führte zu einer Reduktion des inflammatorischen Zelleinstroms in die BAL, nicht jedoch die prophylaktische Gabe. In Korrelation mit diesen Ergebnissen, wurde am Modell der Bleomycin-induzierten Lungenschädigung gezeigt, dass die Gabe von Roscovitine zum Zeitpunkt maximaler Entzündung diese reduzierte und die Auflösung der Inflammation förderte (Rossi et al. 2006). So ist anzunehmen, dass nur die therapeutische Gabe von Roscovitine zu einer Modulation der Apoptose von neutrophilen Granulozyten führt, somit die inflammatorischen Reaktion im LPS-Modell reduziert und letztlich die Resolution der Entzündung fördert. Einige CDK-Inhibitoren befinden sich bereits in klinischer Prüfung zur Behandlung von Prostata- und Lungenkrebs (Senderowicz 2003). Sie besitzen darüber hinaus Potential als alternative Therapie von Erkrankungen, die mit erhöhter oder persistierender 78 DISKUSSION inflammatorischer Immunantwort assoziiert sind, wie beispielsweise COPD, Einsatz zu finden. 4.4 Die pathogenetische Rolle der adaptiven Immunität bei COPD 4.4.1 Charakterisierung der inflammatorischen Reaktion infolge LPS-Exposition Tabak- und Zigarettenrauch, die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von COPD, enthalten hohe Mengen des potenten inflammatorischen Stimulus LPS (Hasday et al. 1999). Es ist bekannt, dass die Inhalation von LPS eine akute und chronische Entzündung, begleitet von inflammatorischem Zelleinstrom und der Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen, verursacht (Brass et al. 2003). Die LPS-Exposition über einen längeren Zeitraum führt zu einem Einstrom von Makrophagen und CD8+ Lymphozyten in die peripheren Atemwege, die kurzfristige Exposition hingegen zum Einstrom von Neutrophilen und Makrophagen (Vernooy et al. 2002). In Übereinstimmung mit der Literatur (Ferretti et al. 2003) führte die Exposition von Yeti-Mäusen gegenüber einem LPS-Aerosol zu einem deutlichen Einstrom von Immunzellen in die BAL, dessen Höhepunkt sechs Stunden nach der LPS Provokation erreicht war, gefolgt von einem zweiten „Peak“, der 24 Stunden später detektiert werden konnte. Das zelluläre Infiltrat bestand zu den beiden frühen Zeitpunkten hauptsächlich aus neutrophilen Granulozyten, während 72 Stunden nach der Inhalation ein deutlicher Einstrom an Lymphozyten messbar war. Zeitgleich mit der erhöhten neutrophilen Infiltration der frühen Zeitpunkte war eine Zunahme der Myeloperoxidase-Aktivität in der Lunge nachweisbar, als Marker für die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten (Klebanoff 2005). Auch die schädigende Wirkung von LPS auf die alveolo-endotheliale Barriere konnte in Abhängigkeit der Zeit bestätigt werden. Erhöhte Albuminkonzentrationen in der BAL infolge LPS-Inhalation waren zu allen Zeitpunkten nachweisbar, zeigten sich jedoch über die Zeit hinweg als kontinuierlich abnehmend. Die aktive Teilnahme von T-Zellen an der inflammatorischen Reaktion in den Atemwegen ist hinreichend belegt. Im Lungenparenchym von COPD Patienten konnten 79 DISKUSSION erhöhte Mengen von CD4+ und CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden, mit einer Dominanz der CD8+ Lymphozyten (Saetta et al. 1998). Grumelli und Mitarbeiter konnten nachweisen, dass jene CD4+ und CD8+ Zellen scheinbar vollständig aktiviert sind, in gleicher Art und Weise wie dies nach Antigenpräsentation der Fall ist (Grumelli et al. 2004). Die T-Lymphozyten zeigen überwiegend ein T Helfer 1 (Th1)/ zytotoxisches T 1 (Tc1) Muster mit verstärkter IFN-γ Produktion. Ebenso wiesen Panzner und Mitarbeiter eine gesteigerte IFN-γ Sekretion in Bronchialbiopsien von COPD - Patienten nach (Panzner et al. 2003). Bizistronische IFN-γ-eYFP Reporter Mäuse (Yeti), welche die direkte Identifizierung von vitalen IFN-γ exprimierenden Zellen ermöglichen, wiesen 72 Stunden nach der LPS-Inhalation maximale Lymphozyteninfiltration in die BAL auf. Die Lymphozytenpopulation bestand aus CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen. Ein überwiegender Anteil der CD8+ Lymphozyten konnte als eYFP+ respektive als IFN-γ-produzierend detektiert werden, was eine Th1-Immunantwort bei der LPS-induzierten Lungenschädigung implizierte. Dies korreliert mit der kürzlich erwiesenen gesteigerten IFN-γ-Geninduktion bei COPD und bestätigt somit ein Th1-Paradigma der beteiligten T-Zellen (Di Stefano et al. 2004). 4.4.2 IFN-γ-Neutralisation reduziert LPS-induzierten Lungenschaden Die Rolle von IFN-γ bei inflammatorischen Prozessen in der Lunge ist nicht vollständig geklärt. IFN-γ ist ein charakteristisches Zytokin der Typ 1 Immunantwort und CD8+ Lymphoyzten sind neben CD4+ T-Zellen die hauptsächliche Quelle, aber auch natürliche Killerzellen und Makrophagen sind in der Lage IFN-γ zu produzieren. Neben seiner antiviralen Aktivität ist IFN-γ eng mit der Induktion der Apoptose von Makrophagen und T-Zellen assoziiert (Dalton et al. 1993; Farrar und Schreiber 1993). Darüber hinaus induziert IFN-γ andere Zytokine und deren Rezeptoren, die mit immunmodulatorischen und pro-inflammatorischen Prozessen assoziiert sind, wie TNF-α, IP-10 oder RANTES (Boehm et al. 1997; Schroder et al. 2004). Die Inhalation von LPS von Yeti Mäusen resultierte in einer Infiltration von eYFP+ CD8+ Lymphozyten in die BAL, was gleichzeitig mit einer erhöhten Lungenschädigung assoziiert war. Durch die Neutralisation von IFN-γ sollte evaluiert 80 DISKUSSION werden, ob und inwiefern IFN-γ bei der LPS-induzierten Lungenschädigung eine kausale Rolle spielt. Der Einsatz von IFN-γ-neutralisierenden Antikörpern erfolgte bereits zur Untersuchung diverser Tiermodelle in verschiedenen Studien. Beispielsweise konnte durch die Gabe von α-IFN-γ die Hypoxie-induzierte Lungenschädigung im Tiermodell reduziert werden (Yamada et al. 2004). Auch die Mortalität des septischen Schockes infolge Endotoxinämie konnte durch die Neutralisation von IFN-γ reduziert werden (Heinzel 1990). Eine regulatorische Rolle für IFN-γ für die inflammatorische Reaktion des unteren Respirationstraktes infolge LPS-Exposition wurde kürzlich demonstriert. Die Inhalation von LPS führte in IFN-γ-defizienten Mäusen zu einer reduzierten Einwanderung von PMN (Burch et al. 2006). Dies korreliert mit den Ergebnissen der IFN-γ-Neutralisation. Die Applikation von neutralisierenden Antikörpern hemmte den inflammatorischen Zelleinstrom in die BAL und das Lungengewebe 72 Stunden nach der LPS-Exposition. Die Behandlung reduzierte die Infiltration neutrophiler Granulozyten in die bronchoalveoläre Lavage. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass in humanen Neutrophilen IFN-γ die Expression von TLR4, einem essentiellen Rezeptor für das LPS Signaling, erhöht (Pearl-Yafe et al. 2007). Dieser Prozess ist gefolgt von gesteigerter Zytokinproduktion sowie Phagozytoseaktivität und somit wird durch IFN-γ die neutrophile Immunantwort infolge LPS-Provokation gefördert. In Korrelation mit den Ergebnissen der IFN-γ-Neutralisation ist anzunehmen, dass IFN-γ ein wichtiger Regulator des angeborenen Immunsystems, womöglich durch die Beteiligung an der Rekrutierung von Neutrophilen ist und somit eine entscheidende Rolle in der akuten LPS-induzierten Lungenschädigung spielen könnte. Zahlreiche Studien konnten in Bronchialbiopsien von Rauchern mit oder ohne COPD eine gesteigerte Expression von T-Lymphozyten und erhöhte Zahlen aktivierter Makrophagen nachweisen (Di Stefano et al. 2001; Saetta et al. 2001; Saetta et al. 2002). Es ist anzunehmen, dass neben der Modulation der T-Zell-Rezeptor-Expression und T-Zell-Aktivierung, die vermehrte Anwesenheit von IFN-γ+ Zellen womöglich eine Rolle in der Immunmodulation von Makrophagenfunktionen bei COPD spielt. IFN-γ aktiviert ruhende Makrophagen und induziert die Synthese einer Reihe von Rezeptoren für Pathogenbindung, katabolischer Enzyme, Transkriptionsfaktoren und Zytokine, die Teil des angeborenen Immunsystems sind (Gallin et al. 1995). Jene 81 DISKUSSION immunmodulatorische Rolle beinhaltet darüber hinaus die Aktivierung von Phagozyten und vermehrte Rekrutierung von aktivierten Makrophagen (Antoniou et al. 2003). Während akuter Exazerbationen können aktivierte Makrophagen durch Freisetzung von IL-12 T-Zellen und Makrophagen stimulieren, was letztlich wiederum zu einer Erhöhung der IFN-γ-Expression führt. LPS Inhalation führte zu vermehrter Infiltration von Makrophagen und Lymphozyten in die BAL. Die Applikation von α-IFN-γ reduzierte die Zahl der Makrophagen und CD4+ und CD8+ Lymphozyten in BAL und Lungengewebe. Durch die Regulation bzw. Unterdrückung der modulatorischen Aktivität von IFN-γ könnte somit die lokale Inflammation, vermutlich durch verringerte Rekrutierung von Makrophagen und Unterdrückung der T-Zell-Antwort, reduziert werden. Finkelstein beschrieb sowohl eine Korrelation zwischen pulmonaler Zerstörung und Anzahl der T-Lymphozyten bei Rauchern, als auch eine verstärkte pulmonale Schädigung, die mit erhöhten Zahlen von Alveolarmakrophagen assoziiert war (Finkelstein et al. 1995). Emphysematöse Veränderungen und Zerstörung von Lungenparenchym, verbunden mit inflammatorischer Zellinfiltration sind typische Charakteristika von COPD. Emphysembildung und andere pathologische Veränderungen der Lunge stehen in kausalem Zusammenhang mit der lokalen Entzündung (Hogg et al. 2004; Donaldson et al. 2005). Die Überexpression von IFN-γ verursachte in Mäusen Emphysembildung mit Vergrößerung der Alveolen und einhergehender makrophagozytärer und neutrophiler Inflammation sowie Expression von MMP (Wang et al. 2000). Die Neutralisation von IFN-γ mit monoklonalen Antikörpern reduzierte die durch LPS induzierte pulmonale Inflammation und den inflammatorischen Zelleinstrom, so dass histologisch geringere Entzündungszeichen nachweisbar waren. Diese Ergebnisse könnten, im Zusammenhang mit der reduzierten Zellinfiltration in der BAL, für eine bedeutende regulative Rolle des pro-inflammatorischen Zytokins IFN-γ bei der LPS-induzierten Lungenschädigung sprechen. Neben reduzierter pulmonaler Entzündung konnte durch die Applikation von neutralisierenden Antikörpern gegen IFN-γ die vaskuläre Hyperpermeabilität 72h nach LPS-Exposition reduziert werden. Die durch LPS-Inhalation induzierte Schädigung der alveolo-endothelialen Barriere führte zu einer Permeabilitätserhöhung und zum Übertritt von Albumin in die BAL. Dieser Effekt konnte durch die Gabe von α-IFN-γ gehemmt 82 DISKUSSION werden, was vermutlich zu den anti-inflammatorischen Wirkungen der Neutralisation von IFN-γ bei der LPS-induzierten Lungenschädigung beiträgt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass IFN-γ eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von COPD zuteil wird. Die Neutralisation von IFN-γ durch monoklonale Antikörper konnte die durch LPS induzierte Lungenschädigung reduzieren. Vermittelt wurde dieser anti-inflammatorische Effekt mutmaßlich durch eine Reduktion des Neutrophilen- und Makrophageneinstroms. Inadäquat erhöhte membranolytische CD8+ T-Zellen sowie eine verringerte CD4+/CD8+ Ratio in den Lungen von COPD Patienten sind zahlreich belegt. Eine Studie von Enelow demonstrierte, dass die Aktivierung und Akkumulation von CD8+ T-Zellen aus der Stimulation durch ein „Auto-Antigen“, verursacht vermutlich durch das Rauchen, resultiert und eine direkte Lungenschädigung die Folge ist (Enelow et al. 1998). Die Neutralisation von IFN-γ senkte die Zahl der CD8+ Lymphozyten, woraus letztlich vermutlich auch eine verminderte pulmonale Inflammation infolge LPS-Exposition resultierte. Möglicherweise wird durch die Neutralisation von IFN-γ die abnormale inflammatorische Reaktion des unteren Respirationstraktes positiv auf ein nicht-entzündliches Niveau herunterreguliert. Allerdings ist die inadäquate Reaktion der Lungen bei COPD vermutlich multifaktoriell bedingt und weiterführende Untersuchungen sind nötig, um die Interaktionen von Mediatoren und inflammatorischen Mechanismen zu beleuchten. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen der Neutralisation von IFN-γ ein mögliches Potenzial zur Behandlung von COPD. Die Neutralisation von Zytokinen gilt als ein vielversprechender Ansatz zu Behandlung von COPD. Monoklonale Antikörper gegen TNF-α werden beispielsweise bereits erfolgreich zur Behandlung anderer inflammatorischer Erkrankungen, wie Rheumatoider Arthritis eingesetzt und der Einsatz bei COPD und Asthma Patienten ist derzeit in klinischer Prüfung (Yamagata und Ichinose 2006). 83 LITERATURVERZEICHNIS 5 Literaturverzeichnis Antoniou, K. M., E. Ferdoutsis and D. Bouros (2003). "Interferons and their application in the diseases of the lung." Chest 123(1): 209-16. Bannenberg, G., M. Arita and C. N. Serhan (2007). "Endogenous receptor agonists: resolving inflammation." ScientificWorldJournal 7: 1440-62. Barker, D. J., K. M. Godfrey, C. Fall, C. Osmond, P. D. Winter and S. O. Shaheen (1991). "Relation of birth weight and childhood respiratory infection to adult lung function and death from chronic obstructive airways disease." Bmj 303(6804): 671-5. Barnes, P. J. (2000). "Chronic obstructive pulmonary disease." N Engl J Med 343(4): 269-80. Barnes, P. J. (2004). "Small airways in COPD." 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Chest 125(2): 626-32. 96 ANHANG 6 Anhang 6.1 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Pathogenese der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung .........................7 Abbildung 2 MAPK-Signaltransduktionskaskaden..............................................................16 Abbildung 3 Zeitkinetik der IL-2 Expression........................................................................36 Abbildung 4 Blockade der ERK Aktivierung durch U0126 .................................................37 Abbildung 5 Konzentrationsabhängigkeit von U0126 auf Zytokininhibition in humanen PBMC.................................................................................................39 Abbildung 6 Detektion von phosphorylierter p44/42 MAPK mittels SandwichELISA .................................................................................................................40 Abbildung 7 U0126 reduziert zelluläre Infiltration in die BAL ...........................................41 Abbildung 8 Einfluss von U0126 auf die Aktivität der Myeloperoxidase ...........................42 Abbildung 9 Dosisabhängigkeit des inhibitorischen Potentials von U0126.........................43 Abbildung 10 Effekt von U0126 auf Zytokin- und Chemokinlevel in der BAL ...................44 Abbildung 11 Histologische Untersuchung der Lunge ...........................................................45 Abbildung 12 Quantifizierung der pulmonalen Entzündung.................................................46 Abbildung 13 Einfluss von U0126 auf die Albuminspiegel in der BAL.................................47 Abbildung 14 Effekte von U0126 auf die Lungenfunktion .....................................................48 Abbildung 15 Vergleich von i.t. und i.p. Applikation von Dexamethason ............................49 Abbildung 16 Prophylaktische und therapeutische Gabe von Dexamethason und Roscovitine..........................................................................................................50 Abbildung 17 Zeitkinetik des LPS-Modells anhand von Yeti Mäusen..................................52 Abbildung 18 Charakterisierung der Lymphozytenpopulation in der BAL anhand von Yeti Mäusen.................................................................................................53 Abbildung 19 Albumingehalt im BAL Überstand von Yeti Mäusen im LPS-Modell ..........54 Abbildung 20 Myeloperoxidase-Aktivität in Lungen von Yeti Mäusen nach LPSInhalation............................................................................................................54 Abbildung 21 Histologische Untersuchung des Lungengewebes von Yeti-Mäusen 6h, 24h und 72h nach LPS-Inhalation ....................................................................55 Abbildung 22 Quantifizierung der pulmonalen Entzündung von Yeti-Mäusen...................56 Abbildung 23 Effekte der IFN-γ-Neutralisierung in Yeti-Mäusen 24h nach LPSInhalation............................................................................................................57 Abbildung 24 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisierung und 24h nach LPSExposition in Yeti-Mäusen ................................................................................58 Abbildung 25 Effekte der IFN-γ-Neutralisation 24h nach der LPS-Inhalation ...................60 97 ANHANG Abbildung 26 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisation und 24h nach LPSExposition ...........................................................................................................61 Abbildung 27 Histologische Untersuchung des Lungengewebes ...........................................63 Abbildung 28 Veränderungen der Lungenhistologie und der Albuminspiegel in der BAL nach IFN-γ-Neutralisierung 24h nach der LPS-Inhalation...................64 Abbildung 29 Effekte der IFN-γ-Neutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation .................65 Abbildung 30 Zelluläre Zusammensetzung der BAL und Myeloperoxidaseaktivität 72h nach der LPS-Inhalation ............................................................................66 Abbildung 31 Durchflusszytometrische Analysen von CD4+ und CD8+ Zellen aus BAL und Lunge nach IFN-γ-Neutralisierung und 72h nach LPSExposition ...........................................................................................................67 Abbildung 32 Veränderungen des Albuminspiegel in der BAL nach IFN-γNeutralisierung 72h nach der LPS-Inhalation ................................................68 Abbildung 33 Semiquantitative Auswertung der Lungenhistologie nach IFN-γ Neutralisierung...................................................................................................69 Abbildung 34 Histologische Untersuchung des Lungengewebes 72h nach LPSInhalation............................................................................................................70 Abbildung 35 Chemische Struktur von U0126........................................................................72 98 ANHANG 6.2 Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen.....................................................vi Tabelle 2 Substanzen ..........................................................................................................24 Tabelle 3 Verbrauchsmaterialien ......................................................................................24 Tabelle 4 Verwendete Primer ............................................................................................24 Tabelle 5 Verwendete Antikörper .....................................................................................25 Tabelle 6 Käuflich erworbene Systeme.............................................................................25 Tabelle 7 Geräte und Software..........................................................................................26 99 VERÖFFENTLICHUNGEN 7 Veröffentlichungen Schuh K., Pahl A. Inhibition of the MAP kinase ERK protects from lipopolysaccharideinduced lung injury; Biochemical Pharmacology, akzeptiert Februar 2009 Schuh K, Pahl.A, Gessner A. Lipopolysaccharide induced lung inflammation is inhibited by neutralisation of IFN-γ, in Vorbereitung. 100 VERÖFFENTLICHUNGEN 101