Wnt/β-Catenin-Zielgene in der Maus-Entwicklung Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. vorgelegt von Christian Wehrle aus Herbolzheim Freiburg 2003 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Juni 1999 bis Mai 2003 am Max-Planck-Institut für Immunbiologie in Freiburg i. Br. unter Anleitung von Herrn Dr. habil. Rolf Kemler angefertigt. Dekan der Fakultät: Betreuer der Arbeit: Referent: Koreferent: Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. Hans Kleinig Dr. habil. Rolf Kemler Dr. habil. Rolf Kemler Prof. Dr. Wolfgang Driever Prof. Dr. Karl-Friedrich Fischbach Tag der mündlichen Prüfung: 23. Juli 2003 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung..............................................................................1 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.2. 1.3. 1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.5. 1.5.1. 1.5.2. 1.5.3. 1.6. 1.7. 1.8. Die frühe Embryonalentwicklung der Maus.................................................... 1 Präimplantationsentwicklung....................................................................... 2 Postimplantationsentwicklung ..................................................................... 3 Interzelluläre Kommunikation während der Entwicklung .............................. 5 Wnt-Proteine binden an Frizzled-Rezeptoren und LRP-Corezeptoren .......... 6 Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist einer von mehreren Wnt-Signalwegen.... 7 Der Wnt/β-Catenin-Signalweg..................................................................... 7 Alternative Wnt-Signalwege und Signalspezifität.................................... 10 Wnt-Signale in Vertebratenentwicklung und Pathogenese........................... 11 Die Etablierung der primären Körperachse in Xenopus-Embryonen ...... 12 Wnt-Signale während der Mausentwicklung ............................................ 13 Der Wnt/β-Catenin-Signalweg in der Pathogenese .................................. 14 Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs....................................................... 15 Das ES-Zell-Cokultursystem .......................................................................... 16 Die Erstellung von Genexpressionsprofilen mit Hilfe von DNA-Microarrays............................................................................................ 18 1.9. Aufbau von Affymetrix-Microarrays ............................................................. 19 1.10. Zielsetzung dieser Arbeit................................................................................. 20 2. Material und Methoden......................................................22 2.1. Materialien ....................................................................................................... 22 2.1.1. Chemikalien ................................................................................................ 22 2.1.2. Gebrauchswaren.......................................................................................... 22 2.1.3. Klonierungsvektoren und Wirtsbakterien ................................................. 22 2.1.4. Bakterienmedien ......................................................................................... 23 2.1.5. Eukaryotische Zelllinien............................................................................. 23 2.1.6. Oligonukleotide und Enzyme..................................................................... 23 2.1.7. in situ Hybridisierungssonden.................................................................... 26 2.1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen.................................................. 26 2.2. Molekularbiologische Methoden .................................................................... 27 2.2.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen........................................... 27 2.2.2. Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA .................................... 27 2.2.3. Auffüllen von 5’-überhängenden DNA-Enden......................................... 27 2.2.4. Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten ................................. 27 2.2.5. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen................................ 27 2.2.6. Phenol/ Chloroform- Extraktion ................................................................ 28 2.2.7. Präzipitation von Nukleinsäuren (DNA oder RNA)................................. 28 2.2.8. Ligation von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA ................................... 28 2.2.9. Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Bakterien ........ 29 2.2.10. Herstellung und Transformation elektrisch kompetenter Bakterien........ 29 2.2.11. Identifizierung rekombinanter Kolonien ................................................... 30 2.2.12. Präparation von Plasmid-DNA .................................................................. 30 2.2.13. DNA-Sequenzierung................................................................................... 30 2.2.14. Ortsgerichtete Mutagenese......................................................................... 31 2.2.15. Southern-Blot Analyse .............................................................................. 32 2.2.16. Radioaktive Markierung von DNA- Sonden............................................. 32 2.2.17. Hybridisierung von Southern-Blots........................................................... 33 2.2.18. Reverse Transkription von RNA in cDNA .............................................. 33 2.2.19. Polymerase-Kettenreaktion („PCR“)......................................................... 34 2.2.20. Klonierung von PCR-Produkten ................................................................ 34 2.2.21. Quantitative PCR mit dem LightCycler–System ...................................... 35 2.3. Expressionsanalyse mit dem Affymetrix GeneChip System ...................... 36 2.3.1. Prinzip.......................................................................................................... 36 2.3.2. Präparation der biotinylierten cRNA für die Hybridisierung................... 36 2.3.3. Hybridisierung der Oligonukleotid-Microarrays und Detektion der hybridisierten cRNA................................................................................... 37 2.3.4. Auswertung der Microarrays...................................................................... 39 2.3.5. Validierung der Microarray-Ergebnisse .................................................... 40 2.4. Zellbiologische Methoden............................................................................... 41 2.4.1. Zellkultur von NIH 3T3-Fibroblasten und HEK 293-Zellen ................... 41 2.4.2. Zellkultur von ES-Zellen............................................................................ 41 2.4.3. Herstellung eines Nährzellrasens aus Embryonalen Fibroblasten (EMFI).. 42 2.4.4. Cokultur von ES-Zellen und NIH 3T3 Fibroblasten ................................ 42 2.4.5. Isolation von Gesamt-RNA aus cokultivierten ES-Zellen ....................... 43 2.4.6. Reporterstudien in transfizierten HEK 293-Zellen................................... 43 2.5. Embryologische Methoden ............................................................................. 45 2.5.1. Verwendete Mäuse ..................................................................................... 45 2.5.2. Isolation von Embryonen ........................................................................... 46 2.5.3. Präparation von genomischer DNA aus embryonalen Dottersäcken ...... 46 2.5.4. Präparation von genomischer DNA aus Schwanzbiopsien ...................... 46 2.5.5. Herstellung von markierten RNA-Proben für die in situ Hybridisierung ... 46 2.5.6. „Whole mount“ RNA in situ Hybridisierung............................................ 47 2.5.7. Herstellung von Embryopulver.................................................................. 48 2.5.8. Herstellung transgener Reportermäuse...................................................... 48 2.5.9. Genotypisierung von Mäusen und Mausembryonen ................................ 48 2.5.10. X-Gal Färbung von Embryonen................................................................. 49 2.6. Histologische Methoden.................................................................................. 49 2.6.1. Paraffineinbettung von Embryonen........................................................... 49 2.6.2. RNA in situ Hybridisierung auf Paraffinschnitten ................................... 50 2.6.3. Histologische Färbung von Präparaten...................................................... 51 3. 3.1. 3.2. Ergebnisse..........................................................................52 Modifikation des ES-Zell-Cokultursystems................................................... 52 Identifikation von Zielgen-Kandidaten des Wnt/β-Catenin-Signalwegs mit Hilfe des Affymetrix GeneChip Systems .............................................. 55 3.2.1. Übersicht über die durchgeführten Microarray-Experimente.................. 55 3.2.2. Zielgen-Screening mit Mu6500-Microarrays ........................................... 57 3.2.3. Zielgen-Screening mit Mu19k-Microarrays ............................................. 61 3.2.4. Zielgen-Screening mit MG-U74A-Microarrays ....................................... 64 3.2.5. Übersicht über die Ergebnisse aus den einzelnen Experimenten............. 69 3.3. Informationen zu den Zielgen-Kandidaten .................................................... 70 3.3.1. Funktionelle Klassifizierung der Zielgen-Kandidaten ............................. 70 3.3.2. Beschreibung der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten....................... 71 3.4. Untersuchung der 5‘-flankierenden Sequenzen der Wnt1-induzierten Gene... 77 3.5. Untersuchung von Axin2 ................................................................................. 79 3.5.1. Vergleich der Axin2-Loci von Maus und Mensch .................................... 79 3.5.2. Luciferase-Reporterstudien ........................................................................ 80 3.5.2.1. Klonierung von Axin2-Luciferase-Reporterkonstrukten ..................... 81 3.5.2.2. Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in HEK 293-Zellen ...... 81 3.5.2.3. Stimulation des Ax2 P/I1-Luc-Konstrukts durch verschiedene TCF/β-Catenin-Komplexe..................................................................... 82 3.5.2.4. Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen ....... 84 3.5.3. Untersuchungen zur Axin2-Expression in Mausembryonen .................... 86 3.5.3.1. Expression von Axin2 in Wildtyp-Mausembryonen............................ 86 3.5.3.2. Axin2-Expression in vestigial tail Embryonen..................................... 88 3.5.3.3. Ektopische Axin2-Expression nach Aktivierung des Wnt/ β-Catenin-Signalwegs in vivo ............................................................... 89 3.5.4. Reporterstudien an transgenen Mäusen..................................................... 92 3.5.4.1. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der Axin2 Promotor / Intron 1-Region ........................................................ 92 3.5.4.2. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der mutierten Axin2 Promotor / Intron 1-Region ........................................................ 95 3.6. Untersuchung von Follistatin.......................................................................... 97 3.6.1. Vergleich der Follistatin-Loci von Maus und Mensch ............................ 97 3.6.2. Luciferase-Reporterstudien ........................................................................ 99 3.6.2.1. Klonierung von Follistatin-Luciferase-Reporterkonstrukten.............. 99 3.6.2.2. Stimulation des Foll 4 kb-Luc-Konstrukts durch verschiedene TCF/β-Catenin-Komplexe..................................................................... 99 3.6.2.3. Luciferase-Reporterstudien mit Deletionskonstrukten von Foll 4 kb-Luc ........................................................................................ 101 3.6.2.4. Follistatin-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen....... 103 3.6.3. Expression von Follistatin während der Maus-Embryogenese ............. 106 3.6.3.1. „Whole mount“ in situ Hybridisierungen von Embryonen............... 107 3.6.3.2. In situ Hybridisierungen auf Gewebeschnitten.................................. 108 3.6.4. Reporterstudien an transgenen Mäusen................................................... 110 3.6.4.1. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des 2,8 kb Follistatin-Promotors ............................................................... 110 3.6.4.2. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des mutierten 2,8 kb Follistatin-Promotors ............................................................... 117 4. Diskussion........................................................................122 4.1. Zielgen-Screening auf der Grundlage des ES-Zell-Cokultursystems......... 123 4.1.1. Anteil der mit den Microarrays in ES-Zellen detektierten Transkripte..... 123 4.1.2. Expressionsunterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten ES-Zellen basierend auf den Microarray-Daten ..................................... 124 4.1.3. Ausmaß der Expressionssteigerung Wnt-induzierter Gene im ES-Zell-Cokultursystem ........................................................................... 126 4.1.4. Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus den Microarray-Experimenten.... 129 4.1.4.1. Überschneidung der Ergebnisse aus den einzelnen MicroarrayExperimenten ....................................................................................... 129 4.1.4.2. Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten mittels quantitativer RT-PCR ................................................................................................ 132 4.2. Viele der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten haben eine regulatorische Funktion................................................................................. 133 4.3. Axin2 ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs................... 135 4.4. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg steuert die Axin2-Expression im präsomitischen Mesoderm und im dorsalen Neuralrohr ............................. 136 4.5. Mögliche Funktion einer negativen Rückkopplung des Wnt/β-CateninSignalwegs über Axin2 im präsomitischen Mesoderm................................ 139 4.6. Andere Mechanismen der negativen Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ........................................................................... 140 4.7. Follistatin ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ........... 140 4.8. Das Promotorfragment Foll 2,8 kb enthält nicht alle Elemente, die an der Regulation der Follistatin-Expression beteiligt sind ................................... 142 4.9. Die Expression von Follistatin in Schnurrhaarfollikeln ist wahrscheinlich abhängig vom Wnt/β-Catenin-Signalweg .................................................... 143 4.10. Hinweise auf eine Regulation von Follistatin durch den TGFβ-Signalweg .. 145 4.11. Ein Ausblick................................................................................................... 145 5. Zusammenfassung ..........................................................147 6. Literaturverzeichnis.........................................................149 7. Anhang..............................................................................165 Abkürzungsverzeichnis.................................................................................... 165 Veröffentlichungen .......................................................................................... 168 Danksagung ...................................................................................................... 169 Lebenslauf......................................................................................................... 170 Einleitung 1. Einleitung Der Körper eines erwachsenen Menschen besteht aus geschätzten 1014 Zellen. Dabei kann man hunderte Zelltypen voneinander unterscheiden, die in einer Vielzahl von Organen und Geweben organisiert sind. Alle diese Zellen entstehen im Verlauf der Ontogenese aus einer einzigen befruchteten Eizelle. Diese Zahlen lassen bereits erkennen, welche grundlegenden Prozesse im Verlauf der Entwicklung eines Organismus, insbesondere während der Embryonalentwicklung, ablaufen müssen. Zellproliferation, Zelldifferenzierung und morphogenetische Prozesse, aber auch programmierter Zelltod, führen im Verlauf der Entwicklung zur Festlegung der Körperachsen und zur Ausbildung von Organen und Geweben. Unter Zelldifferenzierung versteht man dabei die Spezialisierung einer Zelle hinsichtlich ihrer Funktion. Dabei erlangen unterschiedliche Zelltypen aufgrund differentieller Genexpression die für sie charakteristischen Eigenschaften. Durch morphogenetische Prozesse verändert sich dagegen die Gestalt eines Organismus. Die Gastrulation und die Bildung des Neuralrohrs bei der Wirbeltierentwicklung sind Beispiele für solche morphogenetischen Prozesse. Auf zellulärer Ebene liegt der Morphogenese die Veränderung der Form einer Zelle oder die Adhäsion der Zelle mit benachbarten Zellen bzw. dem Substrat zugrunde. Die Adhäsion von benachbarten Zellen innerhalb eines Zellverbands ist jedoch nur eine Form der zellulären Interaktion in einem sich entwickelnden Embryo. Um zu gewährleisten, dass die Entwicklung in reproduzierbarer Weise abläuft, müssen die verschiedenen Entwicklungsprozesse genauestens zeitlich und räumlich koordiniert werden. Dabei spielen verschiedene interzelluläre Kommunikationswege, die sich im Laufe der Evolution entwickelt haben, eine entscheidende Rolle. 1.1. Die frühe Embryonalentwicklung der Maus Der vergleichsweise kurze Generationszyklus und die genetische Manipulierbarkeit der Maus (Capecchi, 1989) haben dazu geführt, dass die Maus zum Modellorganismus für die Säugerentwicklung geworden ist. Im Gegensatz zu den Embryonen anderer Wirbeltierklassen, bei denen alle für die Entwicklung und Versorgung des Embryos notwendigen Bestandteile bereits im Ei vorhanden sind, ist der Säugerembryo auf die Ernährung über die Plazenta der Mutter angewiesen. Dies Seite 1 Einleitung bedingt einige charakteristische Unterschiede in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung, da der Säugerembryo für die Implantation in die Gebärmutter vorbereitet werden muss. 1.1.1. Präimplantationsentwicklung Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Bildung der Zygote aus Ei- und Samenzelle. Noch vor der Befruchtung erfolgt in der Eizelle die erste meiotische Zellteilung und der erste Polkörper wird gebildet. Erst nach der Befruchtung der Eizelle wird die Meiose abgeschlossen und der zweite Polkörper gebildet (s. Abb. 1.1). Während der Embryo den Eileiter hinunter wandert, erfolgen die ersten Furchungsteilungen. In dieser Phase ist der Embryo noch von der Zona pellucida, einer schützenden Glykoproteinhülle, umgeben. Im Zweizellstadium, das etwa 24 h nach der Befruchtung erreicht wird, wird das zygotische Genom aktiviert und die maternale mRNA abgebaut. Nach zwei weiteren Teilungsschritten wird am Tag 2,5 p.c. das Acht-Zell-Stadium erreicht. In diesem Stadium kommt es durch die Ausweitung der Zell-Zell-Kontakte zwischen den Blastomeren zur Kompaktion des Embryos, in deren Verlauf die Zellen ihre apikal-basale Polarität erhalten. Über das charakteristische Morula-Stadium entwickelt sich der Embryo weiter zum Blasenkeim (Blastozyste) am Tag 3,5 p.c. In diesem Stadium lassen sich erstmals zwei Zelltypen voneinander unterscheiden. Die äußeren Zellen der Morula entwickeln sich zum Trophektoderm, die inneren Zellen der Morula bilden einen kleinen Zellhaufen, der als innere Zellmasse bezeichnet wird. Das Trophektoderm transportiert Flüssigkeit in das Innere der Blastozyste, wodurch ein flüssigkeitsgefüllter Hohlraum (Blastozoel) entsteht, der an einer Seite die innere Zellmasse trägt. Die innere Zellmasse besteht aus pluripotenten Embryonalen Stammzellen (ES-Zellen), die ex vivo kultiviert und, nach entsprechender Manipulation, zur Erzeugung von chimären Mäusen mit genetisch veränderten Zellen genutzt werden können (Capecchi, 1989). Die Bildung der Blastozyste ist einer der ersten Schritte in der Organisation der embryonalen Achsen, da der Embryo nun in einen proximalen Anteil, der die innere Zellmasse enthält, und einen gegenüberliegenden distalen Anteil eingeteilt werden kann. Am Tag 4,0 - 4,5 p.c. differenziert sich ein dritter Zelltyp an der Oberfläche der inneren Zellmasse, das primitive Entoderm, das später zur Ausbildung extraembryonaler Strukturen beiträgt. Die übrige innere Zellmasse, das primitive Ektoderm bzw. der Epiblast, entwickelt sich dagegen zum eigentlichen Embryo sowie zu extraembryonalen Seite 2 Einleitung Mesodermstrukturen. Die Zellen des Trophektoderms tragen im weiteren Verlauf der Entwicklung ausschließlich zu extraembryonalem Gewebe bei. Nachdem sich im Blastozystenstadium die Zona pellucida abgelöst hat, erfolgt etwa am Tag 4,5 p.c. die Einnistung der Blastozyste in die Uterusschleimhaut. Beim Eindringen in die Uteruswand spielen spezialisierte Zellen des Trophektoderms (Riesenzellen) eine wesentliche Rolle. Abb. 1.1. Schematische Darstellung der frühen Mausentwicklung. Die obere Hälfte der Abbildung zeigt die Präimplantationsentwicklung, darunter ist die Postimplatationsentwicklung bis zum Tag 7,5 p.c. dargestellt. Zusätzlich sind die Keimblätter des 6,5 p.c. und 7,5 p.c. Tage alten Mausembryos als flache Scheiben abgebildet, um den Vergleich mit anderen Vertebraten zu erleichtern. Die Bezeichnung der Körperachsen wird anhand des Profils einer adulten Maus erläutert (nähere Erläuterungen siehe Text; entnommen aus Beddington und Robertson, 1999). 1.1.2. Postimplantationsentwicklung Nach der Einnistung in die Uteruswand wachsen Teile des Trophektoderms zum ektoplazentalen Kegel und extraembryonalen Ektoderm heran (etwa an Tag 5,5 p.c.). Das viszerale Entoderm, das aus dem primitiven Entoderm hervorgegangen ist, umhüllt den Epiblasten und das extraembryonale Ektoderm. Zusätzlich kommt es im Epiblasten zur Ausbildung der Proamnionhöhle, wodurch der charakteristische Eizylinder entsteht, in dem der Epiblast als becherförmiges Epithel vorliegt. Bis zu diesem Zeitpunkt behält der Embryo morphologisch seine radiale Symmetrie bei. Seite 3 Einleitung Diese Symmetrie wird durchbrochen, wenn am Tag 6,5 p.c. mit der Ausbildung des Primitivstreifens an der Übergangszone von embryonalem zu extraembryonalem Ektoderm die Gastrulation beginnt. Mit Hilfe von molekularen Markern lässt sich jedoch bereits vorher, am Tag 5,5 p.c., eine Gruppe von Zellen am distalen Ende des viszeralen Entoderms von den restlichen Zellen dieser Schicht unterscheiden (Beddington und Robertson, 1998). Diese Zellen wandern im weiteren Verlauf in ihre Position im anterioren viszeralen Entoderm (AVE), wo sie später die Bildung anteriorer embryonaler Strukturen beeinflussen. Die anterior-posteriore Achse des Embryos wird also bereits festgelegt, bevor der Primitivstreifen die posteriore Seite des Embryos auch morphologisch sichtbar macht. Während der Gastrulation (Tag 6,5 – 7,5 p.c.) entstehen aus dem Epiblasten durch gerichtete Zellwanderung die drei Keimblätter. Im Bereich des Primitivstreifens durchlaufen Zellen des Epiblasten zunächst eine Epithelial-Mesenchymale Transition. Anschließend wandern sie durch den Primitivstreifen hindurch und breiten sich nach vorne und zur Seite hin zwischen dem primitiven Ektoderm und dem viszeralen Entoderm aus. Auf diese Weise entsteht eine Schicht mesodermaler Zellen. Zudem dringen einige Zellen aus dem Epiblasten in die viszerale Entodermschicht ein und ersetzen sie schrittweise, wodurch das definitive Entoderm entsteht. Das viszerale Entoderm wird dabei in den extraembryonalen Bereich verdrängt. Im Verlauf der Gastrulation verlängert sich der Primitivstreifen bis zur distalen Spitze des Eizylinders. Dabei bildet sich am Vorderende des Primitivstreifens der Primitvknoten. Diese Struktur ist homolog zum Spemann-Organistor im Amphibien-Embryo (s. 1.5.1.) und zu den entsprechenden Strukturen im Zebrafisch- (Embryoschild) bzw. im Hühnerembryo (Hensenscher Knoten). In Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch die Transplantation des Primitivknotens in heterotopische Regionen des Embryos eine sekundäre Körperachse induziert wird (Lemaire und Kodjabachian, 1996). Zellmarkierungsexperimente (fate mapping-Experimente) haben gezeigt, dass der Zeitpunkt und die Position des Einwanderns einzelner Zellen in den Primitivstreifen über deren zukünftige Position innerhalb des Embryos bestimmen (Lawson et al., 1991; Smith et al., 1994; Sulik et al., 1994; Tam und Beddington, 1987). Zellen, die am posterioren Ende in den Primitivstreifen einwandern, werden zu extraembryonalem Mesoderm, das zur Bildung von Allantois, Amnion und viszeralem Dottersack beiträgt, wichtigen Bestandteilen der Plazenta. Die Zellen, die durch den mittleren Teil des Primitivstreifens wandern, tragen später zu paraxialem Mesoderm, intermediärem Mesoderm und Seitenplattenmesoderm bei. Das axiale Mesendoderm geht aus Zellen hervor, die durch den Primitivknoten wandern, und Seite 4 Einleitung bildet die Chorda dorsalis und das definitive Entoderm, aus dem sich der Darm entwickelt. Zellen aus dem Primitivknoten tragen zusätzlich zu den Somiten und zum Neuralrohr des Embryos bei. Etwa am Tag 7,5 p.c. ist die Gastrulation abgeschlossen, und die embryonalen Achsen anterio-posterior, dorsal-ventral und links-rechts sind festgelegt (Beddington und Robertson, 1999). Die Entwicklung des Embryos schreitet nun schnell fort, wobei sich anteriore Strukturen zuerst entwickeln. Zwischen Tag 7,5 p.c. und 8,5 p.c. beginnt die Entwicklung von Neuralrohr, Kopf und Herz. Die Neurulation wird am vorderen Ende des Embryos durch Signale des AVE eingeleitet. Das Neuroektoderm der Neuralplatte faltet sich auf und schließt sich später zum Neuralrohr. Die Entwicklung des Neuralrohrs geht einher mit dem Aufwölben der Kopffalte vom umgebenden Ektoderm und mit der Bildung der ersten Somiten. Auf der ventralen Seite des Embryos entwickelt sich das Herz aus den gepaarten Herzanlagen von linkem und rechtem Seitenplattenmesoderm sowie weiteren Vorläuferzellen. Ab Tag 8,0 p.c. beginnt die Einstülpung des Entoderms zum Vorderdarm und später zum Hinterdarm. Eine besondere Eigenart der Mausentwicklung ist die „Inversion der Keimblätter“, die sich darin zeigt, dass sich das Entoderm während der frühen Entwicklungsphasen in Relation zu den anderen Keimblättern außen befindet. Die Orientierung der Keimblätter wird erst mit der Drehung des Embryos am Tag 8,5 p.c. korrigiert, so dass schließlich das Entoderm nach innen zu liegen kommt. Im weiteren Verlauf der Entwicklung werden zusätzliche Somiten gebildet, aus denen sich anschließend u. a. die Skelettmuskulatur und die Wirbelsäule bilden. Das intermediäre Mesoderm trägt zur Bildung des Urogenitalsystem bei, während sich aus Zellen des Seitenplattenmesoderms die Gliedmaßenknospen entwickeln. Die Entwicklung der inneren Organe (Lunge, Magen, Pankreas, Leber) erfolgt ausgehend von Ausstülpungen des Darmschlauchs. 1.2. Interzelluläre Kommunikation während der Entwicklung Die Entwicklung einer bestimmten Struktur, etwa des Neuralrohrs (s. 1.2.1.), wird in der Embryonalentwicklung häufig durch benachbarte Strukturen beeinflusst, es findet also Kommunikation zwischen Zellen und Geweben statt. Die interzelluläre Kommunikation erfolgt oft nach folgendem Muster: Signale in Form von sezernierten oder membrangebundenen Proteinen werden von einer Zelle abgegeben und von der Zielzelle mit Hilfe von Rezeptorproteinen erkannt. Dies setzt in der Zielzelle eine Signalkaskade in Gang und führt letztlich im Kern der Zelle zu einem veränderten Seite 5 Einleitung Genexpressionsmuster. Angesichts der Komplexität der Embryonalentwicklung und der Vielzahl der zu steuernden Vorgänge würde man das Vorhandensein einer großen Zahl an verschiedenen Signalproteinen und entsprechenden Signalwegen erwarten. In den letzten Jahren ist man jedoch zu der Erkenntnis gelangt, dass es im Wesentlichen sechs Signalwege sind, die das Geschick von Zellen während der Embryonalentwicklung beeinflussen. FGF- (Powers et al., 2000), Hedgehog- (Ingham und McMahon, 2001), TGFβ- (Massague und Wotton, 2000) und Wnt-Proteine (Wodarz und Nusse, 1998) bilden jeweils eine Familie an sezernierten Signalproteinen, die entsprechend bezeichnete Signalwege aktivieren. Ephrine bzw. Delta und Serrate sind membrangebundene Proteine, die Ephrin- (Holder und Klein, 1999) bzw. Notch- (Mumm und Kopan, 2000) Rezeptoren benachbarter Zellen stimulieren. Diese Signalwege sind evolutionär hochkonserviert, steuern also z. B. die Entwicklung von Drosophila, Xenopus aber auch von Säugern. Oft sind mehrere dieser Signalwege an der Steuerung eines Entwicklungsvorgangs beteiligt, und gerade die Kombination der verschiedenen Signalaktivitäten bewirkt einen bestimmten Effekt. So sind zum Beispiel für die Bildung des Spemann-Organisators im XenopusEmbryo (s. 1.5.1.) die Signalaktivitäten von TGFβ- und Wnt/β-Catenin-Signalweg (s. 1.4.1.) erforderlich. Ganz wesentlich für die Reaktion einer Zielzelle auf ein bestimmtes Signal ist jedoch auch die Kompetenz dieser Zelle, auf dieses Signal zu reagieren. Diese Kompetenz wird von dem augenblicklichen Differenzierungszustand der Zielzelle bestimmt, ist also z.B. abhängig von dem Repertoire an Oberflächenrezeptoren oder Transkriptionsfaktoren, die von der Zelle gerade exprimiert werden. Die Tatsache, dass unterschiedlich differenzierte Zellen sich in ihrer Antwort auf ein bestimmtes Signal unterscheiden können, erklärt auch, warum es nur relativ weniger Signalwege bedarf, um eine wesentlich größere Zahl an Entwicklungsprozessen zu steuern. 1.3. Wnt-Proteine binden an Frizzled-Rezeptoren und LRP-Corezeptoren Die Familie der Wnt-Proteine bildet eine der wichtigsten Klassen von Signalmolekülen während der Entwicklung. Wnt-Gene definieren sich durch ihre Sequenzhomologie zu den zuerst identifizierten Vertretern dieser Genfamilie, Wnt1 aus der Maus (Nusse und Varmus, 1982; van Ooyen und Nusse, 1984) und wingless aus Drosophila (Cabrera et al., 1987; Rijsewijk et al., 1987; Sharma und Chopra, Seite 6 Einleitung 1976). Wnt1 wurde zunächst als bevorzugte Integrationsstelle eines Maus-Tumorvirus (MMTV) beschrieben, und daher als Proto-Onkogen Int-1 bezeichnet. Das Drosophila-Gen wingless wurde benannt nach dem Phänotyp der DrosophilaMutante, in der dieses Gen defekt war. Erst die Klonierung und Sequenzierung beider Gene deckte auf, dass es sich um Homologe handelt, weshalb die Bezeichnungen wingless und Int-1 später zum Begriff Wnt zusammengefasst wurden. Mittlerweile wurden etwa 100 Wnt-Gene aus den verschiedensten Organismen, von Hydra (Hobmayer et al., 2000) bis zum Menschen, isoliert. Allein in den Genomen von Maus und Mensch konnten jeweils 19 Wnt-Gene identifiziert werden (s. WntHomepage: www.stanford.edu/~rnusse/). Alle diese Gene codieren für Cystein-reiche Glycoproteine mit etwa 350-400 Aminosäuren, die von den produzierenden Zellen sezerniert werden. Wnt-Proteine binden an Oberflächenrezeptoren der FrizzledFamilie (Fz), das sind Membranproteine mit sieben Transmembrandomänen und einem Cystein-reichen N-Terminus, der an der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor maßgeblich beteiligt ist (Bhanot et al., 1996; Dann et al., 2001; Vinson et al., 1989). Auch die Frizzled-Gene bilden eine Multigenfamilie mit 9 Vertretern in der Maus und 10 im menschlichen Genom. Zudem konnte kürzlich gezeigt werden, dass Vertreter der LDL-Rezeptor-verwandten Proteine, LRP5 und LRP6 in Vertebraten sowie arrow in Drosophila, als Corezeptoren für Wnt-Proteine fungieren (Pinson et al., 2000; Tamai et al., 2000; Wehrli et al., 2000). 1.4. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist einer von mehreren Wnt-Signalwegen Es wird immer deutlicher, dass Wnt-Proteine, nach der Bindung an ihre Rezeptoren, eine Reihe von divergierenden Signalwegen aktivieren können (Huelsken und Birchmeier, 2001; Pandur et al., 2002). In Vertebraten existieren neben dem Wnt/βCatenin-Signalweg (s. 1.4.1.) noch der Wnt/Ca2+-Signalweg (Kuhl et al., 2000) und der Wnt/JNK-Signalweg (Boutros et al., 1998) (s. 1.4.2.). 1.4.1. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg Der Wnt/β-Catenin-Signalweg, auch als kanonischer Wnt-Signalweg bezeichnet, wurde zuerst identifiziert und ist deshalb auch am Besten erforscht. Das Protein βCatenin spielt dabei eine zentrale Rolle. β-Catenin nimmt in der Zelle zwei unterschiedliche Funktionen wahr. Einerseits ist β-Catenin an der Verknüpfung von Seite 7 Einleitung Cadherin-Zelladhäsionsmolekülen mit dem Cytoskelett beteiligt. β-Catenin bindet an die cytoplasmatische Domäne von klassischen Cadherinen und gleichzeitig an αCatenin, das wiederum direkt mit Actin-Filamenten interagiert (Aberle et al., 1996; Vleminckx und Kemler, 1999). Andererseits findet man β-Catenin auch im Cytoplasma und im Kern von Zellen. Dort interagiert β-Catenin mit DNA-bindenden Proteinen der LEF/TCF-Familie und nimmt als deren Cotransaktivator Einfluss auf die Expression von Zielgenen (Behrens et al., 1996; Huber et al., 1996; van de Wetering et al., 1997). Die spezifische Bindung an das Sequenzmotiv 5’CTTTGA/TA/T-3’ erfolgt dabei ausschließlich über die HMG-Domäne der LEF/TCFFaktoren (Giese et al., 1991; van de Wetering et al., 1991). Die CotransaktivatorFunktion von β-Catenin wird vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert, indem die Menge an β-Catenin-Protein, das nicht in Zelladhäsionskomplexen gebunden ist, reguliert wird. Abb. 1.2 zeigt schematisch wie diese Regulation abläuft. Abb. 1.2. Schematische Darstellung des Wnt/β-Catenin Signalwegs. (A) In Abwesenheit eines Wnt-Signals wird β-Catenin, das nicht mit Cadherinen assoziiert ist, in der Zelle abgebaut. Der Abbau wird durch die Phosphorylierung von β-Catenin an N-terminalen Aminosäureresten eingeleitet. Phosphoryliertes β-Catenin wird von dem F-Box-Protein βTrCP erkannt, und nach Ubiquitinierung dem Proteasom zugeführt. (B) Durch die Bindung von Wnt-Proteinen an Frizzled-Rezeptoren und LRP-Corezeptoren wird eine Signalkaskade in Gang gesetzt, die dafür sorgt, dass der β-CateninDegradationskomplex aus Axin, APC, GSK3β und CK1α auseinanderfällt. β-Catenin wird nicht länger phosphoryliert, weshalb der Abbau gestoppt wird und β-Catenin in der Zelle akkumuliert. Durch die Bindung von β-Catenin an LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren wird im Zellkern die Transkription von Zielgenen aktiviert. Nähere Erläuterungen siehe Text. In Abwesenheit eines Wnt-Signals (Abb. 1.2 A) bindet β-Catenin an einen Proteinkomplex, dessen zentrales Element Axin (Zeng et al., 1997) bzw. das AxinHomolog Axin2 (Conductin) ist (Behrens et al., 1998). Axin bildet zusammen mit dem Genprodukt des Tumorsuppressorgens APC (Groden et al., 1991; Kinzler et al., Seite 8 Einleitung 1991) ein Gerüst, an das neben β-Catenin auch die beiden Kinasen GlycogenSynthase–Kinase 3β (GSK3β) und Casein-Kinase 1α (CK1α) binden (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998; Polakis, 2002). Dieser Proteinkomplex ermöglicht die Phosporylierung von β-Catenin an N-terminalen Serin- und ThreoninResten durch CK1α und GSK3β (Amit et al., 2002; Liu et al., 2002; Yanagawa et al., 2002). Phosphoryliertes β-Catenin wird von dem F-Box-Protein β-TrCP erkannt (Jiang und Struhl, 1998; Marikawa und Elinson, 1998) und anschließend ubiquitiniert und im Proteasom abgebaut (Aberle et al., 1997). Die Expression von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs wird in Abwesenheit eines Wnt-Signals durch einen Repressorkomplex aus TCF-Transkriptionsfaktoren und verschiedenen Corepressoren (z. B. Groucho) verhindert (Cavallo et al., 1998; Roose et al., 1998). Der reprimierende Effekt wird dabei durch Histon-Deacetylasen vermittelt, die vom Repressorkomplex rekrutiert werden (Chen et al., 1999). Die Bindung eines Wnt-Proteins an seine Rezeptoren Frizzled und LRP5/6 (s. Abb. 1.2 B) führt dazu, dass der Abbau von β-Catenin gestoppt wird und β-Catenin in der Zelle akkumuliert. Viele der Proteine, die an der Wnt/β-Catenin-Signalleitung beteiligt sind, konnten identifiziert werden, wie die Signaltransduktion genau abläuft, ist jedoch noch nicht verstanden. Abb. 1.2 B zeigt das Modell, das im Moment favorisiert wird (s. Wnt-Homepage: www.stanford.edu/~rnusse/). Über einen noch unbekannten Mechanismus wird das Wnt-Signal vom Frizzled/LRP-Rezeptorkomplex zum Protein Dishevelled (Dsh) geleitet, wobei es zur Aktivierung dieses Proteins kommt. Die Phosphorylierung von Dishevelled durch die Casein-Kinase 1ε, einen Interaktionspartner von Dishevelled, scheint ein wesentlicher Schritt dieser Aktivierung zu sein (Peters et al., 1999; Sakanaka et al., 1999). Dishevelled bindet an Axin, wodurch der β-Catenin-Degradationskomplex aus Axin, APC, CK1α und GSK3β inaktiviert wird (Farr et al., 2000; Li et al., 1999; Salic et al., 2000). Eine wichtige Rolle kommt dabei dem GSK3-Bindeprotein (GBP) zu, einem weiteren Interaktionspartner von Dishevelled. GBP bindet an GSK3β und verhindert die Interaktion zwischen GSK3β und Axin (Farr et al., 2000). Als Konsequenz wird βCatenin nicht mehr von GSK3β phosphoryliert und infolgedessen nicht mehr von βTrCP erkannt. Auf diese Weise wird der Abbau von β-Catenin über den Proteasomweg verhindert, und es kommt zur Akkumulation des Proteins im Cytoplasma und im Kern der Zelle. Der Kerntransport von β-Catenin erfolgt dabei zumindest teilweise über dessen Interaktion mit LEF/TCF-Faktoren (Huber et al., 1996). Im Kern ersetzt β-Catenin die an TCF gebundenen Corepressoren und fungiert seinerseits als Coaktivator. Dabei rekrutiert β-Catenin verschiedene andere Proteine, Seite 9 Einleitung wie z.B. p300/CBP (Hecht et al., 2000) oder Pontin52 (Bauer et al., 2000), und stellt so u.a. den Kontakt zur basalen Transkriptionsmaschinerie her (Hecht und Kemler, 2000). Die Interaktion zwischen Axin und dem Wnt-Corezeptor LRP5/6, die als Antwort auf ein Wnt-Signal beobachtet wird, ist vielleicht ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion (Mao et al., 2001) und wurde in dem in Abb. 1.2 B gezeigten Modell bereits berücksichtigt. Kürzlich veröffentlichte Ergebnisse aus Experimenten an Drosophila-Mutanten mit einem Defekt in GSK3β (Zw3 in Drosophila) lassen sogar den Schluss zu, dass die Wnt/β -CateninSignaltransduktion über den Frizzled/LRP-Rezeptorkomplex und Axin unabhängig von GSK3β erfolgen kann (Tolwinski et al., 2003). Die Autoren postulieren einen alternativen Signalweg, in dem Axin durch die Bindung an LRP5/6 destabilisiert und abgebaut wird. Durch den Abbau von Axin würde bisher gebundenes β-Catenin freigesetzt und könnte im Kern seine Signalfunktion erfüllen. Tatsächlich konnte schon früher gezeigt werden, dass die Stabilität von Axin und die Interaktion zwischen Axin und β-Catenin über den Phosphorylierungszustand von Axin (s. Abb. 1.2 B) Wnt-abhängig reguliert werden – allerdings unter Einbeziehung von GSK3β (Willert et al., 1999; Yamamoto et al., 1999). Über die Existenz eines von GSK3β unabhängigen Wnt/β-Catenin-Signalwegs auch in anderen Organismen ist bisher nichts bekannt. 1.4.2. Alternative Wnt-Signalwege und Signalspezifität Wie eingangs schon erwähnt, existieren in Vertebraten neben dem Wnt/β-CateninSignalweg noch zwei weitere Wnt-abhängige Signalwege, der Wnt/Ca2+-Signalweg (Kuhl et al., 2000) und der Wnt/JNK-Signalweg (Boutros et al., 1998). Beim Wnt/Ca2+-Signalweg erfolgt die Signalleitung vom aktivierten FrizzledRezeptor über trimere G-Proteine (Slusarski et al., 1997), die das Enzym Phospholipase C zur Produktion der Signalmoleküle Diacylglycerol (DG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) anregen. Dadurch kommt es zur Freisetzung von Ca2+-Ionen aus zellulären Speichern und in der Folge zur Aktivierung Ca2+-abhängiger Kinasen wie CamKII und PKC (Kuhl et al., 2000). Der Wnt/JNK-Signalweg weist Ähnlichkeiten zu dem Signalweg auf, der in Drosophila die planare Zellpolarität kontrolliert. Die Signalleitung erfolgt vom aktivierten Frizzled-Rezeptor über das Protein Dishevelled (s. 1.4.1.) und führt zunächst zur Aktivierung der GTPase Rho (Habas et al., 2001) und im weiteren Verlauf zur Aktivierung der Jun N-terminalen Seite 10 Einleitung Kinase (JNK) (Boutros et al., 1998). Daneben gibt es Anzeichen für die Existenz weiterer Wnt-abhängiger Signalwege in Drosophila und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans (Huelsken und Birchmeier, 2001; Pandur et al., 2002). Angesichts der dargestellten Vielfalt an Wnt-abhängigen Signalwegen stellt sich die Frage, wie die Spezifität eines Wnt-Signals gewährleistet werden kann. Darüber ist bisher nicht viel bekannt. Es wurde der Versuch gemacht, die verschiedenen WntLiganden und Frizzled-Rezeptoren anhand funktioneller Tests den verschiedenen Signalwegen zuzuordnen (Du et al., 1995; Kuhl et al., 2000; Torres et al., 1996; Wong et al., 1994). Einer dieser funktionellen Versuche bestand in der Überexpression verschiedener Wnt-Proteine in Xenopus-Embryonen. Anhand der Fähigkeit der verschiedenen Wnt-Liganden, eine zweite Körperachse zu induzieren (s.1.5.1.), wurden die Wnt-Gene in zwei Kategorien unterteilt, die Xenopus Wnt1-Klasse (Xwnt1) sowie die XWnt5a-Klasse (Du et al., 1995; Torres et al., 1996). Liganden der XWnt1-Klasse (XWnt1, XWnt3a, XWnt8 und XWnt8b) induzieren eine Doppelachse, während Liganden der XWnt5a-Klasse (XWnt4, XWnt5a und XWnt11) dazu nicht in der Lage sind. Die Signalleitung von Wnt-Proteinen der XWnt1-Klasse erfolgt wahrscheinlich bevorzugt über den Wnt/β-Catenin-Signalweg (s. 1.5.1.), die der anderen Liganden über alternative Wnt-Signalwege. Die Spezifität der Interaktion zwischen den verschiedenen Wnt-Liganden und Frizzled-Rezeptoren ist noch wenig erforscht, ebenso wie die mögliche Zuordnung der einzelnen Frizzled-Rezeptoren zu den verschiedenen Wnt-Signalwegen. Ergebnisse aus Drosophila deuten aber darauf hin, dass tatsächlich funktionelle Unterschiede zwischen Frizzled-Rezeptoren bestehen, und zwar sowohl hinsichtlich ihrer Affinität zu einzelnen Wnt-Liganden (Rulifson et al., 2000) als auch hinsichtlich der Signalleitung (Boutros et al., 2000). Auch jenseits der Ligand/Rezeptor-Interaktion ist nicht viel darüber bekannt, wie Signalspezifität erreicht wird. Das Protein Diversin (Schwarz-Romond et al., 2002) scheint zwischen Wnt/β-Catenin-Signalweg und Wnt/JNK-Signalweg zu vermitteln. Dishevelled ist an der Signalleitung von Wnt/β-Catenin-Signalweg und Wnt/JNKSignalweg beteiligt, jedoch nicht in den Wnt/Ca2+-Signalweg involviert. Dishevelled dürfte deshalb ebenfalls eine Schlüsselrolle bei der Interpretation der verschiedenen Wnt-Signale zukommen (Wharton, 2003). 1.5. Wnt-Signale in Vertebratenentwicklung und Pathogenese Wnt-Signale sind im Verlauf der Embryonalentwicklung an der Steuerung vieler verschiedener Prozesse beteiligt. Die folgende Darstellung beschränkt sich auf einige Seite 11 Einleitung Funktionen von Wnt-Proteinen in Vertebraten, obwohl die Einflüsse des WntSignalwegs auf die Entwicklung von Invertebraten ebenso mannigfaltig sind. 1.5.1. Die Etablierung der primären Körperachse in Xenopus-Embryonen Der Krallenfrosch Xenopus laevis war der erste Wirbeltierorganismus, an dem die Rolle von Wnt-Proteinen in der Vertebratenentwicklung intensiv erforscht wurde. Die Injektion von Wnt1-mRNA in ventrale Blastomere des frühen Xenopus-Embryos führte zu einer Duplikation der Körperachse (McMahon und Moon, 1989) (s. 1.4.2.). Dieser Phänotyp erinnerte stark an den Phänotyp, den Spemann und Mangold in Molchembryonen beobachtet hatten, nachdem sie diesen im frühen Gastrula-Stadium die dorsale Urmundlippe einer anderen Gastrula in eine ventrale Region eingepflanzt hatten (Spemann und Mangold, 1924). Spemann und Mangold fanden damals heraus, dass die zweite Körperachse vom transplantierten Gewebe induziert wurde, weshalb sie die transplantierte Region (die dorsale Urmundlippe) als Organisator-Region bezeichneten. Die Ergebnisse von McMahon und Moon deuteten darauf hin, dass die injizierte Wnt1-mRNA die Entstehung eines solchen Organisators in der ventralen Region des Xenopus-Embryos bewirkte. Es war daher nahe liegend, zu vermuten, dass ein Wnt-Signal auch an der Entstehung der primären Körperachse beteiligt ist. Durch weitere Versuche konnte schließlich gezeigt werden, dass der Wnt/β-CateninSignalweg tatsächlich an der Etablierung des endogenen Organistors im AmphibienEmbryo mitwirkt (Moon und Kimelman, 1998). Dies geschieht über die Aktivierung von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in der dorsalen Region des Embryos. β-Catenin akkumuliert während der frühen Furchungsstadien in den dorsalen Blastomeren des Xenopus-Embryos, wobei noch nicht geklärt ist, ob diese Akkumulation durch ein lokales Wnt-Signal eingeleitet wird. Nach der Translokation in den Kern der dorsalen Blastomere interagiert β-Catenin mit dem HMG BoxTranskriptionsfaktor XTCF3 und aktiviert so u. a. die Expression der HomeoboxGene Siamois (Brannon et al., 1997) und Twin (Laurent et al., 1997). Beides sind direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (s. 1.6.) in den dorsalen Blastomeren des Xenopus-Embryos. Die Aktivierung dieser Gene ist notwendig, um die Expression Organisator-spezifischer Gene wie Goosecoid zu induzieren. Die Analyse des Goosecoid-Promotors (Laurent et al., 1997; Watabe et al., 1995) hat gezeigt, dass der Homeobox-Transkriptionsfaktor Twin an eine Region des Promotors bindet, von der bereits bekannt war, dass sie die Wnt-abhängige Regulation des Goosecoid-Gens vermittelt. Goosecoid ist also ein indirektes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs Seite 12 Einleitung (s. 1.6.). Zudem wurde gezeigt, dass Goosecoid auch vom TGFβ-Signalweg reguliert wird (Watabe et al., 1995). Dieser Signalweg ist in der gesamten vegetalen Hälfte des frühen Amphibien-Embryos aktiv (Moon und Kimelman, 1998). Für die Entstehung des Spemann-Organisators und der Körperachse im Amphibien-Embryo ist also die Integration der Signalaktivitäten von Wnt/β-Catenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg notwendig (Nishita et al., 2000). 1.5.2. Wnt-Signale während der Mausentwicklung Die Analyse von sog. knock out-Mäusen (Capecchi, 1989), in denen Wnt-Gene bzw. Elemente des Wnt/β-Catenin-Signalwegs gezielt ausgeschaltet sind, hat wesentlich zur Aufklärung der Funktion dieser Gene in der Entwicklung beigetragen. Sowohl Wnt3 (Liu et al., 1999) als auch β-Catenin (Haegel et al., 1995) wurden in Mäusen inaktiviert, was jeweils zu einem Abbruch der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Gastrulation führte. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die ektopische Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs während der frühen Mausentwicklung auch in diesem Organismus zur Bildung einer zweiten Körperachse führt (Popperl et al., 1997; Zeng et al., 1997). Zusammen zeigen die Daten, dass der Wnt/β-CateninSignalweg auch in der Maus an der Etablierung der Körperachse beteiligt ist (s. 1.5.1.). Weitere Wnt-Phänotypen sind z.B. der Verlust von Mittelhirn- und Kleinhirn in Wnt1-defizienten Mäuse (McMahon und Bradley, 1990), sowie die beeinträchtigte Entwicklung des Urogenitalsystems in Wnt4-defizienten Mäusen (Stark et al., 1994; Vainio et al., 1999). Auch die Entwicklung der Gliedmaßen wird maßgeblich von Wnt-Signalen beeinflusst. So weisen Wnt5a-defiziente Mäuse neben anderen Defekten erheblich verkürzte Gliedmaßen auf (Yamaguchi et al., 1999a), während bei Wn7a-defizienten Mäuse u.a. die dorso-ventrale sowie anterio-posteriore Musterbildung in den Gliedmaßen gestört ist (Parr und McMahon, 1995). Experimente an Hühnerembryonen haben zudem gezeigt, dass der Wnt/β-CateninSignalweg auch bei der Inititation der Gliedmaßenentwicklung entscheidend mitwirkt (Kawakami et al., 2001). Auch Wnt3a-defiziente Mäuse (Takada et al., 1994) zeigen einen interessanten Phänotyp. Die Expression von Wnt3a im Mausembryo beginnt normalerweise am Tag 7,0 p.c. im Primitivstreifen und wird in dieser Struktur bis zum Ende der Gastrulation aufrechterhalten. In späteren Entwicklungsstadien (E 9,5 – 10,5 d.p.c.) wird Wnt3a in der Schwanzknospe und im dorsalen Neuralrohr exprimiert (Takada et al., 1994). Wnt3a-defiziente Mausembryonen zeigen den vollständigen Verlust der caudal zu den Seite 13 Einleitung vorderen Gliedmaßen gelegenen Somiten, was zu einer Verkürzung der Körperachse führt. Die Schwanzknospe wird in diesen Embryonen nicht ausgebildet und auch das caudale Neuralrohr ist missgebildet (Takada et al., 1994). Erstaunlicherweise bildet sich statt des paraxialen Mesoderms eine Art ektopisches Neuralrohr. Dies deutet darauf hin, dass das Wnt3a-Signal während der Gastrulation an der Determinierung von mesodermalem gegenüber ektodermalem Zellschicksal beteiligt ist (Yoshikawa et al., 1997). Weitere Untersuchungen zeigten, dass das mesoderm-spezifisch exprimierte T-Box Gen Brachyury (Herrmann et al., 1990) ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ist (Arnold et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999b), und dass die Brachyury-Expression im anterioren Primitivstreifen von Wnt3a-defizienten Embryonen verloren geht (Yamaguchi et al., 1999b). Brachyury-defiziente Embryonen zeigen ebenfalls einen Verlust mesodermaler Strukturen caudal zu den vorderen Extremitäten (Herrmann et al., 1990), was den Phänotyp der Wnt3adefizienten Embryonen erklärt. Eine mildere Form des Wnt3a-Phänotyps findet man in vestigial tail-Mäusen (Greco et al., 1996) (s. 3.5.3.2.), die eine spontane Mutation in der regulatorischen Region des Wnt3a-Gens aufweisen. 1.5.3. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg in der Pathogenese Die Klonierung des ersten Wnt-Gens der Maus (Wnt1, s. 1.3.) im Zusammenhang mit der Integration eines Maus-Tumorvirus in benachbarte Regionen dieses Gens war gleichzeitig der erste Hinweis auf eine Verbindung zwischen Wnt-Signalen und Tumorentstehung (Nusse und Varmus, 1982; van Ooyen und Nusse, 1984). Zwischenzeitlich wurden viele Komponenten der Wnt/β-Catenin- Signaltransduktionskette identifiziert (s. 1.4.1.), und es wurde deutlich, dass Gene, die für Elemente des Wnt/β-Catenin-Signalweg codieren, in vielen menschlichen Tumoren Mutationen aufweisen (Bienz und Clevers, 2000; Polakis, 2000). Dabei sind vor allem Komponenten des β-Catenin-Degradationskomplexes wie APC und Axin/Axin2 betroffen. Die Mutation des APC-Gens im Genom von FAP-Patienten (familial adenomatous polyposis) führt zu einer vererbbaren Form von Dickdarmkrebs (Kinzler und Vogelstein, 1996). Es wurden aber auch Mutationen im β-Catenin-Gen gefunden, die den N-terminalen Bereich des Proteins verändern. Es wurde bereits erwähnt, dass über die Phosphorylierung N-terminaler Aminosäurereste durch den β-Catenin-Degradationskomplex der Abbau von β-Catenin eingeleitet wird (s. 1.4.1.). Alle diese Mutationen beeinträchtigen den Abbau von β-Catenin und bewirken so eine Stabilisierung des Proteins im Cytoplasma. Dadurch kommt es zu Seite 14 Einleitung einer konstitutiven Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs und zur Expression von TCF/β-Catenin-Zielgenen. Die Identifizierung einiger dieser Zielgene gab Hinweise darauf, auf welche Weise die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs die Tumorentstehung begünstigt. So wurde gezeigt, dass der Zellzyklusregulator Cyclin D1 und das Proto-Onkogen c-myc direkte Zielgene des Wnt/β-CateninSignalwegs sind (He et al., 1998; Tetsu und McCormick, 1999). Über die Steuerung dieser Gene nimmt der Wnt/β-Catenin-Signalweg Einfluss auf die Zellproliferation. 1.6. Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs Die bisher angeführten Beispiele für die Funktion von Wnt-Signalen während der Entwicklung und Pathogenese haben verdeutlicht, wie wichtig die Identifizierung von Wnt-Zielgenen für das Verständnis dieser Prozesse ist. Basierend auf dem Mechanismus, der zur Genaktivierung führt, kann man zwischen direkten und indirekten Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs unterscheiden. Direkte Zielgene enthalten funktionelle LEF/TCF-Bindestellen in den regulatorischen Sequenzen und werden von TCF/β-Catenin-Komplexen reguliert. Im Gegensatz dazu erfolgt die Aktivierung indirekter Zielgene nicht über TCF/β-Catenin-Komplexe, sondern über andere Transkriptionsfaktoren, die ebenfalls Wnt-abhängig reguliert werden. Die Xenopus Homeobox-Gene Siamois und Twin (s. 1.5.1.) sind Beispiele für direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Brannon et al., 1997; Laurent et al., 1997). Twin ist wiederum an der Regulation von Goosecoid beteiligt, einem indirekten Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Laurent et al., 1997) (s. 1.5.1.). Das Xenopus-Gen Siamois war das erste Gen, für das die Regulation über TCF/β-CateninKomplexe gezeigt werden konnte (Brannon et al., 1997). Aufgrund seiner dorsalen Expression und der Tatsache, dass die Injektion von Siamois-mRNA in ventrale Blastomere die Bildung einer sekundären Körperachse induziert (Lemaire et al., 1995), war vermutet worden, dass Siamois über den Wnt/β-Catenin-Signalweg reguliert wird (s. 1.5.1.). Die gleichen Überlegungen führten auch zur Identifizierung der Zielgene Twin und Xnr3 (Laurent et al., 1997; McKendry et al., 1997). Weitere Xenopus-Gene, die β-Catenin-abhängig reguliert werden, sind Fibronectin, Engrailed-2 und Connexin43 (Gradl et al., 1999; McGrew et al., 1999; van der Heyden et al., 1998). Die Untersuchung von Zebrafisch-Entwicklungsmutanten führte zur Identifizierung der Wnt/β-Catenin-Zielgene Bozozok und Nacre (Dorsky et al., 2000; Ryu et al., 2001). Seite 15 Einleitung Zu Beginn dieser Arbeit war die Zahl der bekannten Wnt/β-Catenin-Zielgene aus Säugetieren gering. Die meisten Wnt-Zielgene aus Säugern waren mit Hilfe von menschlichen Tumorzelllinien identifiziert worden, in denen der Wnt/β-CateninSignalweg konstitutiv aktiv ist (s. 1.5.3.). Mit Cyclin D1 und c-myc wurden bereits zwei Beispiele genannt (He et al., 1998; Tetsu und McCormick, 1999). Neben diesen waren noch Tcf1, PPARδ, c-jun, fra-1, sowie MMP-7 als direkte Zielgene bekannt (Crawford et al., 1999; He et al., 1999; Mann et al., 1999; Roose et al., 1999). Die einzigen identifizierten Wnt/β-Catenin-Zielgene der Maus waren zu diesem Zeitpunkt Brachyury (Arnold et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999b), Cdx1 (Lickert et al., 2000), WISP-1 (Pennica et al., 1998), Cyclooxygenase-2 (Howe et al., 1999) und sFRP2 (Lescher et al., 1998), wobei nur für Brachyury und Cdx1 eine direkte Regulation über LEF/TCF-Bindestellen gezeigt werden konnte. Seit dieser Zeit ist die Zahl identifizierter Wnt-Zielgene stark gestiegen (s. Wnt-Homepage: www.stanford.edu/~rnusse/). Angesichts der großen Zahl an Wnt-Genen im Genom von Säugern, der Vielfalt der Genexpressionsmuster und der teilweise dramatischen Phänotypen, die sich beim Verlust einzelner Wnt-Gene in knock out-Mäusen zeigen (s. 1.5.2.), ist jedoch zu erwarten, dass noch wesentlich mehr Zielgene des Wnt/βCatenin-Signalwegs existieren. 1.7. Das ES-Zell-Cokultursystem Die Identifizierung der oben genannten Wnt/β-Catenin-Zielgene aus Xenopus und Zebrafisch erfolgte jeweils nach Hinweisen auf eine mögliche Wnt-abhängige Regulation dieser Gene durch Genexpressionsanalysen oder funktionelle Tests bzw. vorhandene Entwicklungsmutanten (Brannon et al., 1997; Dorsky et al., 2000; Laurent et al., 1997; McKendry et al., 1997; Ryu et al., 2001). Solche „Kandidaten“Ansätze sind limitiert und erfordern unter Umständen aufwändige Vorarbeiten. Eine alternative Vorgehensweise zur Zielgen-Identifizierung ist der Einsatz von kultivierten Zellen, in denen der Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert ist. Das Beispiel der Tumorzelllinien wurde bereits angeführt (s. 1.6.), eine weitere Möglichkeit bietet jedoch das ES-Zell-Cokultursystem (Arnold et al., 2000). Das ES-ZellCokultursystem wurde mit dem Ziel etabliert, entwicklungsbiologisch relevante Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu identifizieren, für die noch keine Hinweise auf eine Wnt-abhängige Regulation aus z.B. Genexpressionsanalysen vorliegen. Seite 16 Einleitung ES-Zellen (s. 1.1.1.) sind pluripotent, d.h. sie sind in der Lage, sich in alle Zelltypen des Organismus zu differenzieren (Evans und Kaufman, 1981; Martin, 1981). Es wurde gezeigt, dass ES-Zellen Frizzled-Rezeptoren und alle notwendigen Komponenten der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktionskette exprimieren (Arnold et al., 2000). Nach Stimulation durch Wnt-Proteine wurde in ES-Zellen die Stabilisierung von cytoplasmatischem β-Catenin und die Expression eines TCF/β-Cateninregulierten Reportergens beobachtet (Arnold et al., 2000). Die Identifizierung der Wnt/β-Catenin-Zielgene Brachyury (Arnold et al., 2000) und Cdx1 (Lickert et al., 2000) mit Hilfe von Wnt-stimulierten ES-Zellen zeigt, dass diese Eigenschaften genutzt werden können, um neue Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu finden. Abb. 1.3. Prinzip des ES-Zell-Cokultursystems. Maus ES-Zellen werden auf eine konfluente Zellschicht von Wnt-sezernierenden Fibroblasten ausgebracht. Im Verlauf der nächsten 24 h werden die beiden Zelltypen gemeinsam kultiviert (24 h Cokultur). Sezernierte Wnt-Proteine binden an die Rezeptoren der ES-Zellen (Frizzled-Rezeptoren und LRP-Corezeptoren). Nach Aktivierung des Wnt/βCatenin-Signalwegs kommt es zur Expression von TCF/β-Catenin-Zielgenen in den ES-Zellen. Nach Ablauf der Cokultur wird die Gesamt-RNA aus Fibroblasten und ES-Zellen isoliert. Abb. 1.3 zeigt das Prinzip des ES-Zell-Cokultursystems. Kultivierte ES-Zellen werden auf einen Zellrasen aus NIH 3T3-Fibroblasten ausgebracht. Die Fibroblasten wurden vorher stabil mit einem Expressionsvektor für das Wnt1-Gen transfiziert und exprimieren daher diesen Wnt-Liganden. Während einer Phase, in der die beiden Zelltypen gemeinsam kultiviert werden (deshalb Cokultur), kommen die ES-Zellen in den Kontakt mit den sezernierten Wnt1-Proteinen, wodurch der Wnt/β-CateninSignalweg in den ES-Zellen aktiviert und Zielgene dieses Signalwegs exprimiert Seite 17 Einleitung werden. Durch den Vergleich der Genexpressionsprofile von Wnt-stimulierten ESZellen und ES-Zellen eines Kontrollexperiments können diese Zielgene identifiziert werden. 1.8. Die Erstellung von Genexpressionsprofilen mit Hilfe von DNA-Microarrays Die auf der Paarung von komplementären Nukleinsäuresträngen basierende Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren durch Southern- bzw. NorthernHybridisierung gehört seit langem zu den Standardmethoden der molekularbiologischen Forschung (Southern, 1975). Mit Hilfe der NorthernHybridisierung können mRNA-Moleküle nachgewiesen werden, diese Methode eignet sich also grundsätzlich für die Detektion von Expressionsunterschieden zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen. Allerdings wird bei der NorthernHybridisierung in jedem Experiment nur eine einzige Transkriptsorte detektiert, weshalb diese Methode für die Erstellung von Genexpressionsprofilen nicht in Frage kommt. Die Detektion von Nukleinsäure-Molekülen mit Hilfe von DNA-Microarrays basiert ebenfalls auf der Paarung von komplementären Nukleinsäuresträngen, DNAMicroarrays ermöglichen aber die Detektion vieler verschiedener Transkripte in einem einzigen Experiment (Lockhart et al., 1996; Lockhart und Winzeler, 2000). DNA-Microarrays bestehen aus einem Trägermaterial (Glas oder Kunststoff), auf das in sehr hoher Dichte viele verschiedene Nukleinsäuremoleküle aufgebracht wurden, wobei die genaue Position jeder DNA-Spezies bekannt ist. Bezogen auf die Art der Fertigung und die Größe der aufgebrachten Nukleinsäuren kann man zwei verschiedene Typen solcher DNA-Microarrays unterscheiden, cDNA-Microarrays und Oligonukleotid-Microarrays. Bei der Herstellung von cDNA-Microarrays werden fertig synthetisierte und gelöste Nukleinsäuremoleküle in feinen Tropfen auf den Träger pipettiert, wo sie fixiert werden. Dagegen werden die Nukleinsäuren der Oligonukleotid-Microarrays durch ein Verfahren, dass photolithographische Methoden und DNA-Festphasensynthese verbindet, direkt auf dem Trägermaterial synthetisiert (Lipshutz et al., 1999; McGall et al., 1996). Während cDNA-Microarrays grundsätzlich auch Nukleinsäuren unbekannter Sequenz tragen können, sind für die Fertigung der Oligonukleotid-Microarrays genaue Sequenzinformationen notwendig (Lockhart und Winzeler, 2000). Beide Microarray-Typen ermöglichen die parallele Seite 18 Einleitung Detektion von vielen Tausend verschiedenen Transkripten, weshalb sie für die Erstellung von Genexpressionsprofilen hervorragend geeignet sind. 1.9. Aufbau von Affymetrix-Microarrays Für die Erstellung von Genexpressionsprofilen von ES-Zellen aus dem ES-ZellCokultursystem wurden im Verlauf dieser Arbeit Oligonukleotid-Microarrays der Firma Affymetrix verwendet (s. 2.3.1.). Um das Verständnis der generierten Expressionsdaten zu erleichtern, soll nachfolgend der spezielle Aufbau dieser Microarrays kurz erläutert werden (Lipshutz et al., 1999). Abb. 1.4. Schema der Repräsentation eines Gens auf Affymetrix-Microarrays. Jede Referenzsequenz wird von bis zu 20 Oligonukleotid-Sondenpaaren detektiert. Zur Detektion werden bevorzugt Sequenzabschnitte aus dem 3’-Bereich der codierenden Region ausgewählt. Jedes Sondenpaar besteht aus zwei Sondenzellen mit verschiedenen Oligonukleotiden. Die Oligonukleotide der einen Sondenzelle (PM für Perfect Match) stimmen vollständig mit der Referenzsequenz überein. Die Oligonukleotide der anderen Sondenzelle (MM für Mismatch) besitzen einen einzigen Basenaustausch. Nach der Hybridisierung der Microarrays wird das Fluoreszenzsignal aller Sondenzellen gemessen. Aus der Intensität und Verteilung der Fluoreszenzsignale für die einzelnen Sondenzellen wird berechnet, ob und in welcher Signalstärke ein Transkript detektiert wurde (nähere Erläuterungen siehe Text; nach Lipshutz, 1999). Die einzelnen Affymetrix-Arrays sind in mehrere Hunderttausend Areale (Sondenzellen) eingeteilt. Jede Sondenzelle enthält etwa 107 Kopien eines bestimmten Oligonukleotid mit einer Länge von 25 Nukleotiden. Die große Zahl an verschiedenen Sondenzellen ist notwendig, weil die Detektion jedes Transkripts über 20 verschiedene Oligonukleotidsequenzen erfolgt (s. Abb. 1.4). Die Auswahl der Oligonukleotidsequenzen erfolgt dabei anhand einer Referenzsequenz für jedes zu detektierende Transkript, wobei bevorzugt Oligonukleotide aus der 3’-Region eines Seite 19 Einleitung Trankripts ausgewählt werden. Durch den Einsatz mehrerer Sondensequenzen zur Detektion eines Transkripts steigt die Zuverlässigkeit des Transkript-Nachweises. Um diese Zuverlässigkeit weiter zu erhöhen, wurde jeder Sondenzelle, deren Oligonukleotide die entsprechende Referenzsequenz genau widerspiegeln, eine Sondenzelle gegenübergestellt, in deren Oligonukleotide an Position 13 eine Base ausgetauscht wurde. Oligonukleotiden mit perfekter Sequenzübereinstimmung zur Referenzsequenz (PM, d.h. Perfect Match) stehen also Oligonukleotide mit nur teilweiser Sequenzübereinstimmung (MM, d.h. Mismatch) gegenüber. Jedem zu detektierenden Transkript sind deshalb insgesamt 40 Sondenzellen bzw. 20 Sondenpaare auf dem Array zugeordnet (s. Abb. 1.4), die Gesamtheit dieser 20 Sondenpaare wird als Sondensatz (Probensatz) bezeichnet. Diese Anordnung der Sondenzellen ist Grundlage für die Berechnung der Signalstärke eines Transkripts und ermöglicht zudem, dass Kreuzhybridisierungen von der Analyse-Software erkannt werden können. Im Normalfall bindet das PMOligonukleotid wesentlich besser an das Zieltranskript, als das MM-Oligonukleotid, was durch ein deutlich stärkeres Fluoreszenzsignal (s. 2.3.3.) der PM-Sondenzelle im Vergleich zur MM-Sondenzelle sichtbar wird. Die Analyse-Software, mit der nach der Detektion der Fluoreszenzsignale die Auswertung erfolgt (s. 2.3.4.), ermittelt für jedes Sondenpaar die Differenz der Fluoreszenzintensitäten zwischen PM- und MMSondenzelle. Diese Differenzen sind die Grundlage für die Berechnung der Signalstärke und für die Aussage bezüglich der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Transkripts (s. 2.3.4.). Ein umgekehrtes Verhältnis der Fluoreszenzsignale von PMund MM-Sondenzellen wird von der Analyse-Software als Hinweis darauf gewertet, dass die betreffende Oligonukleotidsequenz das falsche Transkript erkennt. Bei der Arbeit kamen insgesamt drei Generationen von Affymetrix-Microarrays zum Einsatz, Mu6500-Arrays, Mu19k-Arrays sowie MG-U74-Arrays. Die Oligonukleotidsonden für die 6500 Gene bzw. ESTs, die mit den Mu6500-Arrays detektiert werden konnten, waren auf insgesamt vier unabhängige Träger verteilt (Mu6500 subA, B, C ,D), bei den Mu19k-Arrays (19000 Gene bzw. ESTs) waren es drei unabhängige Träger (Mu19k sub A, B, C). Von den drei verschiedenen MG-U74Arrays wurde nur der MG-U74A-Chip verwendet (12000 Gene bzw. ESTs). 1.10. Zielsetzung dieser Arbeit Zu Beginn dieser Arbeit waren nur wenige Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs bekannt. Die Identifizierung weiterer Zielgene würde jedoch wesentlich zum weiteren Seite 20 Einleitung Verständnis der biologischen Funktionen dieses Signalwegs beitragen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, bisher unbekannte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu identifizieren. Die Zielgensuche sollte zunächst auf der Grundlage des ES-ZellCokultursystems unter Anwendung von DNA-Microarrays erfolgen. Anschließend sollten einzelne Zielgen-Kandidaten genauer charakterisiert werden. Durch funktionelle Promotoranalysen in vitro und in vivo sollte geprüft werden, ob die Wntabhängige Regulation dieser Zielgen-Kandidaten direkt über LEF/TCF-Bindestellen in deren regulatorischen Sequenzen erfolgt. Die Analyse transgener Reportermäuse sollte zudem Hinweise darauf liefern, in welchem Gewebe und zu welchem Zeitpunkt die Zielgen-Kandidaten einer Wnt-abhängigen Regulation unterliegen. Daraus sollten sich Hinweise auf die biologische Funktion dieser Regulation ergeben. Seite 21 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Materialien 2.1.1. Chemikalien Häufig verwendete Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, in größtmöglichem Reinheitsgrad von folgenden Firmen bezogen: Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg), Bachem Fine Chemicals (Torrance, USA), Bio- Rad Laboratories GmbH( München), Carl Roth GmbH (Karlsruhe), Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, USA), Difco Laboratories (Detroit, USA), Eppendorf (Köln), Fluka AG (Buchs, Schweiz), Fine Chemicals AG (Uppsala, Schweden), Fisher Scientific GmbH (Schwerte), Gibco BRL (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), Invitrogen (Groningen, Holland), Merck AG (Darmstadt), Nunc GmbH & Co. KG (Wiesbaden), PAN Systems GmbH (Nürnberg), Qiagen AG (Hilden), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Sigma Chemie (München), Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg), Tropix (Bedford, USA) Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) bezogen: α-(32P) dCTP (3000 Ci/mmol; 10mCi/ml, wässrige Lösung) 2.1.2. Gebrauchswaren 0,5ml/1,5ml Reaktionsgefäße Einfrierröhrchen Einwegspritzen Einwegzellschaber Gewebekulturschalen Hybond- N+- Nylon- Membranen Kanülen Latex- Handschuhe Pipettenspitzen Röntgenfilme (BioMax MR, MS) Sterilfilter Whatman-Papier Zellkulturröhrchen 2.1.3. Eppendorf (Köln) Nunc (Roskilde, Dänemark) Becton Dickinson GmbH (Heidelberg) Costar (Cambridge, USA) Greiner (Nürtingen) Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) Terumo Europe N.V. (Leuven, Belgien) Carl Roth GmbH (Karlsruhe) Eppendorf (Köln) Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg) Schleicher und Schüll (Dassel) Schleicher und Schüll (Dassel) Falcon über Becton Dickinson (Heidelberg) Klonierungsvektoren und Wirtsbakterien Als bakterieller Klonierungsvektor wurde in der Regel das kommerziell erhältliche Plasmid pBluescriptII KS (+/-) (pKS; Stratagene GmbH, Mannheim) benutzt. Als eukaryotischer Expressionsvektor mit einer Neomycin-Resistenz und CMV-Promoter wurde der Vektor pCS2+ (Dr. Ralph Rupp, Tübingen) verwendet. Zur Expression des Luciferase–Reportergens unter der Kontrolle verschiedener Promoterkonstrukte kam der Vektor pGL3 basic (Promega GmbH, Mannheim) zum Einsatz. Zur internen Standardisierung der Luciferase-Messungen dienten der pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) oder der pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH, Mannheim). Um die Transfektionsrate von Zellen zu kontrollieren, wurde das GFP exprimierende Plasmid pEGFP-N3 (Clontech, Heidelberg) benutzt. Seite 22 Material und Methoden Die Klonierung sämtlicher Luciferase-Reporterkonstrukte mit dem Axin2- bzw. Follistatin-Promoter ist im Ergebnisteil beschrieben (s. 3.5.2.1. u. 3.6.2.1.). Als Wirtsbakterien dienten Epicurian ColiR XL1-blue und XL10-Gold (Stratagene, Heidelberg), TOP10F´(Invitrogen, Groningen, Holland) und DH5α (Clontech, Palo Alto, USA). 2.1.4. Bakterienmedien Bezeichnung Zusammensetzung / Herstellung für 1 Liter: 10g Bacto- Trypton; 5g Hefe- Extrakt; 5g NaCl; Auffüllen mit H2O, anschließend autoklavieren. LB-Medium Bei Bedarf wurden nach dem Autoklavieren Antibiotika (100 µg/ml Ampicillin oder 25 µg/ml Kanamycin) zugesetzt. LB-Agarplatten wie LB-Medium; zusätzlich 1,5 % (w/v) Bacto-Agar zugeben, nach dem Autkolavieren gießen. für 1 Liter: 21 g NZY Mediengrundlage (Gibco BRL #13635-024); Auffüllen mit H2O, anschließend autoklavieren. NZY+ Medium Danach folgende sterilfiltrierte Lösungen zugeben: 12,5 ml 1M MgCl2 12,5 ml 1M MgSO4 10 ml 2M Glucose 2.1.5. Eukaryotische Zelllinien Linie Spezies Typ NIH3T3-lacZ Maus NIH3T3-Wnt1 Maus ES-R1 Maus ES-D3 HEK293 Fibroblasten stabil mit lacZ-cDNA transfektiert Fibroblasten stabil mit Wnt1-cDNA transfektiert Referenz/ ATCCNummer (Kispert et al., 1998) (Kispert et al., 1998) embryonale Stammzellen (129/Sv) (Nagy et al., 1993) (Doetschman et al., Maus embryonale Stammzellen (129/Sv) 1985) ATCC-Nummer: Mensch embryonale, epitheliale Nierenzellen 45504 Zellkulturmedien s. Abschnitt 2.4. 2.1.6. Oligonukleotide und Enzyme Oligonukleotide wurden von der MWG- Biotech AG (Ebersberg) bezogen. Sämtliche molekularbiologischen Enzyme wurden von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg), Gibco BRL (Karlsruhe), MBI Fermentas (St. Leon-Rot), New England Biolabs (Beverly, USA), Qiagen (Hilden), Stratagene (Heidelberg) oder Roche Diagnostics GmbH (Mannheim) bezogen. Die Primer, die zur Amplifikation von Sequenzen aus einer cDNA-Mischung in konventionellen (s. 2.2.19.) oder quantitativen (s. 2.2.21.) RT-PCR Reaktionen zum Einsatz sind in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet. Seite 23 Material und Methoden Die Identifikationsnummern aus TIGR- (TIGR Gen-Index) oder NCBI- (GenBankNummer) Datenbanken für die verschiedenen Gene können den Tabellen in Abschnitt 3.2. entnommen werden. Gen 5’-Primer (5’→3’) 3’-Primer (5’→3’) Asf GCGTGAGGCAGGTGATGTATGT ACCCGGATGTAGGCAGTTTCTC AtfX CGGGCCGGGGGATTCAG GCTTCGGGCCTTATACACCTCAA Axin2 CCCTTACCCCACCCAACACT TCCGCAGGCAAATTCGTCACT Brachyury TGCTGCCTGTGAGTCATAAC ACAAGAGGCTGTAGAACATG Cadh.-7 Hom. CGCGCTTCGAGGAGGAGGTGT GGGTGGCGCAGCTGGTTTATG Cd97 GCTTCGGCCTGTTCCTCTTCAA TGGGCTGGCTGCATTCTGTTT Cdx1 CTCCCCAGTGCCCGTCAAG GCATGGGGTGCTAGGGCAG Cerr1 ACAATGTGGCTGGGGATGAT CAACGCCAGATAACCAACAGTAA ATTGGGGGCACCTATATCTCATCC GCCACTTTCCGCTCGTTCTCC Crbp1 ATCCGCACGCTGAGCACTTTTC CAGGCCCATCCCACTTGTTCC Dia2 TGGCTCCCGGAATGCTCAA GTGTCATGCTGCCCAGTAGTGTG Dmrt1 ATCGCGCAGGGTTTGTTGTTATT TGCCCGCTCTTCTCACTGGT Ebf1 TGCCCCACAACAACCAGGAGAT TTGGAGGGGAGGCTTGTAGATGAG Elk3 TCGGGCTCCAAAACCAAGTCTC TGGCATCATCCGTCATCTGTTCT GCAGGCCGCAGTGGATGAG TCTTGCTGGTGAGGGGATGTTTT CCCAGGCAGGCTTTCGTGTT TCCCCCTATTTCAGTGGCTTTATG CGACCATTACGCCGCCATTA TCGTTCTTATTCCGCCCCTCTG Filamin –Homolog TGGCATGGGTGAGGTGGAAGTT CGGCAGGCAGCTGGGTTAC Follistatin GTGGGCTGGATGGGAAAACCTACC GGCAGCTTCCTTCATGGCACACTC ACCACAGTCCATGCCATCACT GTCCACCACCCTGTTGCTGTA Glypican-3 CCAGCCGAAGAAGGGAACT AAAAAGGCACGCCACATCGAT Hint-1 Hom. GTTCGCCAACCGTCTTCTCC CGCCCATCTTGCCATCATTA Hmga2 CCGGGGGCATTCGTATAAGAAAAG TCCGATGCTTCAAGGCTGACAAG Igfbp3 CAGCCAGCGCTACAAAGTTGACTATG AAGGGCGGCATCGTTTCTTCTTAT Klf12 GATAGCGCTCATACCTTGTCCTCA CCCCCTCTCCTCGATTCTTTGT Lef1 GCAGCGGAGCGGAGATTACAC CACCACGGGCACTTTATTTGATG Chop-10 Endophilin 1 EpoxidHydrolase Fba Gapdh Seite 24 Material und Methoden Lhpp GCGCTCGAGTATGCCTGTGGTATC GCCTGGTGCCCTGGAAGTATGTG Mkk6 CTCCGCGGACTTTGTTGACTTTA GAGGACCCACCCGTATGACTTG Mmp1 GGCTGCCCACGGACAAGAT AGCAGTAGTACCGGCAGGACCA Mmp10 GCCCTGGATTTTATGGAGATGTT AGAGTGGGCCAAAATGCTGATA Ndr2 ACCGCCGAGACCTGAACTTTG GATGCTGTGCGAGACCGAGATA Nek1 GGGCTTTGGGCTGTGTCCTTTA CCTGTTTATGTTTTGGGGGTGGTT Neo CGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGG CAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCC Nip45 CGGGTGCAGGGGAAGGAGAA TGGGGCGAAAAATCACAATAATAAAA Nkx6.2 GCGCCCGCCCATCTTCTG AGGGGCCGGTTGTATTCGTCA GCAGCGCTAACCCCAATGAC ATCTCTCCCGATCGTCCCTTC Pace4a GGGGCCCAGCAGAGAAGAGTGTAT TAGATGGGCAAACGGGCAGACAG Pdgfrβ CTTTCAGCCCCACCAGTCCTA TGAACCCCCAGAGTGTGAAGTGTA Pgrp GCTGGGCTGGTGCGATGTA GGGGGATTCTCACTAGGTCTCAAG Pim1 GTGGCTTCGGCTCGGTCTACT GGGCTCCTCGTTCGGTGATAA Pkp2a GGCCGCCTCCTGCTGTGA CCGATGGGAGGAAGATGATGAGA GGCGCAGTGTATCAATGGCAAAGT ACCTCGTACCCTCGGGCTCTGA RelB CTGCCCCCACGCTCTTCACTAT AGCGCTGCAGATGTCCGATTC Rp42 CATGCCTTGCTCTCCTGCTGA GACCAATCCCTGTAACGTGAATAGAA sFrp2 CGCTCTTCGCCCCTGTCTGT TCGCCGCCCTGCTTCTGT Sprr2a GGGCCGTGTCGTCCTGTAGTGT TGGAGGATGAAGGGTGGAGAAGAT ATCCCTGAGGCTCCATCTTGAA AATAGCCTGGAAATCGTTGTTAGTGA TGTGAGCCCCGCAGAGAA GCTAACGCCGCCAGTGAA GGCGCTGTCCCCAAATCTG GGCCCATCCCACCACTTACTG Tgfβ2 GAAGGCGTTAGTCTGCATCTCACC CTCCTTCCCCCTGGCTTATTTG Troy CTGGCTGTGAATGTTAGGACTGGT GGGCGAAGGATGAAGAGAAAATG Tulp2 CAGCCCAGAAGAATACAGAAACAG GGGGTCCAGGGAGATGAGATA GTGATCGGGAACAGAGGGAGAG TACTGAAGCTGGGAGGCACATAG GATGCGGCTTCTAAGACTATTTCAG CACCGTACACTGCTTCATTTTCTC Nrp2 Prot.phosphatase 5 TC32971 (EST) TC35476 (EST) TC37382 (EST) Vasa Hom. Vldlr Seite 25 Material und Methoden Oligonukleotide, die im Verlauf der Microarray-Versuche eingesetzt wurden (s. Abschnitt 2.3): B2-Oligo: 5’-Bio-GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA-3’ T7-(dT)24 : 5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24-3’ Die 3,6 kb große 5’- flankierende Sequenz des Axin2-Gens (Ax2 P/I1; s. 3.5.1.) wurde durch PCR (s. 2.2.20.) aus genomischer DNA von Maus ES-Zellen amplifiziert. Dabei kamen folgende Primer zum Einsatz. Ax2 P/I1 5’-Primer: 5’-Pho-GGCATTCCACGGCTGTTTAATAAGTAA-3’ Ax2 P/I1 3’-Primer: 5’-Pho-TTCCCTCCTCCTCCTTTTTCTTCTTC-3’ Der 4 kb Follistatin-Promotor (s. 3.6.1.) wurde freundlicherweise von Egbert de Groot (de Groot et al., 2000) zur Verfügung gestellt. 2.1.7. in situ Hybridisierungssonden Plasmid cDNA antisense/sense Herkunft/Referenz pCMV-SPORT6Follistatin pSV-SPORT1Axin2 PT7T3D-PACWnt3a 73-1086 bp cDNA 1423-4202 bp cDNA 1399-2777 bp cDNA SalI, T7 / NotI, SP6 IMAGp998K118748 SalI, T7 / NotI, SP6 von B. Herrmann zur Verfügung gestellt EcoRI,T3 / PacI, T7 IMAGp998P08999 2.1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen Die Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser oder bidestilliertem Wasser (ddH2O) angesetzt und zum Teil autoklaviert oder sterilfilitriert. Bezeichnung 10x PCRReaktionspuffer 20x SSC 50x Denhardt´s Lösung 50x TAE 6x DNA-Ladepuffer DEPC-Wasser PBS PBT TE Tris-Puffer Zusammensetzung / Herstellung 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 15 mM MgCl2 3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; pH 7,0 (bzw. pH 4,5) 5 g Ficoll (Type 400, Pharmacia), 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g BSA in 500 ml ddH2O angesetzt 2 M Tris-HCl, pH 8,0; 1 M Essigsäure; 50mM EDTA 15% Ficoll-400; 0,1% Bromphenolblau; 0,1% Xylencyanol in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 0,1 % (v/v) DEPC wurden in ddH2O angesetzt, danach über Nacht bei 37°C inkubiert und anschließend autoklaviert pro Liter: 9 g NaCl; 0,2 g KCl; 1,15 g Na2HPO4; 0,2 g KH2PO4; auf pH 7,4 eingestellt PBS + 0,1% Tween-20 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 Seite 26 Material und Methoden 2.2. Molekularbiologische Methoden 2.2.1. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen Restriktionsendonukleasen binden spezifisch und schneiden doppelsträngige DNA an definierten Erkennungsstellen. Die Restriktionsenzyme wurden in dem vom Händler mitgelieferten Reaktionspuffer inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden bei der empfohlenen Temperatur (meist 37°C) für 1 h im Wasserbad inkubiert, die DNAFragmente elektrophoretisch aufgetrennt und analysiert (s. 2.2.4.). Gegebenenfalls wurden entsprechende DNA-Fragmente aus dem Agarose-Gel isoliert (s. 2.2.5.). 2.2.2. Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA Die alkalische Phosphatase (AP) katalysiert die Hydrolyse des 5’-Phosphatrestes von DNA, RNA und Nukleotidtriphosphaten. Das durch die Dephosphorylierung produzierte 5’-OH Ende kann nicht mehr mit dem 3’-OH Ende religieren. Die Dephosphorylierung wurde üblicherweise direkt im Anschluß an den Restriktionsverdau durch Zugabe von 1µl Calf Intestine Alkaline Phosphatase (Roche, Mannheim) in den Restriktionsansatz für 1h bei 37°C durchgeführt. Danach wurden die dephosphorylierten Plasmide über ein Agarosegel elektrophoretisch gereinigt und für die Ligationen (s. 2.2.8.) eingesetzt. 2.2.3. Auffüllen von 5’-überhängenden DNA-Enden Falls die Enden von DNA-Fragmenten mit den gewünschten Restriktionsschnittstellen im Vektor nicht kompatibel waren, wurden sie durch Behandlung mit der T4-DNAPolymerase aufgefüllt. Zu diesem Zweck wurde der Restriktionsansatz, nach der Spaltung mit den jeweiligen Enzymen, mit 1 U T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) und Desoxyribonukleotiden (dNTPs, 1 mM Endkonzentration) bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitzedenaturierung der Enzyme (10 min, 70°C) gestoppt und die DNA-Fragmente über ein Agarosegel elektrophoretisch gereinigt. 2.2.4. Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten DNA-Moleküle verschiedener Größen lassen sich durch Gelelektrophorese voneinander trennen. Die Art und Konzentration der Agarose bestimmt das Auflösungsvermögen der zu trennenden DNA. Zur Herstellung der Gele wurde die entsprechende Agarosemenge in Gelpuffer (1x TAE) unter Kochen gelöst, mit Ethidiumbromid (1 µg/ml Endkonzentration) versetzt und in vorgefertigte Gelkammern gegossen. DNA-Proben wurden mit 6x DNA-Ladepuffer versetzt und in die Geltaschen hinein pipettiert. Die Elektrophorese wurde bei 60-100 V durchgeführt. Der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid interkaliert während des Laufs in die DNA, weshalb die Auftrennung der DNA-Fragmente anschließend unter UV-Licht (254 nm oder 312 nm) sichtbar gemacht werden kann. Zur Größenbestimmung einzelner DNA-Fragmente dienten Standards definierter Fragmentlängen, meistens die 1 kb DNA-Leiter (Gibco/BRL, Eggstein). 2.2.5. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Für die Elution von elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde der „QIAquick Gel Extraction Kit” der Firma Qiagen verwendet. Seite 27 Material und Methoden Das Prinzip dieses Reinigungsverfahrens beruht auf der Bindung von DNA an eine Silikamembran unter hohen Salzkonzentrationen. Die DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel unter langwelligem UV-Licht (312 nm) ausgeschnitten. Das Agarosestück wurde zunächst im 3-fachen Überschuss einer 6 M NaI-Lösung bei 50°C aufgelöst. Die Lösung mit der DNA und der solubilisierten Agarose wurde dann auf eine QIAquick-Säule gegeben und mittels Zentrifugation durch das Säulenmaterial gepresst, wobei die DNA an die Silikamembran bindet. Nach einem Waschschritt mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer wurde die DNA mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA) von der Säule eluiert. (s. QIAquick Spin Handbook 03/2001). 2.2.6. Phenol/ Chloroform- Extraktion Unerwünschte Verschmutzungen in Nukleinsäurelösungen, insbesondere Proteinverunreinigungen, wurden mit der klassischen Methode der Phenol/ Chloroform- Extraktion entfernt. Die Nukleinsäurelösungen wurden nacheinander mit einem Volumen Phenol (pH 8,0), Phenol- Chloroform- Isoamylalkohol (25:24:1(v/v)) und einem Volumen Chloroform ausgeschüttelt. Es wurde dazwischen jeweils kurz mit maximaler Drehzahl zentrifugiert und die obere, wässrige Phase, unter Vermeidung der Interphase, in ein neues Gefäß überführt. Anschließend wurden durch Präzipitation der Nukleinsäuren (s. 2.2.7.) verbleibende Phenolreste aus der Lösung entfernt und die Nukleinsäuren in Tris-Puffer aufgenommen. 2.2.7. Präzipitation von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) Einer wässrigen Nukleinsäure-Lösung wurden 0,1 Volumenanteil einer 3M Natriumacetatlösung (pH 5,2) und 2,5 Volumenanteile 100% Ethanol zugegeben. Nach Inkubation für 10min bei –80°C wurde die präzipitierte DNA/RNA abzentrifugiert (15min; 4°C; 14000 rpm). Das Nukleinsäure- Pellet wurde noch mindestens einmal mit 70% Ethanol gewaschen, danach für ca. 10 min getrocknet und anschließend in Tris-Puffer (DNA) oder RNase-freiem Wasser (RNA) aufgenommen. Alternativ wurde bei zu großen Volumina mit 0,7 Volumenanteilen Isopropanol präzipitiert. Hierbei musste aber noch mindestens zweimal mit 70% Ethanol gewaschen werden. Bei geringen Mengen an zu fällenden Nukleinsäuren wurde durch die Zugabe von 1µl Glycogenlösung (Ambion #9510) die Effizienz der Präzipitation gesteigert. 2.2.8. Ligation von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA Die Ligation von DNA- Fragmenten mit Klonierungsvektoren wurde mit der T4DNA- Ligase (New England Biolabs, Beverly, USA) durchgeführt. Für eine Standard- Ligation wurden, nach Kontrolle der Mengen der DNA durch AgarosegelElektrophorese, ca. 25-30 ng Vektor- DNA und das zu klonierende DNA-Fragment im 2-5 fachen molaren Überschuss eingesetzt. Bei einem 10 µl Reaktionsansatz wurden 1 µl 10x Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,8; 0,1 M MgCl2; 0,2 M DTT; 500 µg/ml BSA; 10 mM ATP) sowie 0,5 µl T4 DNA- Ligase (2000 Units/µl) zugegeben und die Reaktion für 1-4 Stunden bei RT (für kohäsive Enden), oder über Nacht bei 14°C (für geglättete Enden) inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde ohne weitere Behandlung zur Transformation eingesetzt (je 5 µl). Seite 28 Material und Methoden 2.2.9. Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Bakterien Zur Herstellung chemokompetenter Zellen (Hanahan, 1983) wurden 400 ml LBMedium mit 1 ml einer frischen Bakterienübernachtkultur im Erlenmeyerkolben angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 geschüttelt. Anschließend wurden die Zellen 20 min auf Eis gekühlt, 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert und in 30 ml eiskaltem TFB1-Puffer (30 mM Natriumazetat, pH 5,8; 0,1 M NaCl; 50 mM MnCl2; 10 mM CaCl2; 15% Glycerol) aufgenommen und für 10-15 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Bakterien wie oben abzentrifugiert, in 4 ml eiskaltem TFB2Puffer (10 mM MOPS, pH 7,0; 75 mM CaCl2; 10 mM NaCl; 15% Glycerol) resuspendiert, in vorgekühlte Eppendorf-Gefäße aliquotiert und bei -80°C gelagert. Zur Transformation wurden die Aliquots auf Eis aufgetaut. Zu 50 µl kompetenten Zellen wurden 5-10 µl eines Ligationsansatzes oder 0,5 µg Plasmid-DNA gegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem anschließenden Hitzeschock (1 min, 42°C) wurden die Zellen mit 0,5 ml LB-Medium versetzt und für 45 min bei 37°C inkubiert (Thermoschüttler). Schließlich wurde der Transformationsansatz auf LB-Agarplatten ausplattiert, die, je nach Plasmidtyp, Ampicillin oder Kanamycin zur Selektion enthielten. Üblicherweise wurden pro µg zirkulärer DNA 1-5x107 Transformanten erhalten. 2.2.10. Herstellung und Transformation elektrisch kompetenter Bakterien Elektrokompetente Zellen wurden ausschließlich mit dem XL1-blue Bakterienstamm hergestellt. Hierbei wurden 500 ml LB-Medium mit 30 µl einer Bakteriensuspension (Aliquot von aufgetauten elektrokompetenten Zellen) angeimpft und ÜN bei Raumtemperatur bis zu einer OD600 von 0,5 geschüttelt. Alle weiteren Schritte wurden in mit ddH2O gewaschenen, autoklavierten, auf Eis vorgekühlten Zentrifugenbechern, bzw. autoklavierten und vorgekühlten Corex-Zentrifugenröhrchen im Kühlraum oder Eisbad durchgeführt. Die Bakteriensupension wurde 15 min auf Eis gekühlt, auf zwei Zentrifugenbecher verteilt (2 x 250 ml) und bei 4000 rpm für 15 min bei 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, die Bakterien im selben Volumen (2 x 250 ml) eiskaltem, autoklaviertem ddH2O resuspendiert und danach erneut abzentrifugiert (6000 rpm, 15 min, 4°C). Die erhaltenen Bakterienpellets wurden jeweils nochmals in 125 ml eiskaltem ddH2O resuspendiert und erneut bei 6000 rpm für 15 min bei 4°C abzentrifugiert. Jedes Pellet wurde dann in 5 ml 10% Glycerol (v/v) resuspendiert und in 30 ml Corex-Zentrifugenöhrchen überführt. Dies wurde bei 8000 rpm für 15 min bei 4°C zentrifugiert und das erhaltene Bakterienpellet zuletzt in 0,5 ml 10% Glycerol resuspendiert. Diese Bakteriensuspension wurde in 30 µl Aliquots in vorgekühlten 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefässen portioniert und bei –80°C gelagert. Zur Transformation wurden Aliquots auf Eis aufgetaut und salzfreier Ligationsansatz (DNA-Präzipitation notwendig) dazu pipettiert. Der Transformationsansatz wurde in eine vorgekühlte Elektroden-Küvette (Elektrodenabstand 0,2 cm) gegeben. Die Elektroporation wurde in einer Apparatur von Biorad (Gene Pulser und Pulse Controller) mit folgenden Einstellungen durchgeführt:: 1,6 kV, 25 µF, 200 Ω. Die Zeitkonstante des Impulses sollte zwischen 4,0 und 4,9 ms betragen (hängt von der Salzkonzentration des Ansatzes ab). Unmittelbar nach der Elektroporation wurde 1 ml LB-Medium in die ElektrodenKüvette pipettiert, die Bakteriensuspension wieder entnommen und 45 min bei 37°C inkubiert (Thermoschüttler). Schließlich wurden verschiedene Verdünnungen des Transformationsansatz auf LB-Agarplatten ausplattiert, die, je nach Plasmidtyp, Ampicillin oder Kanamycin zur Selektion enthielten. Üblicherweise wurden pro µg zirkulärer DNA 1-5x109 Transformanten erhalten. Seite 29 Material und Methoden 2.2.11. Identifizierung rekombinanter Kolonien Um zu überprüfen, ob eine Bakterienkolonie ein Plasmid mit dem richtigen Ligationsprodukt in der richtigen Orientierung trägt, wurde das Plasmid isoliert (s. 2.2.12.) und durch Restriktionsverdau und Gelelektrophorese (siehe 2.2.1. u. 2.2.4.) überprüft. 2.2.12. Präparation von Plasmid-DNA Zur Präparation von Plasmiden im Miniansatz wurden 3 ml LB-Medium (mit 100 µg/ml Ampicillin oder 25 µg/ml Kanamycin) mit einer einzelnen Bakterienkolonie angeimpft und in einem Reagenzglas über Nacht bei 37°C geschüttelt. 1,5 ml dieser Übernachtkultur wurden bei 14000 rpm für 2 min abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 250 µl P1-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM Glucose; 10 mM EDTA; 100 µg/ml RNAse A) resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte nach Zugabe von 250 µl P2-Puffer (0,2 M NaOH; 1% SDS) für 3-5 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 250 µl P3-Puffer (3 M Kaliumacetat, pH 4,8) 5 min auf Eis neutralisiert. Das Präzipitat aus Zelltrümmern und genomischer DNA wurde durch Zentrifugation (14000 rpm, 10 min, 4°C) pelletiert. Zur Fällung der Plasmid-DNA wurde der Überstand mit 500 µl Isopropanol versetzt, gemischt und abzentrifugiert (14000 rpm, 15 min, 4°C). Das Pellet wurde mit 70%-igem Ethanol gewaschen, in der Vakuum-Zentrifuge für 10 min getrocknet und in 75 µl Tris-Puffer resuspendiert. Die DNA-Ausbeuten lagen zwischen 5 und 15 µg. Größere Mengen hochreiner PlasmidDNA wurden mit „Präparations-Kits” der Firma QIAGEN nach Angaben des Herstellers isoliert. Die Zellen wurden bei diesen Methoden ebenfalls alkalisch lysiert. Die Reinigung der Plasmid-DNA erfolgt jedoch mit einer Anionen-AustauscherSäule. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Präparation homogener PlasmidDNA bis zu einer Menge von 600 µg. 2.2.13. DNA-Sequenzierung Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Didesoxy-Methode (Sanger et al., 1977) durchgeführt. Dazu wurde der „ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Perkin-Elmer Corp., Foster City, USA) nach Angaben des Herstellers verwendet. Das Prinzip der Methode liegt im Einbau fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide während der DNA-Synthese mit Hilfe einer modifizierten Taq-Polymerase (AmpliTaqFS). Die Fluoreszenzfarbstoffe lassen sich durch Laser-Licht anregen, wobei sie Licht vier verschiedener Spektralfarben entsprechend den vier Nukleotiden emittieren. Für einen Reaktionsansatz wurden 4 µl BigDyeTM Mix (enthält Farb-ddNTPs, dNTPs, Polymerase, Puffer und MgCl2), 1 µg dsDNA als Matrix, 10 pmol Primer mit ddH2O auf 10 µl Endvolumen in einem PCR-Röhrchen angesetzt. Die Proben wurden 25 Zyklen (96oC für 10 s, 55oC für 5 s und 60oC für 4 min) in einem Thermocycler (T3 Thermocycler, Biometra) amplifiziert und mit Centriflex Gelfiltrations-Säulen (MoBiTec, Göttingen) entsprechend den Angaben des Herstellers zur Entfernung überschüssiger Nukleotide aufbereitet. Die DNA wurde für 15 min in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Das Pellet wurde in 5 µl ddH2O aufgenommen und mit 10 µl Template Suppression Reagenz (Perkin-Elmer) gemischt. Der Ansatz wurde für 2 min bei 100oC denaturiert, schnell auf Eis gekühlt und im „ABI PRISM 310 Genetic Analyzer” (Perkin-Elmer) automatisch sequenziert. Seite 30 Material und Methoden 2.2.14. Ortsgerichtete Mutagenese Um die direkte Regulation des Axin2- bzw. Follistatin-Promoters durch βCatenin/TCF-Komplexe zu zeigen, wurden die LEF/TCF-Bindestellen innerhalb dieser Promotoren durch ortsgerichtete Mutagenese mutiert. Zur Herstellung der zielgerichtet mutierten Promoter-Konstrukte wurde das „QuikChangeTM Multi SiteDirected Mutagenesis Kit“ (Stratagene, Heidelberg) benutzt. Dieses System erlaubt die gleichzeitige Mutagenese von bis zu fünf Zielsequenzen innerhalb eines Plasmids in nur wenigen Schritten. Im Falle von Follistatin wurden die vier LEF/TCF-Bindestellen, die auf dem 2,8 kb Follistatin-Promoterfragment liegen, mutiert. Für die Mutagenese wurde das 2,8 kb (KpnI/HindIII) Fragment aus dem Foll 2,8kb-Luc-Konstrukt (s. 3.6.2.1.) in den KpnI/HindIII geöffneten pBluescriptKS-Vektor subkloniert. Die regulatorische Region des Axin2-Gens (Ax2 P/I1), die in dieser Arbeit untersucht wurde, war insgesamt ca. 3,6 kb lang und wies insgesamt sieben TCF-Bindestellen auf. Für die Mutagenese wurden deshalb jeweils ein 1 kb großes HindIII-Fragment (mit den TCFBindestellen 1-3) sowie ein 2 kb großes KpnI/SpeI-Fragment mit den TCFBindestellen 4-7) aus dem Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt (s. 3.5.2.1.) in den mit den entsprechenden Enzymen geöffneten pBluescriptKS-Vektor subkloniert. Nach erfolgter Mutagenese (s.u.) wurden die jeweiligen Fragmente mit den mutierten TCFBindestellen wieder aus den pBluescriptKS-Subklonen ausgeschnitten und wieder in die entsprechenden Promotor-Luc Konstrukte (bzw. Promotor-lacZ Konstrukte, s. 2.5.8.) eingefügt. Ablauf der PCR-basierten Mutagenese: Für jede Zielsequenz (DNA-Region um die TCF-Bindestelle) wurde ein 25-45 Basen langer Primer hergestellt, der an den beiden Enden mit jeweils 10-15 Basen exakt komplementär zu der Zielsequenz war, in der Mitte aber die gewünschte Mutation (d.h. Sequenzveränderung) enthielt. Die Primer, die zusammen in einer MutageneseReaktion eingesetzt werden sollten, mussten alle zu dem selben Plasmidstrang komplementär sein. Die Mutagenese-Reaktion lief dann wie folgt ab: die PlasmidDNA mit den Zielsequenzen (aus E. coli aufgereinigt und somit methyliert) wurde mit den Mutagenese-Primern, freien Desoxynukleotiden, einem Enzym-Cocktail (QuikChangeTM Multi Enzyme Blend, enthält PfuTurbo DNA Polymerase), Reaktionspuffer und Wasser nach Angaben des Herstellers gemischt und in einer PCR-Maschine (T3 Thermocycler, Biometra) folgendem Temperaturprogramm unterworfen. Nach einminütiger Denaturierung bei 95°C wurde die gewünschte DNASequenz über 30 Zyklen wie folgt amplifiziert: 1. Denaturierung 95°C, 30 s 2. Hybridisierung 55°C, 1 min 3. DNA-Synthese 65°C, 2 min / kb Plasmidlänge In jedem dieser Zyklen wurden die Primer, die an den komplementären Plasmidstrang gebunden haben, bis zum nächsten gepaarten Primer verlängert. Der neu synthetisierte Strang wies deshalb zunächst Einzelstrangbrüche an den Übergängen zwischen neu synthetisierter DNA und darauf folgendem Primer auf, diese Einzelstrangbrüche wurden aber durch eine Ligaseaktivität in dem Enzymcocktail repariert. Da die eingesetzten Primer in den neu synthetisierten Strang inkorporiert wurden, wies dieser auch die gewünschten Mutationen auf. Darüber hinaus war die DNA des in vitro neu synthetisierten Strangs nicht methyliert, weshalb der komplementäre Strang aus „parentaler“ Plasmid-DNA durch die methylierungssensitive Restriktionsendonuklease DpnI in einem nächsten Schritt selektiv verdaut werden konnte. Dazu wurde der abgekühlte Reaktionsansatz mit 10 U dieses Restriktionsenzyms versetzt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde ein Teil des Seite 31 Material und Methoden Reaktionsansatzes nach Angaben des Herstellers für die Transformation von XL10Gold ultrakompetenten Bakterien (Stratagene, Heidelberg) verwendet. Rekombinante Klone wurden anhand der durch die Mutagenese-Primer neu eingefügten Restriktionsschnittstellen identifiziert (s. 2.2.1). Der nachfolgenden Tabelle sind die Sequenzen der Oligonukleotide zu entnehmen, die zur Mutagenese der einzelnen LEF/TCF-Bindestellen (TBE) verwendet wurden. Die ursprüngliche Position der LEF/TCF-Bindestelle ist jeweils durch eine Unterstreichung hervorgehoben; ausgetauschte Basen sind durch kleine Buchstaben gekennzeichnet. Bezeichnung Sequenz Ax2/TBE1-mut GCCTGTTTACTTTCTTGCTcaGcTGTTGGGTAGATCTGG Ax2/TBE2-mut GCTCAGATTTCGCCTcTagAAAAGCTGCGTCGGATAC Ax2/TBE3-mut CTCTTTAAAAGTTTGAAGtgCAcAGCCTCTAAGTTAGTGAACTGG Ax2/TBE4-mut GGGGCGGCGCTcTagAGTTGGCAGGCCG Ax2/TBE5-mut CCGGCGCGCTcaGcTGTGCGGGGCG Ax2/TBE6-mutII GGCTCGCGCCTcTGcAGTGCACAGTTAAATCC Ax2/TBE7-mutII GACCGGCTGCGCcTcGAgAAGGTCCTGGC Foll/TBE1-mut/n CTCCTGCCGCcTcGAgTTCGGGCACCTC Foll/TBE2-mut/n GAAATTTAAAAGGCAGCTcTagAATAAACAATATAGCCTTTTCCGTGAAG Foll/TBE3-mut/n GCCCACTTTCAgctGGGGGCTTGGGCCC Foll/TBE4-mut/n GAAGAAAACAGTTCAACcTcGAgATTCTGCCGTTAAGTGGC 2.2.15. Southern-Blot Analyse Zur Genotypisierung der Nachkommen verschiedener Mauslinien wurden Southern Blot Analysen (Chomczynski und Qasba, 1984; Southern, 1975) durchgeführt. Mit Restriktionsenzymen verdaute DNA wurde, wie in 2.2.4. beschrieben, auf Agarosegelen aufgetrennt und mit Längenstandards photographiert. Das Gel wurde 15 min lang mit 0,25 M HCl behandelt (Depurinierung; verbessert die Effizienz, mit der große Fragmente auf die Filter transferiert werden) und anschließend mit deionisiertem Wasser gespült. Danach wurde das Gel für mindestens 30 min in 0,5 M NaOH / 1,5 M NaCl-Lösung behandelt (Denaturierung) und anschließend weitere 30 min in 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 / 1,5 M NaCl-Lösung neutralisiert. Zum Blotten wurde der Aufbau nach Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989) verwendet. Der Transfer wurde ÜN durchgeführt und die DNA wurde mit 3600 J UV-Bestrahlung (UV Stratalinker, Stratagene) an die Nylonmembran quervernetzt. 2.2.16. Radioaktive Markierung von DNA- Sonden Radioaktiv markierte DNA- Sonden wurden nach der Methode von Feinberg und Vogelstein (Feinberg und Vogelstein, 1983) durch Einbau von α-(32P)dCTP durch das Klenow- Fragment der DNA- Polymerase I bei der Synthese von zufällig geprimter DNA gewonnen. Es wurden die Komponenten des „MegaprimeTM DNA Labelling Kits“ (Amersham Pharmacia) folgendermaßen benutzt: 100 ng eines DNA-Fragments wurde mit 5 µl der Lösung mit Zufallshexameren („Primer solution“) in einem Gesamtvolumen von 33 µl (mit ddH2O aufgefüllt) für 5 min gekocht und sofort auf Eis abgekühlt. Dazu wurden 10 µl Markierungspuffer, 5 µl α-(32P)dCTP und 2 µl Seite 32 Material und Methoden Klenow- Enzym gegeben. Der Reaktionsansatz wurde für mindestens 30 min bei 37°C inkubiert. Nicht eingebaute Nukleotide wurden durch Gelfiltration über Sephadex G- 50 Säulen (Nick-ColumnsTM, Pharmacia) nach Angaben des Herstellers abgetrennt und die Radioaktivität von 1% des Eluats in einem FlüssigkeitsSzintillationszähler (Wallac 1410; Pharmacia) gemessen. Die markierte DNA wurde direkt vor der Zugabe zu der Hybridisierungs- Lösung durch 5 min Kochen denaturiert und sofort auf Eis abgekühlt. 2.2.17. Hybridisierung von Southern-Blots Die Membranfilter mit den immobilisierten Nukleinsäuren wurden in Glasröhren überführt und für 2-3 h bei 65°C mit 15 ml für 5-10 min vorgekochter Vorhybridisierungslösung (4x SSC; 1% SDS; 1% Fett-freies Milchpulver; 333 µg/ml Lachssperm-DNA) unter ständiger Bewegung abgesättigt. Die Hybridisierungslösung (20% (w/v) Dextransulfat; 4x SSC; 1% SDS; 1% Fett-freies Milchpulver; 500 µg/ml Lachssperm-DNA) wurde mit 106-107 cpm/ml radioaktiv markierter Sonde versetzt und für 10 min gekocht. Die Vorhybridisierungslösung wurde verworfen und der Membranfilter über Nacht bei 65°C bei ständiger Bewegung mit dieser Hybridisierungslösung inkubiert. Anschließend wurden die Filter zweimal kurz mit 2x SSC/ 0,1% SDS bei RT, und zweimal 15-30 min mit 0,1x SSC/ 0,1% SDS bei 65°C gewaschen. Die Filter wurden in Plastikfolie eingeschweißt und bei –80°C auf Kodak-Röntgenfilmen exponiert. 2.2.18. Reverse Transkription von RNA in cDNA Für die Reverse Transkription im Rahmen von RT- PCRs wurde lediglich der korrespondierende Strang cDNA als DNA- Einzelstrang synthetisiert und anschließend die PCR mit den genspezifischen Oligonukleotiden durchgeführt. Die cDNA- Synthese im Rahmen von RT-PCRs wurde mit dem „SUPERSCRIPTTM FirstStrand Synthesis System for RT-PCR“ (Gibco BRL Life Technologies) nach Angaben des Herstellers in einem Thermozykler (T3 Thermocycler, Biometra) durchgeführt. Als Ausgangsmaterial diente Gesamt-RNA, die aus cokultivierten ES-Zellen isoliert wurde (s. 2.4.5.). Um eventuelle Kontaminationen der RNAs mit genomischer DNA auszuschließen wurde vor der Reversen Transkription ein DNaseI- Verdau der RNA durchgeführt. Hierzu wurden 2,5 µg Gesamt- RNA in folgendem Reaktionsansatz für 15min bei RT inkubiert: x µl 0,7 µl x µl 0,7 µl 7 µl entspr. 2,5 µg Gesamt- RNA 10x DNaseI- Puffer (200mM Tris-HCl pH 8,4; 20mM MgCl2; 500 mM KCl) ddH2O DNaseI; 1U/µl Gesamtvolumen Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1µl 25mM EDTA- Lösung (pH 8,0) und Erhitzen auf 65°C (10min) beendet. Anschließend erfolgte das Anlagern der Oligo(dT)-Primer an die Poly(A)-Enden der mRNA-Moleküle. Dazu wurde die DNaseI- verdaute RNA mit 1µl Oligo(dT)12-18Primer und 1 µl dNTP-Mix (10 mM) versetzt, dieser Ansatz für 5min auf 65°C erhitzt und danach sofort auf Eis abgekühlt. Seite 33 Material und Methoden Anschließend wurde der folgende Reaktionsmix angesetzt: 10µl 2µl 4µl 2µl 1µl RNA nach DNaseI- Verdau und Primer-Anlagerung (inkl. dNTPs) 10x RT- Puffer 25mM MgCl2 100mM DTT RNaseOUT RNase Inhibitor Der Reaktionsmix wurde für kurze Zeit (ca. 2 min) auf 42°C erwärmt und nach Zugabe von 1 µl Reverse Transkriptase (SuperScriptII 50U/µl) weitere 50 min bei dieser Temperatur inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch 15-minütiges Erhitzen auf 70°C gestoppt und der Reaktionsansatz auf Eis abgekühlt. Die RNA wurde anschließend durch Inkubation mit 1µl RNaseH (2U/µl) für 20min bei 37°C verdaut. Jeweils 1 µl der synthetisierten Einzelstrang-cDNA wurde in PCR- Reaktionen (s. 2.2.19.) mit genspezifischen Primern für Expressionsanalysen eingesetzt. Für semiquantitative Analysen der Genexpression wurde die PCR mit der optimalen Anzahl von Reaktionszyklen durchgeführt und stets als Kontrolle des Einsatzes gleicher cDNA- Mengen zeitgleich die PCR für ein ubiquitär exprimiertes sog. Haushaltsgen durchgeführt (meistens Gapdh). Die cDNA wurde auch für quantitative „real-time PCR“ mit dem LightCycler -System (Roche, Mannheim) eingesetzt (s. 2.2.21.). 2.2.19. Polymerase-Kettenreaktion („PCR“) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR = „polymerase chain reaction“; (Saiki et al., 1988; Saiki et al., 1985) ermöglicht die in vitro Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz aus einem Nukleinsäuregemisch unter Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) (Chien et al., 1976), sowie eines sequenzspezifischen Oligonukleotid-Primerpaares. Standard PCR-Reaktionen wurden wie folgt ausgeführt. 1-50 ng template-DNA wurde mit jeweils 10 pmol der beiden Primer, 2,5 µl 10x PCR-Reaktionspuffer, 0,5 µl 10 mM Desoxyribonukleotidlösung (dNTPs), 2,5 U Taq-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) und bidestilliertem Wasser in einem Gesamtvolumen von 25 µl gemischt. Nach zweiminütiger Denaturierung bei 95°C in einer PCRMaschine (T3 Thermocycler, Biometra) wurden die gewünschten DNA-Sequenzen über 18-35 Zyklen wie folgt amplifiziert: 1. Denaturierung 94°C, 30 s 2. Hybridisierung 50-65°C, 30s 3. DNA-Synthese 72°C, 30-120 s Unvollständige Produkte wurden in einem Terminationsschritt aufgefüllt (72°C, 300 s). Anschließend wurde der Ansatz auf 4°C gekühlt. Ein Aliquot jedes PCR-Ansatzes wurde auf einem Agarosegel analysiert. Für manche nachfolgenden Anwendungen wurden die überflüssigen Nukleotide, Polymerase und Salze aus dem PCR-Ansatz durch Gelfiltrationssäulen (MoBiTec, Göttingen) entfernt. 2.2.20. Klonierung von PCR-Produkten Sollten PCR-Fragmente kloniert werden, wurde die PCR mit der ProofStart Polymerase (Qiagen, Hilden) oder der PfuTurboTM Polymerase (Stratagene, Heidelberg) nach den entsprechenden Anleitungen durchgeführt. Diese Enzyme besitzen neben der prozessiven 5’-3’-DNA-Polymeraseaktivität zusätzlich eine 3’-5’Exonukleaseaktivität (Korrekturlesefunktion) und bauen deshalb ungefähr zehnmal weniger falsche Nukleotide ein als die Taq-Polymerase. Seite 34 Material und Methoden Um PCR-Produkte zu klonieren, wurden diese in den SmaI-geschnittenen pBluescriptKS-Vektor ligiert (s. 2.2.8.). Dazu mussten entweder die eingesetzten PCR-Primer am 5‘-Ende phosphoryliert sein oder das fertige PCR-Produkt phosphoryliert werden, da die 5‘-Enden des linearisierten Vektors im Anschluss an den SmaI-Verdau dephosphoryliert (s. 2.2.2.) worden waren. Die Phosphorylierung von PCR-Produkten erfolgte mit der T4 Polynukleotid-Kinase. Dazu wurde die Menge PCR-Produkt, die anschließend zur Ligation eingesetzt werden sollte, mit 1 µl 10xT4 Ligase-Puffer (New England Biolabs, Beverly, USA), 5 U T4 PolynukleotidKinase (New England Biolabs, Beverly, USA) und bidestilliertem Wasser in einem Gesamtvolumen von 10 µl gemischt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz für 20 min bei 65°C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Das so behandelte PCR-Produkt konnte dann direkt für die Ligation eingesetzt werden (s. 2.2.8.). 2.2.21. Quantitative PCR mit dem LightCycler -System Die quantitative Auswertung konventioneller PCR-Reaktionen, um z. B. das Mengenverhältnis einer bestimmten cDNA zwischen zwei Proben zu ermitteln, gestaltet sich relativ schwierig und ist fehlerbehaftet. Ursache für das Problem ist, dass bei jeder PCR-Reaktion die Produktmenge nur über eine gewisse Spanne von Reaktionszyklen exponentiell ansteigt. Dies wiederum führt dazu, dass beim Vergleich zwischen zwei PCR-Reaktionen mit unterschiedlicher Konzentration der zu amplifizierenden cDNA, das Verhältnis der jeweiligen Produktmengen abhängig ist vom Zeitpunkt der Probenentnahme. Eine Lösung dieses Problems liegt darin, die Produktmenge der PCR-Reaktionen nach jedem einzelnen Synthesezyklus zu messen und zur Anzahl der Reaktionszyklen ins Verhältnis zu setzen. Für diese Arbeit wurde das LightCycler-System (Roche, Mannheim) für die Durchführung und Auswertung quantitativer PCR-Reaktionen benutzt. Bei diesem System werden die PCRReaktionen in dünnen Glaskapillaren durchgeführt. Im Reaktionsmix ist neben Puffersubstanzen, genspezifischen Primern (s. 2.1.6.), Desoxynukleotiden und einer hitzestabilen DNA-Polymerase auch ein Fluoreszenzfarbstoff (SYBR Green I) enthalten, dessen Fluoreszenz durch die spezifische Bindung an doppelsträngige DNA stark ansteigt. Dies ermöglicht die Messung der Produktmenge einer PCR-Reaktion nach jedem Synthesezyklus über die Messung eines Fluoreszenzsignals. Somit gewinnt man einen genauen Überblick über den „zeitlichen“ Verlauf jeder PCRReaktion und kann quantitative Aussagen bezüglich der Produktmengen von PCRReaktionen treffen. LightCycler-Reaktionen wurden mit dem „FastStart DNA Master SYBR Green I – Kit“ (Roche #2239264) ausgeführt. 2 µl einer template-cDNA-Lösung (s. 2.2.18.) wurden mit 18 µl eines Reaktionsmix vermischt (s. Anleitung des „FastStart DNA Master SYBR Green I – Kit“), in eine LightCycler-Kapillare pipettiert und die gewünschte DNA-Sequenz im LightCycler-Instrument (Roche, Mannheim) wie folgt amplifiziert: 10 min bei 95°C zur Aktivierung der FastStart DNA-Polymerase, danach 45 Reaktionszyklen mit folgenden Temperaturen 1. Denaturierung 95°C, 15 s 2. Hybridisierung 50-65°C, 5 s 3. DNA-Synthese 72°C, 15-30 s Nach jedem Synthesezyklus wurde die Intensität der SYBR Green I-Fluoreszenz gemessen und aufgezeichnet. Nach Beendigung des letzten Synthesezyklus wurde eine Schmelztemperaturanalyse des PCR-Produkts durchgeführt. Dazu wurde die Temperatur des Reaktionsansatzes langsam von 65°C auf 95°C erhöht und die SYBR Green I-Fluoreszenz kontinuierlich gemessen und aufgezeichnet. Anschließend wurde Seite 35 Material und Methoden der Ansatz wieder heruntergekühlt und ein Aliquot jedes PCR-Ansatzes wurde auf einem Agarosegel analysiert. Die Schmelztemperaturanalyse des PCR-Produkts und die Agarosegelelektrophorese wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass tatsächlich das zu erwartende Produkt amplifiziert wurde. 2.3. Expressionsanalyse mit dem Affymetrix GeneChip System 2.3.1. Prinzip Die Firma Affymetrix (Santa Clara, USA) stellt sog. Oligonukleotid-Microarrays („Gen-Chips“) her, mit denen in einem einzigen Experiment die Expression mehrerer Tausend Gene, untersucht werden kann. DNA-Oligonukleotide (je 25 Basen lang), die jeweils kurze Abschnitte der codierenden Sequenz von Genen repräsentieren, werden kombinatorisch mit Hilfe von photolithographischen Masken direkt auf einer Glasoberfläche synthetisiert (Lipshutz et al., 1999; McGall et al., 1996). Für eine Genexpressionsanalyse wird RNA (polyA-RNA oder Gesamt-RNA) aus den zu untersuchenden Zellen oder Geweben isoliert. Anschließend wird die RNA revers transkribiert, wobei ein Oligo(dT)-Primer zum Einsatz kommt der am 5‘-Ende durch einen T7-Promoter verlängert ist. Nach Erst- und Zweitstrang-DNA-Synthese erhält man als Produkte cDNAs mit angehängtem T7-Promoter. Diese cDNAs dienen im nächsten Schritt wieder als Matrize für eine in vitro-Transkription mit der T7 RNAPolymerase. Der Reaktionsmix für die in vitro-Transkription enthält biotinylierte Nukleotide, Endprodukt dieser Reaktion ist also biotinylierte cRNA. Neben der Biotin-Markierung der cRNA-Moleküle dient dieser Schritt auch der Signalverstärkung, da ein einzelnes cDNA-Molekül mehrfach in cRNA transkribiert werden kann. Die biotinylierte cRNA wird (nach Hitzefragmentierung) zur Hybridisierung mit den Oligonukleotiden auf dem Gen-Chip eingesetzt. Hybridisierte cRNA wird schließlich mit Hilfe eines fluoreszierenden Streptavidin-PhycoerythrinKonjugats in einem Laserscanner nachgewiesen und quantifiziert, die Daten mit Hilfe spezieller Software analysiert. Die Expressionsanalysen in dieser Arbeit wurden nach dem Protokoll von Affymetrix (Expression Analysis – Technical Manual) durchgeführt. Die wichtigsten Schritte sind nachfolgend aufgeführt. 2.3.2. Präparation der biotinylierten cRNA für die Hybridisierung RNA aus cokultivierten ES-Zellen wurde wie in 2.4.5. beschrieben isoliert. Für die cDNA-Synthese wurde das „Superscript Choice System“ (Gibco BRL #18090-019) verwendet. Je 30 µg Gesamt-RNA wurden mit 0,1 nM T7-Oligo-dT-Primer für 10 min bei 70°C denaturiert, auf Eis abgekühlt und dann mit 400 U Superscript II bei 42°C für 1 h revers transkribiert (in 1 x Erststrangpuffer, 10 mM DTT, 0,5 mM dNTP-Mix, Gesamtvolumen 20 µl). Anschließend wurde die Zweitstrangysnthese durchgeführt. Dazu wurden dem Reaktionsmix 40 U DNA Polymerase I, 10 U E. coli DNA-Ligase, 2 U RNaseH, 30 µl 5 x Zweitstrangpuffer, 3 µl 10 mM dNTP-Mix und RNase-freies Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 150 µl zugegeben und das Ganze für 2 h bei 16 °C inkubiert. Danach wurde der Ansatz noch mit 10 U T4-DNAPolymerase versetzt und weitere 5 min bei 16 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) abgestoppt und die cDNA durch einmalige Phenol/Chloroform Extraktion (Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol 25:24:1, Ambion #9732) gereinigt. Zur besseren Phasentrennung nach der Extraktion wurde ein inertes Gel (Phase Lock Gel, Eppendorf #188233) benutzt. Durch Zugabe von 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat-Lösung und 2,5 Volumen 100% Ethanol wurde die cDNA gefällt, für 20 min bei 14000 rpm (RT) abzentrifugiert und nach einmaligem Waschen mit 80% Ethanol in 12 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen. Seite 36 Material und Methoden Je 2,5 µl dieser cDNA wurden für die in vitro-Transkription (T7 RNA-Polymerase) mit dem „BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit“ (Enzo, #900182) nach Angaben des Herstellers eingesetzt. Bei der in vitro – Transkription wurden Biotinmarkiertes CTP und UTP in die cRNA eingebaut. Die Biotin-markierte RNA wurde anschließend mit RNeasy Säulen (RNeasy Mini Kit, Qiagen, s. 2.4.5.) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt, in 30 µl RNase-freiem Wasser aufgenommen und die RNA-Menge und Konzentration photometrisch bestimmt. Die biotinylierte RNA wurde dann in 40 mM Tris-Acetat (pH 8,0), 100 mM Kalium-Acetat und 30 mM Magnesium-Acetat (möglichst kleines Gesamtvolumen) für 35 min bei 95 °C fragmentiert und anschließend bis zur Chip-Hybridisierung eingefroren Ein Aliquot der fragmentierten cRNA wurde zur Kontrolle auf einem 1 % Agarosegel analysiert. 2.3.3. Hybridisierung der Oligonukleotid-Microarrays und Detektion der hybridisierten cRNA Lösungen: Bezeichnung Zusammensetzung / Herstellung für 1 Liter: 70,4 g MES (freie Säure, Monohydrat; Sigma, 12 x MES #M5287), 193,3 g MES-Natriumsalz (Sigma #M3885), Pufferlösung Auffüllen mit DEPC-H2O, danach sterilfiltrieren. Der pH(1,22 M MES-Puffer) Wert sollte zwischen 6,5 und 6,7 liegen. für 250 ml: 41,7 ml 12 x MES-Pufferlösung, 92,5 ml 5M 2 x Färbepuffer NaCl, 2,5 ml 10 % Tween-20 (Pierce #28320) und 112,8 ml DEPC-H2O mischen und sterilfiltrieren. 2 x MES 0,2 M MES-Puffer, 1,77 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02 % Hybridisierungslösung Tween-20, angesetzt mit DEPC-H2O für 1 Liter: 175,32 g NaCl, 27,6 g NaH2PO4, 7,45 g EDTA in ca. 800 ml DEPC-H2O lösen. pH-Wert mit 10 N NaOH 20 x SSPE einstellen auf pH 7,4, danach mit DEPC-H2O auf 1 Liter auffüllen und sterilfiltrieren. für 1 Liter: 300 ml 20 x SSPE, 1 ml 10 % Tween-20 (Pierce Waschpuffer A #28320) und 698 ml DEPC-H2O mischen. Sterilfiltrieren und danach 1 ml 5 % Antifoam (Sigma #A8082) zugeben. für 1 Liter: 83,3 ml 12 x MES Pufferlösung, 5,2 ml 5 M Waschpuffer B NaCl, 1 ml 10 % Tween-20 (Pierce #28320) und 910,5 ml DEPC-H2O mischen und sterilfiltrieren. Durchführung: Um die Qualität der cRNA zu überprüfen, wurden vor dem eigentlichen ChipExperiment kleine Test-Arrays (Test2-Arrays) mit jeweils 5 µg fragmentierter cRNA hybridisiert und ausgewertet. Für die anschließende Hybridisierung der Mu19ksowie der MG-U74A-Chips wurden 30 µg fragmentierte cRNA pro Chipsatz eingesetzt. Die Hybridisierungslösung enthielt 0,1 M MES-Puffer, 0,885 M NaCl, 20 mM EDTA, 0,01 % Tween 20 (Pierce #28320), 0,5 mg/ml BSA (Gibco BRL #15561020), 0,1 mg/ml Hering Sperma DNA (Promega #D1811) sowie die entsprechende Menge fragmentierte cRNA. Zusätzlich enthielt die Hybridisierungslösung kleine Mengen einer Kontroll-cRNA-Mischung (BioB, BioC, BioD, Cre; s. AffymetrixHandbuch) sowie 0,1 nM eines biotinylierten Kontroll-Oligonukleotids (B2-Oligo). Beide Komponenten waren für die Auswertung der Array-Hybridisierung von Bedeutung. Die Affymetrix-Microarrays wurden mit 1 x MES Hybridisierungslösung Seite 37 Material und Methoden für ca. 15 min bei 45 °C im Hybridisierungsofen (GeneChip Hybridization Oven 640; Affymetrix, Santa Clara, USA) vorinkubiert. Währenddessen wurde der Hybridisierungscocktail für 5 min bei 99 °C erhitzt, danach für weitere 5 min bei 45 °C inkubiert und schließlich 5 min bei 14000 rpm (RT) abzentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu sedimentieren. Der zur Vorinkubation eingesetzte 1 x MES Puffer wurde nun durch den Hybridisierungscocktail ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte für 16 h bei 45 °C unter ständiger Rotation im Chip-Hybridisierungsofen. Nach der Hybridisierung wurde der Hybridisierungscocktail entnommen und der Chip mit Waschpuffer A gefüllt. Die Microarrays wurden in die AffymetrixFlüssigkeitsstation (GeneChip Fluidics Station 400; Affymetrix, Santa Clara, USA) eingesetzt und nach den zugeordneten Waschprotokollen behandelt. Für Test2 -Arrays kam das folgende Waschprotokoll zum Einsatz. Wasch- und Färbeprogramm Mini_euk1 (Test2 Arrays) Waschschritt 1 10 Zyklen mit Waschpuffer A (2 x Mischen/Zyklus) bei 25°C Waschschritt 2 8 Zyklen mit Waschpuffer B (15 x Mischen/Zyklus) bei 50°C Färbeschritt 1 10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA (Gibco BRL #15561-020) und 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin (Molecular Probes #S-866) enthielt. Waschschritt 3 10 Zyklen mit Waschpuffer A (4 x Mischen/Zyklus) bei 30°C Für Mu19k- und MG-U74A-Arrays wurde das nachfolgend dargestellte Waschprotokoll eingesetzt. Waschschritt 1 Waschschritt 2 Färbeschritt 1 Waschschritt 3 Färbeschritt 2 Färbeschritt 3 Waschschritt 4 Wasch- und Färbeprogramm EukGE-WS2 (Mu19k- und MG-U74A-Arrays, modifiziert für Mu6500-Arrays) 10 Zyklen mit Waschpuffer A (2 x Mischen/Zyklus) bei 25°C 4 Zyklen mit Waschpuffer B (15 x Mischen/Zyklus) bei 50°C 10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA (Gibco BRL #15561-020) und 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin (Molecular Probes #S-866) enthielt. 10 Zyklen mit Waschpuffer A (4 x Mischen/Zyklus) bei 25°C 10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA (Gibco BRL #15561-020), 0,1 mg/ml Ziegen IgG (Sigma #5256) und 3 µg/ml eines biotinylierten Anit-Streptavidin-Antikörpers (Vector Laboratories #BA-0500) enthielt. 10 min Inkubation in 1 x Färbepuffer, der zusätzlich 2 µg/µl BSA (Gibco BRL #15561-020) und 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin (Molecular Probes #S-866) enthielt. 15 Zyklen mit Waschpuffer A (4 x Mischen/Zyklus) bei 30°C Nach den entsprechenden Waschprogrammen wurden die Fluoreszenzsignale auf den Microarrays mit einem speziellen Laserscanner (GeneArray Scanner; Affymetrix, Santa Clara, USA) detektiert. Vorgehensweise bei den Mu6500-Arrays: Bei der Hybridisierung der Mu6500-Arrays wurde von den Herstellerangaben abgewichen. Für die Hybridisierung wurden zunächst die vorgeschriebenen 15 µg fragmentierte cRNA je Chipsatz verwendet. Die restlichen Komponenten der Seite 38 Material und Methoden Hybridisierungslösung waren die gleichen, wie in 2.3.3. besprochen. Das vom Hersteller empfohlene Wasch- und Färbeprogramm für Mu6500-Arrays entspricht weitgehend dem bereits dargestellten Protokoll für Mu19k- und MG-U74A-Arrays, bis auf die Tatsache, dass Waschschritt 3, sowie die Färbeschritte 2 und 3 dieses Programms bei den Mu6500-Arrays normalerweise weggelassen werden. Eine Amplifikation des Fluoreszenzsignals mit Hilfe der Antikörper war also nicht vorgesehen und wurde zunächst auch nicht durchgeführt. Bei der Detektion der Fluoreszenzsignale zeigte sich jedoch, dass die Intensität der Signale zu gering war (s. 3.2.2.). Deshalb wurde das Protokoll nach der ersten Detektion zunächst um die Schritte zur Antikörper-Amplifikation ergänzt. Die Fluoreszenzdaten der Chips vor und nach der Antikörper-Amplifikation wurden jeweils getrennt ausgewertet. Durch die zusätzlich durchgeführte Antikörper-Amplifikation konnte zwar die Intensität der Fluoreszenzsignale erhöht werden, schwach exprimierte Gene wurden aber trotzdem nicht zuverlässig detektiert (s. 3.2.2.). Versuchsweise wurden deshalb die Mu6500-Arrays einer zweiten Hybridisierung unterzogen, diesmal allerdings mit 45 µg fragmentierter cRNA pro Chipsatz. Es wurde wieder das Wasch- und Färbeprogramm für Mu19k- und MG-U74A-Arrays benutzt. Die Detektion der Fluoreszenzsignale erfolgte ebenfalls wieder vor und nach der AntikörperAmplifikation. 2.3.4. Auswertung der Microarrays Die Datenauswertung erfolgte mit der Analyse-Software von Affymetrix (Microarray Suite Version 3.3 bzw. 4.0.1), wobei die Standardeinstellungen beibehalten wurden. Eine genaue Darstellung der empirisch ermittelten Algorithmen, mit denen die hybridisierten Microarrays ausgewertet wurden, ist dem Technischen Handbuch des GeneChip-Systems zu entnehmen (Affymetrix GeneChip Expression Analysis – Technical Manual; GeneChip 3.1 Expression Analysis Algorithm Tutorial). An dieser Stelle wird ein kurzer Überblick gegeben und es werden diejenigen Begriffe erklärt, die für das Verständnis von Ergebnisteil und Diskussion notwendig sind. Der prinzipielle Aufbau der Microarrays wurde in Abschnitt 1.9. bereits erklärt. Er ist die Grundlage für die Datenanalyse. Erster Schritt der Datenanalyse ist die Einzelanalyse jedes Chips. Die Software trifft anhand der Fluoreszenzdaten für den jeweiligen Sondensatz eine absolute Aussage bezüglich der Anwesenheit (Affymetrix: Absolute Call) und Signalstärke (Affymetrix: Average Difference) eines Transkripts. Dafür werden die einzelnen Sondenpaare innerhalb des Satzes untersucht. Ist in vielen Sondenpaaren die gemessene Fluoreszenz-Intensität der PM-Sondenzelle höher als die der MM-Sondenzelle (s. 1.9.), schließt die Software auf ein Vorhandensein des Transkripts - die Differenzen dieser Intensitäten bilden wiederum die Berechnungsgrundlage für die Signalstärke. Bezüglich der Präsenz eines Transkripts (Affymetrix: Absolute Call) sind insgesamt drei Aussagen möglich: ein Transkript wird entweder nicht detektiert (Absent), nur schwach detektiert (Marginal) oder eindeutig detektiert (Present). Auf diese Weise werden aus Fluoreszenzintensitäten Expressionsdaten. Ist die Einzelanalyse für jeden Chip abgeschlossen, können die Chips untereinander verglichen werden (vergleichende Analyse i. Ggs. zur Einzelanalyse). Dazu werden zunächst Unterschiede in der Gesamtintensität der Fluoreszenzsignale zwischen den einzelnen Chips rechnerisch ausgeglichen. Dies geschieht mittels Skalierung der jeweiligen Intensitäten auf einen vorgegebenen Wert. Danach vergleicht die Software für jeden Sondensatz die in den Einzelanalysen erhobenen Daten (eine der Einzelanalysen dient dabei als Bezugspunkt) und gibt an, ob Expressionsunterschiede bestehen (Affymetrix: Difference Call) und wie groß diese Unterschiede sind (Affymetrix: Average Difference Change und Fold Change). Bezüglich des Seite 39 Material und Methoden Unterschieds (Affymetrix: Difference Call) zwischen der detektierten Menge eines Transkripts in zwei verschiedenen Experimenten, sind insgesamt fünf Aussagen möglich: Zunahme (Increase; I), leichte Zunahme (Marginal Increase; MI), kein Unterschied (No Change; NC), leichte Abnahme (Marginal Decrease; MD), Abnahme (Decrease; D). Für jedes Transkript wird zusätzlich die Differenz zwischen den in den Einzelanalysen errechneten Signalstärken (skalierte Werte) angegeben (Affymetrix: Average Difference Change). Diese Differenz wird in ein definiertes Verhältnis zur ursprünglichen Signalstärke gesetzt, wodurch man einen Faktor erhält (Affymetrix: Fold Change), der Umfang und Änderungsrichtung (positives oder negatives Vorzeichen) der Transkriptmengenänderung angibt. In einigen Fällen ist eine genaue Berechnung des Änderungsfaktors (Fold Change) für ein bestimmtes Transkipt nicht möglich, etwa weil das Transkript in einem der Experimente gar nicht detektiert wurde (Absolute Call = Absent). In solchen Fällen gibt die AnalyseSoftware Schätzwerte an. Änderungsfaktoren, bei denen es sich um Schätzwerte handelt, sind durch ein Tilde-Zeichen (∼) gekennzeichnet. Es ist zu beachten, dass die Berechnung/Darstellung des Änderungsfaktors (Fold Change) immer erfolgt, unabhängig davon, ob ein absoluter Expressionsunterschied (Zunahme oder Abnahme, s.o.) festgestellt wurde oder nicht. Nach Angaben des Herstellers (Affymetrix, Santa Clara, USA) können mit dem Affymetrix GeneChip System Unterschiede in der Expressionsstärke eines Gens bis hinab zu einem Faktor von 2,0 relativ zuverlässig detektiert werden, wenn die absolute Expressionsstärke des Gens nicht zu niedrig ist. Eine noch höhere Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist naturgemäß bei Expressionsunterschieden mit einem Faktor von 3,0 und höher gegeben. 2.3.5. Validierung der Microarray-Ergebnisse Die Methode der quantitativen RT-PCR in Echtzeit (s. 2.2.21.) besitzt gegenüber anderen Methoden, die ebenfalls zur Quantifizierung von Transkriptmengen eingesetzt werden (z.B. Northern-Blot, RNase protection assays), den großen Vorteil, dass sie vergleichsweise schnell durchgeführt werden kann. Deshalb wurde zur Überprüfung der Ergebnisse aus den Chip-Experimenten die quantitative RT-PCR mit Hilfe des LightCycler-Systems (Roche, Mannheim) eingesetzt. Unmittelbar nach den jeweiligen Chip-Experimenten wurde mit RNA aus den gleichen RNA-Pools, die auch für die Synthese der biotinylierten cRNA verwendet wurden, cDNA-Erststrangsynthesen durchgeführt (s. 2.2.18.). Diese erfolgten, jeweils mit gleichen RNA-Mengen, getrennt für RNA aus Wnt1-behandelten ES-Zellen bzw. ES-Zellen des Kontrollexperiments. Mit der cDNA aus dem Wnt1-Experiment wurde eine Verdünnungsreihe aus drei bis vier unterschiedlichen Konzentrationen erstellt (Verdünnungen im Bereich zwischen 1:10 und 1:1000). Auch die cDNA aus dem lacZ-Experiment wurde einmal verdünnt (meistens 1:20). Diese unterschiedlich verdünnten cDNA-Lösungen wurden nun, ergänzt durch eine Wasserkontrolle, für Echtzeit-PCR Reaktionen mit dem LightCycler-System (s. 2.2.21.) verwendet, wobei genspezifische Primerpaare für das jeweils zu untersuchende Genprodukt zum Einsatz kamen (s. 2.1.6.). Mit Hilfe der LightCycler-Software (Version 3.5) konnte die Produktmenge (SYBR Green I – Fluoreszenzsignal) jeder einzelnen PCR-Reaktion gegen die Zeit (Anzahl der Zyklen) graphisch dargestellt werden. Anhand der Ergebnisse der Reaktionen, die mit den verschiedenen Verdünnungen der cDNA aus Wnt1-behandelten ES-Zellen durchgeführt wurden, ließ sich eine Eichgerade erstellen. Mit Hilfe dieser Eichgeraden konnten, für die jeweils amplifizierten Genprodukte, die Ausgangskonzentrationen in den lacZ-behandelten ES-Zellen ins Verhältnis gesetzt werden zu den Konzentrationen in den Wnt1-behandelten ESZellen. Daraus ließ sich für jedes untersuchte Gen ein Faktor errechnen, der den Seite 40 Material und Methoden Unterschied in der Expressionsstärke des Gens in lacZ- bzw. Wnt1-behandelten ESZellen widerspiegelt (sog. LightCycler-Faktor). Um sicherzustellen, dass die cDNAErststrangsynthese bei lacZ-Probe und Wnt1-Probe gleich effektiv abgelaufen war, wurde zunächst ein Haushaltsgen (Gapdh = Glycerinaldehyd-3-PhosphatDehydrogenase) nach dem obigen Muster amplifiziert und die jeweiligen Konzentrationen verglichen. Kleine Konzentrationsunterschiede, die auftraten, wurden vernachlässigt. Die Faktoren für die Expressionsunterschiede, die mit Hilfe der Echtzeit-PCR ermittelt wurden, konnten mit den entsprechenden Faktoren aus den ChipExperimenten verglichen werden (s. 2.3.4.). Für Gene, die auch in der Echtzeit-PCR einen Expressionsunterschied zwischen lacZ-Probe und Wnt1-Probe aufwiesen, wurden die Ergebnisse nochmals mit RNA aus unabhängigen Cokultur-Experimenten (nicht für die Chip-Experimente verwendet!) überprüft. Dies geschah, um sicherzustellen, dass der ermittelte Expressionsunterschied reproduzierbar ist, und nicht nur aus der biologischen Variabilität des Ausgangsmaterials resultiert. 2.4. Zellbiologische Methoden 2.4.1. Zellkultur von NIH 3T3-Fibroblasten und HEK 293-Zellen. NIH 3T3-Fibroblasten und HEK 293-Zellen (humane embryonale Nierenzellen) wurden in DMEM („Dulbecco’s modified Eagle’s medium”) mit 10% FCS (Gibco BRL), 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin in feuchter Atmosphäre bei 10% CO2 und 37°C kultiviert. Das DMEM-Kulturmedium wurde in Pulverform von Seromed (München) bezogen und zusammen mit dem ATV und PBS in der Medienküche des Institutes angesetzt. Konfluente Zellen wurden 2x mit PBS gewaschen und kurzzeitig mit ATV-Lösung (pro Liter: 8 g NaCl; 0,4 g KCl; 1 g Glucose; 0,59 g NaHCO3; 0,29 g EDTA; 0,59 g Trypsin (Sigma, TypXI) inkubiert. Wenn sich die Zellen deutlich abgerundet hatten und sich von der Kulturschale lösten, wurde der Trypsinverdau durch Zugabe von Kulturmedium in 5-fachem Überschuß abgestoppt und die Zellen durch Auf- und Abpipettieren im Kulturmedium von der Platte abgelöst und vereinzelt. Danach wurden die Zellen in geeigneten Verdünnungen in neue Kulturschalen gegeben. Sollten bestimmte Anzahlen an Zellen ausplattiert werden, so wurden die Zellen nach Ablösen von der Schale und Vereinzelung im Kulturmedium in Falcon-Röhrchen pipettiert. Die Zellen wurden bei 1000 rpm für 3 min sedimentiert (Zentrifuge: Hettich Rotanta) und in 5 ml Kulturmedium resuspendiert. Danach wurde die Zellanzahl mit Hilfe der NeubauerZählkammer unter dem Mikroskop bestimmt, und die gewünschte Anzahl an Zellen ausplattiert. 2.4.2. Zellkultur von ES-Zellen Die Zellen wurden unter Standard-Zellkultur-Bedingungen bei 37°C und 10% CO2 auf einem Nährzell-Rasen aus inaktivierten EMFIs (s. 2.4.3.) kultiviert. Benutzt wurde DMEM (ES-Zell-getestet; Sigma #5671) mit 20% FCS (ES-Zell-getestet, PAN Biotech GmbH #P30-1402, Aidenbach), 1:105 β-Mercaptoethanol (ZellkulturReinigungsgrad von Sigma #M7522), 1000 U/ml Lif1 (Gibco BRL), 1x MEM (Gibco BRL #11140-035), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Gibco BRL #15070-022), 2 mM L-Glutamin (Gibco BRL #25030-024). Die ES-Zellen wurden alle 2 Tage passagiert. Dazu wurden sie 1x mit PBS gewaschen, mit ATV für 2-5 min bei 37°C inkubiert, das Trypsin durch Zugabe eines 5-fachen Volumens an Medium inaktiviert und durch Pipettieren in Einzelzell-Suspension überführt. Nach Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) wurden die Zellen in frischem Medium Seite 41 Material und Methoden resuspendiert und in einer Verdünnung 1:3 bis 1:6 auf neuen EMFI-Schalen (s. 2.4.3.) ausgesät. 2.4.3. Herstellung eines Nährzellrasens aus Embryonalen Fibroblasten (EMFI) 14 – 16 Tage alte Embryonen (129/Sv, heterozygot neoR ) wurden semi-steril entnommen und nach Entfernung der Dezidua zweimal mit PBS gewaschen, die Leber entfernt und die Embryonen mechanisch zerkleinert. Danach wurden sie mit je 2 x 50 ml ATV im Erlenmeyerkolben (mit Glasperlen, 4 mm) bei 37°C unter schwachem Rühren (Magnetrührer) 2 x 30 min inkubiert. Die Zellsuspension wurde abgesiebt, das Trypsin unter Mediumzugabe (EMFI-Medium: DMEM + 10% FCS, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin) abgestoppt und bei 1000 rpm für 5 min abzentrifugiert. Nach dem Resuspendieren wurden die Zellen auf 150 mm Gewebekulturschalen ausplattiert und bis zur Konfluenz kultiviert (ca. 2 Tage) und eingefroren (60% DMEM, 30% FCS, 10% DMSO). Als Faustregel galt: 23 Embryonen ergeben eine 150 mm Schale. Bei Bedarf wurden die Zellen aufgetaut, 1:3 verdünnt auf 150 mm Platten ausgesät, noch einmal 1:4 passagiert und zuletzt durch Röntgenbestrahlung in der Anlage des Instituts von Christiane Heidkämper zellteilungsinaktiviert. Hierbei wird durch die γStrahlung (3000 rad) die DNA der Zellen geschädigt, wodurch es zum Teilungsstopp kommt. Die embryonalen Fibroblasten (EMFI) wurden nach der Bestrahlung in einem Einfrierröhrchen/150 mm Platte eingefroren und bei Bedarf wurden pro Einfrierröhrchen: 5x 90 mm Gewebekulturschalen mit Nährzellrasen hergestellt. 2.4.4. Cokultur von ES-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten Die Cokultur von ES-Zellen mit transfizierten NIH 3T3-Fibroblasten, d.h. die Kultur von ES-Zellen in engem räumlichen Kontakt mit diesen Fibroblasten, wurde durchgeführt, um ES-Zellen mit einem Wnt-Signal zu stimulieren. Die eingesetzte Fibroblasten-Zelllinie (NIH 3T3-Wnt1) war dazu mit der cDNA von Maus Wnt1 unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promoters transfiziert worden (Kispert et al., 1998). Eine weitere Fibroblasten-Zelllinie (NIH 3T3-lacZ), die mit der cDNA der E. coli β-Galactosidase (lacZ) transfiziert worden war, wurde für Kontrollexperimente eingesetzt. Die Kultur von ES-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten erfolgte wie oben beschrieben. Am Vorabend des Cokulturexperiments wurden jeweils 3 x 106 Fibroblasten der Zelllinien NIH 3T3-Wnt1 bzw. NIH 3T3-lacZ auf 90 mm Gewebekulkturschalen ausgesät und über Nacht in Fibroblasten-Kulturmedium (s. 2.4.1.) kultiviert. Am nächsten Tag, nach ca. 18 h, bildeten die Fibroblasten einen fast konfluenten Zellrasen in den Gewebekulturschalen. Nun wurden ES-Zellen von einer 30-50 % konfluenten Gewebekulturschale (mit EMFI-Zellrasen) abgelöst, vereinzelt und die Zelldichte mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Je 3,5 x 105 ES-Zellen wurden auf 24 mm Transwell-Filter (Costar #3491, Kollagen-beschichtet, Porengröße: 0,4 µm) in 1,5 ml ES-Zell-Kulturmedium ausgesät. Die Transwell-Filter mit den ESZellen wurden in mit 2 ml ES-Zell-Kulturmedium pro well beschickten 6-well Platten (Costar #3506) platziert und bei Standard-Bedingungen für 6 h inkubiert. Nach diesen 6 Stunden hafteten die meisten ES-Zellen auf den Kollagen-beschichteten porösen Membranen der Transwell-Filter. Nun wurden die 90 mm Gewebekulturschalen, auf denen sich die NIH 3T3-Fibroblasten bis zur Konfluenz ausgebreitet hatten, für die Cokultur präpariert, indem das Fibroblasten-Kulturmedium durch ES-ZellKulturmedium ersetzt wurde. Die Transwell-Filter mit den ES-Zellen wurden dann direkt auf den Fibroblasten-Zellrasen platziert, sodass die poröse Membran der Filter direkt mit den NIH 3T3-Zellen in Kontakt kam. Je zwei Transwell-Filter wurden auf Seite 42 Material und Methoden eine 90 mm Gewebekulturschale mit NIH 3T3-Wnt1 Zellen und eine weitere Schale mit NIH 3T3-lacZ Zellen platziert und bei Standard-Bedingungen inkubiert. Nach 10 h bzw. 18 h Cokultur wurden die Transwell-Filter mit den ES-Zellen von den jeweiligen Kulturschalen genommen und die Gesamt-RNA aus den beiden Ansätzen (Wnt1 und lacZ) getrennt isoliert (s. 2.4.5.). 2.4.5. Isolation von Gesamt-RNA aus cokultivierten ES-Zellen Die Isolation von Gesamt-RNA aus den cokultivierten ES-Zellen (s. 2.4.4.) wurde mit dem „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Das Prinzip beruht auf der Bindung von RNA-Molekülen, die länger sind als 200 Nukleotide, an eine Silikamembran unter hohen Salzkonzentrationen. Die Handhabung der Transwell-Filter, in denen die ES-Zellen kultiviert wurden (s. 2.4.4.), bei den ersten Schritten des Aufreinigungsprozesses wird nachfolgend beschrieben. Nach dem Herunternehmen der Transwell-Filter mit den ES-Zellen von der Kulturschale mit den NIH 3T3-Fibroblasten wurde zunächst das ES-ZellKulturmedium abgesaugt und die ES-Zellen einmal mit PBS gewaschen. Danach wurde die Unterseite der Transwell-Filter für 2 min in PBS-Lösung, die EDTA in einer Konzentration von 2 mM enthielt, getaucht. Anschließend wurde die Unterseite der Transwell-Filter mit einem in PBS getränkten Papiertuch abgewischt. Diese beiden Schritte dienten dazu, eventuell an der Unterseite der Filtermembran haftende NIH 3T3-Fibroblasten zu entfernen. Die PBS-Lösung in den Transwell-Filtern wurde nun vollständig abgesaugt und die ES-Zellen auf der Filtermembran mit einem Guanidin-Isothiocyanat-haltigen Puffer, dem zusätzlich β-Mercaptoethanol zugegeben wurde, lysiert. Dazu wurden 350 µl des Lysispuffers direkt auf die Filtermembran mit den ES-Zellen gegeben und die Oberfläche des Filters vorsichtig mit einem Zellschaber behandelt. Durch die im Puffer enthaltenen Substanzen wurden vorhandene RNasen inaktiviert, wodurch die Degradation der RNA verhindert wurde. Das Lysat wurde anschließend in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und durch mehrmaliges Aufziehen in eine 1 ml-Spritze durch eine 0,9 mm (20xg) Kanüle homogenisiert. Das homogenisierte Lysat wurde nun mit 350 µl 70 % Ethanol gemischt, auf eine RNeasy Mini-Säule gegeben und mittels Zentrifugation durch das Säulenmaterial gepresst, wobei die RNA an die Silikamembran bindet. Nach mehreren Waschschritten wurde die RNA mit RNase-freiem Wasser von der Säule eluiert. (s. RNeasy Mini Handbook 06/2001). 2.4.6. Reporterstudien in transfizierten HEK 293-Zellen Lösungen: Bezeichnung 2x HBS für Transfektionen NP-40-Lysispuffer (Luciferase-Messung) Luciferase-Messlösung Renilla-Messlösung Zusammensetzung 280 mM NaCl; 50 mM HEPES; 1,5 mM Na2HPO4; pH 7,01-7,04 250 mM KCl; 50 mM Tris-H3PO4, pH 7,8; 10% (v/v) Glycerol; 0,1% (v/v) NP-40 25 mM Tris-PO4, pH 7,8; 10 mM MgSO4; 2 mM ATP pH 7,5; 50 µM Luciferin (Sigma #L6882) 100 mM NaCl; 25 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM EDTA; 0,5 µM Coelenterazin (Calbiochem #233900) Seite 43 Material und Methoden β-Galaktosidase Messlösung β-Galaktosidase Stopplösung 1x Galacton (Tropix #GC040) in H2O 0,2 M NaOH; 0,2 mg/ml Emerald (Tropix #LAE250) Durchführung: Zur Charakterisierung der regulatorischen Sequenzen von Axin2 und Follistatin wurden Promotor-Reporterstudien durchgeführt. Dazu wurden die regulatorischen Sequenzen der beiden Gene vor das Luciferase-Reportergen (Photinus-Luciferase) im pGL3 basic-Vektor (Promega GmbH, Mannheim) kloniert (s. 3.5.2.1. u. 3.6.2.1.). Anschließend wurden die Luciferase-Reporterkonstrukte in HEK 293-Zellen funktionell getestet. Dazu wurden die Luciferase-Reporterkonstrukte zusammen mit weiteren Reportern und Expressionsvektoren in HEK 293-Zellen transfiziert. Für die Transfektion von 3x105 Zellen HEK 293-Zellen kamen folgende DNAMengen zum Einsatz: Zur Expression des Luciferase-Reportergens 1 µg eines pGL3-Reporterkonstrukts (mit d. Axin2 bzw. Follistatin-Promotor) Zur internen Standardisierung 0,1 µg pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH, Mannheim) oder 0,2 µg pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) Zur Aktivierung des Wnt/β-Catenin Signalwegs (s. 3.5.2.2.) 50-500 ng eines pCS2+-LEF/TCF-Expressionskonstrukts 0,5 µg pCS2+-β-Catenin S33A Die DNA-Menge in den einzelnen Transfektionsansätzen wurde gegebenenfalls durch die Zugabe des leeren pCS2+-Vektors angeglichen. Um die Transfektionsrate von Zellen zu kontrollieren, wurde das GFP exprimierende Plasmid pEGFP-N3 (Clontech, Heidelberg; 1 µg je Transfektionsansatz) benutzt. Die Transfektion von HEK293-Zellen wurde mit der CalciumphosphatPräzipitationsmethode durchgeführt (Gorman und Cristofalo, 1985). Die Zellen wurden mindestens 6 h vor der Transfektion in einer Dichte von 3x105 Zellen pro well (= 3,5 cm Schale) in 6-well Schalen mit DMEM-Kulturmedium (s. 2.4.1.) ausgebracht. Zur Herstellung des Calciumphosphat-Präzipitats wurden die jeweiligen Expressionsvektoren (max. 2,5 µg DNA) mit 15 µl 2,5 M CaCl2 und sterilem ddH2O in einem Volumen von 150 µl vermischt. Anschließend wurden dieser Lösung tropfenweise 150 µl 2x HBS unter Vortexen zugeführt. Das Präzipitat wurde anschließend direkt auf die Zellen getropft und verteilt. Nach 12-16 h wurde das Medium abgesaugt, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und für weitere 24-28 h in frischem DMEM-Kulturmedium unter Standardbedingungen weiter kultiviert. Für die Reporter-Messungen (s.u.) wurden die transfizierten Zellen mit 400 µl NP-40Lysispuffer pro well für 20 min bei 4°C unter starkem Schütteln (Kippschüttler) lysiert und für 10 min bei 14000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Für jede Messung wurde 1/10 (40 µl) des jeweiligen Überstandes in 96-well Mikrotiterplatten pipettiert. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen mit einem Luminoskan AscentLuminometer (Thermo Labsystems) durchgeführt. Alle Luciferase-ReporterExperimente wurden mindestens fünf mal unabhängig voneinander durchgeführt. Die Seite 44 Material und Methoden gemessene Luciferase-Aktivität in den einzelnen Ansätzen wurde jeweils in Bezug gesetzt zur gemessenen Aktivität der β-Galaktosidase bzw. der Renilla-Luciferase im gleichen Ansatz (interne Standardisierung). Aus dieser Verfahrensweise ergeben sich sog. standardisierte Luciferase-Aktivitäten, deren Größe nicht mehr von der Transfektionseffizienz der HEK 293-Zellen abhängt. Luciferase-Messung Die pGL3-Reporterkonstrukte codieren für die Photinus-Luciferase. Der Begriff Luciferase ist eine Sammelbezeichnung für strukturell unterschiedliche Oxidoreductasen aus verschiedenen Organismen mit der gemeinsamen Eigenschaft, durch Oxidation sogenannter Luciferine Biolumineszenz induzieren zu können. Besonders gut untersucht ist das System bei dem Leuchtkäfer Photinus pyralis. Der Einfachheit halber wird die Photinus-Luciferase deshalb in dieser Arbeit als Luciferase bezeichnet, das Photinus-Luciferin einfach als Luciferin. Für jede Messung wurden 100 µl Luciferase-Messlösung pro well injiziert und nach 10 s Inkubation die Lumineszenz detektiert. Renilla-Messung (pCMV-Renilla Vektor) Der pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH, Mannheim) codiert für die RenillaLuciferase. Bei der Renilla-Messung handelt es sich also auch um die Messung der Aktivität einer Luciferase, der Luciferase des Meeresstiefmütterchens Renilla reniformis. Das Renilla-Luciferin Coelenterazin unterscheidet sich in Struktur und in der chemischen Umsetzung durch die Renilla-Luciferase wesentlich vom PhotinusLuciferin. Für jede Messung wurden 100 µl Renilla-Messlösung pro well injiziert und unmittelbar die Lumineszenz detektiert. β-Galaktosidase-Messung (pCMV-β-Galaktosidase Vektor) Das Enzym β-Galactosidase, für das der pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech, Palo Alto, USA) codiert, katalysiert in Organismen die Hydrolyse des Disaccharids Lactose in seine Bestandteile Glucose und Galactose. Es gibt aber auch eine große Zahl von Lactose-Derivaten, die von diesem Enzym als Substrat gebunden und umgesetzt werden. Bei der Hydrolyse einiger dieser Substrate entstehen Chromophore bzw. Fluorophore, was den Einsatz dieses Enzyms als Reporter ermöglicht. In diesem Fall wurde Galacton als Substrat eingesetzt., das nach Zugabe der β-GalaktosidaseMesslösung (100 µl pro well) bei physiologischem pH von der β-Galactosidase hydrolysiert wird (30 min Inkubationszeit bei RT). Neben Galactose entsteht ein weiteres Spaltungsprodukt, das bei alkalischem pH-Wert (deshalb Zugabe von βGalaktosidase Stopplösung / 100 µl pro well) spontan zerfällt, wobei ein angeregtes Zerfallsprodukt entsteht, das durch Emission von Photonen in einen stabilen Zustand übergeht. Diese Lichtemission wird vom Luminometer gemessen. 2.5. Embryologische Methoden 2.5.1. Verwendete Mäuse Die Mäuse wurden in der Versuchstieranlage des Institutes gehalten und gezüchtet. Es wurden für die vorliegende Arbeit Mäuse der Stämme NMRI, C57BL/6, FVB und die einzelnen genetisch veränderten Stämme mit reinem oder gemischtem Hintergrund verwendet. Zur Kontrolle der über Nacht angesetzten Verpaarungen wurden die Seite 45 Material und Methoden Weibchen auf einen Vaginalpfropf hin untersucht. Mittags am Tag des Vaginalpfropfs wurde als Tag 0,5 p.c. der Embryonalentwicklung gezählt. 2.5.2. Isolation von Embryonen Die Embryonen wurden zu den entsprechenden Zeiten entnommen und routinemäßig in kaltem PBS unter dem Stereomikroskop nach Standardtechnik freipräpariert (Hogan et al., 1994). Für die spätere Verwendung zur in situ Hybridisierung (s. 2.5.6.) wurden die Embryonen über Nacht in 4% Paraformaldehyd/PBS bei 4°C fixiert, 3x in PBT und 3x in 100% Methanol gewaschen und anschließend in 100% Methanol bei –20°C gelagert. 2.5.3. Präparation von genomischer DNA aus embryonalen Dottersäcken Bei der Präparation von Embryonen (s. 2.5.2.) wurde der Dottersack entnommen und für 5 h in einem Lysis-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 0,45% Tween-20; 0,45% NP-40; 200 µg/ml Proteinase K) bei 50°C inkubiert. Anschließend wurde die Proteinase K durch Inkubation für 30 min bei 95°C inaktiviert. Zur Genotypisierung der Embryonen wurden dann 1-2 µl dieses Dottersack-Lysats in einer PCR-Reaktion eingesetzt (s. 2.5.9.). 2.5.4. Präparation von genomischer DNA aus Schwanzbiopsien Hierfür wurde eine ungefähr 0,5-1 cm lange Schwanzprobe entnommen und ÜN in 600 µl Lysis-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM EDTA; 0,5% SDS; 200 µg/ml Proteinase K) bei 55°C geschüttelt. Am nächsten Morgen wurden die unlöslichen Bestandteile für 10 min bei 14000rpm abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Durch Zugabe von 600 µl Isopropanol wurde die genomische DNA gefällt und entsprechend der Menge entweder erneut wie oben abzentrifugiert und in TE-Puffer aufgenommen oder mit einer Pipettenspitze aus dem Eppendorf-Gefäß entnommen und in ein neues Eppendorf-Gefäß mit 50-200 µl TEPuffer transferiert. Durch erneutes Schütteln bei 55°C für 30 min bis zu mehreren Stunden wurde die DNA vollständig gelöst. Die so gewonnene DNA wurde für die Genotypisierung durch Southern-Blot-Analyse oder eine PCR-Reaktion eingesetzt. 2.5.5. Herstellung von markierten RNA-Proben für die in situ Hybridisierung Für den Nachweis von mRNA-Molekülen durch in situ Hybridisierung wurden komplementäre RNA-Proben hergestellt. Hierfür wurden cDNA-Fragmente möglichst aus dem offenen Leseraster des nachzuweisenden Transkripts in Plasmide kloniert, die flankierend zum Polylinker die Bakteriophagen-Promotoren (SP6, T3 oder T7) besitzen. Einige dieser Plasmide wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt (s. 2.1.7.). Die Plasmide mit den cDNA-Fragmenten wurden linearisiert. RNA-Sonden beider Stränge wurden in vitro hergestellt; der nicht kodierende Strang („anti-sense“) diente zum Nachweis der Transkripte, während der kodierende Strang („sense“) als Kontrolle zur Einschätzung des unspezifischen Hintergrundes verwendet wurde. 10 µg DNA wurden mit ca. 20 U eines geeigneten Restriktionenzyms über Nacht verdaut und mit Natriumacetat pH 5,2 (Endkonz. 0,3 M) gefällt, zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 10 µl DEPC-Wasser aufgenommen. 1 µl wurde für die in vitro Transkription eingesetzt. Seite 46 Material und Methoden Der Transkriptionsansatz wurde bei RT zusammenpipettiert und danach 2 h bei 37°C inkubiert: 6 µl DEPC-Wasser 1 µl Transkriptionspuffer (Roche) 1 µl linearisiert Plasmid-DNA 1 µl 10x DIG RNA Reaktions-Mix (Roche) 0,5 µl RNase Inhibitor (Roche) 0,5 µl SP6-,T3-, oder T7-RNA-Polymerasen (Roche) Nach der Inkubationszeit wurden 1 µl DNase I (10 U/µl Roche) zugegeben und für weitere 15 min bei 37°C inkubiert. Die Fällung der RNA erfolgte unter Volumenerhöhung mit 100 µl DEPC-Wasser und Zugabe von 10 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 300 µl Ethanol bei –80°C für 15 min. Die ausgefällte RNA wurde abzentrifugiert (10 min bei 14000 rpm und 4°C) und einmal mit 70%igem Ethanol gewaschen. Die getrocknete RNA wurde in 55 µl DEPC-Wasser aufgenommen und 5 µl wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. 2.5.6. „Whole mount“ RNA in situ Hybridisierung 1. Tag (RNA-Hybridisierung): Alle Schritte wurden in Szintillationsgläschen durchgeführt, Lösungen RNase-frei in DEPC-Wasser angesetzt und soweit nicht anders angegeben bei RT gearbeitet. Die Embryonen für die Hybridisierungen wurden wie in 2.5.2. beschrieben isoliert und bei –20°C in Methanol gelagert. Zu Beginn wurden diese in einer absteigenden Methanol-Reihe (75%, 50%, 25% Methanol/PBT) und dann zweimal in PBT für jeweils 5-10 min rehydriert. Die Embryonen wurden dann mit 6% H2O2 in PBT bei RT gebleicht und erneut 3x 5 min in PBT gewaschen. Danach erfolgte ein Verdau mit Proteinase K. Hierfür wurde die Embryonen mit 10 µg/ml Proteinase K in PBT bei RT inkubiert (Inkubationszeiten 7,5 d.p.c., 2 min; 8,5 d.p.c., 3 min; 9,5 d.p.c., 4 min; 10,5 d.p.c., 6 min; 11,5 d.p.c., 9 min; 12,5 d.p.c., 15 min; 13,5 d.p.c., 20-25 min; 14,5 d.p.c., 25-30 min) Der Proteinase K-Verdau wurde durch Inkubation der Embryonen für 2x 10 min in 2 mg/ml Glycin in PBT abgestoppt, anschließend wurden die Embryonen 3x 5 min in PBT gewaschen. Danach wurden die Embryonen in 4% Paraformaldehyd/0,2% Glutaraldehyd in PBS für 20 min nachfixiert und erneut weitere 3x 5 min in PBT gewaschen. Nun wurden die Embryonen für 2 h bei 70°C im Hybridisierungspuffer (50% Formamid; 5x SSC, pH 4,5; 1% SDS; 50 µg/ml Hefe tRNA; 50 µg/ml Heparin) unter ständiger Bewegung inkubiert. Die Hybridisierung mit der RNA-Sonde erfolgte bei 70°C ÜN in neuem Hybridisierungspuffer mit 1 µg/ml RNA-Probe (s. 2.5.5.). 2. Tag (anti-DIG Antikörper Inkubation): Nicht gebundene RNA-Probe wurde durch 3x 30 min Waschen in Waschlösung I (50% Formamid, 5x SSC, pH 4,5; 1% SDS) bei 70°C, 3 x 5 min Waschen in TNT (10mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,5 M NaCl; 0,1% Tween-20) bei RT, 1 h Inkubation in TNT mit 100 µg/ml RNase A bei 37°C und erneutem 3x 30 min Waschen in Waschpuffer II (50% Formamid, 2x SSC pH 4,5; 0,5 M NaCl, 0,1% Tween-20) bei 65°C vollständig weggewaschen. Die Embryonen wurden dann für die AntikörperReaktion 3x 5 min in MAB (100 mM Maleinsäure; 150 mM NaCl; 2 mM Levamisol; 0,1% Tween-20; pH 7,5) bei RT gewaschen und für 2 h mit 10% Schafserum in MAB/2% Block-Pulver (Roche #1096176) bei RT abgesättigt und zuletzt ÜN in Antikörper-Lösung bei 4°C unter Bewegung inkubiert. Antikörperlösung: 0,5 ml MAB/2% Block wurden mit 1 mg Embryopulver (s. 2.5.7.) versetzt, gevortext und für 30 min bei 70°C inkubiert und danach auf Eis abgekühlt. Seite 47 Material und Methoden Zu dieser Lösung wurden 5 µl Schafserum und 0,4 µl Anti-DIG Alkaline Phosphatase-gekoppelt (1:5000) zugegeben und bei 4°C unter ständiger Bewegung für 1 h inkubiert. Die Lösung wurde bei 5000 rpm für 10 min abzentrifugiert und mit MAB/2% Block/1% Schafserum auf 2 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Wenn größere Mengen benötigt wurden, wurde der Ansatz multipliziert. 3. Tag (Waschtag): Am Anfang des Tages wurden die Embryonen 3x 10 min in MAB bei RT gewaschen und dann über den ganzen Tag hinweg stündlich der MAB-Puffer gewechselt. Zuletzt wurde ÜN bei 4°C in MAB gewaschen. 4. Tag (Entwicklung): Die Embryonen wurden auf die Entwicklung durch 3x Waschen in NTMT (100 mM Tris-HCl, pH 9,5; 50 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 0,1% Tween-20) vorbereitet und dann in BM Purple (Roche #1442074) inkubiert, bis die Färbung ausreichend stark war. Die Reaktion wurde durch 3x Waschen in PBT pH 4,5 abgestoppt und die Embryonen in 4% Paraformaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd/PBS fixiert. Zum Fotografieren wurden die Embryonen in PBT überführt und schließlich in 4% Paraformaldehyd/PBS gelagert. 2.5.7. Herstellung von Embryopulver Zur Absorption von unspezifisch gebundenen Antikörpern, die mit dem Mausgewebe reagieren, wurde die Antikörperlösung mit Embryopulver inkubiert. Zur Präparation von Embryopulver wurde die in Hogan et al. (Hogan et al., 1994) auf Seite 358 ausführlich beschriebene Methode verwendet. 2.5.8. Herstellung transgener Reportermäuse Ausgangspunkt für die Klonierung von Axin2- bzw. Follistatin- lacZ-ReporterKonstrukten war ein Cdx1-Promoter lacZ-Reporter-Konstrukt (pGL3b-cdx1-3725 lacZ), das von Heiko Lickert zur Verfügung gestellt wurde (Lickert, 2001). Der Cdx1Promoter dieses Plasmids wurde durch die regulatorische Region des Axin2-Gens (Ax2 P/I1 bzw. Ax2 P/I1 1-7 mut) oder den Follistatin-Promotor (Foll 2,8 kb bzw. Foll 2,8 kb 1-4 mut) ersetzt. Alle Axin2- bzw. Follistatin- Promoter lacZ-Reporter wurden mit KpnI/SalI aus dem Vektor ausgeschnitten, über ein Agarosegel aufgereinigt (s. 2.2.4.) und aus dem Gel isoliert (s. 2.2.5.). Die DNA wurde in Injektions-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1mM EDTA) aufgenommen und auf eine Konzentration von 5 ng/µl verdünnt. Im Transgenen Service des Institutes wurde die DNA in dieser Konzentration in die Pronuklei von befruchteten Eizellen injiziert. Injizierte Zygoten, die sich über Nacht geteilt hatten und somit das Zweizellstadium erreicht hatten, wurden in die Uteri scheinschwangerer Mäuse retransferiert. Die Embryonen wurden entweder am Tag 9,0 – 9,5 der Entwicklung präpariert (sog. transiente Transgene; s. 3.5.4.) oder von den Mäusen bis zur Geburt ausgetragen und für Verpaarungen mit NMRI-Mäusen eingesetzt (stabile transgene Linien; s. 3.6.4.). 2.5.9. Genotypisierung von Mäusen und Mausembryonen Zum Nachweis des lacZ-Reportergens in transgenen Embryonen/Mäusen (s. 2.5.8.) wurde eine lacZ-PCR (s. 2.2.19.) mit isolierter DNA aus Dottersäcken (s. 2.5.3.) oder Schwanzbiopsien (s. 2.5.4.) durchgeführt. lacZ 5’-Primer: 5´-GCG TTG GCA ATT TAA CCG CC-3´ lacZ 3’-Primer: 5´-CAG TTT ACC CGC TCT GCT AC-3´ Seite 48 Material und Methoden Die Embryonen aus den Verpaarungen der β-Catenin Exon 3- gefloxten Mäuse mit den En1-Cre knock in Mäusen (s. 3.5.3.3.) wurden von Veronique Brault genotypisiert. Dabei wurden mit DNA aus Dottersäcken (s. 2.5.3.) verschiedene PCR-Reaktionen (s. 2.2.19.) durchgeführt. Zum Nachweis der Cre-Rekombinase erfolgte eine PCR mit folgenden Primern: Cre 5’-Primer:: 5’- CAAGTTGAATAACCGGAAATG-3’ Cre 3’-Primer: 5’- GCCAGGTATCTCTGACCAGA-3’ Der β-Catenin-Locus wurde durch PCR-Reaktionen mit folgenden Primerpaaren analysiert. Zum Nachweis des Exon 3-gefloxten β-Catenin-Allels: Ex3 floxed 5’-Primer: 5’- GACACCGCTGCGTGGACAATG-3’ Ex3 floxed 3’-Primer: 5’- GTGGCTGACAGCAGCTTTTCTG-3’ Zum Nachweis des Exon 3-deletierten β-Catenin-Allels: Ex3 floxdel 5’-Primer: 5’- GCTGCGTGGACAATGGCTAC-3’ Ex3 floxdel 3’-Primer: 5’- TGAGCCCTAGTCATTGCATAC-3’ Eine Genotypisierung der vestigial tail Embryonen (s. 3.5.3.2.) wurde nicht durchgeführt. Die Entnahme der Embryonen erfolgte am Tag 10,25 p.c. In diesem Entwicklungsstadium konnten heterozygote und homozygote vestigial tail Embryonen bereits anhand des Phänotyps voneinander unterschieden werden. 2.5.10. X-Gal Färbung von Embryonen Für die X-Gal Färbung wurden die Embryonen (7,5-14,5 d.p.c.) in PBS isoliert (s. 2.5.2.) und dann für 15-90 min (je nach Alter) bei Raumtemperatur mit Fixativ (1% Formaldehyd; 0,2 % Glutaraldehyd; 5 mM EGTA; 2 mM MgCl2; 0,02 % NP-40; in PBS angesetzt) inkubiert. Danach wurde 3x 10 min mit 0,02 % NP-40/PBS gewaschen (bei RT). Die Färbung erfolgte zwischen 2h – ÜN bei 37°C im Dunkeln mit X-Gal Lösung (2 mM MgCl2; 5 mM K3Fe(CN)6; 5 mM K4Fe(CN)6; 0,01% NaDesoxycholat; 0,02% NP-40; 1 mg/ml X-Gal; in PBS angesetzt). Die Embryonen wurden nach der Färbung in PBS gewaschen und in 4% Paraformaldehyd/PBS nachfixiert. Daraufhin wurden sie photographiert und histologisch analysiert (siehe Abschnitt 2.6.). 2.6. Histologische Methoden 2.6.1. Paraffineinbettung von Embryonen Frisch präparierte Embryonen oder X-Gal gefärbte Embryonen wurden in PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd in PBS ÜN bei 4°C fixiert. Die Embryonen wurden dann folgendermaßen weiterbehandelt: Dehydrieren: Die Embryonen (9,5 - 14,5 d.p.c.) wurden nacheinander für jeweils eine Stunde in 40%, 70% und 100% Ethanol inkubiert. Danach wurde das 100% Ethanol noch einmal durch frisches 100% Ethanol ersetzt und die Embryonen über Nacht vollständig dehydriert. Embryonen, die vorher schon in 100% Methanol gelagert wurden (s. 2.5.2.), wurden 1x kurz mit 100% Ethanol gewaschen und dann ebenfalls über Nacht in 100% Ethanol inkubiert. Die Dehydrierung wurde bei 4°C durchgeführt. Einbetten: Nachdem die Embryonen dehydriert waren, wurden sie in 100% Xylol überführt und je nach Alter für einige Zeit unter gelegentlichem Schütteln inkubiert (9,5 d.p.c., 10 min; 11,5 d.p.c., 15 min; 12,5 d.p.c., Seite 49 Material und Methoden Schneiden 2.6.2. 20 min; 13,5 d.p.c., 25 min; 14,5 d.p.c., 35 min). Anschließend wurde das Xylol verworfen, durch flüssiges Paraffin (Histowax, Reichert & Jung) ersetzt. und die Embryonen über Nacht im Brutschrank (65°C) inkubiert. Die Embryonen wurden dann in Gießförmchen mit flüssigem Paraffin überführt und ausgerichtet. Nach dem Aushärten der Blöcke wurden diese bei 4°C gelagert. Von den Paraffin-Blöcken wurden 4-10 µm dicke Schnitte mit dem Ultramikrotom (RM 2155, Leica) angefertigt, auf Objektträger (SuperFrostPlus, Menzel-Gläser) aufgezogen und bei 40°C ÜN getrocknet. Die Schnitte wurden bei 4°C gelagert und wie in 2.6.2. bzw. 2.6.3. beschrieben weiter prozessiert. RNA in situ Hybridisierung auf Paraffinschnitten 1. Tag: (RNA-Hybridisierung) Paraffinschnitte wurden wie unter 2.6.1. beschrieben RNase-frei hergestellt. Die Schnitte wurden 2x 5 min in Xylol entparaffiniert und 5 min in 100% Ethanol gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte in einer absteigenden Ethanol-Reihe (66%, 33% in DEPC-Wasser) rehydriert (je 5 min) und 1x in PBS für jeweils 5 min bei RT gewaschen. Nach 20 min Nachfixierung in 4% Paraformaldehyd/PBS wurde erneut 2x 5 min in PBS gewaschen. Danach erfolgte ein Proteinase K-Verdau. Hierfür wurden die Schnitte mit 10 µg/ml Proteinase K in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 für 10 min bei 37°C inkubiert. Der Verdau wurde in 0,2% Glycin in PBS für 10 min bei RT abgestoppt und die Schnitte 2x 5 min in PBS gewaschen. Anschließend wurde mit 0,2 M HCl für 15 min bei RT inkubiert und 2x in PBS gewaschen. Daraufhin wurden die Schnitte in eine 0,1 M Triethanolaminlösung, pH 8,0, überführt in die dann unter ständigem Rühren tropfenweise Essigsäureanhydrid bis zu einer Konzentration von 0,25% zugeführt wurde – nach erfolgter Zugabe wurde für weitere 10 min bei RT inkubiert. Durch erneutes Waschen in PBS und DEPC-Wasser für jeweils 5 min waren die Schnitte bereit für die Prähybridisierung. Dies geschah in Hybridisierungslösung (50% Formamid; 5x SSC, pH 7,0; 1x Denhardt´s; 0,1% Tween-20; 50 µg/ml Heparin, noch ohne tRNA) bei 70°C unter ständiger Bewegung für 2 h. Die Hybridisierung mit 3 µg/ml RNA-Probe (s. 2.5.5.) in frischer Hybridisierungslösung, der zusätzlich 50 µg/ml tRNA zugegeben wurden, erfolgte ÜN direkt auf den Objektträgern (mit Deckgläschen abgedeckt) in einer feuchten Kammer bei 70°C. 2. und 3. Tag: Es wurde wie unter 2.5.6. beschrieben fortgefahren, mit der Ausnahme dass die Antikörperreaktion direkt auf den Paraffinschnitten (mit Deckgläschen abgedeckt) über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer durchgeführt wurde und die Farbentwicklung schon am Ende des 3. Tages erfolgte. Die exponierten Schnitte wurden zuletzt 3x 15 min in PBS gewaschen, für 45 min in MEMFA (100 mM MOPS; 2 mM EDTA, pH 8,0; 1mM MgSO4; 1/10 4% PFA in PBS) fixiert und in nach Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“ (s. 2.6.3.) in Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt) eingebettet. Seite 50 Material und Methoden 2.6.3. Histologische Färbung von Präparaten Für die histologische Analyse von Gewebeschnitten wurde eine „Nuclear Fast Red“ (NFR) Gegenfärbung durchgeführt. Hierfür wurde die Färbung wie folgt durchgeführt: 5 min Xylol 5 min Xylol 2 min abs. Ethanol 2 min 90% Ethanol 2 min 70% Ethanol 2 min 40% Ethanol 2 min ddH2O 30 s – 2 min NFR (gesättigte Lösung in ddH2O) 30 s ddH2O 30 s ddH2O Die Präparate wurden dann in Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt) eingebettet. Seite 51 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Modifikation des ES-Zell-Cokultursystems Das von Arnold et al. (Arnold et al., 2000) etablierte System zur Induktion von Maus ES-Zellen mit einem Wnt-Signal (s. 1.7.) eignet sich als biologisches System zur Identifikation von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs. Das in Abb. 1.3 dargestellte System gewährleistet in besonders einfacher Weise, dass ES-Zellen in unmittelbaren Kontakt mit Wnt-exprimierenden Fibroblasten, und somit auch von sezernierten Wnt-Liganden, gelangen. Das System besitzt aber den Nachteil, dass im Anschluss an die Cokultur ein Gemisch aus Fibroblasten und ES-Zellen analysiert wird. Gerade für Experimente, in deren Verlauf Genexpressionsprofile miteinander verglichen werden, ist aber eine möglichst homogene Zellpopulation wünschenswert, um die biologische Variabilität so gering wie möglich zu halten. Dies würde den Vergleich von Datensätzen und die Interpretation der gewonnenen Daten erleichtern. Aus diesem Grund wurde das in Abb. 1.3 dargestellte Cokultursystem modifiziert. Ziel war es, eine homogene Population Wnt-stimulierter ES-Zellen zu gewinnen. Zu Beginn der Arbeit war keine Methode bekannt, die zur Gewinnung größerer Mengen an löslichem Wnt-Protein mit biologischer Aktivität geeignet gewesen wäre (Willert et al., 2003). Darüber hinaus waren eigene Versuche, Zellkulturmedium, mit dem Wnt-sezernierende Fibroblasten kultiviert worden waren, zur Wnt-Stimulation von ES-Zellen einzusetzen (Shibamoto et al., 1998), nicht erfolgreich. Deshalb wurde an dem Prinzip der Wnt-Stimulation von ES-Zellen durch einen Zellrasen von Wntsezernierenden Fibroblasten in einem Cokultur-Ansatz festgehalten. Der Einsatz von sog. „Transwell-Filtern“ sollte die Trennung von ES-Zellen und Fibroblasten gewährleisten. Transwell-Filter sind Zellkulturschalen, deren Boden nicht aus solidem Kunststoff, sondern aus einer porösen Kunststoffmembran besteht. Je nach Einsatzzweck variiert das Material und die Porengröße der verwendeten Filtermembran. In diesem Fall sollte die Filtermembran die ES-Zellen während der Cokultur räumlich von den Wnt-sezernierenden Fibroblasten trennen und dennoch einen Austausch von Makromolekülen (Wnt-Proteinen !) zwischen beiden Zellpopulationen ermöglichen (s. Abb. 3.1). Seite 52 Ergebnisse Abb. 3.1. Ablauf eines ES-Zell-Cokulturexperiments unter Verwendung von Transwell-Filtern. Anders als beim klassischen ES-Zell-Cokultursystem (s. Abb. 1.3) werden die ES-Zellen nicht direkt auf die Zellschicht aus Wnt-sezernierenden Fibroblasten ausgebracht, sondern in sog. Transwell-Filter mit einer Porengröße von 0,4 µm pipettiert. Nach 6 h, in denen sich die ES-Zellen an die Filtermembran heften, werden die Transwell-Filter mit den ES-Zellen auf den Fibroblasten plaziert, wo sie für 10 bzw. 18 h verweilen (10 / 18 h Cokultur). Während dieser Phase kommt es zur WntStimulation der ES-Zellen durch die Filtermembran hindurch und im weiteren Verlauf zur Expression von Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in den ES-Zellen (s. Abb. 3.2). Nach Ablauf der Cokultur wird die Gesamt-RNA aus den ES-Zellen isoliert. Es wurden mehrere verschiedene Transwell-Filter getestet, deren Filtermembranen eine Porengröße von 0,4 µm aufwiesen. Die Transwell-Filter mussten für die Kultur von ES-Zellen geeignet sein, d.h. die ES-Zellen mussten an der Filteroberfläche haften und eine normale ES-Zell Morphologie aufweisen - rundliche Zellen ohne Zellfortsätze, die nach mehrfacher Teilung möglichst runde ES-Zell-Kolonien bilden. Zudem musste in Cokultur-Versuchen eine Wnt-Stimulation der ES-Zellen durch die Filtermembran erfolgen. Von den getesteten Filtern eigneten sich kollagenbeschichtete Transwell-Filter von Costar am besten für die Cokultur (Costar, Cambridge, USA; Transwell-COL, Durchmesser 24 mm, Porengröße 0,4 µm; Cat-No. 3491). In Abb. 3.2 sind die Ergebnisse von direkter Cokultur und Filter-Cokultur gegenübergestellt. Die Expression von vier Markergenen (Cdx1, Bra, Neo, Gapdh) in Fibroblasten (3T3 lacZ, 3T3 Wnt1) bzw. ES-Zellen (ES) vor und nach einer Cokultivierung wurde mittels RT-PCR und Agarose-Gelelektrophorese dargestellt. Cdx1 (Caudal type homeo box 1) und Bra (Brachyury) sind Maus-Gene, deren Wntabhängige Regulation bereits mit Hilfe des konventionellen Cokultursystems beschrieben werden konnte (Arnold et al., 2000; Lickert et al., 2000). Eine gesteigerte Seite 53 Ergebnisse Expression dieser beiden Gene nach Cokultivierung von ES-Zellen mit Wnt1exprimierenden Fibroblasten gibt Auskunft darüber, ob die ES-Zellen tatsächlich ein Wnt-Signal erhalten haben. Neo (Neomycin-Resistenzgen) ist ein Selektionsmarker, der zusammen mit den cDNAs für lacZ bzw. Wnt1 in die Fibroblasten (3T3 lacZ, 3T3 Wnt1) eingebracht wurde (Kispert et al., 1998). In einer reinen ES-ZellPopulation sollte sich das N e o-Transkript nicht nachweisen lassen. Gapdh (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) ist ein Haushaltsgen, dessen Expression häufig zur Standardisierung von Experimenten ermittelt wird (Beladungskontrolle). Abb. 3.2. Vergleich zwischen klassischem ES-Zell-Cokultursystem (direkte Cokultur) und ESZell-Cokultursystem mit Transwell-Filtern (Filter-Cokultur). Die Experimente wurden parallel mit den gleichen Fibroblasten bzw. ES-Zellen (R1) durchgeführt. Neben NIH 3T3-Wnt1 Zellen kamen in Kontrollexperimenten NIH 3T3-lacZ Zellen zum Einsatz. Nach jeweils 24 h Cokultur (die 6-stündige Vorinkubation der ES-Zellen in den Transwell-Filtern wurde weggelassen) wurde Gesamt-RNA aus den einzeln kultivierten Zellen und den verschiedenen Cokultur-Ansätzen isoliert. Den Bezeichnungen in der oberen Hälfte der Abbildung ist jeweils zu entnehmen, aus welchen Zellen die Gesamt-RNA isoliert wurde. Bei der Filter-Cokultur ist in Klammern angegeben, mit welchen NIH 3T3-Zellen die Cokultur erfolgte (beh. = behandelt). Anschließend wurden mit je 2,5 µg RNA cDNAErststrangsynthesen durchgeführt. Jeweils 1/20 des Reaktionsansatzes wurde für die verschiedenen PCR-Reaktionen eingesetzt. Cdx1-PCR: 35 Zyklen; Bra-PCR: 25 Zyklen; Neo-PCR: 30 Zyklen; Gapdh-PCR: 20 Zyklen. (Primer s. Abschnitt 2.1.6.). Anschließend wurden die PCR-Reaktionen auf einem Agarose-Gel analysiert und die Banden durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Nähere Erläuterungen siehe Text. Abb. 3.2 zeigt, dass in kultivierten ES-Zellen bereits vor einer Cokultur geringe Transkriptmengen von Cdx1 und Bra nachgewiesen werden können, im Gegensatz zur Situation in NIH 3T3-Zellen. Während bei der Filter-Cokultur die Isolation der Gesamt-RNA ausschließlich aus ES-Zellen erfolgt, wird nach der direkten Cokultur die Gesamt-RNA aus einer Mischung von ES-Zellen und Fibroblasten isoliert. Dies erklärt, warum im lacZ-Kontrollexperiment der Filter-Cokultur höhere Seite 54 Ergebnisse Transkriptmengen an Cdx1 und Bra nachgewiesen werden, als im lacZKontrollexperiment der direkten Cokultur. In jedem Fall steigt nach Cokultur der ES Zellen mit Wnt1-sezernierenden Fibroblasten die Expression der beiden Wnt/βCatenin-Zielgene Cdx1 und Bra deutlich an, und zwar sowohl bei der direkten Cokultur als auch bei der Filter-Cokultur. Der Anstieg der Transkriptmengen von Cdx1 bzw. Bra nach Wnt1-Stimulation ist bei beiden Cokultur-Systemen vergleichbar. Die Induktion von Wnt-Zielgenen ist somit unter den gewählten Bedingungen in beiden Systemen vergleichbar effektiv. Abb. 3.2 zeigt zudem, dass durch die Verwendung der Transwell-Filter die beiden Zellpopulationen effektiv voneinander getrennt werden, da bei der Filter-Cokultur in den ES-Zell-Lysaten der Selektionsmarker Neo nicht nachgewiesen werden kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch das modifizierte ES-Zell-Cokultursystem für die Suche nach Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs eingesetzt werden kann. 3.2. Identifikation von Zielgen-Kandidaten des Wnt/β-CateninSignalwegs mit Hilfe des Affymetrix GeneChip Systems 3.2.1. Übersicht über die durchgeführten Microarray-Experimente Im Verlauf dieser Doktorarbeit brachte die Firma Affymetrix verschiedene, jeweils dem aktuellen Bestand an Sequenzdaten angepasste, Microarrays auf den Markt. Für die Untersuchung von Cokulturexperimenten wurden die Affymetrix-Microarrays Mu6500 (subA, B, C, D), Mu19k (subA, B, C) sowie MG-U74A eingesetzt. Tabelle 3.1 gibt einen Überblick über die in den jeweiligen Experimenten verwendeten Zellen, die Dauer der Cokultur sowie die zur Untersuchung eingesetzten Microarrays. Microarrays Fibroblasten ES Zellen Dauer der Cokultur Mu6500 (subA, B, C, D) Mu19k (subA, B, C) 3T3 lacZ bzw. 3T3 Wnt1 3T3 lacZ bzw. 3T3 Wnt1 3T3 lacZ bzw. 3T3 Wnt1 3T3 lacZ bzw. 3T3 Wnt1 R1 ES Zellen 18 h R1 ES Zellen 18 h D3 ES Zellen 10 h D3 ES Zellen 18 h MG-U74A MG-U74A Tab. 3.1. Übersicht über die durchgeführten Microarray-Experimente. Seite 55 Ergebnisse Es sei an dieser Stelle erwähnt, dass die Hybridisierung der verschiedenen Microarrays mit den jeweiligen cRNA-Proben in allen Fällen gut funktioniert hat. Die Auswertung der Kontroll-Signale für Gapdh und Actin auf den Microarrays bestätigte regelmäßig, dass die eingesetzten cRNA-Proben von guter Qualität waren. Für diese beiden Gene sind jeweils drei Probensätze auf jedem Microarray vorhanden. Ein Probensatz detektiert die 5’-Region des Transkripts, ein anderer detektiert die zentrale Region und ein dritter Probensatz erkennt die 3’-Region (in der Nähe des Poly ASchwanz) des jeweiligen Transkripts. Wenn die Signalintensitäten, die mit den drei Probensätzen erzielt werden, nicht zu stark voneinander abweichen, kann man davon ausgehen, dass die cDNA, von der die cRNA in vitro transkribiert wurde, von guter Qualität war, bei der reversen Transkription ausgehend vom Poly T-Primer also auch die 5’-Region der jeweiligen Transkripte erfasst wurde. Dies war bei allen eingesetzten cRNA-Proben der Fall. Zudem bestätigte die Auswertung der Probensätze, mit denen die Transkripte der beigemengten Kontroll-cRNA (BioB, BioC, BioD, Cre, s. 2.3.3.) nachgewiesen werden, dass die eigentliche Hybridisierung der cRNA-Proben auf die Arrays und die sich anschließenden Wasch- und Detektionsschritte in allen Fällen reibungslos funktioniert haben. Deshalb werden diese Sachverhalte an anderer Stelle nicht mehr diskutiert. Bei der Auswertung der Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ESZellen und ES-Zellen des Kontrollexperiments fiel das Hauptaugenmerk auf die Transkripte, die in den Wnt1-behandelten ES-Zellen stärker exprimiert waren, als in der lacZ-Kontrolle. Der Hauptgrund hierfür war, dass für die direkte, positive Regulation von Wnt/β-Catenin-Zielgenen ein molekularer Mechanismus beschrieben ist (s.1.4.1. u. 1.6.) und somit potentielle Zielgene schneller verifiziert werden können. Der molekulare Mechanismus für die positive Regulation eines Zielgens beinhaltet auf DNA-Ebene das Vorhandensein einer bzw. mehrerer funktioneller LEF/TCF-Bindestellen (Giese et al., 1991; van de Wetering et al., 1991) in der regulatorischen Region des Gens. Die Gensequenz (soweit bekannt) der einzelnen Zielgen-Kandidaten konnte auf das Vorhandensein solcher LEF/TCF-Bindestellen überprüft werden, wodurch sich ein Anhaltspunkt für die weitere Bewertung der verschiedenen Kandidaten ergab (s. 3.4.). Dagegen ist die negative Regulation von Genen als Antwort auf ein Wnt-Signal bisher kaum verstanden, was die weitere Analyse solcher Zielgen-Kandidaten erschwert. Aus diesem Grund wird im Folgenden auf eine genauere Darstellung der Ergebnisse für die Gene verzichtet, deren Expression durch ein Wnt-Signal reprimiert wurde. Dabei ist unbestritten, dass die Negativregulation eines Gens im Laufe eines Entwicklungsvorgangs ebenso Seite 56 Ergebnisse essentiell sein kann, wie die Induktion eines Gens. Desweiteren werden bei der Darstellung der Microarray-Ergebnisse diejenigen Transkripte als induziert bezeichnet, für die sich in der vergleichenden Datenanalyse eine Zunahme (Difference Call: I = Increase / MI = Marginal Increase; s. 2.3.4.) der Transkriptmenge im Wnt1Experiment, verglichen mit dem lacZ-Experiment, ergeben hat. Zusätzlich muss der von der Analyse-Software anhand der einzelnen Microarray-Ergebnisse errechnete Änderungsfaktor mindestens 2,0 betragen. (s. 2.3.4.). Reprimierte Transkripte erfüllen die umgekehrten Kriterien. Für einige Zielgen-Kandidaten wurden die MicroarrayErgebnisse durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System überprüft (s. 2.3.5.). Das Ergebnis dieser Überprüfung wird im Folgenden als LightCycler-Faktor dargestellt. Dieser Faktor gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen aus dem lacZ-Experiment für das entsprechende Gen wieder. 3.2.2. Zielgen-Screening mit Mu6500-Microarrays Die Hybridisierung der Mu6500-Arrays mit cRNA nach Angaben des Herstellers ergab bei der anschließenden Detektion nur relativ schwache Fluoreszenzsignale, weshalb die Fluoreszenzintensitäten zunächst durch den Einsatz von Antikörpern in weiteren Färbeschritten verstärkt wurden (s. 2.3.3.). Zudem wurden die Arrays anschließend noch einer zweiten Hybridisierung mit der dreifachen cRNA-Menge unterzogen (s. 2.3.3.), obwohl eine solche Mehrfachbenutzung vom Hersteller eigentlich nicht vorgesehen ist. Diese Schritte wurden durchgeführt, um die Detektion schwach exprimierter Transkripte nach Möglichkeit zu optimieren. Anteil detektierter Ø Transkript- Induz. Reprim Transkripte signalstärke (Tss) Transkr. Transkr. lacZ (- / + Ak) 38,5 % / 39,8 % 961 / 812 Wnt1 (- / + Ak) 37,8 % / 40,3 % 969 / 834 11 20 lacZ (- / + Ak) 35,5 % / 35,5 % 1002 / 3907 Wnt1 (- / + Ak) 34,2 % / 35,3 % 975 / 3872 35 47 Experiment 1. Hybridisierung (15 µg cRNA) 2. Hybridisierung (45 µg cRNA) Tab. 3.2. Mu6500-Arrays / 18 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten. Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente, jeweils vor bzw. nach der Antikörperamplifikation zur Verstärkung des Fluoreszenzsignals. Für die Angabe der induzierten und reprimierten Transkripte wurden die entsprechenden Zahlen vor bzw. nach der Antikörperamplifikation jeweils addiert. Seite 57 Ergebnisse Tabelle 3.2 gibt einen Überblick über den Anteil der detektierten Transkripte und die durchschnittliche Transkriptsignalstärke (Ø Tss) in den einzelnen Experimenten, jeweils vor bzw. nach Antikörper-Amplifikation der Fluoreszenzsignale. Die Anzahl der induzierten bzw. reprimierten Transkripte ist ebenfalls angegeben. Bei der 1. Hybridisierung mit 15 µg cRNA wurden 37,8 – 40,3 % der 6.500 Transkripte, die mit den Mu6500-Arrays detektiert werden können, in den ES-Zellen nachgewiesen. Überraschenderweise lag der Anteil der detektierten Transkripte bei der 2. Hybridisierung mit 45 µg cRNA nur bei 34,2 - 35,5 %, er war also geringer als bei der 1. Hybridisierung mit weniger cRNA. In jedem Fall wurden nach der AntikörperAmplifikation der Fluoreszenzsignale (s. 2.3.3.) mehr Transkripte detektiert, als ohne diese Amplifikation, und zwar sowohl bei der 1. als auch bei der 2. Hybridisierung der Mu6500-Arrays. Ein deutlicher Unterschied zwischen lacZ-Experiment und Wnt1-Experiment in Bezug auf den Anteil der nachgewiesenen Transkripte, ließ sich nicht erkennen. Es zeigte sich weiterhin, dass die Anzahl der Wnt1-induzierten (bzw. reprimierten) Transkripte sehr gering war, insbesondere nach der 1. Hybridisierung. Aus diesem Grund wurden für die weitere Überprüfung auch einige Gene berücksichtigt, für die sich bei der Datenanalyse keine Zunahme der Transkriptmenge ergeben hatte (Difference Call: NC = No Change; s. 2.3.4.), für die aber trotzdem ein Änderungsfaktor von über 2,0 errechnet worden war. Wie in Abschnitt 2.3.4. erwähnt, erfolgt die Berechnung des Änderungsfaktors (Fold Change) unabhängig von der Feststellung eines Expressionsunterschieds (Difference Call). Die MicroarrayErgebnisse wurden durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System überprüft (s. 2.3.5.). In den Tab. 3.3 und 3.4 sind die Ergebnisse dieser Überprüfung und die ursprünglichen Chip-Ergebnisse für die untersuchten Gene dargestellt, und zwar getrennt für Hybridisierung 1 und 2. Seite 59 oben Tab. 3.3. Mu6500-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten (1. Hybridisierung). Seite 59 unten Tab. 3.4. Mu6500-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten (2. Hybridisierung). Zur Darstellung der Chip-Ergebnisse: die Spalte „Änderung“ entspricht dem Difference Call aus der Datenauswertung. NC (No Change) bedeutet keine Änderung, MI (Marginal Increase) bedeutet leichte Zunahme, I (Increase) bedeutet Zunahme. Die Spalte „Faktor“ enthält jeweils den errechneten Wert für den Fold Change. Die Spalte „∆Tss“ gibt den Unterschied der Transkriptsignalstärken zwischen Wnt1Experiment und lacZ-Experiment wider und entspricht dem Average Difference Change. Für die genaue Erklärung der Begriffe s. Abschnitt 2.3.4. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an. Seite 58 Ergebnisse Bezeichnung Chip-Ergebnisse GenBank- LightCyclerFaktor Nummer Änderung Faktor ∆ Tss Chop-10 X67083 - / NC - / ~6,5 - / 378 ~ 1,0 EpoxidHydrolase Z37107 I/I 3,1 / 10,8 149 / 155 ~ 1,0 Nek1 S45828 MI / - ~2,1 / - 47 / - ~ 1,0 Nip45 U76759 I / NC 2,4 / 2,0 95 / 75 ~ 1,0 Pace4a D50060 - / NC - / ~3,5 - / 205 ~ 1,0 RelB M83380 NC / NC ~3,8 / ~6,8 111 / 98 2,0 Pgrp X89374 I/- ~2,2 / - 329 / - 16,8 Tulp2 X69827 MI / - ~2,4 / - 256 / - ~ 1,0 Bezeichnung Chip-Ergebnisse GenBank- LightCyclerFaktor Nummer Änderung Faktor ∆ Tss Chop-10 X67083 - / NC - / ~4,2 - / 1522 ~ 1,0 EpoxidHydrolase Z37107 I/I ~4,6 / ~5,3 153 / 625 ~ 1,0 Nip45 U76759 I / NC 2,8 / 2,0 118 / 373 ~ 1,0 RelB M83380 - / NC - / ~4,9 - / 770 2,0 Cadherin-7 Hom. W48463 I/- ~2,0 / - 61 / - ~ 1,0 Cdx1 M37163 -/I - / ~3,2 - / 1060 s. Abb.3.2 Ebf1 L12147 I/- ~2,5 / - 62 / - 2,4 Endophilin 1 U58886 MI / - ~2,2 / - 317 / - ~ 1,0 Hint-1 Hom. W08109 I / NC ~3,0 / ~2,2 558 / 1138 ~ 1,0 Mkk6 U39066 I/- ~2,6 / - 404 / - ~ 1,0 Nek1 S45828 MI / - ~2,1 / - 47 / - ~ 1,0 Pdgfrβ X63100 I/I ~2,2 / ~3,1 189 / 1020 ~ 1,0 Protein phosphatase 5 AA037987 I/- 3,1 / - 344 / - ~ 1,0 Tgfβ2 X57413 I/- ~2,2 / - 190 / - 2,3 Vasa Hom. D14859 I/- ~2,1 / - 300 / - ~ 1,0 Vldlr U06670 - / MI - / ~2,6 - / 314 ~ 1,0 Seite 59 Ergebnisse Von insgesamt 19 neuen Zielgen-Kandidaten wurde die Expression in lacZ- bzw. Wnt1-behandelten ES-Zellen mit dem LightCycler untersucht. Für vier dieser Gene, RelB, Pgrp, Ebf1 und Tgfβ2, konnten die Ergebnisse, die mit den Microarrays erzielt wurden, durch quantitative RT-PCR bestätigt werden. RelB und Pgrp wurden schon nach der ersten Hybridisierung der Mu6500-Arrays als hochreguliert erkannt, wohingegen Ebf1 und Tgfβ2 erst nach der zweiten Hybridisierung in der Liste der induzierten Gene auftauchten. Auch Cdx1, ein Gen, für das eine Regulation durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg bereits gezeigt wurde (Lickert et al., 2000), wurde von der Software als hochreguliert eingestuft, aber ebenfalls erst nach der zweiten Hybridisierung. Für Ebf1 ergab sich in der quantitativen RT-PCR eine 2,4-fach höhere Transkriptmenge in den Wnt1-behandelten ES-Zellen, im Vergleich zur lacZKontrolle, was ungefähr dem Ergebnis aus dem Chip-Experiment entspricht (Faktor ~2,5). Auch für Tgfβ2 stimmen die Änderungsfaktoren aus dem Chip-Experiment (~2,2) und der quantitativen PCR (2,3) beinahe überein. Im Falle von Pgrp ergab die quantitative RT-PCR, dass die Transkriptmenge in den Wnt1-behandelten ES-Zellen deutlich stärker ansteigt (über 16-facher Anstieg), als nach den Microarray-Daten zu erwarten gewesen wäre (etwa 2-facher Anstieg). Im Gegensatz dazu ergab sich für RelB in der quantitativen PCR (Faktor 2,0) ein geringerer Expressionsunterschied zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Kontrolle, als durch die Chip-Ergebnisse (Faktoren zwischen ∼3,8 und ∼6,8) angezeigt wurde. An dieser Stelle sollte erwähnt werden, dass es sich bei den Änderungsfaktoren, die sich aus den Microarray-Experimenten ergaben, teilweise nur um Schätzwerte handelt, die von der Analyse-Software angegeben wurden. In diesen Fällen ist dem Änderungsfaktor ein Tilde-Zeichen (∼) vorangestellt. Schätzwerte werden angegeben, wenn die Berechnung des Änderungsfaktors nicht möglich war, etwa weil das entsprechende Gen im lacZ-Kontrollexperiment gar nicht detektiert wurde (s. 2.3.4.). Für alle anderen überprüften Gene ließen sich die im Chip-Experiment festgestellten Expressionsunterschiede nicht reproduzieren. Für diese Gene war die Transkriptmenge in Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen des lacZKontrollexperiments ungefähr gleich, im LightCycler-Experiment ergab sich also ein Faktor von etwa 1,0. Interessant ist in diesem Zusammenhang ein Blick auf die absoluten Änderungen der Transkriptsignalsstärken (∆ Tss) für die jeweiligen Zielgen-Kandidaten, die ebenfalls in den Tabellen 3.3 und 3.4 dargestellt sind. Verglichen mit den durchschnittlichen Transkriptsignalstärken für die jeweiligen Experimente, die man Tab. 3.2 entnehmen kann, sind die Werte für ∆ Tss in den meisten Fällen sehr niedrig, was bedeutet, dass es sich bei den meisten untersuchten Seite 60 Ergebnisse Zielgen-Kandidaten um sehr schwach exprimierte Gene handelt, deren Nachweis mit Hilfe der Microarrays gerade noch möglich ist. 3.2.3. Zielgen-Screening mit Mu19k-Microarrays Die Erfahrungen mit den Mu6500-Arrays führten dazu, dass in den darauf folgenden Experimenten 30 µg cRNA, statt den empfohlenen 15 µg cRNA, für die Hybridisierung der Mu19k- sowie der MG-U74A-Arrays eingesetzt wurden. Dies diente dazu, die Signalstärken bei der Detektion von schwach exprimierten Genen zu erhöhen (Luthi-Carter et al., 2000). Eine weitere Konsequenz aus den Ergebnissen, die mit den Mu6500-Arrays erzielt wurden, lag darin, dass zumindest ein großer Teil der folgenden Chip-Experimente mehrfach durchgeführt wurde. Bei der Auswertung der Daten sollten dann nur diejenigen Gene berücksichtigt werden, die in jedem Fall einen Expressionsunterschied zwischen lacZ-Kontrolle und Wnt1-Experiment zeigen. Dies würde eine effektivere Auswahl der Zielgen-Kandidaten ermöglichen, für die der Wnt1-induzierte Expressionsunterschied durch quantitative RT-PCR überprüft werden soll. Die hohen Anschaffungskosten für die Microarrays begrenzten jedoch die Möglichkeit, Experimente mehrfach durchzuführen. Von den Mu19k-Arrays standen insgesamt drei komplette Chipsätze zur Verfügung. Ein Chipsatz wurde mit cRNA von lacZ-behandelten ES-Zellen hybridisiert. Die beiden anderen Chipsätze wurden jeweils mit cRNA von Wnt1-behandelten ES-Zellen hybridisiert, wobei die cRNA für diese beiden Chipsätze von unabhängigen Cokultur-Experimenten stammte. Die Expressionsdaten aus den beiden Wnt1-Experimenten wurden abschließend, unabhängig voneinander, mit den Expressionsdaten der lacZ-Kontrolle verglichen. Die Schnittmenge von Zielgen-Kandidaten aus diesen Einzelvergleichen wurde genauer analysiert. Tabelle 3.5 gibt einen Überblick über den Anteil der detektierten Transkripte und die durchschnittliche Transkriptsignalstärke (Ø Tss) in den einzelnen Experimenten. Die Anzahl der induzierten bzw. reprimierten Transkripte wird ebenfalls angegeben, wobei diejenigen Transkripte, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur lacZ-Kontrolle gleich reguliert waren, jeweils in einer Schnittmenge zusammengefasst wurden. Im Kontroll-Experiment wurden 43 % der etwa 19.000 Transkripte, die mit den Mu19k-Arrays detektiert werden können, in den ES-Zellen nachgewiesen. Dagegen wurden in den beiden Wnt1-Experimenten jeweils etwa 46 % der potentiell nachzuweisenden Transkripte detektiert. Die durchschnittliche Transkriptsignalstärke war in allen drei Experimenten vergleichbar und lag auf einem Seite 61 Ergebnisse Anteil detektierter Ø Transkript- Induzierte Reprimierte Transkripte signalstärke (Tss) Transkripte Transkripte lacZ 43,0 % 3849 Wnt1 – 1. Exp. 45,9 % 3811 124 66 Wnt1 – 2. Exp. 46,2 % 3773 157 69 36 10 Experiment Schnittmengen aus den beiden Wnt1-Experimenten Tab. 3.5. Mu19k-Arrays / 18 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten. Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente sowie die Anzahl der induzierten und reprimierten Transkripte in den Wnt1-Experimenten verglichen zum lacZ-Kontrollexperiment. deutlich höheren Niveau, als bei der 1. Hybridisierung der Mu6500-Arrays (vgl. Tab. 3.2). Auch die Anzahl der Wnt1-induzierten (bzw. reprimierten) Transkripte war deutlich höher als in den Experimenten mit den Mu6500-Arrays. Dabei ist zu berücksichtigen, dass, im Vergleich zu den Mu6500-Arrays, mit den Mu19k-Arrays etwa die dreifache Menge an Transkripten detektiert werden kann. Im ersten Wnt1Experiment war im Vergleich zur lacZ-Kontrolle die Expression von 124 Transkripten induziert, im zweiten Wnt1-Experiment waren es 157 Transkripte. Darunter waren 36 Transkripte, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur lacZ-Kontrolle hochreguliert waren. Von diesen 36 Genen wurden diejenigen ausgewählt, die aus der Sicht des Entwicklungsbiologen am vielversprechendsten erschienen. Zusätzlich wurden einige wenige Gene ausgewählt, deren Expression nur in einem der Wnt1-Experimente als hochreguliert eingestuft worden war. Die ChipErgebnisse wurden jeweils durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System überprüft (s. 2.3.5.). In Tab. 3.6 sind die Ergebnisse dieser Überprüfung und die ursprünglichen Chip-Ergebnisse für die untersuchten Gene dargestellt. Brachyury war eines der 36 Gene, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur lacZ-Kontrolle hochreguliert waren. Dies zeigt, dass die Methode, mit der das Zielgen-Screening durchgeführt wurde, grundsätzlich funktioniert, da Brachyury bereits als Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs beschrieben ist (Arnold et al., 2000; Luthi-Carter et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999b). Von weiteren 19 neuen Zielgen-Kandidaten wurde die Expression in den unterschiedlich behandelten ES-Zellen mit dem LightCycler –System untersucht. Für sieben dieser Gene konnte eine Wnt1-abhängige Expressionssteigerung bestätigt werden. Neben Axin2, Follistatin, Lhpp, Sprr2a und Troy, für die in der quantitativen PCR über zweifach höhere Transkriptmengen in den Seite 62 Ergebnisse Bezeichnung Chip-Ergebnisse TIGR LightCyclerFaktor Gen-Index Änderung Faktor ∆ Tss Asf TC32978 I/I 4,0 / 4,0 3175 / 3170 ~1,0 Axin2 TC18387 I/I ~24,7 / ~24,7 3374 / 3395 3,8 Elk3 TC19315 - / MI - / 6,4 - / 874 ~1,0 Filamin– Homolog TC24101 -/I - / ~9,2 - / 1173 ~1,0 Follistatin TC25779 I/I 3,0 / 5,0 420 / 860 2,8 Glypican-3 TC27120 I/- ~3,1 / - 1044 / - ~1,0 Hmga2 TC16454 NC / - ~3,0 / - 279 / - 1,4 Igfbp3 TC26378 I/I ~10,5 / ~7,9 4693 / 3422 1,6 Lef1 TC21158 I/- ~2,0 / - 664 / - ~1,0 Lhpp TC34823 I/I ~4,8 / ~4,9 1902 / 1930 2,8 Mmp1 TC39785 I/- ~2,5 / - 846 / - ~1,0 Pkp2a TC34418 MI / I 2,5 / 2,9 1773 / 2207 ~1,0 Rp42 TC28722 I/I ~2,1 / ~3,3 553 / 1137 ~1,0 sFrp2 TC39936 I/- ~2,2 / - 671 / - ~1,0 Sprr2a TC24113 I/I ~7,8 / ~13,4 964 / 1781 2,3 Brachyury TC24494 I/I 5,0 / 9,2 987 / 2057 s. Abb. 3.2 Troy TC21938 I/I 2,5 / 2,4 555 / 500 3,2 Unbek. cDNA AK003195 TC35476 I/I ~2,7 / ~5,1 966 / 2093 ~1,0 EST TC32971 I/I 2,2 / 3,6 822 / 1725 ~1,0 EST TC37382 MI / MI ~5,0 / ~3,7 2264 / 1369 ~1,0 Tab. 3.6. Mu19k-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten. Zur Darstellung der Chip-Ergebnisse: die Spalte „Änderung“ entspricht dem Difference Call aus der Datenauswertung. NC (No Change) bedeutet keine Änderung, MI (Marginal Increase) bedeutet leichte Zunahme, I (Increase) bedeutet Zunahme. Die Spalte „Faktor“ enthält jeweils den errechneten Wert für den Fold Change. Die Spalte „∆Tss“ gibt den Unterschied der Transkriptsignalstärken zwischen Wnt1Experiment und lacZ-Experiment wider und entspricht dem Average Difference Change. Für die genaue Erklärung der Begriffe s. Abschnitt 2.3.4. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an. Wnt1-behandelten ES-Zellen im Vergleich zur lacZ-Kontrolle ermittelt wurden, wurde auch für Hmga2 und Igfbp3 eine Wnt1-abhängige Expressionssteigerung bestätigt. Für Hmga2 und Igfbp3 waren die in der quantitativen PCR gemessenen Seite 63 Ergebnisse Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-Probe und lacZ-Kontrolle jedoch nur gering. Überhaupt war in fast allen Fällen der Faktor der Expressionssteigerung, der mit Hilfe der quantitativen PCR ermittelt wurde, niedriger als der im Chip-Experiment ermittelte. Besonders deutlich wird dies am Beispiel von Axin2. Die MicroarrayDaten zeigten einen ca. 25-fachen Expressionsanstieg nach Wnt1-Stimulation der ESZellen, tatsächlich ergab sich in der quantitativen RT-PCR ein Expressionsanstieg um weniger als das Vierfache. Dabei ist jedoch zu beachten, dass es sich bei den Änderungsfaktoren aus den Mu19k-Experimenten fast ausschließlich um Schätzwerte handelt (s. 2.3.4.). 3.2.4. Zielgen-Screening mit MG-U74A-Microarrays Für die Hybridisierung der MG-U74A-Arrays wurde von der bisherigen Vorgehensweise in einigen Punkten abgewichen. Ziel dieser Veränderungen war es, Zielgen-Kandidaten zu identifizieren, die mit den bisherigen Experimenten nicht erfasst worden waren. Bei den ES-Zell-Cokulturen für die bisher vorgestellten Microarray-Experimente betrug die Dauer der Cokultur jeweils 18 Stunden. Zudem wurden bisher alle Experimente mit R1 ES-Zellen (Nagy et al., 1993) durchgeführt. Nun kamen in den Cokulturexperimenten D3 ES-Zellen (Doetschman et al., 1985) zum Einsatz. Zudem wurden ES-Zellen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Cokultur geerntet. Die Hälfte der Cokulturexperimente wurde wieder, wie bisher, mit einer Cokultur-Dauer von 18 h durchgeführt, für die andere Hälfte wurde die Dauer der Cokultur auf 10 h reduziert. Damit sollte der Anteil von direkten Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs unter den Zielgen-Kandidaten erhöht werden, also der Anteil der Gene, deren Wnt-abhängige Expression direkt über funktionelle LEF/TCF-Bindestellen in der jeweiligen Promotorregion gesteuert wird (s. 1.6.). Eine weitere Änderung bestand darin, die Gesamt-RNA aus mehreren (drei) unabhängigen Cokultur-Experimenten, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt worden waren, zu vereinigen, und die cDNA-Synthese und alle weiteren Schritte mit RNA aus diesem Pool durchzuführen. Damit sollten Fehler, die aus der biologischen Variabilität des ES-Zell-Cokultursystems resultieren, weiter verringert werden. Alle Hybridisierungen (lacZ 10 h, Wnt1 10 h, lacZ 18 h, Wnt1 18 h) wurden zwei mal mit unabhängigen Proben durchgeführt, sodass insgesamt acht MG-U74AArrays zum Einsatz kamen. Mit den MG-U74A-Microarrays kann die Expression von etwa 12.000 Transkripten untersucht werden. Seite 64 Ergebnisse Die Tabellen 3.7 und 3.8 geben einen Überblick über den Anteil der detektierten Transkripte und die durchschnittliche Transkriptsignalstärke (Ø Tss) in den einzelnen Experimenten. Die Anzahl der induzierten bzw. reprimierten Transkripte wird ebenfalls angegeben, wobei diejenigen Transkripte, die in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zu den lacZ-Kontrollen gleich reguliert waren, jeweils in einer Schnittmenge zusammengefasst wurden. Anteil detektierter Ø Transkript- Induzierte Reprimierte Transkripte signalstärke (Tss) Transkripte Transkripte lacZ 43,8 % 3467 Wnt1 41,1 % 3400 26 28 lacZ 43,1 % 3484 Wnt1 45,8 % 3160 20 3 1 0 Experiment Exp. 1 Exp. 2 Schnittmenge aus beiden Experimenten Tab. 3.7. MG-U74A-Arrays / 10 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten. Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente sowie die Anzahl der induzierten und reprimierten Transkripte in den Wnt1-Experimenten verglichen zum jeweiligen lacZKontrollexperiment. Nach 10 h Cokulturdauer stellt sich die Situation wie folgt dar (s. Tab. 3.7). Der Anteil detektierter Transkripte in den einzelnen Experimenten lag zwischen 41,1 – 45,8 %, wobei im 1. Experiment mehr Transkripte bei der lacZ-Kontrolle als im Wnt1-Experiment detektiert wurden; im 2. Experiment war dies umgekehrt. Die durchschnittlichen Transkriptsignalstärken in den einzelnen Ansätzen waren vergleichbar und lagen auf etwa demselben Niveau wie beim Experiment mit den Mu19k-Arrays (s. Tab 3.5). Die Anzahl der Wnt1-induzierten (bzw. reprimierten) Transkripte war relativ gering. Zudem fand sich nur ein Transkript, das sowohl im 1. als auch im 2. Wnt1-Experiment im Vergleich zur jeweiligen lacZ-Kontrolle hochreguliert war (Schnittmenge = 1). Bei dem Gen handelt es sich um Cdx1, ein direktes Zielgen, des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Lickert et al., 2000). Die Situation nach 18 h Cokulturdauer (s. Tab. 3.8) ähnelt der Situation nach 10 h Cokultur. Der Anteil detektierter Transkripte in den einzelnen Experimenten lag zwischen 43 – 45 %, bei vergleichbaren Werten für die durchschnittlichen Transkriptstärken in den einzelnen Experimenten. Wieder waren nur wenige Transkripte nach Wnt1-Behandlung der D3-ES Zellen induziert oder reprimiert, wobei Cdx1 erneut als einziges Transkript in beiden Parallelen als Wnt1-induziert eingestuft wurde (Schnittmenge = 1). Seite 65 Ergebnisse Anteil detektierter Ø Transkript- Induzierte Reprimierte Transkripte signalstärke (Tss) Transkripte Transkripte lacZ 45 % 3380 Wnt1 43 % 3468 17 20 lacZ 43,4 % 3437 Wnt1 43,5 % 3527 20 16 1 0 Experiment Exp. 1 Exp. 2 Schnittmenge aus beiden Experimenten Tab. 3.8. MG-U74A-Arrays / 18 h Cokultur – Zusammenfassung der Microarray-Daten. Die Tabelle zeigt neben dem Anteil der detektierten Transkripte die durchschnittliche Transkriptsignalstärke für die einzelnen Microarray-Experimente sowie die Anzahl der induzierten und reprimierten Transkripte in den Wnt1-Experimenten verglichen zum jeweiligen lacZKontrollexperiment Aus der in den Tabellen 3.7 und 3.8 dargestellten Situation ergaben sich für die weitere Untersuchung folgende Konsequenzen. Zum einen wurde das Vorhaben fallengelassen, nur Zielgen-Kandidaten weiterzuverfolgen, die in der Schnittmenge aus jeweils beiden parallelen Experimenten auftauchten, da sich Cdx1 als einziges Gen in dieser Schnittmenge wiederfand. Von den Transkripten, die jeweils in nur einem Wnt1-Experiment hochreguliert waren, wurden diejenigen weiteruntersucht, die aus der Sicht des Entwicklungsbiologen am interessantesten erschienen. Die ChipErgebnisse für diese Transkripte wurden jeweils durch quantitative RT-PCR mit dem LightCycler-System überprüft (s. 2.3.5.). In den Tabellen 3.9 und 3.10 sind die Ergebnisse dieser Überprüfung und die ursprünglichen Chip-Ergebnisse für die untersuchten Gene dargestellt, wiederum getrennt für 10 h bzw. 18 h Cokulturdauer. Seite 67 oben Tab. 3.9. MG-U74A-Arrays / 10 h Cokultur – überprüfte Kandidaten. Seite 67 Mitte Tab. 3.10. MG-U74A-Arrays / 18 h Cokultur – überprüfte Kandidaten. Zur Darstellung der Chip-Ergebnisse: die Spalte „Änderung“ entspricht dem Difference Call aus der Datenauswertung. NC (No Change) bedeutet keine Änderung, MI (Marginal Increase) bedeutet leichte Zunahme, I (Increase) bedeutet Zunahme. Die Spalte „Faktor“ enthält jeweils den errechneten Wert für den Fold Change. Die Spalte „∆Tss“ gibt den Unterschied der Transkriptsignalstärken zwischen Wnt1Experiment und lacZ-Experiment wider und entspricht dem Average Difference Change. Für die genaue Erklärung der Begriffe s. Abschnitt 2.3.4. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an. Seite 66 Ergebnisse Bezeichnung Chip-Ergebnisse GenBank- LightCyclerFaktor Nummer Änderung Faktor ∆ Tss AtfX AB012276 -/I - / ~2,6 - / 469 ~1,0 Cd97 AA754887 I/- ~2,5 / - 439 / - ~1,0 Cdx1 M80463 I/I ~4,0 / ~4,4 857 / 1009 s. Abb.3.2 Cerr1 AF031896 I/- ~3,1 / - 598 / - ~1,0 Dia2 AF094519 I/- 2,5 / - 649 / - ~1,0 Dmrt1 AL133300 -/I - / 2,4 - / 566 1,9 Fba AV027999 MI / - 2,4 / - 535 / - ~1,0 Ndr2 AB033921 - / MI - / ~3,5 - / 733 1,5 Nrp2 AF022856 I/- ~2,7 / - 474 / - 1,6 Pgrp AF076482 -/I - / ~6,1 - / 1511 s. Tab. 3.3 Bezeichnung Chip-Ergebnisse GenBank- LightCyclerFaktor Nummer Änderung Faktor ∆ Tss Cd97 Y18365 I/- ~3,3 / - 587 / - ~1,0 Cdx1 M80463 I/I ~5,4 / ~5,0 1135 / 1119 s. Abb.3.2 Crbp1 X60367 - / MI - / 2,1 - / 1502 1,7 Klf12 Y14295 -/I - / ~2,4 - / 381 ~1,0 Mmp10 Y13185 I/- ~3,0 / - 506 / - ~1,0 Nkx6.2 L08074 -/I - / ~3,7 - / 753 1,6 Pim1 M13945 /I - / ~5,4 - / 1242 1,9 Von insgesamt 14 neuen Zielgen-Kandidaten (aus 10 h und 18 h Experiment) wurde die Expression in D3 ES-Zellen aus dem lacZ- bzw. Wnt1-Experiment mit dem LightCycler untersucht. Für sechs dieser Gene konnte eine Wnt1-abhängige Expressionssteigerung bestätigt werden, diese Expressionssteigerung lag aber für alle diese Gene in einem Bereich zwischen 1,5-fach und 1,9-fach, war also jeweils geringer als von den Ergebnissen der Chip-Hybridisierung her zu erwarten gewesen wäre (s. Chip-Ergebnisse, Tab. 3.9 u. 3.10). Drei der sechs Gene, Dmrt1, Ndr2 und Nrp2, waren in den ES-Zellen hochreguliert, die nur über einen Zeitraum von 10 h mit den Wnt1-sezernierenden Fibroblasten in Kontakt gewesen waren. Die anderen drei Seite 67 Ergebnisse Gene, Crbp1, Nkx6.2 und Pim1 waren in den ES-Zellen differentiell exprimiert, die 18 h lang cokultiviert worden waren. Neben den neuen Zielgen-Kandidaten wurde, wie schon oben erwähnt, auch Cdx1, ein schon bekanntes Wnt-Zielgen, als hochreguliert in den Wnt1-behandelten ES-Zellen erkannt, und zwar sowohl nach 10 h als auch nach 18 h Cokulturdauer. Zusätzlich wurde nach 10 h Cokulturdauer Pgrp als hochreguliert erkannt, ein Gen, dessen Wnt1-abhängige Regulation (in R1 ESZellen nach 18 h Cokulturdauer) schon im Experiment mit den Mu6500-Arrays nachgewiesen und durch quantitative RT-PCR bestätigt wurde (s. Tab 3.3). Wie schon erwähnt, wurden die Experimente, in denen MG-U74A-Arrays zum Einsatz kamen, allesamt mit D3 ES-Zellen durchgeführt, wohingegen alle vorherigen Experimente mit R1 ES-Zellen durchgeführt worden waren. Die durch quantitative RT-PCR ermittelten Expressionsänderungen für die sechs neuen Zielgen-Kandidaten (aus den Experimenten mit den MG-U74A-Arrays) lagen alle unter einem Faktor von 2,0, und keines der sechs Gene wurde in den vorangegangenen Chip-Experimenten mit den R1 ES-Zellen als Wnt1-reguliert erkannt. Deshalb wurde die Expression dieser Gene in Wnt1-behandelten R1 ES-Zellen bzw. ES-Zellen des Kontrollexperiments nach 18 h Cokultur nachträglich überprüft. Für Dmrt1, Ndr2 und Nrp2, die Gene also, die in Wnt1-behandelten D3 ES-Zellen bereits nach 10 h Cokultur induziert waren, wurde zusätzlich überprüft, ob in D3 ES-Zellen eine solche Induktion auch noch nach 18 h Cokulturdauer festgestellt werden konnte. Mit Hilfe dieser Analysen sollte geklärt werden, ob sich die schwache Wnt1-abhängige Regulation dieser Gene auch unter leicht veränderten Bedingungen bestätigen lässt, bzw. ob diese Regulation unter diesen Bedingungen sogar deutlicher ausgeprägt ist. Die Ergebnisse der quantitativen PCR-Analysen, die zu diesem Zweck durchgeführt wurden, sind Tab. 3.11 zu entnehmen. Bezeichnung GenBankNummer Dmrt1 AL133300 1,9 1,5 2,0 Ndr2 AB033921 1,5 1,4 1,2 Nrp2 AF022856 1,6 1,4 1,2 Crbp1 X60367 - 1,7 2,2 Nkx6.2 L08074 - 1,6 1,5 Pim1 M13945 - 1,9 1,5 ES-Zelllinie D3 D3 R1 Cokulturdauer 10 h 18 h 18 h LightCycler-Faktoren Tab. 3.11. Vergleich der Wnt1-Induktionen in verschiedenen Experimenten Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR sind anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZExperiment an. Nähere Erläuterungen siehe Text. Seite 68 Ergebnisse Alle getesteten Gene zeigten in jedem Fall eine zumindest leichte Expressionssteigerung nach Wnt1-Stimulation der ES-Zellen, unabhängig von der ES-Zelllinie und der Dauer der Cokultur. Für Dmrt1 und Crpb1 war die Wnt1abhängige Regulation in R1 ES-Zellen tatsächlich etwas ausgeprägter, als es in den D3 ES-Zellen der Fall war. Für Dmrt1 ergab sich nach Wnt1-Stimulation von R1 ESZellen eine Expressionssteigerung um das Zweifache, im Vergleich zur lacZKontrolle, für Crbp1 betrug der Faktor 2,2. Für Nkx6.2 und Pim1 wurde in R1 ESZellen dagegen nur eine Expressionssteigerung nach Wnt1-Stimulation um das 1,5 fache ermittelt, im Vergleich zu 1,6- bzw. 1,9 facher Expressionssteigerung in D3 ESZellen. Im Falle von Ndr2 und Nrp2 fielen die Wnt1-abhängigen Expressionssteigerungen in den D3 ES-Zellen nach 18 h Cokultur geringer aus, als nach 10 h Cokultur, in R1 ES-Zellen war eine Wnt1-abhängige Regulation dieser Gene nach 18 h Cokultur kaum mehr zu erkennen (s. Tab. 3.11). 3.2.5. Übersicht über die Ergebnisse aus den einzelnen Experimenten Tab. 3.12 fasst die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR für die Gene / ESTs zusammen, für die sich der mit den Microarrays ermittelte Expressionsunterschied qualitativ bestätigen ließ. Mu6500-Arrays Mu19k-Arrays MG-U74A-Arrays Neue Zielgen-Kandidaten Neue Zielgen-Kandidaten Neue Zielgen-Kandidaten Gen LightCyclerFaktor Gen LightCyclerFaktor Gen LightCyclerFaktor Ebf1 2,4 Axin2 3,8 Crbp1 1,7 Pgrp 16,8 Follistatin 2,8 Dmrt1 1,9 RelB 2,0 Hmga2 1,4 Ndr2 1,5 Tgfβ2 2,3 Igfbp3 1,6 Nrp2 1,6 Lhpp 2,8 Nkx6.2 1,6 Sprr2a 2,3 Pim1 1,9 Troy 3,2 Pgrp (16,8) Bereits bekannte Zielgene Bereits bekannte Zielgene Bereits bekannte Zielgene Cdx1 Brachyury Cdx1 Tab.3.12. Übersicht über die neuen Zielgen-Kandidaten. Die Ergebnisse der quantitativen RTPCR sind anhand des LightCycler-Faktors dargestellt. Dieser gibt das tatsächliche Verhältnis der Transkriptmengen zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Experiment an. Die Transkriptmengen für Pgrp wurden nur in R1 ES-Zellen nach 18 h Cokultur quantifiziert (s. Tab. 3.3), deshalb steht die Angabe für den LightCycler-Faktor diese Gens im MG-U74A-Experiment in Klammern. Bereits bekannte Zielgene, für die ein Expressionsunterschied angezeigt wurde, sind ebenfalls aufgelistet. Seite 69 Ergebnisse Insgesamt konnten durch die Microarray-Experimente und die anschließende Überprüfung der Ergebnisse durch quantitative RT-PCR 17 neue Wnt-ZielgenKandidaten identifiziert werden. Abb. 3.3 zeigt, wie sich, bezogen auf die 17 ZielgenKandidaten aus Tab. 3.12, die Ausmaße der jeweiligen Expressionssteigerungen nach Wnt-Stimulation der ES-Zellen verteilen. Für insgesamt acht Zielgenkandidaten (Crbp1, Dmrt1, Hmga2, Igfbp3, Ndr2, Nrp2, Nkx6.2, Pim1) ergab sich eine Expressionssteigerung nach Wnt-Stimulation um weniger als das Zweifache. Die Expression von sechs weiteren Genen (Ebf1, Follistatin, Lhpp, RelB, Sprr2a, Tgfβ2) steigt um das Zwei- bis Dreifache an. Zwei Gene (Axin2, Troy) zeigen eine Expressionssteigerung um das Drei- bis Vierfache und nur für ein Gen (Pgrp) erhöht sich die Transkriptmenge nach Wnt-Stimulation der ES-Zellen um mehr als das Vierfache. Abb. 3.3. Verteilung der Expressionssteigerungen nach Wnt1-Stimulation der ESZellen für die 17 ZielgenKandidaten aus Tab. 3.12. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR waren die Grundlage für die Einteilung der 17 Zielgen-Kandidaten in die verschiedenen Klassen. 3.3. Informationen zu den Zielgen-Kandidaten Im folgenden Abschnitt werden die neu identifizierten Zielgen-Kandidaten zunächst gemäß ihrer zellulären Funktion klassifiziert und anschließend genauer beschrieben. 3.3.1. Funktionelle Klassifizierung der Zielgen-Kandidaten Sezernierte Proteine Follistatin, Igfbp3, Pgrp, Tgfβ2 Zelluläre Rezeptoren Nrp2, Troy Intrazelluläre Signaltransduktoren Axin2, Pim1 Transkriptionsfaktoren Dmrt1, Ebf1, Hmga2, Nkx6.2, RelB Proteine mit sonstiger oder unbekannter Funktion Crbp1, Lhpp, Ndr2, Sprr2a Seite 70 Ergebnisse 3.3.2. Beschreibung der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten Axin2 Axin2 (Conductin) ist homolog zu Axin, dem Protein, das eine wichtige Rolle im Wnt/β-Catenin–Signalweg einnimmt (s. 1.4.1.). Die Aminosäuresequenzen der beiden Maus Axin-Homologe sind zu 45 % identisch. Axin/Axin2 spielt als Gerüstprotein eine zentrale Rolle beim Abbau von β-Catenin in der Zelle, da es mit allen wichtigen Komponenten des β-Catenin-Degradationskomplexes (APC, GSK3β, CK1α, βCatenin) direkt interagiert und somit diese Proteine in räumliche Nähe zueinander bringt (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998; Polakis, 2002). Axin2 zeigt ein gewebespezifisches Expressionsmuster (s. Abb. 3.7) während der Embryonalentwicklung (Jho et al., 2002), im Gegensatz zu Axin, das ubiquitär exprimiert ist (Zeng et al., 1997). Crbp1 Das Protein Crbp1 (Cellular retinol binding protein 1) ist an der Vitamin A Homöostase in der Zelle beteiligt. Es bindet spezifisch an intrazelluläres all-transRetinol (Vitamin A1) und solubilisiert so dieses hydrophobe Molekül im wässrigen Milieu des Cytoplasma (Vogel et al., 2001). Es wurde gezeigt, dass Crbp1-defiziente Mäuse bei Vitamin A-armer Ernährung deutlich weniger Retinyl-Ester (Speicherform des Retinol) in der Leber enthalten als Wildtyp-Mäuse (Ghyselinck et al., 1999). Aus entwicklungsbiologischer Sicht ist der Retinoid-Stoffwechsel interessant, weil Retinsäure als Signalmolekül Prozesse in der frühen Embryogenese steuert (Niederreither et al., 2001; Niederreither et al., 2000; Niederreither et al., 2002; Villanueva et al., 2002). Crbp1 ist während der Embryonalentwicklung in der fötalen Leber, aber auch in anderen Organen, etwa in Teilen des sich entwickelnden Nervensystems exprimiert (Dolle et al., 1990; Gustafson et al., 1993; Ruberte et al., 1991). Dmrt1 Das Protein Dmrt1 besitzt eine DM-Domäne, eine DNA-Bindedomäne, deren Namen sich von den Proteinen Doublesex (Drosophila) und MAB-3 (C. elegans) ableitet (Raymond et al., 1998), zwei Transkriptionsfaktoren, bei denen diese Domäne zum ersten Mal beschrieben wurde. Proteine mit DM-Domänen sind bei den Seite 71 Ergebnisse verschiedensten Spezies an der Bestimmung und Differenzierung des männlichen bzw. weiblichen Geschlechts beteiligt (Zarkower, 2002). Während der Embryogenese der Maus ist Dmrt1 zunächst in den Genitalleisten beider Geschlechter exprimiert, in späteren Stadien (ab E 14,5 d.p.c.) dagegen nur noch in den männlichen Gonadenanlagen und in den Hoden (Raymond et al., 1999). Dmrt1-defiziente Mäuse zeigen einen Defekt in der Hodendifferenzierung, die Geschlechtsbestimmung ist aber offenbar nicht beeinträchtigt (Raymond et al., 2000). Ebf1 Ebf1 (Early B-cell factor 1) gehört zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren mit einer Zink-stabilisierten DNA-Bindedomäne und einer HLH-Dimerisierungsdomäne (Hagman et al., 1995; Liberg et al., 2002). Diese Transkriptionsfaktoren sind an der Regulation vieler Entwicklungsprozesse beteiligt (Liberg et al., 2002). Ebf1 K.O.Mäuse zeigen eine Blockade der B-Zell-Entwicklung im pro-B-Zell-Stadium (Lin und Grosschedl, 1995). Darüber hinaus ist in Ebf1-defizienten Mäusen die Zelldifferenzierung in Teilen des Zentralnervensystems gestört, was u. a. zu einer Größenreduktion betroffener Gehirnteile führt (Garel et al., 1999). Die Entwicklung von Adipocyten aus mesenchymalen Stammzellen wird ebenfalls von Ebf1 beeinflusst (Akerblad et al., 2002; Liberg et al., 2002). Follistatin Das Protein Follistatin wurde zuerst aus der Follikelflüssigkeit von Rindern isoliert (Robertson et al., 1987). Es wurde gezeigt, dass Follistatin, ebenso wie Inhibin, antagonistisch auf die Activin-induzierte Sekretion von Follikelstimulierendem Hormon (FSH) der Hypophyse wirkt (Kogawa et al., 1991; Ying et al., 1987). Später wurde gezeigt, dass Follistatin schon früh während der Embryonalentwicklung von Mäusen und anderen Vertebraten exprimiert wird (Albano et al., 1994; Feijen et al., 1994) und an der Steuerung vieler Entwicklungsprozesse beteiligt ist (HemmatiBrivanlou et al., 1994; Matzuk et al., 1995; Patel, 1998). Follistatin bindet direkt an Activin (Nakamura et al., 1990) und andere Vertreter der TGFβ− Familie von Signalmolekülen (Amthor et al., 2002; Fainsod et al., 1997) und moduliert so deren Bindung an zelluläre Rezeptoren. Follistatin K.O.-Mäuse sterben wenige Stunden nach der Geburt. Sie zeigen u. a. Skelettabnormalitäten, schwach ausgebildete Zwerchfell- und Zwischenrippenmuskulatur sowie Defekte in der Entwicklung von Haut, Schnurrhaaren und Zähnen (Matzuk et al., 1995). Seite 72 Ergebnisse Hmga2 Hmga2 (auch Hmgi-c) ist Mitglied einer Familie von kleinen, nukleären Proteinen, die wahrscheinlich eine Rolle als architektonische Transkriptionsfaktoren besitzen (Goodwin, 1998; Liu et al., 2001; Manfioletti et al., 1995). Das heißt die Proteine binden an DNA, besitzen jedoch keine transaktivierende Funktion, sondern beeinflussen die Bindung weiterer Transkriptionsfaktoren und die Bildung eines aktiven Transkriptionskomplexes (Liu et al., 2001). Außer im Gehirn wird Hmga2 während den frühen Stadien der Maus-Embryonalentwicklung in den meisten Geweben exprimiert; in späteren Entwicklungsstadien ist Hmga2 v.a. im Darmepithel exprimiert (Hirning-Folz et al., 1998). Das Ausschalten des Gens in der Maus führt zu Zwergenwuchs (Zhou et al., 1995) und insbesondere einer Reduktion des Fettgewebes (Anand und Chada, 2000). Passend dazu wurde die Expression von Hmga2 in einigen Tumoren, insbesondere Fettzell-Tumoren, beschrieben (Goodwin, 1998). Igfbp3 Igfbp3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3) bindet mit hoher Affinität an die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II (Baxter, 2000). Auf diese Weise wirkt Igfbp3 als Träger für diese Wachstumsfaktoren im Blutstrom, konkurriert aber auch mit den zellulären Rezeptoren dieser Wachstumsfaktoren und beeinflusst so den IGF-Signalweg, der an der Steuerung von Zellwachstum und –differenzierung beteiligt ist (Kelley et al., 1996; Schneider et al., 2000). Lhpp Das Gen codiert für eine Phosphatase. Aus der genauen Bezeichnung für das homologe Genprodukt des Menschen lässt sich entnehmen, das Phospholysin, Phosphohistidin und anorganisches Pyrophosphat die Substrate dieses Enzyms sind. Die mRNA des Maus-Gens wurde aus der Zunge einer adulten Maus isoliert (GenBank AK009207). Ndr2 Ndr2 ist homolog zu Ndr1 (Shimono et al., 1999), einem Gen, dessen Expression durch N-myc negativ reguliert ist (Ndr1 steht für N-myc downstream regulated 1). Im Gegensatz zu Ndr1, wird die Expression von Ndr2 nicht von N-myc beeinflusst (Okuda und Kondoh, 1999). Die Expression von Ndr2 ist entwicklungsspezifisch Seite 73 Ergebnisse reguliert, mit deutlicher Expression in Herz und ventrikulärer Zone des Neuralrohrs, neben anderen Expressionsdomänen (Okuda und Kondoh, 1999). Über die Funktion von Ndr2 ist nichts bekannt. Eine Mutation des humanen Ndr1-Homologs NDRG1 ist für eine erblich bedingte Erkrankung des peripheren Nervensystem verantwortlich (Kalaydjieva et al., 2000). Nrp2 Neuropiline sind Transmembranproteine, die als zelluläre Rezeptoren für sezernierte Semaphorine an der axonalen Wegfindung beteiligt sind (Chen et al., 1997; Giger et al., 2000; Neufeld et al., 2002). Wahrscheinlich sind Plexine, eine andere Klasse von Semaphorin-Rezeptoren, die mit den Neuropilinen einen Komplex bilden können, für die Signalleitung nach der Semaphorin-Bindung verantwortlich. Neuropiline dienen also vermutlich eher als Corezeptoren für Semaphorine (Neufeld et al., 2002). Zudem dienen Neuropiline als Corezeptoren für einige Wachstumsfaktoren der VEGF-Klasse (Neufeld et al., 1999). Nrp2-defiziente Mäuse zeigen Defekte in Organisation und Verlauf zentraler und peripherer Nerven (Giger et al., 2000) und Störungen in der Entwicklung der Lymphgefäße (Yuan et al., 2002). Nkx6.2 Das Homeobox-Gen Nkx6.2 (frühere Bezeichnung: Gtx) wird während der Embryonalentwicklung im ventralen Neuralrohr exprimiert, ebenso wie das nah verwandte Gen Nkx6.1 (Vallstedt et al., 2001). In adulten Mäusen ist Nkx6.2 in Gehirn, Rückenmark und Hoden exprimiert (Komuro et al., 1993). Sowohl für Nkx6.1 als auch Nkx6.2 wurde eine repressorische Wirkung auf die Genexpression ermittelt (Awatramani et al., 2000; Vallstedt et al., 2001). Nkx6.2 K.O.-Mäuse zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp (Cai et al., 2001), möglicherweise aufgrund von funktioneller Redundanz von Nkx6.1 und Nkx6.2. Für Nkx6.1 konnte gezeigt werden, dass es an der Spezifikation von Motoneuronen und Interneuronen im ventralen Neuralrohr beteiligt ist (Sander et al., 2000). Pgrp Dieses Protein ist ein Vertreter einer Familie von Proteinen, die von Insekten bis zu Säugetieren evolutionär konserviert sind (Kang et al., 1998; Kiselev et al., 1998), und mit hoher Affinität an Peptidoglycan, den Hauptbestandteil bakterieller Zellwände, binden (Pgrp steht für Peptidoglycan recognition protein). In Drosophila wurden 12 Seite 74 Ergebnisse Pgrp-Gene isoliert (Werner et al., 2000) und es wurde gezeigt, dass die Proteine, für die diese Gene codieren, eine wichtige Rolle bei der Abwehr bakterieller Infektionen spielen (Choe et al., 2002). Peptidoglycan-bindende Proteine werden von Zellen sezerniert oder aber als membrangängige Proteine an deren Oberfläche präsentiert. Das Gen, dessen Expression nach Wnt1-Behandlung der Maus ES-Zellen stimuliert wurde, codiert wahrscheinlich für ein sezerniertes PGRP. Es wurde gezeigt, dass das Protein im Knochenmark und in neutrophilen Zellen des Immunsystems exprimiert wird (Liu et al., 2000). Auch die Bindung des Proteins an Peptidoglycan wurde experimentell bestätigt (Liu et al., 2000). Pim1 Pim1 codiert für eine Serin/Threonin-Kinase (Saris et al., 1991). Das Gen wurde identifiziert als eine bevorzugte Integrationsstelle eines Maus-Tumorvirus, das T-Zell Lymphome in Mäusen auslöst (Cuypers et al., 1984). Genauere Untersuchungen zeigten, dass Pim1 an der Regulation von Proliferation, Differenzierung und programmiertem Zelltod von lymphoiden und myeloiden Zellen beteiligt ist (Laird et al., 1993; Shirogane et al., 1999; Wang et al., 2001). Während der Embryonalentwicklung ist Pim1 in Zellen des hämatopoetischen Systems, aber auch in Teilen des Zentralnervensystems exprimiert, was auf eine Funktion des Proteins auch außerhalb des hämatopoetischen Systems hindeutet (Eichmann et al., 2000). Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die Expression von Pim1 für die sogenannte „long term potentiation“ (LTP), also die Langzeit-Modulation der synaptischen Übertragung zwischen Neuronen erforderlich ist (Konietzko et al., 1999). RelB Das Protein RelB gehört zur Familie der Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren mit einer charakteristischen Proteindomäne, der Rel Homologie Domäne (RHD), die für DNA Bindung und Dimerisierung dieser Faktoren verantwortlich ist (Baeuerle und Baltimore, 1996; May und Ghosh, 1997). Das Drosophila- Protein Dorsal, das wesentlich an der Etablierung der dorso-ventralen Polarität in diesem Organismus beteiligt ist, ist ebenfalls ein solcher Rel/NFκB Transkriptionsfaktor (Steward, 1987). In Vertebraten sind Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren v. a. in lymphoiden Zellen und Organen exprimiert (Schmidt-Ullrich et al., 1996) und an der Regulation von Immunantworten und Entzündungsprozessen beteiligt (Attar et al., 1997; Gerondakis et al., 1999). Eine Beteiligung von Rel/NFκB Transkriptionsfaktoren an Seite 75 Ergebnisse Entwicklungsprozessen, ähnlich wie in Drosophila, konnte bisher in Vertebraten nicht nachgewiesen werden. Sprr2a Das Protein Sprr2a ist ein Vertreter aus einer Familie kleiner, Prolin-reicher Proteine (Sprr steht für small proline-rich), die während der terminalen Differenzierung von Keratinocyten exprimiert werden (Fischer et al., 1996; Song et al., 1999). Wie die anderen Sprr-Proteine ist Sprr2a an der Ausbildung der Hornschicht von terminal differenzierten Keratinocyten beteiligt. Tgfβ2 TGFβ2 ist eines von mehr als 30 Mitgliedern der Superfamilie von extrazellulären TGFβ-Signalmolekülen (Massague, 1998; Miller et al., 1989). Der TGFβ-Signalweg, der von diesen Proteinen stimuliert wird, ist evolutionär hochkonserviert und an der Regulation einer Vielzahl von Wachstums- und Entwicklungsprozessen beteiligt (Massague, 1998). Maus Tgfβ2 wird während der Embryonalentwicklung in vielen Organen exprimiert (Millan et al., 1991). Tgfβ2-defiziente Mäuse zeigen eine Vielzahl von Entwicklungsdefekten und sterben nach der Geburt. Betroffen sind z. B. Herz, Lunge und sensorische Organe sowie das Urogenitalsystem. Zudem treten Skelettabnormalitäten auf (Sanford et al., 1997). Troy Troy (Tnfrsf19) ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor Superfamilie (Hu et al., 1999). Insbesondere die extrazelluläre Domäne des Proteins weist eine starke Homologie zu Edar (Ectodysplasin-A Rezeptor) auf, einem Vertreter der TNF-Rezeptor Superfamilie, der die Entwicklung von Haarfollikeln reguliert (Kojima et al., 2000). Während der Embryonalentwicklung ist Troy in Teilen des Neuroepithels, in der Epidermis und in den Epithelien einiger Organe exprimiert. In neugeborenen Mäusen wurde Troy mRNA hauptsächlich in Haarfollikeln und in Teilen des Großhirns nachgewiesen, nicht aber in der Epidermis der Haut (Kojima et al., 2000). Seite 76 Ergebnisse 3.4. Untersuchung der 5‘-flankierenden Sequenzen der Wnt1induzierten Gene Wie bereits erwähnt (s. 1.4.1.), binden Transkriptionsfaktoren der LEF/TCF-Familie an konservierte Bindestellen (Giese et al., 1991; van de Wetering et al., 1991) in den regulatorischen Abschnitten von Wnt-Zielgenen und ermöglichen so die β-Catenin abhängige Regulation der Expression dieser Zielgene. Entsprechend finden sich in den 5‘-flankierenden Sequenzen fast aller bisher identifizierten direkten Wnt-Zielgene solche LEF/TCF-Bindestellen, und in vielen Fällen konnte gezeigt werden, dass diese Bindestellen auch funktionell sind. Eine Möglichkeit, die identifizierten ZielgenKandidaten weiter zu analysieren, besteht darin, die 5‘-flankierenden Sequenzen dieser Gene auf das Vorhandensein von LEF/TCF-Bindestellen hin zu untersuchen. Die kurze Konsensussequenz von nur sieben Nukleotiden (5’-CTTTGA/TA/T-3’), die für die Bindung der LEF/TCF-Faktoren an die DNA notwendig ist, bedingt, dass diese Bindestellen sehr häufig vorkommen. Statistisch ist in jedem Sequenzabschnitt von 2 kb Länge eine solche Bindestelle vorhanden, wenn man berücksichtigt, dass LEF/TCF-Faktoren an beide DNA-Stränge binden können. Das Vorhandensein einer solchen LEF/TCF-Bindestelle in den 5‘-flankierenden DNA-Sequenzen eines beliebigen Gens innerhalb einer Spezies ist also eher der Normalfall und von geringer Aussagekraft. Die interspezifische evolutionäre Konservierung einer LEF/TCFBindestelle in den regulatorischen Abschnitten orthologer Gene sagt eher etwas darüber aus, ob eine bestimmte LEF/TCF-Bindestelle möglicherweise funktionell, also für die Regulation dieser Gene von Bedeutung ist. Für die korrespondierenden Gene von Maus und Mensch der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten wurden daher aus den Sequenzdatenbanken des NCBI die 5‘flankierenden DNA-Sequenzen analysiert. Soweit möglich wurde jeweils ein Sequenzabschnitt von 5 kb Länge unmittelbar vor dem Translationsinitiationscodon eines Gens auf LEF/TCF-Bindestellen hin untersucht. Ergaben sich aus den in der Datenbank vorhandenen mRNA-Sequenzen Hinweise darauf, dass Transkriptionsstart und Translationsstart für ein Gen bzw. Transkript weit auseinander liegen, wurde die untersuchte Sequenzregion entsprechend erweitert oder verschoben, um zu gewährleisten, dass der untersuchte DNA-Abschnitt die Promotorregion des Gens enthält. Die 5‘-flankierenden Sequenzen aus Maus und Mensch wurden verglichen (DNA-Analysesoftware „MegAlign“) und im Hinblick auf die Konservierung vorhandener LEF/TCF-Bindestellen zwischen den beiden Sequenzen ausgewertet (s. Tab. 3.13). Seite 77 Ergebnisse Anzahl der LEF/TCFBindestellen in den untersuchten Sequenzabschnitten Maus Mensch konservierte Bindestellen (Position u. Orientierung) Zus. Bindestellen in vergleichbarer Position Gen (Maus) Länge der untersuchten 5‘-Sequenz Axin2 5 kb (*) 8 8 5 0 Crbp1 2 kb 1 4 0 0 Dmrt1 5 kb 4 3 0 1 Ebf1 3 kb 3 2 0 1 Follistatin 4 kb 7 1 1 0 Hmga2 5 kb 8 5 2 2 Igfbp3 5 kb 7 1 0 0 Lhpp 2,5 kb 1 2 0 1 Ndr2 (*) 3 6 1 0 7 kb Nkx6.2 5 kb 2 1 0 0 Nrp2 5 kb 7 5 3 0 Pgrp 4,5 kb 8 2 0 0 Pim1 5 kb 10 9 2 2 RelB 5 kb 2 1 0 0 Sprr2a 5 kb 5 7 1 0 Tgfβ2 2,5 kb 3 1 1 0 11 2 0 1 Troy 5 kb (*) Tab. 3.13. LEF/TCF-Bindestellen in den 5’-flankierenden Sequenzen der Zielgen-Kandidaten. Die 5’-flankierenden Sequenzen vor den ATG-Translationsinitiationscodons der Gene wurden auf die Sequenz 5’-CTTTGA/TA/T-3’ hin untersucht (beide DNA-Stränge). Die Sequenzen der orthologen Gene von Maus und Mensch wurden mit der DNA-Analysesoftware „MegAlign“ paarweise verglichen. Konservierte LEF/TCF-Bindestellen finden sich an jeweils gleicher Position und besitzen die gleiche Orientierung. LEF/TCF-Bindestellen, deren Position in Maus und Mensch nicht exakt konserviert ist, die aber in der gleichen Region liegen (<100 Basen Toleranz), wurden ebenfalls aufgelistet. (*) Bei Axin2, Ndr2 und Troy liegt das ATG-Startcodon auf dem zweiten Exon. In den 5‘-flankierenden Sequenzen der folgenden acht Gene wurde mindestens eine LEF/TCF-Bindestelle gefunden, die in Position und Orientierung zwischen Maus und Mensch exakt konserviert ist: Axin2, Follistatin, Hmga2, Ndr2, Nrp2, Pim1, Sprr2a und Tgfβ2 . Für Axin2, Hmga2, Nrp2 und Pim1 konnten gleich mehrere solcher konservierten LEF/TCF-Bindestellen identifiziert werden, im Falle von Axin2 insgesamt fünf. Von den acht Genen mit konservierten LEF/TCF-Bindestellen zeigten Axin2, Follistatin, Sprr2a und Tgfβ2 im Cokultur-System die deutlichste Expressionssteigerung als Antwort auf eine Wnt1-Stimulation der ES-Zellen, wie aus Tab. 3.12 ersichtlich ist. Das Vorhandensein konservierter LEF/TCF-Bindestellen und das Ausmaß der Expressionssteigerung in ES-Zellen nach Wnt1-Stimulation waren ausschlaggebend dafür, dass von den identifizierten Zielgen-Kandidaten im weiteren Verlauf der Arbeit Axin2 und Follistatin weiter untersucht wurden. Zudem war Seite 78 Ergebnisse natürlich von Bedeutung, dass Axin2 an der Regulation des Wnt/β-CateninSignalwegs beteiligt ist und Follistatin bei vielen Entwicklungsprozessen Einfluß auf den TGFβ-Signalweg nimmt. Beide Gene erscheinen also aus der Sicht des Entwicklungsbiologen besonders interessant. 3.5. Untersuchung von Axin2 3.5.1. Vergleich der Axin2-Loci von Maus und Mensch Um die Wnt-abhängige Regulation von Axin2 detailliert untersuchen zu können, musste zunächst die regulatorische Region des Maus-Gens kloniert werden. Eine vergleichende Sequenzanalyse zwischen den Axin2-Genloci von Maus und Mensch mit Hilfe der Analysesoftware DiAlign (http://www.genomatix.de/cgibin/dialign/dialign.pl) ergab, dass die DNA-Sequenzen in 5'-Richtung der Translationsstarts über einen Abschnitt von etwa 4 kb hinweg recht gut konserviert sind. Etwa 61% der Basen in diesem 4 kb langen 5'-flankierenden Abschnitt sind in Maus und Mensch identisch. Ein Vergleich der genomischen Sequenzen mit den cDNA-Sequenzen von Maus und Mensch Axin2 zeigt, dass sich in diesem 4 kb langen Sequenzabschnitt auch jeweils das erste Exon des Axin2-Gens befindet, das allerdings keine codierende Sequenz enthält, sondern nur zum 5'-untranslatierten Ende der mRNA beiträgt. Der Vergleich der genomischen Sequenzen mit den cDNASequenzen ergibt auch, dass die Position dieses ersten Exons, und somit der Transkriptionsstart des Axin2-Gens, zwischen Maus und Mensch interessanterweise nicht konserviert ist, sondern in der Maus um etwa 1 kb in 5'-Richtung verschoben. Demzufolge unterscheiden sich die Sequenzen der 5'-untranslatierten Regionen der Transkripte von Maus und Mensch erheblich. In Abb. 3.4 ist die Situation schematisch dargestellt. Ein DNA-Abschnitt mit einer Länge von 3,6 kb, der unmittelbar 5' vor dem Translationsstart des Maus Axin2-Gens liegt, wurde mittels PCR von genomischer DNA (aus Maus ES-Zellen) amplifiziert (Primersequenzen s. 2.1.6.). Das Fragment wurde Ax2 P/I1 genannt, für Axin2 Promotor / Intron 1-Region. Abb. 3.4 zeigt die Position des amplifizierten Abschnitts im Maus Axin2-Locus. Auf diesem Abschnitt, der u. a. Exon 1, Intron 1 und untranslatierte Teile von Exon 2 des Maus Axin2-Gens enthält, befinden sich insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen, von denen fünf zwischen Maus und Mensch konserviert sind (s. Tab. 3.13 u. Abb. 3.4). Seite 79 Ergebnisse Abb. 3.4. Vergleich der 5’-flankierenden Sequenzen der Axin2-Gene von Maus und Mensch. Die 5’-flankierenden Sequenzen vor den ATG-Translationsinitiationscodons der Axin2-Gene von Maus und Mensch wurden auf die Sequenz 5’-CTTTGA/TA/T-3’ hin untersucht (beide DNA-Stränge). Die Sequenzen wurden mit der DNA-Analysesoftware „MegAlign“ paarweise verglichen. Innerhalb von etwa 4 kb der jeweiligen 5’-flankierenden Sequenzen der Axin2-Gene sind fünf LEF/TCF-Bindestellen konserviert (rote Kästchen), d. h. sie befinden sich an jeweils gleicher Position und besitzen die gleiche Orientierung. Nicht konservierte LEF/TCF-Bindestellen sind ebenfalls dargestellt (blaue Kästchen). Die Analyse der veröffentlichten cDNA-Sequenzen ergab, dass sich die Position des ersten Exons in den Axin2-Genen von Maus und Mensch unterscheidet. Sämtliche konservierte LEF/TCFBindestellen im Maus Axin2-Gen befinden sich in 3’-Richtung des vermuteten Transkriptionsstarts, jedoch vor dem Translationsstart. 3.5.2. Luciferase-Reporterstudien Die Analyse von regulatorischen Gensequenzen erfolgt sehr oft über den Einsatz sogenannter Promotor-Reporterkonstrukte. Das sind künstliche DNA-Konstrukte, in denen die regulatorische Sequenz, die untersucht werden soll, die Expression eines Reportergens steuert. Reportergene codieren für Proteine, die sich durch entsprechende Nachweismethoden detektieren und quantifizieren lassen (s. 2.4.6.). Ein Beispiel für ein Reportergen ist das Gen für die Photinus-Luciferase aus dem Leuchtkäfer Photinus pyralis. Dieses Gen codiert für eine Oxidoreductase, die durch Umsetzung ihres Substrats u.a. messbare Biolumineszenz erzeugt (s. 2.4.6.). Das Luciferase-Reportergen wurde eingesetzt, um die amplifizierte 5’-flankierende Sequenz des Axin2-Gens (Ax2 P/I1) näher zu charakterisieren. Seite 80 Ergebnisse 3.5.2.1. Klonierung von Axin2-Luciferase-Reporterkonstrukten Das amplifizierte 3,6 kb-Fragment wurde zunächst in einen SmaI-geschnittenen pBluescriptKS-Vektor (Stratagene) kloniert. Das Konstrukt wurde pKS-Ax2 P/I1 genannt. Um in vitro testen zu können, ob das amplifizierte DNA-Fragment aus der 5'-Region des Maus Axin2-Gens, die TCF/β-Catenin-abhängige Expression eines Reportergens steuern kann, mußte das amplifizierte 3,6 kb-Fragment vor das Luciferase-Gen des pGL3 basic Vektors (Promega) gebracht werden. Dazu wurde pKS-Ax2 P/I1 zuerst mit NdeI geöffnet und die überhängenden Enden der Schnittstelle aufgefüllt. Danach wurde der linearisierte Vektor mit SalI verdaut, das 3,6 kb-Insert isoliert und in einen mit SmaI und XhoI geschnittenen pGL3 basicVektor kloniert. Das Konstrukt wurde Ax2 P/I1-Luc genannt. Zusätzlich zu diesem Wildtyp-Konstrukt wurden verschiedene Konstrukte hergestellt, in denen einige oder alle LEF/TCF-Bindestellen in der Ax2 P/I1-Region mutiert waren. Die mutierten Konstrukte sind in Abb. 3.6 zusammen mit den zugehörigen Ergebnissen der Luciferase-Reporterstudien dargestellt. Die Herstellung der mutierten Konstrukte ist im Methodenteil beschrieben (s. 2.2.14.). 3.5.2.2. Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in HEK 293-Zellen Ziel der Luciferase-Reporterversuche war es, festzustellen, ob die Expression des Luciferase-Gens in den verschiedenen Ax2 P/I1-Luc-Konstrukten TCF/β-Cateninabhängig gesteuert werden kann. Dazu benötigt man ein biologisches System, in dem man einerseits den Wnt/β−Catenin Signalweg gezielt manipulieren kann und das sich andererseits gut für die Bestimmung der Luciferaseaktivität eignet. HEK 293-Zellen lassen sich leicht kultivieren und transfizieren und sind somit ein geeignetes Zellsystem für Reporterversuche. Eine Möglichkeit, den Wnt/β−Catenin Signalweg in diesen Zellen zu aktivieren, ist die Expression eines dominant-stabilen β−Catenin Proteins, z.B. β−Catenin S33A, einer mutierten Form von β−Catenin, bei der vier Serinreste im N-Terminus des Proteins durch je einen Alaninrest ersetzt wurden (Aberle et al., 1997). Wie in Abb. 1.2 dargestellt, wird die Menge an freiem β−Catenin Protein in der Zelle durch den β−Catenin-Degradationskomplex strikt reguliert. Erster Schritt bei der Degradation von β−Catenin ist dabei die Phosphorylierung des Proteins an den besagten N-terminalen Serinresten. Der Austausch dieser Serinreste durch Alaninreste, die nicht phosphoryliert werden können, führt dazu, dass β−Catenin S33A in der Zelle nicht abgebaut wird. Folglich Seite 81 Ergebnisse akkumuliert das Protein im Cytoplasma und kann im Kern der Zelle seine Funktion als Cotransaktivator von LEF/TCF-Faktoren erfüllen (s. 1.4.1.). Für die Luciferase-Reporterversuche kamen demnach HEK 293-Zellen zum Einsatz, die mit den verschiedenen Ax2 P/I1-Luc Reporterkonstrukten sowie Expressionsvektoren für β−Catenin S33A und LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren cotransfiziert waren. Zur internen Standardisierung der Luciferase-Messungen diente der pCMV-β-Galaktosidase Vektor (Clontech, Palo Alto, USA), der zusätzlich in die HEK 293-Zellen eingebracht wurde (s. 2.4.6.). Zur Berechnung einer standardisierten Luciferase-Aktivität, die unabhängig ist von der Transfektionseffizienz der HEK 293Zellen, wurde der Quotient aus Luciferase-Aktivität und β-Galaktosidase-Aktivität gebildet. Zusätzlich zu den Versuchen, in denen die HEK 293-Zellen mit dem jeweiligen Luc-Reporterkonstrukt, dem pCMV-β-Galaktosidase Vektor, sowie den pCS2+-Expressionsvektoren für LEF/TCF-Faktoren und β−Catenin S33A cotransfiziert wurden, wurden weitere Versuche durchgeführt. Zum einen wurden HEK 293-Zellen nur mit dem Luc-Reporterkonstrukt, pCMV-β-Galaktosidase sowie dem leeren pCS2+-Vektor cotransfiziert. Die standardisierten Luciferase-Aktivitäten aus diesen Versuchen dienten als Bezugsgröße für die Berechnung der „WntInduktion“ in den anderen Versuchen (s. 3.5.2.3.). Zudem wurde in einem Teil der Versuche getestet, ob die Genexpression ausgehend von Ax2 P/I1 auch dann aktiviert werden kann, wenn neben den Reporterplasmiden nur LEF/TCF-Faktoren oder nur β−Catenin S33A in den HEK 293-Zellen exprimiert werden, statt diese in Kombination zu exprimieren. Für eine genaue Beschreibung der Vorgehensweise wird auf Abschnitt 2.4.6. verwiesen. 3.5.2.3. Stimulation des Ax2 P/I1-Luc-Konstrukts durch verschiedene TCF/β-Catenin-Komplexe Um festzustellen, ob und welche LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren in der Lage sind, zusammen mit β−Catenin S33A das Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt zu aktivieren, wurden zunächst verschiedene LEF/TCF-Expressionsvektoren zusammen mit dem β−Catenin S33A-Expressionsvektor und Ax2 P/I1-Luc in HEK 293-Zellen eingebracht und getestet. Abb. 3.5 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Aus der Abbildung geht hervor, dass alle verwendeten LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren zusammen mit β−Catenin S33A in der Lage waren, die Expression des Luciferase-Gens unter der Kontrolle des Ax2 P/I1-Fragments zu induzieren. Das heißt, dass die standardisierte Luciferase-Aktivität in den HEK 293-Zellen, die, zusätzlich zum Ax2 P/I1-Luc- Seite 82 Ergebnisse Konstrukt, mit den pCS2+-Expressionsvektoren für LEF/TCF und β−Catenin S33A transfiziert worden waren, immer höher war, als die standardisierte Luciferaseaktivität in den HEK 293-Zellen aus den Kontrollversuchen, die mit dem leeren pCS2+-Vektor transfiziert worden waren. Das Ausmaß dieser „Wnt-Induktion“ (die relative Luciferaseaktivität) ergab sich jeweils aus dem Quotienten aus standardisierter Luciferaseaktivität der Zellen, in denen der Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert wurde, und standardisierter Luciferaseaktivität der Zellen aus dem Kontrollversuch, in dem lediglich der leere pCS2+-Vektor mit dem Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt cotransfiziert wurde. Abb. 3.5. Funktionalität verschiedener LEF/TCF-Faktoren bei der Aktivierung des Ax2 P/I1Luc-Konstrukts. Verschiedene LEF/TCF-Faktoren wurden zusammen mit β-Catenin S33A in HEK 293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung des Wildtyp Ax2 P/I1-Luc-Konstrukts in LuciferaseReporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die Transfektionseffizienz wurde der pCMV β-Galaktosidase-Vektor eingesetzt. Die relative LuciferaseAktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch LEF/TCF-Faktoren und β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die LuciferaseAktivität in HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Alle eingesetzten LEF/TCF-Faktoren können zusammen mit β-Catenin S33A die Reportergenexpression aktivieren, allerdings unterschiedlich stark. Aus Abb. 3.5 wird also zum einen deutlich, dass die 5'-flankierende Sequenz des Axin2-Gens (Ax2 P/I1), die vor das Luciferase-Gen des pGL3 basic-Vektors kloniert wurde, alle notwendigen Promotorelemente enthält, um die Expression eines benachbarten Gens zu ermöglichen. Zum anderen wird deutlich, dass in dem 3,6 kb großen Ax2 P/I1-Fragment, cis-regulatorische Elemente vorhanden sind, die die Expression des Luciferase-Gens TCF/β-Catenin-abhängig steuern können. Schließlich wird die Expression des Reportergens in den HEK 293-Zellen deutlich gesteigert, wenn der Wnt/β-Catenin-Signalweg aktiviert wird. Wie ebenfalls aus Abb. 3.5 hervorgeht, bestehen deutliche Unterschiede im Ausmaß der mit den einzelnen LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren erreichten Induktionen. Die Seite 83 Ergebnisse Induktionen, die mit TCF1E und TCF3 erzielt wurden, sind deutlich größer, als die Induktionen, die mit LEF1, TCF1B und TCF4E erzielt wurden. Die eingesetzten LEF/TCF-Faktoren unterscheiden sich also in ihrer Fähigkeit, zusammen mit βCatenin die Transkription ausgehend von Ax2 P/I1 zu steuern. Überraschend ist, dass die Induktion der Genexpression geringer wurde, wenn bei der Transfektion der Zellen größere Mengen der entsprechenden LEF/TCF-Expressionvektoren eingesetzt wurden. Die größte Induktion wurde fast immer erreicht, wenn nur 50 ng des jeweiligen pCS2+-Expressionsvektors für die Transfektion eingesetzt wurden. 3.5.2.4. Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen Als Konsequenz aus den Ergebnissen, die in Abb. 3.5 dargestellt sind, kam bei allen weiteren Luciferase-Reporterversuchen mit Ax2 P/I1-Luc-Konstrukten der Transkriptionsfaktor TCF1E zum Einsatz, und zwar je 50 ng des pCS2+-TCF1EExpressionsvektors pro Transfektionsansatz. Nachdem gezeigt wurde, dass Ax2 P/I1 die Expression des Luciferase-Reportergens abhängig vom Aktivitätszustand des Wnt/β-Catenin-Signalwegs steuern kann, war es naheliegend, zu vermuten, dass die konservierten LEF/TCF-Bindestellen in dieser DNA-Region verantwortlich sind für die Wnt1-abhängige Regulation. Um diese Hypothese zu testen, wurden die oben schon erwähnten Reporterkonstrukte hergestellt, in denen die LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 mutiert sind (s. 2.2.14.). Die Induktion der Reportergenexpression durch Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs sollte mit diesen mutierten Reporterkonstrukten wesentlich geringer ausfallen, als mit dem WildtypReporterkonstrukt, wenn die LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 tatsächlich eine funktionelle Bedeutung haben. Abb. 3.6 zeigt die Ergebnisse der LuciferaseReporterstudien mit den verschiedenen Luc-Konstrukten. Aus der Abbildung geht zunächst hervor, dass der promotorlose Expressionsvektor pGL3 basic keine cisregulatorischen Elemente in der Vektorsequenz enthält, die die Expression des Luciferasegens abhängig vom Wnt/β−Catenin-Signalweg regulieren. Die LuciferaseAktivität in den Versuchen mit pGL3 basic bewegte sich immer auf einem niedrigen Niveau, auch wenn der Wnt/β−Catenin-Signalweg aktiviert war. Im Gegensatz dazu stieg die relative Luciferaseaktivität stark an, wenn in HEK 293-Zellen, die das Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt enthielten, TCF1E und β−Catenin S33A exprimiert wurden. In diesem Fall wurde eine relative Luciferase-Aktivität von etwa 26 erreicht, das heißt die standardisierte Luciferase-Aktivität in diesen Zellen war 26 mal höher, als in Zellen, die das Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt enthielten, in denen der Wnt/β−Catenin- Seite 84 Ergebnisse Abb. 3.6. Aktivierbarkeit verschiedener Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte nach Mutagenese von LEF/TCF-Bindestellen. Durch gezielte Mutagenese wurden verschiedene Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen generiert. TCF1E und β-Catenin wurden einzeln oder in Kombination in HEK 293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung der Ax2 P/I1-Luc-Konstrukte in Luciferase-Reporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die Transfektionseffizienz wurde der pCMV β-Galaktosidase-Vektor eingesetzt. Die relative LuciferaseAktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch TCF1E und/oder β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Die Darstellung der Ax2 P/I1-Reporterkonstrukte basiert auf Abb. 3.4. Mutierte LEF/TCF-Bindestellen sind durchkreuzt dargestellt. Die Mutagenese aller LEF/TCF-Bindestellen im Ax2 P/I1 1-7 mut-Luc-Konstrukt führt zum weitgehenden Verlust der Aktivierbarkeit durch TCF1E und β-Catenin S33A. Signalweg jedoch nicht aktiviert war (Kontrollversuch mit leerem pCS2+-Vektor). Das Ausmaß dieser Induktion deckt sich in etwa mit dem Ergebnis, das in Abb. 3.5 dargestellt ist (50 ng pCS2+-TCF1E-Expressionsvektor). Interessanterweise war eine Erhöhung der relativen Luciferase-Aktivität auch in den Zellen zu beobachten, die das Ax2 P/I1-Luc-Konstrukt enthielten und in denen nur β−Catenin S33A exprimiert wurde, nicht jedoch in den Zellen, in denen nur TCF1E exprimiert wurde. Die relative Luciferase-Aktivität stieg in den β−Catenin S33A-exprimierenden Zellen auf einen Wert zwischen 6 und 7, in TCF1E-exprimierenden Zellen blieb sie auf dem niedrigen Hintergrund-Niveau von etwa 2. Betrachtet man die Werte für die relative Luciferase-Aktivität, die mit den Reporterkonstrukten Ax2 P/I1 4-7 mut-Luc und Ax2 P/I1 1-3 mut-Luc erzielt wurden (s. Abb. 3.6), stellt man fest, dass sich die Werte nicht wesentlich von den Werten für das Wildtyp-Konstrukt Ax2 P/I1-Luc unterscheiden0. Es wurden zwar etwas geringere Werte erzielt, die Erhöhung der Luciferase-Aktivitäten nach Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalwegs durch die Expression von TCF1E und β−Catenin S33A Seite 85 Ergebnisse lag aber immer noch im Bereich von etwa 20. In den jeweils vergleichbaren Zellen, in denen nur β−Catenin S33A exprimiert wurde, lag die relative Luciferase-Aktivität bei knapp 5, also auch in etwa auf dem Niveau, das unter gleichen Bedingungen mit dem Wildtyp-Konstrukt erzielt wurde. Die Mutagenese nur eines Teils der LEF/TCFBindestellen in Ax2 P/I1 scheint also keinen großen Einfluss auf die TCF/β−Cateninabhängige Aktivierung dieser regulatorischen Region zu haben. Anders sah die Situation aus, wenn alle sieben LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 mutiert wurden. Durch die alleinige Expression von β−Catenin S33A in den HEK 293-Zellen ließ sich das Konstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-Luc überhaupt nicht mehr aktivieren. Erst wenn TCF1E und β−Catenin S33A zusammen exprimiert wurden stieg die relative Luciferase-Aktivität leicht an, allerdings nur auf einen Wert von etwa 6, im Vergleich zu Werten über 20, die mit den anderen Konstrukten erzielt worden waren. Die Mutagenese aller LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 führt also zu einer starken Hemmung der TCF/β−Catenin-abhängigen Aktivierung dieser regulatorischen Region, ohne sie jedoch gänzlich auszuschalten. 3.5.3. Untersuchungen zur Axin2-Expression in Mausembryonen Da das Expressionsmuster von Axin2 während der Embryonalentwicklung in der vorhandenen Literatur nicht gut dokumentiert war, wurden zunächst „whole mount“ in situ Hybridisierungen mit Wildtyp-Mausembryonen durchgeführt (s. 3.5.3.1.). Zusätzlich wurde die Expression des endogenen Axin2-Gens in Mausembryonen untersucht, in denen Elemente des Wnt/β-Catenin-Signalwegs genetisch verändert sind (s. 3.5.3.2. u. 3.5.3.3.). Ziel war es, die in vitro Daten aus den LuciferaseReporterversuchen durch in vivo Hinweise auf eine Regulation der Axin2-Expression durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg zu unterstützen. 3.5.3.1. Expression von Axin2 in Wildtyp-Mausembryonen Mit Hilfe der in situ Hybridisierung können die Transkripte (mRNA-Moleküle) eines bestimmten Gens in situ, das heißt im Gewebeverband, lokalisiert werden. Als Probenmaterial eignen sich Gewebeschnitte, aber auch ganze Organe oder Embryonen, wenn diese eine bestimmte Größe nicht überschreiten. Im letzteren Fall spricht man von einer „whole mount“ in situ Hybridisierung (s. 2.5.6.). Im Falle von Axin2 wurde die „whole mount“ in situ Hybridisierung mit Embryonen aus folgenden Seite 86 Ergebnisse Entwicklungsstadien durchgeführt: E 7,5 d.p.c.; E 8,5 d.p.c.; E 9,5 d.p.c. und E 10,5 d.p.c. Die Ergebnisse sind Abbildung 3.7 zu entnehmen. Abb. 3.7. Nachweis der Axin2-Expression in Wildtyp-Mausembryonen durch „whole mount“ in situ Hybridisierung. Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien wurden präpariert und die Axin2-mRNA durch in situ Hybridisierung nachgewiesen. (A) E 7,5 dpc; Expression von Axin2 im Primitivstreifen. (B,C) E 8,5 dpc; Axin2-Expression im Bereich der posterioren Neuralfalte, im präsomitischen Mesoderm und im Bereich der Kopffalte. (D) E 9,5 dpc; Expression von Axin2 v.a. im dorsalen Neuralrohr, in der Schwanzknospe, im präsomitischen Mesoderm, sowie in Kiemenbögen und Gliedmaßenknospen. (E) E 10,5 dpc; Gewebespezifität der Axin2-Expression ähnlich wie an Tag 9,5 dpc. (A) laterale Ansicht, dorsal oben, posterior rechts; (B) dorsale Ansicht, posterior rechts; (C) laterale Ansicht, dorsal oben, posterior rechts; (D,E), laterale Ansicht. Maßstab: 0,5 mm. Axin2 ist nicht ubiquitär eprimiert, sondern zeigt ein gewebespezifisches Expressionsmuster. Am Tag 7,5 p.c. ist Axin2 in der posterioren Hälfte des becherförmigen Embryos, insbesondere in der Region des Primitivstreifens, exprimiert. Zwischen Tag 8 p.c. und Tag 8,5 p.c. beginnt die Expression von Axin2 im sich entwickelnden Neuralrohr, und zwar im Bereich der posterioren Neuralfalte. Auch im präsomitischen Mesoderm sowie im Bereich der Kopffalte wird Axin2 detektiert. Nach der Drehung des Embryos (s. 1.1.2.) ist Axin2 am Tag 9,5 p.c. im gesamten dorsalen Neuralrohr und in benachbarten Bereichen exprimiert. Weitere Expressionsdomänen befinden sich in der Schwanzknospe, den Kiemenbögen und den vorderen Gliedmaßenknospen. An Tag 10,5 p.c. ist dieses Expressionsmuster im Wesentlichen erhalten. Auch die hinteren Gliedmaßenknospen entwickeln sich nun und exprimieren ebenfalls Axin2. Im Bereich des Hinterhirns ist an Tag 10,5 p.c. eine deutliche Lücke in der Expression von A x i n 2 im Neuralrohr zu sehen. Seite 87 Ergebnisse Interessanterweise sind in einigen der genannten Axin2-Expressionsdomänen, etwa in der Schwanzknospe und im dorsalen Neuralrohr, auch verschiedene Wnt-Proteine exprimiert (McMahon und Bradley, 1990; Roelink und Nusse, 1991; Shackleford und Varmus, 1987; Takada et al., 1994; Wilkinson et al., 1987). 3.5.3.2. Axin2-Expression in vestigial tail Embryonen Mäuse, in denen bestimmte Elemente des Wnt/β-Catenin Signalwegs genetisch verändert sind, bieten ein geeignetes Unteruchungsmodell, um den Einfluß dieses Signalwegs auf die Expression des endogenen Axin2-Gens in vivo zu untersuchen. Ein Vertreter der Wnt-Familie, Wnt3a, ist während der Embryogenese u. a. am Tag 9,5 p.c. im dorsalen Neuralrohr und in der Schwanzknospe von Mäusen exprimiert. Das gezielte Ausschalten der Wnt3a-Expression in Wnt3a K.O.-Mäusen führt caudal zu den vorderen Gliedmaßenknospen zu einer Reihe von Defekten (s. 1.5.2.), vor allem in mesodermalen Strukturen (Takada et al., 1994). Es wurde gezeigt, dass die Expression des Wnt3a-Gens auch in vestigial tail Mäusen, Mäusen mit einer natürlich vorkommenden, regulatorischen Mutation im Wnt3a-Gen, eingeschränkt ist (Greco et al., 1996). vestigial tail Mäuse besitzen einen kürzeren bzw. völlig verstümmelten Schwanz, je nachdem, ob sie heterozygot oder homozygot für die Mutation sind, auch die homozygoten Tiere sind aber lebensfähig und fertil. Um den Einfluss der reduzierten Wnt3a-Expression auf die Axin2-Expression zu untersuchen, wurden Verpaarungen zwischen homozygoten und heterozygoten vestigial tail Mäusen angesetzt, die Embryonen am Tag 10,25 p.c. präpariert und anschließend die Expression von Wnt3a und Axin2 in den Embryonen mittels in situ Hybridisierungen analysiert. Abb. 3.8 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs. Die in situ Hybridisierungen mit der Wnt3a-Sonde zeigen deutlich den fast völligen Verlust der Wnt3a-Expressionsdomäne in der Schwanzknospe von homozygoten (vt/vt) vestigial tail Embryonen am Tag 10,25 p.c (vgl. Abb. 3.8 A und B). Die Expression von Wnt3a im dorsalen Neuralrohr ist dagegen bei heterozygoten und homozygoten Embryonen durchaus vergleichbar. Ein ähnliches Bild ergibt sich für die Expression des Axin2-Gens. Bei dem Embryo, der heterozygot (vt/+) für die vestigial tail Mutation ist, also noch ein Wildtyp-Allel des Wnt3a-Gens enthält, ist die Expression von Axin2 in der Schwanzknospe und im präsomitischen Mesoderm deutlich zu erkennen (Abb. 3.8 C). Im Gegensatz dazu wird bei der in situ Hybridisierung der homozygoten (vt/vt) vestigial tail Embryonen kaum noch Axin2-mRNA in diesen Strukturen detektiert (Abb. 3.8 D). Seite 88 Ergebnisse Abb. 3.8. Nachweis der Expression von Wnt3a und Axin2 in vestigial tail Embryonen durch „whole mount“ in situ Hybridisierung. E 10,25 dpc Embryonen, die heterozygot (vt/+) bzw. homozygot (vt/vt) für eine regulatorische Mutation im Wnt3a-Gen waren (vestigal tail / vt) wurden mittels „whole mount“ in situ Hybridsierung untersucht. Die Expression von Wnt3a (A,B) und Axin2 (C,D) wurde nachgewiesen. Homozygote vestigial tail Embryonen (vt/vt) zeigen den Verlust der Expression beider Gene im Bereich von Schwanzknospe und präsomitischem Mesoderm (B,D). Die Schwanzregion der Embryonen ist in stärkerer Vergrößerung in dorsaler Ansicht dargestellt. Maßstab: 0,5 mm. Die Analyse der Genexpression in vestigial tail Embryonen zeigt, dass die Axin2Expression in den posterioren Strukturen des Embryos von der Expression des Wnt3aGens abhängig ist. 3.5.3.3. Ektopische Axin2-Expression nach Aktivierung des Wnt/β-CateninSignalwegs in vivo In Mäusen, in denen beide Allele des Wnt3a-Gens die vestigial tail Mutation tragen, geht neben der Expression von Wnt3a auch die Expression von Axin2 in der Schwanzknospe und im präsomitischen Mesoderm verloren. Die negative Beeinflussung des Wnt-Signalwegs hat also Auswirkungen auf die Axin2-Expression. Was geschieht aber, wenn im umgekehrten Fall der Wnt/β-Catenin Signalweg in vivo aktiviert wird? Hat dies ebenfalls Auswirkungen auf die Axin2-Expression? Wie schon in Abschnitt 3.5.2..2. besprochen, besteht eine Möglichkeit, den Wnt/β-Catenin Signalweg zu Seite 89 Ergebnisse aktivieren darin, eine stabile Form von β-Catenin in Zellen einzubringen. Ein Beispiel dafür lieferte bereits die Transfektion von HEK 293-Zellen mit einem Expressionsvektor für βCatenin S33A bei der Durchführung der Luciferase-Reporterstudien. Harada et al. (Harada et al., 1999) haben eine Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, eine stabilisierte Form von β-Catenin gewebespezifisch in Mäusen zu exprimieren. Dazu benutzten die Autoren das Cre/loxP-System zur in vivo Rekombination von Genen (Hamilton und Abremski, 1984; Nagy, 2000). Sie generierten eine Maus mit einer Variante des βCatenin-Gens, in der das dritte Exon an beiden Enden von loxP-Sequenzen flankiert ist. Die Rekombination dieses „Exon 3 - gefloxten“ β-Catenin-Gens durch die Cre-Rekombinase führt zu einer Variante des β-Catenin-Gens, in dessen codierender Sequenz Exon 3 fehlt. Dieses Exon enthält normalerweise den Sequenzabschnitt, der für die Aminosäuren 5-81 des β-Catenin-Proteins codiert, also den N-terminalen Abschnitt, der von CK1 und GSK3β phosphoryliert wird, um β-Catenin für den Abbau im Proteasom vorzubereiten (Aberle et al., 1997; Harada et al., 1999). Das derart veränderte β-Catenin-Protein wird also nicht mehr Wnt-abhängig reguliert (s. Abb. 1.2), sondern ist in den Zellen konstitutiv in erhöhter Menge vorhanden und kann, da die entsprechenden Proteinabschnitte unverändert sind, als Transaktivator für LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren wirken. Durch die Kreuzung von Mäusen mit „Exon 3 - gefloxtem“ β-Catenin-Gen und Mäusen, die die Cre-Rekombinase unter einem gewebespezifischen Promotor exprimieren, kann somit der Wnt/β-Catenin Signalweg in Nachkommen dieser Mäuse gewebespezifisch aktiviert werden. Für diese Arbeit wurde die β-Catenin Exon 3 - gefloxte Maus mit einer En1-Cre knock in Maus (Hanks et al., 1995; Kimmel et al., 2000) gekreuzt. Letztere exprimiert die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des Engrailed 1-Locus. Die Embryonen wurden 10,5 Tage nach der Verpaarung der Mäuse präpariert, genotypisiert und mittels in situ Hybridisierung auf die Expression von Axin2 hin untersucht (Abb. 3.9 B-C). Zusätzlich wurde die Cre-Expression in einer En1-Cre knock in Maus detektiert (Abb. 3.9 A). Abb. 3.9 A zeigt das Ergebnis der in situ Hybridisierung, die mit der Probe für die Cre-Rekombinase durchgeführt wurde. Es wird deutlich, dass am Tag 10,5 p.c. die Cre-Rekombinase vor allem im Mittel- und Hinterhirn des En1-Cre knock in Embryos exprimiert wird. Zusätzlich ist jedoch eine schwächere Färbung in den Somiten zu erkennen, Cre wird also auch in den Somiten exprimiert. Abb. 3.9 B zeigt die Axin2Expression ebenfalls in einem Tag 10,5 p.c. Embryo des gleichen Genotyps. Das Expressionsmuster von Axin2 in dem En1-Cre knock in Embryo unterscheidet sich nicht von dem in normalen Wildtyp-Embryonen (vgl. Abb. 3.7). Anders sieht die Situation aus, wenn in den En1-Cre knock in Embryonen das Exon 3 - gefloxte β-Catenin-Allel vorhanden ist (Abb. 3.9 C). In diesen Embryonen ist die Expression von Axin2 in der Seite 90 Ergebnisse Region von Mittel- und Hinterhirn deutlich ausgeprägter, als in vergleichbaren β-CateninWildtyp Embryonen .Während in der Wildtyp-Situation die Axin2-Expression im dorsalen Neuralrohr im Bereich der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze nur sehr schwach ausgeprägt ist (s. Abb. 3.7 und Abb. 3.9 B), ist diese Region in dem Embryo in Abb. 3.9 C stark gefärbt. Abb. 3.9. „Whole mount“ in situ Hybridisierung von E 10,5 dpc Embryonen aus Verpaarungen von En1-Cre knock in Mäusen und β-Catenin-Exon 3-floxed Mäusen. Der Genotyp der Embryonen ist unter den Bildern angegeben. Abb. 3.9 (A ) zeigt die Expression der Cre-mRNA in Mittel-/Hinterhirn sowie in differenzierten Somiten eines En1-Cre knock in Embryos mit zwei Wildtyp-Allelen des β-Catenin-Gens. Abb. 3.9 (B) zeigt die Axin2-Expression in einem Embryo des gleichen Genotyps. Das Expressionsmuster entspricht dem von Wildtyp-Embryonen (vgl. Abb. 3.7). In Embryonen des Genotyps En1 Cre / + / β-Catenin Exon3 floxed / + kommt es in Mittel-/Hinterhirn und in differenzierten Somiten zur Cre-vermittelten Rekombination des Exon 3gefloxten β-Catenin-Allels und damit zur gewebespezifischen Expression eines stabilen β-Catenin-Proteins. Dies führt zu einer ektopischen Axin2-Expression in der Mittel-/Hinterhirn-Region und in differenzierten Somiten (C). Maßstab: 0,5 mm. Nähere Erläuterungen siehe Text. En1-Cre knock in Embryonen, die das Exon 3 - gefloxte β-Catenin-Allel enthalten, zeigen neben der Mittelhirn-Hinterhirn-Region noch einen weiteren Ort ektopischer Axin2Expression. Die anterior gelegenen älteren Somiten sind in Embryonen dieses Genotyps am Tag 10,5 p.c. deutlich angefärbt (Abb. 3.9 C). Die beiden Orte ektopischer Axin2Expression, Mittel-/Hinterhirn und Somiten, decken sich mit der gewebespezifischen Expression der Cre-Rekombinase in En1-Cre knock in Embryonen (s. Abb. 3.9 A). Die gewebespezifische Cre-vermittelte Rekombination des β-Catenin-Locus, in deren Folge eine stabile Form von β-Catenin exprimiert wird, führt also offenbar in der Mittel/Hinterhirn-Region und in den Somiten zu einer ektopischen Expression von Axin2. Die Expression einer stabilen Form von β-Catenin in der Mittelhirn-Hinterhirn-Region hat aber auch morphologische Veränderungen in diesem Hirnabschnitt zur Folge. In Abb. 3.9 C ist deutlich eine unnatürliche Öffnung und Aufwölbung des Neuralrohrs im Bereich von Mittelhirn und Hinterhirn zu erkennen, ein Zustand, der als Exencephalie bezeichnet wird. Seite 91 Ergebnisse 3.5.4. Reporterstudien an transgenen Mäusen Die Luciferase-Reporterstudien in HEK 293-Zellen haben bereits gezeigt, dass die Axin2 Promotor / Intron 1-Region (Ax2 P/I1) die Expression eines Reportergens in Abhängigkeit des Wnt/β-Catenin Signalwegs steuern kann (s. Abschnitt 3.5.2.). Die Ergebnisse der in situ Hybridisierungen haben zudem gezeigt, dass das Axin2-Gen während der Embryonalentwicklung gewebespezifisch exprimiert wird und die Axin2Expression vom Wnt/β-Catenin Signalweg beeinflusst wird. Es ist bisher jedoch nicht geklärt, ob der Sequenzabschnitt Ax2 P/I1 alle cis-regulatorischen Elemente enthält, die erforderlich sind, um die embryonale Expression von Axin2, bzw. die Expression eines Reportergens, in dem beobachteten zeitlich-räumlichen Muster zu steuern. Eine Möglichkeit, dies herauszufinden, liegt in der Herstellung von transgenen Mäusen, die das Reportergen β-Galaktosidase (lacZ) unter der Kontrolle der Ax2 P/I1-Sequenz exprimieren (s. Abb. 3.10 A). Zusätzlich kann mit einem solchen transgenen Ansatz geklärt werden, ob auch in vivo eine Regulation der Reportergen-Expression durch den Wnt/β-Catenin Signalweg erfolgt. Dazu wurden zusätzlich transgene Mäuse generiert, die das lacZ-Reportergen unter der Kontrolle der Ax2 P/I1 1-7 mut-Sequenz exprimieren (s. Abb. 3.11 A), der Variante von Ax2 P/I1, in der sämtliche LEF/TCFBindestellen mutiert sind. Zur Herstellung der transgenen Mäuse siehe Abschnitt 2.5.8. Für die Reporterstudien mit Ax2 P/I1-lacZ bzw. Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ wurden die Embryonen jeweils 9 Tage nach Reimplantation der Embryonen (erfolgt im Zweizell-Stadium) aus den Leihmüttern entnommen. Zu diesem Zeitpunkt haben die Embryonen ein Entwicklungsstadium erreicht, das in etwa dem von normal gezeugten Embryonen 9,0 bis 9,5 Tage nach der Befruchtung entspricht. Zum Nachweis der βGalaktosidase-Aktivität wurde eine X-Gal-Färbung an den präparierten Embryonen durchgeführt (s. 2.5.10.). 3.5.4.1. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der Axin2 Promotor / Intron 1-Region In zwei unabhängigen Versuchen, die durchgeführt wurden, um mit dem Ax2 P/I1lacZ-Konstrukt transgene Embryonen zu produzieren, wurden insgesamt 84 Embryonen präpariert. Die PCR-Genotypisierung, die mit genomischer DNA aus den Dottersäcken durchgeführt wurde, ergab, dass in insgesamt 23 Embryonen das lacZTransgen im Genom vorhanden war (27,3 %). Die X-Gal Färbung resultierte bei 18 Embryonen in einer Blaufärbung. Seite 92 Ergebnisse Abb. 3.10. Gewebespezifität der β-Galaktosidase-Aktivität in transgenen Embryonen (E 9,5 dpc) mit dem Ax2 P/I1-lacZ-Konstrukt. (A) Schematische Darstellung des Ax2 P/I1-lacZKonstrukts, das für die Generierung der transgenen Embryonen eingesetzt wurde. Die Bezeichnung der einzelnen Elemente in Ax2 P/I1 ist Abb. 3.4 zu entnehmen. (B) Transgener Embryo (E 9,5 dpc) nach „whole mount“ X-Gal-Färbung. Die Blaufärbung ist Folge der β-Galaktosidase-Aktivität in den Zellen, die das lacZ-Transgen exprimieren. Von 18 gefärbten Embryonen zeigten 14 ein vergleichbares Färbungsmuster. Das Färbungsmuster gibt in etwa die Expression des endogenen Axin2-Gens zu diesem Zeitpunkt wieder (vgl. Abb. 3.7 D). Von einem solchen X-Gal gefärbten Embryo wurden Gewebeschnitte hergestellt. Die transversale Schnittführung ist in (B) angedeutet. (C-G) Gewebeschnitte nach „whole mount“ X-Gal-Färbung und Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“. Das lacZ-Transgen ist v.a. im dorsalen Neuralrohr (auch im Gehirn), in dorsal gelegenen mesenchymalen Zellen, in den Gliedmaßenknospen, in der Schwanzknospe und im paraxialen Mesoderm exprimiert. Abkürzungen: dA, dorsale Aorta; Gk, Gliedmaßenknospe; Hd, Hinterdarm; Hz, Herzregion; Lh, Leibeshöhle; mZ, mesenchymale Zellen – u.a. Neuralleistenzellen; Ne, Neuralrohr; NeH, Seite 93 Ergebnisse Neuroektoderm des Hinterhirns; NeM, Neuroektoderm des Mittelhirns; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; Oe, Oberflächenektoderm; pM, paraxiales Mesoderm. Vd, Vorderdarm. Maßstab: 0,5 mm. Nähere Erläuterungen siehe Text. Die Färbungsmuster, die bei der X-Gal Färbung der Embryonen auftraten, lassen sich in die drei folgenden Gruppen aufteilen. Zwei der insgesamt 18 gefärbten Embryonen zeigten nur eine äußerst schwache Blaufärbung. Die Auswertung dieser Embryonen hinsichtlich auftretender Färbungsmuster war nicht möglich. Zwei andere Embryonen zeigten lediglich eine Blaufärbung in einer zentralen, posterioren Region des Embryos, im Bereich der Schwanzknospe. Weitere embryonale Strukturen waren nicht angefärbt. Bei 14 Embryonen wurde folgendes Färbungsmuster beobachtet (s. Abb. 3.10): über die gesamte Länge des Embryos war die dorsale Hälfte stark gefärbt, wohingegen die ventrale Hälfte der Embryonen kaum gefärbt war. Die vorderen Gliedmaßenknospen und die posteriore Hälfte der Kiemenbögen zeigten ebenfalls eine Blaufärbung. Zusätzlich trat eine Blaufärbung im Bereich um die Schwanzknospe und eine schwache Färbung in den Somiten auf. Abb. 3.10 B zeigt eine Übersichtsaufnahme von einem dieser Embryonen. In den Abb. 3.10 CG sind Querschnitte durch einen anderen Embryo mit gleichem Färbungsmuster zu sehen. Abb. 3.10 C zeigt deutlich, dass sowohl das Oberflächenektoderm als auch das angeschnittene Neuroektoderm des Mittelhirns blau gefärbt sind. In Abb. 3.10 D ist zu erkennen, dass sich die Blaufärbung des Neuroektoderms in Vorderhirn und Hinterhirn fortsetzt. Die Färbung ist jeweils auf die dorsale Hälfte des Neuralrohrs beschränkt, zusätzlich sind das Oberflächenektoderm und mesenchymale Zellen gefärbt. Abb. 3.10 E zeigt einen Querschnitt durch den Rumpf des Embryos. Es ist deutlich zu sehen, dass sich die Färbung des dorsalen Neuralrohrs und angrenzender nicht-neuronaler Gewebe in caudale Richtung fortsetzt. Abbildung 3.10 F zeigt u.a. die Färbung der vorderen Gliedmaßenknospen, die hier in der Schnittebene liegen. In Abb. 3.10 G ist ein Querschnitt durch die Schwanzspitze zu sehen. Über den gesamten Querschnitt sind die Zellen verschiedener Strukturen blau gefärbt. Neben Neuralrohr und Hinterdarm sind auch die Zellen des präsomitischen Mesoderms blau gefärbt. Vergleicht man die Abbildungen 3.7 und 3.10, so ist zu sehen, dass das Muster der Blaufärbung, das in jeweils 14 der Embryonen gefunden wurde, die das lacZTransgen unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 exprimierten, in etwa mit dem Expressionsmuster des endogenen Axin2-Gens am Tag 9,5 p.c. übereinstimmt. Die Seite 94 Ergebnisse Blaufärbung in den dorsalen Regionen des transgenen Embryo ist jedoch wesentlich stärker und ausgedehnter, als die Färbung der dorsalen Regionen, die bei der in situ Hybridisierung zum Nachweis des endogenen Axin2-Gens erzielt wurde. Auch die Somiten sind in den transgenen Embryonen deutlich angefärbt, während die in situ Hybridisierung mit einer Axin2-Sonde nur eine sehr schwache Anfärbung dieser Strukturen ergab. 3.5.4.2. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle der mutierten Axin2 Promotor / Intron 1-Region Es wurden insgesamt drei unabhängige Versuche durchgeführt, um mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ-Konstrukt transgene Embryonen zu produzieren. Dabei wurden 125 Embryonen präpariert. Die PCR-Genotypisierung ergab, dass bei 26 dieser 125 Embryonen das lacZ-Transgen im Genom vorhanden war (20,8 %). Die X-Gal Färbung führte bei 17 Embryonen zu einer Blaufärbung. Die Färbungsmuster, die sich mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ-Konstrukt ergaben, waren heterogener, als die, die sich mit dem Wildtyp Ax2 P/I1-lacZ-Konstrukt ergeben hatten. Auch hier konnten die Färbungsmuster jedoch in Gruppen eingeteilt werden. Ein Embryo zeigte über die gesamte Länge eine Färbung in der Region um das ventrale Neuralrohr. Das Färbungsmuster dieses Embryos unterschied sich sehr stark von den in anderen Embryonen beobachteten Färbungen. Acht Embryonen zeigten ausschließlich in der Kopfregion des Embryos eine Blaufärbung (zwei Embryonen nur schwach, sechs Embryonen stark gefärbt). Ein solcher Embryo ist in Abb. 3.11 B abgebildet. Es ist zu sehen, dass sich die Blaufärbung auf die eher dorsal gelegenen Bereiche um die Regionen von Mittelund Hinterhirn konzentriert und sich in caudale Richtung bis zum Ohrbläschen erstreckt. Die beiden Querschnitte, die in Abb. 3.11 C und D zu sehen sind, zeigen jedoch, dass das Neuroektoderm selbst nicht gefärbt ist, vielmehr ist die Blaufärbung auf die Epidermis und mesenchymale Zellen seitlich des Neuralrohrs beschränkt. Acht weitere Embryonen zeigten ebenfalls eine Färbung der Region um Mittelund Hinterhirn, wie sie gerade beschrieben wurde. Zusätzlich waren in diesen acht Embryonen aber noch verschiedene andere Strukturen blau gefärbt. Als Beispiel ist in Abb. 3.11 E ein Embryo zu sehen, der, zusätzlich zur Färbung in der Kopfregion, eine Blaufärbung in den posterioren Abschnitten der Kiemenbögen, in den vorderen Gliedmaßenknospen und am Ansatz der Allantois Seite 95 Ergebnisse aufweist. Eine schwächere Färbung der vorderen Gliedmaßenknospen war in zwei weiteren der acht Embryonen zu beobachten. Zudem war bei zwei der acht Embryonen eine schwache Blaufärbung in der seitlichen Rumpfregion des Embryos auf Höhe der älteren, differenzierten Somiten zu sehen. Bei drei der acht Embryonen trat eine Färbung auf der ventralen Seite im Bereich der Anlagen für die inneren Organe auf. Abb. 3.11. Gewebespezifität der β-Galaktosidase-Aktivität in transgenen Embryonen (E 9,5 dpc) mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ-Konstrukt. (A) Schematische Darstellung des Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ-Konstrukts, das für die Generierung der transgenen Embryonen eingesetzt wurde. Die Bezeichnung der einzelnen Elemente in Ax2 P/I1 1-7 mut ist Abb. 3.4 zu entnehmen; mutierte LEF/TCF-Bindestellen sind durchkreuzt dargestellt. (B) Transgener Embryo (E 9,5 dpc) nach „whole mount“ X-Gal-Färbung. Die Blaufärbung ist Folge der β-Galaktosidase-Aktivität in den Zellen, die das lacZ-Transgen exprimieren. Die Expression des lacZ-Transgens beschränkt sich auf die Region um Mittel- und Hinterhirn. Von 17 gefärbten transgenen Embryonen zeigten acht eine vergleichbare Färbung. Von einem solchen X-Gal gefärbten Embryo wurden Gewebeschnitte hergestellt. Die transversale Schnittführung ist in (B) angedeutet. (C,D) Gewebeschnitte nach „whole mount“ X-GalFärbung und Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“. Die Expression des lacZ-Transgens beschränkt sich auf Zellen des Oberflächenektoderms und mesenchymale Zellen in der Region um Mittel- und Hinterhirn. Das Neuroektoderm zeigt keine Blaufärbung. (E) Acht weitere transgene Embryonen Seite 96 Ergebnisse zeigten ebenfalls eine Blaufärbung in mesenchymalen und ektodermalen Zellen der Mittel/Hinterhirnregion und zusätzliche β-Galaktosidase-Aktivität in anderen Strukturen, jedoch nie im Neuroektoderm, in der Schwanzknospe oder im paraxialen Mesoderm. Der in (E) dargestellte Embryo zeigt zusätzliche Blaufärbung in den Kiemenbögen, in den Gliedmaßenknospen und am Ansatz der Allantois (s. kleines Kästchen). Abkürzungen: mZ, mesenchymale Zellen; NeH, Neuroektoderm des Hinterhirns; NeM, Neuroektoderm des Mittelhirns; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; Oe, Oberflächenektoderm. Maßstab: 0,5 mm. Nähere Erläuterungen siehe Text. Ein Vergleich der Abbildungen 3.10 und 3.11 liefert deutliche Unterschiede zwischen den ermittelten Färbungsmustern in Embryonen, die das Reportergen β-Galaktosidase (lacZ) unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 bzw. unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 1-7 mut exprimierten. Die Blaufärbung im Gehirn und dorsalen Neuralrohr, in der Schwanzknospe, im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten, die mit dem Konstrukt Ax2 P/I1-lacZ erzielt werden konnte, wurde in keinem einzigen der 17 Embryonen beobachtet, die β-Galaktosidase unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 1-7 mut, dem Konstrukt mit den mutierten LEF/TCF-Bindestellen, exprimierten. Auch die β-Galaktosidase-Expression in den, dem Neuralrohr benachbarten, ektodermalen und mesenchymalen Zellen der dorsalen Rumpfregion war in den Embryonen mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ Konstrukt nicht zu beobachten. Die β-GalaktosidaseExpression in epidermalen und mesenchymalen Zellen der Kopfregion wurde jedoch vom Fehlen der LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 nicht beeinflußt. Auch die Blaufärbung in den vorderen Gliedmaßenknospen und den Kiemenbögen war zumindest in einem Teil der Embryonen mit dem Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ Konstrukt erhalten. Die Ergebnisse, die mit den transgenen Mäusen erzielt wurden, zeigen, dass zumindest in einigen Geweben die Genexpression unter der Kontrolle von Ax2 P/I1 nur erfolgen kann, wenn die LEF/TCF-Bindestellen in dieser regulatorischen Region intakt sind. 3.6. Untersuchung von Follistatin 3.6.1. Vergleich der Follistatin-Loci von Maus und Mensch Erster Ansatzpunkt für die nähere Untersuchung der Wnt-abhängigen Regulation des Follistatin-Gens war wiederum die Promotoranalyse. Ein etwa 4 kb großer Abschnitt der 5'-flankierenden Sequenz des Maus Follistatin-Gens wurde von de Groot et al. (de Groot et al., 2000) kloniert und näher charakterisiert. Die Autoren fanden drei verschiedene Transkriptionsinitiationsstellen, die alle innerhalb eines Bereichs von 500 Basen vor dem Translationsstart des Follistatin-Gens lagen. Diese 4 kb große 5'- Seite 97 Ergebnisse flankierende DNA des Maus Follistatin-Gens (Foll 4 kb) wurde uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt (pKS Foll 4 kb) und war der Ausgangspunkt für die Klonierung verschiedener Promotor-Reporter-Konstrukte (s. 3.6.2.1.). Ein Vergleich der 5’-flankierenden Sequenzen der Follistatin-Loci von Maus und Mensch, mit Hilfe der Analysesoftware DiAlign (http://www.genomatix.de/cgi-bin/dialign/dialign.pl), ergab eine hohe Sequenzkonservierung. Die -4 kb-Regionen vor den jeweiligen Translationsstartstellen sind zwischen Maus und Mensch zu 53% konserviert, die -3 kb-Regionen sogar zu 66%. In Abb. 3.12 ist die Verteilung von LEF/TCFBindestellen in den jeweils 4 kb langen 5'-flankierenden Sequenzen der FollistatinLoci von Maus und Mensch schematisch dargestellt. In der Maus-Sequenz sind insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen enthalten, in der humanen Sequenz nur eine einzige, deren Sequenz und Position ist jedoch zwischen Maus und Mensch exakt konserviert. (s. Tab. 3.13 und Abb. 3.12). Abb. 3.12. Vergleich der 5’-flankierenden Sequenzen der Follistatin-Gene von Maus und Mensch. Die 5’-flankierenden Sequenzen vor den ATG-Translationsinitiationscodons der FollistatinGene von Maus und Mensch wurden auf die Sequenz 5’-CTTTGA/TA/T-3’ hin untersucht (beide DNAStränge). Die Sequenzen wurden mit der DNA-Analysesoftware „MegAlign“ paarweise verglichen. Innerhalb von 4 kb der jeweiligen 5’-flankierenden Sequenzen der Follistatin-Gene ist lediglich eine LEF/TCF-Bindestelle konserviert (rotes Kästchen). Im Maus Follistatin-Locus finden sich zusätzlich sechs LEF/TCF-Bindestellen, die im humanen Gen nicht konserviert sind (blaue Kästchen). Seite 98 Ergebnisse 3.6.2. Luciferase-Reporterstudien 3.6.2.1. Klonierung von Follistatin-Luciferase-Reporterkonstrukten Der 4 kb große 5'-flankierende Abschnitt des Follistatin-Gens wurde mit HindIII aus dem Konstrukt pKS Foll 4 kb ausgeschnitten und in den HindIII geöffneten pGL3 basic Vektor kloniert. Das Konstrukt wurde Foll 4 kb-Luc genannt. Ausgehend von diesem Konstrukt wurden weitere Follistatin-Luciferase Konstrukte hergestellt, in denen jeweils ein Teil der regulatorischen Sequenz des Follstatin-Gens vom 5'-Ende her deletiert war. Dazu wurde das Konstrukt Foll 4 kb-Luc mit passenden Restriktionsenzymen geschnitten und religiert, bzw. ein Follistatin PromotorFragment aus Foll 4 kb-Luc (oder pKS Foll 4 kb) ausgeschnitten und in den entsprechend vorbehandelten pGL3 basic Vektor kloniert. Die Deletionskonstrukte sind in Abb. 3.14 zusammen mit den zugehörigen Ergebnissen der LuciferaseReporterstudien dargestellt. Zudem wurden verschiedene Konstrukte hergestellt, in denen die LEF/TCF-Bindestellen 1-4 des Follistatin-Promotors einzeln oder in Kombination mutiert waren. Die mutierten Konstrukte werden in den Abb. 3.15 und 3.16 zusammen mit den zugehörigen Ergebnissen der Luciferase-Reporterstudien gezeigt. Die Herstellung der mutierten Konstrukte ist im Methodenteil beschrieben (2.2.14.). 3.6.2.2. Stimulation des Foll 4 kb-Luc-Konstrukts durch verschiedene TCF/β-Catenin-Komplexe Die Luciferase-Reporterversuche mit den Follistatin-Luc-Konstrukten wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wie die entsprechenden Versuche mit den Ax2 P/I1-Konstrukten (s. 2.4.6. u. 3.5.2.2.). Zur internen Standardisierung der Luciferase-Messungen wurde jedoch der pCMV-Renilla Vektor (Promega GmbH, Mannheim) eingesetzt, statt wie bisher der pCMV-β-Galaktosidase-Vektor. Zur Berechnung der standardisierten Luciferase-Aktivität in den jeweiligen Versuchen wurde der Quotient aus den Aktivitäten von Photinus-Luciferase und RenillaLuciferase gebildet (s. 2.4.6.). Zunächst musste festgestellt werden, ob und welche LEF/TCF-Transkriptionsfaktoren geeignet sind, den Follistatin-Promotor zusammen mit β-Catenin S33A zu aktivieren. Dazu wurden verschiedene LEF/TCF-Expressionsvektoren zusammen mit dem β-Catenin Seite 99 Ergebnisse S33A-Expressionsvektor und Foll 4 kb- Luc in HEK 293-Zellen eingebracht und getestet. Abb. 3.13 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Abb. 3.13. Funktionalität verschiedener LEF/TCF-Faktoren bei der Aktivierung des Foll 4 kbLuc-Konstrukts. Verschiedene LEF/TCF-Faktoren wurden zusammen mit β-Catenin S33A in HEK 293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung des Wildtyp Foll 4kb-Luc-Konstrukts in LuciferaseReporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die Transfektionseffizienz wurde der pCMV-Renilla Vektor eingesetzt. Die relative Luciferase-Aktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch LEF/TCF-Faktoren und β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Nur TCF1E, TCF3 und TCF4E aktivieren zusammen mit β-Catenin S33A die Reportergenexpression. Aus der Abbildung geht hervor, dass TCF1E, TCF3 und TCF4E, nicht aber LEF1 und TCF1B, in der Lage sind, zusammen mit β-Catenin S33A den Follistatin-Promotor zu aktivieren und die Expression des Luciferase-Reportergens zu induzieren. Die größten relativen Luciferase-Aktivitäten wurden mit TCF1E und TCF3 erzielt, wobei die Variation der eingesetzten Menge des entsprechenden LEF/TCF-Expressionsvektors, zumindest in dem getesteten Bereich (50-500 ng), kaum Auswirkungen auf das Ergebnis hatte. Bei der Verwendung von TCF4E fielen die Induktionen der Luciferase-Aktivität geringer aus, als bei der Verwendung von TCF1E oder TCF3. Interessanterweise war hier jedoch eine deutliche Steigerung der relativen Luciferase-Aktivität zu beobachten, wenn bei der Transfektion der HEK293-Zellen mehr von dem TCF4E-Expressionsvektor eingesetzt wurde. Die geschilderten Ergebnisse bestätigen zum einen die Ergebnisse von de Groot et al. (de Groot et al., 2000) bezüglich der Promotoraktivität der klonierten 5'-flankierenden Sequenz des Maus Follistatin-Gens. Zusätzlich zeigen die Reporterstudien, dass die Promotoraktivität des Foll 4 kb-Fragments TCF/β-Catenin-abhängig gesteuert werden kann, und dass die verschiedenen LEF/TCF-Tanskriptionsfaktoren sich bezüglich ihrer Funktionalität bei dieser Steuerung unterscheiden. Als Konsequenz aus den in Seite 100 Ergebnisse Abb. 3.13 dargestellten Ergebnissen, wurden für alle weiteren LuciferaseReporterversuche mit Follistatin-Luc Konstrukten pro Transfektionsansatz 50 ng des pCS2+-TCF1E-Expressionsvektors eingesetzt. 3.6.2.3. Luciferase-Reporterstudien mit Deletionskonstrukten von Foll 4 kb-Luc Eine Möglichkeit, einen Promotor zu charakterisieren, besteht darin, ihn sukzessive vom 5'Ende her zu deletieren, und die Auswirkung dieser Deletionen auf die Promotoraktivität zu studieren. Im Falle des Foll 4 kb-Fragments wurde diese Methode benutzt, um erste Hinweise auf die Funktionalität der insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen auf diesem Abschnitt bei der durch TCF1E und β-Catenin S33A vermittelten Transaktivierung zu erhalten. Abb. 3.14 zeigt die eingesetzten Deletionskonstrukte sowie die Egebnisse der Luciferase-Reporterversuche. Abb. 3.14. Aktivierbarkeit verschiedener Deletionskonstrukte von Foll 4 kb-Luc in LuciferaseReporterversuchen. Ausgehend vom Foll 4 kb- Luc-Konstrukt wurden weitere LuciferaseReporterkonstrukte hergestellt, in denen jeweils ein Teil der regulatorischen Sequenz des FollstatinGens vom 5'-Ende her deletiert war. Die dafür eingesetzten Restriktionsschnittstellen im FollistatinPromotor sind eingezeichnet. TCF1E und β-Catenin wurden einzeln oder in Kombination in HEK 293Zellen überexprimiert und die Aktivierung verschiedener Follistatin-Luc-Konstrukte in LuciferaseReporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die Seite 101 Ergebnisse Transfektionseffizienz wurde der pCMV-Renilla Vektor eingesetzt. Die relative Luciferase-Aktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch TCF1E und/oder β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Die Darstellung der Follistatin-Reporterkonstrukte basiert auf Abb. 3.12. Nähere Erläuterungen siehe Text. In HEK 293-Zellen, die das Foll 4 kb-Luc-Konstrukt enthielten und in denen entweder nur TCF1E oder nur β−Catenin S33A exprimiert wurde, konnte kein deutlicher Anstieg der standardisierten Luciferase-Aktivitäten im Vergleich zum Kontrollversuch beobachtet werden. Da dies auch für alle weiteren getesteten Follistatin-Luc Konstrukte der Fall war, werden im Folgenden nur die Ergebnisse aus den Versuchen näher besprochen, bei denen TCF1E und β−Catenin S33A in Kombination eingesetzt wurden, um den Wnt/β−Catenin-Signalweg zu aktivieren. Unter diesen Bedingungen ergab sich für das Konstrukt Foll 4 kb-Luc (LEF/TCFBindestellen 1-7) eine relative Luciferase-Aktivität von etwa 30, d.h. die standardisierte Luciferase-Aktivität der HEK 293-Zellen, die mit den pCS2+-Expressionsvektoren für TCF1E und β−Catenin S33A transfiziert worden waren, war 30-fach höher, als die standardisierte Luciferaseaktivität der HEK 293-Zellen aus dem Kontrollversuch, die mit dem leeren pCS2+-Vektor transfiziert worden waren. Wegen der übersichtlicheren Darstellung wurde in Abb. 3.14 die Reihenfolge der Deletionskonstrukte so gewählt, dass das Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt zuletzt gezeigt wird, es soll nun aber zuerst besprochen werden. Abb. 3.14 zeigt, dass die LuciferaseExpression unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb nach Aktivierung des Wnt/β−CateninSignalwegs in den HEK 293-Zellen auch um das 30-fache ansteigt, obwohl in diesem Deletionskonstrukt nur noch die LEF/TCF-Bindestellen 1-4 vorhanden sind. Auch mit dem Konstrukt Foll 2,1 kb-Luc, das lediglich die LEF/TCF-Bindestellen 1-3 besitzt, konnte in etwa die gleiche relative Luciferase-Aktivität erzielt werden, wie mit den Konstrukten Foll 4 kb-Luc und Foll 2,8 kb-Luc; der Wert für Foll 2,1 kb-Luc war mit 32 sogar etwas größer als bei den beiden längeren Konstrukten. Im Foll 1,8 kb-LucKonstrukt sind weitere 300 Basen vom 5'-Ende des Follistatin-Promotors deletiert, was u. a. zum Verlust der LEF/TCF-Bindestelle 3 führt, der LEF/TCF-Bindestelle, die zwischen Maus und Mensch evolutionär konserviert ist. Mit dem Foll 1,8 kb-LucKonstrukt ergab sich nach Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalwegs in den HEK 293-Zellen lediglich eine Steigerung der standardisierten Luciferase-Expression um das 8-fache. Auch dieses 1,8 kb große Fragment des Follistatin-Promotors kann also noch durch TCF1E und β−Catenin S33A aktiviert werden, allerdings weniger stark als die bereits besprochenen, längeren Follistatin-Promotorfragmente. Diese Induzierbarkeit der Luciferase-Expression durch TCF1E und β−Catenin S33A ist Seite 102 Ergebnisse auch bei dem Foll 0,5 kb-Luc-Konstrukt erhalten, mit dem sich ebenfalls eine relative Luciferase-Aktivität von etwa 8 ergab. In dem 0,5 kb großen Fragment des Follistatin-Promotors ist nur noch eine LEF/TCF-Bindestelle vorhanden. Wird ein weiterer, 150 Basen langer Abschnitt deletiert, der diese LEF/TCF-Bindestelle enthält, so geht die Induzierbarkeit der Luciferase-Expression durch TCF1E und β−Catenin S33A verloren, wie die Ergebnisse, die mit dem Foll 0,35 kb-LucKonstrukt erzielt wurden, zeigen. 3.6.2.4. Follistatin-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen Als Konsequenz aus den Ergebnissen mit den Deletionskonstrukten (s. 3.6.2.3.), und angesichts der ausgeprägten Konservierung der 3 kb großen Sequenzabschnitte in 5'Richtung der Translationsstartstellen der Follistatin-Gene von Maus und Mensch (s. 3.6.1.), beschränkten sich die weiteren in vitro und in vivo Analysen des FollistatinPromotors im Wesentlichen auf das in Abb. 3.14 skizzierte 2,8 kb-Fragment des Promotors mit insgesamt vier LEF/TCF-Bindestellen (in der Wildtyp-Version). Um zu zeigen, dass diese LEF/TCF-Bindestellen tatsächlich für die Aktivierung des Follistatin-Promotors durch TCF1E und β−Catenin S33A verantwortlich sind, wurden die LEF/TCF-Bindestellen 1-4 in dem Foll 2,8 kb-Fragment mutiert (s. 2.2.14.). Verschiedene Follistatin-Luc-Konstrukte, in denen einzelne oder alle LEF/TCF-Bindestellen mutiert waren, wurden anschließend in HEK 293-Zellen unter den üblichen Bedingungen getestet (s. 2.4.6.). Die Konstrukte sowie die Ergebnisse der Reporterversuche sind in Abb 3.15 und 3.16 zu sehen. Abb. 3.15 zeigt die Ergebnisse, die mit den verschiedenen Foll 2,8 kb-LucKonstrukten in Luciferase-Reporterstudien erzielt wurden. Zunächst ist festzuhalten, dass in dieser Versuchsreihe die relative Luciferase-Aktivität, die mit dem Wildtyp Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt erzielt wurde, geringer ist, als der entsprechende Wert aus der letzten Versuchsreihe (vgl. Abb. 3.14). Lag der Wert für Foll 2,8 kb-Luc in der vorherigen Versuchsreihe bei etwa 30, so liegt er nun bei etwa 19. Es ist nicht klar, worauf dieser Unterschied zurückzuführen ist. Die beiden Versuchsreihen wurden mit HEK 293-Zellen durchgeführt, die unterschiedlich oft passagiert worden waren, was eine mögliche Erklärung liefern könnte. Für die Interpretation der Ergebnisse ist es letztlich unerheblich, da Vergleiche zwischen unterschiedlichen Reporterkonstrukten nur innerhalb der einzelnen Versuchsreihen angestellt werden. Mit dem Konstrukt Foll 2,8 kb1-4 mut-Luc, in dem alle vier LEF/TCF-Bindestellen mutiert sind, ergab Seite 103 Ergebnisse Abb. 3.15. Aktivierbarkeit verschiedener Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte nach Mutagenese von LEF/TCF-Bindestellen. Durch gezielte Mutagenese wurden verschiedene Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen generiert. TCF1E und β-Catenin wurden einzeln oder in Kombination in HEK 293-Zellen überexprimiert und die Aktivierung der Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte in Luciferase-Reporterversuchen ermittelt. Zur Standardisierung der Luciferase-Aktivitäten auf die Transfektionseffizienz wurde der pCMV Renilla Vektor eingesetzt. Die relative Luciferase-Aktivität gibt die Steigerung der Luciferase-Aktivität nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch TCF1E und/oder β-Catenin S33A an. Als Bezugsgröße diente dabei die Luciferase-Aktivität in HEK 293-Zellen, die lediglich mit den Reporterplasmiden transfiziert wurden. Die Darstellung der Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukte basiert auf Abb. 3.12. Mutierte LEF/TCF-Bindestellen sind durchkreuzt dargestellt. Die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestelle 1 in drei verschiedenen Konstrukten führt jeweils zum weitgehenden Verlust der Promotoraktivierbarkeit durch TCF1E und β-Catenin S33A. sich in jedem Fall eine stark reduzierte relative Luciferase-Aktivität, im Vergleich zum Wildtyp-Konstrukt. Die 5-fache Steigerung der standardisierten LuciferaseAktivität durch Expression von TCF1E und β−Catenin S33A liegt nur geringfügig über dem Wert, der erzielt wurde, wenn als Reporterkonstrukt der pGL3 basicLeervektor eingesetzt wurde. Die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen 1-4 im Foll 2,8 kb 1-4 mutPromotorfragment führt somit dazu, dass die Luciferase-Expression allenfalls noch schwach von TCF1E und β−Catenin S33A aktiviert werden kann. Die Konstrukte Foll 2,8 kb 1-2 mut-Luc und Foll 2,8 kb3-4 mut-Luc dienten dazu, die funktionell relevanten LEF/TCF-Bindestellen näher einzugrenzen. Wie Abb. 3.15 zu entnehmen ist, führt bereits die Mutation der LEF/TCF-Bindestellen 1 und 2 zu einer ähnlichen Seite 104 Ergebnisse Reduktion der relativen Luciferase-Aktivität wie die Mutation aller vier LEF/TCFBindestellen. Die standardisierte Luciferase-Aktivität steigt bei dem Konstrukt Foll 2,8 kb 1-2 mut-Luc nach Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalweg nur noch um das 4-fache an, die Aktivierung dieses Konstrukts durch TCF1E und β−Catenin S33A ist also stark eingeschränkt, im Vergleich zum Wildtyp-Konstrukt. Dagegen hat die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen 3 und 4 kaum Auswirkungen auf die Aktivierbarkeit des Foll 2,8 kb 3-4 mut-Fragments durch den Wnt/β−CateninSignalweg. Mit dem Foll 2,8 kb3-4 mut-Luc-Konstrukt wird eine relative LuciferaseAktivität von etwa 17 erreicht, ein Wert der nur unwesentlich unter dem liegt, der in dieser Versuchsreihe für das Wildtyp Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt ermittelt wurde. Schließlich wurden zwei weitere Reporterkonstrukte hergestellt, in denen nur die LEF/TCF-Bindestelle 1 (Foll 2,8 kb 1 mut-Luc) bzw. die LEF/TCF-Bindestelle 2 (Foll 2,8 kb 2 mut-Luc) des 2,8 kb Follistatin-Promotors mutiert war. Die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle hat starke Auswirkungen auf die Aktivierbarkeit des Foll 2,8 kb 1 mut-Luc-Konstrukts durch TCF1E und β−Catenin S33A. Dagegen wird mit dem Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 2 mut-Luc in etwa die gleiche relative Luciferase-Aktivität erreicht, wie mit dem Wildtyp Foll 2,8 kb-Luc-Konstrukt. Die Ergebnisse, die mit den verschiedenen Deletionskonstrukten des FollistatinPromotors in Luciferase-Reporterstudien erzielt wurden (s. Abb. 3.14), deuteten bereits darauf hin, dass die LEF/TCF-Bindestellen 5-7, die nur im Foll 4 kb-LucKonstrukt vorhanden waren, nicht an der Regulation des Follistatin-Promotors durch den Wnt/β−Catenin-Signalweg beteiligt sind. Um dies zu bestätigen, wurde ein Reporterkonstrukt auf der Basis des Foll 4 kb-Luc-Konstrukt hergestellt, in dem die erste LEF/TCF-Bindestelle mutiert ist (Foll 4 kb 1 mut-Luc, s. Abb. 3.16). Dieses Konstrukt wurde zusammen mit dem Wildtyp Foll 4 kb-Luc-Konstrukt, sowie Foll 2,8 kb 1 mut-Luc und Foll 2,8 kb-Luc in HEK 293-Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.16 dargestellt. Die relativen Luciferase-Aktivitäten, die mit den Wildtyp-Konstrukten Foll 4 kb-Luc und Foll 2,8 kb-Luc erzielt wurden, sind nahezu identisch (vgl. auch Abb. 3.14). Die Aktivierung des Wnt/β−Catenin-Signalwegs durch TCF1E und β−Catenin S33A führte mit beiden Wildtyp-Konstrukten zu einer etwa 30-fachen Steigerung der standardisierten Luciferase-Aktivität in den HEK 293Zellen. Dass die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle in Foll 2,8 kb 1 mut-Luc zu einer stark reduzierten Wnt/β−Catenin-Antwort führt, wurde bereits besprochen (s. 3.6.2.4. und Abb. 3.15). Das gleiche wurde auch mit dem Konstrukt Foll 4 kb 1 mutLuc beobachtet. Auch hier führte die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle zu einer drastischen Reduktion der relativen Luciferase-Aktivität im Vergleich zum Seite 105 Ergebnisse Wildtyp- Foll 4 kb-Luc-Konstrukt. Die drei zusätzlichen LEF/TCF-Bindestellen, die in Foll 4 kb 1 mut-Luc im Vergleich zu Foll 2,8 kb 1 mut-Luc vorhanden sind, konnten also die Mutation der ersten LEF/TCF-Bindestelle nicht kompensieren. Abb. 3.16. Überprüfung der Funktionalität der LEF/TCF-Bindestellen 5-7 des 4 kb FollistatinPromotors. Um zu prüfen, ob die LEF/TCF-Bindestellen 5-7 des 4 kb Follistatin-Promotors die TCF/ β-Catenin-vermittelte Aktivierung des Follistatin-Promotors trotz mutierter LEF/TCF-Bindestelle 1 wiederherstellen können, wurde das Konstrukt Foll 4 kb 1 mut-Luc generiert und zusammen mit bereits bekannten Follistatin-Luc-Konstrukten in Luciferase-Reporterversuchen getestet (Durchführung s. Text u. Abb. 3.15). Die Darstellung der Follistatin-Luc-Konstrukte basiert auf Abb. 3.12. Die mutierte LEF/TCF-Bindestelle 1 ist durchkreuzt dargestellt. Das Foll 4 kb 1 mut-Luc-Konstrukt verhält sich in Luciferase-Reporterversuchen ähnlich wie das Foll 2,8 kb 1 mut-Luc-Konstrukt. Die drei zusätzlichen LEF/TCF-Bindestellen (5-7) haben also keinen Einfluss auf die Aktivierbarkeit des FollistatinPromotors durch TCF1E und β-Catenin S33A. Diese Versuche zeigen, dass von den sieben LEF/TCF-Bindestellen, die in dem 4 kb Follistatin-Promotor vorhanden sind, nur die dem Transkriptionsstart nächstgelegene bei der TCF/β-Catenin-abhängigen Regulation eines Reportergens funktionell ist. Diese LEF/TCF-Bindestelle ist nicht im humanen Genom konserviert (s. Abschnitt 4.7 der Diskussion). 3.6.3. Expression von Follistatin während der Maus-Embryogenese Um einen Überblick über die Expression des Follistatin-Gens in den verschiedenen Entwicklungsstadien zu bekommen, wurden in situ Hybridisierungen durchgeführt. Dabei wurden neben ganzen Embryonen („whole mount“ in situ Hybridisierung) auch Gewebeschnitte analysiert. (Albano et al., 1994; Feijen et al., 1994). Seite 106 Ergebnisse 3.6.3.1. „Whole mount“ in situ Hybridisierungen von Embryonen „Whole mount“ in situ Hybridisierungen zur Detektion der Follistatin mRNA wurden mit Embronen aus den Entwicklungsstadien E 7,5 d.p.c - E 12,5 d.p.c. durchgeführt. Die Ergebnisse sind Abb. 3.17 zu entnehmen. Abb. 3.17. Nachweis der Follistatin-Expression in Wildtyp-Mausembryonen durch „whole mount“ in situ Hybridisierung. Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien wurden präpariert und die Follistatin-mRNA durch in situ Hybridisierung nachgewiesen. (A) E 7,5 dpc; Expression von Follistatin im Primitivstreifen. (B) E 8,5 dpc; Follistatin-Expression im paraxialen Mesoderm und im Bereich der Kopffalte. (D) E 9,5 dpc; schwache Follistatin-Expression im Mittelhirn, starke Expression in einzelnen Rhombomeren des Hinterhirns und in den Somiten. (D) E 10,5 dpc; nur noch schwache Follistatin-Expression in den Somiten und in Mittel- u. Hinterhirn. (E) E 11,5 dpc; neue Expressionsdomänen von Follistatin in den Gliedmaßen und im Kopf des Embryos erscheinen. (F) E 12,5 dpc; zusätzlich zur starken Follistatin-Expression in den Gliedmaßen ist eine schwache Färbung im Rumpf des Embryos zu erkennen. Neben weiteren Expressionsdomänen im Kopfbereich exprimieren auch die Schnurrhaarfollikel Follistatin. (A) laterale Ansicht, dorsal oben, posterior rechts; (B) lateral-dorsale Ansicht, posterior rechts; (C-F) laterale Ansicht. Maßstab: 0,5 mm. Am Tag 7,5 p.c. ist Follistatin in der Region des Primitivstreifens exprimiert (Abb. 3.17 A), am Tag 8,5 der Embryonalentwicklung (Abb. 3.17 B) im paraxialen Mesoderm und im sich entwickelnden Hinterhirn. Abb 3.17 C zeigt die FollistatinExpression am Tag 9,5 p.c. Es ist nun klar zu erkennen, dass sich die Expression von Follistatin im Hinterhirn auf einzelne Rhombomere konzentriert, und zwar besonders Seite 107 Ergebnisse auf die Rhombomere 1,2, 4 und 6 (Albano et al., 1994). Zudem tritt eine schwache Färbung in mehr anterior liegenden Hirnabschnitten auf. Im paraxialen Mesoderm beschränkt sich das Follistatin-Signal auf die Somiten, die stark gefärbt sind, das präsomitische Mesoderm zeigt dagegen allenfalls eine schwache Färbung (Albano et al., 1994). Am Tag 10,5 p.c. (Abb. 3.17 D) ist die Follistatin-Expression im paraxialen Mesoderm bereits deutlich schwächer geworden und auch die Expressionsdomäne im Hinterhirn ist kaum noch zu erkennen. Deutlicher als bisher ist die Epression von Follistatin im Mittelhirn zu sehen. Die Embryonen der folgenden Entwicklungsstadien sind aufgrund ihrer Größe nicht mehr so gut für die Analyse der Genexpression mittels „whole mount“ in situ Hybridisierung geeignet. Die Embryonen in Abb. 3.17 E (E 11,5 d.p.c.) und 3.17 F (E 12,5 d.p.c.) werden hier trotzdem gezeigt, weil sie verdeutlichen, dass in den späteren Entwicklungsstadien neue Expressionsdomänen von Follistatin erscheinen, etwa im Gesicht (Region um das Auge, Follikel der Schnurrhaare) und in den Gliedmaßen. 3.6.3.2. In situ Hybridisierungen auf Gewebeschnitten Für eine detailliertere Analyse der Follistatin-Expression während späterer Entwicklungsstadien wurden in situ Hybridisierungen auf Gewebeschnitten durchgeführt. In Abb. 3.18 sind drei solche Schnitte (sagitale Schnittebene) durch einen Embryo am Tag 12,5 p.c. dargestellt. Abbildung 3.18 A zeigt schematisch die ungefähre Schnittführung durch den Embryo. In Abb. 3.18 B ist deutlich zu sehen, dass Follistatin an mehreren Stellen in der vorderen Gliedmaße exprimiert ist. Neben der starken Follistatin-Expression am distalen Ende der Gliedmaße (i. d. Region der zukünftigen Finger, vgl. Abb. 3.17 F) sind in proximaler Richtung verschiedene Kondensationen von mesenchymalen Zellen blau gefärbt. In Abb. 3.18 B ist auch zu erkennen, dass Follistatin in Gruppen mesenchymaler Zellen in der Nähe des Auges exprimiert wird. Auch eine schwache Expression in dem angeschnittenen Neuroektoderm ist zu sehen. Abb 3.18 C zeigt deutlich die starke Expression von Follistatin in den dem Riechepithel benachbarten, mesenchymalen Zellen und im Innenohr. Weitere Follistatin-Expressionsdomänen findet man in mesenchymalen Zellen zwischen den Anlagen der Rippen, in der hinteren Gliedmaße und im Neuroepithel, v.a. im Bereich des Mittelhirns. In Abb. 3.18 D ist die regionale Spezifität der Follistatin-Expression im zentralen Nervensystem besser zu sehen. Vor allem im Dach des Mittelhirns, im Diencephalon und im ventralen Hinterhirn tritt eine Blaufärbung auf. Abb. 3.18 D zeigt auch die starke Expression von Follistatin in der Seite 108 Ergebnisse Zunge und um die Nasenhöhle. Weiterhin ist ein segmentales Expressionsmuster im dorsalen Bereich des Embryos zu erkennen. Feijen et al. (Feijen et al., 1994) konnten zeigen, dass Follistatin in Embryonen am Tag 12,5 p.c. noch in weiteren Geweben exprimiert ist, etwa in mesenchymalen Zellen um den Magen und im Darm, in den Gonadenanlagen und in der Epidermis. Bei den Follistatin-exprimierenden Zellen im Rumpf und in den Gliedmaßen handelt es sich zum Teil um Muskelvorläuferzellen (Amthor et al., 1996; Connolly et al., 1995). Abb. 3.18. Nachweis der Follistatin-mRNA durch in situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten eines E 12,5 dpc Wildtyp-Embryos. (A) Schematische Darstellung der Schnittführung durch einen 12,5 Tage alten Embryo. Es wurden sagittale Schnitte hergestellt. (B-D) Nach in situ Hybridisierung mit einer Follistatin-Sonde wurden die Gewebeschnitte mit „Nuclear Fast Red“ gegengefärbt. Die blaue Färbung markiert Gewebe, die Follistatin exprimieren. Abkürzungen: Au, Auge; F, zukünftiger Finger; hG, hintere Gliedmaße; Hh, Hinterhirn; Io, Innenohr; Mh, Mittelhirn; Mhd, Mittelhirndach; mK, Kondensation mesenchymaler Zellen; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; Nh, Nasenhöhle; Re; Riechepithel; vG, vordere Gliedmaße; Zh, Zwischenhirn; Zr, zukünftige Zwischenrippenregion; Zu, Zunge. Vergrößerung: 10x. Nähere Erläuterungen siehe Text. Seite 109 Ergebnisse 3.6.4. Die Reporterstudien an transgenen Mäusen Luciferase-Reporterstudien mit den verschiedenen Follistatin- Promotorfragmenten haben gezeigt, dass die Aktivität des Follistatin-Promotors durch den Wnt/β−Catenin-Signalweg reguliert werden kann. Bisher ist jedoch nichts über die in vivo Funktionalität dieser Follistatin-Promotorfragmente bekannt, d.h. es ist nicht klar, ob etwa auf dem Foll 2,8 kb-Fragment alle cis-regulatorischen Elemente vorhanden sind, die notwendig sind, um das komplexe zeitlich-räumliche Expressionsmuster des Follistatin-Gens während der Embryonalentwicklung (s. Abb. 3.17 und 3.18) zu generieren. Um diese Frage zu beantworten, wurden transgene Mäuse hergestellt, die das Reportergen β-Galaktosidase (lacZ) unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb exprimieren (Foll 2,8 kb-lacZ, s. Abb. 3.19, 3.20 u. 3.21). Zusätzlich wurden transgene Mäuse produziert, in denen der lacZ-Reporter unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb 1-4 mut, dem Follistatin-Promotorfragment mit vier mutierten LEF/TCF-Bindestellen, exprimiert wurde (Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ, s. Abb. 3.22 u. 3.23). Mit diesem Ansatz sollte geklärt werden, ob der Follistatin-Promotor auch in vivo durch den Wnt/β−Catenin-Signalweg reguliert wird. Die Herstellung der transgenen Tiere wird im Methodenteil beschrieben (s. 2.5.8.). Anders als bei den in vivo Untersuchungen zur Axin2-Regulation mit transienten Transgenen (s. Abschnitt 3.5.4.) wurden mit den beiden Konstrukten Foll 2,8 kb-lacZ und Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ stabile transgene Mauslinien hergestellt. Das bedeutet, dass die injizierten Embryonen nach erfolgter Reimplantation von den Leihmüttern bis zur Geburt ausgetragen wurden. Nach der Entwicklung zur Geschlechtsreife wurden die Tiere, die das Reportergen stabil in ihr Genom integriert hatten, mit Wildtyp-Mäusen gekreuzt und die Nachkommen erneut genotypisiert. Männliche Nachkommen, denen das lacZ-Transgen vererbt worden war, wurden dann mit weiblichen Wildtyp-Mäusen verpaart. Die gezeugten Embryonen wurden in den entsprechenden Entwicklungsstadien präpariert und die β-Galaktosidase-Aktivität durch X-Gal Färbung nachgewiesen (s. 2.5.10.). 3.6.4.1. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des 2,8 kb Follistatin-Promotors Ein Versuch zur Herstellung transgener Mäuse mit dem Wildtyp-Konstrukt Foll 2,8 kb-lacZ resultierte in der Geburt von insgesamt 20 Mäusen, von denen fünf das lacZTransgen in ihr Genom integriert hatten (25 %). Alle fünf Mäuse gaben das Transgen Seite 110 Ergebnisse an ihre Nachkommen weiter. Die transgenen Linien wurden nach der fortlaufenden Numerierung der Mäuse aus der ersten Generation folgendermaßen benannt: Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 5, Nr. 11, Nr. 14, Nr. 16 und Nr. 19. Die Ergebnisse der X-Gal Färbung von Embryonen der verschiedenen transgenen Mauslinien sind in Tabelle 3.14 schematisch dargestellt. Um eine Übersicht über die Färbungsmuster zu geben, werden in Abb. 3.19 die X-Gal gefärbten Embryonen der verschiedenen Foll 2,8 kb-lacZ Mauslinien in den Entwicklungsstadien E 12,5 d.p.c. und E 14,5 d.p.c. gezeigt. Mauslinie Nr. 5 Nr. 11 Entw.stadium Nr. 14 Nr. 16 Nr. 19 - - Blaufärbung ja/ nein (+/-) E 7,5 d.p.c. - E 8,5 d.p.c. - - - - E 9,5 d.p.c. - - (+) (+) - + + E 10,5 d.p.c. + E 11,5 d.p.c. - + - + + E 12,5 d.p.c. - + + + + E 13,5 d.p.c. - + + + + E 14,5 d.p.c. - + - + + lacZ aktiv nein ja ja ja ja Tab. 3.14. Übersicht über die Ergebnisse der X-Gal Färbungen der transgenen Embryonen mit dem Wildtyp-Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ. Mit dem oben gezeigten Konstrukt wurden stabile transgene Mauslinien generiert. Die Bezeichnung der einzelnen Elemente in Foll 2,8 kb ist Abb. 3.12 zu entnehmen; das Konstrukt enthält die LEF/TCF-Bindestellen 1-4. Die Embryonen von fünf verschiedenen Mauslinien wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien präpariert und die Expression des β-Galaktosidase-Reportergens durch „whole mount“ X-Gal Färbungen nachgewiesen. Vorhandene β-Galaktosidase-Aktivität ist durch ein Plus-Zeichen dargestellt, wenn keine Blaufärbung erzielt wurde, ist dies durch ein Minus-Zeichen angegeben. Eingeklammerte Plus-Zeichen weisen auf eine Expression des lacZ-Reportergens in Geweben hin, in denen das endogene Follistatin-Gen nicht exprimiert wird (ektopische Expression). Bis auf die transgene Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 5 ließ sich in allen Linien die Expression des lacZ-Transgens zumindest in einigen Entwicklungsstadien nachweisen (vgl. Abb. 3.19). Tab. 3.14 ist zu entnehmen, dass an Tag 7,5 p.c. und 8,5 p.c. das lacZ-Transgen in keiner der untersuchten Linien exprimiert wurde. Der früheste Zeitpunkt, an dem eine positive X-Gal Färbung in den Embryonen beobachtet werden konnte, war etwa 9,5 Tage nach der Befruchtung, allerdings nur in Embryonen der transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 und 16. Die beobachtete Blaufärbung war jedoch in beiden Fällen nur schwach ausgeprägt und korrespondierte nicht mit der endogenen Expression des Seite 111 Ergebnisse Abb. 3.19. Übersicht über die XGal-Färbemuster der transgenen Embryonen mit dem WildtypReporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ an Tag 12,5 p.c. und 14,5 p.c. (A) Die Embryonen der transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 u. Nr. 19 zeigen weitgehend übereinstimmende X-Gal-Färbemuster. An Tag 12,5 p.c. ist u. a. die Mittelhirn-Region der Embryonen stark gefärbt. Starke β-Galaktosidase-Aktivität wurde auch in proximalen Abschnitten der Gliedmaßen und zentralen Teilen des Rumpfes nachgewiesen. Die Färbung im Rumpf der Embryonen folgt einem segmentalen Muster – bei den gefärbten Strukturen handelt es sich u. a. um Muskelvorläuferzellen, die aus den myotomalen Abschnitten der Somiten hervorgehen. In den transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 ist das lacZ-Transgen an Tag 12,5 p.c.13,5 p.c. in den Schnurrhaarfollikeln exprimiert. Fortsetzung siehe nächste Seite. Seite 112 Ergebnisse An Tag 14,5 p.c. wird das lacZ-Transgen in den transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 u. Nr. 19 in der Muskelschicht der Hypodermis exprimiert. Weite Teile des Rumpfs und einzelne Muskelfasern in der Kopfregion sind intensiv blau gefärbt. Auch in den Gliedmaßen wird das lacZ-Transgen noch exprimiert, die Expression in der Mittelhirn-Region ist an Tag 14,5 p.c. jedoch nicht mehr zu beobachten. (B) In den Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 5 wurde keine βGalaktosidase-Aktivität nachgewiesen. Die transgene Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 exprimiert das lacZ-Transgen an Tag 12,5 p.c.- 13,5 p.c. in Mittelhirn, Gliedmaßen und im Rumpf des Embryos (s.o.). Zusätzlich sind jedoch weite Teile des Neuralrohrs und des Gefäßsystems blau gefärbt (ektopische Expression). An Tag 14,5 p.c. lässt sich in den Embryonen dieser Linie kaum noch β-GalaktosidaseAktivität nachweisen (vgl. Tab. 3.14). Vergrößerungen; E 12,5 dpc: 5,5x.; E 14,5 dpc: 4x. Follistatin-Gens, auf die bildliche Darstellung der Embryonen wird deshalb verzichtet. Transgene Embryonen der Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, 16 und 19 zeigten von Tag 10,5 p.c. bzw. 11,5 p.c. an eine Blaufärbung in allen untersuchten späteren Entwicklungsstadien (bis Tag 14,5). Das beobachtete Färbungsmuster war in allen drei Linien sehr ähnlich (s. Abb. 3.19 A). Dagegen zeigten Embryonen der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 nur an Tag 12,5 p.c. und Tag 13,5 p.c. eine positive X-Gal-Färbung. Die Färbung (s. Abb. 3.19 B) überlappte zu diesen Zeitpunkten deutlich mit dem Färbungsmuster, das in den Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, 16 und 19 beobachtet wurde, war aber zusätzlich auf andere Gewebe ausgedehnt. Am Ende dieses Kapitels wird darauf noch einmal eingegangen. Die transgene Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 5 war die einzige, für die in keinem der untersuchten Entwicklungsstadien eine Aktivität des lacZ-Reportergens nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 3.19 B). Die X-Gal Färbungsmuster der Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11 werden in den Abb. 3.20 und 3.21 noch einmal genauer dargestellt und im Text erläutert. Abb. 3.20 zeigt Gesamtaufnahmen von Embryonen der Entwicklungsstadien E 11,5 d.p.c bis E 14,5 d.p.c. nach der X-Gal-Färbung. In Abb. 3.21 sind Gewebeschnitte durch einen X-Gal gefärbten Embryo am Tag 12,5 p.c. zu sehen. Wie schon erwähnt, konnte in Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11 die Aktivität des lacZ-Reportergens frühestens 10,5 Tage nach der Befruchtung nachgewiesen werden. Die X-Gal Färbung dieser Embryonen lieferte aber lediglich eine sehr schwache Blaufärbung in der Region des Mittelhirns und im Rumpf der Embryonen, auf eine Darstellung wurde deshalb verzichtet. Abb. 3.20 A zeigt einen X-Gal gefärbten Embryo am Tag 11,5 p.c. Auffallend ist zunächst die starke Blaufärbung in der Region des Mittelhirns. Deutlich zu sehen ist auch eine segmentale Färbung im Rumpf des Embryos und die Expression des lacZ-Transgens in den Gliedmaßen. Zusätzlich wurde im Bereich des sich entwickelnden Ohrs und Seite 113 Ergebnisse Abb. 3.20. Genauere Darstellung der X-Gal-Färbemuster für Embryonen der transgenen Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11. (A) E 11,5 dpc; Vergr. 12,5x . (B) E 12,5 dpc; Vergr. 10x. (C) E 13,5 dpc; Vergr. 8x. (D) E14,5 dpc; Vergr. 7,5x. Nähere Erläuterungen siehe Text u. Abb. 3.19. unterhalb des Auges eine Blaufärbung beobachtet. Bei den Zellen, die das lacZTransgen an Tag 11,5 p.c. exprimieren, handelt es sich teilweise um Muskelvorläuferzellen. Experimente mit Hühnerembryonen haben gezeigt, dass Follistatin in Muskelvorläuferzellen exprimiert wird (Amthor et al., 1996; Connolly et al., 1995). Zudem stimmt das Muster der lacZ-Expression in Rumpf und Gliedmaßen der transgenen Mausembryonen weitgehend mit dem Expressionsmuster des muskelspezifischen Transkriptionsfaktors Myf-5 in diesem Entwicklungsstadium Seite 114 Ergebnisse überein (Zweigerdt et al., 1997). Abb. 3.20 B zeigt, dass in dem 12,5 Tage alten Embryo im Wesentlichen die gleichen Strukturen angefärbt sind. Das Ausmaß der Blaufärbung im Mittelhirn scheint etwas reduziert, die Blaufärbung im Rumpf und in den Gliedmaßen ist aber ausgedehnter als in dem Embryo am Tag 11,5 p.c. Zudem beginnt am Tag 12,5 p.c. die Expression des lacZ-Transgens in den Schnurrhaarfollikeln des Embryos. Abb. 3.20 C zeigt einen X-Gal gefärbten Embryo am Tag 13,5 p.c. Wieder sind die Follikel der Schnurrhaare blau gefärbt, sowie ausgedehnte Abschnitte in Rumpf und Gliedmaßen des Embryos. Die Blaufärbung im Bereich des Mittelhirns ist zu diesem Zeitpunkt nur noch schwach ausgeprägt. Die XGal Färbung eines Embryos am Tag 14,5 der Embryonalentwicklung ergab ein deutlich verändertes Färbungsmuster. Zu diesem Zeitpunkt tritt eine starke subepidermale Färbung auf, die weite Teile des Embryorumpfs, mit Ausnahme der dorsalen Mittellinie, erfasst. Auch am Kopf des Embryos sind einzelne Partien subepidermal gefärbt, besonders im Bereich der Wangen und über dem Auge. Bei stärkerer Vergrößerung offenbart sich die faserige Struktur dieser subepidermalen Färbung; vor allem im anterioren Bereich ist dies deutlich zu erkennen. Bei der gefärbten Struktur handelt es sich um die Muskelschicht der Hypodermis (Panniculus carnosus), die bei höheren Säugetieren (z. B. Mensch) nur noch rudimentär ausgebildet ist. In Abb. 3.21 sind mehrere Längsschnitte durch einen 12,5 Tage alten, X-Gal gefärbten Embryo zu sehen. Abbildung 3.21 A zeigt schematisch die ungefähre Schnittführung durch den Embryo. Abb. 3.21 B dokumentiert die Blaufärbung im proximalen Teil der vorderen Gliedmaße in den Bereichen, in denen auch das endogene Follistatin-Gen exprimiert ist (vgl. Abb. 3.18 B). Eine Expression des lacZTransgens im Bereich der sich entwickelnden Finger wurde jedoch nicht detektiert (s.u.). Abb. 3.21 C zeigt u.a. eine lacZ-Expression in einer Reihe von Muskelvorläuferzellen in Kopf und Rumpf des Embryos sowie an der Basis der Vordergliedmaße. In Abb. 3.21 D und E ist zu sehen, dass die Zellen zwischen den Rippenanlagen, die sich u.a. zur Zwischenrippenmuskulatur entwickeln, deutlich blau gefärbt sind. In Abb. 3.21 D ist zudem eine lacZ-Expression in den folgenden Strukturen zu erkennen: in der Schulterregion, in der hinteren Gliedmaße und in mehreren Gruppen von Zellen um das Auge. Ein Vergleich mit Abb. 3.18 zeigt, dass in allen diesen Strukturen auch das endogene Follistatin-Gen exprimiert wird. Bei dem Schnitt, der in Abb. 3.21 E gezeigt wird, liegt die Mittelhirn-Region in der Schnittebene. Eine starke Blaufärbung dieser Region, insbesondere in der rostralen Hälfte, ist zu sehen. In anderen Hirnabschnitten wird das lacZ-Transgen aber offenbar Seite 115 Ergebnisse nicht exprimiert, da dort keine Blaufärbung zu beobachten ist, auch nicht im Bereich des Innenohrs, in dem Follistatin stark exprimiert wird (vgl. Abb. 3.18 C). In Abb. 3.21 F ist zu sehen, dass auch in der Zunge und in den mesenchymalen Zellen, die an das Riechepithel angrenzen, das lacZ-Transgen nicht exprimiert wird, obwohl auch diese Gewebe starke Follistatin-Expression aufweisen (vgl. Abb. 3.18 C und D). Abb. 3.21. Sagittale Schnitte durch einen X-Gal gefärbten E 12,5 dpc Embryo der transgenen Linie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11. (A) Schematische Darstellung der Schnittführung durch einen12,5 Tage alten Embryo. Es wurden sagittale Schnitte hergestellt. (B-F) Gewebeschnitte nach „whole mount“ XGal-Färbung und Gegenfärbung mit „Nuclear Fast Red“. Abkürzungen: hG, hintere Gliedmaße; Mh, Mittelhirn; mK, Kondensation mesenchymaler Zellen – wahrscheinlich Muskelvorläuferzellen; Mvz, Muskelvorläuferzellen; NeV, Neuroektoderm des Vorderhirns; vG, vordere Gliedmaße; Zr, zukünftige Zwischenrippenregion. Vergrößerung: 8x. Nähere Erläuterungen siehe Text. Bis auf geringe Abweichungen zeigen die Embryonen der transgenen Mauslinien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 16 und Nr. 19 die gleichen Färbungsmuster, wie sie bei der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11 beobachtet wurden. Deshalb wird an dieser Stelle auf eine detailliertere bildliche Darstellung der restlichen transgenen Mauslinien verzichtet. Lediglich ein Unterschied im Färbungsmuster zwischen den Mauslinien Foll 2,8 kblacZ Nr. 19 und Nr. 11 bzw. Nr. 16 soll hier erwähnt werden. Bei der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 19 zeigen die Schnurrhaarfollikel an Tag 12,5 und 13,5 der Seite 116 Ergebnisse Embryonalentwicklung keine β-Galaktosidase-Expression, bei den Mauslinien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11 und Nr. 16 sind diese nach der X-Gal Färbung jedoch deutlich blau gefärbt (s. Abb. 3.19 A). Wie schon erwähnt, ist das lacZ-Transgen in der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 nur an Tag 12,5 und 13,5 der Embryonalentwicklung deutlich exprimiert. Zu diesen Zeitpunkten überlappt die bei der X-Gal Färbereaktion beobachtete Blaufärbung einerseits mit der lacZ-Expression in den Mauslinien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 und Nr. 19, dehnt sich aber auch auf Gewebe aus, die in letzteren nicht gefärbt sind. Zum Beispiel ist in Abb. 3.19 B zu sehen, dass an Tag 12,5 der Embryonalentwicklung in der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 eine leichte Blaufärbung der beiden Vorderhirnventrikel auftritt. Zusätzlich sind während dieses Entwicklungsstadiums Teile des Gefäßsystems im Rumpf und im Kopf des Embryos angefärbt. Am Tag 13,5 p.c. ist die Aktivität der β-Galaktosidase in Embryonen der Mauslinie Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 14 schwach (Embryo nicht gezeigt), verglichen mit den anderen Mauslinien. Interessant ist aber, dass in den Gliedmaßen am Tag 13,5 p.c. die proximalen Abschnitte der sich entwickelnden Finger blau gefärbt sind, was in den restlichen transgenen Linien bisher nicht beobachtet wurde. Abb. 3.17 F zeigt, dass auch das endogene Follistatin-Gen in den Fingern exprimiert wird. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass das 2,8 kb große Fragment des FollistatinPromotors, das zur Steuerung der β-Galaktosidase-Expression in den transgenen Embryonen eingesetzt wurde, das komplexe Expressionsmuster von Follistatin nur teilweise wiedergeben kann. Insbesondere konnte in den frühen Entwicklungsstadien (E 7,5 – 8,5 d.p.c.) keine lacZ-Expression nachgewiesen werden, obwohl Follistatin zu diesem Zeitpunkt bereits exprimiert wird (s. Abb. 3.17). 3.6.4.2. β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle des mutierten 2,8 kb Follistatin-Promotors Zwei Versuche zur Herstellung transgener Mäuse mit dem Konstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ resultierten in der Geburt von insgesamt 28 Mäusen, von denen fünf das lacZ-Transgen in ihr Genom integriert hatten (17,9 %). Eine dieser fünf Mäuse starb vor der Geschlechtsreife, die anderen vier gaben das Transgen an ihre Nachkommen weiter. Die transgenen Linien wurden nach der fortlaufenden Numerierung der Mäuse aus der ersten Generation folgendermaßen benannt: Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6, Nr. 17, und Nr. 22. Seite 117 Ergebnisse Die Ergebnisse der X-Gal Färbung von Embryonen der verschiedenen transgenen Mauslinien sind in Tabelle 3.15 schematisch dargestellt. Um eine Übersicht über die Färbungsmuster zu geben, werden in Abb. 3.22 die X-Gal gefärbten Embryonen der verschiedenen Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Mauslinien in den Entwicklungsstadien E 12,5 d.p.c. und E 14,5 d.p.c. gezeigt. Mauslinie Nr. 1 Entw.stadium Nr. 6 Nr. 17 Nr. 22 Blaufärbung ja/nein (+/-) E 10,5 d.p.c. - - E 11,5 d.p.c. + + - + E 12,5 d.p.c. + + - + E 13,5 d.p.c. + + - + E 14,5 d.p.c. + + - + lacZ aktiv ja ja nein ja Tab. 3.15. Übersicht über die Ergebnisse der X-Gal Färbungen der transgenen Embryonen mit dem mutierten Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ. Mit dem oben gezeigten Konstrukt wurden stabile transgene Mauslinien generiert. Die Bezeichnung der einzelnen Elemente in Foll 2,8 kb 1-4 mut ist Abb. 3.12 zu entnehmen; das Konstrukt enthält die mutierten LEF/TCF-Bindestellen 1-4 (durchkreuzt dargestellt). Die Embryonen von vier verschiedenen transgenen Mauslinien wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien präpariert und die Expression des β-Galaktosidase-Reportergens durch „whole mount“ X-Gal Färbungen nachgewiesen. Vorhandene β-Galaktosidase-Aktivität ist durch ein Plus-Zeichen dargestellt, wenn keine Blaufärbung erzielt wurde, ist dies durch ein MinusZeichen angegeben. Bis auf die transgene Linie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 17 ließ sich in allen Linien die Expression des lacZ-Transgens zwischen Tag 11,5 p.c.– 14,5 p.c. nachweisen (vgl. Abb. 3.22). Tab. 3.15 ist zu entnehmen, dass in den Embryonen von drei der vier untersuchten transgenen Mauslinien die Expression der β-Galaktosidase unter der Kontrolle des Foll 2,8 kb 1-4 mut-Promotors nachgewiesen werden konnte, und zwar bei den Mauslinien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6 und Nr. 22. Die Embryonen der vierten transgenen Linie, Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 17, zeigten zumindest in den untersuchten Entwicklungsstadien keinerlei Blaufärbung im Verlauf der X-Gal Färbereaktion. Abb. 3.22 zeigt die Embryonen der vier transgenen Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6, Nr. 17 und Nr. 22 an Tag 12,5 bzw. 14,5 der Embryonalentwicklung nach der X-Gal Färbung. Die Embryonen der transgenen Linien Foll 2,8 kb 1-4 mutlacZ Nr. 1, Nr. 6 und Nr. 22 zeigen jeweils eine sehr ähnliche Verteilung der lacZExpression. Eine leichte Blaufärbung der Vorderhirnventrikel (s. Abb. 3.22; E 12,5), Seite 118 Ergebnisse Abb. 3.22. Übersicht über die X-Gal-Färbemuster der transgenen Embryonen mit dem mutierten Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ an Tag 12,5 p.c. und 14,5 p.c. In Embryonen der transgenen Linie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 17 konnte zu keinem Zeitpunkt eine Expression des lacZ-Transgens nachgewiesen werden. Die Embryonen der transgenen Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6 u. Nr. 22 exprimieren das lacZ-Transgen und zeigen weitgehend überlappende X-Gal-Färbemuster. Die Intensität der Färbung ist jedoch bei den 12,5 Tage alten Embryonen der Linie Nr. 22 geringer als bei gleich alten Embryonen der beiden anderen trangenen Linien. Die Färbemuster der Embryonen (transgene Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1, Nr. 6 u. Nr. 22) mit dem mutierten Reporterkonstrukt entsprechen fast völlig den Mustern, die sich bei der X-GalFärbung der transgenen Linien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 u. Nr. 19 mit dem WildtypReporterkonstrukt ergeben haben (vgl. Abb. 3.19 A). D.h. an Tag 12,5 p.c. sind neben der MittelhirnRegion u.a. Muskelvorläuferzellen in den Gliedmaßen und im Rumpf der Embryonen blau gefärbt. Jedoch konnte in keiner der transgenen Linien, die mit dem mutierten Reporterkonstrukt hergestellt wurden, die Expression des lacZ-Transgens in den Schnurrhaarfollikeln von 12,5-13,5 Tage alten Embryonen nachgewiesen werden. An Tag 14,5 p.c. entsprechen sich die Färbemuster der Embryonen, die mit den beiden unterschiedlichen Reporterkonstrukten hergestellt wurden (Wildtyp-Konstrukt bzw. Konstrukt mit mutierten LEF/TCF-Bindestellen) ebenfalls (vgl. Abb. 3. 19 A), d.h. zu diesem Zeitpunkt tritt eine intensive Färbung der Muskelschicht der Hypodermis auf. Vergrößerungen; E 12,5 dpc: 5,5x.; E 14,5 dpc: 4x. eine Färbung der sich entwickelnden Finger (s. Abb. 3.22; E 14,5 d.p.c.) sowie eine starke Blaufärbung des Auges tritt aber jeweils nur in den Embryonen der Mauslinie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 1 auf, nicht in den Linien Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6 und Nr. 22. In Abb. 3.23 sind die X-Gal Färbungsmuster der Embryonen (E 11,5 – E 14,5 d.p.c.) der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6 genauer dargestellt. Seite 119 Ergebnisse Abb. 3.23. Vergrößerte Darstellung der X-Gal-Färbemuster für Embryonen der transgenen Linie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6. (A) E 11,5 dpc; Vergr. 12,5x. (B) E 12,5 dpc; Vergr. 10x. (C) E 13,5 dpc; Vergr. 8x. (D) E14,5 dpc; Vergr. 7,5x. Nähere Erläuterungen siehe Text u. Abb. 3.22. Vergleicht man die Färbungsmuster der Embryonen in Abb. 3.22 und 3.23 mit den bereits besprochenen Färbungsmustern der transgenen Mauslinien Foll 2,8 kb-lacZ Nr. 11, Nr. 16 und Nr. 19, die in Abb. 3.19 und 3.20 dargestellt sind, so stellt man fest, dass weitestgehend Übereinstimmung herrscht. Für die Gewebespezifität der lacZ-Expression unter der Kontrolle des mutierten Promotors Foll 2,8 kb 1-4 mut gilt also im Wesentlichen dasselbe, was in Abschnitt 3.6.4.1. über die transgenen Mäuse geschrieben wurde, die das Wildtyp-Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ enthalten. Seite 120 Ergebnisse Ein kleiner Unterschied zwischen den X-Gal Färbungsmustern, die mit den beiden verschiedenen Reporterkonstukten erzielt wurden, besteht jedoch. In den Embryonen der Mauslinien, die das lacZ-Transgen unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb 1-4 mut exprimierten, wurde am Tag 12,5 bzw. 13,5 der Embryonalentwicklung keine bzw. nur eine sehr schwache Blaufärbung in den Schnurrhaarfollikeln festgestellt (s. Abb. 3.22 u. 3.23). Dagegen konnte bei zwei der transgenen Mauslinien, die mit dem Wildtyp-Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb–lacZ hergestellt worden waren (Foll 2,8 kblacZ Nr. 11 und Nr. 16), eine starke lacZ-Expression in den Schnurrhaarfollikeln der Embryonen an Tag 12,5 p.c. und 13,5 p.c. eindeutig nachgewiesen werden (s. Abb. 3.19 u. 3.20). Dies ist jedoch der einzige Hinweis auf einen Expressionsunterschied zwischen den Reporterkonstrukten Foll 2,8 kb–lacZ und Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ, der bei der Analyse der X-Gal Färbungsmuster in Embryonen der Entwicklungsstadien E 10,5 d.p.c. - E 14,5 d.p.c. festgestellt werden konnte. Auch die Analyse von Gewebe-schnitten gefärbter Embryonen der transgenen Mauslinie Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ Nr. 6 ergab keine Hinweise auf weitere Veränderungen der lacZ-Expression durch die Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen in dem FollistatinPromotorfragment. Abgesehen von der fehlenden Expressionsdomäne in den Follikeln der Schnurrhaare, kann das Promotorfragment Foll 2,8 kb 1-4 mut mit den mutierten LEF/TCFBindestellen die Expression des lacZ-Transgens also in den gleichen Geweben aktivieren, wie das Wildtyp-Promotorfragment Foll 2,8 kb. Angesichts der Variabilität der lacZ-Expression in den Schnurrhaarfollikeln der Embryonen, die das Wildtyp-Konstrukt Foll 2,8 kb–lacZ enthalten (s. 3.6.4.1.), und der geringen Anzahl an transgenen Mauslinien mit dem mutierten Konstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ, die bisher untersucht wurden, ist jedoch noch keine endgültige Aussage darüber möglich, ob die lacZ-Expression in den Schnurrhaarfollikeln tatsächlich vom Vorhandensein funktioneller LEF/TCF-Bindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor abhängt. Seite 121 Diskussion 4. Diskussion Die Entwicklung eines komplexen Organismus aus der befruchteten Eizelle im Verlauf der Ontogenese ist ein faszinierender Vorgang. Dabei wird aus einer einzigen Zelle in relativ kurzer Zeit und in reproduzierbarer Weise ein funktioneller Körper aus Milliarden von Zellen geformt. Umso erstaunlicher ist, dass die Zahl an Signalwegen zur interzellulären Kommunikation, die an der zeitlich-räumlichen Koordination der notwendigen Entwicklungsschritte beteiligt sind, durchaus überschaubar ist. Dies gilt auch, wenn man den Blick über Artgrenzen hinweg richtet – die meisten entwicklungsrelevanten Signalwege sind auch evolutionär stark konserviert. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist ein Vertreter für einen solchen evolutionär konservierten Signalweg. Ebenso mannigfaltig wie die Organismen, in denen bisher Wnt-Gene gefunden wurden, sind die Prozesse, die durch die Wnt-Proteine, über mindestens drei divergierende Wnt-Signalwege (s. Abschnitt 1.4.), gesteuert werden. Der wiederholte Griff in die molekulare Werkzeugkiste im Verlauf der Evolution hat dazu geführt, dass der am besten untersuchte Wnt/β-Catenin-Signalweg in Vertebraten etwa an der anterior-posterioren Achsenbildung während der frühen Embryogenese beteiligt ist (s. 1.5.1. u. 1.5.2.), aber z. B. auch bei der Organogenese der Niere (Stark et al., 1994) oder der Homöostase des Darmepithels (Korinek et al., 1998; Lickert et al., 2001) eine wichtige Rolle spielt. Das bifunktionelle Protein βCatenin ist dabei das zentrale Element des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (s. 1.4.1.). βCatenin bindet an Transkriptionsfaktoren der LEF/TCF-Familie und steuert über seine Funktion als Coaktivator die Transkription von Zielgenen. Auf diesem Weg beeinflusst der Wnt/β-Catenin-Signalweg Proliferation, Differenzierung und Schicksal von Zellen. Aus den oben genannten Zusammenhängen wird deutlich, wie wichtig Erkenntnisse darüber sind, welche Zielgene vom Wnt/β-Catenin-Signalweg angesteuert werden. Das Verständnis eines komplexen Entwicklungsvorgangs setzt das Wissen um die molekularen Mechanismen, die diesem Vorgang zu Grunde liegen, unmittelbar voraus. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, bisher unbekannte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu identifizieren und deren Wnt-abhängige Regulation nach Möglichkeit in bestimmte Entwicklungsvorgänge einzuordnen. Seite 122 Diskussion 4.1. Zielgen-Screening auf der Grundlage des ES-ZellCokultursystems Das ES-Zell Cokultursystem, das von Arnold et al. etabliert wurde und mit dessen Hilfe schon die beiden Wnt/β-Catenin-Zielgene Brachyury und Cdx1 identifiziert werden konnten (Arnold et al., 2000; Lickert et al., 2000), bildete in modifizierter Form die Grundlage für die Suche nach weiteren Zielgenen. Die dabei erzielten Ergebnisse werden an dieser Stelle diskutiert. Dabei werden zunächst ausführlich die Ergebnisse besprochen, die mit den Affymetrix-Microarrays erzielt wurden. Im Anschluss werden die weiteren Ergebnisse diskutiert, die sich bei der Analyse der Zielgen-Kandidaten Axin2 und Follistatin ergaben. 4.1.1. Anteil der mit den Microarrays in ES-Zellen detektierten Transkripte Zunächst soll darauf eingegangen werden, welcher Anteil der auf den Microarrays repräsentierten Gene in den ES-Zellen detektiert werden konnte. Es gibt bisher nur wenige Publikationen, in denen Genexpressionsprofile von ES-Zellen beschrieben sind. Kelly et al. verwendeten cDNA-Microarrays von Clontech, um eine Expressionsprofil von ES-Zellen zu erstellen (Kelly und Rizzino, 2000). Von ca. 600 Genen, die mit diesen Microarrays detektiert werden können, waren etwa 50 % in den ES-Zellen exprimiert. In zwei neueren Studien (Ivanova et al., 2002; Ramalho-Santos et al., 2002) wurde das Transkriptom von embryonalen, neuronalen und hämatopoetischen Stammzellen von Mäusen mit Hilfe von MG-U74v2-Arrays untersucht und paarweise verglichen. Ivanova et al. verwendeten dabei den kompletten Satz der MG-U74v2-Arrays (sub A, B, C), mit denen insgesamt über 36000 Gene bzw. ESTs nachgewiesen werden können (Ivanova et al., 2002). Etwa 39 % davon waren in der untersuchten ES-Zelllinie (CCE) exprimiert. Abschnitt 3.2. der hier vorliegenden Arbeit ist zu entnehmen, dass mit den Mu6500Arrays im Schnitt 38,2 % (1. Hybridisierung) der etwa 6500 repräsentierten Gene bzw. ESTs in den ES-Zellen der lacZ-Kontrolle detektiert werden konnten. Bei den Mu19k-Arrays (Probensätze für ca. 19000 Gene/ESTs) lag die Rate an detektierten Transkripten bei 43 %, bei den MG-U74A-Arrays (Probensätze für ca. 12000 Gene/ESTs) im Schnitt bei 43,8 %, war also jeweils deutlich höher, als bei den Mu6500-Arrays. Geht man von einer mehr oder weniger zufälligen Verteilung der auf den verschiedenen Oligonukleotid-Microarrays repräsentierten Gene bzw. ESTs aus, so kann man Vergleiche zwischen den einzelnen Experimenten anstellen. Zunächst Seite 123 Diskussion fällt auf, dass die eigenen Daten bezüglich des Anteils exprimierter Gene in ES-Zellen prinzipiell vergleichbar sind mit den Daten von Ivanova et al (Ivanova et al., 2002). Es wird aber auch deutlich, dass mit den Mu19k-Arrays und den MG-U74A-Arrays im Schnitt ein höherer Prozentsatz (über 43 %) der repräsentierten Transkripte in den ES-Zellen detektiert wurde, als dies mit den Mu6500-Arrays (39,1 %) oder bei Ivanov et al. (39 %, MG-U74v2-Arrays) der Fall war. Interessant ist, dass ein höherer Prozentsatz an Transkripten gerade in den Versuchen detektiert wurde, in denen die doppelte Menge an fragmentierter cRNA (30 µg statt der empfohlenen 15 µg) für die Hybridisierung der Microarrays eingesetzt wurde. Möglicherweise führt diese Erhöhung der eingesetzten cRNA-Menge tatsächlich dazu, dass schwach exprimierte Gene zuverlässiger detektiert werden können. 4.1.2. Expressionsunterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten ES-Zellen basierend auf den Microarray-Daten Nun soll auf die Zahl der Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-induzierten ESZellen und den ES-Zellen der lacZ-Kontrolle in den jeweiligen Experimenten eingegangen werden, die mit Hilfe der Microarrays detektiert wurden. Nimmt man Wnt1-induzierte und Wnt1-reprimierte Transkripte zusammen, so wurden mit den Mu6500-Arrays (ca. 6500 Gene/ESTs) 31 Expressionsunterschiede detektiert (82 Expressionsunterschiede nach der zweiten Hybridisierung). Die Hybridisierung der Mu19k-Arrays (ca. 19000 Gene/ESTs) und der anschließende Vergleich zwischen Wnt1-Experiment und lacZ-Kontrolle lieferte eine deutlich größere Zahl an differentiell exprimierten Genen. Im ersten Paralleversuch wurden 190 Expressionsunterschiede detektiert, im zweiten Parallelversuch waren es 226. Die MG-U74A-Arrays (ca. 12000 Gene/ESTs) wurden mit cRNA-Proben aus ES-ZellCokulturen nach 10 h bzw. 18 h Cokulturdauer hybridisiert, wiederum getrennt für Wnt1-behandelte ES-Zellen und lacZ-Kontrolle. Der Vergleich der Wnt1- und lacZcRNA-Proben nach 10 h Cokulturdauer lieferte 54 bzw. 23 Expressionsunterschiede in zwei parallelen Versuchen, nach 18 h wurden 37 bzw. 36 differentiell exprimierte Gene gezählt. Dieser Überblick zeigt, dass die Zahl der beobachteten Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen nach der Kontrollbehandlung in allen Experimenten gering war (zwischen 23 und 226), verglichen mit der Zahl der untersuchten Transkripte (zwischen 6500 und 19000). Bildet man einen Mittelwert aus allen Experimenten, so wurden im Schnitt nur 0,66 % der auf den Microarrays repräsentierten Gene bzw. etwa 1,66 % der tatsächlich Seite 124 Diskussion detektierten Gene (bei einer Detektionsrate von 40 %) als differentiell exprimiert erkannt. Wie sind diese Zahlen einzuordnen? Nach Angaben von Affymetrix liegt die zu erwartende Rate an „falsch Positiven“ deutlich unter 0,5 % (Dr. Matthias Prucha, Affymetrix; persönliche Kommunikation), wenn die selbe cRNA-Probe aufgeteilt, anschließend in parallelen Versuchen auf identischen Oligonukleotid-Microarrays analysiert wird, und die Expressionsdaten danach miteinander verglichen werden. Das heißt, wenn keine Expressionsunterschiede vorhanden sind, werden weniger als 0,5 % der repräsentierten Transkripte als differentiell exprimiert angezeigt. Dies wird auch durch Ergebnisse einer Studie zur Reproduzierbarkeit von Microarray-Daten bestätigt (Piper et al., 2002). Diese Betrachtung bestätigt einerseits, dass Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen der lacZ-Kontrolle vorlagen, verdeutlicht aber andererseits, dass die Zahl der detektierten Expressionsunterschiede nicht sehr hoch war. Dieses Ergebnis lässt sich in zwei Richtungen deuten: entweder waren tatsächlich nicht mehr Expressionsunterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten ESZellen vorhanden, oder ein Teil der vorhandenen Expressionsunterschiede konnte mit Hilfe der Microarrays nicht zuverlässig detektiert werden. Beide Aspekte werden in den folgenden Abschnitten diskutiert. An dieser Stelle soll aber noch auf die Ergebnisse hingewiesen werden, die von Willert et al. publiziert wurden (Willert et al., 2002). Diese Arbeitsgruppe verfolgte einen experimentellen Ansatz, der mit dem ES-Zell-Cokultursystem zu vergleichen ist, ebenfalls mit dem Ziel, Wnt-regulierte Gene zu identifizieren. Embryonale Karzinomzellen (EC-Zellen) – pluripotente Zellen mit Eigenschaften, ähnlich derer von ES-Zellen – wurden für einige Stunden in Wnt3a-konditioniertem Medium (Shibamoto et al., 1998) inkubiert. Anschließend wurden cDNA-Microarrays benutzt, um das Genexpressionsprofil dieser Wntinduzierten Zellen mit dem von Kontroll-Zellen zu vergleichen. Von 23000 verschiedenen cDNAs, die auf den benutzten Microarrays repräsentiert waren, zeigten nur etwa 50 einen Expressionsunterschied zwischen EC-Zellen, die mit Wnt3akonditioniertem Medium behandelt wurden, und der Kontrolle (Willert et al., 2002). Der Prozentsatz an differentiell exprimierten Genen war, gemessen an der Gesamtzahl der untersuchten Gene, in diesem Experiment also noch geringer (< 0,25 %), als in den hier dargestellten Versuchen mit dem ES-Zell-Cokultursystem. Offensichtlich bedingt die Art der Versuchsanordnung in beiden Fällen, dass eine große Zahl an differentiell exprimierten Genen gar nicht erwartet werden kann. Seite 125 Diskussion 4.1.3. Ausmaß der Expressionssteigerung Wnt-induzierter Gene im ES-ZellCokultursystem Aus Tab. 3.12 ist zu entnehmen, in welchem Maß die Transkriptmengen der einzelnen Zielgen-Kandidaten nach Wnt1-Stimulation der ES-Zellen im Vergleich zur lacZKontrolle anstiegen. Die Änderungsfaktoren, die mittels quantitativer RT-PCR bestimmt wurden, bewegten sich, bis auf eine Ausnahme, im Bereich zwischen 1,4 und 3,8. Lediglich die Transkriptmenge des Pgrp-Gens stieg nach Wnt1-Stimulation überproportional stark an, nämlich um mehr als das 16-fache. Abbildung 3.3 zeigt, wie die Wnt1-induzierten Expressionsanstiege der 17 Zielgen-Kandidaten verteilt waren. Es wird deutlich, dass die große Mehrzahl der Gene eine Expressionsänderung um weniger als das dreifache erfuhr, bei acht Genen wurde die Transkriptmenge in den ES-Zellen nach Wnt-Stimulation um weniger als das Zweifache erhöht. Zwar können auch subtile Veränderungen des Expressionsniveaus von Genen einen physiologischen Effekt bewirken, insbesondere wenn es sich dabei um regulatorische Gene handelt, es ist jedoch davon auszugehen, dass die mit dem ES-ZellCokultursystem ermittelten Expressionsanstiege den tatsächlichen Anstieg der Transkriptmenge eines Wnt-Zielgens in einer in vivo Situation nicht in jedem Fall korrekt wiedergeben. Dafür gibt es mehrere Gründe. Ein wichtiger Punkt ist, dass die Expressionssteigerung eines Gens als Antwort auf ein Wnt-Signal einem bestimmten zeitlichen Verlauf folgt. Für die einzelnen Zielgen-Kandidaten können sich die Kinetiken der Expressionssteigerungen unterscheiden. Zum Beispiel wird die Aktivierung eines direkten Wnt-Zielgens, dessen Regulation über die Bindung von TCF/β-Catenin Komplexen an funktionelle LEF/TCF-Bindestellen im Promotor erfolgt (s. 1.4.1. u. 1.6.), schneller zu beobachten sein, als der Expressionsanstieg eines indirekten Zielgens, dessen Aktivierung unter Umständen erst die Neusynthese zwischengeschalteter Transkriptionsfaktoren erfordert. Auch die Dauer der Reaktion, also die Zeitspanne, in der eine erhöhte Transkriptmenge für ein bestimmtes Zielgen in der Zelle vorliegt, ist eine variable Größe. Weiter kompliziert wird die Situation durch die Tatsache, dass die in einer Zelle vorhandene Transkriptmenge natürlich nicht nur von der Rate der Transkription abhängt, sondern auch von der Stabilität der mRNA bzw. deren Abbau. Übertragen auf das ES-Zell-Cokultursystem bedeutet dies, dass die Dauer der Cokultur von ES-Zellen und 3T3-Fibroblasten, bzw. der Zeitpunkt der Probenentnahme, großen Einfluss auf das zu erwartende Ergebnis hat. Idealerweise würde man diesem Umstand Rechnung tragen, indem man zu mehreren Seite 126 Diskussion Zeitpunkten das Expressionsprofil der ES-Zellen mit Hilfe der Microarrays bestimmt. Angesichts der hohen Anschaffungskosten, die für die Microarrays anfielen, war dies zunächst jedoch nicht möglich. Zudem war es im Hinblick auf die Auswertung der Ergebnisse auch wünschenswert, die Experimente unter den gleichen Bedingungen mehrfach durchzuführen und, wenn möglich, die Ergebnisse zu reproduzieren. Da die Anschaffungskosten für die Microarrays im Verlauf dieser Arbeit sanken, wurden erst in der letzten Versuchsreihe, die mit den MG-U74A-Arrays durchgeführt wurde, zwei verschiedene Zeitpunkte untersucht. Waren bis dahin sämtliche Expressionsprofile nach 18 h Cokulturdauer ermittelt worden, wurden mit den MG-U74A-Arrays nun zusätzlich ES-Zellen nach 10 h Cokulturdauer analysiert. In jedem Fall stellen die beobachteten Unterschiede zwischen den Transkriptmengen der Zielgen-Kandidaten in Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen aus dem Kontrollexperiment jeweils nur eine Momentaufnahme dar. Dies muss bei der Betrachtung der Ergebnisse natürlich berücksichtigt werden. Die Tatsache, dass in den Wnt1-behandelten ES-Zellen selten Expressionssteigerungen von Wnt-Zielgen-Kandidaten um mehr als das Dreifache erzielt wurden, resultiert sicher auch aus Beschränkungen des ES-Zell-Cokultursystems. Die Luciferase-Reporterversuche, die mit den Promotoren von Axin2 und Follistatin durchgeführt wurden (s. 3.5.2. u. 3.6.2.), ergaben, dass die Aktivität dieser Promotoren durch Stimulation des Wnt/β-Catenin Signalwegs um das 30-fache gesteigert werden kann. Die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR haben jedoch gezeigt, dass die Expression dieser beiden Gene in Wnt1-behandelten ES-Zellen (ESZell-Cokultursystem) lediglich um den Faktor 3,8 (Axin2) bzw. 2,8 (Follistatin) gesteigert wird (s. Tab. 3.12). Geht man davon aus, dass die Promotorfragmente (Axin2 P/I1 bzw. Foll 2,8 kb), die in den Luciferase-Reporterversuchen zum Einsatz kamen, alle Elemente enthalten, um die β-Catenin-vermittelte Regulation der beiden Gene korrekt wiederzugeben, so ist der Grund für die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen aus ES-Zell-Cokultursystem und Luciferase-Reporterversuchen wohl in der unterschiedlich starken Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in ES-Zellen und HEK 293-Zellen zu suchen. Um den Wnt/β-Catenin-Signalweg in den HEK 293Zellen zu aktivieren, wurden TCF1E sowie eine stabilisierte Form von β-Catenin mit Hilfe von Expressionsvektoren in den Zellen überexprimiert (s. 3.5.2.2.). Es ist kaum zu erwarten, dass eine vergleichbare Konzentration an freiem β-Catenin in Cytoplasma und Kern von Zellen durch die Bindung von Wnt-Liganden an seine zellulären Rezeptoren erreicht werden kann. Seite 127 Diskussion Im Falle des ES-Zell-Cokultursystems ist noch ein weiterer Aspekt zu berücksichtigen. Anders als etwa Fibroblasten, bilden ES-Zellen unter Zellkulturbedingungen rundliche Kolonien. Vor dem Aussähen der ES-Zellen in die Transwell-Filter zu Beginn des Cokultur-Experiments (s. Abb. 3.1) wurden die ESZellen zwar vereinzelt, gegen Ende des Experiments, also etwa 24 h nach Aussaat der Zellen (bei einer Cokulturdauer von 18 h), hatten sich durch Teilung der ES-Zellen jedoch bereits wieder kleine Zellkolonien gebildet. Es ist deshalb denkbar, dass nicht alle ES-Zellen gleichermaßen in Kontakt mit den Wnt1-Proteinen kamen, die von den Wnt1-transfizierten 3T3-Fibroblasten in der Zellkulturschale sezerniert wurden. In diesem Fall würde man mit dem ES-Zell-Cokultursystem also eine Mischung von ESZellen betrachten, in denen der Wnt/β-Catenin-Signalweg in unterschiedlichem Maße aktiviert wurde. Entsprechend dürften auch die in den ES-Zellen vorhandenen Transkriptmengen von Wnt-Zielgenen nicht immer in gleichem Maße angestiegen sein – starke Expressionsanstiege in einigen Zellen stünden schwache Expressionsanstiege in anderen Zellen gegenüber. Bei der Lyse der ES-Zellen (zur RNA-Isolation) würden diese Unterschiede verwischt und es käme quasi zu einer „Verdünnung der Wnt-Antwort“. Dies würde auch erklären, warum für die meisten Zielgen-Kandidaten in den Wnt1-behandelten ES-Zellen nur eine relativ geringe Expressionssteigerung ermittelt werden konnte. Der Expressionsanstieg um das 16,8-fache, der für das Pgrp-Gen ermittelt wurde, ist außergewöhnlich, wenn man sich die übrigen Ergebnisse betrachtet. Die Analyse der 5’-flankierenden Sequenzen des Maus-Gens ergab, dass in einem 4,5 kb großen Abschnitt acht LEF/TCF-Bindestellen vorhanden sind (s. Tab. 3.13), was den starken Expressionsanstieg des Gens auf eine Wnt1-Stimulation hin erklären könnte. Das humane Pgrp-Gen, das in der Sequenzdatenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) als orthologes Gen geführt wird, weist ebenfalls zwei LEF/TCF-Bindestellen in der 5’-flankierenden Sequenz auf, die Positionen dieser LEF/TCF-Bindestellen sind aber im Maus-Gen nicht konserviert (s. Tab. 3.13). Die 5’-flankierenden Sequenzen der beiden Gene aus Maus und Mensch zeichnen sich aber generell durch nur geringe Sequenzübereinstimmung aus. Da es sich bei den Pgrp-Genen zudem um eine erst kürzlich entdeckte und wenig erforschte Multigenfamilie handelt, ist nicht ausgeschlossen, dass die beiden verglichenen Genen gar nicht ortholog sind. Seite 128 Diskussion 4.1.4. Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus den Microarray-Experimenten Die Frage nach der Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten umfasst zwei Teilaspekte. Auf der einen Seite steht die Frage nach der Überschneidung der Ergebnisse aus den einzelnen Microarray-Experimenten. Der zweite Teilaspekt befasst sich mit der Vergleichbarkeit der Ergebnisse aus den MicroarrayExperimenten und der quantitativen RT-PCR. Beide Themenkomplexe sollen getrennt voneinander betrachtet werden. 4.1.4.1. Überschneidung der Ergebnisse aus den einzelnen MicroarrayExperimenten Die Versuche mit dem ES-Zell-Cokultursystem wurden in gleicher oder leicht abgeänderter Form mehrfach durchgeführt und anschließend mit den verschiedenen Affymetrix-Microarrays (Mu6500, Mu19k und MG-U74A) ausgewertet (s. Tab. 3.1). Zudem wurden mit den Mu19k-Arrays zwei parallele Versuche mit Wnt1behandelten ES-Zellen ausgewertet (s. Tab. 3.5) und mit den MG-U74A-Arrays je zwei parallele Versuche von Wnt1-Experiment und lacZ-Kontrolle analysiert (s. Tab. 3.7 und 3.8). Diese Redundanz ermöglicht es, die Überschneidung der Ergebnisse aus den einzelnen Experimenten zu überprüfen. Zunächst soll dabei auf die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den erwähnten Parallelversuchen eingegangen werden. Der Vergleich der beiden Wnt1-Experimente, die mit den Mu19k-Arrays ausgewertet wurden, zur entsprechenden lacZ-Kontrolle lieferte übereinstimmende Expressionsunterschiede für insgesamt 46 Gene bzw. ESTs (s. Tab. 3.5). 36 Transkripte waren in beiden Wnt1-Experimenten im Vergleich zur lacZKontrolle induziert, darunter Brachyury, ein Gen dessen Wnt-abhängige Regulation bereits beschrieben wurde (Arnold et al., 2000), 10 weitere Transkripte waren im Vergleich zur lacZ-Kontrolle reprimiert. Den 46 Genen, für die sich in den beiden Wnt1-Experimenten ein übereinstimmendes Bild ergab, stehen 324 Gene gegenüber, die nur in einem der Wnt1-Experimente einen Expressionsunterschied zur lacZKontrolle zeigten. Nimmt man jedes Wnt1-Experiment für sich, so konnten im Schnitt etwa 22,3 % der Expressionsunterschiede im Parallelversuch bestätigt werden. Hierbei ist zu beachten, dass der Bezugspunkt zur Detektion von Expressionsunterschieden für beide Wnt1-Experimente jeweils der gleiche war, da nur ein lacZ-Kontrollexperiment durchgeführt wurde (s. Tab. 3.5). Anders sieht die Situation aus, wenn man die Ergebnisse aus den Parallelversuchen vergleicht, die mit Seite 129 Diskussion den MG-U74A-Arrays analysiert wurden (s. Tab. 3.7 und 3.8). Die beiden Parallelversuche über 10 h Cokulturdauer lieferten nur in einem Fall eine Überschneidung bezüglich der detektierten Expressionsunterschiede, ebenso wie die Parallelversuche über 18 h Cokulturdauer. In beiden Fällen handelte es sich dabei um Cdx1, ein Gen, dessen Wnt-abhängige Regulation bereits beschrieben wurde (Lickert et al., 2000). Bezogen auf die einzelnen Experimente bedeutet dies, dass nur etwa 2,9 % der detektierten Expressionsunterschiede im Parallelversuch bestätigt wurden, ein Wert der deutlich unter dem liegt, der sich für die Mu19k-Arrays ergab. Dabei ist zu beachten, dass im Falle der MG-U74A-Arrays auch die lacZ-Kontrollversuche mehrfach durchgeführt wurden, und deshalb die Wnt1-Experimente zur Detektion von Expressionsunterschieden auch jeweils mit einer anderen lacZ-Kontrolle verglichen wurden, im Gegensatz zur Vorgehensweise bei den Mu19k-Arrays. Was war der Grund für die geringe Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten aus den verschiedenen Paralleversuchen mit dem ES-Zell-Cokultursystem? Ein Problem lag wahrscheinlich darin, dass viele der detektierten Expressionsunterschiede Gene betreffen, die in ES-Zellen nur schwach exprimiert sind. So war die Signalstärke der Transkripte, für die mit den Mu19k-Arrays ein reproduzierbarer Expressionsunterschied zwischen den Wnt1-Experimenten und der lacZ-Kontrolle ermittelt wurde, um ein Mehrfaches niedriger als die durchschnittliche Signalstärke aller auf den Mu19k-Arrays repräsentierten Transkripte (jeweils bezogen auf die Signalstärken im lacZ-Kontrollexperiment, s. auch Tab. 3.5). Ein weiteres Problem wurde in Abschnitt 4.1.3. bereits angesprochen. Die Expressionsunterschiede zwischen Wnt1behandelten ES-Zellen und ES-Zellen des lacZ-Kontrollexperiments (ermittelt durch quantitative RT-PCR) überstiegen, bis auf wenige Ausnahmen, eine dreifache Änderung der Transkriptmenge nicht. Dies war sicher einer der Gründe für die geringe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Der Blick auf einige Publikationen, die sich u.a. mit der Variabilität bzw. Reproduzierbarkeit von Microarray-Daten befassen (Novak et al., 2002; Piper et al., 2002; Schadt et al., 2000), verdeutlicht die Problematik von niedrigem Expressionsniveau einerseits und geringem Expressionsunterschied andererseits. Piper et al. konnten zeigen, dass bei der Verwendung von Affymetrix-Microarrays die Variation des Messwerts für die Signalstärke eines Transkripts bei niedrigen Signalintensitäten stark ansteigt (Piper et al., 2002), eine Beobachtung, die von anderen Autoren bestätigt wurde (Novak et al., 2002). Einzelne Messwerte für schwach exprimierte Gene sind also wenig zuverlässig. Der gleiche Zusammenhang gilt im Wesentlichen für die Bestimmung des Expressionsunterschieds von Genen. Bei geringen Expressionsunterschieden, d.h. Seite 130 Diskussion niedrigen Werten für den Fold Change (s. 2.3.4.), sinkt die Reproduzierbarkeit der Daten beträchtlich (Piper et al., 2002). Auch hier gilt: je kleiner der Wert, desto größer die Messungenauigkeit. Zusätzlich ergeben sich bei schwach exprimierten Genen Probleme bei der Datenauswertung. Bei Genen, die an der Nachweisgrenze des GeneChip-Systems liegen, erweist sich der sog. Absolute Call (s. 2.3.4.) als besonders problematisch. Die für diese Arbeit benutzte Software (Affymetrix Microarray Suite 3.3 und 4.0) trifft anhand der Fluoreszenzdaten für den jeweiligen Probensatz (s. 1.9.) eine absolute Aussage bezüglich der Anwesenheit (Affymetrix: Absolute Call) eines bestimmten Transkripts (s. 2.3.4.). Die in diesem Schritt getroffene Aussage war jeweils mit entscheidend dafür, ob ein potentiell vorhandener Expressionsunterschied (angezeigt durch Fold Change bzw. Difference Call, s. 2.3.4.) zwischen zwei Vergleichsexperimenten berücksichtigt wurde oder nicht. Bei der Datenauswertung galten folgende, von Affymetrix empfohlene Richtlinien: „ein Gen, das in Wnt1-behandelten ES-Zellen nicht detektiert wird, ist auch nicht induziert im Vergleich zum lacZKontrollexperiment“ bzw. „ein Gen, das schon im lacZ-Experiment nicht detektiert wurde, ist in Wnt1-behandelten ES-Zellen auch nicht reprimiert“. Dieser Schritt der Datenfilterung wurde von Affymetrix empfohlen, um die Rate an „falsch Positiven“ (s. 4.1.2.) zu minimieren. Mehrere Benutzer der Affymetrix-Technologie verweisen aber darauf, dass dadurch wichtige Expressionsdaten nicht berücksichtigt werden und stellen deshalb den Nutzen dieses Auswertungsschritts in Frage (Mayanil et al., 2001; Schadt et al., 2000). Es ist durchaus möglich, dass die Überschneidung zwischen den Ergebnissen aus den einzelnen ES-Zell-Cokulturexperimenten größer gewesen wäre, wenn bei der Datenauswertung der Absolute Call nicht berücksichtigt worden wäre. Eine ähnliche Überlegung kann man bezüglich des sog. Difference Call anstellen (s. 2.3.4.). Angesichts dessen, was im oberen Abschnitt besprochen wurde, war nicht zu erwarten, dass die Ergebnisse aus Experimenten, die mit unterschiedlichen Microarrays durchgeführt wurden, sich stark überschneiden. Zum einen kann mit den verschiedenen Microarrays (Mu6500, Mu19k und MG-U74A) ein unterschiedliches Repertoire an Genen nachgewiesen werden, zum anderen unterscheiden sich die Oligonukleotide, mit denen auf den verschiedenen Arrays die gleichen Transkripte detektiert werden sollen, sicher erheblich voneinander. Letzteres hat zwei Gründe: 1) die Mu19k-Arrays wurden vor allem auf der Grundlage der Sequenzdatenbank des TIGR (The Institute for Genomic Research, Rockville, USA) entworfen, die Mu6500- Seite 131 Diskussion und MG-U74A-Arrays auf der Grundlage der UniGene-Datenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA). 2) Quantität und Qualität der verfügbaren Sequenzdaten haben sich in den letzten Jahren dramatisch erhöht, weshalb die Probensätze insbesondere zur Detektion von ESTs von Affymetrix stark modifiziert wurden. Im Falle der MG-U74A-Arrays ist dabei zusätzlich zu berücksichtigen, dass, durch Fehler im Proben-Design seitens des Herstellers, ein gewisser Prozentsatz der Transkripte, die auf dem Chip repräsentiert sein sollten, nicht detektiert werden können. Nach Angaben von Affymetrix sind insgesamt 25 % der auf dem MG-U74A-Array vorhandenen Probensätze auf der Grundlage von zumindest teilweise fehlerhaften Sequenzen entstanden. Bei etwa 10 % der Probensätze ist die Detektion des Transkripts dadurch beeinträchtigt (Dr. Matthias Prucha, Affymetrix; persönliche Kommunikation). Trotz allem wurden die beiden Gene Cdx1 und Pgrp sowohl mit den Mu6500-Arrays als auch den MGU74A-Arrays als Wnt1-reguliert erkannt (s. Tab. 3.12), ein Hinweis darauf, dass die Expressionsunterschiede zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und Zellen des Kontrollexperiments für diese beiden Transkripte besonders deutlich waren. 4.1.4.2. Reproduzierbarkeit der Microarray-Daten mittels quantitativer RT-PCR Die Ergebnisse von insgesamt 52 Genen bzw. ESTs, für die sich in den verschiedenen Microarray-Experimenten ein Expressionsunterschied zwischen Wnt1-behandelten ES-Zellen und lacZ-Kontrolle ergeben hatte (s. Tab. 3.3, 3.4, 3.6, 3.9 und 3.10), wurden mittels quantitativer RT-PCR überprüft (s. 2.3.5.). Für 17 dieser 52 Gene konnte tatsächlich ein Expressionsunterschied bestätigt werden, das entspricht einer Rate von etwa 33 %. Für die restlichen überprüften Gene ergaben sich keine weiteren Hinweise auf eine Beeinflussung der Genexpression durch Wnt-Proteine, d.h. die jeweiligen Transkriptmengen in Wnt1-behandelten ES-Zellen und ES-Zellen des Kontrollexperiments waren ungefähr gleich. Da die Auswahl der getesteten Gene nach dem Ausmaß des Expressionsunterschieds im Microarray-Experiment und zusätzlichen, subjektiven Kriterien erfolgte, ist es unrealistisch, anzunehmen, dass die differentielle Expression aller noch nicht überprüften Gene ebenfalls in einem Drittel der Fälle bestätigt würde. Trotzdem kann man festhalten, dass ein beträchtlicher Anteil der mit den Microarrays ermittelten Expressionsunterschiede aus dem ES-Zell –Cokultursystem in einem unabhängigen Versuch (s. 2.3.5.) und durch eine andere Quantifizierungsmethode reproduziert werden konnte. Diese Tatsache relativiert die Seite 132 Diskussion mangelnde Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den einzelnen MicroarrayExperimenten, die in Abschnitt 4.1.4.1. diskutiert wurde. Die Überprüfung für die 17 Zielgen-Kandidaten ergab allerdings auch, dass das Ausmaß des tatsächlich vorhandenen Expressionsunterschieds (ermittelt über quantitative RT-PCR), durch die vorangegangenen Microarray-Experimente nicht sehr zuverlässig vorhergesagt wurde. Nur in sechs Fällen (Crbp1, Dmrt1, Ebf1, Follistatin, Tgfb2, Troy) ergab sich eine annähernde Übereinstimmung zwischen den Änderungsfaktoren, die mit den beiden Analysemethoden ermittelt wurden. In fast allen anderen Fällen war der tatsächlich vorhandene Expressionsunterschied deutlich geringer, als es der mit Hilfe des GeneChip-Systems ermittelte Änderungsfaktor (Fold Change) erwarten ließ. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass es sich bei einem Großteil der Änderungsfaktoren aus dem Microarray-Experiment um Schätzwerte handelte (s. 2.3.4.). An dieser Stelle soll ein weiterer wichtiger Punkt erwähnt werden. Der Anstieg der Transkriptmenge für ein bestimmtes Gen hat nicht automatisch die verstärkte Neusynthese des entsprechenden Proteins in der Zelle zur Folge, da auch die Translation von mRNA-Molekülen in vielen Fällen einer Regulation unterliegt. Einer Schätzung zufolge führt der Anstieg in der Transkriptmenge eines Gens nur in etwa 50 % der Fälle auch zu einer gesteigerten Proteinexpression (Chuaqui et al., 2002). 4.2. Viele der neu identifizierten Zielgen-Kandidaten haben eine regulatorische Funktion Abschnitt 3.3. kann man eine funktionelle Klassifizierung sowie jeweils eine genauere Beschreibung der 17 Zielgen-Kandidaten entnehmen, für die sich in der quantitativen RT-PCR ein Expressionsunterschied bestätigen ließ. Die meisten der 17 Gene codieren für Proteine, die an der Regulation von zellulären Signalwegen beteiligt sind, oder als Transkriptionsfaktoren direkt die Expression anderer Gene beeinflussen. Unabhängig davon, ob es sich bei den regulierten Genen um direkte oder indirekte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs handelt, wird eines erneut deutlich. Die Aktivierung eines bestimmten zellulären Signalwegs hat sehr oft Auswirkungen auf die Aktivität anderer Signalwege, d.h. es findet eine gegenseitige Beeinflussung der verschiedenen Signalaktivitäten innerhalb einer Zelle statt. Über die Regulation von Igfbp3 (s. 3.3.2.) beeinflusst der Wnt-Signalweg möglicherweise den IGF-Signalweg. Eine Wechselwirkung zwischen diesen Signalwegen wurde bereits in anderem Zusammenhang beobachtet. In ZellkulturSeite 133 Diskussion Experimenten wurde gezeigt, dass 3T3-L1 Präadipocyten durch ektopische Expression von Wnt1 zur Produktion der Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II angeregt werden (Longo et al., 2002). In Xenopus-Reporterstudien wurde zudem gezeigt, dass die Überexpression von IGF-I die Zielgen-Aktivierung durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg inhibiert (Richard-Parpaillon et al., 2002). Die Wntabhängige Regulation von Crbp1 (s. 3.3.2.) hat unter Umständen Auswirkungen auf den Retinoid-Stoffwechsel und somit vielleicht auch auf Retinsäure-gesteuerte Prozesse. Die funktionelle Interaktion von Wnt-Faktoren und Retinsäure bei der anterio-posterioren Musterbildung des Neuroektoderms ist bereits bekannt (Kudoh et al., 2002; Maden, 2002). Zudem wurde beobachtet, dass die neuronale Differenzierung von P19 Embryonalen Karzinomzellen (P19 EC) ebenfalls durch beide Signalwege aktiviert wird (McBurney et al., 1982; Tang et al., 2002). Von besonderem Interesse ist jedoch, dass gleich zwei der 17 Zielgen-Kandidaten, Follistatin und Tgfβ2, auf eine enge Verbindung zwischen Wnt/β-Catenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg hinweisen. In den Promotorsequenzen dieser beiden Gene wurde jeweils eine LEF/TCF-Bindestelle gefunden, die zwischen Maus und Mensch konserviert ist (s. Tab. 3.13). Dies deutet darauf hin, dass beide Gene möglicherweise direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs sind, was für Follistatin im weiteren Verlauf dieser Arbeit auch gezeigt werden konnte (s. Abschnitt 3.6.). Die Entstehung des Spemann-Organisators in Xenopus-Embryonen wurde in der Einleitung bereits besprochen (s. 1.5.1.) und ist ein Beispiel für einen biologischen Prozess, der von Wnt/β-Catenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg synergistisch gesteuert wird (Nishita et al., 2000; Watabe et al., 1995). Bei der Diskussion der Ergebnisse für Follistatin wird auf die Interaktion zwischen diesen beiden Signalwegen noch einmal eingegangen. Die Hinweise auf die Wechselwirkung zwischen Wnt/β-Catenin-Signalweg und anderen zellulären Kommunikationswegen, die sich aus den ES-ZellCokulturexperimente ergaben, wurden bereits angesprochen. Mindestens ebenso interessant ist aber die Tatsache, dass Axin2 in der Liste der Zielgen-Kandidaten auftaucht. Axin2 (bzw. Axin) ist als zentrales Element des β-CateninDegradationskomplexes (s. 1.4.1.) an der Regulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs beteiligt (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998; Ikeda et al., 1998). Da Axin2 negativ regulierend auf den Wnt/β-Catenin-Signalweg einwirkt, liegt die Existenz einer sogenannten negativen Rückkoppelungsschleife (negative feedback loop), wie sie in vielen Regulationsvorgängen vorkommt (Freeman, 2000), auch bei diesem WntSignalweg nahe. In den folgenden Abschnitten werden die weiteren Ergebnisse, die Seite 134 Diskussion sich bei der Untersuchung des Axin2-Gens im Verlauf dieser Arbeit ergaben, diskutiert und mit bereits veröffentlichten Ergebnissen anderer Autoren verglichen. 4.3. Axin2 ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs Die Untersuchungen zur Axin2-Expression haben deutlich gemacht, dass dieses Gen während der Embryonalentwicklung gewebespezifisch exprimiert wird und die Expression von Axin2 zum Teil mit der von verschiedenen Wnt-Genen überlappt (s. 3.5.3.1.). Eine Analyse der DNA-Sequenzen ergab, dass in einem 3,6 kb großen Sequenzabschnitt des Maus Axin2-Gens insgesamt sieben LEF/TCF-Bindestellen vorhanden sind, von denen fünf im menschlichen Genom konserviert sind (s.3.5.1.). Die Luciferase-Reporterversuche mit dieser Axin2 Promotor / Intron 1-Region (Ax2 P/I1) haben gezeigt, dass dieser Sequenzabschnitt die TCF/β-Catenin-abhängige Expressionssteuerung des Axin2-Gens vermitteln kann. Durch Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs konnte die Expression des Luciferase-Gens unter Kontrolle von Ax2 P/I1 in HEK 293-Zellen um fast das 30-fache gesteigert werden. Durch ortsgerichtete Mutagenese konnte zudem gezeigt werden, dass die Regulation über mehrere LEF/TCF-Bindestellen in diesem Sequenzabschnitt erfolgt (s. Abschnitt 3.5.2.). Nach Mutagenese aller LEF/TCF-Bindestellen in dem Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-Luc war in HEK 293-Zellen nur noch eine schwache Expressionssteigerung des Luciferase-Gens nach Stimulation des Wnt/β-CateninSignalwegs zu beobachten (s. Abb. 3.6). Axin2 ist also ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs. Diese Ergebnisse stimmen im Wesentlichen mit kürzlich veröffentlichten Daten einer anderen Arbeitsgruppe überein (Jho et al., 2002). Auch diese Autoren haben die Expression des Maus Axin2-Gens während der Embryonalentwicklung genauer untersucht und fanden das gleiche gewebespezifische Expressionsmuster wie in Abb. 3.7. Zudem konnten sie die Axin2-Expression in Darm, Lunge und Niere von Embryonen am Tag 14,5 p.c. nachweisen. Sie fanden auch, dass nach Stimulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in C57MG-Zellen die Axin2-Expression ansteigt, und zwar sowohl auf Transkript- als auch auf Proteinebene. Die Funktionalität der LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region wurde von diesen Autoren in Luciferase-Reporterversuchen ebenfalls nachgewiesen. Zusätzlich konnte die spezifische Bindung von Proteinen aus dem Kernextrakt von 293T-Zellen an eine der LEF/TCF-Bindestellen gezeigt werden. Jho et al. postulieren zwar eine negative Regulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs durch Axin2, geben aber keine Hinweise Seite 135 Diskussion auf eine mögliche in vivo Funktion dieser Regulation (Jho et al., 2002). In zwei weiteren Publikationen (Leung et al., 2002; Lustig et al., 2002) wurde zwar gezeigt, dass in einer Reihe von Tumoren und Tumorzelllinien (v.a. aus Colonkarzinomen) die Axin2-Expression stark hochreguliert ist, dies ist aber eher Ausdruck einer gesteigerten Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalwegs in diesen Zellen (s. 1.5.3.), als ein Hinweis auf eine biologische Funktion der negativen Rückkoppelung über Axin2. Viele Colonkarzinome zeichnen sich ohnehin durch Mutationen im APC-Gen aus, die die Funktionalität des β-Catenin-Degradationskomplexes beeinträchtigen. In diesen Zellen kann Axin2 seine regulatorische Wirkung als zentrales Element des β-CateninDegradationskomplexes also gar nicht entfalten (Leung et al., 2002). 4.4. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg steuert die Axin2-Expression im präsomitischen Mesoderm und im dorsalen Neuralrohr Die Analyse von vestigial tail Embryonen ergab, dass der Verlust der Wnt3aExpression in der Schwanzknospe dieser Mutanten den Verlust der Axin2-Expression im posterioren Bereich des Embryos zur Folge hatte (s. 3.5.3.2.). Dies deutete darauf hin, dass Axin2 in der Schwanzknospe von Wnt3a aktiviert wird, war also ein erster in vivo Hinweis auf eine Wnt-abhängige Steuerung der Axin2-Expression während der Embryonalentwicklung. Die ektopische Axin2-Expression in der MittelhirnHinterhirn-Region und in den Somiten von β−Catenin Exon 3 floxed / +/ En1 Cre k.i. / +-Mäusen war ein weiterer in vivo Hinweis darauf, dass Axin2 ein Zielgen des Wnt/β-CateninSignalwegs ist (s. 3.5.3.3.). Die Untersuchung transgener Mäuse, die das β-Galaktosidase-Reportergen unter der Kontrolle der intakten bzw. mutierten Axin2 Promotor / Intron 1-Region exprimierten (s. Abschnitt 3.5.4.), sollte klären, in welchen Geweben die Axin2-Expression über den Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert wird. Dadurch sollten sich auch weitere Hinweise auf die biologische Bedeutung der Axin2-vermittelten Negativregulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ergeben. Zunächst konnte gezeigt werden, dass, zumindest in 9,0 - 9,5 Tage alten Embryonen, die Gewebespezifität der βGalaktosidase-Expression im Wesentlichen der des endogenen Axin2-Gens entsprach, wenn das Reportergen unter der Kontrolle der Wildtyp-Sequenz von Ax2 P/I1 exprimiert wurde. Die meisten der transgenen Embryonen zeigten eine deutliche Blaufärbung in der dorsalen Hälfte des Neuralrohrs (auch im Gehirn), in weiteren mesenchymalen und ektodermalen Zellen der gesamten dorsalen Region, in der Schwanzknospe, dem präsomitischen Mesoderm und in der vorderen Seite 136 Diskussion Gliedmaßenknospe, sowie eine schwächere Färbung in den Kiemenbögen und in den Somiten (s. 3.5.4.1. u. Abb. 3.10). In Abschnitt 3.5.4.1. wurde bereits angesprochen, dass die X-Gal Färbung in den dorsalen Bereichen und in den Somiten der transgenen Embryonen ausgedehnter bzw. stärker ausgeprägt war, als die endogene Axin2Expression (vgl. Abb. 3.7) in den gleichen Strukturen. Dabei muss jedoch berücksichtigt werden, dass bei der X-Gal Färbung das Protein β-Galaktosidase nachgewiesen wurde, während bei der in situ Hybridisierung die Axin2-mRNA detektiert wurde. Während es sich bei dem Enzym β-Galaktosidase um ein recht stabiles Protein handelt (Trainor et al., 1999), gibt es Hinweise darauf, dass das Axin2-Transkript einem schnellen Abbau unterliegt (Aulehla et al., 2003). Dies würde den deutlichen Unterschied in der Intensität der in X-Gal-Reaktion und in situ Hybridisierung erzielten Färbungen erklären. Im Übrigen handelte es sich bei den mesenchymalen Zellen in der dorsalen Embryohälfte, die β-Galaktosidase-Aktivität aufwiesen (s. Abb. 3.10), vielleicht zum Teil um wandernde Neuralleistenzellen, was die Ausbreitung der Blaufärbung ebenfalls erklären könnte. Die von dem üblichen Muster abweichende Färbung nur im zentralen Bereich der Schwanzknospe, die bei zwei Embryonen beobachtet wurde, ist wahrscheinlich durch Positionseffekte zu erklären, d.h. durch die Beeinflussung der Transgen-Expression durch dem Integrationsort benachbarte DNA-Abschnitte. Dass solche Einflüsse existieren, wurde schon bald nach der Einführung der transgenen Technologie erkannt (Gordon et al., 1980; Palmiter und Brinster, 1986). Meist wirken diese Positionseffekte hemmend auf die Transgen-Expression, d.h. das Transgen wird nicht oder nur schwach exprimiert (Palmiter und Brinster, 1986). Dies war bei der Untersuchung der transgenen Embryonen, die im Verlauf dieser Arbeit generiert wurden, auch zu beobachten. So wurde bei der Genotypisierung der Embryonen, die mit dem Konstrukt Ax2 P/I1-lacZ injiziert worden waren, das lacZ-Transgen in 23 Embryonen nachgewiesen. Nur bei 18 Embryonen konnte jedoch die Expression der β-Galaktosidase in den 9,5 Tage alten Embryonen nachgewiesen werden, bei einigen dieser 18 Embryonen war das Transgen nur schwach exprimiert (s. 3.5.4.1.). Positionseffekte können jedoch auch zu einer verstärkten oder ektopischen Expression des Transgens im Organismus führen (Palmiter und Brinster, 1986). Der Einfluss von Positionseffekten auf die Transgen-Expression zeigte sich erneut bei den transgenen Embryonen, die das Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ enthielten. Die Reportergen-Expression war zwischen den einzelnen Transgenen zum Teil recht unterschiedlich, was durch die verschiedenen Färbungsmuster dokumentiert wird (s. 3.5.4.2. und Abb. 3.11). Trotzdem wurde deutlich, dass die Mutagenese der Seite 137 Diskussion LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region deutliche Auswirkungen auf die Gewebespezifität der β-Galaktosidase-Expression in den transgenen Embryonen (s. 3.5.4.2.) hatte. In 16 von 17 transgenen Embryonen, die das Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ enthielten, war eine Blaufärbung dorsaler Zellen außerhalb des Neuralrohrs in der Mittelhirn-Hinterhirn-Region zu beobachten. Die dorsalen Strukturen im Rumpf der Embryonen zeigten dagegen keine β-Galaktosidase-Expression, im Gegensatz zur Situation in den Embryonen, die das Wildtyp-Reporterkonstrukt enthielten (s.o.). Auch die Blaufärbung im dorsalen Neuralrohr, in der Schwanzknospe und dem präsomitischen Mesoderm sowie in den Somiten konnte in keinem der Embryonen, die das Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ enthielten, beobachtet werden. In den Embryonen, die das WildtypKonstrukt enthielten, waren diese Strukturen dagegen fast immer angefärbt. Im Gegensatz dazu war die β-Galaktosidase-Expression in den Kiemenbögen und in den Gliedmaßenknospen zumindest bei einigen der Embryonen erhalten, die das Transgen unter der Kontrolle der mutierten Axin2 Promotor / Intron 1-Region exprimierten (s. Abb. 3.10). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Axin2-Expression zumindest im dorsalen Neuralrohr sowie in der Schwanzknospe und dem präsomitischen Mesoderm durch die LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region gesteuert wird. In diesen embryonalen Strukturen kann die Axin2-mRNA durch in situ Hybridisierung eindeutig nachgewiesen werden und die β-Galaktosidase-Aktivität geht durch die Mutation der LEF/TCF-Bindestellen in Ax2 P/I1 1-7 mut-lacZ verloren. Durch die Versuche mit den vestigial tail Mäusen (s. 3.5.3.2.) konnte zudem gezeigt werden, dass die Steuerung der Axin2-Expression im Bereich von Schwanzknospe und präsomitischem Mesoderm über Wnt3a erfolgt. Die Überlappung der Expression von Wnt1 (Shackleford und Varmus, 1987; Wilkinson et al., 1987) und Wnt3a (Roelink und Nusse, 1991) mit der von Axin2 im dorsalen Neuralrohr weist darauf hin, dass in dieser Struktur Axin2 möglicherweise über Wnt1 und Wnt3a reguliert wird. Auch in den Somiten ist das endogene Axin2-Gen schwach exprimiert (Aulehla et al., 2003), und die β-Galaktosidase-Aktivität ist abhängig von funktionellen LEF/TCFBindestellen im Reporterkonstrukt Ax2 P/I1-lacZ. Die Axin2-Expression wird deshalb vielleicht auch in den Somiten von Wnt-Liganden beeinflusst, z.B. von Wnt1, Wnt4, Wnt6 oder Wnt 7a, die in benachbarten Geweben exprimiert werden (Parr et al., 1993; Tajbakhsh et al., 1998). Die Versuche mit den β−Catenin Exon 3 floxed / + / En1 Cre k.i. / + - Mäusen (s. 3.5.3.3.) haben schließlich gezeigt, dass Axin2 in den Somiten durch den Wnt/β-Catenin-Signalwegs aktiviert werden kann. Andererseits könnte die βSeite 138 Diskussion Galaktosidase-Aktivität in den Somiten der Mäuse, die mit dem Ax2 P/I1-lacZ Konstrukt hergestellt wurden, auch von einer früheren Expression des lacZReportergens in Schwanzknospe bzw. präsomitischen Mesoderm herrühren, aus denen die Somiten hervorgehen. Ähnlich ist die Situation in den dorsalen Zellen außerhalb des Neuralrohrs einzuschätzen, in denen die lacZ-Reporteraktivität von funktionellen LEF/TCF-Bindestellen abhängig ist. Da die Reporteraktivität in dieser Region nicht streng mit der endogenen Axin2-Expression korreliert (s.o.), findet die TCF-abhängige Regulation der Axin2-Expression hier wahrscheinlich zu einem früheren Zeitpunkt in Vorläuferzellen statt. Eine wichtige Schlussfolgerung ergibt sich noch aus der Tatsache, dass in den transgenen Embryonen, die mit dem mutierten Reporterkonstrukt Ax2 P/I1 1-7 mutlacZ hergestellt wurden, immer noch eine β-Galaktosidase-Aktivität u.a. in der Kopfregion, den Kiemenbögen und in den Gliedmaßenknospen vorhanden ist. Dies zeigt, dass die Axin2-Expression nicht ausschließlich über den Wnt/β-CateninSignalweg aktiviert wird. Offensichtlich sind auch andere Signalwege an der Steuerung dieses Gens beteiligt. 4.5. Mögliche Funktion einer negativen Rückkopplung des Wnt/ β-Catenin-Signalwegs über Axin2 im präsomitischen Mesoderm Die Arbeitsgruppe von Bernhard Herrmann (MPI für Immunbiologie) machte im Rahmen eines Screens für Gene, die spezifisch in der Schwanzknospe bzw. im präsomitischen Mesoderm von 9,5 Tage alten Embryonen exprimiert sind, eine interessante Beobachtung. Die Expression von Axin2 in diesen posterioren Strukturen ist nicht konstant, sondern sie oszilliert mit einer Periode von etwa 120 Minuten zwischen sehr schwacher und starker Expression (Aulehla et al., 2003). Diese Beobachtung und die oben bereits diskutierten Ergebnisse, die zeigen, dass die Axin2Expression in der Schwanzknospe und dem präsomitischen Mesoderm vom Wnt/βCatenin-Signalweg gesteuert wird, waren der Ausgangspunkt für eine Reihe weiterer Experimente. Aulehla et al. fanden heraus, dass Wnt3a wahrscheinlich ein wichtiges Element der molekularen Uhr bei der Somitogenese ist. In ihrem Modell einer solchen molekularen Uhr spielt die negative Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalweg über Axin2 eine zentrale Rolle (Aulehla et al., 2003). Seite 139 Diskussion 4.6. Andere Mechanismen der negativen Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs Neben der Wnt-abhängigen Regulation von Axin2 gibt es noch andere Mechanismen, die möglicherweise eine Art negative Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs bewirken. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass Tcf1 ein direktes Zielgen des Wnt/βCatenin-Signalwegs ist (Roose et al., 1999). Einige der durch alternatives Splicen generierten Isoformen dieses Transkriptionsfaktors besitzen keine β-CateninInteraktionsdomäne (Van de Wetering et al., 1996) und wirken deshalb als Repressoren des Wnt/β-Catenin-Signalwegs. Roose et al. konnten zeigen, dass im Darm von Tcf1-defizienten Mäusen vermehrt polypenartige Wucherungen auftreten und es darüber hinaus zur Bildung von Tumoren in den Brustdrüsen der Tiere kommt (Roose et al., 1999). Dieser Tumor-Phänotyp wurde noch verstärkt, wenn in den Tieren ein Allel des APC-Gens (Polakis, 2000) defekt war. Die Synergy der Phänotypen von Tcf1 und APC weist eindeutig auf eine reprimierende Wirkung des Tcf1-Proteins auf den Wnt/β-Catenin-Signalweg in diesen Geweben hin. Ein weiterer Mechanismus, über den sich der Wnt/β-Catenin-Signalweg selbst regulieren kann, beinhaltet das Protein β-TrCP (Spiegelman et al., 2000). Dieses bindet an phosphoryliertes β-Catenin und führt es der Ubiquitinierung und dem anschließenden Abbau im Proteasom zu (s. 1.4.1.) (Jiang und Struhl, 1998; Marikawa und Elinson, 1998). Über einen posttranskriptionalen Regulationsmechanismus wird β-TrCP nach Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs induziert und damit der Abbau von βCatenin beschleunigt (Spiegelman et al., 2000). Die Wnt-abhängige Regulation von Axin2 ist also nur einer von mehreren Mechanismen, welche die negative Rückkopplung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs bewirken. 4.7. Follistatin ist ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs Das Protein Follistatin wurde ursprünglich im Zusammenhang mit der Regulation der FSH-Sekretion der Hypophyse beschrieben (Robertson et al., 1987; Ying et al., 1987). Die Entdeckung, dass Follistatin spezifisch an Activin bindet und dessen Funktion beeinflusst (Nakamura et al., 1990), war ein erster Anhaltspunkt dafür, dass Follistatin weitere Funktionen besitzt, da bekannt war, dass Activin bei vielen biologischen Prozessen eine Rolle spielt. Später wurde gezeigt, dass Follistatin auch mit verschiedenen BMP-Signalmolekülen interagiert und deren Bindung an zelluläre Rezeptoren moduliert (Amthor et al., 2002; Fainsod et al., 1997). Die Untersuchung Seite 140 Diskussion der Follistatin-Expression in Maus (Albano et al., 1994; Feijen et al., 1994), Xenopus (Hemmati-Brivanlou et al., 1994) und anderen Modellorganismen ergab ein komplexes Expressionsmuster (s. Abschnitt 3.6.3.). Besonders interessant ist dabei die Expression in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung. In der Xenopus-Blastula ist Follistatin im Spemann-Organisator exprimiert (Hemmati-Brivanlou et al., 1994), in 6,5 bis 7,5 Tage alten Mausembryonen im Primitivstreifen (Albano et al., 1994). Da auch gezeigt wurde, dass in diesen frühen embryonalen Strukturen der Wnt/βCatenin-Signalweg aktiviert ist (Liu et al., 1999; Moon und Kimelman, 1998), lag die Vermutung nahe, dass Follistatin während der frühen Embronalentwicklung durch diesen Signalweg reguliert wird. Dies war mit ein Grund, warum von den 17 ZielgenKandidaten, die mit dem ES-Zell-Cokultursystem identifiziert worden waren (s. Tab. 3.12), neben Axin2 auch Follistatin näher untersucht wurde. Die Sequenzanalyse des Maus Follistatin-Promotors ergab, dass in einem 4 kb großen Abschnitt sieben LEF/TCF-Bindestellen vorhanden sind, von denen allerdings nur eine im menschlichen Promotor konserviert ist (s. Tab. 3.13 und Abb. 3.12). Die Ergebnisse der Luciferase-Reporterversuche, die mit den verschiedenen FollistatinPromotorkonstrukten durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass die Aktivität des Follistatin-Promotors vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert wird. Durch Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs konnte die Expression des LuciferaseGens unter Kontrolle des Follistatin–Promotors in HEK 293-Zellen um das bis zu 30fache gesteigert werden (s. Abschnitt 3.6.2.). Die Untersuchung von Deletionskonstrukten des Follistatin-Promotors deutete darauf hin, dass u.a. die LEF/TCF-Bindestelle 3, die zwischen Maus und Mensch konserviert ist, für die Wntabhängige Regulation verantwortlich ist. Die ortsgerichtete Mutagenese der LEF/TCF-Bindestellen zeigte jedoch, dass nur die LEF/TCF-Bindestelle 1 für die Wnt-Regulation des Maus Follistatin-Promotors essentiell ist. Nach Mutagenese dieser LEF/TCF-Bindestelle in dem Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1 mut-Luc war in HEK 293-Zellen eine deutlich schwächere Expressionssteigerung des LuciferaseGens nach Stimulation des Wnt/β-Catenin-Signalwegs zu beobachten, als mit dem Wildtyp-Konstrukt Foll 2,8 kb-Luc. Eine schwache Aktivierbarkeit des FollistatinPromotors durch β-Catenin S33A und TCF1E blieb auch erhalten, wenn alle weiteren LEF/TCF-Bindestellen in diesem Fragment mutiert waren (s. Abb. 3.15). Diese Ergebnisse zeigen, dass Follistatin ein direktes Zielgen des Wnt/β-CateninSignalwegs ist. Die immer noch vorhandene, wenn auch stark abgeschwächte, Wnt/βCatenin-Aktivierbarkeit des mutierten Follistatin-Promotors weist aber auch darauf hin, dass ein Teil der Wnt-Regulation möglicherweise nicht durch TCF-Faktoren Seite 141 Diskussion vermittelt wird, sondern über andere Transkriptionsfaktoren erfolgt. In diesem Zusammenhang ist interessant, dass sich auf dem Maus Follistatin-Promotor in der Nähe der LEF/TCF-Bindestelle 1 eine potentielle Bindestelle für den T-Box Transkriptionsfaktor Brachyury findet (de Groot et al., 2000). Brachyury ist selbst ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs (Arnold et al., 2000; Yamaguchi et al., 1999b) und ist in der frühen Embryonalentwicklung teilweise mit Follistatin copexprimiert, etwa am Tag 7,5 p.c. im Primitivstreifen (Albano et al., 1994; Clements et al., 1996). Möglicherweise ist Brachyury über die Bindung an den Follistatin-Promotor ebenfalls an der Wnt-abhängigen Regulation von Follistatin beteiligt. Die Tatsache, dass die direkte Wnt/β-Catenin-Regulation des Follistatin-Gens über die LEF/TCF-Bindestelle 1 erfolgt, überrascht, da diese LEF/TCF-Bindestelle im menschlichen Gen nicht vorhanden ist. Eine Analyse der Follistatin-Gensequenzen aus Ratte und Schwein zeigt jedoch, dass die LEF/TCF-Bindestelle 1 in diesen beiden Organismen ebenso vorhanden ist, wie bei der Maus. In anderen Organismen ist dieser Sequenzabschnitt also durchaus evolutionär konserviert. Im Übrigen haben Willert et al. Follistatin kürzlich ebenfalls als direktes Zielgen des Wnt/β-CateninSignalwegs identifiziert und die Funktionalität der LEF/TCF-Bindestelle 1 im Follistatin-Promotor der Ratte nachgewiesen (Willert et al., 2002). 4.8. Das Promotorfragment Foll 2,8 kb enthält nicht alle Elemente, die an der Regulation der Follistatin-Expression beteiligt sind Die Untersuchung des 2,8 kb Follistatin-Promotors in Luciferase-Reporterversuchen hat gezeigt, dass dieses Promotorfragment die Expression des Luciferase-Gens in HEK 293-Zellen in Abhängigkeit vom Wnt/β-Catenin-Signalweg steuern kann. Die Generierung von transgenen Mauslinien mit dem Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb-lacZ sollte klären, ob dieses Promtorfragment in der Lage ist, das komplexe zeitlichräumliche Muster der Follistatin-Expression während der Embryonalentwicklung (s. 3.6.3.) zu gewährleisten. Die einzelnen transgenen Mauslinien zeigten nur teilweise übereinstimmende Transgen-Expression, wahrscheinlich aufgrund von Positionseffekten (s. 3.6.4.1.). Trotzdem ergab sich ein deutliches Bild bezüglich der Eigenschaften des 2,8 kb Follistatin-Promotors. Die X-Gal-Färbung der transgenen Embryonen in den verschiedenen Entwicklungsstadien zeigte, dass die β-Galaktosidase-Expression unter der Kontrolle von Foll 2,8 kb nur teilweise der endogenen Follistatin-Expression entsprach (s. Seite 142 Diskussion 3.6.4.1.). In frühen Entwicklungsstadien war das lacZ-Reportergen entweder nicht exprimiert (Tag 7,5 - 8,5 p.c.), oder das Expressionsmuster zeigte keine Ähnlichkeit mit der endogenen Follistatin-Expression (Tag 9,5 p.c.). Erst ab Tag 10,5 p.c. bzw. 11,5 p.c. wurde die β-Galaktosidase in mehreren Mauslinien mit übereinstimmender Gewebespezifität exprimiert. Die Transgen-Expression überlappte ab diesem Zeitpunkt überwiegend mit der Expression des endogenen Follistatin-Gens. Vor allem Muskelvorläuferzellen zeigten eine starke β-Galaktosidase-Expression. Trotzdem zeigten in den späteren Entwicklungsstadien auch nicht alle Gewebe eine Blaufärbung, in denen Follistatin exprimiert wird, etwa das Innenohr, die Zunge und die mesenchymalen Zellen, die an das Riechepithel angrenzen. Was lässt sich aus diesen Ergebnissen schließen? Offenbar sind in dem 2,8 kb Follistatin-Promotor nicht alle cis-regulatorischen Elemente vorhanden, die notwendig sind, um die Expression des Gens in den frühen Stadien der Embryonalentwicklung, etwa an Tag 7,5 p.c. im Primitivstreifen, zu steuern. Die spätere Expression des Follistatin-Gens wird von dem Promotorfragment auch nur teilweise wiedergegeben, was ebenfalls darauf hindeutet, dass cis-regulatorische Elemente fehlen. 4.9. Die Expression von Follistatin in Schnurrhaarfollikeln ist wahrscheinlich abhängig vom Wnt/β-Catenin-Signalweg Die Ergebnisse, die im obigen Abschnitt diskutiert wurden, machen bereits deutlich, dass die Frage, ob die Follistatin-Expression im Primitivstreifen von Mausembryonen vom Wnt/β-Catenin-Signalweg beeinflusst wird, durch die weitere Analyse des 2,8 kb Follistatin-Promotors nicht beantwortet werden kann. Dieses Promotorfragment reicht nicht aus, um die Follistatin-Expression während der frühen Embryonalentwicklung zu steuern. Das bedeutet jedoch keineswegs, dass die cis-regulatorischen Elemente, die in dem 2,8 kb Follistatin-Promotor vorhanden sind, wie etwa die LEF/TCFBindestellen, nicht an der Regulation der frühen Follistatin-Expression beteiligt sind. Klar ist lediglich, dass die vorhandenen cis-regulatorischen Elemente alleine nicht dafür ausreichen. Trotz dieser Beschränkungen wurden transgene Embryonen generiert, die das Reporterkonstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ mit den mutierten LEF/TCF-Bindestellen enthielten (s. 3.6.4.2.). Die Analyse dieser transgenen Embryonen sollte klären, ob der Wnt/β-Catenin-Signalweg an der Steuerung der Follistatin-Expression ab Tag 10,5 der Embryonalentwicklung beteiligt ist. Es zeigte sich, dass die Mutation der Seite 143 Diskussion LEF/TCF-Bindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor keine gravierenden Auswirkungen auf die β-Galaktosidase-Expression in transgenen Embryonen zwischen Tag 10,5 und Tag 14,5 der Entwicklung hatte (vgl. Abb. 3.20 u. 3.23). Die Expressionsmuster, die mit dem Wildtyp- bzw. mutierten Promotor erzielt wurden, waren annähernd gleich, allein die β-Galaktosidase-Expression in den Schnurrhaarfollikeln konnte bei den Embryonen, die das Konstrukt Foll 2,8 kb 1-4 mut-lacZ enthielten, nicht mehr beobachtet werden. Da die Transgen-Expression in den Schnurrhaarfollikeln der Embryonen mit dem Wildtyp-Reporterkonstrukt ebenfalls variierte (s. Abb. 3.19) und die Zahl der jeweils untersuchten transgenen Linien nicht sehr groß war, ist nicht eindeutig geklärt, ob LEF/TCF-Faktoren tatsächlich an der Regulation von Follistatin in den Schnurrhaarfollikeln beteiligt sind. Dass der Wnt/β-Catenin-Signalweg bei der Entwicklung von Haarfollikeln eine wichtige Rolle spielt, zeigt u.a. der Phänotyp von Lef1-defizienten Mäusen, die weder Schnurrhaare noch Körperhaare besitzen. (van Genderen et al., 1994). LEF1 aber auch TCF3 (Kratochwil et al., 1996; van Genderen et al., 1994) (DasGupta und Fuchs, 1999) sind in Haarfollikeln exprimiert, ebenso wie β-Catenin (Ridanpaa et al., 2001) und Wnt3 (Millar et al., 1999). Entsprechend konnte gezeigt werden, dass ein künstliches Promotorkonstrukt (TOPGAL-Reporterkonstrukt), das in 5’-Richtung eines c-fos Minimalpromotors drei LEF/TCF-Bindestellen besitzt, in Haarfollikeln die Expression des lacZ-Reportergens aktivieren kann (DasGupta und Fuchs, 1999). Es ist also durchaus denkbar, dass Follistatin in Haarfollikeln ein direktes Zielgen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs ist. Die Aufgabe von Follistatin in Haarfollikeln besteht wahrscheinlich darin, die Funktion von BMP2, BMP4 und/oder Activin A zu beeinflussen, die ebenfalls während der Entwicklung der Haarfollikel exprimiert werden (Jones et al., 1991; Laurikkala et al., 2002; Lyons et al., 1990). Dass Follistatin eine wichtige Rolle bei der Morphogenese der Haarfollikel spielt, zeigen die Defekte in den Schnurrhaaren und die retardierte Entwicklung der Körperhaarfollikel in Follistatin-defizienten Mäusen (Matzuk et al., 1995; Nakamura et al., 2003). Die Entwicklung von Haaren zeigt viele Gemeinsamkeiten mit der Entwicklung anderer epidermaler Fortsätze, wie z. B. Zähnen, und erfordert die Integration einer Vielzahl von Signalaktivitäten (Fuchs et al., 2001; Jernvall und Thesleff, 2000; Millar, 2002). Die Wnt-abhängige Regulation von Follistatin ist vielleicht einer der molekularen Mechanismen, die an der Integration von Wnt/βCatenin-Signalweg und TGFβ-Signalweg während dieser Entwicklungsprozesse beteiligt sind. Seite 144 Diskussion 4.10. Hinweise auf eine Regulation von Follistatin durch den TGFβ-Signalweg Die Expression von Follistatin in Schnurrhaarfollikeln ist wahrscheinlich abhängig vom Wnt/β-Catenin-Signalweg. Die Reportergenexpression in den anderen Geweben wird durch die Mutation der LEF/TCF-Bindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor jedoch nicht beeinflusst. Deshalb stellt sich die Frage, durch welche anderen Faktoren die Follistatin-Expression während der Embryonalentwicklung gesteuert wird. Es wurde bereits erwähnt, dass sich im Follistatin-Promotor eine potentielle Bindestelle für den Transkriptionsfaktor Brachyury befindet (de Groot et al., 2000). Die Analyse des Follistatin-Promotors, die von de Groot et al. durchgeführt wurde, ergab zusätzlich Hinweise auf weitere Transkriptionsfaktorbindestellen, z.B. für AP-1, AP2, und CREB. Von besonderem Interesse ist jedoch, dass auch mehrere potentielle Bindestellen für Smad-Proteine gefunden wurden (de Groot et al., 2000). SmadProteine sind für die Signalleitung des TGFβ-Signalwegs von der Zelloberfläche in den Kern verantwortlich (Massague und Wotton, 2000) und binden an die Promotoren von Zielgenen dieses Signalwegs. Die Funktionalität dieser Bindestellen wurde bisher jedoch noch nicht gezeigt. 4.11. Ein Ausblick Durch die nähere Untersuchung der Wnt-abhängigen Genregulation von Axin2 und Follistatin konnte gezeigt werden, dass beide Gene direkt über LEF/TCF-Bindestellen in den jeweiligen Promotoren vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert werden. Aus den Analysen der transgenen Mäuse ergaben sich zudem wichtige Hinweise darauf, in welchem biologischen Kontext die Wnt-abhängige Regulation der beiden Gene jeweils von Bedeutung ist. Im Falle von Follistatin bleibt zu klären, ob der Wnt/βCatenin-Signalweg an der Regulation des Gens während der frühen Embryonalentwicklung beteiligt ist. Neben Axin2 und Follistatin wurden weitere 15 Gene identifiziert, deren Expression in ES-Zellen durch Wnt1-Stimulation erhöht war (s. Tab. 3.12). Dabei handelt es sich hauptsächlich um Gene, die für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine codieren (s. 3.3.). Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob es sich dabei tatsächlich um Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs handelt und ob die Regulation auch hier direkt über LEF/TCF-Bindestellen erfolgt. Das Hauptaugenmerk sollte sich dabei auf diejenigen Zielgen-Kandidaten richten, für die konservierte Seite 145 Diskussion LEF/TCF-Bindestellen in den 5’-Sequenzen der orthologen Gene von Maus und Mensch identifiziert wurden (s. Tab. 3.13). Dies war bei Hmga2, Ndr2, Nrp2, Pim1, Sprr2a und Tgfβ2 der Fall. Zusätzlich müssen die Expression und biologische Funktion dieser Gene genauer auf mögliche Überschneidungen mit Wnt-Genen bzw. Genen für LEF/TCF-Faktoren überprüft werden. Dadurch sollten sich weitere Hinweise für die Relevanz der verschiedenen Zielgen-Kandidaten ergeben. Seite 146 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Der Wnt/β-Catenin-Signalweg ist an der Steuerung vieler Entwicklungsprozesse während der Embryonalentwicklung beteiligt. Die zentrale Komponente des Signalwegs ist das Protein β-Catenin, das zusammen mit LEF/TCFTranskriptionsfaktoren Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs aktiviert. Zu Beginn dieser Arbeit waren nur wenige Zielgene dieses Signalwegs bekannt. Ziel der Arbeit war deshalb die Identifizierung von neuen Zielgenen des Wnt/β-Catenin-Signalwegs. Grundlage für die Suche nach Wnt-Zielgenen war das ES-Zell-Cokultursystem. Das Prinzip des ES-Zell-Cokultursystems liegt in der Wnt-Stimulation von ES-Zellen durch die gemeinsame Kultivierung mit Wnt-sezernierenden Fibroblasten. Mit Hilfe verschiedener Oligonukleotid-Microarrays wurden Genexpressionsprofile von Wntstimulierten ES-Zellen und ES-Zellen aus Kontrollexperimenten erstellt. Durch den Vergleich der Genexpressionsprofile und die anschließende Überprüfung der Ergebnisse durch quantitative RT-PCR wurden 17 Zielgen-Kandidaten identifiziert, deren Expression in Wnt-stimulierten ES-Zellen gesteigert war, darunter Axin2 und Follistatin. Axin2 ist als zentrale Komponente des β-Catenin-Degradationskomplexes an der Steuerung des Wnt/β-Catenin-Signalwegs beteiligt. Follistatin bindet an Signalmoleküle der TGFβ-Superfamilie und moduliert so deren Bindung an zelluläre Rezeptoren. Weitere Gene, für die eine Wnt-abhängige Expressionssteigerung in ESZellen nachgewiesen wurde, codieren für Transkriptionsfaktoren oder für Proteine, die auf verschiedene Weise Einfluss auf zelluläre Signalwege nehmen können. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Axin2 und Follistatin direkte Zielgene des Wnt/β-Catenin-Signalwegs sind. Durch die Charakterisierung von 5’-regulatorischen Sequenzen dieser beiden Gene in vitro mittels LuciferaseReporterversuchen wurden jeweils funktionelle LEF/TCF-Bindestellen identifiziert, die eine TCF/β-Catenin-abhängige Regulation von Axin2 bzw. Follistatin ermöglichen. Für Axin2 konnte die Funktionalität dieser LEF/TCF-Bindestellen auch in vivo gezeigt werden. Es wurden transgene Embryonen generiert, die das lacZ-Reportergen unter der Kontrolle der Axin2 Promotor / Intron 1-Region exprimierten. Die Analyse der transgenen Embryonen (E 9,5 d.p.c.) ergab zunächst, dass dieser 3,6 kb große Seite 147 Zusammenfassung Sequenzabschnitt ausreicht, um in dem untersuchten Entwicklungsstadium das endogene Expressionsmuster des Axin2-Gens korrekt wiederzugeben. Das gezielte Ausschalten der LEF/TCF-Bindestellen in der Axin2 Promotor / Intron 1-Region führte zu einem Verlust der Transgen-Expression im dorsalen Neuralrohr, in der Schwanzknospe und im präsomitischen Mesoderm. In diesen Strukturen wird die Axin2-Expression offenbar vom Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert. Durch die Untersuchung von Mäusen, die eine spontane Mutation im Wnt3a-Gen aufweisen (vestigial tail Mäuse), konnte zudem gezeigt werden, dass die Axin2-Expression in Schwanzknospe und präsomitischem Mesoderm von Wnt3a reguliert wird. Die in vivo Charakterisierung des 2,8 kb Follistatin-Promotors mit Hilfe von transgenen Mäusen ergab, dass in diesem Sequenzabschnitt nicht alle cisregulatorischen Elemente vorhanden sind, die für die Steuerung der FollistatinExpression in frühen Stadien der Embryonalentwicklung (E 7,5 – 9,5 d.p.c.) benötigt werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass der untersuchte Promotorabschnitt die Expression von Follistatin während späterer Entwicklungsstadien, z. B. in Muskelvorläuferzellen, steuern kann. Die Follistatin-Expression zwischen Tag 11,5 und 14,5 der Embryonalentwicklung hängt in den meisten Geweben nicht von den LEF/TCFBindestellen im 2,8 kb Follistatin-Promotor ab. In den Schnurrhaarfollikeln wird die Follistatin-Expression jedoch wahrscheinlich durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg gesteuert. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob die Follistatin-Expression in anderen Stadien der Embryonalentwicklung oder postnatal vom Wnt/β-CateninSignalweg beeinflusst wird. 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DIG DMEM DMSO DNA DNase dNTP dpc dsDNA Dsh DTT EC-Zellen Katalognummer Grad Celsius Micro Ohm Doppelmutante für das Gen X Defekt in einem Allel des Gens X mutierte LEF/TCF-Bindestelle Ampère Abbildung absolut Antikörper „Adenomatous Polyposis Coli“-Gen / Protein „American Type Culture Collection“ Adenosintriphosphat Trypsin-Lösung (s. 2.4.1.) Axin2 Promotor / Intron 1-Region „basepair“ (Basenpaar) Brachyury (T-Box Gen) „bovine serum albumine“ (Rinderserumalbumin) bezüglich beziehungsweise centi circa „copy“ DNA (Komplementäre DNA) „Caudal-related homeobox gene 1“ Curie Casein-Kinase „counts per minute“ (radioaktive Zerfälle pro Minute) „copy“ RNA aus in vitro Transkription (s. 2.3.2.) Cytidintriphosphat Desoxycytidintriphosphat bidestilliertes Wasser Diethylpyrocarbonat das heißt Digoxygenin „Dulbecco’s modified Eagle’s medium“ Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonuklease Desoxyribonukleotidtriphosphat „days post coitum“ doppelsträngige DNA Dishevelled Dithiothreitol embryonale Karzinomzellen Seite 165 Anhang EDTA EGTA EMFIs EST ES-Zellen et al. EtBr EtOH F FCS Foll x kb g Gapdh GBP GFP GSK-3β h HEPES I IgG inkl. IVT k kb k.i. l LB Medium LEF LIF LRP m M MI min MM mRNA mut MW NC NCBI Neo OD PBS pc PCR PM RNA RNase rpm RT s s. s. o. Ethylendiamintetraessigsäure Ethylenglykol-bis(β-Aminoethylether)tetraessigsäure Primäre embryonale Fibroblastenzellen „expressed sequence tag“ embryonale Stammzellen et altera (und andere) Ethidiumbromid Ethanol Farad „fetal calf serum“ (Fötales Kälberserum) Follistatin-Promotorfragment Erdbeschleunigung Gen für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase GSK3β-Bindeprotein Grünfluoreszierendes Protein Glykogen-Synthase Kinase-3β Stunde N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethanolsulfonsäure „Increase“ (s. 2.3.4.) Immunglobulin G (Antikörper-Klasse) inklusive in vitro Transkription kilo „kilobases“ (Kilobasen) „knock in“ Liter „Luria Broth“ (Nährmedium) „lymphoid enhancer binding factor“ „leukaemia inhibitory factor“ LDL-Rezeptor verwandtes Protein milli Molar „Marginal Increase“ (s. 2.3.4.) Minute, minütig „Mismatch“ „messenger RNA“ (Boten-RNA) mutiert Molekulargewicht „No change“ (s. 2.3.4.) „National Center for Biotechnology Information“ Neomycin (-Resistenzgen) Optische Dichte „phosphate buffered saline“ (Phosphatgepufferte Salzlösung) post coitum „polymerase chain reaction“ (Polymerasekettenreaktion) „Perfect Match“ Ribonukleinsäure Ribonuklease „rotations per minute“ (Umdrehungen pro Minute) Raumtemperatur Sekunden siehe siehe oben Seite 166 Anhang s. u. SDS Tab. TCF TIGR Tris tRNA Tss U u. a. Ub ü. N. UTP UV V v. a. Vergr. vgl. vt v/v w/v Wnt wt X-Gal z. B. siehe unten „sodium dodecylsulphate“ (Natriumdodecylsulfat) Tabelle „T-cell factor“ „The Institute for Genomic Research“ Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan „transfer RNA“ Transkript-Signalstärke „unit“ (Einheit) unter anderem Ubiquitin über Nacht Uraciltriphosphat ultraviolett Volt vor allem Vergrößerung vergleiche vestigial tail (Mutation im Maus Wnt3a-Gen) Volumenprozent Gewichtsprozent Aus Wingless und Int (Integration) Wildtyp 5-Bromo-4-Chloro-β-D-Galactopyranosid zum Beispiel Seite 167 Anhang Veröffentlichungen Aulehla, A., Wehrle, C., Brand-Saberi, B., Kemler, R., Gossler, A., Kanzler, B. und Herrmann, B.G. (2003) Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Dev Cell, 4, 395-406. Kortenjann, M., Wehrle, C., Nehls, M.C. und Boehm, T. (2001) Only one nemo-like kinase gene homologue in invertebrate and mammalian genomes. Gene, 278, 161-165. Lickert, H., Domon, C., Huls, G., Wehrle, C., Duluc, I., Clevers, H., Meyer, B.I., Freund, J.N. und Kemler, R. (2000) Wnt/(beta)-catenin signaling regulates the expression of the homeobox gene Cdx1 in embryonic intestine. Development, 127, 3805-3813. Seite 168 Anhang Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Besonders möchte ich mich bei Herrn Dr. habil. Rolf Kemler für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die gewährte Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und die fortwährende Diskussionsbereitschaft bedanken. Bernhard Herrmann und Alexander Aulehla danke ich für die Bereitstellung der Axin2-cDNA sowie der vestigial tail Mäuse. Veronique Brault stellte die En1-Cre knock in- und β-Catenin Exon 3 floxed-Mäuse zur Verfügung. Christine Mummery danke ich für die Überlassung des Follistatin-Promotors. Ein Dankeschön geht an Thomas Schlake und Conrad Bleul für die Beantwortung vieler Fragen bei der Durchführung der Microarray-Experimente. Mein besonderer Dank gilt den Mitarbeitern des Transgenen Service, Benoit Kanzler, Elsa Huber und Laurent Morawiec, für die Generierung der transgenen Mäuse. Ebenso möchte ich mich bei den Tierpflegern des Mausstalls bedanken. Ein herzliches Dankeschön an alle Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Kemler für die vielen kleinen Ratschläge und Hilfen und die angenehme Arbeitsatmosphäre. Besonders danke ich Heiko Lickert, Sebastian Arnold, Jörg Stappert und Andreas Rolke für die Starthilfe am Anfang meiner Doktorarbeit. Auch Veronique Brault, Marc Stemmler, Andreas Hecht, Kati Hansen und Steffi Kutsch standen mir oft mit Rat und Tat zur Seite, ebenso wie viele andere. Dirk Junghans danke ich für das Korrekturlesen der Arbeit. Zum Schluss ein besonderer Dank an meine Lieben. Meiner Freundin Petra danke ich für die immerwährende Aufmunterung in schwierigen Phasen und für die Schaffung einer wunderbaren Parallelwelt, in der missglückte Experimente keine Bedeutung haben. Meinen lieben Eltern danke ich ganz herzlich für ihre große Unterstützung in allen Phasen meines Lebens und meinen Freunden danke ich für ihr Verständnis in den Wochen des Zusammenschreibens. Seite 169 Anhang Lebenslauf Name: Christian Wehrle Geburtsdatum: 11.01.1972 Geburtsort: Herbolzheim Wohnort: Gartenstr. 23, 79365 Rheinhausen Schulausbildung 1978 – 1982 Grundschule Oberhausen 1982 – 1991 Gymnasium Kenzingen, Abschluss: Abitur Zivildienst 1991 – 1992 Zivildienst beim Bund für Umwelt- und Naturschutz e.V., Ortsgruppe Ettenheim Akademische Ausbildung 1992 – 1994 Studium der Biologie an der Justus-Liebig-Universität Giessen bis zum Vordiplom 1994 – 1999 Fortsetzung des Biologie-Studiums an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg und an der University of Leeds, England (6-monatiges ERASMUS-Stipendium) 1999 Abschluss des Biologie-Studiums mit dem Diplom. Diplomarbeit am Institut für Biologie II der Albert-LudwigsUniversität Freiburg, Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Eberhard Schäfer). Thema der Diplomarbeit: „Charakterisierung eines GCN4-komplementierenden Proteins aus Arabidopsis thaliana“ 1999 - 2003 Doktorarbeit am Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Abteilung Molekulare Embryologie (Dr. habil. Rolf Kemler). Thema der Doktorarbeit: „Wnt/β-Catenin-Zielgene in der Maus-Entwicklung“ Seite 170