Wirksamkeitsnachweis einer neuen liposomalen Gemcitabin

Aus der
Chirurgischen Universitätsklinik
Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie
der Albert-Ludwigs Universität Freiburg i.Br.
Wirksamkeitsnachweis einer neuen liposomalen
Gemcitabin-Formulierung auf humane Pankreaskarzinome
durch Biolumineszenz-Imaging
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs Universität
Freiburg i.Br.
Vorgelegt 2007
von Christian Bornmann
geboren in Ilmenau
2
Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Dekan
: Prof. Dr. med. Ch. Peters
1. Gutachter
: Priv.-Doz. Dr. med. T. Keck
2. Gutachter
: Prof. Dr. med. C. Unger
Jahr der Promotion : 2007
3
1. EINLEITUNG ...................................................................................... 5
1.1. BEDEUTUNG VON KREBSERKRANKUNGEN UND PANKREASKARZINOMEN ............................... 5
1.2. TIERMODELLE IN DER ONKOLOGIE ........................................................................................... 6
1.3. ORTHOTOPE TIERMODELLE ― TRANSPARENT DURCH IN VIVO-IMAGING ............................... 7
1.3.2. LUCIFERASE ............................................................................................................................. 7
1.4. ANWENDUNG IM THERAPIEVERSUCH ....................................................................................... 8
1.4.1. GEMCITABIN ............................................................................................................................ 9
1.4.2. VESIKULÄRE PHOSHOLIPIDGELE (VPG) UND GEMLIP ....................................................... 10
2. ZIEL DER STUDIE .............................................................................. 11
3. MATERIAL UND METHODEN............................................................. 12
3.1. CHEMOTHERAPEUTIKA ............................................................................................................ 12
3.2. VERSUCHSTIERE UND TIERHALTUNG ..................................................................................... 12
3.2.1. ART DER VERSUCHSTIERE .................................................................................................... 12
3.2.2. HALTUNG DER VERSUCHSTIERE .......................................................................................... 13
3.3. TUMORZELLLINIEN UND ZELLKULTUR ................................................................................... 14
3.3.1 URSPRUNGSZELLLINIEN ........................................................................................................ 14
3.3.1.1. MIA PaCa-2 ....................................................................................................................... 14
3.3.1.2. AsPC-1................................................................................................................................ 14
3.3.2. INITIIEREN DER ZELLKULTUR .............................................................................................. 15
3.3.3. MEDIUMWECHSEL UND SUBKULTIVIERUNG DER TUMORZELLEN ..................................... 15
3.3.4. KRYOKONSERVIERUNG DER TUMORZELLEN ....................................................................... 16
3.3.5. LUCIFERASE-TRANSDUZIERTE ZELLLINIEN......................................................................... 17
3.3.5.1. Transduktion der Zellen durch retroviralen Gentransfer .......................................... 17
3.3.5.2. Luciferase-Assay von Zellkulturen................................................................................ 18
3.4. ETABLIERUNG DER SUBKUTANEN XENOGRAFTS .................................................................... 18
3.4.1. AUFBEREITUNG DER ZELLSUSPENSION ZUR IMPLANTATION.............................................. 18
3.4.2. SUBKUTANE IMPLANTATION DER TUMORZELLEN .............................................................. 18
3.5. ETABLIERUNG DER ORTHOTOPEN MAUSMODELLE ................................................................ 19
3.5.1. GEWINNUNG DER TUMORFRAGMENTE ................................................................................ 19
3.5.2. ANÄSTHESIE UND BEATMUNG .............................................................................................. 19
3.5.3. IMPLANTATION DER TUMORFRAGMENTE ............................................................................ 20
3.6. IN VIVO-IMAGING ― BILDGEBUNG IM BIO-LUMINESZENZ-IMAGING-ASSAY ....................... 21
3.6.1. DATENERHEBUNG IM CCD-KAMERASYSTEM ...................................................................... 21
3.6.2. QUANTIFIZIERUNG DER LICHTEMISSION DER TUMOREN .................................................. 22
3.7. THERAPIESTUDIE GEMLIP VS. GEMCITABIN ........................................................................... 24
3.7.1. EINTEILUNG DER THERAPIEGRUPPEN DURCH BLI ............................................................. 24
3.7.2. APPLIKATION UND DOSIERUNG ........................................................................................... 25
3.8. TIERETHIK UND ABBRUCHKRITERIEN .................................................................................... 26
3.9. NEKROPSIE ............................................................................................................................... 27
3.9.1. SUBKUTANES MODELL .......................................................................................................... 27
3.9.2. ORTHOTOPES MODELL ......................................................................................................... 27
3.9.3. LUCIFERASE-ASSAY VON ORGANEN ..................................................................................... 28
3.10. HISTOLOGIE ........................................................................................................................... 29
3.10.1. HERSTELLEN DER KRYOSCHNITTE ..................................................................................... 29
3.10.2. HÄMALAUN-EOSIN (HE)-FÄRBUNG VON GEFRIERSCHNITTEN ....................................... 29
3.10.3. PANZYTOKERATIN-(1-8)-FÄRBUNG VON KRYOSCHNITTEN .............................................. 30
4
4. ERGEBNISSE.................................................................................... 32
4.1. GENERIERUNG DER LUCIFERASE-EXPRIMIERENDEN ZELLLINIEN ........................................ 32
4.2. GENERIERUNG DER SPENDERTUMOREN AUS SUBKUTANEN XENOGRAFTS .......................... 33
4.2.1. DIE SUBKUTANEN MIA PACA-2-XENOGRAFTS ................................................................... 34
4.2.2. DIE SUBKUTANEN ASPC-1-XENOGRAFTS ............................................................................ 36
4.3. GENERIERUNG DER ORTHOTOPEN XENOGRAFTMODELLE .................................................... 38
4.3.1. DAS ORTHOTOPE XENOGRAFTMODELL MIA PACA-2 /ELN............................................... 38
4.3.1.1. Die parentale MIA PaCa-2 Gruppe ................................................................................ 38
4.3.1.2. MIA PaCa-2 ELN-Gruppe............................................................................................... 39
4.3.2. DAS ORTHOTOPE MODELL ASPC-1 LN................................................................................ 44
4.4. THERAPIESTUDIE GEMLIP VS. GEMCITABIN .......................................................................... 46
4.4.1. IN VITRO-WIRKSAMKEIT, TOXIZITÄT UND DOSISFINDUNG ................................................ 46
4.4.2. GRUPPIERUNG UND VERLAUFSMONITORING ...................................................................... 48
4.5. THERAPIE-EFFEKTE AUF DIE PRIMÄRTUMOREN – ENDPUNKTANALYSE .............................. 51
4.6. THERAPIE-EFFEKTE AUF DIE METASTASIERUNG – ENDPUNKTANALYSE ............................. 53
4.7. HISTOLOGISCHE AUFARBEITUNG ............................................................................................ 56
5. DISKUSSION .................................................................................... 59
5.1. KURZZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 59
5.2. DISKUSSION DER METHODIK .................................................................................................. 59
5.2.1. MODELL DES EXPERIMENTELLEN PANKREAS-KARZINOMS ................................................ 59
5.2.1.1. Subkutane Tumormodelle............................................................................................... 60
5.2.1.2. Orthotope Tumormodelle............................................................................................... 62
5.2.1.3. In vivo-Imaging im Tiermodell ...................................................................................... 63
5.2.1.4. GFP und Luziferase ......................................................................................................... 65
5.2.1.5. Nekropsie .......................................................................................................................... 67
5.2.1.6. Gemcitabin, VPG und GemLip....................................................................................... 67
5.3. DISKUSSION DER ERGEBNISSE ................................................................................................ 71
5.3.1. LUCIFERASE-MARKIERTE TUMORMODELLE ........................................................................ 71
5.3.1.1. Subkutane Xenografts...................................................................................................... 71
5.3.1.2. Orthotope Xenografts im in vivo-Imaging ................................................................... 73
5.3.2. THERAPIESTUDIE GEMLIP VS. GEMCITABIN ....................................................................... 74
5.3.2.1. Primärtumore ................................................................................................................... 75
5.3.2.2. Metastasen........................................................................................................................ 75
5.4. AUSBLICK UND KLINISCHE BEDEUTUNG DER ERGEBNISSE ................................................... 76
6. REFERENZEN .................................................................................. 78
7. ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................... 91
8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................. 92
9. DANKSAGUNG ................................................................................. 93
10. CURRICULUM VITAE....................................................................... 96
11. VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONGRESSBEITRÄGE ......................... 98
5
1. Einleitung
1.1. Bedeutung von Krebserkrankungen und Pankreaskarzinomen
Weltweit erkranken jährlich mehr als 11 Millionen Menschen an Krebs. Bis
2020 ist zu erwarten, dass diese Zahl auf über 16 Millionen steigen wird. Jedes
Jahr sterben 7 Millionen an malignen Entartungen [1]. Das entspricht einem Achtel
aller Todesfälle [2]. In Deutschland werden zurzeit jährlich 390.000 neue Fälle von
Krebserkrankungen
Menschen
an
diagnostiziert
Krebs.
In
der
und
jährlich
versterben
demoskopischen
etwa
Entwicklung
210.000
werden
die
Krebserkrankungen in wenigen Jahren die zurzeit noch an erster Stelle geführten
Kreislauf- und Gefäßerkrankungen ablösen.
Den Malignomen der Bauchspeicheldrüse kommt dabei eine nicht
unerhebliche Bedeutung zu. Bei lediglich 2 - 4 % der Inzidenzen aller Krebsneuerkrankungen zeichnen die Pankreaskarzinome in der westlichen Welt für bis
zu 6 % aller Krebstodesfälle verantwortlich und sind somit die vierthäufigste
Krebstodesursache bei Frauen und fünfthäufigste bei Männern [3].
Bei
Diagnosestellung
einer
bösartigen
Neoplasie
im
Bereich
der
Bauchspeicheldrüse beträgt die Fünfjahresüberlebensrate (5 - JÜR) bereits nur
noch zwischen maximal 1 und 5 %. An dieser Tatsache hat sich in den letzten drei
Dekaden nichts Grundlegendes geändert.
Den bislang einzigen kurativen Ansatz stellen die gegenwärtig verfügbaren
operativen Maßnahmen mit eventuell anschließender adjuvanter Chemotherapie
dar. Hierzu zählen die Pankreaskopf-Resektion nach Kausch-Whipple
[4,5]
und
deren Modifikationen (z.B. PPPD – pyloruserhaltende Pankreaskopf-Resektion),
sowie die Pankreas-Linksresektion und die totale Pankreatektomie [6].
Das absolute Ziel dieser Operationen besteht in der R0-Resektion, dem
Erreichen histologisch gesicherter Tumorfreiheit an allen Absetzungsrändern mit
definiertem Sicherheitsabstand zwischen gesundem und Tumorgewebe, ohne
Nachweis einer verbleibenden Metastasierung.
Dieses Ziel kann zum Zeitpunkt der Erstdiagnose nur noch bei etwa 20 %
der Patienten verfolgt werden. Trotz beachtlicher Erfolge durch chirurgischen
6
Fortschritt bleibt die Datenlage kurativer Therapieerfolge nach wie vor auf kleine
Fallzahlen beschränkt. Eine Verbesserung der Langzeitüberlebensraten kann nur
durch neue, multimodale Therapiekonzepte erfolgen [7,8].
Einen weiteren essentiellen Bestandteil entsprechender Regimes stellt
neben den chirurgischen Optionen der Einsatz von Chemotherapeutika dar. Seit
der Zulassung zur Therapie von Pankreas-Karzinomen im Jahre 1996
[9]
ist
Gemcitabin die zentrale Substanz gängiger Chemotherapieprotokolle. Im Vergleich
zu bis dahin angewandten Standards konnten durch Gemcitabin allein oder in
Kombinationstherapie signifikante Steigerungen des Überlebens und der
Lebensqualität [10,11] erzielt werden.
Doch die Spanne der für den Patienten hinzugewonnenen Zeit bewegt sich
im Bereich von wenigen Wochen bis einigen Monaten. Folglich fehlen für das
Pankreaskarzinom durchschlagende kurative, adjuvante und neoadjuvante
Therapiekonzepte.
Die neuentwickelte liposomale Gemcitabin-Formulierung soll nun anhand
eines ebenfalls neuartigen in vivo-Imaging-Tiermodelles darauf überprüft werden,
ob sie einen Beitrag zur Verbesserung dieser Situation zu leisten vermag.
1.2. Tiermodelle in der Onkologie
Für die Entwicklung neuer antitumoraler Strategien sind gute in vivo
Tumormodelle unerlässlich. Wünschenswerte Eigenschaften kliniknaher Modelle
sind
unter
anderem
physiologisch-anatomische
Relevanz,
gute
Reproduzierbarkeit, Standardisierung und hohe Flexibilität bei möglichst
ökonomischem Kosten- und Zeitaufwand und nicht zuletzt eine möglichst
schonende, artgerechte Einbindung der Versuchstierart.
Zur
Simulation
des
exokrinen,
meist
duktalen
humanen
Pankreaskarzinomes wurden in den vergangenen Jahren verschiedenste Strategien
entwickelt [12-14], wie in Tab. 3, Kap. 5.2.1.1. aufgeführt.
Im vorliegenden Projekt sollten die humanen Pankreaskarzinom-Zelllinien
MIA PaCa-2 und AsPC-1 in immunsuffizienten Mäusen als Tumorfragmente
7
orthotop in das Zielorgan Bauchspeicheldrüse implantiert werden, um die
Erkrankung möglichst realitätsnah im Modell abbilden zu können.
1.3. Orthotope Tiermodelle ― transparent durch In vivo-Imaging
Intraabdominal, direkt im Pankreas wachsende Tumore entziehen sich
aufgrund der Modellstruktur besonders in der Anfangsphase der Experimente
einfachen
Beurteilungsmethoden,
zum
Beispiel
der
Verifizierung
des
Implantationserfolges oder der Wachstumsmessung, die bei subkutanen Tumoren
vergleichsweise leicht durchführbar sind.
So ist es für orthotope Modelle sinnvoll, eine Methode zur Verfügung zu
haben, welche diese und weitere Informationen am lebenden Tier enthüllen kann.
Dementsprechend sollte im Projekt ein System zur Bildgebung in vivo
(nachfolgend als in vivo-Imaging bezeichnet) integriert werden. Aus der Vielfalt
der zur Verfügung stehenden Methoden (Tab. 4, Kapitel 5.2.1.4.) wurde ein auf der
Emission von Licht basierendes Verfahren ausgewählt. Auf der Grundlage des, hier
stark vereinfacht dargestellten, Biochemismus:
Luciferase + Luciferin + ATP = Licht
sollten die nach außen nicht sichtbaren Tumore optisch detektierbar gemacht
werden.
1.3.2. Luciferase
Unter Luciferasen versteht man diverse, im Aufbau unterschiedliche
Enzyme verschiedener Tierarten
[15],
die diese Spezies zur Biolumineszenz
befähigen. In der Gegenwart von ATP und molekularem Sauerstoff setzen diese
Enzyme unter Emission von Lichtquanten spezielle heterocyklische Carboxylate,
sogenannte Luciferine, um (Fig. 1). Dieser Biochemismus ist schon vor einigen
Jahrzehnten entschlüsselt worden [16-20].
8
Fig. 1 – Strukturformel des verwendeten D-Luciferins.
Wissenschaftlich wird das Luciferase-Luciferin-System auch dazu genutzt,
um ATP-abhängige Prozesse zu beobachten und zu quantifizieren
[21-23]
oder das
Aktivieren oder Inaktivieren von Genen zu verfolgen, was beispielweise mit den
klassischen „Reporter-Assays“ möglich ist [24].
Um die orthotop wachsenden Tumore dem in vivo-Imaging zugänglich zu
machen, sollte die genetische Information zur Synthese des Enzyms Luciferase
dauerhaft in das Genom der Tumorzellen integriert werden.
1.4. Anwendung im Therapieversuch
Zur Verifizierung der Leistungsfähigkeit des Tumormodelles sollte nach
dessen Etablierung ein Therapieversuch mit einer am Pankreas-Karzinom noch
nicht
getesteten
liposomalen
Gemcitabin-Formulierung
(Arbeitsgruppe
U.
Massing, KTB Freiburg) angeschlossen werden. In dieser Formulierung wird das
freie Gemcitabin in einem vesikulären Phospholipidgel (VPG) eingeschlossen,
wodurch die Freisetzung protrahiert und die Anreicherung im Tumorgewebe
verbessert werden soll.
9
1.4.1. Gemcitabin
Momentan ist Gemcitabin (Fig. 2) die zentrale Komponente der
Chemotherapie der Wahl für Pankreaskarzinome dar
[25].
Verglichen mit dem
Standardzytostatikum 5-FU werden durch den Einsatz der Substanz signifikante
Anhebungen von Überleben und Lebensqualität der betroffenen Patienten erreicht
[26].
Angesichts der hohen in vitro-Sensitivität vieler Pankreaskarzinomzelllinien
auf konventionelles Gemcitabin
[27,28]
verwundert die eher begrenzte in vivo
Aktivität. Eine Möglichkeit zur Steigerung der Effektivität des Gemcitabins besteht
in der Verbesserung der Bioverfügbarkeit der Substanz.
Fig. 2 – Endogen vorkommendes Desoxycytidin (links) und das durch Substitution
mit zwei Fluoratomen an der C-2´-Position des Desoxyribofuranosylringes
generierte Gemcitabin (rechts) – nach Lilly®.
10
1.4.2. Vesikuläre Phosholipidgele (VPG) und GemLip
VPGs sind dicht gepackte liposomale Bläschen im Nanometer-Bereich Die
einzelnen Partikel bestehen unilamellaren Phospholipid-Sphären. Der strukturelle
Aufbau der Gele ermöglicht die Speicherung Gemcitabin an sich ist in vitro ein
sehr unstabiles Molekül mit einer Plasmahalbwertszeit von 8-17 Minuten. Durch
die Verkapselung des Compounds in VPGs konnte eine Stabilisierung des
Gemcitabins durch Schutz vor der schnellen enzymatischen Inaktivierung und
somit eine Verlängerung der Plasmahalbwertszeit auf bis zu 13 Stunden erreicht
werden [29].
Außerdem sollte durch den von Matsumura und Maeda erstbeschriebenen,
sogenannten EPR-Effekt (Enhanced Permeability and Retention) eine passive
Anreicherung der Substanz in Tumor und Metastasen
sowie eine verbesserte
Vertäglichkeit ermöglicht werden [30,31].
Anhand des neuentwickelten orthotopen Pankreaskarzinom-Mausmodelles
sollten die antitumoralen Effekte des freien Gemcitabins (GemKonv) mit denen
der liposomal verpackten Variante (GemLip) verglichen werden.
11
2. Ziel der Studie
Ziel dieser experimentellen Arbeit war es, ein orthotopes Tumor-XenograftModell (griech. Xeno-: fremd, engl. -graft: Transplantat) zu etablieren, welches
zur Evaluierung antitumoraler und antimetastatischer Therapieoptionen zu
Verfügung steht. So sollten zwei hinsichtlich ihrer Aggressivität und ihrem
Metastasierungsverhalten verschiedende humane Pankreaskarzinomzelllinien vor
allem auf ihre Verwendbarkeit im orthotopen Mausmodell überprüft werden.
Hierzu wurde die Technik der Implantation von soliden Fragmenten zuvor
gezüchteter Donortumoren verwand, die derzeit neben der Injektionstechnik als
Standardversuchsaufbau auf diesem Gebiet angesehen werden kann [12,32,33].
Da in orthotopen Tiermodellen die Verfolgung des Tumorwachstums und
der Metastasenbildung oft schwierig oder sogar unmöglich ist, sollten im Projekt
Zelllinien verwendet werden, die mittels eines retroviralen Konstruktes zur
Expression von Luziferase
[34]
befähigt werden. So sollte die Detektion der Zellen
im lebenden Tier und ex vivo ermöglicht werden.
Die Leistungsfähigkeit des Modells sollte in einem anschließenden
Therapieversuch
mit
einer
neuartigen
liposomalen
Formulierung
Standardzytostatikums Gemcitabin validiert werden.
Systematisch ist diese Arbeit der Fragestellung folgend innerhalb der einzelnen
Kapitel in drei Abschnitte gegliedert:
1.
Subkutane Xenografts zur Generierung der Spendertumoren
2.
Etablierung der orthotopen Mausmodelle.
3.
Validierung im Therapieversuch.
des
12
3. Material und Methoden
In der vorliegenden Therapiestudie wurde eine verbesserte GemLipFormulierung mit einer liposomalen Einschlußrate von 47 % Gemcitabine. Die
Liposomen im Durchschnitt eine Größe von 37 nm, was die Pharmakokinetik noch
einmal entscheidend verbessern sollte.
Da der Mechanismus der Pharmakokinetik von großer Bedeutung für die
Effektivität des der neuen Formulierung ist, war ein Karzinommodell notwendig,
dass das menschliche Pankreas-Karzinom als Krankheit möglichst akkurat
abbildet. Es wurde deshalb entschieden, MIA PaCa-2-Tumorfragmente orthotop in
die Bauchspeicheldrüse der Maus. Diese Zelllinie ist chemosensibel für Gemcitabin
[35,36],
wurde als primär lokal metastasierend beschrieben und konnte bereits
erfolgreich orthotop implantiert werden.
3.1. Chemotherapeutika
Gemcitabin, GemLip und das reine vesikuläre Phospholipid-Gel (VPG)
wurden freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. U. Massing, Klinische
Forschung, Klinik für Tumorbiologie Freiburg (KTB) unter Genehmigung der Lilly
Pharma Holding GmbH, Bad Homburg, zur Verfügung gestellt.
3.2. Versuchstiere und Tierhaltung
3.2.1. Art der Versuchstiere
Bei allen durchgeführten Versuchen kamen immundefiziente Tiere zum
Einsatz, um eventuelle Abstoßungsreaktionen durch das Einbringen menschlichen
Gewebes zu minimieren. Es handelte sich hierbei um athymische, weibliche
Nacktmäuse (Fig. 3) des Stammes NMRI nu/nu im Alter von fünf bis sechs
13
Wochen. Das Gewicht der Tiere diesen Alters liegt zwischen 25 und 30 Gramm.
Die Mäuse wurden von der Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Deutschland
bezogen.
3.2.2. Haltung der Versuchstiere
Die Tiere wurden artgerecht nach den Richtlinien des deutschen
Tierschutzgesetzes (Bundesgesetzblatt vom 18. 1. 1986, Teil I) in Gruppen von zwei
bis drei Tieren im Tierstall der der Proqinase GmbH Freiburg gehalten. Ein
maßgeblicher Teil der Betreuung der Mäuse erfolgte durch Bianca Giessen und
Sandra Moor aus der veterinärmedizinischen Abteilung der Proqinase unter der
Leitung von Dr. vet. med. Norbert Esser.
Fig. 3 – NMRI nu/nu-Nacktmaus.
3 Tage nach orthotoper Implantation eines MIA PaCa-2 ELN Tumorfragmentes – Der Pfeil zeigt
die vollständige verheilte Hautnaht mit einer verbliebenen Einzelknopfnaht.
14
Nach Lieferung der Tiere wurden diese in gesäuberten und autoklavierten
Käfigen bei Standarddiät Trockenfutter (Ssniff Spezialdiäten, Soest) und Wasser
ad libitum mit maximal drei Mäusen pro Käfig in die Tierhaltung eingestallt und
für zwei Wochen in Quarantäne gehalten. In dieser Zeit konnten sie sich vom
Transport erholen und an die neue Umgebung gewöhnen.
Die Tiere wurden einem automatischen Tag-/Nachtrhythmus von 12 h
sowie einer kontinuierlichen Temperatur von 24 °C ausgesetzt, die Käfige alle 10
Tage gesäubert, Futter und Wasser ersetzt. Mit dem Beginn der Experimente
wurden
die
Versuchstiere
täglich
kontrolliert
und
Verhalten
sowie
Nahrungsaufnahme bewertet.
3.3. Tumorzelllinien und Zellkultur
3.3.1 Ursprungszelllinien
Bezogen wurden die Zelllinien MIA PaCa-2 und AsPC-1 (ATCC-Nr. CRL1420 und CRL-1682) von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,
MD, USA
[37].
Beide Zelllinien sind chemosensibel für Gemcitabin und wurden
bereits erfolgreich orthotop implantiert [35,36].
3.3.1.1. MIA PaCa-2
Die Tumorzelllinie MIA PaCa-2 wächst als adhärente Einzelschicht
(Monolayer). Sie wurde 1975 etabliert. Ursprung ist Tumorgewebe aus dem
Pankreas eines 65 Jahre alten Mannes kaukasischer Abstammung. Es handelt sich
um undifferenzierte Tumorzellen, die im orthotopen Modell zu ausgeprägter
Lokalmetastasierung neigen [38].
3.3.1.2. AsPC-1
Die Tumorzelllinie AsPC-1 wächst ebenfalls als Monolayer. Sie wurde 1982
aus Zellen im Aszites einer 62 Jahre alten, an Bauchspeicheldrüsenkrebs
15
erkrankten Patientin kaukasischer Abstammung generiert. Es handelt sich um
mäßig bis nicht differenzierte Tumorzellen, die im orthotopen Modell zu
ausgeprägter Fernmetastasierung neigen [39,40].
Zelllinie
MIA PaCa-2
AsPC-1
ATCC-Nr. CRL-1420
Differenzie- undifferenziert
rungsgrad
CRL-1682
kaum bis mäßig differenziert
Herkunft
Primärtumor
MonolayerZellkultur
Aszites
Tabelle 1 ― Charakteristika der verwendeten Ausgangszelllinien MIA PaCa-2
und AsPC-1.
3.3.2. Initiieren der Zellkultur
Die Tumorzellen wurden im gefrorenen Zustand geliefert und nach Erhalt
in 37°C warmem Medium in 10 cm Petrischalen suspendiert und anschließend im
Wärmeschrank bei 37 °C und 10 % CO2-Atmosphäre in Kultur genommen.
Innerhalb von ca. 3 - 7 Tagen bildete sich ein dichter Zellrasen, so dass die
Zellkultur subkultiviert werden konnte.
3.3.3. Mediumwechsel und Subkultivierung der Tumorzellen
Die verwendeten Zelllinien wurden als adhärente Monolayer in 10 cm
Zellkulturschalen (Greiner Bio-One, Frickenhausen) bei 37 °C und 5 % CO2 im
Brutschrank kultiviert. Als Kulturmedium wurde Dulbecco’s modified Eagle
16
Medium (DMEM, GIBCO®, Invitrogen, Karlsruhe) ergänzt durch 10 % Fetales
Kälberserum (FCS), 100 U/ml Penizillin und 100 µg/ml Streptomycin verwendet
(Komplettmedium). Die in vitro-Verdopplungszeit beider Zelllinien liegt bei etwa
2 Tagen.
Alle 2-3 Tage wurden die Zellen passagiert. Hierzu wurden die Zellrasen
durch Waschung PBS-Puffer (phosphate buffered saline solution), einer sterilen
isotonen Salzlösung, von toten Zellen und FCS befreit. Die am Schalenboden
adhärenten Tumorzellen wurden für 3-5 min mit 2 ml Trypsin bei 37 °C im
Wärmeschrank inkubiert. Zwischendurch wurden die Petrischalen vorsichtig
geschüttelt, um alle Tumorzellen vom Boden abzulösen. Die Vollständigkeit der
Ablösung wurde mikroskopisch verifiziert. Die tryptische Aktivität konnte durch
Zugabe von 8 ml Vollmedium zum Stillstand gebracht werden. Nach Bestimmung
der Zellzahl wurden eine Million Zellen pro Schale wiederaufplattiert, mit 15 ml
Komplettmedium ergänzt und weiterkultiviert.
Die Zellkonzentration wurde mit Hilfe eines Zytometers (Coulter Particle
Counter Z.1, Coulter Corp., Miami, FL, USA) bestimmt. Aus der vorbereiteten
Zellsuspension wurde mit einer Mikropipette 100 µl Flüssigkeit entnommen und
am Rand der Zählkammer abgegeben. Die Zellzahl wurde dreimalig gemessen und
anschließend der Mittelwert bestimmt. Durch Verdünnung oder erneutes
Zentrifugieren wurde die gewünschte Zellkonzentration eingestellt.
3.3.4. Kryokonservierung der Tumorzellen
Die Tumorzellen wurden bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase
vermehrt. Das Medium wurde entfernt und die in den Petrischalen adhärenten
Zellen von der Oberfläche abtrypsiniert. Die lytische Wirkung des Trypsins wurde
durch frisches Kulturmedium gestoppt und die Zellsuspensionen in einem sterilen
50 ml Universalbehälter (Falcon tube, Greiner Bio-One, Frickenhausen)
aufbewahrt.
Nach Bestimmung der Zellkonzentration wurden die Flüssigkeit bei 1500
U/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen im
Gefriermedium (94 % FCS, 6 % DMSO) resuspendiert und auf 1 × 106 Zellen/ml
eingestellt. Jeweils 0,5 ml der Zellsuspension wurden in Kryokontainer gefüllt und
17
bei –80 °C eingefroren. Nach erfolgreicher Rekultivierungskontrolle wurden die
Kryokontainer in der Vaporphase flüssigen Stickstoffs eingelagert.
3.3.5. Luciferase-transduzierte Zelllinien
Die gentechnische Methode des retroviralen Gentransfers erlaubt die
Integration artfremden Erbgutes in Bakterien und Zellen. Im Fall der vorliegenden
Studie sollten die humanen Pankreaskarzinom-Zelllinien zur Expression des
Enzymes Luciferase befähigt werden, um die Zellen auf biochemischer Basis
optisch detektabel zu machen.
Die Transduktion der Tumorzellen wurde von Dr. Ralph Graeser, Klinik für
Tumorbiologie Freiburg, in einem Zellkulturlabor der Sicherheitsstufe II
durchgeführt.
3.3.5.1. Transduktion der Zellen durch retroviralen Gentransfer
Der retrovirale Gentransfer gliedert sich in drei Schritte: der transienten
Virusproduktion, der Bestimmung des viralen Titers und der Infektion der
Zielzellen.
Die
Luciferase-Neomycin-Fusionsproteine
exprimierenden
retroviralen
Transfervektoren wurden mit einem weiteren Plasmid, welches
das VSV-G
Envelope-Protein
kodiert,
in 293A-Zellen
(Clontech
#C3201-1;
Clontech,
Mountain View, CA, USA) kotransfiziert. Fünf Stunden nach Transfektion wurde
das Medium durch 20ml DMEM plus 10 % FCS ersetzt.
72 Stunden nach der Transfektion wurde der virusenthaltende Überstand
abgenommen, mit 4 mg/ml Polybrene ergänzt und auf die Zielzellen (MIA PaCa-2,
AsPC-1) gegeben. Diese wurden am Tag zuvor in einer Zellzahl von 4 x 105 auf 10
cm Petrischalen ausplattiert. Nach 24 Stunden Inkubationszeit wurde der
Überstand durch frisches Medium ersetzt. Weitere 48 Stunden später wurden die
Zellen im Verhältnis eins zu sechs gesplittet und nach weiteren 24 Stunden mit
G418 (Neomycin) in einer Konzentration von 1-3 mg/ml versetzt, um die
transduzierten Zellen zu selektionieren. Nach einer Selektionszeit von einer Woche
18
wurde sowohl für die Luci-Neo (LN) als auch für die EF1α Luci-Neo (ELN)
Zelllinien die Luciferase-Aktivität bestimmt.
3.3.5.2. Luciferase-Assay von Zellkulturen
Zur Bestimmung der Luciferase-Aktivität wurden 106 Zellen in 100 µl 1 x
Lysis-Puffer für 10 Minuten auf Eis lysiert (25 mM TRIS-Phosphat pH 7-8; 2 mM
EDTA; 2 mM DTT; 0,1 % Triton α-100), unlösliches Material für 5 Minuten bei
maximaler Geschwindigkeit abzentrifugiert. Der Überstand wurde seriell
verdünnt. Je 10 µl wurden in eine 96-well Platte (Lumitrac 200, Greiner Bio-One,
Frickenhausen) überführt. Das Substrat (Promega E4550, Promega, Mannheim)
wurde in einem Luminometer (LUMIstar, BMG, Offenburg) in die Wells injiziert
und die Luciferase-Aktivität gemessen.
3.4. Etablierung der subkutanen Xenografts
3.4.1. Aufbereitung der Zellsuspension zur Implantation
Die zur Implantation benötigte Zellzahl wurde nach Literaturlage
[33]
auf 5 x 106
pro Tier festgelegt. Die Tumorzellen wurden wie oben beschrieben in Zellkultur
vermehrt. Nach einer Kulturdauer von 3 Tagen wurde das Medium entfernt, die
Zellen durch Trypsinierung vom Boden der Petrischalen gelöst, in einem sterilen
50 ml Falcon tube gepoolt und gezählt. Danach wurden die Zellen vorsichtig für 10
Minuten bei 1500 U/min zentrifugiert und in 100µl PBS in Einzeldosen aufgeteilt.
3.4.2. Subkutane Implantation der Tumorzellen
Den Tieren wurden jeweils 5 x 106 vitale Tumorzellen in 100 µl PBS
subkutan in die linke Bauchseite unterhalb des unteren Milzpoles injiziert. Dazu
wurde ein Tier mit der linken Hand an der Hautfalte am Hinterkopf und am
Schwanz fixiert, die linke Flanke wurde mit 70 % Alkohol desinfiziert und die
Tumorzellsuspension injiziert (Injektionskanüle 30 G, 0,8 cm lang, Insulin
19
Einmalspritze U100 von Becton-Dickinson, Heidelberg). Nach erfolgreicher
Injektion wies die Bauchwand eine ca. 5 mm x 5 mm große Blase auf.
Die Tiere wurden neben den täglichen Inspektionen 3 x wöchentlich
gewogen,
die
Tumorgröße
wurde
mittels
Mess-Schieber
ermittelt.
Die
Tumorvolumina wurden mit der Formel
V = a² x A/2
(a - kleiner Durchmesser, A - großer Durchmesser)
bestimmt. Die Daten wurden mit dem Programm Prism 4.0 (GraphPad
Software, San Diego, USA) dokumentiert und in Wachstumskurven umgewandelt.
3.5. Etablierung der orthotopen Mausmodelle
3.5.1. Gewinnung der Tumorfragmente
Die zu implantierenden Fragmente wurden aus subkutanen Donortumoren
mit einer Größe von 0,5 cm³ bis 1 cm³ gewonnen. Hierzu wurden die Donortiere
durch zervikale Dislokation stress- und schmerzarm getötet, die Tumoren keimfrei
unter einer Sterilbank enukleiert. Anschließend wurden die Tumoren in
Petrischalen mit 37 °C warmem Kulturmedium überführt und mit sterilen
Einmalskalpellen (Klinge Fig. 15, B.Braun-Aesculap, Tuttlingen) zu Stücken á 1
mm³ zerschnitten. Nur makroskopisch vitale Bereiche der Tumoren fanden
Verwendung. Zentrale Nekrosen oder Tumorrandstücke wurden verworfen.
3.5.2. Anästhesie und Beatmung
Die Narkose der Tiere wurde durch Inhalation eines Sauerstoff-IsofluranGemisches in einer Einschlafbox für Mäuse eingeleitet. Nach ca. 5 Minuten waren
die Tiere bewusstlos und relaxiert und konnten anschließend in Rechtsseitenlage
auf einer mit sterilem OP-Tuch überzogenen Korkplatte mittels Klebeband
(Omnifilm®, Hartmann, Heidenheim) fixiert werden. Hierbei wurde der Kopf in
einen Beatmungstrichter aus Silikon eingeführt, worüber den Mäusen ein
20
kontinuierlicher Gasstrom reinen Sauerstoff mit 2 Vol. % Isofluran (Forene®,
Abbott, Ludwigshafen) appliziert wurde. Eine Flussrate von 2 l/min wurde für den
Zeitraum der OP aufrechterhalten.
Die Ausleitung erfolgte durch schrittweise Senkung des Isofluran-Anteils
von 2 auf 0 Vol. %. Anschließend wurden die Tiere für ca. 10 Minuten in ein mit
sterilem OP-Tuch überzogenes Wärmebett gelegt, bis sie wieder vital waren und
laufen konnten.
3.5.3. Implantation der Tumorfragmente
Die Implantationsoperationen fanden im Kleintier-OP der KTB unter
sterilen Bedingungen statt. Die linke Flanke der narkotisierten und fixierten Tiere
wurde zunächst mit alkoholischer Lösung (70 Vol. %) und einem bromhaltigen
Desinfektionsmittel (Dibromol®-Tinktur, Trommsdorff Arzneimittel, Alsdorf)
desinfiziert.
Als Zugangsweg in das Abdomen wurde ein Hautschnitt von ca. 1 cm Länge
parallel zur Hinterkante der Milz gewählt, welche sich durch die Haut der
Nacktmäuse gut abzeichnete. Die Bauchwand wurde mit 2 kleinen anatomischen
Pinzetten gefasst und, in Lage und Länge identisch zum Hautschnitt, eröffnet.
Daraufhin wurde der untere Milzpol dargestellt und mittels sterilem Wattetupfer
und Pinzette vorsichtig aus dem Abdomen luxiert. Hierbei spannte sich der
Pankreasschwanz entlang der Milzgefäße flächig auf.
Im Pankreasparenchym wurde anschließend mittels zweier Mikropinzetten
(micro-select®, A.Dumont & Fils, Montignez, Schweiz) eine kleine Gewebetasche
von etwa 2-3 mm Tiefe präpariert. Als Leitstruktur diente hierbei die größte
Milzvene. In dieser Tasche wurde nun ein Tumorfragment so platziert, dass es
vollständig von Pankreasgewebe umschlossen wurde. Eine weitere Fixierung der
Tumorstücke im Empfängerpankreas etwa durch Nahtmaterial oder Gewebekleber
erfolgte nicht.
Pankreas und Milz wurden in die Bauchhöhle zurückverlagert und die
Bauchwand zweischichtig mit 5-0 resorbierbarem Faden (DEXON®, B.BraunDexon,
Spangenberg)
verschlossen.
Nach
Benetzen
der
Hautnaht
mit
21
bromhaltigem Feindesinfektionsmittel wurde die Narkose ausgeleitet, das Tier in
das Wärmebett gelegt und anschließend wieder in die Käfighaltung überführt.
3.6. In vivo-Imaging ― Bildgebung im Bio-Lumineszenz-Imaging-Assay
3.6.1. Datenerhebung im CCD-Kamerasystem
Einmal pro Woche wurden die Tiere mit Tumoren der transduzierten
Zelllinie in einem mit Flüssigstickstoff gekühlten CCD-Kamerasystem (charge
coupled device) untersucht.
Dazu wurden die Tiere durch eine intraperitoneale Injektion von 15 µl
Medetomidinhydrochlorid-Lösung (10 mg/kg; Domitor®, 1 mg/ml, Pfizer,
Karlsruhe) und 20 µl Ketaminhydrochlorid-Lösung (20 mg/kg; Ketamin 10 %,
Essex Tierarznei, München) narkotisiert.
Bei Erreichen der gewünschten Narkosetiefe wurden jeweils 100 µl DLuciferin (20 mg/ml; Molecular Imaging Products, Ann Arbor, MI, USA) ebenfalls
intraperitoneal appliziert.
Die Tiere wurden ins Wärmebett gelegt, um einer Auskühlung vorzubeugen.
Um einer eventuellen Austrocknung der Hornhäute vorzubeugen, wurden
stecknadelkopfgroße Mengen eines Augengels (Oculotect®, Novartis, Basel,
Schweiz) aufgetragen.
Nach 10 Minuten wurden die Tiere in die Dunkelkammer des
Imagingsystems (Fig. 4; Flüssigstickstoff-gekühlte CCD-Kamera LNU/S von
PerkinElmer, CCD-Kamerakontroller LSR-Astrocam von Astro-Med, Rodgau)
gelegt.
Zuerst wurde für 100 ms belichtet, um die anatomische Lage der Tiere in
der Dunkelkammer zu später mit den Lumineszenzbildern überlagern zu können.
Danach wurden die Signale der Tumorlumineszenz gemessen. Die dafür
notwendigen Messzeiten liegen für die subkutanen Tumoren bei 10 s, für die
orthotopen Tumoren bei 300 s. Die Aufwachphase wurde durch 50 mg/kg
Atipamezolhydrochlorid (Antisedan®, 5 mg/ml, Pfizer, Karlsruhe) verkürzt.
22
N2-Einfülltrichter
CCD-Kamera
Maus
Dunkelschrank
Kamera-Controller
Fig. 4 – In vivo-Imaging-Arbeitsplatz mit dem CCD-Kamerasystem.
Die narkotisierte Maus wird 10 min nach Luciferin-Injektion im Dunkelschrank platziert. Der
CCD-Chip der mit Flüssigstickstoff gekühlten Kamera wird je nach Tumor 10 – 300 s belichtet.
Die resultierenden Rohdaten werden über den Controller in den PC geleitet und können dort
mittels Software weiterbearbeitet werden.
3.6.2. Quantifizierung der Lichtemission der Tumoren
Die Signale der Kamera-Rohbilder (Fig. 5 a) wurden in einem ersten Schritt
mittels
Bildbearbeitungssoftware
(Photoshop
CS®,
Adobe,
München)
in
weiterverarbeitbare TIFF-Formate (engl. Tagged Image File Format) transformiert
und verstärkt. Die so generierten Bilder wurden danach in Falschfarben
umgewandelt (Fig. 5 c). Dies diente einerseits der späteren Quantifizierung der
Signale, andererseits der deutlicheren Visualisierung.
23
a)
b)
c)
d)
Fig. 5 – Bildbearbeitung mit Photoshop am Beispiel der Tiere 1100/05 und
1101/05 mit orthotopen MIA PaCa-2 ELN-Tumoren 5 Wochen nach
Implantation.
a) Rohbild mit Signalen der photonenemittierenden Tumoren im lichtdichten Dunkelschrank des
CCD-Kamerasystems (Belichtungszeit 5 min).
b) Rohbild der Tiere im Dunkelschrank des CCD-Kamerasystems (Belichtungszeit 100 ms bei
grünem LED-Auflicht) – das Rohbild wird in Photoshop CS® in ein 8bit-Graustufen-Bild im
TIFF-Format umgewandelt.
c) In Photoshop CS® Isolierte Signale – die Rohdaten (a) werden normalisiert, verstärkt und zur
Quantifizierung (in ImageJ) und Kontrastierung in Falschfarben transformiert.
24
d) Overlay-Bild – da die Rohbilder der Signale (a) und der Tiere (b) über identische,
standardisierte Pixelmaße verfügen, können sie zur Visualisierung in Photoshop CS®
übereinandergelegt werden (overlay).
Die Rohdaten der Auflichtbilder wurden ebenso der narkotisierten Tiere in
TIFF-Dateien überführt (Fig. 5 b). Im nächsten Schritt wurden die entsprechenden
TIFFs der Tumorsignale und der Tiere durch Übereinanderlegen (overlay)
zusammengeführt.
Die
Quantifizierung
der
Rohdaten
erfolgte
über
die
Falsch-
farbendarstellung (Fig. 5 c) mit der Bildbearbeitungssoftware ImageJ. Hier wurde
in einem vordefinierten Quadrat von 150 x 150 Bildpunkten (Pixel) zur Erstellung
von wachstumskorrelierten Signalkurven der Querschnitt der Pixel-Intensitäten
als
Absolutwert
gemessen.
Die
Größe
des
Quadrates
wurde
der
Durchschnittsgröße der Tumorsignale angepasst.
3.7. Therapiestudie GemLip vs. Gemcitabin
3.7.1. Einteilung der Therapiegruppen durch BLI
Das Protokoll des GemLip-Therapieversuches beinhaltete fünf Gruppen á 10
Tiere
(Tab.
2).
Als
Einteilungskriterium
dienten
die
quantifizierten
Lumineszenzsignale der Tumoren 2 Wochen nach Implantation.
Gruppe
Tierzahl
Substanz
Konzentration
Applikation
1. Kontrolle
10
Kochsalzlösung
0,9%
i.v. 1x / Woche
2. GemKonv
10
konventionelles Gemcitabin
240 mg/kg KG
i.v. 1x / Woche
3. GemLip 4
10
Gemcitabin in VPG
4 mg/kg KG
i.v. 1x / Woche
4. GemLip 8
10
Gemcitabin in VPG
8 mg/kg KG
i.v. 1x / Woche
5. VPG
10
pures VPG
entspr. Gruppe 4
i.v. 1x / Woche
Tabelle 2 – Gruppeneinteilung für den Therapieversuch mit GemLip.
25
Dazu wurden die Signale der Tiere in 5 Intensitätsbereiche aufgeteilt und
dementsprechend die Tiere gleichmäßig den Therapiegruppen zugewiesen. Tiere
ohne Signal und solche mit im Kamerabild sichtbar aberranten Tumoren wurden
aus der Studie ausgeschlossen.
3.7.2. Applikation und Dosierung
Gemäß Protokoll wurde die Therapie 2 Wochen nach Implantation der
Tumorfragmente begonnen und für 5 Wochen fortgeführt. Die Substanzen wurden
einmal pro Woche über eine der Schwanzvenen der Tiere appliziert. Dazu wurden
die Mäuse in einer Injektionsröhre fixiert (Fig. 6). Der Injektionstermin lag zeitlich
jeweils 1 Tag vor der wöchentlichen Bildgebung im CCD-Kamerasystem.
Die Applikationsmenge aller richtete sich nach dem jeweils aktuellen
Gewicht der Mäuse nach der Formel
Injektionsmenge [µl] = Tiergewicht [g] x 10
Einer 30 g schweren Maus wurden dementsprechend 300 µl appliziert. Den
Tieren der Kontrollgruppe wurden gewichtsadaptierte Äquivalenzmengen isotoner
Kochsalzlösung injiziert. Die in vivo MTD-Werte (Maximal Tolerierbare Dosis) für
die
klinische
Gemcitabin-Formulierung
wurden
von
Experimenten
mit
Weichteilsarkom-Xenografts der Gruppe U.Massing (d.n.s) für Gruppe 2
(GemKonv 240 mg/kg) übernommen.
Zur Bestimmung der MTD der neuen VPG-Formulierung wurde zusätzlich
eine kleine Toxizitätsstudie (d.n.s.) durchgeführt, in der toxische Symptome ab
einer Dosierung von 16 – 20 mg/kg auftraten. Dementsprechend wurden eine
Gruppe 3 mit ¼ MTD (GemLip 4 mg/kg KG) und eine Gruppe 4 mit ½ MTD
(GemLip 8 mg/kg KG) im Protokoll integriert. Eine weitere Gruppe 5 erhielt das
reine VPG ohne Gemcitabin zur Überprüfung möglicher Effekte der liposomalen
Grundsubstanz auf die Tumoren.
26
Fig. 6 – Injektionshilfe für die intravenöse Applikation in die Schwanzvenen von
Mäusen.
3.8. Tierethik und Abbruchkriterien
Bezüglich der Versuchsvorhaben wurde ein Tierethikantrag Registier-Nr. G05/13 gemäß § 8 Tierschutzgesetz -TSchG- beim Referat Veterinärwesen des
Regierungspräsidiums Freiburg eingereicht und bewilligt.
Folgende Kriterien für vorzeitige Beendigung des Versuches wurden festgelegt:
•
Tumordurchmesser größer 2 cm
•
Hochgradig ulzerierender Tumor
•
Gewichtsverlust von über 30%
27
•
Apathie (hochgradige Inaktivität)
•
Fehlende Futter- bzw. Tränkeaufnahme
•
Hochgradige Dispnoe
•
Motorische Ausfallserscheinungen
•
Abnorme Körperhaltung
3.9. Nekropsie
3.9.1. Subkutanes Modell
Nach der Tötung der Tiere durch zervikale Dislokation wurden sie in
Rechtsseitenlage mit Injektionsnadeln auf einer Korkunterlage fixiert. Die
Tumoren wurden enukleiert, fotografiert, vermessen, gewogen. Für die weiteren
Untersuchungen (Luciferase-Assay, Histologie) wurden die Tumoren in flüssigem
Stickstoff eingefroren. Abschließend wurde das Abdomen eröffnet, um nach
eventuellen Metastasen zu suchen.
3.9.2. Orthotopes Modell
Das getötete Tier wurde in Rückenlage fixiert und das Abdomen in der
Medianlinie eröffnet. Tumor, Metastasen und andere besondere pathologische
Befunde wie Leberveränderungen, Ödem und Blutungen wurden markiert und im
Gesamtsitus fotografiert.
Es folgte eine Metastasenzählung der Bauchwand. Danach wurde der
Primärtumor entnommen, vermessen, gewogen, fotografiert und halbiert. Eine
Hälfte wurde für weitere histologische Untersuchungen in flüssigem Stickstoff
eingefroren, die andere für den anschließenden Luciferase-Assay (3.9.3.) in
Lysispuffer (3.3.5.2.) gegeben.
Nach Protokoll wurden Pankreas, Leber, Milz, Magen, Darm, inguinale
Lymphknoten und Lunge entnommen, eventuelle Metastasen in den betroffenen
Organen dokumentiert und in entsprechende Organteile in den Lysispuffer
überführt. Teile von verschiedenen, makroskopisch nicht metastasierten Organen
28
wurden ebenfalls eingefroren, um später eventuelle Signale im ex vivo-LuciferaseAssay histologisch belegen zu können.
3.9.3. Luciferase-Assay von Organen
Um metastasiertes Tumorgewebe in Organen festzustellen, wurden
Organteile in 1 x Lysispuffer (25 mM TRIS-Phosphat pH 7,8; 2 mM EDTA; 2 mM
DTT; 0,1 % Triton-100) aufgenommen. Die für die einzelnen Organe benötigten
Lysis-Puffer-Volumina verteilten sich wie folgt:
•
Tumor
2 ml
•
Pankreas
2 ml
•
Leber
2 ml
•
Milz
2 ml
•
Magen
2 ml
•
Darm
2 ml
•
Lunge
2 ml
•
inguinale Lymphknoten
1 ml
Die Organe wurden in 2 ml Glashomogenisatoren homogenisiert und in 15
ml Falcons überführt. Unlösliches Material wurde 10 Minuten lang bei 3000
U/min in einer Zentrifuge (Heräus Megafuge 2.0, Heräus, Hanau) abzentrifugiert.
Daraufhin
wurde
ein
Bradford-Assay
zur
Bestimmung
der
Proteinkonzentration der Homogenisate durchgeführt. Je 5 µl des Überstandes
wurden in 96-well Platten (NUNC 437796, NUNC, Wiesbaden) überführt und 200
µl Bradford-Lösung (Sigma-Aldrich B-6916, Sigma-Aldrich, München) dazugeben.
Anschließend wurde in einem ELISA-Reader die Licht-Absorption bei 595 nm
gemessen. Als Standard für den Bradford-Assay wurde eine 1-10 mg BSAStandardkurve (Bovine Serum Albumin) erstellt.
Im Anschluß wurde mit den Homogenisaten ein Luciferase-Assay, wie unter
Kap. 3.3.5.2. beschrieben, durchgeführt.
29
3.10. Histologie
Um Signale aus den ex vivo-Luciferase-Assays verifizieren zu können,
sollten
von
signalpositiven
Organen
exemplarisch
histologische
Schnitte
angefertigt werden. Hierzu wurden die Organe bei Nekropsie halbiert und in
flüssigem Stickstoff tiefgefroren, wobei eine Hälfte dem ex vivo-Luciferase-Assay
zugeführt wurde. Falls dieser Test positiv ausfiel, wurden aus der verbliebenen
Hälfte HE- und humanspezifische Zytokeratin (1-8)-Färbungen angefertigt. Mit
diesen Methoden sollte es möglich sein, ein Luciferase-Signal sicher den
entsprechenden Organmetastasen zuzuordnen.
Die Histologie wurde unter der maßgeblichen Betreuung von Sandra Mohr,
Proqinase GmbH, durchgeführt.
3.10.1. Herstellen der Kryoschnitte
Von den tiefgefrorenen Tumor- und Organteilen (-80 °C) wurden mittels
Kryotom
(Leica
CM
3050
Kryostat,
Kammertemperatur
-25
°C,
Objektträgertemperatur -18 °C, Leica Mikrosysteme, Wetzlar) Gefrierschnitte in 6
µm Schichtdicke angefertigt und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.
3.10.2. Hämalaun-Eosin (HE)-Färbung von Gefrierschnitten
Die HE-Färbung ist eine histologische Standardmethode, mit der eine gute
Allgemeinübersicht über das Präparat erreicht werden kann. Zellkerne werden
durch das Hämalaun vorwiegend blau bis violett angefärbt, während Eosin das
Zytoplasma in Rot-Abstufungen darstellt.
Die angefertigten Kryoschnitte mussten zunächst über Nacht lufttrocknen.
Die trockenen Schnitte wurden für 10 Minuten in 4 % Paraformaldehyd (PFA)
fixiert. Danach wurde für dreimal 5 Minuten in 1x Histopuffer (HP, 40 ml 25x HP
in 960 ml Aqua dest.) gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte kurz mit
Aqua dest. gespült.
30
Mit Mayer´s-Hämalaunlösung (180 ml Aqua dest in 20 ml Mayer´s
Hämalaun, Merck, Darmstadt) wurden die Kerne für 7 bis 10 Minuten gefärbt und
für weitere 15 Minuten unter fließendem Leistungswasser (Badenova, Freiburg)
gebläut. Die Gegenfärbung erfolgte für 5 bis 10 Minuten mit Eosin B (Acid Red 91,
Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim). Daraufhin wurden die Schnitte für etwa 1
Minute unter Beobachtung in 70 % Alkohol differenziert, in einer aufsteigenden
Alkoholbad-Reihe (80 %, 95 %, 99 %) je 2 Minuten und abschließend für zweimal
5 Minuten in Xylol gewaschen.
Die
gefärbten
Gefrierschnitte
wurden
zur
Konservierung
mit
Schnelleindeckmittel (Entellan®, Merck, Darmstadt) überzogen und mit
Deckgläschen eingedeckt.
3.10.3. Panzytokeratin-(1-8)-Färbung von Kryoschnitten
Sinn dieser Färbmethode ist, mithilfe humanspezifischer monoklonaler
Panzytokeratin-(1-8)-Maus-Antikörper
das
aus
Menschen
stammende
Tumorgewebe eindeutig zu identifizieren und vom murinen Wirtsgewebe zu
differenzieren. Da die Antigen-Antikörper-Reaktion auf Paraffin nicht möglich ist,
wurden die Färbungen mit Gefrierschnitten durchgeführt. Aus Gründen der
Vergleichbarkeit kamen für die HE-Färbungen (3.10.2.) ebenfalls Kryoschnitte
zum Einsatz.
Die luftgetrockneten Schnitte wurden initial für 10 Minuten in 4% PFA
fixiert. Danach wurde in 1x HP dreimal 5 Minuten gewaschen und kurz in Aqua
dest. gespült.
Im Anschluß wurden die endogenen Peroxydasen ein 10 Minuten-Bad mit
0,5% H2O2 in Methanol inaktiviert. Nach kurzem Spülen in Aqua dest. wurden die
Schnitte für zweimal 2 Minuten 1x HP gewaschen. Danach erfolgte der AvidinBiotin Block (Dako Diagnostik GmbH, Hamburg) für jeweils 10 Minuten,
woraufhin die Gefrierschnitte wieder für zweimal 2 Minuten 1x HP gewaschen
wurden.
Die biotinylierten, Maus-monoklonalen Panzytokeratin (1-8)-Antikörper
(Progen Biotechnik,
Heidelberg) wurden 1:600 in Antikörper-Puffer (Dako
Diagnostik, Hamburg) verdünnt. In dieser Pufferlösung wurden die Schnitte für
31
etwa 1,5 Stunden mit 50 µl/Schnitt inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt
von zweimal 2 Minuten in HP wurden die Schnitte für 45 Minuten mit AvidinBiotin-Komplex-Reagenz (ABC-Reagenz „Vectastain Elite ABC-Kit“, Linaris,
Wertheim-Bettingen) inkubiert (100 µl/Schnitt, ABC-Reagenz 30 Minuten vor
Gebrauch 1:100 in 1x HP ansetzen).
Nach erneutem Waschen in 1x HP für wurde für 5 bis 7 Minuten mit 3,3´Diaminobenzidine-Peroxidase Substrat (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim) bei
100 µl/Schnitt inkubiert, um die Braunfärbung des Cytokeratins zu initiieren.
Der Überstand wurde mit zweimal 2 Minuten Waschen in Aqua dest.
entfernt. Die Schnitte wurden anschließend für 7 Minuten in Mayer´s Hämalaun
(1:10 in Aqua dest.) gegengefärbt für 15 Minuten unter fließendem Leitungswasser
gebläut. Zur Entwässerung badeten die Schnitte danach für je 2 Minuten in eine
aufsteigende Alkohol-Xylol-Reihe. Abschließend wurden die Schnitte mit
Entellan® eingedeckelt.
32
4. Ergebnisse
4.1. Generierung der Luciferase-exprimierenden Zelllinien
Für das Projekt wurden zwei Pankreas-Karzinom-Zelllinien ausgewählt, die
sich hinsichtlich dem Grad der Differenzierung und dem entsprechend in etwa
dem zu erwartenden Aggressivitäts- und Metastasierungsverhalten der daraus
hervorgehenden Tumoren unterscheiden [33].
Die Auswahl von Zellen unterschiedlicher Eigenschaften sollte der Tatsache
Rechnung tragen, dass die Gruppe humaner Pankreaskarzinome sehr inhomogen
ist
[41].
Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien sollten via retroviraler
Transduktion mit einem Luciferase-Neomycin-Resistenz-Fusionsgen markiert
werden, um via Biolumineszenz, Wachstumskurven der orthotopen, nur schwer
verfolgbaren Tumoren zu generieren. Die Neomycin-Resistenz wurde für die
Selektion erfolgreich transduzierter Zellen verwendet. Die überlebenden Zellen
wurden in sogenannten Zellpools zusammengefaßt und nicht weiter subkloniert.
Der Erfolg der Transduktionen wurde an Zellverdünnungsreihen im in
vitro-Luciferase-Assay überprüft. Der MIA PaCa-2 ELN-Zellpool erreichte eine
Lichtemission von ca. 70 VLE/Zelle, während im MIA PaCa-2 LN-Pool etwa 45
VLE/Zelle gemessen wurden (VLE - Virtuelle Lichteinheit). Der AsPC-1 LNZellpool war mit 4 VLE/Zelle der AsPC-1 ELN-Version (ca. 1 VLE/Zelle) etwa
4fach überlegen (Fig. 7).
Obwohl von allen Zell-Varianten aufgrund der in vitro-Daten ein starkes in
vivo-Signal zu erwarten war, wurden die stärker exprimierenden Zelllinien MIA
PaCa-2 ELN und AsPC-1 LN für die weiteren Versuche ausgewählt und
weiterverwendet.
Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen über Lumineszenzfähigkeit
der neuen Zellkonstrukte und deren morphologischer Identität mit den parentalen
Zelllinien (d.n.s.) konnte die subkutane Implantation der transduzierten Zelllinien
in die Nacktmäuse vorgenommen werden.
33
Zellzahl
a)
2.0
1.5
1.0
0.5
10
20
39
78
0.0
15
6
10
20
39
78
15
6
31
3
62
5
50
00
25
00
12
50
0
2.5
31
3
10
3.0
62
5
20
AsPC-1 ELN
12
50
30
AsPC-1 LN
3.5
25
00
40
4.0
10
00
0
50
10
00
0
Lichtemission (VLE x 105)
MIA PaCa-2 LN
Lichtemission (VLE x 105)
MIA PaCa-2 ELN
60
50
00
70
Zellzahl
b)
Fig. 7 – In vitro-Luciferase-Assay der generierten Zelllinien.
Die Luziferase-Expression wurde nach erfolgter Transduktion indirekt über die erreichte
Lichtemission (VLE – virtuelle Lichteinheit) im in vivo-Luciferase-Assay bestimmt. Hierzu wurde
das von den Tumorzellen emittierte Licht in Zell-Verdünnungsreihen nach Zugabe von Luciferin
im Luminometer gemessen. Zur Auswahl der stärker exprimierenden Zelllinien für die weiteren
Versuche wurden die ELN- und die LN-transduzierten Varianten direkt verglichen.
a) MIA PaCa-2 ELN und LN – Hier erreicht das mittels ELN transduzierte Konstrukt mit ca. 70
VLE/Zelle um etwa ¼ höhere Werte als die LN-Variante mit ca. 45 VLE/Zelle.
b) AsPC-1 LN und ELN – In diesem Fall war die LN-transduzierte Zelllinie mit etwa 4 VLE/Zelle
der ELN-Variante (ca. 1 VLE/Zelle) etwa 4-fach überlegen.
4.2. Generierung der Spendertumoren aus subkutanen Xenografts
Um bei der orthotopen Implantation der Tumoren eine artifzielle
intraabdominelle Zellaussaat mit eventueller konsekutiver Peritonealkarzinose zu
vermeiden, wurde die Verwendung subkutan gewachsener Tumorstücke der
Injektion
von
Zellsuspensionen
vorgezogen.
Die
Bereitstellung
von
Spendertumoren für die orthotopen Versuche erfolgte durch subkutane
Tumorzellimplantation
in
NMRI-Nacktmäuse.
Von
den
heranwachsenden
Tumoren wurden Wachstumskurven angelegt und mit denen von subkutanen
34
Tumoren der parentalen Zelllinie verglichen (Fig. 8 a & 9 a), um mögliche
Transduktionsartefakte zu erkennen.
Weiterhin wurde die Fähigkeit der Tumoren zur Photonenemissionen in
vivo überprüft. Wachstumskurven aus den in vivo-Imaging-Daten konnten erstellt
werden (Fig. 8 f). Die angestrebte Explantationsgröße von etwa 0,5 cm³ [12] wurde
bei beiden Zelllinien nach 3-4 Wochen erreicht (Fig. 8 a, c und 9 a – gestrichelte
Linie).
4.2.1. Die subkutanen MIA PaCa-2-Xenografts
Zur Herstellung der Spendertumoren wurden je 5 x 106 Zellen subkutan in 2
Gruppen á 10 Tiere injiziert. Eine Gruppe erhielt die transduzierte MIA PaCa-2
ELN-Zelllinie.
Die
andere
Gruppe
wurde
als
Kontrolle
der
in
vivo
Wachstumseigenschaften mit der parentalen Zelllinie bestückt.
Die Rate der angewachsenen Tumoren betrug in der MIA PaCa-2 ELNGruppe 100 % und in der MIA PaCa-2-Gruppe 90 %. Von Beginn an zeigten die
Tiere eine gleichmäßige Zunahme von Gewicht und Tumorvolumen im gesamten
Verlauf (Fig. 8 a/b).
Aus Abbildung 8 a ist ersichtlich, dass die Tumoren der transduzierten MIA
PaCa-2 ELN Zelllinie im Vergleich zu denen der Ursprungslinie in diesem Versuch
eine Wachstumsverzögerung aufwiesen. Dieser Trend konnte sich in einem
nachfolgenden Experiment jedoch nicht bestätigt werden (Fig. 8 c/d).
Bei Überprüfung der MIA PaCa-2 ELN-Gruppe auf Luciferase-Expression in
vivo wurde festgestellt, dass nach intraperitonealer Luciferin-Injektion und einer
einsekündigen Expositionszeit in der CCD-Kamera bei 100 % der Tumore ein
starkes Biolumineszenz-Signal nachweisbar war. Des Weiteren ließ sich
exemplarisch aus den Daten mehrerer Imaging-Zeitpunkte eine Wachstumskurve
generieren (Fig. 8 e/f).
Bei Versuchsabbruch betrug die mittlere Tumorgröße in der MIA PaCa-2Gruppe 2,17 cm³ +/- 0,56 cm³ bei einem Tumorgewicht von 1,32 g +/- 0,35 g. In
der MIA PaCa-2 ELN-Gruppe lag die Tumorgröße bei 1,60 cm³ +/- 0,38 cm³, das
Tumorgewicht bei 1,19 g+/- 0,23 g.
35
40
MIA PaCa-2 s.c.
MIA PaCa-2 ELN s.c.
MIA PaCa-2 s.c.
n=10
n=10
MIA PaCa-2 ELN s.c.
n=10
35
2
Tiergewicht (g)
Tumorvolumen (cm³)
3
n=10
1
0
10
20
30
40
50
30
25
60
0
Tag
a)
MIA PaCa-2
n=4
MIA PaCa-2 ELN
n=4
10
30
40
50
60
Tag
b)
36
3
MIA PaCa-2 s.c.
n=4
MIA PaCa-2 ELN s.c.
n=4
32
2
Tiergewicht (g)
Tumorvolumen (cm³)
20
1
0
10
20
30
40
28
24
0
Tag
c)
10
20
30
40
d)
Tag
7
158/04
Lichtemission (VLE x 105)
6
2 Wochen
e)
4 Wochen
6 Wochen
5
4
3
2
1
0
0
f)
2
4
6
8
Wochen
Fig. 8 – Subkutane MIA PaCa-2/-ELN-Xenografts.
a & b) 1. subkutaner Versuch mit subkutanen MIA PaCa-2/ELN Tumoren über 8 Wochen.
a) Tumorwachstum in cm³ – ab der 3. Woche weichen die Kurven auseinander, eine Ursache ist
unklar.
36
b) Tiergewichte in g – parallele, ansteigende Kurven lassen keine gesundheitliche
Beeinträchtigung der Tiere durch die Tumoren vermuten.
c & d) 2. subkutaner Versuch mit subkutanen MIA PaCa-2/ELN Tumoren über 5 ½ Wochen.
c) Tumorwachstum in cm³ – die Kurven sind im gesamten Verlauf parallel und stetig steigend,
eine Wachstumsverzögerung wie im 1. Versuch ist nicht erkennbar.
d) Tiergewichte in g – auch hier parallel ansteigende Kurven.
e & f) Erstellung von Tumorwachstumskurven durch in vivo-Imaging (exemplarisch Tier 158/04).
e) Overlay-Bilder nach in vivo-Imaging von Tier 158/04 nach Implantation.
f) Tumorwachstum in VLE (virtuellen Lichteinheiten) – erstellt aus relativen Werten der in vivoSignale.
Eine Metastasierung war weder im in vivo-Imaging noch visuell während
der Nekropsie feststellbar.
4.2.2. Die subkutanen AsPC-1-Xenografts
Analog zum subkutanen MIA PaCa-2-Versuch wurden 5 x 106 Zellen von
AsPC-1 und AsPC-1 LN in Mäuse implantiert.
In diesem Versuch betrug die Anwachsrate in beiden Gruppen 100 %. Das
Wachstumsverhalten der subkutanen Tumore war hier nicht signifikant
unterschiedlich, die Tiere zeigten zu Beginn eine gleichmäßige Zunahme des
Tumorvolumens (Fig. 9 a).
Allerdings trat bei den Tumoren der parentalen Zelllinie ab der dritten
Woche
eine
Wachstumsstagnation
ein.
Die
Tiergewichte
blieben
im
Versuchszeitraum konstant (Fig. 9 b).
Bei Überprüfung auf Luciferase-Expression nach i.p.-Luciferin-Injektion in
vivo war Biolumineszenz bei 100 % der Tumore bereits nach 1 s Belichtungszeit
nachweisbar. Auch hier konnte eine Metastasierung weder im in vivo-Imaging
noch visuell während der Nekropsie nachgewiesen werden.
Abgesichert durch die gesammelten Erfahrungen aus den Versuchen mit
den subkutanen Modellen konnten die Spendertumor-Fragmente orthotop
implantiert werden.
37
55
AsPC-1 s.c.
(n=10)
AsPC-1 s.c. LN
(n=8)
50
1,0
AsPC-1 s.c.
(n=10)
AsPC-1 s.c. LN
(n=8)
45
Tiergewicht (g)
Tumorvolumen (cm³)
1,5
0,5
0
10
20
30
a)
40
40
35
30
0
Tag
c)
10
20
30
40
b)
Tag
d)
Fig. 9 – Subkutaner AsPC-1-Versuch.
a) Tumorwachstum in cm³ – ab der 3. Woche wiesen die Tumoren der parentalen Zelllinie kein
weiteres Wachstum auf.
b) Tiergewichte in g – parallele Kurven im Verlauf (da die Tiere schon ausgewach-sen waren,
kam es zu keiner Gewichtszunahme).
c & d) Subkutane AsPC-1 LN Tumoren 2 Wochen nach Implantation (exemplarisch die Tiere
360/05 [links] 361/05 [rechts]).
c) Im Rohbild zeigt sich im Bereich des Primärtumors bei Tier 360 eine durch zentrale
Tumornekrose entstandene Verschorfung (Tumornabel).
d) Das Imaging-Signal von Tier 360 zeigt eine Aussparung im Bereich des Tumornabels.
38
4.3. Generierung der orthotopen Xenograftmodelle
In diesem ersten orthotopen Experiment sollten grundlegende Fragen zur
methodischen Durchführbarkeit des Projektes geklärt werden. Dabei stand an
erster
Stelle,
herauszufinden,
ob
die
verwendeten
Nacktmäuse
die
Tumorfragmente tolerierten oder Abstoßungsreaktionen z.B. in Form einer
Pankreatitis zeigten.
Außerdem sollte eruiert werden, ob das menschliche Tumorgewebe im
murinen Pankreas überlebens- und wachstumsfähig war. Des Weiteren sollte die
Frage geklärt werden, ob und in welchen Organen in diesem Modell
Metastasierung zu beobachten war. Der Vergleich der Tumoren aus der originalen
und der transduzierten Zelllinie sollte mögliche Unterschiede bezogen auf
Wachstumsverhalten und Metastasierungsmuster demaskieren.
Als weiterer wichtiger Punkt sollte die Biolumineszenz-basierte in vivoImaging-Methode in Bezug auf die gestellten Erwartungen überprüft werden.
4.3.1. Das orthotope Xenograftmodell MIA PaCa-2 /ELN
Der Versuch schloss 20 Mäuse ein, 10 mit nativen MIA PaCa-2 Tumoren
(MIA-Gruppe) und 10 mit MIA PaCa-2 ELN Tumoren (ELN-Gruppe).
Makroskopisch vitale Bereiche der subkutanen Spendertumoren wurden in
etwa 1 mm³ große Würfel zerteilt und in den Pankreasschwanz von Nacktmäusen
eingebracht. Bereits etwa 3 Tage nach der Operation waren die Wunden der
meisten Tieren verheilt (Kap. 3.2.2., Fig. 3). Endzündungsreaktionen zeigten sich
nicht. Der Erfolg der Implantation wurde 7 und 14 Tage nach dem Eingriff durch
die Messung der Luciferase-Aktivität im in vivo-Assay kontrolliert.
4.3.1.1. Die parentale MIA PaCa-2 Gruppe
Die
Tiere
wiesen
während
des
Experimentes
eine
gleichmäßige
Gewichtszunahme von 31,79 g +/- 1,04 g bei bis 35,72 g +/- 1,75 g bei anfangs
n=10 und n=8 am Ende des Versuches auf (Fig. 10).
39
Im Verlauf waren alle Tiere vital und frei von Krankheitszeichen. Zwei Tiere
erreichten nach 7 Wochen abbruchpflichtige Tumorgrößen von etwa ca. 2 cm
Durchmesser und mussten getötet werden. 9 Wochen nach Implantation wurden
die übrigen 8 Tiere getötet.
40.0
MIA PaCa-2
(n=10)
MIA PaCa-2 ELN (n=10)
37.5
Tiergewichte (g)
35.0
32.5
30.0
27.5
0
10
20
30
40
50
60
Tag
Fig. 10 – Orthotopes Xenograft-modell MIA PaCa-2 /ELN.
Tiergewichte im Versuchsverlauf – Die parallelen Kurven zeigen ein gleichmäßiges Wachstum in
beiden Gruppen ohne krankheitsbedingten Gewichtsverlust.
Die Nekropsie zeigte bezogen auf alle 10 Tiere eine Tumor-Anwachsrate von
70 %, wobei 2 Tiere nicht orthotop angewachsene Tumore trugen. In den übrigen 5
Tieren wurden orthotope Tumoren mit einer ex vivo-Tumorgröße von 2,38 cm³
+/- 0,54 cm³ und einem Tumorgewicht von 2,23 g +/- 0,61 g gefunden.
Makroskopische Metastasierung wurde bei 40 % der orthotopen Tiere in Milz,
Leber, Zwerchfell beobachtet.
4.3.1.2. MIA PaCa-2 ELN-Gruppe
In vivo
Die Tiere zeigten im Verlauf des Experimentes eine gleichmäßige
Gewichtszunahme von 30,45 g +/- 1,07 g bei n=10 zu Beginn auf 36,78 g +/- 0,84
g bei n=6 zu Versuchende (Fig. 10).
40
4 Tiere starben nach 6 Wochen durch an Kreislaufversagen nach
Injektionsnarkose, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erschwert. Ansonsten
zeigten die Tiere keine Krankheitszeichen und wurden erst nach Erreichen
abbruchpflichtiger Tumorgrößen getötet.
Im Biolumineszenz-Imaging entsprach die Anzahl der signalgebenden Tiere
bereits bei der ersten Bildgebung (zwei Wochen nach Implantation) 50 %. Der
Tumor eines Tiers (338/05) konnte in der 3. Woche per CCD-Kamera als nicht
orthotop identifiziert werden (Fig. 11 c & e). Metastasen waren bei den Tieren mit
orthotopen Luciferase-Signalen in der 7. Woche zu 33 %, in der 8. Woche zu 66 %
in der 9. Woche zu 100 % im Biolumineszenz-Imaging zu beobachten. Im Verlauf
des Versuches deutete eine Signalverstärkung auf Wachstum der Tumoren hin.
Nekropsie gesamt
Durch das Versterben von 4 Tieren wurde die Nekropsie dieser Gruppe für
diese Tiere nach 6 Wochen und für die verbleibenden 6 Tiere 11 Wochen nach
Implantation durchgeführt. Die makroskopische Anwachsrate betrug für alle 10
Tiere bei Nekropsie 60 %. Insgesamt bei 5 Tieren wurden visuell detektierbare
orthotope Tumoren gefunden (Fig. 11 a & b).
Es zeigte sich, dass der Tumor des Tieres mit dem durch das in vivoImaging als nicht orthotop identifzierten Signal tatsächlich nicht im Pankreas,
sondern im abdominalen Fettgewebe lokalisiert war (Fig. 11 c & d).
Nach Durchführung des ex vivo-Luciferase-Assays konnte die Anwachsrate
auf 70 % bei insgesamt 6 orthotopen Tumoren korrigiert werden, wobei zusätzlich
ein visuell nicht detektierbarer orthotoper Tumor bei einem der 4 früh
verstorbenen Tiere durch den ex vivo-Luciferase-Assay erkannt wurde.
Nekropsie nach 6 Wochen
Die Nekropsie der nach 6 Wochen verstorbenen 4 Tiere erbrachte eine
Tumorgröße von 0,41 cm³ +/- 0,38 cm³ (Fig. 10 b) und ein Tumorgewicht von
0,41 g +/- 0,37 g bei 2 visuell erkannten orthotopen Tumoren. Bei makroskopisch
negativem Befund zeigte der Luciferase-Assay in einem Tier Tumorgewebe im
Pankreas und in 3 der 4 der Tiere Metastasen vorwiegend in Milz, Leber und den
inguinalen Lymphknoten (Fig. 12 a).
e)
H
e
Kn rz
oc
he
n
Ly
m
ph
k
10000
f)
Fig. 11 – In vivo-Imaging und Nekropsie im MIA PaCa-2/ELN-Modell.
te
n
e
m
ng
no
Lu
D
ar
en
r
ilz
be
M
ag
Le
M
Makroskopisch
Luciferase-Assay
N
ie
re
L
un
Ly
m
ge
ph
kn
ot
en
D
ar
m
d)
ag
en
8
M
0
s
2
ea
MIA PaCa-2 (n=10)
ilz
4
nk
r
6
Anzahl positiver Tiere
MIA PaCa-2 ELN (n=4+6)
Tu
m
or
10
Pa
ng
e
kn
ot
en
Lu
ar
m
en
a)
M
re
as
Le
be
r
Pa
nk
Lichtemission (LE, log 10)
Ly
m
ph
ilz
be
r
ag
D
M
Le
s
8
M
nk
re
a
c)
Pa
Tu
m
or
Anzahl positiver Tiere
41
b)
10
MIA PaCa-2 ELN (n=4+6)
6
4
2
0
100000
343
342
1000
100
10
42
a) Tiere 338/05 und 339/05.
In vivo-Overlay-Bild der Tiere 338/05 und 339/05 (letzter Meßzeitpunkt 1 Tag vor Nekropsie (11
Wochen nach Fragmentimplantation) – 338/05 (links) zeigt das vorbeschriebene Signal eines
aberranten, abdominal gelegenen Tumors, 339/05 mit orthotopem Tumor-Signal. Im NekropsieSitus von Tier 338/05 ist ein 1,3 cm x 1,05 cm messender Tumor im Fett des unteren Abdomens zu
erkennen.
b) Tiere 340/05 und 341/05.
In vivo-Overlay-Bild der Tiere 340/05 und 341/05 (letzter Meßzeitpunkt) – Tier 340 zeigt kein
Signal, hier wurde weder in der Nekropsie noch im ex vivo-Luciferase-Assay Tumorgewebe
gefunden. Tier 341 mit schwachem, aberrantem Signal an der unteren Bauchwand. Im
Nekropsie-Situs von Tier 341/05 war makroskopisch kein Tumor im Pankreas zu erkennen, der ex
vivo-Assay zeigte allerdings ein signifikantes Signal im untersuchten Pankreasgewebe. Das in
vivo-Signal konnte der, auf den ersten Blick, unauffälligen Struktur im Fettgewebe der unteren
Bauchwand (gestrichelt umrandet) zugeordnet werden.
c & d – Tumor- und Metastasenverteilung bei Nekropsie.
c) Die visuell erkennbaren Tumoren und Metastasen zeigten in beiden Gruppen ein ähnliches
Verteilungsmuster. Zu beachten sind die abweichenden Zeitpunkte der Nekropsien. In der
transduzierten Gruppe wurde der nicht orthotope Tumor mit eingeschlossen.
d) Nekropsie der MIA PaCa-2 ELN-Gruppe - Vergleich der visuell erkennbaren Tumor- und
Metastasenverteilung (siehe e) und der qualitativen Verteilung des im Luciferase-Assay
detektierten Tumorgewebes. Im Luciferase-Assay wurden Gewebshomogenisate einzelner Organe
nach Zusatz von Luciferin auf Lumineszenz untersucht und so Tumorgewebe in den Organen
unterhalb der visuellen Grenze nachgewiesen.
g & h – Tiere 342/05 und 343/05
g) In vivo-Overlay-Bild der Tiere 340/05 und 341/05 (letzter Meßzeitpunkt) – Neben den
Primärtumoren sind weitere Spots als deutliche Metastasierungszeichen zu erkennen. Bei der
Nekropsie zeigten beide Tiere massive Metastasierung im gesamten Abdomen.
h) Ex vivo-Luciferase-Assay der Organe – In beiden Tieren konnte in alle überprüften Organen
Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die Signale des Assays sind logarithmisch dargestellt.
Nekropsie nach 11 Wochen
11 Wochen nach Implantation wurden die übrigen 6 Tiere der Nekropsie
zugeführt. Die ex vivo-Tumorgröße erreichte hier durchschnittlich 2,95 cm³ +/1,73 cm³ bei einem Tumorgewicht von 2,243 g +/- 1,46 g. Rein optisch konnten 3
Tumoren als orthotop und einer wie vorbeschrieben als nicht orthotop im
Abdominalfett gelegen erkannt werden (Fig. 11 c & d).
43
2 der 3 orthotopen Tiere zeigten makroskopische Metastasierung in Milz
und Bauchfell. Der Luciferase-Assay konnte bei allen orthotopen Tiere vorher
nicht sichtbare Metastasen vorwiegend in Milz, Magen, Leber und Wirbelsäule
nachweisen (Fig. 12 b).
100000
100000
Nekropsie nach 11 Wochen (n=6)
Nekropsie nach 6 Wochen (n=4)
1000
1000
100
100
AU (log 10)
10000
ph
kn
ot
en
Ly
m
Lu
ng
e
D
ar
m
en
M
ag
er
m
or
/P
Le
b
en
M
ilz
1
ph
kn
ot
Ly
m
Lu
ng
e
ar
m
D
ag
en
M
Le
be
r
M
ilz
Tu
m
or
/P
an
kr
ea
s
1
10
an
kr
ea
s
10
Tu
AU (log 10)
10000
a)
b)
Fig. 12 –Quantitative und qualitative Verteilung des Tumorgewebes im LuciferaseAssay (MIA PaCa-2 ELN-Gruppe).
a) Nekropsie von 4 Tieren nach 6 Wochen – Ein makroskopisch nichtfestgestellter Tumor im
Pankreas wurde durch den ex vivo-Luciferase-Assay erkannt. Bereits nach 6 Wochen konnten
Metastasen nachgewiesen werden, was makroskopisch nicht möglich war (d.n.s.).
b) Nekropsie von 6 Tieren nach 11 Wochen – In 2 Tieren wurde kein verbliebenes Tumorgewebe
nachgewiesen.
Die 2 Tiere, welche im Biolumineszenz-Imaging signalnegativ waren und
bei denen bei Nekropsie keine Tumoren gefunden wurden, zeigten im ex vivo
Luciferase-Assay ebenfalls keine Signale.
44
4.3.2. Das orthotope Modell AsPC-1 LN
In vivo
Aufgrund der Daten aus den subkutanen Versuchen und dem MIA PaCa-2Modell und um die Anzahl der Versuchstiere zu reduzieren, wurde beschlossen,
auf eine Vergleichsgruppe mit nicht transduzierten AsPC-1 Tumoren zu verzichten.
35.0
1.5
AsPC-1 LN orthotop
5
Tumorvolumen (cm³)
n=10
32.5
4
27.5
25.0
22.5
0
10
20
30
40
50
1.0
3
2
0.5
1
0.0
0
850
855
853
854
Tag
852
851
857
848
856
Lichtemission (RLE)
Tumorvolumen (cm³)
p=0.4590
30.0
Tiergewicht (g)
Assay-Signal (RLE)
849
Tiernummer
a)
b)
10 5
10 4
10 3
10 1
Ly
m
ph
kn
ot
en
m
Lu
ng
e
D
ar
M
ag
en
Le
be
r
Tu
m
or
c)
M
ilz
10 0
Pa
nk
re
as
AU (log)
10 2
d)
Fig. 13 - Orthotoper AsPC-1 LN-Versuch.
a) Änderungen der Tiergewichte – Die Gewichtsverluste von durchschnittlich 1 g nach 1, 3 und5
Wochen sind verursacht durch die verminderte Flüssigkeits- und Nahrungsaufnahme der Mäuse
nach der Narkose zur Durchführung des in vivo-Imaging, wurden allerdings bei der folgenden
Gewichtsmessung (nach 3 Tagen) jeweils vollständig kompensiert.
45
b) gemessene Tumor-Volumina in aufsteigender Größe und Luciferase-Assay-Signale der Tumore
bei Nekropsie nach 8 Wochen – Die Korrelation zwischen realer Tumorgröße und in vivo-Signal
ist mit p=0,4590 nicht signifikant.
c) Nachweis des nicht orthotop gelegenenen Tumors bei Maus 855/05 (rechtes Tier) – Bereits 10
Tage nach Fragmentimplantation konnte die nicht orthotope Lage der Haupttumormasse an der
unteren vorderen Bauchwand gezeigt werden. Zum Vergleich sieht man eine orthotope Lage bei
Tier 854/06. In der Nekropsie wurden diese in vivo-Imaging-Daten bestätigt (d.n.s.).
d) Metastasierte AsPC-1-Tumore im in vivo-Imaging nach 8 Wochen – Quantitative und
qualitative Signalverteilung im Luciferase-Assay in der AsPC-1 LN-Versuchsgruppe.
Nekropsie
Das Experiment schloss dementsprechend 10 Mäuse mit AsPC-1 LN
Tumoren ein. Die Take-Rate im in vivo-Luciferase-Imaging betrug 90 % (100 % im
Luciferase-Assay bei Nekropsie nachgewiesen). Bereits nach 10 Tagen waren 80 %
bezüglich der Biolumineszenz signalpositiv, ein Tumor wurde signalgemäß als
aberrant identifiziert. Bei Nekropsie war die größte Tumormasse im Abdominalfett
gelegen* (Fig. 13 b). Das Biolumineszenz-Imaging zeigte nach 2,5 Wochen 40 %
Metastasen bei 90 % signalpositiven Tieren, nach 5 Wochen 100 % Metastasen bei
100
%
signalpositiven.
Im
Verlauf
deutete
eine
Signalverstärkung
auf
Tumorwachstum hin.
Aufgrund stark progredienter Krankheitszeichen bei 2 Tieren wurde die
gesamte Gruppe nach 8 Wochen terminiert. Die durchschnittliche Größe der
visuell orthotopen Tumoren (9 von 10) betrug 0,71 cm³ +/- 0,13 cm³ (Fig 13 a) bei
einem Tumorgewicht von 0,69 g +/- 0,09 g.
Mit bloßem Auge erkennbare Metastasen waren bei 100% der Mäuse zu
verzeichnen. Bei makroskopisch negativem Befund zeigte der Luciferase-Assay in
einem Tier Tumorgewebe im Pankreas. 100% der Mäuse wiesen ex vivo im
Luciferase-Assay, bei zum Teil makroskopisch negativem Metastasenbefund,
positive Signale in verschiedenen Organen auf (Milz 90 %, Magen 80 %, Leber 70
%, Lymphknoten 50 %, Lunge 40 %).
Weiterhin
Metastasierung
konnte
im
in
drei
Fällen
eine
Bereich
des
Dünndarmes
makroskopisch
sowie
des
vermutete
versorgenden
Mesenteriums ausgeschlossen werden, da der ex vivo-Assay für die Därme der
46
betreffenden Tiere negativ blieb. Hierbei handelte es sich sehr wahrscheinlich um
aktivierte Peyer’sche Plaques und mesenteriale Lymphknoten.
4.4. Therapiestudie GemLip vs. Gemcitabin
Im letzten Teil des Projektes wurden die antitumoralen Wirkungen von
herkömmlichem
Gemcitabin
(GemKonv)
mit
denen
der
im
vesikulären
Phospholipidgel verkapselten Formulierung (GemLip) unter Nutzung des
vorbeschriebenen MIA PaCa-2 ELN Xenograft-Modells vergleichend untersucht.
Die Aufteilung der Tiere in Therapiegruppen erfolgte 14 Tage nach
Implantation. Die Quantifizierbarkeit der Lichtemmission der Tumoren wurde
hierbei als stellvertretende relative Größe zur Randomisierung der Tiere benutzt
(Fig. 15 a). Zu diesem Zeitpunkt waren die Tumoren von außen noch nicht
palpabel.
Die Effekte der Behandlung wurden wöchentlich mit dem in vivo-CCD-KameraSystem überwacht und nach 5 Wochen nach Versuchsende jeweils durch
Tumorgröße
und
–gewicht
sowie
durch
in
vitro
Luciferase-Assay
der
Primärtumoren und potentiell metastasentragender Organe verifiziert.
4.4.1. In vitro-Wirksamkeit, Toxizität und Dosisfindung
Die Zelllinie MIA PaCa-2 ist in der Literatur als sensibel auf konventionelles
Gemcitabin beschrieben worden
[42-45].
Vor Beginn des Therapieversuches war es
notwendig, die Chemosensitivität sowohl der parentalen Zelllinie als auch der der
transduzierten Zelllinie MIA PaCa-2 ELN gegenüber dem herkömmlichen
Gemcitabin und der liposomalen Formulierung zu ermitteln (Fig. 14).
Um Wachstumscharakteristiken und Chemosensitivität zu bestimmen,
wurde
ein
Chemosensibilitätstets,
der
BrdU-(5-Bromo-2’-deoxyuridine)-
Proliferations-Assay verwendet (AG Prof. Dr. U. Massing, KTB Freiburg). In der
unbehandelten Zellkultur (zu Beginn des Assays) zeigten beide Zelllinien die
gleichen Proliferationsraten Auch die IC50-Werte für Gemcitabin, 8 nM (parental)
47
und 19.4 nM (ELN), waren ähnlich (Fig.14 a) und im Rahmen bisher beschriebener
Werte für MIA PaCa-2 [11,36,46]. (Fig. 11 a).
MIA PaCa-2
IC50 = 8.13 nM
1.5
MIA PaCa-2
IC50 = 20.2 nM
1.5
MIA PaCa-2 ELN
IC50 = 15.8 nM
1.0
1.0
0.5
0.5
RE
RE
MIA PaCa-2 ELN
IC50 = 19.4 nM
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Gemcitabin (nM; log)
2.5
3.0
3.5
GemLip (nM; log)
a)
b)
Fig. 14 – IC50-Kurven zur Sensitivitätsbestimmung der parentalen und
transduzierten Zelllinien gegenüber GemKonv und GemLip in
vitro im BrdU-(5-Bromo-2’-deoxyuridine)-Assay.
(Gemcitabin-Konzentration gegen relative Einheiten).
a & b) Kulturen von MIA PaCa-2 und MIA PaCa-2 ELN wurden in 96 well-Platten angesetzt.
Nach 24 Stunden wurden Gemcitabine (a) oder GemLip (b) in festgelegten Konzentrationen
hinzugegeben. Nach weiteren 48 Stunden wurde BrdU ergänzt. Wiederum 4 Stunden später
wurden die Zellen lysiert. Der Anteil des in die DNA eingebautem BrdU wurde via ELISA
quantifiziert.
Die
liposomale
Formulierung
von
Gemcitabin
zeigte
im Vergleich
zur
Standardformulierung ähnliche in vitro-Aktivität für beide Zelllinien (Fig. 14 b).
Folglich waren beide Zelllinien empfindlich gegenüber den zytostatischen
Substanzen.
Ein
Hinweis
auf
transduktionsbedingte
Veränderung
von
Wachstumsverhalten oder Chemosensitivität von MIA PaCa-2 ELN zeigte sich
nicht.
Zur Dosisfindung wurden einerseits die MTD-Werte für eine ältere GemLipFormulierung und das klinisch verwendete Gemcitabine (Gemzar®, 360-480
mg/kg) aus Vorexperimenten der Forschungsgruppe U. Massing mit Nacktmäusen
ohne implantierte Tumoren herangezogen [47].
48
Außerdem wurde eine kleine Toxizitäts-Studie mit der aktuellen GemLipFormulierung durchgeführt. Bei wöchentlicher i.v. Applikation über 3 Wochen lag
die MTD hier bei 15-20 mg/kg, wobei zum Teil deutliche Toxizitätszeichen
beobachtet wurden.
Da im Hauptversuch eine Applikationsdauer von mindestens 5 Wochen
vorgesehen war, wurden die Dosierungen weit unter der MTD gewählt, um TierVerluste aufgrund von toxischen Nebenwirkungen zu minimieren.
So wurde Gemcitabin in etwa der halben MTD (240 mg/kg) verabreicht.
GemLip wurde bei MTD/4 und MTD/2 getestet, entsprechend 4 mg/kg und 8
mg/kg. Durch visuelles Monitoring der Gesundheit der Tiere und Beobachten der
Gewichtsverläufe dreimal wöchentlich sollte erkannt werden, ob die Tiere die
Therapie tolerierten.
4.4.2. Gruppierung und Verlaufsmonitoring
Bereits 7 Tage nach der Insertion der Tumorfragmente zeigten 90% der Mäuse ein
Signal in der Pankreas-Region. Eine Woche später betrug die Rate der
signalpositiven Mäuse 93 % (51/55 Tieren mit detektierbarem Tumor).
Zu diesem Zeitpunkt wurden die Tiere über Quantifizierung der
Lichtsignale (Kap. 3.6.2.) in die Untergruppen eingeteilt (Fig. 15 a). Alle
Substanzen wurden einmal wöchentlich i.v. über eine Schwanzvene appliziert. In
keiner der Gruppen konnte im Verlauf ein pathologischer Gewichtsverlust
beobachtet werden (Fig. 15 b), was auf eine allgemein gute Toleranz gegenüber der
Therapie schließen ließ.
Im siebenwöchigen Verlauf wurden Tumorwachstum und dementsprechend
auch die eventuellen Therapieeffekte in vivo indirekt über die Biolumineszenz
verfolgt. Den Tieren wurde einmal pro Woche Luciferin i.p. injiziert, das emittierte
Licht mit einer CCD-Kamera gemessen und die Signale softwaregestützt
quantifiziert (Fig. 15 c). Die Werte der Tumoren in der unbehandelten
Kontrollgruppe nahmen mit Ausnahme der letzten Messung regelmäßig zu. Der
Grund für den Signalabfall des letzten Meßtages ist nicht klar.
12
35.0
9
32.5
6
5.0
30.0
Tiergewicht (g)
Kontrolle
2.5
25.0
je n=10
22.5
10
20
30
40
50
120
Kontrolle
100
GemLip 4
VPG
25
0
0
10
GemLip 8
80
GemLip 8
Lichtemission (VLE)
Lichtemission (VLE)
VPG
b)
GemKonv
50
GemLip 8
Tag
Kontrolle
75
GemLip 4
0
a)
100
GemConv
27.5
VP
G
8
G
em
Li
p
4
G
em
Li
p
G
em
C
on
v
0.0
Ko
nt
ro
lle
Lichtemission (VLE)
49
20
30
40
50
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Tag
c)
Tag
d)
Fig. 15 ― Gruppierung und Verlaufsmonitoring durch in vivo-Imaging.
a) Einteilung der Therapie-Gruppen zu Versuchsbeginn anhand der in vivo-Imaging-Signale 14
Tage nach Implantation– Die Gruppenzuteilung erfolgte durch graphische Quantifizierung der
Lichtemission in in vivo-Assay (Kap. 3.6.). Der Durchschnitt der Signalstärke in der GemLip 4Gruppe war geringfügig niedriger, aber nicht signifikant different von den anderen Gruppen.
b) Tiergewichte zum Verlaufsmonitoring des Gesundheitszustandes der Tiere – Stetige
Gewichtssteigerung
in
allen
Gruppen
spricht
gegen
toxische
oder
tumorbedingte
Beeinträchtigung der Tiere. Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen waren ebenso nicht zu
beobachten.
c & d) Tumor-Wachstumskurven der 5 Therapiegruppen im in vivo-Imaging. Während bei fast
allen Gruppen keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe zu sehen sind (c), zeigt sich im
Vergleich der Kontrollgruppe mit der GemLip 8 mg-Gruppe (d) eine deutliche Reduktion des
Tumorwachstums. Unerwartet war der Signal-Abfall in der Kontrollgruppe zum Zeitpunkt der
letzten Messung.
50
Zu bemerken ist, dass ähnliche Abweichungen zwischen zwei Meßpunkten
gelegentlich auch vorher auftraten, sich aber normalerweise am folgenden Meßtag
aufhoben, wie beispielweise in der GemKonv-Gruppe zwischen dem 20. und 35.
Tag (Fig. 15 d).
7
Tage
14
Tage
28
Tage
21
Tage
48
Tage
42
Tage
35
Tage
a)
Lichtemission (VLE)
40
B eginn der Therapiephas e
30
1122/05 (GemLip 8)
20
1123/05 (GemKonv)
10
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tage nach Implantation
b)
Fig. 16 – Die in vivo-Biolumineszenz der Tiere 1122/05 (GemLip 8 mg-Gruppe)
und
1123/05
(GemKonv-Gruppe)
exemplarisch
im
Verlauf
des
Therapieversuches.
a) Overlay-Bilder des in vivo-Assays im Verlauf von 48 Tagen.
b) Verlaufskurven der quantifizierten in vivo-Signale – Das Signal von Tier 1122 erreicht nach
anfänglichem Wachstum ein niedriges Plateau. Bei Tier 1123 wird das Signal kontinuierlich
stärker und bleibt nach 5 Woche auf hohem Niveau konstant. Zu bemerken sind die
wahrscheinlich Methodik-bedingten Signalausfälle (Tier 1123 am 21. Tag, Tier 1122 am 48. Tag).
Die Kurven bestätigen die anhand der Overlays gemachten Beobachtungen. Die ex vivoTumorvolumina betrugen 0,45 cm³ (1122) und 1,69 cm³ (1123).
Überraschenderweise zeigte das herkömmliche Gemcitabin in der 240 mg
Dosierung im in vivo-Imaging keine signifikante Wirkung auf das Wachstum der
Tumoren. Ebenso waren in der GemLip 4 mg-Gruppe und in der VPG-Gruppe nur
51
tendenzielle, nicht signifikante Effekte zu beobachten. Die Behandlung mit 8
mg/kg jedoch führte im Verlauf der letzten drei Wochen zu einer starken
Inhibition des Tumorwachstums im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine
Tumorregression war allerdings nicht zu erkennen.
Zur letzten Biolumineszenz-Messung zeigte sich ein unerwarteter Abfall des
durchschnittlichen Tumorsignals der Kontroll-Gruppe.
Als Beispiele für die Entwicklung der Signalintensität im Experiment über
den gesamten Zeitraum sind in Fig. 16 die Verläufe der Tiere 1122/05 aus der
GemLip 8 mg–Gruppe und 1123/05 aus der GemKonv-Gruppe als in vivoImaging-Bildreihe und als VLE-Kurve dargestellt. Der Tumor von Tier 1122
erzeugte permanent niedrige Signale. Das Endvolumen dieses Tumors betrug etwa
0,45 cm³. Bei Tier 1123 war in den ersten 5 Wochen eine fast stetige
Signalzunahme zuverzeichnen. Danach stellte sich ein Plateau auf hohem Niveau
ein. Dieser Tumor maß bei Nekropsie rund 1,69 cm³.
Bei sonst relativ homogenen Kurvenverlauf imponierten zwei unerwartet
niedrige Signale (Tier 1123: 3. Woche; Tier 1122: 7. Woche). Ähnliche Phänomene
wurden gelegentlich bei verschiedenen Tieren während der Experimente
beobachtet, zeigten sich in der Regel beim nächsten Meßtermin nicht mehr.
4.5. Therapie-Effekte auf die Primärtumoren – Endpunktanalyse
Nach 5 Wochen Behandlung respektive 7 Wochen nach Tumorimplantation
wurde der Therapieversuch beendet. Die Biolumineszenz wurde ein letztes Mal in
vivo gemessen. Anschließend wurden die Tiere durch zervikale Dislokation schnell
und schmerzarm getötet. Die in vivo-Imaging-Werte der letzten Messung wurden
denen zu Beginn der Therapiephase gegenübergestellt (Fig. 17 a). Es zeigte sich,
dass mit Ausnahme der GemLip 8mg-Tiere alle Gruppen eine signifikante
Zunahme der Signalintensitäten zu verzeichen hatten.
Die
Datenerhebung
der
Nekropsie
beinhaltete
zunächst
die
Fotodokumentation der Primärtumoren in situ, die Zählung der visuell
feststellbaren, oberflächlichen Metastasen
an Pankreas, Leber, Milz, Magen,
52
Darm, Lunge, Bauchfell, Zwerchfell und den lokalen Lymphknoten sowie die
Messung von Tumorgewicht und –volumen.
Bei den Tumorvolumina waren einzig die Unterschiede zwischen der
unbehandelten Kontrollgruppe (V= 1.52 cm³ ± 0.40 cm³, n=10) und der GemLip
8mg-Gruppe (V= 0.48 cm³ ± 0.09 cm³, n=10) mit
― p=0,019 statistisch
*
signifikant (Fig. 17 b). Die T/C-Rate (treated/control) betrug 31 %.
Bei
hypothetischem
Ausschluß
des
jeweils
höchsten
betreffenden beiden Gruppen würde sich die Signifikanz auf
**
Wertes
der
― p=0,0024
erhöhen (Fig. 17 b gestrichelt).
200
8.5
**
p=0.0067
***
p=0.0002
-p=0.0899
***
p=0.0007
***
p=0.0002
*
**
6.5
150
p=0,0192
p=0,0024
a)
en
er
lip
os
om
8m
g
Le
p
G
em
Li
4m
g
p
m
g
24
0
bi
n
7
p=0,0021
0
lle
2
1
G
em
Li
p
G
em
Li
p
7
G
2
Le
er
-V
P
7
8m
g
2
4m
g
7
Li
2
G
em
7
ci
ta
bi
n
Ko
nt
ro
l
le
2
2
tro
0
G
em
AU
50
p=0,0938
Ko
n
100
G
em
ci
ta
Tumorvolumen (cm 3)
p=0,8986
4.5
3
b)
Fig. 17 - Therapieeffekte auf die Primärtumoren – Endpunktanalyse.
a) In vivo-Imaging-Signale der Primärtumoren – Vergleich jeweils 2 Wochen und 7 Wochen (1
Tag vor Nekropsie) nach orthotoper Transplantation.
b) Volumina der Primär-Tumore bei Nekropsie – Die Tumore der GemLip 8mg-Gruppe waren bei
Versuchsende signifikant kleiner als die der Kontroll-Gruppe (* - p=0,0192). Zwischen den
anderen Gruppen wurde keine Signifikanz erreicht. Durch Eliminierung der jeweils stärksten
Signale (gestrichelt eingekreist, neuberechneter Durchschnitt gestrichelt) nach der Formel
Vmax > 2*Vmax-1 (größter Tumor mehr als doppelt so groß wie der zweitgrößte)
verbesserte sich die Signifikanz zwischen Kontrolle und GemLip 8mg auf
**
- p=0,0024. Obwohl
mit * - p=0,0938 nicht signifikant, zeigte sich nun auch in der Gemcitabin 240 mg-Gruppe eine
deutliche Tendenz der Tumorwachstumsverzögerung gegenüber der Kontrolle.
53
Sowohl die Werte der GemKonv-Gruppe als auch die der mit GemLip 4 mgDosierung zeigten in keiner der Endpunktanalysen einen signifikanten Effekt auf
das Tumorwachstum.
Lediglich bei der Messung des Tumorvolumens erreichte die GemKonvGruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe nach hypothetischem Ausschluß des
jeweils stärksten Signales (Elimienierung statisctisch relevanter Aussreißer) in der
Kontrolle und in der GemKonv-Gruppe mit p=0,0938 fast Signifikanz (17 b
gestrichelt) und eine T/C-Rate von 61 %.
4.6. Therapie-Effekte auf die Metastasierung – Endpunktanalyse
Im Verlauf der Therapiestudie zeigten sich im in vivo-Luciferase-Assay
sukzessiv mehr Tiere mit Signale, die etwa aufgrund multipler getrennter Signale
oder mehrerer Maximalwerte innerhalb eines Hauptsignal auf die Ausbildung von
Metastasen schließen ließen (Fig. 18 a/i). Genauere Aussagen über die Lokalisation
der vermuteten Absiedelungen konnten anhand dieser Daten nur in Einzelfällen
gemacht werden. Zum Zeitpunkt der letzten Messung waren in 31 von 50 Tieren
(62 %) entsprechende Signale zu verzeichnen.
Während der Nekropsie wurden die Tiere auf oberflächliche Metastasen
untersucht. In 14 Tieren (28 %) wurde eine oberflächliche Metastasierung
festgestellt. Die Filiae waren vorwiegend in der Milz (7 / 14 %) und im Bereich des
Intestinums (6 / 12 %) lokalisiert.
Nach der Nekropsie wurde zur Detektion und Quantifizierung der
Metastasenlast
ein
Luciferase-Assay
der
metastasenverdächtigen
Organe
(Pankreas, Leber, Milz, Magen, Darm, Lunge, lokale Lymphknoten) durchgeführt.
Wurde während der Nekropsie eine Metastase entdeckt (Fig. 18 a/ii), konnte der
Fund gewöhnlich durch den ex vivo-Luciferase-Assay bestätigt und erweitert (Fig.
18 a/i-iii).
Als Hauptziel der systemischen Metastasierung der MIA PaCa-2 ELNTumoren wurde die Leber identifiziert. Insgesamt 40 von 50 Tieren (80 %) wiesen
ex vivo eine messbare Luciferase-Aktivität in der Leber auf (Fig. 18 b).
54
10000
100
10
a)
i
en
ph
kn
ot
Lu
ng
e
Ly
m
In
te
st
in
um
M
Tu
m
Le
be
r
M
ag
en
ilz
1
or
1/
10
Pa
nk
re
as
Lichtemission (VLE log 10)
Tier 1076
1000
ii
iii
75
50
25
Lu
ng
e
Ly
m
ph
kn
ot
en
In
te
st
in
um
M
ag
en
M
ilz
Le
be
r
0
Pa
nk
re
as
Lichtemission (VLE %)
100
b)
2500
2100
Total
g
en
Le
er
lip
os
om
G
em
Li
p
8m
4m
Li
p
G
em
G
em
n
24
0m
g
g
0
bi
rli
po
s
100
ci
ta
om
en
g
200
Le
e
p
Li
G
em
G
em
Li
p
8m
4m
g
m
24
0
ta
bi
n
G
em
ci
K
on
tr
ol
g
0
300
on
tr
ol
le
500
400
K
Lichtemission (VLE)
1000
le
Lichtemission (VLE)
500
1500
c)
Leber
2000
2000
d)
Fig. 18 ― Endpunktanalyse Metastasierung – Verteilung und Therapieeffekte.
a) Gegenüberstellung von in vivo-Luciferase-Signal (i), Nekropsie-Situs (ii) und ex vivoLuciferase activity (iii) am Beispiel von Tier 1076 (GemLip 4mg-Gruppe).
55
i. In vivo-Luciferase-Aktivität. Das Overlay-Bild wurde wie unter Kap. 3.6. beschreiben
generiert. Das größere Signal (Pfeil) entspricht höchstwahrscheinlich der Position der in a-ii
sichtbaren, oberflächlichen Milz-Metastase. Das kleinere Signal ist durch den mit 0,02 cm³ sehr
kleinen Tumor (Pfeilspitze) erklärt, welcher zusätzlich durch den unteren Milzpol verdeckt wird.
ii. Primär-Tumor und große Milzmetastase im Nekropsie-Situs. Nach der zervikalen Dislokation
wurde die Bauchhöhle eröffnet und digital fotografiert. Die Pfeile zeigen auf den kaum sichtbaren
Primärtumor (oberer Pfeil) und die Milzmetastase (unterer Pfeil).
iii. Ex vivo-Luciferase-Aktivität. Das Balken-Diagramm zeigt die logarhythmisch aufgetragene in
vitro-Lichtemission der Organ-Homogenisate des Tieres 1076. Der homogenisierte Tumor wurde
1/10 verdünnt, um die Signalstärke im messbaren Bereich zu halten.
b) Prozentualer Anteil der Zielorgane mit Luciferase-Aktivität im Gesamtkollektiv. Die
Fehlerbalken stellen die Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen dar. Die Leber wurde mit
ca. 80 % am häufigsten infiltriert. Obwohl zur Messung der Pankreata nur makroskopisch
Tumor-freies Gewebe verwendet wurden, zeigten ca. 70 % der Tiere positive Signale. Dies kann
auf eine diffuse Infiltration durch die MIA PaCa-2-Tumore deuten. Der verhältnismäßig hohe
Prozentsatz an makroskopisch vermuteten Metastasen im Bereich Intestinums wurde im
Luciferase-Assay nicht bestätigt.
c) Addierte Luciferase-Assay–Signale aller Organe. Die Werte der einzelnen Organe jedes Tieres
wurden zusammengefasst dargestellt. Die Datenwolken repräsentieren die Signale einzelner
Tiere innerhalb einer Gruppe. Bemerkenswert sind der relativ hohe Durchschnittswert
GemLip8mg- Gruppe und der sehr niedrige Wert der Leerliposomen-Gruppe.
d) Luciferase-Assay–Signale der Lebern als Hauptzielorgan der Metastasierung. Das Signal einer
Maus der GemLip 8 mg-Gruppe lag weit außerhalb des normalen Bereiches (Pfeil) und ist somit
verantwortlich für den überraschend hohen Durchschnitt der Gesamtgruppe (Pfeilspitze bei
hypothetischem Ausschluß).
Die weiteren, häufiger betroffenen Organe waren die Lunge (58 %), der
Magen (48 %) und die Milz (34 %). Soweit die Trennung zwischen normalem
Pankreas-Gewebe und Tumor makroskopisch möglich war, wurde dieses Material
separat auf Luciferase-Aktivität untersucht. In nur 28% der Tiere konnte Signalfreies und somit Tumor-freies Gewebe des Pankreas isoliert werden. Alle anderen
waren mehr oder weniger diffus von Tumorzellen infiltriert (Fig. 18 b).
Eine
quantitative
Analyse
der
Gesamtmetastasierung
und
der
Lebermetastasierung als Hauptziel der Filiarisierung (Fig. 18 c & d) durch in vitroBiolumineszenz der homogenisierten Organe zeigte in fast allen behandelten
Gruppen eine geringere Tumorlast im Vergleich zur Kontrolle, wenn auch in
keinem Fall stattistisch signifikante Unterschiede zu sehen waren.
56
Eine Ausnahme bildete überraschenderweise die Gruppe der mit 8 mg/kg
GemLip behandelten Tiere. Das hohe Durchschnittssignal im Luciferase-Assay war
hier auf ein Tier mit massiver Leberinfiltration (18 d – Pfeil) zurückzuführen. Alle
anderen Tiere der Gruppe wiesen Werte unter dem Durchschnitt der Kontrolle auf
(18 d – Pfeilspitze).
Bemerkenswert war, dass die auf Grundlage der durchschnittliche
Signalintensität quantifizierte Metastasenlast in der VPG-Gruppe verglichen allen
anderen Gruppen am niedrigsten war. Dieses Ergebnis zeigte sich sowohl in der
Gesamtmetastasierung als in der Metastasenlast der Lebern allein.
4.7. Histologische Aufarbeitung
Den
letzten
Punkt
der
Datengewinnung
stellte
die
histologische
Aufarbeitung der Karzinome und der Zielorgane der Metastasierung dar.
Es wurden sowohl Standardfärbungen zur Übersicht (Hämalaun-Eosin –
HE) als auch Tumor-selektive Färbungen auf immunologischer Basis (CytokeratinFärbung – CK) angelegt. Auf diese Weise konnten die Existenz von humanen
Tumorzellen im makroskopisch gesunden Pankreasgewebe bewiesen werden.
Die Aussagekraft von HE-Färbungen ist weitgehend auf die Darstellung
morphologischer
Unterschiede
begrenzt.
Zur
definitiven
Detektion
der
Tumorzellen wurde diese Färbetechnik durch eine immunhistochemische
Untersuchung auf der Basis einer humanspezifischen Pan-Cytokeratin-Färbung
durchgeführt. Gewebsmorphologische Unterschiede der HE-Schnitte konnten
somit mit der hochspezifischen, Antikörper-vermittelten Farbreaktion der CKTechnik korreliert werden.
In Fig. 19 a & b sind 2 Vergrößerungen von Kryoschnitten einer
makroskopisch Tumor-freien Pankreashälfte dargestellt, deren im LuciferaseAssay verarbeiteter Anteil ein positives Signal zeigte. In der Übersicht (Fig. 19 a)
erkennt man die diffus in das gesunde Pankreasgewebe (schwarzer Pfeil)
einwachsenden Tumorinfiltrate (rote Pfeile). Im Ausschnitt (Fig. 19 b) zeigt sich
die lokale Invasion von immunhistochemisch braun gefärbten humanen
57
Tumorzellen (schwarze Pfeile) in die zur Eindämmung vom murinen Pankreas
gebildete Bindegewebshülle.
Fig. 19 c & d zeigen HE-Färbungen einer hämatogen entstandenen
Mikrometastase im Lebergewebe. Das ehemalige Gefäßlumen wird von den
Tumorzellen vollständig ausgefüllt (Fig. 19 c). Im Vergrößerungsausschnitt ist die
Gefäßwand aufgrund der beginnenden Infiltration (roter Pfeil) kaum noch zu
erkennen (Fig. 19 d).
a
b
10 x
c
20 x
d
10 x
Fig. 19 –MIA PaCa-2-ELN-Tumoren und Metastasen in der Histologie.
20 x
58
a & b) Cytokeratin-Färbungen eines MIA PaCa-2 ELN-Tumorinfiltrates im Pankreas von Tier
1086 (GemKonv-Gruppe) – Durch die immunhistochemische Färbung wird selektiv humanes
Cytokeratin angefärbt, welches die Differenzierung humaner Zellen durch eine bräunliche
Färbung ermöglicht. Das Maus-Pankreas imponiert durch die HE-Gegenfärbung bläulich. Die
andere Pankreashälfte erzielte im Luciferase-Assay eine Lichtemission von ungefähr 500 VLE.
a) 10x-Vergrößerung – Inmitten gesunden Pankreasparenchyms (schwarzer Pfeil) finden sich
mehrere infiltrierend wachsende Tumorareale (rote Pfeile). b) 20x-Vergrößerung – In diesem
Ausschnitt aus Bild a) kommt das invasive Wachstum des Tumors in das umgebende
Bindegewebe (schwarzer Pfeil) zur Darstellung.
c & d) HE-Färbungen einer MIA PaCa-2 ELN-Metastase in der Leber von Tier 1087 (KontrollGruppe). Die andere Leberhälfte erzielte im Luciferase-Assay eine Lichtemission von ungefähr
500 VLE.
c) 10x-Vergrößerung – Hämatogene Lebermetastase in einem Pfortaderast (roter Pfeil).
Umgebend zeigt sich intaktes Leberparenchym.
d) 20x-Vergrößerung – In diesem Ausschnitt aus Bild c) ist die beginnende Infiltration der
Gefäßwand erkennbar (roter Pfeil).
59
5. Diskussion
5.1. Kurzzusammenfassung
Das Adenokarzinom des Pankreas ist trotz intensiver Forschung immer
noch eine kaum verstandene Krankheit, für die es so gut wie keine Heilung gibt.
Die
lokale
und
systemische
Ausbreitung
limitiert
entscheidend
die
Lebenserwartung der betroffenen Patienten. Zum Zeitpunkt der Erstdiagnose liegt
in über 50% der Fälle bereits eine Metastasierung vor
[1].
Somit ist bei jedem 2.
Patienten so gut wie immer eine absolute Kontraindikation zum gegenwärtig
einzigen kurativen Therapieansatz, der Resektion [48] gegeben.
Nach Noble et al. ist Gemcitabin zur Zeit das Mittel der Wahl in der
Therapie der Pankreaskarzinome [49].
In dieser Arbeit wurden orthotope Luciferase-markierte Tumormodelle
etabliert und anhand einer neuen, liposomalen Formulierung des Zytostatikums
Gemcitabin (GemLip) evaluiert. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten
Modelle in der Lage sind, die aufgestellten Erwartungen zu erfüllen. So war es
möglich, die erhofften Informationen, angefangen vom Anwachsen der Tumore
durch das integrierte in vivo-Imaging-System bis hin zur Quantifizierung der
Metastasierung über den ex vivo-Assay, zu generieren.
Auch konnte gezeigt
werden, dass die Verpackung von Gemcitabin in vesikulären Phospholipidgels
(VPG) die antitumoralen und antimetastatischen Eigenschaften positiv beeinflusst.
5.2. Diskussion der Methodik
5.2.1. Modell des experimentellen Pankreas-Karzinoms
Die
ausgeprägte
Tendenz
der
Pankreaskarzinome
zur
frühzeitigen
Metastasierung bei oft sehr verzögert auftretender Symptomatik beschränkt den
Erfolg chirurgischer Intervention
[50].
Es macht also Sinn, zur Erweiterung der
60
Therapieoptionen für das Pankreas-Karzinom dessen Metastasierung besser zu
verstehen und gezielt Therapieansätze gegen diese zu entwickeln.
Um zu streuen, müssen Tumorzellen zuerst eine Sequenz komplexer
Prozesse durchlaufen. Jeder einzelne Schritt wird neben den entarteten Zellen
maßgeblich von den Wirts- oder auch Stromazellen und der Extrazellulär-Matrix
mitbestimmt [51,52]. Die Fähigkeit maligner Zellen, sich vom Tumor zu lösen und in
andere Regionen desselben Organs oder in entfernte Organe zu metastasieren,
muß also in einem modernen Tumormodell abbildbar sein.
Es lässt sich schließen, dass es gerade für die Testung neuer
Chemotherapeutika essentiell ist, Modelle zu generieren, die möglichst nah an der
realen klinischen Situation liegen und somit eine natürliche Metastasierung
zeigen.
Eine der wesentlichen Fragen zu Beginn des Projektes bestand in der Wahl
eines
geeigneten
Tumormodelles.
Als
biologisches
Substrat
eignen
sich
verschiedene Vertreter der Ordnung der Nagetiere (Rodentia), etwa Mäuse, Ratten
und Hamster, aus ökonomischen Gründen besonders [53].
Aus Tabelle 3 lässt sich entnehmen, dass in den vergangenen Jahren
verschiedene Strategien zur modellhaften Abbildung von Pankreaskarzinomen
entwickelt wurden. Grundsätzlich kann zwischen zwei Hauptformen, den
subkutanen und den orthotopen Modellen, unterschieden werden.
5.2.1.1. Subkutane Tumormodelle
Auch
gegenwärtig
Tumormodelle
[54]
finden
vor
Jahrzehnten
Verbreitung in Tierexperimenten
etablierte
[55-58].
subkutane
Diese weisen neben
einigen Vorteilen gravierende Nachteile auf. Zu den Vorteilen gehören, dass mit
diesen Modellen Veränderungen der Tumorgröße unter pharmakologischem
Einfluss unproblematisch protokolliert werden können. Die Tumoren sind
aufgrund ihrer subkutanen Lage für die Größenbestimmung und spezielle
Therapieansätze gut zugänglich. Auch die Implantation der Tumorzellen gestaltet
sich als relativ einfach, da die subkutane Injektion mit geringem Aufwand zu
bewerkstelligen ist [59].
61
Tumorinduktion
Chemisch
Spezies
Übereinstimmung zum humanen
(duktalen) Karzinom
Klinisch Histologisch
Molekular
Nachteile
Referenzen
BOP
(Nitrosamin)
Hamster
+
+
+
Unspezifische
Tumorinduktion
[60,61]
Azaserin
Ratte
(+)
(+)
-
Azinäre Karzinome
[62,63]
DMBA
Ratte
(+)
(+)
(+)
Undifferenzierte
Karzinome, geringe
Tumorprävalenz
[64,65]
Transgene Ela-1-Versionen
Tiere
Maus
(+)/+
-/+
-/+
Azinäre Karzinome,
geringe Tumor-prävalenz
[66,67]
Sukutane
Injektion
Humane
Tumorzellen
Nude/SCIDMaus
-
-/(+)
-/(+)
Immuninsuffiziente
Wirte, keine
Metastasierung,
unspezifische
Stromainteraktion
[68,69]
Orthotope Humane
Injektion Tumorzellen
Nude/SCIDMaus
+
+
+
Immuninsuffiziente
Wirte, artifizielle
Tumoraussaat
[70,71]
Ratte
(+)
+
(+)
Ratten-Tumoren,
artifizielle Tumoraussaat
[64,72]
NudeMaus
+
+
+
Immuninsuffiziente
Wirte
[73,74]
Ratte
+
+
(+)
Ratten-Tumoren
[72]
RattenTumorzellen
Orthotope Fragmente
Implanta- menschlicher
tion
Tumoren
Fragmente von
Rattentumoren
Tabelle 3 – Tiermodelle des exokrinen Pankreaskarzinoms und ihre Eigenschaften mit Blick auf das humane (vorwiegend duktale) Adenokarzinom nach [12].
Beeinträchtigend wirkt sich auch und Ulzerationsneigung der Tumoren, die
zu mechanischer Behinderung der Tiere und Erhöhung der Infektionsrate führen.
Einer der wichtigsten Nachteile ist jedoch, dass diese Modelle in keiner Weise die
reale klinische Situation von Pankreaskarzinomen widerspiegeln. So tragen sie
weder der ausgeprägten Neigung zur Lokal- und Fernmetastasierung noch der
Beeinträchtigung betroffener Organe durch Infiltration Rechnung.
Auch können Interaktionen der Tumorzellen mit Stromazellen des
betroffenen Organes [52,75], die Parameter wie Wachstum oder auch Sensitivität der
62
Tumorzellen auf Chemotherapeutika beeinflussen, nicht dargestellt werden. Dies
können nur orthotope Tumormodelle leisten.
Gerade bei Pankreastumoren die Hauptinformationsqualitäten subkutaner
Modelle, insbesondere Wachstumskurven und Histologien, nur als bedingt
realitätsnah einzustufen.
5.2.1.2. Orthotope Tumormodelle
Die unter 5.2.1.1. aufgeführten Nachteile subkutaner Modelle lassen sich
durch den Einsatz orthotoper Implantationstechniken fast vollständig eliminieren
[76].
Hierbei werden in kleinen operativen Eingriffen Tumorzellen injiziert oder
Tumorfragmente direkt in das Ursprungsorgan eingebracht. Die resultierenden
Tumoren wachsen im Pankreasgewebe an und können sich über die gleichen Wege
ausbreiten, die auch einem spontan entstandenen Tumor zur Verfügung stehen.
Durch Verwendung immuninkompetenter Versuchstiere, beispielsweise
athymischer Nacktmäuse oder Severe Combined Immunodeficient (SCID)-Mäuse
lassen sich humane Tumorzelllinien implantieren
[69,74].
Auf diesem Weg lassen
sich klinische Bilder simulieren, die dem Krankheitsverlauf beim Menschen sehr
nahe kommen [77].
Bei der Auswahl des sinnvollsten Modells bezüglich des Projektvorhabens
spielten verschiedene Faktoren eine Rolle. So sollten menschliche Tumoren direkt
im Zielorgan zum Einsatz kommen, um den klinischen Bezug zu maximieren.
Unter den verbleibenden Varianten schlossen wir die orthotope Injektion aus, da
diese Technik häufig streuungsbedingte artifizielle Peritonealmetastasen zur Folge
hat [12,71].
Am nächsten kam der Idealvorstellung das Modell der orthotopen
Implantation solider Fragmente humaner Tumoren in immuninsuffizienten
Nacktmäusen
[78,79].
Eine Reihe humaner Pankreaskarzinomzelllinien, die sich für
diese Anwendung eignen, sind in der Literatur beschrieben worden [33,74]. In dieser
Arbeit wurden MIA PaCa-2 und AsPC-1 verwendet, die im nächsten Abschnitt
näher beschrieben werden.
63
5.2.1.3. In vivo-Imaging im Tiermodell
Aus der bereits in Kap. 1.2. beschriebenen Modellstruktur ergeben sich in
orthotopen Modellen allerdings auch einige Probleme. Im Vordergrund steht hier,
dass, im Gegensatz zu subkutanen Tumoren das Wachstum des orthotopen
Primärtumors im laufenden Experiment nur schwer nachvollzogen werden kann.
So lässt sich der Implantationserfolg je nach Tumorwachstum und -lokalität unter
Umständen erst nach mehreren Wochen durch Palpation oder Messung mit der
Schieblehre ausreichend sicher beurteilen.
Ein weiterer Nachteil ergibt sich daraus, dass in vivo außer Gewichtskurven
und eventuell palpierbaren Tumorgrößen kaum nennenswerte Daten erhebbar
sind. Hierfür müssen üblicherweise zu verschiedenen Zeitpunkten nach der
Tumorimplantation Tiere getötet und deren Situs untersucht werden. Dies führt
dazu, dass beispielsweise Gruppengrößen im Design von Therapiestudien
entsprechend
hoch
angesetzt
Tumorzahlen zu erhalten
[80].
werden
müssen,
um
statistisch
relevante
Eventuelle Metastasen können meist erst durch
Nekropsie festgestellt werden, dies auch nur lageabhängig und abhängig einer
visuell detektierbaren Größe. Es ist deshalb gerade für orthotope Modelle wichtig,
eine Methode zur Verfügung zu haben, die die Erhebung zusätzlicher
Informationsqualitäten am lebenden Tier erlaubt [81,82].
Um
den
vorbeschriebenen
Nachteilen
orthotoper
Tiermodelle
entgegenwirken zu können, wurde im Projekt ein System zur in vivo Bildgebung
(nachfolgend als in vivo Imaging bezeichnet) integriert werden. Somit wurde es
möglich,
Daten
zur
Gewinnung
von
Tumorwachstumskurven
und
Metastasierungsmustern am lebenden Tier über den gesamten Verlauf der
modellierten Tumorerkrankung zu generieren.
Zur Bildgebung stehen zurzeit verschiedene Systeme zur Verfügung, die auf
unterschiedlichen physikalischen Prinzipien aufbauen (Tabelle 4).
Whole-Body-Imaging-Verfahren (Ganzkörper-Darstellung) wie MRT, CT und
PET sind sehr hochauflösend und besonders in Kombination sehr aussagekräftig.
Jedoch sind sie auch sehr ressourcenaufwendig. Durch die langen Meßzeiten pro
Tier sind diese Methoden für Tierexperimente mit größeren Gruppenstärken nur
64
bedingt geeignet. Hauptsächlich aus diesem Grund fanden die drei Verfahren im
Projekt sie keine Verwendung [83,84]. fanden sie keine Verwendung.
Prinzip
System
Vorteile
Nachteile
Ref.
Radioaktive
Metaboliten
PET
- Darstellung von
Stoffwechselvorgängen
- mit CT kombiniert sehr
aussagekräftig
- Strahlenbelastung
- teuer und aufwendig (Geräte, KM)
- lange Meßdauer/ Tier
[85-87]
Kernspin
in starken
Magnetfeldern
MRT
- sehr hohe Auflösung
- keine Nebenwirkungen
- 3D-Rekonstruktion
- u. U. Kontrastmittel (KM) notwendig
- teuer und aufwendig (Geräte, KM)
- lange Meßdauer/ Tier
[88-90]
Röntgenstrahlen
CT
- gute Auflösung
- sehr gute Darstellung
von Knochenstrukturen
- 3D-Rekonstruktion
- Strahlenbelastung
- u. U. KM notwendig
- teuer und aufwendig (Geräte, KM)
- lange Meßdauer/ Tier
[91-93]
Schallwellen
Sonographie
- kostengünstig
- keine Nebenwirkungen
- geringer apparativer Aufwand
- 3D-Rekonstruktion
- stark untersucherabhängig
- eingeschränkte Reproduzierbarkeit
- Whole-Body-Imaging (GanzkörperDarstellung) schwierig
[94,95]
Fluoreszenz
GFP-/ RFPSignale in
der CCDKamera
- kostengünstig
- sehr hohe Auflösung
- molekulares Imaging
- durch lokale Anregung
Ausblendung der
Primärtumore möglich
- kurze Meßzeiten
- Gentransfer notwendig
- Background durch Autofluoreszenz
bestimmter Proteine
- GFP in hohen, schwer zu erreichenden
Expressionsraten (dann evtl. toxisch)
- sehr geringe Ausdringtiefe bei GFP, bei
RFP günstiger
- kaum klinische Relevanz
[96,97]
Biolumineszenz
Photonenemission des
LuciferinLuciferaseSystems in
der CCDKamera
- kostengünstig
- gute Auflösung
- sehr hohe Spezifität
(kein Background)
- postmortaler Luci-Assay
zur Metastasierungsevaluation
- kaum Nebenwirkungen
- kurze Meßzeiten
- Gentransfer notwendig
- begrenzte Ausdringtiefe des Lichtes
- Anfluten und Metabolisierung des
Luciferins multifaktoriell beeinflusst
(Gefäßsituation, evtl. Peritonitis,
Injektionsfehler, Narkosetiefe)
- kaum klinische Relevanz
[98,99]
Tabelle 4 – Bildgebende Verfahren der tierexperimentellen Forschung.
Aufgrund der begrenzten Reproduzierbarkeit und der stark vom Untersucher
abhängigen Sensitivität und Qualität der Signale wurde auf die sonografische
Technik ebenfalls verzichtet [100].
Verfahren, die auf der Emission von Licht basieren, finden in der
tierexperimentellen Grundlagenforschung weite Verbreitung
nicht
zuletzt
auf
einer
hohen
Auflösung
bei
[101-103].
Dies beruht
vergleichsweise
guter
Wirtschafltichkeit.
Zwei Biomechanismen sind hier von größerer Bedeutung, die Fluoreszenz
und die Biolumineszenz.
65
5.2.1.4. GFP und Luziferase
1962 wurde das Green Fluorescent Protein (GFP) von Osamu Shimomura
als erstes Protein einer sukzessive entdeckten Gruppe von Eiweißen beschrieben,
die nach Anregung Licht einer bestimmter Wellenlängen aussenden
[18].
Fluoreszenz-basierte
der
Imaging-Systeme
werden
heute
in
naturwissenschaftlichen Forschung verbreitet auf zellulärem Gebiet eingesetzt. Mit
ihnen kann eine hohe Bildauflösung bis auf molekulare Ebene erreicht werden [104106].
Um in Fluoreszenz-Systemen ein detektierbares Signal zu erzeugen, muß
eine energetische Anregung erfolgen. Da die umgebenden Gewebe, etwa aufgrund
ubiquitär
vorkommender,
aufweisen,
verursacht
Hintergrundstrahlung
[107].
aromatischer
diese
Aminosäuren,
Anregung
Eigenfluoreszenz
meßtechnisch
relevante
Die resultierenden Hintergrundsignale führen dazu,
dass es mitunter schwierig sein kann, GFP-exprimierende Zellen von anderen
Geweben oder Gewebebestandteilen zu differenzieren. Da die Hintergrundsignale
diffus verteilt auftreten, erschweren sie zudem die suffiziente Durchführung
quantifizierbarer Messungen.
Durch den Einsatz beispielsweise von Red Fluorescent Protein (RFP) lässt
sich das Phänomen der Hintergrundstrahlung zwar reduzieren, allerdings wird für
eine hohe Sensitivität eine noch höhere Proteinexpression als bei GFP benötigt.
Für die Ganzkörper-Bildgebung („Whole-Body-Imaging“) sind bei FluoreszenzProteinen im Vergleich zur Luciferase sehr hohe Expressionsraten notwendig.
Dementsprechend müssen einerseits unter Umständen die markierten Zelllinien
sooft selektioniert und kloniert werden, bis sich grundlegende Eigenschaften der
Zelllinie wie beispielsweise Teilungsraten stark verändern [108].
Zum anderen kann es bei sehr hoher Expression von Fluoreszenz-Proteinen
zur Bildung von Peroxid bei der Entstehung des Fluorophors kommen, welches die
Karzinomzellen unter Stress setzen und schädigen könnte
[109].
Diese Umstände
können die Kliniknähe eines Tumormodells entscheidend beeinträchtigen.
Anders als bei der Fluoreszenz wird zur Signalinduktion der Biolumineszenz
keine energetische Anregung benötigt, eine Eigenemission des Gewebes
unterbleibt. Im Gegensatz zu auf Fluoreszenzfarbstoffen basierenden in vivo-
66
Imaging Systemen bietet ein Lumineszenz-System zudem ein erheblich höheres
Signal-Rausch Verhältnis, da ausschließlich das Signal durch Luciferase
emittierter Photonen gemessen wird [110].
Bei
Substratsättigung
produziert
jedes
einzelne
Enzym
mehrere
Lichtquanten über einen längeren Zeitraum. Durch Summierung der abgegebenen
Photonen über die Zeit wird eine derart hohe Sensitivität erreicht, dass je nach
Luciferase-Expression selbst Zellzahlen im einstelligen Bereich detektierbar sind
(siehe in vitro-Assay in Kap. 4.1., Fig. 7;
Effekte
von
sogenannten
[111]).
Berichte über potentielle toxische
Dinukleotid-Polyphosphaten
[112],
welche
bei
langanhaltendem Substratüberschuß durch die Luciferasen gebildet werden
können, beschränken sich bis dato auf ein in vitro-Experiment mit transduzierten
COS-7-Affenkarzinom-Zellen [113].
Die
genannten
Fakten
legen
dar,
warum
sich
im
vorliegenden
Projektvorhaben für eine Markierung der Tumorzellen mit Luziferase entschieden
wurde.
Die hohe Lichtausbeute kann aber eventuell auch dazu führen, dass große
Primärtumoren lokale Metastasen überstrahlen. In Fluoreszenz-Systemen tritt
dieser Effekt begrenzt auch auf, kann aber bedingt durch die lokale Anregbarkeit
der Fluoreszenz eingeschränkt werden. Die Biolumineszenz-Bildgebung verfügt
über diese Möglichkeit nicht.
Auch die in vivo-Quantifizierbarkeit der Signale unterliegt bedingt durch die
Variabilität der Maus als biologisches System gewissen Einschränkungen. So
können beispielsweise aufgrund wechselnder Lage, Vaskularisierung und
Oxygenierung des Tumorgewebes oder auch verzögerter Anflutung des Substrates
Luciferin passagere Schwankungen in der Signalintensität auftreten (vergleiche
Kap. 4.4.2., Fig. 16).
Die Gruppe um R.M. Hoffman bestimmt die Fläche der Fluoreszenz-Signale
zu deren Quantifizierung
[114-116].
Die in unseren Versuchen entwickelte und
angewandte Methode der Signalquantifizierung beruht dagegen auf der Messung
der durchschnittlichen Signalintensität der Tumore (Kap. 3.6.2.). Dies hat den
Vorteil, dass in die Messung nicht nur die zweidimensionale Ausdehnung der
Signale sondern auch deren Variabilität innerhalb des Tumors einfließt. Somit
67
wird der Tatsache Rechnung getragen, dass nekrotische und vitale Areale
gleichermaßen im Tumor vorkommen können [33].
5.2.1.5. Nekropsie
Durch die Transduktion der Zelllinien mit dem Luciferase-Gen konnte die
die Nekropsie orthotoper Tumormodelle des Pankreaskarzinoms entscheidend
verbessert werden. Bisher beschränkte sich die Datenerhebung orthotoper
Pankreas-Karzinom-Mausmodelle
im
Wesentlichen
auf
Größen-,
Gewichtsmessung und die Bestimmung von makroskopisch sichtbaren Tumoren
und oberflächlich gelegenen Metastasen als Endpunktanalyse.
Für spezielle Fragestellungen während des Verlaufes mussten bisher Teile
der Versuchsgruppen auf Kosten der Vergleichbarkeit terminiert werden
[33,80,117].
Detaillierte Aussagen zur Metastasierung waren nur ausschnittsweise durch
teilweise sehr aufwendige Histologien oder die kostenintensive PCR zu erreichen
[118].
Es konnte gezeigt werden, dass der ex vivo-Luciferase-Assay im Hinblick
auf die Detektierung auch kleinster Metastasen der herkömmlichen Nekropsie in
Sensitivitat und Spezifität überlegen ist.
Durch die Quantifizierbarkeit der Signale, die Tumorgewebe im Assay
erzeugt, ließen sich ex vivo vor allem die Metastasierungsmuster der
verschiedenen der Therapiegruppen beurteilen und vergleichen. Auch konnte
gezeigt werden, dass die beobachteten Metastasierungsmuster in der Regel der
realen, im Menschen vorherrschenden Ausbreitung der Erkrankung entsprachen
[41].
Die Metastasen waren vorwiegend lokal und in der Leber vorzufinden.
5.2.1.6. Gemcitabin, VPG und GemLip
Gegenwärtig hat die Chemotherapie des Pankreas-Karzinomes eine rein
palliative Funktion. Substanz der Wahl ist das Nukleosid-Analogon Gemcitabin
(Fig. 2;
[119]).
Eine Wirksamkeit wurde auch in anderen Tumorentitäten
nachgewiesen [120-124].
2',2'-Difluorodesoxycytidin (dFdC, gemcitabine, Gemzar®), ursprünglich
als antivirale Substanz entwickelt, ist ein synthetischer Antimetabolit aus der
68
Pyrimidin-Gruppe, welcher, abgesehen vom Pankreas-Karzinom, unter anderem
bei soliden Tumoren der Lunge, der Brustdrüse, der Blase und zytotoxische
Wirkung zeigt. Der Unterschied zum endogen vorkommenden, zellulären
Desoxycytidin besteht in der Substitution mit zwei Fluoratomen an der C-2´Position des Desoxyribofuranosylringes (Fig. 2, Kap. 1.4.1.).
Die zytotoxische Aktivität von Gemcitabin beruht auf der Inhibition von
DNS-Synthese und DNS-Reparaturmechanismen. Als Prodrug wird es intrazellulär
durch die Desoxycytidin-Kinase in die zwei- und einfach phosphorylierte Form
metabolisiert. Hier konkurriert das Triphosphat von Gemcitabin (dFdC-TP) als
Substrat mit Desoxycytidin-Triphosphat (dCTP) um den Einbau in die DNS und
blockiert die Topoisomerase, wodurch der programmierte Zelltod (Apoptose)
ausgelöst wird. In die DNS eingebaut inhibiert dFdC-TP deren Elongation und
Termination.
Das Diphosphat von dFdC (dFdC-DP) fungiert als inhibirendes Substrat der
Ribonukleotid-Reduktase (RbNR). Dieses Enzym ist für die Produktion von
Desoxynukleotiden zur DNS-Synthese und DNS–Reparatur notwendig. Aufgrund
dieser Mechanismen wird in der Zelle ebenfalls die Apoptose induziert.
Im Vergleich mit dem onkologischen Standardtherapeutikum 5-FluoroUracil (5-FU) erreicht Gemcitabin bei Patienten mit malignen Neoplasien der
Bauchspeicheldrüse,
auch
in
fortgeschrittenen
Erkrankungsstadien,
eine
verbesserte Ansprechrate und eine verlängerte Medianüberlebenszeit [125].
Doch weder in Einzel- noch in Kombinationstherapie, etwa mit
Camptothecin (Topoisomeraseinhibition
[116]),
Cisplatin (DNA-Strangbrüche
oder Pemetrexin (Störung des Folat-Stoffwechsels
[36]),
[116])
kann eine vollständige
Tumorreduktion erreicht werden [126].
Die insgesamt eher limitierte Aktivität von Gemcitabin in der Behandlung
des Pankreaskarzinomes verwundert, bedenkt man, dass die in vitro-Sensitivität
der Krebs-Zellen gegenüber der Substanz bei einer LD50 im unteren nM-Bereich
liegt [28,127].
Eine Erklärung der geringen systemischen Aktivität liegt in den kurzen
Plasma-Halbwertszeiten zwischen 8 – 17 Minuten im Menschen
ungefähr 9 Minuten in der Maus
[131].
[128-130]
und
Gegen die schnelle Metabolisierung von
Verbindungen können Liposomen Schutz bieten [132,133]. Zudem können liposomale
69
Strukturen bei guter Verträglichkeit große Mengen von Substanzen aufnehmen.
Jedoch war es bis vor kurzem nicht möglich, dFdC in therapeutisch relevanten
Konzentrationen stabil in Liposomen zu integrieren.
Dieses Problem hat die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Uli Massing, Klinik für
Tumorbiologie, Freiburg, in Form von Vesikulären Phospholipid-Gelen (VPG)
[134-138].
gelöst
Diese Gele bestehen aus sehr dicht gepackten, meist unilamellaren
Mikrovesikeln (Endgröße 37 nm), die durch Hochdruck-Homogenisierung
hergestellt werden.
Die wässrigen Phasen innerhalb und zwischen den Bläschen weisen die
gleiche Ladung auf, weshalb eine gleichmäßige Verteilung von dFdC im Gel
gewährleistet ist. In dieser Studie wurde eine Formulierung verwendet, bei der das
Gemcitabin zu 48 % in liposomal eingeschlossener und zu 52 % in freier Form
vorlag. Die Substanz entweicht nach und nach aus der intervesikulären Phase in
die umgebende Flüssigkeit (z.B. Blutplasma) und wird in einem steady state durch
aus den Vesikel nachströmende ersetzt. Aufgrund der protrahierten Freisetzung
von dFdC aus dem VPG kann die Plasma-Halbwertszeit des Gemcitabins von
wenigen Minuten auf bis zu 13 Stunden verlängert werden.
Nach
gegenwärtigem
Wissensstand
sind
die
neuen
vesikulären
Phosholipidgele momentan der einzige Ansatz, Gemcitabin in klinisch relevanten
Dosen und einer akzeptablen Halbwertszeit liposomal einzuschließen.
Kürzlich wurde der Einschluß von Gemcitabin in sogenannten StealthLiposomen (durch PEG-Konjugation der Liposomen mit hydrophoben Ketten wird
eine Opsonierung verhindert) über einen Ammoniumsulfat-Gradienten publiziert
[139].
Obwohl hier von einer 90% Sättigung berichtet wurde, lag die
Maximalkonzentration von Gemcitabin in der endgültigen Liposomen-Dispersion
bei lediglich 75 µg/ml. Um therapeutische Serumspiegel auch nur im unteren
mg/kg-Bereich zu erzielen, müssten demnach deutlich mehr als 10 ml/kg – dem
maximalen Injektionsvolumen für Mäuse – der Dispersion appliziert werden.
Deshalb sind wohl auch bis dato lediglich Zellkultur-Experimente mit dieser Art
Liposomen durchgeführt wurden.
In einer im Vorfeld mit einer frühen GemLip-Formulierung (enthielt 33 %
liposomal gebundenens Gemcitabin in 60 nm-Liposomen) durchgeführten in vivoStudie
[140]
konnte eine beeindruckende Steigerung der Aktivität des GemLips im
70
Vergleich zur freien Substanz festgestellt werden. Wie angenommen kam es auch
zu einer Akkumulation der Liposomen im Tumorgewebe (in diesem Fall
Weichteilsarkome und Blasenkarzinome).
Pharmakokinetisch bedeutsam für die Wirkung von VPG ist der EPR-Effekt
(Enhanced Permeability and Retention). Blutgefäße in Tumoren weisen bedingt
durch ihre Genese im Vergleich mit normalen Gefäßen besondere Eigenschaften
auf. Im Gegensatz zu gesundem Gewebe zeichnen sich die durch imperfekte
Angioneogenese
morphologische
gebildeten
Varianz
aus.
blutführenden
Diese
spezielle
Strukturen
Morphologie
durch
spiegelt
große
sich
beispielsweise in der Präsenz von Gefäßabbrüchen, Lumensprüngen sowie
sinusoidalen und lakunären Aussackungen wieder [141].
Die
Endothelien
solider
Tumore
besitzen
aufgrund
mangelhafter
Vernetzung der Endothelzellen und fehlerhaft generierter Basalmembranen eine
unphysiologisch hohe Durchlässigkeit für größere molekulare Bestandteile im
Blut. Makromoleküle bis zu einer Größe von etwa 200 nm können sich deshalb
verstärkt passiv im Tumorgewebe anreichern [32,142-145]. Dieser Effekt trifft auch auf
die im Therapieversuch eingesetzten Liposomen mit einem durchschnittlichen
Durchmesser von 37 nm zu.
Aufgrund ihrer Partikelgröße im zweistelligen Nanometer-Bereich können
die Vesikel der VPG jedoch nicht passiv in gesundes Gewebe eindringen, weil die
Endothelien entsprechender Blutgefäße durch dichte interzelluläre Verbindungen,
tight junctions, meist nur Öffnungen bis 2 nm Durchmesser aufweisen
[146].
Somit
ist eine spezifische Anreicherung nur im Tumorgewebe möglich.
In gesunden Geweben mit normaler Textur ermöglichen zudem die
Lymphgefäße den schnellen Abtransport von makromolekularen Strukturen.
Unterstützend auf die Akkumulation von Liposomen wirkt sich das Fehlen eines
funktionierenden lymphatischen Abflusses in Tumoren aus. Somit verlängert sich
die Verweildauer der mit Hilfe von makromolekularen Trägern eingedrungenen
antitumoral wirksamen Substanzen [147].
Neben der Art des Tumors, seiner Umgebung sowie der Gefäßlokalisation
ist auch die Tumorgröße von entscheidender Bedeutung für die vaskuläre
Durchlässigkeit
[147,148].
Geeignete
Tumoren
für
eine
Therapie
mit
makromolekularen Vehikelsubstanzen sollten einerseits nicht zu klein sein, da eine
71
deutliche Vaskularisierung Vorrausetzung ist. Andererseits dürfen die Tumoren
aber noch nicht so fortgeschritten sein, daß sich zentral bereits schlecht
vaskularisierte, nekrotischen Regionen gebildet haben, in denen ein gesteigerter
interstitieller Druck der Extravasation entgegenwirkt [146].
5.3. Diskussion der Ergebnisse
5.3.1. Luciferase-markierte Tumormodelle
5.3.1.1. Subkutane Xenografts
Zu Beginn des Projektes wurden durch die Injektion von Tumorzellen unter
die Haut von Nacktmäusen aus verschiedenen Beweggründen subkutan
wachsende Pankreaskarzinome etabliert. Anhand dieser Modelle wurden initial
wertvolle Informationen zur Vergleichbarkeit der transduzierten und der
parentalen Zelllinien gewonnen (Kap. 4.2.).
Bis auf den ersten MIA PaCa-2-Versuch (Wachstumsverzögerung der MIA
PaCa-2 ELN-Tumoren im zweiten Versuch nicht mehr nachweisbar, Fig. 8 a & c)
konnten zwischen den Ursprungszelllinien und ihren transduzierten Formen keine
Unterschiede im Tumorwachstum festgestellt werden. Dies stellt einen großen
Vorteil im Gegensatz zu anderen in vivo-Imaging-Systemen, wie beispielsweise
dem auf Green Fluorescent Protein (GFP), dar. Zur Expression von FluoreszenzProteinen müssen die transduzierten Zellen mehrere Klonierungs-Passagen
durchlaufen, bei denen jeweils die Zellen mit der maximalen Expressionsrate
weiterverarbeitet werden.
Bedingt durch genetische oder methodische Manipulationen verändern sich
bei der extremen Selektionierung GFP produzierender Zellen zum Beispiel
Wachstumsverhalten, Sensibilität gegenüber Chemotherapeutika, Aggressivität
der Tumoren
[108].
Auch durch die Expression der Fluoreszenz-Proteine allein
können wichtige Zell-Parameter beeinflusst werden [149,150].
Spätestens seit der Arbeit von Liu et al. wird die Toxizität von GFP offen
diskutiert
[109].
In
transgenen
Mäusen
können
durch
GFP-Expression
72
schwerwiegende Krankheiten wie die dilatative Kardiomyopathie hervorgerufen
werden [151]. Ein Vergleich der Eigenschaften der Ursprungszelllinie mit denen der
genetisch veränderten Klone wird nur in wenigen Studien angestellt [152].
Die Subkutan-Modelle zeigten in unseren Versuchen ebenfalls, dass die
implantierten humanen Tumorzellen von den immundefizienten Wirtstieren nicht
abgestoßen wurden und wachstumsfähig waren (Kap. 4.2., Fig. 8 a & c, Fig. 9 a).
Udagawa et al. beschrieben hingegen für GFP-basierende PankreaskarzinomModelle die Formierung von Mikroresiduen bei fehlender Ausbildung vitaler
Tumoren durch den Eintritt der Tumorzellen in eine Art Ruhezustand. Solche
Modelle sind für die Abbildung malignen Wachstums wertlos [150].
Außerdem entwickelten die transduzierten Tumore im vorliegenden Projekt
frühzeitig und vollständig starke Signale im in vivo-Assay. Diese Signale nahmen
mit fortschreitendem Wachstum zu, sodass Wachstumskurven generiert werden
konnten (Kap. 4.2.1., Fig. 8 f). Da die Photonen emittierende Reaktion zwischen
Luciferase und Luciferin von der Präsenz von ATP abhängig ist, leuchten im
lebenden Tier nur vitale Zellen.
Aus diesem Grund kam es in fortgeschrittenen Tumoren ab einer gewissen
Größe durch die Ausprägung einer zentralen Nekrose vereinzelt zu einer
merklichen
Verlangsamung
der
Zunahme
der
Imaging-Signale
und
dementsprechend zur Abflachung derWachstumskurve. Dieser Effekt war bei den
subkutanen AsPC-1 LN-Tumoren besonders stark zu sehen, da diese mehr als die
MIA PaCa-Tumoren zu zentralen Nekrosen neigen.
In
der
Literatur
werden
nur
wenige
Pankreaskarzinom-Zelllinien
beschrieben, die subkutan appliziert spontan filiarisieren. Sie stammen zumeist
von aggressiven SUIT-Zelllinien ab. Das Metastasierungsmuster ist mit lokalen
Lymphknoten- und Lungenabsiedelungen eher typisch für Hauttumore wie das
maligne Melanom
[153,154],
die zur Modellierung der Komplexizität pankreatogener
Metastasierung denkbar nutzlos sind.
Die fehlende Metastasierung der subkutanen Experimente auch in unseren
Studien können auf verschiedene Ursachen zurückgeführt werden. So fehlen in der
Haut die für Pankreaskarzinome typischen hämatogenen und lymphogenen
Ausbreitungswege in die Leber und das Retroperitoneum (beziehungsweise. bei
Nagern direkt peritoneal durch die intraperitoneale Lage des Pankreas), während
73
die lymphogene und hämatogene Streuung die lokalen Lymphknoten und die
Lunge erreicht. Eventuell abschwimmende Tumorzellen würden zuerst über das
rechte Herz in den kleinen Kreislauf gelangen und dort vom pulmonalen
Kapillarbett abgefangen werden.
Weiterhin bildet die Haut um den wachsenden Tumor eine bindegewebige
Pseudokapsel, die ein Ausbreiten zusätzlich beschränkt. Anders als bei den weiter
oben beschriebenen SUIT-Abkömmlingen reicht die Invasivität von MIA PaCa-2
und AsPC-1 offenbar nicht aus, diese Barriere zu durchdringen. Auch in anderen
subkutanen Studien mit Pankreaskarzinomen finden sich kaum Hinweise auf
regelmäßige Ausbildung von Metastasen [56].
Selbst
unter
der
Verwendung
Luciferase-exprimierender
Zelllinien
präsentieren sich subkutane Tumormodelle wenig kliniknah. Allenfalls sind sie für
vergleichende Studien des Metastasierungspotentials verschiedener Zelllinien
geeignet
[155,156].
Für die suffiziente präklinische Testung antitumoraler und
antimetastatischer Substanzen verfügen sie im Gegensatz zu den im nächsten
Abschnitt
diskutierten
Modellen
nicht
über
aussagekräftige
Informationsqualitäten.
5.3.1.2. Orthotope Xenografts im in vivo-Imaging
Mit steigender Expertise wurden in den orthotopen Modellen hohe Raten
bezüglich des Anwachsens der Tumoren bis über 90 % erreicht. Die Mäuse
tolerierten die körperfremden Tumorfragmente im Pankreas ohne Zeichen einer
Abwehrreaktion. Schon etwa 7 Tage nach Implantation leuchteten die meisten
Tumore. Ohne in vivo-Imaging können Tumoren in der Regel erst nach 3 Wochen
durch Palpation sicher erkannt werden [157].
Die Qualitätskontrolle der Implantation anhand der Lageprüfung der
Tumore auf Orthotopie konnte je nach Zelllinie spätestens nach etwa 2 Wochen im
in vivo-Imaging erfolgen. Tiere, bei denen die Tumoren nicht angewachsen waren,
wurden erkannt (Kap. 4.3.). Fehllagen von Tumoren, etwa durch missglückte
Implantation der Tumorfragmente, konnten ebenso detektiert werden. Dadurch
war es möglich, im Therapieversuch ausschließlich Tiere mit garantiert orthotop
wachsenden Tumoren zu integrieren.
74
Es konnte gezeigt werden, dass durch das Wachstum der Tumoren auch
deren Signale im in vivo-Imaging an Stärke zunahmen. Die Erstellung von
Wachstumskurven war somit möglich (Kap. 4.4.2., Fig. 16).
Außerdem erwies sich das in vivo-Imaging-Verfahren als geeignet, um
sowohl Metastasen der eher lokal infiltrierenden MIA PaCa-2 ELN- als auch der
bevorzugt
peripher
metastasierenden
AsPC-1
LN-Tumoren
frühzeitig
zu
detektieren. Die in vivo beobachteten Metastasen konnten, wenn auch nicht in
jedem Fall, durch die Nekropsie bestätigt werden.
Ein Anhalt für Veränderungen der Eigenschaften der Zellen aufgrund der
Transduktion konnte nicht beobachtet werden. Dementsprechend wurden auch
keine wesentlichen Unterschiede in den Wachstums- und Metastasierungseigenschaften zwischen den parentalen und den transduzierten Tumoren
festgestellt.
In Einzelfällen traten in Verlauf starke Schwankungen der in vivoTumorsignale auf. Diese Schwankungen bestanden zumeist aus einem starken
Signalabfall oder –ausfall, der in der Regel zum nächsten Meßtermin nicht mehr
auftrat. Wahrscheinlich waren solche Phänomene durch Injektion des Luciferins
in nicht näher bestimmbare intraabdominelle Kompartimente bedingt, die ein
zeitgerechtes Anfluten des Luciferase-Substrates erschwerten oder unmöglich
machten. Eine vollständige Erklärung des Effektes liegt jedoch nicht vor und ist
auch durch eingehende Literaturrecherche nicht nachvollziehbar.
5.3.2. Therapiestudie GemLip vs. Gemcitabin
Ziel des Therapieversuches war, anhand des neuentwickelten orthotopen
Pankreaskarzinom-Mausmodelles die antitumoralen und antimetastatischen
Effekte des freien Gemcitabins mit denen der liposomal verpackten Variante
(GemLip) zu vergleichen und eine eventuell verbesserte in vivo-Aktivität zu
erkennen.
75
5.3.2.1. Primärtumore
Nach Analyse der Daten war die signifikante Wachstumsihibition in der
GemLip 8 mg-Gruppe mit
*
_
p=0,0192 und einer T/C-Rate von 31 % eindeutig
bewiesen. GemLip hemmt in der 8 mg Dosierung das Tumorwachstum besser als
herkömmliches Gemcitabin in der Standard-Dosis von 240 mg/kg. Laut Braakhuis
et al. entfaltet Gemcitabin seine optimale Zytotoxizität bei halbwöchentlicher
Applikation von 120 mg/kg [158].
In diesem Projekt wurde der Zeitabstand von 7 Tagen zwischen den
Applikationen bewusst gewählt, um den direkten Vergleich von Gemcitabin zu
GemLip zu ermöglichen.
Warum allerdings Gemcitabin in dieser Studie auf den ersten Blick kaum
einen Effekt auf die Tumoren zu haben scheint, ist weitgehend unklar und muß in
weiteren Studien verifiziert werden. In Arbeiten anderer Gruppen erreicht
Gemcitabin T/C-Raten 40 bis 30 % bei meist abweichenden Dosierungen
[157,159-
162].
5.3.2.2. Metastasen
Eine bedeutende Eigenschaft der Luciferase-markierte Zellen besteht in der
einfachen Detektion und Quantifizierung in vivo, ex vivo und in vitro. Wie auch in
Fluoreszenz-Modellen
herkömmlichen
lassen
orthotopen
sich
Metastasen
Xenografts
[114,163].
eher
Auch
entdecken
sind
als
bei
Absiedlungen
unabhängig von ihrer Lage zur Oberfläche nachweisbar.
Die Metastasen lassen sich zudem nicht nur nach Anzahl quantifizieren.
Auch eine gewisse Korrelation der Metastasenlast lässt sich darstellen. Neue
Informationen stehen hierdurch zur Verfügung. So fällt beispielsweise in Fig. 18 d,
Kap. 4.6., ein außerordentlich hohes Leber-Signal aus der Gruppe GemLip 8
mg/kg auf. Ohne die Bestimmung der in vitro-Lichtemission würde diese Leber
bei der Nekropsie vermutlich durch oberflächliche Metastasen auffallen. Durch die
Luciferase-Markierung jedoch verändert sich so die mittlere Metastasenlast der
Gruppe beträchtlich. Weshalb diese Leber derart filiarisiert wurde, bleibt unklar.
76
Möglich
wäre
beispielsweise
eine
erworbene
Gemcitabin-Resistenz
der
Metastasen-Zellen [164].
Interessanterweise ist die Metastasenlast sowohl aller Organe (Fig. 18 c) als
auch der Lebern allein (Fig. 18 d) in der Leerliposomen-Therapiegruppe
tendenziell am geringsten, zumal eine signifikante Wirkung auf die Primarien
nicht nachweisbar war (Fig 17).
Die Histologien (Kap. 4.7.) beweisen, dass es sich bei den gemessenen
Lichtemissionen der verschiedenen Organe tatsächlich um Signale von Metastasen
und nicht um Artefakte handelt. Zur Steigerung des Durchsatzes weiterer
präklinischer Studien kann die aufwendige histologische Aufarbeitung der Gewebe
somit unter Umständen drastisch reduziert werden.
5.4. Ausblick und Klinische Bedeutung der Ergebnisse
GemLip zeigt vielversprechende Aktivität gegenüber Primärtumoren und
Metastasen des duktalen Pankreaskarzinomes. Der Schutz vor der schnellen
enzymatischen
Inaktivierung
des
Gemcitabins
und
die
VPG
vermittelte
Akkumulation der Substanz im Tumor begründet maßgeblich die antitumorale als
auch die antimetastatische Überlegenheit der liposomalen Formulierung im
Vergleich zum herkömmlichen dFdC. Diese Überlegenheit wird in weiteren
Versuchen auch mit Zelllinien anderer Eigenschaften überprüft werden. Der
Beginn klinischer Studien für den Fall weiterer positiver Ergebnisse wäre ein
nächster Schritt zur Etablierung von GemLip.
Als zweites bedeutendes Ergebnis der vorliegenden Studie ist der
erfolgreiche Einsatz der Luciferase-markierten Tumorzellen anzusehen. Die
gentechnisch veränderten Konstrukte haben sich als leistungsfähiges Instrument
zur Detektion und Quantifizierung von Metastasen erwiesen. Sie erleichtern
maßgeblich,
orthotop
implantierte
Tumoren
im
Rahmen
von
in
vivo-
Therapiestudien verfolgen zu können.
Weiterhin wurde in diesem Therapieversuch gezeigt, dass VPG über eine
antimetastatische Wirkung verfügen. Dies sollte in weiteren Studien verifiziert
77
werden. Falls sich die Effekte reproduzieren lassen, kann die Wirksamkeit einer
oralen Applikation überprüft werden.
Weiterhin ist die Evaluierung der adjuvanten und neoadjuvanten Potenz
von GemLip bezogen auf das Pankreas-Karzinom anhand weiterer, chirurgisch
geprägter Studien unter Verwendung des in vivo-Imaging-Systems geplant. Als
logische
Konsequenz
schließt
sich
ebenfalls
die
Testung
von
Kombinationstherapien mit weiteren Substanzen an.
Das Modell hat sich als äußerst wertvoll in der Bearbeitung onkologischer
Fragestellungen bezüglich des Pankreas-Karzinomes erwiesen. Die LuciferaseTransduktion von Tumorzelllinien anderer Entitäten (Prostata, Niere) wurde
mittlerweile durch die Arbeitsgruppe Dr. Ralph Graeser, Proqinase GmbH
Freiburg, begonnen. Auch bei diesen Tumoren scheinen die Eigenschaften
neuentwickelten Zellen sehr vielversprechend zu sein.
78
6. Referenzen
1. Jemal, A. et al. (2006) Cancer statistics, 2006. CA Cancer J. Clin. 56: 106.
2. World Health Organisation (2006) www. who. int/cancer/
3. Yeo, T. P. et al. (2002) Pancreatic cancer. Curr. Probl. Cancer 26: 176.
4. Kausch, W. (1912) Das Carcinom der Papilla duodeni und seine radikale
Entfernung. Bruns' Beitr. klin. Chir 78: 439.
5. Whipple, A. O. et al. (1935) Treatment of carcinoma of the ampulla of
Vater). Ann. Surg. 102: 763.
6. Beger, H. G. et al. (2003) Treatment of pancreatic cancer: challenge of the
facts. World J. Surg. 27: 1075.
7. Gudjonsson, B. (1995) Carcinoma of the pancreas: critical analysis of costs,
results of resections, and the need for standardized reporting. J. Am. Coll.
Surg. 181: 483.
8. Hopt, U. T. (2005) Pankreaskarzinom: Chirurgische Therapie. Schweiz.
Rundsch. Med. Prax. 94: 937.
9. Heinemann, V. and Wilkowski, R. (2005) Treatment of advanced and
metastatic pancreatic cancer. Deutsches Ärzteblatt 102: 2294.
10. Noble, S. and Goa, K. L. (1997) Gemcitabine. A review of its pharmacology
and clinical potential in non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.
Drugs 54: 447.
11. Carmichael, J. (1997) Clinical response benefit in patients with advanced
pancreatic cancer. Role of gemcitabine. Digestion 58: 503.
12. Hotz, H. G. et al. (2000) Animal models of exocrine pancreatic cancer. Int. J
Colorectal Dis. 15: 136.
13. Jonkers, J. and Berns, A. (2002) Conditional mouse models of sporadic
cancer. Nat. Rev. Cancer 2: 251.
14. Helms, M. W. et al. (2006) Options for visualizing metastatic disease in the
living body. Contrib. Microbiol. 13: 209.
79
15. Day, J. C. et al. (2004) Evolution of beetle bioluminescence: the origin of
beetle luciferin. Luminescence. 19: 8.
16. Seliger, H. H and McElroy, W. D (1960) Pathways of energy transfer in
bioluminescence. Radiat. Res. Suppl 2: 528.
17. Seliger, H. H and McElroy, W. D (1960) Spectral emission and quantum
yield of firefly bioluminescence. Arch. Biochem. Biophys. 88: 136.
18. Shimomura, O et al. (1962) Extraction, purification and properties of
aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan,
Aequorea. J. Cell Comp Physiol 59: 223.
19. DeLuca, M. et al. (1964) Role of sulfhydryl groups in firefly luciferase.
Biochemistry 3: 935.
20. DeLuca, M. and Dempsey, M. E. (1970) Mechanism of oxidation in firefly
luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 40: 117.
21. Ford, S. R. et al. (1996) Use of firefly luciferase for ATP measurement: other
nucleotides enhance turnover. J. Biolumin. Chemilumin. 11: 149.
22. Shepherd, R. D. and Rinker, K. D. (2004) Bioluminescence-based ATP
assays using a charge-coupled device imaging system. Biotechniques 37:
208, 210.
23. Nakamura, M. et al. (2006) Cell-surface-localized ATP detection with
immobilized firefly luciferase. Anal. Biochem. 352: 61.
24. Ura, S. et al. (2001) Single cell reporter assay using cell surface displayed
Vargula luciferase. J. Biosci. Bioeng. 92: 575.
25. Noble, S. and Goa, K. L. (1997) Gemcitabine. A review of its pharmacology
and clinical potential in non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.
Drugs 54: 447.
26. Burris, H. A., III et al. (1997) Improvements in survival and clinical benefit
with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas
cancer: a randomized trial. J. Clin Oncol. 15: 2403.
27. Zagon, I. S. et al. (2005) Combination chemotherapy with gemcitabine and
biotherapy with opioid growth factor (OGF) enhances the growth inhibition
of pancreatic adenocarcinoma. Cancer Chemother. Pharmacol. 56: 510.
28. Axelson, J. et al. (2005) Inhibition of different intracellular signal cascades
in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 5: 251.
80
29. Moog, R. (1998) Einschuß von Gemcitabine (dFdC) in vesikuläre
Phospholipidgele: in vivo und in vitro - Untersuchungen zur Stabilität,
Pharmakokinetik und antitumoralen Wirksamkeit.
30. Matsumura, Y. and Maeda, H. (1986) A new concept for macromolecular
therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic
accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res 46:
6387.
31. Maeda, H. and Matsumura, Y. (1989) Tumoritropic and lymphotropic
principles of macromolecular drugs. Crit Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:
193.
32. Yuan, F. et al. (1995) Vascular permeability in a human tumor xenograft:
molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55: 3752.
33. Hotz, H. G. et al. (2003) An orthotopic nude mouse model for evaluating
pathophysiology and therapy of pancreatic cancer. Pancreas 26: e89.
34. Lembert, N. (1996) Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light.
Biochem. J. 317 ( Pt 1): 273.
35. Miyamoto, H. et al. (2004) Tumor-stroma interaction of human pancreatic
cancer: acquired resistance to anticancer drugs and proliferation regulation
is dependent on extracellular matrix proteins. Pancreas 28: 38.
36. Giovannetti, E. et al. (2004) Synergistic cytotoxicity and pharmacogenetics
of gemcitabine and pemetrexed combination in pancreatic cancer cell lines.
Clin Cancer Res 10: 2936.
37. Yunis, A. A. et al. (1977) Human pancreatic carcinoma (MIA PaCa-2) in
continuous culture: sensitivity to asparaginase. Int. J. Cancer 19: 218.
38. Fountzilas, G. et al. (1986) Comparative effects of selected drug
combinations on the growth of a human pancreatic carcinoma cell line (MIA
PaCa-2). J. Natl. Cancer Inst. 76: 37.
39. Tan, M. H. et al. (1981) Differential localization of human pancreas cancerassociated antigen and carcinoembryonic antigen in homologous pancreatic
tumoral xenograft. J. Natl. Cancer Inst. 67: 563.
40. Chen, W. H. et al. (1982) Human pancreatic adenocarcinoma: in vitro and
in vivo morphology of a new tumor line established from ascites. In Vitro
18: 24.
81
41. Bardeesy, N. and DePinho, R. A. (2002) Pancreatic cancer biology and
genetics. Nat. Rev Cancer 2: 897.
42. Endou, M. et al. (2005) Growth inhibition of human pancreatic cancer cells
by human interferon-beta gene combined with gemcitabine. Int. J Mol Med.
15: 277.
43. Li, J. et al. (2006) A structurally optimized celecoxib derivative inhibits
human pancreatic cancer cell growth. J Gastrointest. Surg. 10: 207.
44. Ito, D. et al. (2006) In vivo antitumor effect of the mTOR inhibitor CCI-779
and gemcitabine in xenograft models of human pancreatic cancer. Int. J
Cancer 118: 2337.
45. Balasubramanian, S. et al. (2004) Suppression of human pancreatic cancer
cell proliferation by AGN194204, an RXR-selective retinoid. Carcinogenesis
25: 1377.
46. Zagon, I. S. et al. (2005) Combination chemotherapy with gemcitabine and
biotherapy with opioid growth factor (OGF) enhances the growth inhibition
of pancreatic adenocarcinoma. Cancer Chemother. Pharmacol. 56: 510.
47. Moog, R. et al. (2002) Change in pharmacokinetic and pharmacodynamic
behavior of gemcitabine in human tumor xenografts upon entrapment in
vesicular phospholipid gels. Cancer Chemother. Pharmacol. 49: 356.
48. Hopt, U. T. (2005) Pankreaskarzinom: Chirurgische Therapie. Schweiz.
Rundsch. Med. Prax. 94: 937.
49. Noble, S. and Goa, K. L. (1997) Gemcitabine. A review of its pharmacology
and clinical potential in non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.
Drugs 54: 447.
50. DiMagno, E. P. (1999) Pancreatic cancer: clinical presentation, pitfalls and
early clues. Ann. Oncol. 10 Suppl 4: 140.
51. Mareel, M. M. et al. (1993) How and when do tumor cells metastasize? Crit
Rev. Oncog. 4: 559.
52. Yokoi, K. et al. (2005) Simultaneous inhibition of EGFR, VEGFR, and
platelet-derived growth factor receptor signaling combined with
gemcitabine produces therapy of human pancreatic carcinoma and prolongs
survival in an orthotopic nude mouse model. Cancer Res. 65: 10371.
82
53. Maltoni, C. et al. (1981) Carcinogenicity bioassays of vinyl chloride
monomer: a model of risk assessment on an experimental basis. Environ.
Health Perspect. 41: 3.
54. Fogh, J. et al. (1980) Twenty-three new human tumor lines established in
nude mice. Exp. Cell Biol. 48: 229.
55. Bouvet, M. et al. (1998) Adenovirus-mediated wild-type p53 tumor
suppressor gene therapy induces apoptosis and suppresses growth of
human pancreatic cancer [seecomments]. Ann. Surg. Oncol. 5: 681.
56. Buchler, P. et al. (2003) Pancreatic cancer growth is inhibited by blockade
of VEGF-RII. Surgery 134: 772.
57. Qu, C. F. et al. (2005) Pre-clinical study of 213Bi labeled PAI2 for the
control of micrometastatic pancreatic cancer. Clin Exp. Metastasis 22: 575.
58. Ryschich, E. et al. (2006) Effect of Flt3 ligand gene transfer in experimental
pancreatic cancer. Int. J. Colorectal Dis.
59. Capella, G. et al. (1999) Orthotopic models of human pancreatic cancer.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 880: 103.
60. Rao, M. S. (1987) Animal models of exocrine pancreatic carcinogenesis.
Cancer Metastasis Rev. 6: 665.
61. Pour, P. M. and Kazakoff, K. (1989) Effect of secretin on pancreatic
carcinogenesis in the hamster model. Cancer Lett. 46: 57.
62. Roebuck, B. D. et al. (1981) Dietary modulation of azaserine-induced
pancreatic carcinogenesis in the rat. Cancer Res. 41: 888.
63. Longnecker, D. S. et al. (1984) Experimental carcinogenesis in the pancreas.
Int. Rev. Exp. Pathol. 26: 177.
64. Dissin, J. et al. (1975) Experimental induction of pancreatic
adenocarcinoma in rats. J. Natl. Cancer Inst. 55: 857.
65. Rivera, J. A. et al. (1997) A rat model of pancreatic ductal adenocarcinoma:
targeting chemical carcinogens. Surgery 122: 82.
66. Sandgren, E. P. et al. (1991) Pancreatic tumor pathogenesis reflects the
causative genetic lesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88: 93.
83
67. Schaeffer, B. K. et al. (1994) Pancreatic carcinomas of acinar and mixed
acinar/ductal phenotypes in Ela-1-myc transgenic mice do not contain c-Kras mutations. Am. J. Pathol. 145: 696.
68. Parsa, I. and Marsh, W. H. (1976) An in vitro model of pancreatic
carcinoma. Morphology and in vivo growth. Am. J. Pathol. 84: 469.
69. Marincola, F. M. et al. (1989) The nude mouse as a model for the study of
human pancreatic cancer. J Surg Res 47: 520.
70. Tomioka, D. et al. (2001) Inhibition of growth, invasion, and metastasis of
human pancreatic carcinoma cells by NK4 in an orthotopic mouse model.
Cancer Res. 61: 7518.
71. Tsutsumi, S. et al. (2004) Autocrine motility factor signaling enhances
pancreatic cancer metastasis. Clin. Cancer Res. 10: 7775.
72. Hotz, H. G. et al. (2001) An improved clinical model of orthotopic
pancreatic cancer in immunocompetent Lewis rats. Pancreas 22: 113.
73. Ikeda, Y. et al. (1990) Establishment and characterization of human
pancreatic cancer cell lines in tissue culture and in nude mice. Jpn. J.
Cancer Res. 81: 987.
74. An, Z. et al. (1996) A clinical nude mouse metastatic model for highly
malignant human pancreatic cancer. Anticancer Res 16: 627.
75. Muerkoster, S. et al. (2004) Tumor stroma interactions induce
chemoresistance in pancreatic ductal carcinoma cells involving increased
secretion and paracrine effects of nitric oxide and interleukin-1beta. Cancer
Res 64: 1331.
76. Kubota, T. (1994) Metastatic models of human cancer xenografted in the
nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell Biochem.
56: 4.
77. An, Z. et al. (1998) Surgical orthotopic implantation allows high lung and
lymph node metastatic expression of human prostate carcinoma cell line
PC-3 in nude mice. Prostate 34: 169.
78. Vezeridis, M. P. et al. (1989) Invasion and metastasis following orthotopic
transplantation of human pancreatic cancer in the nude mouse. J Surg.
Oncol. 40: 261.
84
79. Furukawa, T. et al. (1993) A novel "patient-like" treatment model of human
pancreatic cancer constructed using orthotopic transplantation of
histologically intact human tumor tissue in nude mice. Cancer Res 53: 3070.
80. Alves, F. et al. (2001) An orthotopic model of ductal adenocarcinoma of the
pancreas in severe combined immunodeficient mice representing all steps
of the metastatic cascade. Pancreas 23: 227.
81. Goldbrunner, R. H. et al. (2000) Models for assessment of angiogenesis in
gliomas. J. Neurooncol. 50: 53.
82. Yang, M. et al. (2001) Whole-body and intravital optical imaging of
angiogenesis in orthotopically implanted tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A 98: 2616.
83. Fleming, J. B. and Brekken, R. A. (2003) Functional imaging of
angiogenesis in an orthotopic model of pancreatic cancer. J Cell Biochem.
90: 492.
84. Klaunberg, B. A. and Lizak, M. J. (2004) Considerations for setting up a
small-animal imaging facility. Lab Anim (NY) 33: 28.
85. Gambhir, S. S. (2002) Molecular imaging of cancer with positron emission
tomography. Nat. Rev. Cancer 2: 683.
86. Yang, H. et al. (2003) MicroPET imaging of prostate cancer in LNCAPSR39TK-GFP mouse xenografts. Prostate 55: 39.
87. Ray, P. et al. (2003) Optical bioluminescence and positron emission
tomography imaging of a novel fusion reporter gene in tumor xenografts of
living mice. Cancer Res. 63: 1160.
88. He, Z. et al. (2000) Magnetic resonance imaging to measure therapeutic
response using an orthotopic model of human pancreatic cancer. Pancreas
21: 69.
89. Berr, S. S. et al. (2003) Magnetic resonance imaging of gastric cancer in Tff1
knock-out mice. Magn Reson. Med. 49: 1033.
90. Nelson, A. L. et al. (2003) Magnetic resonance imaging of patched
heterozygous and xenografted mouse brain tumors. J. Neurooncol. 62: 259.
91. Walters, E. B. et al. (2004) Improved method of in vivo respiratory-gated
micro-CT imaging. Phys. Med. Biol. 49: 4163.
85
92. Boone, J. M. et al. (2004) Small-animal X-ray dose from micro-CT. Mol.
Imaging 3: 149.
93. Mukundan S Jr et al. (2006) A liposomal nanoscale contrast agent for
preclinical CT in mice. AJR Am. J. Roentgenol. 186: 300.
94. Zhou, Y. Q. et al. (2004) Ultrasound-guided left-ventricular catheterization:
a novel method of whole mouse perfusion for microimaging. Lab Invest 84:
385.
95. Wirtzfeld, L. A. et al. (2005) A new three-dimensional ultrasound
microimaging technology for preclinical studies using a transgenic prostate
cancer mouse model. Cancer Res. 65: 6337.
96. Hoffman, R. M. (1998) Orthotopic transplant mouse models with green
fluorescent protein-expressing cancer cells to visualize metastasis and
angiogenesis. Cancer Metastasis Rev. 17: 271.
97. Yang, M. et al. (2000) Whole-body optical imaging of green fluorescent
protein-expressing tumors and metastases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97:
1206.
98. Edinger, M. et al. (1999) Noninvasive assessment of tumor cell proliferation
in animal models. Neoplasia. 1: 303.
99. Burgos, J. S. et al. (2003) Time course of bioluminescent signal in
orthotopic and heterotopic brain tumors in nude mice. Biotechniques 34:
1184.
100. Mai, W. et al. (2004) Ultrasound detection of spontaneous hepato-cellular
carcinomas in X/myc bitransgenic mice. Liver Int. 24: 651.
101. Chalfie, M. et al. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene
expression. Science 263: 802.
102. Chishima, T. et al. (1997) Metastatic patterns of lung cancer visualized live
and in process by green fluorescence protein expression. Clin. Exp.
Metastasis 15: 547.
103. Jenkins, D. E. et al. (2003) In vivo monitoring of tumor relapse and
metastasis using bioluminescent PC-3M-luc-C6 cells in murine models of
human prostate cancer. Clin. Exp. Metastasis 20: 745.
104. Haseloff, J. (1999) GFP variants for multispectral imaging of living cells.
Methods Cell Biol. 58: 139.
86
105. Contag, C. H. et al. (2000) Use of reporter genes for optical measurements
of neoplastic disease in vivo. Neoplasia. 2: 41.
106. Rosochacki, S. J. and Matejczyk, M. (2002) Green fluorescent protein as a
molecular marker in microbiology. Acta Microbiol. Pol. 51: 205.
107. Rogers, K. L. et al. (2005) Visualization of local Ca2+ dynamics with
genetically encoded bioluminescent reporters. Eur. J. Neurosci. 21: 597.
108. Katz, M. H. et al. (2004) An imageable highly metastatic orthotopic red
fluorescent protein model of pancreatic cancer. Clin. Exp. Metastasis 21: 7.
109. Liu, H. S. et al. (1999) Is green fluorescent protein toxic to the living cells?
Biochem. Biophys. Res Commun. 260: 712.
110. Troy, T. et al. (2004) Quantitative comparison of the sensitivity of detection
of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Mol.
Imaging 3: 9.
111. Hooper, C. E. et al. (1990) CCD imaging of luciferase gene expression in
single mammalian cells. J. Biolumin. Chemilumin. 5: 123.
112. McLennan, A. G. (2000) Dinucleoside polyphosphates-friend or foe?
Pharmacol. Ther. 87: 73.
113. Murphy, G. A. and McLennan, A. G. (2004) Synthesis of dinucleoside
tetraphosphates in transfected cells by a firefly luciferase reporter gene. Cell
Mol. Life Sci. 61: 497.
114. Bouvet, M. et al. (2000) Chronologically-specific metastatic targeting of
human pancreatic tumors in orthotopic models. Clin Exp. Metastasis 18:
213.
115. Hoffman, R. M. (2005) In vivo cell biology of cancer cells visualized with
fluorescent proteins. Curr. Top. Dev. Biol. 70: 121.
116. Sun, F. X. et al. (2003) Efficacy of camptothecin analog DX-8951f (Exatecan
Mesylate) on human pancreatic cancer in an orthotopic metastatic model.
Cancer Res. 63: 80.
117. Bruns, C. J. et al. (2000) Epidermal growth factor receptor blockade with
C225 plus gemcitabine results in regression of human pancreatic carcinoma
growing orthotopically in nude mice by antiangiogenic mechanisms.
Clinical Cancer Research 6: 1936.
87
118. Jenkins, D. E. et al. (2005) Bioluminescent human breast cancer cell lines
that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and
multiple metastases in immune deficient mice. Breast Cancer Res. 7: R444.
119. Noble, S. and Goa, K. L. (1997) Gemcitabine. A review of its pharmacology
and clinical potential in non-small cell lung cancer and pancreatic cancer.
Drugs 54: 447.
120. Abratt, R. P. et al. (1994) Efficacy and safety profile of gemcitabine in nonsmall-cell lung cancer: a phase II study. J Clin Oncol 12: 1535.
121. Gatzemeier, U. et al. (1996) Activity of gemcitabine in patients with nonsmall cell lung cancer: a multicentre, extended phase II study. Eur J Cancer
32A: 243.
122. Stadler, W. M. et al. (1996) A phase II study of gemcitabine (GEM) in
bladder cancer (BC). Annal Oncol 7: 58 (abstr 272P).
123. Poplin, E. et al. (1999) Leucovorin, 5-fluorouracil, and gemcitabine: a phase
I study. Invest New Drugs 17: 57.
124. Schmid, P. et al. (1999) Phase II trial of gemcitabine as prolonged infusion
in metastatic breast cancer. Anticancer Drugs 10: 625.
125. Ishii, H. et al. (2005) Impact of gemcitabine on the treatment of metastatic
pancreatic cancer. J Gastroenterol. Hepatol. 20: 62.
126. Rothenberg, M. L. et al. (1996) A phase II trial of gemcitabine in patients
with 5-FU-refractory pancreas cancer. Ann. Oncol. 7: 347.
127. Zagon, I. S. et al. (2005) Combination chemotherapy with gemcitabine and
biotherapy with opioid growth factor (OGF) enhances the growth inhibition
of pancreatic adenocarcinoma. Cancer Chemother. Pharmacol. 56: 510.
128. Abbruzzese, J. L. et al. (1991) A phase I clinical, plasma, and cellular
pharmacology study of gemcitabine. J Clin Oncol 9: 491.
129. Reid, J. M. et al. (2004) Phase I trial and pharmacokinetics of gemcitabine
in children with advanced solid tumors. J. Clin. Oncol. 22: 2445.
130. Wang, L. R. et al. (2005) Pharmacokinetics of gemcitabine in Chinese
patients with non-small-cell lung cancer. J. Zhejiang. Univ Sci. B 6: 446.
131. Moog, R. et al. (2002) Change in pharmacokinetic and pharmacodynamic
behavior of gemcitabine in human tumor xenografts upon entrapment in
vesicular phospholipid gels. Cancer Chemother. Pharmacol. 49: 356.
88
132. van Borssum Waalkes, M. et al. (1993) In-vitro stability and cytostatic
activity of liposomal formulations of 5-fluoro-2'-deoxyuridine and its
diacylated derivatives. Biochim Biophys Acta 1148: 161.
133. van Borssum Waalkes M. et al. (1993) Conversion of liposomal 5-fluoro-2'deoxyuridine and its dipalmitoyl derivative to bile acid conjugates of alphafluoro-beta-alanine and their excretion into rat bile. Biochim. Biophys. Acta
1176: 43.
134. Brandl, M. et al. (1997) Morphology of semisolid aqueous
phosphatidylcholine dispersions, a freeze fracture electron microscopy
study. Chem Phys Lipids 87: 65.
135. Massing, U. et al. (1998) Verfahren zur Herstellung von liposomalen
Wirkstoffformulierungen (Passive loading technique) Int Patent Application
(PCT/EP99/01992).
136. Moog, R. et al. (2002) Change in pharmacokinetic and pharmacodynamic
behavior of gemcitabine in human tumor xenografts upon entrapment in
vesicular phospholipid gels. Cancer Chemother. Pharmacol. 49: 356.
137. Brandl, M. and Massing, U. (2003) Vesicular phospholipid gels. 353.
138. Kaiser, N. et al. (2003) 5-Fluorouracil in vesicular phospholipid gels for
anticancer treatment: entrapment and release properties. Int. J. Pharm.
256: 123.
139. Celano, M. et al. (2004) Cytotoxic effects of gemcitabine-loaded liposomes
in human anaplastic thyroid carcinoma cells. BMC. Cancer 4: 63.
140. Moog, R. et al. (2002) Change in pharmacokinetic and pharmacodynamic
behavior of gemcitabine in human tumor xenografts upon entrapment in
vesicular phospholipid gels. Cancer Chemother. Pharmacol. 49: 356.
141. Schmidt, J. et al. (2000) Vascular structure and microcirculation of
experimental pancreatic carcinoma in rats. Eur. J Surg 166: 328.
142. Seymour, L. W. (1992) Passive tumor targeting of soluble macromolecules
and drug conjugates. Crit Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9: 135.
143. Maeda, H. (2001) The enhanced permeability and retention (EPR) effect in
tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug
targeting. Adv. Enzyme Regul. 41: 189.
89
144. Moog, R. et al. (2002) Change in pharmacokinetic and pharmacodynamic
behavior of gemcitabine in human tumor xenografts upon entrapment in
vesicular phospholipid gels. Cancer Chemother. Pharmacol. 49: 356.
145. Matsumura, Y. (2006) [Micelle carrier system in clinical trial]. Nippon
Rinsho 64: 316.
146. Drummond, D. C. et al. (1999) Optimizing liposomes for delivery of
chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacol. Rev. 51: 691.
147. Yuan, F. et al. (1994) Microvascular permeability and interstitial
penetration of sterically stabilized (stealth) liposomes in a human tumor
xenograft. Cancer Res. 54: 3352.
148. Fukumura, D. et al. (1997) Effect of host microenvironment on the
microcirculation of human colon adenocarcinoma. Am. J. Pathol. 151: 679.
149. Achilles, E. G. et al. (2001) Heterogeneity of angiogenic activity in a human
liposarcoma: a proposed mechanism for "no take" of human tumors in
mice. J. Natl. Cancer Inst. 93: 1075.
150. Udagawa, T. et al. (2002) Persistence of microscopic human cancers in
mice: alterations in the angiogenic balance accompanies loss of tumor
dormancy. FASEB J. 16: 1361.
151. Huang, W. Y. et al. (2000) Transgenic expression of green fluorescence
protein can cause dilated cardiomyopathy. Nat. Med. 6: 482.
152. Goto, H. et al. (2003) Transduction of green fluorescent protein increased
oxidative stress and enhanced sensitivity to cytotoxic drugs in
neuroblastoma cell lines. Mol. Cancer Ther. 2: 911.
153. Kataoka, H. et al. (1999) Enhanced tumor growth and invasiveness in vivo
by a carboxyl-terminal fragment of alpha1-proteinase inhibitor generated by
matrix metalloproteinases: a possible modulatory role in natural killer
cytotoxicity. Am. J. Pathol. 154: 457.
154. Kawano, K. et al. (2004) Establishment and characterization of a novel
human pancreatic cancer cell line (SUIT-4) metastasizing to lymph nodes
and lungs in nude mice. Oncology 66: 458.
155. Taniguchi, S. et al. (1994) Heterogeneities of attachment, chemotaxis, and
protease production among clones with different metastatic potentials from
a human pancreatic cancer cell line. Clin Exp. Metastasis 12: 238.
90
156. Kitamura, N. et al. (2000) High collagenolytic activity in spontaneously
highly metastatic variants derived from a human pancreatic cancer cell line
(SUIT-2) in nude mice. Clin Exp. Metastasis 18: 561.
157. Mohammad, R. M. et al. (1998) An orthotopic model of human pancreatic
cancer in severe combined immunodeficient mice: potential application for
preclinical studies. Clinical Cancer Research 4: 887.
158. Braakhuis, B. J. et al. (1995) Schedule-dependent antitumor effect of
gemcitabine in in vivo model system. Semin Oncol 22: 42.
159. Mohammad, R. M. et al. (1999) Clonal preservation of human pancreatic
cell line derived from primary pancreatic adenocarcinoma. Pancreas 19:
353.
160. Liu, C. et al. (2000) Virulizin-2gamma, a novel immunotherapeutic agent,
in treatment of human pancreatic cancer xenografts. Int J. Oncol. 16: 1015.
161. Feng, N. et al. (2003) Antitumor activity of Virulizin, a novel biological
response modifier (BRM) in a panel of human pancreatic cancer and
melanoma xenografts. Cancer Chemother. Pharmacol. 51: 247.
162. Rostock, M. et al. (2005) Anticancer activity of a lectin-rich mistletoe
extract injected intratumorally into human pancreatic cancer xenografts.
Anticancer Res 25: 1969.
163. Katz, M. H. et al. (2003) A novel red fluorescent protein orthotopic
pancreatic cancer model for the preclinical evaluation of
chemotherapeutics. J Surg Res 113: 151.
164. Duxbury, M. S. et al. (2004) Inhibition of SRC tyrosine kinase impairs
inherent and acquired gemcitabine resistance in human pancreatic
adenocarcinoma cells. Clinical Cancer Research 10: 2307.
91
7. Zusammenfassung
EINFÜHRUNG: Ziel des Projektes war die Entwicklung eines Imaging-fähigen,
orthotopen Mausmodells für menschliche Pankreaskarzinomzelllinien zur Testung
neuer Behandlungsregimes. Die Vorteile eines solchen Systems liegen in der Nähe
zur klinischen Situation und in vivo erhebbare Daten z.B. über Tumorwachstum
und Metastasierung. Das System wurde anhand eines Therapieversuches über 7
Wochen mit einer neuen liposomalen Gemcitabin-Formulierung getestet.
METHODIK: Ein Luciferase-Neomycin-Resistenz-Gen wurde in die Tumorzelllinien
MIA PaCa-2 und AsPC-1 eingebracht und die resultierenden Zelllinien auf
Luciferasexpression überprüft. Zur orthotopen Implantation wurden Fragmente
subkutan gewachsener Donortumoren verwendet. Tumorlokalisation, -wachstum
und Metastasierungsmuster wurden in vivo wöchentlich per CCD-Kamera
überwacht. Quantitative Aussagen zur Metastasierung zu erhalten wurden beim
Abschluss der Experimente im Luziferase-Assay von Tumor, Pankreas, Milz,
Leber, Magen, Darm, Lunge und inguinalen Lymphknoten generiert. Der
Therapieversuch schloß 5 Gruppen á 10 Tiere ein (Kontrolle, GemcitabinPositivkontrolle 240 mg, GemLip 4mg, GemLip 8 mg, Leerliposomen).
ERGEBNISSE: Erste Signale konnten bereits eine Woche nach Implantation
gemessen werden. Bei einem Therapiebeginn 2-3 Wochen nach Implantation
konnten die Gruppen aufgrund der Signalintensität eingeteilt werden. Metastasen
konnten bei AsPC-1 nach 2-3 Wochen, bei MIA PaCa-2 nach 4-5 Wochen
beobachtet werden. Die Bestimmung der Luziferase Aktivität in den Organen
lieferte
eine
quantitative
Behandlungsversuch
zeigte
Größe
sich
eine
der
Metastasen-Belastung.
hochsignifikante
Verzögerung
Im
des
Tumorwachstums in der GemLip 8 mg-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe.
DISKUSSION: Die Modelle sind in der Lage, die erwarteten Daten zu liefern.
Tumoren und Metastasen können bereits wenige Wochen nach Implantation
abgebildet werden. Signalnegative oder aberrante Signale tragende Mäuse können
frühzeitig aussortiert werden, um die Tierzahl zu in Therapieversuchen zu
reduzieren. Die Biolumineszenz-Signale können zur Randomisierung von
Versuchsgruppen genutzt werden. Die neue Gemcitabin-Formulierung zeigt eine
verbesserte Wirksamkeit gegen Pankreaskarzinome.
92
8. Abkürzungsverzeichnis
5-FU
5-Fluoro-Uracil
5-JÜR
Fünfjahresüberlebensrate
ATCC
American Type Culture Collection
ATP
Adenosin-Tri-Phospat
AU
artifizielle Einheiten (atificial units)
CCD
charge coupled device
CK
Cytokeratin
dCTP
Desoxycytidin-Triphosphat
dFdC
2',2'-Difluorodesoxycytidin (Gemcitabin)
FdU
Difluorodesoxyuracil
DMEM
Dulbecco’s modified Eagle Medium
EPR-Effekt
enhanced permeability and retention
FCS
Fetales Kälberserum
GemKonv
klassische Gemcitabin-Formulierung
GemLip
liposomale Gemcitabin-Formulierung
GFP
Green Fluorescent Protein
HE
Hämalaun-Eosin
KTB
Klinik für Tumorbiologie Freiburg
LD50
letale Dosis für die Hälfte der Zellen
MTD
maximal tolerierbare Dosis
PBS-Puffer
phosphate buffered saline
PEG
Polyethylenglykol
PFA
para-Formaldehyd
PPPD
pyloruserhaltende Pankreaskopfresektion
RbNR
Ribonukleotid-Reduktase
RFP
Red Fluorescent Protein
SCID
Severe Combined Immunodeficient
VPG
Vesikuläre Phosholipidgele
T/C-Rate
Quotient der Volumina der behandelten (Treated) und
der Kontrolltiere
(Control)
93
9. Danksagung
Zuerst danke ich Herrn Prof. Dr. med. Dr. h. c. Ulrich Theodor Hopt,
Direktor der Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie der Albert-LudwigsUniversität Freiburg für die herzliche Aufnahme in seiner Klinik und die Schaffung
einer Forschungsstelle, die diese Arbeit initial erst möglich gemacht hat.
Durch die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die Überlassung des
Themas der Promotion ermöglichte mir Dr. med. Ernst von Dobschütz als
Laborleiter den Einstieg in die experimentelle Medizin und das Erlernen des
wissenschaftlichen Arbeitens. Ohne seinen fortwährenden Einsatz, der auch über
die kollegiale Zusammenarbeit hinausreichte, und die vielfältigen Impulse würde
diese Dissertation nicht existieren.
Herrn Dr. Phil. II Ralph Graeser gebürt mein freundschaftlichster Dank für
unermüdliche Motivation und Inspiration. Fest steht, dass die vorliegende Arbeit
ohne seine fortwährende Unterstützung undenkbar gewesen wäre.
Gleiches gilt für Herrn Dr. med. vet. Norbert Esser, der mich in das Reich
der Mäuse einlies und mir die große Verantwortung tierexperimentellen Handels
nahebrachte. Sein aufopferungsvoller Beistand war unabdingbar für die
Durchführung des Projektes.
Für die Übernahme der Vaterschaft und Beurteilung dieser Promotion als
Erstgutachter möchte ich Herrn PD Dr. med. Tobias Keck meinen allerherzlichsten
Dank aussprechen.
Stellvertretend für die Klinik für Tumorbiologie und als Gutachter dieser
Arbeit danke ich Herrn Prof. Dr. med. C. Unger. Unter seiner maßgeblichen
Direktion entstand eine fruchtbare Kooperation zwischen der KTB und der
Chirurgischen Universitätsklinik.
94
Ein ganz herzlicher Dank geht an das Team der Proqinase GmbH unter der
Leitung von Dr. rer. nat. Christoph Schächtele sowohl für die essentielle
menschliche und fachliche Unterstützung sowie für die Bereitstellung ihrer
Ressourcen.
Frau Bianca Giessen und Frau Sandra Mohr aus der Arbeitsgruppe von
Herrn Esser gebührt mein herzlichster Dank für die liebevolle, unabdingbare
Unterstützung beim Umgang mit den Tieren, der Zellkultur und der histologischen
Aufarbeitung. Durch ihre menschliche Art trug wesentlich zur Durchführung der
Projekte nach höchstem ethischen Standard bei.
Ohne die Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Uli Massing
speziell auf der pharmakologischen Ebene wäre die Modellevaluierung so nicht
möglich gewesen. Durch seine ansteckende Begeisterung für VPGs und Kaffee
erhielt das Projekt immer wieder entscheidende Impulse.
Frau Jessica Kluth und Herrn Vitorio Ziroli aus dieser Arbeitsgruppe
möchte ich sehr für den methodischen Support bei der Bereitstellung der
Chemotherapeutika und der im wörtlichen Sinne zermürbenden Beihilfe auf dem
Gebiet der murinen Homogenisation danken. Die stundenlange Knochenarbeit hat
sich gelohnt.
Frau Dr. Marta Rodriguez-Franco und Herrn Prof. Dr. Gunter Neuhaus
(Institut für Biologie II, Zell Biologie,Universität Freiburg) für Ihre uneigennützige
und zuvorkommende Unterstützung sowie die Bereitstellung Ihres CCD-KameraSystem. Ohne Ihre freundliche Kooperation wäre das Projekt nie in diesem
Umfang zustande gekommen.
An dieser Stelle möchte ich der Clotten-Stiftung nochmals meinen Dank für
die großzügige Unterstützung des Gesamtprojektes danken, die es ermöglicht, die
beschrittenen Wege weiterzugehen.
95
Die Chance zu bekommen, das Erreichte auch zu erreichen, ist alles andere
als selbstverständlich. Der Dank hierfür gebührt allein meiner Familie.
Die endgültige Fertigstellung widme ich meinem Stern.
96
10. Curriculum vitae
Persönliche Daten
Geburtsdaten
03.06.1977 in Ilmenau
Familienstand
ledig bis 2007
Vater
Dr. Ing. im Konstruktionsbereich
Mutter
Grundschullehrerin
Schwester
Ärztin
Tätigkeit
2005 ― 2007
Assistenzarzt
Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie
Chirurgische Universitätsklinik Freiburg
Forschung
2004 ― 2007
Wiss. Mitarbeiter im Bereich Chirurgische Forschung
Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie
Chirurgische Universitätsklinik Freiburg
Studium
1997 ― 2004
Humanmedizin Friedrich-Schiller-Universität Jena
3. Staatsexamen
: Note „Sehr gut“
Klinische Ausbildung gesamt
: Note „Gut“
Praktisches Jahr
Kinderchirurgie
Friedrich-Schiller-Universität Jena
Innere Medizin
Spital Thusis - Schweiz
Pädiatrie
Sophien - Hufeland - Kliniken Weimar
97
Famulaturen - Praktika
2002
Allgemeinchirurgische Praxis - Bad Liebenstein
2001
Pädiatrie - Klinik für Kinderheilkunde FSU Jena
2000
Radiologie - Regionalkrankenhaus Bozen - Italien
1999
Allgemeinchirurgie - Klinikum Konstanz
1998
Grundkurs in Tibetischer Medizin - Men Tse Khang
Dharamsala - Indien
Wehrdienst
1996 ― 1997
Obergefreiter im Sanitätsdienst
Straubing und Mellrichstadt - Bayern
Schulbildung
1990 ― 1996
Gymnasium „Am Lindenberg“ Ilmenau
Abiturnote „Sehr gut“
Christian Bornmann
98
11. Veröffentlichungen und Kongressbeiträge
Originalarbeit in “Cancer Chemotherapy and Pharmacology”
C. Bornmann, R. Graeser, N. Esser, V. Ziroli, P. Jantscheff, T. Keck, C.
Unger, U. Hopt, U. Adam, C. Schaechtele, U. Massing, E. von Dobschuetz, A new
liposomal formulation of Gemcitabine is active in an orthotopic mouse model of
pancreatic cancer accessible to bioluminescence imaging. Cancer Chemother
Pharmacol. Manuscript No. CCP-06-0458 (accepted 16.03.2007).
Kongressbeiträge
1. C. Bornmann, R. Graeser, U. Adam, U.T. Hopt, N. Esser, E. von
Dobschütz,
Etablierung
exprimierenden
eines
Zelllinien
Pankreaskarzinommodells
zur
Beurteilung
von
mit
Luziferase-
Therapie-
und
Metastasierungsverhalten mit einem in vivo-Imaging System. Pankreas-Club
Tagung, Freiburg (2006).
2. R. Graeser, N. Esser, C. Bornmann, P. Jantscheff, U.T. Hopt, E. von
Dobschuetz, U. Massing and C. Schaechtele, Development of metastasizing
orthotopic tumor models accessible to in vivo bioluminescence imaging. AACR
Annual Meeting, Washington DC, USA (2006).
3. N. Esser, R. Graeser, C. Bornmann, P. Jantscheff, U.T. Hopt, E. von
Dobschuetz, U. Massing and C. Schaechtele, A new liposomal formulation of
gemcitabine is active in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. AACR
Annual Meeting, Washington DC, USA (2006).
4. R. Graeser, C. Bornmann, N. Esser, P. Jantscheff, V. Ziroli, C. Unger, U.T.
Hopt, E. von Dobschuetz, C. Schaechtele, U. Massing, Anti-metastatic activity of
liposomes demonstrated on anorthotopic mouse model of pancreatic cancer.
AACR Annual Meeting, Los Angeles DC, USA (2007).