Gene expression profiling and immunoglobulin stereotypy
Werbung
Gene expression profiling and immunoglobulin stereotypy in Burkitt lymphoma Dissertation in fulfilment of the requirements for the degree “Dr. rer. nat.” of the Faculty of Mathematics and Natural Sciences at Kiel University submitted by Neus Masqué Soler Kiel, 2015 First referee: Professor nat. rer. Holger Kalthoff Second referee: Professor nat. rer. Thomas Röder Date of the oral examination: 14.12.2015 Approved for publication: 02.02.2016 Dean: Professor Dr. Wolfgang J. Duschl A l’avi Joan Abstract The present work compilation discusses the creation of improved molecular lymphoma classifiers and studies the immunological properties of lymphoma antibodies. Lymphatic system cells are grouped in B, T or natural killer cells according to their functions. The B cell population is responsible for humoral immunity by secreting antibodies and presenting antigen fragments in its surface. When malignantly transformed, B cells can develop into what is described as B cell lymphoma. Burkitt lymphoma (BL) is a rare type of B cell lymphoma characterised by its hallmark chromosomal translocation [t(8;14)] involving the c-Myc oncogene and the immunoglobulin heavy chain locus (IGH@). Burkitt lymphoma shares some immunohistochemical (IHC), morphological and genetic characteristics with the most frequent lymphoma form: diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). Both diseases are considered aggressive, presenting with severe symptoms and rapid growth. Therefore distinguishing within and between the two diagnostic entities can, at times, be challenging. In the past IHC tools were standardised to overcome the categorisation issue. With the wake of gene expression profile assays lymphoma classification was adapted to newer methods. The first chapter of this thesis presents two improved aggressive B cell lymphoma classifiers based on a novel technology that does not require material amplification, avoiding quantification bias and is able to count actual mRNA molecules to infer genetic expression levels. On one side the classifier distinguishes molecular BL (mBL) from non-BL and on the other the distinction is made between DLBCL subtypes. In chapter two the former classifier is used to understand molecular labelling differences between BCL2-expressing and non-expressing BL. The co-expression of MYC and BCL2 has been associated with poorer outcome in DLBCL. By assessing the molecular labelling of BCL2-positive and -negative BL we determined that an expression of the anti-apoptotic BCL2 protein is not enough to modify the labelling of mBL to another lymphoma subtype and detect no clinical differences between BCL2-expressing and non-expressing cases. Chapters three and four focus on the humoral immunity aspect of lymphoma B cells and their B cell receptors (BcR). The BcR is a complex formed by a transmembranous immunoglobulin (IG) and the Ig-/Ig- heterodimer facing the cytoplasm. The IG molecule is in charge of antigen recognition through its variable domain. A wide range of IG variability is achieved by the so called V(D)J recombination, a procedure that combines gene segments in the IGH@. Lymphomas present a biased repertoire of IG gene ABSTRACT recombinations distinct from normal B cells, a phenomenon attributed to antigenic drive. In chapter three the IG rearrangement of B-cell lymphomas is reviewed, with a focus on BL. Three V(D)J segments of BL monoclonal antibodies (mAbs) belonging to one same biased subtype are characterised structurally in silico and studied for their mutation in the antigen-binding site. By reverting the mutation to its original germline amino acid the antigen-biding pocket is seen to vary in shape. Chapter four learns from these observations and performs experimental procedures with phage display and nuclear magnetic resonance techniques. Four peptides with variable binding affinities are discovered that bind to the BL mAbs previously characterised and are homologous to various proteins of alimentary and pathogenic origin. Summarizing, this thesis presents an improved tool for BL and DLBCL classification, which can be used for assessing basic science topics as well as avoiding diagnostic pitfalls. The type of IG in tumoral BL cells and their antigen affinity is assessed, pointing to an antigenic aetiology. Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit stellt eine Zusammenfassung von verbesserten molekularen Lymphom Klassifikatoren und deren Studien über immunologische Eigenschaften von Lymphom Antikörpern dar. Die Zellen des lymphatischen Systems werden je nach Funktion in drei Gruppen eingeteilt, B-Zellen, T-Zellen oder NK-Zellen (Natürliche Killerzellen). Die B-Zell Population ist für die humorale Immunantwort verantwortlich. B-Zellen produzieren und sekretieren Antikörper und präsentieren nach Antigenkontakt auch Fragmente auf der Oberfläche. Bei einer bösartigen Entartung dieser Zellreihen entwickeln sich B-ZellLymphome. Das Burkitt Lymphom (BL) ist eine seltene Form des B-Zell-Lymphoms, welches durch seine charakteristische Chromosomale Translokation [t(8;14)] mit Beteiligung des cMyc Onkogens und des IGH Lokus (IGH@) typisiert ist. Es hat zusätzlich auch immunhistochemische (IHC), morphologische und genetische Eigenschaften wie andere, häufigere Lymphome, z. B. das diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). Beide Erkrankungen sind sehr aggressiv und durch heftige, schlimme Symptome, sowie durch ein schnelles Wachstum gekennzeichnet. Deshalb ist es manchmal eine Herausforderung zwischen diesen beiden Entitäten zu unterscheiden. In der Vergangenheit wurden IHC Methoden und Antikörperauswahl standardisiert, um dadurch eine bessere Kategorisierung zu erreichen. Mit dem Beginn der Gen Expression Assays wurde die Lymphom Klassifizierung an neuere Methoden angepasst. Das erste Kapitel dieser Promotionsschrift zeigt zwei neue Klassifikatoren von aggressiven B-Zell-Lymphomen die durch die Anwendung einer neuartiger Technologie entwickelt wurden, die keine Vervielfältigung von Material benötigt, dadurch Amplifikationsprobleme vermeidet, in der Lage ist mRNA Moleküle zu zählen, und genaue Rückschlüsse auf das genetische Expressions zulässt. Der Klassifikator unterscheidet molekulare BL (mBL) von non-mBL und zeigt zusätzlich den Unterschied zu DLBCL Subtypen. Im zweiten Kapitel wird beschrieben, wie der Klassifikator verwendet wurde, um molekulare Kennzeichnungen zwischen BCL2 exprimierenden und nicht exprimierenden BL zu unterscheiden. Es ist bekannt, dass die Co-Expression von MYC und BCL2 in DLBCLs mit einer schlechteren Prognose verbunden ist. In unserer Studie sind keine klinischen Unterschiede zwischen den untersuchten BCL2 exprimierenden und nicht exprimierenden Fällen erfunden worden. Bei der Auswertung der molekularen Ergebnisse von BCL2 positiven und negativen BL konnten wir allerdings feststellen, dass die Expression des anti-apoptotischen BCL2 ZUSAMMENFASSUNG Proteins nicht ausreicht, um die Kennzeichnung eines mBL in einen anderen molekularen Subtypen zu verändern. Die Schwerpunkte in Kapitel drei und vier beziehen sich auf die humorale Immunantwort bei B-Zell-Lymphomen und den B-Zell-Rezeptoren (BcR). Der BcR ist ein aus einem transmembranären Immunglobulin (IG) und den Ig-alpha/Ig-beta Heterodimer geformter Komplex. Das IG Molekül ist durch seine variable Domäne für die Antigenerkennung hauptverantwortlich. Eine große Reichweite der IG Variabilität wird durch die so genannten V(D)J Rekombination erreicht, ein Ablauf bei dem Gensegmente im IGH@ neu kombiniert werden. Lymphome stellen ein biased Repertoire der IG-Gen Rekombination dar, welche sich von normalen B-Zellen unterscheidet, ein Phänomen, welches auf antigen drive zurückzuführen ist. In Kapitel drei wurde das IG Rearrangement von B-Zell-Lymphomen, mit dem Schwerpunkt auf BL, untersucht. Immunoglobulin-Gen V(D)J Segmente von drei BL monoklonalen AK (mAK) mit bestimmte Subtypen wurden strukturell in silico charakterisiert und auf vorhandene Mutationen in der AntigenBindungsstelle geprüft. Beim Zurückleiten auf die ursprüngliche Keimbahnsequenz der Aminosäuren für die Antigen-Bindungstasche ergaben sich leicht veränderte Strukturen. In Kapitel vier werden die experimentellen Verfahren und Durchführungen mit phage display und nuclear magnetic resonance Technik beschrieben. Dabei wurden vier Peptide mit variablen Bindungsaffinitäten entdeckt, die sich spezifisch an die in Kapitel drei erwähnten BL mAK binden. Die Peptide sind homolog zu verschiedenen Proteinen des Verdauungstrakts und/oder pathogenen Ursprungs. Zusammenfassend liefert diese Promotionsschrift neue Hilfsmittel für die differentielle BL/DLBCL Klassifikation, welche sowohl in der Grundlagenforschung als auch für die Vermeidung von diagnostischen Fehleinschätzungen genutzt werden kann. Der IG Typ und die entsprechende Affinität wurde in malignen BL Zellen bestimmt und weist auf eine Antigen-vermittelte Ätiologie hin.
