Wnt/β-Catenin-Zielgene in der Maus-Entwicklung

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Wnt/β-Catenin-Zielgene in der Maus-Entwicklung
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Fakultät für Biologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
vorgelegt von
Christian Wehrle
aus Herbolzheim
Freiburg 2003
Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Juni 1999 bis Mai 2003 am
Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg i. Br. unter Anleitung von
Herrn Dr. habil. Rolf Kemler angefertigt.
Dekan der Fakultät:
Betreuer der Arbeit:
Referent:
Koreferent:
Promotionsvorsitzender:
Prof. Dr. Hans Kleinig
Dr. habil. Rolf Kemler
Dr. habil. Rolf Kemler
Prof. Dr. Wolfgang Driever
Prof. Dr. Karl-Friedrich Fischbach
Tag der mündlichen Prüfung:
23. Juli 2003
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung..............................................................................1
1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.2.
1.3.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.5.
1.5.1.
1.5.2.
1.5.3.
1.6.
1.7.
1.8.
Die frühe Embryonalentwicklung der Maus.................................................... 1
Präimplantationsentwicklung....................................................................... 2
Postimplantationsentwicklung ..................................................................... 3
Interzelluläre Kommunikation während der Entwicklung .............................. 5
Wnt-Proteine binden an Frizzled-Rezeptoren und LRP-Corezeptoren .......... 6
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist einer von mehreren Wnt-Signalwegen.... 7
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg..................................................................... 7
Alternative Wnt-Signalwege und Signalspezifität.................................... 10
Wnt-Signale in Vertebratenentwicklung und Pathogenese........................... 11
Die Etablierung der primären Körperachse in Xenopus-Embryonen ...... 12
Wnt-Signale während der Mausentwicklung ............................................ 13
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg in der Pathogenese .................................. 14
Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs....................................................... 15
Das ES-Zell-Cokultursystem .......................................................................... 16
Die Erstellung von Genexpressionsprofilen mit Hilfe von
DNA-Microarrays............................................................................................ 18
1.9. Aufbau von Affymetrix-Microarrays ............................................................. 19
1.10. Zielsetzung dieser Arbeit................................................................................. 20
2.
Material und Methoden......................................................22
2.1. Materialien ....................................................................................................... 22
2.1.1.
Chemikalien ................................................................................................ 22
2.1.2.
Gebrauchswaren.......................................................................................... 22
2.1.3.
Klonierungsvektoren und Wirtsbakterien ................................................. 22
2.1.4.
Bakterienmedien ......................................................................................... 23
2.1.5.
Eukaryotische Zelllinien............................................................................. 23
2.1.6.
Oligonukleotide und Enzyme..................................................................... 23
2.1.7.
in situ Hybridisierungssonden.................................................................... 26
2.1.8.
Häufig verwendete Puffer und Lösungen.................................................. 26
2.2. Molekularbiologische Methoden .................................................................... 27
2.2.1.
Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen........................................... 27
2.2.2.
Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA .................................... 27
2.2.3.
Auffüllen von 5’-überhängenden DNA-Enden......................................... 27
2.2.4.
Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten ................................. 27
2.2.5.
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen................................ 27
2.2.6.
Phenol/ Chloroform- Extraktion ................................................................ 28
2.2.7.
Präzipitation von Nukleinsäuren (DNA oder RNA)................................. 28
2.2.8.
Ligation von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA ................................... 28
2.2.9.
Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Bakterien ........ 29
2.2.10. Herstellung und Transformation elektrisch kompetenter Bakterien........ 29
2.2.11. Identifizierung rekombinanter Kolonien ................................................... 30
2.2.12. Präparation von Plasmid-DNA .................................................................. 30
2.2.13. DNA-Sequenzierung................................................................................... 30
2.2.14. Ortsgerichtete Mutagenese......................................................................... 31
2.2.15. Southern-Blot Analyse .............................................................................. 32
2.2.16. Radioaktive Markierung von DNA- Sonden............................................. 32
2.2.17. Hybridisierung von Southern-Blots........................................................... 33
2.2.18. Reverse Transkription von RNA in cDNA .............................................. 33
2.2.19. Polymerase-Kettenreaktion („PCR“)......................................................... 34
2.2.20. Klonierung von PCR-Produkten ................................................................ 34
2.2.21. Quantitative PCR mit dem LightCycler–System ...................................... 35
2.3. Expressionsanalyse mit dem Affymetrix GeneChip System ...................... 36
2.3.1.
Prinzip.......................................................................................................... 36
2.3.2.
Präparation der biotinylierten cRNA für die Hybridisierung................... 36
2.3.3.
Hybridisierung der Oligonukleotid-Microarrays und Detektion der
hybridisierten cRNA................................................................................... 37
2.3.4.
Auswertung der Microarrays...................................................................... 39
2.3.5.
Validierung der Microarray-Ergebnisse .................................................... 40
2.4. Zellbiologische Methoden............................................................................... 41
2.4.1.
Zellkultur von NIH 3T3-Fibroblasten und HEK 293-Zellen ................... 41
2.4.2.
Zellkultur von ES-Zellen............................................................................ 41
2.4.3.
Herstellung eines Nährzellrasens aus Embryonalen Fibroblasten (EMFI).. 42
2.4.4.
Cokultur von ES-Zellen und NIH 3T3 Fibroblasten ................................ 42
2.4.5.
Isolation von Gesamt-RNA aus cokultivierten ES-Zellen ....................... 43
2.4.6.
Reporterstudien in transfizierten HEK 293-Zellen................................... 43
2.5. Embryologische Methoden ............................................................................. 45
2.5.1.
Verwendete Mäuse ..................................................................................... 45
2.5.2.
Isolation von Embryonen ........................................................................... 46
2.5.3.
Präparation von genomischer DNA aus embryonalen Dottersäcken ...... 46
2.5.4.
Präparation von genomischer DNA aus Schwanzbiopsien ...................... 46
2.5.5.
Herstellung von markierten RNA-Proben für die in situ Hybridisierung ... 46
2.5.6.
„Whole mount“ RNA in situ Hybridisierung............................................ 47
2.5.7.
Herstellung von Embryopulver.................................................................. 48
2.5.8.
Herstellung transgener Reportermäuse...................................................... 48
2.5.9.
Genotypisierung von Mäusen und Mausembryonen ................................ 48
2.5.10. X-Gal Färbung von Embryonen................................................................. 49
2.6. Histologische Methoden.................................................................................. 49
2.6.1.
Paraffineinbettung von Embryonen........................................................... 49
2.6.2.
RNA in situ Hybridisierung auf Paraffinschnitten ................................... 50
2.6.3.
Histologische Färbung von Präparaten...................................................... 51
3.
3.1.
3.2.
Ergebnisse..........................................................................52
Modifikation des ES-Zell-Cokultursystems................................................... 52
Identifikation von Zielgen-Kandidaten des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
mit Hilfe des Affymetrix GeneChip Systems .............................................. 55
3.2.1.
Übersicht über die durchgeführten Microarray-Experimente.................. 55
3.2.2.
Zielgen-Screening mit Mu6500-Microarrays ........................................... 57
3.2.3.
Zielgen-Screening mit Mu19k-Microarrays ............................................. 61
3.2.4.
Zielgen-Screening mit MG-U74A-Microarrays ....................................... 64
3.2.5.
Übersicht über die Ergebnisse aus den einzelnen Experimenten............. 69
3.3. Informationen zu den Zielgen-Kandidaten .................................................... 70
3.3.1.
Funktionelle Klassifizierung der Zielgen-Kandidaten ............................. 70
3.3.2.
Beschreibung der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten....................... 71
3.4. Untersuchung der 5‘-flankierenden Sequenzen der Wnt1-induzierten Gene... 77
3.5. Untersuchung von Axin2 ................................................................................. 79
3.5.1.
Vergleich der Axin2-Loci von Maus und Mensch .................................... 79
3.5.2.
Luciferase-Reporterstudien ........................................................................ 80
3.5.2.1.
Klonierung von Axin2-Luciferase-Reporterkonstrukten ..................... 81
3.5.2.2.
Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in HEK 293-Zellen ...... 81
3.5.2.3.
Stimulation des Ax2 P/I1-Luc-Konstrukts durch verschiedene
TCF/β-Catenin-Komplexe..................................................................... 82
3.5.2.4.
Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen ....... 84
3.5.3.
Untersuchungen zur Axin2-Expression in Mausembryonen .................... 86
3.5.3.1.
Expression von Axin2 in Wildtyp-Mausembryonen............................ 86
3.5.3.2.
Axin2-Expression in vestigial tail Embryonen..................................... 88
3.5.3.3.
Ektopische Axin2-Expression nach Aktivierung des Wnt/
β-Catenin-Signalwegs in vivo ............................................................... 89
3.5.4.
Reporterstudien an transgenen Mäusen..................................................... 92
3.5.4.1.
β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der
Axin2 Promotor / Intron 1-Region ........................................................ 92
3.5.4.2.
β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der mutierten
Axin2 Promotor / Intron 1-Region ........................................................ 95
3.6. Untersuchung von Follistatin.......................................................................... 97
3.6.1.
Vergleich der Follistatin-Loci von Maus und Mensch ............................ 97
3.6.2.
Luciferase-Reporterstudien ........................................................................ 99
3.6.2.1.
Klonierung von Follistatin-Luciferase-Reporterkonstrukten.............. 99
3.6.2.2.
Stimulation des Foll 4 kb-Luc-Konstrukts durch verschiedene
TCF/β-Catenin-Komplexe..................................................................... 99
3.6.2.3.
Luciferase-Reporterstudien mit Deletionskonstrukten von
Foll 4 kb-Luc ........................................................................................ 101
3.6.2.4.
Follistatin-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen....... 103
3.6.3.
Expression von Follistatin während der Maus-Embryogenese ............. 106
3.6.3.1.
„Whole mount“ in situ Hybridisierungen von Embryonen............... 107
3.6.3.2.
In situ Hybridisierungen auf Gewebeschnitten.................................. 108
3.6.4.
Reporterstudien an transgenen Mäusen................................................... 110
3.6.4.1.
β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des
2,8 kb Follistatin-Promotors ............................................................... 110
3.6.4.2.
β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des mutierten
2,8 kb Follistatin-Promotors ............................................................... 117
4.
Diskussion........................................................................122
4.1. Zielgen-Screening auf der Grundlage des ES-Zell-Cokultursystems......... 123
4.1.1.
Anteil der mit den Microarrays in ES-Zellen detektierten Transkripte..... 123
4.1.2.
Expressionsunterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten
ES-Zellen basierend auf den Microarray-Daten ..................................... 124
4.1.3.
Ausmaß der Expressionssteigerung Wnt-induzierter Gene im
ES-Zell-Cokultursystem ........................................................................... 126
4.1.4.
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus den Microarray-Experimenten.... 129
4.1.4.1.
Überschneidung der Ergebnisse aus den einzelnen MicroarrayExperimenten ....................................................................................... 129
4.1.4.2.
Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten mittels quantitativer
RT-PCR ................................................................................................ 132
4.2. Viele der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten haben eine
regulatorische Funktion................................................................................. 133
4.3. Axin2 ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs................... 135
4.4. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg steuert die Axin2-Expression im
präsomitischen Mesoderm und im dorsalen Neuralrohr ............................. 136
4.5. Mögliche Funktion einer negativen Rückkopplung des Wnt/β-CateninSignalwegs über Axin2 im präsomitischen Mesoderm................................ 139
4.6. Andere Mechanismen der negativen Rückkopplung des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs ........................................................................... 140
4.7. Follistatin ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ........... 140
4.8. Das Promotorfragment Foll 2,8 kb enthält nicht alle Elemente, die an der
Regulation der Follistatin-Expression beteiligt sind ................................... 142
4.9. Die Expression von Follistatin in Schnurrhaarfollikeln ist wahrscheinlich
abhängig vom Wnt/β-Catenin-Signalweg .................................................... 143
4.10. Hinweise auf eine Regulation von Follistatin durch den TGFβ-Signalweg .. 145
4.11. Ein Ausblick................................................................................................... 145
5.
Zusammenfassung ..........................................................147
6.
Literaturverzeichnis.........................................................149
7.
Anhang..............................................................................165
Abkürzungsverzeichnis.................................................................................... 165
Veröffentlichungen .......................................................................................... 168
Danksagung ...................................................................................................... 169
Lebenslauf......................................................................................................... 170
Einleitung
1. Einleitung
Der Körper eines erwachsenen Menschen besteht aus geschätzten 1014 Zellen. Dabei
kann man hunderte Zelltypen voneinander unterscheiden, die in einer Vielzahl von
Organen und Geweben organisiert sind. Alle diese Zellen entstehen im Verlauf der
Ontogenese aus einer einzigen befruchteten Eizelle. Diese Zahlen lassen bereits
erkennen, welche grundlegenden Prozesse im Verlauf der Entwicklung eines
Organismus, insbesondere während der Embryonalentwicklung, ablaufen müssen.
Zellproliferation, Zelldifferenzierung und morphogenetische Prozesse, aber auch
programmierter Zelltod, führen im Verlauf der Entwicklung zur Festlegung der
Körperachsen und zur Ausbildung von Organen und Geweben. Unter
Zelldifferenzierung versteht man dabei die Spezialisierung einer Zelle hinsichtlich
ihrer Funktion. Dabei erlangen unterschiedliche Zelltypen aufgrund differentieller
Genexpression die für sie charakteristischen Eigenschaften. Durch morphogenetische
Prozesse verändert sich dagegen die Gestalt eines Organismus. Die Gastrulation und
die Bildung des Neuralrohrs bei der Wirbeltierentwicklung sind Beispiele für solche
morphogenetischen Prozesse. Auf zellulärer Ebene liegt der Morphogenese die
Veränderung der Form einer Zelle oder die Adhäsion der Zelle mit benachbarten
Zellen bzw. dem Substrat zugrunde. Die Adhäsion von benachbarten Zellen innerhalb
eines Zellverbands ist jedoch nur eine Form der zellulären Interaktion in einem sich
entwickelnden Embryo. Um zu gewährleisten, dass die Entwicklung in
reproduzierbarer Weise abläuft, müssen die verschiedenen Entwicklungsprozesse
genauestens zeitlich und räumlich koordiniert werden. Dabei spielen verschiedene
interzelluläre Kommunikationswege, die sich im Laufe der Evolution entwickelt
haben, eine entscheidende Rolle.
1.1.
Die frühe Embryonalentwicklung der Maus
Der vergleichsweise kurze Generationszyklus und die genetische Manipulierbarkeit
der Maus (Capecchi, 1989) haben dazu geführt, dass die Maus zum
Modellorganismus für die Säugerentwicklung geworden ist. Im Gegensatz zu den
Embryonen anderer Wirbeltierklassen, bei denen alle für die Entwicklung und
Versorgung des Embryos notwendigen Bestandteile bereits im Ei vorhanden sind, ist
der Säugerembryo auf die Ernährung über die Plazenta der Mutter angewiesen. Dies
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Einleitung
bedingt einige charakteristische Unterschiede in den frühen Stadien der
Embryonalentwicklung, da der Säugerembryo für die Implantation in die Gebärmutter
vorbereitet werden muss.
1.1.1.
Präimplantationsentwicklung
Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Bildung der Zygote aus Ei- und
Samenzelle. Noch vor der Befruchtung erfolgt in der Eizelle die erste meiotische
Zellteilung und der erste Polkörper wird gebildet. Erst nach der Befruchtung der
Eizelle wird die Meiose abgeschlossen und der zweite Polkörper gebildet (s. Abb.
1.1). Während der Embryo den Eileiter hinunter wandert, erfolgen die ersten
Furchungsteilungen. In dieser Phase ist der Embryo noch von der Zona pellucida,
einer schützenden Glykoproteinhülle, umgeben. Im Zweizellstadium, das etwa 24 h
nach der Befruchtung erreicht wird, wird das zygotische Genom aktiviert und die
maternale mRNA abgebaut. Nach zwei weiteren Teilungsschritten wird am Tag 2,5
p.c. das Acht-Zell-Stadium erreicht. In diesem Stadium kommt es durch die
Ausweitung der Zell-Zell-Kontakte zwischen den Blastomeren zur Kompaktion des
Embryos, in deren Verlauf die Zellen ihre apikal-basale Polarität erhalten.
Über das charakteristische Morula-Stadium entwickelt sich der Embryo weiter zum
Blasenkeim (Blastozyste) am Tag 3,5 p.c. In diesem Stadium lassen sich erstmals
zwei Zelltypen voneinander unterscheiden. Die äußeren Zellen der Morula entwickeln
sich zum Trophektoderm, die inneren Zellen der Morula bilden einen kleinen
Zellhaufen, der als innere Zellmasse bezeichnet wird. Das Trophektoderm
transportiert Flüssigkeit in das Innere der Blastozyste, wodurch ein
flüssigkeitsgefüllter Hohlraum (Blastozoel) entsteht, der an einer Seite die innere
Zellmasse trägt. Die innere Zellmasse besteht aus pluripotenten Embryonalen
Stammzellen (ES-Zellen), die ex vivo kultiviert und, nach entsprechender
Manipulation, zur Erzeugung von chimären Mäusen mit genetisch veränderten Zellen
genutzt werden können (Capecchi, 1989). Die Bildung der Blastozyste ist einer der
ersten Schritte in der Organisation der embryonalen Achsen, da der Embryo nun in
einen proximalen Anteil, der die innere Zellmasse enthält, und einen
gegenüberliegenden distalen Anteil eingeteilt werden kann. Am Tag 4,0 - 4,5 p.c.
differenziert sich ein dritter Zelltyp an der Oberfläche der inneren Zellmasse, das
primitive Entoderm, das später zur Ausbildung extraembryonaler Strukturen beiträgt.
Die übrige innere Zellmasse, das primitive Ektoderm bzw. der Epiblast, entwickelt
sich dagegen zum eigentlichen Embryo sowie zu extraembryonalen
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Einleitung
Mesodermstrukturen. Die Zellen des Trophektoderms tragen im weiteren Verlauf der
Entwicklung ausschließlich zu extraembryonalem Gewebe bei.
Nachdem sich im Blastozystenstadium die Zona pellucida abgelöst hat, erfolgt etwa
am Tag 4,5 p.c. die Einnistung der Blastozyste in die Uterusschleimhaut. Beim
Eindringen in die Uteruswand spielen spezialisierte Zellen des Trophektoderms
(Riesenzellen) eine wesentliche Rolle.
Abb. 1.1. Schematische Darstellung der frühen Mausentwicklung. Die obere Hälfte der
Abbildung zeigt die Präimplantationsentwicklung, darunter ist die Postimplatationsentwicklung bis
zum Tag 7,5 p.c. dargestellt. Zusätzlich sind die Keimblätter des 6,5 p.c. und 7,5 p.c. Tage alten
Mausembryos als flache Scheiben abgebildet, um den Vergleich mit anderen Vertebraten zu
erleichtern. Die Bezeichnung der Körperachsen wird anhand des Profils einer adulten Maus erläutert
(nähere Erläuterungen siehe Text; entnommen aus Beddington und Robertson, 1999).
1.1.2.
Postimplantationsentwicklung
Nach der Einnistung in die Uteruswand wachsen Teile des Trophektoderms zum
ektoplazentalen Kegel und extraembryonalen Ektoderm heran (etwa an Tag 5,5 p.c.).
Das viszerale Entoderm, das aus dem primitiven Entoderm hervorgegangen ist,
umhüllt den Epiblasten und das extraembryonale Ektoderm. Zusätzlich kommt es im
Epiblasten zur Ausbildung der Proamnionhöhle, wodurch der charakteristische
Eizylinder entsteht, in dem der Epiblast als becherförmiges Epithel vorliegt. Bis zu
diesem Zeitpunkt behält der Embryo morphologisch seine radiale Symmetrie bei.
Seite 3
Einleitung
Diese Symmetrie wird durchbrochen, wenn am Tag 6,5 p.c. mit der Ausbildung des
Primitivstreifens an der Übergangszone von embryonalem zu extraembryonalem
Ektoderm die Gastrulation beginnt. Mit Hilfe von molekularen Markern lässt sich
jedoch bereits vorher, am Tag 5,5 p.c., eine Gruppe von Zellen am distalen Ende des
viszeralen Entoderms von den restlichen Zellen dieser Schicht unterscheiden
(Beddington und Robertson, 1998). Diese Zellen wandern im weiteren Verlauf in ihre
Position im anterioren viszeralen Entoderm (AVE), wo sie später die Bildung
anteriorer embryonaler Strukturen beeinflussen. Die anterior-posteriore Achse des
Embryos wird also bereits festgelegt, bevor der Primitivstreifen die posteriore Seite
des Embryos auch morphologisch sichtbar macht.
Während der Gastrulation (Tag 6,5 – 7,5 p.c.) entstehen aus dem Epiblasten durch
gerichtete Zellwanderung die drei Keimblätter. Im Bereich des Primitivstreifens
durchlaufen Zellen des Epiblasten zunächst eine Epithelial-Mesenchymale Transition.
Anschließend wandern sie durch den Primitivstreifen hindurch und breiten sich nach
vorne und zur Seite hin zwischen dem primitiven Ektoderm und dem viszeralen
Entoderm aus. Auf diese Weise entsteht eine Schicht mesodermaler Zellen. Zudem
dringen einige Zellen aus dem Epiblasten in die viszerale Entodermschicht ein und
ersetzen sie schrittweise, wodurch das definitive Entoderm entsteht. Das viszerale
Entoderm wird dabei in den extraembryonalen Bereich verdrängt. Im Verlauf der
Gastrulation verlängert sich der Primitivstreifen bis zur distalen Spitze des
Eizylinders. Dabei bildet sich am Vorderende des Primitivstreifens der Primitvknoten.
Diese Struktur ist homolog zum Spemann-Organistor im Amphibien-Embryo (s.
1.5.1.) und zu den entsprechenden Strukturen im Zebrafisch- (Embryoschild) bzw. im
Hühnerembryo (Hensenscher Knoten). In Experimenten konnte gezeigt werden, dass
durch die Transplantation des Primitivknotens in heterotopische Regionen des
Embryos eine sekundäre Körperachse induziert wird (Lemaire und Kodjabachian,
1996). Zellmarkierungsexperimente (fate mapping-Experimente) haben gezeigt, dass
der Zeitpunkt und die Position des Einwanderns einzelner Zellen in den
Primitivstreifen über deren zukünftige Position innerhalb des Embryos bestimmen
(Lawson et al., 1991; Smith et al., 1994; Sulik et al., 1994; Tam und Beddington,
1987). Zellen, die am posterioren Ende in den Primitivstreifen einwandern, werden zu
extraembryonalem Mesoderm, das zur Bildung von Allantois, Amnion und
viszeralem Dottersack beiträgt, wichtigen Bestandteilen der Plazenta. Die Zellen, die
durch den mittleren Teil des Primitivstreifens wandern, tragen später zu paraxialem
Mesoderm, intermediärem Mesoderm und Seitenplattenmesoderm bei. Das axiale
Mesendoderm geht aus Zellen hervor, die durch den Primitivknoten wandern, und
Seite 4
Einleitung
bildet die Chorda dorsalis und das definitive Entoderm, aus dem sich der Darm
entwickelt. Zellen aus dem Primitivknoten tragen zusätzlich zu den Somiten und zum
Neuralrohr des Embryos bei. Etwa am Tag 7,5 p.c. ist die Gastrulation abgeschlossen,
und die embryonalen Achsen anterio-posterior, dorsal-ventral und links-rechts sind
festgelegt (Beddington und Robertson, 1999).
Die Entwicklung des Embryos schreitet nun schnell fort, wobei sich anteriore
Strukturen zuerst entwickeln. Zwischen Tag 7,5 p.c. und 8,5 p.c. beginnt die
Entwicklung von Neuralrohr, Kopf und Herz. Die Neurulation wird am vorderen
Ende des Embryos durch Signale des AVE eingeleitet. Das Neuroektoderm der
Neuralplatte faltet sich auf und schließt sich später zum Neuralrohr. Die Entwicklung
des Neuralrohrs geht einher mit dem Aufwölben der Kopffalte vom umgebenden
Ektoderm und mit der Bildung der ersten Somiten. Auf der ventralen Seite des
Embryos entwickelt sich das Herz aus den gepaarten Herzanlagen von linkem und
rechtem Seitenplattenmesoderm sowie weiteren Vorläuferzellen. Ab Tag 8,0 p.c.
beginnt die Einstülpung des Entoderms zum Vorderdarm und später zum Hinterdarm.
Eine besondere Eigenart der Mausentwicklung ist die „Inversion der Keimblätter“, die
sich darin zeigt, dass sich das Entoderm während der frühen Entwicklungsphasen in
Relation zu den anderen Keimblättern außen befindet. Die Orientierung der
Keimblätter wird erst mit der Drehung des Embryos am Tag 8,5 p.c. korrigiert, so
dass schließlich das Entoderm nach innen zu liegen kommt. Im weiteren Verlauf der
Entwicklung werden zusätzliche Somiten gebildet, aus denen sich anschließend u. a.
die Skelettmuskulatur und die Wirbelsäule bilden. Das intermediäre Mesoderm trägt
zur Bildung des Urogenitalsystem bei, während sich aus Zellen des
Seitenplattenmesoderms die Gliedmaßenknospen entwickeln. Die Entwicklung der
inneren Organe (Lunge, Magen, Pankreas, Leber) erfolgt ausgehend von
Ausstülpungen des Darmschlauchs.
1.2.
Interzelluläre Kommunikation während der Entwicklung
Die Entwicklung einer bestimmten Struktur, etwa des Neuralrohrs (s. 1.2.1.), wird in
der Embryonalentwicklung häufig durch benachbarte Strukturen beeinflusst, es findet
also Kommunikation zwischen Zellen und Geweben statt. Die interzelluläre
Kommunikation erfolgt oft nach folgendem Muster: Signale in Form von sezernierten
oder membrangebundenen Proteinen werden von einer Zelle abgegeben und von der
Zielzelle mit Hilfe von Rezeptorproteinen erkannt. Dies setzt in der Zielzelle eine
Signalkaskade in Gang und führt letztlich im Kern der Zelle zu einem veränderten
Seite 5
Einleitung
Genexpressionsmuster. Angesichts der Komplexität der Embryonalentwicklung und
der Vielzahl der zu steuernden Vorgänge würde man das Vorhandensein einer großen
Zahl an verschiedenen Signalproteinen und entsprechenden Signalwegen erwarten. In
den letzten Jahren ist man jedoch zu der Erkenntnis gelangt, dass es im Wesentlichen
sechs Signalwege sind, die das Geschick von Zellen während der
Embryonalentwicklung beeinflussen. FGF- (Powers et al., 2000), Hedgehog- (Ingham
und McMahon, 2001), TGFβ- (Massague und Wotton, 2000) und Wnt-Proteine
(Wodarz und Nusse, 1998) bilden jeweils eine Familie an sezernierten
Signalproteinen, die entsprechend bezeichnete Signalwege aktivieren. Ephrine bzw.
Delta und Serrate sind membrangebundene Proteine, die Ephrin- (Holder und Klein,
1999) bzw. Notch- (Mumm und Kopan, 2000) Rezeptoren benachbarter Zellen
stimulieren.
Diese Signalwege sind evolutionär hochkonserviert, steuern also z. B. die
Entwicklung von Drosophila, Xenopus aber auch von Säugern. Oft sind mehrere
dieser Signalwege an der Steuerung eines Entwicklungsvorgangs beteiligt, und gerade
die Kombination der verschiedenen Signalaktivitäten bewirkt einen bestimmten
Effekt. So sind zum Beispiel für die Bildung des Spemann-Organisators im XenopusEmbryo (s. 1.5.1.) die Signalaktivitäten von TGFβ- und Wnt/β-Catenin-Signalweg (s.
1.4.1.) erforderlich. Ganz wesentlich für die Reaktion einer Zielzelle auf ein
bestimmtes Signal ist jedoch auch die Kompetenz dieser Zelle, auf dieses Signal zu
reagieren. Diese Kompetenz wird von dem augenblicklichen Differenzierungszustand
der Zielzelle bestimmt, ist also z.B. abhängig von dem Repertoire an
Oberflächenrezeptoren oder Transkriptionsfaktoren, die von der Zelle gerade
exprimiert werden. Die Tatsache, dass unterschiedlich differenzierte Zellen sich in
ihrer Antwort auf ein bestimmtes Signal unterscheiden können, erklärt auch, warum
es nur relativ weniger Signalwege bedarf, um eine wesentlich größere Zahl an
Entwicklungsprozessen zu steuern.
1.3.
Wnt-Proteine
binden
an
Frizzled-Rezeptoren
und
LRP-Corezeptoren
Die Familie der Wnt-Proteine bildet eine der wichtigsten Klassen von
Signalmolekülen während der Entwicklung. Wnt-Gene definieren sich durch ihre
Sequenzhomologie zu den zuerst identifizierten Vertretern dieser Genfamilie, Wnt1
aus der Maus (Nusse und Varmus, 1982; van Ooyen und Nusse, 1984) und wingless
aus Drosophila (Cabrera et al., 1987; Rijsewijk et al., 1987; Sharma und Chopra,
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1976). Wnt1 wurde zunächst als bevorzugte Integrationsstelle eines Maus-Tumorvirus
(MMTV) beschrieben, und daher als Proto-Onkogen Int-1 bezeichnet. Das
Drosophila-Gen wingless wurde benannt nach dem Phänotyp der DrosophilaMutante, in der dieses Gen defekt war. Erst die Klonierung und Sequenzierung beider
Gene deckte auf, dass es sich um Homologe handelt, weshalb die Bezeichnungen
wingless und Int-1 später zum Begriff Wnt zusammengefasst wurden.
Mittlerweile wurden etwa 100 Wnt-Gene aus den verschiedensten Organismen, von
Hydra (Hobmayer et al., 2000) bis zum Menschen, isoliert. Allein in den Genomen
von Maus und Mensch konnten jeweils 19 Wnt-Gene identifiziert werden (s. WntHomepage: www.stanford.edu/~rnusse/). Alle diese Gene codieren für Cystein-reiche
Glycoproteine mit etwa 350-400 Aminosäuren, die von den produzierenden Zellen
sezerniert werden. Wnt-Proteine binden an Oberflächenrezeptoren der FrizzledFamilie (Fz), das sind Membranproteine mit sieben Transmembrandomänen und
einem Cystein-reichen N-Terminus, der an der Interaktion zwischen Ligand und
Rezeptor maßgeblich beteiligt ist (Bhanot et al., 1996; Dann et al., 2001; Vinson et
al., 1989). Auch die Frizzled-Gene bilden eine Multigenfamilie mit 9 Vertretern in der
Maus und 10 im menschlichen Genom. Zudem konnte kürzlich gezeigt werden, dass
Vertreter der LDL-Rezeptor-verwandten Proteine, LRP5 und LRP6 in Vertebraten
sowie arrow in Drosophila, als Corezeptoren für Wnt-Proteine fungieren (Pinson et
al., 2000; Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000).
1.4.
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist einer von mehreren
Wnt-Signalwegen
Es wird immer deutlicher, dass Wnt-Proteine, nach der Bindung an ihre Rezeptoren,
eine Reihe von divergierenden Signalwegen aktivieren können (Huelsken und
Birchmeier, 2001; Pandur et al., 2002). In Vertebraten existieren neben dem Wnt/βCatenin-Signalweg (s. 1.4.1.) noch der Wnt/Ca2+-Signalweg (Kuhl et al., 2000) und
der Wnt/JNK-Signalweg (Boutros et al., 1998) (s. 1.4.2.).
1.4.1.
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg, auch als kanonischer Wnt-Signalweg bezeichnet,
wurde zuerst identifiziert und ist deshalb auch am Besten erforscht. Das Protein βCatenin spielt dabei eine zentrale Rolle. β-Catenin nimmt in der Zelle zwei
unterschiedliche Funktionen wahr. Einerseits ist β-Catenin an der Verknüpfung von
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Cadherin-Zelladhäsionsmolekülen mit dem Cytoskelett beteiligt. β-Catenin bindet an
die cytoplasmatische Domäne von klassischen Cadherinen und gleichzeitig an αCatenin, das wiederum direkt mit Actin-Filamenten interagiert (Aberle et al., 1996;
Vleminckx und Kemler, 1999). Andererseits findet man β-Catenin auch im
Cytoplasma und im Kern von Zellen. Dort interagiert β-Catenin mit DNA-bindenden
Proteinen der LEF/TCF-Familie und nimmt als deren Cotransaktivator Einfluss auf
die Expression von Zielgenen (Behrens et al., 1996; Huber et al., 1996; van de
Wetering et al., 1997). Die spezifische Bindung an das Sequenzmotiv 5’CTTTGA/TA/T-3’ erfolgt dabei ausschließlich über die HMG-Domäne der LEF/TCFFaktoren (Giese et al., 1991; van de Wetering et al., 1991). Die CotransaktivatorFunktion von β-Catenin wird vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert, indem die
Menge an β-Catenin-Protein, das nicht in Zelladhäsionskomplexen gebunden ist,
reguliert wird. Abb. 1.2 zeigt schematisch wie diese Regulation abläuft.
Abb. 1.2. Schematische Darstellung des Wnt/β-Catenin Signalwegs. (A) In Abwesenheit eines
Wnt-Signals wird β-Catenin, das nicht mit Cadherinen assoziiert ist, in der Zelle abgebaut. Der Abbau
wird durch die Phosphorylierung von β-Catenin an N-terminalen Aminosäureresten eingeleitet.
Phosphoryliertes β-Catenin wird von dem F-Box-Protein βTrCP erkannt, und nach Ubiquitinierung
dem Proteasom zugeführt. (B) Durch die Bindung von Wnt-Proteinen an Frizzled-Rezeptoren und
LRP-Corezeptoren wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die dafür sorgt, dass der β-CateninDegradationskomplex aus Axin, APC, GSK3β und CK1α auseinanderfällt. β-Catenin wird nicht länger
phosphoryliert, weshalb der Abbau gestoppt wird und β-Catenin in der Zelle akkumuliert. Durch die
Bindung von β-Catenin an LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren wird im Zellkern die Transkription von
Zielgenen aktiviert. Nähere Erläuterungen siehe Text.
In Abwesenheit eines Wnt-Signals (Abb. 1.2 A) bindet β-Catenin an einen
Proteinkomplex, dessen zentrales Element Axin (Zeng et al., 1997) bzw. das AxinHomolog Axin2 (Conductin) ist (Behrens et al., 1998). Axin bildet zusammen mit
dem Genprodukt des Tumorsuppressorgens APC (Groden et al., 1991; Kinzler et al.,
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1991) ein Gerüst, an das neben β-Catenin auch die beiden Kinasen GlycogenSynthase–Kinase 3β (GSK3β) und Casein-Kinase 1α (CK1α) binden (Behrens et al.,
1998; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998; Polakis, 2002). Dieser Proteinkomplex
ermöglicht die Phosporylierung von β-Catenin an N-terminalen Serin- und ThreoninResten durch CK1α und GSK3β (Amit et al., 2002; Liu et al., 2002; Yanagawa et al.,
2002). Phosphoryliertes β-Catenin wird von dem F-Box-Protein β-TrCP erkannt
(Jiang und Struhl, 1998; Marikawa und Elinson, 1998) und anschließend ubiquitiniert
und im Proteasom abgebaut (Aberle et al., 1997). Die Expression von Zielgenen des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs wird in Abwesenheit eines Wnt-Signals durch einen
Repressorkomplex aus TCF-Transkriptionsfaktoren und verschiedenen Corepressoren
(z. B. Groucho) verhindert (Cavallo et al., 1998; Roose et al., 1998). Der
reprimierende Effekt wird dabei durch Histon-Deacetylasen vermittelt, die vom
Repressorkomplex rekrutiert werden (Chen et al., 1999).
Die Bindung eines Wnt-Proteins an seine Rezeptoren Frizzled und LRP5/6 (s. Abb.
1.2 B) führt dazu, dass der Abbau von β-Catenin gestoppt wird und β-Catenin in der
Zelle akkumuliert. Viele der Proteine, die an der Wnt/β-Catenin-Signalleitung
beteiligt sind, konnten identifiziert werden, wie die Signaltransduktion genau abläuft,
ist jedoch noch nicht verstanden. Abb. 1.2 B zeigt das Modell, das im Moment
favorisiert wird (s. Wnt-Homepage: www.stanford.edu/~rnusse/). Über einen noch
unbekannten Mechanismus wird das Wnt-Signal vom Frizzled/LRP-Rezeptorkomplex
zum Protein Dishevelled (Dsh) geleitet, wobei es zur Aktivierung dieses Proteins
kommt. Die Phosphorylierung von Dishevelled durch die Casein-Kinase 1ε, einen
Interaktionspartner von Dishevelled, scheint ein wesentlicher Schritt dieser
Aktivierung zu sein (Peters et al., 1999; Sakanaka et al., 1999). Dishevelled bindet an
Axin, wodurch der β-Catenin-Degradationskomplex aus Axin, APC, CK1α und
GSK3β inaktiviert wird (Farr et al., 2000; Li et al., 1999; Salic et al., 2000). Eine
wichtige Rolle kommt dabei dem GSK3-Bindeprotein (GBP) zu, einem weiteren
Interaktionspartner von Dishevelled. GBP bindet an GSK3β und verhindert die
Interaktion zwischen GSK3β und Axin (Farr et al., 2000). Als Konsequenz wird βCatenin nicht mehr von GSK3β phosphoryliert und infolgedessen nicht mehr von βTrCP erkannt. Auf diese Weise wird der Abbau von β-Catenin über den
Proteasomweg verhindert, und es kommt zur Akkumulation des Proteins im
Cytoplasma und im Kern der Zelle. Der Kerntransport von β-Catenin erfolgt dabei
zumindest teilweise über dessen Interaktion mit LEF/TCF-Faktoren (Huber et al.,
1996). Im Kern ersetzt β-Catenin die an TCF gebundenen Corepressoren und fungiert
seinerseits als Coaktivator. Dabei rekrutiert β-Catenin verschiedene andere Proteine,
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wie z.B. p300/CBP (Hecht et al., 2000) oder Pontin52 (Bauer et al., 2000), und stellt
so u.a. den Kontakt zur basalen Transkriptionsmaschinerie her (Hecht und Kemler,
2000).
Die Interaktion zwischen Axin und dem Wnt-Corezeptor LRP5/6, die als Antwort auf
ein Wnt-Signal beobachtet wird, ist vielleicht ein wesentlicher Schritt in der frühen
Phase der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion (Mao et al., 2001) und wurde in dem in
Abb. 1.2 B gezeigten Modell bereits berücksichtigt. Kürzlich veröffentlichte
Ergebnisse aus Experimenten an Drosophila-Mutanten mit einem Defekt in GSK3β
(Zw3 in Drosophila) lassen sogar den Schluss zu, dass die Wnt/β -CateninSignaltransduktion über den Frizzled/LRP-Rezeptorkomplex und Axin unabhängig
von GSK3β erfolgen kann (Tolwinski et al., 2003). Die Autoren postulieren einen
alternativen Signalweg, in dem Axin durch die Bindung an LRP5/6 destabilisiert und
abgebaut wird. Durch den Abbau von Axin würde bisher gebundenes β-Catenin
freigesetzt und könnte im Kern seine Signalfunktion erfüllen. Tatsächlich konnte
schon früher gezeigt werden, dass die Stabilität von Axin und die Interaktion
zwischen Axin und β-Catenin über den Phosphorylierungszustand von Axin (s. Abb.
1.2 B) Wnt-abhängig reguliert werden – allerdings unter Einbeziehung von
GSK3β (Willert et al., 1999; Yamamoto et al., 1999). Über die Existenz eines von
GSK3β unabhängigen Wnt/β-Catenin-Signalwegs auch in anderen Organismen ist
bisher nichts bekannt.
1.4.2.
Alternative Wnt-Signalwege und Signalspezifität
Wie eingangs schon erwähnt, existieren in Vertebraten neben dem Wnt/β-CateninSignalweg noch zwei weitere Wnt-abhängige Signalwege, der Wnt/Ca2+-Signalweg
(Kuhl et al., 2000) und der Wnt/JNK-Signalweg (Boutros et al., 1998).
Beim Wnt/Ca2+-Signalweg erfolgt die Signalleitung vom aktivierten FrizzledRezeptor über trimere G-Proteine (Slusarski et al., 1997), die das Enzym
Phospholipase C zur Produktion der Signalmoleküle Diacylglycerol (DG) und
Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) anregen. Dadurch kommt es zur Freisetzung von
Ca2+-Ionen aus zellulären Speichern und in der Folge zur Aktivierung Ca2+-abhängiger
Kinasen wie CamKII und PKC (Kuhl et al., 2000). Der Wnt/JNK-Signalweg weist
Ähnlichkeiten zu dem Signalweg auf, der in Drosophila die planare Zellpolarität
kontrolliert. Die Signalleitung erfolgt vom aktivierten Frizzled-Rezeptor über das
Protein Dishevelled (s. 1.4.1.) und führt zunächst zur Aktivierung der GTPase Rho
(Habas et al., 2001) und im weiteren Verlauf zur Aktivierung der Jun N-terminalen
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Kinase (JNK) (Boutros et al., 1998). Daneben gibt es Anzeichen für die Existenz
weiterer Wnt-abhängiger Signalwege in Drosophila und dem Fadenwurm
Caenorhabditis elegans (Huelsken und Birchmeier, 2001; Pandur et al., 2002).
Angesichts der dargestellten Vielfalt an Wnt-abhängigen Signalwegen stellt sich die
Frage, wie die Spezifität eines Wnt-Signals gewährleistet werden kann. Darüber ist
bisher nicht viel bekannt. Es wurde der Versuch gemacht, die verschiedenen WntLiganden und Frizzled-Rezeptoren anhand funktioneller Tests den verschiedenen
Signalwegen zuzuordnen (Du et al., 1995; Kuhl et al., 2000; Torres et al., 1996; Wong
et al., 1994). Einer dieser funktionellen Versuche bestand in der Überexpression
verschiedener Wnt-Proteine in Xenopus-Embryonen. Anhand der Fähigkeit der
verschiedenen Wnt-Liganden, eine zweite Körperachse zu induzieren (s.1.5.1.),
wurden die Wnt-Gene in zwei Kategorien unterteilt, die Xenopus Wnt1-Klasse
(Xwnt1) sowie die XWnt5a-Klasse (Du et al., 1995; Torres et al., 1996). Liganden der
XWnt1-Klasse (XWnt1, XWnt3a, XWnt8 und XWnt8b) induzieren eine Doppelachse,
während Liganden der XWnt5a-Klasse (XWnt4, XWnt5a und XWnt11) dazu nicht in
der Lage sind. Die Signalleitung von Wnt-Proteinen der XWnt1-Klasse erfolgt
wahrscheinlich bevorzugt über den Wnt/β-Catenin-Signalweg (s. 1.5.1.), die der
anderen Liganden über alternative Wnt-Signalwege. Die Spezifität der Interaktion
zwischen den verschiedenen Wnt-Liganden und Frizzled-Rezeptoren ist noch wenig
erforscht, ebenso wie die mögliche Zuordnung der einzelnen Frizzled-Rezeptoren zu
den verschiedenen Wnt-Signalwegen. Ergebnisse aus Drosophila deuten aber darauf
hin, dass tatsächlich funktionelle Unterschiede zwischen Frizzled-Rezeptoren
bestehen, und zwar sowohl hinsichtlich ihrer Affinität zu einzelnen Wnt-Liganden
(Rulifson et al., 2000) als auch hinsichtlich der Signalleitung (Boutros et al., 2000).
Auch jenseits der Ligand/Rezeptor-Interaktion ist nicht viel darüber bekannt, wie
Signalspezifität erreicht wird. Das Protein Diversin (Schwarz-Romond et al., 2002)
scheint zwischen Wnt/β-Catenin-Signalweg und Wnt/JNK-Signalweg zu vermitteln.
Dishevelled ist an der Signalleitung von Wnt/β-Catenin-Signalweg und Wnt/JNKSignalweg beteiligt, jedoch nicht in den Wnt/Ca2+-Signalweg involviert. Dishevelled
dürfte deshalb ebenfalls eine Schlüsselrolle bei der Interpretation der verschiedenen
Wnt-Signale zukommen (Wharton, 2003).
1.5.
Wnt-Signale in Vertebratenentwicklung und Pathogenese
Wnt-Signale sind im Verlauf der Embryonalentwicklung an der Steuerung vieler
verschiedener Prozesse beteiligt. Die folgende Darstellung beschränkt sich auf einige
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Einleitung
Funktionen von Wnt-Proteinen in Vertebraten, obwohl die Einflüsse des WntSignalwegs auf die Entwicklung von Invertebraten ebenso mannigfaltig sind.
1.5.1.
Die Etablierung der primären Körperachse in Xenopus-Embryonen
Der Krallenfrosch Xenopus laevis war der erste Wirbeltierorganismus, an dem die
Rolle von Wnt-Proteinen in der Vertebratenentwicklung intensiv erforscht wurde. Die
Injektion von Wnt1-mRNA in ventrale Blastomere des frühen Xenopus-Embryos
führte zu einer Duplikation der Körperachse (McMahon und Moon, 1989) (s. 1.4.2.).
Dieser Phänotyp erinnerte stark an den Phänotyp, den Spemann und Mangold in
Molchembryonen beobachtet hatten, nachdem sie diesen im frühen Gastrula-Stadium
die dorsale Urmundlippe einer anderen Gastrula in eine ventrale Region eingepflanzt
hatten (Spemann und Mangold, 1924). Spemann und Mangold fanden damals heraus,
dass die zweite Körperachse vom transplantierten Gewebe induziert wurde, weshalb
sie die transplantierte Region (die dorsale Urmundlippe) als Organisator-Region
bezeichneten. Die Ergebnisse von McMahon und Moon deuteten darauf hin, dass die
injizierte Wnt1-mRNA die Entstehung eines solchen Organisators in der ventralen
Region des Xenopus-Embryos bewirkte. Es war daher nahe liegend, zu vermuten, dass
ein Wnt-Signal auch an der Entstehung der primären Körperachse beteiligt ist.
Durch weitere Versuche konnte schließlich gezeigt werden, dass der Wnt/β-CateninSignalweg tatsächlich an der Etablierung des endogenen Organistors im AmphibienEmbryo mitwirkt (Moon und Kimelman, 1998). Dies geschieht über die Aktivierung
von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in der dorsalen Region des Embryos.
β-Catenin akkumuliert während der frühen Furchungsstadien in den dorsalen
Blastomeren des Xenopus-Embryos, wobei noch nicht geklärt ist, ob diese
Akkumulation durch ein lokales Wnt-Signal eingeleitet wird. Nach der Translokation
in den Kern der dorsalen Blastomere interagiert β-Catenin mit dem HMG BoxTranskriptionsfaktor XTCF3 und aktiviert so u. a. die Expression der HomeoboxGene Siamois (Brannon et al., 1997) und Twin (Laurent et al., 1997). Beides sind
direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (s. 1.6.) in den dorsalen Blastomeren
des Xenopus-Embryos. Die Aktivierung dieser Gene ist notwendig, um die Expression
Organisator-spezifischer Gene wie Goosecoid zu induzieren. Die Analyse des
Goosecoid-Promotors (Laurent et al., 1997; Watabe et al., 1995) hat gezeigt, dass der
Homeobox-Transkriptionsfaktor Twin an eine Region des Promotors bindet, von der
bereits bekannt war, dass sie die Wnt-abhängige Regulation des Goosecoid-Gens
vermittelt. Goosecoid ist also ein indirektes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
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Einleitung
(s. 1.6.). Zudem wurde gezeigt, dass Goosecoid auch vom TGFβ-Signalweg reguliert
wird (Watabe et al., 1995). Dieser Signalweg ist in der gesamten vegetalen Hälfte des
frühen Amphibien-Embryos aktiv (Moon und Kimelman, 1998). Für die Entstehung
des Spemann-Organisators und der Körperachse im Amphibien-Embryo ist also die
Integration der Signalaktivitäten von Wnt/β-Catenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg
notwendig (Nishita et al., 2000).
1.5.2.
Wnt-Signale während der Mausentwicklung
Die Analyse von sog. knock out-Mäusen (Capecchi, 1989), in denen Wnt-Gene bzw.
Elemente des Wnt/β-Catenin-Signalwegs gezielt ausgeschaltet sind, hat wesentlich
zur Aufklärung der Funktion dieser Gene in der Entwicklung beigetragen. Sowohl
Wnt3 (Liu et al., 1999) als auch β-Catenin (Haegel et al., 1995) wurden in Mäusen
inaktiviert, was jeweils zu einem Abbruch der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt
der Gastrulation führte. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die ektopische
Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs während der frühen Mausentwicklung
auch in diesem Organismus zur Bildung einer zweiten Körperachse führt (Popperl et
al., 1997; Zeng et al., 1997). Zusammen zeigen die Daten, dass der Wnt/β-CateninSignalweg auch in der Maus an der Etablierung der Körperachse beteiligt ist (s.
1.5.1.). Weitere Wnt-Phänotypen sind z.B. der Verlust von Mittelhirn- und Kleinhirn
in Wnt1-defizienten Mäuse (McMahon und Bradley, 1990), sowie die beeinträchtigte
Entwicklung des Urogenitalsystems in Wnt4-defizienten Mäusen (Stark et al., 1994;
Vainio et al., 1999). Auch die Entwicklung der Gliedmaßen wird maßgeblich von
Wnt-Signalen beeinflusst. So weisen Wnt5a-defiziente Mäuse neben anderen
Defekten erheblich verkürzte Gliedmaßen auf (Yamaguchi et al., 1999a), während bei
Wn7a-defizienten Mäuse u.a. die dorso-ventrale sowie anterio-posteriore
Musterbildung in den Gliedmaßen gestört ist (Parr und McMahon, 1995).
Experimente an Hühnerembryonen haben zudem gezeigt, dass der Wnt/β-CateninSignalweg auch bei der Inititation der Gliedmaßenentwicklung entscheidend mitwirkt
(Kawakami et al., 2001).
Auch Wnt3a-defiziente Mäuse (Takada et al., 1994) zeigen einen interessanten
Phänotyp. Die Expression von Wnt3a im Mausembryo beginnt normalerweise am Tag
7,0 p.c. im Primitivstreifen und wird in dieser Struktur bis zum Ende der Gastrulation
aufrechterhalten. In späteren Entwicklungsstadien (E 9,5 – 10,5 d.p.c.) wird Wnt3a in
der Schwanzknospe und im dorsalen Neuralrohr exprimiert (Takada et al., 1994).
Wnt3a-defiziente Mausembryonen zeigen den vollständigen Verlust der caudal zu den
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vorderen Gliedmaßen gelegenen Somiten, was zu einer Verkürzung der Körperachse
führt. Die Schwanzknospe wird in diesen Embryonen nicht ausgebildet und auch das
caudale Neuralrohr ist missgebildet (Takada et al., 1994). Erstaunlicherweise bildet
sich statt des paraxialen Mesoderms eine Art ektopisches Neuralrohr. Dies deutet
darauf hin, dass das Wnt3a-Signal während der Gastrulation an der Determinierung
von mesodermalem gegenüber ektodermalem Zellschicksal beteiligt ist (Yoshikawa et
al., 1997). Weitere Untersuchungen zeigten, dass das mesoderm-spezifisch
exprimierte T-Box Gen Brachyury (Herrmann et al., 1990) ein direktes Zielgen des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs ist (Arnold et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999b), und
dass die Brachyury-Expression im anterioren Primitivstreifen von Wnt3a-defizienten
Embryonen verloren geht (Yamaguchi et al., 1999b). Brachyury-defiziente
Embryonen zeigen ebenfalls einen Verlust mesodermaler Strukturen caudal zu den
vorderen Extremitäten (Herrmann et al., 1990), was den Phänotyp der Wnt3adefizienten Embryonen erklärt. Eine mildere Form des Wnt3a-Phänotyps findet man
in vestigial tail-Mäusen (Greco et al., 1996) (s. 3.5.3.2.), die eine spontane Mutation
in der regulatorischen Region des Wnt3a-Gens aufweisen.
1.5.3.
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg in der Pathogenese
Die Klonierung des ersten Wnt-Gens der Maus (Wnt1, s. 1.3.) im Zusammenhang mit
der Integration eines Maus-Tumorvirus in benachbarte Regionen dieses Gens war
gleichzeitig der erste Hinweis auf eine Verbindung zwischen Wnt-Signalen und
Tumorentstehung (Nusse und Varmus, 1982; van Ooyen und Nusse, 1984).
Zwischenzeitlich
wurden
viele
Komponenten
der
Wnt/β-Catenin-
Signaltransduktionskette identifiziert (s. 1.4.1.), und es wurde deutlich, dass Gene, die
für Elemente des Wnt/β-Catenin-Signalweg codieren, in vielen menschlichen
Tumoren Mutationen aufweisen (Bienz und Clevers, 2000; Polakis, 2000). Dabei sind
vor allem Komponenten des β-Catenin-Degradationskomplexes wie APC und
Axin/Axin2 betroffen. Die Mutation des APC-Gens im Genom von FAP-Patienten
(familial adenomatous polyposis) führt zu einer vererbbaren Form von
Dickdarmkrebs (Kinzler und Vogelstein, 1996). Es wurden aber auch Mutationen im
β-Catenin-Gen gefunden, die den N-terminalen Bereich des Proteins verändern. Es
wurde bereits erwähnt, dass über die Phosphorylierung N-terminaler Aminosäurereste
durch den β-Catenin-Degradationskomplex der Abbau von β-Catenin eingeleitet wird
(s. 1.4.1.). Alle diese Mutationen beeinträchtigen den Abbau von β-Catenin und
bewirken so eine Stabilisierung des Proteins im Cytoplasma. Dadurch kommt es zu
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einer konstitutiven Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs und zur Expression
von TCF/β-Catenin-Zielgenen. Die Identifizierung einiger dieser Zielgene gab
Hinweise darauf, auf welche Weise die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
die Tumorentstehung begünstigt. So wurde gezeigt, dass der Zellzyklusregulator
Cyclin D1 und das Proto-Onkogen c-myc direkte Zielgene des Wnt/β-CateninSignalwegs sind (He et al., 1998; Tetsu und McCormick, 1999). Über die Steuerung
dieser Gene nimmt der Wnt/β-Catenin-Signalweg Einfluss auf die Zellproliferation.
1.6.
Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
Die bisher angeführten Beispiele für die Funktion von Wnt-Signalen während der
Entwicklung und Pathogenese haben verdeutlicht, wie wichtig die Identifizierung von
Wnt-Zielgenen für das Verständnis dieser Prozesse ist. Basierend auf dem
Mechanismus, der zur Genaktivierung führt, kann man zwischen direkten und
indirekten Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs unterscheiden. Direkte Zielgene
enthalten funktionelle LEF/TCF-Bindestellen in den regulatorischen Sequenzen und
werden von TCF/β-Catenin-Komplexen reguliert. Im Gegensatz dazu erfolgt die
Aktivierung indirekter Zielgene nicht über TCF/β-Catenin-Komplexe, sondern über
andere Transkriptionsfaktoren, die ebenfalls Wnt-abhängig reguliert werden.
Die Xenopus Homeobox-Gene Siamois und Twin (s. 1.5.1.) sind Beispiele für direkte
Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Brannon et al., 1997; Laurent et al., 1997).
Twin ist wiederum an der Regulation von Goosecoid beteiligt, einem indirekten
Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Laurent et al., 1997) (s. 1.5.1.). Das
Xenopus-Gen Siamois war das erste Gen, für das die Regulation über TCF/β-CateninKomplexe gezeigt werden konnte (Brannon et al., 1997). Aufgrund seiner dorsalen
Expression und der Tatsache, dass die Injektion von Siamois-mRNA in ventrale
Blastomere die Bildung einer sekundären Körperachse induziert (Lemaire et al.,
1995), war vermutet worden, dass Siamois über den Wnt/β-Catenin-Signalweg
reguliert wird (s. 1.5.1.). Die gleichen Überlegungen führten auch zur Identifizierung
der Zielgene Twin und Xnr3 (Laurent et al., 1997; McKendry et al., 1997). Weitere
Xenopus-Gene, die β-Catenin-abhängig reguliert werden, sind Fibronectin,
Engrailed-2 und Connexin43 (Gradl et al., 1999; McGrew et al., 1999; van der
Heyden et al., 1998). Die Untersuchung von Zebrafisch-Entwicklungsmutanten führte
zur Identifizierung der Wnt/β-Catenin-Zielgene Bozozok und Nacre (Dorsky et al.,
2000; Ryu et al., 2001).
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Zu Beginn dieser Arbeit war die Zahl der bekannten Wnt/β-Catenin-Zielgene aus
Säugetieren gering. Die meisten Wnt-Zielgene aus Säugern waren mit Hilfe von
menschlichen Tumorzelllinien identifiziert worden, in denen der Wnt/β-CateninSignalweg konstitutiv aktiv ist (s. 1.5.3.). Mit Cyclin D1 und c-myc wurden bereits
zwei Beispiele genannt (He et al., 1998; Tetsu und McCormick, 1999). Neben diesen
waren noch Tcf1, PPARδ, c-jun, fra-1, sowie MMP-7 als direkte Zielgene bekannt
(Crawford et al., 1999; He et al., 1999; Mann et al., 1999; Roose et al., 1999).
Die einzigen identifizierten Wnt/β-Catenin-Zielgene der Maus waren zu diesem
Zeitpunkt Brachyury (Arnold et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999b), Cdx1 (Lickert et
al., 2000), WISP-1 (Pennica et al., 1998), Cyclooxygenase-2 (Howe et al., 1999) und
sFRP2 (Lescher et al., 1998), wobei nur für Brachyury und Cdx1 eine direkte
Regulation über LEF/TCF-Bindestellen gezeigt werden konnte. Seit dieser Zeit ist die
Zahl identifizierter Wnt-Zielgene stark gestiegen (s. Wnt-Homepage:
www.stanford.edu/~rnusse/). Angesichts der großen Zahl an Wnt-Genen im Genom
von Säugern, der Vielfalt der Genexpressionsmuster und der teilweise dramatischen
Phänotypen, die sich beim Verlust einzelner Wnt-Gene in knock out-Mäusen zeigen
(s. 1.5.2.), ist jedoch zu erwarten, dass noch wesentlich mehr Zielgene des Wnt/βCatenin-Signalwegs existieren.
1.7.
Das ES-Zell-Cokultursystem
Die Identifizierung der oben genannten Wnt/β-Catenin-Zielgene aus Xenopus und
Zebrafisch erfolgte jeweils nach Hinweisen auf eine mögliche Wnt-abhängige
Regulation dieser Gene durch Genexpressionsanalysen oder funktionelle Tests bzw.
vorhandene Entwicklungsmutanten (Brannon et al., 1997; Dorsky et al., 2000;
Laurent et al., 1997; McKendry et al., 1997; Ryu et al., 2001). Solche „Kandidaten“Ansätze sind limitiert und erfordern unter Umständen aufwändige Vorarbeiten. Eine
alternative Vorgehensweise zur Zielgen-Identifizierung ist der Einsatz von
kultivierten Zellen, in denen der Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert ist. Das Beispiel
der Tumorzelllinien wurde bereits angeführt (s. 1.6.), eine weitere Möglichkeit bietet
jedoch das ES-Zell-Cokultursystem (Arnold et al., 2000). Das ES-ZellCokultursystem wurde mit dem Ziel etabliert, entwicklungsbiologisch relevante
Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu identifizieren, für die noch keine
Hinweise auf eine Wnt-abhängige Regulation aus z.B. Genexpressionsanalysen
vorliegen.
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ES-Zellen (s. 1.1.1.) sind pluripotent, d.h. sie sind in der Lage, sich in alle Zelltypen
des Organismus zu differenzieren (Evans und Kaufman, 1981; Martin, 1981). Es
wurde gezeigt, dass ES-Zellen Frizzled-Rezeptoren und alle notwendigen
Komponenten der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktionskette exprimieren (Arnold et al.,
2000). Nach Stimulation durch Wnt-Proteine wurde in ES-Zellen die Stabilisierung
von cytoplasmatischem β-Catenin und die Expression eines TCF/β-Cateninregulierten Reportergens beobachtet (Arnold et al., 2000). Die Identifizierung der
Wnt/β-Catenin-Zielgene Brachyury (Arnold et al., 2000) und Cdx1 (Lickert et al.,
2000) mit Hilfe von Wnt-stimulierten ES-Zellen zeigt, dass diese Eigenschaften
genutzt werden können, um neue Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu finden.
Abb. 1.3. Prinzip des ES-Zell-Cokultursystems. Maus ES-Zellen werden auf eine konfluente
Zellschicht von Wnt-sezernierenden Fibroblasten ausgebracht. Im Verlauf der nächsten 24 h werden
die beiden Zelltypen gemeinsam kultiviert (24 h Cokultur). Sezernierte Wnt-Proteine binden an die
Rezeptoren der ES-Zellen (Frizzled-Rezeptoren und LRP-Corezeptoren). Nach Aktivierung des Wnt/βCatenin-Signalwegs kommt es zur Expression von TCF/β-Catenin-Zielgenen in den ES-Zellen. Nach
Ablauf der Cokultur wird die Gesamt-RNA aus Fibroblasten und ES-Zellen isoliert.
Abb. 1.3 zeigt das Prinzip des ES-Zell-Cokultursystems. Kultivierte ES-Zellen
werden auf einen Zellrasen aus NIH 3T3-Fibroblasten ausgebracht. Die Fibroblasten
wurden vorher stabil mit einem Expressionsvektor für das Wnt1-Gen transfiziert und
exprimieren daher diesen Wnt-Liganden. Während einer Phase, in der die beiden
Zelltypen gemeinsam kultiviert werden (deshalb Cokultur), kommen die ES-Zellen in
den Kontakt mit den sezernierten Wnt1-Proteinen, wodurch der Wnt/β-CateninSignalweg in den ES-Zellen aktiviert und Zielgene dieses Signalwegs exprimiert
Seite 17
Einleitung
werden. Durch den Vergleich der Genexpressionsprofile von Wnt-stimulierten ESZellen und ES-Zellen eines Kontrollexperiments können diese Zielgene identifiziert
werden.
1.8.
Die Erstellung von Genexpressionsprofilen mit Hilfe von
DNA-Microarrays
Die auf der Paarung von komplementären Nukleinsäuresträngen basierende Detektion
und Quantifizierung von Nukleinsäuren durch Southern- bzw. NorthernHybridisierung
gehört
seit
langem
zu
den
Standardmethoden
der
molekularbiologischen Forschung (Southern, 1975). Mit Hilfe der NorthernHybridisierung können mRNA-Moleküle nachgewiesen werden, diese Methode
eignet sich also grundsätzlich für die Detektion von Expressionsunterschieden
zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen. Allerdings wird bei der NorthernHybridisierung in jedem Experiment nur eine einzige Transkriptsorte detektiert,
weshalb diese Methode für die Erstellung von Genexpressionsprofilen nicht in Frage
kommt.
Die Detektion von Nukleinsäure-Molekülen mit Hilfe von DNA-Microarrays basiert
ebenfalls auf der Paarung von komplementären Nukleinsäuresträngen, DNAMicroarrays ermöglichen aber die Detektion vieler verschiedener Transkripte in
einem einzigen Experiment (Lockhart et al., 1996; Lockhart und Winzeler, 2000).
DNA-Microarrays bestehen aus einem Trägermaterial (Glas oder Kunststoff), auf das
in sehr hoher Dichte viele verschiedene Nukleinsäuremoleküle aufgebracht wurden,
wobei die genaue Position jeder DNA-Spezies bekannt ist. Bezogen auf die Art der
Fertigung und die Größe der aufgebrachten Nukleinsäuren kann man zwei
verschiedene Typen solcher DNA-Microarrays unterscheiden, cDNA-Microarrays
und Oligonukleotid-Microarrays. Bei der Herstellung von cDNA-Microarrays werden
fertig synthetisierte und gelöste Nukleinsäuremoleküle in feinen Tropfen auf den
Träger pipettiert, wo sie fixiert werden. Dagegen werden die Nukleinsäuren der
Oligonukleotid-Microarrays durch ein Verfahren, dass photolithographische
Methoden und DNA-Festphasensynthese verbindet, direkt auf dem Trägermaterial
synthetisiert (Lipshutz et al., 1999; McGall et al., 1996). Während cDNA-Microarrays
grundsätzlich auch Nukleinsäuren unbekannter Sequenz tragen können, sind für die
Fertigung der Oligonukleotid-Microarrays genaue Sequenzinformationen notwendig
(Lockhart und Winzeler, 2000). Beide Microarray-Typen ermöglichen die parallele
Seite 18
Einleitung
Detektion von vielen Tausend verschiedenen Transkripten, weshalb sie für die
Erstellung von Genexpressionsprofilen hervorragend geeignet sind.
1.9.
Aufbau von Affymetrix-Microarrays
Für die Erstellung von Genexpressionsprofilen von ES-Zellen aus dem ES-ZellCokultursystem wurden im Verlauf dieser Arbeit Oligonukleotid-Microarrays der
Firma Affymetrix verwendet (s. 2.3.1.). Um das Verständnis der generierten
Expressionsdaten zu erleichtern, soll nachfolgend der spezielle Aufbau dieser
Microarrays kurz erläutert werden (Lipshutz et al., 1999).
Abb. 1.4. Schema der Repräsentation eines Gens auf Affymetrix-Microarrays. Jede
Referenzsequenz wird von bis zu 20 Oligonukleotid-Sondenpaaren detektiert. Zur Detektion werden
bevorzugt Sequenzabschnitte aus dem 3’-Bereich der codierenden Region ausgewählt. Jedes
Sondenpaar besteht aus zwei Sondenzellen mit verschiedenen Oligonukleotiden. Die Oligonukleotide
der einen Sondenzelle (PM für Perfect Match) stimmen vollständig mit der Referenzsequenz überein.
Die Oligonukleotide der anderen Sondenzelle (MM für Mismatch) besitzen einen einzigen
Basenaustausch. Nach der Hybridisierung der Microarrays wird das Fluoreszenzsignal aller
Sondenzellen gemessen. Aus der Intensität und Verteilung der Fluoreszenzsignale für die einzelnen
Sondenzellen wird berechnet, ob und in welcher Signalstärke ein Transkript detektiert wurde (nähere
Erläuterungen siehe Text; nach Lipshutz, 1999).
Die einzelnen Affymetrix-Arrays sind in mehrere Hunderttausend Areale
(Sondenzellen) eingeteilt. Jede Sondenzelle enthält etwa 107 Kopien eines bestimmten
Oligonukleotid mit einer Länge von 25 Nukleotiden. Die große Zahl an verschiedenen
Sondenzellen ist notwendig, weil die Detektion jedes Transkripts über 20
verschiedene Oligonukleotidsequenzen erfolgt (s. Abb. 1.4). Die Auswahl der
Oligonukleotidsequenzen erfolgt dabei anhand einer Referenzsequenz für jedes zu
detektierende Transkript, wobei bevorzugt Oligonukleotide aus der 3’-Region eines
Seite 19
Einleitung
Trankripts ausgewählt werden. Durch den Einsatz mehrerer Sondensequenzen zur
Detektion eines Transkripts steigt die Zuverlässigkeit des Transkript-Nachweises. Um
diese Zuverlässigkeit weiter zu erhöhen, wurde jeder Sondenzelle, deren
Oligonukleotide die entsprechende Referenzsequenz genau widerspiegeln, eine
Sondenzelle gegenübergestellt, in deren Oligonukleotide an Position 13 eine Base
ausgetauscht wurde. Oligonukleotiden mit perfekter Sequenzübereinstimmung zur
Referenzsequenz (PM, d.h. Perfect Match) stehen also Oligonukleotide mit nur
teilweiser Sequenzübereinstimmung (MM, d.h. Mismatch) gegenüber. Jedem zu
detektierenden Transkript sind deshalb insgesamt 40 Sondenzellen bzw. 20
Sondenpaare auf dem Array zugeordnet (s. Abb. 1.4), die Gesamtheit dieser 20
Sondenpaare wird als Sondensatz (Probensatz) bezeichnet.
Diese Anordnung der Sondenzellen ist Grundlage für die Berechnung der Signalstärke
eines Transkripts und ermöglicht zudem, dass Kreuzhybridisierungen von der
Analyse-Software erkannt werden können. Im Normalfall bindet das PMOligonukleotid wesentlich besser an das Zieltranskript, als das MM-Oligonukleotid,
was durch ein deutlich stärkeres Fluoreszenzsignal (s. 2.3.3.) der PM-Sondenzelle im
Vergleich zur MM-Sondenzelle sichtbar wird. Die Analyse-Software, mit der nach
der Detektion der Fluoreszenzsignale die Auswertung erfolgt (s. 2.3.4.), ermittelt für
jedes Sondenpaar die Differenz der Fluoreszenzintensitäten zwischen PM- und MMSondenzelle. Diese Differenzen sind die Grundlage für die Berechnung der
Signalstärke und für die Aussage bezüglich der Anwesenheit oder Abwesenheit eines
Transkripts (s. 2.3.4.). Ein umgekehrtes Verhältnis der Fluoreszenzsignale von PMund MM-Sondenzellen wird von der Analyse-Software als Hinweis darauf gewertet,
dass die betreffende Oligonukleotidsequenz das falsche Transkript erkennt.
Bei der Arbeit kamen insgesamt drei Generationen von Affymetrix-Microarrays zum
Einsatz, Mu6500-Arrays, Mu19k-Arrays sowie MG-U74-Arrays. Die
Oligonukleotidsonden für die 6500 Gene bzw. ESTs, die mit den Mu6500-Arrays
detektiert werden konnten, waren auf insgesamt vier unabhängige Träger verteilt
(Mu6500 subA, B, C ,D), bei den Mu19k-Arrays (19000 Gene bzw. ESTs) waren es
drei unabhängige Träger (Mu19k sub A, B, C). Von den drei verschiedenen MG-U74Arrays wurde nur der MG-U74A-Chip verwendet (12000 Gene bzw. ESTs).
1.10.
Zielsetzung dieser Arbeit
Zu Beginn dieser Arbeit waren nur wenige Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
bekannt. Die Identifizierung weiterer Zielgene würde jedoch wesentlich zum weiteren
Seite 20
Einleitung
Verständnis der biologischen Funktionen dieses Signalwegs beitragen. Ziel dieser
Arbeit war es deshalb, bisher unbekannte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu
identifizieren. Die Zielgensuche sollte zunächst auf der Grundlage des ES-ZellCokultursystems unter Anwendung von DNA-Microarrays erfolgen. Anschließend
sollten einzelne Zielgen-Kandidaten genauer charakterisiert werden. Durch
funktionelle Promotoranalysen in vitro und in vivo sollte geprüft werden, ob die Wntabhängige Regulation dieser Zielgen-Kandidaten direkt über LEF/TCF-Bindestellen
in deren regulatorischen Sequenzen erfolgt. Die Analyse transgener Reportermäuse
sollte zudem Hinweise darauf liefern, in welchem Gewebe und zu welchem Zeitpunkt
die Zielgen-Kandidaten einer Wnt-abhängigen Regulation unterliegen. Daraus sollten
sich Hinweise auf die biologische Funktion dieser Regulation ergeben.
Seite 21
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1.
Materialien
2.1.1.
Chemikalien
Häufig verwendete Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, in
größtmöglichem Reinheitsgrad von folgenden Firmen bezogen: Amersham Pharmacia
Biotech (Freiburg), Bachem Fine Chemicals (Torrance, USA), Bio- Rad Laboratories
GmbH( München), Carl Roth GmbH (Karlsruhe), Clontech Laboratories Inc. (Palo
Alto, USA), Difco Laboratories (Detroit, USA), Eppendorf (Köln), Fluka AG (Buchs,
Schweiz), Fine Chemicals AG (Uppsala, Schweden), Fisher Scientific GmbH
(Schwerte), Gibco BRL (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), Invitrogen
(Groningen, Holland), Merck AG (Darmstadt), Nunc GmbH & Co. KG (Wiesbaden),
PAN Systems GmbH (Nürnberg), Qiagen AG (Hilden), Roche Diagnostics GmbH
(Mannheim), Sigma Chemie (München), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg),
Tropix (Bedford, USA)
Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg)
bezogen: α-(32P) dCTP (3000 Ci/mmol; 10mCi/ml, wässrige Lösung)
2.1.2.
Gebrauchswaren
0,5ml/1,5ml Reaktionsgefäße
Einfrierröhrchen
Einwegspritzen
Einwegzellschaber
Gewebekulturschalen
Hybond- N+- Nylon- Membranen
Kanülen
Latex- Handschuhe
Pipettenspitzen
Röntgenfilme (BioMax MR, MS)
Sterilfilter
Whatman-Papier
Zellkulturröhrchen
2.1.3.
Eppendorf (Köln)
Nunc (Roskilde, Dänemark)
Becton Dickinson GmbH (Heidelberg)
Costar (Cambridge, USA)
Greiner (Nürtingen)
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg)
Terumo Europe N.V. (Leuven, Belgien)
Carl Roth GmbH (Karlsruhe)
Eppendorf (Köln)
Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg)
Schleicher und Schüll (Dassel)
Schleicher und Schüll (Dassel)
Falcon über Becton Dickinson (Heidelberg)
Klonierungsvektoren und Wirtsbakterien
Als bakterieller Klonierungsvektor wurde in der Regel das kommerziell erhältliche
Plasmid pBluescriptII KS (+/-) (pKS; Stratagene GmbH, Mannheim) benutzt. Als
eukaryotischer Expressionsvektor mit einer Neomycin-Resistenz und CMV-Promoter
wurde der Vektor pCS2+ (Dr. Ralph Rupp, Tübingen) verwendet. Zur Expression des
Luciferase–Reportergens unter der Kontrolle verschiedener Promoterkonstrukte kam
der Vektor pGL3 basic (Promega GmbH, Mannheim) zum Einsatz. Zur internen
Standardisierung der Luciferase-Messungen dienten der pCMV-β-Galaktosidase
Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) oder der pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH,
Mannheim). Um die Transfektionsrate von Zellen zu kontrollieren, wurde das GFP
exprimierende Plasmid pEGFP-N3 (Clontech, Heidelberg) benutzt.
Seite 22
Material und Methoden
Die Klonierung sämtlicher Luciferase-Reporterkonstrukte mit dem Axin2- bzw.
Follistatin-Promoter ist im Ergebnisteil beschrieben (s. 3.5.2.1. u. 3.6.2.1.).
Als Wirtsbakterien dienten Epicurian ColiR XL1-blue und XL10-Gold (Stratagene,
Heidelberg), TOP10F´(Invitrogen, Groningen, Holland) und DH5α (Clontech, Palo
Alto, USA).
2.1.4.
Bakterienmedien
Bezeichnung
Zusammensetzung / Herstellung
für 1 Liter: 10g Bacto- Trypton; 5g Hefe- Extrakt; 5g NaCl;
Auffüllen mit H2O, anschließend autoklavieren.
LB-Medium
Bei Bedarf wurden nach dem Autoklavieren Antibiotika (100 µg/ml
Ampicillin oder 25 µg/ml Kanamycin) zugesetzt.
LB-Agarplatten wie LB-Medium; zusätzlich 1,5 % (w/v) Bacto-Agar zugeben, nach
dem Autkolavieren gießen.
für 1 Liter: 21 g NZY Mediengrundlage (Gibco BRL #13635-024);
Auffüllen mit H2O, anschließend autoklavieren.
NZY+ Medium Danach folgende sterilfiltrierte Lösungen zugeben:
12,5 ml 1M MgCl2
12,5 ml 1M MgSO4
10 ml 2M Glucose
2.1.5.
Eukaryotische Zelllinien
Linie
Spezies Typ
NIH3T3-lacZ
Maus
NIH3T3-Wnt1
Maus
ES-R1
Maus
ES-D3
HEK293
Fibroblasten stabil mit lacZ-cDNA
transfektiert
Fibroblasten stabil mit Wnt1-cDNA
transfektiert
Referenz/ ATCCNummer
(Kispert et al., 1998)
(Kispert et al., 1998)
embryonale Stammzellen (129/Sv)
(Nagy et al., 1993)
(Doetschman et al.,
Maus embryonale Stammzellen (129/Sv)
1985)
ATCC-Nummer:
Mensch embryonale, epitheliale Nierenzellen
45504
Zellkulturmedien s. Abschnitt 2.4.
2.1.6.
Oligonukleotide und Enzyme
Oligonukleotide wurden von der MWG- Biotech AG (Ebersberg) bezogen. Sämtliche
molekularbiologischen Enzyme wurden von Amersham Pharmacia Biotech
(Freiburg), Gibco BRL (Karlsruhe), MBI Fermentas (St. Leon-Rot), New England
Biolabs (Beverly, USA), Qiagen (Hilden), Stratagene (Heidelberg) oder Roche
Diagnostics GmbH (Mannheim) bezogen.
Die Primer, die zur Amplifikation von Sequenzen aus einer cDNA-Mischung in
konventionellen (s. 2.2.19.) oder quantitativen (s. 2.2.21.) RT-PCR Reaktionen zum
Einsatz sind in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet.
Seite 23
Material und Methoden
Die Identifikationsnummern aus TIGR- (TIGR Gen-Index) oder NCBI- (GenBankNummer) Datenbanken für die verschiedenen Gene können den Tabellen in Abschnitt
3.2. entnommen werden.
Gen
5’-Primer (5’→3’)
3’-Primer (5’→3’)
Asf
GCGTGAGGCAGGTGATGTATGT
ACCCGGATGTAGGCAGTTTCTC
AtfX
CGGGCCGGGGGATTCAG
GCTTCGGGCCTTATACACCTCAA
Axin2
CCCTTACCCCACCCAACACT
TCCGCAGGCAAATTCGTCACT
Brachyury
TGCTGCCTGTGAGTCATAAC
ACAAGAGGCTGTAGAACATG
Cadh.-7
Hom.
CGCGCTTCGAGGAGGAGGTGT
GGGTGGCGCAGCTGGTTTATG
Cd97
GCTTCGGCCTGTTCCTCTTCAA
TGGGCTGGCTGCATTCTGTTT
Cdx1
CTCCCCAGTGCCCGTCAAG
GCATGGGGTGCTAGGGCAG
Cerr1
ACAATGTGGCTGGGGATGAT
CAACGCCAGATAACCAACAGTAA
ATTGGGGGCACCTATATCTCATCC
GCCACTTTCCGCTCGTTCTCC
Crbp1
ATCCGCACGCTGAGCACTTTTC
CAGGCCCATCCCACTTGTTCC
Dia2
TGGCTCCCGGAATGCTCAA
GTGTCATGCTGCCCAGTAGTGTG
Dmrt1
ATCGCGCAGGGTTTGTTGTTATT
TGCCCGCTCTTCTCACTGGT
Ebf1
TGCCCCACAACAACCAGGAGAT
TTGGAGGGGAGGCTTGTAGATGAG
Elk3
TCGGGCTCCAAAACCAAGTCTC
TGGCATCATCCGTCATCTGTTCT
GCAGGCCGCAGTGGATGAG
TCTTGCTGGTGAGGGGATGTTTT
CCCAGGCAGGCTTTCGTGTT
TCCCCCTATTTCAGTGGCTTTATG
CGACCATTACGCCGCCATTA
TCGTTCTTATTCCGCCCCTCTG
Filamin
–Homolog
TGGCATGGGTGAGGTGGAAGTT
CGGCAGGCAGCTGGGTTAC
Follistatin
GTGGGCTGGATGGGAAAACCTACC
GGCAGCTTCCTTCATGGCACACTC
ACCACAGTCCATGCCATCACT
GTCCACCACCCTGTTGCTGTA
Glypican-3
CCAGCCGAAGAAGGGAACT
AAAAAGGCACGCCACATCGAT
Hint-1
Hom.
GTTCGCCAACCGTCTTCTCC
CGCCCATCTTGCCATCATTA
Hmga2
CCGGGGGCATTCGTATAAGAAAAG
TCCGATGCTTCAAGGCTGACAAG
Igfbp3
CAGCCAGCGCTACAAAGTTGACTATG
AAGGGCGGCATCGTTTCTTCTTAT
Klf12
GATAGCGCTCATACCTTGTCCTCA
CCCCCTCTCCTCGATTCTTTGT
Lef1
GCAGCGGAGCGGAGATTACAC
CACCACGGGCACTTTATTTGATG
Chop-10
Endophilin 1
EpoxidHydrolase
Fba
Gapdh
Seite 24
Material und Methoden
Lhpp
GCGCTCGAGTATGCCTGTGGTATC
GCCTGGTGCCCTGGAAGTATGTG
Mkk6
CTCCGCGGACTTTGTTGACTTTA
GAGGACCCACCCGTATGACTTG
Mmp1
GGCTGCCCACGGACAAGAT
AGCAGTAGTACCGGCAGGACCA
Mmp10
GCCCTGGATTTTATGGAGATGTT
AGAGTGGGCCAAAATGCTGATA
Ndr2
ACCGCCGAGACCTGAACTTTG
GATGCTGTGCGAGACCGAGATA
Nek1
GGGCTTTGGGCTGTGTCCTTTA
CCTGTTTATGTTTTGGGGGTGGTT
Neo
CGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGG
CAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCC
Nip45
CGGGTGCAGGGGAAGGAGAA
TGGGGCGAAAAATCACAATAATAAAA
Nkx6.2
GCGCCCGCCCATCTTCTG
AGGGGCCGGTTGTATTCGTCA
GCAGCGCTAACCCCAATGAC
ATCTCTCCCGATCGTCCCTTC
Pace4a
GGGGCCCAGCAGAGAAGAGTGTAT
TAGATGGGCAAACGGGCAGACAG
Pdgfrβ
CTTTCAGCCCCACCAGTCCTA
TGAACCCCCAGAGTGTGAAGTGTA
Pgrp
GCTGGGCTGGTGCGATGTA
GGGGGATTCTCACTAGGTCTCAAG
Pim1
GTGGCTTCGGCTCGGTCTACT
GGGCTCCTCGTTCGGTGATAA
Pkp2a
GGCCGCCTCCTGCTGTGA
CCGATGGGAGGAAGATGATGAGA
GGCGCAGTGTATCAATGGCAAAGT
ACCTCGTACCCTCGGGCTCTGA
RelB
CTGCCCCCACGCTCTTCACTAT
AGCGCTGCAGATGTCCGATTC
Rp42
CATGCCTTGCTCTCCTGCTGA
GACCAATCCCTGTAACGTGAATAGAA
sFrp2
CGCTCTTCGCCCCTGTCTGT
TCGCCGCCCTGCTTCTGT
Sprr2a
GGGCCGTGTCGTCCTGTAGTGT
TGGAGGATGAAGGGTGGAGAAGAT
ATCCCTGAGGCTCCATCTTGAA
AATAGCCTGGAAATCGTTGTTAGTGA
TGTGAGCCCCGCAGAGAA
GCTAACGCCGCCAGTGAA
GGCGCTGTCCCCAAATCTG
GGCCCATCCCACCACTTACTG
Tgfβ2
GAAGGCGTTAGTCTGCATCTCACC
CTCCTTCCCCCTGGCTTATTTG
Troy
CTGGCTGTGAATGTTAGGACTGGT
GGGCGAAGGATGAAGAGAAAATG
Tulp2
CAGCCCAGAAGAATACAGAAACAG
GGGGTCCAGGGAGATGAGATA
GTGATCGGGAACAGAGGGAGAG
TACTGAAGCTGGGAGGCACATAG
GATGCGGCTTCTAAGACTATTTCAG
CACCGTACACTGCTTCATTTTCTC
Nrp2
Prot.phosphatase 5
TC32971
(EST)
TC35476
(EST)
TC37382
(EST)
Vasa Hom.
Vldlr
Seite 25
Material und Methoden
Oligonukleotide, die im Verlauf der Microarray-Versuche eingesetzt wurden
(s. Abschnitt 2.3):
B2-Oligo: 5’-Bio-GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA-3’
T7-(dT)24 : 5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24-3’
Die 3,6 kb große 5’- flankierende Sequenz des Axin2-Gens (Ax2 P/I1; s. 3.5.1.) wurde
durch PCR (s. 2.2.20.) aus genomischer DNA von Maus ES-Zellen amplifiziert.
Dabei kamen folgende Primer zum Einsatz.
Ax2 P/I1 5’-Primer: 5’-Pho-GGCATTCCACGGCTGTTTAATAAGTAA-3’
Ax2 P/I1 3’-Primer: 5’-Pho-TTCCCTCCTCCTCCTTTTTCTTCTTC-3’
Der 4 kb Follistatin-Promotor (s. 3.6.1.) wurde freundlicherweise von Egbert de
Groot (de Groot et al., 2000) zur Verfügung gestellt.
2.1.7.
in situ Hybridisierungssonden
Plasmid
cDNA
antisense/sense
Herkunft/Referenz
pCMV-SPORT6Follistatin
pSV-SPORT1Axin2
PT7T3D-PACWnt3a
73-1086 bp
cDNA
1423-4202 bp
cDNA
1399-2777 bp
cDNA
SalI, T7 / NotI, SP6
IMAGp998K118748
SalI, T7 / NotI, SP6
von B. Herrmann zur
Verfügung gestellt
EcoRI,T3 / PacI, T7
IMAGp998P08999
2.1.8.
Häufig verwendete Puffer und Lösungen
Die Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser oder bidestilliertem Wasser (ddH2O)
angesetzt und zum Teil autoklaviert oder sterilfilitriert.
Bezeichnung
10x PCRReaktionspuffer
20x SSC
50x Denhardt´s
Lösung
50x TAE
6x DNA-Ladepuffer
DEPC-Wasser
PBS
PBT
TE
Tris-Puffer
Zusammensetzung / Herstellung
500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 15 mM MgCl2
3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; pH 7,0 (bzw. pH 4,5)
5 g Ficoll (Type 400, Pharmacia), 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g BSA in 500 ml ddH2O angesetzt
2 M Tris-HCl, pH 8,0; 1 M Essigsäure;
50mM EDTA
15% Ficoll-400; 0,1% Bromphenolblau; 0,1% Xylencyanol
in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5
0,1 % (v/v) DEPC wurden in ddH2O angesetzt, danach über
Nacht bei 37°C inkubiert und anschließend autoklaviert
pro Liter: 9 g NaCl; 0,2 g KCl; 1,15 g Na2HPO4; 0,2 g
KH2PO4; auf pH 7,4 eingestellt
PBS + 0,1% Tween-20
10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
10 mM Tris-HCl, pH 7,5
Seite 26
Material und Methoden
2.2.
Molekularbiologische Methoden
2.2.1.
Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Restriktionsendonukleasen binden spezifisch und schneiden doppelsträngige DNA an
definierten Erkennungsstellen. Die Restriktionsenzyme wurden in dem vom Händler
mitgelieferten Reaktionspuffer inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden bei der
empfohlenen Temperatur (meist 37°C) für 1 h im Wasserbad inkubiert, die DNAFragmente elektrophoretisch aufgetrennt und analysiert (s. 2.2.4.). Gegebenenfalls
wurden entsprechende DNA-Fragmente aus dem Agarose-Gel isoliert (s. 2.2.5.).
2.2.2.
Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA
Die alkalische Phosphatase (AP) katalysiert die Hydrolyse des 5’-Phosphatrestes von
DNA, RNA und Nukleotidtriphosphaten. Das durch die Dephosphorylierung
produzierte 5’-OH Ende kann nicht mehr mit dem 3’-OH Ende religieren. Die
Dephosphorylierung wurde üblicherweise direkt im Anschluß an den
Restriktionsverdau durch Zugabe von 1µl Calf Intestine Alkaline Phosphatase
(Roche, Mannheim) in den Restriktionsansatz für 1h bei 37°C durchgeführt. Danach
wurden die dephosphorylierten Plasmide über ein Agarosegel elektrophoretisch
gereinigt und für die Ligationen (s. 2.2.8.) eingesetzt.
2.2.3.
Auffüllen von 5’-überhängenden DNA-Enden
Falls die Enden von DNA-Fragmenten mit den gewünschten Restriktionsschnittstellen
im Vektor nicht kompatibel waren, wurden sie durch Behandlung mit der T4-DNAPolymerase aufgefüllt. Zu diesem Zweck wurde der Restriktionsansatz, nach der
Spaltung mit den jeweiligen Enzymen, mit 1 U T4-DNA-Polymerase (Roche,
Mannheim) und Desoxyribonukleotiden (dNTPs, 1 mM Endkonzentration) bei 37°C
für 30 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzedenaturierung der Enzyme (10
min, 70°C) gestoppt und die DNA-Fragmente über ein Agarosegel elektrophoretisch
gereinigt.
2.2.4.
Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten
DNA-Moleküle verschiedener Größen lassen sich durch Gelelektrophorese
voneinander trennen. Die Art und Konzentration der Agarose bestimmt das
Auflösungsvermögen der zu trennenden DNA. Zur Herstellung der Gele wurde die
entsprechende Agarosemenge in Gelpuffer (1x TAE) unter Kochen gelöst, mit
Ethidiumbromid (1 µg/ml Endkonzentration) versetzt und in vorgefertigte
Gelkammern gegossen. DNA-Proben wurden mit 6x DNA-Ladepuffer versetzt und in
die Geltaschen hinein pipettiert. Die Elektrophorese wurde bei 60-100 V
durchgeführt. Der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid interkaliert während des
Laufs in die DNA, weshalb die Auftrennung der DNA-Fragmente anschließend unter
UV-Licht (254 nm oder 312 nm) sichtbar gemacht werden kann. Zur
Größenbestimmung einzelner DNA-Fragmente dienten Standards definierter
Fragmentlängen, meistens die 1 kb DNA-Leiter (Gibco/BRL, Eggstein).
2.2.5.
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Für die Elution von elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmenten aus
Agarosegelen wurde der „QIAquick Gel Extraction Kit” der Firma Qiagen verwendet.
Seite 27
Material und Methoden
Das Prinzip dieses Reinigungsverfahrens beruht auf der Bindung von DNA an eine
Silikamembran unter hohen Salzkonzentrationen. Die DNA-Fragmente wurden aus
dem Agarosegel unter langwelligem UV-Licht (312 nm) ausgeschnitten. Das
Agarosestück wurde zunächst im 3-fachen Überschuss einer 6 M NaI-Lösung bei
50°C aufgelöst. Die Lösung mit der DNA und der solubilisierten Agarose wurde dann
auf eine QIAquick-Säule gegeben und mittels Zentrifugation durch das
Säulenmaterial gepresst, wobei die DNA an die Silikamembran bindet. Nach einem
Waschschritt mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer wurde die DNA mit TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA) von der Säule eluiert. (s. QIAquick Spin
Handbook 03/2001).
2.2.6.
Phenol/ Chloroform- Extraktion
Unerwünschte Verschmutzungen in Nukleinsäurelösungen, insbesondere
Proteinverunreinigungen, wurden mit der klassischen Methode der Phenol/
Chloroform- Extraktion entfernt. Die Nukleinsäurelösungen wurden nacheinander mit
einem Volumen Phenol (pH 8,0), Phenol- Chloroform- Isoamylalkohol (25:24:1(v/v))
und einem Volumen Chloroform ausgeschüttelt. Es wurde dazwischen jeweils kurz
mit maximaler Drehzahl zentrifugiert und die obere, wässrige Phase, unter
Vermeidung der Interphase, in ein neues Gefäß überführt. Anschließend wurden
durch Präzipitation der Nukleinsäuren (s. 2.2.7.) verbleibende Phenolreste aus der
Lösung entfernt und die Nukleinsäuren in Tris-Puffer aufgenommen.
2.2.7.
Präzipitation von Nukleinsäuren (DNA oder RNA)
Einer wässrigen Nukleinsäure-Lösung wurden 0,1 Volumenanteil einer 3M
Natriumacetatlösung (pH 5,2) und 2,5 Volumenanteile 100% Ethanol zugegeben.
Nach Inkubation für 10min bei –80°C wurde die präzipitierte DNA/RNA
abzentrifugiert (15min; 4°C; 14000 rpm). Das Nukleinsäure- Pellet wurde noch
mindestens einmal mit 70% Ethanol gewaschen, danach für ca. 10 min getrocknet und
anschließend in Tris-Puffer (DNA) oder RNase-freiem Wasser (RNA) aufgenommen.
Alternativ wurde bei zu großen Volumina mit 0,7 Volumenanteilen Isopropanol
präzipitiert. Hierbei musste aber noch mindestens zweimal mit 70% Ethanol
gewaschen werden. Bei geringen Mengen an zu fällenden Nukleinsäuren wurde durch
die Zugabe von 1µl Glycogenlösung (Ambion #9510) die Effizienz der Präzipitation
gesteigert.
2.2.8.
Ligation von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA
Die Ligation von DNA- Fragmenten mit Klonierungsvektoren wurde mit der T4DNA- Ligase (New England Biolabs, Beverly, USA) durchgeführt. Für eine
Standard- Ligation wurden, nach Kontrolle der Mengen der DNA durch AgarosegelElektrophorese, ca. 25-30 ng Vektor- DNA und das zu klonierende DNA-Fragment
im 2-5 fachen molaren Überschuss eingesetzt. Bei einem 10 µl Reaktionsansatz
wurden 1 µl 10x Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,8; 0,1 M MgCl2; 0,2 M DTT;
500 µg/ml BSA; 10 mM ATP) sowie 0,5 µl T4 DNA- Ligase (2000 Units/µl)
zugegeben und die Reaktion für 1-4 Stunden bei RT (für kohäsive Enden), oder über
Nacht bei 14°C (für geglättete Enden) inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde ohne
weitere Behandlung zur Transformation eingesetzt (je 5 µl).
Seite 28
Material und Methoden
2.2.9.
Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Bakterien
Zur Herstellung chemokompetenter Zellen (Hanahan, 1983) wurden 400 ml LBMedium mit 1 ml einer frischen Bakterienübernachtkultur im Erlenmeyerkolben
angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 geschüttelt. Anschließend wurden
die Zellen 20 min auf Eis gekühlt, 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert und in 30 ml
eiskaltem TFB1-Puffer (30 mM Natriumazetat, pH 5,8; 0,1 M NaCl; 50 mM MnCl2;
10 mM CaCl2; 15% Glycerol) aufgenommen und für 10-15 min auf Eis inkubiert.
Danach wurden die Bakterien wie oben abzentrifugiert, in 4 ml eiskaltem TFB2Puffer (10 mM MOPS, pH 7,0; 75 mM CaCl2; 10 mM NaCl; 15% Glycerol)
resuspendiert, in vorgekühlte Eppendorf-Gefäße aliquotiert und bei -80°C gelagert.
Zur Transformation wurden die Aliquots auf Eis aufgetaut. Zu 50 µl kompetenten
Zellen wurden 5-10 µl eines Ligationsansatzes oder 0,5 µg Plasmid-DNA gegeben
und 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem anschließenden Hitzeschock (1 min, 42°C)
wurden die Zellen mit 0,5 ml LB-Medium versetzt und für 45 min bei 37°C inkubiert
(Thermoschüttler). Schließlich wurde der Transformationsansatz auf LB-Agarplatten
ausplattiert, die, je nach Plasmidtyp, Ampicillin oder Kanamycin zur Selektion
enthielten. Üblicherweise wurden pro µg zirkulärer DNA 1-5x107 Transformanten
erhalten.
2.2.10. Herstellung und Transformation elektrisch kompetenter Bakterien
Elektrokompetente Zellen wurden ausschließlich mit dem XL1-blue Bakterienstamm
hergestellt. Hierbei wurden 500 ml LB-Medium mit 30 µl einer Bakteriensuspension
(Aliquot von aufgetauten elektrokompetenten Zellen) angeimpft und ÜN bei
Raumtemperatur bis zu einer OD600 von 0,5 geschüttelt. Alle weiteren Schritte wurden
in mit ddH2O gewaschenen, autoklavierten, auf Eis vorgekühlten Zentrifugenbechern,
bzw. autoklavierten und vorgekühlten Corex-Zentrifugenröhrchen im Kühlraum oder
Eisbad durchgeführt. Die Bakteriensupension wurde 15 min auf Eis gekühlt, auf zwei
Zentrifugenbecher verteilt (2 x 250 ml) und bei 4000 rpm für 15 min bei 4°C
abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, die Bakterien im selben Volumen
(2 x 250 ml) eiskaltem, autoklaviertem ddH2O resuspendiert und danach erneut
abzentrifugiert (6000 rpm, 15 min, 4°C). Die erhaltenen Bakterienpellets wurden
jeweils nochmals in 125 ml eiskaltem ddH2O resuspendiert und erneut bei 6000 rpm
für 15 min bei 4°C abzentrifugiert. Jedes Pellet wurde dann in 5 ml 10% Glycerol
(v/v) resuspendiert und in 30 ml Corex-Zentrifugenöhrchen überführt. Dies wurde bei
8000 rpm für 15 min bei 4°C zentrifugiert und das erhaltene Bakterienpellet zuletzt in
0,5 ml 10% Glycerol resuspendiert. Diese Bakteriensuspension wurde in 30 µl
Aliquots in vorgekühlten 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefässen portioniert und bei
–80°C gelagert. Zur Transformation wurden Aliquots auf Eis aufgetaut und salzfreier
Ligationsansatz (DNA-Präzipitation notwendig) dazu pipettiert. Der
Transformationsansatz wurde in eine vorgekühlte Elektroden-Küvette
(Elektrodenabstand 0,2 cm) gegeben. Die Elektroporation wurde in einer Apparatur
von Biorad (Gene Pulser und Pulse Controller) mit folgenden Einstellungen
durchgeführt:: 1,6 kV, 25 µF, 200 Ω. Die Zeitkonstante des Impulses sollte zwischen
4,0 und 4,9 ms betragen (hängt von der Salzkonzentration des Ansatzes ab).
Unmittelbar nach der Elektroporation wurde 1 ml LB-Medium in die ElektrodenKüvette pipettiert, die Bakteriensuspension wieder entnommen und 45 min bei 37°C
inkubiert (Thermoschüttler). Schließlich wurden verschiedene Verdünnungen des
Transformationsansatz auf LB-Agarplatten ausplattiert, die, je nach Plasmidtyp,
Ampicillin oder Kanamycin zur Selektion enthielten. Üblicherweise wurden pro µg
zirkulärer DNA 1-5x109 Transformanten erhalten.
Seite 29
Material und Methoden
2.2.11. Identifizierung rekombinanter Kolonien
Um zu überprüfen, ob eine Bakterienkolonie ein Plasmid mit dem richtigen
Ligationsprodukt in der richtigen Orientierung trägt, wurde das Plasmid isoliert (s.
2.2.12.) und durch Restriktionsverdau und Gelelektrophorese (siehe 2.2.1. u. 2.2.4.)
überprüft.
2.2.12. Präparation von Plasmid-DNA
Zur Präparation von Plasmiden im Miniansatz wurden 3 ml LB-Medium (mit 100
µg/ml Ampicillin oder 25 µg/ml Kanamycin) mit einer einzelnen Bakterienkolonie
angeimpft und in einem Reagenzglas über Nacht bei 37°C geschüttelt. 1,5 ml dieser
Übernachtkultur wurden bei 14000 rpm für 2 min abzentrifugiert. Das Bakterienpellet
wurde in 250 µl P1-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM Glucose; 10 mM
EDTA; 100 µg/ml RNAse A) resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte nach Zugabe
von 250 µl P2-Puffer (0,2 M NaOH; 1% SDS) für 3-5 min bei RT. Anschließend
wurde der Ansatz mit 250 µl P3-Puffer (3 M Kaliumacetat, pH 4,8) 5 min auf Eis
neutralisiert. Das Präzipitat aus Zelltrümmern und genomischer DNA wurde durch
Zentrifugation (14000 rpm, 10 min, 4°C) pelletiert. Zur Fällung der Plasmid-DNA
wurde der Überstand mit 500 µl Isopropanol versetzt, gemischt und abzentrifugiert
(14000 rpm, 15 min, 4°C). Das Pellet wurde mit 70%-igem Ethanol gewaschen, in der
Vakuum-Zentrifuge für 10 min getrocknet und in 75 µl Tris-Puffer resuspendiert. Die
DNA-Ausbeuten lagen zwischen 5 und 15 µg. Größere Mengen hochreiner PlasmidDNA wurden mit „Präparations-Kits” der Firma QIAGEN nach Angaben des
Herstellers isoliert. Die Zellen wurden bei diesen Methoden ebenfalls alkalisch lysiert.
Die Reinigung der Plasmid-DNA erfolgt jedoch mit einer Anionen-AustauscherSäule. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Präparation homogener PlasmidDNA bis zu einer Menge von 600 µg.
2.2.13. DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Didesoxy-Methode (Sanger et al., 1977)
durchgeführt. Dazu wurde der „ABI PRISM BigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit” (Perkin-Elmer Corp., Foster City, USA) nach
Angaben des Herstellers verwendet. Das Prinzip der Methode liegt im Einbau
fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide während der DNA-Synthese mit Hilfe
einer modifizierten Taq-Polymerase (AmpliTaqFS). Die Fluoreszenzfarbstoffe
lassen sich durch Laser-Licht anregen, wobei sie Licht vier verschiedener
Spektralfarben entsprechend den vier Nukleotiden emittieren.
Für einen Reaktionsansatz wurden 4 µl BigDyeTM Mix (enthält Farb-ddNTPs, dNTPs,
Polymerase, Puffer und MgCl2), 1 µg dsDNA als Matrix, 10 pmol Primer mit ddH2O
auf 10 µl Endvolumen in einem PCR-Röhrchen angesetzt. Die Proben wurden 25
Zyklen (96oC für 10 s, 55oC für 5 s und 60oC für 4 min) in einem Thermocycler (T3
Thermocycler, Biometra) amplifiziert und mit Centriflex Gelfiltrations-Säulen
(MoBiTec, Göttingen) entsprechend den Angaben des Herstellers zur Entfernung
überschüssiger Nukleotide aufbereitet. Die DNA wurde für 15 min in einer
Vakuumzentrifuge getrocknet. Das Pellet wurde in 5 µl ddH2O aufgenommen und mit
10 µl Template Suppression Reagenz (Perkin-Elmer) gemischt. Der Ansatz wurde für
2 min bei 100oC denaturiert, schnell auf Eis gekühlt und im „ABI PRISM 310
Genetic Analyzer” (Perkin-Elmer) automatisch sequenziert.
Seite 30
Material und Methoden
2.2.14. Ortsgerichtete Mutagenese
Um die direkte Regulation des Axin2- bzw. Follistatin-Promoters durch βCatenin/TCF-Komplexe zu zeigen, wurden die LEF/TCF-Bindestellen innerhalb
dieser Promotoren durch ortsgerichtete Mutagenese mutiert. Zur Herstellung der
zielgerichtet mutierten Promoter-Konstrukte wurde das „QuikChangeTM Multi SiteDirected Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) benutzt. Dieses System erlaubt
die gleichzeitige Mutagenese von bis zu fünf Zielsequenzen innerhalb eines Plasmids
in nur wenigen Schritten.
Im Falle von Follistatin wurden die vier LEF/TCF-Bindestellen, die auf dem 2,8 kb
Follistatin-Promoterfragment liegen, mutiert. Für die Mutagenese wurde das 2,8 kb
(KpnI/HindIII) Fragment aus dem Foll 2,8kb-Luc-Konstrukt (s. 3.6.2.1.) in den
KpnI/HindIII geöffneten pBluescriptKS-Vektor subkloniert. Die regulatorische
Region des Axin2-Gens (Ax2 P/I1), die in dieser Arbeit untersucht wurde, war
insgesamt ca. 3,6 kb lang und wies insgesamt sieben TCF-Bindestellen auf. Für die
Mutagenese wurden deshalb jeweils ein 1 kb großes HindIII-Fragment (mit den TCFBindestellen 1-3) sowie ein 2 kb großes KpnI/SpeI-Fragment mit den TCFBindestellen 4-7) aus dem Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt (s. 3.5.2.1.) in den mit den
entsprechenden Enzymen geöffneten pBluescriptKS-Vektor subkloniert. Nach
erfolgter Mutagenese (s.u.) wurden die jeweiligen Fragmente mit den mutierten TCFBindestellen wieder aus den pBluescriptKS-Subklonen ausgeschnitten und wieder in
die entsprechenden Promotor-Luc Konstrukte (bzw. Promotor-lacZ Konstrukte, s.
2.5.8.) eingefügt.
Ablauf der PCR-basierten Mutagenese:
Für jede Zielsequenz (DNA-Region um die TCF-Bindestelle) wurde ein 25-45 Basen
langer Primer hergestellt, der an den beiden Enden mit jeweils 10-15 Basen exakt
komplementär zu der Zielsequenz war, in der Mitte aber die gewünschte Mutation
(d.h. Sequenzveränderung) enthielt. Die Primer, die zusammen in einer MutageneseReaktion eingesetzt werden sollten, mussten alle zu dem selben Plasmidstrang
komplementär sein. Die Mutagenese-Reaktion lief dann wie folgt ab: die PlasmidDNA mit den Zielsequenzen (aus E. coli aufgereinigt und somit methyliert) wurde mit
den Mutagenese-Primern, freien Desoxynukleotiden, einem Enzym-Cocktail
(QuikChangeTM Multi Enzyme Blend, enthält PfuTurbo DNA Polymerase),
Reaktionspuffer und Wasser nach Angaben des Herstellers gemischt und in einer
PCR-Maschine (T3 Thermocycler, Biometra) folgendem Temperaturprogramm
unterworfen. Nach einminütiger Denaturierung bei 95°C wurde die gewünschte DNASequenz über 30 Zyklen wie folgt amplifiziert:
1. Denaturierung
95°C, 30 s
2. Hybridisierung
55°C, 1 min
3. DNA-Synthese
65°C, 2 min / kb Plasmidlänge
In jedem dieser Zyklen wurden die Primer, die an den komplementären Plasmidstrang
gebunden haben, bis zum nächsten gepaarten Primer verlängert. Der neu synthetisierte
Strang wies deshalb zunächst Einzelstrangbrüche an den Übergängen zwischen neu
synthetisierter DNA und darauf folgendem Primer auf, diese Einzelstrangbrüche
wurden aber durch eine Ligaseaktivität in dem Enzymcocktail repariert. Da die
eingesetzten Primer in den neu synthetisierten Strang inkorporiert wurden, wies dieser
auch die gewünschten Mutationen auf. Darüber hinaus war die DNA des in vitro neu
synthetisierten Strangs nicht methyliert, weshalb der komplementäre Strang aus
„parentaler“ Plasmid-DNA durch die methylierungssensitive Restriktionsendonuklease DpnI in einem nächsten Schritt selektiv verdaut werden konnte. Dazu
wurde der abgekühlte Reaktionsansatz mit 10 U dieses Restriktionsenzyms versetzt
und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde ein Teil des
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Material und Methoden
Reaktionsansatzes nach Angaben des Herstellers für die Transformation von XL10Gold ultrakompetenten Bakterien (Stratagene, Heidelberg) verwendet.
Rekombinante Klone wurden anhand der durch die Mutagenese-Primer neu
eingefügten Restriktionsschnittstellen identifiziert (s. 2.2.1).
Der nachfolgenden Tabelle sind die Sequenzen der Oligonukleotide zu entnehmen,
die zur Mutagenese der einzelnen LEF/TCF-Bindestellen (TBE) verwendet wurden.
Die ursprüngliche Position der LEF/TCF-Bindestelle ist jeweils durch eine
Unterstreichung hervorgehoben; ausgetauschte Basen sind durch kleine Buchstaben
gekennzeichnet.
Bezeichnung
Sequenz
Ax2/TBE1-mut
GCCTGTTTACTTTCTTGCTcaGcTGTTGGGTAGATCTGG
Ax2/TBE2-mut
GCTCAGATTTCGCCTcTagAAAAGCTGCGTCGGATAC
Ax2/TBE3-mut
CTCTTTAAAAGTTTGAAGtgCAcAGCCTCTAAGTTAGTGAACTGG
Ax2/TBE4-mut
GGGGCGGCGCTcTagAGTTGGCAGGCCG
Ax2/TBE5-mut
CCGGCGCGCTcaGcTGTGCGGGGCG
Ax2/TBE6-mutII
GGCTCGCGCCTcTGcAGTGCACAGTTAAATCC
Ax2/TBE7-mutII
GACCGGCTGCGCcTcGAgAAGGTCCTGGC
Foll/TBE1-mut/n
CTCCTGCCGCcTcGAgTTCGGGCACCTC
Foll/TBE2-mut/n
GAAATTTAAAAGGCAGCTcTagAATAAACAATATAGCCTTTTCCGTGAAG
Foll/TBE3-mut/n
GCCCACTTTCAgctGGGGGCTTGGGCCC
Foll/TBE4-mut/n
GAAGAAAACAGTTCAACcTcGAgATTCTGCCGTTAAGTGGC
2.2.15. Southern-Blot Analyse
Zur Genotypisierung der Nachkommen verschiedener Mauslinien wurden Southern
Blot Analysen (Chomczynski und Qasba, 1984; Southern, 1975) durchgeführt.
Mit Restriktionsenzymen verdaute DNA wurde, wie in 2.2.4. beschrieben, auf
Agarosegelen aufgetrennt und mit Längenstandards photographiert. Das Gel wurde 15
min lang mit 0,25 M HCl behandelt (Depurinierung; verbessert die Effizienz, mit der
große Fragmente auf die Filter transferiert werden) und anschließend mit
deionisiertem Wasser gespült. Danach wurde das Gel für mindestens 30 min in 0,5 M
NaOH / 1,5 M NaCl-Lösung behandelt (Denaturierung) und anschließend weitere 30
min in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 / 1,5 M NaCl-Lösung neutralisiert. Zum Blotten wurde
der Aufbau nach Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989) verwendet. Der Transfer
wurde ÜN durchgeführt und die DNA wurde mit 3600 J UV-Bestrahlung (UV
Stratalinker, Stratagene) an die Nylonmembran quervernetzt.
2.2.16. Radioaktive Markierung von DNA- Sonden
Radioaktiv markierte DNA- Sonden wurden nach der Methode von Feinberg und
Vogelstein (Feinberg und Vogelstein, 1983) durch Einbau von α-(32P)dCTP durch das
Klenow- Fragment der DNA- Polymerase I bei der Synthese von zufällig geprimter
DNA gewonnen. Es wurden die Komponenten des „MegaprimeTM DNA Labelling
Kits“ (Amersham Pharmacia) folgendermaßen benutzt: 100 ng eines DNA-Fragments
wurde mit 5 µl der Lösung mit Zufallshexameren („Primer solution“) in einem
Gesamtvolumen von 33 µl (mit ddH2O aufgefüllt) für 5 min gekocht und sofort auf
Eis abgekühlt. Dazu wurden 10 µl Markierungspuffer, 5 µl α-(32P)dCTP und 2 µl
Seite 32
Material und Methoden
Klenow- Enzym gegeben. Der Reaktionsansatz wurde für mindestens 30 min bei
37°C inkubiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden durch Gelfiltration über
Sephadex G- 50 Säulen (Nick-ColumnsTM, Pharmacia) nach Angaben des Herstellers
abgetrennt und die Radioaktivität von 1% des Eluats in einem FlüssigkeitsSzintillationszähler (Wallac 1410; Pharmacia) gemessen. Die markierte DNA wurde
direkt vor der Zugabe zu der Hybridisierungs- Lösung durch 5 min Kochen
denaturiert und sofort auf Eis abgekühlt.
2.2.17. Hybridisierung von Southern-Blots
Die Membranfilter mit den immobilisierten Nukleinsäuren wurden in Glasröhren
überführt und für 2-3 h bei 65°C mit 15 ml für 5-10 min vorgekochter
Vorhybridisierungslösung (4x SSC; 1% SDS; 1% Fett-freies Milchpulver; 333 µg/ml
Lachssperm-DNA) unter ständiger Bewegung abgesättigt. Die Hybridisierungslösung
(20% (w/v) Dextransulfat; 4x SSC; 1% SDS; 1% Fett-freies Milchpulver; 500 µg/ml
Lachssperm-DNA) wurde mit 106-107 cpm/ml radioaktiv markierter Sonde versetzt
und für 10 min gekocht. Die Vorhybridisierungslösung wurde verworfen und der
Membranfilter über Nacht bei 65°C bei ständiger Bewegung mit dieser
Hybridisierungslösung inkubiert. Anschließend wurden die Filter zweimal kurz mit 2x
SSC/ 0,1% SDS bei RT, und zweimal 15-30 min mit 0,1x SSC/ 0,1% SDS bei 65°C
gewaschen. Die Filter wurden in Plastikfolie eingeschweißt und bei –80°C auf
Kodak-Röntgenfilmen exponiert.
2.2.18. Reverse Transkription von RNA in cDNA
Für die Reverse Transkription im Rahmen von RT- PCRs wurde lediglich der
korrespondierende Strang cDNA als DNA- Einzelstrang synthetisiert und
anschließend die PCR mit den genspezifischen Oligonukleotiden durchgeführt. Die
cDNA- Synthese im Rahmen von RT-PCRs wurde mit dem „SUPERSCRIPTTM FirstStrand Synthesis System for RT-PCR“ (Gibco BRL Life Technologies) nach Angaben
des Herstellers in einem Thermozykler (T3 Thermocycler, Biometra) durchgeführt.
Als Ausgangsmaterial diente Gesamt-RNA, die aus cokultivierten ES-Zellen isoliert
wurde (s. 2.4.5.). Um eventuelle Kontaminationen der RNAs mit genomischer DNA
auszuschließen wurde vor der Reversen Transkription ein DNaseI- Verdau der RNA
durchgeführt. Hierzu wurden 2,5 µg Gesamt- RNA in folgendem Reaktionsansatz für
15min bei RT inkubiert:
x µl
0,7 µl
x µl
0,7 µl
7 µl
entspr. 2,5 µg Gesamt- RNA
10x DNaseI- Puffer (200mM Tris-HCl pH 8,4; 20mM MgCl2;
500 mM KCl)
ddH2O
DNaseI; 1U/µl
Gesamtvolumen
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1µl 25mM EDTA- Lösung (pH 8,0) und
Erhitzen auf 65°C (10min) beendet.
Anschließend erfolgte das Anlagern der Oligo(dT)-Primer an die Poly(A)-Enden der
mRNA-Moleküle. Dazu wurde die DNaseI- verdaute RNA mit 1µl Oligo(dT)12-18Primer und 1 µl dNTP-Mix (10 mM) versetzt, dieser Ansatz für 5min auf 65°C erhitzt
und danach sofort auf Eis abgekühlt.
Seite 33
Material und Methoden
Anschließend wurde der folgende Reaktionsmix angesetzt:
10µl
2µl
4µl
2µl
1µl
RNA nach DNaseI- Verdau und Primer-Anlagerung (inkl. dNTPs)
10x RT- Puffer
25mM MgCl2
100mM DTT
RNaseOUT RNase Inhibitor
Der Reaktionsmix wurde für kurze Zeit (ca. 2 min) auf 42°C erwärmt und nach
Zugabe von 1 µl Reverse Transkriptase (SuperScriptII 50U/µl) weitere 50 min bei
dieser Temperatur inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch 15-minütiges Erhitzen
auf 70°C gestoppt und der Reaktionsansatz auf Eis abgekühlt. Die RNA wurde
anschließend durch Inkubation mit 1µl RNaseH (2U/µl) für 20min bei 37°C verdaut.
Jeweils 1 µl der synthetisierten Einzelstrang-cDNA wurde in PCR- Reaktionen (s.
2.2.19.) mit genspezifischen Primern für Expressionsanalysen eingesetzt. Für
semiquantitative Analysen der Genexpression wurde die PCR mit der optimalen
Anzahl von Reaktionszyklen durchgeführt und stets als Kontrolle des Einsatzes
gleicher cDNA- Mengen zeitgleich die PCR für ein ubiquitär exprimiertes sog.
Haushaltsgen durchgeführt (meistens Gapdh). Die cDNA wurde auch für quantitative
„real-time PCR“ mit dem LightCycler -System (Roche, Mannheim) eingesetzt (s.
2.2.21.).
2.2.19. Polymerase-Kettenreaktion („PCR“)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = „polymerase chain reaction“; (Saiki et al.,
1988; Saiki et al., 1985) ermöglicht die in vitro Amplifikation einer spezifischen
Nukleinsäuresequenz aus einem Nukleinsäuregemisch unter Verwendung einer
hitzestabilen DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) (Chien et al., 1976),
sowie eines sequenzspezifischen Oligonukleotid-Primerpaares.
Standard PCR-Reaktionen wurden wie folgt ausgeführt. 1-50 ng template-DNA
wurde mit jeweils 10 pmol der beiden Primer, 2,5 µl 10x PCR-Reaktionspuffer, 0,5 µl
10 mM Desoxyribonukleotidlösung (dNTPs), 2,5 U Taq-Polymerase (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg) und bidestilliertem Wasser in einem Gesamtvolumen
von 25 µl gemischt. Nach zweiminütiger Denaturierung bei 95°C in einer PCRMaschine (T3 Thermocycler, Biometra) wurden die gewünschten DNA-Sequenzen
über 18-35 Zyklen wie folgt amplifiziert:
1. Denaturierung
94°C, 30 s
2. Hybridisierung
50-65°C, 30s
3. DNA-Synthese
72°C, 30-120 s
Unvollständige Produkte wurden in einem Terminationsschritt aufgefüllt (72°C, 300
s). Anschließend wurde der Ansatz auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot jedes PCR-Ansatzes
wurde auf einem Agarosegel analysiert. Für manche nachfolgenden Anwendungen
wurden die überflüssigen Nukleotide, Polymerase und Salze aus dem PCR-Ansatz
durch Gelfiltrationssäulen (MoBiTec, Göttingen) entfernt.
2.2.20. Klonierung von PCR-Produkten
Sollten PCR-Fragmente kloniert werden, wurde die PCR mit der ProofStart
Polymerase (Qiagen, Hilden) oder der PfuTurboTM Polymerase (Stratagene,
Heidelberg) nach den entsprechenden Anleitungen durchgeführt. Diese Enzyme
besitzen neben der prozessiven 5’-3’-DNA-Polymeraseaktivität zusätzlich eine 3’-5’Exonukleaseaktivität (Korrekturlesefunktion) und bauen deshalb ungefähr zehnmal
weniger falsche Nukleotide ein als die Taq-Polymerase.
Seite 34
Material und Methoden
Um PCR-Produkte zu klonieren, wurden diese in den SmaI-geschnittenen
pBluescriptKS-Vektor ligiert (s. 2.2.8.). Dazu mussten entweder die eingesetzten
PCR-Primer am 5‘-Ende phosphoryliert sein oder das fertige PCR-Produkt
phosphoryliert werden, da die 5‘-Enden des linearisierten Vektors im Anschluss an
den SmaI-Verdau dephosphoryliert (s. 2.2.2.) worden waren. Die Phosphorylierung
von PCR-Produkten erfolgte mit der T4 Polynukleotid-Kinase. Dazu wurde die
Menge PCR-Produkt, die anschließend zur Ligation eingesetzt werden sollte, mit 1 µl
10xT4 Ligase-Puffer (New England Biolabs, Beverly, USA), 5 U T4 PolynukleotidKinase (New England Biolabs, Beverly, USA) und bidestilliertem Wasser in einem
Gesamtvolumen von 10 µl gemischt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurde der Ansatz für 20 min bei 65°C inkubiert, um das Enzym zu
inaktivieren. Das so behandelte PCR-Produkt konnte dann direkt für die Ligation
eingesetzt werden (s. 2.2.8.).
2.2.21. Quantitative PCR mit dem LightCycler -System
Die quantitative Auswertung konventioneller PCR-Reaktionen, um z. B. das
Mengenverhältnis einer bestimmten cDNA zwischen zwei Proben zu ermitteln,
gestaltet sich relativ schwierig und ist fehlerbehaftet. Ursache für das Problem ist,
dass bei jeder PCR-Reaktion die Produktmenge nur über eine gewisse Spanne von
Reaktionszyklen exponentiell ansteigt. Dies wiederum führt dazu, dass beim
Vergleich zwischen zwei PCR-Reaktionen mit unterschiedlicher Konzentration der zu
amplifizierenden cDNA, das Verhältnis der jeweiligen Produktmengen abhängig ist
vom Zeitpunkt der Probenentnahme. Eine Lösung dieses Problems liegt darin, die
Produktmenge der PCR-Reaktionen nach jedem einzelnen Synthesezyklus zu messen
und zur Anzahl der Reaktionszyklen ins Verhältnis zu setzen. Für diese Arbeit wurde
das LightCycler-System (Roche, Mannheim) für die Durchführung und Auswertung
quantitativer PCR-Reaktionen benutzt. Bei diesem System werden die PCRReaktionen in dünnen Glaskapillaren durchgeführt. Im Reaktionsmix ist neben
Puffersubstanzen, genspezifischen Primern (s. 2.1.6.), Desoxynukleotiden und einer
hitzestabilen DNA-Polymerase auch ein Fluoreszenzfarbstoff (SYBR Green I)
enthalten, dessen Fluoreszenz durch die spezifische Bindung an doppelsträngige DNA
stark ansteigt. Dies ermöglicht die Messung der Produktmenge einer PCR-Reaktion
nach jedem Synthesezyklus über die Messung eines Fluoreszenzsignals. Somit
gewinnt man einen genauen Überblick über den „zeitlichen“ Verlauf jeder PCRReaktion und kann quantitative Aussagen bezüglich der Produktmengen von PCRReaktionen treffen.
LightCycler-Reaktionen wurden mit dem „FastStart DNA Master SYBR Green I –
Kit“ (Roche #2239264) ausgeführt. 2 µl einer template-cDNA-Lösung (s. 2.2.18.)
wurden mit 18 µl eines Reaktionsmix vermischt (s. Anleitung des „FastStart DNA
Master SYBR Green I – Kit“), in eine LightCycler-Kapillare pipettiert und die
gewünschte DNA-Sequenz im LightCycler-Instrument (Roche, Mannheim) wie folgt
amplifiziert:
10 min bei 95°C zur Aktivierung der FastStart DNA-Polymerase, danach 45
Reaktionszyklen mit folgenden Temperaturen
1. Denaturierung
95°C, 15 s
2. Hybridisierung
50-65°C, 5 s
3. DNA-Synthese
72°C, 15-30 s
Nach jedem Synthesezyklus wurde die Intensität der SYBR Green I-Fluoreszenz
gemessen und aufgezeichnet. Nach Beendigung des letzten Synthesezyklus wurde
eine Schmelztemperaturanalyse des PCR-Produkts durchgeführt. Dazu wurde die
Temperatur des Reaktionsansatzes langsam von 65°C auf 95°C erhöht und die SYBR
Green I-Fluoreszenz kontinuierlich gemessen und aufgezeichnet. Anschließend wurde
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Material und Methoden
der Ansatz wieder heruntergekühlt und ein Aliquot jedes PCR-Ansatzes wurde auf
einem Agarosegel analysiert. Die Schmelztemperaturanalyse des PCR-Produkts und
die Agarosegelelektrophorese wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass
tatsächlich das zu erwartende Produkt amplifiziert wurde.
2.3.
Expressionsanalyse mit dem Affymetrix GeneChip System
2.3.1.
Prinzip
Die Firma Affymetrix (Santa Clara, USA) stellt sog. Oligonukleotid-Microarrays
(„Gen-Chips“) her, mit denen in einem einzigen Experiment die Expression mehrerer
Tausend Gene, untersucht werden kann. DNA-Oligonukleotide (je 25 Basen lang), die
jeweils kurze Abschnitte der codierenden Sequenz von Genen repräsentieren, werden
kombinatorisch mit Hilfe von photolithographischen Masken direkt auf einer
Glasoberfläche synthetisiert (Lipshutz et al., 1999; McGall et al., 1996). Für eine
Genexpressionsanalyse wird RNA (polyA-RNA oder Gesamt-RNA) aus den zu
untersuchenden Zellen oder Geweben isoliert. Anschließend wird die RNA revers
transkribiert, wobei ein Oligo(dT)-Primer zum Einsatz kommt der am 5‘-Ende durch
einen T7-Promoter verlängert ist. Nach Erst- und Zweitstrang-DNA-Synthese erhält
man als Produkte cDNAs mit angehängtem T7-Promoter. Diese cDNAs dienen im
nächsten Schritt wieder als Matrize für eine in vitro-Transkription mit der T7 RNAPolymerase. Der Reaktionsmix für die in vitro-Transkription enthält biotinylierte
Nukleotide, Endprodukt dieser Reaktion ist also biotinylierte cRNA. Neben der
Biotin-Markierung der cRNA-Moleküle dient dieser Schritt auch der
Signalverstärkung, da ein einzelnes cDNA-Molekül mehrfach in cRNA transkribiert
werden kann. Die biotinylierte cRNA wird (nach Hitzefragmentierung) zur
Hybridisierung mit den Oligonukleotiden auf dem Gen-Chip eingesetzt. Hybridisierte
cRNA wird schließlich mit Hilfe eines fluoreszierenden Streptavidin-PhycoerythrinKonjugats in einem Laserscanner nachgewiesen und quantifiziert, die Daten mit Hilfe
spezieller Software analysiert. Die Expressionsanalysen in dieser Arbeit wurden nach
dem Protokoll von Affymetrix (Expression Analysis – Technical Manual)
durchgeführt. Die wichtigsten Schritte sind nachfolgend aufgeführt.
2.3.2.
Präparation der biotinylierten cRNA für die Hybridisierung
RNA aus cokultivierten ES-Zellen wurde wie in 2.4.5. beschrieben isoliert. Für die
cDNA-Synthese wurde das „Superscript Choice System“ (Gibco BRL #18090-019)
verwendet. Je 30 µg Gesamt-RNA wurden mit 0,1 nM T7-Oligo-dT-Primer für 10
min bei 70°C denaturiert, auf Eis abgekühlt und dann mit 400 U Superscript II bei
42°C für 1 h revers transkribiert (in 1 x Erststrangpuffer, 10 mM DTT, 0,5 mM
dNTP-Mix, Gesamtvolumen 20 µl). Anschließend wurde die Zweitstrangysnthese
durchgeführt. Dazu wurden dem Reaktionsmix 40 U DNA Polymerase I, 10 U E. coli
DNA-Ligase, 2 U RNaseH, 30 µl 5 x Zweitstrangpuffer, 3 µl 10 mM dNTP-Mix und
RNase-freies Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 150 µl zugegeben und das
Ganze für 2 h bei 16 °C inkubiert. Danach wurde der Ansatz noch mit 10 U T4-DNAPolymerase versetzt und weitere 5 min bei 16 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 10 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) abgestoppt und die cDNA durch einmalige
Phenol/Chloroform Extraktion (Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol 25:24:1,
Ambion #9732) gereinigt. Zur besseren Phasentrennung nach der Extraktion wurde
ein inertes Gel (Phase Lock Gel, Eppendorf #188233) benutzt. Durch Zugabe von 0,5
Volumen 7,5 M Ammoniumacetat-Lösung und 2,5 Volumen 100% Ethanol wurde die
cDNA gefällt, für 20 min bei 14000 rpm (RT) abzentrifugiert und nach einmaligem
Waschen mit 80% Ethanol in 12 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen.
Seite 36
Material und Methoden
Je 2,5 µl dieser cDNA wurden für die in vitro-Transkription (T7 RNA-Polymerase)
mit dem „BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit“ (Enzo, #900182) nach
Angaben des Herstellers eingesetzt. Bei der in vitro – Transkription wurden Biotinmarkiertes CTP und UTP in die cRNA eingebaut. Die Biotin-markierte RNA wurde
anschließend mit RNeasy Säulen (RNeasy Mini Kit, Qiagen, s. 2.4.5.) nach Angaben
des Herstellers aufgereinigt, in 30 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen und die
RNA-Menge und Konzentration photometrisch bestimmt. Die biotinylierte RNA
wurde dann in 40 mM Tris-Acetat (pH 8,0), 100 mM Kalium-Acetat und 30 mM
Magnesium-Acetat (möglichst kleines Gesamtvolumen) für 35 min bei 95 °C
fragmentiert und anschließend bis zur Chip-Hybridisierung eingefroren Ein Aliquot
der fragmentierten cRNA wurde zur Kontrolle auf einem 1 % Agarosegel analysiert.
2.3.3.
Hybridisierung der Oligonukleotid-Microarrays und Detektion der
hybridisierten cRNA
Lösungen:
Bezeichnung
Zusammensetzung / Herstellung
für 1 Liter: 70,4 g MES (freie Säure, Monohydrat; Sigma,
12 x MES
#M5287), 193,3 g MES-Natriumsalz (Sigma #M3885),
Pufferlösung
Auffüllen mit DEPC-H2O, danach sterilfiltrieren. Der pH(1,22 M MES-Puffer) Wert sollte zwischen 6,5 und 6,7 liegen.
für 250 ml: 41,7 ml 12 x MES-Pufferlösung, 92,5 ml 5M
2 x Färbepuffer
NaCl, 2,5 ml 10 % Tween-20 (Pierce #28320) und 112,8 ml
DEPC-H2O mischen und sterilfiltrieren.
2 x MES
0,2 M MES-Puffer, 1,77 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02 %
Hybridisierungslösung Tween-20, angesetzt mit DEPC-H2O
für 1 Liter: 175,32 g NaCl, 27,6 g NaH2PO4, 7,45 g EDTA in
ca.
800 ml DEPC-H2O lösen. pH-Wert mit 10 N NaOH
20 x SSPE
einstellen auf pH 7,4, danach mit DEPC-H2O auf 1 Liter
auffüllen und sterilfiltrieren.
für 1 Liter: 300 ml 20 x SSPE, 1 ml 10 % Tween-20 (Pierce
Waschpuffer A
#28320) und 698 ml DEPC-H2O mischen. Sterilfiltrieren und
danach 1 ml 5 % Antifoam (Sigma #A8082) zugeben.
für 1 Liter: 83,3 ml 12 x MES Pufferlösung, 5,2 ml 5 M
Waschpuffer B
NaCl, 1 ml 10 % Tween-20 (Pierce #28320) und 910,5 ml
DEPC-H2O mischen und sterilfiltrieren.
Durchführung:
Um die Qualität der cRNA zu überprüfen, wurden vor dem eigentlichen ChipExperiment kleine Test-Arrays (Test2-Arrays) mit jeweils 5 µg fragmentierter cRNA
hybridisiert und ausgewertet. Für die anschließende Hybridisierung der Mu19ksowie der MG-U74A-Chips wurden 30 µg fragmentierte cRNA pro Chipsatz
eingesetzt. Die Hybridisierungslösung enthielt 0,1 M MES-Puffer, 0,885 M NaCl, 20
mM EDTA, 0,01 % Tween 20 (Pierce #28320), 0,5 mg/ml BSA (Gibco BRL #15561020), 0,1 mg/ml Hering Sperma DNA (Promega #D1811) sowie die entsprechende
Menge fragmentierte cRNA. Zusätzlich enthielt die Hybridisierungslösung kleine
Mengen einer Kontroll-cRNA-Mischung (BioB, BioC, BioD, Cre; s. AffymetrixHandbuch) sowie 0,1 nM eines biotinylierten Kontroll-Oligonukleotids (B2-Oligo).
Beide Komponenten waren für die Auswertung der Array-Hybridisierung von
Bedeutung. Die Affymetrix-Microarrays wurden mit 1 x MES Hybridisierungslösung
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Material und Methoden
für ca. 15 min bei 45 °C im Hybridisierungsofen (GeneChip Hybridization Oven 640;
Affymetrix, Santa Clara, USA) vorinkubiert. Währenddessen wurde der
Hybridisierungscocktail für 5 min bei 99 °C erhitzt, danach für weitere 5 min bei 45
°C inkubiert und schließlich 5 min bei 14000 rpm (RT) abzentrifugiert, um unlösliche
Bestandteile zu sedimentieren. Der zur Vorinkubation eingesetzte 1 x MES Puffer
wurde nun durch den Hybridisierungscocktail ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte für
16 h bei 45 °C unter ständiger Rotation im Chip-Hybridisierungsofen.
Nach der Hybridisierung wurde der Hybridisierungscocktail entnommen und der Chip
mit Waschpuffer A gefüllt. Die Microarrays wurden in die AffymetrixFlüssigkeitsstation (GeneChip Fluidics Station 400; Affymetrix, Santa Clara, USA)
eingesetzt und nach den zugeordneten Waschprotokollen behandelt.
Für Test2 -Arrays kam das folgende Waschprotokoll zum Einsatz.
Wasch- und Färbeprogramm Mini_euk1
(Test2 Arrays)
Waschschritt 1 10 Zyklen mit Waschpuffer A (2 x Mischen/Zyklus) bei 25°C
Waschschritt 2 8 Zyklen mit Waschpuffer B (15 x Mischen/Zyklus) bei 50°C
Färbeschritt 1 10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA
(Gibco BRL #15561-020) und 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin
(Molecular Probes #S-866) enthielt.
Waschschritt 3 10 Zyklen mit Waschpuffer A (4 x Mischen/Zyklus) bei 30°C
Für Mu19k- und MG-U74A-Arrays wurde das nachfolgend dargestellte
Waschprotokoll eingesetzt.
Waschschritt 1
Waschschritt 2
Färbeschritt 1
Waschschritt 3
Färbeschritt 2
Färbeschritt 3
Waschschritt 4
Wasch- und Färbeprogramm EukGE-WS2
(Mu19k- und MG-U74A-Arrays, modifiziert für Mu6500-Arrays)
10 Zyklen mit Waschpuffer A (2 x Mischen/Zyklus) bei 25°C
4 Zyklen mit Waschpuffer B (15 x Mischen/Zyklus) bei 50°C
10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA
(Gibco BRL #15561-020) und 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin
(Molecular Probes #S-866) enthielt.
10 Zyklen mit Waschpuffer A (4 x Mischen/Zyklus) bei 25°C
10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA
(Gibco BRL #15561-020), 0,1 mg/ml Ziegen IgG (Sigma #5256)
und 3 µg/ml eines biotinylierten Anit-Streptavidin-Antikörpers
(Vector Laboratories #BA-0500) enthielt.
10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA
(Gibco BRL #15561-020) und 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin
(Molecular Probes #S-866) enthielt.
15 Zyklen mit Waschpuffer A (4 x Mischen/Zyklus) bei 30°C
Nach den entsprechenden Waschprogrammen wurden die Fluoreszenzsignale auf den
Microarrays mit einem speziellen Laserscanner (GeneArray Scanner; Affymetrix,
Santa Clara, USA) detektiert.
Vorgehensweise bei den Mu6500-Arrays:
Bei der Hybridisierung der Mu6500-Arrays wurde von den Herstellerangaben
abgewichen. Für die Hybridisierung wurden zunächst die vorgeschriebenen 15 µg
fragmentierte cRNA je Chipsatz verwendet. Die restlichen Komponenten der
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Material und Methoden
Hybridisierungslösung waren die gleichen, wie in 2.3.3. besprochen. Das vom
Hersteller empfohlene Wasch- und Färbeprogramm für Mu6500-Arrays entspricht
weitgehend dem bereits dargestellten Protokoll für Mu19k- und MG-U74A-Arrays,
bis auf die Tatsache, dass Waschschritt 3, sowie die Färbeschritte 2 und 3 dieses
Programms bei den Mu6500-Arrays normalerweise weggelassen werden. Eine
Amplifikation des Fluoreszenzsignals mit Hilfe der Antikörper war also nicht
vorgesehen und wurde zunächst auch nicht durchgeführt. Bei der Detektion der
Fluoreszenzsignale zeigte sich jedoch, dass die Intensität der Signale zu gering war (s.
3.2.2.). Deshalb wurde das Protokoll nach der ersten Detektion zunächst um die
Schritte zur Antikörper-Amplifikation ergänzt. Die Fluoreszenzdaten der Chips vor
und nach der Antikörper-Amplifikation wurden jeweils getrennt ausgewertet.
Durch die zusätzlich durchgeführte Antikörper-Amplifikation konnte zwar die
Intensität der Fluoreszenzsignale erhöht werden, schwach exprimierte Gene wurden
aber trotzdem nicht zuverlässig detektiert (s. 3.2.2.). Versuchsweise wurden deshalb
die Mu6500-Arrays einer zweiten Hybridisierung unterzogen, diesmal allerdings mit
45 µg fragmentierter cRNA pro Chipsatz. Es wurde wieder das Wasch- und
Färbeprogramm für Mu19k- und MG-U74A-Arrays benutzt. Die Detektion der
Fluoreszenzsignale erfolgte ebenfalls wieder vor und nach der AntikörperAmplifikation.
2.3.4.
Auswertung der Microarrays
Die Datenauswertung erfolgte mit der Analyse-Software von Affymetrix (Microarray
Suite Version 3.3 bzw. 4.0.1), wobei die Standardeinstellungen beibehalten wurden.
Eine genaue Darstellung der empirisch ermittelten Algorithmen, mit denen die
hybridisierten Microarrays ausgewertet wurden, ist dem Technischen Handbuch des
GeneChip-Systems zu entnehmen (Affymetrix GeneChip Expression Analysis –
Technical Manual; GeneChip 3.1 Expression Analysis Algorithm Tutorial). An dieser
Stelle wird ein kurzer Überblick gegeben und es werden diejenigen Begriffe erklärt,
die für das Verständnis von Ergebnisteil und Diskussion notwendig sind.
Der prinzipielle Aufbau der Microarrays wurde in Abschnitt 1.9. bereits erklärt. Er ist
die Grundlage für die Datenanalyse. Erster Schritt der Datenanalyse ist die
Einzelanalyse jedes Chips. Die Software trifft anhand der Fluoreszenzdaten für den
jeweiligen Sondensatz eine absolute Aussage bezüglich der Anwesenheit (Affymetrix:
Absolute Call) und Signalstärke (Affymetrix: Average Difference) eines Transkripts.
Dafür werden die einzelnen Sondenpaare innerhalb des Satzes untersucht. Ist in vielen
Sondenpaaren die gemessene Fluoreszenz-Intensität der PM-Sondenzelle höher als
die der MM-Sondenzelle (s. 1.9.), schließt die Software auf ein Vorhandensein des
Transkripts - die Differenzen dieser Intensitäten bilden wiederum die
Berechnungsgrundlage für die Signalstärke. Bezüglich der Präsenz eines Transkripts
(Affymetrix: Absolute Call) sind insgesamt drei Aussagen möglich: ein Transkript
wird entweder nicht detektiert (Absent), nur schwach detektiert (Marginal) oder
eindeutig detektiert (Present). Auf diese Weise werden aus Fluoreszenzintensitäten
Expressionsdaten.
Ist die Einzelanalyse für jeden Chip abgeschlossen, können die Chips untereinander
verglichen werden (vergleichende Analyse i. Ggs. zur Einzelanalyse). Dazu werden
zunächst Unterschiede in der Gesamtintensität der Fluoreszenzsignale zwischen den
einzelnen Chips rechnerisch ausgeglichen. Dies geschieht mittels Skalierung der
jeweiligen Intensitäten auf einen vorgegebenen Wert. Danach vergleicht die Software
für jeden Sondensatz die in den Einzelanalysen erhobenen Daten (eine der
Einzelanalysen dient dabei als Bezugspunkt) und gibt an, ob Expressionsunterschiede
bestehen (Affymetrix: Difference Call) und wie groß diese Unterschiede sind
(Affymetrix: Average Difference Change und Fold Change). Bezüglich des
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Material und Methoden
Unterschieds (Affymetrix: Difference Call) zwischen der detektierten Menge eines
Transkripts in zwei verschiedenen Experimenten, sind insgesamt fünf Aussagen
möglich: Zunahme (Increase; I), leichte Zunahme (Marginal Increase; MI), kein
Unterschied (No Change; NC), leichte Abnahme (Marginal Decrease; MD),
Abnahme (Decrease; D). Für jedes Transkript wird zusätzlich die Differenz zwischen
den in den Einzelanalysen errechneten Signalstärken (skalierte Werte) angegeben
(Affymetrix: Average Difference Change). Diese Differenz wird in ein definiertes
Verhältnis zur ursprünglichen Signalstärke gesetzt, wodurch man einen Faktor erhält
(Affymetrix: Fold Change), der Umfang und Änderungsrichtung (positives oder
negatives Vorzeichen) der Transkriptmengenänderung angibt. In einigen Fällen ist
eine genaue Berechnung des Änderungsfaktors (Fold Change) für ein bestimmtes
Transkipt nicht möglich, etwa weil das Transkript in einem der Experimente gar nicht
detektiert wurde (Absolute Call = Absent). In solchen Fällen gibt die AnalyseSoftware Schätzwerte an. Änderungsfaktoren, bei denen es sich um Schätzwerte
handelt, sind durch ein Tilde-Zeichen (∼) gekennzeichnet. Es ist zu beachten, dass die
Berechnung/Darstellung des Änderungsfaktors (Fold Change) immer erfolgt,
unabhängig davon, ob ein absoluter Expressionsunterschied (Zunahme oder
Abnahme, s.o.) festgestellt wurde oder nicht.
Nach Angaben des Herstellers (Affymetrix, Santa Clara, USA) können mit dem
Affymetrix GeneChip System Unterschiede in der Expressionsstärke eines Gens bis
hinab zu einem Faktor von 2,0 relativ zuverlässig detektiert werden, wenn die
absolute Expressionsstärke des Gens nicht zu niedrig ist. Eine noch höhere
Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist naturgemäß bei Expressionsunterschieden mit
einem Faktor von 3,0 und höher gegeben.
2.3.5.
Validierung der Microarray-Ergebnisse
Die Methode der quantitativen RT-PCR in Echtzeit (s. 2.2.21.) besitzt gegenüber
anderen Methoden, die ebenfalls zur Quantifizierung von Transkriptmengen
eingesetzt werden (z.B. Northern-Blot, RNase protection assays), den großen Vorteil,
dass sie vergleichsweise schnell durchgeführt werden kann. Deshalb wurde zur
Überprüfung der Ergebnisse aus den Chip-Experimenten die quantitative RT-PCR mit
Hilfe des LightCycler-Systems (Roche, Mannheim) eingesetzt.
Unmittelbar nach den jeweiligen Chip-Experimenten wurde mit RNA aus den
gleichen RNA-Pools, die auch für die Synthese der biotinylierten cRNA verwendet
wurden, cDNA-Erststrangsynthesen durchgeführt (s. 2.2.18.). Diese erfolgten, jeweils
mit gleichen RNA-Mengen, getrennt für RNA aus Wnt1-behandelten ES-Zellen bzw.
ES-Zellen des Kontrollexperiments. Mit der cDNA aus dem Wnt1-Experiment wurde
eine Verdünnungsreihe aus drei bis vier unterschiedlichen Konzentrationen erstellt
(Verdünnungen im Bereich zwischen 1:10 und 1:1000). Auch die cDNA aus dem
lacZ-Experiment wurde einmal verdünnt (meistens 1:20). Diese unterschiedlich
verdünnten cDNA-Lösungen wurden nun, ergänzt durch eine Wasserkontrolle, für
Echtzeit-PCR Reaktionen mit dem LightCycler-System (s. 2.2.21.) verwendet, wobei
genspezifische Primerpaare für das jeweils zu untersuchende Genprodukt zum Einsatz
kamen (s. 2.1.6.). Mit Hilfe der LightCycler-Software (Version 3.5) konnte die
Produktmenge (SYBR Green I – Fluoreszenzsignal) jeder einzelnen PCR-Reaktion
gegen die Zeit (Anzahl der Zyklen) graphisch dargestellt werden. Anhand der
Ergebnisse der Reaktionen, die mit den verschiedenen Verdünnungen der cDNA aus
Wnt1-behandelten ES-Zellen durchgeführt wurden, ließ sich eine Eichgerade
erstellen. Mit Hilfe dieser Eichgeraden konnten, für die jeweils amplifizierten
Genprodukte, die Ausgangskonzentrationen in den lacZ-behandelten ES-Zellen ins
Verhältnis gesetzt werden zu den Konzentrationen in den Wnt1-behandelten ESZellen. Daraus ließ sich für jedes untersuchte Gen ein Faktor errechnen, der den
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Material und Methoden
Unterschied in der Expressionsstärke des Gens in lacZ- bzw. Wnt1-behandelten ESZellen widerspiegelt (sog. LightCycler-Faktor). Um sicherzustellen, dass die cDNAErststrangsynthese bei lacZ-Probe und Wnt1-Probe gleich effektiv abgelaufen war,
wurde zunächst ein Haushaltsgen (Gapdh = Glycerinaldehyd-3-PhosphatDehydrogenase) nach dem obigen Muster amplifiziert und die jeweiligen
Konzentrationen verglichen. Kleine Konzentrationsunterschiede, die auftraten,
wurden vernachlässigt.
Die Faktoren für die Expressionsunterschiede, die mit Hilfe der Echtzeit-PCR
ermittelt wurden, konnten mit den entsprechenden Faktoren aus den ChipExperimenten verglichen werden (s. 2.3.4.). Für Gene, die auch in der Echtzeit-PCR
einen Expressionsunterschied zwischen lacZ-Probe und Wnt1-Probe aufwiesen,
wurden die Ergebnisse nochmals mit RNA aus unabhängigen Cokultur-Experimenten
(nicht für die Chip-Experimente verwendet!) überprüft. Dies geschah, um
sicherzustellen, dass der ermittelte Expressionsunterschied reproduzierbar ist, und
nicht nur aus der biologischen Variabilität des Ausgangsmaterials resultiert.
2.4.
Zellbiologische Methoden
2.4.1.
Zellkultur von NIH 3T3-Fibroblasten und HEK 293-Zellen.
NIH 3T3-Fibroblasten und HEK 293-Zellen (humane embryonale Nierenzellen)
wurden in DMEM („Dulbecco’s modified Eagle’s medium”) mit 10% FCS (Gibco
BRL), 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin in feuchter
Atmosphäre bei 10% CO2 und 37°C kultiviert. Das DMEM-Kulturmedium wurde in
Pulverform von Seromed (München) bezogen und zusammen mit dem ATV und PBS
in der Medienküche des Institutes angesetzt. Konfluente Zellen wurden 2x mit PBS
gewaschen und kurzzeitig mit ATV-Lösung (pro Liter: 8 g NaCl; 0,4 g KCl; 1 g
Glucose; 0,59 g NaHCO3; 0,29 g EDTA; 0,59 g Trypsin (Sigma, TypXI) inkubiert.
Wenn sich die Zellen deutlich abgerundet hatten und sich von der Kulturschale lösten,
wurde der Trypsinverdau durch Zugabe von Kulturmedium in 5-fachem Überschuß
abgestoppt und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren im Kulturmedium von der
Platte abgelöst und vereinzelt. Danach wurden die Zellen in geeigneten
Verdünnungen in neue Kulturschalen gegeben. Sollten bestimmte Anzahlen an Zellen
ausplattiert werden, so wurden die Zellen nach Ablösen von der Schale und
Vereinzelung im Kulturmedium in Falcon-Röhrchen pipettiert. Die Zellen wurden bei
1000 rpm für 3 min sedimentiert (Zentrifuge: Hettich Rotanta) und in 5 ml
Kulturmedium resuspendiert. Danach wurde die Zellanzahl mit Hilfe der NeubauerZählkammer unter dem Mikroskop bestimmt, und die gewünschte Anzahl an Zellen
ausplattiert.
2.4.2.
Zellkultur von ES-Zellen
Die Zellen wurden unter Standard-Zellkultur-Bedingungen bei 37°C und 10% CO2
auf einem Nährzell-Rasen aus inaktivierten EMFIs (s. 2.4.3.) kultiviert. Benutzt
wurde DMEM (ES-Zell-getestet; Sigma #5671) mit 20% FCS (ES-Zell-getestet, PAN
Biotech GmbH #P30-1402, Aidenbach), 1:105 β-Mercaptoethanol (ZellkulturReinigungsgrad von Sigma #M7522), 1000 U/ml Lif1 (Gibco BRL), 1x MEM (Gibco
BRL #11140-035), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Gibco BRL
#15070-022), 2 mM L-Glutamin (Gibco BRL #25030-024). Die ES-Zellen wurden
alle 2 Tage passagiert. Dazu wurden sie 1x mit PBS gewaschen, mit ATV für 2-5 min
bei 37°C inkubiert, das Trypsin durch Zugabe eines 5-fachen Volumens an Medium
inaktiviert und durch Pipettieren in Einzelzell-Suspension überführt. Nach
Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) wurden die Zellen in frischem Medium
Seite 41
Material und Methoden
resuspendiert und in einer Verdünnung 1:3 bis 1:6 auf neuen EMFI-Schalen (s. 2.4.3.)
ausgesät.
2.4.3.
Herstellung eines Nährzellrasens aus Embryonalen Fibroblasten (EMFI)
14 – 16 Tage alte Embryonen (129/Sv, heterozygot neoR ) wurden semi-steril
entnommen und nach Entfernung der Dezidua zweimal mit PBS gewaschen, die
Leber entfernt und die Embryonen mechanisch zerkleinert. Danach wurden sie mit je
2 x 50 ml ATV im Erlenmeyerkolben (mit Glasperlen, 4 mm) bei 37°C unter
schwachem Rühren (Magnetrührer) 2 x 30 min inkubiert. Die Zellsuspension wurde
abgesiebt, das Trypsin unter Mediumzugabe (EMFI-Medium: DMEM + 10% FCS,
100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin) abgestoppt und
bei 1000 rpm für 5 min abzentrifugiert. Nach dem Resuspendieren wurden die Zellen
auf 150 mm Gewebekulturschalen ausplattiert und bis zur Konfluenz kultiviert (ca. 2
Tage) und eingefroren (60% DMEM, 30% FCS, 10% DMSO). Als Faustregel galt: 23 Embryonen ergeben eine 150 mm Schale.
Bei Bedarf wurden die Zellen aufgetaut, 1:3 verdünnt auf 150 mm Platten ausgesät,
noch einmal 1:4 passagiert und zuletzt durch Röntgenbestrahlung in der Anlage des
Instituts von Christiane Heidkämper zellteilungsinaktiviert. Hierbei wird durch die γStrahlung (3000 rad) die DNA der Zellen geschädigt, wodurch es zum Teilungsstopp
kommt. Die embryonalen Fibroblasten (EMFI) wurden nach der Bestrahlung in einem
Einfrierröhrchen/150 mm Platte eingefroren und bei Bedarf wurden pro
Einfrierröhrchen: 5x 90 mm Gewebekulturschalen mit Nährzellrasen hergestellt.
2.4.4.
Cokultur von ES-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten
Die Cokultur von ES-Zellen mit transfizierten NIH 3T3-Fibroblasten, d.h. die Kultur
von ES-Zellen in engem räumlichen Kontakt mit diesen Fibroblasten, wurde
durchgeführt, um ES-Zellen mit einem Wnt-Signal zu stimulieren. Die eingesetzte
Fibroblasten-Zelllinie (NIH 3T3-Wnt1) war dazu mit der cDNA von Maus Wnt1 unter
der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promoters transfiziert worden (Kispert et al.,
1998). Eine weitere Fibroblasten-Zelllinie (NIH 3T3-lacZ), die mit der cDNA der E.
coli β-Galactosidase (lacZ) transfiziert worden war, wurde für Kontrollexperimente
eingesetzt. Die Kultur von ES-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten erfolgte wie oben
beschrieben.
Am Vorabend des Cokulturexperiments wurden jeweils 3 x 106 Fibroblasten der
Zelllinien NIH 3T3-Wnt1 bzw. NIH 3T3-lacZ auf 90 mm Gewebekulkturschalen
ausgesät und über Nacht in Fibroblasten-Kulturmedium (s. 2.4.1.) kultiviert. Am
nächsten Tag, nach ca. 18 h, bildeten die Fibroblasten einen fast konfluenten
Zellrasen in den Gewebekulturschalen. Nun wurden ES-Zellen von einer 30-50 %
konfluenten Gewebekulturschale (mit EMFI-Zellrasen) abgelöst, vereinzelt und die
Zelldichte mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Je 3,5 x 105 ES-Zellen wurden
auf 24 mm Transwell-Filter (Costar #3491, Kollagen-beschichtet, Porengröße: 0,4
µm) in 1,5 ml ES-Zell-Kulturmedium ausgesät. Die Transwell-Filter mit den ESZellen wurden in mit 2 ml ES-Zell-Kulturmedium pro well beschickten 6-well Platten
(Costar #3506) platziert und bei Standard-Bedingungen für 6 h inkubiert. Nach diesen
6 Stunden hafteten die meisten ES-Zellen auf den Kollagen-beschichteten porösen
Membranen der Transwell-Filter. Nun wurden die 90 mm Gewebekulturschalen, auf
denen sich die NIH 3T3-Fibroblasten bis zur Konfluenz ausgebreitet hatten, für die
Cokultur präpariert, indem das Fibroblasten-Kulturmedium durch ES-ZellKulturmedium ersetzt wurde. Die Transwell-Filter mit den ES-Zellen wurden dann
direkt auf den Fibroblasten-Zellrasen platziert, sodass die poröse Membran der Filter
direkt mit den NIH 3T3-Zellen in Kontakt kam. Je zwei Transwell-Filter wurden auf
Seite 42
Material und Methoden
eine 90 mm Gewebekulturschale mit NIH 3T3-Wnt1 Zellen und eine weitere Schale
mit NIH 3T3-lacZ Zellen platziert und bei Standard-Bedingungen inkubiert. Nach 10 h
bzw. 18 h Cokultur wurden die Transwell-Filter mit den ES-Zellen von den
jeweiligen Kulturschalen genommen und die Gesamt-RNA aus den beiden Ansätzen
(Wnt1 und lacZ) getrennt isoliert (s. 2.4.5.).
2.4.5.
Isolation von Gesamt-RNA aus cokultivierten ES-Zellen
Die Isolation von Gesamt-RNA aus den cokultivierten ES-Zellen (s. 2.4.4.) wurde mit
dem „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Das Prinzip beruht auf der Bindung von RNA-Molekülen, die länger sind als 200
Nukleotide, an eine Silikamembran unter hohen Salzkonzentrationen. Die
Handhabung der Transwell-Filter, in denen die ES-Zellen kultiviert wurden (s. 2.4.4.),
bei den ersten Schritten des Aufreinigungsprozesses wird nachfolgend beschrieben.
Nach dem Herunternehmen der Transwell-Filter mit den ES-Zellen von der
Kulturschale mit den NIH 3T3-Fibroblasten wurde zunächst das ES-ZellKulturmedium abgesaugt und die ES-Zellen einmal mit PBS gewaschen. Danach
wurde die Unterseite der Transwell-Filter für 2 min in PBS-Lösung, die EDTA in
einer Konzentration von 2 mM enthielt, getaucht. Anschließend wurde die Unterseite
der Transwell-Filter mit einem in PBS getränkten Papiertuch abgewischt. Diese
beiden Schritte dienten dazu, eventuell an der Unterseite der Filtermembran haftende
NIH 3T3-Fibroblasten zu entfernen. Die PBS-Lösung in den Transwell-Filtern wurde
nun vollständig abgesaugt und die ES-Zellen auf der Filtermembran mit einem
Guanidin-Isothiocyanat-haltigen Puffer, dem zusätzlich β-Mercaptoethanol
zugegeben wurde, lysiert. Dazu wurden 350 µl des Lysispuffers direkt auf die
Filtermembran mit den ES-Zellen gegeben und die Oberfläche des Filters vorsichtig
mit einem Zellschaber behandelt. Durch die im Puffer enthaltenen Substanzen wurden
vorhandene RNasen inaktiviert, wodurch die Degradation der RNA verhindert wurde.
Das Lysat wurde anschließend in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und durch
mehrmaliges Aufziehen in eine 1 ml-Spritze durch eine 0,9 mm (20xg) Kanüle
homogenisiert. Das homogenisierte Lysat wurde nun mit 350 µl 70 % Ethanol
gemischt, auf eine RNeasy Mini-Säule gegeben und mittels Zentrifugation durch das
Säulenmaterial gepresst, wobei die RNA an die Silikamembran bindet. Nach
mehreren Waschschritten wurde die RNA mit RNase-freiem Wasser von der Säule
eluiert. (s. RNeasy Mini Handbook 06/2001).
2.4.6.
Reporterstudien in transfizierten HEK 293-Zellen
Lösungen:
Bezeichnung
2x HBS für Transfektionen
NP-40-Lysispuffer
(Luciferase-Messung)
Luciferase-Messlösung
Renilla-Messlösung
Zusammensetzung
280 mM NaCl; 50 mM HEPES; 1,5 mM Na2HPO4;
pH 7,01-7,04
250 mM KCl; 50 mM Tris-H3PO4, pH 7,8; 10% (v/v)
Glycerol; 0,1% (v/v) NP-40
25 mM Tris-PO4, pH 7,8; 10 mM MgSO4; 2 mM
ATP pH 7,5; 50 µM Luciferin (Sigma #L6882)
100 mM NaCl; 25 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM
EDTA; 0,5 µM Coelenterazin (Calbiochem
#233900)
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Material und Methoden
β-Galaktosidase Messlösung
β-Galaktosidase Stopplösung
1x Galacton (Tropix #GC040) in H2O
0,2 M NaOH; 0,2 mg/ml Emerald (Tropix
#LAE250)
Durchführung:
Zur Charakterisierung der regulatorischen Sequenzen von Axin2 und Follistatin
wurden Promotor-Reporterstudien durchgeführt. Dazu wurden die regulatorischen
Sequenzen der beiden Gene vor das Luciferase-Reportergen (Photinus-Luciferase) im
pGL3 basic-Vektor (Promega GmbH, Mannheim) kloniert (s. 3.5.2.1. u. 3.6.2.1.).
Anschließend wurden die Luciferase-Reporterkonstrukte in HEK 293-Zellen
funktionell getestet. Dazu wurden die Luciferase-Reporterkonstrukte zusammen mit
weiteren Reportern und Expressionsvektoren in HEK 293-Zellen transfiziert.
Für die Transfektion von 3x105 Zellen HEK 293-Zellen kamen folgende DNAMengen zum Einsatz:
Zur Expression des Luciferase-Reportergens
1 µg
eines pGL3-Reporterkonstrukts (mit d. Axin2 bzw. Follistatin-Promotor)
Zur internen Standardisierung
0,1 µg
pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH, Mannheim)
oder
0,2 µg
pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech, Palo Alto, USA)
Zur Aktivierung des Wnt/β-Catenin Signalwegs (s. 3.5.2.2.)
50-500 ng eines pCS2+-LEF/TCF-Expressionskonstrukts
0,5 µg
pCS2+-β-Catenin S33A
Die DNA-Menge in den einzelnen Transfektionsansätzen wurde gegebenenfalls durch
die Zugabe des leeren pCS2+-Vektors angeglichen. Um die Transfektionsrate von
Zellen zu kontrollieren, wurde das GFP exprimierende Plasmid pEGFP-N3 (Clontech,
Heidelberg; 1 µg je Transfektionsansatz) benutzt.
Die Transfektion von HEK293-Zellen wurde mit der CalciumphosphatPräzipitationsmethode durchgeführt (Gorman und Cristofalo, 1985). Die Zellen
wurden mindestens 6 h vor der Transfektion in einer Dichte von 3x105 Zellen pro well
(= 3,5 cm Schale) in 6-well Schalen mit DMEM-Kulturmedium (s. 2.4.1.)
ausgebracht. Zur Herstellung des Calciumphosphat-Präzipitats wurden die jeweiligen
Expressionsvektoren (max. 2,5 µg DNA) mit 15 µl 2,5 M CaCl2 und sterilem ddH2O
in einem Volumen von 150 µl vermischt. Anschließend wurden dieser Lösung
tropfenweise 150 µl 2x HBS unter Vortexen zugeführt. Das Präzipitat wurde
anschließend direkt auf die Zellen getropft und verteilt. Nach 12-16 h wurde das
Medium abgesaugt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und für weitere 24-28 h in
frischem DMEM-Kulturmedium unter Standardbedingungen weiter kultiviert.
Für die Reporter-Messungen (s.u.) wurden die transfizierten Zellen mit 400 µl NP-40Lysispuffer pro well für 20 min bei 4°C unter starkem Schütteln (Kippschüttler)
lysiert und für 10 min bei 14000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Für jede Messung
wurde 1/10 (40 µl) des jeweiligen Überstandes in 96-well Mikrotiterplatten pipettiert.
Es wurden jeweils Doppelbestimmungen mit einem Luminoskan AscentLuminometer (Thermo Labsystems) durchgeführt. Alle Luciferase-ReporterExperimente wurden mindestens fünf mal unabhängig voneinander durchgeführt. Die
Seite 44
Material und Methoden
gemessene Luciferase-Aktivität in den einzelnen Ansätzen wurde jeweils in Bezug
gesetzt zur gemessenen Aktivität der β-Galaktosidase bzw. der Renilla-Luciferase im
gleichen Ansatz (interne Standardisierung). Aus dieser Verfahrensweise ergeben sich
sog. standardisierte Luciferase-Aktivitäten, deren Größe nicht mehr von der
Transfektionseffizienz der HEK 293-Zellen abhängt.
Luciferase-Messung
Die pGL3-Reporterkonstrukte codieren für die Photinus-Luciferase. Der Begriff
Luciferase ist eine Sammelbezeichnung für strukturell unterschiedliche
Oxidoreductasen aus verschiedenen Organismen mit der gemeinsamen Eigenschaft,
durch Oxidation sogenannter Luciferine Biolumineszenz induzieren zu können.
Besonders gut untersucht ist das System bei dem Leuchtkäfer Photinus pyralis. Der
Einfachheit halber wird die Photinus-Luciferase deshalb in dieser Arbeit als
Luciferase bezeichnet, das Photinus-Luciferin einfach als Luciferin. Für jede
Messung wurden 100 µl Luciferase-Messlösung pro well injiziert und nach 10 s
Inkubation die Lumineszenz detektiert.
Renilla-Messung (pCMV-Renilla Vektor)
Der pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH, Mannheim) codiert für die RenillaLuciferase. Bei der Renilla-Messung handelt es sich also auch um die Messung der
Aktivität einer Luciferase, der Luciferase des Meeresstiefmütterchens Renilla
reniformis. Das Renilla-Luciferin Coelenterazin unterscheidet sich in Struktur und in
der chemischen Umsetzung durch die Renilla-Luciferase wesentlich vom PhotinusLuciferin. Für jede Messung wurden 100 µl Renilla-Messlösung pro well injiziert und
unmittelbar die Lumineszenz detektiert.
β-Galaktosidase-Messung (pCMV-β-Galaktosidase Vektor)
Das Enzym β-Galactosidase, für das der pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech,
Palo Alto, USA) codiert, katalysiert in Organismen die Hydrolyse des Disaccharids
Lactose in seine Bestandteile Glucose und Galactose. Es gibt aber auch eine große
Zahl von Lactose-Derivaten, die von diesem Enzym als Substrat gebunden und
umgesetzt werden. Bei der Hydrolyse einiger dieser Substrate entstehen Chromophore
bzw. Fluorophore, was den Einsatz dieses Enzyms als Reporter ermöglicht. In diesem
Fall wurde Galacton als Substrat eingesetzt., das nach Zugabe der β-GalaktosidaseMesslösung (100 µl pro well) bei physiologischem pH von der β-Galactosidase
hydrolysiert wird (30 min Inkubationszeit bei RT). Neben Galactose entsteht ein
weiteres Spaltungsprodukt, das bei alkalischem pH-Wert (deshalb Zugabe von βGalaktosidase Stopplösung / 100 µl pro well) spontan zerfällt, wobei ein angeregtes
Zerfallsprodukt entsteht, das durch Emission von Photonen in einen stabilen Zustand
übergeht. Diese Lichtemission wird vom Luminometer gemessen.
2.5.
Embryologische Methoden
2.5.1.
Verwendete Mäuse
Die Mäuse wurden in der Versuchstieranlage des Institutes gehalten und gezüchtet. Es
wurden für die vorliegende Arbeit Mäuse der Stämme NMRI, C57BL/6, FVB und die
einzelnen genetisch veränderten Stämme mit reinem oder gemischtem Hintergrund
verwendet. Zur Kontrolle der über Nacht angesetzten Verpaarungen wurden die
Seite 45
Material und Methoden
Weibchen auf einen Vaginalpfropf hin untersucht. Mittags am Tag des Vaginalpfropfs
wurde als Tag 0,5 p.c. der Embryonalentwicklung gezählt.
2.5.2.
Isolation von Embryonen
Die Embryonen wurden zu den entsprechenden Zeiten entnommen und routinemäßig
in kaltem PBS unter dem Stereomikroskop nach Standardtechnik freipräpariert
(Hogan et al., 1994). Für die spätere Verwendung zur in situ Hybridisierung (s. 2.5.6.)
wurden die Embryonen über Nacht in 4% Paraformaldehyd/PBS bei 4°C fixiert, 3x in
PBT und 3x in 100% Methanol gewaschen und anschließend in 100% Methanol bei
–20°C gelagert.
2.5.3.
Präparation von genomischer DNA aus embryonalen Dottersäcken
Bei der Präparation von Embryonen (s. 2.5.2.) wurde der Dottersack entnommen und
für 5 h in einem Lysis-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2;
0,45% Tween-20; 0,45% NP-40; 200 µg/ml Proteinase K) bei 50°C inkubiert.
Anschließend wurde die Proteinase K durch Inkubation für 30 min bei 95°C
inaktiviert. Zur Genotypisierung der Embryonen wurden dann 1-2 µl dieses
Dottersack-Lysats in einer PCR-Reaktion eingesetzt (s. 2.5.9.).
2.5.4.
Präparation von genomischer DNA aus Schwanzbiopsien
Hierfür wurde eine ungefähr 0,5-1 cm lange Schwanzprobe entnommen und ÜN in
600 µl Lysis-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM EDTA; 0,5% SDS; 200 µg/ml
Proteinase K) bei 55°C geschüttelt. Am nächsten Morgen wurden die unlöslichen
Bestandteile für 10 min bei 14000rpm abzentrifugiert und der Überstand in ein neues
Eppendorf-Gefäß überführt. Durch Zugabe von 600 µl Isopropanol wurde die
genomische DNA gefällt und entsprechend der Menge entweder erneut wie oben
abzentrifugiert und in TE-Puffer aufgenommen oder mit einer Pipettenspitze aus dem
Eppendorf-Gefäß entnommen und in ein neues Eppendorf-Gefäß mit 50-200 µl TEPuffer transferiert. Durch erneutes Schütteln bei 55°C für 30 min bis zu mehreren
Stunden wurde die DNA vollständig gelöst. Die so gewonnene DNA wurde für die
Genotypisierung durch Southern-Blot-Analyse oder eine PCR-Reaktion eingesetzt.
2.5.5.
Herstellung von markierten RNA-Proben für die in situ Hybridisierung
Für den Nachweis von mRNA-Molekülen durch in situ Hybridisierung wurden
komplementäre RNA-Proben hergestellt. Hierfür wurden cDNA-Fragmente möglichst
aus dem offenen Leseraster des nachzuweisenden Transkripts in Plasmide kloniert,
die flankierend zum Polylinker die Bakteriophagen-Promotoren (SP6, T3 oder T7)
besitzen. Einige dieser Plasmide wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt (s.
2.1.7.).
Die Plasmide mit den cDNA-Fragmenten wurden linearisiert. RNA-Sonden beider
Stränge wurden in vitro hergestellt; der nicht kodierende Strang („anti-sense“) diente
zum Nachweis der Transkripte, während der kodierende Strang („sense“) als
Kontrolle zur Einschätzung des unspezifischen Hintergrundes verwendet wurde.
10 µg DNA wurden mit ca. 20 U eines geeigneten Restriktionenzyms über Nacht
verdaut und mit Natriumacetat pH 5,2 (Endkonz. 0,3 M) gefällt, zweimal mit
70%igem Ethanol gewaschen und in 10 µl DEPC-Wasser aufgenommen. 1 µl wurde
für die in vitro Transkription eingesetzt.
Seite 46
Material und Methoden
Der Transkriptionsansatz wurde bei RT zusammenpipettiert und danach 2 h bei 37°C
inkubiert:
6 µl DEPC-Wasser
1 µl Transkriptionspuffer (Roche)
1 µl linearisiert Plasmid-DNA
1 µl 10x DIG RNA Reaktions-Mix (Roche)
0,5 µl RNase Inhibitor (Roche)
0,5 µl SP6-,T3-, oder T7-RNA-Polymerasen (Roche)
Nach der Inkubationszeit wurden 1 µl DNase I (10 U/µl Roche) zugegeben und für
weitere 15 min bei 37°C inkubiert. Die Fällung der RNA erfolgte unter
Volumenerhöhung mit 100 µl DEPC-Wasser und Zugabe von 10 µl 3 M
Natriumacetat (pH 5,2) und 300 µl Ethanol bei –80°C für 15 min. Die ausgefällte
RNA wurde abzentrifugiert (10 min bei 14000 rpm und 4°C) und einmal mit
70%igem Ethanol gewaschen. Die getrocknete RNA wurde in 55 µl DEPC-Wasser
aufgenommen und 5 µl wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert.
2.5.6.
„Whole mount“ RNA in situ Hybridisierung
1. Tag (RNA-Hybridisierung):
Alle Schritte wurden in Szintillationsgläschen durchgeführt, Lösungen RNase-frei in
DEPC-Wasser angesetzt und soweit nicht anders angegeben bei RT gearbeitet.
Die Embryonen für die Hybridisierungen wurden wie in 2.5.2. beschrieben isoliert
und bei –20°C in Methanol gelagert. Zu Beginn wurden diese in einer absteigenden
Methanol-Reihe (75%, 50%, 25% Methanol/PBT) und dann zweimal in PBT für
jeweils 5-10 min rehydriert. Die Embryonen wurden dann mit 6% H2O2 in PBT bei
RT gebleicht und erneut 3x 5 min in PBT gewaschen. Danach erfolgte ein Verdau mit
Proteinase K. Hierfür wurde die Embryonen mit 10 µg/ml Proteinase K in PBT bei
RT inkubiert (Inkubationszeiten 7,5 d.p.c., 2 min; 8,5 d.p.c., 3 min; 9,5 d.p.c., 4 min;
10,5 d.p.c., 6 min; 11,5 d.p.c., 9 min; 12,5 d.p.c., 15 min; 13,5 d.p.c., 20-25 min; 14,5
d.p.c., 25-30 min) Der Proteinase K-Verdau wurde durch Inkubation der Embryonen
für 2x 10 min in 2 mg/ml Glycin in PBT abgestoppt, anschließend wurden die
Embryonen 3x 5 min in PBT gewaschen. Danach wurden die Embryonen in 4%
Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd in PBS für 20 min nachfixiert und erneut
weitere 3x 5 min in PBT gewaschen. Nun wurden die Embryonen für 2 h bei 70°C im
Hybridisierungspuffer (50% Formamid; 5x SSC, pH 4,5; 1% SDS; 50 µg/ml Hefe
tRNA; 50 µg/ml Heparin) unter ständiger Bewegung inkubiert. Die Hybridisierung
mit der RNA-Sonde erfolgte bei 70°C ÜN in neuem Hybridisierungspuffer mit 1
µg/ml RNA-Probe (s. 2.5.5.).
2. Tag (anti-DIG Antikörper Inkubation):
Nicht gebundene RNA-Probe wurde durch 3x 30 min Waschen in Waschlösung I
(50% Formamid, 5x SSC, pH 4,5; 1% SDS) bei 70°C, 3 x 5 min Waschen in TNT
(10mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,5 M NaCl; 0,1% Tween-20) bei RT, 1 h Inkubation in
TNT mit 100 µg/ml RNase A bei 37°C und erneutem 3x 30 min Waschen in
Waschpuffer II (50% Formamid, 2x SSC pH 4,5; 0,5 M NaCl, 0,1% Tween-20) bei
65°C vollständig weggewaschen. Die Embryonen wurden dann für die AntikörperReaktion 3x 5 min in MAB (100 mM Maleinsäure; 150 mM NaCl; 2 mM Levamisol;
0,1% Tween-20; pH 7,5) bei RT gewaschen und für 2 h mit 10% Schafserum in
MAB/2% Block-Pulver (Roche #1096176) bei RT abgesättigt und zuletzt ÜN in
Antikörper-Lösung bei 4°C unter Bewegung inkubiert.
Antikörperlösung: 0,5 ml MAB/2% Block wurden mit 1 mg Embryopulver (s. 2.5.7.)
versetzt, gevortext und für 30 min bei 70°C inkubiert und danach auf Eis abgekühlt.
Seite 47
Material und Methoden
Zu dieser Lösung wurden 5 µl Schafserum und 0,4 µl Anti-DIG Alkaline
Phosphatase-gekoppelt (1:5000) zugegeben und bei 4°C unter ständiger Bewegung
für 1 h inkubiert. Die Lösung wurde bei 5000 rpm für 10 min abzentrifugiert und mit
MAB/2% Block/1% Schafserum auf 2 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Wenn größere
Mengen benötigt wurden, wurde der Ansatz multipliziert.
3. Tag (Waschtag):
Am Anfang des Tages wurden die Embryonen 3x 10 min in MAB bei RT gewaschen
und dann über den ganzen Tag hinweg stündlich der MAB-Puffer gewechselt. Zuletzt
wurde ÜN bei 4°C in MAB gewaschen.
4. Tag (Entwicklung):
Die Embryonen wurden auf die Entwicklung durch 3x Waschen in NTMT (100 mM
Tris-HCl, pH 9,5; 50 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 0,1% Tween-20) vorbereitet und
dann in BM Purple (Roche #1442074) inkubiert, bis die Färbung ausreichend stark
war. Die Reaktion wurde durch 3x Waschen in PBT pH 4,5 abgestoppt und die
Embryonen in 4% Paraformaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd/PBS fixiert. Zum
Fotografieren wurden die Embryonen in PBT überführt und schließlich in 4%
Paraformaldehyd/PBS gelagert.
2.5.7.
Herstellung von Embryopulver
Zur Absorption von unspezifisch gebundenen Antikörpern, die mit dem Mausgewebe
reagieren, wurde die Antikörperlösung mit Embryopulver inkubiert. Zur Präparation
von Embryopulver wurde die in Hogan et al. (Hogan et al., 1994) auf Seite 358
ausführlich beschriebene Methode verwendet.
2.5.8.
Herstellung transgener Reportermäuse
Ausgangspunkt für die Klonierung von Axin2- bzw. Follistatin- lacZ-ReporterKonstrukten war ein Cdx1-Promoter lacZ-Reporter-Konstrukt (pGL3b-cdx1-3725
lacZ), das von Heiko Lickert zur Verfügung gestellt wurde (Lickert, 2001). Der Cdx1Promoter dieses Plasmids wurde durch die regulatorische Region des Axin2-Gens
(Ax2 P/I1 bzw. Ax2 P/I1 1-7 mut) oder den Follistatin-Promotor (Foll 2,8 kb bzw.
Foll 2,8 kb 1-4 mut) ersetzt. Alle Axin2- bzw. Follistatin- Promoter lacZ-Reporter
wurden mit KpnI/SalI aus dem Vektor ausgeschnitten, über ein Agarosegel
aufgereinigt (s. 2.2.4.) und aus dem Gel isoliert (s. 2.2.5.). Die DNA wurde in
Injektions-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1mM EDTA) aufgenommen und auf eine
Konzentration von 5 ng/µl verdünnt. Im Transgenen Service des Institutes wurde die
DNA in dieser Konzentration in die Pronuklei von befruchteten Eizellen injiziert.
Injizierte Zygoten, die sich über Nacht geteilt hatten und somit das Zweizellstadium
erreicht hatten, wurden in die Uteri scheinschwangerer Mäuse retransferiert. Die
Embryonen wurden entweder am Tag 9,0 – 9,5 der Entwicklung präpariert (sog.
transiente Transgene; s. 3.5.4.) oder von den Mäusen bis zur Geburt ausgetragen und
für Verpaarungen mit NMRI-Mäusen eingesetzt (stabile transgene Linien; s. 3.6.4.).
2.5.9.
Genotypisierung von Mäusen und Mausembryonen
Zum Nachweis des lacZ-Reportergens in transgenen Embryonen/Mäusen (s. 2.5.8.)
wurde eine lacZ-PCR (s. 2.2.19.) mit isolierter DNA aus Dottersäcken (s. 2.5.3.) oder
Schwanzbiopsien (s. 2.5.4.) durchgeführt.
lacZ 5’-Primer: 5´-GCG TTG GCA ATT TAA CCG CC-3´
lacZ 3’-Primer: 5´-CAG TTT ACC CGC TCT GCT AC-3´
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Material und Methoden
Die Embryonen aus den Verpaarungen der β-Catenin Exon 3- gefloxten Mäuse mit den
En1-Cre knock in Mäusen (s. 3.5.3.3.) wurden von Veronique Brault genotypisiert. Dabei
wurden mit DNA aus Dottersäcken (s. 2.5.3.) verschiedene PCR-Reaktionen (s. 2.2.19.)
durchgeführt.
Zum Nachweis der Cre-Rekombinase erfolgte eine PCR mit folgenden Primern:
Cre 5’-Primer:: 5’- CAAGTTGAATAACCGGAAATG-3’
Cre 3’-Primer:
5’- GCCAGGTATCTCTGACCAGA-3’
Der β-Catenin-Locus wurde durch PCR-Reaktionen mit folgenden Primerpaaren
analysiert.
Zum Nachweis des Exon 3-gefloxten β-Catenin-Allels:
Ex3 floxed 5’-Primer: 5’- GACACCGCTGCGTGGACAATG-3’
Ex3 floxed 3’-Primer: 5’- GTGGCTGACAGCAGCTTTTCTG-3’
Zum Nachweis des Exon 3-deletierten β-Catenin-Allels:
Ex3 floxdel 5’-Primer: 5’- GCTGCGTGGACAATGGCTAC-3’
Ex3 floxdel 3’-Primer: 5’- TGAGCCCTAGTCATTGCATAC-3’
Eine Genotypisierung der vestigial tail Embryonen (s. 3.5.3.2.) wurde nicht
durchgeführt. Die Entnahme der Embryonen erfolgte am Tag 10,25 p.c. In diesem
Entwicklungsstadium konnten heterozygote und homozygote vestigial tail
Embryonen bereits anhand des Phänotyps voneinander unterschieden werden.
2.5.10. X-Gal Färbung von Embryonen
Für die X-Gal Färbung wurden die Embryonen (7,5-14,5 d.p.c.) in PBS isoliert (s.
2.5.2.) und dann für 15-90 min (je nach Alter) bei Raumtemperatur mit Fixativ (1%
Formaldehyd; 0,2 % Glutaraldehyd; 5 mM EGTA; 2 mM MgCl2; 0,02 % NP-40; in
PBS angesetzt) inkubiert. Danach wurde 3x 10 min mit 0,02 % NP-40/PBS
gewaschen (bei RT). Die Färbung erfolgte zwischen 2h – ÜN bei 37°C im Dunkeln
mit X-Gal Lösung (2 mM MgCl2; 5 mM K3Fe(CN)6; 5 mM K4Fe(CN)6; 0,01% NaDesoxycholat; 0,02% NP-40; 1 mg/ml X-Gal; in PBS angesetzt). Die Embryonen
wurden nach der Färbung in PBS gewaschen und in 4% Paraformaldehyd/PBS
nachfixiert. Daraufhin wurden sie photographiert und histologisch analysiert (siehe
Abschnitt 2.6.).
2.6.
Histologische Methoden
2.6.1.
Paraffineinbettung von Embryonen
Frisch präparierte Embryonen oder X-Gal gefärbte Embryonen wurden in PBS
gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd in PBS ÜN bei 4°C fixiert. Die Embryonen
wurden dann folgendermaßen weiterbehandelt:
Dehydrieren: Die Embryonen (9,5 - 14,5 d.p.c.) wurden nacheinander für jeweils
eine Stunde in 40%, 70% und 100% Ethanol inkubiert. Danach wurde
das 100% Ethanol noch einmal durch frisches 100% Ethanol ersetzt
und die Embryonen über Nacht vollständig dehydriert. Embryonen, die
vorher schon in 100% Methanol gelagert wurden (s. 2.5.2.), wurden 1x
kurz mit 100% Ethanol gewaschen und dann ebenfalls über Nacht in
100% Ethanol inkubiert. Die Dehydrierung wurde bei 4°C
durchgeführt.
Einbetten:
Nachdem die Embryonen dehydriert waren, wurden sie in 100% Xylol
überführt und je nach Alter für einige Zeit unter gelegentlichem
Schütteln inkubiert (9,5 d.p.c., 10 min; 11,5 d.p.c., 15 min; 12,5 d.p.c.,
Seite 49
Material und Methoden
Schneiden
2.6.2.
20 min; 13,5 d.p.c., 25 min; 14,5 d.p.c., 35 min). Anschließend wurde
das Xylol verworfen, durch flüssiges Paraffin (Histowax, Reichert &
Jung) ersetzt. und die Embryonen über Nacht im Brutschrank (65°C)
inkubiert. Die Embryonen wurden dann in Gießförmchen mit flüssigem
Paraffin überführt und ausgerichtet. Nach dem Aushärten der Blöcke
wurden diese bei 4°C gelagert.
Von den Paraffin-Blöcken wurden 4-10 µm dicke Schnitte mit dem
Ultramikrotom (RM 2155, Leica) angefertigt, auf Objektträger
(SuperFrostPlus, Menzel-Gläser) aufgezogen und bei 40°C ÜN
getrocknet. Die Schnitte wurden bei 4°C gelagert und wie in 2.6.2.
bzw. 2.6.3. beschrieben weiter prozessiert.
RNA in situ Hybridisierung auf Paraffinschnitten
1. Tag: (RNA-Hybridisierung)
Paraffinschnitte wurden wie unter 2.6.1. beschrieben RNase-frei hergestellt. Die
Schnitte wurden 2x 5 min in Xylol entparaffiniert und 5 min in 100% Ethanol
gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte in einer absteigenden Ethanol-Reihe
(66%, 33% in DEPC-Wasser) rehydriert (je 5 min) und 1x in PBS für jeweils 5 min
bei RT gewaschen. Nach 20 min Nachfixierung in 4% Paraformaldehyd/PBS wurde
erneut 2x 5 min in PBS gewaschen. Danach erfolgte ein Proteinase K-Verdau. Hierfür
wurden die Schnitte mit 10 µg/ml Proteinase K in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 für 10 min
bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde in 0,2% Glycin in PBS für 10 min bei RT
abgestoppt und die Schnitte 2x 5 min in PBS gewaschen. Anschließend wurde mit 0,2
M HCl für 15 min bei RT inkubiert und 2x in PBS gewaschen. Daraufhin wurden die
Schnitte in eine 0,1 M Triethanolaminlösung, pH 8,0, überführt in die dann unter
ständigem Rühren tropfenweise Essigsäureanhydrid bis zu einer Konzentration von
0,25% zugeführt wurde – nach erfolgter Zugabe wurde für weitere 10 min bei RT
inkubiert. Durch erneutes Waschen in PBS und DEPC-Wasser für jeweils 5 min
waren die Schnitte bereit für die Prähybridisierung. Dies geschah in
Hybridisierungslösung (50% Formamid; 5x SSC, pH 7,0; 1x Denhardt´s; 0,1%
Tween-20; 50 µg/ml Heparin, noch ohne tRNA) bei 70°C unter ständiger Bewegung
für 2 h. Die Hybridisierung mit 3 µg/ml RNA-Probe (s. 2.5.5.) in frischer
Hybridisierungslösung, der zusätzlich 50 µg/ml tRNA zugegeben wurden, erfolgte
ÜN direkt auf den Objektträgern (mit Deckgläschen abgedeckt) in einer feuchten
Kammer bei 70°C.
2. und 3. Tag:
Es wurde wie unter 2.5.6. beschrieben fortgefahren, mit der Ausnahme dass die
Antikörperreaktion direkt auf den Paraffinschnitten (mit Deckgläschen abgedeckt)
über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer durchgeführt wurde und die
Farbentwicklung schon am Ende des 3. Tages erfolgte. Die exponierten Schnitte
wurden zuletzt 3x 15 min in PBS gewaschen, für 45 min in MEMFA (100 mM
MOPS; 2 mM EDTA, pH 8,0; 1mM MgSO4; 1/10 4% PFA in PBS) fixiert und in
nach Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“ (s. 2.6.3.) in Kaisers Glyceringelatine
(Merck, Darmstadt) eingebettet.
Seite 50
Material und Methoden
2.6.3.
Histologische Färbung von Präparaten
Für die histologische Analyse von Gewebeschnitten wurde eine „Nuclear Fast Red“
(NFR) Gegenfärbung durchgeführt. Hierfür wurde die Färbung wie folgt
durchgeführt:
5 min
Xylol
5 min
Xylol
2 min
abs. Ethanol
2 min
90% Ethanol
2 min
70% Ethanol
2 min
40% Ethanol
2 min
ddH2O
30 s – 2 min NFR (gesättigte Lösung in ddH2O)
30 s
ddH2O
30 s
ddH2O
Die Präparate wurden dann in Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt)
eingebettet.
Seite 51
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1.
Modifikation des ES-Zell-Cokultursystems
Das von Arnold et al. (Arnold et al., 2000) etablierte System zur Induktion von Maus
ES-Zellen mit einem Wnt-Signal (s. 1.7.) eignet sich als biologisches System zur
Identifikation von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs. Das in Abb. 1.3
dargestellte System gewährleistet in besonders einfacher Weise, dass ES-Zellen in
unmittelbaren Kontakt mit Wnt-exprimierenden Fibroblasten, und somit auch von
sezernierten Wnt-Liganden, gelangen. Das System besitzt aber den Nachteil, dass im
Anschluss an die Cokultur ein Gemisch aus Fibroblasten und ES-Zellen analysiert
wird. Gerade für Experimente, in deren Verlauf Genexpressionsprofile miteinander
verglichen werden, ist aber eine möglichst homogene Zellpopulation wünschenswert,
um die biologische Variabilität so gering wie möglich zu halten. Dies würde den
Vergleich von Datensätzen und die Interpretation der gewonnenen Daten erleichtern.
Aus diesem Grund wurde das in Abb. 1.3 dargestellte Cokultursystem modifiziert.
Ziel war es, eine homogene Population Wnt-stimulierter ES-Zellen zu gewinnen. Zu
Beginn der Arbeit war keine Methode bekannt, die zur Gewinnung größerer Mengen
an löslichem Wnt-Protein mit biologischer Aktivität geeignet gewesen wäre (Willert
et al., 2003). Darüber hinaus waren eigene Versuche, Zellkulturmedium, mit dem
Wnt-sezernierende Fibroblasten kultiviert worden waren, zur Wnt-Stimulation von
ES-Zellen einzusetzen (Shibamoto et al., 1998), nicht erfolgreich. Deshalb wurde an
dem Prinzip der Wnt-Stimulation von ES-Zellen durch einen Zellrasen von Wntsezernierenden Fibroblasten in einem Cokultur-Ansatz festgehalten. Der Einsatz von
sog. „Transwell-Filtern“ sollte die Trennung von ES-Zellen und Fibroblasten
gewährleisten. Transwell-Filter sind Zellkulturschalen, deren Boden nicht aus solidem
Kunststoff, sondern aus einer porösen Kunststoffmembran besteht. Je nach
Einsatzzweck variiert das Material und die Porengröße der verwendeten
Filtermembran. In diesem Fall sollte die Filtermembran die ES-Zellen während der
Cokultur räumlich von den Wnt-sezernierenden Fibroblasten trennen und dennoch
einen Austausch von Makromolekülen (Wnt-Proteinen !) zwischen beiden
Zellpopulationen ermöglichen (s. Abb. 3.1).
Seite 52
Ergebnisse
Abb. 3.1. Ablauf eines ES-Zell-Cokulturexperiments unter Verwendung von Transwell-Filtern.
Anders als beim klassischen ES-Zell-Cokultursystem (s. Abb. 1.3) werden die ES-Zellen nicht direkt
auf die Zellschicht aus Wnt-sezernierenden Fibroblasten ausgebracht, sondern in sog. Transwell-Filter
mit einer Porengröße von 0,4 µm pipettiert. Nach 6 h, in denen sich die ES-Zellen an die
Filtermembran heften, werden die Transwell-Filter mit den ES-Zellen auf den Fibroblasten plaziert, wo
sie für 10 bzw. 18 h verweilen (10 / 18 h Cokultur). Während dieser Phase kommt es zur WntStimulation der ES-Zellen durch die Filtermembran hindurch und im weiteren Verlauf zur Expression
von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in den ES-Zellen (s. Abb. 3.2). Nach Ablauf der
Cokultur wird die Gesamt-RNA aus den ES-Zellen isoliert.
Es wurden mehrere verschiedene Transwell-Filter getestet, deren Filtermembranen
eine Porengröße von 0,4 µm aufwiesen. Die Transwell-Filter mussten für die Kultur
von ES-Zellen geeignet sein, d.h. die ES-Zellen mussten an der Filteroberfläche
haften und eine normale ES-Zell Morphologie aufweisen - rundliche Zellen ohne
Zellfortsätze, die nach mehrfacher Teilung möglichst runde ES-Zell-Kolonien bilden.
Zudem musste in Cokultur-Versuchen eine Wnt-Stimulation der ES-Zellen durch die
Filtermembran erfolgen. Von den getesteten Filtern eigneten sich kollagenbeschichtete Transwell-Filter von Costar am besten für die Cokultur (Costar,
Cambridge, USA; Transwell-COL, Durchmesser 24 mm, Porengröße 0,4 µm; Cat-No.
3491). In Abb. 3.2 sind die Ergebnisse von direkter Cokultur und Filter-Cokultur
gegenübergestellt. Die Expression von vier Markergenen (Cdx1, Bra, Neo, Gapdh) in
Fibroblasten (3T3 lacZ, 3T3 Wnt1) bzw. ES-Zellen (ES) vor und nach einer
Cokultivierung wurde mittels RT-PCR und Agarose-Gelelektrophorese dargestellt.
Cdx1 (Caudal type homeo box 1) und Bra (Brachyury) sind Maus-Gene, deren Wntabhängige Regulation bereits mit Hilfe des konventionellen Cokultursystems
beschrieben werden konnte (Arnold et al., 2000; Lickert et al., 2000). Eine gesteigerte
Seite 53
Ergebnisse
Expression dieser beiden Gene nach Cokultivierung von ES-Zellen mit Wnt1exprimierenden Fibroblasten gibt Auskunft darüber, ob die ES-Zellen tatsächlich ein
Wnt-Signal erhalten haben. Neo (Neomycin-Resistenzgen) ist ein Selektionsmarker,
der zusammen mit den cDNAs für lacZ bzw. Wnt1 in die Fibroblasten (3T3 lacZ,
3T3 Wnt1) eingebracht wurde (Kispert et al., 1998). In einer reinen ES-ZellPopulation sollte sich das N e o-Transkript nicht nachweisen lassen. Gapdh
(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) ist ein Haushaltsgen, dessen Expression
häufig zur Standardisierung von Experimenten ermittelt wird (Beladungskontrolle).
Abb. 3.2. Vergleich zwischen klassischem ES-Zell-Cokultursystem (direkte Cokultur) und ESZell-Cokultursystem mit Transwell-Filtern (Filter-Cokultur). Die Experimente wurden parallel mit
den gleichen Fibroblasten bzw. ES-Zellen (R1) durchgeführt. Neben NIH 3T3-Wnt1 Zellen kamen in
Kontrollexperimenten NIH 3T3-lacZ Zellen zum Einsatz. Nach jeweils 24 h Cokultur (die 6-stündige
Vorinkubation der ES-Zellen in den Transwell-Filtern wurde weggelassen) wurde Gesamt-RNA aus
den einzeln kultivierten Zellen und den verschiedenen Cokultur-Ansätzen isoliert. Den Bezeichnungen
in der oberen Hälfte der Abbildung ist jeweils zu entnehmen, aus welchen Zellen die Gesamt-RNA
isoliert wurde. Bei der Filter-Cokultur ist in Klammern angegeben, mit welchen NIH 3T3-Zellen die
Cokultur erfolgte (beh. = behandelt). Anschließend wurden mit je 2,5 µg RNA cDNAErststrangsynthesen durchgeführt. Jeweils 1/20 des Reaktionsansatzes wurde für die verschiedenen
PCR-Reaktionen eingesetzt. Cdx1-PCR: 35 Zyklen; Bra-PCR: 25 Zyklen; Neo-PCR: 30 Zyklen;
Gapdh-PCR: 20 Zyklen. (Primer s. Abschnitt 2.1.6.). Anschließend wurden die PCR-Reaktionen auf
einem Agarose-Gel analysiert und die Banden durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Nähere Erläuterungen siehe Text.
Abb. 3.2 zeigt, dass in kultivierten ES-Zellen bereits vor einer Cokultur geringe
Transkriptmengen von Cdx1 und Bra nachgewiesen werden können, im Gegensatz
zur Situation in NIH 3T3-Zellen. Während bei der Filter-Cokultur die Isolation der
Gesamt-RNA ausschließlich aus ES-Zellen erfolgt, wird nach der direkten Cokultur
die Gesamt-RNA aus einer Mischung von ES-Zellen und Fibroblasten isoliert. Dies
erklärt, warum im lacZ-Kontrollexperiment der Filter-Cokultur höhere
Seite 54
Ergebnisse
Transkriptmengen an Cdx1 und Bra nachgewiesen werden, als im lacZKontrollexperiment der direkten Cokultur. In jedem Fall steigt nach Cokultur der ES
Zellen mit Wnt1-sezernierenden Fibroblasten die Expression der beiden Wnt/βCatenin-Zielgene Cdx1 und Bra deutlich an, und zwar sowohl bei der direkten
Cokultur als auch bei der Filter-Cokultur. Der Anstieg der Transkriptmengen von
Cdx1 bzw. Bra nach Wnt1-Stimulation ist bei beiden Cokultur-Systemen
vergleichbar. Die Induktion von Wnt-Zielgenen ist somit unter den gewählten
Bedingungen in beiden Systemen vergleichbar effektiv. Abb. 3.2 zeigt zudem, dass
durch die Verwendung der Transwell-Filter die beiden Zellpopulationen effektiv
voneinander getrennt werden, da bei der Filter-Cokultur in den ES-Zell-Lysaten der
Selektionsmarker Neo nicht nachgewiesen werden kann. Diese Ergebnisse zeigen,
dass auch das modifizierte ES-Zell-Cokultursystem für die Suche nach Zielgenen des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs eingesetzt werden kann.
3.2.
Identifikation von Zielgen-Kandidaten des Wnt/β-CateninSignalwegs mit Hilfe des Affymetrix GeneChip Systems
3.2.1.
Übersicht über die durchgeführten Microarray-Experimente
Im Verlauf dieser Doktorarbeit brachte die Firma Affymetrix verschiedene, jeweils
dem aktuellen Bestand an Sequenzdaten angepasste, Microarrays auf den Markt. Für
die Untersuchung von Cokulturexperimenten wurden die Affymetrix-Microarrays
Mu6500 (subA, B, C, D), Mu19k (subA, B, C) sowie MG-U74A eingesetzt. Tabelle
3.1 gibt einen Überblick über die in den jeweiligen Experimenten verwendeten
Zellen, die Dauer der Cokultur sowie die zur Untersuchung eingesetzten Microarrays.
Microarrays
Fibroblasten
ES Zellen
Dauer der
Cokultur
Mu6500
(subA, B, C, D)
Mu19k
(subA, B, C)
3T3 lacZ bzw.
3T3 Wnt1
3T3 lacZ bzw.
3T3 Wnt1
3T3 lacZ bzw.
3T3 Wnt1
3T3 lacZ bzw.
3T3 Wnt1
R1 ES Zellen
18 h
R1 ES Zellen
18 h
D3 ES Zellen
10 h
D3 ES Zellen
18 h
MG-U74A
MG-U74A
Tab. 3.1. Übersicht über die durchgeführten Microarray-Experimente.
Seite 55
Ergebnisse
Es sei an dieser Stelle erwähnt, dass die Hybridisierung der verschiedenen
Microarrays mit den jeweiligen cRNA-Proben in allen Fällen gut funktioniert hat. Die
Auswertung der Kontroll-Signale für Gapdh und Actin auf den Microarrays bestätigte
regelmäßig, dass die eingesetzten cRNA-Proben von guter Qualität waren. Für diese
beiden Gene sind jeweils drei Probensätze auf jedem Microarray vorhanden. Ein
Probensatz detektiert die 5’-Region des Transkripts, ein anderer detektiert die zentrale
Region und ein dritter Probensatz erkennt die 3’-Region (in der Nähe des Poly ASchwanz) des jeweiligen Transkripts. Wenn die Signalintensitäten, die mit den drei
Probensätzen erzielt werden, nicht zu stark voneinander abweichen, kann man davon
ausgehen, dass die cDNA, von der die cRNA in vitro transkribiert wurde, von guter
Qualität war, bei der reversen Transkription ausgehend vom Poly T-Primer also auch
die 5’-Region der jeweiligen Transkripte erfasst wurde. Dies war bei allen
eingesetzten cRNA-Proben der Fall. Zudem bestätigte die Auswertung der
Probensätze, mit denen die Transkripte der beigemengten Kontroll-cRNA (BioB,
BioC, BioD, Cre, s. 2.3.3.) nachgewiesen werden, dass die eigentliche Hybridisierung
der cRNA-Proben auf die Arrays und die sich anschließenden Wasch- und
Detektionsschritte in allen Fällen reibungslos funktioniert haben. Deshalb werden
diese Sachverhalte an anderer Stelle nicht mehr diskutiert.
Bei der Auswertung der Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ESZellen und ES-Zellen des Kontrollexperiments fiel das Hauptaugenmerk auf die
Transkripte, die in den Wnt1-behandelten ES-Zellen stärker exprimiert waren, als in
der lacZ-Kontrolle. Der Hauptgrund hierfür war, dass für die direkte, positive
Regulation von Wnt/β-Catenin-Zielgenen ein molekularer Mechanismus beschrieben
ist (s.1.4.1. u. 1.6.) und somit potentielle Zielgene schneller verifiziert werden
können. Der molekulare Mechanismus für die positive Regulation eines Zielgens
beinhaltet auf DNA-Ebene das Vorhandensein einer bzw. mehrerer funktioneller
LEF/TCF-Bindestellen (Giese et al., 1991; van de Wetering et al., 1991) in der
regulatorischen Region des Gens. Die Gensequenz (soweit bekannt) der einzelnen
Zielgen-Kandidaten konnte auf das Vorhandensein solcher LEF/TCF-Bindestellen
überprüft werden, wodurch sich ein Anhaltspunkt für die weitere Bewertung der
verschiedenen Kandidaten ergab (s. 3.4.). Dagegen ist die negative Regulation von
Genen als Antwort auf ein Wnt-Signal bisher kaum verstanden, was die weitere
Analyse solcher Zielgen-Kandidaten erschwert. Aus diesem Grund wird im
Folgenden auf eine genauere Darstellung der Ergebnisse für die Gene verzichtet,
deren Expression durch ein Wnt-Signal reprimiert wurde. Dabei ist unbestritten, dass
die Negativregulation eines Gens im Laufe eines Entwicklungsvorgangs ebenso
Seite 56
Ergebnisse
essentiell sein kann, wie die Induktion eines Gens. Desweiteren werden bei der
Darstellung der Microarray-Ergebnisse diejenigen Transkripte als induziert
bezeichnet, für die sich in der vergleichenden Datenanalyse eine Zunahme (Difference
Call: I = Increase / MI = Marginal Increase; s. 2.3.4.) der Transkriptmenge im Wnt1Experiment, verglichen mit dem lacZ-Experiment, ergeben hat. Zusätzlich muss der
von der Analyse-Software anhand der einzelnen Microarray-Ergebnisse errechnete
Änderungsfaktor mindestens 2,0 betragen. (s. 2.3.4.). Reprimierte Transkripte erfüllen
die umgekehrten Kriterien. Für einige Zielgen-Kandidaten wurden die MicroarrayErgebnisse durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System überprüft (s.
2.3.5.). Das Ergebnis dieser Überprüfung wird im Folgenden als LightCycler-Faktor
dargestellt. Dieser Faktor gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen
zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen aus dem lacZ-Experiment für
das entsprechende Gen wieder.
3.2.2.
Zielgen-Screening mit Mu6500-Microarrays
Die Hybridisierung der Mu6500-Arrays mit cRNA nach Angaben des Herstellers
ergab bei der anschließenden Detektion nur relativ schwache Fluoreszenzsignale,
weshalb die Fluoreszenzintensitäten zunächst durch den Einsatz von Antikörpern in
weiteren Färbeschritten verstärkt wurden (s. 2.3.3.). Zudem wurden die Arrays
anschließend noch einer zweiten Hybridisierung mit der dreifachen cRNA-Menge
unterzogen (s. 2.3.3.), obwohl eine solche Mehrfachbenutzung vom Hersteller
eigentlich nicht vorgesehen ist. Diese Schritte wurden durchgeführt, um die Detektion
schwach exprimierter Transkripte nach Möglichkeit zu optimieren.
Anteil detektierter
Ø Transkript-
Induz.
Reprim
Transkripte
signalstärke (Tss)
Transkr.
Transkr.
lacZ (- / + Ak)
38,5 % / 39,8 %
961 / 812
Wnt1 (- / + Ak)
37,8 % / 40,3 %
969 / 834
11
20
lacZ (- / + Ak)
35,5 % / 35,5 %
1002 / 3907
Wnt1 (- / + Ak)
34,2 % / 35,3 %
975 / 3872
35
47
Experiment
1. Hybridisierung
(15 µg cRNA)
2. Hybridisierung
(45 µg cRNA)
Tab. 3.2. Mu6500-Arrays / 18 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten.
Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche
Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente, jeweils vor bzw. nach der
Antikörperamplifikation zur Verstärkung des Fluoreszenzsignals. Für die Angabe der induzierten und
reprimierten Transkripte wurden die entsprechenden Zahlen vor bzw. nach der Antikörperamplifikation
jeweils addiert.
Seite 57
Ergebnisse
Tabelle 3.2 gibt einen Überblick über den Anteil der detektierten Transkripte und die
durchschnittliche Transkriptsignalstärke (Ø Tss) in den einzelnen Experimenten,
jeweils vor bzw. nach Antikörper-Amplifikation der Fluoreszenzsignale. Die Anzahl
der induzierten bzw. reprimierten Transkripte ist ebenfalls angegeben. Bei der 1.
Hybridisierung mit 15 µg cRNA wurden 37,8 – 40,3 % der 6.500 Transkripte, die mit
den Mu6500-Arrays detektiert werden können, in den ES-Zellen nachgewiesen.
Überraschenderweise lag der Anteil der detektierten Transkripte bei der 2.
Hybridisierung mit 45 µg cRNA nur bei 34,2 - 35,5 %, er war also geringer als bei der
1. Hybridisierung mit weniger cRNA. In jedem Fall wurden nach der AntikörperAmplifikation der Fluoreszenzsignale (s. 2.3.3.) mehr Transkripte detektiert, als ohne
diese Amplifikation, und zwar sowohl bei der 1. als auch bei der 2. Hybridisierung
der Mu6500-Arrays. Ein deutlicher Unterschied zwischen lacZ-Experiment und
Wnt1-Experiment in Bezug auf den Anteil der nachgewiesenen Transkripte, ließ sich
nicht erkennen. Es zeigte sich weiterhin, dass die Anzahl der Wnt1-induzierten (bzw.
reprimierten) Transkripte sehr gering war, insbesondere nach der 1. Hybridisierung.
Aus diesem Grund wurden für die weitere Überprüfung auch einige Gene
berücksichtigt, für die sich bei der Datenanalyse keine Zunahme der Transkriptmenge
ergeben hatte (Difference Call: NC = No Change; s. 2.3.4.), für die aber trotzdem ein
Änderungsfaktor von über 2,0 errechnet worden war. Wie in Abschnitt 2.3.4. erwähnt,
erfolgt die Berechnung des Änderungsfaktors (Fold Change) unabhängig von der
Feststellung eines Expressionsunterschieds (Difference Call). Die MicroarrayErgebnisse wurden durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System
überprüft (s. 2.3.5.). In den Tab. 3.3 und 3.4 sind die Ergebnisse dieser Überprüfung
und die ursprünglichen Chip-Ergebnisse für die untersuchten Gene dargestellt, und
zwar getrennt für Hybridisierung 1 und 2.
Seite 59 oben
Tab. 3.3. Mu6500-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten (1. Hybridisierung).
Seite 59 unten
Tab. 3.4. Mu6500-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten (2. Hybridisierung).
Zur Darstellung der Chip-Ergebnisse: die Spalte „Änderung“ entspricht dem Difference Call aus der
Datenauswertung. NC (No Change) bedeutet keine Änderung, MI (Marginal Increase) bedeutet leichte
Zunahme, I (Increase) bedeutet Zunahme. Die Spalte „Faktor“ enthält jeweils den errechneten Wert für
den Fold Change. Die Spalte „∆Tss“ gibt den Unterschied der Transkriptsignalstärken zwischen Wnt1Experiment und lacZ-Experiment wider und entspricht dem Average Difference Change. Für die
genaue Erklärung der Begriffe s. Abschnitt 2.3.4. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind
anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der
Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an.
Seite 58
Ergebnisse
Bezeichnung
Chip-Ergebnisse
GenBank-
LightCyclerFaktor
Nummer
Änderung
Faktor
∆ Tss
Chop-10
X67083
- / NC
- / ~6,5
- / 378
~ 1,0
EpoxidHydrolase
Z37107
I/I
3,1 / 10,8
149 / 155
~ 1,0
Nek1
S45828
MI / -
~2,1 / -
47 / -
~ 1,0
Nip45
U76759
I / NC
2,4 / 2,0
95 / 75
~ 1,0
Pace4a
D50060
- / NC
- / ~3,5
- / 205
~ 1,0
RelB
M83380
NC / NC
~3,8 / ~6,8
111 / 98
2,0
Pgrp
X89374
I/-
~2,2 / -
329 / -
16,8
Tulp2
X69827
MI / -
~2,4 / -
256 / -
~ 1,0
Bezeichnung
Chip-Ergebnisse
GenBank-
LightCyclerFaktor
Nummer
Änderung
Faktor
∆ Tss
Chop-10
X67083
- / NC
- / ~4,2
- / 1522
~ 1,0
EpoxidHydrolase
Z37107
I/I
~4,6 / ~5,3
153 / 625
~ 1,0
Nip45
U76759
I / NC
2,8 / 2,0
118 / 373
~ 1,0
RelB
M83380
- / NC
- / ~4,9
- / 770
2,0
Cadherin-7
Hom.
W48463
I/-
~2,0 / -
61 / -
~ 1,0
Cdx1
M37163
-/I
- / ~3,2
- / 1060
s. Abb.3.2
Ebf1
L12147
I/-
~2,5 / -
62 / -
2,4
Endophilin 1
U58886
MI / -
~2,2 / -
317 / -
~ 1,0
Hint-1 Hom.
W08109
I / NC
~3,0 / ~2,2
558 / 1138
~ 1,0
Mkk6
U39066
I/-
~2,6 / -
404 / -
~ 1,0
Nek1
S45828
MI / -
~2,1 / -
47 / -
~ 1,0
Pdgfrβ
X63100
I/I
~2,2 / ~3,1
189 / 1020
~ 1,0
Protein
phosphatase 5
AA037987
I/-
3,1 / -
344 / -
~ 1,0
Tgfβ2
X57413
I/-
~2,2 / -
190 / -
2,3
Vasa Hom.
D14859
I/-
~2,1 / -
300 / -
~ 1,0
Vldlr
U06670
- / MI
- / ~2,6
- / 314
~ 1,0
Seite 59
Ergebnisse
Von insgesamt 19 neuen Zielgen-Kandidaten wurde die Expression in lacZ- bzw.
Wnt1-behandelten ES-Zellen mit dem LightCycler untersucht. Für vier dieser Gene,
RelB, Pgrp, Ebf1 und Tgfβ2, konnten die Ergebnisse, die mit den Microarrays erzielt
wurden, durch quantitative RT-PCR bestätigt werden. RelB und Pgrp wurden schon
nach der ersten Hybridisierung der Mu6500-Arrays als hochreguliert erkannt,
wohingegen Ebf1 und Tgfβ2 erst nach der zweiten Hybridisierung in der Liste der
induzierten Gene auftauchten. Auch Cdx1, ein Gen, für das eine Regulation durch den
Wnt/β-Catenin-Signalweg bereits gezeigt wurde (Lickert et al., 2000), wurde von der
Software als hochreguliert eingestuft, aber ebenfalls erst nach der zweiten
Hybridisierung. Für Ebf1 ergab sich in der quantitativen RT-PCR eine 2,4-fach
höhere Transkriptmenge in den Wnt1-behandelten ES-Zellen, im Vergleich zur lacZKontrolle, was ungefähr dem Ergebnis aus dem Chip-Experiment entspricht (Faktor
~2,5). Auch für Tgfβ2 stimmen die Änderungsfaktoren aus dem Chip-Experiment
(~2,2) und der quantitativen PCR (2,3) beinahe überein.
Im Falle von Pgrp ergab die quantitative RT-PCR, dass die Transkriptmenge in den
Wnt1-behandelten ES-Zellen deutlich stärker ansteigt (über 16-facher Anstieg), als
nach den Microarray-Daten zu erwarten gewesen wäre (etwa 2-facher Anstieg). Im
Gegensatz dazu ergab sich für RelB in der quantitativen PCR (Faktor 2,0) ein
geringerer Expressionsunterschied zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Kontrolle,
als durch die Chip-Ergebnisse (Faktoren zwischen ∼3,8 und ∼6,8) angezeigt wurde.
An dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass es sich bei den Änderungsfaktoren, die
sich aus den Microarray-Experimenten ergaben, teilweise nur um Schätzwerte
handelt, die von der Analyse-Software angegeben wurden. In diesen Fällen ist dem
Änderungsfaktor ein Tilde-Zeichen (∼) vorangestellt. Schätzwerte werden angegeben,
wenn die Berechnung des Änderungsfaktors nicht möglich war, etwa weil das
entsprechende Gen im lacZ-Kontrollexperiment gar nicht detektiert wurde (s. 2.3.4.).
Für alle anderen überprüften Gene ließen sich die im Chip-Experiment festgestellten
Expressionsunterschiede nicht reproduzieren. Für diese Gene war die
Transkriptmenge in Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen des lacZKontrollexperiments ungefähr gleich, im LightCycler-Experiment ergab sich also ein
Faktor von etwa 1,0. Interessant ist in diesem Zusammenhang ein Blick auf die
absoluten Änderungen der Transkriptsignalsstärken (∆ Tss) für die jeweiligen
Zielgen-Kandidaten, die ebenfalls in den Tabellen 3.3 und 3.4 dargestellt sind.
Verglichen mit den durchschnittlichen Transkriptsignalstärken für die jeweiligen
Experimente, die man Tab. 3.2 entnehmen kann, sind die Werte für ∆ Tss in den
meisten Fällen sehr niedrig, was bedeutet, dass es sich bei den meisten untersuchten
Seite 60
Ergebnisse
Zielgen-Kandidaten um sehr schwach exprimierte Gene handelt, deren Nachweis mit
Hilfe der Microarrays gerade noch möglich ist.
3.2.3.
Zielgen-Screening mit Mu19k-Microarrays
Die Erfahrungen mit den Mu6500-Arrays führten dazu, dass in den darauf folgenden
Experimenten 30 µg cRNA, statt den empfohlenen 15 µg cRNA, für die
Hybridisierung der Mu19k- sowie der MG-U74A-Arrays eingesetzt wurden. Dies
diente dazu, die Signalstärken bei der Detektion von schwach exprimierten Genen zu
erhöhen (Luthi-Carter et al., 2000). Eine weitere Konsequenz aus den Ergebnissen,
die mit den Mu6500-Arrays erzielt wurden, lag darin, dass zumindest ein großer Teil
der folgenden Chip-Experimente mehrfach durchgeführt wurde. Bei der Auswertung
der Daten sollten dann nur diejenigen Gene berücksichtigt werden, die in jedem Fall
einen Expressionsunterschied zwischen lacZ-Kontrolle und Wnt1-Experiment zeigen.
Dies würde eine effektivere Auswahl der Zielgen-Kandidaten ermöglichen, für die der
Wnt1-induzierte Expressionsunterschied durch quantitative RT-PCR überprüft
werden soll. Die hohen Anschaffungskosten für die Microarrays begrenzten jedoch
die Möglichkeit, Experimente mehrfach durchzuführen. Von den Mu19k-Arrays
standen insgesamt drei komplette Chipsätze zur Verfügung. Ein Chipsatz wurde mit
cRNA von lacZ-behandelten ES-Zellen hybridisiert. Die beiden anderen Chipsätze
wurden jeweils mit cRNA von Wnt1-behandelten ES-Zellen hybridisiert, wobei die
cRNA für diese beiden Chipsätze von unabhängigen Cokultur-Experimenten
stammte. Die Expressionsdaten aus den beiden Wnt1-Experimenten wurden
abschließend, unabhängig voneinander, mit den Expressionsdaten der lacZ-Kontrolle
verglichen. Die Schnittmenge von Zielgen-Kandidaten aus diesen Einzelvergleichen
wurde genauer analysiert.
Tabelle 3.5 gibt einen Überblick über den Anteil der detektierten Transkripte und die
durchschnittliche Transkriptsignalstärke (Ø Tss) in den einzelnen Experimenten. Die
Anzahl der induzierten bzw. reprimierten Transkripte wird ebenfalls angegeben,
wobei diejenigen Transkripte, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur
lacZ-Kontrolle gleich reguliert waren, jeweils in einer Schnittmenge
zusammengefasst wurden. Im Kontroll-Experiment wurden 43 % der etwa 19.000
Transkripte, die mit den Mu19k-Arrays detektiert werden können, in den ES-Zellen
nachgewiesen. Dagegen wurden in den beiden Wnt1-Experimenten jeweils etwa 46 %
der potentiell nachzuweisenden Transkripte detektiert. Die durchschnittliche
Transkriptsignalstärke war in allen drei Experimenten vergleichbar und lag auf einem
Seite 61
Ergebnisse
Anteil detektierter
Ø Transkript-
Induzierte
Reprimierte
Transkripte
signalstärke (Tss)
Transkripte
Transkripte
lacZ
43,0 %
3849
Wnt1 – 1. Exp.
45,9 %
3811
124
66
Wnt1 – 2. Exp.
46,2 %
3773
157
69
36
10
Experiment
Schnittmengen aus den beiden Wnt1-Experimenten
Tab. 3.5. Mu19k-Arrays / 18 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten.
Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche
Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente sowie die Anzahl der induzierten und
reprimierten Transkripte in den Wnt1-Experimenten verglichen zum lacZ-Kontrollexperiment.
deutlich höheren Niveau, als bei der 1. Hybridisierung der Mu6500-Arrays (vgl. Tab.
3.2). Auch die Anzahl der Wnt1-induzierten (bzw. reprimierten) Transkripte war
deutlich höher als in den Experimenten mit den Mu6500-Arrays. Dabei ist zu
berücksichtigen, dass, im Vergleich zu den Mu6500-Arrays, mit den Mu19k-Arrays
etwa die dreifache Menge an Transkripten detektiert werden kann. Im ersten Wnt1Experiment war im Vergleich zur lacZ-Kontrolle die Expression von 124
Transkripten induziert, im zweiten Wnt1-Experiment waren es 157 Transkripte.
Darunter waren 36 Transkripte, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur
lacZ-Kontrolle hochreguliert waren. Von diesen 36 Genen wurden diejenigen
ausgewählt, die aus der Sicht des Entwicklungsbiologen am vielversprechendsten
erschienen. Zusätzlich wurden einige wenige Gene ausgewählt, deren Expression nur
in einem der Wnt1-Experimente als hochreguliert eingestuft worden war. Die ChipErgebnisse wurden jeweils durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System
überprüft (s. 2.3.5.). In Tab. 3.6 sind die Ergebnisse dieser Überprüfung und die
ursprünglichen Chip-Ergebnisse für die untersuchten Gene dargestellt. Brachyury war
eines der 36 Gene, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur lacZ-Kontrolle
hochreguliert waren. Dies zeigt, dass die Methode, mit der das Zielgen-Screening
durchgeführt wurde, grundsätzlich funktioniert, da Brachyury bereits als Zielgen des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs beschrieben ist (Arnold et al., 2000; Luthi-Carter et al.,
2000; Yamaguchi et al., 1999b). Von weiteren 19 neuen Zielgen-Kandidaten wurde
die Expression in den unterschiedlich behandelten ES-Zellen mit dem LightCycler
–System untersucht. Für sieben dieser Gene konnte eine Wnt1-abhängige
Expressionssteigerung bestätigt werden. Neben Axin2, Follistatin, Lhpp, Sprr2a und
Troy, für die in der quantitativen PCR über zweifach höhere Transkriptmengen in den
Seite 62
Ergebnisse
Bezeichnung
Chip-Ergebnisse
TIGR
LightCyclerFaktor
Gen-Index
Änderung
Faktor
∆ Tss
Asf
TC32978
I/I
4,0 / 4,0
3175 / 3170
~1,0
Axin2
TC18387
I/I
~24,7 / ~24,7
3374 / 3395
3,8
Elk3
TC19315
- / MI
- / 6,4
- / 874
~1,0
Filamin–
Homolog
TC24101
-/I
- / ~9,2
- / 1173
~1,0
Follistatin
TC25779
I/I
3,0 / 5,0
420 / 860
2,8
Glypican-3
TC27120
I/-
~3,1 / -
1044 / -
~1,0
Hmga2
TC16454
NC / -
~3,0 / -
279 / -
1,4
Igfbp3
TC26378
I/I
~10,5 / ~7,9
4693 / 3422
1,6
Lef1
TC21158
I/-
~2,0 / -
664 / -
~1,0
Lhpp
TC34823
I/I
~4,8 / ~4,9
1902 / 1930
2,8
Mmp1
TC39785
I/-
~2,5 / -
846 / -
~1,0
Pkp2a
TC34418
MI / I
2,5 / 2,9
1773 / 2207
~1,0
Rp42
TC28722
I/I
~2,1 / ~3,3
553 / 1137
~1,0
sFrp2
TC39936
I/-
~2,2 / -
671 / -
~1,0
Sprr2a
TC24113
I/I
~7,8 / ~13,4
964 / 1781
2,3
Brachyury
TC24494
I/I
5,0 / 9,2
987 / 2057
s. Abb. 3.2
Troy
TC21938
I/I
2,5 / 2,4
555 / 500
3,2
Unbek. cDNA
AK003195
TC35476
I/I
~2,7 / ~5,1
966 / 2093
~1,0
EST
TC32971
I/I
2,2 / 3,6
822 / 1725
~1,0
EST
TC37382
MI / MI
~5,0 / ~3,7
2264 / 1369
~1,0
Tab. 3.6. Mu19k-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten.
Zur Darstellung der Chip-Ergebnisse: die Spalte „Änderung“ entspricht dem Difference Call aus der
Datenauswertung. NC (No Change) bedeutet keine Änderung, MI (Marginal Increase) bedeutet leichte
Zunahme, I (Increase) bedeutet Zunahme. Die Spalte „Faktor“ enthält jeweils den errechneten Wert für
den Fold Change. Die Spalte „∆Tss“ gibt den Unterschied der Transkriptsignalstärken zwischen Wnt1Experiment und lacZ-Experiment wider und entspricht dem Average Difference Change. Für die
genaue Erklärung der Begriffe s. Abschnitt 2.3.4. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind
anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der
Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an.
Wnt1-behandelten ES-Zellen im Vergleich zur lacZ-Kontrolle ermittelt wurden,
wurde auch für Hmga2 und Igfbp3 eine Wnt1-abhängige Expressionssteigerung
bestätigt. Für Hmga2 und Igfbp3 waren die in der quantitativen PCR gemessenen
Seite 63
Ergebnisse
Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-Probe und lacZ-Kontrolle jedoch nur gering.
Überhaupt war in fast allen Fällen der Faktor der Expressionssteigerung, der mit Hilfe
der quantitativen PCR ermittelt wurde, niedriger als der im Chip-Experiment
ermittelte. Besonders deutlich wird dies am Beispiel von Axin2. Die MicroarrayDaten zeigten einen ca. 25-fachen Expressionsanstieg nach Wnt1-Stimulation der ESZellen, tatsächlich ergab sich in der quantitativen RT-PCR ein Expressionsanstieg um
weniger als das Vierfache. Dabei ist jedoch zu beachten, dass es sich bei den
Änderungsfaktoren aus den Mu19k-Experimenten fast ausschließlich um Schätzwerte
handelt (s. 2.3.4.).
3.2.4.
Zielgen-Screening mit MG-U74A-Microarrays
Für die Hybridisierung der MG-U74A-Arrays wurde von der bisherigen
Vorgehensweise in einigen Punkten abgewichen. Ziel dieser Veränderungen war es,
Zielgen-Kandidaten zu identifizieren, die mit den bisherigen Experimenten nicht
erfasst worden waren. Bei den ES-Zell-Cokulturen für die bisher vorgestellten
Microarray-Experimente betrug die Dauer der Cokultur jeweils 18 Stunden. Zudem
wurden bisher alle Experimente mit R1 ES-Zellen (Nagy et al., 1993) durchgeführt.
Nun kamen in den Cokulturexperimenten D3 ES-Zellen (Doetschman et al., 1985)
zum Einsatz. Zudem wurden ES-Zellen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten nach
Beginn der Cokultur geerntet. Die Hälfte der Cokulturexperimente wurde wieder, wie
bisher, mit einer Cokultur-Dauer von 18 h durchgeführt, für die andere Hälfte wurde
die Dauer der Cokultur auf 10 h reduziert. Damit sollte der Anteil von direkten
Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs unter den Zielgen-Kandidaten erhöht
werden, also der Anteil der Gene, deren Wnt-abhängige Expression direkt über
funktionelle LEF/TCF-Bindestellen in der jeweiligen Promotorregion gesteuert wird
(s. 1.6.). Eine weitere Änderung bestand darin, die Gesamt-RNA aus mehreren (drei)
unabhängigen Cokultur-Experimenten, die unter den gleichen Bedingungen
durchgeführt worden waren, zu vereinigen, und die cDNA-Synthese und alle weiteren
Schritte mit RNA aus diesem Pool durchzuführen. Damit sollten Fehler, die aus der
biologischen Variabilität des ES-Zell-Cokultursystems resultieren, weiter verringert
werden. Alle Hybridisierungen (lacZ 10 h, Wnt1 10 h, lacZ 18 h, Wnt1 18 h) wurden
zwei mal mit unabhängigen Proben durchgeführt, sodass insgesamt acht MG-U74AArrays zum Einsatz kamen. Mit den MG-U74A-Microarrays kann die Expression von
etwa 12.000 Transkripten untersucht werden.
Seite 64
Ergebnisse
Die Tabellen 3.7 und 3.8 geben einen Überblick über den Anteil der detektierten
Transkripte und die durchschnittliche Transkriptsignalstärke (Ø Tss) in den einzelnen
Experimenten. Die Anzahl der induzierten bzw. reprimierten Transkripte wird
ebenfalls angegeben, wobei diejenigen Transkripte, die in beiden Wnt1-Experimenten
im Vergleich zu den lacZ-Kontrollen gleich reguliert waren, jeweils in einer
Schnittmenge zusammengefasst wurden.
Anteil detektierter
Ø Transkript-
Induzierte
Reprimierte
Transkripte
signalstärke (Tss)
Transkripte
Transkripte
lacZ
43,8 %
3467
Wnt1
41,1 %
3400
26
28
lacZ
43,1 %
3484
Wnt1
45,8 %
3160
20
3
1
0
Experiment
Exp. 1
Exp. 2
Schnittmenge aus beiden Experimenten
Tab. 3.7. MG-U74A-Arrays / 10 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten.
Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche
Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente sowie die Anzahl der induzierten und
reprimierten Transkripte in den Wnt1-Experimenten verglichen zum jeweiligen lacZKontrollexperiment.
Nach 10 h Cokulturdauer stellt sich die Situation wie folgt dar (s. Tab. 3.7). Der
Anteil detektierter Transkripte in den einzelnen Experimenten lag zwischen 41,1 –
45,8 %, wobei im 1. Experiment mehr Transkripte bei der lacZ-Kontrolle als im
Wnt1-Experiment detektiert wurden; im 2. Experiment war dies umgekehrt. Die
durchschnittlichen Transkriptsignalstärken in den einzelnen Ansätzen waren
vergleichbar und lagen auf etwa demselben Niveau wie beim Experiment mit den
Mu19k-Arrays (s. Tab 3.5). Die Anzahl der Wnt1-induzierten (bzw. reprimierten)
Transkripte war relativ gering. Zudem fand sich nur ein Transkript, das sowohl im 1.
als auch im 2. Wnt1-Experiment im Vergleich zur jeweiligen lacZ-Kontrolle
hochreguliert war (Schnittmenge = 1). Bei dem Gen handelt es sich um Cdx1, ein
direktes Zielgen, des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Lickert et al., 2000).
Die Situation nach 18 h Cokulturdauer (s. Tab. 3.8) ähnelt der Situation nach 10 h
Cokultur. Der Anteil detektierter Transkripte in den einzelnen Experimenten lag
zwischen 43 – 45 %, bei vergleichbaren Werten für die durchschnittlichen
Transkriptstärken in den einzelnen Experimenten. Wieder waren nur wenige
Transkripte nach Wnt1-Behandlung der D3-ES Zellen induziert oder reprimiert,
wobei Cdx1 erneut als einziges Transkript in beiden Parallelen als Wnt1-induziert
eingestuft wurde (Schnittmenge = 1).
Seite 65
Ergebnisse
Anteil detektierter
Ø Transkript-
Induzierte
Reprimierte
Transkripte
signalstärke (Tss)
Transkripte
Transkripte
lacZ
45 %
3380
Wnt1
43 %
3468
17
20
lacZ
43,4 %
3437
Wnt1
43,5 %
3527
20
16
1
0
Experiment
Exp. 1
Exp. 2
Schnittmenge aus beiden Experimenten
Tab. 3.8. MG-U74A-Arrays / 18 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten.
Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche
Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente sowie die Anzahl der induzierten und
reprimierten Transkripte in den Wnt1-Experimenten verglichen zum jeweiligen lacZKontrollexperiment
Aus der in den Tabellen 3.7 und 3.8 dargestellten Situation ergaben sich für die
weitere Untersuchung folgende Konsequenzen. Zum einen wurde das Vorhaben
fallengelassen, nur Zielgen-Kandidaten weiterzuverfolgen, die in der Schnittmenge
aus jeweils beiden parallelen Experimenten auftauchten, da sich Cdx1 als einziges
Gen in dieser Schnittmenge wiederfand. Von den Transkripten, die jeweils in nur
einem Wnt1-Experiment hochreguliert waren, wurden diejenigen weiteruntersucht,
die aus der Sicht des Entwicklungsbiologen am interessantesten erschienen. Die ChipErgebnisse für diese Transkripte wurden jeweils durch quantitative RT-PCR mit dem
LightCycler-System überprüft (s. 2.3.5.). In den Tabellen 3.9 und 3.10 sind die
Ergebnisse dieser Überprüfung und die ursprünglichen Chip-Ergebnisse für die
untersuchten Gene dargestellt, wiederum getrennt für 10 h bzw. 18 h Cokulturdauer.
Seite 67 oben
Tab. 3.9. MG-U74A-Arrays / 10 h Cokultur – überprüfte Kandidaten.
Seite 67 Mitte
Tab. 3.10. MG-U74A-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten.
Zur Darstellung der Chip-Ergebnisse: die Spalte „Änderung“ entspricht dem Difference Call aus der
Datenauswertung. NC (No Change) bedeutet keine Änderung, MI (Marginal Increase) bedeutet leichte
Zunahme, I (Increase) bedeutet Zunahme. Die Spalte „Faktor“ enthält jeweils den errechneten Wert für
den Fold Change. Die Spalte „∆Tss“ gibt den Unterschied der Transkriptsignalstärken zwischen Wnt1Experiment und lacZ-Experiment wider und entspricht dem Average Difference Change. Für die
genaue Erklärung der Begriffe s. Abschnitt 2.3.4. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind
anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der
Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an.
Seite 66
Ergebnisse
Bezeichnung
Chip-Ergebnisse
GenBank-
LightCyclerFaktor
Nummer
Änderung
Faktor
∆ Tss
AtfX
AB012276
-/I
- / ~2,6
- / 469
~1,0
Cd97
AA754887
I/-
~2,5 / -
439 / -
~1,0
Cdx1
M80463
I/I
~4,0 / ~4,4
857 / 1009
s. Abb.3.2
Cerr1
AF031896
I/-
~3,1 / -
598 / -
~1,0
Dia2
AF094519
I/-
2,5 / -
649 / -
~1,0
Dmrt1
AL133300
-/I
- / 2,4
- / 566
1,9
Fba
AV027999
MI / -
2,4 / -
535 / -
~1,0
Ndr2
AB033921
- / MI
- / ~3,5
- / 733
1,5
Nrp2
AF022856
I/-
~2,7 / -
474 / -
1,6
Pgrp
AF076482
-/I
- / ~6,1
- / 1511
s. Tab. 3.3
Bezeichnung
Chip-Ergebnisse
GenBank-
LightCyclerFaktor
Nummer
Änderung
Faktor
∆ Tss
Cd97
Y18365
I/-
~3,3 / -
587 / -
~1,0
Cdx1
M80463
I/I
~5,4 / ~5,0
1135 / 1119
s. Abb.3.2
Crbp1
X60367
- / MI
- / 2,1
- / 1502
1,7
Klf12
Y14295
-/I
- / ~2,4
- / 381
~1,0
Mmp10
Y13185
I/-
~3,0 / -
506 / -
~1,0
Nkx6.2
L08074
-/I
- / ~3,7
- / 753
1,6
Pim1
M13945
/I
- / ~5,4
- / 1242
1,9
Von insgesamt 14 neuen Zielgen-Kandidaten (aus 10 h und 18 h Experiment) wurde
die Expression in D3 ES-Zellen aus dem lacZ- bzw. Wnt1-Experiment mit dem
LightCycler untersucht. Für sechs dieser Gene konnte eine Wnt1-abhängige
Expressionssteigerung bestätigt werden, diese Expressionssteigerung lag aber für alle
diese Gene in einem Bereich zwischen 1,5-fach und 1,9-fach, war also jeweils
geringer als von den Ergebnissen der Chip-Hybridisierung her zu erwarten gewesen
wäre (s. Chip-Ergebnisse, Tab. 3.9 u. 3.10). Drei der sechs Gene, Dmrt1, Ndr2 und
Nrp2, waren in den ES-Zellen hochreguliert, die nur über einen Zeitraum von 10 h mit
den Wnt1-sezernierenden Fibroblasten in Kontakt gewesen waren. Die anderen drei
Seite 67
Ergebnisse
Gene, Crbp1, Nkx6.2 und Pim1 waren in den ES-Zellen differentiell exprimiert, die
18 h lang cokultiviert worden waren. Neben den neuen Zielgen-Kandidaten wurde,
wie schon oben erwähnt, auch Cdx1, ein schon bekanntes Wnt-Zielgen, als
hochreguliert in den Wnt1-behandelten ES-Zellen erkannt, und zwar sowohl nach 10
h als auch nach 18 h Cokulturdauer. Zusätzlich wurde nach 10 h Cokulturdauer Pgrp
als hochreguliert erkannt, ein Gen, dessen Wnt1-abhängige Regulation (in R1 ESZellen nach 18 h Cokulturdauer) schon im Experiment mit den Mu6500-Arrays
nachgewiesen und durch quantitative RT-PCR bestätigt wurde (s. Tab 3.3).
Wie schon erwähnt, wurden die Experimente, in denen MG-U74A-Arrays zum
Einsatz kamen, allesamt mit D3 ES-Zellen durchgeführt, wohingegen alle vorherigen
Experimente mit R1 ES-Zellen durchgeführt worden waren. Die durch quantitative
RT-PCR ermittelten Expressionsänderungen für die sechs neuen Zielgen-Kandidaten
(aus den Experimenten mit den MG-U74A-Arrays) lagen alle unter einem Faktor von
2,0, und keines der sechs Gene wurde in den vorangegangenen Chip-Experimenten
mit den R1 ES-Zellen als Wnt1-reguliert erkannt. Deshalb wurde die Expression
dieser Gene in Wnt1-behandelten R1 ES-Zellen bzw. ES-Zellen des
Kontrollexperiments nach 18 h Cokultur nachträglich überprüft. Für Dmrt1, Ndr2 und
Nrp2, die Gene also, die in Wnt1-behandelten D3 ES-Zellen bereits nach 10 h
Cokultur induziert waren, wurde zusätzlich überprüft, ob in D3 ES-Zellen eine solche
Induktion auch noch nach 18 h Cokulturdauer festgestellt werden konnte. Mit Hilfe
dieser Analysen sollte geklärt werden, ob sich die schwache Wnt1-abhängige
Regulation dieser Gene auch unter leicht veränderten Bedingungen bestätigen lässt,
bzw. ob diese Regulation unter diesen Bedingungen sogar deutlicher ausgeprägt ist.
Die Ergebnisse der quantitativen PCR-Analysen, die zu diesem Zweck durchgeführt
wurden, sind Tab. 3.11 zu entnehmen.
Bezeichnung
GenBankNummer
Dmrt1
AL133300
1,9
1,5
2,0
Ndr2
AB033921
1,5
1,4
1,2
Nrp2
AF022856
1,6
1,4
1,2
Crbp1
X60367
-
1,7
2,2
Nkx6.2
L08074
-
1,6
1,5
Pim1
M13945
-
1,9
1,5
ES-Zelllinie
D3
D3
R1
Cokulturdauer
10 h
18 h
18 h
LightCycler-Faktoren
Tab. 3.11. Vergleich der
Wnt1-Induktionen in verschiedenen Experimenten
Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind anhand
des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das
tatsächliche Verhältnis der
Transkriptmengen zwischen
Wnt1-Experiment und lacZExperiment an. Nähere Erläuterungen siehe Text.
Seite 68
Ergebnisse
Alle getesteten Gene zeigten in jedem Fall eine zumindest leichte
Expressionssteigerung nach Wnt1-Stimulation der ES-Zellen, unabhängig von der
ES-Zelllinie und der Dauer der Cokultur. Für Dmrt1 und Crpb1 war die Wnt1abhängige Regulation in R1 ES-Zellen tatsächlich etwas ausgeprägter, als es in den
D3 ES-Zellen der Fall war. Für Dmrt1 ergab sich nach Wnt1-Stimulation von R1 ESZellen eine Expressionssteigerung um das Zweifache, im Vergleich zur lacZKontrolle, für Crbp1 betrug der Faktor 2,2. Für Nkx6.2 und Pim1 wurde in R1 ESZellen dagegen nur eine Expressionssteigerung nach Wnt1-Stimulation um das 1,5
fache ermittelt, im Vergleich zu 1,6- bzw. 1,9 facher Expressionssteigerung in D3 ESZellen.
Im
Falle
von Ndr2
und
Nrp2 fielen die Wnt1-abhängigen
Expressionssteigerungen in den D3 ES-Zellen nach 18 h Cokultur geringer aus, als
nach 10 h Cokultur, in R1 ES-Zellen war eine Wnt1-abhängige Regulation dieser
Gene nach 18 h Cokultur kaum mehr zu erkennen (s. Tab. 3.11).
3.2.5.
Übersicht über die Ergebnisse aus den einzelnen Experimenten
Tab. 3.12 fasst die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR für die Gene / ESTs
zusammen, für die sich der mit den Microarrays ermittelte Expressionsunterschied
qualitativ bestätigen ließ.
Mu6500-Arrays
Mu19k-Arrays
MG-U74A-Arrays
Neue Zielgen-Kandidaten
Neue Zielgen-Kandidaten
Neue Zielgen-Kandidaten
Gen
LightCyclerFaktor
Gen
LightCyclerFaktor
Gen
LightCyclerFaktor
Ebf1
2,4
Axin2
3,8
Crbp1
1,7
Pgrp
16,8
Follistatin
2,8
Dmrt1
1,9
RelB
2,0
Hmga2
1,4
Ndr2
1,5
Tgfβ2
2,3
Igfbp3
1,6
Nrp2
1,6
Lhpp
2,8
Nkx6.2
1,6
Sprr2a
2,3
Pim1
1,9
Troy
3,2
Pgrp
(16,8)
Bereits bekannte Zielgene
Bereits bekannte Zielgene
Bereits bekannte Zielgene
Cdx1
Brachyury
Cdx1
Tab.3.12. Übersicht über die neuen Zielgen-Kandidaten. Die Ergebnisse der quantitativen RTPCR sind anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der
Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an. Die Transkriptmengen für
Pgrp wurden nur in R1 ES-Zellen nach 18 h Cokultur quantifiziert (s. Tab. 3.3), deshalb steht die
Angabe für den LightCycler-Faktor diese Gens im MG-U74A-Experiment in Klammern. Bereits
bekannte Zielgene, für die ein Expressionsunterschied angezeigt wurde, sind ebenfalls aufgelistet.
Seite 69
Ergebnisse
Insgesamt konnten durch die Microarray-Experimente und die anschließende
Überprüfung der Ergebnisse durch quantitative RT-PCR 17 neue Wnt-ZielgenKandidaten identifiziert werden. Abb. 3.3 zeigt, wie sich, bezogen auf die 17 ZielgenKandidaten aus Tab. 3.12, die Ausmaße der jeweiligen Expressionssteigerungen nach
Wnt-Stimulation der ES-Zellen verteilen. Für insgesamt acht Zielgenkandidaten
(Crbp1, Dmrt1, Hmga2, Igfbp3, Ndr2, Nrp2, Nkx6.2, Pim1) ergab sich eine
Expressionssteigerung nach Wnt-Stimulation um weniger als das Zweifache. Die
Expression von sechs weiteren Genen (Ebf1, Follistatin, Lhpp, RelB, Sprr2a, Tgfβ2)
steigt um das Zwei- bis Dreifache an. Zwei Gene (Axin2, Troy) zeigen eine
Expressionssteigerung um das Drei- bis Vierfache und nur für ein Gen (Pgrp) erhöht
sich die Transkriptmenge nach Wnt-Stimulation der ES-Zellen um mehr als das
Vierfache.
Abb. 3.3. Verteilung der
Expressionssteigerungen nach
Wnt1-Stimulation der ESZellen für die 17 ZielgenKandidaten aus Tab. 3.12.
Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR waren die
Grundlage für die Einteilung
der 17 Zielgen-Kandidaten in
die verschiedenen Klassen.
3.3.
Informationen zu den Zielgen-Kandidaten
Im folgenden Abschnitt werden die neu identifizierten Zielgen-Kandidaten zunächst
gemäß ihrer zellulären Funktion klassifiziert und anschließend genauer beschrieben.
3.3.1.
Funktionelle Klassifizierung der Zielgen-Kandidaten
Sezernierte Proteine
Follistatin, Igfbp3, Pgrp, Tgfβ2
Zelluläre Rezeptoren
Nrp2, Troy
Intrazelluläre Signaltransduktoren
Axin2, Pim1
Transkriptionsfaktoren
Dmrt1, Ebf1, Hmga2, Nkx6.2, RelB
Proteine mit sonstiger oder
unbekannter Funktion
Crbp1, Lhpp, Ndr2, Sprr2a
Seite 70
Ergebnisse
3.3.2.
Beschreibung der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten
Axin2
Axin2 (Conductin) ist homolog zu Axin, dem Protein, das eine wichtige Rolle im
Wnt/β-Catenin–Signalweg einnimmt (s. 1.4.1.). Die Aminosäuresequenzen der beiden
Maus Axin-Homologe sind zu 45 % identisch. Axin/Axin2 spielt als Gerüstprotein
eine zentrale Rolle beim Abbau von β-Catenin in der Zelle, da es mit allen wichtigen
Komponenten des β-Catenin-Degradationskomplexes (APC, GSK3β, CK1α, βCatenin) direkt interagiert und somit diese Proteine in räumliche Nähe zueinander
bringt (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998; Polakis, 2002).
Axin2 zeigt ein gewebespezifisches Expressionsmuster (s. Abb. 3.7) während der
Embryonalentwicklung (Jho et al., 2002), im Gegensatz zu Axin, das ubiquitär
exprimiert ist (Zeng et al., 1997).
Crbp1
Das Protein Crbp1 (Cellular retinol binding protein 1) ist an der Vitamin A
Homöostase in der Zelle beteiligt. Es bindet spezifisch an intrazelluläres all-transRetinol (Vitamin A1) und solubilisiert so dieses hydrophobe Molekül im wässrigen
Milieu des Cytoplasma (Vogel et al., 2001). Es wurde gezeigt, dass Crbp1-defiziente
Mäuse bei Vitamin A-armer Ernährung deutlich weniger Retinyl-Ester (Speicherform
des Retinol) in der Leber enthalten als Wildtyp-Mäuse (Ghyselinck et al., 1999). Aus
entwicklungsbiologischer Sicht ist der Retinoid-Stoffwechsel interessant, weil
Retinsäure als Signalmolekül Prozesse in der frühen Embryogenese steuert
(Niederreither et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Niederreither et al., 2002;
Villanueva et al., 2002). Crbp1 ist während der Embryonalentwicklung in der fötalen
Leber, aber auch in anderen Organen, etwa in Teilen des sich entwickelnden
Nervensystems exprimiert (Dolle et al., 1990; Gustafson et al., 1993; Ruberte et al.,
1991).
Dmrt1
Das Protein Dmrt1 besitzt eine DM-Domäne, eine DNA-Bindedomäne, deren Namen
sich von den Proteinen Doublesex (Drosophila) und MAB-3 (C. elegans) ableitet
(Raymond et al., 1998), zwei Transkriptionsfaktoren, bei denen diese Domäne zum
ersten Mal beschrieben wurde. Proteine mit DM-Domänen sind bei den
Seite 71
Ergebnisse
verschiedensten Spezies an der Bestimmung und Differenzierung des männlichen
bzw. weiblichen Geschlechts beteiligt (Zarkower, 2002). Während der Embryogenese
der Maus ist Dmrt1 zunächst in den Genitalleisten beider Geschlechter exprimiert, in
späteren Stadien (ab E 14,5 d.p.c.) dagegen nur noch in den männlichen
Gonadenanlagen und in den Hoden (Raymond et al., 1999). Dmrt1-defiziente Mäuse
zeigen einen Defekt in der Hodendifferenzierung, die Geschlechtsbestimmung ist aber
offenbar nicht beeinträchtigt (Raymond et al., 2000).
Ebf1
Ebf1 (Early B-cell factor 1) gehört zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren mit
einer Zink-stabilisierten DNA-Bindedomäne und einer HLH-Dimerisierungsdomäne
(Hagman et al., 1995; Liberg et al., 2002). Diese Transkriptionsfaktoren sind an der
Regulation vieler Entwicklungsprozesse beteiligt (Liberg et al., 2002). Ebf1 K.O.Mäuse zeigen eine Blockade der B-Zell-Entwicklung im pro-B-Zell-Stadium (Lin und
Grosschedl, 1995). Darüber hinaus ist in Ebf1-defizienten Mäusen die
Zelldifferenzierung in Teilen des Zentralnervensystems gestört, was u. a. zu einer
Größenreduktion betroffener Gehirnteile führt (Garel et al., 1999). Die Entwicklung
von Adipocyten aus mesenchymalen Stammzellen wird ebenfalls von Ebf1
beeinflusst (Akerblad et al., 2002; Liberg et al., 2002).
Follistatin
Das Protein Follistatin wurde zuerst aus der Follikelflüssigkeit von Rindern isoliert
(Robertson et al., 1987). Es wurde gezeigt, dass Follistatin, ebenso wie Inhibin,
antagonistisch auf die Activin-induzierte Sekretion von Follikelstimulierendem
Hormon (FSH) der Hypophyse wirkt (Kogawa et al., 1991; Ying et al., 1987). Später
wurde gezeigt, dass Follistatin schon früh während der Embryonalentwicklung von
Mäusen und anderen Vertebraten exprimiert wird (Albano et al., 1994; Feijen et al.,
1994) und an der Steuerung vieler Entwicklungsprozesse beteiligt ist (HemmatiBrivanlou et al., 1994; Matzuk et al., 1995; Patel, 1998). Follistatin bindet direkt an
Activin (Nakamura et al., 1990) und andere Vertreter der TGFβ− Familie von
Signalmolekülen (Amthor et al., 2002; Fainsod et al., 1997) und moduliert so deren
Bindung an zelluläre Rezeptoren. Follistatin K.O.-Mäuse sterben wenige Stunden
nach der Geburt. Sie zeigen u. a. Skelettabnormalitäten, schwach ausgebildete
Zwerchfell- und Zwischenrippenmuskulatur sowie Defekte in der Entwicklung von
Haut, Schnurrhaaren und Zähnen (Matzuk et al., 1995).
Seite 72
Ergebnisse
Hmga2
Hmga2 (auch Hmgi-c) ist Mitglied einer Familie von kleinen, nukleären Proteinen,
die wahrscheinlich eine Rolle als architektonische Transkriptionsfaktoren besitzen
(Goodwin, 1998; Liu et al., 2001; Manfioletti et al., 1995). Das heißt die Proteine
binden an DNA, besitzen jedoch keine transaktivierende Funktion, sondern
beeinflussen die Bindung weiterer Transkriptionsfaktoren und die Bildung eines
aktiven Transkriptionskomplexes (Liu et al., 2001). Außer im Gehirn wird Hmga2
während den frühen Stadien der Maus-Embryonalentwicklung in den meisten
Geweben exprimiert; in späteren Entwicklungsstadien ist Hmga2 v.a. im Darmepithel
exprimiert (Hirning-Folz et al., 1998). Das Ausschalten des Gens in der Maus führt zu
Zwergenwuchs (Zhou et al., 1995) und insbesondere einer Reduktion des Fettgewebes
(Anand und Chada, 2000). Passend dazu wurde die Expression von Hmga2 in einigen
Tumoren, insbesondere Fettzell-Tumoren, beschrieben (Goodwin, 1998).
Igfbp3
Igfbp3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3) bindet mit hoher Affinität an die
Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II (Baxter, 2000). Auf diese
Weise wirkt Igfbp3 als Träger für diese Wachstumsfaktoren im Blutstrom, konkurriert
aber auch mit den zellulären Rezeptoren dieser Wachstumsfaktoren und beeinflusst so
den IGF-Signalweg, der an der Steuerung von Zellwachstum und –differenzierung
beteiligt ist (Kelley et al., 1996; Schneider et al., 2000).
Lhpp
Das Gen codiert für eine Phosphatase. Aus der genauen Bezeichnung für das
homologe Genprodukt des Menschen lässt sich entnehmen, das Phospholysin,
Phosphohistidin und anorganisches Pyrophosphat die Substrate dieses Enzyms sind.
Die mRNA des Maus-Gens wurde aus der Zunge einer adulten Maus isoliert
(GenBank AK009207).
Ndr2
Ndr2 ist homolog zu Ndr1 (Shimono et al., 1999), einem Gen, dessen Expression
durch N-myc negativ reguliert ist (Ndr1 steht für N-myc downstream regulated 1). Im
Gegensatz zu Ndr1, wird die Expression von Ndr2 nicht von N-myc beeinflusst
(Okuda und Kondoh, 1999). Die Expression von Ndr2 ist entwicklungsspezifisch
Seite 73
Ergebnisse
reguliert, mit deutlicher Expression in Herz und ventrikulärer Zone des Neuralrohrs,
neben anderen Expressionsdomänen (Okuda und Kondoh, 1999). Über die Funktion
von Ndr2 ist nichts bekannt. Eine Mutation des humanen Ndr1-Homologs NDRG1 ist
für eine erblich bedingte Erkrankung des peripheren Nervensystem verantwortlich
(Kalaydjieva et al., 2000).
Nrp2
Neuropiline sind Transmembranproteine, die als zelluläre Rezeptoren für sezernierte
Semaphorine an der axonalen Wegfindung beteiligt sind (Chen et al., 1997; Giger et
al., 2000; Neufeld et al., 2002). Wahrscheinlich sind Plexine, eine andere Klasse von
Semaphorin-Rezeptoren, die mit den Neuropilinen einen Komplex bilden können, für
die Signalleitung nach der Semaphorin-Bindung verantwortlich. Neuropiline dienen
also vermutlich eher als Corezeptoren für Semaphorine (Neufeld et al., 2002). Zudem
dienen Neuropiline als Corezeptoren für einige Wachstumsfaktoren der VEGF-Klasse
(Neufeld et al., 1999). Nrp2-defiziente Mäuse zeigen Defekte in Organisation und
Verlauf zentraler und peripherer Nerven (Giger et al., 2000) und Störungen in der
Entwicklung der Lymphgefäße (Yuan et al., 2002).
Nkx6.2
Das Homeobox-Gen Nkx6.2 (frühere Bezeichnung: Gtx) wird während der
Embryonalentwicklung im ventralen Neuralrohr exprimiert, ebenso wie das nah
verwandte Gen Nkx6.1 (Vallstedt et al., 2001). In adulten Mäusen ist Nkx6.2 in
Gehirn, Rückenmark und Hoden exprimiert (Komuro et al., 1993). Sowohl für Nkx6.1
als auch Nkx6.2 wurde eine repressorische Wirkung auf die Genexpression ermittelt
(Awatramani et al., 2000; Vallstedt et al., 2001). Nkx6.2 K.O.-Mäuse zeigen keinen
offensichtlichen Phänotyp (Cai et al., 2001), möglicherweise aufgrund von
funktioneller Redundanz von Nkx6.1 und Nkx6.2. Für Nkx6.1 konnte gezeigt werden,
dass es an der Spezifikation von Motoneuronen und Interneuronen im ventralen
Neuralrohr beteiligt ist (Sander et al., 2000).
Pgrp
Dieses Protein ist ein Vertreter einer Familie von Proteinen, die von Insekten bis zu
Säugetieren evolutionär konserviert sind (Kang et al., 1998; Kiselev et al., 1998), und
mit hoher Affinität an Peptidoglycan, den Hauptbestandteil bakterieller Zellwände,
binden (Pgrp steht für Peptidoglycan recognition protein). In Drosophila wurden 12
Seite 74
Ergebnisse
Pgrp-Gene isoliert (Werner et al., 2000) und es wurde gezeigt, dass die Proteine, für
die diese Gene codieren, eine wichtige Rolle bei der Abwehr bakterieller Infektionen
spielen (Choe et al., 2002). Peptidoglycan-bindende Proteine werden von Zellen
sezerniert oder aber als membrangängige Proteine an deren Oberfläche präsentiert.
Das Gen, dessen Expression nach Wnt1-Behandlung der Maus ES-Zellen stimuliert
wurde, codiert wahrscheinlich für ein sezerniertes PGRP. Es wurde gezeigt, dass das
Protein im Knochenmark und in neutrophilen Zellen des Immunsystems exprimiert
wird (Liu et al., 2000). Auch die Bindung des Proteins an Peptidoglycan wurde
experimentell bestätigt (Liu et al., 2000).
Pim1
Pim1 codiert für eine Serin/Threonin-Kinase (Saris et al., 1991). Das Gen wurde
identifiziert als eine bevorzugte Integrationsstelle eines Maus-Tumorvirus, das T-Zell
Lymphome in Mäusen auslöst (Cuypers et al., 1984). Genauere Untersuchungen
zeigten, dass Pim1 an der Regulation von Proliferation, Differenzierung und
programmiertem Zelltod von lymphoiden und myeloiden Zellen beteiligt ist (Laird et
al., 1993; Shirogane et al., 1999; Wang et al., 2001). Während der Embryonalentwicklung ist Pim1 in Zellen des hämatopoetischen Systems, aber auch in Teilen
des Zentralnervensystems exprimiert, was auf eine Funktion des Proteins auch
außerhalb des hämatopoetischen Systems hindeutet (Eichmann et al., 2000).
Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die Expression von Pim1 für die sogenannte
„long term potentiation“ (LTP), also die Langzeit-Modulation der synaptischen
Übertragung zwischen Neuronen erforderlich ist (Konietzko et al., 1999).
RelB
Das Protein RelB gehört zur Familie der Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren mit einer
charakteristischen Proteindomäne, der Rel Homologie Domäne (RHD), die für DNA
Bindung und Dimerisierung dieser Faktoren verantwortlich ist (Baeuerle und
Baltimore, 1996; May und Ghosh, 1997). Das Drosophila- Protein Dorsal, das
wesentlich an der Etablierung der dorso-ventralen Polarität in diesem Organismus
beteiligt ist, ist ebenfalls ein solcher Rel/NFκB Transkriptionsfaktor (Steward, 1987).
In Vertebraten sind Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren v. a. in lymphoiden Zellen und
Organen exprimiert (Schmidt-Ullrich et al., 1996) und an der Regulation von
Immunantworten und Entzündungsprozessen beteiligt (Attar et al., 1997; Gerondakis
et al., 1999). Eine Beteiligung von Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren an
Seite 75
Ergebnisse
Entwicklungsprozessen, ähnlich wie in Drosophila, konnte bisher in Vertebraten nicht
nachgewiesen werden.
Sprr2a
Das Protein Sprr2a ist ein Vertreter aus einer Familie kleiner, Prolin-reicher Proteine
(Sprr steht für small proline-rich), die während der terminalen Differenzierung von
Keratinocyten exprimiert werden (Fischer et al., 1996; Song et al., 1999). Wie die
anderen Sprr-Proteine ist Sprr2a an der Ausbildung der Hornschicht von terminal
differenzierten Keratinocyten beteiligt.
Tgfβ2
TGFβ2 ist eines von mehr als 30 Mitgliedern der Superfamilie von extrazellulären
TGFβ-Signalmolekülen (Massague, 1998; Miller et al., 1989). Der TGFβ-Signalweg,
der von diesen Proteinen stimuliert wird, ist evolutionär hochkonserviert und an der
Regulation einer Vielzahl von Wachstums- und Entwicklungsprozessen beteiligt
(Massague, 1998). Maus Tgfβ2 wird während der Embryonalentwicklung in vielen
Organen exprimiert (Millan et al., 1991). Tgfβ2-defiziente Mäuse zeigen eine
Vielzahl von Entwicklungsdefekten und sterben nach der Geburt. Betroffen sind z. B.
Herz, Lunge und sensorische Organe sowie das Urogenitalsystem. Zudem treten
Skelettabnormalitäten auf (Sanford et al., 1997).
Troy
Troy (Tnfrsf19) ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor Superfamilie (Hu et al., 1999).
Insbesondere die extrazelluläre Domäne des Proteins weist eine starke Homologie zu
Edar (Ectodysplasin-A Rezeptor) auf, einem Vertreter der TNF-Rezeptor
Superfamilie, der die Entwicklung von Haarfollikeln reguliert (Kojima et al., 2000).
Während der Embryonalentwicklung ist Troy in Teilen des Neuroepithels, in der
Epidermis und in den Epithelien einiger Organe exprimiert. In neugeborenen Mäusen
wurde Troy mRNA hauptsächlich in Haarfollikeln und in Teilen des Großhirns
nachgewiesen, nicht aber in der Epidermis der Haut (Kojima et al., 2000).
Seite 76
Ergebnisse
3.4.
Untersuchung der 5‘-flankierenden Sequenzen der Wnt1induzierten Gene
Wie bereits erwähnt (s. 1.4.1.), binden Transkriptionsfaktoren der LEF/TCF-Familie
an konservierte Bindestellen (Giese et al., 1991; van de Wetering et al., 1991) in den
regulatorischen Abschnitten von Wnt-Zielgenen und ermöglichen so die β-Catenin
abhängige Regulation der Expression dieser Zielgene. Entsprechend finden sich in
den 5‘-flankierenden Sequenzen fast aller bisher identifizierten direkten Wnt-Zielgene
solche LEF/TCF-Bindestellen, und in vielen Fällen konnte gezeigt werden, dass diese
Bindestellen auch funktionell sind. Eine Möglichkeit, die identifizierten ZielgenKandidaten weiter zu analysieren, besteht darin, die 5‘-flankierenden Sequenzen
dieser Gene auf das Vorhandensein von LEF/TCF-Bindestellen hin zu untersuchen.
Die kurze Konsensussequenz von nur sieben Nukleotiden (5’-CTTTGA/TA/T-3’), die
für die Bindung der LEF/TCF-Faktoren an die DNA notwendig ist, bedingt, dass
diese Bindestellen sehr häufig vorkommen. Statistisch ist in jedem Sequenzabschnitt
von 2 kb Länge eine solche Bindestelle vorhanden, wenn man berücksichtigt, dass
LEF/TCF-Faktoren an beide DNA-Stränge binden können. Das Vorhandensein einer
solchen LEF/TCF-Bindestelle in den 5‘-flankierenden DNA-Sequenzen eines
beliebigen Gens innerhalb einer Spezies ist also eher der Normalfall und von geringer
Aussagekraft. Die interspezifische evolutionäre Konservierung einer LEF/TCFBindestelle in den regulatorischen Abschnitten orthologer Gene sagt eher etwas
darüber aus, ob eine bestimmte LEF/TCF-Bindestelle möglicherweise funktionell,
also für die Regulation dieser Gene von Bedeutung ist.
Für die korrespondierenden Gene von Maus und Mensch der neu identifizierten
Zielgen-Kandidaten wurden daher aus den Sequenzdatenbanken des NCBI die 5‘flankierenden DNA-Sequenzen analysiert. Soweit möglich wurde jeweils ein
Sequenzabschnitt von 5 kb Länge unmittelbar vor dem Translationsinitiationscodon
eines Gens auf LEF/TCF-Bindestellen hin untersucht. Ergaben sich aus den in der
Datenbank vorhandenen mRNA-Sequenzen Hinweise darauf, dass Transkriptionsstart
und Translationsstart für ein Gen bzw. Transkript weit auseinander liegen, wurde die
untersuchte Sequenzregion entsprechend erweitert oder verschoben, um zu
gewährleisten, dass der untersuchte DNA-Abschnitt die Promotorregion des Gens
enthält. Die 5‘-flankierenden Sequenzen aus Maus und Mensch wurden verglichen
(DNA-Analysesoftware „MegAlign“) und im Hinblick auf die Konservierung
vorhandener LEF/TCF-Bindestellen zwischen den beiden Sequenzen ausgewertet (s.
Tab. 3.13).
Seite 77
Ergebnisse
Anzahl der LEF/TCFBindestellen in den untersuchten
Sequenzabschnitten
Maus
Mensch
konservierte
Bindestellen
(Position u.
Orientierung)
Zus. Bindestellen in
vergleichbarer
Position
Gen (Maus)
Länge der
untersuchten
5‘-Sequenz
Axin2
5 kb (*)
8
8
5
0
Crbp1
2 kb
1
4
0
0
Dmrt1
5 kb
4
3
0
1
Ebf1
3 kb
3
2
0
1
Follistatin
4 kb
7
1
1
0
Hmga2
5 kb
8
5
2
2
Igfbp3
5 kb
7
1
0
0
Lhpp
2,5 kb
1
2
0
1
Ndr2
(*)
3
6
1
0
7 kb
Nkx6.2
5 kb
2
1
0
0
Nrp2
5 kb
7
5
3
0
Pgrp
4,5 kb
8
2
0
0
Pim1
5 kb
10
9
2
2
RelB
5 kb
2
1
0
0
Sprr2a
5 kb
5
7
1
0
Tgfβ2
2,5 kb
3
1
1
0
11
2
0
1
Troy
5 kb
(*)
Tab. 3.13. LEF/TCF-Bindestellen in den 5’-flankierenden Sequenzen der Zielgen-Kandidaten.
Die 5’-flankierenden Sequenzen vor den ATG-Translationsinitiationscodons der Gene wurden auf die
Sequenz 5’-CTTTGA/TA/T-3’ hin untersucht (beide DNA-Stränge). Die Sequenzen der orthologen Gene
von Maus und Mensch wurden mit der DNA-Analysesoftware „MegAlign“ paarweise verglichen.
Konservierte LEF/TCF-Bindestellen finden sich an jeweils gleicher Position und besitzen die gleiche
Orientierung. LEF/TCF-Bindestellen, deren Position in Maus und Mensch nicht exakt konserviert ist,
die aber in der gleichen Region liegen (<100 Basen Toleranz), wurden ebenfalls aufgelistet. (*) Bei
Axin2, Ndr2 und Troy liegt das ATG-Startcodon auf dem zweiten Exon.
In den 5‘-flankierenden Sequenzen der folgenden acht Gene wurde mindestens eine
LEF/TCF-Bindestelle gefunden, die in Position und Orientierung zwischen Maus und
Mensch exakt konserviert ist: Axin2, Follistatin, Hmga2, Ndr2, Nrp2, Pim1, Sprr2a
und Tgfβ2 . Für Axin2, Hmga2, Nrp2 und Pim1 konnten gleich mehrere solcher
konservierten LEF/TCF-Bindestellen identifiziert werden, im Falle von Axin2
insgesamt fünf. Von den acht Genen mit konservierten LEF/TCF-Bindestellen zeigten
Axin2, Follistatin, Sprr2a und Tgfβ2 im Cokultur-System die deutlichste
Expressionssteigerung als Antwort auf eine Wnt1-Stimulation der ES-Zellen, wie aus
Tab. 3.12 ersichtlich ist. Das Vorhandensein konservierter LEF/TCF-Bindestellen und
das Ausmaß der Expressionssteigerung in ES-Zellen nach Wnt1-Stimulation waren
ausschlaggebend dafür, dass von den identifizierten Zielgen-Kandidaten im weiteren
Verlauf der Arbeit Axin2 und Follistatin weiter untersucht wurden. Zudem war
Seite 78
Ergebnisse
natürlich von Bedeutung, dass Axin2 an der Regulation des Wnt/β-CateninSignalwegs beteiligt ist und Follistatin bei vielen Entwicklungsprozessen Einfluß auf
den TGFβ-Signalweg nimmt. Beide Gene erscheinen also aus der Sicht des
Entwicklungsbiologen besonders interessant.
3.5.
Untersuchung von Axin2
3.5.1.
Vergleich der Axin2-Loci von Maus und Mensch
Um die Wnt-abhängige Regulation von Axin2 detailliert untersuchen zu können,
musste zunächst die regulatorische Region des Maus-Gens kloniert werden. Eine
vergleichende Sequenzanalyse zwischen den Axin2-Genloci von Maus und Mensch
mit Hilfe der Analysesoftware DiAlign (http://www.genomatix.de/cgibin/dialign/dialign.pl) ergab, dass die DNA-Sequenzen in 5'-Richtung der
Translationsstarts über einen Abschnitt von etwa 4 kb hinweg recht gut konserviert
sind. Etwa 61% der Basen in diesem 4 kb langen 5'-flankierenden Abschnitt sind in
Maus und Mensch identisch. Ein Vergleich der genomischen Sequenzen mit den
cDNA-Sequenzen von Maus und Mensch Axin2 zeigt, dass sich in diesem 4 kb langen
Sequenzabschnitt auch jeweils das erste Exon des Axin2-Gens befindet, das allerdings
keine codierende Sequenz enthält, sondern nur zum 5'-untranslatierten Ende der
mRNA beiträgt. Der Vergleich der genomischen Sequenzen mit den cDNASequenzen ergibt auch, dass die Position dieses ersten Exons, und somit der
Transkriptionsstart des Axin2-Gens, zwischen Maus und Mensch interessanterweise
nicht konserviert ist, sondern in der Maus um etwa 1 kb in 5'-Richtung verschoben.
Demzufolge unterscheiden sich die Sequenzen der 5'-untranslatierten Regionen der
Transkripte von Maus und Mensch erheblich. In Abb. 3.4 ist die Situation
schematisch dargestellt. Ein DNA-Abschnitt mit einer Länge von 3,6 kb, der
unmittelbar 5' vor dem Translationsstart des Maus Axin2-Gens liegt, wurde mittels
PCR von genomischer DNA (aus Maus ES-Zellen) amplifiziert (Primersequenzen s.
2.1.6.). Das Fragment wurde Ax2 P/I1 genannt, für Axin2 Promotor / Intron 1-Region.
Abb. 3.4 zeigt die Position des amplifizierten Abschnitts im Maus Axin2-Locus. Auf
diesem Abschnitt, der u. a. Exon 1, Intron 1 und untranslatierte Teile von Exon 2 des
Maus Axin2-Gens enthält, befinden sich insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen, von
denen fünf zwischen Maus und Mensch konserviert sind (s. Tab. 3.13 u. Abb. 3.4).
Seite 79
Ergebnisse
Abb. 3.4. Vergleich der 5’-flankierenden Sequenzen der Axin2-Gene von Maus und Mensch.
Die 5’-flankierenden Sequenzen vor den ATG-Translationsinitiationscodons der Axin2-Gene von Maus
und Mensch wurden auf die Sequenz 5’-CTTTGA/TA/T-3’ hin untersucht (beide DNA-Stränge). Die
Sequenzen wurden mit der DNA-Analysesoftware „MegAlign“ paarweise verglichen. Innerhalb von
etwa 4 kb der jeweiligen 5’-flankierenden Sequenzen der Axin2-Gene sind fünf LEF/TCF-Bindestellen
konserviert (rote Kästchen), d. h. sie befinden sich an jeweils gleicher Position und besitzen die
gleiche Orientierung. Nicht konservierte LEF/TCF-Bindestellen sind ebenfalls dargestellt (blaue
Kästchen). Die Analyse der veröffentlichten cDNA-Sequenzen ergab, dass sich die Position des ersten
Exons in den Axin2-Genen von Maus und Mensch unterscheidet. Sämtliche konservierte LEF/TCFBindestellen im Maus Axin2-Gen befinden sich in 3’-Richtung des vermuteten Transkriptionsstarts,
jedoch vor dem Translationsstart.
3.5.2.
Luciferase-Reporterstudien
Die Analyse von regulatorischen Gensequenzen erfolgt sehr oft über den Einsatz
sogenannter Promotor-Reporterkonstrukte. Das sind künstliche DNA-Konstrukte, in
denen die regulatorische Sequenz, die untersucht werden soll, die Expression eines
Reportergens steuert. Reportergene codieren für Proteine, die sich durch
entsprechende Nachweismethoden detektieren und quantifizieren lassen (s. 2.4.6.).
Ein Beispiel für ein Reportergen ist das Gen für die Photinus-Luciferase aus dem
Leuchtkäfer Photinus pyralis. Dieses Gen codiert für eine Oxidoreductase, die durch
Umsetzung ihres Substrats u.a. messbare Biolumineszenz erzeugt (s. 2.4.6.). Das
Luciferase-Reportergen wurde eingesetzt, um die amplifizierte 5’-flankierende
Sequenz des Axin2-Gens (Ax2 P/I1) näher zu charakterisieren.
Seite 80
Ergebnisse
3.5.2.1. Klonierung von Axin2-Luciferase-Reporterkonstrukten
Das amplifizierte 3,6 kb-Fragment wurde zunächst in einen SmaI-geschnittenen
pBluescriptKS-Vektor (Stratagene) kloniert. Das Konstrukt wurde pKS-Ax2 P/I1
genannt. Um in vitro testen zu können, ob das amplifizierte DNA-Fragment aus der
5'-Region des Maus Axin2-Gens, die TCF/β-Catenin-abhängige Expression eines
Reportergens steuern kann, mußte das amplifizierte 3,6 kb-Fragment vor das
Luciferase-Gen des pGL3 basic Vektors (Promega) gebracht werden. Dazu wurde
pKS-Ax2 P/I1 zuerst mit NdeI geöffnet und die überhängenden Enden der
Schnittstelle aufgefüllt. Danach wurde der linearisierte Vektor mit SalI verdaut, das
3,6 kb-Insert isoliert und in einen mit SmaI und XhoI geschnittenen pGL3 basicVektor kloniert. Das Konstrukt wurde Ax2 P/I1-Luc genannt. Zusätzlich zu diesem
Wildtyp-Konstrukt wurden verschiedene Konstrukte hergestellt, in denen einige oder
alle LEF/TCF-Bindestellen in der Ax2 P/I1-Region mutiert waren. Die mutierten
Konstrukte sind in Abb. 3.6 zusammen mit den zugehörigen Ergebnissen der
Luciferase-Reporterstudien dargestellt. Die Herstellung der mutierten Konstrukte ist
im Methodenteil beschrieben (s. 2.2.14.).
3.5.2.2. Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in HEK 293-Zellen
Ziel der Luciferase-Reporterversuche war es, festzustellen, ob die Expression des
Luciferase-Gens in den verschiedenen Ax2 P/I1-Luc-Konstrukten TCF/β-Cateninabhängig gesteuert werden kann. Dazu benötigt man ein biologisches System, in dem
man einerseits den Wnt/β−Catenin Signalweg gezielt manipulieren kann und das sich
andererseits gut für die Bestimmung der Luciferaseaktivität eignet. HEK 293-Zellen
lassen sich leicht kultivieren und transfizieren und sind somit ein geeignetes
Zellsystem für Reporterversuche. Eine Möglichkeit, den Wnt/β−Catenin Signalweg in
diesen Zellen zu aktivieren, ist die Expression eines dominant-stabilen β−Catenin
Proteins, z.B. β−Catenin S33A, einer mutierten Form von β−Catenin, bei der vier
Serinreste im N-Terminus des Proteins durch je einen Alaninrest ersetzt wurden
(Aberle et al., 1997). Wie in Abb. 1.2 dargestellt, wird die Menge an freiem
β−Catenin Protein in der Zelle durch den β−Catenin-Degradationskomplex strikt
reguliert. Erster Schritt bei der Degradation von β−Catenin ist dabei die
Phosphorylierung des Proteins an den besagten N-terminalen Serinresten. Der
Austausch dieser Serinreste durch Alaninreste, die nicht phosphoryliert werden
können, führt dazu, dass β−Catenin S33A in der Zelle nicht abgebaut wird. Folglich
Seite 81
Ergebnisse
akkumuliert das Protein im Cytoplasma und kann im Kern der Zelle seine Funktion
als Cotransaktivator von LEF/TCF-Faktoren erfüllen (s. 1.4.1.).
Für die Luciferase-Reporterversuche kamen demnach HEK 293-Zellen zum Einsatz,
die
mit
den
verschiedenen Ax2 P/I1-Luc Reporterkonstrukten sowie
Expressionsvektoren für β−Catenin S33A und LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren
cotransfiziert waren. Zur internen Standardisierung der Luciferase-Messungen diente
der pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech, Palo Alto, USA), der zusätzlich in die
HEK 293-Zellen eingebracht wurde (s. 2.4.6.). Zur Berechnung einer standardisierten
Luciferase-Aktivität, die unabhängig ist von der Transfektionseffizienz der HEK 293Zellen, wurde der Quotient aus Luciferase-Aktivität und β-Galaktosidase-Aktivität
gebildet. Zusätzlich zu den Versuchen, in denen die HEK 293-Zellen mit dem
jeweiligen Luc-Reporterkonstrukt, dem pCMV-β-Galaktosidase Vektor, sowie den
pCS2+-Expressionsvektoren für LEF/TCF-Faktoren und β−Catenin S33A
cotransfiziert wurden, wurden weitere Versuche durchgeführt. Zum einen wurden
HEK 293-Zellen nur mit dem Luc-Reporterkonstrukt, pCMV-β-Galaktosidase sowie
dem leeren pCS2+-Vektor cotransfiziert. Die standardisierten Luciferase-Aktivitäten
aus diesen Versuchen dienten als Bezugsgröße für die Berechnung der „WntInduktion“ in den anderen Versuchen (s. 3.5.2.3.). Zudem wurde in einem Teil der
Versuche getestet, ob die Genexpression ausgehend von Ax2 P/I1 auch dann aktiviert
werden kann, wenn neben den Reporterplasmiden nur LEF/TCF-Faktoren oder nur
β−Catenin S33A in den HEK 293-Zellen exprimiert werden, statt diese in
Kombination zu exprimieren. Für eine genaue Beschreibung der Vorgehensweise
wird auf Abschnitt 2.4.6. verwiesen.
3.5.2.3. Stimulation des Ax2 P/I1-Luc-Konstrukts durch verschiedene
TCF/β-Catenin-Komplexe
Um festzustellen, ob und welche LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren in der Lage sind,
zusammen mit β−Catenin S33A das Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt zu aktivieren, wurden
zunächst verschiedene LEF/TCF-Expressionsvektoren zusammen mit dem β−Catenin
S33A-Expressionsvektor und Ax2 P/I1-Luc in HEK 293-Zellen eingebracht und
getestet. Abb. 3.5 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Aus der Abbildung geht
hervor, dass alle verwendeten LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren zusammen mit
β−Catenin S33A in der Lage waren, die Expression des Luciferase-Gens unter der
Kontrolle des Ax2 P/I1-Fragments zu induzieren. Das heißt, dass die standardisierte
Luciferase-Aktivität in den HEK 293-Zellen, die, zusätzlich zum Ax2 P/I1-Luc-
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Ergebnisse
Konstrukt, mit den pCS2+-Expressionsvektoren für LEF/TCF und β−Catenin S33A
transfiziert worden waren, immer höher war, als die standardisierte Luciferaseaktivität
in den HEK 293-Zellen aus den Kontrollversuchen, die mit dem leeren pCS2+-Vektor
transfiziert worden waren. Das Ausmaß dieser „Wnt-Induktion“ (die relative
Luciferaseaktivität) ergab sich jeweils aus dem Quotienten aus standardisierter
Luciferaseaktivität der Zellen, in denen der Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert
wurde, und standardisierter Luciferaseaktivität der Zellen aus dem Kontrollversuch, in
dem lediglich der leere pCS2+-Vektor mit dem Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt cotransfiziert
wurde.
Abb. 3.5. Funktionalität verschiedener LEF/TCF-Faktoren bei der Aktivierung des Ax2 P/I1Luc-Konstrukts. Verschiedene LEF/TCF-Faktoren wurden zusammen mit β-Catenin S33A in HEK
293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung des Wildtyp Ax2 P/I1-Luc-Konstrukts in LuciferaseReporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die
Transfektionseffizienz wurde der pCMV β-Galaktosidase-Vektor eingesetzt. Die relative LuciferaseAktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
durch LEF/TCF-Faktoren und β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die LuciferaseAktivität in HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Alle
eingesetzten LEF/TCF-Faktoren können zusammen mit β-Catenin S33A die Reportergenexpression
aktivieren, allerdings unterschiedlich stark.
Aus Abb. 3.5 wird also zum einen deutlich, dass die 5'-flankierende Sequenz des
Axin2-Gens (Ax2 P/I1), die vor das Luciferase-Gen des pGL3 basic-Vektors kloniert
wurde, alle notwendigen Promotorelemente enthält, um die Expression eines
benachbarten Gens zu ermöglichen. Zum anderen wird deutlich, dass in dem 3,6 kb
großen Ax2 P/I1-Fragment, cis-regulatorische Elemente vorhanden sind, die die
Expression des Luciferase-Gens TCF/β-Catenin-abhängig steuern können. Schließlich
wird die Expression des Reportergens in den HEK 293-Zellen deutlich gesteigert,
wenn der Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert wird.
Wie ebenfalls aus Abb. 3.5 hervorgeht, bestehen deutliche Unterschiede im Ausmaß
der mit den einzelnen LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren erreichten Induktionen. Die
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Ergebnisse
Induktionen, die mit TCF1E und TCF3 erzielt wurden, sind deutlich größer, als die
Induktionen, die mit LEF1, TCF1B und TCF4E erzielt wurden. Die eingesetzten
LEF/TCF-Faktoren unterscheiden sich also in ihrer Fähigkeit, zusammen mit βCatenin die Transkription ausgehend von Ax2 P/I1 zu steuern. Überraschend ist, dass
die Induktion der Genexpression geringer wurde, wenn bei der Transfektion der
Zellen größere Mengen der entsprechenden LEF/TCF-Expressionvektoren eingesetzt
wurden. Die größte Induktion wurde fast immer erreicht, wenn nur 50 ng des
jeweiligen pCS2+-Expressionsvektors für die Transfektion eingesetzt wurden.
3.5.2.4. Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen
Als Konsequenz aus den Ergebnissen, die in Abb. 3.5 dargestellt sind, kam bei allen
weiteren Luciferase-Reporterversuchen mit Ax2 P/I1-Luc-Konstrukten der
Transkriptionsfaktor TCF1E zum Einsatz, und zwar je 50 ng des pCS2+-TCF1EExpressionsvektors pro Transfektionsansatz. Nachdem gezeigt wurde, dass Ax2 P/I1
die Expression des Luciferase-Reportergens abhängig vom Aktivitätszustand des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs steuern kann, war es naheliegend, zu vermuten, dass die
konservierten LEF/TCF-Bindestellen in dieser DNA-Region verantwortlich sind für
die Wnt1-abhängige Regulation. Um diese Hypothese zu testen, wurden die oben
schon erwähnten Reporterkonstrukte hergestellt, in denen die LEF/TCF-Bindestellen
in Ax2 P/I1 mutiert sind (s. 2.2.14.). Die Induktion der Reportergenexpression durch
Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs sollte mit diesen mutierten
Reporterkonstrukten wesentlich geringer ausfallen, als mit dem WildtypReporterkonstrukt, wenn die LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 tatsächlich eine
funktionelle Bedeutung haben. Abb. 3.6 zeigt die Ergebnisse der LuciferaseReporterstudien mit den verschiedenen Luc-Konstrukten. Aus der Abbildung geht
zunächst hervor, dass der promotorlose Expressionsvektor pGL3 basic keine cisregulatorischen Elemente in der Vektorsequenz enthält, die die Expression des
Luciferasegens abhängig vom Wnt/β−Catenin-Signalweg regulieren. Die LuciferaseAktivität in den Versuchen mit pGL3 basic bewegte sich immer auf einem niedrigen
Niveau, auch wenn der Wnt/β−Catenin-Signalweg aktiviert war. Im Gegensatz dazu
stieg die relative Luciferaseaktivität stark an, wenn in HEK 293-Zellen, die das Ax2
P/I1-Luc-Konstrukt enthielten, TCF1E und β−Catenin S33A exprimiert wurden. In
diesem Fall wurde eine relative Luciferase-Aktivität von etwa 26 erreicht, das heißt
die standardisierte Luciferase-Aktivität in diesen Zellen war 26 mal höher, als in
Zellen, die das Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt enthielten, in denen der Wnt/β−Catenin-
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Ergebnisse
Abb. 3.6. Aktivierbarkeit verschiedener Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte nach Mutagenese von
LEF/TCF-Bindestellen. Durch gezielte Mutagenese wurden verschiedene Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte
mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen generiert. TCF1E und β-Catenin wurden einzeln oder in
Kombination in HEK 293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung der Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte in
Luciferase-Reporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die
Transfektionseffizienz wurde der pCMV β-Galaktosidase-Vektor eingesetzt. Die relative LuciferaseAktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
durch TCF1E und/oder β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in
HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Die Darstellung der Ax2
P/I1-Reporterkonstrukte basiert auf Abb. 3.4. Mutierte LEF/TCF-Bindestellen sind durchkreuzt
dargestellt. Die Mutagenese aller LEF/TCF-Bindestellen im Ax2 P/I1 1-7 mut-Luc-Konstrukt führt zum
weitgehenden Verlust der Aktivierbarkeit durch TCF1E und β-Catenin S33A.
Signalweg jedoch nicht aktiviert war (Kontrollversuch mit leerem pCS2+-Vektor).
Das Ausmaß dieser Induktion deckt sich in etwa mit dem Ergebnis, das in Abb. 3.5
dargestellt ist (50 ng pCS2+-TCF1E-Expressionsvektor). Interessanterweise war eine
Erhöhung der relativen Luciferase-Aktivität auch in den Zellen zu beobachten, die das
Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt enthielten und in denen nur β−Catenin S33A exprimiert
wurde, nicht jedoch in den Zellen, in denen nur TCF1E exprimiert wurde. Die relative
Luciferase-Aktivität stieg in den β−Catenin S33A-exprimierenden Zellen auf einen
Wert zwischen 6 und 7, in TCF1E-exprimierenden Zellen blieb sie auf dem niedrigen
Hintergrund-Niveau von etwa 2.
Betrachtet man die Werte für die relative Luciferase-Aktivität, die mit den
Reporterkonstrukten Ax2 P/I1 4-7 mut-Luc und Ax2 P/I1 1-3 mut-Luc erzielt wurden
(s. Abb. 3.6), stellt man fest, dass sich die Werte nicht wesentlich von den Werten für
das Wildtyp-Konstrukt Ax2 P/I1-Luc unterscheiden0. Es wurden zwar etwas geringere
Werte erzielt, die Erhöhung der Luciferase-Aktivitäten nach Aktivierung des
Wnt/β−Catenin-Signalwegs durch die Expression von TCF1E und β−Catenin S33A
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lag aber immer noch im Bereich von etwa 20. In den jeweils vergleichbaren Zellen, in
denen nur β−Catenin S33A exprimiert wurde, lag die relative Luciferase-Aktivität bei
knapp 5, also auch in etwa auf dem Niveau, das unter gleichen Bedingungen mit dem
Wildtyp-Konstrukt erzielt wurde. Die Mutagenese nur eines Teils der LEF/TCFBindestellen in Ax2 P/I1 scheint also keinen großen Einfluss auf die TCF/β−Cateninabhängige Aktivierung dieser regulatorischen Region zu haben.
Anders sah die Situation aus, wenn alle sieben LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1
mutiert wurden. Durch die alleinige Expression von β−Catenin S33A in den HEK
293-Zellen ließ sich das Konstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-Luc überhaupt nicht mehr
aktivieren. Erst wenn TCF1E und β−Catenin S33A zusammen exprimiert wurden
stieg die relative Luciferase-Aktivität leicht an, allerdings nur auf einen Wert von
etwa 6, im Vergleich zu Werten über 20, die mit den anderen Konstrukten erzielt
worden waren. Die Mutagenese aller LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 führt also zu
einer starken Hemmung der TCF/β−Catenin-abhängigen Aktivierung dieser
regulatorischen Region, ohne sie jedoch gänzlich auszuschalten.
3.5.3.
Untersuchungen zur Axin2-Expression in Mausembryonen
Da das Expressionsmuster von Axin2 während der Embryonalentwicklung in der
vorhandenen Literatur nicht gut dokumentiert war, wurden zunächst „whole mount“
in situ Hybridisierungen mit Wildtyp-Mausembryonen durchgeführt (s. 3.5.3.1.).
Zusätzlich wurde die Expression des endogenen Axin2-Gens in Mausembryonen
untersucht, in denen Elemente des Wnt/β-Catenin-Signalwegs genetisch verändert
sind (s. 3.5.3.2. u. 3.5.3.3.). Ziel war es, die in vitro Daten aus den LuciferaseReporterversuchen durch in vivo Hinweise auf eine Regulation der Axin2-Expression
durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg zu unterstützen.
3.5.3.1. Expression von Axin2 in Wildtyp-Mausembryonen
Mit Hilfe der in situ Hybridisierung können die Transkripte (mRNA-Moleküle) eines
bestimmten Gens in situ, das heißt im Gewebeverband, lokalisiert werden. Als
Probenmaterial eignen sich Gewebeschnitte, aber auch ganze Organe oder
Embryonen, wenn diese eine bestimmte Größe nicht überschreiten. Im letzteren Fall
spricht man von einer „whole mount“ in situ Hybridisierung (s. 2.5.6.). Im Falle von
Axin2 wurde die „whole mount“ in situ Hybridisierung mit Embryonen aus folgenden
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Ergebnisse
Entwicklungsstadien durchgeführt: E 7,5 d.p.c.; E 8,5 d.p.c.; E 9,5 d.p.c. und E 10,5
d.p.c. Die Ergebnisse sind Abbildung 3.7 zu entnehmen.
Abb. 3.7. Nachweis der Axin2-Expression in Wildtyp-Mausembryonen durch „whole mount“
in situ Hybridisierung. Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien wurden präpariert und die
Axin2-mRNA durch in situ Hybridisierung nachgewiesen. (A) E 7,5 dpc; Expression von Axin2 im
Primitivstreifen. (B,C) E 8,5 dpc; Axin2-Expression im Bereich der posterioren Neuralfalte, im
präsomitischen Mesoderm und im Bereich der Kopffalte. (D) E 9,5 dpc; Expression von Axin2 v.a. im
dorsalen Neuralrohr, in der Schwanzknospe, im präsomitischen Mesoderm, sowie in Kiemenbögen und
Gliedmaßenknospen. (E) E 10,5 dpc; Gewebespezifität der Axin2-Expression ähnlich wie an Tag 9,5
dpc. (A) laterale Ansicht, dorsal oben, posterior rechts; (B) dorsale Ansicht, posterior rechts; (C)
laterale Ansicht, dorsal oben, posterior rechts; (D,E), laterale Ansicht. Maßstab: 0,5 mm.
Axin2 ist nicht ubiquitär eprimiert, sondern zeigt ein gewebespezifisches
Expressionsmuster. Am Tag 7,5 p.c. ist Axin2 in der posterioren Hälfte des
becherförmigen Embryos, insbesondere in der Region des Primitivstreifens,
exprimiert. Zwischen Tag 8 p.c. und Tag 8,5 p.c. beginnt die Expression von Axin2 im
sich entwickelnden Neuralrohr, und zwar im Bereich der posterioren Neuralfalte.
Auch im präsomitischen Mesoderm sowie im Bereich der Kopffalte wird Axin2
detektiert. Nach der Drehung des Embryos (s. 1.1.2.) ist Axin2 am Tag 9,5 p.c. im
gesamten dorsalen Neuralrohr und in benachbarten Bereichen exprimiert. Weitere
Expressionsdomänen befinden sich in der Schwanzknospe, den Kiemenbögen und den
vorderen Gliedmaßenknospen. An Tag 10,5 p.c. ist dieses Expressionsmuster im
Wesentlichen erhalten. Auch die hinteren Gliedmaßenknospen entwickeln sich nun
und exprimieren ebenfalls Axin2. Im Bereich des Hinterhirns ist an Tag 10,5 p.c. eine
deutliche Lücke in der Expression von A x i n 2 im Neuralrohr zu sehen.
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Ergebnisse
Interessanterweise sind in einigen der genannten Axin2-Expressionsdomänen, etwa in
der Schwanzknospe und im dorsalen Neuralrohr, auch verschiedene Wnt-Proteine
exprimiert (McMahon und Bradley, 1990; Roelink und Nusse, 1991; Shackleford und
Varmus, 1987; Takada et al., 1994; Wilkinson et al., 1987).
3.5.3.2. Axin2-Expression in vestigial tail Embryonen
Mäuse, in denen bestimmte Elemente des Wnt/β-Catenin Signalwegs genetisch
verändert sind, bieten ein geeignetes Unteruchungsmodell, um den Einfluß dieses
Signalwegs auf die Expression des endogenen Axin2-Gens in vivo zu untersuchen. Ein
Vertreter der Wnt-Familie, Wnt3a, ist während der Embryogenese u. a. am Tag 9,5
p.c. im dorsalen Neuralrohr und in der Schwanzknospe von Mäusen exprimiert. Das
gezielte Ausschalten der Wnt3a-Expression in Wnt3a K.O.-Mäusen führt caudal zu
den vorderen Gliedmaßenknospen zu einer Reihe von Defekten (s. 1.5.2.), vor allem
in mesodermalen Strukturen (Takada et al., 1994). Es wurde gezeigt, dass die
Expression des Wnt3a-Gens auch in vestigial tail Mäusen, Mäusen mit einer natürlich
vorkommenden, regulatorischen Mutation im Wnt3a-Gen, eingeschränkt ist (Greco et
al., 1996). vestigial tail Mäuse besitzen einen kürzeren bzw. völlig verstümmelten
Schwanz, je nachdem, ob sie heterozygot oder homozygot für die Mutation sind, auch
die homozygoten Tiere sind aber lebensfähig und fertil. Um den Einfluss der
reduzierten Wnt3a-Expression auf die Axin2-Expression zu untersuchen, wurden
Verpaarungen zwischen homozygoten und heterozygoten vestigial tail Mäusen
angesetzt, die Embryonen am Tag 10,25 p.c. präpariert und anschließend die
Expression von Wnt3a und Axin2 in den Embryonen mittels in situ Hybridisierungen
analysiert.
Abb. 3.8 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs. Die in situ Hybridisierungen mit der
Wnt3a-Sonde zeigen deutlich den fast völligen Verlust der Wnt3a-Expressionsdomäne
in der Schwanzknospe von homozygoten (vt/vt) vestigial tail Embryonen am Tag
10,25 p.c (vgl. Abb. 3.8 A und B). Die Expression von Wnt3a im dorsalen Neuralrohr
ist dagegen bei heterozygoten und homozygoten Embryonen durchaus vergleichbar.
Ein ähnliches Bild ergibt sich für die Expression des Axin2-Gens. Bei dem Embryo,
der heterozygot (vt/+) für die vestigial tail Mutation ist, also noch ein Wildtyp-Allel
des Wnt3a-Gens enthält, ist die Expression von Axin2 in der Schwanzknospe und im
präsomitischen Mesoderm deutlich zu erkennen (Abb. 3.8 C). Im Gegensatz dazu
wird bei der in situ Hybridisierung der homozygoten (vt/vt) vestigial tail Embryonen
kaum noch Axin2-mRNA in diesen Strukturen detektiert (Abb. 3.8 D).
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Ergebnisse
Abb. 3.8. Nachweis der Expression von Wnt3a und Axin2 in vestigial tail Embryonen durch
„whole mount“ in situ Hybridisierung. E 10,25 dpc Embryonen, die heterozygot (vt/+) bzw.
homozygot (vt/vt) für eine regulatorische Mutation im Wnt3a-Gen waren (vestigal tail / vt) wurden
mittels „whole mount“ in situ Hybridsierung untersucht. Die Expression von Wnt3a (A,B) und Axin2
(C,D) wurde nachgewiesen. Homozygote vestigial tail Embryonen (vt/vt) zeigen den Verlust der
Expression beider Gene im Bereich von Schwanzknospe und präsomitischem Mesoderm (B,D). Die
Schwanzregion der Embryonen ist in stärkerer Vergrößerung in dorsaler Ansicht dargestellt. Maßstab:
0,5 mm.
Die Analyse der Genexpression in vestigial tail Embryonen zeigt, dass die Axin2Expression in den posterioren Strukturen des Embryos von der Expression des Wnt3aGens abhängig ist.
3.5.3.3. Ektopische Axin2-Expression nach Aktivierung des Wnt/β-CateninSignalwegs in vivo
In Mäusen, in denen beide Allele des Wnt3a-Gens die vestigial tail Mutation tragen,
geht neben der Expression von Wnt3a auch die Expression von Axin2 in der
Schwanzknospe und im präsomitischen Mesoderm verloren. Die negative
Beeinflussung des Wnt-Signalwegs hat also Auswirkungen auf die Axin2-Expression.
Was geschieht aber, wenn im umgekehrten Fall der Wnt/β-Catenin Signalweg in vivo
aktiviert wird? Hat dies ebenfalls Auswirkungen auf die Axin2-Expression? Wie schon in
Abschnitt 3.5.2..2. besprochen, besteht eine Möglichkeit, den Wnt/β-Catenin Signalweg zu
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Ergebnisse
aktivieren darin, eine stabile Form von β-Catenin in Zellen einzubringen. Ein Beispiel dafür
lieferte bereits die Transfektion von HEK 293-Zellen mit einem Expressionsvektor für βCatenin S33A bei der Durchführung der Luciferase-Reporterstudien. Harada et al. (Harada
et al., 1999) haben eine Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, eine stabilisierte
Form von β-Catenin gewebespezifisch in Mäusen zu exprimieren. Dazu benutzten die
Autoren das Cre/loxP-System zur in vivo Rekombination von Genen (Hamilton und
Abremski, 1984; Nagy, 2000). Sie generierten eine Maus mit einer Variante des βCatenin-Gens, in der das dritte Exon an beiden Enden von loxP-Sequenzen flankiert ist. Die
Rekombination dieses „Exon 3 - gefloxten“ β-Catenin-Gens durch die Cre-Rekombinase
führt zu einer Variante des β-Catenin-Gens, in dessen codierender Sequenz Exon 3 fehlt.
Dieses Exon enthält normalerweise den Sequenzabschnitt, der für die Aminosäuren 5-81
des β-Catenin-Proteins codiert, also den N-terminalen Abschnitt, der von CK1 und GSK3β
phosphoryliert wird, um β-Catenin für den Abbau im Proteasom vorzubereiten (Aberle et
al., 1997; Harada et al., 1999). Das derart veränderte β-Catenin-Protein wird also nicht
mehr Wnt-abhängig reguliert (s. Abb. 1.2), sondern ist in den Zellen konstitutiv in erhöhter
Menge vorhanden und kann, da die entsprechenden Proteinabschnitte unverändert sind, als
Transaktivator für LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren wirken.
Durch die Kreuzung von Mäusen mit „Exon 3 - gefloxtem“ β-Catenin-Gen und Mäusen,
die die Cre-Rekombinase unter einem gewebespezifischen Promotor exprimieren, kann
somit der Wnt/β-Catenin Signalweg in Nachkommen dieser Mäuse gewebespezifisch
aktiviert werden. Für diese Arbeit wurde die β-Catenin Exon 3 - gefloxte Maus mit einer
En1-Cre knock in Maus (Hanks et al., 1995; Kimmel et al., 2000) gekreuzt. Letztere
exprimiert die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des
Engrailed 1-Locus. Die Embryonen wurden 10,5 Tage nach der Verpaarung der Mäuse
präpariert, genotypisiert und mittels in situ Hybridisierung auf die Expression von Axin2 hin
untersucht (Abb. 3.9 B-C). Zusätzlich wurde die Cre-Expression in einer En1-Cre knock in
Maus detektiert (Abb. 3.9 A). Abb. 3.9 A zeigt das Ergebnis der in situ Hybridisierung, die
mit der Probe für die Cre-Rekombinase durchgeführt wurde. Es wird deutlich, dass am Tag
10,5 p.c. die Cre-Rekombinase vor allem im Mittel- und Hinterhirn des En1-Cre knock in
Embryos exprimiert wird. Zusätzlich ist jedoch eine schwächere Färbung in den Somiten zu
erkennen, Cre wird also auch in den Somiten exprimiert. Abb. 3.9 B zeigt die Axin2Expression ebenfalls in einem Tag 10,5 p.c. Embryo des gleichen Genotyps. Das
Expressionsmuster von Axin2 in dem En1-Cre knock in Embryo unterscheidet sich nicht
von dem in normalen Wildtyp-Embryonen (vgl. Abb. 3.7). Anders sieht die Situation aus,
wenn in den En1-Cre knock in Embryonen das Exon 3 - gefloxte β-Catenin-Allel
vorhanden ist (Abb. 3.9 C). In diesen Embryonen ist die Expression von Axin2 in der
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Ergebnisse
Region von Mittel- und Hinterhirn deutlich ausgeprägter, als in vergleichbaren β-CateninWildtyp Embryonen .Während in der Wildtyp-Situation die Axin2-Expression im dorsalen
Neuralrohr im Bereich der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze nur sehr schwach ausgeprägt ist (s.
Abb. 3.7 und Abb. 3.9 B), ist diese Region in dem Embryo in Abb. 3.9 C stark gefärbt.
Abb. 3.9. „Whole mount“ in situ Hybridisierung von E 10,5 dpc Embryonen aus Verpaarungen von
En1-Cre knock in Mäusen und β-Catenin-Exon 3-floxed Mäusen. Der Genotyp der Embryonen ist unter
den Bildern angegeben. Abb. 3.9 (A ) zeigt die Expression der Cre-mRNA in Mittel-/Hinterhirn sowie in
differenzierten Somiten eines En1-Cre knock in Embryos mit zwei Wildtyp-Allelen des β-Catenin-Gens. Abb.
3.9 (B) zeigt die Axin2-Expression in einem Embryo des gleichen Genotyps. Das Expressionsmuster entspricht
dem von Wildtyp-Embryonen (vgl. Abb. 3.7). In Embryonen des Genotyps En1 Cre / + / β-Catenin Exon3 floxed / +
kommt es in Mittel-/Hinterhirn und in differenzierten Somiten zur Cre-vermittelten Rekombination des Exon 3gefloxten β-Catenin-Allels und damit zur gewebespezifischen Expression eines stabilen β-Catenin-Proteins.
Dies führt zu einer ektopischen Axin2-Expression in der Mittel-/Hinterhirn-Region und in differenzierten
Somiten (C). Maßstab: 0,5 mm. Nähere Erläuterungen siehe Text.
En1-Cre knock in Embryonen, die das Exon 3 - gefloxte β-Catenin-Allel enthalten, zeigen
neben der Mittelhirn-Hinterhirn-Region noch einen weiteren Ort ektopischer Axin2Expression. Die anterior gelegenen älteren Somiten sind in Embryonen dieses Genotyps am
Tag 10,5 p.c. deutlich angefärbt (Abb. 3.9 C). Die beiden Orte ektopischer Axin2Expression, Mittel-/Hinterhirn und Somiten, decken sich mit der gewebespezifischen
Expression der Cre-Rekombinase in En1-Cre knock in Embryonen (s. Abb. 3.9 A).
Die gewebespezifische Cre-vermittelte Rekombination des β-Catenin-Locus, in deren
Folge eine stabile Form von β-Catenin exprimiert wird, führt also offenbar in der Mittel/Hinterhirn-Region und in den Somiten zu einer ektopischen Expression von Axin2. Die
Expression einer stabilen Form von β-Catenin in der Mittelhirn-Hinterhirn-Region hat aber
auch morphologische Veränderungen in diesem Hirnabschnitt zur Folge. In Abb. 3.9 C ist
deutlich eine unnatürliche Öffnung und Aufwölbung des Neuralrohrs im Bereich von
Mittelhirn und Hinterhirn zu erkennen, ein Zustand, der als Exencephalie bezeichnet wird.
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Ergebnisse
3.5.4.
Reporterstudien an transgenen Mäusen
Die Luciferase-Reporterstudien in HEK 293-Zellen haben bereits gezeigt, dass die
Axin2 Promotor / Intron 1-Region (Ax2 P/I1) die Expression eines Reportergens in
Abhängigkeit des Wnt/β-Catenin Signalwegs steuern kann (s. Abschnitt 3.5.2.). Die
Ergebnisse der in situ Hybridisierungen haben zudem gezeigt, dass das Axin2-Gen
während der Embryonalentwicklung gewebespezifisch exprimiert wird und die Axin2Expression vom Wnt/β-Catenin Signalweg beeinflusst wird. Es ist bisher jedoch nicht
geklärt, ob der Sequenzabschnitt Ax2 P/I1 alle cis-regulatorischen Elemente enthält,
die erforderlich sind, um die embryonale Expression von Axin2, bzw. die Expression
eines Reportergens, in dem beobachteten zeitlich-räumlichen Muster zu steuern. Eine
Möglichkeit, dies herauszufinden, liegt in der Herstellung von transgenen Mäusen, die
das Reportergen β-Galaktosidase (lacZ) unter der Kontrolle der Ax2 P/I1-Sequenz
exprimieren (s. Abb. 3.10 A). Zusätzlich kann mit einem solchen transgenen Ansatz
geklärt werden, ob auch in vivo eine Regulation der Reportergen-Expression durch
den Wnt/β-Catenin Signalweg erfolgt. Dazu wurden zusätzlich transgene Mäuse
generiert, die das lacZ-Reportergen unter der Kontrolle der Ax2 P/I1 1-7 mut-Sequenz
exprimieren (s. Abb. 3.11 A), der Variante von Ax2 P/I1, in der sämtliche LEF/TCFBindestellen mutiert sind. Zur Herstellung der transgenen Mäuse siehe Abschnitt
2.5.8. Für die Reporterstudien mit Ax2 P/I1-lacZ bzw. Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ wurden
die Embryonen jeweils 9 Tage nach Reimplantation der Embryonen (erfolgt im
Zweizell-Stadium) aus den Leihmüttern entnommen. Zu diesem Zeitpunkt haben die
Embryonen ein Entwicklungsstadium erreicht, das in etwa dem von normal gezeugten
Embryonen 9,0 bis 9,5 Tage nach der Befruchtung entspricht. Zum Nachweis der βGalaktosidase-Aktivität wurde eine X-Gal-Färbung an den präparierten Embryonen
durchgeführt (s. 2.5.10.).
3.5.4.1. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der Axin2 Promotor /
Intron 1-Region
In zwei unabhängigen Versuchen, die durchgeführt wurden, um mit dem Ax2 P/I1lacZ-Konstrukt transgene Embryonen zu produzieren, wurden insgesamt 84
Embryonen präpariert. Die PCR-Genotypisierung, die mit genomischer DNA aus den
Dottersäcken durchgeführt wurde, ergab, dass in insgesamt 23 Embryonen das lacZTransgen im Genom vorhanden war (27,3 %). Die X-Gal Färbung resultierte bei 18
Embryonen in einer Blaufärbung.
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Abb. 3.10. Gewebespezifität der β-Galaktosidase-Aktivität in transgenen Embryonen (E 9,5
dpc) mit dem Ax2 P/I1-lacZ-Konstrukt. (A) Schematische Darstellung des Ax2 P/I1-lacZKonstrukts, das für die Generierung der transgenen Embryonen eingesetzt wurde. Die Bezeichnung der
einzelnen Elemente in Ax2 P/I1 ist Abb. 3.4 zu entnehmen. (B) Transgener Embryo (E 9,5 dpc) nach
„whole mount“ X-Gal-Färbung. Die Blaufärbung ist Folge der β-Galaktosidase-Aktivität in den Zellen,
die das lacZ-Transgen exprimieren. Von 18 gefärbten Embryonen zeigten 14 ein vergleichbares
Färbungsmuster. Das Färbungsmuster gibt in etwa die Expression des endogenen Axin2-Gens zu
diesem Zeitpunkt wieder (vgl. Abb. 3.7 D). Von einem solchen X-Gal gefärbten Embryo wurden
Gewebeschnitte hergestellt. Die transversale Schnittführung ist in (B) angedeutet. (C-G)
Gewebeschnitte nach „whole mount“ X-Gal-Färbung und Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“. Das
lacZ-Transgen ist v.a. im dorsalen Neuralrohr (auch im Gehirn), in dorsal gelegenen mesenchymalen
Zellen, in den Gliedmaßenknospen, in der Schwanzknospe und im paraxialen Mesoderm exprimiert.
Abkürzungen: dA, dorsale Aorta; Gk, Gliedmaßenknospe; Hd, Hinterdarm; Hz, Herzregion; Lh,
Leibeshöhle; mZ, mesenchymale Zellen – u.a. Neuralleistenzellen; Ne, Neuralrohr; NeH,
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Neuroektoderm des Hinterhirns; NeM, Neuroektoderm des Mittelhirns; NeV, Neuroektoderm des
Vorderhirns; Oe, Oberflächenektoderm; pM, paraxiales Mesoderm. Vd, Vorderdarm. Maßstab: 0,5
mm. Nähere Erläuterungen siehe Text.
Die Färbungsmuster, die bei der X-Gal Färbung der Embryonen auftraten, lassen sich
in die drei folgenden Gruppen aufteilen.
Zwei der insgesamt 18 gefärbten Embryonen zeigten nur eine äußerst schwache
Blaufärbung. Die Auswertung dieser Embryonen hinsichtlich auftretender
Färbungsmuster war nicht möglich.
Zwei andere Embryonen zeigten lediglich eine Blaufärbung in einer zentralen,
posterioren Region des Embryos, im Bereich der Schwanzknospe. Weitere
embryonale Strukturen waren nicht angefärbt.
Bei 14 Embryonen wurde folgendes Färbungsmuster beobachtet (s. Abb. 3.10):
über die gesamte Länge des Embryos war die dorsale Hälfte stark gefärbt,
wohingegen die ventrale Hälfte der Embryonen kaum gefärbt war. Die vorderen
Gliedmaßenknospen und die posteriore Hälfte der Kiemenbögen zeigten ebenfalls
eine Blaufärbung. Zusätzlich trat eine Blaufärbung im Bereich um die
Schwanzknospe und eine schwache Färbung in den Somiten auf. Abb. 3.10 B
zeigt eine Übersichtsaufnahme von einem dieser Embryonen. In den Abb. 3.10 CG sind Querschnitte durch einen anderen Embryo mit gleichem Färbungsmuster
zu sehen. Abb. 3.10 C zeigt deutlich, dass sowohl das Oberflächenektoderm als
auch das angeschnittene Neuroektoderm des Mittelhirns blau gefärbt sind. In
Abb. 3.10 D ist zu erkennen, dass sich die Blaufärbung des Neuroektoderms in
Vorderhirn und Hinterhirn fortsetzt. Die Färbung ist jeweils auf die dorsale Hälfte
des Neuralrohrs beschränkt, zusätzlich sind das Oberflächenektoderm und
mesenchymale Zellen gefärbt. Abb. 3.10 E zeigt einen Querschnitt durch den
Rumpf des Embryos. Es ist deutlich zu sehen, dass sich die Färbung des dorsalen
Neuralrohrs und angrenzender nicht-neuronaler Gewebe in caudale Richtung
fortsetzt. Abbildung 3.10 F zeigt u.a. die Färbung der vorderen
Gliedmaßenknospen, die hier in der Schnittebene liegen. In Abb. 3.10 G ist ein
Querschnitt durch die Schwanzspitze zu sehen. Über den gesamten Querschnitt
sind die Zellen verschiedener Strukturen blau gefärbt. Neben Neuralrohr und
Hinterdarm sind auch die Zellen des präsomitischen Mesoderms blau gefärbt.
Vergleicht man die Abbildungen 3.7 und 3.10, so ist zu sehen, dass das Muster der
Blaufärbung, das in jeweils 14 der Embryonen gefunden wurde, die das lacZTransgen unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 exprimierten, in etwa mit dem
Expressionsmuster des endogenen Axin2-Gens am Tag 9,5 p.c. übereinstimmt. Die
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Ergebnisse
Blaufärbung in den dorsalen Regionen des transgenen Embryo ist jedoch wesentlich
stärker und ausgedehnter, als die Färbung der dorsalen Regionen, die bei der in situ
Hybridisierung zum Nachweis des endogenen Axin2-Gens erzielt wurde. Auch die
Somiten sind in den transgenen Embryonen deutlich angefärbt, während die in situ
Hybridisierung mit einer Axin2-Sonde nur eine sehr schwache Anfärbung dieser
Strukturen ergab.
3.5.4.2. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der mutierten Axin2
Promotor / Intron 1-Region
Es wurden insgesamt drei unabhängige Versuche durchgeführt, um mit dem Ax2 P/I1
1-7 mut-lacZ-Konstrukt transgene Embryonen zu produzieren. Dabei wurden 125
Embryonen präpariert. Die PCR-Genotypisierung ergab, dass bei 26 dieser 125
Embryonen das lacZ-Transgen im Genom vorhanden war (20,8 %). Die X-Gal
Färbung führte bei 17 Embryonen zu einer Blaufärbung. Die Färbungsmuster, die sich
mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ-Konstrukt ergaben, waren heterogener, als die, die
sich mit dem Wildtyp Ax2 P/I1-lacZ-Konstrukt ergeben hatten. Auch hier konnten die
Färbungsmuster jedoch in Gruppen eingeteilt werden.
Ein Embryo zeigte über die gesamte Länge eine Färbung in der Region um das
ventrale Neuralrohr. Das Färbungsmuster dieses Embryos unterschied sich sehr
stark von den in anderen Embryonen beobachteten Färbungen.
Acht Embryonen zeigten ausschließlich in der Kopfregion des Embryos eine
Blaufärbung (zwei Embryonen nur schwach, sechs Embryonen stark gefärbt). Ein
solcher Embryo ist in Abb. 3.11 B abgebildet. Es ist zu sehen, dass sich die
Blaufärbung auf die eher dorsal gelegenen Bereiche um die Regionen von Mittelund Hinterhirn konzentriert und sich in caudale Richtung bis zum Ohrbläschen
erstreckt. Die beiden Querschnitte, die in Abb. 3.11 C und D zu sehen sind,
zeigen jedoch, dass das Neuroektoderm selbst nicht gefärbt ist, vielmehr ist die
Blaufärbung auf die Epidermis und mesenchymale Zellen seitlich des Neuralrohrs
beschränkt.
Acht weitere Embryonen zeigten ebenfalls eine Färbung der Region um Mittelund Hinterhirn, wie sie gerade beschrieben wurde. Zusätzlich waren in diesen
acht Embryonen aber noch verschiedene andere Strukturen blau gefärbt. Als
Beispiel ist in Abb. 3.11 E ein Embryo zu sehen, der, zusätzlich zur Färbung in
der Kopfregion, eine Blaufärbung in den posterioren Abschnitten der
Kiemenbögen, in den vorderen Gliedmaßenknospen und am Ansatz der Allantois
Seite 95
Ergebnisse
aufweist. Eine schwächere Färbung der vorderen Gliedmaßenknospen war in zwei
weiteren der acht Embryonen zu beobachten. Zudem war bei zwei der acht
Embryonen eine schwache Blaufärbung in der seitlichen Rumpfregion des
Embryos auf Höhe der älteren, differenzierten Somiten zu sehen. Bei drei der acht
Embryonen trat eine Färbung auf der ventralen Seite im Bereich der Anlagen für
die inneren Organe auf.
Abb. 3.11. Gewebespezifität der β-Galaktosidase-Aktivität in transgenen Embryonen (E 9,5
dpc) mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ-Konstrukt. (A) Schematische Darstellung des Ax2 P/I1 1-7
mut-lacZ-Konstrukts, das für die Generierung der transgenen Embryonen eingesetzt wurde. Die
Bezeichnung der einzelnen Elemente in Ax2 P/I1 1-7 mut ist Abb. 3.4 zu entnehmen; mutierte
LEF/TCF-Bindestellen sind durchkreuzt dargestellt. (B) Transgener Embryo (E 9,5 dpc) nach „whole
mount“ X-Gal-Färbung. Die Blaufärbung ist Folge der β-Galaktosidase-Aktivität in den Zellen, die das
lacZ-Transgen exprimieren. Die Expression des lacZ-Transgens beschränkt sich auf die Region um
Mittel- und Hinterhirn. Von 17 gefärbten transgenen Embryonen zeigten acht eine vergleichbare
Färbung. Von einem solchen X-Gal gefärbten Embryo wurden Gewebeschnitte hergestellt. Die
transversale Schnittführung ist in (B) angedeutet. (C,D) Gewebeschnitte nach „whole mount“ X-GalFärbung und Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“. Die Expression des lacZ-Transgens beschränkt
sich auf Zellen des Oberflächenektoderms und mesenchymale Zellen in der Region um Mittel- und
Hinterhirn. Das Neuroektoderm zeigt keine Blaufärbung. (E) Acht weitere transgene Embryonen
Seite 96
Ergebnisse
zeigten ebenfalls eine Blaufärbung in mesenchymalen und ektodermalen Zellen der Mittel/Hinterhirnregion und zusätzliche β-Galaktosidase-Aktivität in anderen Strukturen, jedoch nie im
Neuroektoderm, in der Schwanzknospe oder im paraxialen Mesoderm. Der in (E) dargestellte Embryo
zeigt zusätzliche Blaufärbung in den Kiemenbögen, in den Gliedmaßenknospen und am Ansatz der
Allantois (s. kleines Kästchen). Abkürzungen: mZ, mesenchymale Zellen; NeH, Neuroektoderm des
Hinterhirns; NeM, Neuroektoderm des Mittelhirns; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; Oe,
Oberflächenektoderm. Maßstab: 0,5 mm. Nähere Erläuterungen siehe Text.
Ein Vergleich der Abbildungen 3.10 und 3.11 liefert deutliche Unterschiede zwischen
den ermittelten Färbungsmustern in Embryonen, die das Reportergen β-Galaktosidase
(lacZ) unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 bzw. unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 1-7
mut exprimierten. Die Blaufärbung im Gehirn und dorsalen Neuralrohr, in der
Schwanzknospe, im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten, die mit dem
Konstrukt Ax2 P/I1-lacZ erzielt werden konnte, wurde in keinem einzigen der 17
Embryonen beobachtet, die β-Galaktosidase unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 1-7
mut, dem Konstrukt mit den mutierten LEF/TCF-Bindestellen, exprimierten. Auch die
β-Galaktosidase-Expression in den, dem Neuralrohr benachbarten, ektodermalen und
mesenchymalen Zellen der dorsalen Rumpfregion war in den Embryonen mit dem
Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ Konstrukt nicht zu beobachten. Die β-GalaktosidaseExpression in epidermalen und mesenchymalen Zellen der Kopfregion wurde jedoch
vom Fehlen der LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 nicht beeinflußt. Auch die
Blaufärbung in den vorderen Gliedmaßenknospen und den Kiemenbögen war
zumindest in einem Teil der Embryonen mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ Konstrukt
erhalten.
Die Ergebnisse, die mit den transgenen Mäusen erzielt wurden, zeigen, dass
zumindest in einigen Geweben die Genexpression unter der Kontrolle von Ax2 P/I1
nur erfolgen kann, wenn die LEF/TCF-Bindestellen in dieser regulatorischen Region
intakt sind.
3.6.
Untersuchung von Follistatin
3.6.1.
Vergleich der Follistatin-Loci von Maus und Mensch
Erster Ansatzpunkt für die nähere Untersuchung der Wnt-abhängigen Regulation des
Follistatin-Gens war wiederum die Promotoranalyse. Ein etwa 4 kb großer Abschnitt
der 5'-flankierenden Sequenz des Maus Follistatin-Gens wurde von de Groot et al. (de
Groot et al., 2000) kloniert und näher charakterisiert. Die Autoren fanden drei
verschiedene Transkriptionsinitiationsstellen, die alle innerhalb eines Bereichs von
500 Basen vor dem Translationsstart des Follistatin-Gens lagen. Diese 4 kb große 5'-
Seite 97
Ergebnisse
flankierende DNA des Maus Follistatin-Gens (Foll 4 kb) wurde uns freundlicherweise
zur Verfügung gestellt (pKS Foll 4 kb) und war der Ausgangspunkt für die
Klonierung verschiedener Promotor-Reporter-Konstrukte (s. 3.6.2.1.). Ein Vergleich
der 5’-flankierenden Sequenzen der Follistatin-Loci von Maus und Mensch, mit Hilfe
der Analysesoftware DiAlign (http://www.genomatix.de/cgi-bin/dialign/dialign.pl),
ergab eine hohe Sequenzkonservierung. Die -4 kb-Regionen vor den jeweiligen
Translationsstartstellen sind zwischen Maus und Mensch zu 53% konserviert, die -3
kb-Regionen sogar zu 66%. In Abb. 3.12 ist die Verteilung von LEF/TCFBindestellen in den jeweils 4 kb langen 5'-flankierenden Sequenzen der FollistatinLoci von Maus und Mensch schematisch dargestellt. In der Maus-Sequenz sind
insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen enthalten, in der humanen Sequenz nur eine
einzige, deren Sequenz und Position ist jedoch zwischen Maus und Mensch exakt
konserviert. (s. Tab. 3.13 und Abb. 3.12).
Abb. 3.12. Vergleich der 5’-flankierenden Sequenzen der Follistatin-Gene von Maus und
Mensch. Die 5’-flankierenden Sequenzen vor den ATG-Translationsinitiationscodons der FollistatinGene von Maus und Mensch wurden auf die Sequenz 5’-CTTTGA/TA/T-3’ hin untersucht (beide DNAStränge). Die Sequenzen wurden mit der DNA-Analysesoftware „MegAlign“ paarweise verglichen.
Innerhalb von 4 kb der jeweiligen 5’-flankierenden Sequenzen der Follistatin-Gene ist lediglich eine
LEF/TCF-Bindestelle konserviert (rotes Kästchen). Im Maus Follistatin-Locus finden sich zusätzlich
sechs LEF/TCF-Bindestellen, die im humanen Gen nicht konserviert sind (blaue Kästchen).
Seite 98
Ergebnisse
3.6.2.
Luciferase-Reporterstudien
3.6.2.1. Klonierung von Follistatin-Luciferase-Reporterkonstrukten
Der 4 kb große 5'-flankierende Abschnitt des Follistatin-Gens wurde mit HindIII aus
dem Konstrukt pKS Foll 4 kb ausgeschnitten und in den HindIII geöffneten pGL3
basic Vektor kloniert. Das Konstrukt wurde Foll 4 kb-Luc genannt. Ausgehend von
diesem Konstrukt wurden weitere Follistatin-Luciferase Konstrukte hergestellt, in
denen jeweils ein Teil der regulatorischen Sequenz des Follstatin-Gens vom 5'-Ende
her deletiert war. Dazu wurde das Konstrukt Foll 4 kb-Luc mit passenden
Restriktionsenzymen geschnitten und religiert, bzw. ein Follistatin PromotorFragment aus Foll 4 kb-Luc (oder pKS Foll 4 kb) ausgeschnitten und in den
entsprechend vorbehandelten pGL3 basic Vektor kloniert. Die Deletionskonstrukte
sind in Abb. 3.14 zusammen mit den zugehörigen Ergebnissen der LuciferaseReporterstudien dargestellt. Zudem wurden verschiedene Konstrukte hergestellt, in
denen die LEF/TCF-Bindestellen 1-4 des Follistatin-Promotors einzeln oder in
Kombination mutiert waren. Die mutierten Konstrukte werden in den Abb. 3.15 und
3.16 zusammen mit den zugehörigen Ergebnissen der Luciferase-Reporterstudien
gezeigt. Die Herstellung der mutierten Konstrukte ist im Methodenteil beschrieben
(2.2.14.).
3.6.2.2. Stimulation des Foll 4 kb-Luc-Konstrukts durch verschiedene
TCF/β-Catenin-Komplexe
Die Luciferase-Reporterversuche mit den Follistatin-Luc-Konstrukten wurden unter
den gleichen Bedingungen durchgeführt wie die entsprechenden Versuche mit den
Ax2 P/I1-Konstrukten (s. 2.4.6. u. 3.5.2.2.). Zur internen Standardisierung der
Luciferase-Messungen wurde jedoch der pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH,
Mannheim) eingesetzt, statt wie bisher der pCMV-β-Galaktosidase-Vektor. Zur
Berechnung der standardisierten Luciferase-Aktivität in den jeweiligen Versuchen
wurde der Quotient aus den Aktivitäten von Photinus-Luciferase und RenillaLuciferase gebildet (s. 2.4.6.).
Zunächst musste festgestellt werden, ob und welche LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren
geeignet sind, den Follistatin-Promotor zusammen mit β-Catenin S33A zu aktivieren.
Dazu wurden verschiedene LEF/TCF-Expressionsvektoren zusammen mit dem β-Catenin
Seite 99
Ergebnisse
S33A-Expressionsvektor und Foll 4 kb- Luc in HEK 293-Zellen eingebracht und getestet.
Abb. 3.13 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche.
Abb. 3.13. Funktionalität verschiedener LEF/TCF-Faktoren bei der Aktivierung des Foll 4 kbLuc-Konstrukts. Verschiedene LEF/TCF-Faktoren wurden zusammen mit β-Catenin S33A in HEK
293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung des Wildtyp Foll 4kb-Luc-Konstrukts in LuciferaseReporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die
Transfektionseffizienz wurde der pCMV-Renilla Vektor eingesetzt. Die relative Luciferase-Aktivität
gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch
LEF/TCF-Faktoren und β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in
HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Nur TCF1E, TCF3 und
TCF4E aktivieren zusammen mit β-Catenin S33A die Reportergenexpression.
Aus der Abbildung geht hervor, dass TCF1E, TCF3 und TCF4E, nicht aber LEF1 und
TCF1B, in der Lage sind, zusammen mit β-Catenin S33A den Follistatin-Promotor zu
aktivieren und die Expression des Luciferase-Reportergens zu induzieren. Die größten
relativen Luciferase-Aktivitäten wurden mit TCF1E und TCF3 erzielt, wobei die Variation
der eingesetzten Menge des entsprechenden LEF/TCF-Expressionsvektors, zumindest in
dem getesteten Bereich (50-500 ng), kaum Auswirkungen auf das Ergebnis hatte. Bei der
Verwendung von TCF4E fielen die Induktionen der Luciferase-Aktivität geringer aus, als
bei der Verwendung von TCF1E oder TCF3. Interessanterweise war hier jedoch eine
deutliche Steigerung der relativen Luciferase-Aktivität zu beobachten, wenn bei der
Transfektion der HEK293-Zellen mehr von dem TCF4E-Expressionsvektor eingesetzt
wurde.
Die geschilderten Ergebnisse bestätigen zum einen die Ergebnisse von de Groot et al. (de
Groot et al., 2000) bezüglich der Promotoraktivität der klonierten 5'-flankierenden
Sequenz des Maus Follistatin-Gens. Zusätzlich zeigen die Reporterstudien, dass die
Promotoraktivität des Foll 4 kb-Fragments TCF/β-Catenin-abhängig gesteuert werden
kann, und dass die verschiedenen LEF/TCF-Tanskriptionsfaktoren sich bezüglich
ihrer Funktionalität bei dieser Steuerung unterscheiden. Als Konsequenz aus den in
Seite 100
Ergebnisse
Abb. 3.13 dargestellten Ergebnissen, wurden für alle weiteren LuciferaseReporterversuche mit Follistatin-Luc Konstrukten pro Transfektionsansatz 50 ng des
pCS2+-TCF1E-Expressionsvektors eingesetzt.
3.6.2.3. Luciferase-Reporterstudien mit Deletionskonstrukten von Foll 4 kb-Luc
Eine Möglichkeit, einen Promotor zu charakterisieren, besteht darin, ihn sukzessive vom 5'Ende her zu deletieren, und die Auswirkung dieser Deletionen auf die Promotoraktivität zu
studieren. Im Falle des Foll 4 kb-Fragments wurde diese Methode benutzt, um erste
Hinweise auf die Funktionalität der insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen auf diesem
Abschnitt bei der durch TCF1E und β-Catenin S33A vermittelten Transaktivierung zu
erhalten. Abb. 3.14 zeigt die eingesetzten Deletionskonstrukte sowie die Egebnisse der
Luciferase-Reporterversuche.
Abb. 3.14. Aktivierbarkeit verschiedener Deletionskonstrukte von Foll 4 kb-Luc in LuciferaseReporterversuchen. Ausgehend vom Foll 4 kb- Luc-Konstrukt wurden weitere LuciferaseReporterkonstrukte hergestellt, in denen jeweils ein Teil der regulatorischen Sequenz des FollstatinGens vom 5'-Ende her deletiert war. Die dafür eingesetzten Restriktionsschnittstellen im FollistatinPromotor sind eingezeichnet. TCF1E und β-Catenin wurden einzeln oder in Kombination in HEK 293Zellen überexprimiert und die Aktivierung verschiedener Follistatin-Luc-Konstrukte in LuciferaseReporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die
Seite 101
Ergebnisse
Transfektionseffizienz wurde der pCMV-Renilla Vektor eingesetzt. Die relative Luciferase-Aktivität
gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch
TCF1E und/oder β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in HEK
293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Die Darstellung der
Follistatin-Reporterkonstrukte basiert auf Abb. 3.12. Nähere Erläuterungen siehe Text.
In HEK 293-Zellen, die das Foll 4 kb-Luc-Konstrukt enthielten und in denen
entweder nur TCF1E oder nur β−Catenin S33A exprimiert wurde, konnte kein
deutlicher Anstieg der standardisierten Luciferase-Aktivitäten im Vergleich zum
Kontrollversuch beobachtet werden. Da dies auch für alle weiteren getesteten
Follistatin-Luc Konstrukte der Fall war, werden im Folgenden nur die Ergebnisse aus
den Versuchen näher besprochen, bei denen TCF1E und β−Catenin S33A in
Kombination eingesetzt wurden, um den Wnt/β−Catenin-Signalweg zu aktivieren.
Unter diesen Bedingungen ergab sich für das Konstrukt Foll 4 kb-Luc (LEF/TCFBindestellen 1-7) eine relative Luciferase-Aktivität von etwa 30, d.h. die standardisierte
Luciferase-Aktivität der HEK 293-Zellen, die mit den pCS2+-Expressionsvektoren für
TCF1E und β−Catenin S33A transfiziert worden waren, war 30-fach höher, als die
standardisierte Luciferaseaktivität der HEK 293-Zellen aus dem Kontrollversuch, die
mit dem leeren pCS2+-Vektor transfiziert worden waren.
Wegen der übersichtlicheren Darstellung wurde in Abb. 3.14 die Reihenfolge der
Deletionskonstrukte so gewählt, dass das Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt zuletzt gezeigt
wird, es soll nun aber zuerst besprochen werden. Abb. 3.14 zeigt, dass die LuciferaseExpression unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb nach Aktivierung des Wnt/β−CateninSignalwegs in den HEK 293-Zellen auch um das 30-fache ansteigt, obwohl in diesem
Deletionskonstrukt nur noch die LEF/TCF-Bindestellen 1-4 vorhanden sind. Auch mit
dem Konstrukt Foll 2,1 kb-Luc, das lediglich die LEF/TCF-Bindestellen 1-3 besitzt,
konnte in etwa die gleiche relative Luciferase-Aktivität erzielt werden, wie mit den
Konstrukten Foll 4 kb-Luc und Foll 2,8 kb-Luc; der Wert für Foll 2,1 kb-Luc war mit
32 sogar etwas größer als bei den beiden längeren Konstrukten. Im Foll 1,8 kb-LucKonstrukt sind weitere 300 Basen vom 5'-Ende des Follistatin-Promotors deletiert,
was u. a. zum Verlust der LEF/TCF-Bindestelle 3 führt, der LEF/TCF-Bindestelle, die
zwischen Maus und Mensch evolutionär konserviert ist. Mit dem Foll 1,8 kb-LucKonstrukt ergab sich nach Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalwegs in den HEK
293-Zellen lediglich eine Steigerung der standardisierten Luciferase-Expression um
das 8-fache. Auch dieses 1,8 kb große Fragment des Follistatin-Promotors kann also
noch durch TCF1E und β−Catenin S33A aktiviert werden, allerdings weniger stark
als die bereits besprochenen, längeren Follistatin-Promotorfragmente. Diese
Induzierbarkeit der Luciferase-Expression durch TCF1E und β−Catenin S33A ist
Seite 102
Ergebnisse
auch bei dem Foll 0,5 kb-Luc-Konstrukt erhalten, mit dem sich ebenfalls eine relative
Luciferase-Aktivität von etwa 8 ergab. In dem 0,5 kb großen Fragment des
Follistatin-Promotors ist nur noch eine LEF/TCF-Bindestelle vorhanden. Wird ein
weiterer, 150 Basen langer Abschnitt deletiert, der diese LEF/TCF-Bindestelle
enthält, so geht die Induzierbarkeit der Luciferase-Expression durch TCF1E und
β−Catenin S33A verloren, wie die Ergebnisse, die mit dem Foll 0,35 kb-LucKonstrukt erzielt wurden, zeigen.
3.6.2.4. Follistatin-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen
Als Konsequenz aus den Ergebnissen mit den Deletionskonstrukten (s. 3.6.2.3.), und
angesichts der ausgeprägten Konservierung der 3 kb großen Sequenzabschnitte in 5'Richtung der Translationsstartstellen der Follistatin-Gene von Maus und Mensch (s.
3.6.1.), beschränkten sich die weiteren in vitro und in vivo Analysen des FollistatinPromotors im Wesentlichen auf das in Abb. 3.14 skizzierte 2,8 kb-Fragment des
Promotors mit insgesamt vier LEF/TCF-Bindestellen (in der Wildtyp-Version). Um
zu zeigen, dass diese LEF/TCF-Bindestellen tatsächlich für die Aktivierung des
Follistatin-Promotors durch TCF1E und β−Catenin S33A verantwortlich sind,
wurden die LEF/TCF-Bindestellen 1-4 in dem Foll 2,8 kb-Fragment mutiert (s.
2.2.14.). Verschiedene Follistatin-Luc-Konstrukte, in denen einzelne oder alle
LEF/TCF-Bindestellen mutiert waren, wurden anschließend in HEK 293-Zellen unter
den üblichen Bedingungen getestet (s. 2.4.6.). Die Konstrukte sowie die Ergebnisse
der Reporterversuche sind in Abb 3.15 und 3.16 zu sehen.
Abb. 3.15 zeigt die Ergebnisse, die mit den verschiedenen Foll 2,8 kb-LucKonstrukten in Luciferase-Reporterstudien erzielt wurden. Zunächst ist festzuhalten,
dass in dieser Versuchsreihe die relative Luciferase-Aktivität, die mit dem Wildtyp
Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt erzielt wurde, geringer ist, als der entsprechende Wert aus
der letzten Versuchsreihe (vgl. Abb. 3.14). Lag der Wert für Foll 2,8 kb-Luc in der
vorherigen Versuchsreihe bei etwa 30, so liegt er nun bei etwa 19. Es ist nicht klar,
worauf dieser Unterschied zurückzuführen ist. Die beiden Versuchsreihen wurden mit
HEK 293-Zellen durchgeführt, die unterschiedlich oft passagiert worden waren, was
eine mögliche Erklärung liefern könnte. Für die Interpretation der Ergebnisse ist es
letztlich unerheblich, da Vergleiche zwischen unterschiedlichen Reporterkonstrukten
nur innerhalb der einzelnen Versuchsreihen angestellt werden. Mit dem Konstrukt
Foll 2,8 kb1-4 mut-Luc, in dem alle vier LEF/TCF-Bindestellen mutiert sind, ergab
Seite 103
Ergebnisse
Abb. 3.15. Aktivierbarkeit verschiedener Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte nach Mutagenese von
LEF/TCF-Bindestellen. Durch gezielte Mutagenese wurden verschiedene Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte
mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen generiert. TCF1E und β-Catenin wurden einzeln oder in
Kombination in HEK 293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung der Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte in
Luciferase-Reporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die
Transfektionseffizienz wurde der pCMV Renilla Vektor eingesetzt. Die relative Luciferase-Aktivität
gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch
TCF1E und/oder β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in HEK
293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Die Darstellung der Foll 2,8
kb-Luc-Konstrukte basiert auf Abb. 3.12. Mutierte LEF/TCF-Bindestellen sind durchkreuzt dargestellt.
Die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestelle 1 in drei verschiedenen Konstrukten führt jeweils zum
weitgehenden Verlust der Promotoraktivierbarkeit durch TCF1E und β-Catenin S33A.
sich in jedem Fall eine stark reduzierte relative Luciferase-Aktivität, im Vergleich
zum Wildtyp-Konstrukt. Die 5-fache Steigerung der standardisierten LuciferaseAktivität durch Expression von TCF1E und β−Catenin S33A liegt nur geringfügig
über dem Wert, der erzielt wurde, wenn als Reporterkonstrukt der pGL3 basicLeervektor eingesetzt wurde.
Die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen 1-4 im Foll 2,8 kb 1-4 mutPromotorfragment führt somit dazu, dass die Luciferase-Expression allenfalls noch
schwach von TCF1E und β−Catenin S33A aktiviert werden kann. Die Konstrukte
Foll 2,8 kb 1-2 mut-Luc und Foll 2,8 kb3-4 mut-Luc dienten dazu, die funktionell
relevanten LEF/TCF-Bindestellen näher einzugrenzen. Wie Abb. 3.15 zu entnehmen
ist, führt bereits die Mutation der LEF/TCF-Bindestellen 1 und 2 zu einer ähnlichen
Seite 104
Ergebnisse
Reduktion der relativen Luciferase-Aktivität wie die Mutation aller vier LEF/TCFBindestellen. Die standardisierte Luciferase-Aktivität steigt bei dem Konstrukt Foll
2,8 kb 1-2 mut-Luc nach Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalweg nur noch um das
4-fache an, die Aktivierung dieses Konstrukts durch TCF1E und β−Catenin S33A ist
also stark eingeschränkt, im Vergleich zum Wildtyp-Konstrukt. Dagegen hat die
Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen 3 und 4 kaum Auswirkungen auf die
Aktivierbarkeit des Foll 2,8 kb 3-4 mut-Fragments durch den Wnt/β−CateninSignalweg. Mit dem Foll 2,8 kb3-4 mut-Luc-Konstrukt wird eine relative LuciferaseAktivität von etwa 17 erreicht, ein Wert der nur unwesentlich unter dem liegt, der in
dieser Versuchsreihe für das Wildtyp Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt ermittelt wurde.
Schließlich wurden zwei weitere Reporterkonstrukte hergestellt, in denen nur die
LEF/TCF-Bindestelle 1 (Foll 2,8 kb 1 mut-Luc) bzw. die LEF/TCF-Bindestelle 2
(Foll 2,8 kb 2 mut-Luc) des 2,8 kb Follistatin-Promotors mutiert war. Die Mutation
der ersten LEF/TCF-Bindestelle hat starke Auswirkungen auf die Aktivierbarkeit des
Foll 2,8 kb 1 mut-Luc-Konstrukts durch TCF1E und β−Catenin S33A. Dagegen wird
mit dem Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 2 mut-Luc in etwa die gleiche relative
Luciferase-Aktivität erreicht, wie mit dem Wildtyp Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt.
Die Ergebnisse, die mit den verschiedenen Deletionskonstrukten des FollistatinPromotors in Luciferase-Reporterstudien erzielt wurden (s. Abb. 3.14), deuteten
bereits darauf hin, dass die LEF/TCF-Bindestellen 5-7, die nur im Foll 4 kb-LucKonstrukt vorhanden waren, nicht an der Regulation des Follistatin-Promotors durch
den Wnt/β−Catenin-Signalweg beteiligt sind. Um dies zu bestätigen, wurde ein
Reporterkonstrukt auf der Basis des Foll 4 kb-Luc-Konstrukt hergestellt, in dem die
erste LEF/TCF-Bindestelle mutiert ist (Foll 4 kb 1 mut-Luc, s. Abb. 3.16). Dieses
Konstrukt wurde zusammen mit dem Wildtyp Foll 4 kb-Luc-Konstrukt, sowie Foll
2,8 kb 1 mut-Luc und Foll 2,8 kb-Luc in HEK 293-Zellen getestet. Die Ergebnisse
sind in Abb. 3.16 dargestellt. Die relativen Luciferase-Aktivitäten, die mit den
Wildtyp-Konstrukten Foll 4 kb-Luc und Foll 2,8 kb-Luc erzielt wurden, sind nahezu
identisch (vgl. auch Abb. 3.14). Die Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalwegs
durch TCF1E und β−Catenin S33A führte mit beiden Wildtyp-Konstrukten zu einer
etwa 30-fachen Steigerung der standardisierten Luciferase-Aktivität in den HEK 293Zellen. Dass die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle in Foll 2,8 kb 1 mut-Luc
zu einer stark reduzierten Wnt/β−Catenin-Antwort führt, wurde bereits besprochen (s.
3.6.2.4. und Abb. 3.15). Das gleiche wurde auch mit dem Konstrukt Foll 4 kb 1 mutLuc beobachtet. Auch hier führte die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle zu
einer drastischen Reduktion der relativen Luciferase-Aktivität im Vergleich zum
Seite 105
Ergebnisse
Wildtyp- Foll 4 kb-Luc-Konstrukt. Die drei zusätzlichen LEF/TCF-Bindestellen, die
in Foll 4 kb 1 mut-Luc im Vergleich zu Foll 2,8 kb 1 mut-Luc vorhanden sind,
konnten also die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle nicht kompensieren.
Abb. 3.16. Überprüfung der Funktionalität der LEF/TCF-Bindestellen 5-7 des 4 kb FollistatinPromotors. Um zu prüfen, ob die LEF/TCF-Bindestellen 5-7 des 4 kb Follistatin-Promotors die TCF/
β-Catenin-vermittelte Aktivierung des Follistatin-Promotors trotz mutierter LEF/TCF-Bindestelle 1
wiederherstellen können, wurde das Konstrukt Foll 4 kb 1 mut-Luc generiert und zusammen mit bereits
bekannten Follistatin-Luc-Konstrukten in Luciferase-Reporterversuchen getestet (Durchführung s.
Text u. Abb. 3.15). Die Darstellung der Follistatin-Luc-Konstrukte basiert auf Abb. 3.12. Die mutierte
LEF/TCF-Bindestelle 1 ist durchkreuzt dargestellt. Das Foll 4 kb 1 mut-Luc-Konstrukt verhält sich in
Luciferase-Reporterversuchen ähnlich wie das Foll 2,8 kb 1 mut-Luc-Konstrukt. Die drei zusätzlichen
LEF/TCF-Bindestellen (5-7) haben also keinen Einfluss auf die Aktivierbarkeit des FollistatinPromotors durch TCF1E und β-Catenin S33A.
Diese Versuche zeigen, dass von den sieben LEF/TCF-Bindestellen, die in dem 4 kb
Follistatin-Promotor vorhanden sind, nur die dem Transkriptionsstart nächstgelegene
bei der TCF/β-Catenin-abhängigen Regulation eines Reportergens funktionell ist.
Diese LEF/TCF-Bindestelle ist nicht im humanen Genom konserviert (s. Abschnitt
4.7 der Diskussion).
3.6.3.
Expression von Follistatin während der Maus-Embryogenese
Um einen Überblick über die Expression des Follistatin-Gens in den verschiedenen
Entwicklungsstadien zu bekommen, wurden in situ Hybridisierungen durchgeführt.
Dabei wurden neben ganzen Embryonen („whole mount“ in situ Hybridisierung) auch
Gewebeschnitte analysiert. (Albano et al., 1994; Feijen et al., 1994).
Seite 106
Ergebnisse
3.6.3.1. „Whole mount“ in situ Hybridisierungen von Embryonen
„Whole mount“ in situ Hybridisierungen zur Detektion der Follistatin mRNA wurden
mit Embronen aus den Entwicklungsstadien E 7,5 d.p.c - E 12,5 d.p.c. durchgeführt.
Die Ergebnisse sind Abb. 3.17 zu entnehmen.
Abb. 3.17. Nachweis der Follistatin-Expression in Wildtyp-Mausembryonen durch „whole
mount“ in situ Hybridisierung. Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien wurden präpariert
und die Follistatin-mRNA durch in situ Hybridisierung nachgewiesen. (A) E 7,5 dpc; Expression von
Follistatin im Primitivstreifen. (B) E 8,5 dpc; Follistatin-Expression im paraxialen Mesoderm und im
Bereich der Kopffalte. (D) E 9,5 dpc; schwache Follistatin-Expression im Mittelhirn, starke Expression
in einzelnen Rhombomeren des Hinterhirns und in den Somiten. (D) E 10,5 dpc; nur noch schwache
Follistatin-Expression in den Somiten und in Mittel- u. Hinterhirn. (E) E 11,5 dpc; neue
Expressionsdomänen von Follistatin in den Gliedmaßen und im Kopf des Embryos erscheinen. (F) E
12,5 dpc; zusätzlich zur starken Follistatin-Expression in den Gliedmaßen ist eine schwache Färbung
im Rumpf des Embryos zu erkennen. Neben weiteren Expressionsdomänen im Kopfbereich
exprimieren auch die Schnurrhaarfollikel Follistatin. (A) laterale Ansicht, dorsal oben, posterior rechts;
(B) lateral-dorsale Ansicht, posterior rechts; (C-F) laterale Ansicht. Maßstab: 0,5 mm.
Am Tag 7,5 p.c. ist Follistatin in der Region des Primitivstreifens exprimiert (Abb.
3.17 A), am Tag 8,5 der Embryonalentwicklung (Abb. 3.17 B) im paraxialen
Mesoderm und im sich entwickelnden Hinterhirn. Abb 3.17 C zeigt die FollistatinExpression am Tag 9,5 p.c. Es ist nun klar zu erkennen, dass sich die Expression von
Follistatin im Hinterhirn auf einzelne Rhombomere konzentriert, und zwar besonders
Seite 107
Ergebnisse
auf die Rhombomere 1,2, 4 und 6 (Albano et al., 1994). Zudem tritt eine schwache
Färbung in mehr anterior liegenden Hirnabschnitten auf. Im paraxialen Mesoderm
beschränkt sich das Follistatin-Signal auf die Somiten, die stark gefärbt sind, das
präsomitische Mesoderm zeigt dagegen allenfalls eine schwache Färbung (Albano et
al., 1994). Am Tag 10,5 p.c. (Abb. 3.17 D) ist die Follistatin-Expression im
paraxialen Mesoderm bereits deutlich schwächer geworden und auch die
Expressionsdomäne im Hinterhirn ist kaum noch zu erkennen. Deutlicher als bisher
ist die Epression von Follistatin im Mittelhirn zu sehen. Die Embryonen der
folgenden Entwicklungsstadien sind aufgrund ihrer Größe nicht mehr so gut für die
Analyse der Genexpression mittels „whole mount“ in situ Hybridisierung geeignet.
Die Embryonen in Abb. 3.17 E (E 11,5 d.p.c.) und 3.17 F (E 12,5 d.p.c.) werden hier
trotzdem gezeigt, weil sie verdeutlichen, dass in den späteren Entwicklungsstadien
neue Expressionsdomänen von Follistatin erscheinen, etwa im Gesicht (Region um
das Auge, Follikel der Schnurrhaare) und in den Gliedmaßen.
3.6.3.2. In situ Hybridisierungen auf Gewebeschnitten
Für eine detailliertere Analyse der Follistatin-Expression während späterer
Entwicklungsstadien wurden in situ Hybridisierungen auf Gewebeschnitten
durchgeführt. In Abb. 3.18 sind drei solche Schnitte (sagitale Schnittebene) durch
einen Embryo am Tag 12,5 p.c. dargestellt. Abbildung 3.18 A zeigt schematisch die
ungefähre Schnittführung durch den Embryo. In Abb. 3.18 B ist deutlich zu sehen,
dass Follistatin an mehreren Stellen in der vorderen Gliedmaße exprimiert ist. Neben
der starken Follistatin-Expression am distalen Ende der Gliedmaße (i. d. Region der
zukünftigen Finger, vgl. Abb. 3.17 F) sind in proximaler Richtung verschiedene
Kondensationen von mesenchymalen Zellen blau gefärbt. In Abb. 3.18 B ist auch zu
erkennen, dass Follistatin in Gruppen mesenchymaler Zellen in der Nähe des Auges
exprimiert wird. Auch eine schwache Expression in dem angeschnittenen
Neuroektoderm ist zu sehen. Abb 3.18 C zeigt deutlich die starke Expression von
Follistatin in den dem Riechepithel benachbarten, mesenchymalen Zellen und im
Innenohr. Weitere Follistatin-Expressionsdomänen findet man in mesenchymalen
Zellen zwischen den Anlagen der Rippen, in der hinteren Gliedmaße und im
Neuroepithel, v.a. im Bereich des Mittelhirns. In Abb. 3.18 D ist die regionale
Spezifität der Follistatin-Expression im zentralen Nervensystem besser zu sehen. Vor
allem im Dach des Mittelhirns, im Diencephalon und im ventralen Hinterhirn tritt eine
Blaufärbung auf. Abb. 3.18 D zeigt auch die starke Expression von Follistatin in der
Seite 108
Ergebnisse
Zunge und um die Nasenhöhle. Weiterhin ist ein segmentales Expressionsmuster im
dorsalen Bereich des Embryos zu erkennen. Feijen et al. (Feijen et al., 1994) konnten
zeigen, dass Follistatin in Embryonen am Tag 12,5 p.c. noch in weiteren Geweben
exprimiert ist, etwa in mesenchymalen Zellen um den Magen und im Darm, in den
Gonadenanlagen und in der Epidermis. Bei den Follistatin-exprimierenden Zellen im
Rumpf und in den Gliedmaßen handelt es sich zum Teil um Muskelvorläuferzellen
(Amthor et al., 1996; Connolly et al., 1995).
Abb. 3.18. Nachweis der Follistatin-mRNA durch in situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten
eines E 12,5 dpc Wildtyp-Embryos. (A) Schematische Darstellung der Schnittführung durch einen
12,5 Tage alten Embryo. Es wurden sagittale Schnitte hergestellt. (B-D) Nach in situ Hybridisierung
mit einer Follistatin-Sonde wurden die Gewebeschnitte mit „Nuclear Fast Red“ gegengefärbt. Die
blaue Färbung markiert Gewebe, die Follistatin exprimieren. Abkürzungen: Au, Auge; F, zukünftiger
Finger; hG, hintere Gliedmaße; Hh, Hinterhirn; Io, Innenohr; Mh, Mittelhirn; Mhd, Mittelhirndach;
mK, Kondensation mesenchymaler Zellen; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; Nh, Nasenhöhle;
Re; Riechepithel; vG, vordere Gliedmaße; Zh, Zwischenhirn; Zr, zukünftige Zwischenrippenregion;
Zu, Zunge. Vergrößerung: 10x. Nähere Erläuterungen siehe Text.
Seite 109
Ergebnisse
3.6.4.
Die
Reporterstudien an transgenen Mäusen
Luciferase-Reporterstudien
mit
den
verschiedenen
Follistatin-
Promotorfragmenten haben gezeigt, dass die Aktivität des Follistatin-Promotors
durch den Wnt/β−Catenin-Signalweg reguliert werden kann. Bisher ist jedoch nichts
über die in vivo Funktionalität dieser Follistatin-Promotorfragmente bekannt, d.h. es
ist nicht klar, ob etwa auf dem Foll 2,8 kb-Fragment alle cis-regulatorischen Elemente
vorhanden sind, die notwendig sind, um das komplexe zeitlich-räumliche
Expressionsmuster des Follistatin-Gens während der Embryonalentwicklung (s. Abb.
3.17 und 3.18) zu generieren. Um diese Frage zu beantworten, wurden transgene
Mäuse hergestellt, die das Reportergen β-Galaktosidase (lacZ) unter der Kontrolle
von Foll 2,8 kb exprimieren (Foll 2,8 kb-lacZ, s. Abb. 3.19, 3.20 u. 3.21). Zusätzlich
wurden transgene Mäuse produziert, in denen der lacZ-Reporter unter der Kontrolle
von Foll 2,8 kb 1-4 mut, dem Follistatin-Promotorfragment mit vier mutierten
LEF/TCF-Bindestellen, exprimiert wurde (Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ, s. Abb. 3.22 u.
3.23). Mit diesem Ansatz sollte geklärt werden, ob der Follistatin-Promotor auch in
vivo durch den Wnt/β−Catenin-Signalweg reguliert wird.
Die Herstellung der transgenen Tiere wird im Methodenteil beschrieben (s. 2.5.8.).
Anders als bei den in vivo Untersuchungen zur Axin2-Regulation mit transienten
Transgenen (s. Abschnitt 3.5.4.) wurden mit den beiden Konstrukten Foll 2,8 kb-lacZ
und Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ stabile transgene Mauslinien hergestellt. Das bedeutet,
dass die injizierten Embryonen nach erfolgter Reimplantation von den Leihmüttern
bis zur Geburt ausgetragen wurden. Nach der Entwicklung zur Geschlechtsreife
wurden die Tiere, die das Reportergen stabil in ihr Genom integriert hatten, mit
Wildtyp-Mäusen gekreuzt und die Nachkommen erneut genotypisiert. Männliche
Nachkommen, denen das lacZ-Transgen vererbt worden war, wurden dann mit
weiblichen Wildtyp-Mäusen verpaart. Die gezeugten Embryonen wurden in den
entsprechenden Entwicklungsstadien präpariert und die β-Galaktosidase-Aktivität
durch X-Gal Färbung nachgewiesen (s. 2.5.10.).
3.6.4.1. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des 2,8 kb
Follistatin-Promotors
Ein Versuch zur Herstellung transgener Mäuse mit dem Wildtyp-Konstrukt Foll 2,8
kb-lacZ resultierte in der Geburt von insgesamt 20 Mäusen, von denen fünf das lacZTransgen in ihr Genom integriert hatten (25 %). Alle fünf Mäuse gaben das Transgen
Seite 110
Ergebnisse
an ihre Nachkommen weiter. Die transgenen Linien wurden nach der fortlaufenden
Numerierung der Mäuse aus der ersten Generation folgendermaßen benannt: Foll 2,8
kb-lacZ Nr. 5, Nr. 11, Nr. 14, Nr. 16 und Nr. 19.
Die Ergebnisse der X-Gal Färbung von Embryonen der verschiedenen transgenen
Mauslinien sind in Tabelle 3.14 schematisch dargestellt. Um eine Übersicht über die
Färbungsmuster zu geben, werden in Abb. 3.19 die X-Gal gefärbten Embryonen der
verschiedenen Foll 2,8 kb-lacZ Mauslinien in den Entwicklungsstadien E 12,5 d.p.c.
und E 14,5 d.p.c. gezeigt.
Mauslinie
Nr. 5
Nr. 11
Entw.stadium
Nr. 14
Nr. 16
Nr. 19
-
-
Blaufärbung ja/ nein (+/-)
E 7,5 d.p.c.
-
E 8,5 d.p.c.
-
-
-
-
E 9,5 d.p.c.
-
-
(+)
(+)
-
+
+
E 10,5 d.p.c.
+
E 11,5 d.p.c.
-
+
-
+
+
E 12,5 d.p.c.
-
+
+
+
+
E 13,5 d.p.c.
-
+
+
+
+
E 14,5 d.p.c.
-
+
-
+
+
lacZ aktiv
nein
ja
ja
ja
ja
Tab. 3.14. Übersicht über die Ergebnisse der X-Gal Färbungen der transgenen Embryonen mit
dem Wildtyp-Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ. Mit dem oben gezeigten Konstrukt wurden stabile
transgene Mauslinien generiert. Die Bezeichnung der einzelnen Elemente in Foll 2,8 kb ist Abb. 3.12
zu entnehmen; das Konstrukt enthält die LEF/TCF-Bindestellen 1-4. Die Embryonen von fünf
verschiedenen Mauslinien wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien präpariert und die Expression
des β-Galaktosidase-Reportergens durch „whole mount“ X-Gal Färbungen nachgewiesen. Vorhandene
β-Galaktosidase-Aktivität ist durch ein Plus-Zeichen dargestellt, wenn keine Blaufärbung erzielt
wurde, ist dies durch ein Minus-Zeichen angegeben. Eingeklammerte Plus-Zeichen weisen auf eine
Expression des lacZ-Reportergens in Geweben hin, in denen das endogene Follistatin-Gen nicht
exprimiert wird (ektopische Expression). Bis auf die transgene Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 5 ließ sich in
allen Linien die Expression des lacZ-Transgens zumindest in einigen Entwicklungsstadien nachweisen
(vgl. Abb. 3.19).
Tab. 3.14 ist zu entnehmen, dass an Tag 7,5 p.c. und 8,5 p.c. das lacZ-Transgen in
keiner der untersuchten Linien exprimiert wurde. Der früheste Zeitpunkt, an dem eine
positive X-Gal Färbung in den Embryonen beobachtet werden konnte, war etwa 9,5
Tage nach der Befruchtung, allerdings nur in Embryonen der transgenen Linien Foll
2,8 kb-lacZ Nr. 14 und 16. Die beobachtete Blaufärbung war jedoch in beiden Fällen
nur schwach ausgeprägt und korrespondierte nicht mit der endogenen Expression des
Seite 111
Ergebnisse
Abb. 3.19. Übersicht über die XGal-Färbemuster der transgenen
Embryonen mit dem WildtypReporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ
an Tag 12,5 p.c. und 14,5 p.c.
(A) Die Embryonen der transgenen
Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr.
16 u. Nr. 19 zeigen weitgehend
übereinstimmende X-Gal-Färbemuster. An Tag 12,5 p.c. ist u. a. die
Mittelhirn-Region der Embryonen
stark gefärbt. Starke β-Galaktosidase-Aktivität wurde auch in
proximalen Abschnitten der Gliedmaßen und zentralen Teilen des
Rumpfes nachgewiesen. Die Färbung im Rumpf der Embryonen
folgt einem segmentalen Muster –
bei den gefärbten Strukturen handelt
es sich u. a. um Muskelvorläuferzellen, die aus den myotomalen
Abschnitten der Somiten hervorgehen. In den transgenen Linien
Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 ist
das lacZ-Transgen an Tag 12,5 p.c.13,5 p.c. in den Schnurrhaarfollikeln exprimiert.
Fortsetzung siehe nächste Seite.
Seite 112
Ergebnisse
An Tag 14,5 p.c. wird das lacZ-Transgen in den transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 u.
Nr. 19 in der Muskelschicht der Hypodermis exprimiert. Weite Teile des Rumpfs und einzelne Muskelfasern in der Kopfregion sind intensiv blau gefärbt. Auch in den Gliedmaßen wird das lacZ-Transgen
noch exprimiert, die Expression in der Mittelhirn-Region ist an Tag 14,5 p.c. jedoch nicht mehr zu
beobachten. (B) In den Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 5 wurde keine βGalaktosidase-Aktivität nachgewiesen. Die transgene Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 exprimiert das
lacZ-Transgen an Tag 12,5 p.c.- 13,5 p.c. in Mittelhirn, Gliedmaßen und im Rumpf des Embryos (s.o.).
Zusätzlich sind jedoch weite Teile des Neuralrohrs und des Gefäßsystems blau gefärbt (ektopische
Expression). An Tag 14,5 p.c. lässt sich in den Embryonen dieser Linie kaum noch β-GalaktosidaseAktivität nachweisen (vgl. Tab. 3.14). Vergrößerungen; E 12,5 dpc: 5,5x.; E 14,5 dpc: 4x.
Follistatin-Gens, auf die bildliche Darstellung der Embryonen wird deshalb
verzichtet. Transgene Embryonen der Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, 16 und 19
zeigten von Tag 10,5 p.c. bzw. 11,5 p.c. an eine Blaufärbung in allen untersuchten
späteren Entwicklungsstadien (bis Tag 14,5). Das beobachtete Färbungsmuster war in
allen drei Linien sehr ähnlich (s. Abb. 3.19 A). Dagegen zeigten Embryonen der
Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 nur an Tag 12,5 p.c. und Tag 13,5 p.c. eine positive
X-Gal-Färbung. Die Färbung (s. Abb. 3.19 B) überlappte zu diesen Zeitpunkten
deutlich mit dem Färbungsmuster, das in den Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, 16 und
19 beobachtet wurde, war aber zusätzlich auf andere Gewebe ausgedehnt. Am Ende
dieses Kapitels wird darauf noch einmal eingegangen. Die transgene Linie Foll 2,8
kb-lacZ Nr. 5 war die einzige, für die in keinem der untersuchten Entwicklungsstadien
eine Aktivität des lacZ-Reportergens nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 3.19 B).
Die X-Gal Färbungsmuster der Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ
Nr. 11 werden in den Abb. 3.20 und 3.21 noch einmal genauer dargestellt und im Text
erläutert. Abb. 3.20 zeigt Gesamtaufnahmen von Embryonen der Entwicklungsstadien
E 11,5 d.p.c bis E 14,5 d.p.c. nach der X-Gal-Färbung. In Abb. 3.21 sind
Gewebeschnitte durch einen X-Gal gefärbten Embryo am Tag 12,5 p.c. zu sehen. Wie
schon erwähnt, konnte in Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr.
11 die Aktivität des lacZ-Reportergens frühestens 10,5 Tage nach der Befruchtung
nachgewiesen werden. Die X-Gal Färbung dieser Embryonen lieferte aber lediglich
eine sehr schwache Blaufärbung in der Region des Mittelhirns und im Rumpf der
Embryonen, auf eine Darstellung wurde deshalb verzichtet. Abb. 3.20 A zeigt einen
X-Gal gefärbten Embryo am Tag 11,5 p.c. Auffallend ist zunächst die starke
Blaufärbung in der Region des Mittelhirns. Deutlich zu sehen ist auch eine
segmentale Färbung im Rumpf des Embryos und die Expression des lacZ-Transgens
in den Gliedmaßen. Zusätzlich wurde im Bereich des sich entwickelnden Ohrs und
Seite 113
Ergebnisse
Abb. 3.20. Genauere Darstellung der X-Gal-Färbemuster für Embryonen der transgenen Linie
Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11. (A) E 11,5 dpc; Vergr. 12,5x . (B) E 12,5 dpc; Vergr. 10x. (C) E 13,5 dpc;
Vergr. 8x. (D) E14,5 dpc; Vergr. 7,5x. Nähere Erläuterungen siehe Text u. Abb. 3.19.
unterhalb des Auges eine Blaufärbung beobachtet. Bei den Zellen, die das lacZTransgen an Tag 11,5 p.c. exprimieren, handelt es sich teilweise um
Muskelvorläuferzellen. Experimente mit Hühnerembryonen haben gezeigt, dass
Follistatin in Muskelvorläuferzellen exprimiert wird (Amthor et al., 1996; Connolly et
al., 1995). Zudem stimmt das Muster der lacZ-Expression in Rumpf und Gliedmaßen
der transgenen Mausembryonen weitgehend mit dem Expressionsmuster des
muskelspezifischen Transkriptionsfaktors Myf-5 in diesem Entwicklungsstadium
Seite 114
Ergebnisse
überein (Zweigerdt et al., 1997). Abb. 3.20 B zeigt, dass in dem 12,5 Tage alten
Embryo im Wesentlichen die gleichen Strukturen angefärbt sind. Das Ausmaß der
Blaufärbung im Mittelhirn scheint etwas reduziert, die Blaufärbung im Rumpf und in
den Gliedmaßen ist aber ausgedehnter als in dem Embryo am Tag 11,5 p.c. Zudem
beginnt am Tag 12,5 p.c. die Expression des lacZ-Transgens in den
Schnurrhaarfollikeln des Embryos. Abb. 3.20 C zeigt einen X-Gal gefärbten Embryo
am Tag 13,5 p.c. Wieder sind die Follikel der Schnurrhaare blau gefärbt, sowie
ausgedehnte Abschnitte in Rumpf und Gliedmaßen des Embryos. Die Blaufärbung im
Bereich des Mittelhirns ist zu diesem Zeitpunkt nur noch schwach ausgeprägt. Die XGal Färbung eines Embryos am Tag 14,5 der Embryonalentwicklung ergab ein
deutlich verändertes Färbungsmuster. Zu diesem Zeitpunkt tritt eine starke
subepidermale Färbung auf, die weite Teile des Embryorumpfs, mit Ausnahme der
dorsalen Mittellinie, erfasst. Auch am Kopf des Embryos sind einzelne Partien
subepidermal gefärbt, besonders im Bereich der Wangen und über dem Auge. Bei
stärkerer Vergrößerung offenbart sich die faserige Struktur dieser subepidermalen
Färbung; vor allem im anterioren Bereich ist dies deutlich zu erkennen. Bei der
gefärbten Struktur handelt es sich um die Muskelschicht der Hypodermis (Panniculus
carnosus), die bei höheren Säugetieren (z. B. Mensch) nur noch rudimentär
ausgebildet ist.
In Abb. 3.21 sind mehrere Längsschnitte durch einen 12,5 Tage alten, X-Gal
gefärbten Embryo zu sehen. Abbildung 3.21 A zeigt schematisch die ungefähre
Schnittführung durch den Embryo. Abb. 3.21 B dokumentiert die Blaufärbung im
proximalen Teil der vorderen Gliedmaße in den Bereichen, in denen auch das
endogene Follistatin-Gen exprimiert ist (vgl. Abb. 3.18 B). Eine Expression des lacZTransgens im Bereich der sich entwickelnden Finger wurde jedoch nicht detektiert
(s.u.). Abb. 3.21 C zeigt u.a. eine lacZ-Expression in einer Reihe von
Muskelvorläuferzellen in Kopf und Rumpf des Embryos sowie an der Basis der
Vordergliedmaße. In Abb. 3.21 D und E ist zu sehen, dass die Zellen zwischen den
Rippenanlagen, die sich u.a. zur Zwischenrippenmuskulatur entwickeln, deutlich blau
gefärbt sind. In Abb. 3.21 D ist zudem eine lacZ-Expression in den folgenden
Strukturen zu erkennen: in der Schulterregion, in der hinteren Gliedmaße und in
mehreren Gruppen von Zellen um das Auge. Ein Vergleich mit Abb. 3.18 zeigt, dass
in allen diesen Strukturen auch das endogene Follistatin-Gen exprimiert wird. Bei
dem Schnitt, der in Abb. 3.21 E gezeigt wird, liegt die Mittelhirn-Region in der
Schnittebene. Eine starke Blaufärbung dieser Region, insbesondere in der rostralen
Hälfte, ist zu sehen. In anderen Hirnabschnitten wird das lacZ-Transgen aber offenbar
Seite 115
Ergebnisse
nicht exprimiert, da dort keine Blaufärbung zu beobachten ist, auch nicht im Bereich
des Innenohrs, in dem Follistatin stark exprimiert wird (vgl. Abb. 3.18 C). In Abb.
3.21 F ist zu sehen, dass auch in der Zunge und in den mesenchymalen Zellen, die an
das Riechepithel angrenzen, das lacZ-Transgen nicht exprimiert wird, obwohl auch
diese Gewebe starke Follistatin-Expression aufweisen (vgl. Abb. 3.18 C und D).
Abb. 3.21. Sagittale Schnitte durch einen X-Gal gefärbten E 12,5 dpc Embryo der transgenen
Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11. (A) Schematische Darstellung der Schnittführung durch einen12,5 Tage
alten Embryo. Es wurden sagittale Schnitte hergestellt. (B-F) Gewebeschnitte nach „whole mount“ XGal-Färbung und Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“. Abkürzungen: hG, hintere Gliedmaße; Mh,
Mittelhirn; mK, Kondensation mesenchymaler Zellen – wahrscheinlich Muskelvorläuferzellen; Mvz,
Muskelvorläuferzellen; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; vG, vordere Gliedmaße; Zr, zukünftige
Zwischenrippenregion. Vergrößerung: 8x. Nähere Erläuterungen siehe Text.
Bis auf geringe Abweichungen zeigen die Embryonen der transgenen Mauslinien Foll
2,8 kb-lacZ Nr. 16 und Nr. 19 die gleichen Färbungsmuster, wie sie bei der Mauslinie
Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11 beobachtet wurden. Deshalb wird an dieser Stelle auf eine
detailliertere bildliche Darstellung der restlichen transgenen Mauslinien verzichtet.
Lediglich ein Unterschied im Färbungsmuster zwischen den Mauslinien Foll 2,8 kblacZ Nr. 19 und Nr. 11 bzw. Nr. 16 soll hier erwähnt werden. Bei der Mauslinie Foll
2,8 kb-lacZ Nr. 19 zeigen die Schnurrhaarfollikel an Tag 12,5 und 13,5 der
Seite 116
Ergebnisse
Embryonalentwicklung keine β-Galaktosidase-Expression, bei den Mauslinien Foll
2,8 kb-lacZ Nr. 11 und Nr. 16 sind diese nach der X-Gal Färbung jedoch deutlich blau
gefärbt (s. Abb. 3.19 A).
Wie schon erwähnt, ist das lacZ-Transgen in der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14
nur an Tag 12,5 und 13,5 der Embryonalentwicklung deutlich exprimiert. Zu diesen
Zeitpunkten überlappt die bei der X-Gal Färbereaktion beobachtete Blaufärbung
einerseits mit der lacZ-Expression in den Mauslinien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16
und Nr. 19, dehnt sich aber auch auf Gewebe aus, die in letzteren nicht gefärbt sind.
Zum Beispiel ist in Abb. 3.19 B zu sehen, dass an Tag 12,5 der
Embryonalentwicklung in der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 eine leichte
Blaufärbung der beiden Vorderhirnventrikel auftritt. Zusätzlich sind während dieses
Entwicklungsstadiums Teile des Gefäßsystems im Rumpf und im Kopf des Embryos
angefärbt. Am Tag 13,5 p.c. ist die Aktivität der β-Galaktosidase in Embryonen der
Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 schwach (Embryo nicht gezeigt), verglichen mit
den anderen Mauslinien. Interessant ist aber, dass in den Gliedmaßen am Tag 13,5
p.c. die proximalen Abschnitte der sich entwickelnden Finger blau gefärbt sind, was
in den restlichen transgenen Linien bisher nicht beobachtet wurde. Abb. 3.17 F zeigt,
dass auch das endogene Follistatin-Gen in den Fingern exprimiert wird.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass das 2,8 kb große Fragment des FollistatinPromotors, das zur Steuerung der β-Galaktosidase-Expression in den transgenen
Embryonen eingesetzt wurde, das komplexe Expressionsmuster von Follistatin nur
teilweise wiedergeben kann. Insbesondere konnte in den frühen Entwicklungsstadien
(E 7,5 – 8,5 d.p.c.) keine lacZ-Expression nachgewiesen werden, obwohl Follistatin
zu diesem Zeitpunkt bereits exprimiert wird (s. Abb. 3.17).
3.6.4.2. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des mutierten 2,8 kb
Follistatin-Promotors
Zwei Versuche zur Herstellung transgener Mäuse mit dem Konstrukt Foll 2,8 kb 1-4
mut-lacZ resultierten in der Geburt von insgesamt 28 Mäusen, von denen fünf das
lacZ-Transgen in ihr Genom integriert hatten (17,9 %). Eine dieser fünf Mäuse starb
vor der Geschlechtsreife, die anderen vier gaben das Transgen an ihre Nachkommen
weiter. Die transgenen Linien wurden nach der fortlaufenden Numerierung der Mäuse
aus der ersten Generation folgendermaßen benannt: Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1,
Nr. 6, Nr. 17, und Nr. 22.
Seite 117
Ergebnisse
Die Ergebnisse der X-Gal Färbung von Embryonen der verschiedenen transgenen
Mauslinien sind in Tabelle 3.15 schematisch dargestellt. Um eine Übersicht über die
Färbungsmuster zu geben, werden in Abb. 3.22 die X-Gal gefärbten Embryonen der
verschiedenen Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Mauslinien in den Entwicklungsstadien E
12,5 d.p.c. und E 14,5 d.p.c. gezeigt.
Mauslinie
Nr. 1
Entw.stadium
Nr. 6
Nr. 17
Nr. 22
Blaufärbung ja/nein (+/-)
E 10,5 d.p.c.
-
-
E 11,5 d.p.c.
+
+
-
+
E 12,5 d.p.c.
+
+
-
+
E 13,5 d.p.c.
+
+
-
+
E 14,5 d.p.c.
+
+
-
+
lacZ aktiv
ja
ja
nein
ja
Tab. 3.15. Übersicht über die Ergebnisse der X-Gal Färbungen der transgenen Embryonen mit
dem mutierten Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ. Mit dem oben gezeigten Konstrukt
wurden stabile transgene Mauslinien generiert. Die Bezeichnung der einzelnen Elemente in Foll 2,8 kb
1-4 mut ist Abb. 3.12 zu entnehmen; das Konstrukt enthält die mutierten LEF/TCF-Bindestellen 1-4
(durchkreuzt dargestellt). Die Embryonen von vier verschiedenen transgenen Mauslinien wurden zu
verschiedenen Entwicklungsstadien präpariert und die Expression des β-Galaktosidase-Reportergens
durch „whole mount“ X-Gal Färbungen nachgewiesen. Vorhandene β-Galaktosidase-Aktivität ist
durch ein Plus-Zeichen dargestellt, wenn keine Blaufärbung erzielt wurde, ist dies durch ein MinusZeichen angegeben. Bis auf die transgene Linie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 17 ließ sich in allen
Linien die Expression des lacZ-Transgens zwischen Tag 11,5 p.c.– 14,5 p.c. nachweisen (vgl. Abb.
3.22).
Tab. 3.15 ist zu entnehmen, dass in den Embryonen von drei der vier untersuchten
transgenen Mauslinien die Expression der β-Galaktosidase unter der Kontrolle des
Foll 2,8 kb 1-4 mut-Promotors nachgewiesen werden konnte, und zwar bei den
Mauslinien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6 und Nr. 22. Die Embryonen der
vierten transgenen Linie, Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 17, zeigten zumindest in den
untersuchten Entwicklungsstadien keinerlei Blaufärbung im Verlauf der X-Gal
Färbereaktion.
Abb. 3.22 zeigt die Embryonen der vier transgenen Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ
Nr. 1, Nr. 6, Nr. 17 und Nr. 22 an Tag 12,5 bzw. 14,5 der Embryonalentwicklung
nach der X-Gal Färbung. Die Embryonen der transgenen Linien Foll 2,8 kb 1-4 mutlacZ Nr. 1, Nr. 6 und Nr. 22 zeigen jeweils eine sehr ähnliche Verteilung der lacZExpression. Eine leichte Blaufärbung der Vorderhirnventrikel (s. Abb. 3.22; E 12,5),
Seite 118
Ergebnisse
Abb. 3.22. Übersicht über die X-Gal-Färbemuster der transgenen Embryonen mit dem
mutierten Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ an Tag 12,5 p.c. und 14,5 p.c. In
Embryonen der transgenen Linie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 17 konnte zu keinem Zeitpunkt eine
Expression des lacZ-Transgens nachgewiesen werden. Die Embryonen der transgenen Linien Foll 2,8
kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6 u. Nr. 22 exprimieren das lacZ-Transgen und zeigen weitgehend
überlappende X-Gal-Färbemuster. Die Intensität der Färbung ist jedoch bei den 12,5 Tage alten
Embryonen der Linie Nr. 22 geringer als bei gleich alten Embryonen der beiden anderen trangenen
Linien. Die Färbemuster der Embryonen (transgene Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6 u. Nr.
22) mit dem mutierten Reporterkonstrukt entsprechen fast völlig den Mustern, die sich bei der X-GalFärbung der transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 u. Nr. 19 mit dem WildtypReporterkonstrukt ergeben haben (vgl. Abb. 3.19 A). D.h. an Tag 12,5 p.c. sind neben der MittelhirnRegion u.a. Muskelvorläuferzellen in den Gliedmaßen und im Rumpf der Embryonen blau gefärbt.
Jedoch konnte in keiner der transgenen Linien, die mit dem mutierten Reporterkonstrukt hergestellt
wurden, die Expression des lacZ-Transgens in den Schnurrhaarfollikeln von 12,5-13,5 Tage alten
Embryonen nachgewiesen werden. An Tag 14,5 p.c. entsprechen sich die Färbemuster der Embryonen,
die mit den beiden unterschiedlichen Reporterkonstrukten hergestellt wurden (Wildtyp-Konstrukt bzw.
Konstrukt mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen) ebenfalls (vgl. Abb. 3. 19 A), d.h. zu diesem
Zeitpunkt tritt eine intensive Färbung der Muskelschicht der Hypodermis auf. Vergrößerungen; E 12,5
dpc: 5,5x.; E 14,5 dpc: 4x.
eine Färbung der sich entwickelnden Finger (s. Abb. 3.22; E 14,5 d.p.c.) sowie eine
starke Blaufärbung des Auges tritt aber jeweils nur in den Embryonen der Mauslinie
Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1 auf, nicht in den Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6
und Nr. 22. In Abb. 3.23 sind die X-Gal Färbungsmuster der Embryonen (E 11,5 – E
14,5 d.p.c.) der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6 genauer
dargestellt.
Seite 119
Ergebnisse
Abb. 3.23. Vergrößerte Darstellung der X-Gal-Färbemuster für Embryonen der transgenen
Linie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6. (A) E 11,5 dpc; Vergr. 12,5x. (B) E 12,5 dpc; Vergr. 10x.
(C) E 13,5 dpc; Vergr. 8x. (D) E14,5 dpc; Vergr. 7,5x. Nähere Erläuterungen siehe Text u. Abb. 3.22.
Vergleicht man die Färbungsmuster der Embryonen in Abb. 3.22 und 3.23 mit den
bereits besprochenen Färbungsmustern der transgenen Mauslinien Foll 2,8 kb-lacZ
Nr. 11, Nr. 16 und Nr. 19, die in Abb. 3.19 und 3.20 dargestellt sind, so stellt man
fest, dass weitestgehend Übereinstimmung herrscht. Für die Gewebespezifität der
lacZ-Expression unter der Kontrolle des mutierten Promotors Foll 2,8 kb 1-4 mut gilt
also im Wesentlichen dasselbe, was in Abschnitt 3.6.4.1. über die transgenen Mäuse
geschrieben wurde, die das Wildtyp-Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ enthalten.
Seite 120
Ergebnisse
Ein kleiner Unterschied zwischen den X-Gal Färbungsmustern, die mit den beiden
verschiedenen Reporterkonstukten erzielt wurden, besteht jedoch. In den Embryonen
der Mauslinien, die das lacZ-Transgen unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb 1-4 mut
exprimierten, wurde am Tag 12,5 bzw. 13,5 der Embryonalentwicklung keine bzw.
nur eine sehr schwache Blaufärbung in den Schnurrhaarfollikeln festgestellt (s. Abb.
3.22 u. 3.23). Dagegen konnte bei zwei der transgenen Mauslinien, die mit dem
Wildtyp-Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb–lacZ hergestellt worden waren (Foll 2,8 kblacZ Nr. 11 und Nr. 16), eine starke lacZ-Expression in den Schnurrhaarfollikeln der
Embryonen an Tag 12,5 p.c. und 13,5 p.c. eindeutig nachgewiesen werden (s. Abb.
3.19 u. 3.20). Dies ist jedoch der einzige Hinweis auf einen Expressionsunterschied
zwischen den Reporterkonstrukten Foll 2,8 kb–lacZ und Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ, der
bei der Analyse der X-Gal Färbungsmuster in Embryonen der Entwicklungsstadien
E 10,5 d.p.c. - E 14,5 d.p.c. festgestellt werden konnte. Auch die Analyse von
Gewebe-schnitten gefärbter Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb 1-4
mut-lacZ Nr. 6 ergab keine Hinweise auf weitere Veränderungen der lacZ-Expression
durch die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen in dem FollistatinPromotorfragment.
Abgesehen von der fehlenden Expressionsdomäne in den Follikeln der Schnurrhaare,
kann das Promotorfragment Foll 2,8 kb 1-4 mut mit den mutierten LEF/TCFBindestellen die Expression des lacZ-Transgens also in den gleichen Geweben
aktivieren, wie das Wildtyp-Promotorfragment Foll 2,8 kb. Angesichts der
Variabilität der lacZ-Expression in den Schnurrhaarfollikeln der Embryonen, die das
Wildtyp-Konstrukt Foll 2,8 kb–lacZ enthalten (s. 3.6.4.1.), und der geringen Anzahl
an transgenen Mauslinien mit dem mutierten Konstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ, die
bisher untersucht wurden, ist jedoch noch keine endgültige Aussage darüber möglich,
ob die lacZ-Expression in den Schnurrhaarfollikeln tatsächlich vom Vorhandensein
funktioneller LEF/TCF-Bindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor abhängt.
Seite 121
Diskussion
4. Diskussion
Die Entwicklung eines komplexen Organismus aus der befruchteten Eizelle im
Verlauf der Ontogenese ist ein faszinierender Vorgang. Dabei wird aus einer einzigen
Zelle in relativ kurzer Zeit und in reproduzierbarer Weise ein funktioneller Körper aus
Milliarden von Zellen geformt. Umso erstaunlicher ist, dass die Zahl an Signalwegen
zur interzellulären Kommunikation, die an der zeitlich-räumlichen Koordination der
notwendigen Entwicklungsschritte beteiligt sind, durchaus überschaubar ist. Dies gilt
auch, wenn man den Blick über Artgrenzen hinweg richtet – die meisten
entwicklungsrelevanten Signalwege sind auch evolutionär stark konserviert.
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist ein Vertreter für einen solchen evolutionär
konservierten Signalweg. Ebenso mannigfaltig wie die Organismen, in denen bisher
Wnt-Gene gefunden wurden, sind die Prozesse, die durch die Wnt-Proteine, über
mindestens drei divergierende Wnt-Signalwege (s. Abschnitt 1.4.), gesteuert werden.
Der wiederholte Griff in die molekulare Werkzeugkiste im Verlauf der Evolution hat
dazu geführt, dass der am besten untersuchte Wnt/β-Catenin-Signalweg in
Vertebraten etwa an der anterior-posterioren Achsenbildung während der frühen
Embryogenese beteiligt ist (s. 1.5.1. u. 1.5.2.), aber z. B. auch bei der Organogenese
der Niere (Stark et al., 1994) oder der Homöostase des Darmepithels (Korinek et al.,
1998; Lickert et al., 2001) eine wichtige Rolle spielt. Das bifunktionelle Protein βCatenin ist dabei das zentrale Element des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (s. 1.4.1.). βCatenin bindet an Transkriptionsfaktoren der LEF/TCF-Familie und steuert über seine
Funktion als Coaktivator die Transkription von Zielgenen. Auf diesem Weg
beeinflusst der Wnt/β-Catenin-Signalweg Proliferation, Differenzierung und
Schicksal von Zellen. Aus den oben genannten Zusammenhängen wird deutlich, wie
wichtig Erkenntnisse darüber sind, welche Zielgene vom Wnt/β-Catenin-Signalweg
angesteuert werden. Das Verständnis eines komplexen Entwicklungsvorgangs setzt
das Wissen um die molekularen Mechanismen, die diesem Vorgang zu Grunde liegen,
unmittelbar voraus. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, bisher unbekannte Zielgene des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu identifizieren und deren Wnt-abhängige Regulation
nach Möglichkeit in bestimmte Entwicklungsvorgänge einzuordnen.
Seite 122
Diskussion
4.1.
Zielgen-Screening auf der Grundlage des ES-ZellCokultursystems
Das ES-Zell Cokultursystem, das von Arnold et al. etabliert wurde und mit dessen
Hilfe schon die beiden Wnt/β-Catenin-Zielgene Brachyury und Cdx1 identifiziert
werden konnten (Arnold et al., 2000; Lickert et al., 2000), bildete in modifizierter
Form die Grundlage für die Suche nach weiteren Zielgenen. Die dabei erzielten
Ergebnisse werden an dieser Stelle diskutiert. Dabei werden zunächst ausführlich die
Ergebnisse besprochen, die mit den Affymetrix-Microarrays erzielt wurden. Im
Anschluss werden die weiteren Ergebnisse diskutiert, die sich bei der Analyse der
Zielgen-Kandidaten Axin2 und Follistatin ergaben.
4.1.1.
Anteil der mit den Microarrays in ES-Zellen detektierten Transkripte
Zunächst soll darauf eingegangen werden, welcher Anteil der auf den Microarrays
repräsentierten Gene in den ES-Zellen detektiert werden konnte. Es gibt bisher nur
wenige Publikationen, in denen Genexpressionsprofile von ES-Zellen beschrieben
sind. Kelly et al. verwendeten cDNA-Microarrays von Clontech, um eine
Expressionsprofil von ES-Zellen zu erstellen (Kelly und Rizzino, 2000). Von ca. 600
Genen, die mit diesen Microarrays detektiert werden können, waren etwa 50 % in den
ES-Zellen exprimiert. In zwei neueren Studien (Ivanova et al., 2002; Ramalho-Santos
et al., 2002) wurde das Transkriptom von embryonalen, neuronalen und
hämatopoetischen Stammzellen von Mäusen mit Hilfe von MG-U74v2-Arrays
untersucht und paarweise verglichen. Ivanova et al. verwendeten dabei den
kompletten Satz der MG-U74v2-Arrays (sub A, B, C), mit denen insgesamt über
36000 Gene bzw. ESTs nachgewiesen werden können (Ivanova et al., 2002). Etwa 39
% davon waren in der untersuchten ES-Zelllinie (CCE) exprimiert.
Abschnitt 3.2. der hier vorliegenden Arbeit ist zu entnehmen, dass mit den Mu6500Arrays im Schnitt 38,2 % (1. Hybridisierung) der etwa 6500 repräsentierten Gene
bzw. ESTs in den ES-Zellen der lacZ-Kontrolle detektiert werden konnten. Bei den
Mu19k-Arrays (Probensätze für ca. 19000 Gene/ESTs) lag die Rate an detektierten
Transkripten bei 43 %, bei den MG-U74A-Arrays (Probensätze für ca. 12000
Gene/ESTs) im Schnitt bei 43,8 %, war also jeweils deutlich höher, als bei den
Mu6500-Arrays. Geht man von einer mehr oder weniger zufälligen Verteilung der auf
den verschiedenen Oligonukleotid-Microarrays repräsentierten Gene bzw. ESTs aus,
so kann man Vergleiche zwischen den einzelnen Experimenten anstellen. Zunächst
Seite 123
Diskussion
fällt auf, dass die eigenen Daten bezüglich des Anteils exprimierter Gene in ES-Zellen
prinzipiell vergleichbar sind mit den Daten von Ivanova et al (Ivanova et al., 2002).
Es wird aber auch deutlich, dass mit den Mu19k-Arrays und den MG-U74A-Arrays
im Schnitt ein höherer Prozentsatz (über 43 %) der repräsentierten Transkripte in den
ES-Zellen detektiert wurde, als dies mit den Mu6500-Arrays (39,1 %) oder bei Ivanov
et al. (39 %, MG-U74v2-Arrays) der Fall war. Interessant ist, dass ein höherer
Prozentsatz an Transkripten gerade in den Versuchen detektiert wurde, in denen die
doppelte Menge an fragmentierter cRNA (30 µg statt der empfohlenen 15 µg) für die
Hybridisierung der Microarrays eingesetzt wurde. Möglicherweise führt diese
Erhöhung der eingesetzten cRNA-Menge tatsächlich dazu, dass schwach exprimierte
Gene zuverlässiger detektiert werden können.
4.1.2.
Expressionsunterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten
ES-Zellen basierend auf den Microarray-Daten
Nun soll auf die Zahl der Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-induzierten ESZellen und den ES-Zellen der lacZ-Kontrolle in den jeweiligen Experimenten
eingegangen werden, die mit Hilfe der Microarrays detektiert wurden. Nimmt man
Wnt1-induzierte und Wnt1-reprimierte Transkripte zusammen, so wurden mit den
Mu6500-Arrays (ca. 6500 Gene/ESTs) 31 Expressionsunterschiede detektiert (82
Expressionsunterschiede nach der zweiten Hybridisierung). Die Hybridisierung der
Mu19k-Arrays (ca. 19000 Gene/ESTs) und der anschließende Vergleich zwischen
Wnt1-Experiment und lacZ-Kontrolle lieferte eine deutlich größere Zahl an
differentiell exprimierten Genen. Im ersten Paralleversuch wurden 190
Expressionsunterschiede detektiert, im zweiten Parallelversuch waren es 226. Die
MG-U74A-Arrays (ca. 12000 Gene/ESTs) wurden mit cRNA-Proben aus ES-ZellCokulturen nach 10 h bzw. 18 h Cokulturdauer hybridisiert, wiederum getrennt für
Wnt1-behandelte ES-Zellen und lacZ-Kontrolle. Der Vergleich der Wnt1- und lacZcRNA-Proben nach 10 h Cokulturdauer lieferte 54 bzw. 23 Expressionsunterschiede
in zwei parallelen Versuchen, nach 18 h wurden 37 bzw. 36 differentiell exprimierte
Gene gezählt. Dieser Überblick zeigt, dass die Zahl der beobachteten
Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen nach
der Kontrollbehandlung in allen Experimenten gering war (zwischen 23 und 226),
verglichen mit der Zahl der untersuchten Transkripte (zwischen 6500 und 19000).
Bildet man einen Mittelwert aus allen Experimenten, so wurden im Schnitt nur 0,66
% der auf den Microarrays repräsentierten Gene bzw. etwa 1,66 % der tatsächlich
Seite 124
Diskussion
detektierten Gene (bei einer Detektionsrate von 40 %) als differentiell exprimiert
erkannt.
Wie sind diese Zahlen einzuordnen? Nach Angaben von Affymetrix liegt die zu
erwartende Rate an „falsch Positiven“ deutlich unter 0,5 % (Dr. Matthias Prucha,
Affymetrix; persönliche Kommunikation), wenn die selbe cRNA-Probe aufgeteilt,
anschließend in parallelen Versuchen auf identischen Oligonukleotid-Microarrays
analysiert wird, und die Expressionsdaten danach miteinander verglichen werden. Das
heißt, wenn keine Expressionsunterschiede vorhanden sind, werden weniger als 0,5 %
der repräsentierten Transkripte als differentiell exprimiert angezeigt. Dies wird auch
durch Ergebnisse einer Studie zur Reproduzierbarkeit von Microarray-Daten bestätigt
(Piper et al., 2002). Diese Betrachtung bestätigt einerseits, dass Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen der lacZ-Kontrolle
vorlagen, verdeutlicht aber andererseits, dass die Zahl der detektierten
Expressionsunterschiede nicht sehr hoch war.
Dieses Ergebnis lässt sich in zwei Richtungen deuten: entweder waren tatsächlich
nicht mehr Expressionsunterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten ESZellen vorhanden, oder ein Teil der vorhandenen Expressionsunterschiede konnte mit
Hilfe der Microarrays nicht zuverlässig detektiert werden. Beide Aspekte werden in
den folgenden Abschnitten diskutiert. An dieser Stelle soll aber noch auf die
Ergebnisse hingewiesen werden, die von Willert et al. publiziert wurden (Willert et
al., 2002). Diese Arbeitsgruppe verfolgte einen experimentellen Ansatz, der mit dem
ES-Zell-Cokultursystem zu vergleichen ist, ebenfalls mit dem Ziel, Wnt-regulierte
Gene zu identifizieren. Embryonale Karzinomzellen (EC-Zellen) – pluripotente
Zellen mit Eigenschaften, ähnlich derer von ES-Zellen – wurden für einige Stunden in
Wnt3a-konditioniertem Medium (Shibamoto et al., 1998) inkubiert. Anschließend
wurden cDNA-Microarrays benutzt, um das Genexpressionsprofil dieser Wntinduzierten Zellen mit dem von Kontroll-Zellen zu vergleichen. Von 23000
verschiedenen cDNAs, die auf den benutzten Microarrays repräsentiert waren, zeigten
nur etwa 50 einen Expressionsunterschied zwischen EC-Zellen, die mit Wnt3akonditioniertem Medium behandelt wurden, und der Kontrolle (Willert et al., 2002).
Der Prozentsatz an differentiell exprimierten Genen war, gemessen an der Gesamtzahl
der untersuchten Gene, in diesem Experiment also noch geringer (< 0,25 %), als in
den hier dargestellten Versuchen mit dem ES-Zell-Cokultursystem. Offensichtlich
bedingt die Art der Versuchsanordnung in beiden Fällen, dass eine große Zahl an
differentiell exprimierten Genen gar nicht erwartet werden kann.
Seite 125
Diskussion
4.1.3.
Ausmaß der Expressionssteigerung Wnt-induzierter Gene im ES-ZellCokultursystem
Aus Tab. 3.12 ist zu entnehmen, in welchem Maß die Transkriptmengen der einzelnen
Zielgen-Kandidaten nach Wnt1-Stimulation der ES-Zellen im Vergleich zur lacZKontrolle anstiegen. Die Änderungsfaktoren, die mittels quantitativer RT-PCR
bestimmt wurden, bewegten sich, bis auf eine Ausnahme, im Bereich zwischen 1,4
und 3,8. Lediglich die Transkriptmenge des Pgrp-Gens stieg nach Wnt1-Stimulation
überproportional stark an, nämlich um mehr als das 16-fache. Abbildung 3.3 zeigt,
wie die Wnt1-induzierten Expressionsanstiege der 17 Zielgen-Kandidaten verteilt
waren. Es wird deutlich, dass die große Mehrzahl der Gene eine Expressionsänderung
um weniger als das dreifache erfuhr, bei acht Genen wurde die Transkriptmenge in
den ES-Zellen nach Wnt-Stimulation um weniger als das Zweifache erhöht. Zwar
können auch subtile Veränderungen des Expressionsniveaus von Genen einen
physiologischen Effekt bewirken, insbesondere wenn es sich dabei um regulatorische
Gene handelt, es ist jedoch davon auszugehen, dass die mit dem ES-ZellCokultursystem ermittelten Expressionsanstiege den tatsächlichen Anstieg der
Transkriptmenge eines Wnt-Zielgens in einer in vivo Situation nicht in jedem Fall
korrekt wiedergeben.
Dafür gibt es mehrere Gründe. Ein wichtiger Punkt ist, dass die
Expressionssteigerung eines Gens als Antwort auf ein Wnt-Signal einem bestimmten
zeitlichen Verlauf folgt. Für die einzelnen Zielgen-Kandidaten können sich die
Kinetiken der Expressionssteigerungen unterscheiden. Zum Beispiel wird die
Aktivierung eines direkten Wnt-Zielgens, dessen Regulation über die Bindung von
TCF/β-Catenin Komplexen an funktionelle LEF/TCF-Bindestellen im Promotor
erfolgt (s. 1.4.1. u. 1.6.), schneller zu beobachten sein, als der Expressionsanstieg
eines indirekten Zielgens, dessen Aktivierung unter Umständen erst die Neusynthese
zwischengeschalteter Transkriptionsfaktoren erfordert. Auch die Dauer der Reaktion,
also die Zeitspanne, in der eine erhöhte Transkriptmenge für ein bestimmtes Zielgen
in der Zelle vorliegt, ist eine variable Größe. Weiter kompliziert wird die Situation
durch die Tatsache, dass die in einer Zelle vorhandene Transkriptmenge natürlich
nicht nur von der Rate der Transkription abhängt, sondern auch von der Stabilität der
mRNA bzw. deren Abbau. Übertragen auf das ES-Zell-Cokultursystem bedeutet dies,
dass die Dauer der Cokultur von ES-Zellen und 3T3-Fibroblasten, bzw. der Zeitpunkt
der Probenentnahme, großen Einfluss auf das zu erwartende Ergebnis hat.
Idealerweise würde man diesem Umstand Rechnung tragen, indem man zu mehreren
Seite 126
Diskussion
Zeitpunkten das Expressionsprofil der ES-Zellen mit Hilfe der Microarrays bestimmt.
Angesichts der hohen Anschaffungskosten, die für die Microarrays anfielen, war dies
zunächst jedoch nicht möglich. Zudem war es im Hinblick auf die Auswertung der
Ergebnisse auch wünschenswert, die Experimente unter den gleichen Bedingungen
mehrfach durchzuführen und, wenn möglich, die Ergebnisse zu reproduzieren. Da die
Anschaffungskosten für die Microarrays im Verlauf dieser Arbeit sanken, wurden erst
in der letzten Versuchsreihe, die mit den MG-U74A-Arrays durchgeführt wurde, zwei
verschiedene Zeitpunkte untersucht. Waren bis dahin sämtliche Expressionsprofile
nach 18 h Cokulturdauer ermittelt worden, wurden mit den MG-U74A-Arrays nun
zusätzlich ES-Zellen nach 10 h Cokulturdauer analysiert. In jedem Fall stellen die
beobachteten Unterschiede zwischen den Transkriptmengen der Zielgen-Kandidaten
in Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen aus dem Kontrollexperiment jeweils
nur eine Momentaufnahme dar. Dies muss bei der Betrachtung der Ergebnisse
natürlich berücksichtigt werden.
Die Tatsache, dass in den Wnt1-behandelten ES-Zellen selten Expressionssteigerungen von Wnt-Zielgen-Kandidaten um mehr als das Dreifache erzielt wurden,
resultiert sicher auch aus Beschränkungen des ES-Zell-Cokultursystems. Die
Luciferase-Reporterversuche, die mit den Promotoren von Axin2 und Follistatin
durchgeführt wurden (s. 3.5.2. u. 3.6.2.), ergaben, dass die Aktivität dieser
Promotoren durch Stimulation des Wnt/β-Catenin Signalwegs um das 30-fache
gesteigert werden kann. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR haben jedoch
gezeigt, dass die Expression dieser beiden Gene in Wnt1-behandelten ES-Zellen (ESZell-Cokultursystem) lediglich um den Faktor 3,8 (Axin2) bzw. 2,8 (Follistatin)
gesteigert wird (s. Tab. 3.12). Geht man davon aus, dass die Promotorfragmente
(Axin2 P/I1 bzw. Foll 2,8 kb), die in den Luciferase-Reporterversuchen zum Einsatz
kamen, alle Elemente enthalten, um die β-Catenin-vermittelte Regulation der beiden
Gene korrekt wiederzugeben, so ist der Grund für die Diskrepanz zwischen den
Ergebnissen aus ES-Zell-Cokultursystem und Luciferase-Reporterversuchen wohl in
der unterschiedlich starken Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in ES-Zellen
und HEK 293-Zellen zu suchen. Um den Wnt/β-Catenin-Signalweg in den HEK 293Zellen zu aktivieren, wurden TCF1E sowie eine stabilisierte Form von β-Catenin mit
Hilfe von Expressionsvektoren in den Zellen überexprimiert (s. 3.5.2.2.). Es ist kaum
zu erwarten, dass eine vergleichbare Konzentration an freiem β-Catenin in
Cytoplasma und Kern von Zellen durch die Bindung von Wnt-Liganden an seine
zellulären Rezeptoren erreicht werden kann.
Seite 127
Diskussion
Im Falle des ES-Zell-Cokultursystems ist noch ein weiterer Aspekt zu
berücksichtigen. Anders als etwa Fibroblasten, bilden ES-Zellen unter
Zellkulturbedingungen rundliche Kolonien. Vor dem Aussähen der ES-Zellen in die
Transwell-Filter zu Beginn des Cokultur-Experiments (s. Abb. 3.1) wurden die ESZellen zwar vereinzelt, gegen Ende des Experiments, also etwa 24 h nach Aussaat der
Zellen (bei einer Cokulturdauer von 18 h), hatten sich durch Teilung der ES-Zellen
jedoch bereits wieder kleine Zellkolonien gebildet. Es ist deshalb denkbar, dass nicht
alle ES-Zellen gleichermaßen in Kontakt mit den Wnt1-Proteinen kamen, die von den
Wnt1-transfizierten 3T3-Fibroblasten in der Zellkulturschale sezerniert wurden. In
diesem Fall würde man mit dem ES-Zell-Cokultursystem also eine Mischung von ESZellen betrachten, in denen der Wnt/β-Catenin-Signalweg in unterschiedlichem Maße
aktiviert wurde. Entsprechend dürften auch die in den ES-Zellen vorhandenen
Transkriptmengen von Wnt-Zielgenen nicht immer in gleichem Maße angestiegen
sein – starke Expressionsanstiege in einigen Zellen stünden schwache
Expressionsanstiege in anderen Zellen gegenüber. Bei der Lyse der ES-Zellen (zur
RNA-Isolation) würden diese Unterschiede verwischt und es käme quasi zu einer
„Verdünnung der Wnt-Antwort“. Dies würde auch erklären, warum für die meisten
Zielgen-Kandidaten in den Wnt1-behandelten ES-Zellen nur eine relativ geringe
Expressionssteigerung ermittelt werden konnte.
Der Expressionsanstieg um das 16,8-fache, der für das Pgrp-Gen ermittelt wurde, ist
außergewöhnlich, wenn man sich die übrigen Ergebnisse betrachtet. Die Analyse der
5’-flankierenden Sequenzen des Maus-Gens ergab, dass in einem 4,5 kb großen
Abschnitt acht LEF/TCF-Bindestellen vorhanden sind (s. Tab. 3.13), was den starken
Expressionsanstieg des Gens auf eine Wnt1-Stimulation hin erklären könnte. Das
humane Pgrp-Gen, das in der Sequenzdatenbank des NCBI (National Center for
Biotechnology Information, Bethesda, USA) als orthologes Gen geführt wird, weist
ebenfalls zwei LEF/TCF-Bindestellen in der 5’-flankierenden Sequenz auf, die
Positionen dieser LEF/TCF-Bindestellen sind aber im Maus-Gen nicht konserviert (s.
Tab. 3.13). Die 5’-flankierenden Sequenzen der beiden Gene aus Maus und Mensch
zeichnen sich aber generell durch nur geringe Sequenzübereinstimmung aus. Da es
sich bei den Pgrp-Genen zudem um eine erst kürzlich entdeckte und wenig erforschte
Multigenfamilie handelt, ist nicht ausgeschlossen, dass die beiden verglichenen
Genen gar nicht ortholog sind.
Seite 128
Diskussion
4.1.4.
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus den Microarray-Experimenten
Die Frage nach der Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten umfasst zwei
Teilaspekte. Auf der einen Seite steht die Frage nach der Überschneidung der
Ergebnisse aus den einzelnen Microarray-Experimenten. Der zweite Teilaspekt
befasst sich mit der Vergleichbarkeit der Ergebnisse aus den MicroarrayExperimenten und der quantitativen RT-PCR. Beide Themenkomplexe sollen getrennt
voneinander betrachtet werden.
4.1.4.1. Überschneidung der Ergebnisse aus den einzelnen MicroarrayExperimenten
Die Versuche mit dem ES-Zell-Cokultursystem wurden in gleicher oder leicht
abgeänderter Form mehrfach durchgeführt und anschließend mit den verschiedenen
Affymetrix-Microarrays (Mu6500, Mu19k und MG-U74A) ausgewertet (s. Tab. 3.1).
Zudem wurden mit den Mu19k-Arrays zwei parallele Versuche mit Wnt1behandelten ES-Zellen ausgewertet (s. Tab. 3.5) und mit den MG-U74A-Arrays je
zwei parallele Versuche von Wnt1-Experiment und lacZ-Kontrolle analysiert (s. Tab.
3.7 und 3.8). Diese Redundanz ermöglicht es, die Überschneidung der Ergebnisse aus
den einzelnen Experimenten zu überprüfen. Zunächst soll dabei auf die
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den erwähnten Parallelversuchen
eingegangen werden. Der Vergleich der beiden Wnt1-Experimente, die mit den
Mu19k-Arrays ausgewertet wurden, zur entsprechenden lacZ-Kontrolle lieferte
übereinstimmende Expressionsunterschiede für insgesamt 46 Gene bzw. ESTs (s.
Tab. 3.5). 36 Transkripte waren in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur lacZKontrolle induziert, darunter Brachyury, ein Gen dessen Wnt-abhängige Regulation
bereits beschrieben wurde (Arnold et al., 2000), 10 weitere Transkripte waren im
Vergleich zur lacZ-Kontrolle reprimiert. Den 46 Genen, für die sich in den beiden
Wnt1-Experimenten ein übereinstimmendes Bild ergab, stehen 324 Gene gegenüber,
die nur in einem der Wnt1-Experimente einen Expressionsunterschied zur lacZKontrolle zeigten. Nimmt man jedes Wnt1-Experiment für sich, so konnten im Schnitt
etwa 22,3 % der Expressionsunterschiede im Parallelversuch bestätigt werden.
Hierbei ist zu beachten, dass der Bezugspunkt zur Detektion von
Expressionsunterschieden für beide Wnt1-Experimente jeweils der gleiche war, da
nur ein lacZ-Kontrollexperiment durchgeführt wurde (s. Tab. 3.5). Anders sieht die
Situation aus, wenn man die Ergebnisse aus den Parallelversuchen vergleicht, die mit
Seite 129
Diskussion
den MG-U74A-Arrays analysiert wurden (s. Tab. 3.7 und 3.8). Die beiden
Parallelversuche über 10 h Cokulturdauer lieferten nur in einem Fall eine
Überschneidung bezüglich der detektierten Expressionsunterschiede, ebenso wie die
Parallelversuche über 18 h Cokulturdauer. In beiden Fällen handelte es sich dabei um
Cdx1, ein Gen, dessen Wnt-abhängige Regulation bereits beschrieben wurde (Lickert
et al., 2000). Bezogen auf die einzelnen Experimente bedeutet dies, dass nur etwa 2,9
% der detektierten Expressionsunterschiede im Parallelversuch bestätigt wurden, ein
Wert der deutlich unter dem liegt, der sich für die Mu19k-Arrays ergab. Dabei ist zu
beachten, dass im Falle der MG-U74A-Arrays auch die lacZ-Kontrollversuche
mehrfach durchgeführt wurden, und deshalb die Wnt1-Experimente zur Detektion von
Expressionsunterschieden auch jeweils mit einer anderen lacZ-Kontrolle verglichen
wurden, im Gegensatz zur Vorgehensweise bei den Mu19k-Arrays.
Was war der Grund für die geringe Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten aus den
verschiedenen Paralleversuchen mit dem ES-Zell-Cokultursystem? Ein Problem lag
wahrscheinlich darin, dass viele der detektierten Expressionsunterschiede Gene
betreffen, die in ES-Zellen nur schwach exprimiert sind. So war die Signalstärke der
Transkripte, für die mit den Mu19k-Arrays ein reproduzierbarer Expressionsunterschied zwischen den Wnt1-Experimenten und der lacZ-Kontrolle ermittelt
wurde, um ein Mehrfaches niedriger als die durchschnittliche Signalstärke aller auf
den Mu19k-Arrays repräsentierten Transkripte (jeweils bezogen auf die Signalstärken
im lacZ-Kontrollexperiment, s. auch Tab. 3.5). Ein weiteres Problem wurde in
Abschnitt 4.1.3. bereits angesprochen. Die Expressionsunterschiede zwischen Wnt1behandelten ES-Zellen und ES-Zellen des lacZ-Kontrollexperiments (ermittelt durch
quantitative RT-PCR) überstiegen, bis auf wenige Ausnahmen, eine dreifache
Änderung der Transkriptmenge nicht. Dies war sicher einer der Gründe für die
geringe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Der Blick auf einige Publikationen, die
sich u.a. mit der Variabilität bzw. Reproduzierbarkeit von Microarray-Daten befassen
(Novak et al., 2002; Piper et al., 2002; Schadt et al., 2000), verdeutlicht die
Problematik von niedrigem Expressionsniveau einerseits und geringem
Expressionsunterschied andererseits. Piper et al. konnten zeigen, dass bei der
Verwendung von Affymetrix-Microarrays die Variation des Messwerts für die
Signalstärke eines Transkripts bei niedrigen Signalintensitäten stark ansteigt (Piper et
al., 2002), eine Beobachtung, die von anderen Autoren bestätigt wurde (Novak et al.,
2002). Einzelne Messwerte für schwach exprimierte Gene sind also wenig
zuverlässig. Der gleiche Zusammenhang gilt im Wesentlichen für die Bestimmung
des Expressionsunterschieds von Genen. Bei geringen Expressionsunterschieden, d.h.
Seite 130
Diskussion
niedrigen Werten für den Fold Change (s. 2.3.4.), sinkt die Reproduzierbarkeit der
Daten beträchtlich (Piper et al., 2002). Auch hier gilt: je kleiner der Wert, desto
größer die Messungenauigkeit.
Zusätzlich ergeben sich bei schwach exprimierten Genen Probleme bei der
Datenauswertung. Bei Genen, die an der Nachweisgrenze des GeneChip-Systems
liegen, erweist sich der sog. Absolute Call (s. 2.3.4.) als besonders problematisch. Die
für diese Arbeit benutzte Software (Affymetrix Microarray Suite 3.3 und 4.0) trifft
anhand der Fluoreszenzdaten für den jeweiligen Probensatz (s. 1.9.) eine absolute
Aussage bezüglich der Anwesenheit (Affymetrix: Absolute Call) eines bestimmten
Transkripts (s. 2.3.4.). Die in diesem Schritt getroffene Aussage war jeweils mit
entscheidend dafür, ob ein potentiell vorhandener Expressionsunterschied (angezeigt
durch Fold Change bzw. Difference Call, s. 2.3.4.) zwischen zwei Vergleichsexperimenten berücksichtigt wurde oder nicht. Bei der Datenauswertung galten
folgende, von Affymetrix empfohlene Richtlinien: „ein Gen, das in Wnt1-behandelten
ES-Zellen nicht detektiert wird, ist auch nicht induziert im Vergleich zum lacZKontrollexperiment“ bzw. „ein Gen, das schon im lacZ-Experiment nicht detektiert
wurde, ist in Wnt1-behandelten ES-Zellen auch nicht reprimiert“. Dieser Schritt der
Datenfilterung wurde von Affymetrix empfohlen, um die Rate an „falsch Positiven“
(s. 4.1.2.) zu minimieren. Mehrere Benutzer der Affymetrix-Technologie verweisen
aber darauf, dass dadurch wichtige Expressionsdaten nicht berücksichtigt werden und
stellen deshalb den Nutzen dieses Auswertungsschritts in Frage (Mayanil et al., 2001;
Schadt et al., 2000). Es ist durchaus möglich, dass die Überschneidung zwischen den
Ergebnissen aus den einzelnen ES-Zell-Cokulturexperimenten größer gewesen wäre,
wenn bei der Datenauswertung der Absolute Call nicht berücksichtigt worden wäre.
Eine ähnliche Überlegung kann man bezüglich des sog. Difference Call anstellen (s.
2.3.4.).
Angesichts dessen, was im oberen Abschnitt besprochen wurde, war nicht zu
erwarten, dass die Ergebnisse aus Experimenten, die mit unterschiedlichen
Microarrays durchgeführt wurden, sich stark überschneiden. Zum einen kann mit den
verschiedenen Microarrays (Mu6500, Mu19k und MG-U74A) ein unterschiedliches
Repertoire an Genen nachgewiesen werden, zum anderen unterscheiden sich die
Oligonukleotide, mit denen auf den verschiedenen Arrays die gleichen Transkripte
detektiert werden sollen, sicher erheblich voneinander. Letzteres hat zwei Gründe: 1)
die Mu19k-Arrays wurden vor allem auf der Grundlage der Sequenzdatenbank des
TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, USA) entworfen, die Mu6500-
Seite 131
Diskussion
und MG-U74A-Arrays auf der Grundlage der UniGene-Datenbank des NCBI
(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA). 2) Quantität und
Qualität der verfügbaren Sequenzdaten haben sich in den letzten Jahren dramatisch
erhöht, weshalb die Probensätze insbesondere zur Detektion von ESTs von
Affymetrix stark modifiziert wurden. Im Falle der MG-U74A-Arrays ist dabei
zusätzlich zu berücksichtigen, dass, durch Fehler im Proben-Design seitens des
Herstellers, ein gewisser Prozentsatz der Transkripte, die auf dem Chip repräsentiert
sein sollten, nicht detektiert werden können. Nach Angaben von Affymetrix sind
insgesamt 25 % der auf dem MG-U74A-Array vorhandenen Probensätze auf der
Grundlage von zumindest teilweise fehlerhaften Sequenzen entstanden. Bei etwa 10
% der Probensätze ist die Detektion des Transkripts dadurch beeinträchtigt (Dr.
Matthias Prucha, Affymetrix; persönliche Kommunikation). Trotz allem wurden die
beiden Gene Cdx1 und Pgrp sowohl mit den Mu6500-Arrays als auch den MGU74A-Arrays als Wnt1-reguliert erkannt (s. Tab. 3.12), ein Hinweis darauf, dass die
Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und Zellen des
Kontrollexperiments für diese beiden Transkripte besonders deutlich waren.
4.1.4.2. Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten mittels quantitativer
RT-PCR
Die Ergebnisse von insgesamt 52 Genen bzw. ESTs, für die sich in den verschiedenen
Microarray-Experimenten ein Expressionsunterschied zwischen Wnt1-behandelten
ES-Zellen und lacZ-Kontrolle ergeben hatte (s. Tab. 3.3, 3.4, 3.6, 3.9 und 3.10),
wurden mittels quantitativer RT-PCR überprüft (s. 2.3.5.). Für 17 dieser 52 Gene
konnte tatsächlich ein Expressionsunterschied bestätigt werden, das entspricht einer
Rate von etwa 33 %. Für die restlichen überprüften Gene ergaben sich keine weiteren
Hinweise auf eine Beeinflussung der Genexpression durch Wnt-Proteine, d.h. die
jeweiligen Transkriptmengen in Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen des
Kontrollexperiments waren ungefähr gleich. Da die Auswahl der getesteten Gene
nach dem Ausmaß des Expressionsunterschieds im Microarray-Experiment und
zusätzlichen, subjektiven Kriterien erfolgte, ist es unrealistisch, anzunehmen, dass die
differentielle Expression aller noch nicht überprüften Gene ebenfalls in einem Drittel
der Fälle bestätigt würde. Trotzdem kann man festhalten, dass ein beträchtlicher
Anteil der mit den Microarrays ermittelten Expressionsunterschiede aus dem ES-Zell
–Cokultursystem in einem unabhängigen Versuch (s. 2.3.5.) und durch eine andere
Quantifizierungsmethode reproduziert werden konnte. Diese Tatsache relativiert die
Seite 132
Diskussion
mangelnde Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den einzelnen MicroarrayExperimenten, die in Abschnitt 4.1.4.1. diskutiert wurde.
Die Überprüfung für die 17 Zielgen-Kandidaten ergab allerdings auch, dass das
Ausmaß des tatsächlich vorhandenen Expressionsunterschieds (ermittelt über
quantitative RT-PCR), durch die vorangegangenen Microarray-Experimente nicht
sehr zuverlässig vorhergesagt wurde. Nur in sechs Fällen (Crbp1, Dmrt1, Ebf1,
Follistatin, Tgfb2, Troy) ergab sich eine annähernde Übereinstimmung zwischen den
Änderungsfaktoren, die mit den beiden Analysemethoden ermittelt wurden. In fast
allen anderen Fällen war der tatsächlich vorhandene Expressionsunterschied deutlich
geringer, als es der mit Hilfe des GeneChip-Systems ermittelte Änderungsfaktor (Fold
Change) erwarten ließ. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass es sich bei einem
Großteil der Änderungsfaktoren aus dem Microarray-Experiment um Schätzwerte
handelte (s. 2.3.4.).
An dieser Stelle soll ein weiterer wichtiger Punkt erwähnt werden. Der Anstieg der
Transkriptmenge für ein bestimmtes Gen hat nicht automatisch die verstärkte
Neusynthese des entsprechenden Proteins in der Zelle zur Folge, da auch die
Translation von mRNA-Molekülen in vielen Fällen einer Regulation unterliegt. Einer
Schätzung zufolge führt der Anstieg in der Transkriptmenge eines Gens nur in etwa
50 % der Fälle auch zu einer gesteigerten Proteinexpression (Chuaqui et al., 2002).
4.2.
Viele der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten haben eine
regulatorische Funktion
Abschnitt 3.3. kann man eine funktionelle Klassifizierung sowie jeweils eine genauere
Beschreibung der 17 Zielgen-Kandidaten entnehmen, für die sich in der quantitativen
RT-PCR ein Expressionsunterschied bestätigen ließ. Die meisten der 17 Gene
codieren für Proteine, die an der Regulation von zellulären Signalwegen beteiligt sind,
oder als Transkriptionsfaktoren direkt die Expression anderer Gene beeinflussen.
Unabhängig davon, ob es sich bei den regulierten Genen um direkte oder indirekte
Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs handelt, wird eines erneut deutlich. Die
Aktivierung eines bestimmten zellulären Signalwegs hat sehr oft Auswirkungen auf
die Aktivität anderer Signalwege, d.h. es findet eine gegenseitige Beeinflussung der
verschiedenen Signalaktivitäten innerhalb einer Zelle statt.
Über die Regulation von Igfbp3 (s. 3.3.2.) beeinflusst der Wnt-Signalweg
möglicherweise den IGF-Signalweg. Eine Wechselwirkung zwischen diesen
Signalwegen wurde bereits in anderem Zusammenhang beobachtet. In ZellkulturSeite 133
Diskussion
Experimenten wurde gezeigt, dass 3T3-L1 Präadipocyten durch ektopische
Expression von Wnt1 zur Produktion der Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II
angeregt werden (Longo et al., 2002). In Xenopus-Reporterstudien wurde zudem
gezeigt, dass die Überexpression von IGF-I die Zielgen-Aktivierung durch den
Wnt/β-Catenin-Signalweg inhibiert (Richard-Parpaillon et al., 2002). Die Wntabhängige Regulation von Crbp1 (s. 3.3.2.) hat unter Umständen Auswirkungen auf
den Retinoid-Stoffwechsel und somit vielleicht auch auf Retinsäure-gesteuerte
Prozesse. Die funktionelle Interaktion von Wnt-Faktoren und Retinsäure bei der
anterio-posterioren Musterbildung des Neuroektoderms ist bereits bekannt (Kudoh et
al., 2002; Maden, 2002). Zudem wurde beobachtet, dass die neuronale
Differenzierung von P19 Embryonalen Karzinomzellen (P19 EC) ebenfalls durch
beide Signalwege aktiviert wird (McBurney et al., 1982; Tang et al., 2002).
Von besonderem Interesse ist jedoch, dass gleich zwei der 17 Zielgen-Kandidaten,
Follistatin und Tgfβ2, auf eine enge Verbindung zwischen Wnt/β-Catenin-Signalweg
und TGFβ-Signalweg hinweisen. In den Promotorsequenzen dieser beiden Gene
wurde jeweils eine LEF/TCF-Bindestelle gefunden, die zwischen Maus und Mensch
konserviert ist (s. Tab. 3.13). Dies deutet darauf hin, dass beide Gene möglicherweise
direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs sind, was für Follistatin im weiteren
Verlauf dieser Arbeit auch gezeigt werden konnte (s. Abschnitt 3.6.). Die Entstehung
des Spemann-Organisators in Xenopus-Embryonen wurde in der Einleitung bereits
besprochen (s. 1.5.1.) und ist ein Beispiel für einen biologischen Prozess, der von
Wnt/β-Catenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg synergistisch gesteuert wird (Nishita
et al., 2000; Watabe et al., 1995). Bei der Diskussion der Ergebnisse für Follistatin
wird auf die Interaktion zwischen diesen beiden Signalwegen noch einmal
eingegangen.
Die Hinweise auf die Wechselwirkung zwischen Wnt/β-Catenin-Signalweg und
anderen zellulären Kommunikationswegen, die sich aus den ES-ZellCokulturexperimente ergaben, wurden bereits angesprochen. Mindestens ebenso
interessant ist aber die Tatsache, dass Axin2 in der Liste der Zielgen-Kandidaten
auftaucht. Axin2 (bzw. Axin) ist als zentrales Element des β-CateninDegradationskomplexes (s. 1.4.1.) an der Regulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
beteiligt (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998). Da Axin2 negativ
regulierend auf den Wnt/β-Catenin-Signalweg einwirkt, liegt die Existenz einer
sogenannten negativen Rückkoppelungsschleife (negative feedback loop), wie sie in
vielen Regulationsvorgängen vorkommt (Freeman, 2000), auch bei diesem WntSignalweg nahe. In den folgenden Abschnitten werden die weiteren Ergebnisse, die
Seite 134
Diskussion
sich bei der Untersuchung des Axin2-Gens im Verlauf dieser Arbeit ergaben,
diskutiert und mit bereits veröffentlichten Ergebnissen anderer Autoren verglichen.
4.3.
Axin2 ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
Die Untersuchungen zur Axin2-Expression haben deutlich gemacht, dass dieses Gen
während der Embryonalentwicklung gewebespezifisch exprimiert wird und die
Expression von Axin2 zum Teil mit der von verschiedenen Wnt-Genen überlappt (s.
3.5.3.1.). Eine Analyse der DNA-Sequenzen ergab, dass in einem 3,6 kb großen
Sequenzabschnitt des Maus Axin2-Gens insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen
vorhanden sind, von denen fünf im menschlichen Genom konserviert sind (s.3.5.1.).
Die Luciferase-Reporterversuche mit dieser Axin2 Promotor / Intron 1-Region (Ax2
P/I1) haben gezeigt, dass dieser Sequenzabschnitt die TCF/β-Catenin-abhängige
Expressionssteuerung des Axin2-Gens vermitteln kann. Durch Aktivierung des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs konnte die Expression des Luciferase-Gens unter
Kontrolle von Ax2 P/I1 in HEK 293-Zellen um fast das 30-fache gesteigert werden.
Durch ortsgerichtete Mutagenese konnte zudem gezeigt werden, dass die Regulation
über mehrere LEF/TCF-Bindestellen in diesem Sequenzabschnitt erfolgt (s. Abschnitt
3.5.2.). Nach Mutagenese aller LEF/TCF-Bindestellen in dem Reporterkonstrukt Ax2
P/I1 1-7 mut-Luc war in HEK 293-Zellen nur noch eine schwache
Expressionssteigerung des Luciferase-Gens nach Stimulation des Wnt/β-CateninSignalwegs zu beobachten (s. Abb. 3.6). Axin2 ist also ein direktes Zielgen des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs.
Diese Ergebnisse stimmen im Wesentlichen mit kürzlich veröffentlichten Daten einer
anderen Arbeitsgruppe überein (Jho et al., 2002). Auch diese Autoren haben die
Expression des Maus Axin2-Gens während der Embryonalentwicklung genauer
untersucht und fanden das gleiche gewebespezifische Expressionsmuster wie in Abb.
3.7. Zudem konnten sie die Axin2-Expression in Darm, Lunge und Niere von
Embryonen am Tag 14,5 p.c. nachweisen. Sie fanden auch, dass nach Stimulation des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs in C57MG-Zellen die Axin2-Expression ansteigt, und
zwar sowohl auf Transkript- als auch auf Proteinebene. Die Funktionalität der
LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region wurde von diesen
Autoren in Luciferase-Reporterversuchen ebenfalls nachgewiesen. Zusätzlich konnte
die spezifische Bindung von Proteinen aus dem Kernextrakt von 293T-Zellen an eine
der LEF/TCF-Bindestellen gezeigt werden. Jho et al. postulieren zwar eine negative
Regulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch Axin2, geben aber keine Hinweise
Seite 135
Diskussion
auf eine mögliche in vivo Funktion dieser Regulation (Jho et al., 2002). In zwei
weiteren Publikationen (Leung et al., 2002; Lustig et al., 2002) wurde zwar gezeigt,
dass in einer Reihe von Tumoren und Tumorzelllinien (v.a. aus Colonkarzinomen) die
Axin2-Expression stark hochreguliert ist, dies ist aber eher Ausdruck einer
gesteigerten Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in diesen Zellen (s. 1.5.3.), als
ein Hinweis auf eine biologische Funktion der negativen Rückkoppelung über Axin2.
Viele Colonkarzinome zeichnen sich ohnehin durch Mutationen im APC-Gen aus, die
die Funktionalität des β-Catenin-Degradationskomplexes beeinträchtigen. In diesen
Zellen kann Axin2 seine regulatorische Wirkung als zentrales Element des β-CateninDegradationskomplexes also gar nicht entfalten (Leung et al., 2002).
4.4.
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg steuert die Axin2-Expression
im präsomitischen Mesoderm und im dorsalen Neuralrohr
Die Analyse von vestigial tail Embryonen ergab, dass der Verlust der Wnt3aExpression in der Schwanzknospe dieser Mutanten den Verlust der Axin2-Expression
im posterioren Bereich des Embryos zur Folge hatte (s. 3.5.3.2.). Dies deutete darauf
hin, dass Axin2 in der Schwanzknospe von Wnt3a aktiviert wird, war also ein erster in
vivo Hinweis auf eine Wnt-abhängige Steuerung der Axin2-Expression während der
Embryonalentwicklung. Die ektopische Axin2-Expression in der MittelhirnHinterhirn-Region und in den Somiten von β−Catenin Exon 3 floxed / +/ En1 Cre k.i. / +-Mäusen
war ein weiterer in vivo Hinweis darauf, dass Axin2 ein Zielgen des Wnt/β-CateninSignalwegs ist (s. 3.5.3.3.).
Die Untersuchung transgener Mäuse, die das β-Galaktosidase-Reportergen unter der
Kontrolle der intakten bzw. mutierten Axin2 Promotor / Intron 1-Region exprimierten
(s. Abschnitt 3.5.4.), sollte klären, in welchen Geweben die Axin2-Expression über
den Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert wird. Dadurch sollten sich auch weitere
Hinweise auf die biologische Bedeutung der Axin2-vermittelten Negativregulation des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs ergeben. Zunächst konnte gezeigt werden, dass,
zumindest in 9,0 - 9,5 Tage alten Embryonen, die Gewebespezifität der βGalaktosidase-Expression im Wesentlichen der des endogenen Axin2-Gens entsprach,
wenn das Reportergen unter der Kontrolle der Wildtyp-Sequenz von Ax2 P/I1
exprimiert wurde. Die meisten der transgenen Embryonen zeigten eine deutliche
Blaufärbung in der dorsalen Hälfte des Neuralrohrs (auch im Gehirn), in weiteren
mesenchymalen und ektodermalen Zellen der gesamten dorsalen Region, in der
Schwanzknospe, dem präsomitischen Mesoderm und in der vorderen
Seite 136
Diskussion
Gliedmaßenknospe, sowie eine schwächere Färbung in den Kiemenbögen und in den
Somiten (s. 3.5.4.1. u. Abb. 3.10). In Abschnitt 3.5.4.1. wurde bereits angesprochen,
dass die X-Gal Färbung in den dorsalen Bereichen und in den Somiten der transgenen
Embryonen ausgedehnter bzw. stärker ausgeprägt war, als die endogene Axin2Expression (vgl. Abb. 3.7) in den gleichen Strukturen. Dabei muss jedoch
berücksichtigt werden, dass bei der X-Gal Färbung das Protein β-Galaktosidase
nachgewiesen wurde, während bei der in situ Hybridisierung die Axin2-mRNA
detektiert wurde. Während es sich bei dem Enzym β-Galaktosidase um ein recht
stabiles Protein handelt (Trainor et al., 1999), gibt es Hinweise darauf, dass das
Axin2-Transkript einem schnellen Abbau unterliegt (Aulehla et al., 2003). Dies würde
den deutlichen Unterschied in der Intensität der in X-Gal-Reaktion und in situ
Hybridisierung erzielten Färbungen erklären. Im Übrigen handelte es sich bei den
mesenchymalen Zellen in der dorsalen Embryohälfte, die β-Galaktosidase-Aktivität
aufwiesen (s. Abb. 3.10), vielleicht zum Teil um wandernde Neuralleistenzellen, was
die Ausbreitung der Blaufärbung ebenfalls erklären könnte.
Die von dem üblichen Muster abweichende Färbung nur im zentralen Bereich der
Schwanzknospe, die bei zwei Embryonen beobachtet wurde, ist wahrscheinlich durch
Positionseffekte zu erklären, d.h. durch die Beeinflussung der Transgen-Expression
durch dem Integrationsort benachbarte DNA-Abschnitte. Dass solche Einflüsse
existieren, wurde schon bald nach der Einführung der transgenen Technologie erkannt
(Gordon et al., 1980; Palmiter und Brinster, 1986). Meist wirken diese
Positionseffekte hemmend auf die Transgen-Expression, d.h. das Transgen wird nicht
oder nur schwach exprimiert (Palmiter und Brinster, 1986). Dies war bei der
Untersuchung der transgenen Embryonen, die im Verlauf dieser Arbeit generiert
wurden, auch zu beobachten. So wurde bei der Genotypisierung der Embryonen, die
mit dem Konstrukt Ax2 P/I1-lacZ injiziert worden waren, das lacZ-Transgen in 23
Embryonen nachgewiesen. Nur bei 18 Embryonen konnte jedoch die Expression der
β-Galaktosidase in den 9,5 Tage alten Embryonen nachgewiesen werden, bei einigen
dieser 18 Embryonen war das Transgen nur schwach exprimiert (s. 3.5.4.1.).
Positionseffekte können jedoch auch zu einer verstärkten oder ektopischen Expression
des Transgens im Organismus führen (Palmiter und Brinster, 1986).
Der Einfluss von Positionseffekten auf die Transgen-Expression zeigte sich erneut bei
den transgenen Embryonen, die das Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ
enthielten. Die Reportergen-Expression war zwischen den einzelnen Transgenen zum
Teil recht unterschiedlich, was durch die verschiedenen Färbungsmuster dokumentiert
wird (s. 3.5.4.2. und Abb. 3.11). Trotzdem wurde deutlich, dass die Mutagenese der
Seite 137
Diskussion
LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region deutliche
Auswirkungen auf die Gewebespezifität der β-Galaktosidase-Expression in den
transgenen Embryonen (s. 3.5.4.2.) hatte. In 16 von 17 transgenen Embryonen, die
das Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ enthielten, war eine Blaufärbung
dorsaler Zellen außerhalb des Neuralrohrs in der Mittelhirn-Hinterhirn-Region zu
beobachten. Die dorsalen Strukturen im Rumpf der Embryonen zeigten dagegen keine
β-Galaktosidase-Expression, im Gegensatz zur Situation in den Embryonen, die das
Wildtyp-Reporterkonstrukt enthielten (s.o.). Auch die Blaufärbung im dorsalen
Neuralrohr, in der Schwanzknospe und dem präsomitischen Mesoderm sowie in den
Somiten konnte in keinem der Embryonen, die das Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7
mut-lacZ enthielten, beobachtet werden. In den Embryonen, die das WildtypKonstrukt enthielten, waren diese Strukturen dagegen fast immer angefärbt. Im
Gegensatz dazu war die β-Galaktosidase-Expression in den Kiemenbögen und in den
Gliedmaßenknospen zumindest bei einigen der Embryonen erhalten, die das Transgen
unter der Kontrolle der mutierten Axin2 Promotor / Intron 1-Region exprimierten (s.
Abb. 3.10).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Axin2-Expression zumindest im dorsalen
Neuralrohr sowie in der Schwanzknospe und dem präsomitischen Mesoderm durch
die LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region gesteuert wird. In
diesen embryonalen Strukturen kann die Axin2-mRNA durch in situ Hybridisierung
eindeutig nachgewiesen werden und die β-Galaktosidase-Aktivität geht durch die
Mutation der LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ verloren. Durch die
Versuche mit den vestigial tail Mäusen (s. 3.5.3.2.) konnte zudem gezeigt werden,
dass die Steuerung der Axin2-Expression im Bereich von Schwanzknospe und
präsomitischem Mesoderm über Wnt3a erfolgt. Die Überlappung der Expression von
Wnt1 (Shackleford und Varmus, 1987; Wilkinson et al., 1987) und Wnt3a (Roelink
und Nusse, 1991) mit der von Axin2 im dorsalen Neuralrohr weist darauf hin, dass in
dieser Struktur Axin2 möglicherweise über Wnt1 und Wnt3a reguliert wird. Auch in
den Somiten ist das endogene Axin2-Gen schwach exprimiert (Aulehla et al., 2003),
und die β-Galaktosidase-Aktivität ist abhängig von funktionellen LEF/TCFBindestellen im Reporterkonstrukt Ax2 P/I1-lacZ. Die Axin2-Expression wird deshalb
vielleicht auch in den Somiten von Wnt-Liganden beeinflusst, z.B. von Wnt1, Wnt4,
Wnt6 oder Wnt 7a, die in benachbarten Geweben exprimiert werden (Parr et al., 1993;
Tajbakhsh et al., 1998). Die Versuche mit den β−Catenin
Exon 3 floxed / +
/ En1
Cre k.i. / +
-
Mäusen (s. 3.5.3.3.) haben schließlich gezeigt, dass Axin2 in den Somiten durch den
Wnt/β-Catenin-Signalwegs aktiviert werden kann. Andererseits könnte die βSeite 138
Diskussion
Galaktosidase-Aktivität in den Somiten der Mäuse, die mit dem Ax2 P/I1-lacZ
Konstrukt hergestellt wurden, auch von einer früheren Expression des lacZReportergens in Schwanzknospe bzw. präsomitischen Mesoderm herrühren, aus
denen die Somiten hervorgehen. Ähnlich ist die Situation in den dorsalen Zellen
außerhalb des Neuralrohrs einzuschätzen, in denen die lacZ-Reporteraktivität von
funktionellen LEF/TCF-Bindestellen abhängig ist. Da die Reporteraktivität in dieser
Region nicht streng mit der endogenen Axin2-Expression korreliert (s.o.), findet die
TCF-abhängige Regulation der Axin2-Expression hier wahrscheinlich zu einem
früheren Zeitpunkt in Vorläuferzellen statt.
Eine wichtige Schlussfolgerung ergibt sich noch aus der Tatsache, dass in den
transgenen Embryonen, die mit dem mutierten Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mutlacZ hergestellt wurden, immer noch eine β-Galaktosidase-Aktivität u.a. in der
Kopfregion, den Kiemenbögen und in den Gliedmaßenknospen vorhanden ist. Dies
zeigt, dass die Axin2-Expression nicht ausschließlich über den Wnt/β-CateninSignalweg aktiviert wird. Offensichtlich sind auch andere Signalwege an der
Steuerung dieses Gens beteiligt.
4.5.
Mögliche Funktion einer negativen Rückkopplung des Wnt/
β-Catenin-Signalwegs über Axin2 im präsomitischen Mesoderm
Die Arbeitsgruppe von Bernhard Herrmann (MPI für Immunbiologie) machte im
Rahmen eines Screens für Gene, die spezifisch in der Schwanzknospe bzw. im
präsomitischen Mesoderm von 9,5 Tage alten Embryonen exprimiert sind, eine
interessante Beobachtung. Die Expression von Axin2 in diesen posterioren Strukturen
ist nicht konstant, sondern sie oszilliert mit einer Periode von etwa 120 Minuten
zwischen sehr schwacher und starker Expression (Aulehla et al., 2003). Diese
Beobachtung und die oben bereits diskutierten Ergebnisse, die zeigen, dass die Axin2Expression in der Schwanzknospe und dem präsomitischen Mesoderm vom Wnt/βCatenin-Signalweg gesteuert wird, waren der Ausgangspunkt für eine Reihe weiterer
Experimente. Aulehla et al. fanden heraus, dass Wnt3a wahrscheinlich ein wichtiges
Element der molekularen Uhr bei der Somitogenese ist. In ihrem Modell einer solchen
molekularen Uhr spielt die negative Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalweg
über Axin2 eine zentrale Rolle (Aulehla et al., 2003).
Seite 139
Diskussion
4.6.
Andere Mechanismen der negativen Rückkopplung des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs
Neben der Wnt-abhängigen Regulation von Axin2 gibt es noch andere Mechanismen,
die möglicherweise eine Art negative Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
bewirken. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass Tcf1 ein direktes Zielgen des Wnt/βCatenin-Signalwegs ist (Roose et al., 1999). Einige der durch alternatives Splicen
generierten Isoformen dieses Transkriptionsfaktors besitzen keine β-CateninInteraktionsdomäne (Van de Wetering et al., 1996) und wirken deshalb als
Repressoren des Wnt/β-Catenin-Signalwegs. Roose et al. konnten zeigen, dass im
Darm von Tcf1-defizienten Mäusen vermehrt polypenartige Wucherungen auftreten
und es darüber hinaus zur Bildung von Tumoren in den Brustdrüsen der Tiere kommt
(Roose et al., 1999). Dieser Tumor-Phänotyp wurde noch verstärkt, wenn in den
Tieren ein Allel des APC-Gens (Polakis, 2000) defekt war. Die Synergy der
Phänotypen von Tcf1 und APC weist eindeutig auf eine reprimierende Wirkung des
Tcf1-Proteins auf den Wnt/β-Catenin-Signalweg in diesen Geweben hin. Ein weiterer
Mechanismus, über den sich der Wnt/β-Catenin-Signalweg selbst regulieren kann,
beinhaltet das Protein β-TrCP (Spiegelman et al., 2000). Dieses bindet an
phosphoryliertes β-Catenin und führt es der Ubiquitinierung und dem anschließenden
Abbau im Proteasom zu (s. 1.4.1.) (Jiang und Struhl, 1998; Marikawa und Elinson,
1998). Über einen posttranskriptionalen Regulationsmechanismus wird β-TrCP nach
Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs induziert und damit der Abbau von βCatenin beschleunigt (Spiegelman et al., 2000). Die Wnt-abhängige Regulation von
Axin2 ist also nur einer von mehreren Mechanismen, welche die negative
Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs bewirken.
4.7.
Follistatin ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs
Das Protein Follistatin wurde ursprünglich im Zusammenhang mit der Regulation der
FSH-Sekretion der Hypophyse beschrieben (Robertson et al., 1987; Ying et al., 1987).
Die Entdeckung, dass Follistatin spezifisch an Activin bindet und dessen Funktion
beeinflusst (Nakamura et al., 1990), war ein erster Anhaltspunkt dafür, dass Follistatin
weitere Funktionen besitzt, da bekannt war, dass Activin bei vielen biologischen
Prozessen eine Rolle spielt. Später wurde gezeigt, dass Follistatin auch mit
verschiedenen BMP-Signalmolekülen interagiert und deren Bindung an zelluläre
Rezeptoren moduliert (Amthor et al., 2002; Fainsod et al., 1997). Die Untersuchung
Seite 140
Diskussion
der Follistatin-Expression in Maus (Albano et al., 1994; Feijen et al., 1994), Xenopus
(Hemmati-Brivanlou et al., 1994) und anderen Modellorganismen ergab ein
komplexes Expressionsmuster (s. Abschnitt 3.6.3.). Besonders interessant ist dabei die
Expression in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung. In der Xenopus-Blastula
ist Follistatin im Spemann-Organisator exprimiert (Hemmati-Brivanlou et al., 1994),
in 6,5 bis 7,5 Tage alten Mausembryonen im Primitivstreifen (Albano et al., 1994).
Da auch gezeigt wurde, dass in diesen frühen embryonalen Strukturen der Wnt/βCatenin-Signalweg aktiviert ist (Liu et al., 1999; Moon und Kimelman, 1998), lag die
Vermutung nahe, dass Follistatin während der frühen Embronalentwicklung durch
diesen Signalweg reguliert wird. Dies war mit ein Grund, warum von den 17 ZielgenKandidaten, die mit dem ES-Zell-Cokultursystem identifiziert worden waren (s. Tab.
3.12), neben Axin2 auch Follistatin näher untersucht wurde.
Die Sequenzanalyse des Maus Follistatin-Promotors ergab, dass in einem 4 kb großen
Abschnitt sieben LEF/TCF-Bindestellen vorhanden sind, von denen allerdings nur
eine im menschlichen Promotor konserviert ist (s. Tab. 3.13 und Abb. 3.12). Die
Ergebnisse der Luciferase-Reporterversuche, die mit den verschiedenen FollistatinPromotorkonstrukten durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass die Aktivität des
Follistatin-Promotors vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert wird. Durch
Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs konnte die Expression des LuciferaseGens unter Kontrolle des Follistatin–Promotors in HEK 293-Zellen um das bis zu 30fache gesteigert werden (s. Abschnitt 3.6.2.). Die Untersuchung von
Deletionskonstrukten des Follistatin-Promotors deutete darauf hin, dass u.a. die
LEF/TCF-Bindestelle 3, die zwischen Maus und Mensch konserviert ist, für die Wntabhängige Regulation verantwortlich ist. Die ortsgerichtete Mutagenese der
LEF/TCF-Bindestellen zeigte jedoch, dass nur die LEF/TCF-Bindestelle 1 für die
Wnt-Regulation des Maus Follistatin-Promotors essentiell ist. Nach Mutagenese
dieser LEF/TCF-Bindestelle in dem Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1 mut-Luc war in
HEK 293-Zellen eine deutlich schwächere Expressionssteigerung des LuciferaseGens nach Stimulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu beobachten, als mit dem
Wildtyp-Konstrukt Foll 2,8 kb-Luc. Eine schwache Aktivierbarkeit des FollistatinPromotors durch β-Catenin S33A und TCF1E blieb auch erhalten, wenn alle weiteren
LEF/TCF-Bindestellen in diesem Fragment mutiert waren (s. Abb. 3.15).
Diese Ergebnisse zeigen, dass Follistatin ein direktes Zielgen des Wnt/β-CateninSignalwegs ist. Die immer noch vorhandene, wenn auch stark abgeschwächte, Wnt/βCatenin-Aktivierbarkeit des mutierten Follistatin-Promotors weist aber auch darauf
hin, dass ein Teil der Wnt-Regulation möglicherweise nicht durch TCF-Faktoren
Seite 141
Diskussion
vermittelt wird, sondern über andere Transkriptionsfaktoren erfolgt. In diesem
Zusammenhang ist interessant, dass sich auf dem Maus Follistatin-Promotor in der
Nähe der LEF/TCF-Bindestelle 1 eine potentielle Bindestelle für den T-Box
Transkriptionsfaktor Brachyury findet (de Groot et al., 2000). Brachyury ist selbst ein
direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Arnold et al., 2000; Yamaguchi et
al., 1999b) und ist in der frühen Embryonalentwicklung teilweise mit Follistatin
copexprimiert, etwa am Tag 7,5 p.c. im Primitivstreifen (Albano et al., 1994;
Clements et al., 1996). Möglicherweise ist Brachyury über die Bindung an den
Follistatin-Promotor ebenfalls an der Wnt-abhängigen Regulation von Follistatin
beteiligt.
Die Tatsache, dass die direkte Wnt/β-Catenin-Regulation des Follistatin-Gens über
die LEF/TCF-Bindestelle 1 erfolgt, überrascht, da diese LEF/TCF-Bindestelle im
menschlichen Gen nicht vorhanden ist. Eine Analyse der Follistatin-Gensequenzen
aus Ratte und Schwein zeigt jedoch, dass die LEF/TCF-Bindestelle 1 in diesen beiden
Organismen ebenso vorhanden ist, wie bei der Maus. In anderen Organismen ist
dieser Sequenzabschnitt also durchaus evolutionär konserviert. Im Übrigen haben
Willert et al. Follistatin kürzlich ebenfalls als direktes Zielgen des Wnt/β-CateninSignalwegs identifiziert und die Funktionalität der LEF/TCF-Bindestelle 1 im
Follistatin-Promotor der Ratte nachgewiesen (Willert et al., 2002).
4.8.
Das Promotorfragment Foll 2,8 kb enthält nicht alle Elemente,
die an der Regulation der Follistatin-Expression beteiligt sind
Die Untersuchung des 2,8 kb Follistatin-Promotors in Luciferase-Reporterversuchen
hat gezeigt, dass dieses Promotorfragment die Expression des Luciferase-Gens in
HEK 293-Zellen in Abhängigkeit vom Wnt/β-Catenin-Signalweg steuern kann. Die
Generierung von transgenen Mauslinien mit dem Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ
sollte klären, ob dieses Promtorfragment in der Lage ist, das komplexe zeitlichräumliche Muster der Follistatin-Expression während der Embryonalentwicklung (s.
3.6.3.) zu gewährleisten. Die einzelnen transgenen Mauslinien zeigten nur teilweise
übereinstimmende Transgen-Expression, wahrscheinlich aufgrund von
Positionseffekten (s. 3.6.4.1.). Trotzdem ergab sich ein deutliches Bild bezüglich der
Eigenschaften des 2,8 kb Follistatin-Promotors.
Die X-Gal-Färbung der transgenen Embryonen in den verschiedenen
Entwicklungsstadien zeigte, dass die β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle
von Foll 2,8 kb nur teilweise der endogenen Follistatin-Expression entsprach (s.
Seite 142
Diskussion
3.6.4.1.). In frühen Entwicklungsstadien war das lacZ-Reportergen entweder nicht
exprimiert (Tag 7,5 - 8,5 p.c.), oder das Expressionsmuster zeigte keine Ähnlichkeit
mit der endogenen Follistatin-Expression (Tag 9,5 p.c.). Erst ab Tag 10,5 p.c. bzw.
11,5 p.c. wurde die β-Galaktosidase in mehreren Mauslinien mit übereinstimmender
Gewebespezifität exprimiert. Die Transgen-Expression überlappte ab diesem
Zeitpunkt überwiegend mit der Expression des endogenen Follistatin-Gens. Vor allem
Muskelvorläuferzellen zeigten eine starke β-Galaktosidase-Expression. Trotzdem
zeigten in den späteren Entwicklungsstadien auch nicht alle Gewebe eine
Blaufärbung, in denen Follistatin exprimiert wird, etwa das Innenohr, die Zunge und
die mesenchymalen Zellen, die an das Riechepithel angrenzen.
Was lässt sich aus diesen Ergebnissen schließen? Offenbar sind in dem 2,8 kb
Follistatin-Promotor nicht alle cis-regulatorischen Elemente vorhanden, die
notwendig sind, um die Expression des Gens in den frühen Stadien der
Embryonalentwicklung, etwa an Tag 7,5 p.c. im Primitivstreifen, zu steuern. Die
spätere Expression des Follistatin-Gens wird von dem Promotorfragment auch nur
teilweise wiedergegeben, was ebenfalls darauf hindeutet, dass cis-regulatorische
Elemente fehlen.
4.9.
Die Expression von Follistatin in Schnurrhaarfollikeln ist
wahrscheinlich abhängig vom Wnt/β-Catenin-Signalweg
Die Ergebnisse, die im obigen Abschnitt diskutiert wurden, machen bereits deutlich,
dass die Frage, ob die Follistatin-Expression im Primitivstreifen von Mausembryonen
vom Wnt/β-Catenin-Signalweg beeinflusst wird, durch die weitere Analyse des 2,8 kb
Follistatin-Promotors nicht beantwortet werden kann. Dieses Promotorfragment reicht
nicht aus, um die Follistatin-Expression während der frühen Embryonalentwicklung
zu steuern. Das bedeutet jedoch keineswegs, dass die cis-regulatorischen Elemente,
die in dem 2,8 kb Follistatin-Promotor vorhanden sind, wie etwa die LEF/TCFBindestellen, nicht an der Regulation der frühen Follistatin-Expression beteiligt sind.
Klar ist lediglich, dass die vorhandenen cis-regulatorischen Elemente alleine nicht
dafür ausreichen.
Trotz dieser Beschränkungen wurden transgene Embryonen generiert, die das
Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ mit den mutierten LEF/TCF-Bindestellen
enthielten (s. 3.6.4.2.). Die Analyse dieser transgenen Embryonen sollte klären, ob der
Wnt/β-Catenin-Signalweg an der Steuerung der Follistatin-Expression ab Tag 10,5
der Embryonalentwicklung beteiligt ist. Es zeigte sich, dass die Mutation der
Seite 143
Diskussion
LEF/TCF-Bindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor keine gravierenden
Auswirkungen auf die β-Galaktosidase-Expression in transgenen Embryonen
zwischen Tag 10,5 und Tag 14,5 der Entwicklung hatte (vgl. Abb. 3.20 u. 3.23). Die
Expressionsmuster, die mit dem Wildtyp- bzw. mutierten Promotor erzielt wurden,
waren annähernd gleich, allein die β-Galaktosidase-Expression in den
Schnurrhaarfollikeln konnte bei den Embryonen, die das Konstrukt Foll 2,8 kb 1-4
mut-lacZ enthielten, nicht mehr beobachtet werden. Da die Transgen-Expression in
den Schnurrhaarfollikeln der Embryonen mit dem Wildtyp-Reporterkonstrukt
ebenfalls variierte (s. Abb. 3.19) und die Zahl der jeweils untersuchten transgenen
Linien nicht sehr groß war, ist nicht eindeutig geklärt, ob LEF/TCF-Faktoren
tatsächlich an der Regulation von Follistatin in den Schnurrhaarfollikeln beteiligt
sind.
Dass der Wnt/β-Catenin-Signalweg bei der Entwicklung von Haarfollikeln eine
wichtige Rolle spielt, zeigt u.a. der Phänotyp von Lef1-defizienten Mäusen, die weder
Schnurrhaare noch Körperhaare besitzen. (van Genderen et al., 1994). LEF1 aber
auch TCF3 (Kratochwil et al., 1996; van Genderen et al., 1994) (DasGupta und Fuchs,
1999) sind in Haarfollikeln exprimiert, ebenso wie β-Catenin (Ridanpaa et al., 2001)
und Wnt3 (Millar et al., 1999). Entsprechend konnte gezeigt werden, dass ein
künstliches Promotorkonstrukt (TOPGAL-Reporterkonstrukt), das in 5’-Richtung
eines c-fos Minimalpromotors drei LEF/TCF-Bindestellen besitzt, in Haarfollikeln die
Expression des lacZ-Reportergens aktivieren kann (DasGupta und Fuchs, 1999). Es
ist also durchaus denkbar, dass Follistatin in Haarfollikeln ein direktes Zielgen des
Wnt/β-Catenin-Signalwegs ist. Die Aufgabe von Follistatin in Haarfollikeln besteht
wahrscheinlich darin, die Funktion von BMP2, BMP4 und/oder Activin A zu
beeinflussen, die ebenfalls während der Entwicklung der Haarfollikel exprimiert
werden (Jones et al., 1991; Laurikkala et al., 2002; Lyons et al., 1990). Dass
Follistatin eine wichtige Rolle bei der Morphogenese der Haarfollikel spielt, zeigen
die Defekte in den Schnurrhaaren und die retardierte Entwicklung der
Körperhaarfollikel in Follistatin-defizienten Mäusen (Matzuk et al., 1995; Nakamura
et al., 2003). Die Entwicklung von Haaren zeigt viele Gemeinsamkeiten mit der
Entwicklung anderer epidermaler Fortsätze, wie z. B. Zähnen, und erfordert die
Integration einer Vielzahl von Signalaktivitäten (Fuchs et al., 2001; Jernvall und
Thesleff, 2000; Millar, 2002). Die Wnt-abhängige Regulation von Follistatin ist
vielleicht einer der molekularen Mechanismen, die an der Integration von Wnt/βCatenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg während dieser Entwicklungsprozesse
beteiligt sind.
Seite 144
Diskussion
4.10.
Hinweise auf eine Regulation von Follistatin durch den
TGFβ-Signalweg
Die Expression von Follistatin in Schnurrhaarfollikeln ist wahrscheinlich abhängig
vom Wnt/β-Catenin-Signalweg. Die Reportergenexpression in den anderen Geweben
wird durch die Mutation der LEF/TCF-Bindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor
jedoch nicht beeinflusst. Deshalb stellt sich die Frage, durch welche anderen Faktoren
die Follistatin-Expression während der Embryonalentwicklung gesteuert wird. Es
wurde bereits erwähnt, dass sich im Follistatin-Promotor eine potentielle Bindestelle
für den Transkriptionsfaktor Brachyury befindet (de Groot et al., 2000). Die Analyse
des Follistatin-Promotors, die von de Groot et al. durchgeführt wurde, ergab
zusätzlich Hinweise auf weitere Transkriptionsfaktorbindestellen, z.B. für AP-1, AP2, und CREB. Von besonderem Interesse ist jedoch, dass auch mehrere potentielle
Bindestellen für Smad-Proteine gefunden wurden (de Groot et al., 2000). SmadProteine sind für die Signalleitung des TGFβ-Signalwegs von der Zelloberfläche in
den Kern verantwortlich (Massague und Wotton, 2000) und binden an die Promotoren
von Zielgenen dieses Signalwegs. Die Funktionalität dieser Bindestellen wurde bisher
jedoch noch nicht gezeigt.
4.11.
Ein Ausblick
Durch die nähere Untersuchung der Wnt-abhängigen Genregulation von Axin2 und
Follistatin konnte gezeigt werden, dass beide Gene direkt über LEF/TCF-Bindestellen
in den jeweiligen Promotoren vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert werden. Aus
den Analysen der transgenen Mäuse ergaben sich zudem wichtige Hinweise darauf, in
welchem biologischen Kontext die Wnt-abhängige Regulation der beiden Gene
jeweils von Bedeutung ist. Im Falle von Follistatin bleibt zu klären, ob der Wnt/βCatenin-Signalweg an der Regulation des Gens während der frühen
Embryonalentwicklung beteiligt ist.
Neben Axin2 und Follistatin wurden weitere 15 Gene identifiziert, deren Expression
in ES-Zellen durch Wnt1-Stimulation erhöht war (s. Tab. 3.12). Dabei handelt es sich
hauptsächlich um Gene, die für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische
Proteine codieren (s. 3.3.). Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob es sich dabei
tatsächlich um Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs handelt und ob die
Regulation auch hier direkt über LEF/TCF-Bindestellen erfolgt. Das Hauptaugenmerk
sollte sich dabei auf diejenigen Zielgen-Kandidaten richten, für die konservierte
Seite 145
Diskussion
LEF/TCF-Bindestellen in den 5’-Sequenzen der orthologen Gene von Maus und
Mensch identifiziert wurden (s. Tab. 3.13). Dies war bei Hmga2, Ndr2, Nrp2, Pim1,
Sprr2a und Tgfβ2 der Fall. Zusätzlich müssen die Expression und biologische
Funktion dieser Gene genauer auf mögliche Überschneidungen mit Wnt-Genen bzw.
Genen für LEF/TCF-Faktoren überprüft werden. Dadurch sollten sich weitere
Hinweise für die Relevanz der verschiedenen Zielgen-Kandidaten ergeben.
Seite 146
Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist an der Steuerung vieler Entwicklungsprozesse
während der Embryonalentwicklung beteiligt. Die zentrale Komponente des
Signalwegs ist das Protein β-Catenin, das zusammen mit LEF/TCFTranskriptionsfaktoren Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs aktiviert. Zu Beginn
dieser Arbeit waren nur wenige Zielgene dieses Signalwegs bekannt. Ziel der Arbeit
war deshalb die Identifizierung von neuen Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs.
Grundlage für die Suche nach Wnt-Zielgenen war das ES-Zell-Cokultursystem. Das
Prinzip des ES-Zell-Cokultursystems liegt in der Wnt-Stimulation von ES-Zellen
durch die gemeinsame Kultivierung mit Wnt-sezernierenden Fibroblasten. Mit Hilfe
verschiedener Oligonukleotid-Microarrays wurden Genexpressionsprofile von Wntstimulierten ES-Zellen und ES-Zellen aus Kontrollexperimenten erstellt. Durch den
Vergleich der Genexpressionsprofile und die anschließende Überprüfung der
Ergebnisse durch quantitative RT-PCR wurden 17 Zielgen-Kandidaten identifiziert,
deren Expression in Wnt-stimulierten ES-Zellen gesteigert war, darunter Axin2 und
Follistatin. Axin2 ist als zentrale Komponente des β-Catenin-Degradationskomplexes
an der Steuerung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs beteiligt. Follistatin bindet an
Signalmoleküle der TGFβ-Superfamilie und moduliert so deren Bindung an zelluläre
Rezeptoren. Weitere Gene, für die eine Wnt-abhängige Expressionssteigerung in ESZellen nachgewiesen wurde, codieren für Transkriptionsfaktoren oder für Proteine,
die auf verschiedene Weise Einfluss auf zelluläre Signalwege nehmen können.
Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Axin2 und Follistatin
direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs sind. Durch die Charakterisierung
von 5’-regulatorischen Sequenzen dieser beiden Gene in vitro mittels LuciferaseReporterversuchen wurden jeweils funktionelle LEF/TCF-Bindestellen identifiziert,
die eine TCF/β-Catenin-abhängige Regulation von Axin2 bzw. Follistatin
ermöglichen.
Für Axin2 konnte die Funktionalität dieser LEF/TCF-Bindestellen auch in vivo gezeigt
werden. Es wurden transgene Embryonen generiert, die das lacZ-Reportergen unter
der Kontrolle der Axin2 Promotor / Intron 1-Region exprimierten. Die Analyse der
transgenen Embryonen (E 9,5 d.p.c.) ergab zunächst, dass dieser 3,6 kb große
Seite 147
Zusammenfassung
Sequenzabschnitt ausreicht, um in dem untersuchten Entwicklungsstadium das
endogene Expressionsmuster des Axin2-Gens korrekt wiederzugeben. Das gezielte
Ausschalten der LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region
führte zu einem Verlust der Transgen-Expression im dorsalen Neuralrohr, in der
Schwanzknospe und im präsomitischen Mesoderm. In diesen Strukturen wird die
Axin2-Expression offenbar vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert. Durch die
Untersuchung von Mäusen, die eine spontane Mutation im Wnt3a-Gen aufweisen
(vestigial tail Mäuse), konnte zudem gezeigt werden, dass die Axin2-Expression in
Schwanzknospe und präsomitischem Mesoderm von Wnt3a reguliert wird.
Die in vivo Charakterisierung des 2,8 kb Follistatin-Promotors mit Hilfe von
transgenen Mäusen ergab, dass in diesem Sequenzabschnitt nicht alle cisregulatorischen Elemente vorhanden sind, die für die Steuerung der FollistatinExpression in frühen Stadien der Embryonalentwicklung (E 7,5 – 9,5 d.p.c.) benötigt
werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass der untersuchte Promotorabschnitt die
Expression von Follistatin während späterer Entwicklungsstadien, z. B. in Muskelvorläuferzellen, steuern kann. Die Follistatin-Expression zwischen Tag 11,5 und 14,5
der Embryonalentwicklung hängt in den meisten Geweben nicht von den LEF/TCFBindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor ab. In den Schnurrhaarfollikeln wird die
Follistatin-Expression jedoch wahrscheinlich durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg
gesteuert. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob die Follistatin-Expression in
anderen Stadien der Embryonalentwicklung oder postnatal vom Wnt/β-CateninSignalweg beeinflusst wird.
Seite 148
Literaturverzeichnis
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Seite 164
Anhang
7. Anhang
Abkürzungsverzeichnis
#
°C
µ
Ω
X-/X+/x mut
A
Abb.
abs.
AK
APC
ATCC
ATP
ATV
Ax2 P/I1
bp
Bra
BSA
bzgl.
bzw.
c
ca.
cDNA
Cdx1
Ci
CK
cpm
cRNA
CTP
dCTP
ddH2O
DEPC
d. h.
DIG
DMEM
DMSO
DNA
DNase
dNTP
dpc
dsDNA
Dsh
DTT
EC-Zellen
Katalognummer
Grad Celsius
Micro
Ohm
Doppelmutante für das Gen X
Defekt in einem Allel des Gens X
mutierte LEF/TCF-Bindestelle
Ampère
Abbildung
absolut
Antikörper
„Adenomatous Polyposis Coli“-Gen / Protein
„American Type Culture Collection“
Adenosintriphosphat
Trypsin-Lösung (s. 2.4.1.)
Axin2 Promotor / Intron 1-Region
„basepair“ (Basenpaar)
Brachyury (T-Box Gen)
„bovine serum albumine“ (Rinderserumalbumin)
bezüglich
beziehungsweise
centi
circa
„copy“ DNA (Komplementäre DNA)
„Caudal-related homeobox gene 1“
Curie
Casein-Kinase
„counts per minute“ (radioaktive Zerfälle pro Minute)
„copy“ RNA aus in vitro Transkription (s. 2.3.2.)
Cytidintriphosphat
Desoxycytidintriphosphat
bidestilliertes Wasser
Diethylpyrocarbonat
das heißt
Digoxygenin
„Dulbecco’s modified Eagle’s medium“
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonuklease
Desoxyribonukleotidtriphosphat
„days post coitum“
doppelsträngige DNA
Dishevelled
Dithiothreitol
embryonale Karzinomzellen
Seite 165
Anhang
EDTA
EGTA
EMFIs
EST
ES-Zellen
et al.
EtBr
EtOH
F
FCS
Foll x kb
g
Gapdh
GBP
GFP
GSK-3β
h
HEPES
I
IgG
inkl.
IVT
k
kb
k.i.
l
LB Medium
LEF
LIF
LRP
m
M
MI
min
MM
mRNA
mut
MW
NC
NCBI
Neo
OD
PBS
pc
PCR
PM
RNA
RNase
rpm
RT
s
s.
s. o.
Ethylendiamintetraessigsäure
Ethylenglykol-bis(β-Aminoethylether)tetraessigsäure
Primäre embryonale Fibroblastenzellen
„expressed sequence tag“
embryonale Stammzellen
et altera (und andere)
Ethidiumbromid
Ethanol
Farad
„fetal calf serum“ (Fötales Kälberserum)
Follistatin-Promotorfragment
Erdbeschleunigung
Gen für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
GSK3β-Bindeprotein
Grünfluoreszierendes Protein
Glykogen-Synthase Kinase-3β
Stunde
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethanolsulfonsäure
„Increase“ (s. 2.3.4.)
Immunglobulin G (Antikörper-Klasse)
inklusive
in vitro Transkription
kilo
„kilobases“ (Kilobasen)
„knock in“
Liter
„Luria Broth“ (Nährmedium)
„lymphoid enhancer binding factor“
„leukaemia inhibitory factor“
LDL-Rezeptor verwandtes Protein
milli
Molar
„Marginal Increase“ (s. 2.3.4.)
Minute, minütig
„Mismatch“
„messenger RNA“ (Boten-RNA)
mutiert
Molekulargewicht
„No change“ (s. 2.3.4.)
„National Center for Biotechnology Information“
Neomycin (-Resistenzgen)
Optische Dichte
„phosphate buffered saline“ (Phosphatgepufferte Salzlösung)
post coitum
„polymerase chain reaction“ (Polymerasekettenreaktion)
„Perfect Match“
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
„rotations per minute“ (Umdrehungen pro Minute)
Raumtemperatur
Sekunden
siehe
siehe oben
Seite 166
Anhang
s. u.
SDS
Tab.
TCF
TIGR
Tris
tRNA
Tss
U
u. a.
Ub
ü. N.
UTP
UV
V
v. a.
Vergr.
vgl.
vt
v/v
w/v
Wnt
wt
X-Gal
z. B.
siehe unten
„sodium dodecylsulphate“ (Natriumdodecylsulfat)
Tabelle
„T-cell factor“
„The Institute for Genomic Research“
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
„transfer RNA“
Transkript-Signalstärke
„unit“ (Einheit)
unter anderem
Ubiquitin
über Nacht
Uraciltriphosphat
ultraviolett
Volt
vor allem
Vergrößerung
vergleiche
vestigial tail (Mutation im Maus Wnt3a-Gen)
Volumenprozent
Gewichtsprozent
Aus Wingless und Int (Integration)
Wildtyp
5-Bromo-4-Chloro-β-D-Galactopyranosid
zum Beispiel
Seite 167
Anhang
Veröffentlichungen
Aulehla, A., Wehrle, C., Brand-Saberi, B., Kemler, R., Gossler, A., Kanzler, B. und
Herrmann, B.G. (2003) Wnt3a plays a major role in the segmentation clock
controlling somitogenesis. Dev Cell, 4, 395-406.
Kortenjann, M., Wehrle, C., Nehls, M.C. und Boehm, T. (2001) Only one nemo-like
kinase gene homologue in invertebrate and mammalian genomes. Gene, 278,
161-165.
Lickert, H., Domon, C., Huls, G., Wehrle, C., Duluc, I., Clevers, H., Meyer, B.I.,
Freund, J.N. und Kemler, R. (2000) Wnt/(beta)-catenin signaling regulates the
expression of the homeobox gene Cdx1 in embryonic intestine. Development,
127, 3805-3813.
Seite 168
Anhang
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die zum Gelingen
dieser Arbeit beigetragen haben.
Besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. habil. Rolf Kemler für die Aufnahme in
seine Arbeitsgruppe, die gewährte Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und
die fortwährende Diskussionsbereitschaft bedanken.
Bernhard Herrmann und Alexander Aulehla danke ich für die Bereitstellung der
Axin2-cDNA sowie der vestigial tail Mäuse. Veronique Brault stellte die En1-Cre
knock in- und β-Catenin Exon 3 floxed-Mäuse zur Verfügung. Christine Mummery
danke ich für die Überlassung des Follistatin-Promotors.
Ein Dankeschön geht an Thomas Schlake und Conrad Bleul für die Beantwortung
vieler Fragen bei der Durchführung der Microarray-Experimente. Mein besonderer
Dank gilt den Mitarbeitern des Transgenen Service, Benoit Kanzler, Elsa Huber und
Laurent Morawiec, für die Generierung der transgenen Mäuse. Ebenso möchte ich
mich bei den Tierpflegern des Mausstalls bedanken.
Ein herzliches Dankeschön an alle Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Kemler für die
vielen kleinen Ratschläge und Hilfen und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Besonders danke ich Heiko Lickert, Sebastian Arnold, Jörg Stappert und Andreas
Rolke für die Starthilfe am Anfang meiner Doktorarbeit. Auch Veronique Brault,
Marc Stemmler, Andreas Hecht, Kati Hansen und Steffi Kutsch standen mir oft mit
Rat und Tat zur Seite, ebenso wie viele andere. Dirk Junghans danke ich für das
Korrekturlesen der Arbeit.
Zum Schluss ein besonderer Dank an meine Lieben. Meiner Freundin Petra danke ich
für die immerwährende Aufmunterung in schwierigen Phasen und für die Schaffung
einer wunderbaren Parallelwelt, in der missglückte Experimente keine Bedeutung
haben. Meinen lieben Eltern danke ich ganz herzlich für ihre große Unterstützung in
allen Phasen meines Lebens und meinen Freunden danke ich für ihr Verständnis in
den Wochen des Zusammenschreibens.
Seite 169
Anhang
Lebenslauf
Name:
Christian Wehrle
Geburtsdatum:
11.01.1972
Geburtsort:
Herbolzheim
Wohnort:
Gartenstr. 23, 79365 Rheinhausen
Schulausbildung
1978 – 1982
Grundschule Oberhausen
1982 – 1991
Gymnasium Kenzingen,
Abschluss: Abitur
Zivildienst
1991 – 1992
Zivildienst beim Bund für Umwelt- und Naturschutz e.V.,
Ortsgruppe Ettenheim
Akademische Ausbildung
1992 – 1994
Studium der Biologie an der Justus-Liebig-Universität Giessen
bis zum Vordiplom
1994 – 1999
Fortsetzung des Biologie-Studiums an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg und an der University of Leeds, England
(6-monatiges ERASMUS-Stipendium)
1999
Abschluss des Biologie-Studiums mit dem Diplom.
Diplomarbeit am Institut für Biologie II der Albert-LudwigsUniversität Freiburg, Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie
(Prof. Dr. Eberhard Schäfer).
Thema der Diplomarbeit:
„Charakterisierung eines GCN4-komplementierenden Proteins
aus Arabidopsis thaliana“
1999 - 2003
Doktorarbeit am Max-Planck-Institut für Immunbiologie,
Abteilung Molekulare Embryologie (Dr. habil. Rolf Kemler).
Thema der Doktorarbeit:
„Wnt/β-Catenin-Zielgene in der Maus-Entwicklung“
Seite 170
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