FRUCTOSE-1.6-BISPHOSPHATE ALDOLASE - ETH E

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Diss. ETH No. 10092
THE STRUCTURE DETERMINATION OF
FRUCTOSE-1.6-BISPHOSPHATE
FROM DROSOPHILA
A
ALDOLASE
MELANOGASTER AT 1.9
crystallographic study
molecular
dynamics
Academic dissertation
(EC 4.1.2.13)
A RESOLUTION
and
simulations
submitted
to
the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY
ZÜRICH
for the
degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
GERKO HESTER
Drs.
(chemistry)
University
of
Groningen
The Netherlands
born October 3, 1963
citizen
accepted
of The
Netherlands
the recommendation of
on
Prof. Dr. K.H. Winterhalter, examiner
Prof. Dr. W.F.
Dr. K.
van
Gunsteren, co-examiner
Piontek, co-examiner
Zürich
1993
4
Summary
Fructose-1,6-bisphosphate
glycolytic
(FBP)
catalyzing
enzyme
fructose-1,6-bisphosphate
of
158
Each
kDa.
4.1.2.13)
aldol
reversible
homotetramer
This
comprises
subunit
is
a
of
cleavage
dihydroxyacetone phosphate
to
glyceraldehyde-3-phosphate.
weight
(EC
aldolase
the
has
D-
and
molecular
a
single polypeptide
a
chain of 360 amino acids.
In
this
work
of
crystals
previously
collected
diffraction
Drosophila
aldolase,
sofar
the
native
separate batches,
together
to
dataset
a
method
replacement
employing the
post processed and
were
known
applied
structure of
differences
also
from
could be
the
with
the
last
positions
while
in
squares
residues
three
was
the
the
first
method
three
an
In
investigate
order
to
simulations
Initially,
as
a
The
simulated
final
model
Â. Except
4.0 to 2.5
was
refinement
refinement
density map
of fourfold real space
into
built
of
the
this
atomic
annealing approach
the
restrained
least
comprises
all
molecular
dynamics
amino
R-factor of 17.9%.
were
simulated:
the
of
rounds
used.
was
electron
complete model
a
map.
performed applying
last
acids and has
were
of
phase extension from
improved electron density
aldolase
problematic parts
although
structure
quality
crystal structure,
density map showed unambiguous
considerably improved by application
averaging combined
for
original
The
present.
were
molecular
The
FBP
rabbit muscle
search model. The initial electron
in
merged and scaled
the
solve
to
the
only processed
 resolution.
1.9
to
up
was
of
data
one
1-phosphate (F1P)
substrate
performed.
binding
Two
enzyme-substrate
complexes
complex of Drosophila aldolase with fructose-
and
one
complex
Drosophila
of
aldolase
with
fructose-1,6-bisphosphate (FBP).
The
shows
present analysis
represents
aldolase.
structure
a
that
homotetramer of
However,
it
could
might represent
a
the
one
not
mixture
determined
of the
be
isozymes
excluded
of five
crystal
of
that
possible
structure
Drosophila
the
crystal
tetramer
types
5
differing
terminal
The
in
the
residue
The
isomerase.
of
analysis
aldolase-substrate
possible hinge
helix
fourth
basically has the
structure
phosphate
helices.
the
from
position
the
C-
end.
solved
triose
at
type
might
the
X-ray
complexes
its
at
be
However
catalysis together
with
the
fold
as
are
three
that
it
giving
for
closing
flexible
and
structure
suggests
N-terminus
responsible
same
there
the
C-terminal
enzyme
extra
the
has
flexibility.
active
a-
simulated
helix
one
intrinsic
the
site
a
This
during
arm.
The crystal structure of Drosophila aldolase shows the presence of
interactions
strong
hydrophobic
has
been
identified
particular
offset
between
interactions
residue
stacked
at
one
being
as
the
along
a
interaction
cis-proline.
a
subunit
subunits
subunit
interface
between
is
with
dominating
interface.
The
Proline
158
of
this
presence
allow
to
necessary
an
tyrosines of neighbouring
two
subunits.
We postulate
(1) lysines
three
(3) lysine
and
phosphate binding sites
107 and
41
146 and
which
binds both
results
of
the
of
Two
proposed
the
regions
active
terminal
are
site
Drosophila
which
is
arm
41
is
extra
not
is
to
phosphate groups of
influence substrate
second
its
flexibility
cleavage
formed
suited
for
FBP
and
and
the
confirm
F1P.
compared
specificity. One
to
binding
which
region
FBP/F1P.
by
42 and 303
separate binding site.
dynamics simulations
better
of
a
aldolase for FBP
the
specificity through
the reversible
as
molecular
higher specificity
aldolase
arginine 148, (2) arginines
therefore should be considered
The
in
FBP.
The
discriminating
Histidine 361
and either the
glutamic
acid
transfer
during
intermediate
189
are
substrate
possibly directly
influences
The
active site
residue
lysine
the
two
to
Tyrosine
be
363
directly involved
is
an
substrates.
Ci-phosphate group of the substrate
postulated
catalysis.
states.
between
C-
affects
present in vertebrate liver aldolases which might be
factor
is
proposed
to
in
or
proton
stabilize
6
Zusammenfassung
Fruktose-1,6-bisphosphat
glykolytisches
Glyceraldehyd-3-phosphat
Molekulargewicht
die
Dieses
katalysiert.
von
ist
4.1.2.13)
Spaltung
reversible
Dihydroxyacetonphosphat
in
Fruktose-1,6-bisphosphat
einem
(EC
Aldolase
welches
Enzym
und
D-
Homotetramer,
mit
kDA, besteht
158
ein
von
vier
aus
chemisch
äquivalenten Untereinheiten. Jede Untereinheit enthält eine einzelne
Polypetidkette
In der
von
360 Aminosäuren.
vorliegenden Arbeit,
Röntgendaten
der
prozessiert
als
kompletten
Datensatz
skaliert.
Teile,
bis
Fruktose-1,6-bisphosphat
Suchmodell
verwendet
Startphasen
wurde
welche
eindeutige
Suchmodell
wurde.
eine
Elektronendichteverteilung
ursprünglichen
den
in
drei
die
Anfänglich
drei
Methode
vorhanden
des
konnte
die
durch
in
der
Qualität
der
Mittelung
von
Untereinheiten
wurde
Methode
vollständiges
ein
Elektronendichtekarte
annealing"
Modells
Verfeinerungsrunden
eingesetzt wurde.
ursprünglichen
mit
4,0 auf 2,5 Â kombiniert. Abgesehen
Das
Substratbindungsstellen
molekulardynamische Simulationen
Substratkomplexe wurden simuliert:
während
von
zu
atomare
für
die
in
den
squares"
Modell
enthält
17.9%.
identifizieren,
durchgeführt.
ein
least
von
werden.
gebaut
"restrained
endgültige
der
atomares
Methode
verwendet,
die
alle Aminosäuren und hat einen R-Wert
Um
konnte
als
berechnet,
Stellen
Die
waren.
Diese
"simulated
atomaren
dem
nichtkristallographischen
Aminosäuren
die
Muskel
resultierenden
problematische
auch
werden.
verbesserte
wurde
Verfeinerung
letzten
vier
der Phasen von
letzten
Modell
der
verbessert
Ausdehnung
Vergleich
zu
und
des
Struktur der
bekannte
daraus
nur
einem
Methode
Elektronendichtekarte
im
Elektronendichtekarte
Elektronendichte
die
Kaninchen
den
Mit
erste
obwohl
die
aus
zu
zusamengefasst
wurde
wobei
Aldolase
Unterschiede
zeigte,
wesentlich
 Auflösung
1.9
angewandt,
Ersatzes
vermessenen
und
prozessiert
post
Kristallstrukturbestimmung
Zur
molekularen
einzelne
die bereits früher
wurden
Drosophila Aldolasekristalle, bisher
nativen
Komplex
Zwei
mit
wurden
Enzym-
Fruktose-1-
7
phosphat
und
(F1P)
ein
Fruktose-1,6-bisphosphat
mit
Komplex
(FBP).
gelöste
Die
bestehend
Kristallstruktur
Homotetramer,
ein
repräsentiert
einem der
Aldolase. Es kann
der
Isozyme
Drosophila
jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die Kristallstruktur ein
Gemisch
in
aus
fünf
von
möglichen Tetramertypen repräsentiert, die sich
der viertletzten
Aminosäure
unterscheiden.
Die Struktur hat im Wesentlichen die
Triosephosphatisomerase,
Strukturelementen.
sich
Untersuchungen
dem
an
Strukturelemente,
N-terminalen
ein
zusätzlichen
drei
darauf
lässt
befindet
und
der
schliessen,
dieser
einer
Ende,
"Scharnier"
helikalen
Kristallstruktur
der
Aldolase-Substratkomplexe
"simulierten"
dass
jedoch
gleiche Faltung wie das Enzym
mit
helikalen
welches
erhöhte
Flexibilität
Die
ermöglicht.
Analyse der Kristallstruktur
die
Wechselwirkungen
der
Kontaktstellen,
Prolin158
wird.
Anwesenheit
der
Kontaktstellen
verschiedene
Drei
cis-Prolin
entlang einer
zwei
Untereinheiten
identifiziert
Aminosäurerestes,
Untereinheiten,
zwischen
107 und 146 und
Die
einer
der
an
eine
ermöglicht
aromatische
sich
welche
Tyrosinen,
werden.
in
zwei
befinden.
welches
41
zu
(1)
Arginin 148, (2) Arginine 42 und 303 und (3)
Molekulardynamische
Spezifität
die
Simulationen
Drosophila
von
Bereiche
welche
Phosphatgruppen von FBP bindet
Bindungsstelle angenommen wurde.
beiden
deshalb als eine seperate
Zwei
Untereinheiten,
Phosphatbindungsstellen wurden für Aldolasen postuliert:
Lysine
Lysin
ein
als
speziellen
dieses
Drosophila Aldolase zeigt, dass
den
hydrophoben Wechselwirkungen dominiert
von
konnte
Wechselwirkung
der
zwischen
der
Polypeptidkette wurden
Substratspezifität
bisphosphat.
Dieser
C-terminale
beeinflusst
Flexibilität
reversible
Der
und
hat
Spaltung
nicht vorhanden
in
die
Arm
zur
den
in
die
direkten
Lysin 41,
Leberaidolasen
von
F1P.
zu
Erwägung gezogen,
ist
von
zweite
Substratspezifität
FBP/F1P.
grössere
Vergleich
Eine
Bindung
stellt
möglicherweise
von
im
beeinflussen.
Stelle, welche sich besser eignet
die
bestätigten
Aldolase für FBP,
und
die
aktive
Fruktose-1,6-
Region
mittels
Einfluss
in der aktiven
Wirbeltieren.
dar.
seiner
auf
die
Stelle, ist
Dies
lässt
8
vermuten,
bei der
Histidin
oder
dass
dieser
Aminosäurerest
361
und entweder die
Glutaminsäure
Protonentransfer
angenommen, dass
189
während
Tyrosin
ebenfalls
eine
Rolle
spielt
zwei Substrate.
Diskriminierung der
Ci-Phosphatgruppe
sind
der
363
des
wahrscheinlich
Katalyse
beteiligt.
Übergangszustände
Substrates
direkt
Es
stabilisiert.
am
wird
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