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Aus der Universitäts-Augenklinik der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Neuroprotektion mit dem
Neuropeptid NAP
nach Sehnervenquetschung
und
Erhöhung des intraokularen Druckes
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
vorgelegt 2007
von Simone Maria Auer
geboren in Engen
Dekan: Prof. Dr. C. Peters
1. Gutachter: Prof. Dr. W. A. Lagrèze
2. Gutachter: Prof. Dr. S. Rauer
Promotionsjahr 2008
Inhaltsverzeichnis
3
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung .............................................................................................................. 6
1.1 Anatomie von Netzhaut und Sehbahn............................................................... 6
1.2 Erkrankungen der retinalen Ganglienzellen ...................................................... 8
1.3 Tiermodelle für den Ganglienzellverlust ............................................................ 9
1.4 Neuroprotektion und Apoptose ....................................................................... 10
1.5 NAP und neuroprotektive Peptide ................................................................... 15
1.6 Fragestellung .................................................................................................. 18
2. Materialien und Methoden ................................................................................. 19
2.1 Materialien ...................................................................................................... 19
2.1.1 Erzeugung der Narkose............................................................................ 19
2.1.2 Retrogrades Markieren der Ganglienzellen .............................................. 19
2.1.2.1 Herstellung der Fluorogoldlösung ...................................................... 19
2.1.2.2 Stereotaktische Injektion .................................................................... 19
2.1.3 Schädigung des Sehnerven ..................................................................... 20
2.1.3.1 Sehnervenquetschung ....................................................................... 20
2.1.3.2 Netzhautischämie .............................................................................. 20
2.1.4 Behandlung mit Medikamenten ................................................................ 21
2.1.4.1 Ansetzen der entsprechenden Dosierungen ...................................... 21
2.1.4.2 Intraperitoneale Injektion.................................................................... 21
2.1.5 Gewinnung der Netzhäute und Sehnerven............................................... 22
2.1.5.1 Perfusion der Ratten .......................................................................... 22
2.1.5.2 Entnahme und Behandlung der Augen und Sehnerven..................... 22
2.1.5.3 Erstellung der Netzhautflachpräparate............................................... 23
2.1.6 Auswertung der Netzhautflachpräparate .................................................. 23
2.1.7 Erstellen der Semidünnschnitte ................................................................ 23
2.1.7.1 Vorbehandlung der Sehnerven .......................................................... 23
2.1.7.2 Einbettung in Kunststoff ..................................................................... 24
2.1.7.3 Anfertigung der Semidünnschnitte ..................................................... 24
2.1.8 Immunhistochemie ................................................................................... 25
2.1.8.1 Erstellen der Paraffinschnitte ............................................................. 25
Inhaltsverzeichnis
4
2.1.8.2 Immunhistochemische Färbung ......................................................... 25
2.1.9 Auswertung Semidünnschnitte ................................................................. 26
2.2 Methoden ....................................................................................................... 27
2.2.1 Versuchstiere............................................................................................ 27
2.2.2 Erzeugung der Narkose............................................................................ 27
2.2.3 Retrogrades Markieren der Ganglienzellen .............................................. 28
2.2.3.1 Herstellung Fluorogoldlösung ............................................................ 28
2.2.3.2 Auflegen von Gelatineplättchen auf die Colliculi superiores .............. 28
2.2.3.3 Stereotaktische Injektion von Fluorogold ........................................... 29
2.2.4 Schädigung des Sehnerven ..................................................................... 30
2.2.4.1 Kalibrierte Sehnervkompression ........................................................ 30
2.2.4.2 Netzhautischämie durch Erhöhung des Augeninnendruckes............. 31
2.2.5 Behandlung mit entsprechenden Medikamenten...................................... 32
2.2.5.1 Ansetzen der entsprechenden NAP-Lösung ...................................... 32
2.2.5.2 i.p.-Injektion der Medikamente ........................................................... 33
2.2.6 Gewinnung der Netzhäute und Sehnerven............................................... 33
2.2.6.1 Perfusion............................................................................................ 33
2.2.6.2 Entnahme und Behandlung der Augen und Sehnerven..................... 34
2.2.6.3 Präparation der Netzhäute ................................................................. 34
2.2.7 Histologische Aufarbeitung der Präparate ................................................ 36
2.2.7.1 Anfertigung von Semidünnschnitten in Kunststoff.............................. 36
2.2.7.1.1 Vorbehandlung der Sehnerven.................................................... 36
2.2.7.1.2 Einbettung in Kunststoff............................................................... 36
2.2.7.1.3 Anfertigung der Semidünnschnitte .............................................. 37
2.2.7.2 Immunhistochemie an Paraffinschnitten ............................................ 37
2.2.8 Auswertung............................................................................................... 39
2.2.8.1 Netzhautflachpräparate...................................................................... 39
2.2.8.2 Semidünnschnitte .............................................................................. 40
3. Ergebnisse .......................................................................................................... 41
3.1 Retrograde Markierung der Ganglienzellen .................................................... 41
3.2 Morphologie der Netzhautflachpräparate ........................................................ 41
3.2.1 Netzhautflachpräparate in unterschiedlicher Vergrößerung ..................... 41
Inhaltsverzeichnis
5
3.2.2 Morphologie der retinalen Ischämie und Sehnervenquetschung .............. 43
3.2.3 Morphologie der verschiedenen Zellpopulationen .................................... 43
3.3 Schädigungsmodelle....................................................................................... 44
3.3.1 Retinale Ischämie durch Ligatur der A. centralis retinae .......................... 44
3.3.2 Sehnervenquetschung.............................................................................. 44
3.3.2 Korrelation retinaler Ganglienzellen und aktivierter Gliazellen ................. 47
3.4 Neuroprotektion mit NAP ................................................................................ 48
3.4.1 NAP bei erhöhtem intraokularen Druck .................................................... 48
3.4.2 NAP bei der Sehnervenquetschung ......................................................... 49
3.5 Semidünnschnitte der Sehnerven ................................................................... 51
3.5.1 Morphologie.............................................................................................. 51
3.5.2 Qualitative Auswertung............................................................................. 52
3.6 Immunhistologische Auswertung der Sehnerven ............................................ 53
4. Diskussion .......................................................................................................... 54
4.1 Retrograde Markierung der Ganglienzellen .................................................... 54
4.2 Auswertung der Netzhautflachpräparate......................................................... 56
4.2.1 Ganglienzellen.......................................................................................... 56
4.2.2 Gliazellen.................................................................................................. 56
4.3 Schädigungsmodelle....................................................................................... 57
4.3.1 Retinale Ischämie durch Ligatur der A. centralis retinae .......................... 58
4.3.2 Retinale Ischämie durch erhöhten intraokularen Druck ............................ 59
4.3.3 Sehnervenquetschung.............................................................................. 60
4.4 Neuroprotektion mit NAP ................................................................................ 62
4.5 Semidünnschnitte vom Sehnerven.................................................................. 64
4.6 Immunhistochemische Aufarbeitung ............................................................... 65
4.7 Ausblick........................................................................................................... 66
5. Zusammenfassung ............................................................................................. 68
6. Literaturverzeichnis............................................................................................ 69
7. Danksagung ........................................................................................................ 76
8. Lebenslauf........................................................................................................... 77
6
Einleitung
1. Einleitung
Bereits im antiken Griechenland befassten sich Gelehrte mit Funktion und Aufbau
des Sehnerven. Diese Erkenntnisse beeinflussten Theorien zur Entstehung von
Sehnervenerkrankungen bis ins frühe 20. Jahrhundert.
Im Zuge der Entwicklung der Mikroskopie durch Jackson Lister, etwa um 1820 und
der Histologie wurde im späten 19. Jahrhundert zum ersten Mal postuliert, dass
Sehnervenfasern und Ganglienzellen durch Krankheiten wie das Glaukom vermindert
werden. Lange Zeit wurden Erkrankungen, auch die des Sehnerven, durch ein
Ungleichgewicht
des
Körpers
und
der
Psyche
erklärt.
Dies
führte
zu
Therapieempfehlungen wie beispielsweise der von Georg Joseph Beer (1763-1821),
der seinen Patienten zu Ausritten, Billard und Kricket riet, um das Sehen nach
„extremer Anspannung des Sehnerven“ zu entspannen [Reeves und Taylor, 2004].
Zwar wissen wir heute mehr über Ursachen und Pathophysiologie verschiedener
Sehnervenerkrankungen als zur damaligen Zeit, trotzdem stehen außer der Senkung
des Augeninnendruckes beim Glaukom keine Behandlungsoptionen zur Verfügung.
In
Süddeutschland
sind
Optikusatrophien
mit
dem
Glaukom
nach
Makuladegeneration die zweithäufigste Erblindungsursache [Trautner, Haastert et al.,
2003].
In Irland stellt das Glaukom die zweithäufigste Erblindungsursache nach der
Makuladegeneration dar [Kelliher, Kenny et al., 2006]. Die Chennai Glaukom Studie
untersuchte Erblindungsursachen der ländlichen Bevölkerung Südindiens. Sowohl
beim einseitigen als auch beim beidseitigen Sehverlust steht das Glaukom an zweiter
Position nach der Katarakt [Vijaya, George et al., 2006].
1.1 Anatomie von Netzhaut und Sehbahn
Die Retina gliedert sich von außen nach innen in die äußeren und inneren Segmente
der Photorezeptoren, welche die äußere Körnerzellschicht (ONL) bilden (1. Neuron
der Sehbahn), die äußere plexiforme Schicht (OPL), die innere Körnerzellschicht
(INL) mit bipolaren und amakrinen Zellen und Horizontalzellen (2. Neuron der
7
Einleitung
Sehbahn), die innere plexiforme Schicht (IPL), die Ganglienzellschicht (GCL) (3.
Neuron der Sehbahn). Daran schließen sich die Axone der Ganglienzellen als
Nervenfaserschicht (NFL) an. Diese ziehen als Nervus opticus zum Chiasma opticum
und kreuzen. Von dort ziehen die Axone als Tractus opticus ins Mittelhirn zum
Corpus geniculatum laterale. Die Axone des zentralen Neurons gehen von dort aus
als Gratiolet-Sehstrahlung zum Okzipitalpol.
Bei der Ratte kreuzen nahezu alle Axone auf die Gegenseite, etwa 5% projizieren
sich auf die ipsilaterale Seite. Einige Kolateralen stehen in Verbindung mit dem
Nucleus suprachiasmaticus, ungefähr 30% der Axone mit dem Corpus geniculatum
laterale und weniger als 15% der Axone ziehen weiter ins Prätektum. Der Großteil
der Axone endet im Colliculus superior [Heiduschka, Fischer et al., 2004]. Die
Colliculi superiores sind die Hauptprojektionsgebiete der retinalen Ganglienzellen.
Die
Zellkörper
der
Ganglienzellen
können
mittels
Injektion
eines
Fluoreszenzfarbstoffs durch aktiven retrograden Transport angefärbt werden.
Die Blutversorgung der Netzhaut wird durch zwei Blutgefäßsysteme gewährleistet.
Die inneren Netzhautanteile werden über die A. centralis retinae, die äußeren
Anteile, auch die Photorezeptoren über die Aa. choroideae versorgt.
Neben den beschriebenen Zellen existiert eine weitere Zellpopulation in der Retina,
die Gliazellen. Mikroglia sind ubiquitär in der menschlichen Retina vorhanden und
gehören zwei verschiedenen Subtypen an [Bodeutsch und Thanos, 2000; Thanos,
Fischer et al., 2000]. Von einer Zellpopulation wird angenommen, dass diese
Gliazellen in den frühen Entwicklungsstufen des Mesenchyms in die Netzhaut
eintreten und später in den Zellschichten ruhen. Von der anderen Zellpopulation wird
vermutet, dass sie Abkömmlinge von Blutzellen, möglicherweise von Perizyten der
Gefäße sind. Beide Zellarten können Funktion als Makrophagen aufnehmen und zur
Phagozytose degenerierter retinaler Neurone stimuliert werden [Boycott und
Hopkins, 1981].
Gliazellen spielen eine fundamentale Rolle bei Transportvorgängen im zentralen
Nervensystem, bei der Ernährung der Nervenzellen und bei der Immunabwehr.
Reizung und Verletzung des Sehnerven führen zu ihrer Proliferation. Unter
8
Einleitung
physiologischen Bedingungen unterstützen Gliazellen die neuronale Funktion durch
Entfernung von extrazellulärem Glutamat und Synthese von Wachstumsfaktoren.
Erhöhte Aktivität von Gliazellen kann Schäden an Neuronen durch Freisetzung von
Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies oder Stickstoffmonoxid begünstigen [Kuehn,
Fingert et al., 2005].
Abbildung 1: Querschnitte durch Netzhäute von Ratten, links normales Auge, Nervenfaserschicht
(Stern) und Ganglienzellschicht (Pfeile) sind eindeutig zu identifizieren, rechts Netzhaut nach
Erhöhung des Augeninnendruckes, beide Schichten fehlen [Morrison, Moore et al., 1997]
1.2 Erkrankungen der retinalen Ganglienzellen
Retinale Ganglienzellen und ihre Axone gehen beim Glaukom, der Neuritis nervi
optici sowie bei anderen Optikusneuropathien durch gesteigerte Apoptose (siehe
unten) zugrunde [Quigley, Nickells et al., 1995; McKinnon, Lehman et al., 2002].
Äußere Faktoren wie Hypoxie, Unterversorgung mit trophischen Faktoren im
Rahmen einer Minderperfusion, Bildung freier Radikale und bestimmte Aminosäuren
beeinflussen dies [Schmidt, 2004]. Bei Ischämie und Hypoxie setzen Ganglienzellen
vermehrt Glutamat frei und reagieren besonders empfindlich gegenüber dieser
erregenden Aminosäure
[Osborne, Chidlow et al., 2004]. Traumatisierung des
Sehnerven führt ebenfalls zu einer vermehrten Ausschüttung von Glutamat [Vorwerk,
Zurakowski et al., 2004]. Die Überstimulation der Glutamatrezeptoren führt zu
vermehrtem Kalziumeinstrom in die Zelle, zur Bildung freier Radikale und kann somit
die Apoptose induzieren [Schmidt 2004].
9
Einleitung
Ziel der Forschung ist es, durch verschiedene Modelle Annährungen an die
Vorgänge beim Ganglienzelluntergang zu schaffen, um diese zu untersuchen und
therapeutische Interventionsmöglichkeiten zu entwickeln.
1.3 Tiermodelle für den Ganglienzellverlust
Der Untergang retinaler Ganglienzellen kann sowohl durch Schädigung des
Zellkörpers, als auch des Axons stattfinden. Aus diesem Grund sind unterschiedliche
Modelle notwendig, welche die entsprechenden pathophysiologischen Ereignisse
simulieren.
Ratten werden aufgrund ihrer einfachen Haltung und Handhabung und der guten
Zugangswege zum Sehnerven und Colliculus superior verwandt. Physikalische
Läsionen des Sehnerven sind oftmals Folge eines Schädel-Hirn-Traumas. Die
Prognose einer traumatischen Optikusneuropathie ist noch immer schlecht. Modelle
der traumatischen optischen Neuropathie sind einerseits die Axotomie, bei der der
Sehnerv unter Erhaltung der Sehnervenscheide mit den okularen Gefäßen
vollständig durchtrennt wird. Alternativ kann der Sehnerv mit einer kalibrierten
Pinzette in unterschiedlichem Ausmaß gequetscht werden [Levkovitch-Verbin, 2004].
Schwartz et al. [Schwartz, 2004] entwickelten ein Modell der Sehnervenquetschung
an der Ratte, was es ermöglicht, das posttraumatische Schädigungsausmaß, die
vermittelnden
Substanzen
und
mögliche
neuroprotektive
Substanzen
zu
untersuchen.
Im Modell der akuten Erhöhung des intraokularen Drucks und der damit verbundenen
Netzhautischämie bei Ratten können durch die Ähnlichkeit der Struktur und
Vaskularisierung des Sehnerven der Ratte nützliche Vergleiche gezogen und
Einblicke in das Geschehen des Sehnervenschadens beim humanen Glaukom
genommen werden [Morrison, 2005]. Das Rattenmodell dient vor allem der
Untersuchung der zellulären Veränderungen der druckinduzierten optischen
Neuropathie und potenziellen neuroprotektiven Ansätzen [Levkovitch-Verbin, 2004].
Genetische Untersuchungen werden eher an Mäusen durchgeführt, da hier die
Möglichkeit besteht, genetische Manipulationen zu erzeugen und zu bewerten.
10
Einleitung
Der
Vorteil
von
Primatenmodellen
liegt
in
der
großen
phylogenetischen
Verwandtschaft und Homologie zum Menschen. Die Anatomie von Netzhaut und
Sehnerv ist nahezu identisch zu der des Menschen. Allerdings sind Primaten teuer in
Anschaffung und Haltung und es erfordert spezialisierte Forscherteams und
besonderen logistischen Aufwand, Untersuchungen an ihnen durchzuführen
[Levkovitch-Verbin, 2004].
1.4 Neuroprotektion und Apoptose
Der Begriff „Neuroprotektion“ beschreibt den Versuch mittels Pharmaka den
Untergang von Neuronen zu verlangsamen oder zu verhindern. Durch die enge
Verwandtschaft von Retina und Sehnerv mit dem zentralen Nervensystem, lassen
sich allgemeingültige Prinzipien der Neuroprotektion in die Augenheilkunde
übertragen
[Lagrèze,
2001].
Bezogen
auf
die
Glaukomtherapie
beschreibt
Neuroprotektion den Versuch, den Untergang retinaler Ganglienzellen zu verhindern
oder zu verzögern und die Regeneration bereits geschädigter Ganglienzellen zu
fördern [Mittag und Schmidt, 2004].
Die Reaktionen des Nervensystems auf Schädigung beinhalten zahlreiche
Mechanismen, darunter die Änderung der extrazellulären Ionenkonzentrationen, die
Freisetzung
reaktiver
Sauerstoffspezies
und
freier
Radikale,
entzündliche
Veränderungen und die Freisetzung erregender neurotoxischer Aminosäuren.
Es existiert bereits eine Vielzahl an Substanzen, die sich in vitro und in vivo als
potenziell neuroprotektiv erwiesen haben.
Betablocker zeigen neuroprotektive Eigenschaften nach topischer Applikation im
Modell der Ischämie und der Exzitotoxizität. Dies geschieht mittels Verminderung des
Natrium-
und
Calciumeinstromes
in
die
Zelle
durch
Interaktion
mit
spannungsabhängigen Natriumkanälen [Chidlow, Melena et al., 2000]. Der Beta-1
selektive Blocker Betaxolol zeigte seine neuroprotektive Potenz sowohl in vivo, als
auch in vitro. Die beiden unselektiven Betablocker Metipranolol und Timolol sind in
der Lage, den Zelluntergang in Neuronenkulturen zu vermindern [Wood, Schmidt et
al., 2003]. Timolol vermindert nach Erhöhung des intraokularen Druckes den
Ganglienzelluntergang [Goto, Ota et al., 2002].
11
Einleitung
Vorbehandlung
mit
alpha-2
Rezeptoragonisten,
beispielsweise
Brimonidin,
verhinderte im Modell der transienten Netzhautischämie den Verlust retinaler
Ganglienzellen [Vidal-Sanz, Lafuente et al., 2001]. Zudem senkte Brimonidin am
Rattenmodell den intraokularen Druck und reduzierte sekundäre Schädigungen nach
traumatischer Läsion des Sehnerven. Weiterhin zeichnet sich Brimonidin durch
geringe Toxizität aus [Burke und Schwartz, 1996]. Eine Wirkungsweise der alpha-2
Rezeptoragonisten besteht in Verhinderung der Akkumulation von extrazellulärem
Glutamat und Aspartat [Donello, Padillo et al., 2001].
Öffner ATP-sensitiver Kaliumkanäle, Gabapentin und Gabapentin-Laktam sind in der
Lage, die Ausschüttung der neurotoxischen Aminosäure Glutamat zu vermindern.
Allerdings erwies sich Gabapentin in vivo nicht als neuroprotektiv [Jehle, Feuerstein
et al., 2001]. Gabapentin-Laktam zeigte hingegen im Modell der Netzhautischämie
durch erhöhten intraokularen Druck neuroprotektive Potenz [Jehle, Lagrèze et al.,
2000]. Untersuchungen an Kulturen retinaler Ganglienzellen zeigten einen positiven
Effekt von Gabapentin-Laktam, nicht jedoch von Gabapentin auf das Überleben der
Zellen [Pielen, Kirsch et al., 2004]. In Retinae von Ratten, die eine Quetschung des
Sehnerven erfahren haben, wurde eine geringere Konzentration eines retinalen
Glutamattransporters gefunden, was zur Akkumulation von Glutamat und somit zur
Störung der Glutamat-Homöostase führt [Mawrin, Pap et al., 2003]. Vor dem
Hintergrund, dass bereits gering erhöhte Konzentrationen der exzitatorischen
Aminosäure Glutamat toxische Wirkung auf Nervenzellen besitzen, wurde die
neuroprotektive Potenz von Antagonisten exzitatorischer Aminosäuren untersucht
[Vorwerk, Lipton et al., 1996]. Antagonisten am N-methyl-D-aspartat (NMDA)
Rezeptor zeigen eine Verminderung des Zelluntergangs nach ischämischer
Netzhautschädigung [Funk und Schmidt, 2004]. Durch die Ischämie steigt die
Konzentration von Glutamat und Glycin, beide Agonisten am NMDA-Rezeptor.
Systemische Verabreichung des NMDA-Rezeptorantagonisten Memantin zeigt
protektive Wirkung [Lagrèze, Knorle et al., 1998]. Ebenso wirksam erwies sich
Dizocilpin bei erhöhtem intraokularen Druck [Gu, Yamamoto et al., 2000]. Weiterhin
zeigten Cerestat, ebenfalls ein NMDA-Rezeptorantagonist und Riluzol, ein
12
Einleitung
Hemmstoff der Glutamatfreisetzung bei Netzhautischämie eine Reduktion des
Ganglienzelluntergangs [Lagrèze, Otto et al., 1999].
Stickstoffmonooxid (NO) vermittelt möglicherweise die Toxizität von Glutamat bei
ischämischer Schädigung der Netzhaut [Adachi, Kashii et al., 1998].
Durch Schädigung des Sehnerven und bei Ischämie werden Astrozyten und
Mikroglia aktiviert, die in der Lage sind, toxische Substanzen, darunter auch NO
freizusetzen. Dies scheint ein wesentlicher Faktor des Ganglienzelluntergangs beim
Glaukom zu sein [Osborne, Chidlow et al., 2004]. Im Glaukommodell an der Ratte
konnten durch einen Hemmstoff der induzierbaren NO-Synthase [Neufeld, 2004;
Neufeld, Das et al., 2002] neuroprotektive Effekte erreicht werden.
Neuere Untersuchungen zeigten, dass Exposition einer intakten Retina gegenüber
Glutamat und NMDA zum schnellen und großen Verlust der amakrinen Zellen führt,
die
Ganglienzellen
sind
jedoch
nicht
betroffen.
Also
sind
Ganglienzellen
unempfindlicher gegenüber Glutamat- und NMDA-vermittelter Exzitotoxizität [Ullian,
Barkis et al., 2004].
Einstrom von Natriumionen in die Zelle führt zur Depolarisation und damit zur
Erregung der Zelle. Phenytoin, ein Blocker des Natriumkanals vermindert den
Untergang retinaler Ganglienzellen nach partieller Schädigung des Sehnerven.
Hierbei wurde beobachtet, dass sowohl Phenytoin, als auch Memantin den Influx von
Calcium, wie er beispielsweise durch Glutamat vermittelt wird, vermindern [Naskar,
Quinto et al., 2002].
Vor dem Hintergrund, dass sowohl bei Glutamat-vermittelter Neurotoxizität, als auch
bei retinaler Ischämie eine erhöhte intrazelluläre Calciumkonzentration vorhanden ist,
wurden Calciumkanalblocker hinsichtlich ihrer neuroprotektiven Wirkung untersucht.
Calcium ist ein bedeutsames Ion in der Steuerung unterschiedlichster Zellfunktionen.
Durch
dessen
intrazelluläre
Akkumulation
werden
diverse
Botenfunktionen
beeinträchtigt. Es kommt zur Freisetzung von Transmittern, die den Calciuminflux
begünstigen und somit zur weiteren Überladung der Zelle mit Calcium beitragen
können [Funk und Schmidt, 2004].
13
Einleitung
Behandlung mit dem Calciumantagonisten Diltiazem wirkte neuroprotektiv bei
ischämischer Schädigung und nach Inkubation von Ganglienzellen mit Glutamat
[Vallazza-Deschamps,
Fuchs
et
al.,
2005].
Topische
Applikation
des
Caliciumkanalblockers Flunarizin führt zur Reduktion des intraokularen Druckes und
vermindert den Ganglienzelluntergang [Osborne, Wood et al., 2002].
Gemeinsame Endstrecke vieler neuroprotektiver Mechanismen ist die Hemmung des
programmierten
Untergangs
von
Zellen.
Dieser
Zelltod
ohne
begleitende
Entzündungsreaktion wird als Apoptose bezeichnet. Physiologischerweise tritt sie in
der Embryonalentwicklung, nach Beendigung der biologischen Funktion einer Zelle,
nach Mutationen oder bei Zellschäden auf. Die Apoptose stellt einen hochgradig
regulierten, fundamentalen Prozess in der Homöostase von Geweben des adulten
Organismus
dar.
Zudem
wurde
gezeigt,
dass
sie
bei
zahlreichen
Sehnervenerkrankungen wie z.B. beim Glaukom, der Neuritis nervi optici sowie den
ischämischen,
traumatischen
und
hereditären
Optikusneuropathien
für
den
Untergang retinaler Ganglienzellen und ihrer Axone verantwortlich ist [Quigley,
Nickells et al., 1995; McKinnon, Lehman et al., 2002].
1972 beschrieben die Forscher Kerr, Wyllie und Currie erstmals den Ablauf der
Apoptose. Die Wissenschaftler Sydney Brenner, H. Robert Horvitz und John E.
Sulston erhielten 2002 den Nobelpreis für Medizin für ihre Entdeckungen zur
genetischen Regulation der Organentwicklung und des programmierten Zellsterbens.
Zwei unterschiedliche, zur Apoptose führende Signalwege sind bekannt. Zum einen
extrinsisch, über Bindung jeweiliger Liganden an ihre entsprechenden sogenannten
Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche. Beteiligt sind beispielsweise der FASRezeptor (Apo I oder CD95 ) und TNF related apoptosis-inducing ligand oder Apo II
(TRAIL). Die Bindung führt zur Aktivierung des Death-inducing signalling Complex
(DISC) und damit zur Aktivierung der Procaspase 8. Dies mündet zuletzt in
Aktivierung der Caspase 3. Caspasen sind Zystinproteasen, die einen Prozess
katalysieren, der schließlich zu DNA-Fragmentierung und Zelldegradation führt. Der
extrinsische
Signalweg
ist
vor
allem
Gewebegleichgewichtes von Bedeutung.
bei
der
Aufrechterhaltung
des
Einleitung
14
Abbildung 2: Extrinsischer Signalweg der Apoptose, vermittelt über Rezeptorbindung
Zum anderen wird die Apoptose intrinsisch über die Mitochondrien vermittelt. Dies
geschieht vorwiegend als Reaktion auf extrazelluläre Störungen, aber auch bei
intrazellulären Ereignissen wie DNA-Schädigung. Reguliert wird dieser Signalweg
durch die BH3-Proteine (z.B. Bid, Bim, Bmf, Bad), die ihrerseits pro- und
antiapoptotische Proteine der B-Cell-Lymphom (bcl-2) Familie (z.B. Bax, Bak)
beeinflussen. Diese wiederum sind in der Lage, die Permeabilität der äußeren
Mitochondrienmembran (Mitochondrial outer Membrane Permeabilization = MOMP)
zu beeinflussen. Dies führt zum Zusammenbruch des Spannungsgradienten über der
mitochondrialen Membran. Es kommt es zur Freisetzung von Cytochrom C, welches
an den apoptotischen Protease-Aktivierungsfaktor-1 (Apaf-1) bindet. Durch diese
Bindung erfolgt eine Konformationsänderung von Apaf-1
und die Caspase-
Rekrutierungs-Domäne (CARD) zur Bindung an Procaspase 9 wird frei.
Der
Komplex aus Apaf-1, Cytochrom C und Procaspase 9 wird als Apoptosom
bezeichnet und entspricht der aktiven Caspase 9. Letztlich erfolgt die Aktivierung der
Caspase 3 und somit die Apoptose [Fadeel und Orrenius, 2005; Beere, 2005].
Einleitung
15
Abbildung 3: Intrinsicher Signalweg der Apoptose, mitochondrial vermittelt
1.5 NAP und neuroprotektive Peptide
Endogen produzierte neurotrophe Peptide und Proteine beeinflussen Differenzierung
und Überleben von Nervenzellen. Bisher bekannt sind unter anderem der nerve
growth factor (NGF) [Levi-Montalcini und Angeletti, 1968], der glial cell line-derived
neurotrophic factor (GDNF) [Lin, Doherty et al., 1993], der ciliary neurotrophic factor
(CNTF) [Leibrock, Lottspeich et al., 1989], das Neurotrophin-3 (NT-3), der brainderived neurotrophic factor (BDNF) [Cheng und Mattson, 1994], der pigmentepithelium-derived factor (PEDF) [Tombran-Tink und Barnstable, 2003] und der lens
epithelium-derived growth factor (LEDGF) [Inomata, Hirata et al., 2003].
Das neurotrophe vasoaktive intestinale Polypeptid (VIP) ist ein bedeutsames
regulatorisches Peptid im Zentralnervensystem und von enormer Bedeutung für die
Funktion des Gehirns [Gozes, Shani et al., 1987]. Es ist in der Lage, zentralnervöse
Neurone vor neurotoxischen Einflüssen zu bewahren. Intranasale Applikation zeigt
neuroprotektive Effekte im Modell des alzheimerinduzierten Zelluntergangs [Gozes,
Bardea et al., 1996]. In Neuronenkulturen konnte nachgewiesen werden, dass durch
16
Einleitung
VIP stimulierte Astrogliazellen activity-dependent neurotrophic factor (ADNF)
freisetzen und somit die neuronale Differenzierung einleitet wird. ADNF stimuliert die
Bildung
von
Neurotrophin-3,
beide
Proteine
wirken
regulatorisch
auf
Glutamatrezeptoren [Blondel, Collin et al., 2000]. Die Expression von VIP in retinalen
Amakrinzellen wird durch Brain-derived neurotrophic-factor (BDNF) reguliert
[Cellerino, Arango-Gonzalez et al., 2003]. VIP beeinflusst die Gliazellen in der
Sekretion
von
neuroprotektiven
Substanzen.
Darunter
activity-dependent
neurotrophic factor (ADNF), mit seinen potenteren Bestandteilen ADNF-14 und
ADNF-9 und activity-dependent neuroprotective peptide (ADNP).
Die Konzentration von ADNP erhöhte sich nach Schädigung des Gehirns und führte
zu
der
Annahme,
dass
es
ein
Bestandteil
eines
endogenen
Kompensationsmechanismus nach Verletzung des Nervensystems darstellt. An
Untersuchungen
von
Neuronenkulturen
konnte
ein
protektiver
Effekt
von
rekombinantem ADNP gegenüber oxidativem Stress, ausgelöst durch Beta-Amyloid
und H2O2 aufgezeigt werden. Dies ging mit einer signifikanten Abnahme der
intrazellulären p53 Expression einher [Steingart und Gozes, 2006].
ADNF-9
mit
der
Sequenz
SALLRISPA
(Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala)
beeinflusst die Expression von Hitzeschockprotein (HSP) 60. Die Behandlung mit
Beta-Amyloid, welches bei Morbus Alzheimer abgelagert wird, führt zur Absenkung
der Konzentration von HSP 60 [Zamostiano, Pinhasov et al., 1999]. Als Reaktion auf
neuronale Depolarisation wird ADNF-9 von Astrozyten sezerniert und bewirkt einen
Konzentrationsanstieg von nuclear factor-kappa B (NF-kappa B). Dieser führt zu
einer erhöhten Widerstandskraft der Neurone gegenüber apoptotischen Faktoren
[Glazner, Camandola et al., 2000]. Gemeinsam ist diesen vom VIP abstammenden
Substanzen, dass sie ihre Wirkung in extrem geringen Konzentrationen zeigen, was
zum neuen pharmakologischen Ansatz der Neuroprotektion führen kann [Gozes und
Brenneman, 2000].
NAP, ein aus acht Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit der Sequenz
NAPVSIPQ (Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln) ist das kleinste aktive Fragment von
ADNP. Mögliche Signaltransduktionswege von NAP beinhalten Produktion von
Einleitung
17
cGMP [Ashur-Fabian, Giladi et al., 2001] und Interaktionen mit TNFα. Im Modell des
geschlossenen Schädel-Hirn-Traumas an Mäusen, in welchem durch die Gabe von
NAP die Konzentration von TNFα in den verletzten Gehirnarealen abnahm, konnte
eine Reduktion der Mortalität und eine signifikante Erholung des Hirngewebes
beobachtet werden [Beni-Adani, Gozes et al., 2001].
In Neuronenkulturen konnte die protektive Wirkung von NAP gegenüber oxidativem
Stress [Offen, Sherki et al., 2000], Glucosemangel [Zemlyak, Furman et al., 2000],
Beta-Amyloid Toxizität [Bassan, Zamostiano et al., 1999; Zemlyak, Furman et al.,
2000; Ashur-Fabian, Segal-Ruder et al.; 2003], Tetrodotoxin [Brenneman und Eiden,
1986], dem Hüllprotein des HI-Virus [Bassan, Zamostiano et al., 1999] und
Exzitotoxizität von NMDA [Bassan, Zamostiano et al., 1999] gezeigt werden. Die
Wirkung von NAP bei dieser Vielzahl unterschiedlicher Noxen lassen Einflüsse in
allgemeinen Prozessen des Zelluntergangs vermuten. Die Signaltransduktionswege
beinhalten cGMP-Produktion [Ashur-Fabian, Giladi et al., 2001], Interaktionen mit
Tumor-Nekrose-Faktor α und Entzündungsmechanismen. Verabreichung von NAP
führt nach geschlossenem Schädelhirntrauma zu einer verminderten Expression des
Komplementrezeptors 3 (Mac 1) [Zaltzman, Alexandrovich et al., 2005].
Nach Schlaganfällen reduziert Injektion von NAP das Ausmaß der motorischen
Behinderung und die Infarktgrösse. Langzeitstudien an Tieren zeigen sowohl
signifikante Verminderung der Infarktgröße und Behinderung, als auch eine
Reduktion der apoptotischen Zellen [Leker, Teichner et al., 2002].
Auch in einem Apolipoprotein E-Mangel Modell zeigte sich nach subkutaner Injektion
die günstige Wirkung von NAP auf Reflexentwicklung und Kurzzeitgedächtnis
[Bassan, Zamostiano et al., 1999]. Ebenfalls wirksame Applikationswege von NAP
sind intranasale [Gozes und Brenneman, 2000] und intraperitoneale Injektion [BeniAdani, Gozes et al., 2001].
Das Schlüsselprotein der Apoptose p53 wurde als Zielprotein von NAP identifiziert
[Gozes, Steingart et al., 2004]. Ebenso interagiert NAP nach Überwindung der
Plasmamembran mit Tubulin und beeinflusst die Reorganisation von Mikrotubuli.
Diese sind Bestandteile des Zytoskeletts und verantwortlich für Zellteilung und
18
Einleitung
Differenzierung [Divinski, Mittelman et al., 2004; Holtser-Cochav, Divinski et al.,
2006]. Zusätzlich verstärkt NAP, wie andere klassische Wachstumsfaktoren die Poly
ADP-Ribosylierung [Visochek, Steingart et al., 2005], welche möglicherweise
unmittelbar mit der Anordnung der Mikrotubuli durch die Kinesin Superfamilie 4
assoziiert ist [Kaplan und Miller, 2006; Midorikawa, Takei et al., 2006].
Lagrèze et al. [Lagrèze, Pielen et al., 2004] konnten bereits in vitro an Kulturen
retinaler Ganglienzellen der Ratte zeigen, dass NAP das Überleben der
Ganglienzellen steigert und das Auswachsen von Neuriten fördert.
Aufgrund
dieser
viel
versprechenden
Wirkungen
stellt
NAP
eine
für
die
Augenheilkunde interessante neuroprotektive Substanz dar, deren Wirkung in vivo
weiter untersucht werden sollte.
1.6 Fragestellung
Ziel der Arbeit war es, die Sehnervenquetschung und die temporäre okulare
Ischämie
am
Sehnerv
der
Ratte
als
zuverlässiges
und
reproduzierbares
Schädigungsmodell zu etablieren. Dazu zählten sämtliche Arbeitsschritte von der
Markierung der Ganglienzellen, über Schädigung des Sehnerven, Anfertigung der
Netzhautflachpräparate bis zur qualitativen und quantitativen Auswertung der
Präparate.
Dem Neuropeptid NAP werden aussichtsreiche neuroprotektive Eigenschaften
zugeschrieben. Die Wirkungen von NAP auf das Überleben retinaler Ganglienzellen
sollten in vivo nach Etablierung der Schädigungsmodelle überprüft werden. Wir
überprüften einerseits die Wirkung bei Schädigung der Zellkörper der retinalen
Ganglienzellen (okulare Ischämie), andererseits den Effekt bei axonaler Schädigung
(Quetschung des Sehnervens).
Ergänzend zur quantitativen Auswertung der Ganglienzellen mittels Auszählen
bestimmter Areale im Netzhautflachpräparat, sollten durch Immunhistochemie und
Semidünnschnitte weitere Methoden zur Beurteilung des Zellschadens etabliert
werden.
Materialien und Methoden
19
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Erzeugung der Narkose
Forene
Abbott, Wiesbaden
Sauerstoff, O2 medica
SWF Friedrichshafen
Silikonmaske und Schlauchsystem
Plastikbox mit Deckel
2.1.2 Retrogrades Markieren der Ganglienzellen
2.1.2.1 Herstellung der Fluorogoldlösung
Fluorochrome
LCC, Denver
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim
Isotone NaCl 0,9%, 10 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Analysenwaage SBC 32
Scaltec, Göttingen
Eppendorf Reaktionsgefäße 2 ml
Transferpette 100-1000 µl
Brand, Wertheim
MS1 Minishaker
IKA, Staufen
Alufolie
2.1.2.2 Stereotaktische Injektion
Terralin Liquid
Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt
Flurogoldlösung
s. Herstellungsprotokoll
Methocel 2%
Novartis, Nürnberg
Refobacin Augensalbe
Merck KGaA, Darmstadt
H2O2, 3%
August Heidinger, Stuttgart
Narkoseeinheit
Operationshalterung
Materialien und Methoden
20
Rasierapparat
Handstaubsauger
Heizmatte mit Thermometer
Disposable Scalpel No. 11
Feather, Japan
Stereotaktische Apparatur
•
Microliter Hamilton
•
TSE Systems
Hamilton AG, Bonaduz, Schweiz
Skalpellklinge
Pro-ophtha Augenstäbchen
Lohmann & Rauscher Internat.
GmbH & Co KG, Rengsdorf
Pinzette
Nahtmaterial
Ethicon, Johnson & Johnson Intl.
2.1.3 Schädigung des Sehnerven
2.1.3.1 Sehnervenquetschung
Mydriaticum Stulln
Pharma Stulln, Stulln
Methocel 2%
Novartis, Nürnberg
Floxal Augentropfen
Dr. Mann Pharma, Berlin
Refobacin Augensalbe
Merck KGaA, Darmstadt
Narkoseeinheit
Operationshalterung
Operationsmikroskop
Zeiss, Jena
Deckgläser
R. Langenbrink, Teningen
Disposable Scalpel No. 11
Feather, Japan
Pinzette
Nahtmaterial
Ethicon, Johnson & Johnson Intl.
2.1.3.2 Netzhautischämie
Mydriaticum Stulln
Pharma Stulln, Stulln
Methocel 2%
Novartis, Nürnberg
Materialien und Methoden
21
Ophtocain N
Dr. Winzer Pharma GmbH, Berlin
Isotone NaCl 0,9%, 10 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
BD Microlance 3, 30 G
BD Drogheda, Ireland
Manometer Erka
Klingenfuss, Bad Tölz
Original Perfusor-Leitung PE
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Injekt 10 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Omnifix 40 Solo Insulin
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Discofix Dreiwegehahn
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Narkoseeinheit
Operationshalterung
Operationsmikroskop
Zeiss, Jena
Deckgläser
R. Langenbrink, Teningen
Pinzette
Nahtmaterial
Ethicon, Johnson & Johnson Intl.
2.1.4 Behandlung mit Medikamenten
2.1.4.1 Ansetzen der entsprechenden Dosierungen
NAP
Arbeitsgruppe I. Gozes, Department of
Clinical Biochemistry, Sackler School of
Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv
69978, Israel
Aqua ad iniectabile
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Analysenwaage SBC 32
Scaltec, Göttingen
Eppendorf Reaktionsgefäße 2 ml
Transferpette 100-1000 µl
Brand, Wertheim
MS1 Minishaker
IKA, Staufen
2.1.4.2 Intraperitoneale Injektion
Medikamente
Sterican 27 G
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Materialien und Methoden
22
Injekt 5 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Isotone NaCl 0,9%, 10 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
2.1.5 Gewinnung der Netzhäute und Sehnerven
2.1.5.1 Perfusion der Ratten
Chloralhydrat
E. Merck Darmstadt
Isotone NaCl 0,9%, 1000 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Formaldehyd 37%
Merck KGaA, Darmstadt
DPBS (Phosphatpuffer)
Cambrex Bio Science, Verviers
Ringer-Spüllösung
Delta Select GmbH, Pfullingen
Präparationsbesteck (Schere, Klemme)
Perfusionssystem
•
Plastikbox
•
Pumpe Ismatec MS Reglo
Hugo Sachs Electronic, March
•
Schlauchsystem mit Venofix 21 G
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
2.1.5.2 Entnahme und Behandlung der Augen und Sehnerven
Karnowski-Lösung
•
Formaldehyd 37%
Merck KGaA, Darmstadt
•
Glutaraldehyd 25%
Merck KGaA, Darmstadt
•
Cacodylatpuffer 0,2 M, pH 7,4
(Dimethylarsinsäurenatriumsalz)
Merck KGaA, Darmstadt
Eppendorf Reaktionsgefäße 2 ml
Pinzette
Schere, Klemme
Gefäße mit Formalin
Sterican 27 G
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Holzstift
Faber-Castell
Klebeband
Materialien und Methoden
23
2.1.5.3 Erstellung der Netzhautflachpräparate
Sterican 27 G
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Tischmikroskop
Olympus, Tokyo
Tischlichtquelle KL 1500
Schott
Pertrischale mit Modelierwachs
Pinsel
Objektträger
R. Langenbrink, Teningen
Deckgläser
R. Langenbrink, Teningen
Vectashield Mounting Medium for
Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA
Fluorescence
94010
Transparenter Nagellack
2.1.6 Auswertung der Netzhautflachpräparate
Zeiss Imager A1
Zeiss, Jena
Axio CaMRm
Zeiss, Jena
Axio Vision Rel 4.5
Folien für Kopiergeräte und Laserdrucker Geha
Non-permanent OHPen
Stabilo, Heroldsberg
2.1.7 Erstellen der Semidünnschnitte
2.1.7.1 Vorbehandlung der Sehnerven
Kaliumdihydrogenphosphat
Merck KGaA, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat
Carl Roth GmbH + Co. , Karlsruhe
Aqua bidest.
Osmiumtetroxid, 2%
Merck KGaA, Darmstadt
Magnetrührer KMO 2 basic
IKA, Staufen
Laborwaage EW 1500-2M
Kern, Balingen
Transferpette 100-1000 µl
Brand, Wertheim
Materialien und Methoden
24
2.1.7.2 Einbettung in Kunststoff
Araldite Cy 212
Serva Electrophoresis GmbH,
Heidelberg
Araldite Hardener Hy 964
Serva Electrophoresis GmbH,
Heidelberg
Araldite M Accelerator
Fluka Chemie AG, Buchs, CH
Aceton
Merck KGaA, Darmstadt
Greiner Bio-one Cellstar Tubes, 50 ml
Greiner, Frickenhausen
Transferpette 100-1000 µl
Brand, Wertheim
Silikoneinbettförmchen
Science, München
Trockenschrank
Ehret, Emmendingen
Sarstedt Laborschaukel
Sarstedt, Nümbrecht-Rümmelsdorf
2.1.7.3 Anfertigung der Semidünnschnitte
Leica Glass Stripes 400x25x6,4
Leica Microsystems GmbH, Nussloch
Leica EMKMR Knifemaker
Leica Microsystems GmbH, Nussloch
Reichert-Jung Ultracut E
Reichert-Jung, Bensheim
Mikroskop Reichert Stereo Star Zoom
Reichert-Jung, Bensheim
Heizplatte Medax Nagel GmbH, Typ
Nagel GmbH, Kiel
13800
Aqua ad iniectabile
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Injekt 10 ml
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Aceton
Merck KGaA, Darmstadt
Objektträger Super Frost
R. Langenbrink, Teningen
Sterican 20 G
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Arodisc Syringe Filter 0,45µm
Pall Corporation, Ann Arbor
Toluidin-Blau
Merck KGaA, Darmstadt
Dentalwachs
Science, München
Metallspatel
Messerwännchen
Leica Microsystems GmbH, Nussloch
Materialien und Methoden
25
2.1.8 Immunhistochemie
2.1.8.1 Erstellen der Paraffinschnitte
Einbettautomat
Leica Microsystems GmbH, Nussloch
Paraffin Peletts
Merck KGaA, Darmstadt
Eis, Pinsel
Wasserbad
Rotationsmikrotom Super Cut 2050
Leica Microsystems GmbH, Nussloch
Objektträger Super Frost
R. Langenbrink, Teningen
Heizplatte Medax Nagel GmbH, Typ
Nagel GmbH, Kiel
13800
Trockenschrank
Ehret, Emmendingen
2.1.8.2 Immunhistochemische Färbung
Xylol
Merck KGaA, Darmstadt
Ethanol
Aqua dest.
TRIS-Puffer
Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim
Natriumchlorid
Merck KGaA, Darmstadt
Kälberserum
Biochrom, Berlin
Rattenserum
Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim
Antikörper
•
Myelin Basic Protein
Dako Cytomation, Hamburg
•
Neurofilament 160
Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim
Biotinmarkiertes Mausimmunglobulin
Dako Cytomation, Hamburg
(Sekundärantikörper)
Alkalische Phosphatase konjugiertes
Dako Cytomation, Hamburg
Streptavidin
Neufuchsin für alkalische Phosphatase
Mayer’s Hämalaun
Glasküvetten
Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim
Materialien und Methoden
26
Feuchte Kammer
Objektträgerständer
Eindeckelmedium Aquatex
Merck KGaA, Darmstadt
Deckgläser
R. Langenbrink, Teningen
Färbeautomat Combitec II
Vogel, Gießen
Transferpette 100-1000 µl
Brand, Wertheim
Magnetrührer KMO 2 basic
IKA, Staufen
MS1 Minishaker
IKA, Staufen
2.1.9 Auswertung Semidünnschnitte
BH2-RFC, Auflichtfluoreszenzmikroskop
Olympus, Hamburg
Kamera CC 12 soft imaging system
analySIS
Soft Imaging System GmbH,
Münster
27
Materialien und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Versuchstiere
Alle Versuche wurden mit männlichen Wistar-Ratten, Gewicht 200-250 g
durchgeführt. Die Tierversuche wurden von der Tierschutzkommission des
Regierungspräsidiums
Freiburg
genehmigt.
(Nr.
G-04/61,
Aktenzeichen
35-
9185.81/1/807)
2.2.2 Erzeugung der Narkose
Sämtliche operativen Eingriffe, wie das Markieren der Ganglienzellen und die
Manipulationen am Sehnerven werden unter Isoflurannarkose durchgeführt.
Die Ratte wird zunächst in die Narkosekammer gesetzt, in die 3,5% Isofluran
eingeleitet wird. Nach beginnender Betäubung wird die Ratte kurz vor eine
Silikonmaske gehalten, um die Narkose zu vertiefen. Bei ausbleibender Reaktion auf
Schmerzreize kann sie schließlich unter Herausziehen der Zunge und Einhängen der
oberen Schneidezähne in der Narkoseapparatur fixiert werden. Stabile Narkose wird
erreicht bei 2,5% Isofluran, bei Zufügung von starken Schmerzreizen (Abschaben
des Periosts von der Kalotte) wird die Narkose etwas vertieft. Die Körpertemperatur
der Ratten wird während der Eingriffe über eine geregelte Heizmatte konstant
gehalten.
Abbildung 1: Schematischer Aufbau der Operationshalterung
28
Materialien und Methoden
Abbildung 2: Narkoseschema
2.2.3 Retrogrades Markieren der Ganglienzellen
2.2.3.1 Herstellung Fluorogoldlösung
Ziel ist die Herstellung einer 3% Fluorogoldlösung in 10% DMSO.
Zunächst erfolgt das Abwiegen der entsprechenden Menge Fluorogold in einem
Eppendorf Reaktionsgefäß. Es werden 7,5 mg Fluorogold in 25 µl DMSO und 225 µl
Kochsalz in Lösung gebracht, bei entsprechend kleinerer Menge wird prozentual
umgerechnet. Die Lösung muss mit dem Vortex gut durchgemischt werden, um das
vollständige Auflösen von Fluorogold zu erreichen. Die fertige Lösung kann im
Kühlschrank aufbewahrt werden, lichtgeschützt in Alufolie verpackt.
2.2.3.2 Auflegen von Gelatineplättchen auf die Colliculi superiores
Ein besonders genaues Verfahren, das Ausmaß der Degeneration nach einer Läsion
zu quantifizieren und neuroprotektive Maßnahmen zu bewerten, ist die Auszählung
retinaler Ganglienzellen.
Zunächst müssen diese spezifisch angefärbt werden.
Es existieren verschiedene Optionen, die retinalen Ganglienzellen zu markieren. Eine
Möglichkeit
ist
das
direkte
auflegen
eines
in
Fluorogold
getränkten
Gelatineplättchens auf die Colliculi superiores.
Zunächst wird die Narkose entsprechend dem geschilderten Vorgehen eingeleitet.
Die Schädelhaare werden zwischen den Ohren abrasiert und entfernt.
Materialien und Methoden
29
Die Ratte wird in der Operationshalterung fixiert, wobei sie während des Eingriffs auf
einer Heizmatte liegt und die Körpertemperatur mit einem rektal eingeführten
Thermometer kontrolliert wird, um das Auskühlen zu verhindern.
Sämtliche operativen Eingriffe werden unter dem Operationsmikroskop durchgeführt.
Ein großer Tropfen Methocel wird zum Schutz in beide Augen eingebracht.
Das Fell wird durch einen ca. 2,5 cm langen Schnitt eröffnet. Anschließend wird das
Fell auseinander gezogen und bis auf das Periost abpräpariert. Die Knochenhaut
wird mit einer Skalpellklinge entfernt, bis die Suturen deutlich zu sehen sind. Dies ist
wichtig zur exakten Bestimmung der Lokalisation der Bohrlöcher. Zur Desinfektion
wird H2O2, 0,3% auf die Kalotte getropft, eine Minute belassen und dann entfernt.
Dann wird ein in Fluorogold-Lösung getränktes Gelatineplättchen auf die Colliculi
superiores aufgelegt und der Transport des Farbstoffes in die Ganglienzellen
abgewartet.
2.2.3.3 Stereotaktische Injektion von Fluorogold
Die zweite Möglichkeit, retinale Ganglienzellen anzufärben ist Fluorgold mittels eines
stereotaktischen Injektionssystems direkt in den Colliculus superior zu injizieren.
Dieses gelangt retrograd durch axonalen Transport in die Somata der Ganglienzellen
und färbt sie somit an.
Bis zum Auftropfen von H2O2 auf die Kalotte wird in der oben beschriebenen Weise
vorgegangen. Dann werden mit einer Fräse vier Löcher (Durchmesser 1 mm) nach
unten stehendem Schema in die Kalotte gebohrt.
Materialien und Methoden
30
Abbildung 3: Lokalisation der Bohrlöcher anhand von Orientierungspunkten am knöchernen Schädel,
Bregma (1), Sutura coronoidea (2), Sutura sagittalis (3) und Sutura lambdoidea
Die Vorbereitung der stereotaktischen Apparatur erfolgt durch Spülen der
Injektionskanüle mit Alkohol und dreimaligem Spülen mit steriler Kochsalzlösung. 4 µl
Fluorogold werden aufgezogen und in die entsprechenden Bohrlöcher in einer Tiefe
von jeweils 3,5 mm und 4,5 mm injiziert. Die Injektionsgeschwindigkeit beträgt ca. 1
µl pro Minute. Pro Höhenparameter wird 1 µl
Fluorogold appliziert. Auf der
Gegenseite erfolgt die Injektion mit den gleichen Parametern. Nach der Injektion
empfiehlt es sich, mit der Entfernung der Injektionskanüle kurz zu warten, um starken
Reflux der Fluorogold-Lösung zu verhindern. Die Wunde wird mit einer fortlaufenden
Naht (z.B. Seralon 5.0, Vicryl 6.0) verschlossen. Um Infektionen vorzubeugen, wird
Refobacin Augensalbe auf Naht und Augen aufgetragen. Die Ratte wird nach dem
Eingriff mindestens noch eine halbe Stunde in der Narkosekammer in Narkose
belassen.
2.2.4 Schädigung des Sehnerven
2.2.4.1 Kalibrierte Sehnervkompression
Durch kalibrierte Sehnervkompression kann eine axonale Schädigung des N. opticus
erreicht werden.
Die Induktion der Narkose erfolgt entsprechend des vorgestellten Verfahrens, Rasur
und Fixierung des Tiers in der Operationshalterung genau wie beim Labeln.
Materialien und Methoden
31
Tropicamid wird zur Erzeugung einer Mydriasis ins linke Auge getropft. Zur
Sicherstellung einer guten retinalen Durchblutung wird präoperativ mit einem
Deckglas und Methocel eine Funduskopie durchgeführt. Zunächst wird das Fell wie
zuvor beschrieben eröffnet und bis auf das Periost abpräpariert bis die Orbitakante
getastet werden kann. Das abpräparierte Fell wird durch Anschlingen mit einem
Faden an der Unterlage fixiert. Mittels eines zirkulären Schnittes entlang der
knöchernen Orbitakante wird diese eröffnet. Der nun sichtbare Tränendüsenkörper
wird teilweise entfernt und nach nasal zur Seite geschoben. Nun wird der Bulbus
sichtbar. Man versucht, unter dem M. rectus superior eine schmale Pinzette
durchzuschieben und diesen so aufzulagern. Dann kann dieser durchtrennt werden.
Als nächstes wird mit dem M. obliquus superior ebenso verfahren. Der kaudale
Stumpf der Muskels wird angeschlungen und der Bulbus mit diesem nach nasal
unten gezogen und an der Unterlage fixiert. Somit erhält man Einblick auf den
Nervus opticus. Durch vorsichtiges Abpräparieren der umgebenden Strukturen kann
der Sehnerv separiert werden. Mit einer speziellen Pinzette (Restöffnung 100 µm)
wird der Sehnerv mitsamt Sehnervenscheide für 10 Sekunden ca. 3 mm hinter dem
Bulbus komprimiert. Dies wird mit einer Stoppuhr kontrolliert.
Zur Infektionsprophylaxe wird ein Tropfen Floxal in die Orbita getropft und
anschließend erfolgt der Wundverschluss. Postoperativ muss durch Funduskopie die
Reperfusion der Retina bestätigt werden. Bei Ausbleiben dieser ist das Tier nicht in
die Versuchsgruppe einzuschließen. Abschließend erfolgt Applikation von Refobacin
Augensalbe.
2.2.4.2 Netzhautischämie durch Erhöhung des Augeninnendruckes
Zunächst wird entsprechend des bekannten Vorgehens die Narkose induziert und
das Tier in der Operationshalterung fixiert. Anschließend wird das linke Auge mit
Lokalanästhetikum und Mydriatikum vorbehandelt, auf das andere Auge wird zum
Schutz Methocel aufgebracht.
Die Konjunktiva wird nahe des Limbus mit der Pinzette gegriffen. Dann wird mit der
Kanüle in die Vorderkammer des Auges eingestochen.
32
Materialien und Methoden
Der Augeninnendruck wird nun durch Injektion von Kochsalz-Lösung auf 140 bis 160
mm Hg erhöht und den gewünschten Zeitraum belassen.
Durch Funduskopie wird das Eintreten der Ischämie, erkennbar an Abblassung der
Retina verifiziert. Während der gesamten Dauer der Ischämie wird diese alle fünf
Minuten
durch
Überprüfung
des
angelegten
Druckes
und
funduskopisch
sichergestellt.
Nach der Ischämiezeit werden Kochsalz-Lösung und Kanüle wieder entfernt und die
postoperative Reperfusion der Retina wird durch erneute Funduskopie überprüft.
Bleibt diese aus, wird das Tier aus der Versuchsgruppe ausgeschlossen.
Abbildung 4: Versuchsapparatur zur Erhöhung des Augeninnendruckes
2.2.5 Behandlung mit entsprechenden Medikamenten
2.2.5.1 Ansetzen der entsprechenden NAP-Lösung
1,5 mg NAP werden im Eppendorf Reaktionsgefäß abgewogen und in 1,5 ml H2O
durch vortexen gelöst. Jeweils 100 µl dieser Stammlösung werden in 15
Reaktionsgefäße pipettiert und eingefroren. Dies ergibt einen Peptidgehalt von 0,1
mg NAP in 100 µl Lösung. Entsprechend des Bedarfes wird die Stammlösung wieder
aufgetaut. Zur Herstellung einer entsprechenden Verdünnung von 1:100 werden 100
µl der Stammlösung in 9900 µl H2O gelöst. Pro kg Körpergewicht werden 100 µg
NAP zu den entsprechenden Zeitpunkten verabreicht. Eventuelle Reste der
Injektionslösung werden erneut eingefroren.
Materialien und Methoden
33
2.2.5.2 i.p.-Injektion der Medikamente
Das Tier wird entweder noch in Narkose (nach Schädigung) oder in erneuter kurzer
Narkose gewogen. Die Dosierung des Medikamentes erfolgt entsprechend des
Gewichtes, 100 µg pro kg Körpergewicht. Die Ratte wird auf den Rücken gedreht und
die Injektion erfolgt in den linken unteren Quadranten des Abdomens zur Meidung
des Zoekums rechts. Das Fell wird angehoben und eingestochen, danach Aspiration
und Injektion des Medikamentes. Den Tieren der Kontrollgruppe wird stattdessen die
entsprechende Menge Kochsalzlösung injiziert
2.2.6 Gewinnung der Netzhäute und Sehnerven
2.2.6.1 Perfusion
Die Ratten werden zunächst durch Injektion einer Überdosis Chloralhydrat getötet.
Das Fell wird großzügig von unterhalb des Rippenbogens her eröffnet und stumpf
abpräpariert, bis sich der Thorax darstellt. Das Sternum wird aufgesucht und rechts
entlang der Rippen wird der Thorax eröffnet. Dies sollte möglichst unter Zug und
nahe an den Rippen geschehen, um eine Verletzung der großen Gefäße zu
vermeiden. Dann wird das Herz stumpf vom umliegenden Gewebe getrennt und
durch einen Einschnitt in das rechte Herzohr eröffnet. Anschließend wird die
Butterfly-Kanüle in die linke Kammer eingestochen.
Abbildung 5: Schematischer Aufbau der Perfusionsapparatur
Materialien und Methoden
34
Die Perfusion beginnt mit Ringer-Spüllösung. Nach ca. fünf Minuten wird auf 4%
Formalin in PBS für weitere zehn Minuten umgestellt. Die korrekte Perfusion kann
vor allem an Muskelfaszikulationen erkannt werden, wenn das Formalin in den
großen Kreislauf gelangt. Zudem versteift sich die ganze Ratte.
2.2.6.2 Entnahme und Behandlung der Augen und Sehnerven
Zunächst werden die Augen entnommen. Dies geschieht durch ca. 0,5 mm lange
Schnitte in beide Lidwinkel. Mit einem Buntstift wird die Orientierung (oben) des
Bulbus markiert.
Mit der Schere geht man retrobulbär ein, spreizt sie auf, kann somit das Auge von
der Umgebung trennen und schließlich mit der Pinzette greifen und herausnehmen.
Mit einer Kanüle wird zweimal in den Bulbus eingestochen, um eine bessere
Penetration des Formalins zu erreichen, was die Fixierung verbessert. Die Augen
werden ca. eine Stunde im Formalin belassen.
Nach den Augen werden auch die Sehnerven entnommen. Dazu wird der Kopf vom
restlichen Körper abgetrennt. Das Fell wird in Längsrichtung bis zur Schnauze
aufgeschnitten. Dann wird der Schädel durch zwei Längsschnitte eröffnet, wobei man
mit einer Klemme die Kalotte abhebeln kann. Der Kopf wird umgedreht und das
Hirngewebe vorsichtig vom Schädel gelöst. Allmählich arbeitet man sich dann bis zu
den Sehnerven vor. Diese werden am Eintrittspunkt in den Canalis opticus mit einem
Skalpell abgesetzt. Rechter und linker Sehnerv werden getrennt voneinander in
Eppendorfgefäßen aufbewahrt.
2.2.6.3 Präparation der Netzhäute
Ziel ist die Erstellung von Netzhautflachpräparaten.
Nach ca. einer Stunde werden die Augen aus den Formalinbehältern genommen und
einige Male mit PBS gespült. Die Präparation erfolgt unter dem Tischmikroskop in
einer Petrischale mit Modellierwachs.
Eventuell vorhandene Gewebereste werden mit Pinzette und Wimpernschere vom
Bulbus entfernt, da diese die weitere Präparation stören. Der Bulbus wird durch einen
Schnitt kurz unterhalb der Cornea eröffnet, möglichst unterhalb des Ziliarkörpers, da
Materialien und Methoden
35
dieser eine Separation der Netzhaut von der Sklera stört. Durch einen zirkulären
Schnitt entlang des Limbus wird die Cornea entfernt, danach die Linse. Zur Fixierung
des restlichen Augenbechers in der Petrischale wird eine Kanüle ins Zentrum
gestochen.
Vier radiäre Schnitte werden Richtung N. opticus angebracht, ein tieferer um zwölf
Uhr zu markieren. An den Rändern trennt man vorsichtig Sklera und Netzhaut und
fixiert mit jeweils zwei Kanülen die Sklera am Untergrund.
Abbildung 6: Präparation der Netzhaut
Anschließend kann mit einer weiteren Kanüle die Netzhaut vorsichtig von der Sklera
separiert werden. Durch Umspülen mit PBS wird die Abtrennung erheblich erleichtert.
Ist die Netzhaut vollständig gelöst, schwimmt sie wie eine Blume auf dem PBS.
Mit einem feinen Pinsel wird die Netzhaut auf einem Objektträger ausgebreitet, mit
einem Löschpapierstreifen angesaugt und wieder in Formalin gelegt.
Nach einer Stunde wird die Netzhaut aus dem Formalingefäß herausgeholt und für
20 Minuten in PBS gelegt.
Danach wird sie mit dem feinen Pinsel auf einen Objektträger übertragen, wobei der
tiefe Einschnitt
bei zwölf Uhr lokalisiert sein sollte. Unter dem Tischmikroskop
werden Glaskörper und andere Fremdkörper mit Pinsel und Pinzette vom Präparat
entfernt. Dann wird ein Tropfen Fluoreszenzmedium auf das Präparat aufgetropft und
ein Deckglas möglichst blasenfrei aufgesetzt. Zur Abdichtung werden die Kanten des
Deckglases mit durchsichtigem Nagellack bestrichen.
Materialien und Methoden
36
2.2.7 Histologische Aufarbeitung der Präparate
2.2.7.1 Anfertigung von Semidünnschnitten in Kunststoff
2.2.7.1.1 Vorbehandlung der Sehnerven
Zuerst werden die Sehnerven mehrfach mit Phosphatpuffer gespült, um die
Fixierungslösung zu entfernen. Nach dem letzten Spülen wird dem Puffer
Osmiumlösung zugegeben und mindestens zwei Stunden mit den Sehnerven
inkubiert. Danach wird das Gemisch abgegossen und wiederum werden die
Präparate mit Puffer gespült.
Dann folgt die Entwässerung des Nervengewebes in einer aufsteigenden
Acetonreihe. Dazu werden Aceton und Aqua dest. vermischt, beginnend im
Verhältnis 50:50, aufsteigend bis 90:10, wobei die Präparate jeweils 15 Minuten in
jeder Stufe verbleiben. Anschließend werden die Sehnerven drei Mal mit Aceton
behandelt, wobei sie im letzten Acetonbad mehrere Stunden bleiben.
2.2.7.1.2 Einbettung in Kunststoff
Der Kunststoff wird aus mehreren Komponenten hergestellt. Araldite Cy 212 wird mit
Araldite Hardener Hy 964, nach Volumen abgemessen zu gleichen Teilen vermischt.
Zuletzt wird dem Gemisch 2% des Gesamtvolumens entsprechend Araldite M
Accelerator zugefügt.
Zur Einbettung der Sehnerven in Kunststoff wird dieser im ersten Schritt zunächst zu
gleichen Anteilen mit Aceton gemischt, bis keine Trübungen mehr zu erkennen sind.
Dann werden die Überstände aus den Reaktionsgefäßen abgegossen und durch das
Aceton-Kunststoff-Gemisch ersetzt. Nach einiger Zeit werden die Reaktionsgefäße
geöffnet, damit das Aceton verdampfen kann und über Nacht stehen gelassen.
Im zweiten Schritt wird das Aceton-Kunststoff-Gemisch gegen reinen Kunststoff
ausgetauscht, wobei die Deckel der Reaktionsgefäße offen belassen werden.
Zuletzt erfolgt die Platzierung in den Einbettformen. Dazu wird ein letztes Mal der
Kunststoff abgegossen und die Sehnerven in entsprechender Ausrichtung in den
Vertiefungen platziert. Danach werden diese mit Kunststoff aufgefüllt und die Formen
werden bei 60°C mindestens zwei Tage in den Brutschrank gestellt.
37
Materialien und Methoden
2.2.7.1.3 Anfertigung der Semidünnschnitte
Die Semidünnschnitte werden an einem Ultramikrotom mit Hilfe von Glasmessern
erstellt. Zuerst wird der Kunststoffüberstand um den Sehnerven herum reduziert, so
dass ein kleines Viereck um den Sehnerven verbleibt. Anschließend versucht man
durch wiederholtes Schneiden, eine ebene Schnittfläche zu erzeugen. Idealerweise
sollte sie vollständig spiegeln, da ansonsten Gewebedefekte im Nerven vorhanden
sind, welche später im Semidünnschnitt als Beschädigung des Präparats zu sehen
sind.
Ist dies erreicht, wird das normale Glasmesser gegen ein Messer mit Wasserbad
ausgetauscht. Dieses wird hergestellt, indem ein Messerwännchen mit Wachs an ein
Glasmesser geheftet wird. Mit einem Metallspatel werden verbleibende Lücken
ebenso durch Wachs geschlossen. Wird jetzt ein Schnitt erstellt, schwimmt dieser auf
dem Wasserspiegel und kann von dort mittels eines Glasstabes auf einen
Objektträger verbracht werden.
Zum Trocknen und zur Fixierung werden die Präparate auf eine Heizplatte gelegt.
Ist das Wasser vollständig abgetrocknet, können die Präparate durch Betropfen mit
Toluidin-Blau angefärbt werden. Um Rückstände auf dem Präparat zu verhindern,
sollte zum Aufbringen der Färbelösung ein Filter verwendet werden. Erneut werden
die Präparate auf die Heizplatte gelegt.
Beginnt die Farbe am Rand des Tropfens einzutrocknen, wird die restliche Lösung
mit Wasser abgespült und die Präparate abschließend getrocknet.
2.2.7.2 Immunhistochemie an Paraffinschnitten
Die
einzubettenden
Präparate
durchlaufen
zunächst
über
Nacht
den
Einbettautomaten. Danach werden sie in Plastikkassetten platziert und mit flüssigem
Paraffin übergossen. Nach Aushärtung werden die Paraffinblöcke zunächst auf Eis
gelagert, wodurch sie weiter härten und besser zu schneiden sind. Mit dem
Rotationsmikrotom werden Paraffinschnitte angefertigt, im Wasserbad gestreckt und
mittels Pinsel auf die Objektträger aufgebracht. Auf der Heizplatte trocknen die
Schnitte zunächst leicht an, danach werden sie über Nacht in den Trockenschrank
bei 56 °C gestellt.
38
Materialien und Methoden
Pro Tierspezies, aus der der Antikörper gewonnen wird und pro Schnitt benötigt man
eine negative Kontrolle, bei der der Primärantikörper ausgespart wird. Diese Schnitte
dürfen letztendlich keine Farbreaktion zeigen.
Es folgt die Entparaffinierung und Rehydrierung über eine absteigende Alkoholreihe
im Färbeautomaten. Nächster Schritt ist die Demaskierung mittels TRIS gepufferter
Saline, 50 mM, pH=7,6. In diesem Schritt werden die Epitope den Antikörpern
zugänglich gemacht. Die Objektträger werden mit ihren Ständern in Glasküvetten
eingehängt, in denen sich eine Mischung aus TRIS-Puffer und Kälberserum im
Verhältnis 1:1 befindet. Durch die Zugabe von Kälberserum werden unspezifische
Bindungen der Antikörper verhindert.
Nach ca. 20 bis 30 Minuten erfolgt das Auftragen des Primärantikörpers. Dazu wird
dieser entsprechend der angegebenen Verdünnung hergestellt. Pro Schnitt werden
100 µl Antikörper benötigt. Die Inkubationszeit beträgt 60 Minuten. Während dieser
Zeit werden die Schnitte in einer feuchten Kammer gelagert, um ein Austrocknen zu
verhindern. Bei den negativen Kontrollen wird auf den Primärantikörper verzichtet.
Sie verleiben in der Pufferlösung.
Nach 60 Minuten werden die Objektträger mit einer Mischung aus Kälberserum und
Aqua dest. mit einer Spritzflasche gespült. Danach wird vorsichtig überschüssige
Flüssigkeit abgetupft, um eine zu starke Verdünnung des Sekundärantikörpers zu
verhindern. Dann erfolgt das Auftropfen des Zweitantikörpers, an Biotin gekoppeltes
Mausimmunglobulin.
Zur
Herstellung
der
entsprechenden
Verdünnung
wird
zusätzlich Rattenserum benötigt, falls der Zweitantikörper nicht spezifisch für
Rattengewebe ist. Die Zugabe des Serums verhindert unspezifische Bindungen
gegenüber Rattengewebe. Der Zweitantikörper wird ca. 30 Minuten belassen.
Der Sekundärantikörper wird in gleicher Weise abgespült und an alkalische
Phosphatase gekoppeltes Streptavidin in entsprechender Verdünnung zugegeben.
Die Inkubationszeit beträgt hierfür 45 Minuten.
Um nun eine entsprechende Farbrektion zu erhalten, muss eine Substratlösung
zugegeben werden. Dazu verwenden wir Neufuchsin für AP. Levamisole zur
Blockierung der Aktivität der endogenen Alkalischen Phosphatase ist darin enthalten.
Streptavidin AP wird mehrmals abgespült und die Substratlösung auf die
39
Materialien und Methoden
Objektträger aufgetropft, 100 µl pro Schnitt. Nach 20 Minuten werden die Schnitte
gründlich mit Aqua dest. gespült und wieder in die Ständer eingehängt.
Zur Gegenfärbung der Kerne wird Mayer’s Hämatoxylin verwendet. Die Ständer mit
den Schnitten werden ca. 30 Sekunden in die Farblösung gestellt, dann gründlich
abgespült und zurück in die Küvette mit Aqua dest. gestellt.
Zuletzt werden die Objektträger abgetupft, 1 bis 2 Tropfen Eindeckelmedium
aufgetropft und ein Deckgläschen aufgesetzt.
2.2.8 Auswertung
2.2.8.1 Netzhautflachpräparate
Zunächst wird die Netzhaut in Quadranten eingeteilt.
Abbildung 7: Einteilung der Netzhaut zur Auswertung
Aus jedem Quadranten wird dann mit dem Mikroskop in 20 facher Vergrößerung ein
Bild
aufgenommen.
Dieses
wird
nach
möglichst
konstanten
Bedingungen
ausgewertet.
Ausgezählt wird aus jedem Bild ein definiertes Feld, das auf eine Overheadfolie
gezeichnet wurde. Diese Folie wird stets an den rechten unteren Rand des
Computermonitors angelegt. Mitgezählt werden die Zellen, die auf dem oberen und
auf dem linken Rand des Feldes liegen.
40
Materialien und Methoden
Neben den Ganglienzellen wird ebenso die Anzahl aktivierter Gliazellen erfasst.
2.2.8.2 Semidünnschnitte
Die histologische Untersuchung mittels Semidünnschnitten wird von mehreren
Arbeitsgruppen durchgeführt. Die Präparate werden im Lichtmikroskop betrachtet
und pro Schnitt werden zwei repräsentative Bilder in 60 facher Vergrößerung
aufgenommen. Diese werden von verschiedenen Betrachtern bewertet. Zur
Bewertung der Schädigung dient eine Skala von 1 (normaler Sehnerv ohne
Schädigung) bis 5 (vollständige Degeneration).
Schädigungsgrad 2 charakterisiert sich durch eine geringe Anzahl degenerierter
Axone in einer Region des Sehnerven. Bei Grad 3 zeigt sich eine zunehmende
Dichte
zugrunde
gegangener
Axone
in
mehreren
Arealen
des
Sehnervenquerschnittes. Sind intakte und degenerierte Axone etwa zu gleichen
Teilen vorhanden, wird die Schädigung als Grad 4 klassifiziert. Sind nahezu keine
intakten Axone mehr zu identifizieren, ist der Nerv vollständig degeneriert (Grad 5).
Aus den Bewertungen der unterschiedlichen Betrachter wird der Mittelwert gebildet.
Der Punktwert steht für den Optic Nerve Injury Grade (ONIG).
Ergebnisse
41
3. Ergebnisse
3.1 Retrograde Markierung der Ganglienzellen
Zur Quantifizierung retinaler Ganglienzellen wurden diese durch stereotaktische
Injektion mit Fluorogold in den Colliculus superior retrograd angefärbt.
Zunächst wurde pro Hirnhälfte nur ein Loch gebohrt, in das jeweils 2 µl Fluorogold in
2,8 und 3,2 mm Tiefe injiziert wurden.
In der ersten Versuchsreihe in Kombination mit Ligatur der A. centralis retinae
zeigten 18 von 20 (90%) Tieren eine vollständige Markierung.
Bei der nächsten Versuchsreihe verbunden mit der Sehnervenquetschung zeigten
lediglich 8 von 12 (66,6%) Tieren eine vollständige Markierung.
Als Konsequenz daraus wurden bei den folgenden Markierungen anstatt des einen
Bohrloches zwei zueinander versetzte Löcher gefräst. Zudem wurden die
Injektionsstellen tiefer gewählt. Seitdem wird die Markierung wie zuvor beschrieben
mit sehr guten Ergebnissen durchgeführt.
3.2 Morphologie der Netzhautflachpräparate
3.2.1 Netzhautflachpräparate in unterschiedlicher Vergrößerung
Abbildung 1: Netzhaut direkt nach Präparation
aus dem Auge. Vier radiäre Einschnitte
unterteilen in die Quadranten. Die Markierung
kennzeichnet den in Abbildung 2 gezeigten
Abschnitt der Retina.
Ergebnisse
42
1
2
3
4
Abbildung 2: Bilder von Netzhautausschnitten aufgenommen in unterschiedlicher Vergrößerung,
2,5 fache (1), 10 fache (2), 20 fache (3) und 40 fache Vergrößerung (4)
Bei Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop zeigen sich die Netzhautpräparate
wie in Abbildung 2 dargestellt. Sämtliche Bilder zur Auswertung der Zellzahlen
wurden in 20 facher Vergrößerung (3) aufgenommen. Die Detailansichten der Zellen
sind 40 fach vergrößert (4).
43
Ergebnisse
3.2.2 Morphologie der retinalen Ischämie und Sehnervenquetschung
100 µm
1
100 µm
2
100 µm
Abbildung 3: Retinale Ganglienzellen und
aktivierte Gliazellen in markierten Netzhäuten.
Die Abbildungen 1 bis 3 zeigen repräsentative
Ausschnitte aus Netzhautflachpräparaten 17
Tage nach Applikation von Fluorogold in die
Colliculi superiores: Kontrollaugen (1), wobei alle
sichtbaren Zellen retinale Ganglienzellen sind, 60
Minuten nach retinaler Ischämie (2) sind weniger
retinale Ganglienzellen zu erkennen (Pfeil), die
kleinen Zellen sind aktivierte Gliazellen, die nach
Phagozytose markierte Fragmente von retinalen
Ganglienzellen enthalten (Pfeilspitze), nach
Sehnervenquetschung von 10 Sekunden (3).
3
Sehr eindrücklich zeigen sich die unterschiedlichen Muster in den beiden
Schädigungsmodellen, wie Abbildung 3 veranschaulicht. Bereits ohne exakte
Auswertung ist ersichtlich, dass nach Quetschung des Sehnerven (1) die Dichte der
vorliegenden Ganglienzellen viel geringer als in den übrigen Bildern ausfällt. Das
Fehlen aktivierter Gliazellen unterscheidet die beiden gesunden Netzhäute von den
geschädigten.
3.2.3 Morphologie der verschiedenen Zellpopulationen
In den Präparaten konnten wir zum einen die retinalen Ganglienzellen nachweisen.
Nach Schädigung zeigte sich eine weitere Zellpopulation mit multiplen Fortsätzen,
die aktivierten Gliazellen.
Ergebnisse
44
Abbildung 4: Detailaufnahme (Vergrößerung 40 fach) einer Netzhaut, Unterscheidung zwischen
Ganglienzellen und aktivierten Gliazellen
3.3 Schädigungsmodelle
3.3.1 Retinale Ischämie durch Ligatur der A. centralis retinae
Zuerst wurde versucht, die Netzhaut durch eine 60 Minuten dauernde Unterbindung
der A. centralis retinae zu schädigen.
Gleichzeitig wurde um die Sehnervenscheide des Sehnerven der rechten Seite
ebenfalls eine Ligatur gelegt, jedoch ohne diese zu schließen.
Bei der Auswertung stellte sich allerdings heraus, dass die Netzhäute beider Augen
annährend gleichermaßen geschädigt waren. Die Schädigung der Zellen schien
somit Folge des Operationstraumas und nicht der Ischämie zu sein.
Folglich wurde dieses Schädigungsmodell in den folgenden Experimenten nicht
eingesetzt.
3.3.2 Sehnervenquetschung
In ersten Versuchen wurde eine Quetschung des Sehnerven nach vorheriger
retrograder Markierung der Ganglienzellen durchgeführt. Um den optimalen
45
Ergebnisse
Entnahmezeitpunkt für die Augen festzulegen, wurden diese nach 7, 10 und 14
Tagen entnommen. Als Kontrollen dienten die ungeschädigten rechten Augen von 45
Versuchstieren.
2500
CI95
2000
Retinale Ganglienzellen
Aktivierte Gliazellen
1500
1000
500
0
0 Tage
7 Tage
10 Tage
14 Tage
Abbildung 5: ONC und Variation der Entnahmezeitpunkte der Netzhäute zwischen 7, 10 und 14
Tagen, als Kontrolle dienen Netzhäute ungeschädigter rechter Augen, die Fehlerbalken sind
Konfidenzintervalle
Nach 17 Tagen zeigte sich in den Netzhautflachpräparaten der Kontrollgruppe eine
durchschnittliche Zelldichte der retinalen Ganglienzellen von 2456 Zellen pro mm2,
CI95 [2313, 2596]. Wie in Abbildung 5 dargestellt, konnten in den Präparaten keine
aktivierten Gliazellen nachgewiesen werden.
Ergebnisse
46
7 Tage nach Schädigung beträgt die Dichte der retinalen Ganglienzellen 973 Zellen
pro mm2, CI95 [706, 1240], was einer Verminderung der Zelldichte um 51% verglichen
mit der Kontrollgruppe entspricht. Die Anzahl der aktivierten Gliazellen beträgt 248
Zellen pro mm2, CI95 [234, 334].
Bei Auswertung der Netzhautpräparate nach 10 Tagen zeigen sich noch 344
Ganglienzellen pro mm2, CI95 [267, 421], was einer Zelldichte von 17% bezogen auf
die Kontrollgruppe entspricht. Bei den Gliazellen waren 591 Zellen pro mm2, CI95
[529, 653] vorhanden.
14 Tage nach Sehnervenquetschung sind lediglich noch 9% der Ganglienzellen im
Vergleich zur Kontrollgruppe vorhanden, 162 Zellen pro mm2, CI95 [140, 185]. Die
Anzahl der aktivierten Gliazellen ist im Vergleich zu den Zahlen nach 10 Tagen leicht
vermindert, 464 Zellen pro mm2, CI95 [284, 645].
Die Anzahl der vorhandenen retinalen Ganglienzellen nimmt bei Entnahme zwischen
7, 10 und 14 Tagen deutlich ab. Hingegen steigt die Anzahl der aktivierten Gliazellen
von 7 bis 10 Tagen, nimmt bei Entnahme am 14 Tag wieder leicht ab.
47
Ergebnisse
3.3.2 Korrelation retinaler Ganglienzellen und aktivierter Gliazellen
4000
Kontrollen
Sehnervenquetschung (scrambled peptide)
Sehnervenquetschung (NAP 100 µg/kg)
Retinale IschŠmie (scrambled peptide)
Retinale IschŠmie (NAP 100 µg/kg)
Regressionsgerade
Anzahl retinaler Ganglienzellen mm
2
3000
2000
1000
0
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
2
Anzahl aktivierter Gliazellen mm
Abbildung 6: Korrelation zwischen retinalen Ganglienzellen und aktivierten Gliazellen. In dem
Streudiagramm ist die Dichte der retinalen Ganglienzellen als Funktion der Dichte der aktivierten
Gliazellen in 93 Tieren aus fünf verschiedenen Behandlungsgruppen aufgetragen. Die
Regressionsgerade verdeutlicht die gute Korrelation von R = -0,717 (p<0,001) zwischen beiden
Zellpopulationen.
Um die Beziehung zwischen retinalen Ganglienzellen und aktivierten Gliazellen zu
beurteilen, wurde der Korrelationskoeffizient R festgelegt. Wie in Abbildung 6
veranschaulicht wird, korrelieren retinale Ganglienzellen und aktivierte Gliazellen
signifikant, verglichen unter allen Versuchsgruppen, mit R = -0.717 (p<0,0001).
48
Ergebnisse
3.4 Neuroprotektion mit NAP
3.4.1 NAP bei erhöhtem intraokularen Druck
In diese Versuchsreihe wurden 27 Tiere eingeschlossen. 16 Tieren wurde NAP
verabreicht, wobei die Applikationszeitpunkte beibehalten wurden.
Die 11 Tiere der Kontrollgruppe erhielten ein Peptid, zusammengesetzt aus den
gleichen Aminosäuren wie NAP, lediglich in anderer Sequenz (scrambled peptide).
100 µm
2
1
2500
CI95
CI95
2000
Aktivierte Gliazellen [mm
Retinale Ganglienzellen [mm
2
]
2
]
400
1500
1000
500
0
3
Vor Ischämie
Kontrolle
300
200
100
0
NAP 100 µg/kg
Vor Ischämie
Kontrolle
NAP 100 µg/kg
4
Abbildung 7: Einfluss von NAP auf das Überleben der retinalen Ganglienzellen nach retinaler
Ischämie. Kontrollgruppe (1), Injektion von 100 µg/kg scrambled peptide, 100 µg/kg NAP (2) jeweils
am Tag vor, am Tag der Schädigung, ein und zwei Tage danach. Vergleich retinale Ganglienzellen (3)
und aktivierte Gliazellen (4) jeweils vor Sehnervenquetschung, in Kontroll- und NAP-Gruppe,
Fehlerbalken sind Konfidenzintervalle
10 Tage nach retinaler Ischämie konnte eine deutliche Abnahme der Anzahl der
retinalen Ganglienzellen auf 1271 Zellen pro mm2, CI95 [967, 1572] beobachtet
werden (3). Zusätzlich tauchten aktivierte Gliazellen auf, die nach Phagozytose der
49
Ergebnisse
retinalen Ganglienzellen ebenfalls durch Fluorogold markiert waren und die sich
morphologisch
von
den
retinalen
Ganglienzellen
unterscheiden
lassen.
Nach retinaler Ischämie betrug die durchschnittliche Anzahl der aktivierten Gliazellen
374 Zellen pro mm2, CI95 [309, 440] (4). Die Unterschiede zwischen den Gruppen
waren signifikant; retinale Ganglienzellen Kontrolle gegenüber retinaler Ischämie
p<0,0001,
aktivierte
Gliazellen
Ischämie
gegenüber
Sehnervenquetschung
p<0,0001.
Wie in Abbildung 7 gezeigt, erhöht intraperitoneale Injektion von NAP die Anzahl
überlebender retinaler Ganglienzellen und vermindert die Anzahl aktivierter
Gliazellen
nach
retinaler
Ischämie
von
60
Minuten.
Die Dichte überlebender retinaler Ganglienzellen 10 Tage nach Ischämie beträgt
1781 Zellen pro mm2, CI95 [1548, 2015], 40,2% (p<0,005) mehr als in der
Kontrollgruppe (3). Die Dichte der aktivierten Gliazellen ist auf 204 Zellen pro mm2,
CI95 [144, 264] vermindert, 45,5% (p<0,0005) weniger als in den Netzhautpräparaten
der Kontrollgruppe (4). Die Applikation von NAP wurde von allen Versuchstieren gut
toleriert.
3.4.2 NAP bei der Sehnervenquetschung
Die Sehnervenquetschung wurde 10 Tage nach Markierung der retinalen
Ganglienzellen durchgeführt.
9 Tiere erhielten eine intraperitoneale Injektion von 100 µg NAP pro kg
Körpergewicht am Tag vor der Schädigung verabreicht, zudem am Tag der
Schädigung, ein und zwei Tage danach. Die 10 Tiere der Kontrollgruppe erhielten
wiederum das scrambled peptide. Die Applikation erfolgte ebenfalls intraperitoneal in
gleicher Dosierung.
50
Ergebnisse
100 µm
1
100 µm
2
CI95
2500
CI95
2000
500
Aktivierte Gliazellen [mm
Retinale Ganglienzellen [mm
2
]
2
]
600
1500
1000
500
0
400
300
200
100
Vor Quetschung
Kontrolle
0
NAP 100 µg/kg
Vor Quetschung
Kontrolle
NAP 100 µg/kg
4
3
Abbildung 8: Einfluss von NAP auf das Überleben der retinalen Ganglienzellen nach
Sehnervenquetschung. Kontrollgruppe (1), Injektion von 100 µg/kg scrambled peptide, 100 µg/kg NAP
(2) jeweils am Tag vor, am Tag der Schädigung, ein und zwei Tage danach. Vergleich retinale
Ganglienzellen (3) und aktivierte Gliazellen (4) jeweils vor Sehnervenquetschung, in Kontroll- und
NAP-Gruppe, Fehlerbalken sind Konfidenzintervalle
Nach weiteren 10 Tagen wurden die Augen entnommen und die Netzhäute
präpariert.
10 Tage nach Sehnervenquetschung wurde die Anzahl der retinalen Ganglienzellen
auf 344 Zellen pro mm2, CI95 [267, 421] vermindert (3), wobei die Anzahl der
aktivierten Gliazellen auf 591 Zellen pro mm2, CI95 [529, 653] angestiegen ist (4). Die
Unterschiede zwischen den Gruppen waren signifikant; retinale Ganglienzellen
Kontrolle gegenüber Sehnervenquetschung p<0,0001, aktivierte Gliazellen Ischämie
gegenüber Sehnervenquetschung p<0,0001.
Abbildung 8 illustriert, dass nach Sehnervenquetschung die intraperitoneale
Verabreichung
von
NAP
(100
µg/kg)
die
Anzahl
überlebender
retinaler
Ganglienzellen auf 449 Zellen pro mm2, CI95 [350, 548] erhöht, was mit einer
Ergebnisse
51
Zunahme um 30,6%, verglichen mit der Kontrollgruppe gleichbedeutend ist (3). Zu
der mit scrambled peptide behandelten Gruppe zeigte sich kein signifikanter
Unterschied (p=0,07). Trotzdem wurde die Anzahl der aktivierten Gliazellen
signifikant um 29,1% auf 420 Zellen pro mm2, CI95 [371, 467] von NAP (p<0,0001)
vermindert (4).
Da NAP vorwiegend Wirkungen im subletalen Bereich nachgesagt werden und in
diesem Schädigungsmodell eine großen Anzahl untergehender Ganglienzellen zu
beobachten war, wurde dieses verlassen. Stattdessen wurde eine ischämische
Schädigung der Netzhaut durch erhöhten intraokularen Druck durchgeführt.
3.5 Semidünnschnitte der Sehnerven
3.5.1 Morphologie
1
2
3
4
52
Ergebnisse
Abbildung 9: Semidünnschnitte gefärbt mit
Toluidin-Blau, morphologische Veränderungen
vom ungeschädigten Sehnerven (1) bis hin zur
vollständigen Degeneration des gesamten
Nerven (5)
5
Die gefärbten Semidünnschnitte wurden unter dem Lichtmikroskop betrachtet.
Wie
Abbildung
9
verdeutlicht,
zeigen
sich
in
den
Präparaten
deutliche
morphologische Veränderungen. Exemplarisch wurden 40 Präparate erstellt.
20 Präparate von gequetschten Sehnerven, 17 Präparate von der Ischämie und 3
von ungeschädigten rechten Sehnerven.
Innerhalb der Gruppen wurde zwischen Sehnerven der Kontrollgruppe und der
Medikamentengruppe unterschieden.
3.5.2 Qualitative Auswertung
Die Semidünnschnitte wurden mittels eines Punktesystems ausgewertet, welches mit
dem Grad der Schädigung, dem Optic Nerve Injury Grade (ONIG) korreliert. Je höher
der Punktewert, desto stärker die Degeneration des Sehnerven.
Bei
der
Sehnervenquetschung
betrug
der
durchschnittliche
ONIG
der
Medikamentengruppe 4,525 (n=10), bei der Kontrollgruppe 4,65 (n=10). Die
Präparate, die nach Erhöhung des intraokularen Druckes angefertigt wurden, wiesen
einen ONIG von 2,75 (n=9) bei der Medikamentengruppe und 2,844 (n=8) bei der
Kontrollgruppe auf. Die Semidünnschnitte nach Ischämie zeigten einen niedrigeren
ONIG, als die nach Sehnervenquetschung. Allerdings sind die Unterschiede
innerhalb der Schädigungsmodelle zwischen behandelten Tieren und Kontrollgruppe
nicht signifikant, es gibt lediglich eine leichte Tendenz zugunsten eines niedrigen
Punktwertes bei NAP.
Ergebnisse
53
Eine quantitative Auswertung durch Auszählung der vorhandenen Myelinscheiden im
Präparat war nicht reproduzierbar und zuverlässig möglich.
3.6 Immunhistologische Auswertung der Sehnerven
Zur histologischen Aufarbeitung und Auswertung wurden neben Semidünnschnitten
auch Paraffinschnitte der Sehnerven angefertigt. Mit dieser Technik war allerdings
nur die Anfertigung von Querschnitten des eingebetteten Sehnerven möglich.
Längsschnitte konnten nicht erzeugt werden.
Exemplarisch wurden zur differenzierten Darstellung axonaler Veränderungen des
Sehnerven und somit zur Beurteilung geringer Schädigungen immunhistologische
Färbungen axonaler Strukturproteine an Gefrierschnitten in Kooperation mit der
Neuropathologie durchgeführt. Abbildung 10 zeigt eine Doppelmarkierung des
intrakraniellen Sehnerven der Ratte. Sichtbar sind die Axonhülle und intraaxonale
Strukturen. Proximal der Läsion kommt es zu einem Zerfall der Myelinscheiden und
einer Ausdünnung des longitudinal orientierten, intraaxonalen Zytoskeletts.
An Paraffinschnitten wurde eine Immunreaktion gegen Neurofilament 160 und
Myelin-basic Protein durchgeführt. Die Färbung mit Neufuchsin mit anschließender
Gegenfärbung der Kerne mit Mayer’s Hämatoxylin erbrachte keine auswertbaren
Ergebnisse.
Die lichtmikroskopische Betrachtung der Präparate zeigte sowohl bei den Sehnerven
der Kontrollgruppe wie auch bei denen der behandelten Tiere eine homogene
Anfärbung, wobei keine auswertbaren morphologischen Unterschiede ersichtlich
waren. Unter lichtmikroskopischer Betrachtung der erstellten Präparate waren keine
Unterschiede zu eruieren, wie sie in Abbildung 10 veranschaulicht werden.
Abbildung 10: Immunhistochemische Färbung auf Neurofilament-160 und Myelin Basic Protein an
Gefrierschnitten des intrakraniellen Sehnerven. Linke Abbildung zeigt Kontrollauge, zu sehen sind
intakte Myelinzylinder (rot) und Neurofilament (grün), die rechte Abbildung zeigt den Zustand nach
Kompression des Sehnerven.
54
Diskussion
4. Diskussion
Neurodegenerative Erkrankungen und akute Traumata des zentralen Nervensystems
führen zu irreversiblem Funktionsverlust, da sich zerstörte Neurone nicht
regenerieren können. Erkrankungen des Sehnerven, beispielsweise beim Glaukom
oder der Neuritis nervi optici im Rahmen der Multiplen Sklerose sind die
zweithäufigste Ursache für Erblindung in Deutschland [Trautner, Haastert et al.,
2003]. Die Behandlungsmöglichkeiten hierfür sind begrenzt und es war Ziel dieser
Arbeit, die neuroprotektive Substanz NAP an zwei unterschiedlichen Modellen für
Sehnervenerkrankungen zu untersuchen.
4.1 Retrograde Markierung der Ganglienzellen
Zur quantitativen Auswertung überlebender Ganglienzellen nach Schädigung von
Sehnerven oder Netzhaut müssen diese von anderen Netzhautzellen eindeutig
unterschieden
werden.
Ein
besonders
genaues
Verfahren,
Ausmaß
der
Degeneration nach einer Läsion zu quantifizieren und neuroprotektive Maßnahmen
zu bewerten, ist die Auszählung retinaler Ganglienzellen im Flachpräparat der
Netzhaut nach spezifischer Anfärbung durch aktiven retrograden Transport.
Hierfür existieren verschiedene Optionen. Zum einen kann der Schädel und die Dura
eröffnet, das über den Colliculi superiores gelegene Hirngewebe mittels Sauger
entfernt werden, um die Colliculi superiores darzustellen. Dann wird ein in
Fluorogold-Lösung getränktes Gelatineplättchen auf die Colliculi superiores aufgelegt
und der Transport des Farbstoffs in die Ganglienzellen abgewartet. Bei dieser
Methode hat nach etwa sieben Tagen ein Großteil der Ganglienzellen den
Fluoreszenzfarbstoff aufgenommen. Die Qualität der Markierung bleibt für einen
Zeitraum von mindestens 3 Wochen auf nahezu gleichem, hohem Niveau [Lafuente,
Villegas-Perez et al., 2001; Peinado-Ramon, Salvador et al., 1996].
Zunächst wurde die Markierung in unserem Labor auf diese Weise durchgeführt.
Durch Absaugen des Hirngewebes entstehen starke Blutungen und es erwies sich
als schwierig, diese suffizient zu stillen. Die Blutstillung ist notwendig, um eine
Verdünnung des Farbstoffs zu verhindern. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist,
55
Diskussion
dass die aufgebrachte Menge an Fluorogold mit der Größe der Plättchen variiert. Da
diese sehr klein zugeschnitten werden müssen, ist eine gleich bleibende Größe nicht
gewährleistet. Verglichen mit der stereotaktischen Injektion eines definierten
Volumens Fluorogold wird zudem eine viel größere Menge benötigt. Bei der
Auswertung unserer Netzhautpräparate zeigte sich variierend keine,
eine
inhomogene oder eine komplette Markierung der Ganglienzellen. Da sich diese
Methode in unserem Labor als unzuverlässig herausstellte, wurde sie wieder
verlassen.
Die zweite Möglichkeit retinale Ganglienzellen anzufärben ist, Fluorgold mittels eines
stereotaktischen Injektionssystems direkt in den Colliculus superior zu injizieren. Die
Injektion erfolgte in der Nähe der Suturen in einer Tiefe von 2,8 mm und 3,2 mm
ausgehend von der Schädelkalotte.
In unserer ersten Versuchsreihe, bei der die Markierung mittels stereotaktischer
Injektion durchgeführt wurde, waren die Ganglienzellen nicht markiert. Es wäre
denkbar, dass das Fluorogold genau zwischen die Hemisphären injiziert wurde. Bei
der Betrachtung eines Hirnpräparates wurde deutlich, das die Colliculi superiores in
Relation zu den Suturen tiefer und weiter dorsolateral liegen, als angenommen. Wird
das Bohrloch unmittelbar neben der Sutur gesetzt, wird der Colliculus superior nicht
getroffen. Zudem bemerkten wir bei unseren ersten Experimenten einen starken
Rückfluss von Fluorogold.
In den folgenden Versuchsreihen wurde die Lokalisation der Bohrlöcher im Vergleich
zu den Suturen weiter dorsolateral gewählt und die Injektionstiefe verändert. Nun
injizierten wir in einer Tiefe von 3,5 mm und 4,5 mm. Durch deutlich verlangsamtes
Injizieren von 1 µl pro Minute und durch kurzes Abwarten vor Entfernung der
Injektionskanüle konnte der Rückfluss von Fluorogold reduziert werden. Durch die
veränderten Bedingungen wurden die retinalen Ganglienzellen zuverlässig und
homogen markiert.
Zahlreiche
Arbeitsgruppen
führen
dieses
Verfahren
bei
unterschiedlichen
Schädigungsmodellen durch [Mittag, Danias et al., 2000; Levkovitch-Verbin, HarrisCerruti et al., 2000; Maeda, Sawada et al., 2004; Sarup, McEwan et al., 2005]. Sie
56
Diskussion
unterscheiden
sich jedoch hinsichtlich
Injektionskoordinaten, Dosierung von
Fluorogold, Geschwindigkeit und Zeitpunkt der Injektion. Bei der von uns auf diese
Weise durchgeführten Markierung zeigte sich nach 17 Tagen eine durchschnittliche
Dichte von 2455 Ganglienzellen pro mm2 in den Netzhautflachpräparaten der
Kontrollgruppe. Diese Zahlen korrelieren gut mit den Daten anderer Arbeitsgruppen.
Dort zeigten sich Zelldichten zwischen 1800 und 2664 Zellen pro mm2, abhängig von
dem
verwendeten
Rattenstamm,
der
Fluorogold-Applikation
und
dem
Untersuchungszeitpunkt [Bakalash, Kipnis et al., 2002; Lafuente, Villegas-Perez et
al., 2002; Levkovitch-Verbin, Quigley et al., 2003; Naskar, Quinto et al., 2002].
Mit der stereotaktischen Markierung der retinalen Ganglienzellen wurde in unserem
Labor eine effiziente, zeitsparende und zuverlässige Methode zur Quantifizierung der
Ganglienzellen im Rattenmodell etabliert.
4.2 Auswertung der Netzhautflachpräparate
4.2.1 Ganglienzellen
Eine Schädigung von Netzhaut und Sehnerv führt zu einer Abnahme der Dichte der
retinalen Ganglienzellen. Die Netzhaut weist in den verschiedenen Regionen eine
sehr unterschiedliche Ganglienzelldichte auf. Zentral sehr eng liegend, nimmt die
Zelldichte in die Peripherie deutlich ab. Dies ist bei der Auswertung der
Netzhautflachpräparate zu berücksichtigen [Danias, Lee et al., 2003]. Des Weiteren
führen verschiedene Schädigungen zu unterschiedlichen und heterogenen Mustern
des Ganglienzelluntergangs [Osborne, Casson et al., 2004]. Daher betrachteten wir
zwölf verschiedene Felder pro Netzhaut. Im Vergleich zu anderen Arbeitsgruppen
variieren die Vergrößerung, unter der die Präparate betrachtet wurden und die
Anzahl der ausgezählten Felder [Sarup, McEwan et al., 2005].
4.2.2 Gliazellen
Gliazellen spielen eine fundamentale Rolle bei Transportvorgängen im ZNS, bei der
Ernährung der Nervenzellen und bei der Immunabwehr. Reizung und Verletzung des
57
Diskussion
Sehnerven führen zu Proliferation. Daher ist eine Auszählung der Anzahl aktivierter
Gliazellen als zusätzlicher Marker für die neuronale Schädigung heranzuziehen.
In unseren Experimenten wurde nach Schädigung ein weiterer Zelltyp neben den
retinalen Ganglienzellen durch Markierung mit Fluorogold sichtbar. Diese Zellen
haben multiple Fortsätze, sind sehr intensiv angefärbt und sind in ihrer Struktur
Mikrogliazellen oder Makrophagen ähnlich [Reisberg, Doody et al., 2003]. Sie werden
als aktivierte Gliazellen eingeordnet, die durch Phagozytose geschädigter retinaler
Ganglienzellen Fluorogold aufnehmen. Die durchschnittliche Dichte der aktivierten
Gliazellen betrug in unseren Versuchen 374 Zellen pro mm2 nach retinaler Ischämie
und 591 Zellen pro mm2 nach Sehnervenquetschung. In den Netzhautpräparaten der
Kontrollgruppe waren keine aktivierten Gliazellen nachweisbar.
Die Aktivierung von Mikroglia wird als Marker für pathologische Ereignisse im
zentralen Nervensystem beschrieben [Kacza, Mohr et al., 2001]. In der Retina wurde
die Aktivierung von Mikroglia unter verschiedensten pathologischen Bedingungen
wie Diabetes [Watanabe und Fukuda, 2002], retinaler Dystrophie [Pinhasov, Mandel
et al., 2003], Axotomie des Sehnerven [Nickells, 2004; Schwartz, Yoles et al., 1999]
und Glaukom [Visochek, Steingart et al., 2005] beschrieben.
So weit uns bekannt, wurde die Reaktion der retinalen Mikrogliazellen auf Ischämie
und Sehnervenquetschung bis jetzt noch nicht quantifiziert. Aktivierte Gliazellen und
retinale Ganglienzellen zeigen eine hoch signifikante negative Korrelation von R = 0,717. 14 Tage nach Sehnervenquetschung waren kaum noch Gliazellen
auszuzählen. Die Akutphase des Zellschadens scheint nach diesem Zeitraum schon
vorbei zu sein, daraus resultierend die geringere Aktivität der Gliazellen.
Der Zusammenhang zwischen retinalen Ganglienzellen und aktivierten Gliazellen ist
nicht streng proportional, da die Mikroglia durch das retinale Gewebe wandern und
mehrere
retinale
Ganglienzellen
phagozytieren.
Medikamente
könnten
die
Anwesenheit und Beweglichkeit der Mikroglia beeinflussen.
4.3 Schädigungsmodelle
Da bei Sehnervenerkrankungen die Schädigung entweder vom Soma (z.B.
hereditäre Optikusneuropathien) oder vom Axon der retinalen Ganglienzellen (z.B.
58
Diskussion
Glaukom, ischämische Optikusneuropathie) ausgeht, etablierten wir entsprechend
unterschiedliche Tiermodelle in unserem Labor.
Zur Schädigung der Axone komprimierten wir den Sehnerven 2 mm hinter dem
Bulbus mittels einer kalibrierten Pinzette mit 100 µm Restöffnung. Zur Schädigung
der Zellkörper erhöhten wir für eine Stunde den intraokularen Augendruck, um eine
reversible Netzhautischämie zu erzeugen. Zur Quantifizierung des Verlustes an
retinalen Ganglienzellen wurden diese eine Woche vor Schädigung durch Injektion
von Fluorogold in den Colliculus superior retrograd markiert und danach im
Netzhautflachpräparat an definierten Orten ausgezählt.
4.3.1 Retinale Ischämie durch Ligatur der A. centralis retinae
Zuerst wurde versucht, die Ischämie der Retina durch selektive Ligatur der A.
centralis retinae hervorzurufen [Lafuente, Villegas-Perez et al., 2001]. Hierbei wird
der Nervus opticus von der die Blutgefäße führenden Sehnervenscheide getrennt
und diese mit einem Nylonfaden [Nishiwaki, Ueda et al., 2003; Reichstein, Ren et al.,
2007] unter Schonung des Nerven ligiert. Durch Funduskopie ist eine Verifizierung
der
Ischämie, sowie nach der Ischämiezeit die Sicherstellung der Reperfusion
möglich.
Dieses Verfahren führte zum Untergang einer Vielzahl von retinalen Ganglienzellen.
Um sicherzustellen, dass die beobachtete Schädigung wirklich aufgrund der
Ischämie und nicht durch das Operationstrauma entsteht, wurde eine „ShamOperation“
am
rechten
Auge
durchgeführt.
Alle
Operationsschritte
wurden
durchgeführt, ohne jedoch eine Ischämie zu induzieren [Nishiwaki, Ueda et al., 2003;
Zhang, Chaudhry et al., 2003].
Es zeigten sich im Netzhautpräparat des rechten Auges ebenfalls zahlreiche
degenerierte Ganglienzellen und aktivierte Mikroglia. Die beobachtete Schädigung
der Retina ist demnach auch durch die Operationstechnik und nicht allein durch die
Unterbindung der Gefäße verursacht. Ausmaß und Ursache der Schädigung
schienen somit nicht reproduzierbar und nicht zur Untersuchung der Wirksamkeit
eines Medikamentes geeignet. Sicher hätte sich die Qualität und Konstanz der
Diskussion
59
Schädigung mit steigenden Operationsanzahlen verbessert, ein traumatischer
Nervenschaden ist jedoch bei diesem Verfahren nicht sicher auszuschließen. Daher
wurde dieses Modell verlassen und ein anderes Ischämiemodell ausgewählt.
4.3.2 Retinale Ischämie durch erhöhten intraokularen Druck
Eine weit verbreitete Methode zur Erzeugung einer retinalen Ischämie ist die
Erhöhung des intraokularen Druckes durch Injektion von NaCl 0,9% in die
Vorderkammer [Lagrèze, Knorle et al., 1998; Lagrèze, Muller-Velten et al., 2001;
Adachi, Kashii et al., 1998; Adachi, Takahashi et al., 1996; Katai und Yoshimura
1999].
In den von uns durchgeführten Experimenten führte eine Ischämie von 60 Minuten
Dauer verlässlich zu einer Anzahl überlebender Ganglienzellen von 1271 Zellen pro
mm2, was einer verbleibenden Zelldichte von 48,2% verglichen mit den rechten
Kontrollaugen entspricht. Nach retinaler Ischämie betrug die durchschnittliche Anzahl
der aktivierten Gliazellen 374 Zellen pro mm2.
Die Art und Weise, die retinalen Ganglienzellen zu detektieren (beispielsweise
Färbung mit Cresyl-Violet [Jehle, Lagrèze et al., 2000], Immunmarkierung mittels
Brn-3b [Leahy, Ornberg et al., 2004], retrograde Markierung mit Fluorogold oder
diAsp [Lafuente, Villegas-Perez et al., 2002; Selles-Navarro, Villegas-Perez et al.,
1996]), die Methode, die retinale Ischämie zu erzeugen (beispielsweise durch Ligatur
der Gefäße [Lafuente, Villegas-Perez et al., 2001], Erhöhung des Augendruckes
durch Punktion der Vorderkammer [Jehle, Lagrèze et al., 2000]) und besonders die
Anzahl der Tage nach der Ischämie entscheiden, wie viele retinale Ganglienzellen
nach dem Ereignis verbleiben. Die Prozentzahl der absterbenden Zellen in den
verschiedenen Studien ist daher nur schwierig zu vergleichen.
Nach Erhöhung des Augeninnendruckes auf 120 mm Hg für 60 Minuten konnte die
Arbeitsgruppe um Prof. Lagrèze [Lagrèze, Knorle et al., 1998; Lagrèze, Muller-Velten
et al., 2001] schon in vorangegangenen Arbeiten gute neuroprotektive Effekte für
verschiedene Substanzen zeigen.
Die gewählten 60 Minuten in den Versuchsreihen erschienen eine optimale Dauer
der Ischämie zu sein. Das Modell der retinalen Ischämie erwies sich als zuverlässig
60
Diskussion
und
gut
reproduzierbar
und
ist
somit
gut
zur
Untersuchung
von
Medikamentenwirkungen geeignet.
4.3.3 Sehnervenquetschung
Als Modell für eine axonale Schädigung von retinalen Ganglienzellen wählten wir die
kalibrierte Sehnervenquetschung. Die Sehnervenquetschung ist ein weit verbreitetes
Modell zur Untersuchung des Untergangs retinaler Ganglienzellen und von
Apoptoseprozessen, welches einer traumatischen optischen Neuropathie entspricht,
zudem aber auch Prozesse des Zelluntergangs beim Glaukom beinhaltet [Nickells,
2004].
Die von uns durchgeführte Sehnervenquetschung (Dauer 10 Sekunden, 100 µm
Restöffnung) führte zu einer Reduktion der retinalen Ganglienzellen auf 344 Zellen
pro mm2 nach 10 Tagen, was einer Reduktion der Zellen von 86%, verglichen mit
der Kontrollgruppe entspricht. Die Anzahl der aktivierten Gliazellen stieg auf 592
Zellen pro mm2 an. Durch gleichzeitig durchgeführte funktionelle Untersuchungen der
Ganglienzellen konnten wir zeigen, dass die Sehnervenquetschung ein Modell mit
größerem Schädigungsausmaß darstellt, als dies bei der Ischämie der Fall ist.
Die Dichte der Ganglienzellen wird reduziert, die Anzahl der aktivierten Gliazellen ist
verglichen mit der Ischämie erhöht und eventuell vorhandene neuroprotektive Effekte
lassen sich weniger deutlich nachweisen.
Die Überlebensrate der retinalen Ganglienzellen nach Sehnervenquetschung ist
abhängig von verschiedenen Gegebenheiten, beispielsweise Schweregrad und
Dauer der Schädigung. Dauer der Sehnervenquetschung von 1 Sekunde [Maeda,
Sawada et al., 2004],
20 Sekunden [Vorwerk, Zurakowski et al., 2004] bis 30
Sekunden [Mawrin, Pap et al., 2003] werden in der Literatur beschrieben. Eine
andere Möglichkeit besteht in der Quetschung in 3 Intervallen von jeweils 10
Sekunden [Freeman und Grosskreutz, 2000; Grosskreutz, Hanninen et al., 2005].
Yoles und Schwartz zeigten, das leichte Sehnervenquetschung im Rattenmodell zu
einem Verlust der Ganglienzellen von mehr als 90% nach 5 Tagen führt [Yoles,
Wheeler et al., 1999]. Gellrich et al. [Gellrich, Schramm et al., 2002] zeigten den
Zusammenhang zwischen verwandter Kraft und Schädigungsdauer des Sehnerven.
Diskussion
61
In weiteren Versuchen wurde nach dem optimalen Entnahmezeitpunkt gesucht.
Wenn man zudem davon ausgeht, dass neuroprotektive Substanzen lediglich den
Zelluntergang verlangsamen, ihn jedoch nicht aufhalten können, spielt der
Untersuchungszeitpunkt eine große Rolle. Wird dieser zu lang nach der Schädigung
gewählt, zeigen sich in den Ergebnissen nur geringe oder keine Wirkungen durch
das Medikament, da viele Zellen bereits apoptotisch untergegangen sind. Bei zu
früher Auswertung und somit noch geringem Zellschaden sind keine großen
Unterschiede zu erwarten. In unseren Experimenten beobachteten wir eine
Reduktion der Anzahl der retinalen Ganglienzellen um 51% bei Untersuchung 7 Tage
nach Schädigung, nach 10 Tagen 86% und bei Entnahme der Netzhäute nach 14
Tagen Reduktion der Zellzahl um 91% der ursprünglich vorhandenen Ganglienzellen.
Im Vergleich zu unseren Daten fanden Maeda et al. [Maeda, Sawada et al., 2004]
vier Wochen nach Quetschung von 30 Sekunden mittels eines Clips 37,2% ± 8,4%
der ursprünglich vorhandenen retinalen Ganglienzellen. Levkovitch-Verbin et al.
[Levkovitch-Verbin, Harris-Cerruti et al., 2000] beschreiben nach Quetschung von 1
Sekunde mit einer kalibrierten Pinzette eine Überlebensrate der retinalen
Ganglienzellen von 47% nach 7 Tagen und 27% nach 14 Tagen. Bei dreimaligem
Crush von jeweils 10 Sekunden mit einer kalibrierten Pinzette verbleiben von den
ursprünglich vorhandenen Ganglienzellen 39% [Freeman und Grosskreutz, 2000].
Die Anzahl der überlebenden retinalen Ganglienzellen nach Sehnervenquetschung
variiert bei den verschiedenen Autoren. Dies könnte darauf zurückzuführen sein,
dass sich die Experimente hinsichtlich Entnahmezeitpunkt der Netzhäute, Dauer der
Quetschung und der verwandten Instrumente unterscheiden. Die Pinzetten und der
Clip (siehe oben) wurden hinsichtlich ihrer Restöffnung nicht näher beschrieben.
Bei der Quetschung muss unbedingt auf die versorgenden Gefäße geachtet werden,
um diese nicht zu verletzen. Eine funduskopische Kontrolle der Reperfusion ist
unbedingt erforderlich. Bleibt diese aus, variiert das Ausmaß der Schädigung, denn
durch die retinale Ischämie würde ein zusätzlicher Schaden entstehen.
Die Quetschung des Sehnerven ist eine gut zu erlernende, standardisiert
reproduzierbare Methode zur Schädigung. Allerdings ist der gesetzte Schaden auch
bei einer Pinzette mit einer Restöffnung von 100 µm sehr hoch.
62
Diskussion
4.4 Neuroprotektion mit NAP
Die
vorliegende
Doktorarbeit
hatte
die
Untersuchung
einer
möglichen
neuroprotektiven Wirkung des Neuropeptids NAP zum Ziel. Wir zeigten, dass die
intraperitoneale Gabe des Neuropeptids NAP (100 µg/kg) sowohl nach einer
Ischämie, als auch nach Kompression des Sehnerven zu einer verringerten Apoptose
von retinalen Ganglienzellen und zu geringerer Aktivierung der Mikroglia führte.
Die Überlegungen, die hinter der Auswahl der Substanz NAP standen, waren die
bereits gezeigten neuroprotektiven Wirkungen, die NAP bei Ganglienzellen in vitro
[Lagrèze, Pielen et al., 2004] gezeigt hatte. Zudem wirkt NAP in vivo neuroprotektiv
in Tiermodellen für cerebrale Ischämie [Leker, Teichner et al., 2002] und schwerem
Schädel-Hirn-Trauma [Beni-Adani, Gozes et al., 2001].
Im Modell der Ischämie zeigten wir, dass die intraperitoneale Injektion von NAP zu
einer signifikanten Erhöhung der Anzahl überlebender retinaler Ganglienzellen um
40% auf 1781 Zellen pro mm2 führt. Gleichzeitig wird die Anzahl aktivierter Gliazellen
um 45,5% auf 204 Zellen pro mm2 vermindert, verglichen mit der Kontrollgruppe.
Beide Ergebnisse waren signifikant.
NAP wurde bereits in einem anderen Modell neuronaler Ischämie getestet. Leker et
al. [Leker, Teichner et al., 2002] konnten zeigen, dass bereits eine einzige
intravenöse Injektion von NAP (3µg/kg) bis zu 4 Stunden nach Trauma protektive
Effekte (Infarktgrösse, sensorische und motorische Reflexe) in einem Modell fokaler
zerebraler Ischämie aufweist.
Nach Sehnervenquetschung führt die intraperitoneale Verabreichung von NAP zu
einer Erhöhung der Anzahl überlebender retinaler Ganglienzellen auf 449 Zellen pro
mm2, was einer Erhöhung um 30,6% verglichen mit der Kontrollgruppe entspricht.
Dieses Ergebnis war statistisch knapp nicht signifikant. Da die Dichte der aktivierten
Gliazellen signifikant um 29,1% verglichen mit der Kontrollgruppe reduziert wurde,
was einer Dichte von 420 Zellen pro mm2 entspricht, nehmen wir trotzdem
neuroprotektive Effekte von NAP im Modell der axonalen Schädigung an.
In unseren Untersuchungen zeigten sich bei Applikation von NAP innerhalb beider
Schädigungsmodelle weniger Gliazellen als in den jeweiligen Kontrollgruppen. Dies
verdeutlicht den Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Ganglienzellschädigung
63
Diskussion
und der Aktivierung der Gliazellen. Unsere Resultate deuten darauf hin, dass bei
Applikation von NAP in geringerem Ausmaß Phagozytose stattfindet. Zusätzlich ist
es möglich, dass NAP eine Wirkung auf Astrozyten haben könnte und dadurch
axonale Degeneration oder sekundäre Degeneration von Neuronen verhindern
könnte.
Die
Quantifizierung
der
aktivierten
Gliazellen
könnte
zusätzliche
Informationen über Medikamentenwirkung in neuroprotektiven Studien liefern.
Um NAP als neuroprotektives Augenmedikament einsetzen zu können, kommen eine
Vielzahl von Applikationsformen in Frage.
Durch intranasale Substanzapplikation kann eine gute Bioverfügbarkeit erreicht
werden. Bereits 30 Minuten nach Applikation lässt sich radioaktiv markiertes NAP im
Magen-Darmtrakt und in der Leber detektieren. Im Gehirn konnte etwa 10 bis 20%
der Aktivität nachgewiesen werden [Gozes, Divinsky et al., 2003]. Bei intranasaler
Applikation ist zu beachten, dass die Substanz nicht durch Nasensekret wieder
abtransportiert wird, bevor eine Aufnahme möglich ist. Allerdings erfolgt durch die gut
durchblutete Schleimhaut eine schnelle Aufnahme.
Bei intravenöser Applikation in einem Rattenmodell für cerebrale Ischämie wurde
NAP radioaktiv markiert und die Konzentrationen bestimmt. Bereits 15 Minuten nach
Injektion lässt sich Radioaktivität im Gehirn nachweisen und verbleibt für mindestens
1 Stunde im ischämischen Gewebe, was auf eine Akkumulation schließen lässt.
Ungefähr 30 Minuten nach Applikation ist eine homogene Verteilung messbar.
Zwischen Dosis und Anreicherung im Gehirn zeigt sich nahezu ein linearer
Zusammenhang [Leker, Teichner et al., 2002].
Auch
bei
intraperitonealer
Injektion
zeigten
Untersuchungen
mit
radioaktiv
markiertem NAP eine ausreichende Bioverfügbarkeit [Spong, Abebe et al., 2001]. Die
intraperitoneale Applikation eines Medikamentes stellt eine gute Möglichkeit dar, ein
Depot zu setzen, von welchem aus das Medikament langsam und kontinuierlich
resorbiert wird und einen ausreichenden Wirkspiegel erreichen kann.
In unseren Experimenten wurde NAP in vier Dosen um das schädigende Ereignis
herum intraperitoneal appliziert. Weitere Experimente sind nötig, um Informationen
über die neuroprotektiven Möglichkeiten zu erhalten, wenn die Substanz an einem
Zeitpunkt nach einer Schädigung verabreicht wird.
Diskussion
64
Der Vergleich der Wirkung von NAP in unseren Experimenten mit anderen Studien
ist schwierig, da die vorliegende Arbeit die erste Studie ist, welche NAP am Auge
einsetzt.
Unsere Ergebnisse, zusammen mit den Daten aus der in vitro Studie von Lagrèze et
al. [Lagrèze, Pielen et al., 2004] legen effektive neuroprotektive Eigenschaften von
NAP bei verschiedenen Augenerkrankungen, entweder ausgehend vom Soma oder
vom Axon nahe. Weitere Versuche werden notwendig sein, um Zeit- und DosisWirkungskurven aufzustellen, verschiedene Applikationsformen zu beurteilen und zu
klären, ob NAP in der Lage ist, die Funktion der Retina und des Sehnerven nach
Ischämie aufrecht zu erhalten.
4.5 Semidünnschnitte vom Sehnerven
Neben dem Auszählen der Ganglienzellen zur Quantifizierung einer Schädigung und
zur Untersuchung einer Medikamentenwirkung wäre es wünschenswert, auf weitere
Möglichkeiten zur Erfassung von morphologischen Veränderungen zurückgreifen zu
können.
Das Absterben der Ganglienzellen repräsentiert den Endzustand einer Erkrankung
oder eines Schadens. Beurteilung von subletalen Schädigungen und Veränderungen
der Ultrastruktur könnten helfen, das Ausmaß eines Zellschadens besser bewerten
zu können. Die Anfertigung von Semidünnschnitten und anschließende Färbung mit
Toluidin-Blau wurde exemplarisch an Sehnerven sowohl aus der Gruppe der
Ischämie und der Sehnervenquetschung, behandelt mit NAP und Kontrollgruppe
durchgeführt. Zusätzlich wurden einige Kontrollpräparate von rechten Sehnerven
angefertigt. Anschließend wurden die Präparate qualitativ mittels des optic nerve
injury grade (ONIG) beurteilt [Morrison, Moore et al., 1997]. Es zeigten sich bei der
qualitativen Auswertung keine signifikanten Unterschiede innerhalb der mit NAP
behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe. Allerdings zeigten sich signifikant
geringere Punktwerte bei der Ischämie als bei der Sehnervenquetschung. Eine
quantitative Auswertung der Axone war aufgrund der mikroskopischen Auflösung
nicht möglich.
65
Diskussion
Andere Arbeitsgruppen verwenden den ONIG zur Bewertung eines gesetzten
Schadens. Fortune et al. [Fortune, Bui et al., 2004] und Morrison et al. [Morrison,
Moore et al., 1997] konnten zeigen, dass mit Erhöhung des Augeninnendruckes der
ONIG ebenfalls zunimmt und bei einem Augendruck von 35 mm Hg über fünf
Wochen bei durchschnittlich 4,8 liegt. Bei Erhöhung um etwa 1 mm Hg im Vergleich
zum ungeschädigten Auge bleibt der ONIG bei 1,0. Bei Erhöhung um etwa 3 mm Hg
liegt der ONIG zwischen 1,7 und 2,6. Bereits ab intraokularer Druckerhöhung um
etwa 10 bis 20 mm Hg im Vergleich zum Normalwert liegt der ONIG bei 5,0 [Jia,
Cepurna et al., 2000].
Bei chronischen Prozessen und graduierteren Schäden scheint sich dieses
Auswertungsmodell besser als bei akuten Schädigungsmodellen zu eignen.
4.6 Immunhistochemische Aufarbeitung
Eine
weitere
Möglichkeit,
Ganglienzellschäden
zu
quantifizieren
ist
die
immunhistochemische Färbung bestimmter zellulärer Strukturproteine.
Neurofilamente sind Bestandteile peripherer und zentraler Neurone. Da die
Reaktivität bei der Immunhistochemie gegen Neurofilamente vor allem in retinalen
Ganglienzellen und ihren Axonen vorhanden ist, dient diese Markierung der
Visualisierung von retinalen Ganglienzellen [Ruiz-Ederra, Garcia et al., 2004].
Ruiz-Ederra et al. [Ruiz-Ederra und Vecino, 2001] beschrieben, dass sich bei
neurodegenerativen Erkrankungen die Anordnung der Neurofilamente verändert und
dass eine Akkumulation in Soma und Axon von Motorneuronen stattfindet.
Das myelinbasische Protein (MBP) ist ein Antigen im Myelin und stellt einen Marker
für die Phagozytose von Myelin dar. Nach neuronaler Schädigung kann eine erhöhte
Präsenz von MBP und MBP-positiven Makrophagen nachgewiesen werden [Ahmed,
Gveric et al., 2001]. Bei erhöhtem Umsatz von Myelin in inflammatorischen Zellen,
beispielsweise nach traumatischer Hirnschädigung, zeigt sich eine erhöhte Präsenz
von MBP in den Mikroglia [Ahmed, Baker et al., 2003].
Um die Sehnerven in unseren Geweben auf die Expression von Neurofilament 160
und des myelinbasischen Proteins hin zu untersuchen, wurden Paraffinschnitte aus
der Versuchsgruppe der Sehnervenquetschung, jeweils aus der mit NAP
66
Diskussion
behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe angefertigt. Bei der mikroskopischen
Betrachtung konnten qualitativ geringfügige Unterschiede in der Verteilung der
Strukturproteine zwischen geschädigten und ungeschädigten Sehnerven beobachtet
werden. Allerdings war es aufgrund der Präparatqualität nicht möglich, diese
Unterschiede zu quantifizieren. Zwischen den Präparaten der mit NAP behandelten
Gruppe und der Kontrollgruppe waren keine Unterschiede fassbar.
4.7 Ausblick
Mit der vorliegenden Arbeit konnten wir zeigen, dass NAP eine potente
neuroprotektive Substanz darstellt, die am Auge einsetzbar wäre. NAP schützt
retinale
Ganglienzellen
sowohl
bei
axonalem
Schaden
im
Modell
der
Sehnervenquetschung, als auch bei somatischem Schaden im Modell der retinalen
Ischämie durch temporäre Erhöhung des Augeninnendruckes.
Dosis-Wirkungs-Kurven
von
NAP
könnten
helfen,
das
Ausmaß
eines
neuroprotektiven Effektes noch weiter zu optimieren. Daran könnten sich Vergleiche
der systemischen oder topischen Applikation und der jeweiligen erreichbaren
Bioverfügbarkeit anschließen.
Es wäre aufschlussreich, die genauen Wirkmechanismen zu untersuchen, wie NAP
seine neuroprotektiven Eigenschaften vermittelt. Zu diesem Zweck könnten
einerseits modulierende Substanzen verschiedener Apoptoseprozesse eingesetzt
werden, andererseits könnte zu diesem Zweck die Aktivierung bestimmter Gene oder
die Wirkung in verschiedenen Knock-out Mäusen untersucht werden.
Problem der klinischen Anwendung ist, dass die Mechanismen in Tieren nur
ansatzweise auf den Menschen übertragbar sind. In unseren Experimenten mit NAP
konnte zwar ein neuroprotektiver Effekt gezeigt werden, letztlich bleibt zu klären, ob
dieser Effekt beim Menschen überhaupt relevant ist. Umfangreiche Studien sind
notwendig, um die Effekte, die optimale Dosierung und mögliche Nebenwirkungen
am Menschen zu evaluieren. Da die Wirkung bei Patienten häufig geringer ausfällt
und die Studien im Vergleich zu Tierexperiment heterogen sind, ist es bei Patienten
schwieriger, signifikante Ergebnisse zu erhalten. Zudem muss man beachten, dass
Diskussion
67
zahlreiche Substanzen neuroprotektive Effekte zeigen und den Untergang retinaler
Ganglienzellen teilweise reduzieren, jedoch nicht vollständig aufhalten.
Zusammenfassung
68
5. Zusammenfassung
Gemeinsame Endstrecke vieler Sehnervenerkrankungen ist der Untergang retinaler
Ganglienzellen und ihrer Axone durch Apoptose und damit der Verlust der
Sehfähigkeit. Neuroprotektion beschreibt den Versuch, mittels Pharmaka den
apoptotischen Untergang von Nervenzellen zu reduzieren oder zu verhindern.
NAP, ein aus acht Aminosäuren bestehendes Polypeptid ist das kleinste aktive
Fragment von ADNP. Für NAP sind in einer Vielzahl neuronaler Erkankungsmodelle
zytoprotektive Effekte beschrieben, in vitro Studien legen spezifische Wirkungen zur
Verhinderung der Apoptose nahe.
Ziel dieser Arbeit war es, die Wirksamkeit von NAP auf den Untergang retinaler
Ganglienzellen bei der Sehnervenquetschung und der retinalen Ischämie in der Ratte
zu untersuchen. Hierfür mussten zunächst beide Schädigungsmodelle, sowie das
Quantifizierungsverfahren des Ganglienzellschadens in der Universitäts-Augenklinik
etabliert werden. Die Ganglienzellen wurden mittels stereotaktischer Injektion von
Fluorogold markiert, die Auszählung erfolgte im Netzhautflachpräparat.
Intraperitoneale Verabreichung von NAP erhöhte bei der Sehnervenquetschung die
Anzahl überlebender retinaler Ganglienzellen um 30,6%, die Anzahl der aktivierten
Gliazellen wurde um 29,1% im Vergleich mit der Kontrollgruppe vermindert.
Bei retinaler Ischämie wurde die Dichte überlebender retinaler Ganglienzellen durch
NAP um 40,2% gesteigert und die der aktivierten Gliazellen um 45,5% vermindert.
Die Anzahl der Ganglienzellen und der aktivierten Gliazellen aller Netzhautpräparate
korrelieren signifikant.
Neben quantitativer Auswertung durch Auszählen der beiden Zellpopulationen wurde
versucht, durch Semidünnschnitte und Immunhistochemie das Ausmaß einer
Schädigung weiter zu charakterisieren.
Zukünftig wäre es aufschlussreich, die molekularen Wirkmechanismen von NAP zu
untersuchen. Inwieweit sich die neuroprotektiven Effekte steigern lassen, könnte
durch Anwendung weiterer Applikationsformen und unterschiedlicher Dosierungen
beurteilt werden.
Letztlich bleibt zu klären, inwieweit sich unsere Ergebnisse auf den Menschen
übertragen lassen und ob NAP im klinischen Einsatz Nervenzellen erhalten kann.
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Danksagung
76
7. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich einigen Menschen danken, ohne die diese Arbeit nicht
zustande gekommen wäre.
Zunächst herzlichen Dank an Prof. Dr. W. A. Lagrèze für die Überlassung des
Themas der Dissertation und die Erstkorrektur der Arbeit.
Besten Dank an Prof. Dr. S. Rauer für die Übernahme der Zweitkorrektur.
Dank an Prof. Dr. T. Reinhard, dass ich meine Doktorarbeit an der Augenklinik der
Universität Freiburg verfassen durfte.
Großen Dank an meinen Betreuer Dr. T. Jehle, der mich geduldig in die Methoden
einwies und mir sowohl bei den Experimenten, als auch bei der schriftlichen
Ausarbeitung immer mit Hilfe und für Fragen zur Seite gestanden hat.
Herzlichen Dank an Frau R. Buchen aus dem histologischen Labor der Augenklinik,
die mich bei der Aufarbeitung der Sehnerven stets mit Rat und Tat unterstützt hat.
Dank an Dr. R. Knoth aus der Abteilung für Neuropathologie für die Mitbenutzung
des Mikroskops und die Beratung bei der histologischen Aufarbeitung.
Vielen Dank an meine Eltern, ohne deren großzügige Unterstützung das
Medizinstudium und die vorliegende Arbeit nicht möglich gewesen wären.
77
Lebenslauf
8. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Simone Maria Auer
Anschrift:
Eisenlohrstraße 6
79115 Freiburg
E-Mail:
[email protected]
Telefon:
0761-7077621
Geburtsdatum:
29.04.1982
Geburtsort:
Engen
Eltern:
Evelin Maria Auer, geb. Martin
Richard Heinz Auer, Schlossermeister
Ausbildung
05/2008
Staatsexamen Humanmedizin
08/2006 bis 07/2007
Praktisches Jahr
12/2004 bis 10/2007
Promotion zum Thema „Neuroprotektion mit dem
Neuropeptid NAP nach Sehnervenquetschung und
Erhöhung des intraokularen Druckes“ an der
Universitätsaugenklinik
August 2003
Ärztliche Vorprüfung
Seit 10/2001
Studium der Humanmedizin, Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
09/1992 bis 07/2001
Nellenburg-Gymnasium Stockach
09/1988 bis 07/1992
Grund- und Hauptschule Eigeltingen
Praktika und Famulaturen
Pflegepraktikum
Loretto-Krankenhaus Freiburg, Chirurgie
Famulaturen
In den Bereichen Anästhesie, Orthopädie, Augenheilkunde
und Unfallchirurgie