ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus dem Institut für
Pathologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Tumormetastasierung in die Leber –
Reaktionen des zellulären hepatischen Abwehrsystems
beim Menschen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Sonnhild Cordua
geboren in Nördlingen
Aus dem Institut für
Pathologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Tumormetastasierung in die Leber –
Reaktionen des zellulären hepatischen Abwehrsystems
beim Menschen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Sonnhild Cordua
geboren in Nördlingen
Dekan:
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Jahr der Promotion:
Prof. Dr. C. Peters
Prof. Dr. Dr. h. c. N. Freudenberg
PD Dr. R. Fischer
2009
Meiner Mutter
in großer Dankbarkeit
gewidmet
I N HALT S V E R Z E I C H N I S
1
EINLEITUNG
1.1
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.3
Einführung in den Problemkomplex ……………………………..
Nicht-parenchymale Leberzellen (NPLC) …………………………
Lebertypische Makrophagen …………………………………….
Leber-assoziierte Lymphozyten (LAL) ………………………….
NK-Zellen ……………………………………………………….
Ito-Zellen
………………………………………………………
Sinusoidale Endothelzellen ……………………………………...
Fragestellung …………………………………………………….
2
MATERIAL UND METHODEN
2.1
2.1.1
Gewinnung des Gewebematerials ……………………………….
Tumorumgebendes Gewebe …………………………………….
2.1.1.1 Histologischer Befund …………………………………
Tumorfreies Kontroll-Gewebe ………………………………….
Prozedere bis zur Verwendung des Materials …………………….
Isolierung der NPLC ……………………………………………
Methodische Änderungen
……………………………………..
Vorgang der Isolierung der NPLC ……………………………….
Fixierung der Zellen ……………………………..........................
Immunzytochemische Identifizierung der NPLC ……………….
Variierung der Parameter beim Einsatz der Antikörper …………
Auswahl der Antikörper …………………………………………
2.4.2.1 Nicht einsetzbare Antikörper ………………………….
2.4.2.2 Verwendete Antikörper und Bezugsquellen ……………
Antikörper und zugehörige Antigene ………................................
Vorgang der NPLC-Färbung …………………………………....
Lichtmikroskopische Auswertung ………………………………
1.2
2.1.2
2.1.3
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
1
3
3
4
5
7
7
8
10
10
11
12
12
12
12
13
15
16
16
16
16
17
19
21
22
3
3.1
3.2
3.3
3.3.1
ERGEBNISSE
3.3.3
3.3.4
Gruppierung der Gewebeproben …………………………………
Zellausbeute ……………………………………………………..
Anteil der identifizierten Zellen an den NPLC …………………..
Lebertypische Makrophagen …………………………………….
3.3.1.1 Unreife Makrophagen (27E10) …………………………
3.3.1.2 Reife Makrophagen (25F9) …………………………….
3.3.1.3 Vergleich der unreifen und reifen Makrophagen ………
3.3.1.4 Verhältnis von 25F9/27E10 ………………………………
3.3.1.5 CD68-positive Makrophagen …………………………..
3.3.1.6 Vergleich der reifen M. (25F9) mit CD68-pos. M. ………
3.3.1.7 CD16-positive Makrophagen ……………………………
Leber-assoziierte Lymphozyten …………………………………
3.3.2.1 T-Lymphozyten (CD3) …………………………………
3.3.2.2 NK-Zellen (CD16) ……………………………………..
3.3.2.3 Zytotoxische T-Zellen (CD8) …………………………..
3.3.2.4 B-Lymphozyten (CD20) ……………………………….
Ito-Zellen (Aktin, Desmin) ………………………………………
Anteil der identifizierten Zellen an den NPLC …………………...
4
DISKUSSION
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
Anmerkungen zur Methode und zum Material ………………….
Untersuchungsergebnisse ………………………………………
Bewertung der Ergebnisse ………………………………………
Lebertypische Makrophagen ……………………………………
Leber-assoziierte Lymphozyten ………………………………...
Ito-Zellen
………………………………………………………
Sinusoidale Endothelzellen
…………………………………..
3.3.2
23
24
25
26
26
28
30
31
33
35
37
39
39
41
43
44
45
47
49
51
51
51
53
55
56
5
ZUSAMMENFASSUNG
6
ANHANG
…………………………………………………..
58
6.1
6.2
6.3
Abkürzungen …………………………………………………….
Verwendete Lösungen …………………………………………..
Literaturverzeichnis ……………………………………………..
Lebenslauf und Danksagung ……………………………………….
58
59
60
74
57
1
1
EINLEITUNG
1.1
Einführung in den Problemkomplex
Folgende Tatsachen verdeutlichen, wie wichtig das frühe Erkennen von Lebermetastasen und die
Weiterentwicklung der Therapiemöglichkeiten sind:
-
Nach den Lymphknoten ist die Leber das am häufigsten von Metastasen betroffene Organ und
unter den zum Tode führenden Lebererkrankungen stehen die Metastasen an zweiter Stelle.
-
Von den Patienten mit kolorektalen Karzinomen haben 25% bei Erstdiagnose des Primärtumors
bereits Lebermetastasen und im weiteren Verlauf streuen die Tumorzellen bei 66% der
Patienten in die Leber.
-
Nach kurativer Resektion des Primärtumors ist das Tumorwachstum in der Leber ein
entscheidender prognostischer Faktor.
In der Leber findet sich ein vollständiges und autonomes Kompartiment des Immunsystems, das
sich aus Nicht-parenchymalen Leberzellen (NPLC) zusammensetzt. Zu diesen Zellen gehören
sinusoidale und perisinusoidalen Zellen, sowie Zellen des Pfortadersystems. Die sinusoidalen und
perisinusoidalen Zellen umfassen vier gut bekannte Zelltypen: Kupffer-Zellen (Makrophagen), PitZellen (NK-Zellen), Fett speichernde (Ito-) Zellen und Endothelzellen. Bioulac-Sage et al (1988)
identifizierten außerdem Lymphozyten, die in den Sinusoiden ansässig sind.
Tumorzellen haben die Fähigkeit, durch unterschiedliche Signale lokale Immunreaktionen in ihrer
Umgebung sowohl zu stimulieren als auch zu supprimieren. Eine Aktivierung ortsständiger oder
chemotaktisch angelockter immunkompetenter Zellen wiederum kann hemmend oder fördernd auf
die Proliferation und Ausbereitung der Tumorzellen einwirken (Jones 1983). Von Makrophagen
beispielsweise ist bekannt, dass sie von so genannten Stressproteinen auf Tumorzellen aktiviert
werden und zytotoxische Substanzen sowie Zytokine sezernieren. Zytokine bewirken eine
Aktivierung und Chemotaxis von CD4- und CD8-positiven Antitumor-Zellen. Auch BLymphozyten werden aktiviert und bilden Antikörper gegen Tumor-Antigene.
Andererseits wird beschrieben, dass tumorassoziierte Makrophagen Reaktionen anstoßen, welche
die Ausbreitung und das Wachstum eines Tumors fördern. Es kommt u. a. zur Auflösung von
Basalmembranen und zur Förderung der Angiogenese. Nicht bekannt ist, wovon es abhängt,
2
welcher der möglichen Reaktionswege zum Zuge kommt. Die Einsicht in die Wirkungsweise des
zellulären und humoralen
Immunsystems der Leber könnte ein Schlüssel zur Prävention,
Früherkennung und Therapie von Metastasen werden.
Das Wissen der Tumorimmunologie basiert bis heute zum großen Teil auf Ergebnissen, die an
Tiermodellen gewonnen wurden (Prendergast et al 2007).
Oka et al (1994) zeigten an der Ratte, dass ein chirurgischer Eingriff im Gastrointestinaltrakt die
zytotoxische Aktivität der Nicht-parenchymalen Leberzellen (NPLC) signifikant supprimiert und
die Entstehung von Lebermetastasen begünstigt. Dieses Ergebnis lässt auf den antimetastatischen
Effekt einer perioperativen Immuntherapie hoffen.
Am Maus-Modell konnten Freudenberg et al (1996) Veränderungen im zellulären Immunsystem
der Leber identifizieren, die eine bevorstehende Metastasierung ankündigten. Bei Bestätigung
dieses Ergebnisses an humanen NPLC könnte ein Frühwarnsystem für eine bevorstehende
Metastasierung entwickelt werden.
Zu den Interaktionen zwischen dem humanen Immunsystem und Tumorzellen liegen wenige
Untersuchungen vor. Bisherige immunzytochemische Untersuchungen an humanen NPLC
konzentrierten sich jeweils nur auf einzelne Populationen der sinusoidalen Zellen oder nur auf die
perisinusoidalen (Ito-) Zellen. Um auf die Reaktionen des lokalen Immunsystems der Leber
Einfluss nehmen zu können, ist es notwendig, die einzelnen Zelltypen dieses Systems und weitere,
zu diesem funktionellen Netzwerk gehörende Nicht-parenchymale Leberzellen (Ito-Zellen und
sinusoidale Endothelzellen) in ihrem Verhältnis zueinander zu charakterisieren. Die bisherigen
Ergebnisse hierzu wurden am Tier-Modell gewonnen (Freudenberg et al 1989b).
Mit der Etablierung einer auch für kleine Gewebeproben (ab etwa 0,5 Gramm) geeigneten
Isolierungsmethode für die Gesamtheit der bekannten humanen NPLC möchte diese Arbeit einen
Beitrag zu Bestimmung von deren quantitativer Zusammensetzung leisten.
Ein weiterer Meilenstein ist das Erkennen von Parametern, die tumorbedingte Veränderungen in
dem System anzeigen und möglichst schon vor dem Auftreten makroskopisch erkennbarer
Metastasen nachweisbar sind. Der erste Schritt gilt der Untersuchung, ob sich die
Zusammensetzung der NPLC verändert, wenn bereits Tumoren erkennbar sind. Es war ein weiteres
Ziel der vorliegenden Arbeit, dieser Frage nachzugehen.
3
1.2
1.2.1
Nicht-parenchymale Leberzellen (NPLC)
Lebertypische Makrophagen (Kupffer-Sternzellen)
Die Makrophagen sind die wichtigsten geweberesidenten phagozytischen Zellen des angeborenen
Immunsystems. Sie bilden neben den neutrophilen Granulozyten eine erste Verteidigungslinie
gegen zahlreiche Krankheitserreger und auch gegen Tumorzellen. Nach Ausreifung im
Knochenmark zirkulieren sie 1-2 Tage im Intravasalraum als Monozyten (Blutmakrophagen), bevor
sie in verschiedene Gewebe einwandern und sich dort zu ortsständigen, gewebetypischen
Makrophagen differenzieren.
Die lebertypischen Makrophagen werden als Kupffer-Sternzellen oder einfach Kupffer-Zellen
bezeichnet. Sie machen den weitaus größten Teil der sessilen Makrophagen im menschlichen
Körper aus. Lokalisiert sind sie in den Lebersinusoiden auf oder zwischen den Endothelzellen,
gelegentlich findet man sie auch im Disse-Raum.
Ob die Kupffer-Zell-Population durch lokale Proliferation oder durch Einwanderung von
Vorläuferzellen aus dem Knochenmark aufrechterhalten wird, war über viele Jahrzehnte eine
Streitfrage. Je nach Ausgangssituation konnte der eine oder andere Mechanismus nachgewiesen
werden. Nach Jones (1983) und Crofton et al (1978) wird die Kupffer-Zell-Population unter
normalen Bedingungen hauptsächlich durch lokale Proliferation aufrechterhalten. Bei erhöhtem
Kupffer-Zell-Bedarf kommt auch der Einwanderung von Monozyten über die periphere Zirkulation
eine je nach Art des Stimulus unterschiedlich gewichtete Rolle zu (Freudenberg et al 1989a).
Unter den Kupffer-Zellen lassen sich reife und unreife Makrophagen unterscheiden. Die reifen
Zellen sind größer, phagozytieren stärker und zeigen eine ausgeprägtere Aktivität lysosomaler
Enzyme im Vergleich zu den kleineren unreifen Makrophagen. Letztere sind empfänglicher für
eine Aktivierung durch Muramylpeptide und tragen mehr Galaktosylrezeptoren an ihrer
Zelloberfläche, was ihre Bindungsfähigkeit an andere Zellen, z. B. Tumorzellen, erhöht (Bouwens
1992, Freudenberg et al 1996). Im Leber-Lobulus lässt sich periportal eine größere Anzahl reifer
Makrophagen nachweisen, während die perizentralen Makrophagen überwiegend den unreifen
Makrophagen zuzuordnen sind.
Die Bedeutung der Kupffer-Zellen für das Immunsystem beinhaltet sowohl antigenspezifische als
auch antigenunspezifische Funktionen (David und Reinke 1987, Bouwens 1988b). Außerdem
lassen sich konstitutive Funktionen von solchen unterscheiden, die beispeilsweise nur nach
Aktivierung durch Lymphokine wahr genommen werden (Fidler 1985). Zu den Letzteren zählt
4
auch die Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen. Diese kann durch spezifischen Zellkontakt (Fidler
1985) oder auf unspezifischem Wege erfolgen. Über die Sekretion von Zytokinen, wie IL-1 und
TNFα, können Kupffer-Zellen die Tumorzellen indirekt angreifen, da IL-1 und TNFα die
Proliferation von NK- und T-Zellen stimulieren (Johnkoski et al 1992) und deren zytotoxisches
Potential durch Induktion der Bildung von IL-2 und IL-2-Rezeptoren beeinflussen.
Hingegen wird an anderer Stelle für TNFα und Interleukin-1 eine fördernde Wirkung auf die
Ausbreitung von Metastasen beschrieben (Mantovani et al 1992).
Kan et al (1995) konnten zeigen, dass Zahl und Aktivität der Kupffer-Zellen in Metastasen
tragenden Lebern deutlich erhöht sind, wobei der Effekt in tumornahem Lebergewebe stärker
ausgeprägt ist als in tumorfernem. Außerdem ist eine Größenzunahme der Zellen in der
Nachbarschaft des Tumors erkennbar. Im Gegensatz hierzu sind sowohl Zahl als auch Größe und
phagozytische Aktivität dieser Zellen innerhalb des Tumors vermindert.
1.2.2
Leber-assoziierte Lymphozyten (LAL)
In den Lebersinusoiden sind verschiedene Lymphozytenpopulationen beheimatet, die unter dem
Namen leberassoziierte Lymphozyten (LAL) zusammengefasst werden. Es gibt zwei Hauptgruppen
von Lymphozyten: T-Lymphozyten und B-Lymphozyten. Sie unterscheiden sich durch ihre
Antigenrezeptoren und den Ort, an dem sie ausdifferenzieren: die T-Zellen im Thymus und die BZellen im Knochenmark.
Die meisten Lymphozyten sind kleine Zellen, die nur wenige zytoplasmatische Organellen
besitzen. Ein großer Teil des Kernchromatins ist kondensiert und damit inaktiv. Lange Zeit wurden
diese Zellen als Zellen ohne bekannte Funktion beschrieben. Lymphozyten besitzen tatsächlich
keine funktionelle Aktivität, bevor sie auf ein Antigen treffen, das ihre Proliferation und die
Ausdifferenzierung ihrer speziellen Funktionsmerkmale auslöst.
Während die Makrophagen beim Einsatz des angeborenen Immunsystems an vorderster Front
stehen, haben sich die Lymphozyten des adaptiven Immunsystems zu einem flexibleren
Abwehrmechanismus entwickelt, der zusätzlichen Schutz bietet. Besonderes Merkmal der
Lymphozyten ist ihre Fähigkeit, eine spezifische Immunantwort gegen praktisch jedes fremde
Antigen zu entwickeln. Der T-Zell-Antigenrezeptor (TCR) besitzt die Fähigkeit, Antigene von
fremden Proteinen oder Pathogenen zu erkennen, die in Wirtszellen eingedrungen sind. Die
Zerstörung dieser Eindringlinge ist die Aufgabe der T-Zellen. Sie sind für die zellvermittelte
Immunantwort des adaptiven Immunsystems verantwortlich.
5
Die Subpopulationen der Lymphozyten in der Leber unterscheiden sich quantitativ und zum Teil
auch qualitativ von denen im peripheren Blut.
Winnock et al (1995) sind bei der Untersuchung von Metastasenlebern als auch von Lebern mit
benignen Tumoren zu folgendem Ergebnis gekommen: Der Anteil der CD56-positiven Zellen ist in
der Leber dreimal so groß wie im Blut, wobei bemerkenswert ist, dass sich die leberassoziierten
CD56-positiven Zellen zu 95% aus CD3-positiven und CD16-negativen Zellen rekrutieren,
während die des peripheren Blutes hauptsächlich dem Phänotyp CD3-negativ und CD16-positiv
angehören.
Auch die γδ-T-Lymphozyten der Leber unterscheiden sich phänotypisch von denen des Blutes,
nämlich in ihrem Gen-Rearrangement (V-Gen). Außerdem sind nach Winnock et al (1991) CD8positive T-Zellen unter den LAL stärker, CD4-positive hingegen schwächer vertreten als im
peripheren Blut.
Über die Aktivität der leberassoziierten Lymphozyten (LAL) finden sich unterschiedliche Angaben.
Winnock et al (1993) haben bei den LAL aus Lebern mit benignen Tumoren eine im Vergleich zu
den Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL) sehr starke Zytotoxizität nachgewiesen, während
sich die Zytotoxizität der LAL aus Metastasenlebern nicht von jener der PBL unterscheidet und
deutlich schwächer ist als bei LAL aus Lebern mit benignen Tumoren.
LAL aus metastasennahem Gewebe wiederum zeigen geringere lymphokin-aktivierte KillerzellAktivität als solche, die metastasenfern lokalisiert sind, was einen supprimierenden Einfluss der
Tumorzellen nahelegt.
1.2.3
NK-Zellen (Pit-Zellen)
Pit-Zellen sind die organspezifischen NK-Zellen der Leber. Sie befinden sich im Lumen der
Sinusoide in enger Verbindung mit den Endothel- und Kupffer-Zellen.
Morphologisch gehören sie zu den Lymphozyten mit großen Granula. Charakterisiert wurden NKZellen ursprünglich durch ihre Fähigkeit, ohne vorherige Sensibilisierung in vitro bestimmte
Zielzellen zu lysieren. Von den nicht MHC-restringierten T-Zellen unterscheiden sie sich durch ihr
fehlendes Rearrangement der β- und γ-Gene des T-Zell-Rezeptors. Bisher konnte bei ihnen kein
immunologisches Gedächtnis und keine Spezifität für bestimmte Zielzellen nachgewiesen werden.
Untersuchungen von Papa et al (1994) zeigen hingegen, dass Antikörper gegen bestimmte
Oberflächenmoleküle der NK-Zellen deren Fähigkeit herabsetzen, Zielzellen zu binden, was eine
spezifische Zellinteraktion nahelegt. Interessant ist auch die Beobachtung von Moretta et al (1994),
6
dass die Expression von HLA-I-Antigenen auf Zellen diese vor NK-Zell-induzierter Zytolyse
schützt.
Die Unterschiede in der Expression der Oberflächenmoleküle spiegeln die Heterogenität der NKZellen wider. Viele dieser Zellen exprimieren Antigene, die sich auch auf T-Zellen (CD2) oder
Zellen der myeloischen Reihe nachweisen lassen. Diese Überschneidungen sind mit dafür
verantwortlich, dass keine endgültige Klarheit darüber besteht, ob NK- und T-Zellen sich von einer
gemeinsamen Vorläuferzelle ableiten oder ob es sich um zwei von Anfang an getrennte Zell-Linien
handelt (Hackett et al 1985, Lanier et al 1986a). Wiederholt nachgewiesen ist, dass NK-Zellen sich
thymusunabhängig entwickeln können (Herbermann und Ortaldo 1981), jedoch zu ihrer
Differenzierung auf ein intaktes Knochenmark angewiesen sind (Lanier et al 1986b). In
Zellkulturen konnte ihre Reifung aus CD34-positiven Zellen gezeigt werden (Shibuya et al 1995).
Neben der Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen und virusinfizierten Zellen sind NK-Zellen durch
ihre Sekretion von Zytokinen, wie IL-2 (Kasahara et al 1983), Inteferon (Trinchieri et al 1978,
Timonen et al 1980) und TNFα, an der Immunregulation beteiligt. Sie können die Aktivität anderer
Immunzellen steigern; umgekehrt wirken andere Immunzellen auf NK-Zellen ein. So können CD4positive T-Zellen die Proliferation von NK-Zellen fördern (Kovanen et al 1995).
Neben Interferonen ist auch IL-2 ein potenter Aktivator der NK-Zellen. Ihr Ansprechen auf IL-2
macht man sich zunutze, indem man in vitro aktivierte NK-Zellen als Lymphokin-aktivierte
Killerzellen (LAK) in der Tumortherapie einsetzt (Phillips et al 1987, Caligiuri et al 1993).
Im Normalzustand findet in der Leber nahezu keine NK-Zell-Proliferation statt, sie kann jedoch
durch Zytokine induziert werden. Das Zytokin IL-2 induziert auch eine Einwanderung von NKVorläuferzellen aus dem peripheren Blut in das hepatische Interstitum (Wiltrout et al 1989).
Die frisch eingewanderten Vorläuferzellen aus dem Blut differenzieren unter dem Einfluss des
speziellen Milieus in der Leber zu den für dieses Organ spezifischen Pit-Zellen mit hohem
zytotoxischen Potential (Vanderkerken et al 1995).
Nach ihrer Dichte unterscheidet man zwischen einer Fraktion mit hoher Dichte (HD - high density)
und einer mit geringer Dichte (LD - low density). Die HD-Fraktion findet sich bevorzugt periportal
und nimmt in ihrer Dichte und Funktion eine Mittelstellung zwischen der leberspezifischen LDFraktion und den NK-Zellen des peripheren Blutes ein. Die HD-Zellen machen einen großen Anteil
der leberassoziierten Lymphozyten mit NK-Aktivität aus und sind als CD3-negative, CD16positive und CD56-positive Zellen charakterisiert. Im peripheren Blut zeigt nur ein kleiner Teil der
7
NK-Zellen dieses Markerprofil. Die LD-Fraktion ist die funktionell und morphologisch
leberspezifische NK-Zell-Population. Diese Zellen zeigen keine Proliferation nach IL-2Applikation. Man vermutet, dass sie das Endstadium eines Differenzierungsprozesses darstellen.
Sie enthalten besonders zahlreich zytoplasmatische Granula, zeigen eine intensivere Zytotoxizität
gegenüber Tumorzellen im Vergleich zu NK-Zellen des peripheren Blutes und lysiren auch
Tumorzellen, die gegenüber diesen resistent sind (Bouwens 1992).
1.2.4
Ito-Zellen
Die Ito-Zellen, auch perisinusoidale oder Fett speichernde Zellen genannt, sind im Disse-Raum
lokalisiert, der von den Hepatozyten auf der einen und den sinusoidalen Endothelzellen auf der
anderen Seite begrenzt wird.
Folgende Aufgaben werden von Ito-Zellen wahrgenommen: Für das dünne Endothel bilden die ItoZellen gleichsam ein Gerüst (Fraser et al 1986). Im sogenannten ruhenden Zustand speichern sie in
ihrem Zytoplasma Lipide und Vitamin-A (Bronfenmajer et al 1966, Sztark et al 1986). Im
transformierten Zustand tritt die Produktion extrazellulärer Matrix im Disse-Raum in den
Vordergrund und sie tragen zur Fibrogenese bei (Sztark et al 1986). Darüber hinaus sind sie an der
Regulation der sinusoidalen Mikrozirkulation beteiligt.
Die unter pathologischen Bedingungen beobachtete Transformation der Ito-Zellen zu
Myofibroblasten bedeutet die Umwandlung von einem hauptsächlich speichernden Zelltyp in einen
vorwiegend sezernierenden Zelltyp (Mak et al 1988).
Ito-Zellen reagieren auch auf Zytokine. IL-1 und TNFα beispielsweise haben einen mitogenen
Effekt, hemmen jedoch die Kollagensynthese. Möglicherweise beeinflussen Zytokine sogar die
Expression von α-SMA in Ito-Zellen. Noch nicht erforscht ist, ob Zytokine ihre Wirkung direkt
oder indirekt über Kupffer-Zellen entfalten (Schmitt-Gräff 1991). Aufgrund dieser Interaktionen
spiegeln sie möglicherweise Änderungen im zellulären Immunsystem der Leber wider.
1.2.5
Sinusoidale Endothelzellen
Das sinusoidale Endothel vermittelt den Stoffaustausch zwischen dem Blut und dem Disse-Raum.
Ein charakteristisches Merkmal der Zellen sind flache Fortsätze, die von Poren in der Größe von
etwa 0,1µm durchbrochen und in sogenannnten Siebplatten angeordnet sind (Horn et al 1986).
Periportal ist der Durchmesser der Poren größer als perizentral, ihre Zahl jedoch geringer. Die
Weite der Poren ist durch zahlreiche Faktoren (u. a. Hormone, Kalziumionen und Alkohol)
beeinflussbar (Wisse et al 1985). Bei Mäusen mit Lebertumoren sind Zahl und Größe der Poren
8
vermindert (Vidal-Vanaclocha et al 1990). Bemerkenswert ist, dass keine subendotheliale
Basalmembran existiert.
Die hochdifferenzierten Zellen nehmen Aufgaben im Rahmen der Angiogenese (z. B. bei
Tumorwachstum) wahr und agieren bei der Immunregulation mit (z. B. Lymphozyten-Homing:
Nonomura et al 1991, Expression von IL-1 und IL-6: Rieder et al 1992). Viele der funktionell
wichtigen Moleküle auf der Endotheloberfläche sind quantitativ und/oder qualitativ induzierbar. Es
werden MHC-Antigene der Klasse 1 (HLA-ABC) und der Klasse 2 (HLA-DR) auf sinusoidalen
Endothelien exprimiert und Letztere sind durch Zytokine, wie IFN-γ, induzierbar. Auch das
Vorhandensein einiger Adhäsionsmoleküle ist an stimulierende Faktoren gebunden (Coulevard et al
1993, Garcia-Barcina et al 1994, 1995).
In den Azinuszonen 3 und 4 lässt sich auch CD16 nachweisen - ein Zeichen für die Rolle dieser
Zellen bei der Elimination von Immunkomplexen aus der Zirkulation. Zudem können sie
Makrophagen in der durch lösliche Antigene induzierten T-Zell-Proliferation ersetzen (Nunez et al
1983).
Charakteristisch
für
das
sinusoidale
Endothel
ist
auch
die
Expression
der
Adhäsionsmoleküle CD4 und ICAM-1; CD4 wurde bisher auf keinem anderen Endothel
nachgewiesen. Beide Moleküle vermitteln eine Leukozytenadhäsion und sind vermutlich auch an
der Interaktion von Kupffer-Zellen mit den Sinusendothelzellen beteiligt (Scoazec 1991).
Im Zusammenhang mit der Abwehr von Tumorzellen ist auch die T-Zell-induzierte
Stickstoffmonoxyd-Produktion der Endothelzellen in der Leber zu erwähnen, die am Maus-Modell
antimetastatisch wirkt.
1.3
Fragestellung
Aus der Standortbestimmung und der aufgezeigten Zielorientierung resultierten folgende Fragen,
die Thema der vorliegenden Arbeit wurden:
1. Welche Methode eignet sich zur Isolierung der NPLC in der humanen Leber?
Freudenberg et al (1989b) entwickelten eine Methode zur Isolierung der NPLC bei Mäusen. Es galt
abzuklären, inwiefern diese Methode bei der Untersuchung von humanem Lebergewebe modifiziert
werden muss.
2. Welches Gewebe aus der humanen Leber ist für die Isolierung der NPLC geeignet?
Versuche an Mäusen ermöglichen Untersuchungen an der gesamten Leber. Es galt zu prüfen,
welches Gewebematerial von der humanen Leber sich für eine Isolierung der NPLC eignet.
9
3. Welche Antikörper können zur Identifizierung der NPLC in der humanen Leber verwendet
werden?
Hierfür kamen Literaturangaben und eigene Versuche in Betracht.
4. In welchem Verhältnis sind die NPLC im humanen Lebergewebe vorhanden?
In der Literatur ließ sich eine Beschreibung einzelner Zellgruppen der humanen NPLC, nicht aber
die prozentuale Zusammensetzung der bekannten NPLC finden.
5. Können die bestehenden Anhaltspunkte für Veränderungen in der Zusammensetzung der NPLC
im Falle einer Tumorerkrankung (Freudenberg et al 1996, Seki et al 1990) für humane Lebern
bestätigt werden?
10
MATERIAL UND METHODEN
2
2.1
Gewinnung des Gewebematerials
2.1.1
Tumorumgebendes Lebergewebe
Zur Isolierung der NPLC bei Mäusen kann die gesamte Leber verwendet werden. Für die
Untersuchungen an der humanen Leber stellte sich das Problem, geeignete Gewebeproben zu
finden.
Zunächst wurden die NPLC aus Autopsiegewebe mit einem Gewicht zwischen 0,6 g und 8,1 g
isoliert. Die untersuchten Gewebeproben waren einer Ischämiedauer von ungefähr 10 Stunden
ausgesetzt. Die Zahl der daraus gewonnenen NPLC war spärlich und ließ sich auch durch
Abwandlung der Isolierungsmethode nicht auf eine für die immunzytochemische Auswertung
ausreichende Anzahl steigern. Das unbefriedigende Ergebnis wurde der mangelnden Zellvitalität
zugeschrieben.
Lebermetastasen werden in der Regel im gesunden Gewebe mit einem Sicherheitsabstand reseziert.
Die makroskopisch tumorfreien Resektatränder erwiesen sich als geeignetes Material für die
NPLC-Isolierung. Die daraus gewonennen Gewebeproben hatten ein Gewicht zwischen 1,0 und 8,7
Gramm.
Im Laufe von 2 Jahren konnte aus dem Operationsgut der Universität Freiburg das in Tabelle 1
erfasste Gewebematerial gewonnen werden.
Tabelle 1 gibt Aufschluss über den Primärtumor und das Alter der Patienten, von deren Leber die
Gewebeproben entnommen wurden, sowie über die Zahl der tumorumgebenden Gewebeproben.
Tabelle 1: Einteilung der Gewebeproben nach Primärtumor und Patientenalter
Primärtumor
Adenokarzinom des Kolons/Rektums
Adenokarzinom des Ovars
Undifferenziertes Teratokarzinom d. Hodens
Gallenblasen-Karzinom
Hepatozelluläres Adenom
Fokal-noduläre Hyperplasie
Patientenalter Zahl d. Gewebeproben
55-72 J
63 J
34 J
67 J
27 J
31 J
7
1
1
1
2
1
11
2.1.1.1
Histologischer Befund
Der histologische Befund des Pathologischen Instituts der Universität Freiburg zeigt die
Beurteilung des tumorumgebenden Gewebes. Die Nummerierung der Gewebeproben wurde in der
gesamten Untersuchung beibehalten.
Tabelle 2: Histologischer Befund
Gewebeprobe
Histologie
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
hochgradige entzündliche Reaktion der Portalfelder (Lymphozyten und
Granulozyten), keine Verfettung
mittelgradige chronische Entzündung der Portalfelder (Lymphozyten), portale
und septale Fibrose
hochgradige
entzündliche
Reaktion
der
Portalfelder
(Granulozyten,
Lymphozyten)
mittelgradige entzündliche Reaktion der Portalfelder (Lymphozyten); Fettleber
(ca. 90% der Hepatozyten verfettet)
hochgradige chronisch entzündliche Reaktion der Portalfelder (Lymphozyten);
mäßige Verfettung
mittelgradige chronisch entzündliche Reaktion der Portalfelder
(Lymphozyten,Granulozyten); mittelgradige Verfettung
geringe entzündliche Reaktion der Portalfelder (Lymphozyten, Granulozyten);
mäßige portale Fibrose; ausgeprägte großtopfige Verfettung
geringe entzündliche Reaktion der Portalfelder (Lymphozyten); geringe Fibrose;
mäßige, mittelgroß tropfige Verfettung
keine Angaben
geringe entzündliche Reaktion der Portalfelder (Lymphozyten, Granulozyten)
mäßige fokale chronisch entzündliche Reaktion der Portalfelder, Lymphozyten,
wenige Granulozyten
12
2.1.2
Tumorfreies Kontroll-Lebergewebe
Innerhalb von 2 Jahren war es nicht möglich, aus dem Operationsgut der Universitätsklinik
Freiburg ausreichend Gewebeproben zu erhalten, die als Kontrollen geeignet gewesen wären. Nach
Genehmigung durch die Ethikkommission wurden die NPLC aus Lebergewebeproben von
Organspendern isoliert. Bei diesen Lebern stand bereits fest, dass sie nicht transplantiert würden.
Bei allen Spendern hatte eine neurologische Erkrankung (Schädelhirntrauma, Apoplex) zum
Hirntod geführt. Die Spender (2 Männer und 2 Frauen) waren zwischen 42 und 56 Jahren alt.
Ein weiteres Kontrollgewebe stammte von einer 30-jährigen Frau, deren Leber von Echinokokkus
granulosus-Zysten durchsetzt war und teilreseziert werden musste. Das für die Zellisolierung
entnommene Gewebestück hatte keinen unmittelbaren Kontakt zu einer Zyste.
2.1.3
Prozedere bis zur Verwendung des Materials
Das Gewebe wurde in RPMI (RPMI Medium 1640, Art.Nr. 21875-034, Life Technologies GmbH,
Eggenstein) in das Labor transportiert. Zwischen der Entnahme des Resektats aus der Tumorleber
und dem Zeitpunkt, zu dem das Gewebe in RPMI gelegt wurde, verging bis zu einer Stunde.
Während dieser Zeit lag das Gewebe "trocken" im Operationssaal. Das Gewebe der Organspender
wurde sofort in RPMI gelegt und bei etwa 4°C aufbewahrt. Bis zur Isolierung vergingen 15
Minuten bis 2 Stunden, bei Kontrolle D vergingen 7 Stunden, was die Vitalität der NPLC jedoch
nicht beeinträchtigte.
2.2
2.2.1
Isolierung der NPLC
Änderungen der beim Tier-Modell angewandten Isolierungs-Methode
Die in der Literatur vielfach zur Isolierung der NPLC von Versuchstieren beschriebenene Methode
(Freudenberg et al 1989b, Heuff et al 1994, Jones 1983, Wake et al 1989) wurde im Wesentlichen
übernommen. Abänderungen ergaben sich daraus, dass nicht, wie bei Versuchstieren, die ganze
Leber, sondern nur Gewebeproben verwendet werden konnten.
Während bei den Versuchen an Tieren die gesamte Leber durch Einspritzen der Pufferlösung in die
Vena portae blutleer gespült wird, konnte bei den humanen Gewebeproben die Anämie des
Gewebes nur durch ein aufwendiges, in 2.2.2 beschriebenes Prozedere erzielt werden.
13
Auch für die Lyse der Hepatozyten und für die Auflösung des Gewebes wird bei Tieren die
gesamte Leber mit einer Pronase- und Kollagenase-Lösung perfundiert. Die humanen
Gewebeproben hingegen mussten zerkleinert in diese Lösungen eingelegt werden. Das damit
erzielte Ergebnis war befriedigend.
Im Unterschied zu den Versuchen mit Mäusen wurde die Suspension nicht nur einmal, sondern
2-3mal gewaschen.
Versuche an Mäusen unterscheiden sich außerdem dadurch, dass die NPLC der Mäuse nach der
Zentrifugation im Dichtegradienten eine schmale, scharf abgrenzbare Bande bilden, während die
humanen NPLC meist eine etwas unscharf begrenzte Bande zeigten. Deshalb wurde der Bereich
großzügig abgesaugt.
2.2.2
Vorgang der Isolierung der NPLC
1. Dekapsulieren und Perfusion
In einem ersten Schritt wurde - soweit vorhanden - die Organkapsel mit einer Pinzette abgezogen.
Für die Perfusion wurden RPMI (Raumtemperatur), eine sterile 10 ml Einmalspritze, eine VasocanBraunüle (d = 0,8 mm, 22G) und eine Uhrglasschale benötigt.
Waren kanülierbare Gefäße vorhanden, wurde zuerst durch diese perfundiert. Wenn damit das
Gewebe nicht weiter abgeblasst werden konnte, wurde es mit einem Skalpell in wenige Millimeter
dicke Scheiben zerteilt und die Perfusion durch diffuses Einspritzen von Pufferlösung fortgesetzt.
2. Inkubation
Das Gewebe wurde mit dem Skalpell weiter zerkleinert und jeweils 10 Minuten bei 37°C in einer
Pronase-Lösung (6 mg Pronase gelöst in 10 ml RPMI, Pronase E, aus Streptomyces griseus, 4 x 106
PU/g, Art.-Nr. 7433.30001, Merck, Darmstadt) und anschließend in einer Pronase/KollagenaseLösung (3 mg Pronase + 7 mg Kollagenase in 25 ml RPMI, Typ CLSO, 400U/mg, Art.-Nr. Co-28,
Seromed) im Wasserbad inkubiert. Nach den beiden Inkubationen wurden die Stückchen jeweils
nach Dekantieren des Überstandes mit einer Pinzette aus der Suspension genommen und mit 2
Pinzetten weiter zerkleinert, bevor sie in einer reinen Kollagenase-Lösung (17 mg in 25 ml RPMI)
inkubiert wurden. Der entstandene Gewebebrei wurde 30 Minuten bei 37°C im Wasserbad
inkubiert. Während der Inkubationen wurden die Suspensionen mit einem Magnetrührer
durchmischt.
14
3 Filtern und Waschen
Die Suspension wurde durch ein steriles Edelstahlsieb gefiltert und das Filtrat in 50 ml RPMI
10 Minuten lang bei 4°C mit 300g (Erdbeschleunigung) und mit halber Bremskraft gewaschen.
Um die Enzyme und Verunreinigungen (freie Lipide etc.) vollständig auszuwaschen, wurde der
Überstand dekantiert, das entstandene Pellet in 50 ml GBSS (geys balanced salts solution, Art.Nr.
24260-028, Life technologies GmbH, Eggenstein) resuspendiert und erneut 10 Minuten bei 4°C
mit 300g und mit halber Bremskraft gewaschen. Dieser Schritt wurde bei stärkerer Trübung des
Überstandes 1-2mal wiederholt.
4. Beseitigen von Zelltrümmern und Erythrozyten
Die neben den NPLC in der Suspension enthaltenen Erythrozyten und Zelltrümmer wurden durch
Zentrifugation in einem Dichtegradienten abgetrennt. Dazu wurde der Zellrückstand in 5 ml GBSS
resuspendiert, in ein 15 ml Röhrchen umgefüllt und mit 7 ml einer Nykodenz-Lösung* (NykodenzPulver, Art.Nr. 1002423N, Life technologies, Eggenstein) gemischt. Das Gemisch wurde sehr
vorsichtig mit 3 ml GBSS überschichtet.
Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 4°C mit 1500g (Erdbeschleunigung) und ohne Bremskraft
bildeten die NPLC an der Grenzschicht eine meist etwas unscharf begrenzte Bande.
5. Membranschutz mit Serum und Waschen der NPLC
Mit einer Pasteurpipette wurden die Zellen durch großzügiges Absaugen der Bande entnommen. Im
Bodensatz fanden sich überwiegend Erythrozyten, Hepatozyten und Zelltrümmer. Nach Zugabe
von 0,25 ml fetalem Kälberserum (Myoclone Plus, virus and mycoplasma screened, Gibco,
Eggenstein) wurden die NPLC in RPMI suspendiert und mit 300g und halber Bremskraft bei 4°C
zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde nach Dekantieren des Überstands in NKH*
resuspendiert und nochmals gewaschen.
6. Zellzählung und Beurteilung der Vitalität
Der Zellrückstand wurde je nach anzunehmender Zellzahl mit NKH* auf 1-4 ml aufgefüllt und
durchmischt. Eine kleine Menge der Suspension wurde auf einem Objektträger mit getrocknetem
Trypanblau gemischt. Anschließend wurde damit eine Neubauer-Zählkammer beschickt. Zur
Bestimmung
der
isolierten
Zellzahl
wurden
8-10
Gruppenquadrate
ausgezählt.
Definition: Zellzahl in einem Gruppenquadrat x 250 = Zellzahl/µl (Z). Z x Volumen der
Zellsuspension = Gesamtzahl der gewonnenen Zellen.
15
Zellvitalität: Als vital wurden Zellen gewertet, die kein Trypanblau aufnahmen. Dieses Kriterium
erfüllten 94,3-98% der NPLC. Nach Jones (1983) können auch rigide Membranen avitaler Zellen
das Eindringen von Trypanblau in die Zelle verhindern, was die Zuverlässigkeit des Tests
einschränkt.
2.3
Fixierung der Zellen auf Adhäsionsobjektträgern (Objektträgermethode)
Zur immunzytochemischen Identifizierung wurden die isolierten Zellen nach Bross et al (1978) auf
Adhäsionsobjektträger aufgebracht. (Bezugsquelle: Firma Biorad, Adhäsionsobjektträger, Art.Nr.
1807001, BioRad Laboratories GmbH, München). Vitale Zellen haften elektrostatisch auf den
speziell beschichteten Reaktionsfeldern, die von einer hydrophoben Fläche umgeben sind.
Vorbereitung der Objektträger
Die farbige Schutzschicht auf den Reaktionsfeldern wurde mit Leitungswasser abgespült. Sobald
sie entfernt war, durften die Reaktionsfelder nicht mehr austrocknen. Daher wurden sie zunächst in
eine mit NKH* gefüllte Küvette gestellt und alle weiteren Schritte in einer feuchten Kammer (in
einem mit feuchten Tüchern ausgelegten Plastikbehälter) durchgeführt.
Auftragen der Zellen auf die Reaktionsfelder
Jedes Feld erhielt 50 µl Suspension mit ca. 105 Zellen. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37°C
hafteten die Zellen auf der Glasoberfläche und wurden bei späteren vorsichtigen Spülungen nicht
mehr entfernt. Nun wurden die Zellen mit 0,5-1,0 ml NKH* pro Feld gewaschen; abgesaugt wurde
mit einer Wasserstrahlpumpe.
Fixierung der NPLC
Zur Fixierung wurden die Zellen mit einem Tropfen 0,05%igem Glutaraldehyd (Fixierlösung*)
bedeckt und für 15 Minuten in den Kühlschrank (4°C) gestellt.
Tiefgefrieren
Nach dem Absaugen des Fixans wurden die Zellen mit NKH* gespült und mit einem Tropfen
Einfrierlösung* versehen. Bis zur weiteren Bearbeitung wurden die Objektträger bei minus 70°C
aufbewahrt. Auch nach einem Jahr Lagerung war die Antigenstruktur noch unverändert vorhanden.
16
2.4
Immunzytochemische Identifizierung der NPLC (Färbung)
Der Antigen-Nachweis erfolgte mit Hilfe der indirekten Avidin-Biotin-Methode in 3 Schritten:
1. Ein primärer Antikörper, der spezifisch das gesuchte Antigen bindet, wurde auf die Zellen
aufgetragen.
2. Der anschließend aufgetragene sekundäre Antikörper reagierte mit der Fc-Region des primären
Antikörpers.
3. Hinzugabe eines Peroxidase-Komplexes, der mit Avidin und Biotin konjugiert ist. Die freien
Stellen des Avidins banden an das Biotinkonjugat des Sekundär-Antikörpers. Die PeroxidaseAktivität wurde mittels eines farbigen Reaktionsproduktes nachgewiesen.
2.4.1
Variierung der Parameter beim Einsatz der Antikörper
Für jeden Primär-Antikörper wurde in Verdünnungsreihen die Konzentration ausgetestet, die sich
für die lichtmikroskopische Auswertung am besten eignete.
Zur Optimierung der Auswertung trugen im Weiteren Testreihen bei, die mit veränderter
Inkubationszeit (1 Stunde versus 12 Stunden) und mit veränderter Temperatur während der
Inkubation der Zellen mit dem ersten Antikörper (4° C versus Raumtemperatur, etwa 20° C)
durchgeführt wurden.
2.4.2
Auswahl der Antikörper
2.4.2.1
Nicht einsetzbare Antikörper
Anti-CD56
Für die Markierung der NK-Zellen war Anti-CD56 vorgesehen. Trotz zahlreicher Versuche unter
variierten Bedingungen, wie Verdünnung, Inkubationszeit, Temperatur und Verwendung gegen das
Epitop NKH-1 und gegen das Epitop NCAM (getrennt und als 1:1-Mischung), war es nicht
möglich, mit Anti-CD56 eine Zellfärbung zu erzielen.
Ein Defekt in den Antikörpern konnte durch positive Reaktion an unfixierten Zellen einer
bronchoalveolären Lavage und an frisch isolierten mononukleären Zellen des Blutes
ausgeschlossen werden.
Anti-CD4
Anti-CD4 wird üblicherweise zur Identifizierung der T-Helferzellen verwendet. Versuche, mit dem
Anti-CD4 der Firma clonab die Zellen anzufärben, misslangen gänzlich. Mit Anti-CD4 der Firma
Immunotech gelang zwar bei Auftragen des Antikörpers vor dem Fixieren der Zellen und bei 12-
17
stündiger Inkubation eine gute Zellfärbung. Es wurden jedoch Zellen verschiedenster Größe
angefärbt, so dass es sich nicht nur um T-Helferzellen handeln konnte, sondern auch Monozyten
und Makrophagen erfasst wurden.
Auch andere Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, dass mit Anti-CD4 verschiedene Zelltypen
angefärbt werden. Das CD4-Molekül wird nicht nur von T-Helferzellen und inflammatorischen TZellen exprimiert, sondern auch von Monozyten und Makrophagen (van Ravenswaay et al 1992),
speziell von Kupffer-Zellen (Rieder et al 1992), und von sinusoidalen Endothelien (Nagura et al
1986, Rieder et al 1992). Die Färbung ist daher unspezifisch. Von einer Auszählung der CD4positiven Zellen wurde deshalb abgesehen.
2.4.2.2
Verwendete Antikörper und deren Bezugsquellen
Die Auswahl wurde aufgrund von Literaturangaben und aufgrund von zahlreichen Vorversuchen
getroffen.
Anti-CD16
Da Anti-CD56 in den Vorversuchen zur Markierung der NK-Zellen ausgeschieden war, musste
Anti-CD16 verwendet werden. Dieser Antikörper ist für die Markierung der NK-Zellen insofern
problematisch, als damit teilweise auch T-Zellen, Monozyten und Makrophagen angefärbt werden.
Die beiden Letzteren konnten aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe identifiziert werden, so dass
sich der Unsicherheitsfaktor auf die Unterscheidbarkeit der NK-Zellen und der T-Zellen
beschränkte.
Ferner zeigte sich in den Vorversuchen, dass die Makrophagen und Monozyten das Antigen auch
intrazellulär exprimieren, während bei den kleinen mononuklearen Zellen das Antigen nur an der
Oberfläche als brauner Ring sichtbar wurde.
Der Einsatz von Anti-CD16 war gerechtfertigt, da sowohl die NK-Zellen als auch die T-Zellen zu
den Immunzellen gehören und ebenso die mit diesem Marker nicht unterscheidbaren Monozyten
und Makrophagen.
Anti-CD34
Über Anti-CD34 finden sich in der Literatur widersprüchliche Angaben zur Reaktion des Markers
mit sinusoidalen Endothelien der Leber. Es konnte jedoch kein Marker ausfindig gemacht werden,
der diese Zellen zuverlässig identifiziert.
18
Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Gesamtauswahl der Antikörper und die NPLC, deren
Identifizierung angestrebt wurde, sowie die Verdünnung der Stammlösung.
Tabelle 3: Eingesetzte Antikörper, Zielzellen und angewandte Verdünnung
Antikörper
Zielzellen
Verdünnung
Anti-27E10
Unreife Makrophagen
1:6000
Anti-25F9
Reife Makrophagen
1:800
Anti-CD 68
Makrophagen / Monozyten
1:3200
Anti-CD 16
NK-Zellen,
1:40
Makrophagen
Anti-CD3
T-Lymphozyten
1:40
Anti-CD8
Zytotoxische T-Zellen
1:10
Anti-CD20
B-Lymphozyten
1:40
Anti-CD 34
Sinusoidale Endothelzellen
1:400
Anti-Aktin
Ito-Zellen
1:10
Anti-Desmin
Tabelle 4: Bezugsquellen der eingesetzten Antikörper
Antikörper
Bezugsquelle
Anti-CD3
Becton Dickinson, Kat.Nr. 347340, Lot 30348
Anti-CD8
Immunotech, Kat.Nr. 0102
Anti-CD16
Quartett, Best.Nr. CD16-01-22
Anti-CD20
Coulter, Best.Nr. 6602140
Anti-CD34
Dianova-immunotech, Kat.Nr. 0786, Klon QBEND10
Anti-CD68
Dako, Best.Nr. M876
Anti-27E10
BMA Biomedicals AG, Augst, Schweiz, Best.Nr. T-1023
Anti-25F9
BMA Biomedicals AG, Augst, Schweiz, Best.Nr. T-1016
Aktin,
Desmin
Dako Epos, Anti-Human Smooth Muscle Actin/HRP, Kode-Nr. U7033
19
2.4.3
Antikörper und zugehörige Antigene
27E10 (unreife Makrophagen)
Der Antikörper erkennt das Heterodimer aus MRP8 und MRP14, die beide myelomonozytäre
Differenzierungsantigene darstellen und zur S100-Familie kalziumbindender Proteine gehören
(Burwinkel et al 1994). Die Expression des Antigens ist für Monozyten und Makrophagen bei akut
entzündlichen Prozessen beschrieben (Bhardway et al 1992). Darüber hinaus wird eine Expression
des Antigens bei Makrophagen in den invasiven Regionen kolorektaler Karzinome beschrieben.
Makrophagen in gesunden Geweben wird ein 27E10-negativer Phänotyp zugeschrieben. In
gesundem Lebergewebe lassen sich nur einige Granulozyten und Monozyten in den Sinusoiden mit
diesem Antikörper anfärben.
Die funktionelle Bedeutung von MRP8/MRP14 ist noch spekulativ. Man nimmt an, dass sie unter
anderem während akut entzündlicher Prozesse die Interaktion zwischen Strukturen des Zytoskeletts
und Membranen modulieren. Isolierte Monozyten sezernieren große Mengen TNFα, Prostaglandin
E2 und IL-1 (Hauptmann et al 1993, Zwadlo et al 1986).
25F9 (reife Makrophagen)
Dieser Antikörper erkennt ein Differenzierungsantigen, das hauptsächlich von reifen Makrophagen
in nicht entzündetem Gewebe exprimiert wird (Zwadlo et al 1985). In chronisch entzündetem und
Tumorgewebe zeigen nur wenige Zellen eine positive Reaktion. Das Antigen wird sowohl
intrazytoplasmatisch als auch auf der Zellmembran exprimiert.
In der gesunden Leber reagiert nur ein Teil der Makrophagen mit Anti-25F9 (Tomita et al 1994).
CD68 (Makrophagen)
CD68 ist ein intrazytoplasmatisches Glykoprotein, das eine Assoziation mit lysosomalen Granula
zeigt. Seine Funktion ist nicht geklärt. Der verwendete Antikörper gegen das Epitop PG-M1 wird
als Pan-Makrophagen-Marker beschrieben, der in schwächerem Ausmaß auch mit Monozyten
reagiert (Falini et al 1993).
CD16 (NK-Zellen, Makrophagen)
Das CD16-Antigen gehört zur Gruppe der Fc-gamma-Rezeptoren, die an den Fc-Teil von
Immunglobulin G (IgG)-Molekülen binden und somit eine Brücke zwischen humoraler und
zellulärer Immunantwort bilden. CD16 entspricht dem Fc-gamma-RIII, einem Rezeptor niedriger
Affinität. Es sind zwei Isoformen bekannt, Fc-gamma-RIIIA und Fc-gamma-RIIIB, die von
unterschiedlichen Zelltypen exprimiert werden: Fc-gamma-RIIIA von neutrophilen Granulozyten
und
stimulierten
Eosinophilen,
Fc-gamma-RIII-B
von
NK-Zellen,
aktivierten
20
Monozyten/Makrophagen und einer Subpopulation zytotoxischer T-Lymphozyten. Auf NK-Zellen
vermittelt der Rezeptor antikörperabhängige Zytotoxizität (Gessner et al 1995).
In immunhistochemischen Färbungen an menschlichem Lebergewebe ist das Verteilungsmuster
CD16-positiver Zellen mit dem von Kupffer-Zellen kongruent (Clarkson und Ory 1988). Es ist
jedoch nur ein Teil der Kupffer-Zellen CD16-positiv (Tomita et al 1994).
CD3 (T-Lymphozyten)
CD3 ist ein Komplex aus fünf Proteinen an der Oberfläche von T-Zellen. Die Proteine sind für die
Expression des T-Zell-Rezeptors erforderlich und intrazytoplasmatische Domänen können auf
Tyrosinkinasen einwirken. Nach bisherigen Erkenntnissen wird CD3 von allen T-Lymphozyten
exprimiert.
CD8 (Zytotoxische T-Zellen)
Während der Antigenerkennung verbinden sich CD8-Moleküle mit Komponenten des T-ZellRezeptors. Daher tragen sie den Namen Korezeptoren.
Das CD8-Antigen tragen zytotoxische T-Lymphozyten und einige NK-Zellen auf ihrer Oberfläche.
Beide Moleküle erhöhen die Empfindlichkeit der T-Zellen für ein von MHC-Klasse-I, bzw. MHCKlasse-II, präsentiertes Antigen auf das 100-fache. Über die Kopplung an eine zytoplasmatische
Tyrosinkinase sind sie an der Signaltransduktion beteiligt.
CD20 (B-Lymphozyten)
Mit dem Antikörper gegen das CD20-Antigen werden alle B-Lymphozyten erfasst. Es wird
vermutet, dass das Molekül an der Regulation der B-Zell-Aktivierung beteiligt ist.
Desmin (Ito-Zellen)
Desmin gehört zu den intermediären Filamenten, denen statische Verankerungsfunktion und eine
Rolle bei der Signaltransduktion zwischen Zellmembran und/oder Zytoplasma und Zellkern
zugeschrieben wird. Während Ito-Zellen laut Schmitt-Gräff et al (1991) und Bioulac-Sage und
Balabaud (1992) in gesunder menschlicher Leber kein Desmin exprimieren, fanden sie unter
pathologischen Bedingungen eine variable Anzahl Desmin-positiver Zellen.
Aktin (Ito-Zellen)
Aktin gehört zur zellinternen Muskulatur, die u.a. für die intrazelluläre Organellenbewegung
verantwortlich ist. Es wurde mit einem Antikörper gegen die in glatten Muskelzellen vorkommende
Isoform α-SMA (α-Smooth Muscle Actin) gearbeitet, die auch als Marker für Ito-Zellen
beschrieben wird, wobei die Meinungen divergieren, ob α-SMA als phänotypischer Marker (Enzan
21
et al 1994) anzusehen ist, oder ob der Gehalt an α-SMA eher als Hinweis für unterschiedliche
Differenzierungsgrade dieser Zellen zu werten ist (Schmitt-Gräff et al 1991).
CD34 (Sinusoidalen Endothelzellen)
Dem Glykoprotein CD34 wird eine Bedeutung bei Zellinteraktionen zugeschrieben, z. B. bei der
Adhäsion (Coulevard et al 1993, Fina et al 1990). Neben seinem Vorkommen auf
hämatopoetischen Vorläuferzellen und manchen mesenchymalen Zellen gilt es als Endothelmarker,
seine Expression auf diesen Zellen ist jedoch nicht konstitutiv und die Angaben zur Reaktion des
Markers mit sinusoidalen Endothelien der Leber sind widersprüchlich.
2.4.4
Vorgang der NPLC-Färbung
1. Die Objektträger wurden zum Auftauen in eine feuchte Kammer gelegt und die Einfrierlösung
möglichst rasch durch Waschen mit PBS-Puffer entfernt.
2. Die vor allem in Makrophagen enthaltene endogene Peroxidase würde bei dieser Färbemethode
zu unspezifischen Reaktionen führen. Deshalb musste sie gehemmt werden. Das wurde mit einer
0,5 %igen H2O2-Lösung in 70 %igem Methanol (50 µl pro Reaktionsfeld) erreicht.
3. Nach 30-minütiger Inkubation auf dem Schwenktisch bei Raumtemperatur wurden die Zellen
zweimal mit PBS gespült.
4. Der primäre Antikörper bindet unspezifisch an reaktive Gruppen und geladene Oberflächen
(z. B. Glas). Daher deckt man diese Stellen mit einer neutralen Proteinlösung ab. In dieser
Untersuchung wurde das antikörperfreie Serum derjenigen Tierart verwendet, von welcher der
sekundäre Antikörper stammte. Unter Verwendung einer 2,5 %igen Serumlösung in PBS wurden
die Zellen 30 Minuten auf dem Schwenktisch inkubiert.
5. Sofort nach dem Absaugen des Serums wurden auf jedes Feld 35-50 µl des jeweiligen primären
Antikörpers aufgetragen, der mindestens 1,5 Stunden zuvor mit 1 %igem BSA (bovines SerumAlbumin) in PBS angesetzt worden war.
Als Negativkontrolle wurde ein Feld ohne primären Antikörper (mit 1 %igem BSA in PBS)
inkubiert. Die Reaktion erfolgte über Nacht auf dem Schwenktisch.
6. Am folgenden Morgen wurde der nicht gebundene Anteil der Antikörper abgesaugt und jedes
Feld mit PBS gespült. Anschließend wurde der sekundäre Antikörper aufgetragen. Er wurde dem
Kit entnommen und über Nacht 1:200 mit 1,5 %igem Humanserum adsorbiert.
22
7. Nach 30 Minuten wurden die Zellen erneut mit PBS gewaschen und anschließend eine halbe
Stunde mit einem Avidin-Biotin-Komplex inkubiert. Dazu war eine Stunde zuvor mit Avidin und
Biotin aus dem Vectastain-Kit eine 0,4 %ige Lösung in PBS hergestellt worden. Die freien Stellen
des Avidins banden an das Biotinkonjugat des Zweitantikörpers, was die anschließende
Farbreaktion verstärkte.
8. Dem Waschen der Zellen folgte eine 5-minütige Inkubation im Dunkeln mit dem
lichtempfindlichen Diaminobenzidin (DAB). Das auf Vorrat eingefrorene DAB wurde aufgetaut
und pro Milliliter mit 1 µl 30 %igem H2O2 versetzt.
9. Das giftige DAB wurde in einen Spezialbehälter entsorgt und gründlich von den Zellen
abgespült.
Eine Braunfärbung beim Zusammenschütten des DAB-Restes mit dem verbliebenen Avidin-BiotinKomplex bestätigte die Aktivität.
10. Zur Nachfixierung und Kontrastverstärkung wurden die Zellen mit einer 2 %igen Osmiumtetroxidlösung behandelt (Stammlösung 4 %ig, verdünnt mit Aqua bidest; Ampulle, Art.Nr. R1024,
Plano, Marburg). Nach 5-10 Minuten wurde das Osmiumtetroxid in den Sondermüll entsorgt und
die Objektträger gründlich mit Aqua bidest gespült.
11. Zuletzt erhielt jedes Feld einen Tropfen Eindecklösung* und das Deckglas wurde luftblasenfrei
aufgelegt. Die Ränder wurden mit Nagellack versiegelt.
2.4.5
Lichtmikroskopische Auswertung der Zellen
Die Auswertung erfolgte bei 1.000-facher Vergrößerung in Ölimmersion. Pro Feld wurden
mindestens 2.000 Zellen nach einem randomisierten Verfahren ausgezählt. Kontrollen mit
mehrfach ausgezählten, jeweils 2.000 Zellen ergaben nahezu keine Differenzen.
23
3
ERGEBNISSE
3.1
Gruppierung der Gewebeproben
Um einen eventuellen Einfluss der Ausdehnung des Tumors in der Leber auf die NPLCZusammensetzung zu erkennen, wurden die Gewebeproben folgenden Gruppen zugeordnet:
Gruppe 1
7 Gewebeproben: Nr. 1 bis Nr. 7
Die Tumorlast in der Leber war groß, was folgendermaßen definiert wurde:
- eine (singuläre oder solitäre) große Metastase mit einem maximalen Durchmesser zwischen
8 cm und 11 cm (Gewebeproben Nr. 2, 3, 7)
- zahlreiche konfluierende Metastasen bis zu einem maximalen Durchmesser von 13 cm
(Gewebprobe Nr. 1), bzw. bis 4 cm (Gewebeprobe Nr. 4)
- 2 Tumorknoten mittlerer Größe mit einem maximalen Durchmesser zwischen 2,3 cm und
3,5 cm (Gewebeproben Nr. 5 und 6)
Gruppe 2
2 Gewebeproben: Nr. 8 und Nr. 9
Die Tumorlast war geringer. Die Leber war nur von einem Tumorknoten mittlerer Größe infiltriert
(maximaler Durchmesser 2,8 cm bzw. 3 cm).
Gruppe 3
2 Gewebeproben: Nr. 10 und Nr. 11
Die Neoplasie war gutartig:
- hepatozelluläres Adenom: ein Knoten, maximaler Durchmesser 8 cm
- fokal-noduläre Hyperplasie: mehrere Knoten, maximaler Durchmesser 12 cm.
Gruppe 4 (Kontrollgruppe)
5 Gewebeproben: A, B, C, D und E
Das Gewebematerial stammte aus tumorfreien Lebern.
Vorversuchsgruppe
2 Gewebeproben: X (hepatozelluräres Adenom), Y (Karzinom der Gallenblase).
24
3.2
Zellausbeute
Tabelle 5: Zahl der isolierten NPLC pro Gramm Lebergewebe.
Nummerierte Gewebeprobe
Isolierte NPLC
(106/g Gewebe)
Gruppe 1 (größere Tumorlast)
1
1,2
2
1,1
3
1,3
4
2,7
5
7,8
6
1,0
7
1,5
Gruppe 2 (geringere Tumorlast)
8
4,7
9
14,3
Gruppe 3 (benigne Tumoren)
10
1,7
11
11,6
Kontrollgruppe (tumorfreie Lebern)
A
1,2
B
1,3
C
1,1
D
2,5
E
1,9
X
3,2
Y
8,7
Vorversuchsgruppe
Die Gewebeproben wurden gewogen und die isolierten NPLC ausgezählt. Die Zahl der isolierten
NPLC schwankte bei den tumorumgebenden Geweben zwischen 1,0 x 106 und 14,3 x 106 pro
Gramm Lebergewebe, bei den Kontrollgeweben zwischen 1,1 x 106 und 2,5 x 106 pro Gramm
Gewebe.
25
3.3
Anteil der identifizierten Zellen an den NPLC
Der in Prozenten ausgedrückte Anteil an den NPLC errechnet sich aus den pro Reaktionsfeld
ausgezählten 2.000 NPLC (100%) und den davon jeweils identifizierten Zellen.
Von den insgesamt 18 Leberproben gelangten 16 Proben in die Auswertung. Die 2 Proben der
Vorversuchsgruppe wurden gänzlich aufgebraucht in den zahlreichen Vorversuchen, einerseits mit
Verdünnungsreihen und mit der Variation von Inkubationszeit und Inkubationstemperatur,
andererseits mit der Austestung von Antikörpern verschiedener Firmen.
Zum Vergleich der mittleren Anteile der identifizierten Zellen an den NPLC wurde folgende
Gruppierung vorgenommen:
größere Tumorlast
Gruppe 1
größere + geringere Tumorlast
Gruppe 1+2
(maligne Tumoren)
benigne Tumoren
Gruppe 3
tumorfreie Leber
Kontrollgruppe
Das Ergebnis der Gruppe mit größerer Tumorlast wurde gesondert dargestellt, um eventuelle
Tendenzen zur Veränderung der NPLC-Anteile bei zunehmender Tumorbelastung der Leber zu
erfassen.
Beim Vergleich der Einzelwerte wurde die Nummerierung der Gewebeproben von Tabelle 5
beibehalten.
26
3.3.1
Lebertypische Makrophagen
In dieser Zellgruppe wurden mit Anti-25F9 reife Makrophagen und mit Anti-27E10 unreife
Makrophagen identifiziert. Außerdem wurde eine Färbung mit dem für die Identifizierung von
Makrophagen gängigen Marker Anti-CD68 durchgeführt. Mit Anti-CD16, primär eingesetzt zur
Identifizierung der NK-Zellen, ließ sich auch eine Subpopulation der Makrophagen erfassen.
3.3.1.1
Unreife Makrophagen (27E10)
Mittelwerte
Gr. 1:
Gr. 1
Gr. 1+2
Gr. 3 Kontroll-Gr.
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 1.1: Anteil der unreifen Makrophagen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 6.1: Prozentwerte zu Abb. 1.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
29,4
32,6
34,1
Kontroll-Gr.
20,4
Der mittlere Anteil der unreifen Makrophagen liegt in allen tumorumgebenden Geweben deutlich
höher als bei den tumorfreien Kontrollen. Eine Korrelation mit dem Ausmaß der Tumorlast ist nicht
erkennbar.
27
Unreife Makrophagen
Einzelwerte
1 2 3 4 5 6 7
8
Gr. 1
9
Gr. 2
10 11
A B C D E
Gr. 3
Kontroll-Gruppe
Abb. 1.2: Anteil der unreifen Makrophagen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 6.2: Prozentwerte zu Abb. 1.2
Gr. 1
1
2
33,2
13,2
3
4
Gr. 2
5
6
7
8
9
Gr. 3
10
11
Kontroll-Gr.
A
B
C
D
E
32,0 34,4 15,6 50,8 26,5 53,2 34,5 35,6 32,6 16,0 30,6 19,9 17,8 17,9
Der Vergleich der Einzelwerte zeigt, dass zwei Werte der Gruppe mit größerer Tumorlast nach
unten ausweichen und gruppenübergreifend den geringsten Anteil an unreifen Makrophagen
aufweisen, was sich nivellierend auf den Mittelwert auswirkt. Bei den Kontrollen fällt eine geringe
Schwankungsbreite der Anteile auf. Mit einer Ausnahme bewegen sich die Anteile der unreifen
Makrophagen in dieser Gruppe zwischen 16% und 20 %.
28
3.3.1.2
Reife Makrophagen (25F9)
Mittelwerte
Gr. 1:
Gr. 1
Gr. 1+2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 2.1: Anteil der reifen Makrophagen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 7.1: Prozentwerte zu Abb. 2.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
10,8
10,9
10,7
Kontroll-Gr.
16,7
Die Tumorleber-Gruppen weisen im Mittel den gleichen Anteil an reifen Makrophagen auf. In den
tumorfreien Geweben liegt der mittlere Anteil deutlich höher.
29
Reife Makrophagen
Einzelwerte
1 2 3 4 5 6 7
8 9
10 11
A B C D E
Gr. 1
Gr. 2
Gr. 3
Kontroll-Gruppe
Abb. 2.2: Anteil der reifen Makrophagen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 7.2: Prozentwerte zu Abb. 2.2
Gr. 1
Gr. 2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
15,1
10,0
17,0
8,3
8,0
8,6
8,2
8,7
14,2
Gr. 3
10
11
Kontroll-Gr.
A
9,9 11,5 18,0
B
C
D
E
9,3 10,5 20,9 25,0
Der Vergleich der Einzelwerte zeigt, dass in den Tumorleber-Gruppen die 10%-Marke bei 7 von
den 11 Gewebeproben nicht überschritten wird. Die Anteile dieser 7 Proben gruppieren sich nahe
an der 10%-Marke. In der Kontroll-Gruppe fällt eine höhere Schwankungsbreite des Anteils der
reifen Makrophagen auf.
30
3.3.1.3
Vergleich der unreifen und reifen Makrophagen
Mittelwerte
1
1+2
3
K.
1 1+2
3
K
A
unreife M.
Gr. 1:
reife M.
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 3:
benigne Tumoren
K
Kontroll-Gruppe
Abb. 3.1: Anteile der unreifen und reifen Makrophagen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 8.1: Prozentwerte zu Abb. 3.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
unreife M.
29,4
32,6
34,1
20,4
reife M.
10,8
10,9
10,7
16,7
Kontroll-Gr.
Dieser Vergleich verdeutlicht das einheitliche Überwiegen der unreifen Makrophagen in den
Tumorleber-Gruppen und den viel geringeren Anteil reifer Makrophagen, sowohl innerhalb der
Tumorleber-Gruppen als auch gemessen an den Kontrollen.
31
3.3.1.4
Verhältnis der reifen und unreifen Makrophagen (25F9 / 27E10)
Mittelwerte
Gr. 1: größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3: benigne Tumoren
Abb. 3.2: Verhältnis der Anteile unreifer und reifer Makrophagen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 8.2 Prozentwerte zu Abb. 3.2
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
Kontroll-Gr.
reife M.
10,8
10,9
10,7
16,7
unreife M.
29,4
32,6
34,1
20,4
25F9 / 27E10
0,4
0,4
0,3
0,9
Entsprechend der geringeren Zahl reifer Makrophagen und der Erhöhung der unreifen
Makrophagen in den Tumorleber-Gruppen sind die Quotienten in diesen Gruppen deutlich
niedriger als in der Kontrollgruppe.
32
Verhältnis der reifen und unreifen Makrophagen (25F9 / 27E10)
Einzelwerte
Abb. 3.3: Verhältnis der Anteile reifer und unreifer Makrophagen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 8.3 Prozentwerte zu Abb. 3.3
Gr. 1
Gr. 2
Gr. 3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
reife M.
15,1
10,0
17,0
8,3
8,0
8,6
8,2
8,7
14,2
unreife M.
33,2
13,2
32,0 34,4 15,6 50,8 26,5 53,2 34,5 35,6 32,6 16,0 30,6 19,9 17,8
25F9/27E10
0,5
0,8
0,5
0,2
0,5
0,2
0,3
0,2
0,4
10
11
Kontroll-Gr.
A
9,9 11,5 18,0
0,3
0,4
1,1
B
C
D
9,3 10,5 20,9
0,3
0,5
1,2
Die hohe Schwankungsbreite der aus den Einzelwerten resultierenden Quotienten macht deutlich,
dass kein konstantes Verhältnis zwischen reifen und unreifen Makrophagen vorliegt.
33
3.3.1.5
CD68-positive Makrophagen
Mittelwerte
Gr. 1:
Gr. 1
Gr. 1+2
Gr. 3
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Kontroll-Gr.
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 4.1: Anteil der CD68-positiven Makrophagen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 9.1: Prozentwerte zu Abb. 4.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
13,5
13,6
12,8
Kontroll-Gr.
14,5
Der mittlere Anteil der CD68-positiven Makrophagen zeigt sowohl innerhalb der TumorleberGruppen als auch im Vergleich zu den Kontrollen nur geringe Unterschiede.
34
CD68-positive Makrophagen
Einzelwerte
1 2 3 4 5 6 7
Gr. 1
8 9
10 11
A B C D E
Gr. 2
Gr. 3
Kontroll-Gruppe
Abb. 4.2: Anteil der CD68-positiven Makrophagen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 9.2: Prozentwerte zu Abb. 4.2
Gr. 1
1
2
17,6
15,7
3
4
Gr. 2
5
6
7
13,2 16,8 10,3 11,3 9,5
8
9
Gr. 3
10
11
Kontroll-Gr.
A
12,7 15,3 12,2 13,4 16,1
B
C
D
E
9,6 10,6 10,4 26,0
In allen Gruppen fällt eine geringe Schwankungsbreite der Einzelwerte auf. Kontrolle E bildet
einen Ausreißer.
35
3.3.1.6
Vergleich der reifen Makrophagen (25F9) mit CD68-positiven Makrophagen
Mittelwerte
1
1+2 3
K.
1
1+2 3
K
Gr. 1:
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
A
reife M. (25F9)
CD68-pos. M.
Gr. 3:
benigne Tumoren
K
Kontroll-Gruppe
Abb. 5.1: Anteile der reifen Makrophagen und der CD68-positiven Makrophagen (Mittelwerte)
Tabelle 10.1: Prozentwerte zu Abb. 5.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
reife M.
10,8
10,9
10,7
16,7
CD68-pos. M.
13,5
13,6
12,8
14,5
Kontroll-Gr.
In allen Tumorleber-Gruppen liegt der mittlere Anteil der CD68-positiven Makrophagen höher als
der Anteil reifer Makrophagen. Bei den Kontrollen ist das Verhältnis umgekehrt. Die reifen
Makrophagen überwiegen.
36
Vergleich der reifen Makrophagen (25F9) und CD68-positiven Makrophagen
Einzelwerte
Abb. 5.2: Anteile der reifen Makrophagen (25F9) und der CD68-positiven Makrophagen an den
NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 10.2: Prozentwerte zu Abb 5.2
Gr. 1
1
2
3
25F9-pos. 15,1 10,2 17,0
Gr. 2
4
5
6
7
8,3
8,0
8,6
8,2
8
9
Gr. 3
10
11
Kontroll-Gr.
A
B
C
D
E
8,7 14,2 9,9 11,5 18,0 9,3 10,5 20,9 25,0
CD68-pos. 17,6 15,7 13,2 16,8 10,3 11,3 9,5 12,7 15,3 12,2 13,4 16,1 9,6 10,9 10,4 26,0
In 13 der insgesamt 16 Gewebeproben überwiegt der Anteil CD68-positiver Makrophagen.
In den Tumorleber-Gruppen ist die Konstellation nur einmal umgekehrt (Nr. 3), bei den Kontrollen
zweimal (A und D). Diese 3 Proben ergaben einen höheren Anteil der reifen Makrophagen als an
CD68-positiven Zellen.
37
3.3.1.7
CD16-positive Makrophagen
Mittelwerte
Gr. 1:
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 1
Gr. 1+2 Gr. 3 Kontroll-Gr.
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 6.1: Anteil der CD16-positiven Makrophagen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 11.1: Prozentwerte zu Abb. 6.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
10,6
10,5
10
Kontroll-Gr.
6,5
Die Tumorleber-Gruppen weisen nahezu den gleichen mittleren Anteil CD16-positiver
Makrophagen auf. Bei den Kontrollen liegt der mittlere Anteil deutlich niedriger.
38
CD16-positive Makrophagen
Einzelwerte
1 2 3 4 5 6 7
8 9
10 11
A B C D
Gr. 1
Gr. 2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
Abb. 6.2 Anteil der CD16-positiven Makrophagen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 11.2: Prozentwerte zu Abb. 6.2
Gr. 1
Gr. 2
1
2
3
4
5
6
18,7
13,5
11,4
4,2
6,4
3,5
7
8
16,3 5,8
9
Gr. 3
10
11
14,5 15,5 4,4
Kontroll-Gr.
A
B
C
8,3
5,2
4,0
D
E
8,3 (37,8)
Alle Tumorleber-Gruppen zeigen eine ähnlich hohe Schwankung der Einzelwerte. Daraus
resultieren die nahezu gleichen Mittelwerte. Bei den Kontrollen finden sich durchgehend niedrige
Einzelwerte. Der Ausreißer (Kontrolle E) wurde nicht berücksichtigt.
39
3.3.2
Leber-assoziierte Lymphozyten (LAL)
Zu dieser Zellgruppe konnten T-Lymphozyten (CD3), NK-Zellen (CD16), zytotoxische T-Zellen
(CD8) und B-Lymphozyten (CD20) erfasst werden.
3.3.2.1
T-Lymphozyten (CD3)
Mittelwerte
Gr. 1:
Gr. 1
Gr. 1+2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 7.1: Anteil der T-Lymphozyten an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 12.1: Prozentwerte zu Abb. 7.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
16,3
15,1
6,7
Kontroll-Gr.
14,1
Der mittlere Anteil der T-Lymphozyten liegt in den Gruppen mit malignen Tumoren etwas höher
als bei den Kontrollen. Der Anteil der T-Lymphozyten steigt mit zunehmender Tumorlast. Der sehr
niedrige Anteil in der Gruppe benigner Tumoren fällt aus dem Rahmen.
40
T-Lymphozyten (CD3)
Einzelwerte
1 2 3 4 5 6 7
8
Gr. 1
9
Gr. 2
10 11
A B C D E
Gr. 3
Kontroll-Gruppe
Abb. 7.2 Anteil der T-Lymphozyten an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 12.2: Prozentwerte zu Abb. 7.2
Gr. 1
1
2
19,9
14,7
3
4
Gr. 2
5
6
7
8
9
17,8 14,8 24,5 10,2 12,5 11,4 10,1
Gr. 3
10
11
7,7
5,6
Kontroll-Gr.
A
B
C
D
16,7 12,8 24,6 5,9
E
10,7
Die Anteile an T-Lymphopzyten in den Tumorleber-Gruppen insgesamt lassen eine ähnlich hohe
Schwankungsbreite erkennen wie die Anteile in der Kontroll-Gruppe. Sie liegen zwischen knapp
6% und knapp 25%. Die höheren Werte häufen sich in der Gruppe mit größerer Tumorlast.
41
3.3.2.2
NK-Zellen (CD16)
Mittelwerte
Gr. 1:
Gr. 1
Gr. 1+2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 8.1: Anteil der NK-Zellen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 13.1: Prozentwerte zu Abb. 8.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
5,2
4,5
2,2
Kontroll-Gr.
3,2
Der mittlere Anteil der NK-Zellen steigt mit zunehmender Tumorlast. Ähnlich wie der Anteil der
T-Lymphozyten ist der mittlere Anteil der NK-Zellen bei den benignen Tumoren
gruppenübergreifend am geringsten.
42
NK-Zellen (CD16)
Einzelwerte
1 2 3 4 5 6 7
8 9
10 11
A B C D E
Gr. 1
Gr. 2
Gr. 3
Kontroll-Gruppe
Abb. 8.2 Anteil der kleinen CD16-positiven Zellen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 13.2: Prozentwerte zu Abb. 8.2
Gr. 1
Gr. 2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A
B
C
D
E
7,2
6,3
2,9
6,1
6,2
2,3
5,4
1,5
2,8
2,1
2,2
5,0
5,4
2,2
1,3
4,5
Nur in der Gruppe mit größerer Tumorlast finden sich Anteile über der 6%-Marke. Insgesamt
betrachtet wurden zwischen 1,3% und 7,3% kleine CD16-positive Zellen nachgewiesen.
43
3.3.2.3
Zytotoxische T-Zellen (CD8)
Mittelwerte
Gr. 1:
größere Tumorlast
Gr. 1+2: größere + geringere Tu-Last
Gr. 1
Gr. 1+2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
Gr. 3:
benigne Tumoren
Abb. 9: Anteil der zytotoxischen T-Zellen an den NPLC (Mittelwerte)
Tabelle 14.1: Prozentwerte zu Abb. 9
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
0,2
0,3
0,6
Kontroll-Gr.
0,8
Einzelwerte
Tabelle 14.2: Anteil der zytoxischen T-Zellen an den NPLC in Prozenten (Einzelwerte)
Gruppe 1
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
Gruppe 2
Nr.
einzelne +
negativ
0,3
0,7
einzelne +
negativ
0,6
8
9
Gruppe 3
Nr.
einzelne +
0,6
10
11
Kontroll-Gr.
Bez.
einzelne +
1,1
A
B
C
D
E
1,9
0,6
0,3
0,5
0,7
44
Der Anteil an nachweisbaren CD8-positiven Lymphozyten ist in allen Gruppen gering. Während
jedoch aus den tumorfreien Kontroll-Geweben ein gewisser Prozentsatz dieser Zellen durchgängig
erfassbar war, konnten aus den tumorumgebenden Geweben auf einem Reaktionsfeld mit ca. 105
Zellen mehrfach gar keine oder nur ganz vereinzelt CD8-positive Lymphozyten nachgewiesen
werden. Der Mittelwert der Kontrollgruppe liegt entsprechend höher.
3.3.2.4
B-Lymphozyten (CD20)
Tabelle 15a: Prozentualer Anteil der B-Lymphozyten (Mittelwerte)
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere + geringere
Tumorlast
Gr. 3
benigne
Tumoren
0,0
0,0
0,0
Kontroll-Gr.
0,7
Tabelle 15b: Anteil der B-Lymphozyten (Einzelwerte)
Gruppe 1
Nr.
1
2
3
4
5
6
7
Gruppe 2
Nr.
einzelne
einzelne
einzelne
einzelne
einzelne
einzelne
einzelne
+
+
+
+
+
+
+
8
9
Gruppe 3
Nr.
einzelne +
einzelne +
10
11
Bez.
einzelne +
einzelne +
A
B
C
D
E
Kontroll-Gr.
%
0,9
0,3
0,2
1,1
1,1
Die nachweisbare B-Zell-Population ist sehr klein. In allen tumorumgebenden Geweben konnten
unter 105 Zellen nur ganz vereinzelt positive B-Lymphozyten identifiziert werden, während in den
Kontrollgeweben durchgängig eine geringe Zellausbeute möglich war.
45
3.3.3
Ito-Zellen
Zur Identifizierung von Ito-Zellen wurden Aktin und Desmin verwendet.
Vergleich der Anteile von Aktin-pos. und Desmin-pos. Ito-Zellen
Mittelwerte
1 1+2 3
K.
1 1+2 3
K
A
Aktin
Desmin
1: (Gr. 1) größere Tumorlast
1+2: (Gr. 1+2) größere + geringere
Tumorlast
3: (Gr. 3) benigne Tumoren
K:
Kontroll-Gruppe
Abb. 10.1: Mittlere Anteile von Aktin-pos. und Desmin-pos. Ito-Zellen an den NPLC
Tabelle 16.1: Prozentwerte zu Abb. 10.1
Mittelwert
Gr. 1
größere
Tumorlast
Gr. 1+2
größere +
geringere Tu-Last
Gr. 3
benigne
Tumoren
Aktin
1,3
1,5
1,5
2,0
Desmin
2,0
1,9
1,7
2,5
Kontroll-Gr.
In allen Gruppen konnte mit Desmin ein geringfügig höherer Prozentsatz an Ito-Zellen identifiziert
werden. Die Gruppenunterschiede bewegen sich bei den Aktin-positiven ebenso wie bei den
Desmin-positiven Zellen nur im Zehntelbereich.
46
Vergleich der Anteile von Aktin-positiven und Desmin-positiven Ito-Zellen
Einzelwerte
Abb. 10.2: Anteile der Aktin-pos. und Desmin-pos. Ito-Zellen an den NPLC (Einzelwerte)
Tabelle 16.2: Prozentwerte zu Abb. 10.2
Gr. 1
Gr. 2
Gr. 3
Kontroll-Gr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A
B
C
D
E
Aktin
1,5
0,8
1,1
0,3
2
3,7
1,8
1,2
1,3
2,5
0,4
2,5
2,9
3,1
0,5
0,9
Desmin
2,6
0,9
1,2
0,9
2,1
4,3
2,0
1,7
1,6
1,8
1,5
2,0
3,0
3,2
1,4
2,9
Mit 2 Ausnahmen (Gewebe-Nr. 10 und Kontrolle A) liegt der Anteil an Desmin-positiven ItoZellen etwas höher als der Anteil an Aktin-positiven Ito-Zellen.
47
3.3.4
Anteil der identifizierten Zellen an den NPLC
größere + geringere Tumorlast
Kontroll-Gruppe
Abb. 11: Prozentuale Zusammensetzung der NPLC
unreife Makrophagen
Desmin-pos. Ito-Zellen
reife Makrophagen
Aktin-pos. Ito-Zellen
T-Lymphozyten
Zytotoxische T-Zellen
NK-Zellen
B-Lymphozyten
48
Tabellen 17: Prozentwerte zu Abb. 11 (Prozentuale Zusammensetzung der NPLC)
17a: Zelltypen mit einem höheren Anteil an den NPLC (Prozentwerte)
Größere + geringere Tumorlast
Kontroll-Gruppe
Unreife Makrophagen
32,6
Unreife Makrophagen
20,4
Reife Makrophagen
10,9
Reife Makrophagen
16,7
T-Lymphozyten
15,1
T-Lymphozyten
12,5
NK-Zellen
4,5
NK-Zellen
3,2
17b: Zelltypen mit einem geringen Anteil an den NPLC (Prozentwerte)
Größere + geringere Tumorlast
Kontroll-Gruppe
Desmin-pos. Ito-Zellen
1,9
Desmin-pos. Ito-Zellen
2,5
Aktin-pos. Ito-Zellen
1,5
Aktin-pos. Ito-Zellen
2,0
Zytotoxische T-Zellen
0,3
Zytotoxische T-Zellen
0,8
B-Lymphozyten
0,0
B-Lymphozyten
0,7
In Abbildung 11 sind die Zelltypen mit einem höheren Anteil an den NPLC gruppiert und jene
Zelltypen, für die nur ein geringer Anteil an den NPLC nachgewiesen werden konnte. Die NKZellen, die bzgl. der Ausbeute eine Mittelstellung einnehmen, wurden aufgrund ihrer Bedeutung für
die Tumorimmunologie den höher-anteiligen NPLC zugeordnet.
49
4
DISKUSSION
4.1
Anmerkungen zur Methode und zum Material für die Isolierung
der NPLC
Bisher ist keine Methode zur Isolierung der NPLC bekannt, die keine Fehlerquellen enthält.
Die in der vorliegenden Untersuchung angewandte Methode erforderte die Inkubation des
zerkleinerten Gewebes in einer Kollagenase- und Pronase-Lösung, um die Auflösung des Gewebes
zu erzielen. Gelegentlich blieb jedoch ein Teil der Zellen verklumpt und ließ sich nicht
resuspendieren. Die darin enthaltenen NPLC gingen verloren, was zu einem -möglicherweise sogar
selektiven- Zellverlust führte. Derartige Aggregate traten bevorzugt bei der Aufarbeitung etwas
größerer Gewebeproben (7-8 Gramm) auf. Hier wurde entsprechend der größeren Hepatozytenzahl
bei deren Lyse mehr DNA freigesetzt, die zu einem Verklumpen führen kann. Nach Jones (1983)
kann die Verwendung von DNAse diese Aggregatbildung zwar nicht verhindern, aber verringern.
Ein selektiver Verlust, speziell von Ito-Zellen, ist außerdem dadurch möglich, dass mit dem
variablen Lipidgehalt auch die Dichte dieser Zellen schwankt. Nur bei geringem Fettgehalt
entspricht sie in etwa jener der anderen NPLC (Alpini et al 1994). Um diesen Störfaktor möglichst
gering zu halten, wurde die Bande aus dem Dichtegradienten großzügig abgesaugt.
Zur Trennung der NPLC von Zelltrümmern und Erythrozyten war der Einsatz eines
Dichtegradienten notwendig. Solche Gradienten können ebenfalls zu einem Zellverlust führen.
Kutvirt et al (1993) beschreiben für den Ficoll-Hypaque-Gradienten, dass er einen selektiven
Verlust von Lymphozytenpopulationen bedingt. Mit diesem Gradienten kommt es bei der
Isolierung mononukleärer Zellen aus dem Blut zu einer Verminderung der B-Lymphozyten und der
zytotoxischen T-Zellen (CD8-positiv), während der Anteil CD56-exprimierender Zellen zunimmt.
Weiter dokumentieren Shaw et al (1984) bei der Auftrennung im Metrizamid-Gradienten eine
Minderung der NPLC-Ausbeute beim Meerschweinchen um 47%. Als Ursache dafür wird die
Bildung von Aggregaten zwischen NPLC und Zellen, bzw. Zelltrümmern, des Pellets angesehen,
die den Autoren zufolge auch durch DNAse nicht reduziert werden kann.
Für den in dieser Untersuchung verwendeten Nykodenz-Gradienten liegen diesbezüglich keine
Daten vor, ein vergleichbarer Effekt ist jedoch nicht auszuschließen.
50
Zu bedenken ist auch eine mögliche Antigen-Zerstörung durch die Wirkung der zur
Hepatozytenlyse eingesetzten Pronase. Als Proteinase mit breiter Substratspezifität greift sie auch
proteinhaltige Moleküle, also auch Antigene, auf der Zellmembran von Nicht-Hepatozyten an, die
dadurch möglicherweise von Antikörpern nicht mehr erkannt werden (Jones 1983).
Darin könnte zumindest einer der Gründe für den misslungenen Nachweis des CD56-Antigens
(NK-Zellen) liegen, das durch besondere Labilität gekennzeichnet ist.
Für CD3-positive und CD68-positive Zellen ist immunhistologisch eine Änderung der Zelldichte in
Abhängigkeit von der Distanz des Gewebes zu dem Tumor beschrieben (Miyagawa et al 2002). Es
war nicht möglich, für diese Untersuchung Gewebeproben zu erhalten, die einen genau definierten
und konstanten Abstand von der makroskopischen Tumorgrenze aufweisen. Die Variabilität des
Abstands muss als möglicher Einflussfaktor auf die Zusammensetzung der NPLC in Betracht
gezogen werden.
Bei einem Vergleich der Lymphozytenpopulationen im peripheren Blut von Kindern und
Erwachsenen kamen Osugi et al (1995) zu dem Ergebnis, dass die Gesamtzahl der T- und BLymphozyten keine Altersabhängigkeit zeigt, die Zahl CD4-positiver T-Zellen aber mit
zunehmendem Alter abnimmt, während die der NK-Zellen zunimmt.
Mariani et al (1994) wiesen mit der Zunahme CD16-positiver Zellen im vorgerückten Alter eine
Abnahme der lytischen Aktivität der Zellen in vitro nach, so dass die zahlenmäßige Zunahme
möglicherweise dem Ausgleich einer funktionellen Minderwertigkeit dient.
Zu den mononukleären Zellen der menschlichen Leber liegen keine altersbezogenen Daten vor.
Lediglich von Mäusen ist bekannt, dass sich aus der Leber alter Tiere viermal so viele
mononukleäre Zellen isolieren lassen wie aus der Leber junger Tiere (Ohteki et al 1991, Watanabe
1992).
Inwieweit in dem Untersuchungsgut der vorliegenden Arbeit die Altersschwankungen (27 Jahre bis
72 Jahre) als Einflussgröße zu werten sind, bleibt aufgrund der geringen Probandenzahl
dahingestellt.
51
4.2
Untersuchungsergebnisse
4.2.1
Bewertung der Ergebnisse
Es sei erwähnt, dass die Beschaffung von 18 Gewebeproben, dem Ausgangsmaterial für die
vorliegende Untersuchung, mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden war und daher die Zahl der
Gewebeproben beschränkt bleiben musste. Anders als bei Versuchstieren, die unter exakt
kontrollierbaren Bedingungen gezüchtet werden und ein hohes Maß an Einheitlichkeit aufweisen,
ist bei Untersuchungen am menschlichen Organismus mit einer Vielzahl von Einflussgrößen zu
rechnen. Für möglicherweise erzielbare signifikante Ergebnisse wäre demnach eine größere
Stichprobenzahl erforderlich gewesen. Das schließt jedoch nicht aus, dass der verfügbare
Stichprobenumfang eine Beurteilung der aufgezeigten Unterschiede in der Zusammensetzung der
NPLC zwischen den tumorumgebenden Geweben und den tumorfreien Kontroll-Geweben zulässt
(Schulte Mönting, Institut für medizinische Biometrie und medizinische Informatik der Universität
Freiburg). Es erscheint berechtigt, dass auch numerisch geringe Unterschiede Beachtung finden und
als Hinweis gewertet werden auf mögliche Veränderungen in der Zusammensetzung der NPLC bei
einer Tumorerkrankung.
In den Diagrammen finden verschiedene Maßstäbe Verwendung, um die relativen Unterschiede zu
verdeutlichen. Gerechtfertigt erscheint dieses Vorgehen dadurch, dass geringe Differenzen bei
niedrig-anteiligen NPLC ein größeres Gewicht haben als bei höher-anteiligen NPLC.
4.2.2
Lebertypische Makrophagen
Das eindrücklichste Ergebnis der Untersuchung ist, dass im Gewebe aus der Umgebung maligner
ebenso wie benigner Tumoren der Anteil unreifer Makrophagen (27E10-positiv) an den NPLC mit
32%, bzw. 34% bei benignen Tumoren, deutlich höher liegt als bei den tumorfreien Kontrollen
(20 %).
Der Anteil an reifen Makrophagen (25F9-positiv) hingegen ist in den tumorumgebenden Geweben
mit 11% deutlich reduziert im Vergleich zur Kontroll-Gruppe (17%).
In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis konnten Freudenberg et al (1996) am Maus-Modell bei
Tumorwachstum in der Leber eine erhebliche Erhöhung des Anteils unreifer Makrophagen an den
NPLC bei gleichzeitiger Abnahme der reifen Makrophagen beobachten. Des Weiteren konnten
Kan et al (1995) zeigen, dass Zahl und Aktivität der Kupffer-Zellen in Metastasen tragenden
humanen Lebern deutlich erhöht sind.
52
In der Literatur war keine Untersuchung an humanen Lebern zu finden, die sich auf eine
quantitative Unterscheidung reifer und unreifer Makrophagen konzentrierte. Relevant ist die
Angabe, dass bei erhöhtem Kupffer-Zell-Bedarf der Einwanderung von Monozyten über die
periphere Zirkulation eine je nach Art des Stimulus unterschiedlich gewichtete Rolle zukommt
(Freudenberg et al 1989a).
Die Zunahme unreifer Makrophagen in den tumorumgebenden Lebergeweben könnte daraus
resultieren, dass Monozyten von sog. Chemokinen der Tumorzellen oder von bereits aktivierten
ortsständigen Immunzellen an den Ort des Tumorwachstums gelockt werden. Andererseits ist auch
beschrieben, dass Tumorzellen die Ausreifung verschiedener Immunzellen, auch der Makrophagen,
unterdrücken können (Letterio und Roberts 1998, Prendergast et al 2007) und reife Makrophagen
eliminieren können (Freudenberg et al 2001, Göppinger et al 2005).
Daraus lässt sich eine
Erklärungsmöglichkeit ableiten für den geringen Anteil an reifen Makrophagen in den
Tumorlebern. Denkbar ist auch, dass ein erhöhter Verbrauch der für die Tumorabwehr eingesetzten
reifen Makrophagen zu einer Reduzierung dieser Zellart führt.
Zur immunhistologischen bzw. immunzytologischen Darstellung der lebertypischen Makrophagen
wird in der Literatur überwiegend Anti-CD68 angegeben. Tomita et al (1994) identifizierten
Makrophagen aus Geweben von gesunden und an chronischer Hepatitis erkrankten Lebern mit
Anti-25F9 und Anti-CD68. Sie beobachteten, dass CD68-positive Makrophagen gegenüber den
25F9-positiven Zellen in normalen wie in erkrankten Lebern konstant überwiegen. Es ließen sich
doppelt positive und nur CD68-positive Makrophagen unterscheiden. Die Autoren vermuten, dass
für die unterschiedliche Expression der beiden Antigene der unterschiedliche Reifegrad der
Lebermakrophagen verantwortlich ist. Sie folgern daraus, dass CD68-positive Makrophagen,
verglichen mit den doppelt positiven Zellen, unreif sind und dass sie sich in einem Durchgangsstadium der Reifung befinden.
Das Ergebnis der vorliegenden Arbeit stimmt mit dem Resultat von Tomita et al (1994) überein. In
13 der insgesamt 16 untersuchten Gewebeproben, also sowohl in den Geweben aus tumortragenden
als auch aus tumorfreien Lebern, überwiegt der Anteil an CD68-positiven Makrophagen gegenüber
dem Anteil an 25F9-positiven Makrophagen. Die umgekehrte Konstellation (das Überwiegen der
25F9-positiven Zellen gegenüber den CD68-positiven Makrophagen) ergab sich nur einmal in
einem tumorumgebenden Gewebe und in zwei Kontroll-Geweben.
Die Anteile CD68-positiver Zellen liegen gruppenübergreifend im Mittel 2% über den Anteilen an
25F9-positiven reifen Makrophagen. Der numerische Abstand der Anteile CD68-positiver Zellen
zu den 27E10-positiven unreifen Makrophagen ist bei weitem höher (im Mittel 15%). Daraus läßt
sich ableiten, dass mit Anti-CD68 im Wesentlichen reife Makrophagen identifiziert werden. Der
53
Überhang könnte – in Anlehnung an die Vermutung von Tomita et al – aus einem Anteil an
Makrophagen resultieren, die sich in einem Durchgangsstadium befinden und noch nicht
vollständig ausgereift sind.
Der mittlere Anteil an CD68-positiven Makrophagen liegt in den tumorumgebenden Geweben
etwas höher als bei den Kontrollen, was die Dringlichkeit des Makrophagen-Nachschubs für die
Tumorabwehr charakterisieren könnte.
Große CD16-exprimierende Zellen entsprechen funktionell aktivierten Monozyten und
Makrophagen (van Ravenswaay et al 1992). Der prozentuale Anteil liegt in den TumorleberGruppen im Mittel höher, wenngleich eine hohe Schwankungsbreite der Einzelwerte auffällt (4,2%
bis 18,7%). Die Kontrollgruppe weist geschlossen niedrige Werte auf (4% bis 8,3%), wenn von
Kontrolle E, die weit aus dem Rahmen fällt, abgesehen wird.
4.2.3
Leber-assoziierte Lymphozyten
Mit dem Ergebnis dieser Arbeit, dass leberassoziierte Lymphozyten zu einem großen Teil CD3
exprimieren, werden die Angaben in der Literatur bestätigt (Hata et al 1990, Hata et al 1991,
Winnock et al 1993, Barnaba et al 1994). Mit der Identifizierung von CD3-positiven Lymphozyten
speziell in tumorumgebenden Lebergeweben befasste sich eine Untersuchung von Kasper et al
(2003). Sie wiesen immunzytochemisch ein Überwiegen der CD3-positiven Lymphozyten nach.
In der vorliegenden Untersuchung zeichnet sich ab, dass eine größere Tumorlast zu einem Anstieg
der CD3-positiven T-Lymphozyten führt (16,3% versus 14,3% bei den Kontrollen). Entsprechung
findet dieses Ergebnis in einer Untersuchung von Johnkoski et al (1992). Er verzeichnete bei Tieren
mit Tumoren eine Zunahme von T-Lymphozyten. Derselbe Autor beschreibt eine Zunahme der TLymphozyten auch im humanen Lebergewebe, noch bevor sich makroskopisch Metastasen
nachweisen lassen. Ebenso fand er den Anteil der aktivierten Lymphozyten unter den γδ-T-Zellen
schon vor einer manifesten Metastasierung erhöht.
Ebenso konnten Bortolami et al (2002) immunhistologisch im tumorumgebenden Lebergewebe von
Patienten mit hepatozellulärem Karzinom, Leberfiliae oder benignen Lebertumoren eine höhere
Dichte CD3-positiver T-Zellen feststellen, verglichen mit Gewebeproben aus tumorfreien Lebern.
Die Zunahme der γδ-T-Zellen ist allerdings kein konstant nachweisbarer Parameter. So konnten
Hata et al (1991) bei den von ihnen untersuchten Patienten mit Metastasen eines Kolonkarzinoms
keine Zunahme dieser Zellen beobachten. Ebenso bleibt im Maus-Modell (Freudenberg et al 1996)
die Gesamtzahl der T-Lymphozyten vom Tumorwachstum unbeeinflusst.
54
Somit fügt sich das Ergebnis dieser Arbeit hinsichtlich des leichten Anstiegs der CD3-positiven TZellen bei zunehmender Tumorlast in den Rahmen ein, den bisherige Untersuchungen an humanen
Lebern und am Tier-Modell gesetzt haben.
Mit Anti-CD16 wurde die Identifizierung der NK-Zellen, einer weiteren Lymphozyten-Population,
angestrebt. Unter den CD16-positiven Zellen sind lichtmikroskopisch zwei Populationen
abgrenzbar: Große CD16-exprimierende Zellen und kleine morphologisch
lymphoide
mononukleäre Zellen. Bei Letzteren handelt es sich im Wesentlichen um NK-Zellen. Nur ein sehr
geringer Anteil zytotoxischer T-Zellen exprimiert auch CD16 (Winnock et al 1991, Hata et al 1990
und 1992). In der vorliegenden Untersuchung wurde bereits mit Anti-CD8, einem Marker speziell
für zytotoxische T-Zellen, ein sehr geringer Anteil dieses Zelltyps an den NPLC nachgewiesen.
Damit liegt der Schluss nahe, dass es sich bei den identifizierten kleinen CD16-exprimierenden
Zellen größtenteils um NK-Zellen handelt.
Die Ausbeute an NK-Zellen liegt im Maximum bei 7%. Die höheren Anteile dieser Zellen häufen
sich in der Gruppe mit größerer Tumorlast. Der Mittelwert beträgt 5%, bei den Kontrollen 3%. Eine
ähnliche Erhöhung der Anteile an den NPLC bei zunehmender Tumorlast wurde bei den CD3exprimierenden T-Zellen beobachtet. Auch wenn die numerischen Unterschiede zur Kontrollgruppe
nicht hoch sind, darf aus der Übereinstimmung der Ergebnisse ein Hinweis auf mögliche
Veränderungen der Lymphozyten-Anteile in Tumorlebern abgeleitet werden.
Der geringe Anteil zytotoxischer T-Zellen (CD8), der in den tumorumgebenden ebenso wie in den
Geweben aus tumorfreien Lebern nachweisbar war, findet Entsprechung in einer Untersuchung von
Kasper et al (2003). Auch diese Autoren konnten nur einen geringen Anteil CD8-exprimierender
Zellen nachweisen.
Winnock et al (1993) hingegen kamen zu anderen Ergebnissen. Sie isolierten leberassoziierte
Lymphozyten aus Gewebe mit benignen und malignen Tumoren mittels sinusoidaler Lavage und
identifizierten die Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Sie konnten im Tumorgewebe eine
Anreicherung CD8-positiver LAL im Vergleich zum peripheren Blut nachweisen. Auch Hata et al
(1991) isolierten aus gesundem Lebergewebe und aus dem Lebergewebe von Patienten mit
Metastasen oder hepatozellulärem Karzinom deutlich mehr CD8- als CD4-positive Zellen.
Die von Johnkoski et al (1992) beschriebene Zunahme CD8-positiver Lymphozyten im MausModell mit experimentell induzierten Lebertumoren konnten Hata et al (1992) aufgrund von
Untersuchungen an humanem Lebergewebe nicht bestätigen. Als Ursache ist neben dem
Speziesunterschied unter anderem auch eine Abhängigkeit von der Art des Tumors und dessen
Einfluss auf das Immunystem denkbar (McBride 1986).
55
Auffallend ist, dass im gesunden Lebergewebe ausnahmslos ein, wenngleich sehr geringer Anteil
CD8-positiver zytotoxischer T-Zellen nachweisbar war, während dies in den tumorumgebenden
Geweben nur selten gelungen ist.
Ähnlich liegt das Ergebnis bei den B-Lymphozyten (CD20). In allen tumorumgebenden
Gewebeproben konnten nur vereinzelt einige Zellen nachgewiesen werden, während in jedem
Gewebe aus tumorfreier Leber ausnahmslos ein geringer Prozentsatz an B-Zellen erfassbar war.
Bestätigung findet das vorliegende Ergebnis in der Literatur. Whiteside et al (1986) geben an, dass
unter den tumorinfiltrierenden Lymphozyten der meisten Tumoren B-Zellen nur sehr spärlich
vertreten sind. Hata et al (1990) haben Anti-CD19 als B-Zell-Marker eingesetzt und das spärliche
Vorhandensein von B-Lymphozyten bestätigt. Im Übrigen werden die B-Lymphozyten in der
Literatur selten erwähnt. Der Grund hierfür könnte darin liegen, dass die der Leber zugeordneten
immunologischen Aufgaben primär solche sind, für die das zelluläre Immunsystem verantwortlich
ist. Außerdem werden bisherigen Erkenntnissen zufolge stimulierende und hemmende
Interaktionen mit Tumorzellen vorwiegend dem zellulären Immunsystem - durch direkte Zell-ZellInteraktionen und über Zytokine - zugeschrieben.
Da sich die CD3-exprimierenden Lymphozyten näherungsweise aus CD8- und CD4exprimierenden Zellen zusammensetzen, legt die in der vorliegenden Untersuchung geringe
Ausbeute an CD8-positiven Zellen nahe, dass mit Anti-CD3 näherungsweise die CD4-positiven
Zellen erfasst wurden.
4.2.4
Ito-Zellen
In der vorliegenden Untersuchung tragen Desmin-positive Ito-Zellen im tumorumgebenden
Gewebe im Mittel mit rund 2% und in tumorfreien Lebern im Mittel mit 2,5% zu den NPLC bei.
In der Literatur sind die Angaben bezüglich der Expression von Desmin in humanen Ito-Zellen
widersprüchlich. Einige Autoren beschreiben sie als immunhistochemisch konstant Desmin-negativ
(Enzan et al 1994, Schmitt-Gräff et al 1991, Bioulac-Sage 1992). Dagegen konnten Mathew et al
(1994b) immunhistochemisch eine schwach ausgeprägte Expression von Desmin nachweisen.
Auch Schmitt-Gräff et al (1991) identifizierten in Lebergeweben, die benigne oder maligne
(primäre und sekundäre) Tumoren umgaben, eine variable Anzahl Desmin-exprimierender ItoZellen, was dem Ergebnis dieser Arbeit nahekommt.
Der Anteil an Aktin-positiven Ito-Zellen ist gruppenübergreifend noch geringer. Die Metastasen
sind somit von keiner wesentlichen Stromareaktion begleitet.
56
4.2.5
Sinusoidale Endothelzellen
Einige Studien dokumentieren den immunhistochemisch konstant CD34-negativen Phänotyp
sinusoidaler Endothelzellen in nicht geschädigter Leber (Coulevard et al 1993, Scoazec et al 1994)
im Gegensatz zu Endothelzellen portaler Kapillaren, die CD34 exprimieren (Scoazec et al 1994).
Kuzu et al (1992) zeigten, dass zwar an formalinfixiertem Gewebe der Nachweis von CD34 nicht
gelingt, sinusoidale Endothelzellen in Kryostatschnitten aus gesundem Lebergewebe aber CD34positiv sind. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass sinusoidale Endothelzellen mit Anti-CD34
nicht durchgehend nachweisbar sind.
In dieser Arbeit handelte es sich bei den identifizierten CD34-positiven Zellen morphologisch um
langgestreckte, meist spindelförmige Zellen, was lichtmikroskopisch mit Endothelzellen vereinbar
ist. Sie machen nur wenige Prozent der isolierten NPLC aus. Hingegen konnten Freudenberg et al
(1989b) elektronenmikroskopisch 50% sinusoidale Endothelzellen unter den NPLC der Maus
nachweisen.
Als Folgerung liegt nahe, dass mit Anti-CD34 der Anteil der Endothelzellen nicht zuverlässig
erfasst werden konnte. Dieser Zelltyp wurde deshalb nicht in die Darstellung der
Untersuchungsergebnisse aufgenommen. Thurman et al (1993) weisen daraufhin, dass
Endothelzellen gegenüber physikalischen Einflüssen, wie Abkühlung und Wieder-Erwärmung, sehr
empfindlich reagieren. Ob aus diesem Grund nur ein so
geringer Anteil der sinusoidalen
Endothelzellen intakt geblieben ist oder ob nur eine Subpopulation der Endothelzellen CD34
exprimiert, kann nicht abschließend beurteilt werden. Die Zeitspanne, in der das Gewebe trocken
lag (bis zu 1 Stunde) oder in RPMI aufbewahrt wurde (maximal 7 Stunden), hatte keinen Einfluss
auf den Anteil CD34-positiver Zellen.
57
5
ZUSAMMENFASSUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit war, Nicht-parenchymale Leberzellen (NPLC), insbesondere
das zelluläre Abwehrsystem, in der humanen Leber zu identifizieren, die prozentuale Häufigkeit der
Zellen zu bestimmen und zu untersuchen, ob sich in tumorerkrankten humanen Lebern ihre
Zusammensetzung verändert.
Als geeignetes Material erwiesen sich die tumorfreien Resektatränder von resezierten
Lebermetastasen. Verglichen wurden 11 Proben von tumorumgebendem Gewebe mit 5
Gewebeproben aus tumorfreien Lebern.
Die Isolierung dieser Zellen wurde mit der Kollagenase/Pronase Technik durchgeführt. Die
Identifizierung der NPLC erfolgte immunzytochemisch mit Hilfe monoklonaler Antikörper unter
Anwendung der indirekten Avidin-Biotin Methode und durch anschließende lichtmikroskopische
Auswertung.
Die unreifen Makrophagen (27E10) und die reifen Makrophagen (20F9) repräsentierten in ihrer
Gesamtheit in den tumorumgebenden Geweben, ebenso wie in den Geweben aus den tumorfreien
Kontroll-Lebern, die weitaus größte Gruppe der Abwehrzellen. Für beide Zellarten ließen sich die
deutlichsten Unterschiede zwischen den Tumorleber-Gruppen und den Kontrollen nachweisen. In
den Tumorleber-Gruppen überwogen deutlich die unreifen Makrophagen, während die reifen
Makrophagen reduziert waren.
Unter den leberassoziierten Lymphozyten machten die T-Zellen (CD3) die größte Gruppe aus. Mit
Abstand folgten die NK-Zellen (CD16). Für beide Zelltypen zeichnete sich mit zunehmender
Tumorlast eine leichte Erhöhung ab.
Die Ausbeute an zytotoxischen T-Zellen (CD8) und an B-Lymphozyten (CD20) war gering.
Während jedoch bei den Kontroll-Geweben ausnahmslos ein prozentualer Anteil an den NPLC
errechnet werden konnte, waren diese Zellen in den tumorumgebenden Geweben zumeist nur ganz
vereinzelt oder gar nicht nachweisbar. Auch Aktin-positive und Desmin-positive Ito-Zellen hatten
nur einen geringen Anteil an den identifizierten NPLC. Er lag bei den tumorfreien Kontrollen etwas
höher als in den Tumorleber-Gruppen.
Insgesamt betrachtet zeichnen sich Veränderungen in der Zusammensetzung der NPLC, vor allem
der Abwehrzellen, in tumorerkrankten humanen Lebern ab. Als Hinweis auf eine Metastasierung in
die Leber kann aufgrund der vorliegenden Arbeit eine Erhöhung der Zahl unreifer Makrophagen
bei gleichzeitiger Reduzierung der reifen Makrophagen gewertet werden. Die numerisch geringeren
Veränderungen in der Zusammensetzung der übrigen NPLC in tumorumgebendem Gewebe
bedürfen weiterer Untersuchungen.
58
6
ANHANG
6.1
Abkürzungen
LAL:
Leber-assoziierte Lymphozyten
NPLC:
Nicht-parenchymale Leberzellen
PBL:
Lymphozyten des peripheren Blutes
NK-Zellen:
Natürliche KillerZellen
LAK:
Lymphokin-aktivierte Killerzellen
59
6.2
Verwendete Lösungen
Zusammensetzung der im Text mit " * " gekennzeichneten Lösungen:
Eindecklösung:
80 ml Glycerin (Art.Nr.4094, Merck)
15 ml Phosphatpuffer 0,1 M, pH 7,4
5
ml Glutaraldehyd 25% (Merck)
Einfrierlösung:
31 ml NKH
2,8 ml Glucose 40%
2,0 ml BSA 20%
4,0 ml DMSO
0,4 ml NaN3 10%
Fixierlösung:
90 ml Phosphatpuffer
0,2 ml Glutaraldehyd 25% (Merck)
1,0 g
Glucose (oder 2,5 ml 40%ige Glucoselösung)
Hepespuffer 1M, pH 7,4:
23,83 g
Hepes
80 ml Aqua bidest, pH 7,4 mit NaOH konz. einstellen, auf
1,0 l
Aqua bidest
NKH-Puffer
8,0 g
NaCl
0,4 g
KCl
2,0 ml Hepespuffer1M, pH 7,4, auf
1,0 l
Aqua bidest
Nykodenz:
Zur Herstellung der Nykodenz-Lösung werden pro 50g Nykodenzpulver 172 ml GBSS-4A-Lösung
benötigt, die wie folgt zusammengesetzt ist:
225 mg/l CaCl2 x 2 H20
370 mg/l KCl
210 mg/l MgCl2 x 6 H20
70 mg/l MgSO4 x 7 H2O
150 mg/l Na2HPO4 x 2 H2O
30 mg/l KH2PO4
1090 mg/l Glucose x H2O
237 mg/l NaHCO3
60
6.3
LITERATURVERZEICHNIS
Die gesamte verzeichnete Literatur diente als Grundlage für die Arbeit. Die eingerückte Literatur ist
im Text zitiert.
-
ALPINI G, PHILLIPS J O, VROMAN B, LA RUSSO N F. (1994). Recent advances in the isolation of
liver cells. Hepatology 20:494-514.
BALLARDINI G, GROFF P, DE GIORGI L B, SCHUPPAN D, BIANCHI F B. (1994). Ito cell
heterogeneity: Desmin-negative Ito cells in normal rat liver. Hepatology 19:440-446.
BARLOZZARI T, LEONHARDT J, WILTROUT R H, HERBERMANN R B, REYNOLDS C W. (1985). Direct
evidence for the role of LGL in the inhibition of experimental tumor metastases. J Immunol
134:2783-2789.
-
BARNABA V, FRANCO A, PAROLI M, BENVENUTO R, DE PETRILLO G, BURGIO V L, SANTILIO I,
BALSANO C, BONAVITA M S, CAPPELLI G, COLIZZI V, CUTRONA G, FERRARINI M. (1994).
Selective expansion of cytotoxic T lymphocytes with a CD4+CD56+ surface phenotype and a T
helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with
hepatitis B virus. J Immunol 152:3074-87.
-
BHARDWAY R S, ZOTZ C, ZWADLO-KLARWASSER B, ROTH J, GOEBELER M, MAHNKE K, FALK
M, MEINARDUS-HAGER G, SORG C. (1992). The calcium binding proteins MRP8 and MRP14
form a membrane-associated heterodimer in a subset of monocytes/macrophages present in
acute but absent in chronic inflammatory lesions. Eur J Immunol 22:1891-1897.
-
BIOULAC-SAGE P, BOULARD A, ROSSIGNOL D, BERNARD P, LE BAIL B, QUINTON A, BALABAUD
C. (1988). The increase in the number of liver sinusoidal pit cells in four patients with primary
or metastatic cancer of the liver. J Submicrosc Cytol Pathol. 20(2):335-40.
-
BIOULAC-SAGE P, BALABAUD C. (1992). Proliferation and phenotypic expression of
perisinusoidal cells. J Hepatol 15:284-287.
61
-
BORTOLAMI M, VENTURI C, GIACOMELLI L, SCALERTA R, BACCHETTI S, MARINO F, FLOREANI
A, LISE M, NACCARATO R, FARINATI F. (2002). Cytokine, infiltrating macrophages and T cellmediated response to development of primary and secondary human liver cancer. Dig Liver
Dis. 34(11):794-801.
BOUWENS L, REMELS L, BAEKELAND M, VAN BOSSUYT H, WISSE E. (1987). Large granular
lymphocytes or "Pit cells" from rat liver: isolation,ultrastructural characterization and natural killer
activity. Eur J Immunol 17:37-42.
BOUWENS L. (1988a). Proliferation and phenotypic expression of non-parenchymal liver cells.
Scand J Gastroenterol 23(suppl151):46-51.
-
BOUWENS L. (1988b). Structural and functional aspects of Kupffer cells. Rev Sobre Biol
Celular 16:69-94.
-
BOUWENS L, DE BLESER P, VANDERKERKEN K, GEERTS B, WISSE E. (1992). Liver cell
heterogeneity: Functions of non-parenchymal cells. Enzyme 46:155-168.
-
BRONFENMAJER S, SCHAFFNER F, POPPER H. (1966). Fat-storing cells (lipocytes) in human
liver. Arch Path 82:447-453.
BROUWER A, BARELDS R J, DE LEEUW A M, BLAUW E, PLAS A, YAP S H, VAN DEN BROEK A M W
C, KNOOK D L. (1988). Isolation and culture of Kupffer cells from human liver. Ultrastructure,
endocytosis and prostaglandin synthesis. J Hepatol 6:36-40.
BURT A D, LE BAIL B, BALABAUD C, BIOULAC-SAGE P. (1993). Morphologic investigation of
sinusoidal cells. Semin Liver Dis 13(1):21-38.
-
BURWINKEL F, ROTH J, GOEBELER M, BITTER U, WROCKLAGE V, VOLLMER E, ROESSNER A,
SORG C, BÖCKER W. (1994). Ultrastructural localization of the S-100-like proteins MRP8 and
MRP14 in monocytes is calcium-dependent. Histochemistry 101:113-120.
62
CALIGIURI M A, ZMUIDZINAS A, MANLEY T J, LEVINE H, SMITH K A, RITZ J. (1990). Functional
consequences of Interleukin 2 recetpor expression on resting human lymphocytes. J Exp Med
171:1509-1526.
-
CALIGIURI M A, MURRAY C, ROBERTSON M J, WANG E, COCHRAN K, CAMERON C, SCHOW P,
ROSS M E, KLUMPP T R, SOIFFER R J, SMITH K S, RITZ J. (1993). Selective modulation of
human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant Interleukin
2. J Clin Invest 91:123-132.
-
CLARKSON S B, ORY P A. (1988). CD16. Developmentally regulated IgG Fc-receptors on
cultured human monocytes. J Exp Med 167:408-420.
-
COULEVARD A, SCOAZEC J Y, FELDMANN G. (1993). Expression of cell-cell and cell-matrix
adhesion proteins by sinusoidal endothelial cells in the normal and cirrhotic human liver. Am J
Pathol 143:738-752.
-
CROFTON R W, DIESSELHOF-DEN DULK M C,
VAN
FURTH R. (1978). The origin, kinetics and
characteristics of the Kupffer cells in the normal steady state. J Exp Med 148:1-17.
-
DAVID H, REINKE P. (1987). The concept of „perisinusoidal functional unit“ of the liverimportance to pathological processes. Exp Pathol 32:193-224.
DECKER T, LOHMANN-MATTHES M L, GIFFORD G E. (1987). Cell-associated tumor necrosis factor
(TNF) as a killing mechanism of activated cytotoxic macrophages. J Immunol 138(3):957-962.
-
ENZAN H, HIMENO H, IWAMURA S, ONISHI S, SAIBARA T, YAMAMOTO Y, HARA H. (1994).
Alpha-smooth muscle actin-positive perisinusoidal stromal cells in human hepatocellular
carcinoma. Hepatology 19:895-903.
-
ENZAN H, HIMENO H, IWAMURA S, ONISHI S, SAIBARA T, YAMAMOTO Y, HARA H. (1994).
Immunohistochemical identification of Ito cells and their myofibroblastic transformation in
adult human liver. Virchows Arch. 424(3):249-56.
FAJARDO L F. (1989). Special report. The complexity of endothelial cells. Am J Clin Pathol 92:241250.
63
-
FALINI B, FLENGHI L, PILERI S, GAMBACORTA M, BIGERNA B, DURKOP H, EITELBACH F,
THIELE J, PACINI R, CAVALIERE A, MARTELLI M, CARDARELLI N, SABATTINI E, POGGI S, STEIN
H. (1993). PG-M1: a new monoclonal antibody directed against a fixative-resistant epitope on
the macrophage-restricted form of the CD68 molecule. Am J Pathol 142:1359-1372.
-
FIDLER I J. (1985). Macrophages and metastases - a biological approach to cancer therapy:
presidential address. Cancer Res 45:4714-4726.
FIDLER I J, SCHROIT A J. (1988). Recognition and destruction of neoplastic cells by activated
macrophages: recognition of altered self. Biochim Biophys Acta 948:151-173.
FIDLER I J. (1990). Critical factors in the biology of human cancer metastases: Twenty-eighth
G.H.A. clowes memorial award lecture. Cancer Res 50:6130-6138.
-
FINA L, MOLGAARD H V, ROBERTSON D, BRADLEY N J, MONAGHAN P, DELIA D, SUTHERLAND
D R, BAKER M A, GRAEVES M F. (1990). Expression of the CD34 gene in vascular endothelial
cells. Blood 75(12):2417-2426.
-
FRASER R, DAY W A, FERNANDO N S. (1986). Review: The liver sinusoidal cells. Their role in
disorders of the liver, lipoprotein metabolism and atherogenesis. Pathology 18:5-11.
-
FREUDENBERG N, GALANOS C, DATZ, O, HÄMMERLING G, KATSCHINSKI T H, SCHALK J, PEIN
U, STÜBIG H, FREUDENBERG M A. (1989a). Mechanism of replacement of non-parenchymal
liver cells (NPLC) in murine radiation chimeras. Virchows Arch A Pathol Anat 415:203-209.
-
FREUDENBERG N, SCHALK J, GALANOS C, KATSCHINSKI T, DATZ O, PEIN U, FREUDENBERG M
A. (1989b). Identification and percentage frequency of isolated non-parenchymal liver cells
(NPLC) in the mouse. Virchows Arch B Cell Pathol 57:109-115.
-
FREUDENBERG N, RAHNER P, DARDA C, KISS A, VERES G, NEES T, LAMERS R, RIEDE U N,
KORTSIK C, SCHUBERT M, FRENZER-WELLE K. (1996). Early detection of metastases by
alterations in the cellular immune system in the murine liver and blood. Virchows Arch
428:187-194.
64
-
FREUDENBERG N, FRENZER-WELLE K, AXT H, WOLFF J, WOISETSCHLÄGER M, CHAU K T,
WELLENS E, KORTSIK C, GALANOS C, FREUDENBERG M A. (2001). Maligne Tumorzellen
induzieren mithilfe eines löslichen Faktors Apoptosen von Makrophagen am Zielort der
Metastasierung. Verh. Dtsch. Ges. Zyt. 22:14-16.
FRIEDMANN S L, ROCKEY D C, MCGUIRE R F, MAHER J J, BOYLES J K, YAMASAKI G. (1992).
Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional
characteristics in primary culture. Hepatology 15:234-243.
-
GARCIA-BARCINA M, WINNOCK M, BIDAURRAZAGA I, HUET S, BIOULAC-SAGE P, BALABAUD
C. (1994). Detection of cell-adhesion molecules on human liver-associated lymphocytes.
Immunology 82(1):95-98.
-
GARCIA-BARCINA M, BIDAURRAZAGA I,
NEAUD
V, BIOULAC-SAGE P, BALABAUD C, VIDAL-
VANACLOCHA F, WINNOCK M. (1995). Variations in the expression of cell-adhesion molecules
on liver-associated lymphocytes and peripheral-blood lymphocytes in patients with and without
liver metastases. Int J Cancer 61:475-479.
-
GESSNER J E, GRUSSENMEYER T, KOLANUS W, SCHMIDT R E. (1995). The human low affinity
immunglobulin G Fc receptor III-A and III-B genes. J Biol Chem 270(7):1350-1361.
-
GÖPPINGER S, WOISETSCHLÄGER M, WOLFF J, GRIESBAUM S, FREUDENBERG M A, GALANOS C,
FREUDENBERG N. (2005). Counterattack – ein Prinzip für die Metastasierung bösartiger
Tumoren. Verh. Dtsch. Ges. Zyt. 24:168-169.
-
HACKETT J, BENNETT M, KUMAR V. (1985). Origin and differentiation of natural killer cells. J
Immunol 134(6):3731-3738.
-
HATA K, ZHANG X R, IWATSUKI S,
VAN
THIEL D H, HERBERMANN R B, WHITESIDE T L.
(1990). Isolation, phenotyping and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin
Immunol Immunopathol 56:401-419.
-
HATA K,
VAN
THIEL D H, HERBERMAN R B, WHITESIDE T L. (1991). Natural killer activity of
human liver-derived lymphocytes in various liver diseases. Hepatology 14:495-503.
65
-
HATA K,
VAN
THIEL D H, HERBERMANN R B, WHITESIDE T L. (1992). Phenotype and
functional characteristics of lymphocytes isolated from liver biopsy specimens from patients
with active liver disease. Hepatology 15:816-823.
-
HAUPTMANN S, ZWADLO-KLARWASSER G, KIRKPATRICK C J. (1993). Macrophages and
multicellular tumor spheroids in co-culture: a three-dimensional model to study tumor-host
interactions. Am J Pathol 143(5):1406-1415.
-
HERBERMANN R B, ORTALDO J R. (1981). Natural killer cells: Their role in defense against
disease. Science 214:24-30.
-
HEUFF G, MEYER Y, BEELEN R H J. (1994). Isolation of rat and human Kupffer cells by a
modified enzymatic assay. J Immunol Methods 174:61-65.
-
HORN T, HENRIKSEN J H, CHRISTOFFERSEN P. (1986). The sinusoidal lining cells in „normal“
human liver. Liver 6:98-110.
JAFFE E A. (1987). Cell biology of endothelial cells. Hum Pathol 18:234-239.
-
JOHNKOSKY J A, TZUNG S P, DOERR R J, COHEN S A. (1992). Hepatic metastasis alters the
immune function of murine liver nonparenchymal cells. Arch Surg-Chicago 127:1325-1329.
-
JONES A. (1983). Hepatic sinusoidal cells: new insights and controversies. Hepatology
3(2):259-266.
JONGES G N, VOGELS I M C, BOSCH K S, DINGEMANS K P,
VAN
NOORDEN C J F. (1993).
Experimentally induced colon cancer metastases in rat liver increase the proliferation rate and
capacity for purine catabolism in liver cells. Histochemistry 100:41-51.
-
KAN Z, IVANCEV K, LUNDERQUIST A, MCCUSKEY P A, MCCUSKEY R S, WALLACE S. (1995).
In vivo microscopy of hepatic metastases: Dynamic Observation of tumor cell invasion and
interaction with Kupffer cells. Hepatology 21:487-494.
66
-
KASAHARA T, DJEU J Y, DOUGHERTY S F, OPPENHEIM J J. (1983). Capacity of human large
granular lymphocytes (LGL) to produce multiple lymphonkines: interleukin 2, interferon and
colony stimulating factor. J Immunol. 131(5):2379-85.
-
KASPER H U, DREBBER U, ZUR HAUSEN A, STIPPEL D, DIENES H P, DRIES V. (2003).
Dominance of CD4+ alpha/beta T-cells and inferior role of innate immune reaction in liver
metastases. Anticancer Res. 23(4): 3175-81.
KLEIN E, MANTOVANI A. (1993). Action of natural killer cells and macrophages in cancer. Curr
Opin Immunol. 5:714-718.
-
KOVANEN P E, KNUUTILA S, TIMONEN T. (1995). Requirement of CD4+ lymphocytes in IL-2stimulated NK cell proliferation. Scand J Immunol 41(1):70-76.
-
KUTVIRT S , LEWIS S L, SIMON T L. (1993). Lymphocyte phenotypes in infants are altered by
separation of blood on density gradients. Brit J Biomed Science 50:321-328.
-
KUZU I, BICKNELL R, HARRIS A L, JONES M, GATTER K C, MASON D Y. (1992). Heterogeneity
of vascular endothelial cells with relevance to diagnosis of vascular tumors. J Clin Pathol
45:143-148.
-
LANIER L , LE A M, CIVIN C I, LOKEN M R, PHILLIPS J H. (1986a). The relationship of CD16
(Leu-11) and Leu-19 (NKH*-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and
cytotoxic T lymphocytes. J Immunol 136(12):4480-4486.
-
LANIER L L, PHILLIPS J H, HACKETT J, TUTT M, KUMAR V. (1986b). OPINION Natural killer
cells: Definition of a cell type rather than a function. J Immunol 137:2735-2739.
-
LETTERIO J J, ROBERTS A B. (1998). Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu. Rev.
Immunaol. 16:137-161.
LUKOMSKA B, PIENKOWSKA B, ANDRZEJEWSKI W, OLSZEWSKI W L. (1991). Liver sinusoidal
cytotoxic cells are recruited from blood and divide locally. J Hepatol 12:332-335.
67
-
MAK K M, LIEBER C S. (1988). Lipocytes and transitional cells in alcoholic liver disease: a
morphometric study. Hepatology 8:1027-1032.
-
MANTOVANI A, BOTTAZZI B, COLOTTA F, SOZZANI S, RUCO L. (1992). The origin and function
of tumor-associated macrophages. Immunol Today 13:265-270.
-
MARIANI E, MONACO M C, CATTINI L,
SINOPPI
M, FACCHINI A. (1994). Distribution and lytic
activity of NK cell subsets in the elderly. Mech Ageing Dev. 76(2-3):177-87.
MATHEW J, HINES J E, JAMES O F W, BURT A D. (1994a). Non-parenchymal cell responses in
paracetamol (acetaminophen)-induced liver injury. J Hepatol 20:537-541.
-
MATHEW J, HINES J E, TOOLE K, JOHNSON S J, JAMES O F, BURT A. (1994b). Quantitative
analysis of macrophages and perisinusoidal cells in primary biliary cirrhosis. Histopathology
25:65-70.
-
MCBRIDE W H. (1986). Phenotype and functions of intratumoral macrophages. Biochem
Biophys Acta 865:27-41.
METERISSIAN S, STEELE JR G D, THOMAS P. (1993). Human and murine Kupffer cell function may
be altered by both intrahepatic and intrasplenic tumor deposits. Clin Exp Metastasis 11:175-182.
METTINEN M, LINDENMAYER A E, CHAUBAL A. (1994). The cell markers CD31, CD34, and BNH9
antibody to H- and Y-antigens evaluation of their specifity and sensitivity in the diagnosis of
vascular tumors and comparison with von Willebrand factor. Modern Pathol 7(1):82-90.
-
MIYAGAWA S, MIWA S, SOEDA J, KOBAYASHI A, KAWASAKI S. (2002). Morphometric analysis
of liver macrophages in patients with colorectal liver metastasis. Clin Exp Metastasis.
19(2):119-25.
-
MORETTA L, CICCONE E, POGGI A, MINGARI M C, MORETTA A. (1994). Origin and functions of
human natural killer cells. Int J Clin Lab Res 24:181-186.
68
-
NAGURA H, KOSHIKAWA T, FUKUDA Y, ASAI J. (1986). Hepatic vascular endothelial cells
heterogenously express antigens associated with monocytes, macrophages and T-lymphocytes.
Virchows Arch (Pathol Anat) 409:407-416.
NATHAN C F. (1987). Secretory products of macrophages. J Clin Invest 79:319-326.
-
NONOMURA A, MIZUKAMI Y, MATSUBARA F, KOBAYASHI K. (1991). Clinicopathological study
of lymphocyte attachment to endothelial cells (endothelialitis) in various liver diseases. Liver
11(2):78-88.
-
NUNEZ G, BALL E J, STASTNY P. (1983). Accessory cell function of human endothelial cells. J
Immunol 131:666-673.
-
OHTEKI T, ABO T, SEKI S, KOBATA T, YAGITA H, OKUMARA K, KUMAGAI K. (1991).
Predominant appearance of gamma/delta T lymphocytes in the liver of mice after birth. Eur J
Immunol 21(7):1733-1740.
O`LAUGHLIN S, BRAVERMAN M, SMITH-JEFFERIES
M,
BUCKLEY P. (1992). Macrophages
(Histiocytes) in various reactive and inflammatory conditions express different antigenic
phenotypes. Hum Pathol 23:1410-1418.
-
OKA M, HAZAMA S, SUZUKI M, WANG F X, SHIMODA K, IIZUKA N, WADAMORI K, SUZUKI T,
ATTWOOD S. (1994). Depression of cytotoxicity of nonparenchymal cells in the liver after
surgery. Surgery 116(5):877-882.
-
OSUGI Y, HARA J, KURAHASHI H, SAKATA N, INOUE M, YUMURAYAGI K, KAWAHA K, OKADA
S, TAWA A. (1995). Age-related changes in surface antigens on peripheral lymphocytes of
healthy children. Clin & Exp Immunol 100(3):543-548.
-
PAPA S, GREGORINI A, PASCUCCI E, BARTOLUCCI M, ROCCHI M B L, VALENTINI M. (1994).
Inhibition of NK binding to K562 cells induced by Mab saturation of adhesion molecules on
target membrane. Eur J Histochem 38(Suppl 1):83-90.
69
-
PHILLIPS J H, GEMLO B T, MYERS W W, RAYNER A A, LANIER L L. (1987). In vivo and in vitro
activation of natural killer cells in advanced cancer patients undergoing combined recombinant
interleukin-2 and LAK cell therapy. J Clin Oncol 5(12):1933-1941.
-
PRENDERGAST C G, JAFFEE E M (2007). Cancer Immunotherapy. Immune Suppression and
Tumor Growth. Elsevier.
RAMADORI G. (1991). The stellate cell (Ito-cell, fat-storing cell, lipocyte, perisinusoidal cell) of the
liver. Virch Arch B Cell Pathol 61:147-158.
-
van RAVENSWAAY CLAASEN H H, KLUIN P, FLEUREN G J. (1992). Tumor infiltrating cells in
human cancer. Lab Invest 67(2):166-174.
-
RIEDER H, MEYER
ZUM
BÜSCHENFELDE K-H, RAMADORI G. (1992). Functional spectrum of
sinusoidal endothelial liver cells. J Hepatol 15:237-250.
RITZ J, SCHMIDT R E, MICHON J, HERCEND T, SCHLOSSMANN S F. (1988). Characterization of
functional surface structures on human natural killer cells. Adv Immunol 42:181-211.
ROGOFF T M, LIPSKY P E. (1981). Role of the Kupffer cells in local and systemic immune
responses. Gastroenterology 80:854-860.
RUCK P, XIAO J-C, KAISERLING E. (1995). Immunoreactivity of sinusoids in hepatocellular
carcinoma. Arch Pathol Lab Med. 119:173-178.
SATO K, OHTSUKA K, WATANABE H, ASAKURA H, ABO T. (1993). Detailed characterization of -T
cells within the organs in mice: classsification into three groups. Immunology 80:380-387.
SCHMIDT R E, MURRAY C, DALEY J F, SCHLOSSMANN S F, RITZ J. (1986). A subset of natural killer
cells in peripheral blood displays a mature T cell phenotype. J Exp Med 164:351-356.
-
SCHMITT-GRÄFF A, KRÜGER S, BOCHARD F, GABBIANI G, DENK H. (1991). Modulation of
alpha-smooth muscle actin and desmin expression in perisinusoidal cells of normal and
diseased human livers. Am J Pathol 138:1233-1242.
70
SCOAZEC J Y
AND
FELDMANN G. (1990). Both macrophages and endothelial cells of the human
hepatic sinusoid express the CD4 molecule, a receptor for the human immunodeficiency virus.
Hepatology 12:505-510.
-
SCOAZEC J Y, FELDMANN G. (1991). In situ immunophenotyping study of endothelial cells of
the human hepatic sinusoid: results and functional implications. Hepatology 14:789-797.
-
SCOAZEC J Y, RACINE L, COULEVARD A, FLEJOU J F, FELDMANN G. (1994). Endothelial cell
heterogeneity in the normal human liver acinus: in situ immunhistochemical demonstration.
Liver 14: 113-123.
-
SEKI S, ABO T, MASUDA T, OHTEKI T, KANNO A, TAKEDA K, RIKIISHI H, NAGURA H, KUMAGI
K. (1990). Identification of activated T cell receptor gamma/delta-lymphocytes in the liver of
tumor-bearing hosts. J Clin Invest 86:409-415.
-
SHAW G R, JOHNSON A R, SCHULZ W W, ZAHLTEN R N, BURTON C. (1984). Sinusoidal
endothelial cells from normal guinea pig liver: Isolation, culture and characterization.
Hepatology 4(4):591-602.
-
SHIBUYA A, NAGAYOSHI K, NAKAMURA K, NAKAUCHI H. (1995). Lymphokine requirement for
the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 85(12):
3538-3546.
SHIRATORY Y, NAKATA R, OKANO K, KOMATSU Y, SHIINA S, KAWASE T, SUGIMOTO T, OMATA M,
TANAKA M. (1992). Inhibition of hepatic metastasis of colon carcinoma by asialo GM1-positive
cells in the liver. Hepatology 16:469-478.
SILVERBERG E, LUBERA J. (1989). Cancer statistics. Cancer 37:2-19.
-
SZTARK F, DUBROCA J, LATRY P, QUINTON A, BALABAUD C, BIOULAC-SAGE P. (1986).
Perisinusoidal cells in patients with normal liver histology. J Hepatol 2:358-369.
71
TAKAGI S, KANGNIAN C, SCHWARZ R, IWATSUKI S, HERBERMANN R B, WHITESIDE T L. (1989).
Functional and phenotypic analysis of tumor-infiltrating lymphocytes isolated from human primary
and metastatic liver tumors and cultured in recombinant Interleukin-2. Cancer 63:102-111.
TAKII Y, HASHIMOTO S, IIAI T, WATANABE H, HATAKEYAMA K, ABO T. (1994). Increase in the
proportion of granulated CD56+ T cells in patients with malignancy. Clin & Exp Immunol
97(3):522-527.
-
THURMAN R G, BUNZENDAHL H, LEMASTERS J J. (1993). Role of sinusoidal lining cells in
hepatic reperfusion injury following cold storage and transplantation. Sem Liver Disease
13(1):93-100.
-
TIMONEN T, ORTALDO J R, HERBERMANN R B. (1980) . Characteristics of human large granular
lymphocytes and relationship to natural killer and K cells. J Exp Med 153(3):568-582.
-
TOMITA M, YAMAMOTO K, KOBASHI H, OHMOTO M, TSUJI T. (1994). Immunohistochemical
phenotyping of liver macrophages in normal and diseased human liver. Hepatology 20:317-325.
TRINCHIERI G, PERUSSIA B. (1984). Biology of disease. Human natural killer cells: biologic and
pathologic aspects. Lab Invest 50(5):489-513.
-
TRINCHIERI G, SANTOLI D. (1978). Anti-viral activity induced by culturing lymphocytes with
tumor-derived or virus-transformed cells. Enhancement of human natural killer cell activity by
interferon and antagonistic inhibition of susceptibility of target cells to lysis. J Exp Med
147(5):1314-1333.
TURNER R R, BECKSTEAD J H, WARNKE R A, WOOD G S. (1987). Endothelial cell phenotypic
diversity. Am J Clin Pathol 87:569-575.
-
VANDERKERKEN K, BOUWENS L, VAN ROOIJEN N, VAN DEN BERG K, BAEKELAND M, WISSE E.
(1995). The role of Kupffer cells in the differentiation process of hepatic natural killer cells.
Hepatology. 22(1):283-90.
72
-
VIDAL-VANACLOCHA F, ALONSO-VARONA A, AYALA R, BARBERA-GUILLEM E. (1990).
Functional variations in liver tissue during the implantation process of metastatic tumor cells.
Virchows Archiv A Pathol Anat 416:189-195.
-
WAKE K, DECKER K, KIRN A, KNOOK D L, MCCUSKEY R S, BOUWENS L, WISSE E. (1989).
Cell biology and kinetics of Kupffer cells in the liver. Internat Rev Cytol 118:173-229.
-
WATANABE H, OHTSUKA K, KIMURA M, IKARASHI Y, OHMORI K, KUSUMI A, OHTEKI T, SEKI
S, ABO T. (1992). Details of an isolation method for hepatic lymphocytes in mice. J Immunol
Methods 146:145-154.
-
WHITESIDE T L, MIESCHER S, HURLIMANN J, MORETTA L,
VON
FLIEDNER V. (1986).
Separation, phenotyping and limiting dilution analysis of T-lymphocytes infiltrating human
solid tumors. Internat J Cancer 37(6):803-811.
WILTROUT R , HERBERMANN R B, ZHANG S R, CHIRIGOS M A, ORTALDO J R, GREEN K M,
TALMADGE J E. (1985). Role of organ-associated NK cells in decreased formation of experimental
metastases in lung and liver. J Immunol 134:4267-4275.
-
WILTROUT R H, PILARO A M, GRUYS M E, TALMADGE J E, LONGO D L, ORTALDO J R,
REYNOLDS C W. (1989). Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by
biologic reponse modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes
from the bone marrow. J Immunol 143:372-378.
-
WINNOCK M, LAFON M E, BOULARD A, FERRER A M, SARIC J, DUBUISSON L, BIOULAC-SAGE
P, BALABAUD C. (1991). Characterization of liver-associated natural killer cells in patients with
liver tumors. Hepatology 13:676-682.
-
WINNOCK M, GARCIA-BARCINA M, HUET S, BERNARD P, SARIC J, BIOULAC-SAGE P, GUALDE
N, BALABAUD C. (1993). Functional characterization of liver-associated lymphocytes in
patients with liver metastasis. Gastroenterology 105:1152-1158.
73
-
WINNOCK M, GARCIA-BARCINA M, LUKOMSKA B, HUET S, SARIC J, BALABAUD C, BIOULACSAGE P. (1995). Human liver-associated lymphocytes: an overview. J Gastroenterol & Hepatol
10(suppl 1):43-46.
-
WISSE E, DE ZANGER R B, CHARELS K, VAN DER SMISSEN P, MCCUSKEY R S. (1985). The liver
sieve: Considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the
sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology 5:638-692.
XU Z L, BUCANA C D, FIDLER I J. (1984). In vitro activation of murine Kupffer cells by
lymphokines or endotoxins to lyse syngeneic tumor cells. Am J Pathol 117:372-379.
WISSE E,
VAN’T
NOORDENDE J M,
VAN DER
MEULEN J, DAEMS W T. (1976). The pit cell:
description of a new type of cell occuring in the rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell &
Tissue Res 173(4):423-435.
YONEI Y, KUROSE I, FUKUMURA D, SAIT H, MIURA S, TSUKADA N, ODA M, TSUCHIYA M. (1994).
Evidence of direct interaction between Kupffer cells and colon cancer cells: an ultrastructural study
of the co-culture. Liver 14:37-44.
-
ZWADLO G, BRÖCKER E B,
VON
BASSEWITZ D B, FEIGE U, SORG C. (1985). Amonoclonal
antibody to a differentiation antigen present on mature human macrophages and absent from
monocytes. J Immunol 134(3):1487-1492.
-
ZWADLO G, SCHLEGEL R, SORG C. (1986). A monoclonal antibody to a subset of human
monocytes found only in the peripheral blood and inflammmatory tissues. J Immunol
137(2):512-518.
-
ZWADLO G, BRÜGGEN J, GERHARDS G, SCHLEGEL R, SORG C. (1988). Two calcium-binding
proteins associated with specific stages of myeloid cell differentiation are expressed by subsets
of macrophages in inflammatory tissues. Clin Exp Immunol 72:510-515.
74
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Sonnhild Cordua
Geburtsdatum/-ort
18.10.1969 in Nördlingen
Familienstand
verheiratet, 1 Kind
Eltern
Peter Cordua, Arzt
Dr. Christiane Caspers, Psychologin
Schulausbildung
1976-1982
Waldorfschule in Freiburg
1982-1989
Kolleg St. Sebastian in Stegen
05/1989
Abitur
Weiterer Werdegang
05/1989-10/1990
Arbeit in verschiedenen Bereichen (Betreuung geistig Behinderter in
England, Krankenpflegepraktika, Arbeit in einer Pension und in der
Landwirtschaft)
10/1990
Beginn des Medizinstudiums in Freiburg
08/1992
Ärztliche Vorprüfung
08/1993
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
08/1996
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
04/1997-04/1998
Praktisches Jahr am Klinikum Konstanz
05/1998
3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
08/1998-01/2000
AIP am Klinikum Konstanz, Abteilung für Innere Medizin
02/2000-05/2006
Facharzt-Weiterbildung Innere Medizin am Klinikum Konstanz
seit 06/2006
Mutterschutz und Elternzeit
02/2008
Anerkennung als Fachärztin für Innere Medizin
75
Danksagung
Mein aufrichtiger Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. h. c. N. Freudenberg für die Überlassung des
interessanten Themas und für die engagierte Betreuung meiner Arbeit.
Weiterhin danke ich herzlich Herrn PD Dr. R. Fischer für die zweite Begutachtung der Arbeit.
Mein Dank gebührt auch Frau M. Kremer vom Pathologischen Institut, Herrn Dr. St.
Klessinger und Herrn F. Schirvani für ihre Unterstützung.