Gene expression profiling and immunoglobulin stereotypy

Gene expression profiling and
immunoglobulin stereotypy
in Burkitt lymphoma
Dissertation
in fulfilment of the requirements
for the degree “Dr. rer. nat.”
of the Faculty of Mathematics
and Natural Sciences
at Kiel University
submitted by
Neus Masqué Soler
Kiel, 2015
First referee:
Professor nat. rer. Holger Kalthoff
Second referee:
Professor nat. rer. Thomas Röder
Date of the oral examination:
14.12.2015
Approved for publication:
02.02.2016
Dean:
Professor Dr. Wolfgang J. Duschl
A l’avi Joan
Abstract
The present work compilation discusses the creation of improved molecular lymphoma
classifiers and studies the immunological properties of lymphoma antibodies.
Lymphatic system cells are grouped in B, T or natural killer cells according to their
functions. The B cell population is responsible for humoral immunity by secreting
antibodies and presenting antigen fragments in its surface. When malignantly transformed,
B cells can develop into what is described as B cell lymphoma.
Burkitt lymphoma (BL) is a rare type of B cell lymphoma characterised by its
hallmark chromosomal translocation [t(8;14)] involving the c-Myc oncogene and the
immunoglobulin heavy chain locus (IGH@). Burkitt lymphoma shares some
immunohistochemical (IHC), morphological and genetic characteristics with the most
frequent lymphoma form: diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). Both diseases are
considered aggressive, presenting with severe symptoms and rapid growth. Therefore
distinguishing within and between the two diagnostic entities can, at times, be challenging.
In the past IHC tools were standardised to overcome the categorisation issue. With the
wake of gene expression profile assays lymphoma classification was adapted to newer
methods. The first chapter of this thesis presents two improved aggressive B cell
lymphoma classifiers based on a novel technology that does not require material
amplification, avoiding quantification bias and is able to count actual mRNA molecules to
infer genetic expression levels. On one side the classifier distinguishes molecular BL (mBL)
from non-BL and on the other the distinction is made between DLBCL subtypes. In
chapter two the former classifier is used to understand molecular labelling differences
between BCL2-expressing and non-expressing BL. The co-expression of MYC and BCL2
has been associated with poorer outcome in DLBCL. By assessing the molecular labelling
of BCL2-positive and -negative BL we determined that an expression of the anti-apoptotic
BCL2 protein is not enough to modify the labelling of mBL to another lymphoma subtype
and detect no clinical differences between BCL2-expressing and non-expressing cases.
Chapters three and four focus on the humoral immunity aspect of lymphoma B cells
and their B cell receptors (BcR). The BcR is a complex formed by a transmembranous
immunoglobulin (IG) and the Ig-/Ig- heterodimer facing the cytoplasm. The IG
molecule is in charge of antigen recognition through its variable domain. A wide range of
IG variability is achieved by the so called V(D)J recombination, a procedure that combines
gene segments in the IGH@. Lymphomas present a biased repertoire of IG gene
ABSTRACT
recombinations distinct from normal B cells, a phenomenon attributed to antigenic drive.
In chapter three the IG rearrangement of B-cell lymphomas is reviewed, with a focus on
BL. Three V(D)J segments of BL monoclonal antibodies (mAbs) belonging to one same
biased subtype are characterised structurally in silico and studied for their mutation in the
antigen-binding site. By reverting the mutation to its original germline amino acid the
antigen-biding pocket is seen to vary in shape. Chapter four learns from these observations
and performs experimental procedures with phage display and nuclear magnetic resonance
techniques. Four peptides with variable binding affinities are discovered that bind to the
BL mAbs previously characterised and are homologous to various proteins of alimentary
and pathogenic origin.
Summarizing, this thesis presents an improved tool for BL and DLBCL
classification, which can be used for assessing basic science topics as well as avoiding
diagnostic pitfalls. The type of IG in tumoral BL cells and their antigen affinity is assessed,
pointing to an antigenic aetiology.
Zusammenfassung
Die vorliegende Arbeit stellt eine Zusammenfassung von verbesserten molekularen
Lymphom Klassifikatoren und deren Studien über immunologische Eigenschaften von
Lymphom Antikörpern dar.
Die Zellen des lymphatischen Systems werden je nach Funktion in drei Gruppen
eingeteilt, B-Zellen, T-Zellen oder NK-Zellen (Natürliche Killerzellen). Die B-Zell
Population ist für die humorale Immunantwort verantwortlich. B-Zellen produzieren und
sekretieren Antikörper und präsentieren nach Antigenkontakt auch Fragmente auf der
Oberfläche. Bei einer bösartigen Entartung dieser Zellreihen entwickeln sich B-ZellLymphome.
Das Burkitt Lymphom (BL) ist eine seltene Form des B-Zell-Lymphoms, welches
durch seine charakteristische Chromosomale Translokation [t(8;14)] mit Beteiligung des cMyc Onkogens und des IGH Lokus (IGH@) typisiert ist. Es hat zusätzlich auch
immunhistochemische (IHC), morphologische und genetische Eigenschaften wie andere,
häufigere Lymphome, z. B. das diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). Beide
Erkrankungen sind sehr aggressiv und durch heftige, schlimme Symptome, sowie durch ein
schnelles Wachstum gekennzeichnet. Deshalb ist es manchmal eine Herausforderung
zwischen diesen beiden Entitäten zu unterscheiden. In der Vergangenheit wurden IHC
Methoden und Antikörperauswahl standardisiert, um dadurch eine bessere Kategorisierung
zu erreichen. Mit dem Beginn der Gen Expression Assays wurde die Lymphom
Klassifizierung an neuere Methoden angepasst. Das erste Kapitel dieser Promotionsschrift
zeigt zwei neue Klassifikatoren von aggressiven B-Zell-Lymphomen die durch die
Anwendung einer neuartiger Technologie entwickelt wurden, die keine Vervielfältigung
von Material benötigt, dadurch Amplifikationsprobleme vermeidet, in der Lage ist mRNA
Moleküle zu zählen, und genaue Rückschlüsse auf das genetische Expressions zulässt. Der
Klassifikator unterscheidet molekulare BL (mBL) von non-mBL und zeigt zusätzlich den
Unterschied zu DLBCL Subtypen. Im zweiten Kapitel wird beschrieben, wie der
Klassifikator verwendet wurde, um molekulare Kennzeichnungen zwischen BCL2
exprimierenden und nicht exprimierenden BL zu unterscheiden. Es ist bekannt, dass die
Co-Expression von MYC und BCL2 in DLBCLs mit einer schlechteren Prognose
verbunden ist. In unserer Studie sind keine klinischen Unterschiede zwischen den
untersuchten BCL2 exprimierenden und nicht exprimierenden Fällen erfunden worden. Bei
der Auswertung der molekularen Ergebnisse von BCL2 positiven und negativen BL
konnten wir allerdings feststellen, dass die Expression des anti-apoptotischen BCL2
ZUSAMMENFASSUNG
Proteins nicht ausreicht, um die Kennzeichnung eines mBL in einen anderen molekularen
Subtypen zu verändern.
Die Schwerpunkte in Kapitel drei und vier beziehen sich auf die humorale
Immunantwort bei B-Zell-Lymphomen und den B-Zell-Rezeptoren (BcR). Der BcR ist ein
aus einem transmembranären Immunglobulin (IG) und den Ig-alpha/Ig-beta Heterodimer
geformter Komplex. Das IG Molekül ist durch seine variable Domäne für die
Antigenerkennung hauptverantwortlich. Eine große Reichweite der IG Variabilität wird
durch die so genannten V(D)J Rekombination erreicht, ein Ablauf bei dem Gensegmente
im IGH@ neu kombiniert werden. Lymphome stellen ein biased Repertoire der IG-Gen
Rekombination dar, welche sich von normalen B-Zellen unterscheidet, ein Phänomen,
welches auf antigen drive zurückzuführen ist. In Kapitel drei wurde das IG Rearrangement
von B-Zell-Lymphomen, mit dem Schwerpunkt auf BL, untersucht. Immunoglobulin-Gen
V(D)J Segmente von drei BL monoklonalen AK (mAK) mit bestimmte Subtypen wurden
strukturell in silico charakterisiert und auf vorhandene Mutationen in der AntigenBindungsstelle geprüft. Beim Zurückleiten auf die ursprüngliche Keimbahnsequenz der
Aminosäuren für die Antigen-Bindungstasche ergaben sich leicht veränderte Strukturen. In
Kapitel vier werden die experimentellen Verfahren und Durchführungen mit phage display
und nuclear magnetic resonance Technik beschrieben. Dabei wurden vier Peptide mit variablen
Bindungsaffinitäten entdeckt, die sich spezifisch an die in Kapitel drei erwähnten BL mAK
binden. Die Peptide sind homolog zu verschiedenen Proteinen des Verdauungstrakts
und/oder pathogenen Ursprungs.
Zusammenfassend liefert diese Promotionsschrift neue Hilfsmittel für die
differentielle BL/DLBCL Klassifikation, welche sowohl in der Grundlagenforschung als
auch für die Vermeidung von diagnostischen Fehleinschätzungen genutzt werden kann.
Der IG Typ und die entsprechende Affinität wurde in malignen BL Zellen bestimmt und
weist auf eine Antigen-vermittelte Ätiologie hin.