Identifizierung altersassoziierter genetischer und

Identifizierung altersassoziierter
genetischer und epigenetischer Aberrationen
in reifzelligen Keimzentrums-B-Zell-Lymphomen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
vorgelegt von
Ulrike Paul
Kiel, 2016
Erster Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Manuela Dittmar
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. med. Wolfram Klapper
Tag der mündlichen Prüfung: 10.06.2016
Zum Druck genehmigt: 10.06.2016
Gez. der Dekan Prof. Dr. rer. nat Wolfgang J. Duschl
Zusammenfassung
Diffus großzellige B-Zell-Lymphome (DLBCL) und follikuläre Lymphome (FL) sind die weitaus
häufigsten Lymphome im Erwachsenenalter in Zentraleuropa und umfassen etwa 70-80% aller B-ZellLymphome bei Patienten im hohen Alter. Standardmäßig werden hochmaligne FL und DLBCL mit
einer Kombination aus Chemotherapie und dem monoklonalen Antikörper Rituximab (R-CHOP)
behandelt. Jedoch kann diese Therapie häufig bei sehr alten Patienten nicht angewandt werden, da das
Immunsystem die Nebenwirkungen einer derartigen Hochdosis-Chemotherapie nicht übersteht. Für
sehr alte Patienten mit einem Keimzentrums-B-Zell-Lymphom und einem hohen Internationalen
prognostischen Index (IPI) gibt es derzeit keine wirksame Therapie. Aufgrund des kontinuierlichen
Anstiegs der Lebenserwartung der Bevölkerung der westlichen Länder nimmt auch die Bedeutung der
Behandlung von sehr alten Patienten mit einem Keimzentrums-B-Zell-Lymphom in der onkologischen
Versorgung zu. Das Ziel dieser Arbeit war es daher altersassoziierte genetische und epigenetische
Aberrationen bei Keimzentrums-B-Zell-Lymphomen zu identifizieren und dabei potenzielle
molekulargenetische Marker zu ermitteln, die vorzugsweise bei sehr alten Patienten aberrant vorliegen
und als mögliche Therapieoption für die sehr alten Patienten fungieren können. In dieser Arbeit wurde
der Begriff Senium für Patienten ab einem Ersterkrankungsalter von 80 Jahren verwendet.
Zur Bearbeitung der Ziele war eine Methoden-Optimierung der Hochdurchsatz-Sequenzierung inkl.
der Austestung verschiedener kommerzieller und Custom Panel zur Probenvorbereitung von Frischund FFPE-Material erforderlich. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit die Probenvorbereitung
von jeweils zwei kommerziellen und zwei Custom Panel optimiert werden. Insbesondere konnte ein
Custom Panel (Lymphom-Panel) erstellt und optimiert werden, dass die Mutationsanalyse an Frischund FFPE-Material in Lymphomen von häufig mutierten Target-Regionen mittels HochdurchsatzSequenzierung ermöglicht.
Für die Analyse der Keimzentrums-B-Zell-Lymphome wurde in dieser Arbeit eine neue Kohorte von
insgesamt 198 sehr alten Patienten zusammengestellt und molekulargenetisch mittels Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung (FISH: BCL2, BCL6, IGH, MYC), Immunhistochemie (IHC: BCL2, BCL6, CD10,
Ki67,
MUM1),
Target-Resequenzierung
und
Infinium
HumanMethylation450
Bead
ChiP
charakterisiert. Zusätzlich standen die molekulargenetischen Daten von insgesamt 1694 Patienten aus
den klinischen Studien RICOVER und NHL-B sowie den Forschungsstudien MMML und ICGC
MMML-Seq zur Verfügung, sodass insgesamt 1892 Patienten im Alter von 3 bis 97 Jahren
hinsichtlich genetischer und/oder epigenetischer Aberrationen in Keimzentrums-B-Zell-Lymphomen
analysiert werden konnte.
Die Ergebnisse dieser Analysen konnten zeigen, dass bei Patienten mit einem Keimzentrums-B-ZellLymphom im hohen Alter vorwiegend DLBCL und nur selten FL diagnostiziert wurden und DLBCL
bei älteren Patienten vorwiegend vom ABC- bzw. nonGCB-Subtypen waren. Darüber hinaus konnte
gezeigt werden, dass die Tumore mit zunehmendem Alter der Patienten verstärkt BCL2, Ki67 und
weniger CD10 exprimieren. Insgesamt wurden 50 rekurrent mutierte Gene in der analysierten
DLBCL-Kohorte identifiziert, wovon 11 Gene eine Mutationsfrequenz von über 15% aufwiesen.
Zudem überlappten die Gene stark mit bereits bekannten rekurrent mutierten Genen in DLBCL. Für
12 der rekurrent mutierten Gene wurde ein medianes Alter der Patienten von über 80 Jahren berechnet.
Als Top Kandidatengen für DLBCL-Patienten im hohen Alter wurde CD58 ermittelt, wobei in einer
altersassoziierten Auswertung der Punktmutationen und strukturellen Aberrationen in CD58 gezeigt
wurde, dass das Gen signifikant häufiger bei DLBCL-Patienten mit einem hohen Ersterkrankungsalter
verändert vorlag (Median: 74 Jahre, P-Wert: 0,0035).
In den epigenetischen Analysen dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass das DNAMethylierungsprofil von DLBCL deutlich heterogener ist als das Methylierungsprofil von FL. Es
konnten keine CpG-Loci in DLBCL-Patienten identifiziert werden, die signifikant häufiger im hohen
Alter differentiell methylierte auftreten. Die Analysen der DNA-Methylierungswerte der TumorProben mit dem Horvath-Modell zeigten, dass das berechnete epigenetische Alter der DLBCLPatienten im Median deutlich über dem biologischen Alter lag. In einem Vergleich der Top 20
rekurrent mutierten Genen mit dem höchsten medianen Alter nach dem biologischen bzw.
epigenetischen Alter konnten 12 Gene identifiziert werden, die in beiden Altersberechnungen
rekurrent mutiert auftraten. Die Auswertung der 50 rekurrent mutierten Gene in DLBCL in
Assoziation zur Differenz des biologischen und epigenetischen Alters (Delta-Alter) identifizierte
33 Gene als potenzielle „epigenetic modifier“. Diese Gene können möglicherweise das epigenetische
Alter der analysierten Patienten beeinflussen und können damit ggf. als „epigenetic modifier“
bezeichnet werden. Insgesamt wurden 6 der 33 „epigenetic modifier“ als Gene identifiziert, die bereits
im Zusammenhang mit epigenetischen Modifikationen bei Tumoren publiziert wurden: CREBBP,
KMT2D (MLL2), HIST1H2AC, HIST1H1C, TET1 und TET2.
Zusammenfassend haben die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen zur Identifizierung von
genetischen und epigenetischen Aberrationen geführt, die vorwiegend in sehr alten Patienten auftraten.
Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass es Unterschiede in der Molekulargenetik von
DLBCL zwischen jüngeren und älteren Patienten gibt. Insbesondere wurde CD58 als Top
Kandidatengen für genetische Aberrationen in sehr alten DLBCL-Patienten ermittelt. Hierbei handelt
es sich um ein transmembranständiges Glykoprotein von dem bereits bekannt ist, dass es eine zentrale
Bedeutung in der Interaktion von B- und T-Zellen und der damit verbundenen Immunantwort besitzt.
Möglicherweise könnte das CD58-Gen in Zukunft einen neuen molekularen Marker für die Diagnostik
und altersangepasste Therapie bei DLBCL-Patienten im Senium darstellen.
Summary
Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and follicular lymphoma (FL) are the most common
lymphoma in patients with advanced age in central Europe and account for around 70-80 % of all Bcell lymphoma at the advanced age. The standard therapy for FL and DLBCL is a combination of
chemotherapy and monoclonal antibody Rituximab (R-CHOP). However, this therapy is often not
applicable to very elderly patients because the immune system does not get over the side effects of that
chemotherapy. For very elderly patients with a germinal center derived B-cell lymphoma and a high
International Prognostic Index (IPI) score no effective standard therapy is currently available. Based
on the continuous increase of the life expectancy in western countries the need of potential treatment
in oncological care for very elderly patients with a germinal center derived B-cell lymphoma
increases. Therefore, the aim of this work was to identify age-associated genetic and epigenetic
alterations in germinal center derived B-cell lymphoma which are more prone to be mutated in very
elderly patients. These markers might be help to achieve new therapy options for those patients. In this
thesis the term “senium” was used for patients with an age at diagnosis of 80 and more years.
To identify genetic aberrations especially mutation targeted resequencing should be used. Therefore, it
was necessary to optimize the high-throughput sequencing method using commercial and custom
panels for the sample preparation of DNA extracted from fresh and FFPE material. In summary two
commercial and two custom panels could be successfully optimized for the sample preparation
followed by high-throughput sequencing within this thesis. In particular a custom panel (LymphomaPanel) could be established that enable the analysis of recurrently mutated target regions in
lymphomas analysis in DNA extracted from fresh and FFPE material.
For the analysis of the germinal center derived B-cell lymphoma a new cohort of 198 very old patients
was identified and characterized using fluorescence in-situ hybridization (FISH: BCL2, BCL6, IGH,
MYC), immunohistochemistry (IHC: BCL2, BCL6, CD10, Ki67, MUM1), targeted resequencing and
Infinium HumanMethylation450 Bead chip.
In addition molecular genetic data of 1694 germinal center derived B-cell lymphoma patients from the
clinical studies RICOVER and NHL-B as well as the research studies MMML and ICGC MMML-Seq
were available. In total of 1892 patients with an age at diagnosis of 3 to 97 years could be analyzed
concerning age-associated genetic and/or epigenetic alterations in germinal center derived B-cell
lymphoma.
The results of this analysis showed that very elderly patients with a germinal center derived B-cell
lymphoma were mainly diagnosed with DLBCL and only seldom with FL were diagnosed.
Furthermore, DLBCL of elderly patients were mainly of the ABC or nonGCB-subtyp.
In addition the results showed that with increasing age of the patients the frequency of tumors
expressing BCL2 and Ki67 increases and decreases for CD10. Altogether, 50 recurrent mutated genes
were identified in the analyzed DLBCL cohort with 11 genes showing a mutation frequency of more
than 15% and a general high overlap to genes which are already known to be recurrently mutated in
DLBCL. 12 recurrently mutated genes had a median age at diagnosis of 80 or more years. The top
candidate gene for age-associated genetic alterations in very elderly DLBCL patients was CD58. An
age-associated analysis of point mutations and structural aberrations showed that CD58 occur
significantly more often in DLBCL patients with high age at diagnosis (median: 74 years, p-value=
0.0035).
In this thesis the epigenetic analysis could confirm that the DNA methylation pattern of DLBCLs is
compared to FLs more heterogeneous. No age-associated differential methylated CpG-Loci could be
identified in DLBCL patients. Using the Horvath model the DNA methylation of the tumor samples
showed that the epigenetic age of the DLBCL patients was in the median higher compared to the
biological age. The top 20 recurrently mutated genes with the highest median biological age were
compared to the top 20 recurrently mutated genes with the highest median epigenetic age and
identified 12 genes which were mutated in both age calculations. The analysis of the 50 recurrently
mutated genes in DLBCL in association to the difference of the biological and epigenetic age (delta
age) identified 33 genes as potential "epigenetic modifier". Those genes might possibly influence the
epigenetic age of the analyzed patients and can be called "epigenetic modifier". Altogether 6 of 33
"epigenetic modifier" were previously published in association to epigenetic modifications in tumors:
CREBBP, KMT2D (MLL2), HIST1H2AC, HIST1H1C, TET1 and TET2.
In summary, the analysis performed in the framework of this thesis lead to the identification of the
genetic and epigenetic aberrations, which appeared mainly in very elderly DLBCL patients. These
results confirm the hypothesis that there are differences in the molecular genetics between younger
(adult) and older (very elderly) DLBCL patients. In particular the CD58 gene was identified as a top
candidate gene for genetic aberrations in very elderly DLBCL patients. CD58 is a transmembranous
glycoprotein and it´s already known that this protein has a central role in the interaction of B and T
cells and the associated immune system function. Maybe, the CD58 gene could be a new molecular
marker for the diagnostics and age-adapted therapy for very elderly DLBCL patients.