DissertationFabianPridoehl 2016 (002)

Identifikation und Analyse von Zielgenen
des terminalen Systems in
Tribolium castaneum
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Fabian Pridöhl aus Hof
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2016
Vorsitzende/r des Promotionsorgans: Prof. Dr. Georg Kreimer
Gutachter/in:
PD Dr. Michael Schoppmeier
Prof. Dr. Martin Klingler
Inhalt
Zusammenfassung.................................................................................................................................. vii
Summary ................................................................................................................................................. ix
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................................. xi
Tabellenverzeichnis ................................................................................................................................ xii
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................................... xiii
1. Einleitung ............................................................................................................................................. 1
1.1 Ziele der Entwicklungsbiologie ...................................................................................................... 1
1.2 Embryonalentwicklung von Insekten ............................................................................................ 2
1.3 Drosophila melanogaster als Beispiel für Langkeiminsektenentwicklung .................................... 2
1.3.1 Maternale Achsendeterminierung in Drosophila ................................................................... 3
1.3.2 Achsensysteme in Drosophila................................................................................................. 4
1.4 Achsendeterminierung in Tribolium.............................................................................................. 7
1.4.1 Anterior-posteriore Musterbildung in Tribolium ................................................................... 8
1.4.2 Dorso-ventrale Achsenbildung in Tribolium ......................................................................... 12
1.5 Das terminale System in Drosophila und Tribolium .................................................................... 13
1.6 Die Identifikation neuer Kandidatengene in Tribolium castaneum ............................................ 17
1.7 Ziele dieser Arbeit ....................................................................................................................... 18
2. Material und Methoden .................................................................................................................... 21
2.1 Verwendete Lösungen................................................................................................................. 21
2.2 Käferhaltung und Stämme .......................................................................................................... 22
2.3 RNA-Interferenz (RNAi) ............................................................................................................... 22
2.3.1 Synthese von Doppelstrang-RNA (dsRNA) ........................................................................... 22
2.3.2 Primer-Design ....................................................................................................................... 25
2.3.3 Gelelektrophorese ................................................................................................................ 26
2.3.4 Pupale Injektion.................................................................................................................... 26
2.3.5 Adulte Injektion .................................................................................................................... 27
2.4 Larvale Kutikulapräparate ........................................................................................................... 28
2.5 Whole mount in-situ Hybridisierung und Antikörperfärbung ..................................................... 28
2.5.1 Fixierung von Embryonen..................................................................................................... 29
2.5.2 Sondensynthese Digoxygenin (DIG) gelabelter Sonden ....................................................... 29
2.5.3 In-situ Hybridisierung ........................................................................................................... 30
2.5.4 Antikörperfärbung ................................................................................................................ 30
2.6 SOLiD™ Next-Generation-Sequencing......................................................................................... 31
iiv
2.6.1 Gewinnung der Embryonen für das NGS.............................................................................. 31
2.6.2 mRNA-Aufreinigung.............................................................................................................. 31
2.6.3 SOLiD®-Next-Generation-Sequencing .................................................................................. 32
2.7 "Mini-Screen" und Rescreen ....................................................................................................... 32
2.7.1 Arbeitsablauf des Mini-Screens ............................................................................................ 33
2.7.2 Rescreen ............................................................................................................................... 33
2.8 Live-Imaging ................................................................................................................................ 34
2.8.1 Vorbereitung für das Live-Imaging ....................................................................................... 34
2.8.2 Präparation der Embryonen für das inverse Live-Imaging ................................................... 34
2.8.3 Einstellungen des LAS AF Version 2.4.1................................................................................ 35
2.9 Dokumentation ........................................................................................................................... 35
3. Ergebnisse ......................................................................................................................................... 37
3.1 Next-Generation-Sequencing als Ansatz zur Identifikation von Zielgenen des terminales
Systems.............................................................................................................................................. 37
3.2 Vom Next-Generation-Sequencing zu den Kandidatengenen .................................................... 39
3.2.1 Bestimmung homologer Gene und Vergleich mit anderen Datenbanken ........................... 40
3.2.2 Kriterien für die Auswahl und Selektion der Kandidatengene ............................................. 41
3.3 Ergebnisse des "Mini-Screens" .................................................................................................... 42
3.3.1 Analyse der Expression der Kandidatengene ....................................................................... 42
3.3.2 Larvale RNAi-Phänotypen des Mini-Screens ........................................................................ 44
3.3.3 Embryonale RNAi-Phänotypen des Mini-Screens ................................................................ 48
3.4 Live-Imaging der Embryonalentwicklung von Tribolium castaneum .......................................... 53
3.5 Rescreen für ausgewählte Kandidaten ........................................................................................ 57
3.5.1 Verifizierung der Experimente des Mini-Screens und Ergebnisse des Rescreens................ 59
3.6 Tribolium maelstrom besitzt eine wichtige Funktion in der Embryogenese ............................... 66
3.6.1 Tc'mael ist maternal exprimiert ........................................................................................... 66
3.6.2 Larvale Tc'mael-RNAi-Phänotypen zeigen vier Klassen an Phänotypen .............................. 68
3.6.3 Live-Imaging von Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigt zusätzlich einen späten Serosadefekt ... 72
3.6.4 Das Markergen Tc'wg zeigt nach der Invagination gestörte Expression in prägnathalen und
gnathalen Segmenten ................................................................................................................... 75
3.6.5 Die Expressionen der Markergene Tc'eve und Tc'zen-1 zeigen Defekte in der
Wachstumszone und der extraembryonalen Serosa .................................................................... 77
3.6.6 Der Knock-down von Tc'maelstrom beeinflusst das Wnt-Signal in der Wachstumszone.... 81
3.6.7 Tc'maelstrom ist als Zielgen des terminalen Systems an der frühen, terminalen
Musterbildung und Morphogenese beteiligt ................................................................................ 82
iv
3.7 Der Tc'Torso-Signalweg moduliert die Tc'Dpp-Aktivität mittels Tc'CHOp24............................... 85
3.7.1 Expression von Tc'CHOp24 ................................................................................................... 85
3.7.2 Larvale Phänotypen zeigen anteriore und posteriore Defekte ............................................ 88
3.7.3 Markergenfärbungen in Tc'CHOp24-RNAi zeigen Defekte ab dem differenzierten
Blastoderm .................................................................................................................................... 91
3.7.4 Live-Imaging zeigt starke Defekte in Tc'CHOp24-RNAi bei der Invagination ....................... 95
3.7.5 Der Knock-down von Tc'CHOp24 zeigt bereits in blastodermalen Anlagen Defekte ......... 100
3.7.5 Tc'CHOp24 moduliert dpp-Aktivität ................................................................................... 104
3.7.6 Tc'CHOp24-Expression in Tc'tsl- und Tc'cic-RNAi-Embryonen ........................................... 111
4. Diskussion ........................................................................................................................................ 114
4.1 Das Zielgen des terminalen Systems Tc'maelstrom ist für anteriore und posteriore
Morphogenese essentiell ................................................................................................................ 114
4.1.1 Der Knock-down von Tc'maelstrom führt wahrscheinlich zu Defekten bei der
Morphogenese der Serosa .......................................................................................................... 114
4.1.2 Defekte der prägnathalen und gnathalen Segmente der Tc'mael-RNAi-Embryonen sind
wahrscheinlich auf Defekte der extraembryonalen Serosa zurückzuführen .............................. 117
4.1.3 Mögliche Ursachen der Defekte der extraembryonalen Membran in der späteren
Entwicklung von Tc'mael-RNAi-Embryonen ................................................................................ 118
4.1.4 Evertierte Larven und Defekte beim Rückenschluss sind auf die späteren Defekte der
Serosa zurückzuführen ................................................................................................................ 120
4.1.5 Tc'maelstrom hat eine essentielle Funktion bei der Etablierung der Wachstumszone ..... 121
4.1.6 Tc'maelstrom bedingt als Zielgen des terminalen Systems anteriore und posteriore
Morphogenese ............................................................................................................................ 124
4.2 Tc'CHOp24 ist für die frühe Embryonalentwicklung essentiell ................................................. 127
4.2.1 Tc'CHOp24 moduliert die Tc'dpp-Aktivität ......................................................................... 127
4.2.2 Tc'CHOp24-Invaginations-Phänotypen entstehen nicht durch Defekte bei der WntSekretion ..................................................................................................................................... 130
4.2.3 Die Bedeutung von Tc'CHOp24 als Zielgen des terminalen Systems ................................. 131
4.2.4 Integration der AP- und DV-Achse in Tribolium ................................................................. 136
4.3 Die differenzielle Genexpressionsanalyse vermittelt viele Zielgene und bisher unbekannte
Funktionen des terminalen Systems ............................................................................................... 139
4.3.1 Die differenzielle Genexpressionsanalyse zeigt viele potentielle Gene mit Funktion in der
frühembryonalen Entwicklung von Tribolium ............................................................................. 139
4.3.2 Die Bedeutung des terminalen Systems in Kurzkeiminsekten ........................................... 140
Anhang ................................................................................................................................................ 144
Anhang 1: Live-Imaging-Protokoll ................................................................................................... 155
v
Anhang 2: Transcriptome sequencing reveals maelstrom as essential target gene of the terminalsystem in the red flour beetle Tribolium castaneum ...................................................................... 158
Literaturverzeichnis ............................................................................................................................. 196
Danksagung ......................................................................................................................................... 212
vi
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die anterior-posteriore Achsenentwicklung ist ein essentieller Bestandteil der Embryonalentwicklung von Insekten. Als Teil dieser Achsenbildung ist das terminale System für Musterbildungsprozesse der terminalen Strukturen Acron und Telson verantwortlich. Die Umsetzung dieses Torso-Signals wird in dem Langkeiminsekt Drosophila über Gap-Gene realisiert wird und ist bereits sehr gut untersucht. Die Bedeutung
des terminalen Systems in dem Kurzkeiminsekt Tribolium ist im Vergleich dazu durch
den unterschiedlichen Entwicklungsmodus deutlich umfangreicher. Die Summe der
bisher bekannten Zielgene des Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalwegs lassen nicht die
zugehörigen Phänotypen vollständig erklären. Diese Arbeit sollte bisher unbekannte
Zielgene des Torso-Signalwegs identifizieren und zum umfassenderen Verständnis,
der Umsetzung dieses Signals, auch analysieren.
Zur Identifikation weiterer Zielgene wurde die differentielle Genexpression der Repression (Tc'tsl-RNAi) mit der Derepression des Torso-Signals (Tc'cic-RNAi) mittels
Next-Generation-Sequencing verglichen. 50 Potentielle Kandidaten wurden in einem
"Mini-Screen" auf Expression, embryonale und larvale RNAi-Phänotypen untersucht.
Die Ergebnisse dieses Screens zeigen, dass die differentielle Genexpressionsanalyse eine durchaus geeignete Methode zur Identifikation bislang unbekannter Zielgene
des terminalen Systems in Tribolium ist.
Die Bedeutung ausgewählter Kandidaten in der Embryonalentwicklung wurde daraufhin durch dafür etabliertes Live-Imaging und auf Markergenexpression untersucht. Durch diesen Prozess wurden zwei Kandidaten, Tc maelstrom und Tc
CHOp24, ausgewählt, um im Detail analysiert zu werden. Die Ergebnisse dieser
Analysen zeigen auf der einen Seite, dass die anterior-posteriore Achsenentwicklung
mit der dorso-ventralen Achsenentwicklung in Tribolium stärker gekoppelt ist als bisher angenommen. Das Cargorezeptor-Ortholog Tc'CHOp24 ist ein Zielgen des terminalen Systems und reguliert die Tc'Dpp-Aktivität im anterioren Bereich des Blastoderms. Folglich könnten über die Modulation der Dpp-Aktivität durch das TorsoSignal beide Achsen bei der Bildung der extraembryonalen Serosa integriert sein.
iiv
Zusammenfassung
Auf der anderen Seite könnte die Umsetzung des Torso-Signals in Tribolium vielmehr durch die Steuerung der umfangreichen morphogenetischen Prozesse als
durch die Spezifikation anteriorer und posteriorer Termini realisiert werden. Die Analyse des Zielgens Tc'maelstrom legt nahe, dass das Torso-Signal auch über die
Steuerung solcher morphologischen Veränderungen für die korrekte Ausbildung der
extraembryonalen Serosa sowie der Wachstumszone sorgt.
Folglich weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine noch umfangreichere Bedeutung des terminalen Systems in der Entwicklung des Kurzkeiminsekts Tribolium castaneums hin und zeigen bis dato unbekannte Faktoren, durch die das Torso-Signal
umgesetzt wird.
viii
Summary
Summary
The development of the anterior-posterior axis is an essential component of insect
development. Part of the formation of this axis is the terminal system which patterns
the terminal structures acron and telson. This Torso-signal is realized via gap-genes
in the long-germ insect Drosophila and has already been studied in great detail. The
importance of the terminal System is more substantial and extensive in the shortgerm insect Tribolium. So far, all known target genes of the receptor-tyrosine-kinasesignaling pathway cannot entirely explain the associated phenotypes. Thus this work
focuses on the identification of yet unknown target-genes of the terminal system and
the analysis of these genes to obtain a better understanding of the implementation of
this signal.
For the identification of further target-genes, differential gene-expression of the repression (Tc'tsl-RNAi) was compared to the derepression of the Torso-signal (Tc'cicRNAi) via Next-Generation-Sequencing. 50 potential candidates were chosen and
analyzed for embryonic and larval RNAi-phenotypes as well as expression in the
wild-type organism. The results of this "mini-screen" show that differential geneexpression-analysis is a suitable approach for the identification of previously unknown target genes of the terminal system.
The significance of selected candidates during embryonic development was evaluated via live-imaging and marker-gene stainings. By this process, two candidates,
Tc'CHOp24 and Tc'maelstrom, were chosen to be analyzed in great detail. The results of these analyses show a stronger interconnection between anterior-posterior
and dorso-ventral axis development on the one hand. The cargoreceptor-ortholog
Tc'CHOp24 is a target-gene of the terminal system and regulates Tc'Dpp-activity in
the anterior blastoderm. Thus, there may be an integration of both axes for the formation of the extraembryonic serosa via the modulation of Dpp-activity by the Torsosignal.
On the other hand, the Torso-signal could be realized, at least partially, by the control
of the extensive morphogenetic processes rather than the specification of anterior
and posterior termini. The analysis of Tc'maelstrom suggests that the regulation of
ix
Summary
morphological change by the terminal system is essential for the proper formation of
the extraembryonic serosa as well as the growth-zone.
Thus, the results of this work indicate an even more elaborate significance of the
terminal system in the development of the short-germ insect Tribolium castaneum.
Furthermore, yet unknown factors by which the Torso-Signal is implemented have
been identified.
x
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Primerdesign für PCR. .....................................................................................26
Abbildung 2: Heat-Map der Ergebnisse des SOLiD®-Next-Generation-Sequencing.............39
Abbildung 3: Beispiele für die Expression von Kandidatengenen. ........................................43
Abbildung 4: Expression der Kandidaten. .............................................................................44
Abbildung 5: Beispiele für larvale Phänotypen des Mini-Screens. ........................................46
Abbildung 6: Unterteilung der larvalen RNAi-Phänotypen.....................................................47
Abbildung 7: Verteilung der larvalen Phänotypen der Kandidaten des Mini-Screens. ...........48
Abbildung 8: Verteilung der embryonalen Phänotypen der Kandidaten des Mini-Screens ....50
Abbildung 9: Beispiele für embryonale Phänotypen. .............................................................53
Abbildung 10: Live-Imaging der embryonalen Frühentwicklung von Tribolium castaneum....57
Abbildung 11: Kandidaten des Rescreens. ...........................................................................65
Abbildung 12: In-situ Hybridisierung gegen Tc'mael im WT. .................................................67
Abbildung 13: Statistische Verteilung der larvalen Kutikulaphänotypen von Tc'mael-RNAi.. .69
Abbildung 14: mael-RNAi-Kutikulaphänotypen. ....................................................................71
Abbildung 15: Live-Imaging der embryonalen Tc'mael-RNAi-Embryonen.. ...........................74
Abbildung 16: Tc'wg In-situ Hybridisierung in 0-24h mael-RNAi-Embryonen. .......................77
Abbildung 17: Expression von Tc' zen-1 und Tc'eve in Tc'mael-RNAi-Embryonen. ..............80
Abbildung 18: Expression von Tc'WntD/8 in Tc'mael-RNAi-Embryonen. ..............................82
Abbildung 19: Expression Tc'mael in Tc'tsl- und Tc'cic-RNAi-Embryonen. ...........................84
Abbildung 20: In-situ Hybridisierung gegen Tc'CHOp24 im WT. ...........................................87
Abbildung 21: Statistische Verteilung der Kutikulaphänotypen von Tc'CHOp24-RNAi. .........89
Abbildung 22: CHOp24-RNAi-Kutikulaphänotypen. ..............................................................91
Abbildung 23: Expression von Tc'wg in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. ...............................95
Abbildung 24: Live-Imaging der embryonalen Entwicklung von Tc'CHOp24-RNAiEmbryonen. ..........................................................................................................................99
Abbildung 25: Expression von Tc' zen-1 und Tc'eve in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. ......101
Abbildung 26: Expression von Tc'otd in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. .............................104
Abbildung 27: Expression von Tc'pMAD in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. ........................106
Abbildung 28: Expression von Tc'doc in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. ............................108
Abbildung 29: Expression von Tc'pnr in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. .............................109
Abbildung 30: Expression von Tc'iro in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. ..............................111
Abbildung 31: Expression von Tc'CHOp24 in Tc'tsl-RNAi-Embryonen. ..............................113
Abbildung 32: Schematische Darstellung der AP- und DV-Spezifikation der Serosa. .........136
xi
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: cDNA Two-Step PCR Programm .........................................................................24
Tabelle 2: Arbeitsablauf des Mini-Screens............................................................................33
Tabelle 3: Kandidaten des Rescreens. .................................................................................59
Tabelle 4: Übersicht "Mini-Screen ......................................................................................144
Tabelle 5: "Übersicht über die Ergebnisse des Rescreens .................................................151
Tabelle 6: Primer des "Mini-Screens" .................................................................................153
xii
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
μl
Mikroliter
μM
mikromolar
A1-8
abdominales Segment 1-8
Abb.
Abbildung
AK
Antikörper
Ant
Antenne
AP
anterior-posterior
bai
baiser
bcd
bicoid
C
Celsius
cDNA
copy-Desoxyribonukleinsäure
cad
caudal
cic
capicua
DIG
Digoxigenin
Dm
Drosophila melanogaster
DNA
Desoxyribonukleinsäure
doc
dorsocross
dpp
decapentaplegic
dsRNS
doppel-strängige RNA
DV
dorso-ventral
eca
eclair
eg
eagle
EGF
Epidermal Growth Factor
eGFP
enhanced GFP
eve
even-skipped
exu
exuperantia
fkh
forkhead
g
Gramm
GFP
grün fluoreszierendes Protein
grk
Gurken
gro
groucho
h
Stunde
xiii
Abkürzungsverzeichnis
H2O
Wasser
hb
hunchback
iro
iroquois
HybA/HybB Hybridisierungslösung A/B
Lb
Labium
Lr
Labrum
M
molar
mael
maelstrom
Md
Mandibel
Mex-3
muscle excess-3
mg
Milligramm
ml
Milliliter
mM
millimolar
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
Mx
Maxille
ng
Nanogramm
NGS
Next-Generation-Sequencing
Oc
okulare Domäne
otd-1
orthodenticle-1
PCR
Polymerase-Ketten-Reaktion
pMAD
phosphoryliertes Mothers-Against-Dpp
pnr
panier
Py
Pygopodien
RNA
Ribonukleinsäure
RNAi
RNA Interferenz
rRNA
ribosomale Ribonukleinsäure
SB
San Bernadino
SEG
Serosa-Embryo-Grenze
sog
short-gastrulation
T1-3
thorakales Segment 1-3
tkv
thick-veins
tRNA
Transfer- Ribonukleinsäure
Tc
Tribolium castaneum
tll
tailless
xiv
Abkürzungsverzeichnis
tor
torso
tsl
torso-like
Ug
Urogomphi
wg
wingless
WT
Wildtyp
zen
zerknüllt
xv
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1 Ziele der Entwicklungsbiologie
Ernst Haeckel prägte in seinem Werk "Prinzipien der generellen Morphologie der Organismen" (1906) als erster den Begriff der "Ontogenese". Unter diesem Begriff wird
die Entwicklung eines einzelnen Lebewesens beginnend bei einer einzelnen Zelle bis
hin zu komplexen, vielzelligen Organismen verstanden. Die Identifikation und Analyse dieser zahlreichen Prozesse und deren vielschichtiges und umfassendes Zusammenspiel um aus einer Eizelle einen adulten Organismus zu bilden, ist der Inhalt der
Entwicklungsbiologie. Ziel dieses Teilbereichs der Biologie ist es somit, möglichst
vollständig und im Zusammenhang alle Abläufe und Mechanismen auf molekularer,
genetischer, zellulärer und morphologischer Ebene zu beschreiben, die an der Ontogenese beteiligt sind.
Die Untersuchung der Ontogenese vieler unterschiedlicher Organismen hat gezeigt,
dass sich die Entwicklung unterschiedlicher Arten sehr ähnlich (konserviert) ist (Judd,
2001). Somit ist es in der Entwicklungsbiologie möglich mit speziellen Organismen zu
arbeiten, die sie durch ihre Eigenschaften besonders für die Forschung geeignet
sind. Aussagen, die über solche Modellorganismen getroffen werden, sollten folglich
eine gewisse Allgemeingültigkeit besitzen und sollten auch auf möglichst viele andere Arten übertragen können werden. Des Weiteren sollten die Modellorganismen einfach und günstig zu halten sein und über eine rasche Generationsfolge verfügen. Ein
weiterer wichtiger Aspekt dieser etablierten Modellorganismen ist die Möglichkeit molekularer und genetischer Analysen und Manipulationen. Zu den bekanntesten Vertretern der Entwicklungsbiologie, die sich repräsentativ für unterschiedliche Stämme
und Klassen herausgebildet haben, gehören u.a. der Fadenwurm C. elegans, die
Taufliege Drosophila melanogaster, der Zebrafisch Danio rerio, der Krallenfrosch
Xenopus laevis und die Maus Mus musculus (Vignali et al., 1994; Culetto und
Sattelle, 2000; Dooley und Zon, 2000; Bernards und Hariharan, 2001; Judd, 2001).
Als Mordellorganismus für die Experimente dieser Doktorarbeit wurde Tribolium castaneum (Tc) verwendet. Der rotbraune Reismehlkäfer gehört innerhalb der Ordnung
1
1. Einleitung
der Coleoptera zur Familie der Schwarzkäfer (Tenebrionidae) und ist damit ein weiterer Vertreter für Modellorganismen der Insekten (Denell, 2008).
1.2 Embryonalentwicklung von Insekten
Der Beginn der Embryonalentwicklung ist in allen Insekten relativ ähnlich. Nach der
Befruchtung teilt sich der zygotische Kern zunächst mehrmals, jedoch ohne vollständige Zytokinese (Davis und Patel, 2002). Dadurch entsteht ein Synzytium, das zunächst in der Mitte des Eis bleibt. Erst im weiteren Verlauf der Entwicklung kleiden
die Zellkerne des Synzytiums die Peripherie des Eis aus. Dort kommt es dann zur
Zellularisierung. Dies kann, wie bei Tribolium, sofort geschehen oder auch, wie bei
Drosophila, zeitlich verzögert (Davis und Patel, 2002). Ungefähr zu diesem Zeitpunkt
der Insektenentwicklung werden auch embryonales- und extraembryonales Gewebe
spezifiziert. Die weitere Entwicklung richtet sich nach dem Entwicklungsmodus des
Insekts, wobei hier generell in Kurz- und Langkeimmodus unterschieden werden
kann (Davis und Patel, 2002; Rosenberg et al., 2009).
1.3 Drosophila melanogaster als Beispiel für Langkeiminsektenentwicklung
Drosophila melanogaster ist einer der bekanntesten und am besten analysierten Modellorganismen der Entwicklungsbiologie (vgl. Nüsslein-Volhard und Wieschaus,
1980; Nüsslein-Volhard et al., 1987; Nüsslein-Volhard, 1991). Das Genom von Drosophila ist seit dem Jahr 2000 vollständig sequenziert (Adams, 2000). Die Entwicklung der Taufliege ist jedoch stark spezialisiert und somit nur auf wenige andere Organismen übertragbar (Tautz et al., 1994; Davis und Patel, 2002). Der larvale Kopf
von Drosophila ist invertiert. Auch die Beine werden embryonal nicht gebildet und
somit ist die Untersuchung der embryonalen Kopfsegmente und der Beinentwicklung
in Drosophila kaum möglich (Klingler, 2004). Drosophila-Entwicklung folgt dem Modus der Langkeimentwicklung (Davis und Patel, 2002). Bei Langkeiminsekten werden alle Segmente bereits im Blastoderm angelegt. Im Vergleich dazu werden bei
2
1. Einleitung
den basaleren Kurzkeiminsekten nur die anteriorsten Segmente in diesem Stadium
spezifiziert. Alle weiteren Segmente werden durch sekundäres Wachstum sukzessive aus einer sogenannten Wachstums- oder Segmentadditionszone heraus gebildet
(vgl. Davis und Patel, 2002; Klingler, 2004; Klingler und Bucher, 2004; Rosenberg et
al., 2009). Die Langkeimentwicklung bedingt auch einen anderen Modus der APSpezifikation (vgl. Kapitel 1.4) als Kurzkeiminsekten.
1.3.1 Maternale Achsendeterminierung in Drosophila
In Drosophila werden bereits vor der Befruchtung während der Oogenese die anterior-posteriore (AP) und die dorso-ventrale (DV) Achse festgelegt und durch das vom
Zellkern sezernierte Gurken-Signal etabliert (van Eeden und St Johnson, 1999; Roth
und Lynch, 2009).
Bei der Festlegung der AP-Achse bindet das vom Oozyten-Kern sezernierte GurkenProtein an den Torpedo-Rezeptor der terminalen Follikelzellen (Gonzáles-Reyes et
al., 1995; van Eeden und St Johnson, 1999; Roth und Lynch, 2009). Diese Follikelzellen werden dadurch zu posterioren Follikelzellen spezifiziert (Roth und Lynch,
2009), die dann wiederum eine Reorganisation des Mikrotubuliapparates bedingen
bei der die Minuspole anterior in der Oozyte zu liegen kommen (Riechmann und
Ephrussi, 2001). Durch diese Umstrukturierung der Mikrotubuli wird u.a. bicoid
mRNA anterior lokalisiert (Berleth et al., 1988 Nüsslein-Volhard; 1991). Im weiteren
Verlauf der Entwicklung ist das Morphogen Bicoid einer der wichtigsten Faktoren in
der anterioren Musterbildung (Driever und Nüsslien-Volhard, 1988; Lehmann und
Nüsslein Volhard, 1991). Die repolarisierten Mikrotubuli lokalisieren oskar mRNA
posterior im Ei (Ephrussi et al., 1991). oskar wird wiederum für die posteriore Lokalisation der maternalen nanos mRNA benötigt (Ephrussi et al., 1991), dessen Protein
später ein Faktor bei der posterioren Musterbildung ist (Driever und NüsslienVolhard, 1988; Lehmnan und Nüsslein Vorlhard, 1991).
Durch die Reorganisation des Mikrotubuliapparates wandert der Oozytenkern auf
einer Seite der Oozyte Richtung anterior (van Eeden und St Johnson, 1999). Der
Oozytenkern sezerniert in dieser Zeit weiter Gurken und aktiviert so in nahen Follikelzellen EGF-Signale. Diese Signale inhibieren die Expression von pipe in den Folli3
1. Einleitung
kelzellen. Die Seite auf der das passiert wird dann im späteren Blastodermstadium
zur dorsalen Seite spezifiziert (van Eeden und St Johnson, 1999). Auf der gegenüberliegenden Seite kann Pipe in den Follikelzellen des Eis zunächst normal synthetisiert werden und folglich im Blastoderm eine Proteasekaskade im Perivitellinraum
aktivieren, die zur Aktivierung des Toll-Rezeptors in der ventralen Plasmamembran
führt (van Eeden und St Johnson, 1999). Als Folge kann im Blastodermstadium Cactus auf dieser Seite innerhalb der Zellen degradiert werden. Dadurch kann Dorsal in
den Zellkern gelangen und dort Transkription aktivieren. Das Dorsal-Signal führt später über Konzentrationsgradienten von Zielgenen zur DV-Musterbildung (Lynch und
Roth, 2011).
1.3.2 Achsensysteme in Drosophila
Entlang der anterior-posterioren Achse geschieht die Spezifizierung der Segmente,
die bei Drosophila simultan im Blastoderm stattfindet (Davis und Patel, 2002), über
drei verschiedene Systeme. Diese sind das anteriore, das posteriore und das terminale System (Nüsslein-Volhard, 1991). Das vierte maternale System in Drosophila
spezifiziert die dorso-ventrale Achse (van Eeden und St Johnson, 1999; Roth, 2003;
Lynch und Roth, 2011).
Das anteriore System funktioniert über einen Biocoid-Gradienten, der, wie bereits
beschrieben, durch maternal exprimierte und in der Oogenese anterior lokalisierte
mRNA entsteht (vgl. Berleth et al., 1988; Nüsslein-Volhard, 1991). Nachdem die anterior lokalisierte bicoid mRNA translatiert wurde, bildet das Protein einen anteriorposterioren Diffusionsgradienten im synzytialen Blastoderm (Berleth et al., 1988;
Driever und Nüsslein-Volhard, 1988). Bicoid-Mutanten zeigen die Deletion der Kopfund Thoraxsegmente (Nüsslein-Volhard et al., 1987). Bicoid wirkt somit als
Morphogen entlang der AP-Achse und aktiviert konzentrationsabhängig als Transkriptionsfaktor Zielgene wie z.B. zygotische hunchback-Expression (Driever und
Nüsslein-Volhard, 1988; Driever und Nüsslein Volhard, 1990; Struhl et al., 1996).
Außerdem reprimiert Bicoid anterior die Translation der caudal mRNA, welche posteriore Schicksale definiert (Rivera-Pomar et al., 1996; Dubnau und Struhl, 1996). Die
weitere Spezifikation von Segmenten geschieht über eine strikte Hierarchie von Ge4
1. Einleitung
nen. Durch Proteingradienten der maternalen Faktoren kommt es zunächst zur Aktivierung von Gap-Genen, die gegenseitig ihre Expressionsdomänen definieren (Rivera-Pomar und Jäckle, 1996; Jäger 2011). Die Gap-Gene aktivieren dann wiederum
die Paarregel-Gene (vgl. Ingham, 1988; Small und Levine 1991). Die Segmentpolaritäts-Gene, die durch die Paarregel-Gene angeschaltet werden bestimmen durch gegenseitige Regulierung die Segmentgrenzen (DiNardo und O'Farrell, 1987; Lawrence
und Struhl, 1996). Die sogenannten Hox-Gene, die von den Gap-Genen und den
Paarregel-Genen reguliert werden, legen die Identitäten der Segmente entlang der
AP-Achse fest (Harding und Levine, 1988; Irish et al., 1989; Akam, 1989; GarciaFernández, 2005).
Das posteriore System ist für die Bildung von abdominalen Segmenten verantwortlich. nanos ist ein Hauptfaktor des posterioren Systems und nanos-Mutanten führen
zum Verlust aller abdominaler Segmente (Lehmann und Nüsslein-Volhard, 1991;
Nüsslein-Volhard, 1991). Da die maternale mRNA von nanos posterior lokalisiert
wurde, entsteht nach Translation ein posterior-anteriorer Gradient (Ephrussi et al.,
1991; Nüsslein-Volhard 1991). Nanos-Protein inhibiert dann über die Bindung an
Pumilio die posteriore Translation von maternalem hunchback. Dadurch können posteriore Gap-Gene wie knirps exprimiert werden (Wreden et al., 1997; Jaeger, 2011).
Der weitere Verlauf der Segmentierung folgt der bereits beschriebenen Genhierarchiekaskade.
Das dritte maternale System zu AP-Spezifizierung in Drosophila ist das terminale
System, welches die anterioren und posterioren, terminalen Strukturen Acron und
Telson spezifiziert (Klingler et al., 1988). Da es Gegenstand dieser Arbeit ist, wird
das terminale System in Drosophila in Kapitel 1.5 ausführlich dargestellt und direkt
mit dem terminalen System in Tribolium castaneum als ein Beispiel für Kurzkeimentwicklung verglichen.
Auch die DV-Achse in Drosophila wird maternal etabliert (van Eeden und St Johnson, 1999; Roth, 2003; Lynch und Roth, 2011). Wie bereits beschrieben aktiviert
dann ein ventral-dorsaler Dorsal-Gradient eine Reihe von Zielgenen, welche die DVSpezifikation umsetzen. Somit spielt Dorsal eine zentrale Rolle in diesem Genregulationsnetzwerk (Lynch und Roth, 2011). Das Dorsal-Protein inhibiert ventral die Expression von decapentaplegic (dpp) (Huang et al., 1993; Ashe et al., 2000). Dadurch
entsteht ein dorsaler Dpp-Gradient, der durch die differentielle Aktivierung des BMP5
1. Einleitung
Signalwegs die Zielgene des Dpp-Signals aktiviert (vgl. Ashe et al., 2000; Sutherland
et al., 2003; Mizutani et al., 2005). Die Mutation von dpp führt zu einer
Ventralisierung des Embryos (Irish und Gelbart, 2987). Der BMP-Inhibitor Shortgastrulation (Sog) wird ventrolateral exprimiert und diffundiert nach dorsal, wo er einen Komplex mit Twisted-gastrulation (Tsg), einem Stabilisator von Dpp (Wang und
Ferguson, 2005), Screw (vgl. Dorfmann und Shilo, 2001) und Dpp selbst bildet und
damit Dpp-Aktivität inaktiviert (Srinivasan et al., 2002; Shimmi et al., 2005; Little und
Mullins, 2006). Die Metalloprotease Tolloid spaltet Sog und erlaubt somit Dpp an seine Rezeptoren Thick-veins (Tkv), Saxophone (Sax) und Punt (Put) zu binden und
Zielgene zu aktivieren (Nellen et al., 1994; Brummel et al., 1994; Shimmi et al., 2005;
Wang und Ferguson, 2005; O'Connor et al., 2006). Zielgene des Dpp-Signals sind
beispielsweise die T-Box-Gene dorsocross 1-3 (vgl. Hamguchi et al., 2004) und der
Zink-Finger Transkriptionsfaktor panier (vgl. Raiman et al. 1993; Winnik et al., 1993;
Ashe et al., 2000).
Die DV-Musterbildung ist auch für die Spezifikation der Amnioserosa verantwortlich
(vgl. Dorfmann und Shilo, 2001). Die Amnioserosa stellt die Fusion der extraembryonalen Membranen Amnion und Serosa dar (vgl. Schmidt-Ott, 2000). Bei der Spezifikation der Membran inhibiert das Dl-Protein die Expression von zerknüllt (zen). Dieses ist durch eine Duplikation aus dem Hox3-Gen entstanden (Falciani et al., 1996;
Stauber et al., 1999). Es ist allerdings nicht für die Spezifikation der Segmentidentitäten verantwortlich, sondern für die dorsale Differenzierung der Amnioserosa
(Rushlow et al., 1987; St Johnson und Gelbart, 1987; Panfilio und Akam, 2007). Die
Mutation von zen führt zum Verlust der Amnioserosa in Drosophila (Rushlow et al.,
1987). Capicua, ein Repressor der Zielgene des terminalen Systems (vgl. Jiménez et
al., 2000), spielt auch bei Dl-vermittelten Repression der zen-Expression und damit
in der DV-Spezifikation eine Rolle. Hier fungiert Cic als Corepressor von Dorsal (vgl.
Shin und Hong, 2014).
Obwohl bereits sehr viel über die Entwicklung Drosophilas bekannt ist, eignet sich
die Taufliege nur eingeschränkt als allgemeingültiger Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie. Die Embryonalentwicklung Drosophilas folgt dem Modus der
Langkeimentwicklung, eine abgeleitete Form der Embryogenese (vgl. Tautz et al.,
1994; Savard et al., 2006). Die meisten Insekten folgen dem Entwicklungsmodus der
Kurzkeimentwicklung (vgl. Bucher und Klingler, 2004). Demnach sind die Erkenntnis6
1. Einleitung
se über die Entwicklungsprozesse der Taufliege nicht auf die meisten Insekten übertragbar. Der rotbraune Reismehlkäfer Tribolium castaneum ist ein Beispiel für ein
Insekt mit Kurzkeimentwicklungsmodus (vgl. Davis und Patel, 2002; Rosenberg et
al., 2009). Tribolium ist wahrscheinlich nach Drosophila das wichtigste Insektenmodell für die Entwicklungsbiologie (vgl. Klingler, 2004; Richards et al., 2008) und diente
als Modellorganismus für die Experimente dieser Arbeit.
1.4 Achsendeterminierung in Tribolium
Die Embryonalentwicklung von Tribolium castaneum folgt dem anzestraleren Modus
der Kurzkeimentwicklung und ist somit in seiner Entwicklung innerhalb der Insecta
repräsentativer als das Langkeiminsekt Drosophila (vgl. Davis und Patel, 2002; Rosenberg et al., 2009). Hierbei werden die meisten Segmente in einem sekundären
Wachstumsprozess aus der sogenannten Wachstumszone oder auch "Segment addition zone" heraus gebildet (Klingler, 2004; Richards et al., 2008). Neben diesem
basaleren Entwicklungsmodus, bietet die Arbeit mit Tribolium als Modellorganismus
noch eine Reihe weiterer Vorteile im Vergleich zu anderen Insektenmodellen. Das
Genom des Reismehlkäfers ist seit 2008 vollständig sequenziert (vgl. Richards et al.,
2008). In Tribolium sind die beiden extraembryonalen Membranen, das Amnion und
die Serosa, nicht wie in Drosophila fusioniert und erlauben somit die Studie deren
Entwicklung (Handel et al., 2000; Klingler, 2004). Für die Analyse der Embryonalentwicklung von Tribolium sind eine Reihe von molekularen und genetischen Methoden
etabliert worden. Hierzu gehört neben einem Gal4/UAS-System (Schinko et al.,
2010) vor allem die Möglichkeit durch parentale RNA Interferenz (RNAi) in der F1Generation Genprodukte gezielt auszuschalten (vgl. Bucher et al., 2002). Die Daten
des iBeetle-Screens, eines Genom-weiten RNAi-Screens, erlauben des Weiteren
den Zugriff auf eine Erstanalyse von tausenden von Genen (Schmitt-Engel et al.
2015). Zusammengenommen ist Tribolium castaneum wahrscheinlich der wichtigste
Vertreter als Modell für die Kurzkeimentwicklung der Insekten.
Die Achsendeterminierung von Tribolium während der Oogenese ist im Vergleich zu
Drosophila bis jetzt noch nicht gänzlich aufgeklärt. Wie bereits beschrieben ist die
Sezernierung des EGF-Liganden gurken ein wichtiger Faktor in der maternalen Etab7
1. Einleitung
lierung der Achsen in Drosophila (vgl. González-Reyes et al., 1995; van Eeden und
St Johnson, 1999; Roth und Lynch, 2009). Auch in Tribolium wurde ein ähnliches
tgfα-Gen identifiziert, das maternal exprimiert wird. Dessen Knock-down führt zu Defekten der dorso-ventralen Polarität des Embryos, da der Oozytenkern nicht in eine
dorsale Position gebracht wird (vgl. Roth, 2003; Lynch et al., 2010). Die anteriorposteriore Polarität wurde jedoch durch diesen Knock-down kaum beeinflusst (vgl.
Lynch et al., 2010).
1.4.1 Anterior-posteriore Musterbildung in Tribolium
Auch die anterior-posteriore Musterbildung in Tribolium ist im Vergleich zu Drosophila noch nicht so gut verstanden, scheint aber auch über drei verschiedene Systeme
vonstattenzugehen. bicoid existiert nicht außerhalb der höheren Dipteren und somit
muss die anteriore Musterbildung von anderen Faktoren übernommen werden
(Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Struhl et al., 1989; Stauber et al., 1999; Brown
et
al.,
2001).
Zunächst
wurde
angenommen,
dass
Tc'hunchback
und
Tc'orthodenticle-1 die frühe anteriore Musterbildung und somit die bicoid-Funktion in
Tribolium übernehmen (vgl. Schröder, 2003). Der Knock-down von Tc'otd-1 führt in
Larven zu stark reduzierten und teilweise vollständig deletierten Köpfen. Durch den
simultanen Knock-down von Tc'hb wird dieser Phänotyp noch verstärkt und führt sogar zur Deletion von thorakalen und abdominalen Segmenten (Schröder, 2003). Somit ähnelt dieser RNAi-Phänotyp den Drosophila bicoid-Mutanten (vgl. Driever und
Nüsslein-Volhard, 1988). Inzwischen konnte allerdings gezeigt werden, dass der Verlust von Kopfsegmenten durch den Knock-down von Tc'otd-1 auf eine Funktion des
Gens in der DV-Achsenbildung zurückgeht (vgl. Kotkamp et al., 2010). RNAi gegen
Tc'otd-1 führt zur Dorsalisierung des Embryos. Da in Tribolium der Kopf eine ventrale
Anlage ist, gehen durch den Knock-down von Tc'otd-1 die Kopfsegmente verloren
(Kotkamp et al., 2010). Nach Tc'hb-RNAi treten homeotische Transformationen von
thorakalen Segmenten zu abdominalen Segmenten auf (vgl. Marques-Souza et al.,
2008). Somit könnte auch der Verlust von Thoraxsegmenten in Tc'otd-1/-Tc'hb-RNAiLarven erklärt werden. Bisher wurde diskutiert, ob es in Tribolium einen Faktor geben
muss, der die morphogenetische Funktion von Dm'bcd übernimmt, oder ob es für
8
1. Einleitung
Kurzkeiminsekten überhaupt ein anteriores Organisationszentrum geben muss (vgl.
Rosenberg et al., 2009).
Seiher wurde festgestellt, dass der kanonische Wnt-Signalweg eine essentielle Rolle
in der anterior-posterioren Musterbildung von Tribolium spielt (vgl. Fu et al., 2012).
Im Zebrafisch ist Axin Bestandteil eines Destruktorkomplexes, der für den Abbau des
Transkriptionsfaktors β-Catenin sorgt, wenn das kanonische Wnt-Signal ausbleibt
und somit Zielgene deaktiviert (vgl. Heisenberg et al., 2001; Heeg-Truesdell und
LaBonne, 2006). Die anteriore Inhibierung des Wnt-Signalwegs ist in Tribolium für
die Bildung anteriorer Strukturen essentiell und wird durch maternal anterior lokalisiertes Tc'axin gewährleistet (Fu et al., 2012). Dieser negative Wnt-Regulator bildet
maternal einen anterior-posterioren Gradienten. Es wird angenommen, dass βCatenin einen gegenläufigen, maternalen Gradienten ausbildet (vgl. Fu et al., 2012).
Der Knock-down von Tc'axin führt zu Larven mit deletierten Kopf- und
Thoraxsegmenten, aber auch zum Verlust abdominaler Segmente. Diese Deletionen
resultieren aus einer Verschiebung des embryonalen Anlageplans im Blastoderm
(vgl. Fu et al., 2012). Somit ist Tc'axin ein essentieller Faktor bei der Bildung anteriorer Strukturen in der AP-Entwicklung Triboliums. Der Transkriptionsfaktor Tc'pangolin
(Tc'pan), der in Tribolium ebenfalls maternal anterior lokalisiert ist (vgl. Bucher et al.,
2005), scheint downstream von Tc'axin zu fungieren (Fu et al., 2012). Nach der Rolle
in der Anlage der AP-Achse hat das Wnt-Signal in Tribolium auch nach der Invagination eine Funktion bei der Bildung weiterer Segmente aus der Wachstumszone (vgl.
Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b). Ein weiterer, bekannter maternal
anterior lokalisierter Faktor, Tc'eagle, scheint keine Funktion in der blastodermalen
Musterbildung zu haben (vgl. Bucher et al., 2005).
Zur Spezifikation der anterior gelegenen, extraembryonalen Serosa ist in Tribolium
das zerknüllt-Homolog Tc'zen-1 notwendig, da dessen Knock-down zum Verlust der
Membran führt (vgl. van der Zee et al., 2005). Tc'zen-1 ist im undifferenzierten Blastoderm zuerst in einer anterioren Kappe und ab der Differenzierung des Blastoderms
in der Serosa exprimiert (vgl. Falciani et al., 1996). Durch eine unabhängige Duplikation von zen-1 gibt es in Tribolium ein weiteres zerknüllt-Homolog, nämlich Tc'zen-2
(vgl. Brown et al., 2001). Tc'zen-2 ist auch in der Serosa exprimiert, übernimmt aber
keine Funktion bei der Bildung der extraembryonalen Membran, sondern inhibiert
hier die Tc'caudal Translation (Schoppmeier et al., 2009). Es spielt wahrscheinlich
9
1. Einleitung
eine Rolle bei der Interaktion des Amnions mit der Serosa in der Embryonalentwicklung (vgl. van der Zee et al., 2005; Hilbrandt et al., 2016).
Auch in Tribolium muss für die korrekte Entwicklung, die anteriore Transkription von
caudal inhibiert werden. Diese Repression wird von Tc'Zen-2 und Tc'Mex-3, dem KHDomänen-Protein-Ortholog (vgl. Draper et al., 1996), übernommen (vgl. Schoppmeier et al., 2009). Nach dem Knock-down von Tc'mex-3 expandiert das Tc'CadProtein nach anterior und führt zum Verlust der Kopfsegmente. Tc'Zen-2 verhindert
die Translation von Tc'cad im Bereich der extraembryonalen Serosa. Der gleichzeitige Knock-down von Tc'zen-2 und Tc'mex-3 führt zu einer Expansion des Tc'CadVorkommens bis zum anterioren Ende des Embryos (Schoppmeier et al., 2009).
Somit bildet Tc'Cad einen zygotischen posterior-anterioren Gradienten, der essentiell
für die Entwicklung posteriorer Strukturen ist (McDonald et al., 1989; Schulz et al.,
1998; Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009; El-Sherif et al., 2014). Der Knockdown von Tc'caudal führt zum Verlust aller gnathalen, thorakalen und abdominalen
Segmente (vgl. Copf et al., 2004) und zeigt damit, wie wichtig Tc'cad für die anteriorposteriore Entwicklung Triboliums ist. Wahrscheinlich ist das Gap-Gen Tc'hunchback
ein Zielgen von Tc'Cad das zur korrekten Ausbildung der Segmente beiträgt (vgl.
Wolff et al., 1998; Copf et al., 2004; Shinmyo et al., 2005). Außerdem definiert der
Tc'Cad-Gradient auch die anteriore Grenze des ersten Tc'even-skipped-Streifens
und hat somit auch einen Einfluss auf Paarregel-Gene. Tc'caudal ist zygotisch in der
Wachstumszone exprimiert und wird hier für dessen Aufrechterhaltung benötigt (vgl.
Copf et al., 2004).
Ähnlich wie in Drosophila scheinen auch in Tribolium das nanos- und das pumillioHomolog eine Rolle in der anterior-posterioren Achsenentwicklung zu spielen (vgl.
Schmitt-Engel et al., 2012). Sie inhibieren posterior die Translation von maternalem
Tc'hunchback und aktivieren die Expressionsdomänen posteriorer Gapgene. Außerdem sind Tc'nanos und Tc'pumillio nicht nur für die Ausbildung abdominaler Segmente essentiell, sondern spielen auch eine Rolle in der anterioren Musterbildung. Der
Knock-down von Tc'nos und Tc'pum führt, neben dem Verlust abdominaler Segmente, auch zu Deletionen und Transformationen der prägnathalen und gnathalen Segmente (Schmitt-Engel et al., 2012).
Die Funktion der Gap-Gene in Tribolium ist noch nicht vollständig geklärt, scheint
sich aber in Art und Umfang stark von den Drosophila Gap-Gen-Homologen zu un10
1. Einleitung
terschieden (Wolff et al., 1995; Bucher und Klingler, 2004; Cerny et al., 2005; Cerny
et al., 2008; Marques-Souza et al., 2008). Durch den unterschiedlichen Entwicklungsmodus haben viele Gap-Gene beispielsweise eine weitere Funktion in der Spezifikation der Segmente, die in Tribolium erst sekundär aus der Wachstumszone gebildet werden (vgl. Cerny et al., 2008). Die Gap-Gene in Tribolium unterliegen einem
starken regulatorischen Zusammenspiel (vgl. Cerny et al., 2008). Da in Tribolium ein
vorher unbekanntes Gap-Gen entdeckt wurde (mille-pattes; Savard et al., 2006), ist
somit nicht geklärt ob es weitere bisher unbekannte Gap-Gene in Tribolium gibt. Die
Gap-Gene aktivieren auch in Tribolium die Hox-Gene (Cerny et al., 2005; MarquesSouza et al., 2008). Die Aktivierung der Gap-Gene unterschiedet sich allerdings
deutlich von der in Drosophila, da in Tribolium das anteriore Morphogen bicoid nicht
existiert (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001; Wolff et al., 1995). Es wurde postuliert, dass möglicherweise Tc'caudal die initiale Aktivierung der Gap-Gen-Expression
übernimmt (vgl. Wolff et al., 1995; Wolf et al., 1998).
Die Paarregel-Gene in Tribolium können auch in primäre und sekundäre PaarregelGene unterteilt werden (Choe und Brown 2007). Die primären Paarregel-Gene
Tc'even-skipped, Tc'runt, Tc'odd-skipped regulieren die sekundären Paarregel-Gene
Tc'paired und Tc'sloppy-paired (Choe et al., 2006). Allerdings ist bisher unbekannt,
wie die primären Paarregel-Gene aktiviert werden. Für Tc'eve und Tc'odd konnte
beispielsweise
eine
oszillierende
Aktivität
nachgewiesen
werden,
was
der
Somitogenese der Vertebraten ähnelt (vgl. Sarrazin et al., 2012; El-Sherif et al.,
2012). Außerdem scheint es auch einen Einfluss von Tc'cad auf die Tc'eveExpression zu geben (vgl. Schoppmeier et al. 2009; El-Sherif et al., 2014). Somit
zeigen sich auf Ebene der Paarregel-Gene deutliche Unterschiede in Tribolium im
Vergleich zu Drosophila. Die Paarregel-Gene regulieren ihrerseits allerdings wiederum die Segmentpolaritäts-Orthologe Tc'wingless und Tc'engrailed, analog zu der
Genhierarchiekaskade in Drosophila (Brown et al., 1994; Nagy et al., 1994; Choe et
al., 2006; Choe und Brown, 2007).
In Tribolium existiert im Vergleich zu Drosophila nur ein Hox-Komplex der alle
homeotischen Gene beinhaltet (vgl. Brown et al., 2002; Shippy et al., 2008). Ihre Regulation erfolgt wie in Drosophila wahrscheinlich über die Gap-Gene (vgl. Cerny et
al., 2005; Marques-Souza et al., 2008).
11
1. Einleitung
Zusammenfassend zeigen sich deutliche Unterschiede für die meisten Genklassen
im Vergleich zwischen Drosophila und Tribolium. Durch den unterschiedlichen Entwicklungsmodus können allerdings in Tribolium auch nicht alle Segmente gleichzeitig
im Blastoderm spezifiziert werden. Die Segmente, die sekundär aus der Wachstumszone gebildet werden, müssen bei ihrer Entstehung spezifiziert werden.
1.4.2 Dorso-ventrale Achsenbildung in Tribolium
Wie in Drosophila, nimmt Dorsal auch eine zentrale Rolle bei der DV-Achsenbildung
in Tribolium ein. Allerdings ist der Tribolium Dorsal-Gradient durch FeedbackRegulation im Vergleich zu Drosophila dynamisch (vgl. Chen et al., 2000; Nunes da
Fonseca et al., 2008; Reeves et al., 2012). Wie in Drosophila wird Tc'sog durch
Tc'Dorsal reguliert (Nunes da Fonseca et al., 2008). Analog zu Drosophila inhibiert
Sog auch in Tribolium die Aktivierung des BMP-Signalwegs durch Tc'Dpp auf der
ventralen Seite des Embryos und transportiert Tc'Dpp nach dorsal (vgl. van der Zee
et al., 2006). Tc'Dorsal selbst scheint Tc'Dpp jedoch nicht zu regulieren (van der Zee
et al., 2006; Lynch et al., 2010).
Anders als in Drosophila (vgl. Ashe et al., 2000) ist Tribolium dpp im undifferenzierten Blastoderm zunächst ubiquitär, mit stärkerer Expression in einer anterioren Kappe exprimiert. Im differenzierten Blastoderm ist Tc'dpp dann in einem Streifen entlang
der Serosa-Embryo-Grenze exprimiert. Die Tc'Dpp-Aktivität ist am dorsalen Rand
des Eis am stärksten, betrifft aber auch die dorsale Hälfte der Serosa, sowie ca. 20%
des dorsalsten, embryonalen Gewebes (vgl. van der Zee et al., 2006). Im Vergleich
dazu ist Tc'sog in einem ventralen Streifen in Blastodermstadien exprimiert. Der
Knock-down von Tc'dpp führt zur Ventralisierung, wohingegen der Knock-down von
Tc'sog zur Dorsalisierung des Embryos führt (van der Zee et al., 2006). Im Falle der
Dorsalisierung wird der dorsale Teil der Serosa auf Kosten der prägnathlen und gnathalen Segmente vergrößert und die Serosa-Embryo-Grenze (SEG) wird rotationssymmetrisch. Bei der Ventralisierung durch den Knock-down von Tc'dpp kommt es
zum Verlust der dorsalen Serosa während auch hier die SEG rotationssymmetrisch
wird und das Kopfgewebe des Embryos expandiert wird (vgl. van der Zee et al.,
2006). Somit ist das Tc'Dpp-Signal ein wichtiger Faktor in der Spezifikation der ext12
1. Einleitung
raembryonalen Serosa. In Tribolium wird Tc'Dpp vermutlich durch die Bindung von
Tc'Sog inhibiert (vgl. Nunes da Fonseca et al., 2010). Auch hier schneidet wahrscheinlich die Metalloprotease Tc'Tld das Tc'Sog-Protein, damit Zielgene des DppSignals aktiviert werden können. Das Twisted-gastrulation-Homolog Tc'Tsg ist wahrscheinlich für die Prozessierung, Faltung und Stabilisierung von Tc'Dpp notwendig.
Dessen Knock-down führt zu Phänotypen, die mit dem Knock-down von Tc'dpp vergleichbar sind (vgl. Nunes da Fonseca et al., 2010). Der Knock-down von Tc'tld führt
im Vergleich dazu nur zu partiellen Tc'dpp-RNAi-Phänotypen, was vermutlich an
nicht vollständig von Tc'Sog gebundenen, lokalen Tc'Dpp-Vorkommen liegt (vgl.
Nunes da Fonseca et al., 2010). Auch in Tribolium werden durch die Dpp-Aktivität
Zielgene aktiviert, die dann die DV-Achsenbildung realisieren. Zu diesen Zielgenen
gehört Tc'dorsocross, welches im differenzierten Blastoderm in der dorsalen Serosa
exprimiert ist und Tc'pnr, das im differenzierten Blastoderm vor allem auf der dorsalen Seite des Keimrudiments exprimiert ist und damit den Ort der höchsten Tc'DppAktivität markiert (vgl. van der Zee et al., 2006).
Tc'otd-1 reguliert die Expression von Tc'sog und moduliert darüber die DVAchsenentwicklung (vgl. Kapitel 1.4.1 und Kotkamp et al., 2010). Somit sind die APund die DV-Entwicklung in Tribolium über Tc'otd-1 integriert.
1.5 Das terminale System in Drosophila und Tribolium
Das terminale System in Drosophila ist für die Musterbildung der anterioren und posterioren terminalen Strukturen Acron und Telson verantwortlich (vgl. Klingler et al.,
1988; Nüsslein-Volhard, 1991; Furriols und Casanova, 2003; Li, 2005). Hierbei ist
Torso-like
(tsl) zuständig für die
Aktivierung des
Rezeptor-Tyrosin-Kinase-
Signalwegs und wird von den terminalen Follikelzellen bereits während der Oogenese exprimiert (Stevens et al., 1990; Mineo et al., 2015). In tsl-Mutanten wird der Torso-Rezeptor nicht aktiviert und es kommt zum Verlust der anterioren und posterioren
Strukturen (Sprenger et al., 1989, Jiménez et al., 2000). Der Torso-Rezeptor ist ubiquitär über die Oberfläche des Blastoderms verteilt. Die Aktivierung findet aber nur
an den terminalen Regionen statt, wo tsl exprimiert wird und ist dementsprechend
zur ersten Expression von tsl zeitlich verzögert (Cassanova und Struhl, 1989; Ste13
1. Einleitung
vens et al., 1990). Hier wird angenommen, dass Tsl den potentiellen Torso-Liganden
Trunk modifiziert, der ebenfalls ubiquitär verteilt ist (vgl. Johnson et al., 2015). Trunk
wiederum aktiviert den Torso-Rezeptor (Furriols und Casanova, 2003; Li et al.,
2005).
tsl ist zwar in der Oogense von den terminalen Follikelzellen exprimiert, das TslProtein aktiviert aber den Torso-Rezeptor erst nach Translokation zur Plasmamembran der embryonalen Zellen im synzytialen Blastoderm (Furriols und Casanova,
2003; Mineo et al., 2015). Hierzu wird angenommen, dass das Tsl-Protein in der Oogenese in die Vitellinkörper eingebaut wird. Nach der Aktivierung des Eis wird Tsl zur
Plasmamembran der Oozyte verlagert (Mineo et al., 2015).
Nach der Aktivierung des Torso-Rezeptors wird über eine Ras/Raf MAPKinaseKaskade der Repressorkomplex der Zielgene des terminalen Systems durch Phosphorylierung inaktiviert so dass diese Gene exprimiert werden können (Duffy und
Perimon, 1994; Jiménez et al., 2000; de la Heras und Casanova, 2006; Astigarraga
et al., 2007). Der auf diese Art und Weise inaktivierende Repressorkomplex besteht
aus dem high-mobility-group- (HMG) Box-Protein Capicua (Cic) und dem Enhancer
of Split-Protein Groucho (Gro). Auch wenn Mutationen beider Gene zu einer Derepression der Torso-Zielgene führen, scheint Cic der Interaktionspartner des terminalen
Systems zu sein (vgl. Schrons et al., 1992; Paroush et al., 1997; Jiménez et al.,
2000). Die einzigen bisher bekannten Zielgene des terminalen Systems in Drosophila
sind die Gap-Gene tailless und huckebein, die dann die Spezifizierung von Acron
und Telson umsetzen (Paroush et al., 1997). Es könnten aber durchaus noch weitere
Zielgene existieren (Casanova, 2005). Beide Gap-Gene sind Transkriptionsfaktoren
die ihrerseits wiederum Zielgene wie brachyenteron (Singer et al., 1996), forkhead
(Weigel et al., 1989; Weigel et al., 1990) und die terminale Expression von
hunchback (Margolis et al., 1995) und wingless (Singer et al., 1996) aktivieren, die
zusammen für die terminale Musterbildung verantwortlich sind.
Trotz der Unterschiede zur Langkeimentwicklung von Drosophila werden auch in Tribolium die anterioren und posterioren Termini durch ein terminales System spezifiziert (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Durch den unterschiedlichen Entwicklungsmodus Triboliums hat jedoch das Torso-Signal eine viel größere Bedeutung.
Zur Spezifizierung der anterioren und posterioren Strukturen gehört hier auch die
Beteiligung an der Formation der extraembryonalen Serosa, sowie die Bildung und
14
1. Einleitung
Aufrechterhaltung der Wachstumszone (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Einzelne Komponenten des terminalen Systems scheinen dennoch ähnliche Funktionen
in Tribolium wie in Drosophila zu haben. Tribolium torso ist in der frühen Embryogenese ubiquitär exprimiert, während Tc'tsl bereits während der Oogenese von den
terminalen Follikelzellen exprimiert wird (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005;
Bäumer et al., 2011). Die Signaltransduktion erfolgt in Tribolium ebenfalls über eine
Ras/MAP-Kinase-Kaskade (Schröder et al., 2000; Schoppmeier und Schröder,
2005).
Anterior ist das Torso-Signal für die Bildung der extraembryonalen Serosa essentiell.
In Tc'tsl-/Tc'tor-RNAi-Embryonen ist die Serosa deutlich in ihrer Größe reduziert und
der anteriore Teil der Serosa ist deletiert. Gleichzeitig expandieren zunächst die
Kopfanlagen (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Wie bei Tc'zen-1-RNAiEmbryonen wird jedoch die Vergrößerung des Gewebes der prägnathalen und gnathalen Segmente im weiteren Verlauf der Embryonalentwicklung kompensiert (vgl.
Schoppmeier und Schröder, 2005; van der Zee et al., 2005). Posterior wird das Torso-Signal benötigt um eine funktionelle Wachstumszone zu etablieren. Der Knockdown von Tc'torso und Tc'tsl führt dazu, dass Embryonen nicht invaginieren und in
der weiteren Entwicklung keine Segmente gebildet werden, die in dem sekundären
Wachstumsprozess aus der Wachstumszone entstehen (vgl. Schoppmeier und
Schröder, 2005). Der Knock-down von des trunk-Homologes führt in Tribolium zu
terminalen Phänotypen, die mit dem Knock-down von Tc'tsl und Tc'tor vergleichbar
sind (Grillo et al., 2015). Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass auch Tc'trk eine Rolle im Torso-Signalweg Triboliums spielt.
Das Torso-Signal wird in Drosophila durch die Spezifizierung der beiden Gap-Gene
huckebein und tailless umgesetzt (vgl. Paroush et al., 1997). Das Drosophila Homolog Tc'hkb ist in Tribolium bisher nicht untersucht. Tc'tll nur kurz posterior exprimiert
(Schröder et al., 2000). Es wird angenommen, dass es posterior keine weitere
Segmentierungsgene reguliert, sonder vielmehr eine kleine Gruppe terminalen Zellen
direkt spezifiziert. Somit scheint sich die Funktion von tll in der Langkeimentwicklung
deutlich von der Funktion in Kurzkeiminsekten zu unterscheiden (vgl. Schröder et al.,
2000). Der Knock-down von Tc'tll resultiert in deutlich schwächeren, terminalen
RNAi-Phänotypen als der Knock-down von Tc'tsl und Tc'tor (Bucher, nicht publiziert).
Die posteriore Expression von Tc'wg ist im Blastoderm von der Aktivierung des Tor15
1. Einleitung
so-Signals abhängig und legt somit nahe, dass das terminale System eine Rolle in
der Aktivierung des Wnt-Signalwegs spielt (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005).
Zwar hat das Wnt-Signal eine Funktion in der Etablierung und Aufrechterhaltung der
Wachstumszone, für die korrekte Ausbildung sind allerdings weitere Faktoren notwendig (vgl. Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b; Beermann et al., 2011).
Des Weiteren ist Tc'cad wahrscheinlich ein Zielgen des posterioren Torso-Signals
(vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Tc'cad ist bei der AP-Musterbildung Triboliums essentiell (vgl. Copf et al., 2004; Schoppmeier et al., 2009). Anterior ist als
Zielgen des terminalen Systems bisher nur Tc'zen-1 bekannt (vgl. Schoppmeier und
Schröder, 2005; Pridöhl et al., eingereicht; siehe Anhang). Somit ist das Torso-Signal
über die Expression von Tc'zen-1 ein wichtiger Faktor in der Spezifikation der Serosa.
Zusammengefasst können die bisher identifizierten Zielgene des terminalen Systems
noch nicht vollständig die Phänotypen der Inhibierung des Torso-Signals erklären.
Ein capicua-Homolog existiert auch in Tribolium (Richards et al., 2008). Der Knockdown von Tc'cic führt zur Derepression der bisher bekannten Zielgene des terminalen Systems wie beispielsweise Tc'wg und Tc'tll (vgl. Pridöhl et al., eingereicht).
Tc'cic-RNAi-Embryonen zeigen eine starke Vergrößerung der extraembryonalen Serosa im differenzierten Blastoderm. Die Serosa-Embryo-Grenze bleibt dabei schräg.
Da im Knock-down von Tc'tsl die Serosa verkleinert ist, spiegelt dieser RNAiPhänotyp die Derepression des Torso-Signals wieder. Diese Ergebnisse legen nahe,
dass Tc'Cic ein Antagonist des Torso-Signalwegs, wie in Drosophila, ist (vgl. Jiménez et al., 2000). Kurz nach der Invagination arretiert die Embryonalentwicklung von
Tc'cic-RNAi-Embryonen, was wahrscheinlich der Grund für die ausbleibende Sekretion von Kutikula im Knock-down von Tc'cic ist (vgl. Pridöhl et al., eingereicht). Die
wenigen Embryonen, die dennoch eine Kutikula sekretieren (ca. 7% der abgelegten
Eier) zeigen starke Defekte der Kopfsegmente (vgl. Pridöhl et al., eingereicht). In Tribolium wurden zwei groucho-Homologe (Tc'gro-1 und Tc'gro-2) identifiziert, welche
Rolle beide Homologe allerdings genau spielen, ist bisher unklar (vgl. Koniszewski,
Diplomarbeit).
16
1. Einleitung
1.6 Die Identifikation neuer Kandidatengene in Tribolium castaneum
Wie bereits beschrieben ist die Taufliege der prominenteste Modellorganismus für
die Entwicklungsbiologie. Einer der ersten Ansätze zur Studie der Entwicklung von
Tribolium war die Analyse von bereits bekannten Faktoren aus Drosophila melanogaster. Dieser sogenannte "candidate gene approach"
kann jedoch mit der fort-
schreitenden Aufklärung von Entwicklungsprozessen in Tribolium immer weniger Erkenntnisse über die beteiligten Faktoren und dessen Funktionen in dem Kurzkeiminsekt liefern. Durch denstark abgeleiteten Entwicklungsmodus Drosophilas können
Faktoren der embryonalen Bein- und Kopfentwicklung (vgl., Klingler, 2004), sowie
Gene, die bei der Formation der Wachstumszone und den beteiligten, umfangreichen, morphologischen Prozessen (vgl. Handel et al., 2000) auf diese Art und Weise
in Tribolium nicht identifiziert werden. Außerdem wurden viele Kandidaten des
candidate gene approach bereits in Tribolium analysiert. Diese Analysen weisen darauf hin, dass unterschiedliche Gene vor allem in der Achsenentwicklung beteiligt
sind (Brown et al., 2001; Schoppmeier et al., 2009; Fu et al., 2012). Da bicoid außerhalb der höheren Diptera nicht vorkommt (Driever und Nüsslein-Volhard, 1988; Struhl
et al., 1989; Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001), muss die anteriore Musterbildung im Mehlkäfer anders von Statten gehen. Somit kann der candidate gene approach nicht als Ansatz dienen um die AP-Achsenentwicklung in Tribolium vollständig
aufzuklären und zu klären, ob es überhaupt ein anteriores Organisationzentrum im
Mehlkäfer gibt (vgl. Rosenberg et al., 2009).
Eine Möglichkeit zur Identifikation von Kandidatengenen sind groß angelegte funktionelle Analysen der Gene eines Organismus. Solche "Screens" beinhalten somit eine
Untersuchung einer Vielzahl an Genen. Ein neuer Ansatz zur Identifikation von Entwicklungsfaktoren in Tribolium war der iBeetle-Screen (Schmid-Engel et al., 2015).
Dieser Genom-weite RNAi-Screen in Tribolium lieferte Informationen zu tausenden
von Genen und deren Funktion in Oogenese, Embryogenese und Metamorphose
(Schmidt-Engel et al., 2015). Durch die unabhängige Analyse von Entwicklungsgenen konnte der iBeetle-Screen auch neuartige Genfunktionen identifizieren, was
durch den candidate gene approach nicht möglich war (Schmidt-Engel et al., 2015).
Somit sind die Ergebnisse des iBeetle-Screens ein bedeutendes Werkzeug bei der
Analyse der Entwicklung Triboliums.
17
1. Einleitung
Ein weiterer Ansatz zur Identifizierung von Entwicklungsfaktoren in Tribolium ist das
Erstellen von Transkriptomen. Der Vergleich aller exprimierter Gene, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der Entwicklung auftreten (vgl. http://bioinf.unigreifswald.de/gb2/gbrowse/tribolium/), lässt auf potentielle Faktoren schließen, die an
der Entwicklung in dem entsprechenden Stadium beteiligt sind. Somit können z.B.
bislang unbekannte, maternale Faktoren identifiziert werden.
Die differentielle Genexpressionsanalyse via Next-Generation-Sequencing (NGS)
erlaubt es, selbst vergleichsweise kleine Unterschiede der Expression von Genen in
einem Organismus zu detektieren (Anders und Huber, 2010). Durch den Knock-down
eines Gens durch RNAi wird nicht nur die Expression dieses Gens selbst reduziert,
sondern auch alle davon downstream gelegenen Gene. Demnach zeigt der Vergleich
des Transkriptoms von RNAi-Embryonen mit dem Wildtyp Transkriptom potentielle
Zielgene des reprimierten Gens auf. Der Vergleich von Expressionsniveaus in der
Repression von Zielgenen des terminalen Systems im Knock-down von Tc'tsl, mit
dem Vergleich der Derepression von Zielgenen im Knock-down von Tc'cic, kann also
zur Identifikation bislang unbekannter Ziele führen. Die differentielle Genexpressionsanalyse wurde folglich als Grundlage für die Arbeit gewählt um bisher unbekannte Zielgene des terminalen Systems in Tribolium zu identifizieren, wie in den Kapiteln
2.6.3 und 3.1 erläutert wird.
1.7 Ziele dieser Arbeit
Für das umfassende Verständnis der embryonalen Musterbildung von Insekten ist
die Analyse von Kurzkeiminsekten essentiell. Der Modus der Langkeiminsekten ist
abgeleitet und damit nur auf vergleichweise wenige Arten im Vergleich übertragbar.
Die Rolle des terminalen Systems in Tribolium ist deutlich umfangreicher und auch
die bisher bekannten Zielgene des Torso-Signals unterscheiden sich stark im Vergleich zu Drosophila (Paroush et al., 1997; Jiménez et al., 2000; Schoppmeier und
Schröder, 2005). Wie bereits beschrieben (vgl. Kapitel 1.5) ist das terminale System
in Tribolium auch an der Bildung der extraembryonalen Serosa beteiligt und essentiell für die Formation und Aufrechterhaltung der posterioren Wachstumszone (vgl.
Klinger et al., 1988; Nüsslein-Volhard, 1991; Paroush et al., 1997; Furriols und Ca18
1. Einleitung
sanova, 2003; Li, 2005; Schoppmeier und Schröder, 2005; Grillo et al., 2012; Pridöhl
et al., eingereicht).
Bislang können alle bekannten Zielgene des terminalen Systems in Tribolium jedoch
nicht die Phänotypen der Repression des Tc'Torso-Signals vollständig erklären. Für
Tribolium hkb sind bisher keine Phänotypen beschrieben und der Knock-down von
Tc'tll spiegelt zwar die terminalen Phänotypen wieder, resultiert aber in deutlich
schwächeren Defekten (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005; Bucher, nicht publiziert). In Tc'tsl-RNAi-Embryonen ist die Serosa deutlich reduziert (Schoppmeier und
Schröder, 2005). Bislang ist allerdings unklar wie der Einfluss des terminalen Systems auf die Bildung der extraembryonalen Membran zu Stande kommt. Des Weiteren ist bekannt, dass das Wnt-Signal über Tc'WntD/8 wichtig für die sekundäre Formation von Segmenten aus der Wachstumszone ist (vgl. Bolognesi et al., 2008b).
Tc'WntD/8 ist wahrscheinlich ein Zielgen des terminalen Systems (Pridöhl et al., eingereicht), aber dessen Knock-down spiegelt, selbst zusammen mit dem Knock-down
von Tc'wg nur einen deutlich schwächeren RNAi-Phänotyp wieder als der Knockdown von Tc'tsl oder Tc'torso (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005; Bolognesi et
al., 2008b). Somit stellt sich die Frage, wie genau das Torso-Signal realisiert wird
und welche bislang unbekannten Faktoren an dieser Umsetzung beteiligt sind. Die
Identifikation bislang unbekannter Zielgene des terminalen Systems in Tribolium, sowie die weitere Analyse der Umsetzung des Torso-Signals sind Inhalt dieser Arbeit.
Der candidate gene approach hilft bei der Identifikation weiterer Zielgene des terminalen Systems in Tribolium nicht weiter. Nur die Gap-Gene tailless und huckebein
sind bisher in Drosophila als Zielgene bekannt, reichen jedoch nicht aus, die Defekte
in der Repression des terminalen Systems zu erklären (vgl. Kapitel 1.5). Folglich sollte die differentielle Genexpressionsanalyse für die Generierung, der für diese Arbeit
grundlegenden Daten, etabliert und verwendet werden (vgl. Kapitel 1.6; Kapitel 2.6.3
und 3.1).
Die aus dem NGS erhaltenen Expressionsniveaus sollten mit anderen Daten zu diesen Genen verglichen werden um Kandidaten für einen Mini-Screen auszuwählen.
Dabei sollen bislang unbekannten potentiellen Zielgene des terminalen Systems analysiert werden. Der Mini-Screen soll auch bestätigen, dass es sich bei den identifizierten Genen tatsächlich um direkte und indirekte Ziele des Torso-Signalwegs handeln kann. Als neue Technik zur Analyse der Kanidatengene soll Live-Imaging etab19
1. Einleitung
liert werden. Die interessantesten Kandidaten des Mini-Screens soll im Detail analysiert werden um neue Kenntnisse über das terminale System in Tribolium zu erlangen und die Fragen nach der Rolle des terminalen Systems und dessen Funktion bei
der Etablierung der Serosa und der Wachstumszone zu beantworten.
20
2. Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Verwendete Lösungen
AP-Stainingbuffer (1 ml): 100μl 1 M Tris pH 9,5 mit HCl, 50μl 1 M MgCl2, 20μl 5 M
NaCl, 5μl 20%, Tween20
Alkalische Phophatase (AP) Färbelösung (1 ml): 15µl NBT/BCIP (Roche), 1 ml PBT
Boehringer Blocking Reagenz Stammlösung (10%) (BBR): 5 g Blocking Reagenz
(Roche, Blocking Reagent) in Maleinsäurepuffer (50 ml, bei 65°C gelöst, pH 7-7,5 mit
NaOH)
Hoyers-Medium: 30 g Gummi Arabicum, 16 ml Glycerol, 200 g Chloralhydrat, auffüllen mit H2O auf 50 ml
Hybridisierungslösung A (HybA): 50% Formamid (deionisiert), 5x SSC; 0,2 mg/ml
Lachshoden DNA (gekocht und fragmentiert), 0,1 mg/ml tRNA, 50 μg/ml Heparin, pH
5,5 (mit HCl)
Hybridisierungslösung B (HybB): 50% Formamid, 5xSSC, pH 5,5 (mit HCl)
Injektionspuffer: 1,4 mM NaCl, 0,7 mM Na2HPO4, 0,03 mM KH2O4, 4 mM KCl
Maleinsäurepuffer (für Blocking Reagenz): 100 mM Malein Säure, 150 mM NaCl, pH
7,5 (mit NaOH)
PEMS: 0,1 M Pipes, 2 mM MgSO4, 1 mM EDTA, pH 6,9 (mit NaOH)
10x PBS: 1,2 M NaCl, 70 mM Na2HPO4, 30 mM NH2PO4, pH 7,2 (mit HCl)
PBT: 1xPBS plus 0,02% Tween20 (Serva)
20x SSC: 3 M NaCl, 300 mM Na-Citrat, pH 7,0 (mit HCl)
21
2. Material und Methoden
2.2 Käferhaltung und Stämme
Als Kontrolle für alle Experimente sowie für die Injektion von dsRNA und für die Wildtyp-In-situ-Hybridisierung diente der T.c. Wildtypstamm San-Bernardino (SB-Stamm).
Für das Live-Imaging wurde der EFA-nGFP-Stamm von Tribolium verwendet (Sarrazin et al., 2012).
Alle Käfer wurden bei 23°C (respektive bei 32°C für die Eiablagen) auf doppelgriffigem Mehl (dg-Mehl) der Firma Rosenmühle GmbH gehalten. Dem Mehl wurde Bierhefe (50 g/kg, Heirler Cenovis GmbH) zugesetzt.
2.3 RNA-Interferenz (RNAi)
RNA-Interferenz (RNAi) wurde als Methode für das gezielte Ausschalten einzelner
Gene verwendet (Knock-down). Hierbei wird Doppelstrang RNA (dsRNA), die komplementär zur Messanger-RNA (mRNA) des Zielgens ist, in ein ausgewähltes Entwicklungsstadium von Tribolium (siehe unten) injiziert. Die dsRNA verhindert größtenteils die Translation des Zielgens (Hammond et al., 2001). Bei Tribolium castaneum inhibiert die parentale RNAi auch in den Nachkommen die Translation des
Zielgens (Bucher et al., 2002). Somit können durch dsRNA Injektionen der Parentalgeneration die zygotische und maternale Expression von Genen in der F1Generation inhibiert werden. Die Auswirkungen dieses Knock-downs auf die Entwicklung kann in der F1-Generation beobachtet und dokumentiert werden. Der RNAiEffekt kann jedoch auch die injizierten Tiere (Parentalgeneration) direkt betreffen und
dort u.a. Phänotypen im Ovar hervorrufen.
2.3.1 Synthese von Doppelstrang-RNA (dsRNA)
Für die Synthese doppelsträngiger RNA für die RNAi-Experimente wurde zunächst
ein DNA-Template erstellt. Als Ausgangsmaterial für das DNA-Template diente
22
2. Material und Methoden
cDNA, die mit dem Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit von der Firma Roche nach Angaben des Hersteller (RNA-Menge: 2 µg, Primer: Anchored-oligo(dT) 18,
Inkubation Schritt 6: 30min, 55°C) synthetisiert wurde. Die verwendete mRNA wurde
freundlicherweise von Michael Schoppmeier zur Verfügung gestellt und umfasst die
gesamte RNA von T.c. Embryonen im Alter zwischen 0 und 24 Stunden.
Die Erstellung des DNA-Template erfolgte über eine two-step-PCR. In der ersten
PCR wurde mit genspezifischen Primern das gewünschte Fragment amplifiziert. In
der 2. PCR wurden die für die dsRNA-Synthese notwendigen T7/Sp6-T7 Primer angehängt. Die PCR-Programme und Ansätze für beide Schritte der Two-step-PCR
sind in Tabelle 1 dargestellt. Das genaue Design aller Primer dieser Dissertation wird
in 2.3.2 beschrieben. Alle verwendeten Primer sind in Tabelle 4 im Anhang aufgeführt.
23
2. Material und Methoden
Tabelle 1: cDNA Two-Step PCR Programm
PCR 1
Initiale Denaturierung
94°C
3min
Denaturierung
Annealing I
Elongation
94°C
60°C
72°C
30sek
30sek
30sek
6x
Denaturierung
Annealing II
Elongation
94°C
62°C
72°C
30sek
30sek
30sek
6x
Denaturierung
Annealing III
Elongation
94°C
65°C
72°C
30sek
30sek
30sek
22x
Finale Elongation
72°C
5min
Ansatz:
H2O
10xPuffer
2µM Primer-Mix
100mM dNTP-Mix
cDNA
Thermus aquaticus
DNA-Polymerase
15 µl
2,5 µl
5 µl (je 2,5 µl/Primer)
0,5 µl
0,5 µl
0,5 µl
PCR 2
Initiale Denaturierung
94°C
3min
Denaturierung
Annealing I
Elongation
94°C
54°C
72°C
30sek
30sek
30sek
Finale Elongation
72°C
7min
Ansatz:
H2O
10xPuffer
2µM Sp6-T7-Primer
2µM T7-Primer
100mM dNTP-Mix
Produkt aus PCR 1
Thermus aquaticus
DNA-Polymerase
30x
33,5 µl
5 µl
2,5 µl
2,5 µl
5 µl
2 µl
0,5 µl
24
2. Material und Methoden
Das Produkt aus PCR 2 wurde mittels Gelelektrophorese quantifiziert und anschließend 1 µg PCR-Produkt als Template für die dsRNA-Synthese verwendet. Die Synthese von doppelsträngiger RNA für die RNAi erfolgte nach dem Standardprotokoll
für das Megascript T7 Kit von Ambion.
2.3.2 Primer-Design
Alle verwendeten Primer, des Mini-Screen, des Rescreen oder für weiterführende
Analysen und Non-overlapping-fragment-Überprüfungen wurden mit nextRNAi (Horn
et al., 2010) erstellt und evaluiert. Basierend auf der Datenbank des Tribolium castaneum 3.0 Assembly (Tcas 3.0, www.beetlebase.org) wurden Primerpaare für die
ausgewählten Gene generiert. Durch die Software nextRNAi konnten off-targets (unerwünschte, zusätzliche Bindestellen im Genom für die Primerpaare) vermieden
werden. Die Primerpaare wurden so gewählt, dass die Amplikons mindestens 220bp
groß waren (siehe Tabelle 6 im Anhang). In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass dsRNA bis ca. 70bp immer noch effektiv ist (Miller et al., 2012). Alle Primer
für PCR 1 (siehe 2.3.1) hatten einen gen-spezifischen Anteil von zwischen 20 und 22
Nukleotiden und eine Schmelztemperatur von 60°C. An den jeweiligen ForwardPrimer (Primer links) wurde die Sp6-Mini-Sequenz (TGACACTATAGAAGTG) gekoppelt
und
an
den
Reverse-Primer
(Primer
rechts)
die
T7-Mini-Sequenz
(CTCACTATAGGGAGA). Somit konnte das Produkt aus PCR 1 als Template für die
PCR 2-Reaktionen verwendet werden (siehe Abbildung 1). Alle Primer wurden von
der Firma Metabion synthetisiert.
25
2. Material und Methoden
Abbildung 1: Primerdesign für PCR. Der erste Teil des Primers (genspezifischer Teil) ist
bei Forward-Primern an den Sp6-Mini und bei Reverse-Primern an T7-Mini gekoppelt
(PCR 1). Die Produkte aus PCR 1 können somit sowohl für die Template-PCR der
dsRNA-Synthese (siehe 2.3.1) als auch für die Template-PCR der Sondensynthese verwendet werden (siehe 2.5.2).
2.3.3 Gelelektrophorese
Alle PCR-Produkte, wie auch die DIG-Sonden (siehe 2.5.2) wurden zur Kontrolle auf
einem 1%-igem Agarosegel aufgetragen. Dazu wurden 3 µl des PCR-Produkts oder
der Sonde mit 5 µl H2O und 2 µl Ladepuffer (Ambion Gel Loading Bufffer II) gemischt. Die Auftrennung erfolgte dann bei 80 mV für ca. 45 Minuten. Über den Längenstandart SmartLadder (Eurogentech) wurden die richtigen Größen der Fragmente
überprüft und, wenn notwendig, die Konzentration abgeschätzt.
2.3.4 Pupale Injektion
Die für die Injektion vorgesehene dsRNA wurde mit Injektionspuffer (siehe 2.1) auf
die entsprechende Konzentration verdünnt. Für den Mini-Screen sowie für die meisten anderen Experimente wurde eine Konzentration von 1 µg/µl gewählt. Höhere und
niedrigere Konzentrationen wurden nur als Kontrollen verwendet.
26
2. Material und Methoden
Weibliche Puppen wurden an einem Durchlichtbinokular (Firma Carl Zeiss Jena) sortiert und anschließend an ihren posterioren Strukturen (Cerci) auf einem Objektträger
(OT) mit Fixogum-Kleber (Marabu) festgeklebt. Diese Methode wird verwendet um
die Puppen für die Injektion zu fixieren und erlaubt den Puppen, normal zu schlüpfen.
Die Injektion erfolgte durch gläsernen Mikrokapillaren, die an einem Nadelzieher
(Sutter Instruments, Model P-97, Flaming/Brown Micropipette Puller) selbst hergestellt wurden. Diese Nadeln wurden mittels Microloader™ von Eppendorf® mit der
entsprechenden dsRNA beladen. Mit einem Mikromanipulator wurden die Puppen
von ventro-lateral angestochen um das ventral liegende Nervensystem nicht zu verletzen und die dsRNA ins Abdomen der Tiere injiziert bis dieses vollständig gestreckt
war.
Nach der Injektion wurden die Objektträger mit den festgeklebten Puppen auf dgMehl gesetzt und Männchen des entsprechenden Stamms im Puppenstadium dazugegeben.
Eine Woche nach Injektion konnten Eiablagen gewonnen werden, die für weitere
Analysen genutzt wurden.
2.3.5 Adulte Injektion
Analog zur pupalen Injektion wurde die dsRNA auf 1 µg/µl verdünnt.
Weibliche, adulte Käfer wurden mit CO2 betäubt und an einem Binokular sortiert. Die
Herstellung der Nadeln aus Mikrokapillaren erfolgte analog der Nadeln der pupalen
Injektion. Die adulten Weibchen wurden mit einer Federstahlpinzette dorso-ventral
gequetscht, damit sich das Abdomen unter den Flügeln hervorschiebt und die Käfer
ventro-lateral angestochen werden konnten um das Nervensystem nicht zu verletzen. Die Käfer wurden mit dsRNA injiziert, bis das Abdomen vollständig getreckt war.
Nach der Injektion wurden die Weibchen zusammen mit unbehandelten adulten
Männchen des entsprechenden Stamms auf doppeltgriffiges Mehl gegeben.
Nach ca. 16 Stunden wurden die Ablagen für das Sammeln von F1-Embryonen gestartet.
27
2. Material und Methoden
2.4 Larvale Kutikulapräparate
Für erste Analysen der Phänotypen in der Entwicklung der F1-Generation der injizierten Puppen und Käfer wurden Kutikulapräparate angefertigt. Dafür wurden zunächst
0-72h-Eiablagen der injizierten Käfer gesammelt und für weitere 72h auf 300 μm
Siebe zum Nachreifen gegeben. Zum Nachreifen der Embryonen wurden die Siebe
über eine mit Speiseöl gefüllte Petrischale gestellt. Wildtypische Larven schlüpfen
durch die Siebmaschen und werden im Öl aufgefangen, wohingegen Embryonen mit
Phänotyp meist nicht mehr in der Lage sind zu schlüpfen und im Sieb verbleiben.
Zur Erstellung der Kutikulapräparate wurden die Embryonen in ein 200 μm-Siebchen
überführt und zweimal 1,5 Minuten in einem Gemisch aus 1:1 Klorix und Wasser (je
50ml, DanKlorix Hygienereiniger, Colgate Palmolive) dechorionisiert. Rückstände
des Bleichmittels wurden durch das gründliche Spülen mit Leitungswasser entfernt.
Die Embryonen wurden in einen Tropfen Hoyers/Milchsäure auf einen OT überführt.
Etwa die Hälfte der Embryonen wurde zudem gequetscht, um die noch verbliebene
Vitellinmembran zu öffnen. Zum Aushärten und Klären der Präparate wurden sie
über Nacht in einem Wärmeschrank bei 60°C gegeben.
Durch die Autofluoreszenz der Kutikulapräparate konnten diese an einem Fluoreszenzmikroskop, wie in 2.9 beschrieben, ausgewertet werden.
2.5 Whole mount in-situ Hybridisierung und Antikörperfärbung
Für weitere Analysen der Phänotypen in der Embryonalentwicklung der F1Generation, sowie zur Expressionsanalyse verschiedener Markergene wurde Whole
mount in-situ Hybridisierungen verwendet. Dazu wird die mRNA-Expression eines
bestimmten Gens mit Hilfe von z.B. durch DIG (Digoxygenin) markierten antisenseSonden sichtbar gemacht. Die Durchführung erfolgte nach dem abgewandelten Protokoll Klingler lab vom Juli 2004.
28
2. Material und Methoden
2.5.1 Fixierung von Embryonen
Für die in-situ Hybridisierung wurden RNAi-Embryonen in Ablagen von 0-24 h fixiert.
Die Embryonen wurden abgesiebt und in 200 μm Siebe überführt, um für zweimal 3
Minuten in 50 ml 1:1 Klorix-Wassergemisch dechorionisiert zu werden. Zur Säuberung von Bleichmittelresten wurden die Embryonen gründlich mit Leitungswasser
gespült und in Gläschen mit jeweils 2 ml PEMS, 6 ml Heptan und 300 μl 37% Formaldehyd überführt.
Die eigentliche Fixierung erfolgte dann für 30-40 Minuten auf einem Schüttler (Nr.
3015, Gesellschaft für Labortechnik GmbH, GFL). Daraufhin wurde die wässrige
Phase (Formaldehyd und PEMS) abgenommen, 8 ml Methanol hinzugefügt und das
Gläschen für 30 Sekunden so stark wie möglich geschüttelt, um ein Abplatzen der
Vitellinmembran zu gewährleisten. Embryonen, bei denen die Vitelinmembran erfolgreich abgesprengt werden konnte, sammelten sich am Boden des Gläschens. Nichtdevitellinisierte Embryonen wurden zusätzlich jeweils zweimal durch Kapillaren mit
1,1 mm Durchmesser (Sterican 1,0x40 mm, B. Braun Melsungen AG) gespritzt, um
die Ausbeute zu erhöhen (Prozessierung der Embryonen). Die Embryonen wurden
dann in Eppendorfgefäße überführt und drei Mal mit Methanol gewaschen. Anschließend wurden sie bei -20°C gelagert.
2.5.2 Sondensynthese Digoxygenin (DIG) gelabelter Sonden
Für die Synthese der Sonden wurde zunächst ein DNA-Template benötigt. Dieses
wurde durch eine abgewandelte Form der PCR 2 aus Tabelle 1 generiert. Der Ansatz
und das PCR-Programm waren identisch, nur anstelle des Sp6-T7-Fusionsprimers
wurde zu Amplifikation in PCR 2, der Sp6-Primer verwendet. Alle genspezifischen
Primer aus PCR 1 waren so gewählt worden, dass anti-sense Einzelstrang-RNA
(ssRNA) Sonden mit einer T7-Polymerase transkribiert werden konnten.
Die Sondensynthese erfolgte nach Standardlaborprotokollen basierend auf Protokollen in TIG10 (S. 73 bzw. 266). Alle eingesetzten Komponenten kamen von der Firma
29
2. Material und Methoden
Roche Diagnostics GmbH. Es wurden jeweils 500 ng Template DNA eingesetzt und
wie oben beschrieben, alle Sonden mit einer T7-Polymerase synthetisiert.
2.5.3 In-situ Hybridisierung
Die Whole mount in-situ Hybridisierungs-Experimente wurden nach dem Laborprotokoll
„Klingler
lab
July
2004“
durchgeführt.
Die
dort
angegebenen
Post-
Fixierungsschritte und der Proteinase K Verdau wurden jedoch weggelassen.
Die Expression von Genen kann mittels Digoxygenin (DIG) markierten Einzelstrangantisense-RNA-Sonden sichtbar gemacht werden. Bei dieser Technik binden die antisense-Sonden an die komplementäre mRNA der jeweiligen Sonden. Die Sonden
werden durch einen α-DIG Antikörper, an welchen eine alkalische Phosphatase (AP)
gebunden ist, markiert (1:2000 Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments, Roche Diagnostics GmbH). Durch Zugabe von 15 μl einer NBT/BCIP-Lösung (NBT/BCIP Stock Solution, Roche Diagnostics GmbH) und 1 ml Färbepuffer, setzt die alkalische Phosphatase die Komponenten im basischen Milieu zu einem blauen Farbstoff um, sodass die Expressionsdomänen werden sichtbar und können dokumentiert werden.
Für die weitere Analyse der Morphologie der Embryonen wurden diese noch mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33258 (1:20, SIGMA) über Nacht bei 4°C gefärbt (und
für 3x15min gewaschen). Hoechst 33258 interkaliert in DNA und färbt damit die Zellkerne an, wodurch das Entwicklungsstadium von blastodermalen Embryonen bestimmt werden und außerdem die Untersuchung der Veränderung der extraembryonalen Serosa in differenzierten Blastodermen ermöglichte.
2.5.4 Antikörperfärbung
Als Grundlage für alle Antikörperfärbungen wurden Embryonen fixiert, wie in 2.5.1
beschrieben. Für die Antikörperfärbung wurde das Protokoll „Antibody staining of Tribolium embryos“ (Klingler, 3/99) verwendet.
30
2. Material und Methoden
Der Mouse-α acetyliertes Tubulin-Antikörper (Sigma) wurde 1:100 eingesetzt und der
sekundäre Antikörper (α-Mouse Cy3) in einer Verdünnung von 1:200. Um in der
pMAD-Färbung den primären Antikörper (RB-αpMAD 1:250; Sigma) sichtbar zu machen, wurde dieser mit einem sekundären Antikörper (Gt-αRb-AP 1:1000) detektiert.
Die Proteinexpression wurde über die Umsetzung von NBT dargestellt. Anschließend
wurden die Embryonen wie bei 2.5.3 beschrieben mit Hoechst 33258 gefärbt.
2.6 SOLiD™ Next-Generation-Sequencing
2.6.1 Gewinnung der Embryonen für das NGS
Für das SOLiD™ Next-Generation-Sequencing wurde zunächst mRNA aus Tribolium-Embryonen aufgereinigt. Für das Next-Generation Sequencing wurde der SBStamm von Tribolium verwendet.
Als Kontrolle wurden WT-Ablagen verwendet. Für die anderen beiden NGS-Ansätze
wurden jeweils 600 Puppen mit 1 µg/µl tsl-dsRNA, respektive mit 1 µg/µl cic-dsRNA
injiziert (siehe 2.3.2). Sieben Tage nach Injektion (ca. 2 Tage nach Schlüpfen der
Puppen) wurden die Ablagen gestartet.
Zuerst wurden Embryonen aus Ablagen von 7-12 Stunden gesammelt (differenziertes Blastoderm bis Serosafensterstadium). Die Embryonen wurden dann 3 Minuten
mit 10% Klorix und 3 Minuten mit 100% Klorix gebleicht. Danach wurden die Embryonen mit Leitungswasser gespült und bis zur mRNA-Extraktion bei -80°C eingefroren.
2.6.2 mRNA-Aufreinigung
21 Tage nach Injektion wurden die Ablagen gestoppt und die mRNA aus allen gesammelten Embryonen der drei Ansätze aufgereinigt. Hierfür wurde ein Oligotex®
31
2. Material und Methoden
Direct mRNA Mini Kit der Firma Qiagen® verwendet. Die mRNA wurde in 40 µl gelöst. Die erhaltenen Konzentrationen waren im Einzelnen:
WT: cmRNA=46,2 ng/µl
tsl-RNAi: cmRNA=122,8 ng/µl
cic-RNAi: cmRNA=16,9 ng/µl
2.6.3 SOLiD®-Next-Generation-Sequencing
Die eigentliche Sequenzierung wurde mit einem SOLiD 4 System von Life Technologies mit 50 bp Fragment-Reads durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit LifeScope
Version 2.5 von Life Technologies gezählt und auf das Referenz-Genom tcas3
gemappt (Kim et al., 2010). Für die Aussortierung von Adaptern, ribosomaler RNA
und tRNAs wurde eine Filterreferenz erstellt. Diese Referenz wurde mit Hilfe einer
Datenbank von Life Technologies für kurze und lange rRNA-Sequenzen und den Ergebnissen eines tRNAscan-SE (v1.1) der Referenzsequenz erstellt. Für den WildtypAnsatz konnten 15.517.184 Reads gemappt werden. Für Tc'tsl-RNAi konnten
6.172.710 Reads gemappt werden und für Tc'cic-RNAi 31.441.775 Reads. Das
Counting zeigte Reads in 143.603 Exons in 16.543 Transkripten der tcas 3 Referenz
(Kim et al., 2010). Für die Normalisierung und den Vergleich der Expressionen aller
drei Ansätze wurde DESeq (Anders und Huber, 2010) verwendet.
Die erhaltenen Daten wurden dann nach ihrem FoldChange sortiert und wie im Ergebnisteil diskutiert, wurden Kandidaten für einen Mini-Screen ausgewählt.
2.7 "Mini-Screen" und Rescreen
Auf der Suche nach Zielgenen des terminalen Systems in Tribolium wurde das SOLiD™-Next-Generation-Sequencing durchgeführt. Zur Validierung der Expressionsanalyse und zur Identifikation und Beschreibung potentieller Zielgene wurde ein MiniScreen durchgeführt.
32
2. Material und Methoden
2.7.1 Arbeitsablauf des Mini-Screens
Für die 50 ausgewählten Kandidaten wurden jeweils 21 Puppen mit der entsprechenden dsRNA injiziert (siehe 2.3.4). Der genaue Arbeitsablauf ist in Tabelle 2 aufgeführt:
Tag 1
Tag 8
Injektion von 21 Puppen pro Kandidatengen
Start der Ablage für die 1. Kutikulapräparation
Tag 10
Start der Ablage für die 1. Embryonenfixierung (0-24h)
Tag 11
Tag 12
Tag 13
Tag 16
1. Embryonenfixierung (0-24h) und Start der 2. Ablage
für die Embryonenfixierung
2. Embryonenfixierung (0-24h)
Start der 2. Ablage für die 2. Kutikulpräparation und 1.
Kutikulapräparation
Ovaranalyse bei möglichen Ablagedefekten und 2.
Kutikulapräparation
Tabelle 2: Arbeitsablauf des Mini-Screens. Nach dem oben beschrieben Schema wurden die RNAi-Experimente der 50 Kandidaten für Zielgene des terminalen Systems
durchgeführt.
Wenn die Eiablagerate der injizierten Käfer reduziert war, wurden die Weibchen abdominal geöffnet, die Ovare heraus präpariert und im Lichtmikroskop auf Defekte
untersucht. Die Fixierten Embryonen wurden mit Hoechst 33258 und gegen βTubulin gefärbt (siehe 2.5.4) und ausgewertet.
2.7.2 Rescreen
Nach der Auswertung der Daten des Mini-Screens wurden 14 Kandidaten für eine
ausführlichere Analyse ausgewählt. Zu diesem Zweck wurden für jeden dieser Kandidaten 300 Puppen injiziert. Daraufhin wurden wie in 2.4 beschrieben drei Kutikulaablagen und Präparationen durchgeführt, sowie zehn 0-24 Stunden Fixierungen.
Alle Kandidaten wurden in einer Doppel-in-situ Hybridisierung für Tc’zen-1 und
Tc’eve sowie in einer weiteren in-situ Hybridisierung für Tc’wg gefärbt.
33
2. Material und Methoden
2.8 Live-Imaging
Die RNAi-Experimente vieler Kandidaten aus dem Mini-Screen deckten Phänotypen
in blastodermalen Stadien oder der Invagination auf. Um diese Phänotypen näher zu
untersuchen, wurde die Morphologie von RNAi-Embryonen während ihrer Entwicklung regelmäßig dokumentiert. Durch Live-Imaging konnte die Entwicklung der RNAiEmbryonen kontinuierlich über einen längeren Zeitraum verfolgt werden. Aus diesen
zeitlichen Abfolgen einzelner Daten wurden am Ende Videos erstellt, die der Beschreibung der RNAi-Phänotypen dienen.
2.8.1 Vorbereitung für das Live-Imaging
Für die Gewinnung der Embryonen für das Live-Imaging wurde ein Tribolium-Stamm
verwendet, bei dem nukleär-lokalisiertes GFP, getrieben durch den EF1-alphaPromotor, exprimiert wird (EVA-nGFP-Stamm; Sarrazin et al., 2012) verwendet. Injektionen wurden wie in 2.3.2 beschrieben durchgeführt. Ablagen von 0-2 Stunden
wurden abgesammelt und 3 Stunden zum Nachreifen gestellt.
2.8.2 Präparation der Embryonen für das inverse Live-Imaging
Als erstes werden die Embryonen mit 1/6 Klorix-Lösung für zweimal 30 Sekunden
gebleicht um das Chorion zu entfernen. Bis zum Transfer wurden die Embryonen
dann in Leitungswasser feucht gehalten.
Als nächstes werden die Embryonen einzeln mit einem Pinsel vorsichtig auf ein
Deckgläschen (24x60mm) transferiert und dort in Gruppen von 3-4 angeordnet. Hierbei ist darauf zu achten, dass so wenig wie möglich Freiraum zwischen den Embryonen bleibt, ohne dass diese sich berühren.
Anschließend wird ein kleiner Tropfen des Halo Carbon Öl 700 (Sigma) vorsichtig
über jede Gruppe von Embryonen gezogen. Die Einzelnen Tropfen sollten einander
34
2. Material und Methoden
nicht berühren. Die richtige Größe der Tropfen ist so zu wählen, dass sie weder verlaufen noch nach Invertierung den Objektträger berühren und dennoch alle Embryonen vollständig bedecken. Das Deckglas wird invertiert und auf einen Objektträger
mit Spacern gelegt.
Ein detailliertes und graphisch aufgearbeitetes Protokoll für die Live-Imaging Präparationen befindet sich im Anhang (siehe Anhang 1, „Live-Imaging Tribolium Protocol“
vom 04.02.15).
2.8.3 Einstellungen des LAS AF Version 2.4.1
Die Einstellungen für die Aufnahme der z-Ebenen (Stapel) wurden wie in diesem Kapitel beschrieben gewählt. Der Argon-Laser wird auf 10% Leistung verwendet und
die Frequenz des Lasers wird auf 200 Hz gesetzt. Als Fluoreszenz wird die vom Programm vorgegebene Voreinstellung “GFP” verwendet. Diese Voreinstellung erlaubt
die Dokumentation des GFP-Markers. Als Auflösung wurde 1024x1024 gewählt, diese Auflösung kann allerdings an die Menge der zu scannenden Embryonen angepasst werden. Höhere Auflösungen vergrößern die Aufnahmezeit, wodurch weniger
Embryonen gleichzeitig dokumentiert werden können.
Von den Gruppen von Embryonen (Positionen) werden dann Stapel von 10-15 Ebenen ca. alle 12 Minuten aufgenommen. Diese Aufnahmen in 10facher Vergrößerung
fanden bei Raumtemperatur statt (ca. 21°C). Das Imaging wurde in Zeiträumen von
24 Stunden vorgenommen, was einer Embryonalentwicklung von ca. 15 Stunden bei
32°C entspricht.
2.9 Dokumentation
Für alle in-situ Präparate wurde ein Zeiss Axiophot Mikroskop mit angeschlossener
schwarz/weiß-Kamera verwendet. Auch die Kutikulapräparate wurden mit dem Zeiss
Axiophot dokumentiert. Die hierbei genutzte Software war AnalySIS (Soft Imaging
Systems).
35
2. Material und Methoden
Zur Dokumentation des Live-Imagings wurde ein Leica TCS SP5 II Confocal System
und zur Nachbearbeitung der Stapel die zugehörige Software LAS AF Version 2.4.1
build 638 und Fiji (Schindelin, 2012) verwendet.
Zur Bearbeitung aller Bilder, sowie zur Erstellung der Abbildungen wurde Adobe
Photoshop CS4 verwendet.
36
3. Ergebnisse
3. Ergebnisse
Ziel dieser Dissertation war die Identifizierung und Beschreibung bisher unbekannter
Zielgene des terminalen Systems in Tribolium castaneum. Nur Tc'zen-1 wurde bisher
als anteriores Zielgen des terminalen Systems identifiziert (Schoppmeier und Schröder, 2005) und die bekannten, posterioren Zielgene (Tc'wg, Tc'tll, Tc'cad und Tc'fkh)
können bisher die Phänotypen eines Knock-downs des torso-Signalwegs nicht vollständig erklären (Schoppmeier und Schröder, 2005). Somit müssen weitere Zielgene
des torso-Signalwegs noch bestimmt werden (Casanova, 2005).
Ein Knock-down des Torso-Signalwegs (z.B. über Tc'tsl-RNAi) führt vermutlich zur
Repression der Expression der Zielgene (Schoppmeier und Schröder, 2005). In Drosophila ist capicua Teil eines Repressorkomplexes, der die Expression von Zielgenen des terminalen Systems reprimiert (Jiménez et al., 2000). Ein vergleichbares
Modell zur Funktion des Dm'cic-Homologes wurde für Tribolium vorgeschlagen. Der
Knock-down von Tc'cic führt also wahrscheinlich zur Derepression von Zielgenen des
terminalen Systems (vgl. Pridöhl et al., eingereicht und siehe auch Kapitel 1.5).
3.1 Next-Generation-Sequencing als Ansatz zur Identifikation von Zielgenen des terminales Systems
Um neue Zielgene des terminalen Systems in Tribolium zu identifizieren wurde die
Expression aller Gene in bestimmten Stadien verglichen. Diese sogenannten
Transkriptome wurden für Wildtypembryonen, Tc'tsl-RNAi-Embryonen und Tc'cicRNAi-Embryonen angefertigt und beinhalteten Embryonen im Alter von 7-11 Stunden
bei 32°C (differenziertes Blastodermstadium bis zum Serosafensterstadium). Dann
wurde das Transkriptom der Zielgenrepression (Tc'tsl-RNAi) mit dem der Zielgenderepression (Tc'cic-RNAi) und dem Transkriptom des Wildtyps verglichen. Bei Genen,
die differentiell in den drei Ansätzen exprimiert sind, könnte es sich um Zielgene des
terminalen Systems handeln. Ist beispielsweise die Genexpression in Tc'tsl-RNAiEmbryonen im Vergleich zum Wildtyp reduziert und gleichzeitig in Tc'cic-RNAi37
3. Ergebnisse
Embryonen erhöht, könnte es sich bei dem Gen um ein Zielgen des Torso-Signals
handeln. Die Analyse der differentiellen Genexpression im Knock-down von Tc'tsl
und Tc'cic war die Grundlage für die Experimente dieser Dissertation (vgl. Kapitel
3.2).
Als Ansatz für die differentielle Genexpressionsanalyse der Repression durch Tc'tslRNAi und der Derepression durch Tc'cic-RNAi diente die aufgereinigte mRNA der
entsprechenden RNAi-Embryonen, sowie des Wildtyps (vgl. Kapitel 2.6). Die eigentliche
Durchführung
der
Expressionsanalyse
geschah
durch
SOLiD®-Next-
Generation-Sequencing. Die erhaltenen Reads wurden auf das Tcas3-Genome
gemappt (http://bioinf.uni-greifswald.de/gb2/gbrowse/tribolium/).
Insgesamt wurde durch das Next-Generation-Sequencing (NGS) differentielle Expression für 12.795 Gene erhalten (vgl. Abbildung 2). Für Zielgene des terminalen
Systems wird erwartet, dass diese im Knock-down von Tc'tsl nicht mehr oder deutlich
reduziert exprimiert sind. Für den Knock-down von Tc'cic würde man, als postulierter
Repressor des terminalen Systems (Pridöhl et al., eingereicht, siehe Anhang),
gleichzeitig eine stärkere Expression für diese Zielgene erwarten. Für Zielgene von
Tc'capicua wurden analog dazu erhöhte Expressionswerte in Tc'tsl-RNAi-Embryonen
und verminderte Expressionswerte in Tc'cic-RNAi-Embryonen erwartet. Somit wurde
eine möglichst differentielle Genexpression der potentiellen Zielgene in der Repression (Tc'tsl-RNAi) und Derepression (Tc'cic-RNAi) des Torso-Signals angenommen.
Die Ergebnisse des Next-Generation-Sequencings zeigen viele solcher potentieller
Kandidaten. Insgesamt wurden 1801 Gene identifiziert, die in Tc'tsl-RNAi hochreguliert und parallel in Tc'cic-RNAi runter reguliert sind. 2790 Gene sind in Tc'tsl-RNAi
herunter reguliert während sie gleichzeitig in Tc'cic-RNAi hochreguliert sind (vgl.
auch Abbildung 2).
Basierend auf den Ergebnissen des NGS und anderen Daten wurden folglich 50
Kandidaten ausgewählt. Diese Kandidaten wurden im Zuge dieser Dissertation auf
Expression, sowie larvalen und embryonalen RNAi-Phänotyp hin untersucht (vgl.
Kapitel 3.2 und 3.3).
38
3. Ergebnisse
Abbildung 2: Heat-Map der Ergebnisse des SOLiD®-Next-Generation-Sequencing. Gegenüberstellung der relativen Expression von Wildtyp (linke Spalte), Tc'tsl-RNAi (mittlere
Spalte) und Tc'cic-RNAi (rechte Spalte). Die Farben korrespondieren proportional zu den
relativen Werten jeder Spalte von höchsten Werten (weiß) bis zu den niedrigsten Werten
(rot).
3.2 Vom Next-Generation-Sequencing zu den Kandidatengenen
Zur Überprüfung der Ergebnisse des NGS und vor allem zur Analyse potentieller,
bisher unbekannter Zielgene des terminalen Systems in Tribolium, wurde eine Reihe
von Kandidaten ausgewählt. Diese Kandidatengene sollten in einem "Mini-Screen",
auf Expression sowie embryonale und larvale RNAi-Phänotypen hin untersucht werden.
Der Vergleich der relativen Expression war das erste Kriterium bei der Auswahl der
Kandidaten. Um die Auswahl einzuschränken wurde ein "cut-off", also eine Grenze
für die differentielle Expression, gewählt. Nur wenn die relative Expression im Vergleich zwischen der Tc'tsl-RNAi und der Tc'cic-RNAi bei mindestens 50% (halber
39
3. Ergebnisse
Wert der relativen Expression bzw. eineinhalbfacher Wert der relativen Expression
im Vergleich zum Wildtyp) lag, kamen die Gene in die Auswahl für die Analyse potentieller Zielgene (vgl. Kapitel 3.3). Dieser strikte cut-off wurde gewählt um die biologische Varianz zwischen den relativen Expressionslevels aller Gene in den unterschiedlichen Hintergründen (Wildtyp, Tc'tsl-RNAi und Tc'cic-RNAi) zu minimieren.
Der Vergleich der relativen Expressionen in der Repression und Derepression war
allerdings nur ein Kriterium bei der Auswahl der zu bearbeitenden Kandidatengene.
3.2.1 Bestimmung homologer Gene und Vergleich mit anderen Datenbanken
Als nächstes wurden zu den Genmodellen homologe Gene in Drosophila melanogaster bestimmt. Die Reads aus dem NGS waren bereits Genmodellen zugeordnet
(Tcas 3.0, vgl. Kim et al., 2010). Diese Genmodelle waren ebenfalls den entsprechenden Dm-Genen aus FlyBase (http://flybase.org/; FB2012_04) zugeordnet, soweit Dm-Homologe vorhanden sind. Durch diese Zuordnung konnten manche der
Gene, die bisher in Tribolium nicht beschrieben oder analysiert waren, teilweise
ebenfalls in Klassen eingeordnet werden.
Für die Klassifizierung der identifizierten Gene wurde diese mit den Ergebnissen des
iBeetle Screens verglichen (vgl. Schmitt-Engel et al., 2015). Die Ergebnisse dieses
genomweiten RNAi-Screens in Tribolium zeigen vor allem RNAi-Phänotypen der
analysierten Gene auf larvaler Ebene, die eine erste Klassifizierung der möglichen
Kandidatengene ermöglichte. Die Analyse des iBeetle-Screens (Schmitt-Engel et al.,
2015) umfasst auch Ablageraten und Ovarphänotypen. Somit konnte durch den Vergleich potentieller Kandidaten mit der iBeetle-Datenbank auch berücksichtigt werden,
ob es nach dem Knock-down überhaupt noch zur Produktion von Eiern gekommen
war, oder ob beispielsweise ein Oogenese-Defekt die Analyse der F1-Generation
unmöglich machen würde. Kandidaten, deren RNAi zu starken Oogenese-Defekten
geführt hatten, wurden für den "Mini-Screen" ausgeschlossen.
Außerdem wurden alle identifizierten Gene mit den Daten von maternalen und embryonalen
Transkriptomen
verglichen
(http://bioinf.uni-
greifswald.de/gb2/gbrowse/tribolium/). Der Vergleich zu diesen Transkriptomen gab
Aufschluss darüber, ob die Gene bereits maternal exprimiert sind oder in welchen
40
3. Ergebnisse
Entwicklungsstadien Transkripte der Gene zu finden sind. Dadurch konnten die identifizierten Gene weiter klassifiziert werden.
Die Auflistung der homologen Gene, der zugehörigen iBeetle-Nummern (SchmittEngel et al., 2015) und der zugeordneten Expressionsdaten aus den Transkriptomen
(http://bioinf.uni-greifswald.de/gb2/gbrowse/tribolium/) befinden sich in Tabelle 4 im
Anhang.
3.2.2 Kriterien für die Auswahl und Selektion der Kandidatengene
Somit gab es folgende Kriterien für die Auswahl der zu analysierenden Kandidaten
als potentielle, bisher nicht beschriebene Zielgene des terminalen Systems in Tribolium:
-differenzielle, relative Expression in Tc'tsl- und Tc'cic-RNAi
-Klassifikation (molekulare und biologische Funktion des Drosophila Homologs)
-larvaler RNAi-Phänotyp aus der iBeetle-Datenbank
-Expression (Daten aus den Transkriptomen)
Basierend auf diesen Kriterien wurden 50 Kandidaten ausgewählt. Für einen Kandidaten ließ sich auf cDNA keine Polymerase-Kettenreaktion durchführen (vgl. Kapitel
2.3). Somit wurde ein "Mini-Screen" mit 49 Kandidaten durchgeführt, wie in Kapitel
2.7 beschrieben. Die Ergebnisse dieses Mini-Screens sind in Kapitel 3.3 dargestellt.
Eine Liste aller Kandidaten des "Mini-Screens" ist in Tabelle 4 im Anhang aufgeführt.
41
3. Ergebnisse
3.3 Ergebnisse des "Mini-Screens"
Die Kandidatengene wurden nach den in Kapitel 3.2 beschriebenen Kriterien selektiert und auf embryonale Expression, larvale und embryonale Phänotypen hin analysiert. Das Vorgehen hierfür ist in Kapitel 2 detailliert beschrieben.
3.3.1 Analyse der Expression der Kandidatengene
Zunächst wurde die Expression aller Kandidaten durch in-situ-Hybridisierung analysiert. Die Expression der Kandidatengene ist exemplarisch in Abbildung 3 dargestellt
und die Verteilung dieser Expressionen der Kandidatengene in Abbildung 4. Es wurden alle Entwicklungsstadien von 0-24h bei 32°C (undifferenziertes Blastoderm bis
gestreckter Keimstreif) ausgewertet. Zusätzlich wurde die Expression in unbefruchteten Eiern analysiert, damit auch maternale Expression aufgezeigt werden konnte.
Eine exakte Beschreibung der Expression aller Mini-Screen-Kandidaten befindet sich
in Tabelle 4 im Anhang.
Die Aktivität des terminalen Systems beschränkt sich auf den anterioren und den
posterioren Pol des Eis und auch Phänotypen in Drosophila und Tribolium zeigen
anterior und posterior Defekte (Klingler et al., 1988; Jiménez et al, 2000; Schoppmeier und Schröder, 2005; de la Heras und Casanova, 2006; Astigarraga et al.,
2007). Die Zielgene des terminalen Systems in Drosophila, tll und hkb, sind in einer
anterioren und einer posterioren Domäne exprimiert (Jiménez et al., 2000). Somit
würde man in der Expression der mRNA von Zielgenen ebenfalls anteriore und/oder
posteriore Expression erwarten.
Zwei der 49 Kandidatengene zeigten in mindestens einem Entwicklungsstadium exklusive, anteriore Expression. 12 Kandidaten zeigten exklusive posteriore Expressionsdomäne. Insgesamt zeigten 23 Kandidaten Expression im anterioren und im posterioren Bereich des Embryos oder Eis (vgl. Abbildung 3, A). Beide unterschiedlichen
Expressionsdomänen sind nicht zwingend in den gleichen Stadien aufgetreten. Zusammengenommen konnte eine Überschneidung der Aktivität des torso-Signalwegs
mit der mRNA-Expression von 76% der Kandidaten gezeigt werden.
42
3. Ergebnisse
Abbildung 3: Beispiele für die Expression von Kandidatengenen. Die Expression ist
mittels Balken hervorgehoben. Alle Embryonen sind mit anterior nach links orientiert und
wurden bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Die Abbildungen zeigen der Reihe nach
jeweils ein Beispiel für anteriore (A), anteriore und posteriore (B) und nur posteriore Expression (C) in Tribolium Embryonen. A) TC004989 ist anterior in unbefruchteten Eiern
exprimiert. B) TC009922 ist im differenzierten Blastoderm anterior in einer Kappe und
posterior im Bereich der posterior Pit exprimiert. C) TC0013474 zeigt im differenzierten
Blastoderm posteriore Expression.
43
3. Ergebnisse
Expression der Kandidatengene
25
23
20
15
12
12
posteriore Expression
ubiquitäre Expression
10
5
2
0
anteriore Expression
anteriore und posteriore Expression
Abbildung 4: Expression der Kandidaten. Verteilung der mRNA-Expression der Kandidatengene des Mini-Screens. Expression in mehreren Domänen ist möglich. Angegeben sind
die absoluten Zahlen zur Expression der Kandidaten basierend auf 49 Kandidaten. Gene,
deren mRNA sowohl anterior als auch posterior exprimiert ist, zeigen nicht immer beide Expressionsdomänen im gleichen Entwicklungsstadium.
Prozentual betrachtet zeigten 4% der Kandidaten nur anteriore Expression, 47% zeigen sowohl anteriore als auch posteriore Expression, 24% der Kandidatengene waren nur posterior
exprimiert und 24% waren ubiquitär exprimiert. Die Daten zur Expression berücksichtigen alle
Entwicklungsstadien der RNAi-Embryonen von Ablagen von 0-24h (undifferenziertes Blastoderm bis zum gestreckten Keimstreif). Eine Beschreibung der Expressionen der Kandidatengene des Mini-Screens befindet sich im Anhang in Tabelle 3.
3.3.2 Larvale RNAi-Phänotypen des Mini-Screens
Als nächstes wurden die RNAi-Phänotypen der Kandidatengene auf larvaler Ebene
untersucht. Der Knock-down von Tc'tsl führt zu starken, posterioren Deletionen
(Schoppmeier und Schröder, 2005). Tc'zen-1 ist ein Zielgen des terminalen Systems
(Schoppmeier und Schröder, 2005). Durch die Effekte des Knock-downs von Tc'tsl
auf die Anlage und Morphogenese der extraembryonalen Serosa kommt es auch bei
der Reprimierung des terminalen Systems gelegentlich zur Vergrößerung der Kopfanalgen. Diese Defekte werden allerdings in der weiteren Embryonalentwicklung
größtenteils kompensiert (Schoppmeier und Schröder, 2005; van der Zee et al.,
2005) und sind auf larvaler Ebene nur selten zu beobachten.
44
3. Ergebnisse
Tc'cic-RNAi-Phänotypen zeigen vor allem starke Defekte der Kopfkapsel und der
Kopfextremitäten, sowie eine deutliche Erhöhung der Anzahl an "leeren Eihüllen"
(Pridöhl et al., eingereicht). Diese gesteigerte Menge an leeren Eihüllen deutet auf
eine früh-embryonale Letalität hin (Schmitt-Engel et al., 2015). In diesem Fall sterben
die Embryonen bevor Kutikula sekretiert wird, sodass in den larvalen Kutikulapräparationen dann nur eine leere Eihülle zurück bleibt. In Drosophila führt eine Mutation
von cic zu starken, anterioren und posterioren Phänotypen (Jiménez et al., 2000; de
la Heras and Casanova, 2006; Astigarraga et al. 2007).
Es wird nicht erwartet, dass ein jedes Zielgen die gleichen Phänotypen bedingt wie
das System, das es aktiviert. Für potentielle Zielgene würden vielmehr Teilaspekte
der beschriebenen RNAi-Phänotypen von Tc'tsl oder Tc'cic erwartet werden, die in
ihrer Summe die vollständige Repression oder Derepression widerspiegeln. Dennoch
ist es denkbar, dass bei einzelnen Kandidaten, beispielsweise solche, über die das
Torso-Signal oder dessen Reprimierung vermittelt werden könnte, auch die Phänotypen des Knock-downs von Tc'tsl oder Tc'cic auftreten. Zielgene des terminalen Systems könnten natürlich auch weitere, vom Torso-Signal unabhängige Funktionen in
der Embryonalentwicklung haben. Die RNAi-Phänotypen des terminalen Systems in
Tribolium sind in der Einleitung (Kapitel 1.5) im Detail beschrieben.
Um die Funktion der Kandidaten zu analysieren, wurden larvale KutikulaPräparationen angefertigt (vgl. 2.4). Auf larvaler Ebene zeigten sich für 45% der
Kandidaten anteriore und posteriore RNAi-Phänotypen (beispielhaft in Abbildung 5,
D) gezeigt. Weitere 14% zeigten nur anteriore Deformationen und Deletionen (Abbildung 5, B). 6% der Kandidaten zeigten nach RNAi nur posteriore Phänotypen (Abbildung 5, C). Für die genauere Darstellung der Verteilung der Phänotypen wurde die
Larve in 5 Bereiche eingeteilt (Abbildung 6): Kopfkapsel, Kopfextremitäten, Thorax,
anteriores Abdomen (A1-A6) und posteriores Abdomen (A7-A9/10 und Urogomphi/Pygopodien). Die Kopfextremitäten (Labrum, Antennen, Mandibeln, Maxillen und
Labium) waren oft nicht von Deformationen oder Größenveränderungen der Kopfkapsel betroffen. Deshalb wurden die Kopfextremitäten als eigene Kategorie aufgeführt. Die Kategorie "Thorax" umfasst die drei thorakalen Segmente und damit die
Beine der Larve. Da sich viele RNAi-Experimente des "Mini-Screens" (vgl. Abbildung
11) zwar auf das Abdomen, nicht jedoch auf das gesamte Abdomen auswirkten,
wurde dieses in das "anteriore Abdomen" und das "posteriore Abdomen" unterteilt.
45
3. Ergebnisse
Auch hier befindet sich die detaillierte Beschreibung aller larvaler RNAi-Phänotypen
in Tabelle 4 im Anhang.
Abbildung 5: Beispiele für larvale Phänotypen des Mini-Screens. Abbildung A zeigt
eine Wildtyp-Larve, Abbildungen B-D zeigen unterschiedliche RNAi-Larven. Alle Larven
wurden bei 100x Vergrößerung aufgenommen und sind mit anterior nach links und dorsal
nach oben orientiert. A) In der Wildtyp-Larve sind die Kopfextremitäten (Labrum, Antennen,
Mandibeln, Maxillen und Labium) deutlich zu erkennen. Die letzten beiden, abdominalen
Segmente (A9/A10) sind fusioniert. Posterior befinden sich die terminalen Strukturen Urogomphi und Pygopodien. B) Im Knock-down von TC004241 ist die Kopfkapsel in ihrer Größe deutlich reduziert (Pfeilspitzen). Von den Kopfextremitäten sind nur noch Labrum und
Antennen erkennbar. In diesem Beispiel ist auch T1 deletiert. Posteriore Strukturen sind
nicht betroffen. C) Die RNAi-Larve von TC015633 zeigt einen starken Segmentierungsabbruch nach A3 (Stern). Anteriore Strukturen und Segmente sind nicht betroffen. D) Anterior
ist die Kopfkapsel dieser Larve nach RNAi von TC005697 verkleinert und nicht alle Kopfextremitäten sind vorhanden. Ein Segmentierungsabbruch nach A3 (Stern) ist zu beobachten.
Ant: Antennen, Lb: Labium, Lr: Labrum, Md: Mandibeln, Mx: Maxillen, T1-3: Thorakale
Segmente 1-3, A1-8: Abdominale Segmente 1-8, Py: Pygopodien, Ug: Urogomphi
46
3. Ergebnisse
Abbildung 6: Unterteilung der larvalen RNAi-Phänotypen. A) Wildtyplarve. Die Larve ist
mit anterior nach links und dorsal nach oben orientiert und wurde bei 100x Vergrößerung
aufgenommen. Die Larve wurde zur Veranschaulichung und Darstellung der larvalen RNAiPhänotypen in 5 Abschnitte unterteilt. Diese Abschnitte sind: Kopfextremitäten, Kopfkapsel,
Thorax, anteriores Abdomen (A1-A6) und posteriores Abdomen (A7-A9/10 und terminale
Strukturen Urogomphi und Pygopodien).
Ant: Antennen, Lb: Labium, Lr: Labrum, Md: Mandibeln, Mx: Maxillen, T1-3: Thorakale
Segmente 1-3, A1-8: Abdominale Segmente 1-8, Py: Pygopodien, Ug: Urogomphi
Die Verteilung der larvalen RNAi-Phänotypen in Abbildung 7 zeigt, dass die Kopfkapsel in vielen Fällen (über 50% der Knock-downs) betroffen ist. Auch posteriore
Bereiche, wie die letzten abdominalen Segmente und die terminalen Urogomphi und
Pygopodien, zeigen sehr häufig einen Phänotyp (Abbildung 7, 45%). Die RNAiPhänotypen erstrecken sich deutlich seltener auf Kopfextremitäten (14%) als auf die
Kopfkapsel und auch im anterioren Abdomen zeigen sich seltener RNAi-Phänotypen
als im Posterioren (29%). Der Knock-down der wenigsten Kandidatengene hatte einen Effekt auf den Thorax (Abbildung 7, 8%). Zusammenfassend zeigen sich also in
den RNAi-Experimenten des "Mini-Screens" auf larvaler Ebene vor allem Defekte in
anterioren Kopfsegmenten und posterioren, abdominalen Segmenten.
Als Hintergrund in larvalen Kutikulapräparationen des Wildtyps treten ca. 20% leere
Eihüllen (auch "empty eggs" genannt) auf, die bereits weiter oben beschrieben sind.
Bei 41 der 49 Kandidaten traten in den RNAi-Experimenten auf larvaler Ebene deutlich erhöhtem Maße leere Eihüllen auf. Bei diesem Phänotyp ist nur die Eihülle übrig.
Es wurde keine larvale Kutikula gebildet. Da es den Tieren nicht gelungen ist, Kutikula zu sekretieren, ist davon auszugehen, dass der Knock-down wahrscheinlich zu
embryonaler Letalität führt. Somit kann bei 84% der Kandidaten davon ausgegangen
47
3. Ergebnisse
werden, dass bereits in embryonalen Entwicklungsstadien ein, in der stärksten Ausprägung letaler, Phänotyp besteht.
Larvale Phänotypen
45
41
40
35
30
25
25
22
20
14
15
10
7
4
5
0
Kopf kapsel
Kopf extremitäten
Thorax
anteriores
Abdomen
posteriores
Abdomen
Leere Eihüllen
Abbildung 7: Verteilung der larvalen Phänotypen der Kandidaten des Mini-Screens.
In welchen Abschnitten der Larve traten in wie vielen Kandidaten Phänotypen auf. Phänotypen eines RNAi-Experimentes zu einem Kandidatengen können mehrere Abschnitte der
Larve betreffen. Die Verteilung der Phänotypen ist in absoluten Zahlen gezeigt.
3.3.3 Embryonale RNAi-Phänotypen des Mini-Screens
Der Knock-down von Tc'tsl zeigt eine starke Verkleinerung der extraembryonalen,
anterioren Serosa, sowie das Ausbleiben der posterioren Invagination (Schoppmeier
und Schröder, 2005). Tc'cic-RNAi führt zur starken Vergrößerung der Serosa. Während die Invaginationsbewegung normal verläuft, sterben die Embryonen vermutlich
im Keimrudimentstadium (Pridöhl et al., eingereicht). Also führt RNAi gegen das maternal-etablierte, terminale System bereits zu Phänotypen in der frühen Embryonal48
3. Ergebnisse
entwicklung (Schoppmeier und Schröder, 2005; Pridöhl et al., eingereicht). Ab diesem Zeitpunkt der Entwicklung werden dementsprechend auch Phänotypen für Zielgene des terminalen Systems erwartet.
Der Knock-down der Kandidaten zeigte in mehr als 80% eine deutlich erhöhte Anzahl
leerer Eihüllen (vgl. Schmitt-Engel et al., 2015). Dieser RNAi-Phänotyp lässt auf frühe, embryonale Letalität schließen (vgl. 3.3.2). Zur Analyse embryonaler Phänotypen
der Kandidaten wurden, wie in 2.5.1 beschrieben, RNAi-Embryonen fixiert und diese
dann gegen β-Tubulin und die Zellkerne mit Hoechst 33258 gefärbt. Somit konnte die
Morphologie der Entwicklungsstadien vom undifferenzierten Blastoderm bis zum gestreckten Keimstreif sichtbar gemacht und analysiert werden. Dies gab weiteren Aufschluss über die RNAi-Phänotypen der Kandidatengene und deren erstmaliges Auftreten. Die genaue Beschreibung der embryonalen Phänotypen befindet sich in Tabelle 4 im Anhang.
Für die Darstellung der Ergebnisse des "Mini-Screens" wurden die embryonalen
Phänotypen kategorisiert. Die zur Darstellung gewählten Kategorien entsprechen
den Entwicklungsstadien in denen im "Mini-Screen" ein RNAi-Phänotyp beobachtet
werden konnte. Der Knock-down eines Kandidatengens kann in unterschiedlichen
Kategorien Phänotypen zeigen und somit auch in mehr als einer Kategorie in Abbildung 6 aufgeführt sein. Ebenfalls ist es möglich, dass keine älteren Stadien, als die,
in denen der erste Phänotyp auftritt, bei den fixierten RNAi-Embryonen vorhanden
waren. Selbstverständlich kann es sein, dass sich die Phänotypen eines Knockdowns in Blastodermstadien die Phänotypen der Keimstreifstadien bedingen. Um
solche Verbindungen zu bestätigen sind weitere Experimente, wie beispielsweise
das Live-Imaging (Kapitel 3.4) notwendig.
Die Unterteilungen der Entwicklungsstadien ist wie folgt: undifferenziertes Blastoderm (ca. 0-6h bei 32°C), differenziertes Blastoderm (ca. 6-8h), Invagination (ca. 8h),
Keimrudiment (ca. 8-11h), Keimstreif (ca. 11-24h). Für die Untersuchung embryonaler Phänotypen wurden im "Mini-Screen" nur Ablagen im Alter von 0-24 Stunden betrachtet.
In den meisten RNAi-Experimenten treten Phänotypen bereits im Blastoderm (0-6h
nach Ablage) auf (36 von 49; vgl. Abbildung 8). Viele dieser Phänotypen zeigen die
Degradation der Blastoderme (30 von 49, vgl. Tabelle 4 im Anhang), einige zeigen
49
3. Ergebnisse
aber auch Unregelmäßigkeiten in der extraembryonalen Serosa (4 von 49), sowie bei
der Lage der Zellkerne und der Kondensierung des embryonalen Gewebes vor der
Invagination (3 von 49; Abbildung 9, C). Diese Phänotypen bleiben entweder in späteren Stadien bestehen und wirken sich auf folgende Entwicklungsstadien aus oder
führen bereits hier zum Tod des Embryos und zur Degradation des Eis.
Phänotypen in Entwicklungsstadien
40
36
35
30
25
22
20
20
15
10
5
3
0
Blastoderm
Invagination
Keimrudiment
Keimstreif
Abbildung 8: Verteilung der embryonalen Phänotypen der Kandidaten des MiniScreens. Bei wie vielen RNAi-Experimenten der Kandidaten des Mini-Screens traten in den
einzelnen Entwicklungsstadien Phänotypen auf. Die einzelnen Entwicklungsstadien wurden
der Reihe nach in die Abschnitte Blastoderm, Invagination, Keimrudiment und Keimstreif
unterteilt. Phänotypen eines Kandidaten können in mehreren Entwicklungsstadien auftreten. Die angegebenen Werte sind absolute Zahlen.
Während der Invagination waren RNAi-Phänotypen bei 3 von 29 Kandidaten des Mini-Screens zu beobachten (vgl. Tabelle 4 im Anhang). In Keimrudimenten und Keimstreifen konnten bei vielen Kandidaten Defekte beobachtet werden. Diese äußerten
50
3. Ergebnisse
sich vor allem anterior in morphologischen Defekten der Kopfanlage und posterior in
Segmentierungsabbrüchen (Abbildung 9, D). Somit zeigten insgesamt 6 Kandidaten
in diesen Stadien nur Defekte der in den Kopfsegmenten. Zwei Kandidaten zeigten
ab dem Keimrudimentstadium Defekte in abdominalen Segmenten und Deletionen
der Segmente, die aus der Wachstumszone heraus entstehen (3. thorakale Segment
und alle abdominalen Segmente; vgl. Davis und Patel, 2002). Und schließlich zeigten
10 von 49 Kandidaten sowohl Defekte der prägnathalen und gnathalen Segmente
sowie Deformationen oder Deletionen der Segmente, die aus der Wachstumszone
sekundär gebildet werden. Die Übersicht der embryonalen Phänotypen für die Kandidaten des Mini-Screens befindet sich in Tabelle 4 im Anhang.
Auch auf embryonaler Ebene zeigen also die RNAi-Experimente vieler Kandidaten
Aspekte der RNAi-Phänotypen des Tc'tsl- und Tc'cic-Knock-downs. Bereits im differenzierten Blastoderm konnte bei 2 Kandidaten eine Verkleinerung der Serosa beobachtet werden, ähnlich wie im Knock-down von Tc'tsl. Teilaspekte des RNAiPhänotyps von Tc'cic werden jedoch auch von einigen Kandidaten gezeigt. Der
Knock-down eines Kandidaten (TC009048) zeigte eine Vergrößerung der extraembryonalen Serosa und einige andere Kandidaten zeigten Defekte und Deletionen der
Kopfsegmente, wie es für den Knock-down von Tc'cic beschrieben ist (Pridöhl et al.,
eingereicht). Desweiteren konnte bei 3 Kandidatengenen Störungen der Invagination
beobachtet werden (vgl. Tabelle 4 im Anhang). Da Tc'tsl-RNAi-Embryonen nicht invaginieren (Schoppmeier und Schröder, 2005) könnte dieser Phänotyp ein Teilaspekt
der Inhibition des Torso-Signals sein. Auf der anderen Seite zeigen auch Tc'cicRNAi-Embryonen Störungen bei der Invagination (Pridöhl et al., eingereicht). Abhängig von der Regulation im Knock-down von Tc'tsl und Tc'cic könnten Defekte der Invagination somit Aspekte der Repression oder Derepression des Torso-Signals sein.
Bei dem Knock-down von insgesamt 21 Kandidatengenen zeigen sich Segmentierungsabbrüche und/oder Deformationen der abdominalen Segmente im Keimrudimentstadium (vgl. Tabelle 4 im Anhang). Diese RNAi-Phänotypen könnten ebenfalls
Teilaspekte des Knock-downs von Tc'tsl sein, bei dem es zu keiner Invagination
kommt und alle Segmente deletiert sind, die sekundär aus der Wachstumszone gebildet werden (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005).
Zusammenfassend zeigen die RNAi-Experimente der Kandidaten auf larvaler und
embryonaler Ebene Aspekte oder Teilaspekte der RNAi-Phänotypen von Tc'tsl oder
51
3. Ergebnisse
Tc'cic. Fast 60% der Kandidaten zeigten auf larvaler Ebene RNAi-Phänotypen, die
auf Störungen des Torso-Signalwegs zurückgeführt werden können (vgl. Kapitel
3.3.2 und Tabelle 4 im Anhang). Wie in diesem Kapitel beschrieben zeigen insgesamt in etwa 39% der Kandidatengene Teilaspekte der Knock-downs von Tc'tsl oder
Tc'cic in der Embryonalentwicklung. Die Diskrepanz der Anzahl von Phänotypen die
auf eine Repression oder Derepression des Torso-Signals zurückzuführen sind, wird
in der Diskussion (siehe Kapitel 4.1) erörtert. Somit kann an dieser Stelle angenommen werden, dass die differentielle Genexpressionsanalyse durch Next-GenerationSequencing und der Ansatz dieser Dissertation zur Identifizierung weiterer Zielgene
des terminalen Systems wahrscheinlich erfolgreich war.
Die einzelnen, fixierten Stadien sind nur Momentaufnahmen und so ist es oft schwierig von blastodermalen Phänotypen auf solche im Keimrudiment zu schließen. Viele
der Phänotypen der Keimrudimente setzen sich vermutlich auch in die Keimstreifstadien fort. Somit können die Ergebnisse der Analyse der embryonalen Phänotypen
des Mini-Screens nicht immer Rückschlüsse auf die Zusammenhänge z.B. der larvalen und der embryonalen Phänotypen geben. Um einen Überblick über die zusammenhängende Entwicklung der embryonalen RNAi-Phänotypen zu erhalten und die
genauen Zeitpunkte des Auftretens der Phänotypen zu bestimmen wurde im Zuge
dieser Dissertation das Live-Imaging der Tribolium Embryonalentwicklung etabliert
und verwendet (vgl. Kapitel 2.8).
52
3. Ergebnisse
Abbildung 9: Beispiele für embryonale Phänotypen. A-D zeigen Hoechstfärbungen der
Zellekerne. Abbildungen A und B zeigen den Wildtyp, Abbildungen C und D RNAiPhänotypen. Embryonen in A und C sind von lateral gezeigt, Embryonen in B und D von
ventral. Alle Embryonen wurden bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A) Undifferenziertes Blastoderm des Wildtyps. B) Keimstreifstadium des Wildtyps von ventral. C) Degradiertes Blastoderm mit sehr unregelmäßigen Zellkernen in der RNAi von TC003946. Embryonales Gewebe ist nur noch posterior dorsal zu erkennen. D) Starke morphologische Defekte
im Keimstreif der RNAi von TC009922 von ventral gezeigt.
3.4 Live-Imaging der Embryonalentwicklung von Tribolium castaneum
Die Ergebnisse des Mini-Screens (Kapitel 3.3) zeigen sehr frühe RNAi-Phänotypen
für in etwa 71% der Kandidaten (35 von 49, vgl. Tabelle 4 im Anhang). Gleichzeitig
geben zwar larvale Phänotypen Hinweise auf embryonale Defekte, können die frühen Phänotypen aber nicht beschreiben und lassen nur vermuten, wann sie entstehen. Durch die Gastrulationsbewegung nach der Differenzierung ist es schwierig,
Phänotypen in Keimstreifen durch blastodermale Phänotypen zu erklären und zu
vereinigen.
Zur Untersuchung der frühen RNAi-Phänotypen und vor allem um Defekte vom undifferenzierten Blastoderm bis zum Keimstreif darstellen zu können, wurde die Methode
des Live-Imaging etabliert. Hierbei werden Embryonen während ihrer Entwicklung in
regelmäßigen Abständen dokumentiert. Für das Live-Imaging wird der EVA-nGFPStamm von Tribolium castaneum verwendet bei dem GFP nuklear exprimiert ist (vgl.
53
3. Ergebnisse
Kapitel 2.8 und Sarrazin et al., 2012). Durch das Live-Imaging können RNAiPhänotypen durchgehend während der Embryonalentwicklung beobachtet werden
und es kann verfolgt werden, ob und wie frühe Phänotypen mit späteren zusammenhängen. Außerdem erlaubt das Live-Imaging Einblicke in schnell ablaufende Entwicklungsabschnitte, wie z.B. der Invaginationsbewegung, welche bei fixierten RNAiEmbryonen oft nur schwer zu analysieren ist.
Zunächst wurde die Methode, wie in 2.8 beschrieben, entwickelt. Wichtige Parameter
für das Imaging waren die Laser-Exposition und die Vorbereitung der Embryonen für
das Imaging. Werden die Embryonen beispielsweise einer zu hohen Laser-Intensität
ausgesetzt, sterben sie und die Eier degradieren. Hierbei spielt es keine Rolle, ob die
Intensität kurz viel zu hoch oder über einen entsprechenden Zeitraum nur ein wenig
zu hoch ist. Deswegen wurde der Argon-Laser des verwendeten Leica SP5 II auf
10% der Leistung verwendet. Um die Laser-Exposition weiter zu minimieren, wurden
nur ca. alle 12 Minuten Ebenen durch den Embryo aufgenommen. Dieser Zeitraum
ist so gewählt, dass bei ca. 21°C keine Informationen während der schnellerablaufenden Entwicklungsprozesse, wie Differenzierung des Blastoderms und Gastrulation, verloren gehen.
Als nächstes müssen sich die Embryonen in einer Umgebung befinden, die ihnen
eine, zu den Normbedingungen kaum abweichende, Entwicklung ermöglicht. Hierzu
hat es sich gezeigt, dass die "Hanging-Drop-Methode" (Kapitel 2.8.2) sich besser
eignet als auf einem Objektträger liegende Embryonen. Die genaue Methodik für das
Live-Imaging ist in Kapitel 2.8 ausführlich beschrieben und das Protokoll für die Vorbereitung der Embryonen befindet sich in Anhang 1.
Bei ca. 21°C entwickeln sich Embryonen in 24 Stunden vom undifferenzierten Blastoderm bis zum kurzen Keimstreif (Handel et al., 2000). Diese Entwicklung entspricht
ca. 18 Stunden der Embryonalentwicklung bei 32°C. Die Analysen der RNAiEmbryonen zeigten, dass viele bereits ab dem Blastoderm Defekte zeigen (vgl. Kapitel 3.3.3 und Tabelle 4 im Anhang). Somit wurde das Imaging bereits in diesem Stadium begonnen. Der Zeitraum des Imaging von 24 Stunden wurde gewählt, da es bei
längeren Zeiträumen, vor allem aber nach ca. 36h des Imagings zu sehr hohen Letalitätsraten der Embryonen kam (Daten nicht gezeigt).
54
3. Ergebnisse
Zunächst wurde als Kontrolle und Referenz das Live-Imaging für den Wildtyp durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbilddungstafel 10 dargestellt und das Live-Imaging
als Video auf der DVD im Anhang (Videos 1 und 2). Im Zuge des Rescreens wurden
sechs Kandidaten ausgewählt und auf diese Art und Weise dokumentiert (Tc'crol,
Tc'CHOp24, Tc'mael, TC006181, TC005697, TC004241). Die Ergebnisse des LiveImagings sind in dieser Dissertation für Tc'mael und Tc'CHOp24 im Einzelnen gezeigt und werden in den folgenden Kapiteln dargestellt.
Die zeitlich animierten Aufnahmen der Live-Imaging-Experimente (Videos) für den
Wildtyp und die drei ausgewählten Kandidaten befinden sich auf der DVD, die der
Dissertation beiliegt.
55
3. Ergebnisse
56
3. Ergebnisse
Abbildung 10: Live-Imaging der embryonalen Frühentwicklung von Tribolium castaneum. Abbildungen A-F zeigen die embryonale Entwicklung eines EVA-nGFPEmbryos (Sarrazin et al., 2012) ab der Differenzierung des Blastoderms bis zur Keimstreifstreckung von lateral. Abbildungen G-L zeigen einen EVA-nGFP-Embryo von der
Differenzierung des Blastoderms bis zum kurzen Keimstreif in ventraler Ansicht. Alle
Embryonen sind mit anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen.
A) Nach der letzten, synchronen Zellkernteilung (Handel et al., 2000) beginnt das Blastoderm zu differenzieren. Hierbei bildet sich anterior die extraembryonale Serosa. Diese ist
an den größeren Zellkernen und dem größeren Abstand der Zellkerne zueinander zu
erkennen. Die Grenze zwischen Serosa und embryonalem Gewebe (SEG) verläuft zunächst gradlinig von ventral nach dorsal (Pfeilspitzen). B) Im posterior gelegenen, embryonalen Gewebe werden die Kopfsegmente (Prägnathum und Gnathum) sowie das erste thorakale Segment angelegt (Patel et al., 1994). Als nächstes kondensiert das embryonale Gewebe nach ventral-posterior. Dadurch wird die SEG schräg (Pfeilspitzen).
Gleichzeitig bildet sich am posterioren Pol die "posterior Pit", der Ort der späteren Invaginationsbewegung (B, Stern). Diese Mulde ist dorso-ventral asymmetrisch. C) Der posteriore Teil des embryonalen Gewebes kommt im Ei zu liegen und das Keimrudiment
kommt ventral auf dem Ei zu liegen. D) Anterior können lateral die Kopfanlangen erkannt
werden (Balken). Mit der Invagination überwächst die extraembryonale Serosa den Embryo. E-F) Anterior wird die Kopfform konkreter (Balken) und posterior beginnt der Embryo
zu elongieren, in dem aus der Wachstumszone weitere Segmente gebildet werden
(Stern). Hierbei wandert der Kopf auf die anteriore Seite des Eis.
G) Der Embryo beginnt sich zu den extraembryonalen (Serosa und Amnion) und embryonalen Gewebe zu differenzieren. H) Das embryonale Gewebe kondensiert auf der ventralen, posterioren Seite des Embryos und vollführt dann die Invaginationsbewegung über
die posterior Pit (I). J) Nach der Invagination können anterior die Kopfanalgen (Balken)
und posterior die Wachstumszone (Stern) erkannt werden. K) Die Serosa überwächst
den Embryo und bildet das Serosafenster, das sich später schließt (vgl. L). L) Während
der Keimstreif posterior elongiert (Stern), wandert der Kopf zur anterioren Seite des Eis.
3.5 Rescreen für ausgewählte Kandidaten
Die Ergebnisse des "Mini-Screens" in Kapitel 3.3 zeigen, dass der Ansatz zur Identifizierung von Zielgenen des terminalen Systems in Tribolium vielversprechend ist.
Die Expression vieler der ausgewählten Kandidatengene spiegelt die anteriore und
posteriore Aktivität des torso-Signalwegs (Schröder et al., 2000) wieder. Die Expression zahlreicher Kandidaten deckt sich ebenfalls mit der Expression der bekannten
Zielgene in Drosophila (Jiménez et al., 2000; de la Heras und Casanova, 2006; Astigarraga et al., 2007). Insgesamt zeigen 37 Kandidatengene anteriore und/oder posteriore Expression in mindestens einem Entwicklungsstadium (vgl. Abbildung 7). Viele larvale und embryonale RNAi-Phänotypen der Kandidaten spiegeln Teilaspekte
des Knock-downs von Tc'tsl oder Tc'cic wieder (vgl. Kapitel 3.3.2 und 3.3.3, sowie
57
3. Ergebnisse
Kapitel 1.5 in der Einleitung und Schoppmeier und Schröder, 2005; Pridöhl et al.,
eingereicht).
Zur weiteren Analyse der vielversprechendsten Kandidaten wurden als nächstes 14
der potentiellen Zielgene ausgewählt (vgl. Tabelle 5). Diese Gene wurden einerseits
auf Basis der Daten aus dem Mini-Screen ausgewählt (Expression, larvale und embryonale RNAi-Phänotypen, vgl. Kapitel 3.3). Die Kriterien zur ursprünglichen Selektion der Kandidaten des "Mini-Screens" (vgl. Kapitel 3.2.2) wurden jedoch andererseits
erneut für die Auswahl der weiter zu bearbeitenden Kandidaten herangezogen (Ergebnisse des NGS, Klassifikation, iB-Phänotyp und Daten aus Transkriptomen).
Die Experimente mit den ausgewählten 14 Kandidaten werden als "Rescreen" bezeichnet. Alle Kandidaten dieses Rescreens zeigen eine anteriore und/oder posteriore Expression in mindestens einem Stadium der Embryonalentwicklung Triboliums
(vgl. Abbildung 11, A-J und A'-J'). Desweiteren kennzeichnen sich alle 14 dieser
Kandidaten durch larvale RNAi-Phänotypen die anteriore und/oder posteriore Deformationen und/oder Deletionen zeigen (vgl. Abbildung 11, A''-J''). Alle RescreenKandidaten zeigen außerdem eine erhöhte Rate an embryonaler Letalität, was wiederum auf eine Funktion in der embryonalen Frühentwicklung hinweist (Abbildung
11, rechte Spalte; vgl. auch "leere Eihüllen" in Kapitel 3.3.2).
58
3. Ergebnisse
TC-Gen
Homolog
TC000868
TC003946
TC004241
TC004989
TC005597
TC006181
TC006235
TC006282
TC007740
TC008122
TC008172
TC009922
TC013474
TC015633
elB
crol
cathD
CG9323
CG43129
Dsp1
geminin
stas
mael
AP-2
sens
CHOp24
normierte relative Expression
Tc'ts l-RNAi
Tc'cic -RNAi
0,00 ↓
1,61 ↑
0,00 ↓
1,82 ↑
4004,49 ↑
10,25 ↑
0,39 ↓
1,89 ↑
0,04 ↓
1,23 ↑
0,00 ↓
2,99 ↑
0,00 ↓
2,21 ↑
0,00 ↓
2,31 ↑
688,99 ↑
1,39 ↑
0,33 ↓
1,58 ↑
0,02 ↓
1,27 ↑
0,00 ↓
2,20 ↑
0,00 ↓
2,93 ↑
0,13 ↓
3,26 ↑
Tabelle 3: Kandidaten des Rescreens. Die linke Spalte zeigt die TC-Nummern der
Rescreen-Kandidaten. Die zweite Spalte zeigt deren Drosophila-Homolog, soweit vorhanden. Die beiden rechten Spalten zeigen die normierte, gegen den Wildtyp relative,
Expression der Rescreen-Kandidaten im Knock-down von Tc'tsl oder Tc'cic. Rote Pfeile
zeigen an, dass die Expression in dem jeweiligen RNAi-Hintergrund herunter geregelt ist,
blaue Pfeile, dass die Expression, im Vergleich zum Wildtyp, hoch geregelt.
Abbildung 11 zeigt eine Übersicht der Daten zu 12 Rescreen-Kandidaten, die nicht
weiter im Detail dargestellt werden. Tc'crol ist in Kapitel 3.6 als Beispiel für die Ergebnisse des Rescreens dargestellt. Tc'mael und Tc'CHOp24 wurden noch detaillierter analysiert und sind im Folgenden einzeln beschrieben (vgl. Kapitel 3.8 und 3.9).
Eine detaillierte Aufführung aller larvalen und embryonalen Phänotypen und der Expressionen aller Kandidaten befindet sich in Tabelle 4 im Anhang.
3.5.1 Verifizierung der Experimente des Mini-Screens und Ergebnisse des Rescreens
Für alle Rescreen-Kandidaten wurden weitere RNAi-Experimente durchgeführt (vgl.
Tabelle 5 im Anhang). Im Vergleich zum Screen wurden für alle Kandidaten des
Rescreens 300 Puppen mit dsRNA injiziert. Jeweils 7, 14 und 21 Tage nach Injektion
wurden Ei-Ablagen für larvale Kutikulapräparationen gestartet. Dieser längere Zeit59
3. Ergebnisse
raum von larvalen Kutikulapräparationen erlaubt die bessere Darstellung von phänotypischen Serien und ermöglicht die Auswertung von deutlich mehr larvalen Kutikulapräparaten als im "Mini-Screen" (bei 21 injizierten Puppen). In allen Fällen konnten
die larvalen RNAi-Phänotypen aus dem "Mini-Screen" reproduziert werden (vgl. Abbildung 11 und Tabelle 5 im Anhang). Die Statistiken zur larvalen Kutikulapräparationen bestätigten weiterhin die Verteilung der Phänotypen, die im "Mini-Screen" erhoben wurde (Abbildung 11, rechte Spalte). Der hohe Prozentsatz der leeren Eihüllen
(Schmitt-Engel et al., 2015; vgl. Abbildung 11, rechte Spalte) der Kandidaten des
Rescreens spricht dafür, dass diese Kandidaten vermutlich eine essentielle Funktion
in der Embryonalentwicklung haben. Die RNAi-Embryonen sterben vermutlich bevor
Kutikula sekretiert werden kann (vgl. auch 3.3.2). Dieser RNAi-Phänotyp wird auch
im Knock-down von Tc'cic beobachtet (Pridöhl et al., eingereicht).
Von den Rescreen-Kandidaten zeigen 8 anteriore Expression, maternal und oder in
Blastodermstadien (CG43129, cathD, TC004241, Dsp1, AP-2, geminin, CG8408; vgl.
Abbildung 11 und siehe auch Kapitel 3.6.1: mael und Kapitel 3.7.1: CHOp24). Alle
Kandidaten zeigen in diesen Stadien posteriore Expression (vgl. Abbildung 11 und
Kapitel 3.6.1 und 3.7.1). Wie bereits in Kapitel 3.3.1 beschrieben würde man für Zielgene des terminalen Systems eine anteriore und/oder posteriore Expression erwarten. Somit sind die Ergebnisse der Expressionsanalyse der Kandidaten durch in-situ
Hybridisierung ein deutlicher Hinweis darauf, dass es sich es sich bei den ausgewählten Rescreen-Kandidaten um Zielgene des Torso-Signalwegs oder dessen Repressor handeln könnte.
Alle Kandidaten des Rescreens zeigen außerdem larvale RNAi-Phänotypen, wie sie
für die Repression oder Derepression des terminalen Systems erwartet werden würden (vgl. Kapitel 3.3.2). Auch im Knock-down der Rescreen-Kandidaten zeigen sich
auf larvaler Ebene Defekte der prägnathalen und gnathalen Segmente (CG43129,
TC004241, Dsp1, geminin, CG4808, CG9323, crol, sens; vgl. Abbildung 11 und siehe auch Kapitel 3.6.2 und 3.7.2). Diese anterioren Defekte könnten Aspekte des
Knock-downs von Tc'cic sein (vgl. Pridöhl et al., eingereicht), könnten aber auch die
gelegentlichen Kopfdefekte des Knock-downs von Tc'tsl wiederspiegeln (Schoppmeier, nicht publiziert). Segmentierungsabbrüche würden für Zielgene des terminalen
Systems erwartet (vgl. Kapitel 3.3.2; Schoppmeier und Schröder, 2005). Die posterioren Deletionen und Deformation der RNAi-Larven von CG43129, cathD, Dsp1,
60
3. Ergebnisse
geminin, CG9323, crol, elB, sens, mael und CHOp24 (vgl. Abbildung 11 und Kapitel
3.6.2 und 3.7.2) könnten somit Aspekte der Repression des Torso-Signalwegs sein.
Folglich sind die larvalen Kutikulapräparationen der RNAi-Experimente des Rescreens ein weiterer Indikator dafür, dass es sich bei den ausgewählten Kandidaten um
Zielgene des terminalen Systems handeln könnte.
Um die embryonalen Phänotypen der Rescreen-Kandidaten weiter zu charakterisieren wurden mit den fixierten RNAi-Embryonen Markergenfärbungen durchgeführt.
Um möglichst viele Erkenntnisse in einem Experiment zu gewinnen, wurden für alle
Rescreen-Kandidaten die Tc'wg in-situ-Hybridisierung durchgeführt (Nagy und
Carrol, 1996). Als Segmentpolaritätsgen ist Tc'wg, bereits in undifferenzierten Blastodermstadien am posterioren Pol exprimiert. Nach der Differenzierung der Blastoderme ist Tc'wg dann ebenfalls in zweiokularen Domänen exprimiert. Nach der Invagination ist Tc'wg segmental und in der Wachstumszone exprimiert (Nagy und Carroll
1994). Somit erlaubt dieses Markergen eine eingehende Analyse von Effekten eines
Knock-downs auf die Embryonalentwicklung.
Insgesamt 10 von 14 Kandidaten zeigten Defekte in der Expression von Tc'wg. Besonders die Reduktion oder Abwesenheit der posterioren Expressionsdomäne von
Tc'wg spiegelt die Situation im Knock-down von Tc'tsl wieder (Schoppmeier und
Schröder, 2005). Desweiteren wird angenommen, dass zumindest die posteriore Expression von Tc'wg unter dem Einfluss des Torso-Signalwegs steht (Schoppmeier
und Schröder, 2005). Posteriore Defekte konnten bei 8 der 10 Kandidaten mit unregelmäßiger Tc'wg-Expression beobachtet werden. Somit zeigen diese Kandidaten
Aspekte der Reprimierung des terminalen Systems. Diese Ergebnisse sind ein weiterer Indikator für den Erfolg des Ansatzes dieser Dissertation zur Identifikation von
bisher unbekannten Zielgenen des Torso-Signalwegs. Alle Ergebnisse der Tc'wgHybridisierungen in den RNAi-Embryonen der "Rescreen"-Kandidaten sind in Tabelle
5 im Anhang im Detail beschrieben.
Für die weitere Analyse der Rescreen-Kandidaten wurde die Tc'zen-1 und Tc'eve
Doppel-in-situ Hybridisierung durchgeführt. Tc'zen-1 ist ein Marker für die extraembryonale Serosa. Bereits vor der Differenzierung des Blastoderms ist Tc'zen-1 zunächst in einer anterioren Kappe exprimiert (Falciani et al., 1996). Diese Expression
erweitert sich mit der Differenzierung auf die extraembryonalen Serosa (Falciani et
al., 1996). Tc'zen-1 bleibt dann in der Serosa exprimiert und kommt am stärksten um
61
3. Ergebnisse
den Rand des Serosafensters vor (Falcani et al., 1996). Der Knock-down von Tc'tsl
führt zu einer Verkleinerung der Serosa (Schoppmeier und Schröder, 2005) und der
Knock-down von Tc'cic zeigt eine Vergrößerung der Serosa (Pridöhl et al., eingereicht). Neben der Analyse der Morphologie durch die Hoechst 33258-Färbungen der
Zellkerne (vgl. 3.3.3) konnten durch diese Markergenexpression auch Serosaphänotypen analysiert werden.
Insgesamt zeigten sechs der Rescreen-Kandidaten einen Effekt auf die Expression
von Tc'zen-1. Bei einem Kandidaten ist die Expressionsdomäne im undifferenzierten
Blastoderm reduziert (Tc'otk) und bei zwei Kandidaten ist die Expression von Tc'zen1, sowie die Größe der Serosa, verkleinert (Tc'mael und Tc'CHOp24). Solche Defekte der extraembryonalen Membran sind für den Knock-down des Torso-Signalwegs
beschrieben (Schoppmeier und Schröder, 2005) und als Teilaspekt für Zielgene erwartet. Diese Ergebnisse sind wiederum weitere Indikatoren, dass es sich bei den
ausgewählten Kandidaten um Zielgene des terminalen Systems, durch welche die
Serosa spezifiziert wird, handeln könnte. Die genauen Beschreibungen der Expression von Tc'zen-1 in den RNAi-Embryonen der Kandidaten befindet sich in Tabelle 5
im Anhang.
Zusammen mit Tc'zen-1 als Marker, wurde auch Tc'even-skipped (Tc'eve) zur Analyse des Knock-downs der Rescreen-Kandidaten verwendet. Tc'eve ist ein Paarregelgen, dessen komplexes und dynamisches Expressionsmuster Aufschluss über
gnathale und thorakale Segmente, sowie die Segmentaddition gibt (Patel et al.,
1994; Brown et al., 1997). Für die Markergenfärbung mit Tc'eve zeigten die RNAiEmbryonen von 7 Kandidaten Defekte in der Expression. Abwesenheit der Expression oder schwächere Expression deutet auf Defekte bei der Bildung der Segmente
hin. Außerdem zeigen sich hier, wie für Zielgene des terminalen Systems erwartet
(Schoppmeier und Schröder), Defekte in der Segmentaddition (vgl. Tabelle 5 im Anhang; Tc'mael, Tc'stas und Tc'dsp1).
Für zwei der Rescreen-Kandidaten (Tc'CHOp24, Tc'mael) wurde die Embryonalentwicklung mittels Live-Imaging dokumentiert. Hierfür wurden in dem EVA-nGFPStamm von Tribolium (Sarrazin et al., 2012) die entsprechenden dsRNAs injiziert und
die Ablagen wie in 2.8 beschrieben für das Imaging verwendet. Für diese Dissertation sind die Live-Imaging Ergebnisse für Tc'mael und Tc'CHOp24 in den folgenden
Kapiteln (3.6 und 3.7) gezeigt.
62
3. Ergebnisse
Die Phänotypen der Kandidaten könnten auf Grund einer unspezifischen oder anderen Bindung der ssRNA im Zuge der RNA-Interferenz auftreten (Schmitt-Engel et al.,
2015). Für die Überprüfung der RNAi-Phänotypen und zum Ausschluss von Offtarget-Effekten wurden Non-overlapping-fragments (dsRNA-Fragmente, die keine
Sequenzidentität mit den Originalfragmenten aus dem Screen aufweisen) verwendet
(siehe auch 2.3.2). Alle im Mini-Screen erhaltenen RNAi-Phänotypen ließen sich auf
larvaler Ebene mit den Non-overlapping-fragments-RNAis verifizieren (vgl. Abbildung
11 und Tabelle 5 im Anhang). Im Falle von Tc'mael und Tc'CHOp24 wurden die Nonoverlapping-fragment-Knock-downs auch auf embryonaler Ebene bestätigt. Durch
die NOF-Experimente und die Überprüfung mit next-RNAi (Horn et al., 2010) wurde
gezeigt, dass die RNAi-Phänotypen spezifisch durch den Knock-down der Kandidatengene entstehen.
Der Rescreen konnte die Ergebnisse des "Mini-Screens" bestätigen (vgl. Kapitel 3.3).
Die weiteren Analysen zeigen bei allen Kandidaten Defekte in der Expression der
Markergene Tc'wg, Tc'zen-1 oder Tc'eve und/oder der Embryonalentwicklung, die
Aspekten der Knock-downs des Torso-Signalwegs ähneln (Schoppmeier und Schröder, 2005). Die Expression und die larvalen Kutikulapräparationen vieler Kandidatengene zeigen ebenfalls Aspekte der Repression oder Derepression des TorsoSignalwegs. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass der Ansatz zur Identifikation neuer Zielgene durchaus geeignet zu sein scheint. Aus den Kandidaten des
Rescreen wurden Tc'mael und Tc'CHOp24 (Kapitel 3.6 und 3.7) ausgewählt um im
Zuge dieser Dissertation im Detail analysiert und charakterisiert zu werden.
63
3. Ergebnisse
64
3. Ergebnisse
Abbildung 11: Kandidaten des Rescreens. Abbildungen A-L und A'-L' zeigen Hellfeldaufnahmen der Expression der mRNA der Kandidaten des Rescreens. Alle Embryonen sind mit anterior
nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Abbildungen A''-J'' zeigen Kutikulapräparationen der entsprechenden RNAi-Experimente. Alle Larven sind mit anterior nach links
und dorsal nach oben im Bild orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Die jeweilige
TC-Nummer und das jeweilige Homolog (soweit verfügbar) stehen in der Spalte links. Rechts in
der Spalte ist die prozentuale Verteilung der Kutikulaphänotypen wie in den Abbildungen A''-L''
gezeigt, angegeben und der Prozentsatz der leeren Eihüllen. Außerdem sind in der rechten Spalte
die embryonalen Phänotypen der jeweiligen Rescreen-Kandidaten stichpunktartig beschrieben.
65
3. Ergebnisse
3.6 Tribolium maelstrom besitzt eine wichtige Funktion in der Embryogenese
Das erste der beiden Kandidatengene, das im Zuge dieser Dissertation im Detail
analysiert wurde, ist Tc'maelstrom (Tc'mael). Die relative Expression von Tc'mael ist
in Tc'tsl-RNAi deutlich reduziert und in Tc'cic-RNAi stark erhöht (vgl. Tabelle 4 im
Anhang). Somit ist, basierend auf dem NGS-Transkriptomen, anzunehmen, dass es
sich bei Tc'mael um ein Zielgen des torso-Signalwegs handelt. Drosophila maelstrom
(mael) ist ein PIWI-Interaktions-RNA-Faktor (piRNA) und verfügt über eine HMGBox-Domäne und eine MAEL-Domäne (Sato und Siomi, 2015). Dm'mael besitzt zwei
unterschiedliche Funktionen.
Die erste beschriebene Funktion von Drosophila mael ist das mRNA-silencing in der
Nuage von Nährzellen während der Oogenese. maelstrom ist dort in den mikroRNAund RNAi-Signalwegen involviert (Findley et al., 2003; Lin, 2012). piRNA-Faktoren
sind in Drosophila notwendig für die Gen-Stilllegung von Transposons in den somatischen Zellen und Keimbahnzellen. mael-Mutanten zeigen eine Derepression der
Transposons, die mit piwi-Mutanten vergleichbar ist (Sato und Siomi, 2015).
Die zweite in Drosophila beschriebene Funktion von mael, ist die Beteiligung der Reorganisation des Mikrotubuliapparates während der Oogenese bei der AP- und DVAchsenanlage (Sato et al., 2011). mael-Mutanten zeigen eine Misslokalisation des
Oozytenkerns in der Oogenese, da das Mikrotubuli-Organisations-Zentrums (MTOC)
nicht posterior lokalisiert wird. Somit ähneln mael-Mutanten dem gurken-Phänotyp.
Sie zeigen eine Akkumulation von bicoid am anterioren und posterioren Pol sowie die
Lokalisierung von oskar in der Mitte der Oozyte (Clegg et al., 1997; Clegg et al.,
2001; Findley et al.; 2003; Sato et al., 2011).
3.6.1 Tc'mael ist maternal exprimiert
Erste Expression von Tc'mael ist maternal zu erkennen. In unbefruchteten Eiern zeigt
sich vermutlich eine breite, anteriore Expressionsdomäne (Balken, Abbildung 12, AA''). Außerdem ist Tc'mael um den Polkörper exprimiert (A-A', Stern). Diese Expres66
3. Ergebnisse
sion ist allerdings vermutlich unspezifisch (Peel und Averof, 2010). Wahrscheinlich
stellt der Polkörper einen größeren Speicher an Zytoplasma zur Verfügung in dem
maternale RNAs passiv vorhanden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die maternalen Transkripte, die zum Polkörper gehören, keinen Einfluss auf die dorso-ventrale
Achsenetablierung haben (Peel und Averof, 2010). Somit kann angenommen werden, dass auch die maternale Expression von Tc'mael um den Polkörper unspezifisch ist. In undifferenzierten Blastodermen ist Tc'mael dann posterior am Pol des Eis
exprimiert (B-B', Stern). Diese Expression bleibt im differenzierten Blastoderm um
die posterior Pit bis zur Invagination bestehen (C-C''). Ab dem Keimrudimentstadium
ist Tc'mael nicht mehr exprimiert (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 12: In-situ Hybridisierung gegen Tc'mael im WT. A-C Hellfeldaufnahmen unterschiedlicher Entwicklungsstadien der Tc'mael-Expression im Wildtyp. A'-C'
Hellfeldaufnahmen im optischen Schnitt. A''-B'' Hoechstfärbungen der Zellkerne der
Embryonen aus A-C. Anterior ist in allen Abbildungen links. Alle Embryonen wurden
bei 100x Vergrößerung aufgenommen.
A-A'') In unbefruchteten Eiern, ist Tc'mael in einer breiten, anterioren Domäne exprimiert (schwarzer Balken). Weitere Expression befindet sich in dem Polkörper
(Stern). B-B'') Im undifferenzierten Blastoderm ist Tc'mael in einer schmalen, posterioren Domäne um den posterioren Pol des Eies exprimiert (Stern). C-C')' Auch im
differenzierten Blastoderm ist Tc'mael posterior um die posterior Pit exprimiert
(Stern).
67
3. Ergebnisse
3.6.2 Larvale Tc'mael-RNAi-Phänotypen zeigen vier Klassen an Phänotypen
Zusätzlich zu den Daten aus den Experimenten des Rescreens, wurden für Tc'mael
300 weitere Puppenstadien für Ei-Ablagen zur larvalen Kutikulapräparation mit
dsRNA injiziert. Außerdem wurden bei Injektionen für Tc'mael-RNAi-EmbryonenAblagen weitere, larvale Kutikulapräparationen als Kontrollen angefertigt. Die Summe aller Kutikula-Präparationen wurde für die Statistik verwendet (n=3423).
Die RNAi-Experimente von Tc'mael zeigen auf larvaler Ebene ein heterogenes Ergebnis. Die präparierten Larven weißen eine Vielzahl unterschiedlicher Phänotypen
auf, die alle auch in Kombination auftreten. Zur Übersicht und Auswertung wurden
die larvalen Tc'mael-RNAi-Phänotypen in vier Kategorien gegliedert.
Die größte und erste Kategorie des larvalen Phänotyps zeigt posteriore Deformationen (Abbildung 14, B, Stern) bis hin zu posterioren Segmentierungsabbrüchen, bei
denen alle abdominalen Segmente deletiert sind (insgesamt 41%; Abbildung 13, CD). In den stärksten posterioren RNAi-Phänotypen ist auch das dritte thorakale Segment deletiert und somit alle Segmente, die sekundär aus der Wachstumszone heraus gebildet werden (Abbildung D).
Der posteriore RNAi-Phänotyp tritt in etwa einem Drittel zusammen mit anterioren
Phänotypen auf (insgesamt bei 14% aller larvalen Kutikularäparate und 34% der posterioren Phänotypen). Anteriore Defekte gehören zur zweiten Kategorie des larvalen
RNAi-Phänotyps von Tc'mael. Das Ausmaß der RNAi-Effekte auf Kopf und Kopfextremitäten ist hochgradig variabel und beinhaltet unter anderem die Reduktion der
Kopfkapsel und das Fehlen von Kopfextremitäten (Abbildung 14, C und D). Soweit
die Kopfextremitäten vorhanden sind, sind diese oft verkürzt und deformiert. Einzelne
Segmente der Kopfextremitäten scheinen nicht deletiert zu sein, wobei die Extremitäten selbst vorhanden sind (C, D, F).
68
3. Ergebnisse
119;
4%
442; 13%
914; 27%
WT
Leere Eihüllen
Kategorie 1: posteriore
Defekte/Deletionen
Kategorie 2: Kopf deletiert/reduziert und
abdominale Deletionen/Deformationen
Kategorie 3: Evertierte Larven
461; 13%
557; 16%
Kategorie 4: Defekte beim
Rückenschluss
930; 27%
Abbildung 13: Statistische Verteilung der larvalen Kutikulaphänotypen von
Tc'mael-RNAi. Gesamtzahl aller ausgezählten Kutikulas n=3423.
Die dritte Kategorie zeigt evertierte Larven (Abbildung 14, E). Bei diesem RNAiPhänotyp sind die äußeren Strukturen der Larve nach innen gekehrt und somit erstrecken sich auch die Beine und Kopfextremitäten in das Innere der Larve. Der
Darm liegt dann meist neben der Larve (nicht gezeigt). Es wurde gezeigt, dass diese
"inside-out"-Phänotypen z.B. durch das Ausbleiben der Fusion zwischen Serosa und
Amnion während der Retraktion des Keimstreifs entstehen können (van der Zee et
al., 2005). Im Wildtyp fusioniert das amniotische Epithel mit der Serosa. Dadurch
reist die Amnionhöhle ein und ermöglicht der lateralen Epidermis des Embryos sich
an der dorsalen Mittelline zu schließen (van der Zee et al., 2005). Der "inside-out"Phänotyp tritt in schwächeren Tc'mael-RNAi-Phänotypen manchmal nur partiell auf
und betrifft dann nur posteriore Teile der Larve (Daten nicht gezeigt). Kopfkapseldefekte und Deformationen der Kopfextremitäten sind ebenfalls oft zu beobachten. Insgesamt zeigen ca. 13% aller Tc'mael-RNAi-Larven diesen Defekt (vgl. Abbildung 13).
Die vierte Kategorie umfasst Defekte beim Rückenschluss (F, Stern). Die Larven sind
oft dorsal stark gekrümmt. Larven mit Defekten beim Rückenschluss zeigen oft auch
69
3. Ergebnisse
abdominale Deletionen und Kopfdefekte (F). Zusammengenommen umfasst diese
vierte Kategorie des larvalen Tc'mael-RNAi-Phänotyps etwa 4% (vgl. Abbildung 13).
Um zu analysieren, wann die vier unterschiedlichen Kategorien von RNAiPhänotypen der larvalen Kutikulapräparate entstehen, wurde das Live-Imaging der
Embryonalentwicklung angewendet. Prägnathale und gnathale Segmente werden
bereits im Blastodermstadium angelegt (vgl. Handel et al., 2000). Somit würde man
erwarten, dass die anterioren RNAi-Phänotypen, die in den larvalen Kutikulapräparationen beobachtet werden konnten, in der Embryonalentwicklung zuerst auftreten. Im
differenzierten Blastoderm wird posterior die Anlage der Wachstumszone gebildet
(Handel et al., 2000). Falls die Segmentierungsabbrüche, die auf larvaler Ebene für
Tc'mael gezeigt wurden (vgl. Abbildung 14, C-D und F) auf Defekte mit der Etablierung der Wachstumszone zurückgehen würden, würde man den Ursprung dieses
RNAi-Phänotyps in diesem Entwicklungsstadium erwarten. Evertierte Larven sind für
Defekte bei der Fusion zwischen Amnion und Serosa beschrieben, bei der Retraktion
des Keimstreifs kurz vor dem Rückenschluss (van der Zee et al., 2005). Somit könnte dieses Entwicklungsstadium der Ursprung der "inside-out"-Phänotypen sein. Der
Rückenschluss ist der letzte Prozess der Embryonalentwicklung (Handel et al., 2000)
und dementsprechend würde man auch die Entstehung dieses RNAi-Phänotyps als
Letztes erwarten. Zur detaillierten Analyse der Phänotypen, sowie deren Entstehungszeitpunkt, wurden außerdem Markergenfärbungen verwendet, wie in den folgenden Kapiteln beschrieben.
70
3. Ergebnisse
Abbildung 14: mael-RNAi-Kutikulaphänotypen. Fluoreszenzaufnahmen bei 100x
Vergrößerung (Kopf in A' bei 200x Vergrößerung). Abbildungen A und A' zeigen einen Wildtyp und Abbildungen B-F zeigen Tc'mael-RNAi-Larven. Alle Larven sind mit
anterior nach links orientiert.
A) Wildtyplarve mit 8 abdominalen Segmenten (A1-A8), terminalen Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py), sowie den Kopfanhängen Labrum (Lr), Antennen
(Ant), Mandibeln (Md), Maxillen (Mx) und Labium (Lb). A') Vergrößerung der Kopfkapsel und der Kopfanhänge. B) Schwächster, larvaler Tc'mael-RNAi-Phänotyp der
sich in der Deformation des Abdomens äußert und in der Deletion posteriorer Strukturen (Stern). C) Stärkere mael-RNAi-Phänotypen zeigen eine starke Reduktion der
Größe der Kopfkapsel sowie die Deletion aller abdominaler Segmente (Stern). D) Die
stärksten anterior-posterioren RNAi-Phänotypen des Tc'mael-Knock-downs betreffen
sogar das dritte thorakale Segmente und den Verlust von Kopfanhängen. E) Unabhängig von den anterioren und posterioren RNAi-Phänotypen (aber auch in Kombination mit diesen) treten inside-out-Phänotypen auf. F) Ebenfalls unabhängig oder in
Kombination mit den anderen, larvalen RNAi-Phänotypen, treten Defekte beim Rückenschluss auf.
Ant: Antennen, Lb: Labium, Lr: Labrum, Md: Mandibeln, Mx: Maxillen, T1-3: Thorakale Segmente 1-3, A1-8: Abdominale Segmente 1-8, Py: Pygopodien, Ug: Urogomphi
71
3. Ergebnisse
3.6.3 Live-Imaging von Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigt zusätzlich einen späten Serosadefekt
Die larvalen Kutikulapräparationen zeigen vier Kategorien an Tc'mael-RNAiPhänotypen, die ihren Ursprung zu teilweise sehr unterschiedlichen Zeitpunkten in
der Entwicklung haben könnten. Um den genauen Zeitpunkt des Ursprungs der Phänotypen aufzuklären und um die RNAi-Phänotypen weiter zu analysieren wurde LiveImaging von Tc'mael-RNAi-Embryonen durchgeführt (vgl. Kapitel 2.8). Die Ergebnisse des Imagings zeigen mögliche Ansätze für alle Kategorien des larvalen Tc'maelRNAi-Phänotyps.
Erste Defekte der Tc'mael-RNAi können zwischen Differenzierung des Blastoderms
und Invagination beobachtet werden. Während das embryonale Gewebe kondensiert
kommt es, im Vergleich zum Wildtyp in Tc'mael-RNAi nicht zur korrekten Ausbildung
der posterior Pit (vgl. Abbildung 15, A und D, Stern). Nach Invagination ist der posteriore Teil des Embryos nicht im Ei versenkt, wie im Wildtyp und das posteriore Ende
embryonalen Gewebes wirkt ausgefranst (E, Stern). In späteren Stadien bleibt die
Morphologie des posterioren Endes des Keimstreifs auf diese Art und Weise gestört
(J-L, Stern) und es kommt nicht zur Elongation des Keimstreifs. Weitere Segmente,
also alle Segmente, die aus der Wachstumszone heraus gebildet werden (3. thorakales Segment und alle abdominalen Segmente), werden nicht mehr gebildet (vgl. G-H
und J-K). Diese posterioren Defekte spiegeln die erste Kategorie der larvalen RNAiPhänotypen wieder.
Im Wildtyp kondensiert anterior das embryonale Kopfgewebe und bildet einen verdickten Rand (vgl. Abbildung 15, Abbildung B, Balken). Ein weiterer Defekt in
Tc'mael-RNAi-Embryonen, der im Live-Imaging erkannt werden kann, zeigt eine unvollständige Kondensierung der Zellkerne im Bereich der Kopfanlage des Keimrudiments. Die Verdickung am anterioren Rand des Embryos wird nicht gebildet (vgl. B
und E, Balken). Im Wildtyp bilden sich als nächstes die Kopflappen (Abbildung 15,
Abbildung C). Diese nehmen hier eine konkrete Form an und stehen in Abgrenzung
zu den posterioren Segmenten (vgl. G-H, Balken). Auch in späteren Stadien wirkt der
Kopf in Tc'mael-RNAi-Embryonen weniger definiert als im Wildtyp. Die Kopflappen
sind unförmiger und weniger konkret ausgebildet. An den Rändern der Kopflappen
wirkt es, als wäre das embryonale Gewebe dort weniger kondensiert (F,J,K, Balken).
72
3. Ergebnisse
Mit der Bildung des Keimrudiments beginnt der nächste Defekt der Embryonalentwicklung nach Tc'mael-RNAi. Nach Invagination wird die Verteilung der Zellkerne der
extraembryonalen Serosa unregelmäßig (vgl. Abbildung 15, G und J). Wenig später
reißt die Serosa am dorsal-posterioren Teil des Eis auf (K, Pfeilspitzen) und zieht
sich um den Embryo zurück (L). Normalerweise reist die Serosa erst deutlich später
in der Embryonalentwicklung von Tribolium kurz vor dem Rückenschluss auf (Panfilio
et al., 2013). Tc'mael-RNAi führt also zu einem starken Defekt der Serosa, der zu
einem verfrühten Aufreißen dieser extraembryonalen Membran führt. Die Embryonen
sterben nicht durch das verfrühte Aufreißen der Serosa (Daten nicht gezeigt). Das
spiegelt sich in der nicht erhöhten embryonale Letalität gegenüber dem WT wider
(vgl. Abbildung 15, 16% und Schmitt-Engel et al., 2015, ~20%). Die Larven zeigen
dann die unterschiedlichen Kategorien an RNAi-Phänotypen (vgl. Kapitel 3.6.2).
Das Live-Imaging gibt weitere Hinweise auf den Zeitpunkt der Entstehung der larvalen RNAi-Phänotypen. Anterior zeigen sich mit der Ausbildung der Kopflappen Defekte der Morphologie und der Kondensierung des embryonalen Gewebes (vgl. Abbildung 15, F,J und K). Posterior ist die Invagination gestört und es kommt zu keiner
Elongation des Keimrudiments (vgl. J-L). Das Live-Imaging von Tc'mael-RNAiEmbryonen lässt außerdem einen starken Serosaphänotyp der Keimstreifstadien
erkennen in dem die Verteilung der Serosazellkerne unregelmäßig ist und es möglicherweise auch zu wenige Serosazellen gibt (vgl. G und J). Für die weitere Analyse
der Phänotypen des Knock-downs von Tc'mael wurden also Marker für die frühe
Kopfentwicklung, für die extraembryonale Serosa und für die Segmentaddition verwendet.
73
3. Ergebnisse
Abbildung 15: Live-Imaging der embryonalen Tc'mael-RNAi-Embryonen. A-C
und G-I) nGFP-Embryo. D-F und J-L) Tc'mael-RNAi-Embryo. Alle Embryonen sind
mit anterior links und ventral unten orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A) Nach der Differenzierung des Embryos kondensiert das embryonale Gewebe und am posterioren Pol bildet sich die posterior Pit als Ort der späteren Invagination (Stern). B) Nach der Invagination hat sich das Keimrudiment gebildet und ist von
der Serosa umgeben (Serosafensterstadium). C) Danach beginnt das Keimrudiment
zu elongieren. D) In Tc'mael-RNAi-Embryonen kondensiert das embryonale Gewebe
zwar, doch es kommt nicht zur Ausbildung der posterior Pit (Stern). E) Der Embryo
invaginiert ohne erkennbare Defekte, nach der Invagination ist jedoch das Gewebe
der Kopfanlage deutlich weniger kondensiert als im Wildtyp (Balken). Auch posterior
scheint das Gewebe deformiert (Stern). F) Die Kopflappen des Tc'mael-RNAiKeimstreifen scheint weniger definiert (Balken). G-I) Der Wildtyp-Embryo elongiert
und reicht schließlich von einer Seite des Eis zur anderen. Die extraembryonale Serosa umgibt das gesamte Ei. J) Die posteriore Addition von Segmenten und damit
die Elongation scheinen in Tc'mael-RNAi-Embryonen gestört (Stern). Das embryonale Gewebe des Kopfes ist nach wie vor weniger kondensiert (Balken). Die Zellkerne
der Serosa fangen an, unregelmäßig verteilt zu sein. K) Es findet keine Elongation
des Embryos statt. Die Serosa reißt dorsal auf (Pfeilspitzen) und zieht sich um das Ei
bis zum embryonalen Gewebe zurück (L).
74
3. Ergebnisse
3.6.4 Das Markergen Tc'wg zeigt nach der Invagination gestörte Expression in prägnathalen und gnathalen Segmenten
Das Live-Imaging gab weitere Hinweise auf die Zeitpunkte der Entstehung der
Tc'mael-Phänotypen und half dabei, die Defekte zu beschreiben. Für die weitere
Analyse des Knock-downs von Tc'mael wurde die Expression des Segmentpolaritätsgens Tc'wg analysiert (Nagy und Carrol, 1996; siehe auch Kapitel 3.5.1). Tc'wg
ist außerdem ein Zielgen des terminalen Systems in Tribolium. Die posteriore Expression von Tc'wg in der Wachstumszone ist nach Tc'torso-RNAi nicht mehr vorhanden (Schoppmeier und Schröder, 2005). Tc'wg ist für die Bildung und Aufrechterhaltung der Wachstumszone notwendig (Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al.,
2008b).
In Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigt Tc'wg normale Expression in undifferenzierten und
differenzierten Blastodermen (Daten nicht gezeigt). Defekte der Tc'wg-Expression in
Tc'mael-RNAi-Embryonen treten erst im Keimrudiment auf. Abbildungen B und B'
zeigen einen stärkeren Tc'mael-RNAi-Phänotyp mit frühem Segmentierungsabbruch.
Die Tc'wg-Expression im Bereich der Antennen und der Mandibeln ist stark reduziert
bis hin zu abwesend (Abbildung 16, B, Ant und Md, Stern). Die Expression in den
Maxillen (B, Mx) ist ebenfalls reduziert und es kann keine Expression in Segmenten
posterior der Maxillen erkannt werden. Die okularen Expressionsdomänen sind vom
Knock-down von Tc'mael weder im Blastoderm (Daten nicht gezeigt) noch im Keimrudiment betroffen (B und C). Auffällig ist, dass trotz des Segmentierungsabbruches
Tc'wg posterior exprimiert ist.
Ein schwächerer Tc'mael-RNAi-Phänotyp ist in Abbildung 16, C und C' gezeigt. Der
Keimstreif weist alle thorakalen Segmente auf. Die Expression von Tc'wg in den prägnathalen und gnathalen Segmenten ist dennoch gestört. Die Expressionsdomänen
sind verkleinert (Abbildung C, Ant, Md, Mx, Lb) oder fehlen (Abbildung C, Sterne).
Auch die Expression von Tc'wg in den thorakalen Segmenten ist stark reduziert und
unregelmäßig (vgl. Abbildung C, T1, T2, T3) im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung A).
Fixierte Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigen außerdem die morphologisch defekten
Keimstreifen (vgl. Abbildung 16, C' und Abbildung 15, J-L), die das Live-Imaging gezeigt hat.
75
3. Ergebnisse
Obwohl Tc'wg in Tc'mael-RNAi posterior in allen Stadien normal exprimiert ist,
scheint es keinen Effekt dieses Kandidatengens auf Tc'wg-Expression in der Wachstumszone zu geben. Dennoch zeigen die fixierten Tc'mael-RNAi-Embryonen (vgl.
Abbildung 16), das Live-Imaging (vgl. Abbildung 15) und die larvalen Kutikulapräparationen (vgl. Abbildung 14) Segmentierungsabbrüche. Somit ist anzunehmen dass
Tc'mael keinen Effekt auf die Tc'wg-Expression in der Wachstumszone hat. Die Defekte in der Wachstumszone, die zum Segmentierungsabbruch in Tc'mael-RNAiEmbryonen führen, haben folglich wahrscheinlich andere Ursachen als die Missregulation von Tc'wg. Es wurde gezeigt, dass das Tc'Wnt-Signal essentiell für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Wachstumszone ist (Bolognesi et al., 2008a). Somit
wäre es möglich, dass Tc'mael einen Einfluss auf dieses Signal hat. Folglich wurde
die Expression von Tc'WntD/8 in Tc'mael-RNAi-Embryonen analysiert, wie in Kapitel
3.6.6 dargestellt.
Die Missexpression von Tc'wg in gnathalen und prägnathalen Segmenten der
Tc'mael-RNAi-Embryonen (vgl. Abbildung 16, B und C) könnte einen Teilaspekt der
Kopfdefekte auf larvaler Ebene erklären. Teilweise ist die Expression in einzelnen
Kopfsegmenten abwesend (Abbildung B, Stern) und das könnte folglich zum Fehlen
der entsprechenden Kopfextremitäten in den Larven führen (vgl. Abbildung 14, B-D).
Zur weiteren Analyse der Effekte des Knock-downs von Tc'mael wurden somit als
Nächstes Tc'eve als frühes Markergen für den posterioren Kopf, sowie Tc'zen-1 als
Marker für die anteriore extraembryonale Serosa verwendet.
76
3. Ergebnisse
Abbildung 16: Tc'wg In-situ Hybridisierung in 0-24h mael-RNAi-Embryonen. AC) Hellfeldaufnahmen. A'-C') Hoechstfärbungen der Zellkerne der Keimstreifen aus
A-C zur besseren Darstellung der Morphologie. Alle Embryonen sind von ventral
gezeigt. Alle Embryonen sind mit anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Abbildungen A und A' zeigen den Wildtyp, Abbildungen B-C'
Tc'mael-RNAi-Embryonen.
A) WT-Keimstreif. Tc'wg ist in den okularen Domänen, sowie doppelt-segmental in
den prägnathalen und gnathalen Segmenten und der Wachstumszone exprimiert. A')
Der Keimstreif liegt gerade, von anterior nach posterior auf dem Ei. Die extraembryonale Serosa umfasst das Ei. B) Die Expression von Tc'wg ist in den prägnathalen
Segmenten gestört oder abwesend (Stern). Tc'wg ist normal in der Wachstumszone
exprimiert. C) Der Keimstreif liegt schief auf dem Ei. Die Expression von Tc'wg in den
prägnathalen und gnathalen Segmenten ist gestört (Stern). Tc'wg ist normal in der
Wachstumszone exprimiert. C') Die Hoechst-Färbung lässt die unregelmäßige Lage
des Keimstreifs erkennen. Das Ei ist dabei zu degradieren.
Oc: Okulare Domäne, Ant: Antenne, Md: Mandibel, Mx: Maxille, Lb: Labium, T1-T1:
thorakales Segment 1-3, Wz: Wachstumszone
3.6.5 Die Expressionen der Markergene Tc'eve und Tc'zen-1 zeigen Defekte in der
Wachstumszone und der extraembryonalen Serosa
Für die Analyse der Entstehung der extraembryonalen Serosa und der Musterbildung
der Embryoanlagen wurden als nächstes Tc'eve und Tc'zen-1 verwendet (Patel et
77
3. Ergebnisse
al., 1994; Falciani et al., 1996; vgl. Kapitel 3.6.3). Vor der Differenzierung des Blastoderms ist der Serosamarker Tc'zen-1 zunächst in einer anterioren Kappe exprimiert.
Diese Expression erweitert sich nach der Differenzierung auf die extraembryonale
Serosa (Falciani et al., 1996). Tc'zen-1 bleibt in der Serosa exprimiert und ist am
stärksten um den Rand des Serosafensters exprimiert (Falcani et al., 1996). Tc'eve
ist ein Paarregelgen, das doppelt-segmental exprimiert ist und als Marker für
gnathale, thorakale und abdominale Segmente dient (Patel et al., 1994; Brown et al.,
1997).
In undifferenzierten Blastodermen zeigt sich keine Veränderung der Expression von
Tc'zen-1 in Tc'mael-RNAi-Embryonen (Daten nicht gezeigt). Im differenzierten Blastoderm der Tc'mael-RNAi-Embryonen hingegen zeigt sich eine deutliche Verkleinerung der Tc'zen-1-Expression (Abbildung 17, B). Die Zellkernfärbung durch Hoechst
zeigt analog zur Tc'zen-1-Expression eine Reduktion der Größe der extraembryonalen Serosa (vgl. A'' und B'', Pfeilspitzen).
Die ersten Störungen der Expression von Tc'eve in Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigen
sich bereits im Blastoderm. In Tc'mael-RNAi-Embryonen ist Tc'eve nur sehr schwach
exprimiert (Abbildung 17, B-B', Balken), die ersten beiden primären Tc'eve-Streifen
sind jedoch vorhanden. Nach Invagination zeigt sich kein offensichtlicher Effekt der
Tc'mael-RNAi auf die anteriore Tc'eve-Expression. Der erste und der der zweite, primäre Tc'eve-Streifen haben sich aufgeteilt (Abbildung D). Der dritte, primäre Tc'eveStreifen ist regulär gebildet, spaltet sich aber nicht auf. Dies zeigt, dass die gnathalen
und thorakalen Anlagen vorhanden sind. Der vierte, primäre Tc'eve-Streifen wird
nicht gebildet (Abbildung 17, D und E) und es kommt zu starken, posterioren, morphologischen Defekten (E, Stern).
Da sich der dritte Tc'eve-Streifen nicht mehr aufspaltet zeigt sich bereits ab dem dritten thorakalen Segment der Effekt des Knock-downs von Tc'mael auf die Segmentaddition (vgl. Abbildung 17, D). Die beiden Tc'eve-Streifen, die durch die Aufspaltung
von Tc'eve 3 entstehen (3a und 3b) markieren das 2. und 3. thorakale Segment (Bucher und Klingler, 2004). Da bereits das dritte Segment des Thorax sekundär aus der
Wachstumszone gebildet wird, kann angenommen werden, dass es bereits in diesem Stadium zu Defekten der Wachstumszone in Tc'mael-RNAi-Embryonen kommt.
Der vierte Tc'eve-Streifen wird nicht mehr gebildet, was wiederum zeigt, dass es im
78
3. Ergebnisse
Knock-down von Tc'mael nicht zur Segmentaddition kommt (vgl. Abbildung 17, D und
E).
Das Keimrudiment bildet einen Überhang über den Dotter (E, Stern). Die posteriorsten Segmente liegen nicht mehr auf dem Ei. Auch hier fehlt der vierte, primäre Tc'eve-Streifen (E, Stern). Im Keimrudiment kann ebenfalls die unvollständige Kondensierung des Kopfgewebes beobachtet werden. Die Kopflappen sind deutlich größer
und wirken fusioniert anstatt zwei laterale Rundungen auszubilden (Abbildung D).
Das Keimrudiment ist auf dem Ei nach anterior verschoben. Die Expression von
Tc'zen-1 fehlt am anterioren Serosafenster, das auch nicht vollständig gebildet wird
(Abbildung D, Pfeilspitze).
Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigen somit die Reduktion der Expression von Tc'zen-1
sowie der Serosa im differenzierten Blastodermstadium (vgl. Abbildung 17, B-B'').
Defekte dieser extraembryonalen Membran können auch in Keimrudimentstadien
und Keimstreifstadien beobachtet werden (vgl. Abbildung D). Somit führt der Knockdown von Tc'mael auch zu Störungen der Serosa ab dem differenzierten Blastoderm.
Die Expression von Tc'eve spiegelt die larvalen RNAi-Phänotypen wieder. Der dritte,
primäre Tc'eve-Streifen wird zwar noch gebildet, spaltet sich aber nicht mehr auf.
Weitere Tc'eve-Streifen werden nicht gebildet. Die Markergenexpression zeigt, dass
die Segmentierung bereits in diesem Stadium abbricht und alle Segmente betrifft, die
aus der Wachstumszone heraus sekundär gebildet werden. Larvale Kutikulapräparate zeigen die Deletion aller Segmente, die aus der Wachstumszone heraus gebildet
werden (vgl. Abbildung 17, D) und unterstützen somit diese Ergebnisse. Folglich
kann angenommen werden, dass Tc'mael eine essentielle Funktion bei der sekundären Addition von Segmenten aus der Wachstumszone hat. Es zeigt sich keine offensichtliche Funktion von Tc'mael bei der Anlage der Segmente im Blastoderm
(prägnathale und gnathale Segmente sowie die ersten beiden thorakalen Segmente).
Folglich scheinen die Segmentierungsabbrüche auf Defekte bei der Etablierung oder
Aufrechterhaltung der Wachstumszone zurückzuführen zu sein. Das Wnt-Signal essentiell für die Bildung und Funktion der Wachstumszone ist (Bolognesi et al.,
2008a), wurde als nächstes die Expression von Tc'WntD/8 in Tc'mael-RNAiEmbryonen analysiert (vgl. Kapitel 3.6.6).
79
3. Ergebnisse
Abbildung 17: Expression von Tc' zen-1 und Tc'eve in Tc'mael-RNAiEmbryonen. Hellfeldaufnahmen unterschiedlicher Entwicklungsstadien. Embryonen
von A-B'' und E-E' sind von lateral gezeigt. Abbildungen C-D' sind von ventral gezeigt. Alle Embryonen sind mit anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Die Embryonen in A-E und A'-B' sind im Hellfeldaufgenommen.
A' und B' sind Aufnahmen des optischen Schnitts der Embryonen aus A und B. A''B'' und C'-E' sind Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A-E. Abbildungsreihen A und C zeigen WT-Embryonen, Abbildungsreihen
B,D,E zeigen Tc'mael-RNAi-Embryonen.
A-A'') Tc'zen-1 ist im differenzierten Blastoderm in der extraembryonalen Serosa
exprimiert (vgl. Pfeilspitzen). Zu diesem Stadium zeigt sich die Expression von Tc'eve in einem anterioren Streifen und einer breiten, posterioren Expressionsdomäne
(Balken, 1, 2). B) In Tc'mael-RNAi ist die Tc'zen-1-Expressiondomäne im differenzierten Blastoderm nach anterior verkleinert. Die Expression von Tc'eve ist stark reduziert aber noch vorhanden (Balken). B'') In der Färbung der Zellkerne zeigt sich
eine Verkleinerung der extraembryonalen Serosa (Pfeilspitzen). C und C') Während
der Keimstreif elongiert, verblassen die ersten Tc'eve-Streifen und neue werden aus
der posterioren Domäne abgespalten. D und D') Tc'mael-RNAi-Phänotypen zeigen
Tc'eve-Expression doch ist diese kaum der zeitlichen Reihenfolge der Streifen zuzuordnen und unregelmäßig. Das Kopfgewebe ist nach wie vor weniger kondensiert
(Pfeilspitze). E und E') Bei einigen Embryonen bildet sich nach der Invagination ein
Überhang des Keimrudiments über den Dotter (Stern). Auch hier ist die Expression
von Tc'eve unregelmäßig.
80
3. Ergebnisse
3.6.6 Der Knock-down von Tc'maelstrom beeinflusst das Wnt-Signal in der Wachstumszone
Die bisherigen Ergebnisse zeigen Segmentierungsabbrüche in Tc'mael-RNAiEmbryonen (vgl. Abbildung 15 C-D,F; Abbildung 16, B und C; Abbildung 17, D und
E), die vermutlich dennoch mit Defekten in der Wachstumszone in Zusammenhang
stehen (Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b). Im Wildtyp, ist das wntSignal essentiell für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Wachstumszone. Vor
allem Tc'wntD/8 ist für die Anlage der Ausbildung der Wachstumszone und die sekundäre Segmentaddition notwendig (Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al.,
2008b). Es können keine Störungen der Tc'wg-Expression in Tc'mael-RNAiEmbryonen beobachtet werden (vgl. Abbildung 16; Abbildungen B und C). Ein weiterer Marker für die Wachstumszone in Tribolium ist somit Tc'wntD/8.
Tc'wntD/8 ist im Wildtyp im undifferenzierten Blastoderm in einer kleinen Domäne am
posterioren Pol des Eis exprimiert (Bolognesi et al., 2008a). In Keimstreifen ist
Tc'WntD/8 dann in zwei punktförmigen Expressionsdomänen am posterioren Teil der
Wachstumszone exprimiert (vgl. Bolognesi et al., 2008a).
In Tc'mael-RNAi bleibt Tc'wntD/8 im undifferenzierten Blastoderm am posterioren Pol
exprimiert. Die Expression ist jedoch nach anterior expandiert und die Tc'WntD/8Domäne deutlich verbreitert (Abbildung 18, B und B'). In anderen Stadien konnte
keine Abweichung der Tc'wntD/8-Expression in Tc'mael-RNAi gegenüber dem Wildtyp erkannt werden (Daten nicht gezeigt).
Somit kann dennoch gezeigt werden, dass der Knock-down von Tc'mael einen Effekt
auf das Wnt-Signal im Bereich der Wachstumszone hat. Der Zusammenhang der
Tc'wntD/8-Überexpression und den Segmentierungsabbrüchen ist unklar, aber es
wäre denkbar, dass eine Missexpression von Tc'wntD/8 einen Einfluss auf die Etablierung der Wachstumszone haben könnte. Folglich könnte dann der Knock-down
von Tc'maelstrom über Tc'wntD/8 zu Defekten in der Wachstumszone führen die
wiederum in den gezeigten Segmentierungsabbrüchen resultieren.
Zusammenfasssend konnte gezeigt werden, dass Tc'mael eine wichtige Rolle bei der
Segmentaddition
in
der
Entwicklung
von
Tribolium spielt.
Hierbei
scheint
81
3. Ergebnisse
Tc'maelstrom über die Regulation von Tc'WntD/8 eine Funktion in der Etablierung
und Aufrechterhaltung der Wachstumszone zu haben.
Abbildung 18: Expression von Tc'WntD/8 in Tc'mael-RNAi-Embryonen. Alle Embryonen sind mit anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A und A') Hellfeldaufnahmen des Wildtyps (bei A' im optischen Schnitt).
Tc'WntD/8 ist im undifferenzierten Blastoderm (vgl. Hoechstfärbung der Zellkerne in
A'') am posterioren Pol des Eis in einer schmalen Domäne exprimiert. B und B') Die
Expressionsdomäne von Tc'WntD/8 in Tc'mael-RNAi-Embryonen ist im undifferenzierten Blastoderm (vgl. Hoechstfärbung der Zellkerne in B'') deutlich nach anterior vergrößert.
3.6.7 Tc'maelstrom ist als Zielgen des terminalen Systems an der frühen, terminalen
Musterbildung und Morphogenese beteiligt
Die Ergebnisse des NGS (vgl. Tabelle 4 im Anhang), die Expression sowie die larvalen und embryonalen Phänotypen des Knock-downs weisen darauf hin, dass es sich
bei Tc'maelstrom um ein Zielgen des terminalen Systems handeln könnte. Zur weiteren Bestätigung dieser These wurde die Expression von Tc'mael in Tc'tsl- und Tc'cicRNAi-Embryonen mittels in-situ Hybridisierung untersucht. Wie bereits beschrieben
ist die relative Tc'mael-Expression in Tc'tsl-RNAi deutlich reduziert (0,02 im Vergleich
zum Wildtyp) wohingegen Tc'mael in Tc'cic-RNAi deutlich stärker (1,27) exprimiert ist
als im Wildtyp (vgl. Tabelle 4 im Anhang).
82
3. Ergebnisse
Wie erwartet, ist Tc'mael-Expression in Tc'tsl-RNAi-Embryonen nicht mehr
detektierbar (Abbildung 19, B). Die Expressionsdomäne am posterioren Pol des Eis
von Tc'mael (vgl. Wildtyp: Abbildung 19, Abbildungen C und C') ist nicht mehr vorhanden.
Im Gegensatz dazu ist die Tc'mael-Expressionsdomäne in Tc'cic-RNAi vergrößert
(Abbildung 19, C) und umfasst das gesamte, embryonale Gewebe. Im Vergleich zur
Expression im Wildtyp (vgl. Abbildung 19, Abbildungen C und C') ist das Vorkommen
der Tc'mael-mRNA also deutlich expandiert.
Die Expression von Tc'mael in Tc'tsl-RNAi-Embryonen und Tc'cic-RNAi-Embryonen
spiegelt folglich die Ergebnisse der gemessenen relativen Expression des NGS wieder. Da die Expression in Tc'tsl-RNAi (Repression der Zielgene des terminalen Systems) deutlich reduziert ist (vgl. Tabelle 4 im Anhang und Abbildung 19, Abbildung B)
und in Tc'cic-RNAi (Derepression der Zielgene des terminalen Systems) deutlich erhöht ist (vgl. Tabelle 4 im Anhang und Abbildung 19, Abbildung C) kann angenommen werden, dass es sich bei Tc'maelstrom um ein Zielgen des Tc'torso-Signalwegs
handelt.
83
3. Ergebnisse
Abbildung 19: Expression Tc'mael in Tc'tsl- und Tc'cic-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen unterschiedlicher Entwicklungsstadien. Embryonen von A-C' sind von lateral
gezeigt und anterior ist in den Abbildungen links. Alle Embryonen sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Die Embryonen in A-E und A'-B' sind im Hellfeld aufgenommen.
A'-C' sind Projektionen der Hoechstfärbung der Zellkerne der Embryonen aus A-C.
A) Expression von Tc'mael im differenzierten Blastoderm im Wildtyp. Tc'mael ist in diesem Stadium um die posterior Pit am posterioren Pol des Embryos exprimiert (Stern).
A') Im differenzierten Blastoderm ist die Serosa-Embryo-Grenze (SEG) schräg (Pfeilspitzen). B) In Tc'tsl-RNAi ist die Expression von Tc'mael vollständig abwesend. B') Die
extraembryonale Serosa ist in Tc'tsl-RNAi-Embryonen stark verkleinert (Pfeilspitzen). C)
Die Expression von Tc'mael umfasst das gesamte, embryonale Gewebe in Tc'cic-RNAiEmbryonen (Pfeilspitzen). C') In Tc'cic-RNAi ist die Serosa nach posterior stark verkleinert (Pfeilspitzen).
84
3. Ergebnisse
3.7 Der Tc'Torso-Signalweg moduliert die Tc'Dpp-Aktivität mittels
Tc'CHOp24
Das zweite Kandidatengen, das im Zuge dieser Dissertation im Detail analysiert wurde, ist das Tribolium-Homolog zu CHOp24. Die relative Expression von Tc'CHOp24RNAi ist in Tc'tsl-RNAi deutlich reduziert (0,13 im Vergleich zum Wildtyp) wohingegen die relative Expression von Tc'CHOp24 in Tc'cic-RNAi stark erhöht ist (3,26 im
Vergleich zum Wildtyp; vgl. Tabelle 4 im Anhang). Diese Repression im Knock-down
des torso-Signalwegs und die Derepression im Knock-down des Repressors (Tc'cic)
deuten darauf hin, dass es sich bei Tc'CHOp24 um ein Zielgen des terminalen Systems handelt. CHOp24 gehört zur Familie der p24-Proteine (Buechling et al., 2011;
Saleem et al., 2011). Bisher wurde in Drosophila nur eine Funktion dieses p24-Gens
in der Sekretion der Wnt-Proteine beschrieben (Buechling et al., 2011).
Die Familie der p24-Proteine wird generell mit der Sekretion und Transport von Proteinen zwischen den unterschiedlichen Kompartimenten des Golgi-Apparats und dem
Transport zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und dem Golgi-Apparat
assoziiert (Wieland und Harter, 1999). In Drosophila sind die p24-Gene baiser (bai)
und eclair (eca) maternal exprimiert und übernehmen bereits eine Funktion bei der
Aktivierung des TGF-β-Rezeptors Thick Veines (Tkv) durch den das Dpp-Signal
vermittelt wird (Bartoszewski et al., 2004). Diese maternale Funktion ist die früheste,
beschriebene Funktion von p24-Genen in der Entwicklung von Drosophila. Außerdem wurde gezeigt, dass die p24-Proteine Opossum (Buechling et al., 2011), Emp24
und Eclair (Port et al., 2011) bei der Sekretion von Wnt-Proteinen beteiligt sind und
dass ohne p24-Proteine, Dm'Wnt-Proteine nicht sekretiert werden können (Buechling
et al., 2011).
3.7.1 Expression von Tc'CHOp24
Das p24-Gen CHOp24 ist in Tribolium maternal exprimiert. In unbefruchteten Eiern
ist die mRNA von Tc'CHOp24 anterior lokalisiert (Abbildung 20, A-A''). Außerdem ist
Tc'CHOp24 um den Polkörper vermutlich unspezifisch exprimiert (vgl. Peel und
85
3. Ergebnisse
Avarof, 2010 und Kapitel 3.6.1 Tc'mael Expression). Die anteriore Expression bleibt
in der weiteren Embryonalentwicklung bestehen und ist mit der Differenzierung des
Blastoderms in der extraembryonalen Serosa exprimiert (Abbildungen B-B''). Dort
zeigen sich eine anteriore und eine dorsale Expressionsdomäne von Tc'CHOp24
(Abbildungen B-B'., Pfeilspitzen). Zusätzlich zeigt sich ab dem differenzierten Blastoderm-Stadium eine posteriore Expressionsdomäne von Tc'CHOp24 im Bereich der
posterior Pit (B-B', Stern).
Im Keimrudiment zeigt sich eine Expressionsdomäne von Tc'CHOp24 in der posterioren Wachstumszone (Abbildung 20, C, Stern). In Keimstreifen ist Tc'CHOp24Expression in einer Domäne in der Wachstumszone zu erkennen (Abbildung D, linker Stern). In diesem Stadium kann dann auch wieder eine anteriore Expression,
vermutlich im Bereich des Stomodeums beobachtet werden (Abbildung D, rechter
Stern).
Im gestreckten Keimstreif ist Tc'CHOp24 in den okularen Domänen (Abbildung 20, E,
Stern) und zusätzlich in den Beinanlagen (Balken) exprimiert. Auch die posteriore
Expressionsdomäne ist noch vorhanden (Abbildung E, rechter Stern).
86
3. Ergebnisse
Abbildung 20: In-situ Hybridisierung gegen Tc'CHOp24 im WT. A-E Hellfeldaufnahmen unterschiedlicher Entwicklungsstadien des Wildtyps. A' und B' Hellfeldaufnahmen im optischen Schnitt. A'' und B'' Projektionen von Hoechstfärbungen der
Zellkerne der Embryonen aus A und B. Anterior ist in allen Abbildungen links und alle
Embryonen wurden mit 100x Vergrößerung aufgenommen.
A-A'') Tc'CHOp24 ist in unbefruchteten Eiern in einer anterioren Kappe, sowie ubiquitär im Polkörper (Stern) exprimiert. B-B'') Im differenzierten Blastoderm ist
Tc'CHOp24 anterior in der extraembryonalen Serosa in einer anterioren und einer
dorsalen Domäne exprimiert (vgl. Pfeilspitzen). Des Weiteren ist Tc'CHOp24 in diesem Entwicklungsstadium in der posterior Pit exprimiert (Stern). C) Nach Invagination
bleibt die posteriore Expressionsdomäne in Keimrudimenten bestehen. D) In elongierenden Keimstreifen ist Tc'CHOp24 in einer posterioren Domäne exprimiert (rechter
Stern) und zusätzlich wieder in einer Domäne in der Kopfanlage (linker Stern). E) Im
gestreckten Keimstreif ist Tc'CHOp24 im Kopf in den okularen Domänen exprimiert.
Weitere Expression befindet sich in den Beinanlagen (schwarzer Balken) und posterior im letzten abdominalen Segment.
87
3. Ergebnisse
3.7.2 Larvale Phänotypen zeigen anteriore und posteriore Defekte
Die Analyse des Tc'CHOp24-RNAi-Phänotyps zeigt auf larvaler Ebene drei Kategorien von Phänotypen. Die Phänotypen der einzelnen Kategorien treten unabhängig
von den Phänotypen der anderen Kategorien auf, kommen aber auch gemeinsam
vor. Am seltensten treten ausschließlich anteriore Defekte der Larven, vor allem die
Reduktion der Kopfkapsel auf (vgl. Abbildung 21, "Kategorie 1" und Abbildung 22, B
und B'). Aber auch die prägnathalen Kopfextremitäten (Antennen und Labrum) sind
in dieser Kategorie oft deformiert (Abbildung 22, B'). Diese Kopfextremitäten sind in
ihrer Länge deutlich reduziert (vgl. Abbildung B'). Die gnathalen Segmente scheinen
vom Knock-down von Tc'CHOp24 nicht betroffen zu sein (vgl. Abbildung B). Alle prägnathalen und gnathalen Segmente sind in den RNAi-Larven vorhanden. Der anteriore RNAi-Phänotyp zeigte sich alleine nur bei ca. 3% der Präparate (Abbildung 21).
Diese Kategorie der larvalen RNAi-Effekte trat jedoch auch in Kombination mit posterioren Defekten auf und somit zeigten insgesamt 13% der Präparate anteriore Defekte.
Insgesamt 26% (Abbildung 21) aller larvalen Kutikulapräparate für Tc'CHOp24-RNAi
zeigten posteriore Defekte. Diese Kategorie umfasst die Deletion und Deformation
von abdominalen Segmenten (vgl. Abbildung 22, C-E). Die stärksten, posterioren
Phänotypen lassen die Deletion aller abdominaler Segmente erkennen (Abbildung
E), wobei das dritte thorakale Segmente dabei nicht betroffen ist.
Wie bereits erwähnt treten anteriore und posteriore Phänotypen auch gemeinsam auf
(Abbildung 21, "Kategorie 3"; Abbildung 22; D-E). Beim stärksten, larvalen
Tc'CHOp24-RNAi-Phänotyp sind alle abdominalen Segmente deletiert und gleichzeitig zeigt sich eine deutliche Reduktion der Kopfkapsel sowie die Verkürzung aller
Kopfextremitäten wie weiter oben beschrieben (Abbildung E).
Die larvalen Kutikulapräparationen zeigen eine stark erhöhte Zahl an sogenannten
leeren Eihüllen (vgl. Schmitt-Engel et al., 2015). Wenn ein Embryo keine Kutikula
sekretiert und vor diesem Prozess in der Entwicklung stirbt, bleibt aus der Ablage
durch den Prozess der Kutikulapräparation nur eine leere Eihülle übrig (siehe Kapitel
2.4). Dieses Ergebnis deutet auf einen embryonalen Phänotypen hin, der zur Letalität
88
3. Ergebnisse
der Tiere führt bevor Kutikula sekretiert werden kann (vgl. Schmitt-Engel et al.,
2015).
Zusammengefasst zeigt Tc'CHOp24-RNAi auf larvaler Ebene anteriore und posteriore Phänotypen, die Teilaspekte der beschriebenen RNAi-Phänotypen des terminalen
Systems wiederspiegeln (Schoppemeier und Schröder, 2005; Schoppmeier, nicht
publiziert; Koniszewski, Diplomarbeit). Die hohe Zahl an leeren Eihüllen ist ein Indikator für letale embryonale RNAi-Phänotypen der Tc'CHOp24-RNAi.
105; 3%
372; 10%
542; 15%
WT
Leere Eihülle
560; 16%
Kategorie 1: Abdominale Segmente
deletiert/Abdominale
Deformationen
Kategorie 2: Kopfkapsel
reduziert/deletiert Deformationen
Kategorie 3: Kopf deletiert/reduziert
und abdominale Deletionen
2046; 56%
Abbildung 21: Statistische Verteilung der Kutikulaphänotypen von Tc'CHOp24RNAi. Gesamtzahl aller ausgezählten Kutikulas n=3625.
89
3. Ergebnisse
90
3. Ergebnisse
Abbildung 22: CHOp24-RNAi-Kutikulaphänotypen. Fluoreszenzaufnahmen bei 100x
Vergrößerung (Köpfe in A', B' und D' bei 200x Vergrößerung). Alle Larven sind mit anterior nach links und dorsal nach oben orientiert. Abbildungen A-A' zeigen eine Wildtyplarve, Abbildungen B-E Larven der Tc'CHOp24-RNAi. A) Wildtyplarve mit 8 abdominalen
Segmenten (A1-A8), terminalen Strukturen Urogomphi (Ug) und Pygopodien (Py), sowie
den Kopfanhängen Labrum (Lr), Antennen (Ant), Mandibeln (Md), Maxillen (Mx) und Labium (Lb). A') Vergrößerung der Kopfkapsel und der Kopfanhänge. B) CHOp24-RNAi
zeigt die Verkleinerung der larvalen Kopfkapsel. Die Kopfextremitäten sind noch alle vorhanden. Die Antennen und das Labrum sind stark deformiert und verkürzt (B'). C)
CHOp24-RNAi zeigt außerdem unabhängig von anterioren RNAi-Phänotypen, Deletionen
abdominaler Segmente und Strukturen (Stern). D und D') Anteriore und posteriore Phänotypen wie einzeln in A und B gezeigt treten auch in Kombination auf. E) Stärkste larvale
RNAi-Phänotypen zeigen eine starke Reduktion der Kopfkapsel und eine Verkürzung der
Kopfextremitäten (wobei alle prägnathalen und gnathalen Segmente vorhanden sind) und
die Deletion aller abdominaler Segmente (Stern).
Ant: Antennen, Lb: Labium, Lr: Labrum, Md: Mandibeln, Mx: Maxillen, T1-3: Thorakale
Segmente 1-3, A1-8: Abdominale Segmente 1-8, Py: Pygopodien, Ug: Urogomphi
3.7.3 Markergenfärbungen in Tc'CHOp24-RNAi zeigen Defekte ab dem differenzierten Blastoderm
Die larvalen Phänotypen des Knock-downs von Tc'CHOp24 zeigen starke, posteriore
Segmentierungsabbrüche, anterior reduzierte Kopfkapseln und deformierte und verkürzte Kopfextremitäten (vgl. Kapitel 3.9.2). Die deutlich erhöhte Menge an leeren
Eihüllen weißt auf einen embryonal letalen Defekt in Tc'CHOp24-RNAi hin (SchmittEngel et al., 2015). Zur Untersuchung der Funktion von Tc'CHOp24 in der Embryonalentwicklung wurde zunächst die Expression des Markergens Tc'wg (Nagy und
Carrol, 1996; vgl. Kapitel 3.7.4) in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen analysiert.
Im undifferenzierten Blastoderm der Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen zeigt die Tc'wgExpression keine Störungen. Die posteriore Expression von Tc'wg ist in diesem Entwicklungsstadium normal ausgeprägt (Daten nicht gezeigt). Im differenzierten Blastoderm sind die okularen Expressionsdomänen von Tc'wg nach anterior verschoben.
Die Expression ist rotationssymmetrisch kreisförmig um den Embryo (Abbildung 23,
Balken in B, B''' und B''''). Die Hoechst-Färbung der Zellkerne in Tc'CHOp24-RNAiEmbryonen zeigt die Verkleinerung der extraembryonalen Serosa nach anterior. Die
Serosa-Embryo-Grenze (SEG), die im Wildtyp schräg verläuft (vgl. Abbildung 23,
A''), wird rotationssymmetrisch (Abbildung 23, B'', Pfeilspitzen). Des Weiteren fällt in
diesem Stadium auf, dass die posterior Pit nicht ausgebildet wird und der Embryo am
91
3. Ergebnisse
posterioren Pol lediglich etwas abflacht (Abbildungen B-B'''', Stern). Die posteriore
Tc'wg-Expression ist von dem morphologischen Defekt jedoch nicht betroffen (Abbildungen B-B'''', Stern).
Die Morphologie der Kopfsegmente der Keimstreifen der Tc'CHOp24-RNAiEmbryonen ist gestört (Abbildung 23, D-D'). Das gesamte embryonale Gewebe wirkt
zu wenig kondensiert. Posterior sind starke Deformationen und Segmentierungsabbrüche zu erkennen (D-D', Stern). Die Tc'wg-Expression im gesamten Keimstreif ist
stark gestört. Die okulare Expressionsdomäne ist zwar noch zu erkennen, aber ungleichmäßig (D, Pfeilspitzen). Die Tc'wg-Expression in den gnathalen Segmenten ist
deutlich schwächer und ebenfalls unregelmäßig (Abbildung D). Durch den Segmentierungsabbruch und den starken, morphologischen Phänotyp ist posterior der prägnathalen Segmente keine Tc'wg-Expression in Tc'CHOp24-RNAi zu erkennen.
Die stärksten Tc'CHOp24-RNAi-Phänotypen zeigen eine undefinierte Ansammlung
embryonalen Gewebes (Abbildung 23, E-E'). Diese Gewebeanhäufung zeigt vermutlich einen RNAi-Embryo nach der Invagination. Eine spezifische Expression von
Tc'wg ist nicht zu erkennen, ebenso wenig wie konkrete, morphologische Strukturen
oder Achsen (Abbildung E). Die breite, anteriore Lippe in der sich Expression zeigt,
könnte die Fusion der okularen Expressionsdomänen von Tc'wg im Serosafensterstadium sein.
Die Ablagen der Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen beinhalten nur eine sehr geringe Anzahl von Entwicklungsstadien, die älter als das differenzierte Blastoderm ist. Die wenigen, älteren Stadien zeigen zu über 90% wildtypische Morphologie und Markergenexpression. Somit ist anzunehmen, dass der Knock-down von Tc'CHOp24 zur Letalität der Embryonen nach dem differenzierten Blastodermstadium führt. Dieses Ergebnis korreliert mit der stark erhöhten embryonalen Letalität, die in den larvalen Kutikulapräparationen durch die große Mengen an leeren Eihüllen suggeriert wird (vgl.
Kapitel 3.7.2).
Somit zeigen sich drei Defekte in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Als erstes tritt ein
Defekt bei der Differenzierung des Blastoderms auf. Die extraembryonale Serosa ist
deutlich nach anterior verkleinert und die SEG rotationssymmetrisch (vgl. Abbildung
23, Abbildungen B-B''''). Dieser RNAi-Phänotyp ähnelt stark dem Knock-down von
Tc'dpp (vgl. van der Zee et al., 2006) oder Tc'otd-1 (Kotkap et al., 2010). Somit könn92
3. Ergebnisse
te Tc'CHOp24 eine Rolle in der dorso-ventralen Achsenbildung haben. Als Nächstes
ist in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen die Ausbildung der posterior Pit als Ort der späteren Invagination gestört (Abbildungen B-B''''). Somit zeigt sich bereits im differenzierten Blastoderm, neben dem anterioren Serosaphänotyp, auch ein posteriorer Defekt. Die wenigen RNAi-Embryonen, die älter als das differenzierte Blastoderm sind
und die stark-missgebildeten Keimstreifen, weisen auf einen letalen Defekt des
Knock-downs von Tc'CHOp24 während der Invagination hin.
93
3. Ergebnisse
94
3. Ergebnisse
Abbildung 23: Expression von Tc'wg in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen unterschiedlicher Entwicklungsstadien. Alle Embryonen sind anterior nach links
orientiert. Embryonen in A und B sind von lateral gezeigt, Embryonen von C-E sind von
ventral gezeigt. Alle Embryonen sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A' und B'
sind Aufnahmen des optischen Schnitts der Embryonen aus A und B. A', B'', D'', C'-E'
sind Projektionen der Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A-E. Die Abbildungsreihen A und C zeigen einen wildtypischen Embryo, die
Abbildungsreihen B, D und E einen Embryo der Tc'CHOp24-RNAi.
A-A') Im differenzierten Blastoderm (vgl. A'') ist Tc'wg im Wildtyp in einer streifenförmigen, anterioren Domäne im Bereich der Okularen exprimiert (Balken), sowie posterior in
der posterior Pit und der späteren Invaginationsstelle (Stern). A'') Die Grenze zwischen
der extraembryonalen Serosa und des embryonalen Gewebes verläuft schräg (Pfeilspitzen). B-B') In Tc'CHOp24-RNAi ist die anteriore Expressionsdomäne von Tc'wg stark
expandiert und rotationssymmetrisch (vgl. dorsale Ansicht in B''' und ventrale Ansicht
desselben Embryos in B''''). Es kommt nicht zur korrekten Ausbildung einer posterior Pit
doch die Tc'wg-Expression ist davon nicht betroffen (Stern). C) Im Wildtyp ist Tc'wg
segmental exprimiert, so wie in den okularen Domänen und der Wachstumszone. D)
Schwächere Phänotypen zeigen nach der Invagination Segmentierungsabbrüche (Stern)
und eine stark gestörte Expression von Tc'wg (Pfeilspitzen). D') In der Hoechstfärbung
der Zellkerne zeigt sich ebenfalls, dass der Kopf stark vergrößert ist. E) Stärkste
Tc'CHOp24-RNAi-Phänotypen zeigen nach der Invagination eine runde Scheibe von
embryonalem Gewebe in der weder Strukturen noch Orientierung zu erkennen sind.
Auch die Expression von Tc'wg ist hier sehr gestört.
3.7.4 Live-Imaging zeigt starke Defekte in Tc'CHOp24-RNAi bei der Invagination
Die Markergenexperimente mit Tc'wg deuten auf einen letalen Effekt von
Tc'CHOp24-RNAi auf die Embryonen nach dem differenzierten Blastodermstadium
hin. Um den genauen Zeitpunkt der Entstehung der RNAi-Phänotypen zu untersuchen wurde der EVA-nGFP-Stamm (Sarrazin et al., 2012) von Tribolium verwendet
um Live-Imaging von Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen durchzuführen (vgl. Kapitel 2.8).
Das Live-Imaging zeigt schwere Defekte in der Embryonalentwicklung von
Tc'CHOp24-RNAi. Die ersten RNAi-Phänotypen können hier ebenfalls ab dem differenzierten Blastoderm beobachtet werden.
Die Verkleinerung der extraembryonalen Serosa im differenzierten Blastoderm wie in
3.9.3 beschrieben (Abbildung 23, D'') zeigt sich auch im Live-Imaging von
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen (vgl. Abbildung 24, Abbildung D). Die Serosa-EmbryoGrenze (SEG) ist rotationssymmetrisch (Abbildung D, Pfeilspitzen). Mit der Kondensierung des embryonalen Gewebes nach ventral-posterior streckt sich die Serosa im
Wildtyp um das ganze Ei zu (Abbildung 24, Abbildungen B-C). Im Knock-down von
95
3. Ergebnisse
Tc'CHOp24 streckt sich die Serosa ebenfalls und umgibt das gesamte Ei. Es sind
jedoch deutlich weniger Serosazellkerne vorhanden als im Wildtyp (vgl. Abbildungen
E-F). Dadurch liegen die Zellkerne der extraembryonalen Membran auch weniger
dicht als im Wildtyp.
Zwar kondensiert das embryonale Gewebe noch (Abbildung 24, Abbildung E), zunächst bleibt die Kondensation aber unvollständig (Abbildung E, Pfeilspitzen) und es
wird keine posterior Pit gebildet (Abbildung E, Stern). Eine Invaginationsbewegung
um die posterior Pit bleibt vorerst aus (Abbildung F, Stern) und das embryonale Gewebe kondensiert posterior-ventral (Abbildung F). Zur besseren Darstellung des
CHOp-24-RNAi-Phänotyps wird die weitere Entwicklung der RNAi-Embryonen von
ventral gezeigt (Abbildung 24, Abbildungen J-L und P-R).
Während der Kondensierung des embryonalen Gewebes vor der Invagination bildet
sich posterior im Wildtyp die "posterior Pit", die dorso-ventral asymmetrisch ist (vgl.
Abbildung 24, Abbildung B, Stern). In Tc'CHOp24-RNAi kommt es zu der Ausbildung
einer medial-lateral Pit (Abbildung 24, J). Im Wildtyp bildet sich diese Einstülpung
nicht (Abbildung 24, G, Stern). Als nächstes kondensiert im Wildtyp das embryonale
Gewebe weiter und erste, anteriore Strukturen werden gebildet, während der Embryo
posterior invaginiert (Abbildung H, Pfeilspitzen). In der Tc'CHOp24-RNAi ist die anteriore Kondensation unvollständig und keine konkreten Strukturen werden erkennbar
(Abbildung K, Pfeilspitzen). Im weiteren Verlauf der Invagination verbleibt im Wildtyp
der posteriore Teil des Embryos im Ei versenkt. Anterior werden die Kopflappen ausgebildet (I, Pfeilspitzen). Der Tc'CHOp24-RNAi-Embryo im Gegensatz kondensiert
zwar auch anterior, bildet aber keine Kopflappen (L, Pfeilspitzen). Die Morphologie
des embryonalen Gewebes ist generell gestört und wirkt zu stark kondensiert (L).
Als nächstes invaginiert der WT-Embryo und bildet das Keimrudiment. Die Serosa
bildet das Serosafenster um den Embryo. Der posteriore Teil des Embryos liegt im
Wildtyp im Dotter versenkt. (Abbildung 24, M). In dem Tc'CHOp24-RNAi-Embryo ist
das embryonale Gewebe maximal kondensiert und bildet eine mehr oder weniger
runde Scheibe. Der posteriore Teil ist nicht im Dotter versenkt (Abbildung P). Im
Wildtyp werden weitere Segmente aus der Wachstumszone heraus gebildet und der
Embryo elongiert (Abbildung N, Stern). Der Tc'CHOp24-RNAi-Embryo besteht im
Vergleich dazu aus zwei Teilen (Abbildung Q). Es zeigt sich eine weitere Aggregation
embryonalen Gewebes, posterior im Ei gelegen, welche nicht mit der anterioren
96
3. Ergebnisse
Scheibe verbunden ist (Abbildung Q, Stern). Im Wildtyp werden in der weiteren Embryonalentwicklung posterior aus der Wachstumszone weitere Segmente gebildet und
der anteriore Teil des Embryos wird nach anterior im Ei positioniert (Abbildung O). In
Tc'CHOp24-RNAi elongiert der Embryo nicht. Beide Anhäufungen des embryonalen
Gewebes wandern nach anterior, aber in der weiteren Entwicklung stirbt der Embryo
und das Ei degradiert (nicht gezeigt).
Die ersten und entscheidenden Defekte des Knock-downs von Tc'CHOp24 treten
bereits im Blastoderm auf (vgl. Abbildung 24, D-F und J-K und Kapitel 3.7.3).
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen sterben wahrscheinlich bevor sie ein Keimrudiment
bilden können und die Eier degradieren (Daten nicht gezeigt). Alle späteren Stadien
sind vermutlich nur dem stärksten RNAi-Effekt entgangen (vgl. Kapitel 3.7.3).
97
3. Ergebnisse
98
3. Ergebnisse
Abbildung 24: Live-Imaging der embryonalen Entwicklung von Tc'CHOp24-RNAiEmbryonen. A-C, G-I und M-O) EVA-nGFP-Embryo. D-F, J-L und P-R) Tc'CHOp24RNAi-Embryo. Alle Embryonen sind mit anterior links orientiert und von ventral gezeigt.
Alle Embryonen sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A) Das Blastoderm differenziert. Hierbei bildet sich im Wildtyp anterior die extraembryonale Serosa. Diese ist an den
größeren Zellkernen und dem größeren Abstand der Zellkerne zueinander zu erkennen.
Die Grenze zwischen Serosa und embryonalem Gewebe (SEG) verläuft leicht schräg von
ventral nach dorsal (Pfeilspitzen). B) Als nächstes kondensiert das embryonale Gewebe
nach ventral-posterior. Gleichzeitig bildet sich am posterioren Pol die "posterior Pit", der
Ort der späteren Invaginationsbewegung (B, Stern). Diese Mulde ist dorso-ventral asymmetrisch. C) Die Invaginationsbewegung findet über die posterior Pit statt (Stern) und bildet das Keimrudiment. D) Die extraembryonale Serosa im differenzierten Blastoderm des
CHOp24-RNAi-Embryos ist deutlich verkleinert und rotationssymmetrisch (Pfeilspitzen).
E) Anterior ist die Kondensation des embryonalen Gewebes im Knock-down von
Tc'CHOp24 unvollständig (Pfeilspitzen). Es wird keine posterior Pit ausgebildet (Stern). F)
Das embryonale Gewebe kondensiert später dennoch vollständig. Eine Invaginationsbewegung über die posterior Pit bleibt aus (Stern).
G) Mit der Differenzierung des Blastoderms bildet sich die extraembryonale Serosa (anterior, zu erkennen an den größeren Zellkernen mit größerem Abstand zu einander). Das
embryonale Gewebe ist stark kondensiert und invaginiert am posterioren Pol (Stern). H)
Mit der Invagination werden die Kopfanlagen erkennbar (Pfeilspitzen). I) Das embryonale
Gewebe kondensiert weiter und bildet das Keimrudiment. J) Die posterior Pit wirkt in
Tc'CHOp24-RNAi, im Vergleich zum Wildtyp, lateralsymmetrisch. K) Im Zuge der Invagination können keine konkreten, anterioren Strukturen erkannt werden und das anteriore,
embryonale Gewebe wirkt wenig kondensiert (Pfeilspitzen). L) Im weiteren Verlauf der
Invagination bildet sich weiterhin keine Kopfanalage anterior während das Keimrudiment
posterior deformiert wirkt. M) Nach der Invagination können im Wildtyp lateral die Kopfanlagen eindeutig identifiziert werden. Die posteriore Wachstumszone liegt im Wildtyp leicht
ins Ei versenkt. N) Der Kopf des wildtypischen Keimrudiments nimmt weiter konkret Form
an, während posterior aus der Wachstumszone weitere Segmente gebildet werden und
der Embryo zu elongieren beginnt (Stern, O). P) In Tc'CHOp24-RNAi ist nach der Invagination das embryonale Gewebe maximal kondensiert und bildet eine Scheibe ohne erkennbare Strukturen oder Orientierung und kein längliches Keimrudiment. Q) In der weiteren Entwicklung elongiert das anteriore Gewebe nicht, im Ei wird allerdings eine weitere
Anhäufung von embryonalem Gewebe sichtbar (Stern). R) Weder das anteriore noch das
zweite, posteriore Gewebe entwickelt sich weiter oder wächst. Der Embryo beginnt später
zu degradieren (nicht gezeigt).
99
3. Ergebnisse
3.7.5 Der Knock-down von Tc'CHOp24 zeigt bereits in blastodermalen Anlagen Defekte
Bevor die Defekte des Knock-downs von Tc'CHOP24 zur Letalität der Embryonen
führt, zeigt die Tc'wg-Färbung jedoch bereits zwei Defekte im differenzierten Blastoderm. Der Knock-down von Tc'CHOp24 spiegelt sowohl AP- als auch DV-Aspekte
wieder. Zum einen ist die Morphogenese der extraembryonalen Serosa gestört. Die
gerade SEG und die Verkleinerung der Serosa (vgl. Abbildung 23, Abbildung B'' und
Abbildung 24, Abbildung D) ähneln dem Knock-down von Tc'dpp, welches eine essentielle Funktion bei der Etablierung der DV-Polarität hat (vgl. van der Zee et al.,
2006). Segmentierungsabbrüche und Defekte der Kopfkapsel, wie auf larvaler Ebene
gezeigt (vgl. Abbildung 22, Abbildungen C-E), ähneln eher dem Knock-down des
Torso-Signals und damit der AP-Polarität (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005;
Schoppmeier, nicht publiziert). Zunächst wurden die AP-Aspekte des Knock-downs
von Tc'CHOp24 untersucht.
Um
herauszufinden,
welche
blastodermalen
Anlagen
in
Tc'CHOp24-RNAi-
Embryonen betroffen sind, wurde eine Markergenfärbung mit Tc'zen-1 und Tc'eve
durchgeführt (vgl. Patel et al., 1994; Falciani et al., 1996; vgl. Kapitel 3.7.4).
Im undifferenzierten Blastoderm ist Tc'zen-1 in einer anterioren Kappe exprimiert, die
den anterioren Pol des Eis umfasst (Abbildung 25, A-A', vgl. Falciani et al., 1996). Im
Vergleich zum WT ist in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen diese Expressionsdomäne
deutlich verkleinert (vgl. Abbildung 25, B-B'). Die Expression ist im Vergleich zum
Wildtyp auf den dorso-anterioren Bereich des Eis beschränkt (vgl. Abbildungen A''
und B''). Mit der Differenzierung des Blastoderms wird der erste, morphologische
Defekt offenbar. In Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen zeigt sich, sowohl durch die Expression von Tc'zen-1, als auch in der Hoechstfärbung, dass die extraembryonale
Serosa stark verkleinert ist (Abbildung 25, D-D'). Auch die Form der Serosa ist verändert, die Serosa-Embryo-Grenze (SEG) ist rotationssymmetrisch und nicht mehr
schräg wie im Wildtyp (Abbildungen C-C').
Die Expression des Paarregelegens Tc'eve in Blastodermstadien von Tc'CHOp-24RNAi ist wildtypisch. Der erste und der zweite, primäre Tc'eve-Streifen werden regulär gebildet (vgl. Abbildungen C und D, Balken). Somit scheint der Knock-down von
100
3. Ergebnisse
Tc'CHOp24 noch nicht zu Defekten bei der Anlage der gnathalen Segmente zu führen. Die auf larvaler Ebene beobachteten Defekte der gnathalen Segmente (vgl. Abbildung 25, B-B' und D-E) haben folglich ihren Ursprung erst später in der Entwicklung.
Abbildung 25: Expression von Tc' zen-1 und Tc'eve in Tc'CHOp24-RNAiEmbryonen. Hellfeldaufnahmen unterschiedlicher Entwicklungsstadien. Alle Embryonen
sind von lateral gezeigt und anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung
aufgenommen. A'-D' sind Aufnahmen des optischen Schnitts der Embryonen aus A-D.
A''-D'' sind Projektionen von Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden
Embryonen aus A-D. Abbildungsreihen A und C zeigen einen Wildtypembryo, wohingegen Abbildungsreihen B und D einen Tc'CHOp24-RNAi-Embryo zeigen.
A-A'') Tc'zen-1 ist im undifferenzierten Blastoderm (vgl. A'') in einer anterioren Kappe
exprimiert (vgl. Pfeilspitzen). B-B') Die Expressionsdomäne von Tc'zen-1 in Tc'CHOp24RNAi-Embryonen im undifferenzierten Blastoderm (vgl. B'') ist deutlich kleiner (Pfeilspitzen). C-C') Im differenzierten Blastoderm (vgl. C'') ist Tc'zen-1 in der extraembryonalen
Serosa exprimiert (Pfeilspitzen). Tc'eve wird in diesen Stadien um im Wildtyp in einem
Streifen und einer breiten, posterioren Domäne exprimiert. D-D') Die Expressionsdomäne von Tc'zen-1 ist in Tc'CHOp24-RNAi stark in der Größe reduziert und rotationssymmetrisch auf den anterioren Pol des Eis beschränkt. Die Expression von Tc'eve scheint
vor allem in der posterioren Domäne reduziert zu sein (Balken). D'') Die Hoechstfärbung
der Zellkerne des Embryos aus A zeigt, dass die Serosa stark reduziert ist und keine
schräge Grenze zu dem embryonalen Gewebe bildet (Pfeilspitzen).
101
3. Ergebnisse
Neben
dem
Serosaphänotyp
zeigen
das
Live-Imaging
und
die
Tc'wg-
Markergenfärbung auch Defekte in der Kopfentwicklung von Tc'CHOp24-RNAiEmbroyen (vgl. Abbildung 23 und Abbildung 24). Für die weitere Analyse der Kopfund
Serosaphänotypen
der
Tc'CHOp-24-RNAi
wurde
der
Kopfmarker
Tc'orthodenticle-1 verwendet. Tc'otd-1 ist zunächst ubiquitär exprimiert und zieht sich
dann von anterior und posterior zurück und ist im differenzierten Blastoderm im anterioren Kopf und in den prägnathalen Segmenten exprimiert (Schröder, 2003; Schinko
et al., 2008). Diese Expressionsdomäne zeigt dann eine dreieckige Form entlang der
Serosa-Embryo-Grenze (SEG; Abbildung 26, A-A'). Der dorsale Teil der Expression
ist im Wildtyp deutlich schmaler als der Ventrale (Schröder, 2003). Die lateralen Expressionsdomänen von Tc'otd-1 sind im Wildtyp ventral nicht verknüpft (Schröder,
2003).
Die Expression des Kopfmarkers Tc'otd-1 ist bis zur Differenzierung des Blastoderms
nicht durch die Tc'CHOp24-RNAi beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Im differenzierten
Blastoderm zeigt sich zunächst in der Tc'CHOp24-RNAi der Serosaphänotyp, bei
dem die SEG nach anterior verschoben ist und rotationssymmetrisch wird (Abbildung
26, B'). Die Tc'CHOp24-RNAi zeigt außerdem eine Veränderung der Tc'otd-1Expression. Die Expression im differenzierten Blastoderm zeigt nicht mehr eine
"dreieckige" Form (Abbildung 26, B), sondern einen Streifen. Dieser Streifen ist dorsal nicht schmaler. Somit wirkt es, als ob der ventral anteriore Teil der Tc'otd-1Expression in Tc'CHOp24-Embryonen nicht vorhanden ist. Dieser Teil korreliert mit
dem anterioren Kopf (Schröder, 2003; Schinko et al.; 2008). Von dorsal betrachtet
zeigt sich, dass die Tc'otd-1-Expression beide lateralen Expressionsdomänen verknüpft und auch dorsal exprimiert ist (Abbildung B''). Ventral ist die jeweilige, laterale
Expression nicht verknüpft (Abbildung B'''). Somit ist die Expression von Tc'otd-1 in
der Tc'CHOp24-RNAi nach dorsal exprimiert und bildet ein "U" um das Ei.
Die Expression von Tc'eve zeigt, dass der Knock-down von Tc'CHOp24 keinen Effekt
auf die Anlage der gnathalen und thorakalen Segmente hat (vgl. Abbildung 25, D-D').
Die Expression von Tc'wg in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen ist in den okularen Domänen expandiert, zeigt aber, dass diese okularen Anlagen prinzipiell vorhanden
sind (vgl. Abbildung 23, B-B''''). Die Tc'otd-1-Expression ist im ventral-anterioren Bereich der Domäne reduziert (vgl. Abbildung 26, B). In der Expression von Tc'otd-1 ist
102
3. Ergebnisse
nur die ventral-anteriore Expression reduziert (vgl. Abbildung 26, Abbildung B). Somit
scheint der Effekt des Knock-downs von Tc'CHOp24 auf die Anlage der prägnathalen
Segmente eher gering zu sein.
Die meisten Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen sterben, bevor ein Keimrudiment gebildet
wird (vgl. Kapitel 3.7.2 und 3.7.4). Die wenigen Embryonen, die jedoch sogar eine
Larve bilden, zeigen vor allem eine starke Reduktion der Kopfkapsel aber auch Verkürzungen und Deformationen des Labrum und der Antennen (vgl. Abbildung 22,
Abbildungen B-B' und D-E). Im Knock-down von Tc'otd-1 sind alle prägnathalen
Segmente deletiert und teilweise sogar das Mandibelsegment (Schröder, 2003). Die
Verkleinerung der Kopfkapsel der Larven des Knock-downs von Tc'CHOp24 könnte
auf die Defekte der Anlage des anterioren Kopfes im Blastodermstadium zurückzuführen sein, die durch das Fehlen des ventral-anterioren Expression von Tc'otd-1
begründet sein mag (vgl. Abbildung 26, B). Allerdings ist der Kopf in Tribolium eine
ventrale Anlage (van der Zee et al., 2006). Der Effekt von Tc'otd-1 auf die APSegmentierung ist eher gering (Kotkamp et al., 2010). Die anterioren Deletionen, die
im Knock-down von Tc'otd-1 beobachtet werden können (Schröder, 2003) sind wahrscheinlich vielmehr auf die Verschiebung des Anlagenplans im Blastoderm zurückzuführen (Kotkamp et al., 2010). Tc'otd-1 beeinflusst die Expression von Tc'sog und
reguliert damit über die Tc'dpp-Aktivität die DV-Segmentierung. Die Folge ist die
Dorsalisierung des Embryos und die Expansion der Kopfanlagen (vgl. Kotkamp et al.,
2010). Die Rotationssymmetrie und die Verkleinerung der extraembryonalen Serosa
in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen (vgl. Abbildung 23, Abbildung B'' und Abbildung 24,
Abbildung D) ähneln außerdem auch stark dem Knock-down von Tc'dpp (vgl. van der
Zee et al., 2006). Somit wäre es möglich, dass sowohl die Serosa-Phänotypen als
auch die Defekte der prägnathalen Segmente des Knock-downs von Tc'CHOp24,
analog zu dem Knock-down von Tc'otd-1, nicht durch Defekte bei der APSegmentierung sondern durch Störungen bei der DV-Achsenbildung zustande kommen.
103
3. Ergebnisse
Abbildung 26: Expression von Tc'otd in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen. Alle Embryonen sind anterior nach links orientiert und außer B'' und B''' von
lateral gezeigt. B'' ist von dorsal gezeigt und B''' von ventral. A' und B' sind Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A und B. Alle Embryonen
sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. Abbildungen A und A' zeigen einen Wildtypembryo und B-B''' einen Tc'CHOp24-RNAi-Embryo.
A) Tc'otd ist im differenzierten Blastoderm in einer dreieckigen Domäne im anterioren
embryonalen Gewebe entlang der Grenze zwischen Serosa und embryonalem Gewebe
exprimiert (Balken, vgl. A' Pfeilspitzen). B) In Tc'CHOp24-RNAi expandiert die Tc'otdExpressionsdomäne und bildet einen gleichmäßigen Streifen von ventral nach dorsal
(Balken). B') Die extraembryonale Serosa ist in Tc'CHOp24-RNAi nach anterior verkleinert und die schräge Grenze zwischen den Geweben begradigt (Pfeilspitzen). B'') Die
dorsale Ansicht des Embryos aus B zeigt, dass die Tc'otd-Expression als Streifen die
lateralen Domänen dorsal verbindet (Balken). B''') Ventral ist die laterale Expression von
Tc'otd nicht verbunden.
3.7.5 Tc'CHOp24 moduliert dpp-Aktivität
Der Serosaphänotyp des Knock-downs von Tc'CHOp24 ähnelt stark den Phänotypen
des Knock-downs von Tc'dpp (vgl. van der Zee et al., 2006 und Abbildungen 24-27).
Außerdem könnten die Defekte der prägnathalen Segmente, wie bereits beschrieben, durch Defekte bei der DV-Segmentierung entstehen. Für Tc'CHOp24 ist eine
Beteiligung an der Sekretion von Wnt-Proteinen beschrieben (Bartscherer und Boutros, 2008; Buechling et al., 2011; Port et al., 2011). Auch Tc'dpp wird sekretiert
(Neumann und Cohen, 1997). Somit wäre zu erwarten, dass der Knock-down von
Tc'CHOp24 keinen Einfluss auf die Expression von Tc'dpp hat, sondern vielmehr auf
104
3. Ergebnisse
dessen Protein und Aktivität (Dorfman und Shumi, 2001) oder auf die Aktivierung des
Rezeptors (Bartoszewski et al., 2004). Tc'dpp ist im Wildtyp in einem Streifen entlang
der SEG exprimiert, sowie posterior im Bereich der posterior Pit (van der Zee et al.,
2006). Tatsächlich ist in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen Tc'dpp-mRNA normal exprimiert (Daten nicht gezeigt). Für die weitere Analyse von Tc'CHOp24 wurde folglich
untersucht, ob der Knock-down des p24-Gens einen Effekt auf die Tc'dpp-Aktivität
hat.
Hierfür wurden zunächst Tc'CHOp24-RNAi-Embroynen mit einem Antikörper gegen
Tc'pMAD gefärbt. Phosphoriliertes Mothers against Dpp (pMAD) ist ein Protein, dass
die dpp-Aktivität anzeigt, da es nur von Zellen mit aktivierten BMP-Rezeptoren produziert wird (Dorfman und Shumi, 2001). Im Knock-down von Tc'dpp ist pMADExpression, als Indikator für Tc'dpp-Aktivität, vollständig verschwunden (van der Zee
et al., 2006). Tc'pMAD ist im Wildtyp im differenzierten Blastoderm auf der dorsalen
Seite des Embryos von anterior nach posterior akkumuliert. Des Weiteren kann
Tc'pMAD um die posterior Pit beobachtet werden, sowie im dorsalsten Teil des Amnions, dass dorsal-posterior im Ei liegt (vgl. Abbildung 27, A, Stern). Weitere Akkumulation von pMAD befindet sich im dorsalen Teil der Serosa, wobei diese in der anterioren Serosa breiter ist (van der Zee et al., 2006).
In der Tc'CHOp24-RNAi ist das posteriore Signal von Tc'pMAD im Bereich der posterior Pit stark reduziert (vgl. Abbildung 27, A und B, Stern). Die posterior Pit wird, wie
bereits beschrieben, im Knock-down von Tc'CHOp24 nicht korrekt gebildet (B,
Stern). Die Expression von Tc'pMAD, die sich im Wildtyp von dorsal nach anterior
zieht und dort auch in der extraembryonalen Serosa vorhanden ist, fehlt in
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen (Abbildung B).
Auch wenn, anders als in dem Tc'dpp-Knock-down, noch etwas Tc'pMAD-Signal und
damit Tc'dpp-Aktivität vorhanden ist, so zeigt sich dennoch ein Effekt von
Tc'CHOp24-RNAi auf die Tc'dpp-Aktivität. Anterior ist kein Signal von Tc'pMAD vorhanden und auch das posteriore Signal, vor allem im Bereich des dorsalen Amnions
ist deutlich reduziert (vgl. Abbildung 27, B, Stern). Wie bereits erwähnt konnte kein
Effekt auf die Expression von Tc'dpp in Tc'CHOp-24-RNAi-Embryonen beobachtet
werden (Daten nicht gezeigt).
105
3. Ergebnisse
Um die Effekte von Tc'CHOp24 auf die Tc'dpp-Aktivität und damit auf den DVSignalweg zu bestätigen und weiter zu analysieren, wurden weitere Markergenfärbungen durchgeführt. Hierfür wurden zwei Zielgene des Tc'dpp-Signalwegs gewählt
(Tc'dorsocross und Tc'panier; van der Zee et al., 2005) und ein Marker für das dorsale Amnion, da hier die Tc'dpp-Aktivität am höchsten ist (Tc'iroquois; van der Zee et
al., 2006; Nunes de Fonseca et al., 2008). In 0-24h RNAi-Embryonen von
Tc'CHOp24 wurden dementsprechend in-situ-Hybridisierungen gegen Tc'dorsocross
(Tc'doc), Tc'panier (Tc'pnr) und Tc'iroquois (Tc'iro) durchgeführt.
Abbildung 27: Expression von Tc'pMAD in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen. Alle Embryonen sind anterior nach links orientiert und von lateral gezeigt.
Alle Embryonen sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A' und B' sind Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A und B. Abbildungen A
und A' zeigen die Tc'pMAD-Expression im Wildtyp und Abbildungen B und B' in
Tc'CHOp24-RNAi.
A) Tc'pMAD ist im differenzierten Blastoderm des Wildtyps in einer dorsalen, posterioren
Domäne (Stern), um die posterior Pit, exprimiert. Schwache Expression zieht sich dorsal
bis nach anterior. A') Die Pfeilspitzen zeigen die Grenze zwischen der extraembryonalen
Serosa (an den größeren Zellkernen und den Größeren Abständen zwischen den Zellkernen zu erkennen). B) In Tc'CHOp24-RNAi ist Tc'pMAD nur noch in einer kleinen Domäne am posterioren Pol des Eis exprimiert (Stern). Keine posterior Pit wurde geformt.
B') Die Grenze zwischen extraembryonaler Serosa und embryonalem Gewebe wurde in
Tc'CHOp24-RNAi begradigt und die Serosa nach anterior verkleinert.
Tc'doc ist ein Zielgen des Tc'dpp-Signalwegs und im Knock-down von Tc'dpp-RNAi
ist Tc'doc-Expression vollständig abwesend (van der Zee et al., 2006). Im undifferen106
3. Ergebnisse
zierten Blastoderm des Wildtyps ist Tc'doc in einer dorsalen, anterioren Kappe exprimiert, die sich mit der Differenzierung nach dorsal zurückzieht. Im differenzierten
Blastoderm ist Tc'doc dann in dem dorsalen Drittel der extraembryonalen Serosa
exprimiert sowie im Bereich der dorsalen posterior Pit und des dorsalen Amnions
(van der Zee et al., 2006; Abbildung 28, A).
In der RNAi von Tc'CHOp24 zeigt sich bereits im undifferenzierten Blastoderm eine
Veränderung der Tc'doc-Expression. Die Expression in Form einer anterioren Kappe,
die Tc'doc im Wildtyp zeigt (Abbildung 28, A-A'), ist in Tc'CHOp24-RNAi deutlich auf
eine kleine, dorsale Expressionsdomäne reduziert (Abbildungen B-B', Pfeilspitze).
Im differenzierten Blastoderm von Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen ist die anteriore Expression von Tc'doc im dorsalen Drittel der Serosa im Vergleich zum Wildtyp fast
vollständig verschwunden. Tc'doc ist nur noch sehr schwach am dorsalen Rand der
Serosa exprimiert (Abbildungen D-D', Pfeilspitze). Die posteriore Expression (Abbildungen C-C', Stern) von Tc'doc im differenzierten Blastoderm ist im Knock-down von
Tc'CHOp24 sogar vollständig abwesend (D-D', Stern). Die SEG ist rotationssymmetrisch und nach anterior verschoben.
Die Expression von Tc'doc ist in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen also stark reduziert.
Da Tc'doc wie in Drosophila ein Zielgen der Tc'dpp-Aktivität ist (van der Zee et al.,
2006), bestätigt die Reduktion dieser Expression den Einfluss von Tc'CHOp24 auf
die Tc'dpp-Aktivität.
107
3. Ergebnisse
Abbildung 28: Expression von Tc'doc in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen. Alle Embryonen sind anterior nach links orientiert und von lateral gezeigt. Alle
Embryonen sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A'-D' sind Hoechstfärbungen
der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A-D. Die Abbildungsreihen A und
C zeigen die Tc'doc-Expression im Wildtyp und die Abbildungsreigen B und D in der
Tc'CHOp24-RNAi.
A-A') Tc'doc ist im Wildtyp im undifferenzierten Blastoderm (vgl. A'') in einer breiten anterioren Kappe exprimiert (vgl. Pfeilspitzen). B-B') In Tc'CHOp24-RNAi ist diese anteriore
Expression stark reduziert und auf eine kleine, dorsale Domäne beschränkt (Pfeilspitze).
C-C') Zusätzlich zu einer dorsalen Expressionsdomäne, die sich nach ventral entlang der
Grenze zwischen extraembryonaler Serosa und embryonalem Gewebe zieht (Pfeilspitze), ist Tc'doc im differenzierten Blastoderm des Wildtyps in einer posterioren Domäne in
der posterior Pit exprimiert (Stern). C'') Die Pfeilspitzen markieren die Grenze zwischen
Serosa und embryonalem Gewebe. D-D') in Tc'CHOp24-RNAi ist die posteriore Expression von Tc'doc vollständig reduziert und nur in der dorsalen Serosa ist noch wenig Expression zu erkennen (Pfeilspitze). D'') In differenzierten Blastodermen der Tc'CHOp24RNAi ist die Grenze zwischen extraembryonalem und embryonalem Gewebe begradigt
(Pfeilspitzen). In schwächeren Tc'CHOp24-RNAi-Phänotypen ist die Serosa nicht verkleinert.
Ein weiteres Zielgen von Tc'Dpp ist Tc'pnr (van der Zee et al., 2006). Tc'pnr ist im
differenzierten Blastoderm wildtypisch in der posterior Pit, im dorsalen embryonalen
108
3. Ergebnisse
Gewebe und im präsumtiven Amnion exprimiert. In Tc'dpp-RNAi ist die Expression
von Tc'pnr vollständig verschwunden (van der Zee et al., 2006).
Defekte der Expression in der Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen zeigen sich auch für
Tc'pnr. Im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung 29, A-A') fehlt die Expression im Amnion (Abbildung 29, B-B', Pfeilspitze). Die SEG ist nach anterior verschoben und deutlich steiler als im Wildtyp. Die Expression von Tc'pnr im Bereich der posterior Pit, ist
stark reduziert (Abbildungen B-B', Stern). Tc'CHOp24-RNAi reduziert also auch die
Expression von Tc'pnr, einem weiteren Zielgen von Tc'dpp (van der Zee et al., 2006).
Abbildung 29: Expression von Tc'pnr in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen. Alle Embryonen sind anterior nach links orientiert. A und B sind von lateral gezeigt. Alle Embryonen sind bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A' und B' sind Aufnahmen des optischen Querschnittes der Embryonen aus A und B. A'' und D'' sind
Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A-B. Abbildungsreihe A zeigt den Wildtyp und Abbildungsreihe B die Tc'CHOp24-RNAi.
A-A') in differenzierten Blastodermen des Wildtyps ist Tc'pnr in einer dorsalen Domäne
im embryonalen Gewebe exprimiert, die sich anterior entlang der Grenze zwischen Serosa und Embryo nach ventral zieht (Pfeilspitze) und posterior den dorsalen Teil der posterior Pit beinhaltet (Stern). A'') Die Pfeilspitzen markieren die Grenze zwischen Serosa
und embryonalem Gewebe. B-B') In Tc'CHOp24-RNAi ist die anteriore Expression von
Tc'pnr entlang der Serosagrenze verschwunden (Pfeilspitze). Die posteriore Expression
ist ebenfalls stark reduziert (Stern). Die Bildung der posterior Pit kann nicht beobachtet
werden. B'') Die Serosagrenze ist nach anterior verschoben in Tc'CHOp24-RNAi Embryonen (Pfeilspitzen). Schwächeren Tc'CHOp24-Phänotypen zeigen keine vollständige Begradigung der SEG.
Als weiterer Marker zur Untersuchung von Defekten in Tc'CHOp24-RNAi wurde Tc'iro verwendet. Tc'iro ist ein Marker für das dorsale Ektoderm und das Amnion und ist
im Wildtyp in differenzierten Blastodermen dementsprechend in einer breiten, poste109
3. Ergebnisse
rioren Domäne im Bereich der posterior Pit, im dorsalen, embryonalen Gewebe und
entlang der SEG exprimiert (Nunes da Fonseca et al., 2008).
Trotz des Knock-downs von Tc'CHOp24 ist die Expression von Tc'iro in der SEG
noch regulär vorhanden (Abbildung 30, B-B', Pfeilspitzen). In diesem Bereich zeigt
sich keine Abweichung im Knock-down von Tc'CHOp24 zum Wildtyp (vgl. Abbildungen A und A'). In schwächeren Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen ist die SEG zwar senkrechter und nach anterior verschoben, die stärkste Verkleinerung und die vollständige Rotationssymmetrie der SEG (vgl. Abbildung 23, Abbildungen B-B'''') zeigt sich
jedoch nicht.
Die Expression von Tc'iro entlang des dorsalen, embryonalen Gewebes bis zur posterior Pit ist in dem Knock-down von Tc'CHOp24 vollständig abwesend (Abbildung
30, B-B', Stern). Im Bereich des dorsalen Amnions und damit dem Bereich der
höchsten Tc'dpp-Aktivität (van der Zee et al., 2006) ist keine Expression von Tc'iro in
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen vorhanden. Somit ergibt sich für die Expression von
Tc'iro in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen folgendes Bild: der Knock-down des p24Proteins hat keinen Einfluss auf die anteriore Expression von Tc'iro im Amnion entlang der SEG, die posteriore Expression im dorsalen Amnion ist aber nicht vorhanden.
110
3. Ergebnisse
Abbildung 30: Expression von Tc'iro in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen. Alle Embryonen sind anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung
aufgenommen. A und B sind von lateral gezeigt. A' und B' sind Aufnahmen des optischen Querschnittes der Embryonen aus A und B. A'' und D'' sind Hoechstfärbungen
der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen aus A-B. Abbildungsreihe A zeigt den
Wildtyp und Abbildungsreihe B die Tc'CHOp24-RNAi.
A-A') Tc'iro ist im differenzierten Blastoderm des Wildtyps entlang der Grenze der extraembryonalen Serosa exprimiert (Pfeilspitzen, vgl. A''), sowie am dorsalen Rand des
embryonalen Gewebes. Diese dorsale Expression zieht sich posterior bis in die dorsale
posterior Pit. B-B') In Tc'CHOp24-RNAi ist die anteriore Expression von Tc'iro (entlang
der Serosagrenze, Pfeilspitzen) unverändert, doch die dorsale und posteriore Expression
ist verschwunden (Stern). B'') Die Serosa in Tc'CHOp24-RNAi ist verkleinert im Vergleich zum Wildtyp (Pfeilspitzen) und in schwächeren Tc'CHOp24-RNAi-Phänotypen ist
die SEG nicht vollständig rotationssymmetrisch.
Zusammenfassend wurde der Einfluss von Tc'CHOp24 auf die Tc'dpp-Aktivität (vgl.
Abbildung 26) durch die gestörte Expression der Tc'dpp-Zielgene bestätigt. Die Abwesenheit des Gewebes (dorsales Amnion), in dem die höchste Tc'dpp-Aktivität vorkommt (van der Zee et al., 2006) verdeutlicht weiterhin den Einfluss von Tc'CHOp24
auf die dorso-ventrale Achsenbildung.
3.7.6 Tc'CHOp24-Expression in Tc'tsl- und Tc'cic-RNAi-Embryonen
Die Markergenexperimente mit Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen zeigen, dass das p24Gen die Tc'dpp-Aktivität beeinflusst. Die Ergebnisse des Expressionsanalyse durch
das SOLiD® Next-Generation-Sequencing (vgl. Tabelle 4 im Anhang) ergaben eine
deutlich reduzierte relative Expression von Tc'CHOp24-mRNA (0,13 im Vergleich
zum Wildtyp) in Tc'tsl-RNAi-Embryonen. Im Gegensatz dazu war die relative mRNA111
3. Ergebnisse
Expression in Tc'cic-RNAi-Embryonen deutlich erhöht (3,26 im Vergleich zum Wildtyp). Somit kann angenommen werden, dass Tc'CHOp24 ein Zielgen des terminalen
Systems ist und als solches dennoch die Tc'dpp-Aktivität moduliert. Um zu bestätigen, dass Tc'CHOp24 ein Zielgen des terminalen Systems ist wurde als nächstes
dessen Expression in Tc'tsl- und Tc'cic-RNAi-Embryonen durch in-situ Hybridisierung
analysiert.
Wie erwartet, ist die Tc'CHOp24-Expression in Tc'tsl-RNAi deutlich reduziert. Bereits
maternal wird die mRNA des p24-Gens nicht mehr anterior lokalisiert (Abbildung 31,
B und B'). Die Expression um den Polkörper, die dennoch vorhanden ist, kann wahrscheinlich vernachlässigt werden (vgl. Kapitel 3.6.1; Peel und Averof, 2010). Mit der
Differenzierung des Blastoderms erscheint zwar in Tc'tsl-RNAi die posteriore Domäne von Tc'CHOp24, diese ist allerdings stark reduziert (Abbildung 31, D und D'). In
Keimrudiment- und Keimstreifstadien konnte nach dem Knock-down von Tc'tsl keine
Tc'CHOp24-Expression detektiert werden. Diese deutlich reduzierte Expression von
Tc'CHOp24 in Tc'tsl-RNAi-Embryonen bestätigt die Ergebnisse für Tc'tsl-RNAi der
Expressionsanalyse (vgl. Tabelle 4 im Anhang) und ist ein weiterer Indikator, dass es
sich bei dem p24-Gen um ein Zielgen des Tc'Torso-Signalwegs handelt.
In Tc'cic-RNAi-Embryonen kann keine eindeutige Vergrößerung der Tc'CHOp24Expressionsdomänen erkannt werden (Daten nicht gezeigt). Der Expressionsanalyse
nach müsste die relative Expression von Tc'CHOp24 im Vergleich zum Wildtyp deutlich erhöht sein (3,26). Die in-situ Hybridisierung von Tc'CHOp24 lässt jedoch, anders als erwartet, keine stärke Expression in Tc'cic-RNAi-Embryonen erkennen. Die
Gründe für dieses unerwartete Ergebnis werden in Kapitel 4.2.3 diskutiert.
112
3. Ergebnisse
Abbildung 31: Expression von Tc'CHOp24 in Tc'tsl-RNAi-Embryonen. Hellfeldaufnahmen. Alle Embryonen sind anterior nach links orientiert und bei 100x Vergrößerung aufgenommen. A''-D'' sind Hoechstfärbungen der Zellkerne der korrespondierenden Embryonen
aus A-D. Die Abbildungsreihen A und C zeigen die Tc'CHOp24-Expression im Wildtyp und
die Abbildungsreigen B und D in der Tc'tsl-RNAi.
A-A') In unbefruchteten Eiern (vgl. A'') ist Tc'CHOp24 maternal anterior exprimiert (Pfeilspitzen). B-B') Die anteriore Expression von Tc'CHOp24 ist in Tc'tsl-RNAi abwesend. C-C') Im
differenzierten Blastoderm ist Tc'CHOp24 im Wildtyp anterior in der extraembryonalen Serosa exprimiert (vgl. 3.9.1) und posterior um die posterior Pit. D-D') Die Expression von
Tc'CHOp24 in Tc'tsl-RNA ist vollständig abwesend. Die posteriore Expression ist stark reduziert (Stern). D'') Die extraembryonale Serosa ist in Tc'tsl-RNAi nach anterior verkleinert. Es
bildet sich keine Invaginationsgrube.
113
4. Diskussion
4. Diskussion
4.1 Das Zielgen des terminalen Systems Tc'maelstrom ist für anteriore
und posteriore Morphogenese essentiell
Aus dem Modellorganismus Drosophila melanogaster sind für maelstrom zwei unterschiedliche Funktionen bekannt (vgl. Kapitel 3.6). Dm'mael ist sowohl im Prozess des
PIWI-vermittelten Transposon-Silencings in der Oogenese beteiligt (Findley et al.,
2003; Sato und Siomi, 2015), als auch bei der Reorganisation des Mikrotubuliapparates und damit bei der Etablierung der anterior-posterioren Achse durch die Polarisierung der Oozyte (Clegg et al.; 2001; Sato et al., 2011). Bisher gibt es keine Daten,
welche maelstrom mit dem terminalen System in Drosophila verknüpfen.
Die in Kapitel 3.6 dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei
Tc'maelstrom um ein Zielgen des terminalen Systems in Tribolium handelt. Folglich
wird diskutiert, wie die Phänotypen in Tc'mael-RNAi-Embryonen zu Stande kommen
könnten und welche Bedeutung Tc'maelstrom als Zielgen des Torso-Signalwegs für
die Etablierung anteriorer und posteriorer Strukturen haben könnte.
4.1.1 Der Knock-down von Tc'maelstrom führt wahrscheinlich zu Defekten bei der
Morphogenese der Serosa
Drosophila maelstrom ist maßgeblich am Prozess der Lokalisation und Organisation
des Mikrotubuli Organisationszentrums (MTOC) beteiligt (vgl. Clegg et al., 1997;
Clegg et al., 2001; Sato et al., 2011). Die korrekte Assemblierung und Lokalisation
des MTOC ist für die Ausbildung der anterior-posterioren Zellpolarität durch den intrazellulären Transport von unterschiedlichen Faktoren essentiell (vgl. Theurkauf et
al., 1992; Theurkauf et al., 1993). Die Etablierung von Zellpolarität spielt wiederum
eine entscheidende Rolle in der Differenzierung der Drosophila Oozyte (vgl.
Theurkauf et al., 1993; Humbert et al., 2008) und ist wichtig für die Morphogenese
von Oozyten und Epithelen (St Johnson und Ahringer, 2010). Die Zellpolarität, die
114
4. Diskussion
durch Lokalisierung bestimmter Faktoren etabliert wird, ist außerdem innerhalb ganzer Zellpopulationen entscheidend für die Migration dieser Zellen (Irvine und Wieschaus, 1994; Zallen und Wieschaus, 2004).
Auch in Tribolium spielt die korrekte Zellpolarität eine wichtige Rolle in der frühen
Embryonalentwicklung, wie beispielsweise bei der Differenzierung des Blastoderms
in embryonales und extraembryonales Gewebe (Handel et al., 2000; Benton et al.,
2013). Hierbei teilen sich die Zellen der extraembryonalen Serosa nicht weiter, während die Zellen des Embryos eine weitere Runde der Zellteilung unterlaufen. Außerdem ändert sich die Form der Zellen markant. Die Serosazellen werden flach und
schuppenförmig, während die embryonalen Zellen säulenförmig werden (Handel et
al., 2000; Beton et al. 2013).
Im differenzierten Blastoderm von Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigt sich anterior eine
Reduktion der extraembryonalen Serosa. Die Serosa-Embryo-Grenze bleibt allerdings schräg. Auch die Expression des Serosa-Markers Tc'zen-1 ist im Vergleich
zum Wildtyp in diesem Entwicklungsstadium reduziert (vgl. Abbildung 17, B-B'').
Da Drosophila maelstrom eine Rolle in der Ausbildung der Zellpolarität hat, wäre es
möglich, dass Tribolium maelstrom über die asymmetrische Verteilung von Faktoren
innerhalb der Zellen zur Differenzierung des Blastoderms beiträgt. Tc'mael könnte
spezifisch die Polarität der zukünftigen Serosazellen koordinieren. Ohne die korrekte
Polarisierung würden die anterioren Zellen des undifferenzierten Blastoderms nicht
zu Serosazellen differenzieren und eventuell überhaupt nicht differenzieren. Es wäre
auch denkbar, dass durch diesen Defekt weniger Zellen zu Serosazellen differenzieren. Der Ursprung des Serosa-Phänotyps in Tc'mael-RNAi-Embryonen läge also
nicht in Defekten der Spezifizierung sondern in Störungen bei der Morphogenese
anteriorer Zellen.
Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigen nur eine Verkleinerung der Serosa, nicht deren
vollständige Deletion (vgl. Abbildung 17, B-B''). Möglicherweise spielt Tc'maelstrom
nur bei der Differenzierung der posterioren Serosazellen eine Rolle, die im Zuge der
Invagination migrieren und das Ei auskleiden (vgl. Benton et al., 2013). Da die Polarität auch für die Migration von Zellen eine Rolle spielt (Irvine und Wieschaus, 1994;
Zallen und Wieschaus, 2004; St Johnson und Ahringer, 2010), könnte das auch die
späteren Defekte des Serosafensters und des verfrühten Aufreißens der Serosa be115
4. Diskussion
gründen (vgl. Kapitel 4.1.3). Andererseits könnte Tc'mael nur einer der Faktoren sein,
welche die Polarisierung der Serosazellen bedingen. In diesem Fall würden weitere
Faktoren noch zur Differenzierung der restlichen Serosa führen. Alternativ könnte es
sich bei den beobachteten RNAi-Phänotypen nur um einen partiellen Knock-down
handeln, bei dem das Protein nicht vollständig abwesend ist (vgl. Bucher et al.,
2002).
Allerdings wäre es auch möglich, dass die Serosa-Phänotypen des Knock-downs
von Tc'maelstrom durch Störungen der Musterbildung zu Stande kommen. Für die
Spezifizierung der Serosazellen ist Tc'zen-1 verantwortlich (vgl. van der Zee et al.,
2005). Tc'zen-1 ist ab dem undifferenzierten Blastoderm in einer anterioren Domäne
exprimiert, die sich ab der Differenzierung mit der extraembryonalen Serosa deckt
(Falciani et al., 1996). Somit könnte die Verkleinerung der extraembryonalen Serosa
in Tc'mael-RNAi-Embryonen auf die Verkleinerung der Expressionsdomäne von
Tc'zen-1 zurückzuführen sein (vgl. Abbildung 17, B-B'). Also könnte Tc'mael die Expression von Tc'zen-1 regulieren.
Die initiale Expression von Tc'zen-1 im undifferenzierten Blastoderm in Tc'maelRNAi-Embryonen ist allerdings nicht verändert (Daten nicht gezeigt). Die Serosa wird
aber eben über diese frühe Expression von Tc'zen-1 spezifiziert (vgl. van der Zee et
al. 2005) und somit ist es unwahrscheinlich, dass die Serosadefekte in Tc'maelRNAi-Embryonen durch die gestörte Regulation von Tc'zen-1 zustande kommen.
Außerdem ist Tc'maelstrom selbst kein Transkriptionsfaktor. Es wäre zwar denkbar,
dass Tc'mael auch in Tribolium, wie in Drosophila, für die Lokalisation maternaler
mRNAs beteiligt ist (Clegg et al., 1997). Allerdings gibt es bisher keine Hinweise darauf, dass Tc'zen-1 selbst maternal exprimiert ist (Falciani et al., 1996). Somit scheinen die Defekte der Serosa nicht auf eine Misslokalisation von Tc'zen-1 im Knockdown von Tc'mael in der Oozyte zurückzuführen zu sein. Tc'tsl, Tc'otd-1 und Tc'axin
sind jedoch maternal exprimiert und der Knock-down dieser Gene hat die Verkleinerung der Serosa zur Folge (Schröder, 2003; Schoppmeier und Schröder, 2005; Bäumer et al., 2010; Fu et al., 2012). Da im Knock-down von Tc'otd-1 und Tc'axin die
Serosa zwar verkleinert, aber gleichzeitig rotationssymmetrisch ist (vgl. Kotkamp et
al., 2010; Fu et al., 2012), ähnelt dieser Phänotyp nicht dem Knock-down von
Tc'mael (vgl. Abbildung 17, B-B''). Dennoch wäre es möglich in Tc'mael-RNAiEmbryonen einen Teilaspekt dieser RNAi-Phänotypen zu sehen. In Tc'tsl bleibt ne116
4. Diskussion
ben der Verkleinerung der Serosa die Serosa-Embryo-Grenze (SEG) schräg (vgl.
Schoppmeier und Schröder, 2005). Also wäre es denkbar, dass Tc'maelstrom bei
einem oder mehreren Faktoren zur maternalen Lokalisation beiträgt. Zusammenfassend ist es jedoch unwahrscheinlich, dass die Reduktion der extraembryonalen Serosa in Tc'mael-RNAi-Embryonen auf eine Funktion von Tc'maelstrom in der Musterbildung zurückzuführen ist.
4.1.2 Defekte der prägnathalen und gnathalen Segmente der Tc'mael-RNAiEmbryonen sind wahrscheinlich auf Defekte der extraembryonalen Serosa zurückzuführen
Larvale Kutikulapräparationen von Tc'maelstrom-RNAi zeigen in geringer Häufigkeit
(ca. 13%, vgl. Abbildung 13) Deformationen oder Deletionen der prägnathalen und
gnathalen Segmente, sowie die Reduktion der Kopfkapsel (vgl. Abbildung 14, C-D
und F). Auf embryonaler Ebene zeigen sich erste Defekte im Knock-down von
Tc'mael bereits in den Anlagen der gnathalen Segmente im Blastodermstadium (vgl.
Abbildung 17, B-B'; Abbildung 15, D und E). Die Dokumentation der Entwicklung von
Tc'mael-RNAi-Embryonen mittels Live-Imaging zeigt bei der Invaginationsbewegung,
dass das Gewebe des Kopfes zunächst nicht vollständig kondensiert (vgl. Abbildung
15, Abbildungen E-F, Stern). Somit könnte hier der Ursprung der prägnathalen Phänotypen sein, die auf larvaler Ebene beobachtet werden. Diese Daten weisen darauf
hin, dass die Phänotypen nicht bei der Anlage der Segmente im Blastoderm, sondern
sekundär durch mangelnde Kondensierung anterioren embryonalen Gewebes bei
der Invagination entstehen.
Die unvollständige Kondensierung des embryonalen Gewebes im Bereich der prägnathalen und gnathalen Segmente wird jedoch im weiteren Verlauf der Entwicklung
von Tc'mael-RNAi-Embryonen größtenteils kompensiert. In Keimstreifstadien wirkt
die Morphologie der Kopfsegmente meist wildtypisch (vgl. Abbildung 15, K-L). Die
Penetranz der larvalen Kopfdefekte ist im Vergleich zum Hintergrund nicht sehr hoch
(ca. 13%, vgl. Kapitel 3.6.2 und Schmitt-Engel et al., 2015). Eine Expansion von
Kopfsegmenten ist ebenfalls für Tc'zen-1-RNAi-Embroynen und Tc'tsl-RNAiEmbryonen beschrieben (Schoppmeier und Schröder, 2005; van der Zee et al.,
117
4. Diskussion
2005). Durch die Verkleinerung der extraembryonalen Serosa expandiert das embryonale Gewebe nach anterior (van der Zee et al., 2005). Dieser Defekt wird allerdings
im weiteren Verlauf der Entwicklung bei der Keimstreifstreckung größtenteils kompensiert (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005; van der Zee et al., 2005). Durch diese Expansion zeigen der Knock-down von Tc'zen-1 sowie der Knock-down von Tc'tsl
in geringer Anzahl Defekte der prägnathalen und gnathalen Segmente auf larvaler
Ebene, die, wie die Kopfphänotypen der Tc'mael-RNAi stark variabel sind (Schoppmeier, nicht publiziert).
Die Tc'maelstrom-RNAi-Phänotypen der prägnathalen und gnathalen Segmente sind
wenig konsistent und zeigen eine große Varianz darin, welche Segmente vom
Knock-down betroffen sind (vgl. Abbildung 14, C-D und F; Abbildung 17, C und E).
Diese Varianz könnte bedeuten, dass die Defekte der Kopfsegmente in Tc'maelRNAi-Embryonen und -Larven nicht direkt auf eine Funktion von Tc'mael in der Musterbildung zurückzuführen ist. Die variablen Deformationen und Deletionen der prägnathalen und gnathalen Segmente könnten durch die Verkleinerung der extraembryonalen Serosa bedingt sein. Wie in Tc'zen-1-RNAi-Embryonen und Tc'tsl-RNAiEmbryonen würde somit die initiale Expansion anterioren embryonalen Gewebes
später kompensiert werden. Die Defekte der Kopfsegmente wären folglich nur ein
sekundärer Effekt, der durch die Störungen der
Morphogenese der Serosa in
Tc'mael-RNAi-Embryonen bedingt ist. Tc'mael hat somit wahrscheinlich keine Funktion in der Anlage der prägnathalen und gnathalen Segmente.
4.1.3 Mögliche Ursachen der Defekte der extraembryonalen Membran in der späteren Entwicklung von Tc'mael-RNAi-Embryonen
Nach der Invagination zeigt sich der nächste Aspekt des Knock-downs von Tc'mael
auf die extraembryonale Serosa. Das sogenannte Serosafenster (vgl. Handel et al.,
2000) wird nicht korrekt ausgebildet und wirkt zu groß (vgl. Abbildung 17, D-D'). Im
Wildtyp reißt die Serosa kurz vor dem Rückschluss an einem anterior-ventralen
Punkt des Eis auf und zieht sich rasch nach dorsal zurück (Hilbrandt et al., 2016). In
Tc'mael-RNAi-Embryonen reißt die Serosa verfrüht an einem posterior-dorsalen
118
4. Diskussion
Punkt auf und zieht sich dann um den Embryo zurück (vgl. Abbildung 15, K-L; Video
2 auf der DVD im Anhang).
Die Polarisierung der Zelle ist für die Verteilung von unterschiedlichen Faktoren notwendig, die über das MTOC koordiniert wird (vgl. Theurkauf et al. 1992; Theurkauf et
al., 1993; Humbert et al, 2008). Diese Asymmetrie der Zelle ist unter anderem auch
für die Zellmigration essentiell (Humbert et al., 2008; St Johnson und Ahringer,
2010). Während der Gastrulationsbewegung des embryonalen Gewebes in Tribolium
umspannt die extraembryonale Serosa das gesamte Ei und schließt sich mit dem
Serosafenster über dem Keimrudiment (vgl. Handel et al., 2000; Benton et al., 2013).
Im Wildtyp migrieren nur die posterioren Serosazellen bei der Invagination (vgl. Benton et al., 2013). Durch mangelnde Etablierung von Zellpolarität im Knock-down von
Tc'mael könnten also die Migrationsbewegungen der posterioren Serosazellen gestört sein. Somit könnte es zunächst zur Störung bei der Bildung des Serosafensters
kommen (vgl. Abbildung 17, D-D'). Im weiteren Verlauf der Entwicklung von Tc'maelRNAi-Embryonen könnten dann diese Defekte oder unabhängige Defekte bei der
Migration der Serosazellen (z.B. durch unregelmäßige Verteilung) zu dem verfrühten
Aufreißen der extraembryonalen Membran an der falschen Stelle führen (vgl. Abbildung 15, K-L).
Vor allem auch Zell-Adhäsionsproteine sind mit dem Zytoskelett, welches durch das
MTOC organisiert wird, verankert (z.B. Cadherine, vgl. Angst et al., 2001). Somit
könnten Störungen des MTOC durch den Knock-down von Tc'mael alternativ auch
zu Defekten beim Zell-Zell-Kontakt der Serosazellen führen. Als Resultat könnte die
extraembryonale Membran frühzeitig aufreißen.
Für den Knock-down von Tc'tsl ist kein verfrühtes Aufreißen der Serosa im Keimrudimentstadium bekannt (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Die Verkleinerung
der extraembryonalen Membran ist in Tc'tsl-RNAi-Embryonen sogar stärker als die in
Tc'mael-RNAi-Embryonen (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005; Abbildung 17, BB'). Wenn also das verfrühte Serosa-Rupturing die Folge der Verkleinerung der Serosa im differenzierten Blastoderdem ist, muss dieser Tc'mael-RNAi-Phänotyp anders zu Stande kommen als durch dieselben Effekte die zu einer Verkleinerung der
Serosa in Tc'tsl-RNAi-Embryonen führt.
119
4. Diskussion
Eine Möglichkeit hierfür wäre, dass die initiale Verkleinerung der Serosa nicht im Zusammenhang mit dem verfrühten Aufreißen steht. Tc'mael könnte neben der Rolle in
der Anlage der extraembryonalen Membran auch noch eine Funktion bei der Migration der Serosazellen während der Invagination haben. Diese spätere Funktion von
Tc'maelstrom könnte unabhängig vom Torso-Signal sein und deswegen würde auch
in
Tc'tsl-RNAi-Embryonen
kein verfrühtes Serosa-Rupturing stattfinden
(vgl.
Schoppmeier und Schröder, 2005). Bei dieser Annahme würden nur die eventuelle
maternale Funktion und die Funktion im Blastoderm von Tc'maelstrom durch das
Torso-Signal bedingt sein.
4.1.4 Evertierte Larven und Defekte beim Rückenschluss sind auf die späteren Defekte der Serosa zurückzuführen
Der Knock-down von Tc'maelstrom führt auch zu evertierten Larven (vgl. Abbildung
14; E). Ein solcher "inside-out"-Phänotyp wurde in Tribolium bisher nur für vermutete
Defekte bei der Interaktion des Amnions mit der Serosa kurz vor dem Rückenschluss
beschrieben (vgl. van der Zee et al., 2005; Panfilio et al., 2008; Hilbrant et al., 2016).
Durch das gezeigte, verfrühte Aufreißen der Serosa könnte das Amnionepithel kurz
vor dem Rückenschluss nicht mehr mit der Serosa fusionieren oder das Amnion
nach dem Rupture nicht mehr nach posterior ziehen (vgl. van der Zee et al., 2005;
Hilbrant et al., 2016). Somit könnte es in Tc'mael-RNAi-Embryonen zum ventralen
Umstülpen der Keimstreifen kommen, analog zum Knock-down von Tc'zen-2 (vgl.
van der Zee et al., 2005). Allerdings wäre es möglich, dass die evertierten Larven,
die im Knock-down von Tc'mael auftreten (vgl. Abbildung 14, E) eine andere Ursache
als Defekte der extraembryonalen Membranen haben.
Ein kleiner Prozentsatz der Larven des Knock-downs von Tc'mael (vgl. Abbildung 13)
zeigt Defekte beim Rückenschluss (zusätzlich zu anderen RNAi-Phänotypen, vgl.
Kapitel 3.6.2 und Abbildung 14; F). Auch für den Rückenschluss spielen die extraembryonalen Membranen eine essentielle Rolle (van der Zee et al., 2005; Panfilio et
al., 2008; Panfilio et al., 2013; Hilbrant et al., 2016). So wurde z.B. gezeigt, dass sowohl Zytoskelettelemente der Serosa als auch des Amnions nach dem Aufreißen der
Serosa notwendig sind, damit die lateralen Zellepithele des Embryos an der Mitte120
4. Diskussion
llinie fusionieren können (vgl. Panifilio et al., 2013; Hilbrant et al., 2016). Durch das
verfrühte Aufreißen an der falschen Stelle (vgl. Abbildung 15, K-L und Hilbrant et al.,
2016) kommt es in Tc'mael-RNAi-Embryonen wahrscheinlich zu evertierten Larven
(siehe oben). Dennoch könnte in schwächeren RNAi-Phänotypen das verfrühte Serosa-Rupturing ausbleiben und die Abwesenheit der Serosa oder auch Defekte des
Zytoskeletts könnten zu einem unvollständigen Rückenschluss führen.
Die genauen Ursachen für die Defekte beim Rückenschluss und die Evertierung der
Larven durch den Knock-down von Tc'maelstrom bleiben jedoch unklar.
4.1.5 Tc'maelstrom hat eine essentielle Funktion bei der Etablierung der Wachstumszone
Neben den Funktionen in der Entwicklung des anterioren Bereichs der Tribolium
Embryonen, zeigen die Experimente auch eine posteriore Rolle für Tc'maelstrom. Die
Tc'mael-RNAi-Larven zeigen in großer Anzahl (ca. 40%, vgl. Abbildung 13) posteriorer Segmentierungsabbrüche, die in den stärksten RNAi-Phänotypen alle Segmente
betreffen, die aus der Wachstumszone heraus gebildet werden (vgl. Abbildung 14, BD und F). Bereits im undifferenzierten Blastoderm zeigt sich die Expansion der
Tc'WntD/8-Expression in Tc'mael-RNAi-Embryonen und damit ein Defekt des posterioren Wnt-Signals (vgl. Abbildung 18, B-B'). Im differenzierten Blastoderm kommt es
durch den Knock-down von Tc'mael zu Defekten bei der Ausbildung der posterior Pit
(vgl. Abbildung 15, D). Die Analyse von Keimrudimentstadien der Tc'mael-RNAiEmbryonen zeigt, dass keine weiteren Segmente aus der Wachstumszone in einem
sekundären Wachstumsprozess gebildet werden (vgl. Abbildung 15, D-E).
Nachdem sich anterior die Serosa gebildet hat, flachen im Tribolium Wildtyp die posterioren Zellen apikal ab. Die gebildete Abflachung stülpt ein und bildet die posterior
Pit oder Primitivgrube. In dieser Stelle findet im Anschluss die Gastrulation statt und
die ersten Zellen der posterior Pit, die bei der Invaginationsbewegung nach innen
wandern, bilden später die Wachstumszone (Handel et al., 2000; Benton et al.,
2013).
121
4. Diskussion
Die Polarität des Mikrotubuliapparates von maelstrom-Mutanten ist stark gestört
(Clegg et al., 2001; Sato et al., 2011; Sato und Siomi, 2015). Diese Polarität ist in
Drosophila für die Etablierung der basal-apikalen Asymmetrie von Oozyten und
epithelialen Zellen essentiell (vgl. St Johnson und Ahnringer, 2010). Eine solche
Asymmetrie ist in Tribolium wichtig, damit sich die posterior Pit, der Ort der späteren
Invagination, bildet (vgl. Benton et al., 2013). Die ersten Zellen, die im Bereich der
posterior Pit einwandern, bilden später die Wachstumszone (vgl. Handel et al.,
2000). In Tc'mael-RNAi-Embryonen kommt es zu Störungen und Verzögerungen der
Ausbildung der posterior Pit (vgl. Abbildung 15, D). Die mangelhafte Ausbildung der
apikal-basalen Polarität der Zellen, die nach der Invagination die Wachstumszone
ausmachen, könnte zu Defekten bei der Migrationsbewegung dieser Zellen führen
(Humbert et al., 2008; ST Johnson und Ahringer, 2010). Somit würde die Etablierung
der Wachstumszone gestört sein. Diese Defekte könnten für die für den Knock-down
von Tc'mael gezeigten Segmentierungsabbrüche verantwortlich sein (vgl. Abbildung
14, C-D und F; Abbildung 15, K-L und Abbildung 17, D und E). Folglich würde das
Torso-Signal über Tc'maelstrom für die basal-apikale Asymmetrie für die Invagination
der Zellen, die später die Wachstumszone bilden, verantwortlich sein. Die gezeigten
Defekte bei der Etablierung der Wachstumszone von Tc'mael-RNAi-Embryonen wären also auf Defekte der Zellpolarität zurückzuführen, die in Migrationsdefekten resultieren. Also könnten die posterioren Defekte des Knock-downs von Tc'maelstrom in
Störungen der Morphogenese und nicht der Musterbildung resultieren.
Allerdings könnten die Segmentierungsabbrüche in Tc'mael-RNAi-Embryonen auch
durch Störungen bei der posterioren Anlagenspezifikation bedingt sein. Für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Wachstumszone in Tribolium ist das Wnt-Signal
essentiell (Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al. 2008b). Die Experimente von
Bolognesi et al. (2008b) zeigen, dass von den Wnt-Genen nur der Knock-down
Tc'WntD/8 zu Segmentierungsabbrüchen führt. Ein simultaner Knock-down von
Tc'wg (Tc'Wnt1) verstärkt zwar den Phänotyp, doch Tc'wg- RNAi-Embryonen selbst
zeigen keine Deletion von Segmenten, die aus der Wachstumszone gebildet werden.
Von allen Wnt-Genen, die in Tribolium vorkommen, führt nur der Knock-down von
Tc'WntD/8 zu Segmentierungsabbrüchen (Bolognesi et al., 2008b).
In Tc'mael-RNAi-Embryonen ist die posteriore Expressionsdomäne von Tc'wg nicht
verändert (vgl. Abbildung 16, B-C). Tc'mael-RNAi-Embryonen zeigen eine Expansion
122
4. Diskussion
der Tc'WntD/8-Expression (vgl. Abbildung 18, Abbildungen B-B'). Diese Vergrößerung ähnelt der Situation des Knock-downs von Tc'cic (vgl. Pridöhl et al., eingereicht,
siehe Anhang). Da die Segmentierungsabbrüche nicht ausschließlich über Störungen
des Wnt-Signalwegs erklärt werden können, kann angenommen werden, dass die
posteriore Funktion von Tc'mael bei der Bildung der Wachstumszone nicht ausschließlich durch das Wnt-Signal bedingt ist oder dass Tc'mael noch weitere Funktionen in der posterioren Musterbildung besitzt.
Die anterior-posteriore Spezifikation in Drosophila beginnt bereits in der Oogenese
über die Lokalisation maternaler Faktoren (Nüsslein-Volhard und Wieschaus, 1980;
Schüppach und Wieschaus, 1986). In Tribolium sind bisher vor allem anteriore maternale Musterbildungsfaktoren beschrieben (vgl. Bucher et al., 2005; Fu et al.,
2012). Analog zur anterioren Lokalisation von mRNAs könnten dennoch über die Polarisierung des Mikrotubuliapparates durch Tc'maelstrom auch posteriore Faktoren in
der Oozyte lokalisiert werden. In mael Mutanten von Drosophila wird beispielsweise
osk nicht mehr posterior lokalisiert (Clegg et al., 1997). Bisher sind allerdings nur für
Insekten mit Langkeimentwicklungsmodus Drosophila, und die Wespe Nasonia vitripennis sowohl ein anteriores als auch ein posteriores Organisationszentrum beschrieben (Rosenberg et al., 2009). Zwar wurden bisher in Tribolium keine Faktoren
identifiziert, die maternalen, posterior lokalisiert werden (vgl. Copf et al., 2004;
Schmitt-Engel et al., 2012), aber die maternale Lokalisation von Tc'axin (und das davon downstream fungierende pangolin) ist für die anteriore Musterbildung essentiell
(Fu et al., 2012).
Also wäre es möglich, dass Tc'mael bisher unbekannte maternale Faktoren posterior
lokalisiert, die dann im weiteren Verlauf der Entwicklung durch posteriore Musterbildung für die Etablierung der Wachstumszone verantwortlich sind. Diese Möglichkeit
beschreibt eine Alternative für die Funktion von Tc'mael und könnte ebenfalls erklären wie die Segmentierungsabbrüche in Tc'mael-RNAi-Embryonen zu Stande kommen könnten. Allerdings könnte die posteriore Segmentierung auch über die Aktivierung von Musterbildungsfaktoren wie z.B. das Wnt-Signal (vgl. Bolognesi et al.,
2008a, Bolognesi et al., 2008b; Beermann et al., 2011) durch das terminale System
(vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005; Bolognesi et al., 2008b) realisiert werden.
Somit würden keine weiteren maternal posterior lokalisierten Faktoren für die frühe
Embryonalentwicklung benötigt werden. Außerdem ist Tc'mael maternal nicht poste123
4. Diskussion
rior exprimiert (vgl. Abbildung 12, Abbildungen A-A'), was ebenfalls gegen dessen
Funktion in der Etablierung eines posterioren Organisationszentrums spricht. Die
posterioren Segmentierungsabbrüche in Tc'mael-RNAi-Embryonen sind also wahrscheinlicher auf Defekte in der Polarisierung und daraus resultierenden Migrationsdefekten terminaler Zellen zurückzuführen, die später die Wachstumszone bilden.
4.1.6 Tc'maelstrom bedingt als Zielgen des terminalen Systems anteriore und posteriore Morphogenese
Die Genexpressionsanalyse die dieser Dissertation zu Grunde liegt (vgl. Kapitel 3.1)
zeigt differentielle, relative Expression von Tc'mael in der Repression von Zielgenen
des terminalen Systems (Tc'tsl-RNAi) und der Derepression von Zielgenen des terminalen Systems (Tc'cic-RNAi). (vgl. Tabelle 4 im Anhang). Diese unterschiedliche
Regulation in der Expression von Tc'mael ist das erste Indiz dafür, dass es sich bei
Tc'mael um ein direktes oder indirektes Zielgen des terminalen Systems handelt.
Genau wie für ein Zielgen erwartet, ist die Expression im Knock-down des TorsoSignals (fast) vollständig abwesend, während der Knock-down des Repressors
(Tc'cic) zur Erhöhung der Expression führt. Die Analyse der Expression von Tc'mael
in Tc'tsl-RNAi- und Tc'cic-RNAi-Embryonen mittels in-situ Hybridiserung unterstützt
diese Aussage (vgl. Abbildung 19, B-C).
Tc'maelstrom ist maternal anterior lokalisiert (vgl. Abbildung 12, A und A'). Es konnte
bereits gezeigt werden, dass die maternale, anteriore Lokalisation von mRNAs einen
Einfluss auf die anteriore Musterbildung und somit auf die AP-Achsenbildung haben
kann (vgl. Fu et al., 2012). Somit könnte auch Tc'mael als Zielgen des terminalen
Systems eine Rolle bei der Entwicklung anteriorer Strukturen haben. Auch die Expression von Tc'mael in späteren Entwicklungsstadien spricht dafür, dass
Tc'maelstrom ein Zielgen des terminalen Systems ist, da sie sich mit der posterioren
Expression bekannter Zielgene und der Aktivität des Torso-Signalwegs deckt (vgl.
Jiménez et al., 2000; Schoppmeier und Schröder, 2005; Abbildung 12; B-C).
Der Knock-down von Tc'maelstrom zeigt anterior eine Verkleinerung der extraembryonalen Serosa im differenzierten Blastoderm (vgl. Abbildung 17, B-B''). Außerdem
sind in Tc'mael-RNAi-Embryonen alle Segmente deletiert, die aus der Wachstums124
4. Diskussion
zone heraus gebildet werden (vgl. Abbildung 15, D-E). Diese Aspekte des Tc'maelRNAi-Phänotypen spiegeln Aspekte des Knock-downs von Tc'tsl wieder (Schoppmeier und Schröder, 2005) und sprechen somit dafür, dass Tc'maelstrom ein direktes
oder indirektes Zielgen des terminalen Systems ist.
Wie in Kapiteln 4.1.1 und 4.1.5
diskutiert, sind die blastodermalen Defekte in
Tc'mael-RNAi-Embryonen wahrscheinlich auf eine Funktion von Tc'maelstrom in
Morphogenese und Zellmigration zurückzuführen. Wenn also Tc'mael ein Zielgen
des terminalen Systems ist, würde das Torso-Signal seine Funktion in der Embryonalentwicklung nicht nur über anteriore und posteriore Spezifizierung realisieren,
sondern auch über die Kontrolle der Differenzierung von bestimmten terminalgelegenen Zellen. Diese Rolle des terminalen Systems in der anterioren und posterioren Morphogenese könnte unter anderem über Tc'maelstrom verwirklicht werden.
Die Verkleinerung der Serosa sowie die Segmentierungsabbrüche in Tc'tsl-RNAiEmbryonen (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005) würden dann über Defekte bei
der Etablierung der Zellpolarität und in Konsequenz über Störung der Differenzierung
oder Zellmigration zustande kommen.
In Drosophila wird die terminale Spezifikation durch die beiden Gap-Gene tailless
und huckebein gewährleistet, die vom Torso-Signal aktiviert werden (vgl. Brönner
und Jäckle, 1991; Pignoni et al., 1992). Die Unterscheidung zwischen Acron und Telson wird durch die zusätzliche Integration des anterioren bzw. posterioren, maternalen Systems realisiert (vgl. Nüsslein-Volhard, 1991; Li et al., 2011). Somit übernimmt
das terminale System in Drosophila vor allem eine Funktion in der Musterbildung im
Blastoderm.
Die Funktion des huckebein-Orthologs in Tribolium ist bisher nicht untersucht. Tribolium tailless ist wahrscheinlich ebenfalls ein Zielgen des terminalen Systems (vgl.
Schröder et al., 2000; Schoppmeier und Schröder, 2005). Tc'tll scheint jedoch keine
Rolle als Regulator von Segmentierungsgenen zu haben (vgl. Schröder et al., 2000).
Es wird somit angenommen, dass die ursprüngliche Funktion von tailless in Insekten
mit Kurzkeimentwicklungsmodus eher eine Rolle in der Differenzierung posteriorer
terminalen Zellen spielt, als in terminaler Musterbildung (Schröder et al., 2000).
Also wäre es möglich, dass das Torso-Signal die Entwicklung terminaler anteriorer
und posteriorer Strukturen über die Steuerung der Differenzierung und Migration ko125
4. Diskussion
ordiniert. Folglich würde die Bildung von Serosa und Wachstumszone nicht auf eine
Spezifizierungsfunktion des terminalen Systems zurückzuführen sein, sondern auf
dessen Kontrolle der Morphogenese anteriorer und posteriorer Zellen. In diesem
Szenario wäre Tc'maelstrom einer der Faktoren über den die Differenzierung der
terminalen Zellen gesteuert wird.
In Drosophila gibt es eine strikte Genhierarchiekaskade in der die maternalen Gene
(wie z.B. bicoid) die Gap-Gene aktivieren (vgl. Nüsslein-Volhard, 1991; Rivera-Pomar
und Jäckle, 1996). Die Analysen der Gap-Gen-Orthologe in Tribolium Tc'gt, Tc'hb,
Tc'kni und Tc'kr ergaben starke Unterschiede zu Expressions- und Regulationsdynamiken in Drosophila (vgl. Sommer und Tautz, 1993; Wolff et al., 1995; Bucher und
Klingler 2004; Cerny et al., 2005; Cerny et al., 2008). Generell stellt die Embryogenese von Drosophila als Beispiel für die Langkeiminsektenentwicklung eine sehr
spezialisierte Variante dar, bei der alle Segmente im Blastoderm gleichzeitig spezifiziert werden (vgl. Tautz et al., 1994; Davis und Patel, 2002; Liu und Kaufmann,
2005).
Die Kurzkeimentwicklung Triboliums spiegelt eine ursprünglichere Form der Embryonalentwicklung wieder als die Langkeimentwicklung Drosophilas (Tautz et al., 1994).
Die Funktion des terminalen Systems bei der Etablierung der Wachstumszone in Tribolium repräsentiert somit vermutlich ebenfalls eine anzestralere Funktion des TorsoSignals (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Wenn das terminale System ursprünglich die Entwicklung posteriorer und anteriorer Strukturen über die Morphogenese realisiert, wäre die Spezifikation der Termini durch Gap-Gene eine evolutionäre
Anpassung der Langkeiminsekten. Allerdings scheint die Bedeutung von tailless zwischen Insekten mit Langkeimentwicklung nicht konserviert zu sein (vgl. Pignoni et al.,
1992 und Lynch et al., 2006). Somit bleibt offen, wie repräsentativ die abgeleitete
Umsetzung des Torso-Signals über die Aktivierung von Gap-Genen in Drosophila ist.
Ob das terminale System allerdings die Bildung anteriorer und posteriorer Strukturen
alleine über die Morphogenese steuert, bleibt offen. Selbstverständlich könnte das
terminale System auch eine Musterbildungsfunktion haben. Diese Musterbildungsfunktion könnte zusammen mit der Morphogenesekontrolle des Torso-Signals notwendig sein, um die Bildung terminaler Strukturen zu realisieren. Es muss noch gezeigt werden, wie das Torso-Signal die Entwicklung anteriorer und posteriorer Strukturen in anderen Kurzkeiminsekten umsetzt.
126
4. Diskussion
4.2 Tc'CHOp24 ist für die frühe Embryonalentwicklung essentiell
p24-Proteine sind in der Entwicklung von Drosophila essentiell (Saleem et al., 2012).
Generell
sind
Dm'p24-Proteine
bei
der
Etablierung
von
Morphogen-
Konzentrationsgradienten und vor allem der Sekretion von Wnt-Proteinen vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat beteiligt in dem sie wahrscheinlich als
Kargorezeptoren fungieren (Muniz et al., 2000; Bartscherer und Boutros, 2008; Port
et al., 2011; Büchling et al., 2011). Für Dm'Eclair und Dm'Baiser konnte gezeigt werden, dass diese p24-Proteine in der Embryogenese für Aktivität des maternal
exprimierten dpp-Rezeptors Thick veins (Tkv) notwendig sind und somit eine Funktion bei der Etablierung der dorso-ventralen Achse haben (Bartoszewski et al., 2004).
Dm'CHOp24 gehört zur β-Subfamilie der p24-Proteine (Carney und Bowen, 2004).
Die in Kapitel 3.7 dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Tc'CHOp24 einen
Einfluss auf die Tc'Dpp-Aktivität hat. Gleichzeitig führt der Knock-down des p24-Gens
zu frühembryonaler Letalität. Somit wird im Folgenden der Zusammenhang dieser
RNAi-Phänotypen diskutiert und erörtert, in wieweit diese durch das Torso-Signal
bedingt sein können.
4.2.1 Tc'CHOp24 moduliert die Tc'dpp-Aktivität
Der Knock-down von Tc'CHOp24 führt im differenzierten Blastoderm anterior zu einer Verkleinerung der extraembryonalen Serosa. Die Grenze zwischen embryonalen
und extraembryonalen Gewebe ist rotationssymmetrisch im Vergleich zum Wildtyp
(vgl. Abbildung 23, B-B''''; Abbildung 24, D; Abbildung 25, D-D''). Dieser Aspekt des
Tc'CHOp24-RNAi-Phänotyps ähnelt stark dem Knock-down von Tc'dpp. In Tc'dppRNAi-Embryonen ist die Serosa ebenfalls stark verkleinert und die Grenze zwischen
embryonalem und extraembryonalem Gewebe (SEG) ist durch die Ventralisierung
des Embryos begradigt und damit rotationssymmetrisch (van der Zee et al., 2006).
Um zu zeigen, dass Tc'CHOp24 wirklich einen Einfluss auf den Tc'Dpp-Signalweg
hat, wurden die Tc'Dpp-Aktivität und Zielgene von Tc'Dpp analysiert. Wie in Kapitel
3.7.5 gezeigt ist die Aktivität von Tc'Dpp, dargestellt durch Tc'pMAD (vgl. Dorfmann
127
4. Diskussion
und Shilo, 2001), im Knock-down von Tc'CHOp24 deutlich reduziert (Abbildung 27,
B). Die Expression der Zielgene Tc'doc und Tc'pnr (vgl. van der Zee et al., 2006) ist
ebenfalls stark reduziert (vgl. Abbildung 28, B-B und D-D'; Abbildung 29, B-B'). Also
scheint Tc'CHOp24 tatsächlich die Tc'Dpp-Aktivität zu modulieren.
Nach dem Knock-down von Tc'dpp kann allerdings kein Tc'pMAD mehr detektiert
werden. Auch die Expressionen von Tc'doc und Tc'pnr sind in Tc'dpp-RNAiEmbryonen vollständig abwesend (vgl. van der Zee et al., 2006). Im Vergleich dazu
zeigen Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen also schwächere Phänotypen, da noch ein
Überrest von Tc'Dpp-Aktivität vorhanden ist und die Zielgenexpressionen auch nicht
vollständig abwesend sind. Folglich kann also angenommen werden, dass CHOp24
zwar in Tribolium die Tc'dpp-Aktivität moduliert, diese allerdings nicht alleine bedingt.
Die Ursache hierfür mag darin liegen, wie Tc'CHOp24 den Einfluss auf das Tc'DppSignal ausübt.
Es wäre denkbar, dass die Modulation von Tc'CHOp24 der Tc'Dpp-Aktivität durch
eine Rolle in der Sekretion von Proteinen, die am Dpp-Signalweg beteiligt sind, erfolgt. Alle bisher beschriebenen p24-Proteine spielen eine Rolle in der Sekretion von
Proteinen (vgl. Bartoszewski et al., 2004; Bartscherer und Boutros, 2008; Port et al.,
2011; Büchling et al., 2011). Für die Aktivität von Dpp sind weitere, sekretierte Proteine notwendig (Little und Mullins, 2006). In Drosophila wird beispielsweise auch die
Metalloprotease Tolloid (Tld), die den Dpp/Short-gastrulation-Komplex spaltet damit
Dpp an seine Rezeptoren binden kann, sekretiert (Parker et al., 2004; O'Connor et
al., 2006). Twisted-gastrulation (Tsg), ein Stabilisator von Dpp (vgl. Wang und Ferguson, 2005), sowie der Dpp-Rezeptor Tkv, werden ebenfalls sekretiert (vgl. Nellen
et al., 1994; Little und Mullins., 2006). Die Sekretierung von Proteinen ist also essentiell für die Regulation der Dpp-Aktivität.
In Tribolium werden Tc'Dpp, Tc'Tld und Tc'Tsg für ein funktionelles Dpp-Signal wahrscheinlich ebenso wie in Drosophila sekretiert (vgl. van der Zee et al., 2006; Nunes
da Fonseca et al., 2010). Somit könnte Tc'CHOp24 eine Funktion in der Sekretion
von einer oder mehreren Komponenten des Tc'Dpp-Signalwegs haben und die
Tc'Dpp-Aktivität auch indirekt modulieren. Während in Tc'tsg-RNAi-Embryonen keine
Tc'Dpp-Aktivität mehr detektiert werden kann, ist diese in Tc'tld-RNAi-Embryonen
zwar stark reduziert aber noch vorhanden. Die Expression des Zielgens des DppSignalwegs Tc'doc ist durch den Knock-down von Tc'tld ebenfalls nur reduziert, wo128
4. Diskussion
hingegen Tc'doc durch den Knock-down von Tc'tsg gar nicht mehr exprimiert ist (vgl.
Nunes da Fonseca et al., 2010). Die Situation in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen ähnelt also eher dem schwächeren Tc'tld-RNAi-Phänotyp.
Der Knock-down von Tc'tld und Tc'tsg führt, wie bei Tc'dpp-RNAi und Tc'CHOp24RNAi, zu einer verkleinerten Serosa mit gerader SEG. Im Vergleich zu Tc'dpp-,
Tc'tsg, und Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen bleibt in Tc'tld-RNAi-Embryonen noch ein
Rest dorsale Serosa übrig und zeigt somit einen leicht schwächeren RNAi-Phänotyp
(vgl. van der Zee et al., 2006; Nunes da Fonseca et al., 2010; vgl. Abbildung 28, DD''). Demnach spiegeln auch andere sekretierte Faktoren des Dpp-Signalwegs den
Serosaphänotyp in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen wieder. Also könnte die Modulation
von Tc'CHOp24 auf die Dpp-Aktivität durch Sekretionsstörungen von Tc'tsg oder
Tc'tld zurückzuführen sein.
Neben den Serosaphänotypen zeigen sich in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen auch
massive Störungen der Invagination (vgl. Abbildung 24, E-F und J-L und P-R) die
letztendlich zum Tod der Embryonen und zur Degradation der Eier führen (Daten
nicht gezeigt). Im Wildtyp invaginiert das embryonale Gewebe posterior und die spätere Wachstumszone wird im Dotter versenkt (vgl. Handel et al., 2000; Benton et al.,
2013). Das Gewebe des Amnions faltet sich ventral über das embryonale Gewebe.
Der dorsale Teil der Serosa expandiert und umgibt schließlich das gesamte Ei mit
dem Embryo (Handel et al., 2000).
Der Knock-down von Tc'dpp, Tc'tsg und Tc'tld führt neben der anterioren Verkleinerung der Serosa ebenfalls zu starken Defekten der Invagination (vgl. van der Zee et
al., 2006; Nunes da Fonseca et al., 2010). Tc'tld-RNAi-Embryonen invaginieren als
symmetrische, ektodermale Schläuche. Im weiteren Verlauf der Gastrulation wird der
posteriore Teil dieses Schlauchs auf die ventrale Seite des Eis lokalisiert (Nunes da
Fonseca et al., 2010). Morphologisch ähnelt dieser Defekt des Knock-downs von
Tc'tld dem Invaginationsdefekt in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen (vgl. Abbildung 24,
P-R).
Der Knock-down von Tc'tsg führt zu massiven Defekten bei der Invagination und ähnelt somit stark dem Knock-down von Tc'dpp (vgl. van der Zee et al., 2006; Nunes da
Fonseca et al., 2010). Hier invaginiert der ektodermale Schlauch am posterioren Pol
des Eis. Die Gastrulationsbewegung ist DV-symmetrisch und am Ende der Invagina129
4. Diskussion
tion kommt die Wachstumszone anterior zu liegen, während die Kopfsegmente des
Embryos posterior im Ei liegen (vgl. Nunes da Fonseca et al., 2010). Diese Art von
Invaginationsdefekt mit Invertierung der Lage des Keimrudiments konnte in
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen nicht beobachtet werden.
Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass der schwächeren Tc'tld-RNAiPhänotyp den Phänotyp in Tc'CHOp24-RNAi-Embroynen am ehesten wiederspiegelt.
Somit könnte die Modulation von Tc'Dpp durch Tc'CHOp24 über einen Einfluss auf
Tc'tld entstehen. Alternativ könnten die im Vergleich zum Knock-down von Tc'dpp
schwächeren Phänotypen in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen auch anders zu Stande
kommen. Drosophila p24-Proteine sind in ihrer Funktion teilweise redundant (vgl.
Bartoszewski et al., 2004; Büchling et al., 2011; Port et al., 2011). Somit wäre es
möglich, dass auch Tribolium CHOp24 ebenfalls ein redundanter Kargorezeptor ist.
Die vergleichsweise schwächeren RNAi-Phänotypen könnten folglich dadurch erklärt
werden, dass weitere p24-Proteine neben Tc'CHOp24 für die Sekretion von Komponenten des Tc'Dpp-Signalwegs verantwortlich sind. Dann könnten auch mehrere sekretierte Komponenten gleichzeitig betroffen sein. Tc'CHOp24 könnte somit eine redundante Funktion mit anderen p24-Proteinen haben.
Beispiele für Homologe von p24-Proteinen in Tribolium sind Eclair (TC000379) und
Baiser (TC016304), die für die Dorsophila Tkv-Sekretion verantwortlich sind (vgl.
Bartoszewski et al., 2004; Kim et al., 2010). Die Untersuchung dieser und weiterer
p24-Homologe könnte zeigen, ob die schwächeren Tc'CHOp24-RNAi-Phänotypen
durch redundante Funktionen der p24-Proteine bei der Sekretion von Tc'DppSignalwegkomponenten zustande kommen. Wie genau der Einfluss von Tc'CHOp24
auf die Tc'Dpp-Aktivität stattfindet bleibt jedoch vorerst unklar.
4.2.2 Tc'CHOp24-Invaginations-Phänotypen entstehen nicht durch Defekte bei der
Wnt-Sekretion
Die Drosophila p24-Proteine sind auch an der Sekretion von Wnt-Proteinen beteiligt
(Bartscherer und Boutros, 2008; Port et al., 2011; Büchling et al., 2011). Somit wäre
es möglich, dass die Phänotypen im Knock-down von Tc'CHOp24 durch Störungen
des Wnt-Signalwegs zustande kommen.
130
4. Diskussion
Die Aktvierung von Wnt-Genen muss in Tribolium für die korrekte Entwicklung anterior inhibiert werden. Diese frühembryonale Hemmung wird über Tc'axin gewährleistet (vgl. Fu et al., 2012). Der Knock-down von Tc'axin zeigt eine verkleinerte Serosa
mit begradigter SEG, die durchaus den Aspekt des Serosadefektes in Tc'CHOp24RNAi-Embryonen wiedersiegelt (vgl. Fu et al., 2012 und Abbildung 23, B-B''). Allerdings steht die Funktion von Tc'axin wahrscheinlich nicht in Zusammenhang mit der
von Tc'CHOp24, da Axin nicht sekretiert wird (Zeng et al., 1997). Außerdem sind für
den Knock-down von Tc'axin keine Invaginationsdefekte beschrieben (vgl. Fu et al.,
2012) und somit kann ausgeschlossen werden, dass es zwischen den Tc'CHOP24RNAi-Phänotypen und Tc'axin eine Verbindung gibt.
Von allen Wnt-Genen in Tribolium führen nur der Knock-down von Tc'WntD/8 und
Tc'wg zu embryonalen Phänotypen. Es sind bisher keine Defekte der Serosa für den
Knock-down von Wnt-Genen beschrieben, nur Segmentierungsabbrüche und Segmentierungsdefekte (vgl. Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b). Nur der
Knock-down von Tc'WntD/8 führt zu Segmentierungsabbrüchen. Die Häufigkeit dieser Segmentierungsabbrüche in Tc'WntD/8-RNAi-Embryonen ist allerdings gering
und wird durch den simultanten Knock-down von Tc'wg etwas erhöht (Bolognesi et
al., 2008b). Die RNAi-Experimente mit Tc'CHOp24 zeigen, dass die Larven und die
embryonalen Stadien nach der Invagination nur dem stärksten RNAi-Effekt entgangen sind (vgl. Kapitel 3.7.2 - 3.7.4). Selbst für den simultanen Knock-down von Tc'wg
und Tc'WntD/8 sind solche starken und frühen Phänotypen nicht beschrieben (vgl.
Bolognesi et al., 2008b). Um zu zeigen, dass Tc'CHOp24 tatsächlich nicht an der
Sekretion von Wnt-Proteinen in Tribolium beteiligt ist, müssten allerdings die Lokalisierungen der Wnt-Proteine untersucht werden. Der massive Invaginationsdefekt in
CHOp24-RNAi-Embryonen (vgl. Abbildung 24, E-F und P-R) kommt jedoch wohl unabhängig von Wnt-Sekretion zustande.
4.2.3 Die Bedeutung von Tc'CHOp24 als Zielgen des terminalen Systems
Die differenzielle Genexpressionsanalyse, die dieser Dissertation zu Grunde liegt
zeigt, dass Tc'CHOp24 wahrscheinlich ein Zielgen des terminalen Systems ist (vgl.
Kapitel 3.5 und Tabelle 4 im Anhang). Dafür sprechen auch dessen Expression im
131
4. Diskussion
Wildtyp (vgl. Abbildung 20, A-D) und die Reduktion der Tc'CHOp24-Expression in
Tc'tsl-RNAi-Embryonen (vgl. Abbildung 31, B-B' und D-D').
In Tc'cic-RNAi-Embryonen konnte mittels in-situ-Hybridisierung nicht die erwartete
Vergrößerung der Expressionsdomänen von Tc'CHOp24 festgestellt werden (Daten
nicht gezeigt), obwohl die relative Expression im Knock-down von Tc'cic eindeutig
erhöht ist (siehe oben). Möglicherweise ist die Methode der in-situ-Hybridisierung
nicht sensitiv genug um ein verstärktes Expressionsniveau (das sich ja nicht unbedingt in einer Expansion der Expressionsdomäne zeigen muss) zu erkennen.
Die Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen weisen Phänotypen auf, die nicht für die Repression oder Derepression des terminalen Systems beschrieben sind (vgl. Schoppmeier
und Schröder, 2005; Pridöhl et al., eingereicht). Somit stellt sich die Frage, wie der
Knock-down eines Zielgens des Torso-Signalwegs zu solchen RNAi-Phänotypen
führt.
In Tc'tsl- und Tc'tor-RNAi-Embryonen ist die Serosa verkleinert, die SEG bleibt
schräg. Da in der Reprimierung des Torso-Signals nur noch der dorsale Teil der Serosa vorhanden ist, scheint das terminale System vor allem für die Ausbildung des
anterioren Teils der Serosa verantwortlich zu sein (vgl. Schoppmeier und Schröder,
2005). Der Knock-down von Tc'cic führt zur massiven Expansion der Serosa, wobei
auch hier die SEG schräg bleibt (vgl. Pridöhl et al., eingereicht). Somit kann angenommen werden, dass das terminale System für die Größe der Serosa verantwortlich ist. Tc'zen-1 ist bereits im undifferenzierten Blastoderm anterior exprimiert und
spezifiziert die Serosa (vgl. Falciani et al., 1996; van der Zee et al., 2005). Demnach
wäre es möglich dass die AP-Spezifikation der Serosa in einem frühen, ersten Schritt
durch einen Einfluss des Torso-Signals auf Tc'zen-1 zustande kommt. Auf die korrekte Ausbildung der SEG scheint das Torso-Signal selbst somit keinen Einfluss zu haben.
Im Vergleich dazu führt der Knock-down von Tc'dpp zum Verlust der dorsalen Serosa, durch die Ventralisierung des Embryos. Die SEG wird dadurch rotationssymmetrisch (vgl. van der Zee et al., 2006; Abbildung 32; A). Der Knock-down des Tribolium
chordin-Orthologs Tc'sog, ein Antagonist des Dpp-Signals (Fracois et al., 1994; Biehr
et al., 1996), führt zur Derepression der Tc'Dpp-Aktivität und zu einer starken Vergrößerung der Serosa (van der Zee et al., 2006; van der Zee et al., 2008). Hierbei ist
132
4. Diskussion
die SEG ebenfalls rotationssymmetrisch (vgl. Abbildung 32, A). Somit ist auch das
Tc'Dpp-Signal eine wichtige Komponente bei der korrekten Formation der Serosa.
Über die Spezifikation der dorsalen Serosa scheint vor allem auch die korrekte SEG
ausgebildet zu werden. Da die initiale Anlage der anterioren Serosa durch das TorsoSignal keinen Einfluss auf die Formation der SEG zu haben scheint (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005; Pridöhl et al., eingereicht; Abbildung 32, Abbildung B),
kann angenommen werden, dass die Spezifikation der dorsalen Serosa erst in einem
späteren, zweiten Schritt erfolgt (vgl. Abbildung 32, Abbildung C). Hierfür spricht
auch, dass der Serosa-Spezifiaktionsfaktor Tc'zen-1 erst später im Bereich der dorsalen Serosa exprimiert ist (vgl. Falcinai et al., 1996; van der Zee et al., 2005). Folglich scheint die extraembryonale Serosa in zwei Schritten spezifiziert zu werden (vgl.
Abbildung 32, Abbildungen B und C).
Tc'dpp ist jedoch bereits im undifferenzierten Blastoderm besonders in einer anterioren Kappe exprimiert (vgl. van der Zee et al., 2006). Zu diesem Zeitpunkt beginnt
auch die Spezifikation der Serosa durch Tc'zen-1, das wie bereits beschrieben ebenfalls zunächst in Form einer anterioren Kappe exprimiert ist (Falciani et al., 1996; van
der Zee et al., 2005). Tc'dpp-RNAi-Embryonen zeigen möglicherweise auch eine
Verkleinerung der anterioren Serosa (vgl. van der Zee et al., 2006). Also wäre ein
Einfluss von Tc'Dpp auf die Spezifizierung der anterioren Serosa, beispielsweise
über die Regulation von Tc'zen-1 möglich. Tc'Dpp könnte also in Konsequenz auch
neben dem terminalen System an der Spezifikation der anterior-posterioren
Serosagröße beteiligt sein (vgl. Abbildung 32, Abbildungen B und C).
Dieser Effekt könnte durch die Modulation von Tc'Dpp-Aktivität durch Tc'CHOp24 zu
Stande kommen. Das Torso-Signal ist bereits in der späten Oogenese aktiv (vgl.
Schoppmeier und Schröder, 2005; Bäumer et al., 2011) und könnte über Tc'CHOp24
die Funktion der Tc'Dpp-Aktivität in der Etablierung der anterioren Serosa regulieren.
In diesem Modell wäre das terminale System zusammen mit dem Tc'Dpp-Signal in
einem ersten Schritt der Serosaspezifikation für die korrekte Anlage des anterioren
Teils der extraembryonalen Membran verantwortlich. Das Torso-Signal würde hier
via Tc'CHOp24 die notwendige Tc'Dpp-Aktivität regulieren (vgl. Abbildung 32, Abbildung B). Daraus ergäbe sich eine Integration der anterior-posterioren Achsenentwicklung mit der dorso-ventralen-Achsenentwicklung bei der Anlage der anterioren
Serosa. In einem zweiten Schritt würde die Interaktion von Tc'Dpp und Tc'Sog die
133
4. Diskussion
dorsale Serosa spezifizieren und im Zuge dieses Prozesses auch die korrekte SEG
ausbilden (vgl. Abbildung 32, Abbildung C).
Tc'CHOp24 moduliert wahrscheinlich nicht nur als Zielgen des terminalen Systems
die Tc'Dpp-Aktivität, sondern ist generell während der gesamten Embryonalentwicklung an dessen Sekretion beteiligt. Somit ähnelt der Tc'CHOp24-RNAi-Phänotyp in
jedem Entwicklungsstadium eher einem schwachen Tc'dpp-RNAi-Phänotypen. Das
würde erklären, warum der Knock-down von Tc'CHOp24 nicht die Repression des
Torso-Signals wiederspiegelt.
Zusammenfassend scheint die Bildung der extraembryonalen Serosa ein Zusammenspiel des terminalen Systems und des Tc'Dpp-Signals in zwei Schritten zu sein.
In Konsequenz wäre eine Integration beider Systeme und damit eine Integration der
AP- und DV-Achsensysteme durchaus denkbar (vgl. Kapitel 4.2.).
134
4. Diskussion
135
4. Diskussion
Abbildung 32: Schematische Darstellung der AP- und DV-Spezifikation der Serosa.
(A) Schematische Darstellungen der Serosaphänotypen in den jeweiligen RNAiEmbryonen (modifiziert nach Schoppmeier und Schröder, 2005; van der Zee et al., 2006;
Pridöhl et al., eingereicht). (B) Schematische Darstellung der anterior-posterioren Spezifikation der Serosa, bei der die Torso-Aktivität direkt und die Dpp-Aktivität über das TorsoSignal und über CHOp24 die Größe der extraembryonalen Membran festlegen. (C) Schematische Darstellung der DV-Spezifikation der Serosa über die Etablierung der dorsalen
Serosa durch die Dpp-Aktivität dorsal und das antagonistisch wirkende Sog-Protein auf der
ventralen Seite. Durch die DV-Spezifikation der Serosa wird auch die Schräge der SEG
ausgebildet (modifiziert nach van der Zee et al., 2006).
AS: anteriore Serosa, DS: dorsale Serosa, SEG: Serosa-Embryo-Grenze
4.2.4 Integration der AP- und DV-Achse in Tribolium
Ein bereits bekanntes Beispiel für die Integration der anterior-posterioren und dorsoventralen Achsenbildung ist Tc'otd-1. Tc'othodenticle-1 spielt über die Etablierung
des anterioren Anlagenplans eine Rolle in der Tribolium AP-Musterbildung (vgl.
Schröder, 2003; Kotkamp et al., 2010). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die
Deletionen der gnathalen und thorakalen Segmente im Knock-down von Tc'otd-1 auf
eine Funktion des Gap-Genes in der dorso-ventralen Musterbildung zurückzuführen
sind. Tc'otd-1 reprimiert Tc'Dpp-Aktivität wahrscheinlich durch die Aktivierung des
Dpp-Antagonisten Tc'sog (vgl. van der Zee et al., 2006; Kotkamp et al., 2010). Da
der Kopf in Tribolium eine ventrale Anlage ist, und die Derepression der Tc'DppAktivität zur Dorsalisierung des Embryos führt, sind in Konsequenz die prägnathalen
und gnathalen Segmente in Tc'otd-1-RNAi-Embryonen deletiert (vgl. van der Zee et
al., 2006; Kotkamp et al., 2010). Neben Tc'otd-1 wäre es also möglich, dass auch
das terminale System, über die Regulation von Tc'Dpp-Aktivität einen Einfluss auf die
Etablierung der DV-Achse hätte. Somit könnte Tc'CHOp24 als Zielgen des TorsoSignals an der Sekretion von Faktoren des Tc'Dpp-Signals beteiligt sein und es gäbe
einen weiteren Faktor über den die AP- und DV-Achsensysteme in Tribolium integriert sein könnten.
In Drosophila ist capicua ein Faktor in der anterior-posterioren Achsenentwicklung
wie auch in der dorso-ventralen-Achsenetablierung. cic fungiert als Bestandteil eines
Proteinkomplexes als Repressor der Zielgene des terminalen Systems (vgl. Jiménez
et al., 2000; Astigarraga et al., 2007; Kapitel 1.5). Desweiteren konnte gezeigt wer136
4. Diskussion
den, dass cic eine Funktion in der DV-Achsenentwicklung durch die Dorsalvermittelte Reprimierung der Expression von zerknüllt hat (vgl. Jiménez et al., 2000;
Shin und Hong, 2014). Außerdem gibt es wahrscheinlich eine negative Regulierung
der Aktivierung von Zielgenen von bicoid durch cic im Kopfbereich von Drosophila
Embryonen für eine korrekte Etablierung der Expressionsdomänen (vgl. Löhr et al.,
2009). Folglich ist eine Komponente des terminalen Systems in Drosophila an unterschiedlichen Achsensystemen beteiligt, was wiederum für eine Integration dieser
Systeme spricht, die in Tribolium möglicherweise über Tc'CHOp24 gewährleistet
wird.
Demnach könnte auch Tribolium capicua eine Funktion in der DV-Achsenentwicklung
haben. Somit könnten die Phänotypen in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen möglicherweise unabhängig vom terminalen System entstehen. Bisher gibt es in Tribolium allerdings keine Daten, die darauf hindeuten, dass Tc'cic eine Funktion im DVAchsensystem hätte (vgl. Pridöhl et al., eingereicht). Demnach sind die Defekte des
Knock-downs von Tc'CHOp24 wahrscheinlich nicht auf eine Beteiligung von Tc'cic in
der DV-Achsenentwicklung zurückzuführen. Dennoch zeigt das Beispiel von capicua
in Drosophila wie unterschiedliche Achsensysteme über einzelne Faktoren verbunden sein können.
Der Knock-down von Tc'CHOp24 führt, neben den anterioren Serosadefekten, zu
starken Invaginationsdefekten, die zur Letalität führen (vgl. Abbildung 14, Abbildungen K-L und P-R). Im Vergleich dazu, invaginieren Tc'tsl-RNAi-Embryonen nicht.
Wahrscheinlich kommt es außerdem zu Störungen bei der Etablierung der Wachstumszone und somit werden keine Segmente in einem sekundären Wachstumsprozess gebildet (vgl. Schoppmeier und Schröder, 2005). Also spiegelt auch dieser
RNAi-Phänotyp von Tc'CHOp24 nicht die Situation der Repression des TorsoSignals wieder. Allerdings wäre es möglich, dass die Invaginationsdefekte, die für
den Knock-down von Tc'CHOp24 gezeigt werden konnten, in Tc'tsl-RNAi-Embryonen
nicht auftreten, da die Invagination ausbleibt. Die Störungen der Gastrulation in
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen könnten zeigen, was passieren würden, wenn Tc'tslRNAi-Embryonen dennoch invaginieren würden und somit einen schwächeren RNAiPhänotyp darstellen. Folglich könnten diese Gastrulationsdefekte trotzdem einen
Teilaspekt der Funktion des terminalen Systems bei der Embryonalentwicklung wiederspiegeln. Allerdings wäre es plausibler, dass die Invaginationsdefekte nicht auf
137
4. Diskussion
Defekte des Torso-Signals zurückzuführen sind und dass Tc'CHOp24 noch eine andere Rolle in der Embryonalentwicklung von Tribolium spielt, bzw. noch in anderen
Prozessen beteiligt ist. Somit wäre es auch möglich, dass die Invaginationsdefekte
im Knock-down von Tc'CHOp24 durch Defekte des Tc'Dpp-Signalwegs entstehen.
Demnach wäre es möglich, dass die massiven Störungen der Invagination in
Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen über eine Funktion von Tc'CHOp24 im Tc'DppSignalweg unabhängig vom terminalen System zu Stande kommen.
Zusammenfassend können sowohl der anteriore Serosaphänotyp als auch die posterioren Invaginationsstörungen, die in Tc'CHOp24-RNAi-Embryonen beobachtet werden können, über eine Funktion von Tc'CHOp24 in der Sekretion von Komponenten
des Tc'Dpp-Signalwegs erklärt werden. Dennoch scheint Tc'CHOp24 ein Zielgen des
terminalen Systems zu sein. In Tribolium wurde mit Tc'otd-1 bereits ein Faktor identifiziert, der das Zusammenspiel der AP- und DV-Achsensysteme zeigt (vgl. Kotkamp
et al., 2010). Tc'CHOp24 könnte also ein weiterer Faktor sein, über den die Achsen
in Tribolium integriert sind indem das Torso-Signal die Tc'Dpp-Aktivität zumindest bei
einzelnen Prozessen reguliert.
In Drosophila ist eine Integration der AP- und DV-Achse bisher nur über capicua beschrieben (vgl. Jiménez et al., 2000; Löhr et al., 2009; Shin und Hong, 2014). Capicua mit einer Funktion als Repressor in der anterior-posterioren und dorso-ventralen
Entwicklung könnte jedoch nur ein Überrest der bei basaleren Insekten möglicherweise stark integrierten Achsensysteme sein. Der Langkeimentwicklungsmodus von
Drosophila gilt im Vergleich zu dem Kurzkeimentwicklungsmodus Triboliums als stark
abgeleitet (Tautz et al., 1994). In Kurzkeiminsekten werden im Vergleich nur wenige
Segmente bereits im Blastodermstadium angelegt. Alle weiteren Segmente werden
sekundär aus einer Wachstumszone heraus gebildet. Die Spezifikation von AP- und
DV-Achse muss gleichzeitig während der Bildung dieser Segmente geschehen. Somit wäre eine feste Integration beider Achsensysteme für Kurzkeiminsekten im Vergleich zu Drosophila möglich.
Die Analyse von Tc'CHOp24 zeigt, dass es noch weitere Faktoren geben könnte, die
das Zusammenspiel der Achsensysteme in der Embryonalentwicklung vermitteln. Die
Ergebnisse dieser Arbeit legen also nahe, dass es bei Tribolium und damit vielleicht
auch für andere Kurzkeiminsekten, eine deutlich stärke Integration der Achsensysteme geben könnte als bei Drosophila. Möglicherweise können weitere Analysen zu138
4. Diskussion
sätzliche Faktoren identifizieren deren Funktion zeigt, dass in der anzestraleren Form
der Entwicklung die Achsensysteme stark integriert sind. Analysen der bereits bekannten Faktoren und neuer Faktoren in anderen Insekten mit Kurzkeimentwicklungsmodus müssten bestätigen, dass diese vermutete Integration nicht nur für Tribolium castaneum gilt.
4.3 Die differenzielle Genexpressionsanalyse vermittelt viele Zielgene
und bisher unbekannte Funktionen des terminalen Systems
Das terminale System in Tribolium castaneum ist notwendig für die Anlage der terminalen Strukturen. Somit ist das Torso-Signal essentiell für die korrekte Ausbildung
der anterioren, extraembryonalen Serosa und der posterioren Wachstumszone
(Schoppmeier und Schröder, 2005; vgl. Kapitel 1.5). Die bisher bekannten Zielgene
des terminalen Systems reichen nicht aus, um die Phänotypen des Knock-downs von
Tc'torso vollständig zu erklären (Casanova, 2005; Schoppmeier und Schröder, 2005;
Pridöhl et al., eingereicht). Ziel dieser Arbeit waren Identifikation und Analyse weiterer Zielgene des terminalen Systems. Im Folgenden wird nun diskutiert, ob die differentielle Genexpressionsanalyse sich zur Identifikation bisher unbekannter Zielgene
des terminalen Systems eignet. Außerdem wird diskutiert, welche Bedeutung die Ergebnisse dieser Arbeit für das Verständnis der frühen Embryonalentwicklung Triboliums haben.
4.3.1 Die differenzielle Genexpressionsanalyse zeigt viele potentielle Gene mit Funktion in der frühembryonalen Entwicklung von Tribolium
Zunächst stellt sich die Frage, ob der Vergleich von Expressionsniveaus in der Repression und Derepression des Torso-Signals wirklich zur Identifikation neuer Zielgene des terminalen Systems führen kann.
Bereits die Analyse der differenziellen Expression der Repression des Torso-Signals
(Tc'tsl-RNAi) und der Derepression des Torso-Signals (Tc'cic-RNAi) zeigten sich ins139
4. Diskussion
gesamt 2790 Gene, die Zielgene des Torso-Signals sein könnten (vgl. Tabelle 7 auf
der DVD im Anhang). Für Zielgene des terminalen Systems würde anteriore
und/oder posteriore Expression erwartet werden (vgl. Jiménez et al., 2000; Schoppmeier und Schröder, 2005). 76% aller Kandidatengene zeigen in mindestens einem
Stadium eine eben solche Expression (vgl. Abbildung 4 und Tabelle 4 im Anhang).
Die Aktivität des Gens kann sich zwar räumlich von der Expression unterscheiden,
dennoch legt die Expressionsanalyse des Mini-Screens nahe, dass es sich bei den
ausgewählten Kandidaten um Zielgene des terminalen Systems handeln könnte.
Auf larvaler Ebene spiegeln die Phänotypen des Knock-downs bei einer Mehrheit der
Kandidaten Aspekte des Knock-downs von Tc'tsl und Tc'cic (also der Repression und
Derepression des Torso-Signals) wieder. Somit unterstützen die Ergebnisse der larvalen Kutikulapräparate, dass es sich bei den ausgewählten "Mini-Screen"Kandidaten um viele Zielgene des terminalen Systems handeln könnte. Die deutlich
erhöhte Menge leerer Eihüllen bei den larvalen Kutikulapräparationen der meisten
Kandidaten weißen auf eine Funktion der Gene in der embryonalen Frühentwicklung
Triboliums hin (vgl. Kapitel 3.3.3). Dieses Ergebnis zeigt, dass die zeitliche Aktivität
der analysierten Kandidaten zu der Aktivität des terminalen Systems passt (vgl. Casanova und Struhl 1989; Schoppmeier und Schröder, 2005).
Die Analysen der embryonalen RNAi-Phänotypen zeigen ebenfalls potentielle Aspekte der Repression oder Derepression des Torso-Signals (vgl. Kapitel 3.3.3; Schoppmeier und Schröder, 2005; Pridöhl et al., eingereicht). Somit lassen die Ergebnisse
des "Mini-Screens" viele potentielle neue Zielgene des terminalen Systems erkennen. Also kann angenommen werden, dass sich die differenzielle Genexpressionsanalyse zur Identifikation von Zielgenen des terminalen Systems in Tribolium eignet.
Der Ansatz der Genexpressionsanalyse zeigt jedoch nicht, ob die identifizierten Gene wirklich direkte oder indirekte Zielgene des terminalen Systems sind.
4.3.2 Die Bedeutung des terminalen Systems in Kurzkeiminsekten
Im "Mini-Screen" wurde für sechs Kandidaten anteriore Expression gezeigt (vgl. Abbildung 4 und Tabelle 4 im Anhang). Diese Kandidaten zeigen auch auf larvaler und
embryonaler Ebene anteriore RNAi-Phänotypen. Die anterioren Anlagen in Drosophi140
4. Diskussion
la werden durch das Gegenspiel von bicoid und der Aktivität des Torso-Signals spezifiziert (Ronchi et al., 1993; Löhr et al., 2009). Da bicoid allerdings nur in höheren
Dipteren vorkommt (Stauber et al., 1999; Brown et al., 2001) bleibt bisher unbekannt,
wie die anteriore gegenüber der posterioren Funktion des terminalen Systems unterschieden wird. Die Lokalisierung maternaler, anteriorer Faktoren ist auch für Tribolium gezeigt (Tc'eagle und Tc'iroquois: Bucher et al., 2005; Tc'axin: Fu et al., 2012).
Diese oder bisher unbekannte Faktoren könnten die das anterioren Anlagen der APAchse spezifizieren. Das terminale System könnte über weitere Faktoren, wie möglicherweise die sechs identifizierten Kandidaten mit anteriorer Expression, weiter zur
anterioren Musterbildung beitragen. Somit könnte es also in Tribolium gar kein zentrales, anteriores Morphogen wie bicoid in Drosophila geben. Die frühembryonale anteriore Entwicklung könnte also über das Zusammenspiel von Zielgenen des terminalen Systems und anderen Faktoren wie u.a. Tc'axin gesteuert werden.
Die Analyse der bisher unbekannten Zielgene des terminalen Systems Tc'maelstrom
(vgl. Kapitel 3.6 und 4.1) und Tc'CHOp24 (vgl. Kapitel 3.7 und 4.2) erweitern nicht
nur die Bedeutung, die das terminale System in Tribolium haben könnte, sondern
zeigen auch bisher unbekannte Aspekte der Funktion und Umsetzung des TorsoSignals.
Ein Beispiel für die Integration der AP- und DV-Achsenetablierung in Tribolium ist
Tc'otd-1 (vgl. Kotkamp et al., 2010). Die Analyse von Tc'CHOp24 lässt ein weiteres
Gen erkennen, über das beide Achsen in der Entwicklung integriert sind (vgl. Kapitel
3.7 und 4.2) und zeigt eine potentielle weitere Funktion des terminalen Systems
durch die Modulation der Tc'Dpp-Aktivität auf. Also könnte das terminale System eine
wichtige Rolle bei der Integration der AP- und DV-Achse spielen und somit eine umfassendere Funktion im initialen Anlagenplan des Tribolium-Embryos als nur die
Spezifikation anteriorer und posteriorer Termini haben.
Die Analyse von Tc'maelstrom zeigt wiederum, dass die Umsetzung des TorsoSignals möglicherweise nicht (nur) durch frühembryonale Musterbildung, sondern
auch durch Steuerung der Morphogenese umgesetzt werden könnte (vgl. Kapitel 3.6
und 4.1). Die Implementierung des Torso-Signals über Gap-Gene wie in Drosophila
(vgl. Brönner und Jäckle, 1991; Pignoni et al., 1992) könnte einen Übergang in regulatorischen Interaktionen bei der Entwicklung von Langkeiminsekten darstellen. In
den basaleren Kurzkeiminsekten könnte das Torso-Signal möglichweise noch direkt
141
4. Diskussion
über die Steuerung der Morphogenese oder dessen Kombination mit Analgenspezifikation umgesetzt werden.
Die Beteiligung des Torso-Signals an der Morphogenese Triboliums könnte auch die
große Menge an identifizierten, potentiellen Zielgenen (2790) und deren Diversität
erklären (vgl. Tabelle 4 im Anhang). Morphogenetische Prozesse sind in der Entwicklung des Kurzkeiminsekt essentiell und reichen von der Differenzierung und Expansion der extraembryonalen Serosa bis zur Einwanderung posteriorer terminaler Zellen zur Bildung der Wachstumszone (vgl. Handel et al., 2000; Benton et al., 2013;
Kapitel 4.1.1 und 4.1.5). In diesen und weiteren morphogenetischen Vorgängen sind
eine Vielzahl unterschiedlicher Gene beteiligt. In Drosophila gehören hierzu u.a. Lokalisierungsfaktoren wie exuperantia (St Johnson et al. 1989; Theurkauf und
Hazelrigg, 1998), Polarisierungsfaktoren wie z.B. Fat und Dachsous (Brittle et al.,
2012), sowie viele weitere Klassen an Genen. Durch den Entwicklungsmodus Triboliums sind morphogenetische Vorgänge im Vergleich zu dem Langkeiminsekt Drosophila viel ausgeprägter und umfangreicher. Alleine die Formation der Wachstumszone und die sekundäre Formation weiterer Segmente sind Prozesse die in Drosophila
nicht vorkommen (vgl. Handel et al., 2000; Davis und Patel, 2002; Klingler, 2004).
Somit kann angenommen werden, dass in Tribolium eine Vielzahl von Genen an diesen Prozessen beteiligt ist. Durch den Einfluss des terminalen Systems auf morphogenetische Prozesse wären die Expressionen dieser Gene in der Repression und
Derepression des Torso-Signals gestört. Folglich zeigt die differentielle Genexpressionsanalyse die dieser Arbeit zu Grunde liegt auch die Missregulation dieser Gene
auf, ohne dass sie direkte oder indirekte Zielgene des terminalen Systems wären.
Die vielen potentiellen, identifizierten Zielgene des terminalen Systems, sowie die
Analyse von Tc'mael und Tc'CHOp24 zeigen die Komplexität des Torso-Signalwegs
in Tribolium. Somit legt diese Arbeit eine umfassendere Funktion des terminalen Systems in dem Kurzkeiminsekt Tribolium im Vergleich zum Langkeiminsekt Drosophila
nahe. Neben der möglichen Modulation der DV-Achsenbildung in Tribolium wäre es
auch möglich, dass die Umsetzung des Torso-Signalwegs in anzestraleren Entwicklungsmodi anders vonstatten geht als bei stärker abgeleiteten Langkeiminsekten.
Diese Umsetzung könnte nämlich über die Steuerung der Morphogenese anstatt
über die Spezifikation der Termini durch Gap-Gene geschehen. Dennoch bleibt zunächst offen, wie genau das Torso-Signal umgesetzt wird und über welche Zielgene.
142
4. Diskussion
Diese Fragestellung wird Gegenstand weiterer Forschung am terminalen System in
Tribolium sein.
Ob die aufgestellten Thesen und die postulierten, erweiterten Funktionen des TorsoSignalwegs für alle Kurzkeiminsekten zutreffen, muss selbstverständlich noch in zukünftigen Analysen gezeigt werden. Dennoch zeigt sich durch diese Arbeit wie wichtig die Analyse basalerer Insekten und der Vergleich unterschiedlicher Entwicklungsmodi
ist
zwischen
verschiedenen
Modellorganismen
ist.
143
Anhang
Anhang
Tabelle 4: Übersicht "Mini-Screen
Tc -Nummer
Drosophila
Homolog
TC002120
CycC
TC002852
Spt3
TC003946
TC004293
crol
CG5885
Expression (0-24h)
Larvale Phänotypen
Anteriore Expression in undifferenzierten
Blastodermen und später in der Serosa; nach
Invagination Expressionsdomänen in
keine Ablage (Starved
Kopfsegmenten. Posteriore Expression in der
Ovarphänotyp)
posterior pit. In Keimstreifen auch Expression im
ventralen Mesoderm.
Maternal im Polkörper unbefruchteter Embryonen.
Posteriore Expressionsdomäne ab differentiertem
Blastoderm bis zum gestreckten Keimstreif. U.U.
Leere Eihüllen.
auch Expression im ventralen Mesoderm und in
den Beinanlagen
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
keine Ablage (Starved
Ovarphänotyp)
Degradierte Blastoderme.
Unvollständige Kondensation
der Zellkerne in Keimstreifen.
Maternal im Polkörper unbefruchteter Embryonen.
Leere Eihüllen.
Im Keimrudiment Expression in distalen
Deformationen des
Kopfanlangen. Posteriore Expression in
ventralen Abdomens.
Blastodermen und in Keimstreifen.
Gestörte Kondensierung des
embryonales Gewebes in
differenzierten Blastodermen.
Invaginatinsdefekte. Anteriore
und posteriore Deformationen
und Deletionen in Keimstreifen.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Anteriore Expression in Blastodermen Leere Eihüllen.
und später in elongierenden Keimstreifen.
Deformationder
Posteriore Expression in Balstodermen. Potentiell abdominalen Segmente.
auch Expression in Beinanlagen.
Degradierte Blastodermstadien.
144
Anhang
Tc -Nummer
Drosophila
Homolog
Expression (0-24h)
Larvale Phänotypen
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
TC004556
Hrb87F
Maternal ubiquitär und in blastodermalen Stadien.
Keine spätere Expression detektierbar.
Leere Eihülle.
Kopfkapselgröße stark
reduziert.
Degradierte Blastodermstadien.
CG9323
Ab dem differentierten Blastoderm posteriore
Expressionsdomäne, ansonsten auch potentiell
ubiquitäre Expression in allen Stadien.
Leere Eihüllen.
Deformierte und degradierte
Blastoderme.
Segmentierungsabbrüche in
Keimstreifstadien.
TC006181
CG43129
Bis zur Invagination sowohl anteriore als auch
posteriore Expressionsdomänen. In späteren
Stadien ubiquitär.
Leere Eihüllen. Kopfkapsel
reduziert, posteriore,
Blastoderme deformiert und
terminale Strukturen
degradiert. Kopfdefekte in
(Urugomphi und
keimstreifstadien.
Pygopodien) deletiert.
TC007989
Taf12
In allen Stadien ubiquitär.
Leere Eihüllen. Kopfkapsel Keine Eiablage wegen
stark reduziert bis deletiert. Ovarphänotyp.
mael
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen und zusätzliche, anteriore
Expressionsdomäne in diesem Stadium. Posteriore
Expression in Blastodermen. Keine Expression in
späteren Stadien.
Leere Eihüllen. Inside-outPhänotyp, Deformationen
des 3. Beinpaares,
abdominale
Deformationen, anteriore
Reduktionen.
TC005697
TC008172
Serosa eventuell verkleinert.
Starke, morphologische
Deformationen nach
Invagination. Posteriore
Deletionen in Keimstreifen. Nach
Invagination mögliche
Serosadefekte.
145
Anhang
Tc -Nummer
TC009048
TC011114
TC011295
TC015182
TC000868
TC003938
Drosophila
Homolog
Expression (0-24h)
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
Degration von Blastodermen.
Serosa in differenzierten
Leere Eihüllen. Kopfkapsel
Blastodermen möglicherweise
deformiert, posteriore
leicht vergrößert. Keine älteren
Segmentierungsabbrüche.
Stadien als differenzierte
Blastoderme.
Larvale Phänotypen
-
Posteriore Expressionsdomäne ab dem
undifferentierten Blastoderm. In gestreckten
Keimstreifen auch potentielle Expression im Kopf
und Thorax.
zfh1
In Blastodermen posteriore Expression. Nach
Invagination im ventralen Mesoderm und der
Mittellinie. Ubiquitär in gestreckten Keimstreifen.
Leere Eihüllen.
Adar
Im differentierten Blastoderm ubiquitär exprimiert.
Nach Invagination posteriore Expression.
Leere Eihüllen. Maxille
vergrößert und deformiert, Morphologische Kopfdefekte in
Kopfkapsel reduziert,
Keimstreifstadien.
abdominale Deletionen
rk
elB
Taf11
Schwache Expression im Polkörper unbefruchteter
Eier. Schwache, ubiquitäre Expression in allen
Stadien. Potentiell Expressionsdomänen im
Mesoderm und dem Kopf von
Serosafensterstadien.
Posteriore Expressiondomäne ab
undifferenziertem Blastoderm. Nach Invagination
auch Expression in den okularen Domänen und
Segmentale Streifen.
Schwach ubiquitäre Expression bis zur
Invagination. Danach Expression im Kopf und in
der Wachstumszone. Später auch in den
Beinanlagen.
Deformierte und degradierte
Blastoderme.
Leere Eihüllen.
Degration von
Balstodermstadien.
Leere Eihüllen.
Verkleinerte Kopfkapseln.
Degradierte Blastodermstadien.
Symmetrische Invagination.
Kopfdefekte in
Keimstreifstadien.
Leere Eihüllen.
Kopfanhänge deformiert
und Kopfkapsel reduziert.
Degration von
Blastodermstadien.
146
Anhang
Tc -Nummer
Drosophila
Homolog
TC006235
Dsp1
TC007289
CG32732
TC008122
stas
TC010347
otk
TC014627
TC002064
CG13284
Expression (0-24h)
Maternale, anteriore Expressionsdomäne und
maternale Expression im Polkörper. Danach
ubiquitär bis zur Invagination. Nach Invagination,
Expresison in der Wachstumszone.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Danach in allen Stadien ubiquitär mit
zusätzlicher, spezifischer posteriorer Expression im
differenzierten Blastoderm.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Im undifferentierten Blastoderm
schwach ubiquitär und ab dem differenzierten
Blastoderm schwach embryonal ubiquitär.
In Keimstreifstadien schwache anteriore und
posteriore Expressionsdomäne.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Im undifferentierten Balstoderm
schwach ubiquitär und dann ab dem differenzierten
Blastoderm schwach embryonal ubiquitär.
Larvale Phänotypen
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
Leere Eihüllen.
Degradierte
Deformationen des Kopfes Blastodermstadien.Schieflage
und posteriore Deletionen. der Keimstreifen im/auf dem Ei.
Leere Eihüllen. Kopf und
Abdomen deformiert.
Leere Eihüllen. Kopf und
erste thorakale Segmente
deformiert, posteriore
Segmentierungsabbrüche.
Leere Eihüllen. Anteriore
und posteriore Deletionen.
Anteriore und posteriore
Deformationen.
Degradierte Blastodermstadien
(Ovarphänotyp).
Anteriore und posteriore
Deformationen in
Keimstreifstadien.
Degradierte Blastodermstadien.
Leere Eihüllen.
Kopfanhänge deformiert
In Keimstreifstadien deformierte
und posteriore
Kopfmorphologie.
Segmentierungsabbrüche.
Collagen alpha1(XI) chain
Schwache Expression im Polkörper unbefruchteter Kopfkapsel reduziert und
(Harpegnathos Eier. Schwach ubiquitär in allen Stadien.
posteriore Deletionen.
saltator )
Kein Phänotyp erkennbar.
147
Anhang
Tc -Nummer
TC005274
Drosophila
Homolog
PREDICTED: probable
RNA-directed DNA
polymerase from
transposon X-element
[Tribolium castaneum]
TC006964
His1:CG33864
TC007740
-
TC009431
PREDICTED:
serine/threonine-protein
kinase pakA-like
[Tribolium castaneum ]
TC030765
Acf
TC003462
CG15014
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
Expression (0-24h)
Larvale Phänotypen
Maternal ubiquitär. Im undifferenzierten
Blastoderm ubiquitär und ab der Differenzierung
embryonal ubiquitär.
Leere Eihüllen. Kopfkapsel
Deformationen von Kopf und
reduziert und posteriore
Abdomen in Keimstreifstadien.
Deletionen.
Ubiquitär im undifferenzierten Blastoderm. Danach
embryonal ubiquitär. Im differenzierten Blastoderm
Leere Eihüllen.
zusätzlich spezifische Epxressionsdomäne ind er
Serosa.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Im differenzierten Blastoderm
Leere Eihüllen.
posteriore Expressionsdomäne. Nach Invagination
schwach ubiquitär.
Ubiquitär bis zum Serosafensterstadium.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Schwach ubiquitär im undifferetierten
Blastoderm und stark embryonal ubiquitär im
differentierten Blastoderm. In Keimstreifen im
ventralen Mesoderm, der Wachsttumszone und
dem Kopf exprimiert.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Ubiquitär im undifferentierten
Blastoderm und ab der Differenzierung embryonal
ubiquitär.
Leere Eihüllen. Kopf,
Thorax und Abdomen
reduziert.
Degradierund der
Blastodermstadien.
Möglicherweise unvollständige
Kondesierung des embryonalen
Gewebes in allen Stadien.
Degradierung in
Balstodermstadien.
Degradierte Blastodermstadien.
Leere Eihüllen. Kopfkapsel
Gestörte Morphologie der
stark reduziert.
Keimstreifen.
Leere Eihüllen. Posteriore
Deletionen.
Degradierte Blastoderme. In
Keimstreifen Kopf- und
Abdomendeformationen.
148
Anhang
Tc -Nummer
Drosophila
Homolog
TC011788
AnxB9
TC013117
CG9752
TC007350
CG9646
TC006756
CG11577
TC014009
Bet3
TC006558
fu2
Expression (0-24h)
Schwach ubiquitäre Expression bis zur
Differenzierung, danach schwach embryonal
ubiquitäre Expression. Ab dem
Serosafensterstadium posteriore
Expressiondomäne und bei gestreckten
Keimstreifen zusätzlich segmentale Expression in
Kopfsegmenten.
Maternal ubiquitär im Polkörper unbefruchteter
Embryonen. Bis zur Invagination ubiquitäre
Expression. Danach posteriore
Expressionsdomäne und schwach, ubiquitäre
Expression im restlichen Embryo.
Maternal ubiquitär im Polkörper und posteriore
Expressionsdomäne von unbefruchten Eiern. Im
differentierten Blastoderm posteriore Epxression,
ansonsten embryonal ubiquitär in allen Stadien.
Im Serosafenster Expression im Mesoderm und
der Wachstumszone. In Keimstreifen in
Kopfsegementen and Beinanlagen und schwach in
der Wachstumszone.
Ubiquitär im undifferenzierten Blastoderm. Ab dem
differenzierten Blastoderm posteriore
Expressionsdomäne. In Keimstreifen zusätzlich
Epxression in Kopfsegmenten.
Ubiquitär und im differenzierten Blastoderm
embryonal ubiquitär. In Keimstreifen
Expressiondomänen in den Antennen und im
Stomodeum.
Larvale Phänotypen
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
Leere Eihülle. Kopf
deformiert und posteriore
Deletionen.
Degration von Blastodermen.
Leicht veränderte Morphologie
von Keimstreifstadien.
Leere Eihüllen. Kopfkapsel
reduziert, posteriore
Blastodermstadien degradiert.
Segmentierungsabbrüche.
Leere Eihüllen. Anteriore
Deformationen und
posteriore Deletionen.
Wenige deformierte und
degradierte Blastodermstadien.
Haupsächlich Wildtyp.
Leere Eihüllen.
Blastodermstadien degradiert.
Leere Eihüllen.
Kein Phänotyp erkennbar.
Kopf reduziert/deformiert,
abdominale Segmente
deletiert. Partieller InsideOut-Phänotyp.
Ab Keimrudimentstadien starke
Deformationen der Köpfe und
Kopfsegmente.
149
Anhang
Tc -Nummer
TC014047
TC015633
Drosophila
Homolog
Dbp80
CHOp24
TC000405
boca
TC001068
Taf13
TC012697
Gas41
Expression (0-24h)
Larvale Phänotypen
Embryonale Phänotypen
(αTubulin und Hoechst)
Im differenzierten Blastoderm ubiquitär mit
spezifischer, anteriorer Domäne exprimiert. Nach
Leere Eihüllen.
Invagination in der Wachstumszone und ab kurzen
Keimstreifen ubiquitär.
Nur degradierte
Blastodermstadien.
Ubiquitär im Polkörper unbefruchteter Embryonen
und zusätzliche, anteriore Expressionsdomäne. Im
undifferentierten Blastoderm anteriore
Epxressionsdomäne. Im differentierten Blastoderm Leere Eihüllen. Abdominale
Expression in der Serosa und posteriore Domäne. Deletionen.
Während der Invagination und Serofesnter
Kopfkapseldefekte.
exprimiert in mesodermalem Streifen und
posteriorer Domäne. Gestreckte Keimstreifen
zeigen zeigen Domänen in Kopfsegmenten.
Verkleinerte Serosa in
differenzierten
Blastodermstadien. Posteriore
Segmentierungsabbrüche und
Kopfdefekte in
Keistreifenstadien.
Ubiquitär im undifferenzierten Blastoderm. Ab dem
differenzierten Blastoderm embryonla ubiquitär mit Keine Ablage.
verstärkter posteriorer Expression.
Schwache Expression im Polkörper unbefruchteter
Eier. Im differenzierten Blastoderm embryonal
Kopfdefekte und
ubiquitär. Nach Invagination anteriore und
abdominale Deletionen.
posteriore Expression. Im gestreckten Keimstreif
schwach ubiquitär.
Ubiquitär im undifferenzierten Blastoderm. Ab dem
Leere Eihüllen.
differenzierten Blastoderm embryonal ubiquitär.
Keine Eiablage.
Degration der
Blastodermstadien.
Blastodermstadien degradiert.
150
Anhang
Tabelle 5: "Übersicht über die Ergebnisse des Rescreens
Tc -Nummer
Drosophila
Homolog
TC003946
crol
TC004989
cathD
im differenzierten Blastoderm keine
Expression in okularen Domänen und
reduzierte, posteriore Expression
wildtypische Expression
wildtypische Expression
TC006181
CG43129
Deutliche schwächere Expression von
Tc'wg in allen Stadien;
Expressionsdomänen nicht verändert
Wildtypische Expression
Wildtypische Expression
TC008172
mael
Expression von Tc'wg
Segementale Expression in allen
Expressionsdomäne von Tc'zen-1 in Tc'eve -Expression im differenzierten
Segmenten unregelmäßig und reduziert
differenzierten Blastodermen
Blastoderm deutlich reduziert; der dritte
bis hin zu abwesend
verkleinert
eve -Streifen spaltet sich nicht auf
TC000868
elB
TC008122
stas
Schwächere bis absende Expression
von Tc'wg
TC010347
Expression von Tc'eve
Nur sehr wenige, degradierte Blastoderme nach Fixierung der RNAi-Embryonen vorhanden; keine auswertbaren
Markergenfärbungen
Im differenzierten Blastoderm keine
Expression in okularen Domänen,
posteriore Expression deutlich
schwächer; in Keimstreifstadien
Expression deutlich reduziert
otk
Expression von Tc'zen-1
Schwächere Expression als im
Wildtyp
Wildtypische Expression
wildtypische Expression
Deutlich schwächere Expression von
Tc'eve ab dem Keimrudimentstadium
Degradierte Blastoderme ließen keine
Analyse dieser Stadien zu; schwächere zen-1 -Domäne in undifferenzierten
Expression von Tc'wg in Keimrudiment- Blastodermen eventuell verkleinert
und Keimstreifstadien
Degradierte Blastoderme zeigen keine
Expression von Tc'eve ; schwächere
Expression in späteren Stadien
151
Anhang
Tc -Nummer
Drosophila
Homolog
Expression von Tc'wg
Expression von Tc'zen-1
TC006235
Dsp1
Wildtypische Expression in allen
Stadien
Wildtypische Expression
TC013117
CG9752
Epression von Tc'wg im Blastoderm
deutlich reduziert; in Keimrudimenten
und Keimstreifen keine Expression
Wildtypische Expression
TC009922
AP-2
TC013474
sens
TC015633
CHOp24
Im differenzierten Blastoderm keine
Expression in okularen Domänen und
unregelmßige, posteriore Expression; in In Blastodermstadien Expression
Keimrudimenten unregelmäßige und von Tc'zen-1 schwächer als Wildtyp
reduzierte Expression in
Kopfsegmenten
Wildtypische Expression
Wildtyische Expression
Expressionsdomäne im
Okulare Domänen in Blastodermen
undifferenzierten Balstoderm
expandiert: rotationssymetrisch um den
verkleinert; im differenzierten
Embryo; in Keim streif reduzierte und
Blastoderm Expressionsdomäne
unregelmäßige Expression; kaum
verkleinert und rotationssymmetrisch
Stadien nach Invagination vorhanden
um die anteriore Kappe
Expression von Tc'eve
Wildtypische Expression in
Blastodermen; in Keimrudimenten und
Keimstreifen reduzierte und
unregelmäßige Expression
Expression in Blastodermen deutlich
reduziert; wildtpyische Expression in
Keimstreifen (nur sehr wenige
Keimstreifen vorhanden)
Tc'eve -Expression in allen Stadien
unregelmäßig und schwächer
Wildtypische Expression
Wildtypische Expression in
Blastodermen; keine älteren Stadien
verfügbar
152
Anhang
Tabelle 6: Primer des "Mini-Screens"
TC-Nummer
TC000405
TC000868
TC001068
Primer Left
ACGTCCATTGCCGAAATTAG
GTCAAATCGGCTCTGACACC
TGTATGGAGATTGGAAGGACG
Primer Right
TGCTTGAATGTGATTGTTCCA
AGGTTCCCAAAGGCAAGTCT
TTCGTCAAAAGCTTTACGTGC
GGAAGCGGAAACAGACGATA
CATTTTGTGGTCTTGCGTGT
TATTGTTAGCCCCCACTTGC
CGGGAGAATTCACCGATTTA
TGAGCTTGGACGTGAACTTG
GCCTCCACGAGTCAAATCAT
AGTGTGGTCGCGGATTCTAC
AGGGGCAGGTTTTGGTTTAG
AAATTCAGCTTCCCTGCTTG
AGGAAATTTTTGGCACCAGAT
CCCGACTCCGATTGTTCTT
CCTCAAGTGCGTCATCAGAG
TAAGACGCTAGGACCGTTGG
CTAGGACTGTGACGGGGTTG
TGCCTGTCTTCGTGCAACTA
CAAGGGCTTCACCAAAGAAG
AATTATTCATCGGCGGTTTG
CATGGCTTCGGCTATGAAAT
GCTACCTTCTCCAGCAGCAC
CATAGCCTGCTTGCTTCACA
CACCAACTCCCCAACAACTT
TGTGCCCCTGGATTTGTATT
CCGATGGAGACGGTGTAGTT
GTCCATCTCTGCTTTGCTCA
CGGAGAAGTTTAGGGCAAGA
CCTTCGGAACTTCAACGAAC
TTGAACTGCCAATACGCTTG
TGGTTGGGTCAAGAGGTACA
GCTCAAGTTGACAAGGAAACG
TTCGGCGTTACAGTAATCCA
TTTGTGCGAGATGAACTTCG
GCACTGACCCTCTCAGCTTC
TGGAAGAATGTGCCCAGTTA
TCGCCACAAAATTCTGGAAG
CCAGCACGTCATCATCAAAC
TGAGTCAGACGTTCCAGACG
TCGCTTCTGGTTCTTTGGTT
CATTCCCATACCTGGAGACAG
TATGGGACATGTGCAACCAC
AGGTCCGGTCCTGCTTCTAC
TGTATCGCCAACTACAATCAAGA
CCCAACTTGACCAACAACCT
TCAAGTCACTGAGGAAGAACGA
ACTCTCCTGCCAGGTACACAA
CGCTTTGTGCCAGAGTCTATC
ATTTGCGTCTCATCGTCTCC
AGCCTCCTCCATCTTCTTCC
TGCTGCATATTTCTCCTTGG
GGACTCGTCCAACATGTCCT
CTTCGGAAGTTTTGGTCACA
ACACGAGGTGTCTTCGTTCC
TTTTGGTTTCGGTGCCTTAG
CCCATCTCTTATGGACTTCTGG
TCGTCTTCGTCCAATGTTGT
TTCTCTTTCCCGACCTCGTA
CGTCGTCTCCGTCCATTAAC
CGGGGGTCCACATATTGTAA
TCGTCAGCGGTCATATTTTG
TTTCTCATCCGCATAAACGA
CGTTGGCGGTGTGTAATTTT
TC009431
PREDICTED:
serine/threonine-protein
kinase pakA-like
[Tribolium castaneum]
ATCAACGCTCTTACCGCTTT
TTATCACTGGCAGGGTTGTG
TC009922
TC009975
TC010347
TC010637
AP-2
atl
otk
CG6961
GTATGAAAGGGGGCAAGGAC
AACCGAGTTGCTCACAGGAG
GGTATGCAACCCACACCAAT
CGGGTTTATCGATCTTGACG
CGATCTTCTCCAGCTTCTCG
AAGCTCTGGATGAGAGTTTTCG
CGACACCCGTTATGATCTCC
TGAATTCGACGAACCAGAAA
TC002064
TC002120
TC002852
TC003462
TC003938
TC003946
TC004241
TC004292
TC004293
TC004556
TC004590
TC004816
TC004989
TC005274
TC005357
TC005697
TC006181
TC006235
TC006282
TC006558
TC006756
TC006964
TC006980
TC007289
TC007350
TC007740
TC007989
TC008122
TC008172
TC009048
Drosophila -Homolog
boca
elB
Taf13
Collagen alpha-1(XI)
chain (Harpegnathos
saltator)
CycC
Spt3
CG15014
Taf11
crol
PREDICTED:
alkylglycerol
monooxygenase
[Tribolium castaneum]
e(y)1
CG5885
Hrb87F
14-3-3ζ
Eip74EF
cathD
PREDICTED:
tetratricopeptide repeat
protein 39C-like [Tribolium
castaneum]
CG9323
CG43129
Dsp1
geminin
fu2
CG11577
His1:CG33864
CG9705
CG32732
CG9646
Taf12
stas
mael
-
153
Anhang
TC-Nummer
TC011114
TC011295
TC011661
TC011788
TC011936
TC013117
TC013474
TC014009
TC014047
TC014627
TC015182
TC015633
TC030765
Drosophila -Homolog
zfh1
Adar
Osi8
AnxB9
niki
CG9752
sens
Bet3
Dbp80
CG13284
rk
CHOp24
Acf
Primer Left
GTCAGAAGACGGCCGTAAAG
ACCATGTCCTGCTCGGATAA
AGCAAAACACCATCGTCCAT
CCTGGCACTTGTCCACTCTT
ATAACGTGGTTTTGGCCATC
AAATTGCGATTTACAAGCGG
CTCCACCGGAACAGGAACTA
TGGACTTGAAAGACACTGCG
GGCCGAATTGTCAAATGATG
AAACAGTGTCGCCAAGGAAT
GGAAAGCCTCACGATCAAAA
TTATCTACCAGGGCGAAAGG
CAACGATCACGACATAAGCG
Primer Right
AAACCCATCGTACCCATTGA
TGTTCCATGGGTTTGGAAAT
CAAAGTCATCGCTTTTGGGT
AACGACGCTCAGGAGACACT
TTAAAATCAAACTTGGCCCC
ATGGATGGAGCAAGCTCTGA
ACTCAGCGAGTCGACCTTGT
TCCAACTTTGCACATCCAAC
CACCCCCACAGTTCCATAAA
CTGGGATGAAAGTGCTGGAT
CTTGATCCCAATCCTCTCCA
TCCAACTTATTCGTGGAATCG
CGCGTTTTCTTGACGAATTT
154
Anhang
Anhang 1: Live-Imaging-Protokoll
Live-Imaging Tribolium Protocol
1. Klorix
2x30sec with 1/6 Klorix in 200µm sieves with screw-cap
2. Transfer
-transfer embryos on 24x60cm coverslip with a brush (very gently)
-best when arranged in groups of 3 in horizontal row
-leave as little space between embryos as possible within the groups of 3 without embryos
touching each other
- leave enough space between the groups of 3 to easily cover the groups with a drop of oil
later
-try to transfer as little water as possible or take water off by using tissue paper or brush as
best as possible (if embryos are not dry, they don’t stick to the coverslip)
-it is possible to image about 36-60 embryos simultaneously (between 12 and 20 individual
positions with 3 embryos each)
-prepare all positions before starting to cover the embryos with oil in order to give them a
chance to stick to the coverslip
3. Oil
-always use the Halo Carbon Oil 700 from Sigma (stored in Denise Lab)
-always use a dry brush (ideally another one than used for transfer)
-never dip the brush directly into the bottle (make small aliquot before)
-cover embryos by SLOWLY pulling a drop from the brush from one side of an embryo-group
over to the other side
-do not let the drops over the groups of 3 touch each other
155
Anhang
-drop should be big enough to completely cover the embryos but not bigger
4. Further preparation
-flip the coverslip and put it on a prepared O.F.L.I. (see below)
-put some liquid (preferably water) between spacers and coverslip to avoid shifting
5. Program set up
-open program
-argon laser to 10% (very important)
-Settings: 10x Air, Fluorescence: GFP, 200Hz, check bidirectional, resolution 1024x1024
 Acquisition xyzt  show „Mark and Find Panel“  uncheck „same stacks for all“
-point of interest: live picture  mark first position in „Mark and Find Box“  define stack
(top: start, middle: stop)  click on stop  choose between 10-12 steps (planes)  click on
redefine step
 live picture  mark second position  and so on
-go to „duration box“. Interval should be between 10-15min. define duration longer than
needed and click on „apply“
-start the live-imaging
How to build an O.F.L.I. (Objektträger fürs Live-Imaging)
Use a regular slide and glue 4 18x18 coverslips on each side on top of each other and on the
slide. The 24x60mm coverslip will be placed with both ends on the opposing spacers. Give a
funny name to your O.F.L.I. before using it.
156
Anhang
157
Anhang
Anhang 2: Transcriptome sequencing reveals maelstrom as essential
target gene of the terminal-system in the red flour beetle Tribolium castaneum
Fabian Pridöhl1, Matthias Weißkopf1, Nikolaus Koniszewski1,3, Andreas Sulzmaier1, Steffen
Uebe2, Arif B. Ekici2, and Michael Schoppmeier1*
*Corresponding Author
1
Department Biology
Developmental Biology Unit
Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg
Staudtstr. 5
91058 Erlangen
Germany
phone: ++49-9131-8528097
fax: ++49-9131-8528040
2
Institute of Human Genetics
Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg
Schwabachanlage 10
91054 Erlangen
Germany
phone: ++49-9131 8522318
fax: ++49-9131 85-23232
3
present address:
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
Otto-von-Guericke-University
Leipziger Str. 44
39120 Magdeburg
Germany
phone: ++49-391-6721834
fax: ++49-391-6713384
158
Anhang
159
Anhang
Abstract
While the terminal system in the short-germ beetle Tribolium provides anterior and posterior polarity cues, the majority of Torso target genes remain to be identified. To gain additional insights into the terminal RTK-signalling, we analysed the functions of HMG-box protein Capicua in Tribolium development. We found Tc-cic to act as an antagonist of terminal
signalling. To uncover a comprehensive set of Torso-target genes, we compared terminalsystem loss-of function (Tc-tsl RNAi) vs. gain-of-function (Tc-cic RNAi) transcriptomes to the
wildtype situation by Next-Generation-Sequencing. We screened 50 candidate genes for
functions in early patterning, and uncovered the PIWI-interacting-RNA-factor Maelstrom as a
novel target gene of the terminal-system. Tc-mael is required for patterning the serosa and
subsequently, for morphogenesis. At the posterior, Tc-mael promotes polarisation of the
embryo and thus, growth-zone formation. Our results indicate that posterior patterning by
Torso may be realized through maelstrom depended activation of posterior wnt domains.
However, since not all aspects of posterior Tc-mael RNAi phenotypes can be explained by
diminished wnt-signalling, we posit that Tc-mael promotes growth-zone formation by localizing an as yet unknown posterior maternal determinant.
KEY WORDS: Tribolium, Short-germ insect, terminal system, anterior-posterior patterning,
transcriptome sequencing, torso, torso-like, capicua, maelstrom
160
Anhang
Introduction
Anterior-posterior patterning of the Drosophila embryo depends on spatial polarity cues
provided by maternal coordinate systems (St Johnston and Nusslein-Volhard, 1992). While
anterior patterning is mediated by the Bicoid morphogen (Driever and Nusslein-Volhard,
1988), posterior patterning largely depends on Nanos (Nos) and Pumilio (Pum) proteins
(Barker et al., 1992; Macdonald, 1992; Nüsslein-Volhard et al., 1987; Wang and Lehmann,
1991). The terminal system acts to pattern the anterior and posterior non-segmented regions of the embryo through the torso-mediated receptor tyrosine kinase (Ras/MAPK) pathway (Furriols and Casanova, 2003; Li, 2005). Both Torso receptor and its putative ligand,
Trunk, are ubiquitously expressed throughout the oocyte, and it appears that localized Torso
activation results from activation of trunk by torso-like, whose expression is restricted to
ovarian follicle cells (Johnson et al., 2015; Mineo et al., 2015; Savant-Bhonsale and Montell,
1993; Stevens et al., 2003). Activation of Torso leads to the localized stimulation of the
Ras/MAPK pathway at the poles of the embryo and the activation of the terminal gap genes
tailless (tll) and huckebein (hkb). This activation, however, is indirect and involves a mechanism of derepression: both genes are normally repressed in the embryo and the Torso signal
counteracts this repression to permit localized tll and hkb transcription at the pole. Repression of tll and hkb requires nuclear factors such as the high-mobility group (HMG) protein
Capicua (Cic) and the Groucho (Gro) corepressor. Embryos lacking maternally contributed Cic
show de-repression of tll and hkb towards the centre of the embryo, which then leads to
suppression of the thoracic and abdominal primordia (Ajuria et al., 2011; Astigarraga et al.,
2007; de las Heras and Casanova, 2006; Jimenez et al., 2000; Liaw and Lengyel, 1993;
Paroush et al., 1997).
While maternal systems were investigated in great detail in Drosophila, comparative studies
in Tribolium and other insects revealed a high degree of divergence (Fu et al., 2012; Kotkamp
et al., 2010; Rosenberg et al., 2009; Schmitt-Engel et al., 2012; Schoppmeier et al., 2009).
The red flour beetle Tribolium develops as a short germ embryo. The majority of segments in contrast to the long germ mode of Drosophila - get patterned in a secondary growth process from a so-called growth or segment addition zone (Klingler, 2004; Richards et al., 2008).
At the blastoderm stage, the anterior region of the Tribolium egg gives rise to extraembryonic membranes (i.e. serosa and amnion), while embryonic anlagen are restricted toward
the ventral-posterior region of the egg (Handel et al., 2000).
161
Anhang
Despite these differences, Torso-signalling was shown to be active at both poles of the Tribolium egg, as activation of Ras/MAPK pathway at the posterior and anteriormost regions
depends at least in part on Torso signalling (Schoppmeier and Schroder, 2005; Schroder et al.,
2000). At the posterior, Torso is required for setting up or maintaining a functional growthzone. In absence of Torso signalling, invagination fails and embryos are depleted of all
growth-zone derived segments (Grillo et al., 2012; Schoppmeier and Schroder, 2005) (see
also Figure 1). At the anterior, terminal signalling is crucial for the formation of extraembryonic membranes. In Torso or tsl like RNAi, the serosa is reduced in size, while the presumptive head region appears enlarged and extended toward the anterior. Nevertheless, embryos
develop with normal head structures, similar as in embryos where serosa reduction results
from diminution of Tc-zen-1 activity (Schoppmeier and Schroder, 2005; van der Zee et al.,
2005).
While putative target genes of the Tribolium Torso pathway in the anterior region remain to
be identified, posterior expression of Tc-wingless (Tc-wg), Tc-tailless (Tc-tll), Tc-caudal (Tccad), and Tc-forkhead (Tc-fkh) depends on Tor activation (Schoppmeier and Schroder, 2005).
In the early blastoderm stage, Tribolium tailless and wingless expression is restricted to posterior domains. Knocking down either torso or torso-like function results in the loss of both
domains (see also Figure 3), indicating that the terminal system is at least required for the
proper activation of wnt-signalling. Wnt, in turn, mediates certain (but not all) aspects of
growth-zone formation and axis elongation (Beermann et al., 2011; Bolognesi et al., 2008a;
Bolognesi et al., 2008b).
Thus far, Torso RNAi phenotypes cannot be entirely explained by the misexpression of the
known target genes, indicating that crucial components for terminal patterning remain to be
identified (Casanova, 2005). To gain additional insights into the terminal system, we analysed the functions of HMG-box protein Capicua in early Tribolium development. We found
that the depletion of Tc-cic results in the de-repression of terminal target genes, indicating
that Capicua acts as an antagonist of the terminal RTK signalling in Tribolium. In addition, we
performed a differential gene-expression-screen, using Next Generation Sequencing (NGS).
By sequencing the transcriptomes of early wildtype, torso-like (tsl) RNAi, and capicua (cic)
RNAi embryos, we identified novel target genes of the terminal system in Tribolium. A subset
of these genes was monitored for functions in terminal patterning in a mini-screen by expression analysis and RNAi. Among others, we uncovered maelstrom (mael) as a new target
162
Anhang
gene of the terminal-system in Tribolium. At the anterior, Tc-mael is required for patterning
the serosa primordia and subsequently, for proper morphogenesis of this extraembryonic
membrane. Tc-mael is also involved in posterior pattern formation. In absence of Tc-mael
axis elongation fails, which is apparently due to the impaired growth-zone formation.
Results
In capicua RNAi, anterior embryonic anlagen become transformed into extraembryonic
membrans
The capicua gene encodes an evolutionarily conserved HMG-box transcription factor that
functions as a transcriptional repressor during RTK signalling (Jimenez et al., 2000). In Tribolium, a single capicua ortholog (Tc-cic, TC004697) is present in the genome (Richards et al.,
2008). Tc-cic mRNA is expressed ubiquitously in unfertilized eggs and also present in early
blastoderm embryos (not shown) and thus, basically resembling the situation in Drosophila
(Jimenez et al., 2000).
Depletion of Tc-cic by parental RNAi results in in severe patterning defects (Figure 1; supplementary Figure S1). Only about 7% of eggs collected in the first week after eclosion of
injected animals were capable of secreting a larval cuticle, whereas 92.4% of the embryos
die prior to completion of embryonic development (empty-egg or no-cuticle phenotypes,
(Schmitt-Engel et al., 2015)). In some cases cuticle remnants were observed, which likely
reflect posterior segments, as these fragments often include Urogomphi-like structures (Figure 1 C). In addition, mildly affected larvae were observed that display severe head defects
(about 3%) (Figure 1 B; Figure S1). In these larvae, pregnathal and gnathal segments were
largely absent. Thoracic and abdominal segments, however, develop without obvious defects (Figure 1 B).
To determine, whether strong Tc-cic RNAi no-cuticle phenotype does not reflect a late function of maintaining embryonic anlagen, we performed time-lapse recordings of live embryos
using a transgenic line expressing nuclear-localized GFP driven by the TriboliumEF1-alpha
promoter (EFA-nGFP) (Sarrazin et al., 2012) (Figure 2; movies S1 and S2).
In wildtype embryos, at the differentiated blastoderm stage, a clear distinction arises between the wider-spaced serosal cells and the more densely spaced cells of the germ rudi163
Anhang
ment (Figure 2 A; movie S1). This difference is even more pronounced at gastrulation onset,
marked by the formation of the primitive pit at the posterior pole. Serosal nuclei become
larger than those of the germ rudiment as they undergo polyploidization (Figure 2 A, C; supplementary movie S1) (Handel et al., 2000). During gastrulation, the embryonic anlagen condense and give rise to the germ-rudiment that progressively becomes covered by the extending extraembryonic membranes (i.e. serosa and amnion) (Figure E, G; supplementary
movie S1) (Benton et al., 2013; Handel et al., 2000). Eventually, the head anlagen become
morphologically visible, serosa window closure proceeds, and germ-band elongation can be
observed (Benton et al., 2013; Handel et al., 2000) (supplementary movie S1).
Upon Tc-cic RNAi, extraembryonic membranes are enlarged and expanded toward the posterior pole of the embryo (Figure 2 B, D; supplementary movie S2). During gastrulation, the
serosal cells spread in posterior direction, while the residual embryonic tissue invaginates
(Figure 2F). Eventually, extraembryonic membranes cover the entire egg, while embryonic
tissue is restricted to the posterior pole of the egg and becomes internalized completely.
This presumably embryonic tissue does not show any signs of morphological differentiation
or axis elongation (Figure 2 H; supplementary movie S2). At this point embryonic development stops. Thus, the majority of Tc-cic depleted embryos die during or soon after gastrulation.
To analyse early patterning of the serosa anlage, we stained Tc-cic RNAi embryos for zerknüllt-1 (Tc-zen-1), which in wildtype is already expressed in the presumptive serosa (Figure
3 G) (Falciani et al., 1996). As expected, in Tc-cic depleted embryos the Tc-zen-1 expression
expands toward the posterior, indicating that already the serosa primordium is enlarged
(Figure 3 I). Interestingly, the serosa-embryo boundary in the differentiated blastoderm is
still oblique in Tc-cic RNAi (Figure 3). Previously it has been shown that the obliqueness of
the serosa / germ rudiment border in Tribolium depends on BMP signalling and rotational
symmetry of this boundary is indicative of defective dorso-ventral (DV) patterning (Nunes da
Fonseca et al., 2008; van der Zee et al., 2006). Hence, in contrast to Drosophila (Ajuria et al.,
2011; Astigarraga et al., 2007; Goff et al., 2001; Jimenez et al., 2000), Tribolium Cic may have
no impact on embryonic DV patterning (see discussion).
To further elucidate the function of Tc-cic in patterning gnathal and thoracic segments, we
visualized the emergence of segment primordia by analysing the Tc-even-skipped expression
164
Anhang
pattern (Figure 3 A-F). In wildtype embryos, Tc-eve is initially expressed in a doublesegmental pattern, each stripe later resolving into secondary segmental stripes (Patel et al.,
1994; Schoppmeier and Schroder, 2005). The first two primary Tc-eve stripes (Tc-eve stripe 1
and stripe 2) mark the maxillary and the first thoracic (T1) segment primordia, while the
third primary stripe (Tc-eve stripe 3) covers the region where the growth-zone will develop
(Figure3 B). In Tc-cic RNAi embryos these primary Tc-eve stripes are formed, but the position
of the first and second primary stripes is shifted towards the posterior (Figure 3 C). In addition, the distance between Tc-eve stripe 1 and the serosa boundary is severely decreased in
size, indicating the depletion of the pregnathal anlagen (Figure 3 F, bar). This is supported by
the loss of the ocular Tc-wg domain (Figure 3L). In wildtype blastoderm, Tc-wg is expressed
in a posterior domain as well as in the ocular anlagen of the anterior head (Figure 3 J)(Nagy
and Carroll, 1994). Upon Tc-cic knock-down this anterior domain is no longer present (Figure
3 L). Thus, gnathal and anterior thoracic segments are initially patterned, while pre-gnathal
segments apparently are lost.
While Tc-cic RNAi causes the expansion of extraembryonic membranes at the expanse of the
anterior head anlagen, the depletion of Torso-signalling results in opposing effects (Figure 3).
In Torso or tsl like RNAi, the serosa is reduced in size, while the presumptive head region
appears enlarged and extended toward the anterior (Figure 3 E). This finding is corroborated
by the expansion of even-skipped and the reduced expression the serosal marker zerknüllt-1
in Tc-tsl RNAi embryos (Schoppmeier and Schroder, 2005) (Figure3 H). These contradictory
phenotypes indicate that (at least) the anterior Tc-cic RNAi reflects a derepression phenotype of the terminal-system.
Capicua serves as an antagonist of Torso-signalling in Tribolium
In Drosophila, the loss of Cic function causes the derepression of target genes of the terminal
system in medial regions of the embryo (Jimenez et al., 2000; Paroush et al., 1997). Also in
Tribolium the Tc-zen-1 domain expands upon in Tc-cic depletion, which also may reflect a
depression phenotype. Next we tested whether also posterior downstream gene activity is
affected in Tc-cic RNAi. To this end we analysed the expression of Tc-tll, Tc-wg, and TcwntD/8 in early Tc-cic and Tc-tsl RNAi embryos (Figure 3).
In early wildtype blastoderm, Tc-tll is expressed in a small posterior domain (Figure 3
P) (Schroder et al., 2000). While the posterior tll domain is abolished in Tc-tsl RNAi (Figure 3
165
Anhang
Q), we observed a massive expansion of Tc-tll expression in Tc-cic depleted embryos (Figure
3R).
A de-repression phenotype was also observed for Tribolium wnt genes (Figure 3 J-O). At the
blastoderm stage, wg/wnt1 and wntD/8 are expressed at the posterior pole (Bolognesi et al.,
2008a; Bolognesi et al., 2008b). In Tc-tsl, posterior Tc-wg and Tc-wntD/8 domains are lost
(Figure 3 K, N) indicating that posterior patterning by Torso may be realized, at least in parts,
through wnt-signalling. Again, the knockdown of Tribolium cic results in the expansion of
posterior Tc-wg and Tc-wntD/8 domains toward central regions of the embryo (Figure 3 L, O).
Hence, both anterior and posterior Tc-cic RNAi phenotypes likely reflect derepression (i.e.
gain of function) phenotypes of the terminal system, basically resembling the situation in
Drosophila (Jimenez et al., 2000; Paroush et al., 1997).
Transcriptome sequencing and analysis of candidate genes
In order to uncover a complete set of Torso target genes, we performed a differential geneexpression-screen, using Next Generation Sequencing (NGS). To this end, we compared terminal-system loss-of function (i.e. Tc-tsl RNAi) versus gain-of-function (i.e. Tc-cic RNAi) transcriptomes to the wildtype situation. Genes being differentially expressed in Tc-tsl vs. Tc-cic
RNAi (i.e. up-regulated in Tc-tsl RNAi and down-regulated in Tc-cic RNAi or vice versa) likely
depend on the activity of the terminal system.
Wildtype (T1), tsl RNAi (T2), and cic RNAi (T3) embryos were fixed at the differentiated blastoderm stage (7-11h) and total RNA was isolated. Sequencing was done on a SOLiD 4 system
(Life Technologies) and reads were mapped to the Tcas3 genome (http://bioinf.unigreifswald.de/gb2/gbrowse/tribolium/). In total, 12.795 genes showed differences in mRNA
expression levels (Figure 4 and supplementary table S2). We found 1801 genes to be upregulated in Tc-tsl RNAi and down-regulated in Tc-cic RNAi and 2790 genes that were upregulated in Tc-cic RNAi but down-regulated in Tc-tsl RNAi (see supplementary table S2 for
details).
To elucidate whether candidate genes are indeed associated with terminal patterning, we
selected 50 differentially expressed candidate genes and proceeded to screen those for
functions in early patterning. Genes were only considered as differentially expressed if the
fold change (T1 vs. T2 or T1 vs. T3) was at least 50% compared to the wildtype. Larvae were
166
Anhang
scored for RNAi phenotypes and, in addition, expression was monitored by whole-mount insitu hybridisation (supplementary Table S3).
We found two genes not to result in any phenotype; four genes effected oogenesis, as we
observed the cessation of egg-laying upon RNAi, and in 12 cases all eggs displayed no-cuticle
phenotypes. As deduced from Hoechst and β-Tubulin staining, these so-called empty egg
phenotypes are due to lethality prior to cellularization (Table S3). Depletion of 30 genes resulted in larval phenotypes, which in most cases were associated with various quantities of
empty-egg phenotypes (Table S3 and Figure 5).
Given that the terminal system is required for patterning anterior- and posteriormost anlagen (Grillo et al., 2012; Schoppmeier and Schroder, 2005), we expect putative target genes
to be expressed at the poles of the egg. However, more than halve of the candidates (27 out
of 50) were expressed ubiquitously during early stages, while only 2 genes did not show any
obvious expression patterns in blastodermal stages or germ rudiment (supplementary Table
S3).
Still, we identified 13 genes with distinct early terminal expression domains (Figure 5 and
Figure 6). Eight of these were expressed at both poles of the embryo, while five genes were
exclusively expressed at the posterior pole or in the segment addition zone (Figure 5). Six
genes displayed an exclusive anterior expression domain in early stages, i.e. freshly layed
eggs and / or undifferentiated blastoderm, suggesting functions in patterning the anterior
anlagen.
To control for potential off-target effects, we tested these 13 genes by injecting dsRNA
fragments not overlapping with the original dsRNA fragments ("non-overlapping fragments",
NOFs). All phenotypes were identical to those observed for the original dsRNA fragments
(not shown).
Larval phenotypes basically resemble the expression of the candidates: genes being expressed at the posterior pole predominantly display posterior truncations or aberrations
(Figure 5). For instance, larvae depleted for TC004989, TC005697, or TC003946 show the loss
of abdominal segments, very similar to the loss of Torso-signalling (Schoppmeier and
Schroder, 2005) and RNAi with TC000868 and TC013474 results in the depletion of terminal
structures (i.e. Urgomphi and Pygopods). Candidates that are also expressed anteriorly frequently show additional head defects. The knockdown of TC006181 or TC006282 not only
167
Anhang
affects axis elongation, but also results in deformation of the larval head (Figure 5). For two
genes (TC004241 and TC008122) we observed the pronounced loss of the entire head without obvious axis elongation phenotypes (Figure 5). The head phenotype resembles that of
mild Tc-cic RNAi (Figures 1 and 5) and thus may represent gain-of-function phenotypes of
the terminal system.
While it remains to be elucidated to which degree these candidate genes are indeed
direct target genes of Torso-signalling, our study establishes that transcriptome sequencing
facilitates the identification of novel candidate genes for early anterior and posterior pattern
formation in Tribolium.
Tribolium Maelstrom is required throughout Tribolium embryogenesis
We selected the Tribolium ortholog of the Drosophila maelstrom gene for closer inspection.
Maelstrom (Mael) is a conserved PIWI-interacting RNA factor (piRNA), consisting of two domains, a HMG box and a MAEL domain (Sato and Siomi, 2015). In Drosophila, piRNA factors
are required for transcriptional transposon silencing in both, germ and ovarian somatic cells
and the knock-down of mael results in the derepression of transposons similar to Piwi mutants (Sato and Siomi, 2015). In addition, Mael coordinates axis specification through nucleating microtubule-organizing center (MTOC) components (Sato et al., 2011). Loss of Mael
function disturbs mRNA localization patterns similar to gurken mutants: bcd mRNA accumulates at both poles and osk mRNA in the centre of the oocyte. Mutations in mael also disrupt
both oocyte nucleus migration to the anterior-dorsal corner and posterior localization of the
MTOC (Clegg et al., 2001; Clegg et al., 1997; Findley et al., 2003; Sato et al., 2011).
The Tribolium genome inherits a single maelstrom ortholog (Tc-mael, TC008172). Tc-mael is
expressed maternally and transcripts accumulate at the anterior pole of unfertilized eggs
(Figure 6 A). During blastoderm stages, Tc-mael expression becomes expressed at the posterior pole. This domain persists until gastrulation (Figure 6 C, E). Later, Tc-mael expression is
not longer detectable (not shown).
Knocking down Tc-mael by RNAi results in a range of phenotypes (Figure 7 and supplementary table S4). About 60% of the larvae lack all growth-zone derived structures: Abdominal
segments and terminal structures are lost, resembling the loss-of Torso-signalling
(Schoppmeier and Schroder, 2005). These posterior truncation phenotypes were occasion168
Anhang
ally (about 20%) accompanied by aberrations of the larval head. Head phenotypes, however,
are highly variable and may include deformations and / or deletions of pre-gnathal and gnathal segments. While these phenotypes likely reveal Tribolium mael functions in early embryonic patterning (see below), we observed additional effects of Tc-mael depletion during
subsequent stages. RNAi with Tc-mael results in incorrect dorsal closure, generating completely or partially everted (so called inside-out) larvae (12,5%). Such phenotypes were reported to arise from failure in the fusion of amnion and serosa at the extended germ-band
stage (van der Zee et al., 2005). In wildtype, merging of the late amniotic epithelium with the
serosa ruptures the amniotic cavity and enables the left and right lateral epidermis of the
embryo to close along the dorsal midline (van der Zee et al., 2005).
To analyse the impact of Tc-mael RNAi, we performed time-lapse recordings of EFA-nGFP
embryos (Figure 8 and Movie S3) (Sarrazin et al., 2012). Upon Tc-mael RNAi, anterior germrudiment formation is impaired: Head anlagen of Tc-mael RNAi embryos are expanded and
less condensed as compared to wildtype (Figure 8 E). Also serosa window formation remains
incomplete to some degree (see also below). During wildtype germ-band elongation the
head region extends to an anterior-dorsal position. New segments are added sequentially
out of the growth-zone and the germ-band extends posteriorly (Figure 8 and supplementary
Movie S1). Upon Tc-mael RNAi, the head anlagen still moves in anterior ventral direction,
posterior elongation, however, fails (Figure 8 J, K, L; and Movie S3), supporting a function for
Tc-mael in growth-zone formation and / or axis elongation (see below).
Unexpectedly, we observed the premature rupturing of the serosa at a posterior-dorsal position (Figure 8 K, L; Movie S3). The serosa retracts and eventually, anterior parts of the embryo are covered with serosal remnants. In wildtype, serosal withdrawal does not occur until
the onset of dorsal closure (Panfilio et al., 2013). Thus, in Tc-mael RNAi serosa withdrawal
starts prematurely and at an inappropriate position. It´s tempting to speculate that premature serosa rupturing may contribute to the larval inside-out phenotype.
Maelstrom affects serosa patterning and morphogenesis
To uncover the influence of Tc-mael on the formation of extraembryonic membranes and
patterning of anterior embryonic anlagen in more detail, we visualized the emergence of
these primordia by analysing the Tc-eve and Tc-zen-1 expression (Falciani et al., 1996; Patel
169
Anhang
et al., 1994) (Figure 9). Upon Tc-mael knockdown the blastodermal Tc-zen-1 domain is
smaller, indicating a reduction of the serosa primordia (Figure 9 B). The first and second primary Tc-eve domains (Tc-eve stripe 1 and stripe 2) are basically present, but reduced and
less defined to some degree (Figure 9 B, D).
During gastrulation extraembryonic membranes fold over anterior and posterior embryonic
margins, thereby completing the rim of a serosal window (Handel et al., 2000). Tc-zen-1 is
expressed throughout serosal window formation and closure, with high expression levels at
the margin of the serosa window (Figure 9 C). Upon Tc-mael knockdown Tc-zen-1 expression
is lost from the anterior rim of serosa window (Figure 9 D, G). Serosa window formation remains incomplete and head primordia appear to be less condensed and shifted towards the
anterior pole of the egg (Figure 9 D). At that stage there are no obvious effects on anterior
Tc-eve expression: The first and second primary Tc-eve stripes have split, while the 3rd double-segmental domain is present (Figure 9 G), reflecting that gnathal and thoracic anlagen
are present. The fourth primary Tc-eve domain, however, does not form properly and in addition, posterior morphology becomes highly irregular (Figure 9 G, H). These results indicate
that posterior elongation is terminated at that stage, which is corroborated by the larval
truncation phenotypes.
Thus, Tc-mael is required for the formation of growth-zone derived segments and in addition,
involved in serosal size regulation and head morphogenesis.
Maelstrom is required for growth-zone formation
Given the larval and embryonic truncation phenotypes and the loss of posterior Tc-eve
stripes, Tribolium mael likely is required for axis elongation. To reveal whether Tc-mael is
already involved in setting up a functional growth-zone, we monitored the expression of of
Tc-wg and Tc-wntD/8 (Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b) (Figure 10). In wildtype, wnt-signalling is required for growth-zone formation and axis elongation. The knockdown of wntD/8 or Wnt receptors Tc-fz1 / Tc-fz2, respectively, results in disturbed growthzone formation and impaired embryonic axis elongation (Beermann et al., 2011; Bolognesi et
al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b). We found that in Tc-mael RNAi, the terminal Tc-wg domain was basically present (not shown). Interestingly, we found a strong effect on Tc-wntD/8
expression. In wildtype, Tc-wntD/8 is expressed in a small domain at the posterior pole of
170
Anhang
the embryo (Figure 10 A). Upon Tc-mael RNAi this domain is notably enlarged (Figure 10 C).
Even though the consequences of Tc-wntD/8 overexpression remain to be elucidated, it´s
reasonable to assume that misexpression and / or -positioning of the early Tc-wntD/8 domain may result in impaired growth-zone formation. Consequently, axis elongation is terminated prematurely, resulting in truncated embryos and larvae.
Next, we monitored Tc-mael expression in both, Tc-tsl and Tc-cic depleted embryos. As expected, we observed an expansion of Tc-mael expression in Tc-cic RNAi (Figure 11 E), while
in Tc-tsl RNAi expression was basically lost (Figure 11 C). Thus, Tribolium maelstrom is indeed
a target gene of the terminal system in this beetle.
Discussion
Tribolium Capicua antagonizes torso-signalling
In this study, we examined the functions of the HGM-box gene capicua during early Tribolium embryogenesis. The depletion of Tc-cic results in the expansion of terminal anlagen
and depression of terminal target genes, reflecting depression (i.e. gain of function) phenotypes of Torso-signalling (Figure 3). This basically resembles the situation in Drosophila
(Jimenez et al., 2000; Paroush et al., 1997), indicating that Tc-cic fulfils conserved roles in
antagonising Torso-signalling in Tribolium.
While the functions of Tribolium capicua in terminal patterning may very well be conserved,
we did not observe any obvious impact of Tc-cic on dorso-ventral pattern formation. In Drosophila, the function of Cic is not restricted to Torso-RTK signalling. Earlier in development,
EGFR signalling also appears to establish antagonistic interactions with Cic. Among others,
the EGFR pathway patterns the DV axis of both the embryo and the eggshell (Ray and
Schupbach, 1996). During Drosophila oogenesis, Cic is required to translate EGFR signalling
into asymmetric pipe expression, as Cic-mediated repression of mirrow promotes pipe transcription in ventral follicle-cells (Andreu et al., 2012; Astigarraga et al., 2007; Goff et al.,
2001). The activation of a protease cascade by Pipe culminates in the establishment of a nuclear Dorsal gradient (Moussian and Roth, 2005).
171
Anhang
In Tribolium, EGF signalling has broadly conserved roles in setting up the DV axis of the embryo (Lynch et al., 2010). The depletion of the Tribolium gurken ortholog (Tc-Tgf-alpha) results in the ventralisation of embryos, resembling Tc-dpp RNAi phenotypes to some degree
(van der Zee et al., 2006). In both, Tc-Tgf-alpha and Tc-dpp RNAi the first morphologically
visible sign of DV polarity, the obliqueness of the border between serosa and germ rudiment,
is lost (Lynch et al., 2010; van der Zee et al., 2006). However, as indicated by morphology
and Tc-zen-1 expression, Tc-cic RNAi does not affect the obliqueness of the serosa / germ
rudiment border (Figure 2 and 3). Thus, in Tribolium there is no obvious antagonistic interaction of EGFR-signalling with Cic in embryonic DV axis formation.
The expansion of the serosa in Tc-cic RNAi embryos goes along with de-repression of Tc-zen1 (Figure 3 G, I). At first glance this situation resembles that of Drosophila, as knockdown of
Dm-cic results in the lateral expansion of Dm-zen expression (Astigarraga et al., 2007;
Jimenez et al., 2000; Kim et al., 2011). In Drosophila, zen is broadly activated by maternal
factors (Rushlow et al., 1987). During early blastoderm stages, cic participates in the ventral
and lateral repression of zen by Dorsal (Dl) (Astigarraga et al., 2007; Jimenez et al., 2000; Kim
et al., 2011). At the poles, Dl-mediated repression of zen is antagonized by Torso signalling
(Rusch and Levine, 1994), which likely depends on MAPK-dependent down-regulation of Cic
(Kim et al., 2011). The situation in Tribolium is different from Drosophila. The distinction between serosa and germ rudiment is primarily set up by inputs from the AP system and secondarily modulated through DV signalling. In particular, Tc-zen-1 expression and thus, serosa
size regulation depends on the combined activity of terminal signalling and Tc-orthodenticle
(Kotkamp et al., 2010), while the obliqueness of the border between serosa and germ rudiment is subsequently established by EFGR and BMP signalling (Lynch et al., 2010; Nunes da
Fonseca et al., 2010; Nunes da Fonseca et al., 2008; Van der Zee et al., 2008; van der Zee et
al., 2006). Given that serosal size regulation, but not the obliqueness of the border between
serosa and germ rudiment is affected in Tc-cic RNAi, it appears that eggs produced after Tccic depletion maintain normal embryonic DV polarity.
172
Anhang
Next generation sequencing facilitates the identification of candidate genes
In Tribolium Torso-RTK signalling is required to pattern anterior and posterior terminal anlagen. Our work identifies the first comprehensive target gene sets of the terminal system in a
short germ embryo.
The majority of candidate gens are related to axis elongation (Figure 5). Truncation phenotypes, however, are not necessarily linked to growth-zone formation, but may resemble subsequent functions in morphogenesis (e.g. convergent extension), maintenance, or even basic
cellular functions such as cell division or metabolism. Still, most of the candidate genes are
expressed posteriorly already during early stages of development, indicating that they may
rather be required for initial steps in growth-zone formation.
In Drosophila, the formation of anterior anlagen depends on the antagonistic activities of
Torso and the anterior morphogen Bicoid (Lohr et al., 2009; Ronchi et al., 1993). Bcd, however, is limited to cyclorrhaphan flies (Brown et al., 2001; Stauber et al., 1999). Still, also in
Tribolium anterior vs. posterior functions of the terminal system need to be distinguished.
We now have identified at set of six candidate gens that are indeed expressed in early anterior domains and in addition, affect early anterior embryonic patterning upon knockdown
(Figure 5). Interestingly, the depletion of these candidate genes results in early embryonic
lethality with a high frequency. Such empty-egg or no cuticle phenotypes comprise genes
with diverse essential functions, including housekeeping, cuticle formation itself or fertilization (Schmitt-Engel et al., 2015). However, also some early patterning genes (e.g. Tc-otd, Tcaxin, or Tc-cad) were shown to result in death before cuticle formation in Tribolium (Copf et
al., 2004; Fu et al., 2012; Kotkamp et al., 2010). Hence further analyses using additional molecular markers are required to determine which process was affected for a given candidate
gene.
Even though it remains to be elucidated how anterior vs. posterior functions of the terminal
system are distinguished in Tribolium, our results demonstrate that a differential gene expression screen has the power to identify novel patterning genes independently of previous
knowledge.
173
Anhang
Maelstrom is required for early terminal patterning and morphogenesis
The depletion of Tribolium maelstrom by RNAi affects axis elongation, germ-band condensation, and the formation of the extra-embryonic serosa (Figure 7, 8, and 9). In Drosophila,
Mael is involved in transcriptional transposon silencing (Sato and Siomi, 2015). Moreover,
Mael coordinates oocyte polarity through interaction with components of the microtubuleorganizing centre (MTOC) (Sato et al., 2011). Achieving proper cell polarity is essential for
diverse processes, including cell shape changes and cell migration, asymmetric cell division,
and morphogenesis (St Johnston and Ahringer, 2010). Also early Tribolium development depends on extensive cell-polarization events (Benton et al., 2013; Handel et al., 2000). RNAi
with Tc-mael disturbs the anterior condensation of the embryonic anlagen and prevents
proper serosa window formation (Fig. 8 and 9), suggesting that - equivalent to the situation
in Drosophila (Clegg et al., 2001; Clegg et al., 1997; Findley et al., 2003; Sato et al., 2011) - in
absence of Tc-mael cell polarity may not be established appropriately, which in turn may
affect early morphogenesis. Although we currently cannot exclude that Tc-mael RNAi phenotypes are due to impaired transposon silencing, we posit that Tc-Mael coordinates cell polarity (possibly by acting on MTOC organisation) at least in serosa morphogenesis and anterior
germ-band condensation in a Torso-signalling dependent manner.
While serosa phenotypes indeed resemble aspects of Tc-tsl or Tc-tor RNAi phenotypes, we
observed additional defects in head development upon Tc-mael knock-down. At first glance
Tc-mael RNAi head phenotypes are not related to terminal patterning. As mentioned before,
anterior Torso-signalling is involved in serosal size regulation (Schoppmeier and Schroder,
2005). The loss or reduction of this extra embryonic membrane by Tc-tsl or Tc-zen-1 RNAi
results in the expansion of the head anlagen, which is largely compensated later in development (Schoppmeier and Schroder, 2005; van der Zee et al., 2005). Nevertheless, a small faction of larvae depleted for Tc-zen-1 or Tc-tsl do also display head defects (van der Zee et al.,
2005) (our unpublished observation). These phenotypes are highly variable and thus, may
rather reflect defects during size compensation and head morphogenesis instead of specific
functions in head patterning. Given that Mael coordinates cell shape and cell migration, our
results strongly suggest that these head phenotypes may reflect insufficient size compensation and head morphogenesis rather than specific functions of Tc-mael patterning the head
anlagen.
174
Anhang
At the posterior pole, Tc-mael function is necessary for growth-zone formation. Upon Tcmael knock-down, expression of Tc-wntD/8 is disturbed and posterior elongation is terminated prematurely (Figures 7 and 10). Given that Tc-wntD/8 is under control of Torsosignalling (Figure 3) (Bolognesi et al., 2008b; Schoppmeier and Schroder, 2005), our results
suggest that posterior patterning by Torso may be realized, at least in part, through Maelstrom depended activation or positioning of posterior wnt-domains.
On the other hand, the knock-down of Tc-wntD8 only results in a small percentage of embryos lacking abdominal segments and additional removal of Tc-wg only enhanced the penetrance of this phenotype to some degree (Bolognesi et al., 2008a). As effects of Tc-mael RNAi
on growth-zone formation and axis elongation are considerably more severe, Tc-mael likely
fulfils additional functions in posterior patterning. This may involve the coordination of cell
polarity during gastrulation (Benton et al., 2013; Handel et al., 2000). However, we did not
observe any obvious effect of Tc-mael RNAi on posterior invagination and posterior amniotic
fold formation (Figure 8), suggesting that posterior morphogenetic movements might be
largely unaffected.
During oogenesis, Drosophila mael mutants fail to establish cytoplasmic polarity, and to
normally accumulate Gurken. Also other polarity markers (e.g. osk, BicD) fail to accumulate
in the posterior ooplasm, and bcd mRNA becomes localized at both poles (Clegg et al., 2001;
Clegg et al., 1997; Findley et al., 2003; Sato et al., 2011). The Tribolium grk orthologue has no
major role in AP axis formation, but rather acts in dorso-ventral patterning (Lynch et al.,
2010). Still, an important role for localized maternal determinants has long been postulated
for several insect taxa including crickets, beetles, and flies. However, thus far the existence
of two morphogenetic centers (anterior and posterior) has only been proven for the longgerm wasp Nasonia vitripennis (Rosenberg et al., 2009). Tribolium utilizes anterior mRNA
localization to some degree (Fu et al., 2012). Posterior localized maternal determinants,
however, have not been identified yet (Schmitt-Engel et al., 2012). While posterior patterning in Tribolium may depend on specially restricted polarity cues (i.e. the terminal system)
that regulate short-range acting target genes required for axis elongation, like Wnt-signaling
(Beermann et al., 2011; Bolognesi et al., 2008a; Bolognesi et al., 2008b) rather than on longrange acting gradients (i.e. Nanos) (Schmitt-Engel et al., 2012), it´s tempting to speculate
that Tc-mael promotes growth-zone formation by localizing an as yet unknown posterior
maternal determinant. Given that Tc-tsl is already expressed in terminal follicle cells, the
175
Anhang
terminal system may already be active during Tribolium oogenesis (Baumer et al., 2010).
Thus, Torso-signaling may promote oocyte polarization and consequently, posterior localization of maternal factors in a Mael depended manner.
Methods
Histology
Fixation and single in situ and immunofluorescence staining were performed using standard
protocols (Patel et al., 1989; Tautz and Pfeifle, 1989). Embryos were subsequently counterstained with Hoechst 33342.
RNAi
Parental RNAi and dsRNA synthesis was performed as described (Bucher and Klingler,
2004; Bucher et al., 2002). dsRNAs were injected into female pupae at a concentration 1
µg/µl. RNAi phenotypes were confirmed by injecting of non-overlapping-dsRNA fragments.
RNAi for all fragments yielded in identical phenotypes, excluding the possibility that an unrelated gene was affected (off target effects).
Cuticle preparation
First instar larvae were cleared in lactic acid/10% ethanol overnight at 60 °C. Cuticles
were transferred to a drop of lactic acid on a slide. The cuticular autofluorescence was detected on a Zeiss Axiophot microscope, and maximum projection images were created from
z stacks using the Analysis D software (Olympus).
Transcriptome Sequencing
Sequencing was done on a SOLiD 4 system (Life Technologies) using 50bp fragment reads.
Mapping
to
the
Tcas3
reference
genome
(http://bioinf.uni-
greifswald.de/gb2/gbrowse/tribolium/) and counting were performed using LifeScope version 2.5, also by Life Technologies. In order to filter out adapters, ribosomal and tRNAs, a
filter reference file was created using the adapter sequences provided from Life Technolo-
176
Anhang
gies, large and small subunit rRNA sequences from the reference and the results of a tRNAscan-SE (v1.1) run over the reference sequence.
Samples T1 (wildtype), T2 (tsl RNAi) and T3 (cic RNAi), mapped read counts were 15,517,184;
6,172,710 and 31,441,775; respectively. Counting yielded read counts for 143,603 exons in
16,543 transcripts as provided by the Tcas3 reference. Normalization and comparison of
expression levels between all 3 samples was performed using DESeq (Anders and Huber,
2010).
Data access
The complete dataset, including all relevant parameters, was deposited at NCBI under accession number PRJNA311251.
Live imaging
For time-lapse imaging, the EFA-nGFP-strain of Tribolium castaneum was used (Sarrazin et al.,
2012). Parental RNAi was performed as described by (Bucher et al., 2002). For live imaging
embryos (4 to 6h) were treated with 12.5% bleach for two times 30 seconds and then rinsed
with tap water. Embryos were then mounted in a hanging drop of Sigma Halocarbon oil 700.
For time-lapse imaging, a Leica TCS SP5 II Confocal System was used. Stacks were recorded
about every 12 minutes for an interval of 12 hours at 10x magnification and room temperature. Processing of the image stacks was done in LAS AF Version 2.4.1 build 638 and Fiji
(Schindelin et al., 2012).
Acknowledgments:
We are grateful to Martin Klingler for continuous support. The lab of M.S. is funded through
grants by the German Research Foundation (DFG: SCHO 1058 5-1). We are very thankful for
valuable comments from the anonymous reviewers.
Author contributions
Conceived and designed the experiments: FP, MS. Acquisition of data: FP, MW, NK, AS, AE.
Analysis and interpretation of data: FP, MW, SU, MS. Writing the manuscript: MS
177
Anhang
Competing financial interests:
All authors declare no competing financial interests.
Supplementary files:
Figure S1: Phenotypic analysis of Tc-cic RNAi experiments
Table S2: Differential expression screen
Table S3: Results of the candidate-screen
Figure S4: phenotypic analysis of Tc-mael RNA
Supplementary Movies
Movie S1: Tribolium wt development
Movie S2: Tc-cic RNAi
Movie S3: Tc-mael RNAi
References
Ajuria, L., Nieva, C., Winkler, C., Kuo, D., Samper, N., Andreu, M. J., Helman, A., Gonzalez-Crespo, S.,
Paroush, Z., Courey, A. J., et al. (2011). Capicua DNA-binding sites are general response elements for
RTK signaling in Drosophila. Development 138, 915-924.
Anders, S. and Huber, W. (2010). Differential expression analysis for sequence count data. Genome
Biol 11, R106.
Andreu, M. J., Gonzalez-Perez, E., Ajuria, L., Samper, N., Gonzalez-Crespo, S., Campuzano, S. and
Jimenez, G. (2012). Mirror represses pipe expression in follicle cells to initiate dorsoventral axis
formation in Drosophila. Development 139, 1110-1114.
Astigarraga, S., Grossman, R., Diaz-Delfin, J., Caelles, C., Paroush, Z. and Jimenez, G. (2007). A MAPK
docking site is critical for downregulation of Capicua by Torso and EGFR RTK signaling. EMBO J 26,
668-677.
Barker, D. D., Wang, C., Moore, J., Dickinson, L. K. and Lehmann, R. (1992). Pumilio is essential for
function but not for distribution of the Drosophila abdominal determinant Nanos. Genes Dev 6, 23122326.
Baumer, D., Trauner, J., Hollfelder, D., Cerny, A. and Schoppmeier, M. (2010). JAK-STAT signalling is
required throughout telotrophic oogenesis and short-germ embryogenesis of the beetle Tribolium.
Dev Biol DOI: 10.1016/j.ydbio.2010.10.020.
Beermann, A., Pruhs, R., Lutz, R. and Schroder, R. (2011). A context-dependent combination of Wnt
receptors controls axis elongation and leg development in a short germ insect. Development 138,
2793-2805.
Benton, M. A., Akam, M. and Pavlopoulos, A. (2013). Cell and tissue dynamics during Tribolium
embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development 140, 3210-3220.
Bolognesi, R., Beermann, A., Farzana, L., Wittkopp, N., Lutz, R., Balavoine, G., Brown, S. J. and
Schroder, R. (2008a). Tribolium Wnts: evidence for a larger repertoire in insects with overlapping
178
Anhang
expression patterns that suggest multiple redundant functions in embryogenesis. Dev Genes Evol 218,
193-202.
Bolognesi, R., Farzana, L., Fischer, T. D. and Brown, S. J. (2008b). Multiple Wnt genes are required
for segmentation in the short-germ embryo of Tribolium castaneum. Curr Biol 18, 1624-1629.
Brown, S., Fellers, J., Shippy, T., Denell, R., Stauber, M. and Schmidt-Ott, U. (2001). A strategy for
mapping bicoid on the phylogenetic tree. Curr Biol 11, R43-44.
Bucher, G. and Klingler, M. (2004). Divergent segmentation mechanism in the short germ insect
Tribolium revealed by giant expression and function. Development 131, 1729-1740.
Bucher, G., Scholten, J. and Klingler, M. (2002). Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol 12,
R85-86.
Casanova, J. (2005). Developmental evolution: torso--a story with different ends? Curr Biol 15, R968970.
Clegg, N. J., Findley, S. D., Mahowald, A. P. and Ruohola-Baker, H. (2001). Maelstrom is required to
position the MTOC in stage 2-6 Drosophila oocytes. Dev Genes Evol 211, 44-48.
Clegg, N. J., Frost, D. M., Larkin, M. K., Subrahmanyan, L., Bryant, Z. and Ruohola-Baker, H. (1997).
maelstrom is required for an early step in the establishment of Drosophila oocyte polarity: posterior
localization of grk mRNA. Development 124, 4661-4671.
Copf, T., Schroder, R. and Averof, M. (2004). Ancestral role of caudal genes in axis elongation and
segmentation. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 17711-17715.
de las Heras, J. M. and Casanova, J. (2006). Spatially distinct downregulation of Capicua repression
and tailless activation by the Torso RTK pathway in the Drosophila embryo. Mech Dev 123, 481-486.
Driever, W. and Nusslein-Volhard, C. (1988). The bicoid protein determines position in the
Drosophila embryo in a concentration-dependent manner. Cell 54, 95-104.
Falciani, F., Hausdorf, B., Schroder, R., Akam, M., Tautz, D., Denell, R. and Brown, S. (1996). Class 3
Hox genes in insects and the origin of zen. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 8479-8484.
Findley, S. D., Tamanaha, M., Clegg, N. J. and Ruohola-Baker, H. (2003). Maelstrom, a Drosophila
spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa and RDE1/AGO1 homolog, Aubergine,
in nuage. Development 130, 859-871.
Fu, J., Posnien, N., Bolognesi, R., Fischer, T. D., Rayl, P., Oberhofer, G., Kitzmann, P., Brown, S. J.
and Bucher, G. (2012). Asymmetrically expressed axin required for anterior development in
Tribolium. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 7782-7786.
Furriols, M. and Casanova, J. (2003). In and out of Torso RTK signalling. EMBO J 22, 1947-1952.
Goff, D. J., Nilson, L. A. and Morisato, D. (2001). Establishment of dorsal-ventral polarity of the
Drosophila egg requires capicua action in ovarian follicle cells. Development 128, 4553-4562.
Grillo, M., Furriols, M., de Miguel, C., Franch-Marro, X. and Casanova, J. (2012). Conserved and
divergent elements in Torso RTK activation in Drosophila development. SCIENTIFIC REPORTS
doi:10.1038/srep00762.
179
Anhang
Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S. and Sander, K. (2000). Tribolium embryogenesis: a SEM study
of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol 210, 167-179.
Jimenez, G., Guichet, A., Ephrussi, A. and Casanova, J. (2000). Relief of gene repression by torso RTK
signaling: role of capicua in Drosophila terminal and dorsoventral patterning. Genes Dev 14, 224-231.
Johnson, T. K., Henstridge, M. A., Herr, A., Moore, K. A., Whisstock, J. C. and Warr, C. G. (2015).
Torso-like mediates extracellular accumulation of Furin-cleaved Trunk to pattern the Drosophila
embryo termini. Nature communications 6, 8759.
Kim, Y., Andreu, M. J., Lim, B., Chung, K., Terayama, M., Jimenez, G., Berg, C. A., Lu, H. and
Shvartsman, S. Y. (2011). Gene regulation by MAPK substrate competition. Dev Cell 20, 880-887.
Klingler, M. (2004). Tribolium. Curr Biol 14, R639-640.
Kotkamp, K., Klingler, M. and Schoppmeier, M. (2010). Apparent role of Tribolium orthodenticle in
anteroposterior blastoderm patterning largely reflects novel functions in dorsoventral axis formation
and cell survival. Development 137, 1853-1862.
Li, W. X. (2005). Functions and mechanisms of receptor tyrosine kinase Torso signaling: lessons from
Drosophila embryonic terminal development. Dev Dyn 232, 656-672.
Liaw, G. J. and Lengyel, J. A. (1993). Control of tailless expression by bicoid, dorsal and synergistically
interacting terminal system regulatory elements. Mech Dev 40, 47-61.
Lohr, U., Chung, H. R., Beller, M. and Jackle, H. (2009). Antagonistic action of Bicoid and the
repressor Capicua determines the spatial limits of Drosophila head gene expression domains. Proc
Natl Acad Sci U S A 106, 21695-21700.
Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M. and Roth, S. (2010). EGF signaling and the origin of
axial polarity among the insects. Curr Biol 20, 1042-1047.
Macdonald, P. M. (1992). The Drosophila pumilio gene: an unusually long transcription unit and an
unusual protein. Development 114, 221-232.
Mineo, A., Furriols, M. and Casanova, J. (2015). Accumulation of the Drosophila Torso-like protein at
the blastoderm plasma membrane suggests that it translocates from the eggshell. Development 142,
1299-1304.
Moussian, B. and Roth, S. (2005). Dorsoventral axis formation in the Drosophila embryo--shaping
and transducing a morphogen gradient. Curr Biol 15, R887-899.
Nagy, L. M. and Carroll, S. (1994). Conservation of wingless patterning functions in the short-germ
embryos of Tribolium castaneum. Nature 367, 460-463.
Nunes da Fonseca, R., van der Zee, M. and Roth, S. (2010). Evolution of extracellular Dpp
modulators in insects: The roles of tolloid and twisted-gastrulation in dorsoventral patterning of the
Tribolium embryo. Dev Biol 345, 80-93.
Nunes da Fonseca, R., von Levetzow, C., Kalscheuer, P., Basal, A., van der Zee, M. and Roth, S.
(2008). Self-regulatory circuits in dorsoventral axis formation of the short-germ beetle Tribolium
castaneum. Dev Cell 14, 605-615.
180
Anhang
Nüsslein-Volhard, C., Frohnhofer, H. G. and Lehmann, R. (1987). Determination of anteroposterior
polarity in Drosophila. Science 238, 1675-1681.
Panfilio, K. A., Oberhofer, G. and Roth, S. (2013). High plasticity in epithelial morphogenesis during
insect dorsal closure. Biology open 2, 1108-1118.
Paroush, Z., Wainwright, S. M. and Ish-Horowicz, D. (1997). Torso signalling regulates terminal
patterning in Drosophila by antagonising Groucho-mediated repression. Development 124, 38273834.
Patel, N. H., Condron, B. G. and Zinn, K. (1994). Pair-rule expression patterns of even-skipped are
found in both short- and long-germ beetles. Nature 367, 429-434.
Patel, N. H., Kornberg, T. B. and Goodman, C. S. (1989). Expression of engrailed during segmentation
in grasshopper and crayfish. Development 107, 201-212.
Ray, R. P. and Schupbach, T. (1996). Intercellular signaling and the polarization of body axes during
Drosophila oogenesis. Genes Dev 10, 1711-1723.
Richards, S., Gibbs, R. A., Weinstock, G. M., Brown, S. J., Denell, R., Beeman, R. W., Gibbs, R.,
Bucher, G., Friedrich, M., Grimmelikhuijzen, C. J., et al. (2008). The genome of the model beetle and
pest Tribolium castaneum. Nature 452, 949-955.
Ronchi, E., Treisman, J., Dostatni, N., Struhl, G. and Desplan, C. (1993). Down-regulation of the
Drosophila morphogen bicoid by the torso receptor-mediated signal transduction cascade. Cell 74,
347-355.
Rosenberg, M. I., Lynch, J. A. and Desplan, C. (2009). Heads and tails: Evolution of antero-posterior
patterning in insects. Biochim Biophys Acta 1789, 333-342.
Rusch, J. and Levine, M. (1994). Regulation of the dorsal morphogen by the Toll and torso signaling
pathways: a receptor tyrosine kinase selectively masks transcriptional repression. Genes Dev 8, 12471257.
Rushlow, C., Frasch, M., Doyle, H. and Levine, M. (1987). Maternal regulation of zerknullt: a
homoeobox gene controlling differentiation of dorsal tissues in Drosophila. Nature 330, 583-586.
Sarrazin, A. F., Peel, A. D. and Averof, M. (2012). A segmentation clock with two-segment periodicity
in insects. Science 336, 338-341.
Sato, K., Nishida, K. M., Shibuya, A., Siomi, M. C. and Siomi, H. (2011). Maelstrom coordinates
microtubule organization during Drosophila oogenesis through interaction with components of the
MTOC. Genes Dev 25, 2361-2373.
Sato, K. and Siomi, M. C. (2015). Functional and structural insights into the piRNA factor Maelstrom.
FEBS Lett 589, 1688-1693.
Savant-Bhonsale, S. and Montell, D. J. (1993). torso-like encodes the localized determinant of
Drosophila terminal pattern formation. Genes Dev 7, 2548-2555.
Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S.,
Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., et al. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image
analysis. Nature methods 9, 676-682.
181
Anhang
Schmitt-Engel, C., Cerny, A. C. and Schoppmeier, M. (2012). A dual role for nanos and pumilio in
anterior and posterior blastodermal patterning of the short-germ beetle Tribolium castaneum. Dev
Biol 364, 224-235.
Schmitt-Engel, C., Schultheis, D., Schwirz, J., Strohlein, N., Troelenberg, N., Majumdar, U., Dao, V.
A., Grossmann, D., Richter, T., Tech, M., et al. (2015). The iBeetle large-scale RNAi screen reveals
gene functions for insect development and physiology. Nature communications 6, 7822.
Schoppmeier, M., Fischer, S., Schmitt-Engel, C., Lohr, U. and Klingler, M. (2009). An Ancient Anterior
Patterning System Promotes Caudal Repression and Head Formation in Ecdysozoa. Curr Biol, 18111815.
Schoppmeier, M. and Schroder, R. (2005). Maternal torso signaling controls body axis elongation in a
short germ insect. Curr Biol 15, 2131-2136.
Schroder, R., Eckert, C., Wolff, C. and Tautz, D. (2000). Conserved and divergent aspects of terminal
patterning in the beetle Tribolium castaneum. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6591-6596.
St Johnston, D. and Ahringer, J. (2010). Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity. Cell
141, 757-774.
St Johnston, D. and Nusslein-Volhard, C. (1992). The origin of pattern and polarity in the Drosophila
embryo. Cell 68, 201-219.
Stauber, M., Jackle, H. and Schmidt-Ott, U. (1999). The anterior determinant bicoid of Drosophila is
a derived Hox class 3 gene. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 3786-3789.
Stevens, L. M., Beuchle, D., Jurcsak, J., Tong, X. and Stein, D. (2003). The Drosophila embryonic
patterning determinant torsolike is a component of the eggshell. Curr Biol 13, 1058-1063.
Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of
specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene
hunchback. Chromosoma 98, 81-85.
van der Zee, M., Berns, N. and Roth, S. (2005). Distinct functions of the Tribolium zerknullt genes in
serosa specification and dorsal closure. Curr Biol 15, 624-636.
Van der Zee, M., da Fonseca, R. N. and Roth, S. (2008). TGFbeta signaling in Tribolium: vertebratelike components in a beetle. Dev Genes Evol 218, 203-213.
van der Zee, M., Stockhammer, O., von Levetzow, C., Nunes da Fonseca, R. and Roth, S. (2006).
Sog/Chordin is required for ventral-to-dorsal Dpp/BMP transport and head formation in a short germ
insect. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16307-16312.
Wang, C. and Lehmann, R. (1991). Nanos is the localized posterior determinant in Drosophila. Cell 66,
637-647.
182
Anhang
Figure legends:
Figure 1: Larval Tc-capicua and Tc-torso-like RNAi phenotypes
Cuticle of wildtype (A),Tc-cic (B-C), and Tc-tsl (D) RNAi larvae. (B) Mildly affected Tc-cic RNAi
larvea display head defects (arrows). (C) In strong phenotypes, cuticle remnants with
Urogomphile-like structures were obvious (arrow). (D) Tc-tsl RNAi larvae are depleted of
growth-zone derived segments. The first thoracic segment (T1) is unaffected, T2 is reduced
(arrowhead). All panels in all pictures: anterior to the left. A-B: lateral views and D: ventral
view.
Figure 2: Live imaging of Tc-cic RNAi
Live imaging of wildtype and Tc-cic RNAi in the transgenic Tribolium EFA-nGFP line. Columns
show nGFP labelled stage matched embryo at representative time-points. (A, C, E, G) lateral
views of wt embryos at differentiated blastoderm (A), posterior-pit (C), invagination (E), and
serosa closure stages (G). (B, D, F, H) corresponding stages of Tc-cic RNAi. Arrows mark the
serosa / embryo boundary, asterisks the side of gastrulation. See text for details.
Figure 3: Expression of terminal target genes in Tc-cic and Tc-tsl RNAi
Expression of Tc-eve (A-C), Tc-zen-1 (D-F), Tc-wg (J-L), Tc-wnt D/8 (M-O), and Tc-tll (P-R) in
wildtype (A, D, G, J, M, P), Tc-tsl (B, E, H, K, N, Q), and Tc-cic RNAi (C, F, I, L, O, R). Embryos in
(A-C) were subsequently stained for the nuclear marker Hoechst 33342 (D-F). Embryos in (N,
O, Q) were double stained for Tc-otd to visualize the head anlagen (bars). In wildtype (A, B)
Tc-eve is expressed in three primary stripes (1-3) that eventually will split and give rise to
segmental (1a, 1b) domains. In Tc-tsl RNAi (B, E), Tc-eve stripes are shifted toward the anterior, reflecting the expansion of the head anlagen (bar) at the expense of the serosa (arrowheads. In Tc-cic depleted embryos, (C, F) the serosa is expands (arrowheads), while the head
anlagen (bar) are reduced. (G) Tc-zen-1 is expressed in the anlagen of the serosa. Upon Tc-tsl
RNAi (H) Tc-zen-1 expression reduced, while Tc-zen-1 is expanded in Tc-cic RNAi (F). At the
blastoderm stage, Tc-wg (J) is expressed in the ocular domain (asterisk) and at the posterior
pole. In Tc-tsl RNAi (K) the posterior domain is absent. Tc-cic RNAi (L), results in the expansion of the posterior Tc-wg domain, while the head domain is lost. In wildtype blastoderm
stages, Tc-wnt D/8 and Tc-tll (M, P) are expressed at the posterior pole. After the knockdown
of Tc-tsl (N, Q) these domains are absent (asterisk). Tc-cic RNAi (O, R) results in the expansion of both domains.
Figure 4. Heat map of normalized expression
DESeq baseMeans of all Tribolium genes with a count greater than zero in any of the three
samples. Colors relate proportionally to the values within each row, from lowest (red) to
highest (white). T1: wildtype; T2: tsl RNAi, and T3: cic RNAi
183
Anhang
Figure 5: Results of the RNAi and expression screen
Twelve candidate genes were monitored for expression and function in AP patterning by
RNAi. Depletion of genes resulted in larval phenotypes, which in most occasions were associated with various quantities of no-egg phenotypes. See text for details.
Figure 6: Expression of Tc-mael
Expression of Tc-mael. Embryos in (A,C,E) were subsequently stained for Hoechst 33342
(B,D,F). (A) In unfertilized eggs, Tc-mael is expressed around the polar body and in an anterior domain of the embryo. (C) During undifferentiated blastodermal stages, Tc-mael is expressed in a distinct posterior expression domain (arrow) that is maintained in differentiated
blastodermal stages und invagination (D).
Figure 7: Tc-mael RNAi
Cuticle of Wildtype (A) and Tc-mael RNAi larvae (B-D). (B) Only remnants of pregnathal and
gnathal segments are left (arrows). The third thoracic segment is still formed (asterisks), but
all abdominal segments are deleted. (C) Weaker phenotypes show the reduction of the head
capsule. All abdominal segments are deleted. (D) Tc-mael-RNAi also results in inside-out
phenotypes affecting the whole larva or (E) only posterior segments.
Figure 8: Live imaging of Tc-meal RNAi
Live imaging detection of wildtype (A-B, G-H) and Tc-cic RNAi(D-F, J-L) in the transgenic Tribolium EFA-nGFP line. Columns show nGFP labelled stage matched embryo at representative
time-points.(A-C) In wildtype, the embryonic anlagen gives rise to germ-rudiment that pbecomes covered by the serosa. (D-F) Upon Tc-mae lRNAi, head anlagen are expanded and less
condensed (E, Arrow). Serosa window formation remains incomplete (E, Arrow and arrowhead). In wildtype, the germ-band extends posteriorly (G-I, asterisks). In Tc-mael RNAi posterior elongation fails (J-L, asterisks ). In addition, the serosa ruptures premature (K, L).
Figure 9: Expression of Tc-zen and Tc-eve in Tc-mael RNAi
Embryos double-stained for Tc-eve and Tc-zen-1. Embryos in (C, D, G) were subsequently
stained for Hoechst 33342 (E, F, H). In Tc-mael RNAi, the serosa anlagen is reduced (B, arrowheads). The first and second primary Tc-eve domains (B, bars) are basically present (C, E).
In wildtype, Tc-zen-1 is expressed at the margin of the serosa window. (D, F) In Tc-mael
knockdown, Tc-zen-1 expression lost from the anterior rim of serosa window (D, arrow). Serosa window formation is incomplete and head primordia are less condensed (D arrow, F
184
Anhang
asterisks). G) The fourth primary Tc-eve domain does not form properly and in addition, posterior morphology eventually becomes highly irregular.
Figure 10: Expression of wnt-genes in Tc-mael RNAi
Expression of Tc-wntD/8 in wildtype undifferentiated blastoderm stage (A, B) and Tc-mael
RNAi (C, D). Embryos in (B, D) were subsequently stained for Hoechst 33342 (A) In wildtype,
Tc-wntD/8 is expressed at the posterior pole (arrowheads). (C) Upon Tc-mael RNAi this domain is notably enlarged (arrowheads).
Figure 11: Tc-mael is a target gene of the terminal system
Expression of Tc-mael in wildtype (A), Tc-tsl RNAi (C), and Tc-cic RNAi (E). Embryos in (A, C, E)
were subsequently stained for Hoechst 33342 (B, D, F). (A) In Tc-tsl RNAi, Tc-mael expression
is basically lost, while (E) the Tc-mael domain expands upon Tc-cic RNAi. Arrows point to the
serosa - embryo boundary.
185
Anhang
Figure 1
186
Anhang
Figure 2
187
Anhang
Figure 3
188
Anhang
Figure 4
189
Anhang
Figure 5
190
Anhang
Figure 6
191
Anhang
Figure 7
192
Anhang
Figure 8
193
Anhang
Figure 9
194
Literaturverzeichnis
Figure 10
Figure 11
195
Literaturverzeichnis
Literaturverzeichnis
Adams, M. D., Celniker, S. E., Holt, R. A., Evans, C. A., Gocayne, J. D., Amanatides,
P. G., … Venter, J. C. (2000). The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science, 287(March), 2185–95.
Akam, M. (1989). Hox and HOM: homologous gene clusters in insects and
vertebrates. Cell, 57(3), 347–9.
Anders, S., & Huber, W. (2010). Differential expression analysis for sequence count
data. Genome Biology, 11(10), R106.
Andreu, M. J., Ajuria, L., Samper, N., González-Pérez, E., Campuzano, S.,
González-Crespo, S., & Jiménez, G. (2012). EGFR-Dependent downregulation
of capicua and the establishment of drosophila dorsoventral polarity. Fly, 6(4),
234–239.
Angst, B. D., Marcozzi, C., & Magee, A. I. (2001). The cadherin superfamily: diversity
in form and function. Journal of Cell Science, 114(4), 629–641.
Ashe, H. L., Mannervik, M., & Levine, M. (2000). Dpp signaling thresholds in the dorsal ectoderm of the Drosophila embryo. Development (Cambridge, England),
127(15), 3305–12.
Astigarraga, S., Grossman, R., Díaz-Delfín, J., Caelles, C., Paroush, Z., & Jiménez,
G. (2007). A MAPK docking site is critical for downregulation of Capicua by Torso and EGFR RTK signaling. The EMBO Journal, 26(3), 668–77.
Bartoszewski, S., Luschnig, S., Desjeux, I., Grosshans, J., & Nüsslein-Volhard, C.
(2004). Drosophila p24 homologues eclair and baiser are necessary for the
activity of the maternally expressed Tkv receptor during early embryogenesis.
Mechanisms of Development, 121(10), 1259–1273.
Bartscherer, K., & Boutros, M. (2008). Regulation of Wnt protein secretion and its role
in gradient formation. EMBO Reports, 9(10), 977–82.
Bäumer, D., Trauner, J., Hollfelder, D., Cerny, A., & Schoppmeier, M. (2011). JAKSTAT signalling is required throughout telotrophic oogenesis and short-germ
embryogenesis of the beetle Tribolium. Developmental Biology, 350(1), 169–82.
Beermann, A., Prühs, R., Lutz, R., & Schröder, R. (2011). A context-dependent
combination of Wnt receptors controls axis elongation and leg development in a
short germ insect. Development (Cambridge, England), 138(13), 2793–2805.
Benton, M. A., Akam, M., & Pavlopoulos, A. (2013). Cell and tissue dynamics during
Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development, 140(15), 3210–3220.
196
Literaturverzeichnis
Benton, Matthew Pavlopoulus, A. (2014). May the force be with you.
BioArchitechture, 4(1), 63–64.
Berleth, T., Burri, M., Thoma, G., Bopp, D., Richstein, S., Frigerio, G., … NüssleinVolhard, C. (1988). The role of localization of bicoid RNA in organizing the anterior pattern of the Drosophila embryo. The EMBO Journal, 7(6), 1749–56.
Retrieved from
Bernards, A., & Hariharan, I. K. (2001). Of flies and men - Studying human disease in
Drosophila. Current Opinion in Genetics and Development, 11(3), 274–278.
Biehs, B., François, V., & Bier, E. (1996). The Drosophila short gastrulation gene
prevents Dpp from autoactivating and suppressing neurogenesis in the
neuroectoderm. Genes and Development, 10(22), 2922–2934.
Biffar, L., & Stollewerk, A. (2014). Conservation and evolutionary modifications of
neuroblast expression patterns in insects. Developmental Biology, 388(1), 103–
116.
Bolognesi, R., Beermann, A., Farzana, L., Wittkopp, N., Lutz, R., Balavoine, G., …
Schröder, R. (2008). Tribolium Wnts: evidence for a larger repertoire in insects
with overlapping expression patterns that suggest multiple redundant functions in
embryogenesis. Dev Genes Evol, 2008, 193–202.
Bolognesi, R., Farzana, L., Fischer, T. D., & Brown, S. J. (2008). Multiple Wnt genes
are required for posterior patterning in the short germ embryo of Tribolium castaneum. Current Biology : CB, 18(20), 1624–1629.
Brittle, A., Thomas, C., & Strutt, D. (2012). Planar polarity specification through
asymmetric subcellular localization of fat and dachsous. Current Biology, 22(10),
907–914.
Brönner, G., & Jäckle, H. (1991). Control and function of terminal gap gene activity in
the posterior pole region of the Drosophila embryo. Mechanisms of Development, 35(3), 205–11.
Brown, S., Fellers, J., Shippy, T., Denell, R., & Stauber, M. (2001). Correspondence
A strategy for mapping bicoid on the phylogenetic tree. Current Biology : CB,
11(2), 43–44.
Brown, S. J., Parrish, J. K., Beeman, R. W., & Denell, R. E. (1997). Molecular
characterization and embryonic expression of the even-skipped ortholog of Tribolium castaneum. Mechanisms of Development, 61(1-2), 165–173.
Brown, S. J., Shippy, T. D., Beeman, R. W., & Denell, R. E. (2002). Tribolium Hox
genes repress antennal development in the gnathos and trunk. Molecular
Phylogenetics and Evolution, 24(3), 384–387.
Brown, S. J., Patel, N. H., & Denell, R. E. (1994). Embryonic Expression of the Single
Tribolium engrailed Homology. October, 18, 7–18.
197
Literaturverzeichnis
Brummel, T. J., Twombly, V., Marqu??s, G., Wrana, J. L., Newfeld, S. J., Attisano, L.,
… Gelbart, W. M. (1994). Characterization and relationship of dpp receptors
encoded by the saxophone and thick veins genes in Drosophila. Cell, 78(2),
251–261.
Bucher, G., Farzana, L., Brown, S. J., & Klingler, M. (2005). Anterior localization of
maternal mRNAs in a short germ insect lacking bicoid. Evolution & Development,
7(2), 142–9.
Bucher, G., & Klingler, M. (2004). Divergent segmentation mechanism in the short
germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development
(Cambridge, England), 131, 1729–1740.
Bucher, G., Scholten, J., & Klingler, M. (2002). Parental RNAi in tribolium
(coleoptera). Current Biology, 12(3), 85–86.
Buechling, T., Chaudhary, V., Spirohn, K., Weiss, M., & Boutros, M. (2011). p24 proteins are required for secretion of Wnt ligands. EMBO Reports, 12(12), 1265–72.
Carney, G. E., & Bowen, N. J. (2004). p24 proteins, intracellular trafficking, and
behavior: Drosophila melanogaster provides insights and opportunities. Biology
of the Cell, 96(4), 271–278.
Casanova, J., & Struhl, G. (1989). Localized surface activity of torso, a receptor
tyrosine kinase, specifies terminal body pattern in Drosophila. Genes & Development, 3(12b), 2025–2038.
Casanova, J. (2005). Developmental Evolution : Torso — a Story with Different
Ends ? Current Biology, 15(23), 968–970.
Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., & Klingler, M. (2005). Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Kruppel mutant jaws. Development (Cambridge,
England), 132(24), 5353–5363.
Cerny, A. C., Grossmann, D., Bucher, G., & Klingler, M. (2008). The Tribolium ortholog of knirps and knirps-related is crucial for head segmentation but plays a
minor role during abdominal patterning. Developmental Biology, 321(1), 284–94.
Chen, G., Handel, K., & Roth, S. (2000). The maternal NF-kappaB/dorsal gradient of
Tribolium castaneum: dynamics of early dorsoventral patterning in a short-germ
beetle. Development (Cambridge, England), 127(23), 5145–5156.
Choe, C. P., & Brown, S. J. (2007). Evolutionary flexibility of pair-rule patterning
revealed by functional analysis of secondary pair-rule genes, paired and sloppypaired in the short germ insect, Tribolium castaneum. Developmental Biology,
48(Suppl 2), 1–6.
Choe, C. P., Miller, S. C., & Brown, S. J. (2006). A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(17),
6560–6564.
198
Literaturverzeichnis
Clegg, N. J., Findley, S. D., Mahowald, A. P., & Ruohola-Baker, H. (2001). Maelstrom
is required to position the MTOC in stage 2-6 Drosophila oocytes. Dev Genes
Evol, 211(1), 44–48.
Clegg, N. J., Frost, D. M., Larkin, M. K., Subrahmanyan, L., Bryant, Z., & RuoholaBaker, H. (1997). maelstrom is required for an early step in the establishment of
Drosophila oocyte polarity: posterior localization of grk mRNA. Development
(Cambridge, England), 124(22), 4661–71.
Copf, T., Schröder, R., & Averof, M. (2004). Ancestral role of caudal genes in axis
elongation. PNAS, 101(51), 17711–17715.
Culetto, E., & Sattelle, D. B. (2000). A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular
Genetics, 9(6), 869–877.
D’Avino, P. P., & Thummel, C. S. (2000). The ecdysone regulatory pathway controls
wing morphogenesis and integrin expression during Drosophila metamorphosis.
Developmental Biology, 220(2), 211–24.
Davis, G. K., & Patel, N. H. (2002). Short , long , and beyond: Molecular and Embryological Approaches to. Annu. Rev. Entomo., (47), 669–99.
de las Heras, J. M., & Casanova, J. (2006). Spatially distinct downregulation of Capicua repression and tailless activation by the Torso RTK pathway in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development, 123(6), 481–6.
Denell, R. E. (2008). Establishment of Tribolium as a Genetic Model System and Its
Early Contributions to Evo-Devo. Genetics, 4, 1–4. Retrieved from
DiNardo, S., & O’Farrell, P. H. (1987). Establishment and refinement of segmental
pattern in the Drosophila embryo: spatial control of engrailed expression by pairrule genes. Genes & Development, 1(10), 1212–1225.
Dooley, K. (2000). Zebrafish: a model system for the study of human disease.
Current Opinion in Genetics & Development, 10(3), 252–256.
Dorfman, R., & Shilo, B. Z. (2001). Biphasic activation of the BMP pathway patterns
the Drosophila embryonic dorsal region. Development (Cambridge, England),
128(6), 965–972.
Draper, B. W., Mello, C. C., Bowerman, B., Hardin, J., & Priess, J. R. (1996). MEX-3
is a KH domain protein that regulates blastomere identity in early C. elegans
embryos. Cell, 87(2), 205–216.
Driever, W., & Nüsslein-Volhard, C. (1988). The bicoid protein determines position in
the Drosophila embryo in a concentration-dependent manner. Cell, 54(1), 95–
104.
199
Literaturverzeichnis
Driever, W., Siegel, V., & Nüsslein-Volhard, C. (1990). Autonomous determination of
anterior structures in the early Drosophila embryo by the bicoid morphogen. Development (Cambridge, England), 109(4), 811–20. Retrieved from
Dubnau, J., & Struhl, G. (1996). RNA recognition and translational regulation by a
homeodomain protein. Nature, 379.
Duffy, J. B., & Perrimon, N. (1994). The torso pathway in Drosophila: lessons on
receptor tyrosine kinase signaling and pattern formation. Developmental Biology.
Deve.
El-Sherif, E., Averof, M., & Brown, S. J. (2012). A segmentation clock operating in
blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development
(Cambridge, England), 139(23), 4341–4346.
El-Sherif, E., Zhu, X., Fu, J., & Brown, S. J. (2014). Caudal Regulates the
Spatiotemporal Dynamics of Pair-Rule Waves in Tribolium. PLoS Genetics,
10(10).
Ephrussi, a, Dickinson, L. K., & Lehmann, R. (1991). Oskar organizes the germ
plasm and directs localization of the posterior determinant nanos. Cell, 66(1),
37–50.
Falciani, F., Hausdorf, B., Schröder, R., Akam, M., Tautz, D., Denell, R., & Brown, S.
(1996). Class 3 Hox genes in insects and the origin of zen. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 93(16), 8479–
84.
Findley, S. D., Tamanaha, M., Clegg, N. J., & Ruohola-Baker, H. (2003). Maelstrom,
a Drosophila spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa
and RDE1/AGO1 homolog, Aubergine, in nuage. Development (Cambridge,
England), 130(5), 859–871.
François, V., Solloway, M., O’Neill, J. W., Emery, J., & Bier, E. (1994). Dorsal-ventral
patterning of the Drosophila embryo depends on a putative negative growth factor encoded by the short gastrulation gene. Genes and Development, 8(21),
2602–2616.
Frohnhofer, H. G., & Lehmann, R. (1987). Anteroposterior Polarity in Drosophila.
Science (New York, N.Y.), 238(5), 1675–1681.
Fu, J., Posnien, N., Bolognesi, R., Fischer, T. D., Rayl, P., & Oberhofer, G. (2012).
Asymmetrically expressed axin required for anterior development in Tribolium.
PNAS, 109(20), 7782–7786.
Furriols, M., & Casanova, J. (2003). In and out of Torso RTK signalling. The EMBO
Journal, 22(9), 1947–1952.
Garcia-Fernàndez, J. (2005). The genesis and evolution of homeobox gene clusters.
Nature Reviews. Genetics, 6(12), 881–92.
200
Literaturverzeichnis
González-Reyes, a, Elliott, H., & St Johnston, D. (1995). Polarization of both major
body axes in Drosophila by gurken-torpedo signalling. Nature.
Grillo, M., Furriols, M., de Miguel, C., Franch-Marro, X., & Casanova, J. (2012).
Conserved and divergent elements in Torso RTK activation in Drosophila development. Scientific Reports, 2, 1–7.
Hamaguchi, T., Yabe, S., Uchiyama, H., & Murakami, R. (2004). Drosophila Tbx6related gene, Dorsocross, mediates high levels of Dpp and Scw signal required
for the development of amnioserosa and wing disc primordium. Developmental
Biology, 265(2), 355–368.
Hammond, S. M., Boettcher, S., Caudy, A. A., Kobayashi, R., & Hannon, G. J.
(2001). Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi.
Science (New York, N.Y.), 293(5532), 1146–50.
Handel, K., Grünfelder, C. G., Roth, S., & Sander, K. (2000). Tribolium embryogenesis : a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal
closure. Dev Genes Evol, (210), 167–179.
Harding, K., & Levine, M. (1988). Gap genes define the limits of antennapedia and
bithorax gene expression during early development in Drosophila. The EMBO
Journal, 7(1), 205–14.
Harter, C., & Wieland, F. T. (1998). A single binding site for dilysine retrieval motifs
and p23 within the gamma subunit of coatomer. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 95(20), 11649–54.
Heeg-Truesdell, E., & LaBonne, C. (2006). Wnt Signaling: A Shaggy Dogma Tale.
Current Biology, 16(2), 62–64.
Heisenberg, C. P., Houart, C., Take-Uchi, M., Rauch, G. J., Young, N., Coutinho, P.,
… Stemple, D. L. (2001). A mutation in the Gsk3-binding domain of zebrafish
masterblind/Axin1 leads to a fate transformation of telencephalon and eyes to
diencephalon. Genes and Development, 15(11), 1427–1434.
Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., & Panfilio, K. A. (2016). The beetle amnion and
serosa functionally interact as apposed epithelia. eLife, 5, 1–17.
Horn, T., Sandmann, T., & Boutros, M. (2010). Design and evaluation of genomewide libraries for RNA interference screens. Genome Biology, 11(6), R61.
Huang, J. D., Schwyter, D. H., Shirokawa, J. M., & Courey, A. J. (1993). The interplay
between multiple enhancer and silencer elements defines the pattern of
decapentaplegic expression. Genes and Development, 7(4), 694–704.
Humbert, P. O., Grzeschik, N. a, Brumby, a M., Galea, R., Elsum, I., & Richardson,
H. E. (2008). Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.
Oncogene, 27(55), 6888–6907.
201
Literaturverzeichnis
Ingham, P. W. (1988). The molecular genetics of embryonic pattern formation in Drosophila. Nature, 335(6185), 25–34.
Irish, V. F., Martinez-Arias, a, & Akam, M. (1989). Spatial regulation of the
Antennapedia and Ultrabithorax homeotic genes during Drosophila early development. The EMBO Journal, 8(5), 1527–37.
Irish, V. F., & Gelbart, W. M. (1987). The decapentaplegic gene is required for dorsalventral patterning of the Drosophila embryo. Genes & Development, 1(8), 868–
879.
Irvine, K. D., & Wieschaus, E. (1994). Cell intercalation during Drosophila germband
extension and its regulation by pair-rule segmentation genes. Development
(Cambridge, England), 120(4), 827–841.
Jaeger, J. (2011). The gap gene network. Cellular and Molecular Life Sciences :
CMLS, 68(2), 243–74. http://doi.org/10.1007/s00018-010-0536-y
Jiménez, G., Guichet, a, Ephrussi, a, & Casanova, J. (2000). Relief of gene repression by torso RTK signaling: role of capicua in Drosophila terminal and dorsoventral patterning. Genes & Development, 14(2), 224–31.
Jiménez, G., González-reyes, A., & Casanova, J. (2002). Cell surface proteins Nasrat
and Polehole stabilize the Torso-like extracellular determinant in Drosophila
oogenesis. Genes & Development, 16, 913–918.
Johnson, T. K., Henstridge, M. A., Herr, A., Moore, K. A., Whisstock, J. C., & Warr, C.
G. (2015). Torso-like mediates extracellular accumulation of Furin-cleaved Trunk
to pattern the Drosophila embryo termini. Nature Communications, 6, 8759.
Johnston, F. van E. and D. S. (1999). The polarisation of the anterior-posterior and
dorsal-ventral axes during Drosophila oogenesis. Current Opinion in Genetics &
Development, 9, 396–404.
Judd, B. H. (2001). Experimental Organisms Used in Genetics. Encyclopedia of Life
Sciences, 1–7.
Khurana, J. S., & Theurkauf, W. (2010). piRNAs, transposon silencing, and Drosophila germline development. Journal of Cell Biology, 191(5), 905–913.
Kim, H. S., Murphy, T., Xia, J., Caragea, D., Park, Y., Beeman, R. W., … Brown, S. J.
(2009). BeetleBase in 2010: Revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Research, 38(SUPPL.1), 437–
442.
Kittelmann, S., Ulrich, J., Posnien, N., & Bucher, G. (2013). Changes in anterior head
patterning underlie the evolution of long germ embryogenesis. Developmental
Biology, 374(1), 174–84.
202
Literaturverzeichnis
Klingler, M., Erdélyi, M., Szabad, J., & Nüsslein-Volhard, C. (1988). Function of torso
in determining the terminal anlagen of the Drosophila embryo. Nature, 335(15),
275–277.
Klingler, M. (2004). Tribolium. Current Biology, 14, 639–640.
Kotkamp, K., Klingler, M., & Schoppmeier, M. (2010). Apparent role of Tribolium
orthodenticle in anteroposterior blastoderm patterning largely reflects novel
functions in dorsoventral axis formation and cell survival. Development (Cambridge, England), 137(11), 1853–62.
Lawrence, P. A., & Struhl, G. (1996). Morphogens, compartments, and pattern:
Lessons from Drosophila? Cell, 85(7), 951–961.
Lehmann, R., & Nüsslein-Volhard, C. (1991). The maternal gene nanos has a central
role in posterior pattern formation of the Drosophila embryo. Development
(Cambridge, England), 112(3), 679–91.
Li, W. X. (2005). Functions and Mechanisms of Receptor Tyrosine Kinase Torso
Signaling: Lessons From Drosophila Embryonic Terminal Development.
Developmental Dynamics, 232(3), 656–672.
Little, S. C., & Mullins, M. C. (2006). Extracellular modulation of BMP activity in
patterning the dorsoventral axis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today:
Reviews, 78(3), 224–242.
Liu, P. Z., & Kaufman, T. C. (2005). Short and long germ segmentation: Unanswered
questions in the evolution of a developmental mode. Evolution and Development, 7(6), 629–646.
Löhr, U., Chung, H.-R., Beller, M., & Jäckle, H. (2009). Antagonistic action of Bicoid
and the repressor Capicua determines the spatial limits of Drosophila head gene
expression domains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 106(51), 21695–700
Lynch, J., & Roth, S. (2011). The evolution of dorsal–ventral patterning mechanisms
in insects. Genes & Development, 107–118.
Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., & Desplan, C. (2006). Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Development Genes and Evolution, 216(7-8), 493–498.
Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., & Roth, S. (2010). EGF signaling
and the origin of axial polarity among the insects. Current Biology, 20(11), 1042–
1047.
Margolis, J. S., Borowsky, M. L., Steingrímsson, E., Shim, C. W., Lengyel, J. A., &
Posakony, J. W. (1995). Posterior stripe expression of hunchback is driven from
two promoters by a common enhancer element. Development (Cambridge, England), 121(9), 3067–3077.
203
Literaturverzeichnis
Matilla, P.K., Lappalainen, P. (2008) Filopodia: molecular architecture and cellular
functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 446-454 (2008).
Marques-Souza, H., Aranda, M., & Tautz, D. (2008). Delimiting the conserved features of hunchback function for the trunk organization of insects. Development
(Cambridge, England), 135(5), 881–888.
Mineo, A., Furriols, M., & Casanova, J. (2015). Accumulation of the Drosophila Torso-like protein at the blastoderm plasma membrane suggests that it translocates
from the eggshell. Development, 142(March), 1–6.
Mizutani, C. M., Nie, Q., Wan, F. Y. M., Zhang, Y. T., Vilmos, P., Sousa-Neves, R., …
Lander, A. D. (2005). Formation of the BMP activity gradient in the drosophila
embryo. Developmental Cell, 8(6), 915–924.
Monge, I., Krishnamurthy, R., Sims, D., Hirth, F., Spengler, M., Kammermeier, L., …
Mitchell, P. J. (2001). Drosophila transcription factor AP-2 in proboscis, leg and
brain central complex development. Development (Cambridge, England), 128(8),
1239–52.
Muñiz, M., Nuoffer, C., Hauri, H. P., & Riezman, H. (2000). The Emp24 complex
recruits a specific cargo molecule into endoplasmic reticulum-derived vesicles.
Journal of Cell Biology, 148(5), 925–930.
Nagy, L. M., & Carroll, S. (1994). Conservation of wingless patterning functions in the
short-germ embryos of Tribolium castaneum. Nature, 367(6462), 460–463.
Nellen, D., Affolter, M., & Basler, K. (1994). Receptor serine/threonine kinases
implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell,
78(2), 225–237.
Neumann, C., & Cohen, S. (1997). Morphogens and pattern formation. BioEssays :
News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology, 19(8),
721–729.
Nunes da Fonseca, R., van der Zee, M., & Roth, S. (2010). Evolution of extracellular
Dpp modulators in insects: The roles of tolloid and twisted-gastrulation in dorsoventral patterning of the Tribolium embryo. Developmental Biology, 345(1), 80–
93.
Nunes da Fonseca, R., von Levetzow, C., Kalscheuer, P., Basal, A., van der Zee, M.,
& Roth, S. (2008). Self-regulatory circuits in dorsoventral axis formation of the
short-germ beetle Tribolium castaneum. Developmental Cell, 14(4), 605–15.
Nüsslein-Volhard, C., & Wieschaus, E. (1980). Mutations affecting segment number
and polarity in Drosophila. Nature, 287(5785), 795–801.
O’Connor, M. B., Umulis, D., Othmer, H. G., & Blair, S. S. (2006). Shaping BMP
morphogen gradients in the Drosophila embryo and pupal wing. Development
(Cambridge, England), 133(2), 183–193.
204
Literaturverzeichnis
Panfilio, K. a. (2008). Extraembryonic development in insects and the acrobatics of
blastokinesis. Developmental Biology, 313, 471–491.
Panfilio, K. a, Oberhofer, G., & Roth, S. (2013). High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biology Open, 2(11), 1108–18.
Panfilio, K. A., & Akam, M. (2007). A comparison of Hox3 and Zen protein coding
sequences in taxa that span the Hox3/zen divergence. Development Genes and
Evolution, 217(4), 323–329.
Parker, L., Stathakis, D.G., Arora, K. (2004). Regulation of BMP and Activin Signaling
in Drosophila. Porgress in Molecular and Cellular Biology, Volume 34 pp73.101.
Patel, N. H., Condron, B. G., & Zinn, K. (1994). Pair-rule expression patterns of evenskipped are found in both short- and long-germ beetles. Nature, 367(6462), 429–
434.
Peel, A. D., & Averof, M. (2010). Early asymmetries in maternal transcript distribution
associated with a cortical microtubule network and a polar body in the beetle Tribolium castaneum. Developmental Dynamics, 239(11), 2875–2887.
Pignoni, F., Steingrímsson, E., & Lengyel, J. a. (1992). bicoid and the terminal system activate tailless expression in the early Drosophila embryo. Development
(Cambridge, England), 115(1), 239–51.
Port, F., Hausmann, G., & Basler, K. (2011). A genome-wide RNA interference
screen uncovers two p24 proteins as regulators of Wingless secretion. EMBO
Reports, 12(11), 1144–52.
Ramain, P., Heitzler, P., Haenlin, M., & Simpson, P. (1993). pannier, a negative regulator of achaete and scute in Drosophila, encodes a zinc finger protein with
homology to the vertebrate transcription factor GATA-1. Development (Cambridge, England), 119(4), 1277–1291.
Reeves, G. T., Trisnadi, N., Truong, T. V., Nahmad, M., Katz, S., & Stathopoulos, A.
(2012). Dorsal-Ventral Gene Expression in the Drosophila Embryo Reflects the
Dynamics and Precision of the Dorsal Nuclear Gradient. Dev Cell., 22(3), 544–
557.
Richards, S., Gibbs, R. a, Weinstock, G. M., Brown, S. J., Denell, R., Beeman, R. W.,
… Grossmann, D. (2008). The genome of the model beetle and pest Tribolium
castaneum. Nature, 452(7190), 949–55.
Riechmann, V., & Ephrussi, a. (2001). Axis formation during Drosophila oogenesis.
Current Opinion in Genetics & Development, 11(4), 374–83. Retrieved from
Rivera-Pomar, R., Niessing, D., Schmidt-Ott, U., Gehring, W. J., & Jäckle, H. (1996).
RNA binding and translational suppression by bicoid. Nature.
205
Literaturverzeichnis
Rivera-Pomar, R., & Jäckle, H. (1996). From gradients to stripes in Drosophila embryogenesis: Filling in the gaps. Trends in Genetics, 12(11), 478–483.
Ronchi, E., Treisman, J., Dostatni, N., Struhl, G., & Desplan, C. (1993). Downregulation of the Drosophila morphogen bicoid by the torso receptor-mediated
signal transduction cascade. Cell, 74(2), 347–355.
Rosenberg, M., Lynch, J., & Desplan, C. (2009). Heads and Tails: Evolution of Antero-Posterior Patterning in Insects. Biochimica et Biophysica Acta, 72(2), 181–
204.
Roth, S. (2003). The origin of dorsoventral polarity in Drosophila. Philosophical
Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences,
358(1436), 1317–29; discussion 1329.
Roth, S., & Lynch, J. A. (2009). Symmetry Breaking During Drosophila Oogenesis.
Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 1–21.
Rushlow, C., Frasch, M., Doyle, H., & Levine, M. (1987). Maternal regulation of zerknüllt: a homoeobox gene controlling differentiation of dorsal tissues in Drosophila. Nature, 330(6148), 583–6.
Saleem, S., Schwedes, C. C., Ellis, L. L., Grady, S. T., Adams, R. L., Johnson, N., …
Carney, G. E. (2012). Drosophila melanogaster p24 trafficking proteins have vital
roles in development and reproduction. Mechanisms of Development, 129(5-8),
177–91.
Sarrazin, A. F., Peel, A. D., & Averof, M. (2012). A segmentation clock with twosegment periodicity in insects. Science (New York, N.Y.), 336(6079), 338–41.
Sato, K., Nishida, K. M., Shibuya, A., Siomi, M. C., & Siomi, H. (2011). Maelstrom
coordinates microtubule organization during Drosophila oogenesis through interaction with components of the MTOC. Genes and Development, 25(22), 2361–
2373.
Sato, K., & Siomi, M. C. (2015). Functional and structural insights into the piRNA factor Maelstrom. FEBS Letters, 589(14), 1688–1693.
Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., & Tautz, D. (2006). A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved
peptides. Cell, 126(3), 559–69.
Schaeffer, V., Killian, D., Desplan, C., & Wimmer, E. a. (2000). High bicoid levels
render the terminal system dispensable for Drosophila head development. Development (Cambridge, England), 127(18), 3993–9. Retrieved from
Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T.,
… a., C. (2012). Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682.
206
Literaturverzeichnis
Schinko, J. B., Kreuzer, N., Offen, N., Posnien, N., Wimmer, E. a, & Bucher, G.
(2008). Divergent functions of orthodenticle, empty spiracles and buttonhead in
early head patterning of the beetle Tribolium castaneum (Coleoptera).
Developmental Biology, 317(2), 600–13.
Schinko, J. B., Weber, M., Viktorinova, I., Kiupakis, A., Averof, M., Klingler, M., …
Bucher, G. (2010). Functionality of the GAL4/UAS system in Tribolium requires
the use of endogenous core promoters. BMC Developmental Biology, 10, 53.
Schmidt-Ott, U. (2000). The amnioserosa is an apomorphic character of
cyclorrhaphan flies. Development Genes and Evolution, 210(7), 373–376.
Schmitt-Engel, C., Cerny, A., & Schoppmeier, M. (2012). A dual role for nanos and
pumilio in anterior and posterior blastodermal patterning of the short-germ beetle
Tribolium castaneum. Developmental Biology, 364, 224–235.
Schmitt-Engel, C., Schultheis, D., Schwirz, J., Ströhlein, N., Troelenberg, N.,
Gerischer, L., … Bucher, G. (2015). The iBeetle large-scale RNAi screen reveals
gene functions for insect development and physiology ¨. Nature Communications.
Schoppmeier, M., Fischer, S., Schmitt-Engel, C., Löhr, U., & Klingler, M. (2009). An
ancient anterior patterning system promotes caudal repression and head formation in ecdysozoa. Current Biology : CB, 19(21), 1811–5.
Schoppmeier, M., & Schröder, R. (2005). Maternal torso signaling controls body axis
elongation in a short germ insect. Current Biology : CB, 15(23), 2131–6.
Schröder, R. (2003). The genes orthodenticle and hunchback substitute for bicoid in
the beetle Tribolium. Nature, 422(April), 621–625.
http://doi.org/10.1038/nature01518.1.
Schroder, R., Eckert, C., Wolff, C., & Tautz, D. (2000). Conserved and divergent
aspects of terminal patterning in the beetle Tribolium castaneum. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(12),
6591–6.
Schrons, H., Knust, E., & Campos-ortega, J. A. (1992). Enhancer ofsplit. Genetics,
132, 481–503.
Schulz, C., Schröder, R., Hausdorf, B., Wolff, C., & Tautz, D. (1998). A caudal
homologue in the short germ band beetle Tribolium shows similarities to both,
the Drosophila and the vertebrate caudal expression patterns. Development Genes and Evolution, 208(5), 283–289.
Schupbach, T., & Wieschaus, E. (1986). Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Developmental Biology,
113(2), 443–448.
207
Literaturverzeichnis
Shimmi, O., Umulis, D., Othmer, H., & O’Connor, M. B. (2005). Facilitated transport
of a Dpp/Scw heterodimer by Sog/Tsg leads to robust patterning of the Drosophila blastoderm embryo. Cell, 120(6), 873–886.
Shin, D. H., & Hong, J. W. (2014). Capicua is involved in Dorsal-mediated repression
of Zerkn??llt expression in Drosophila embryo. BMB Reports, 47(9), 518–523.
Shinmyo, Y., Mito, T., Matsushita, T., Sarashina, I., Miyawaki, K., Ohuchi, H., & Noji,
S. (2005). caudal is required for gnathal and thoracic patterning and for posterior
elongation in the intermediate-germband cricket Gryllus bimaculatus.
Mechanisms of Development, 122(2), 231–239.
Shippy, T. D., Ronshaugen, M., Cande, J., He, J., Beeman, R. W., Levine, M., …
Denell, R. E. (2008). Analysis of the Tribolium homeotic complex: insights into
mechanisms constraining insect Hox clusters. Development Genes and Evolution, 218(3-4), 127–39.
Sider, J. R., Mandato, C. a, Weber, K. L., Zandy, a J., Beach, D., Finst, R. J., …
Bement, W. M. (1999). Direct observation of microtubule-f-actin interaction in cell
free lysates. Journal of Cell Science, 112 ( Pt 1, 1947–1956.
Sienski, G., Dönertas, D., & Brennecke, J. (2012). Transcriptional silencing of transposons by Piwi and maelstrom and its impact on chromatin state and gene expression. Cell, 151(5), 964–980.
Singer, J. B., Harbecke, R., Kusch, T., Reuter, R., & Lengyel, J. a. (1996). Drosophila
brachyenteron regulates gene activity and morphogenesis in the gut. Development (Cambridge, England), 122, 3707–3718.
Small, S., & Levine, M. (1991). The initiation of pair-rule stripes in the Drosophila
blastoderm. Current Opinion in Genetics & Development, 1(2), 255–260.
Sommer, R. J., & Tautz, D. (1993). Involvement of an orthologue of the Drosophila
pair-rule gene hairy in segment formation of the short germ-band embryo of Tribolium (Coleoptera). Nature, 361(6411), 448–450.
Sprenger, F., Stevens, L. M., & Nüsslein-Volhard, C. (1989). The Drosophila gene
torso encodes a putative receptor tyrosine kinase. Nature, 338, 478–483.
Srinivasan, S., Rashka, K. E., & Bier, E. (2002). Creation of a Sog morphogen gradient in the Drosophila embryo. Developmental Cell, 2(1), 91–101.
St Johnston, D., Driever, W., Berleth, T., Richstein, S., & Nüsslein-Volhard, C.
(1989). Multiple steps in the localization of bicoid RNA to the anterior pole of the
Drosophila oocyte. Development (Cambridge, England), 107 Suppl, 13–19.
St Johnston, D., & Nüsslein-Volhard, C. (1992). The origin of pattern and polarity in
the Drosophila embryo. Cell, 68(2), 201–19. Retrieved from
St Johnston, D., & Ahringer, J. (2010). Cell polarity in eggs and epithelia: Parallels
and diversity. Cell, 141(5), 757–774.
208
Literaturverzeichnis
St Johnston, R. D., & Gelbart, W. M. (1987). Decapentaplegic transcripts are
localized along the dorsal-ventral axis of the Drosophila embryo. The EMBO
Journal, 6(9), 2785–2791.
Stauber, M., Jäckle, H., & Schmidt-Ott, U. (1999). The anterior determinant bicoid of
Drosophila is a derived Hox class 3 gene. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 96(7), 3786–9.
Stevens, L. M., Frohnhöfer, H. G., Klingler, M., & Nüsslein-Volhard, C. (1990).
Localized requirement for torso-like expression in follicle cells for development of
terminal anlagen of the Drosophila embryo. Nature, 346(6285), 660–3.
Struhl, G., Struhl, K., & Macdonald, P. M. (1989). The Gradient Morphogen bicoid Is
a Transcriptional Activator. Cell, 57, 1259–1273.
Sutherland, D. J., Li, M., Liu, X.-Q., Stefancsik, R., & Raftery, L. a. (2003). Stepwise
formation of a SMAD activity gradient during dorsal-ventral patterning of the Drosophila embryo. Development (Cambridge, England), 130(23), 5705–16.
Tautz, D (1984). Evolutionary analysis of genes involved in early embryonic pattern
formation in Drosophila. Molecular Ecology and Evolution: Approaches and Applications; Volume 69 of the series Experientia Supplementum pp 525-536.
Tautz, D., Friedrich, M., & Schrdder, R. (1994). lnsect embryogenesis - what is
ancestral and what is derived? Development, 199, 193–199.
Theurkauf, W. E., Alberts, B. M., Jan, Y. N., & Jongens, T. a. (1993). A central role
for microtubules in the differentiation of Drosophila oocytes. Development
(Cambridge, England), 118(4), 1169–80.
Theurkauf, W. E., & Hazelrigg, T. I. (1998). In vivo analyses of cytoplasmic transport
and cytoskeletal organization during Drosophila oogenesis: characterization of a
multi-step anterior localization pathway. Development (Cambridge, England),
125(18), 3655–3666.
Theurkauf, W. E., Smiley, S., Wong, M. L., & Alberts, B. M. (1992). Reorganization of
the cytoskeleton during Drosophila oogenesis: implications for axis specification
and intercellular transport. Development (Cambridge, England), 115(4), 923–36.
van der Zee, M., Berns, N., & Roth, S. (2005). Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology : CB,
15(7), 624–36.
Van der Zee, M., da Fonseca, R. N., & Roth, S. (2008). TGFbeta signaling in Tribolium: vertebrate-like components in a beetle. Development Genes and Evolution,
218(3-4), 203–13.
van der Zee, M., Stockhammer, O., von Levetzow, C., Nunes da Fonseca, R., &
Roth, S. (2006). Sog/Chordin is required for ventral-to-dorsal Dpp/BMP transport
and head formation in a short germ insect. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America, 103(44), 16307–12.
209
Literaturverzeichnis
Vignali, R., De Lucchini, S., Kablar, B., & Barsacchi, G. (1994). Genetic control of
development in Xenopus laevis. Genetica, 94(2-3), 235–248.
Wang, Y., & Ferguson, E. L. (2005). Spatial bistability of Dpp – receptor interactions
during Drosophila dorsal – ventral patterning. Nature, 434(December 2004),
229–234.
Weigel, D., Seifert, E., Reuter, D., Jäckle, H., & Jackle, H. (1990). Regulatory elements controlling expression of the Drosophila homeotic gene fork head. The
EMBO Journal, 9(4), 1199–207.
Weigel, D., Jürgens, G., Küttner, F., Seifert, E., & Jäckle, H. (1989). The homeotic
gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo. Cell, 57(4), 645–658.
Weil, T. T., Forrest, K. M., & Gavis, E. R. (2006). Localization of bicoid mRNA in Late
Oocytes Is Maintained by Continual Active Transport. Developmental Cell, 11(2),
251–262.
Winick, J., Abel, T., Leonard, M. W., Michelson, a M., Chardon-Loriaux, I., Holmgren,
R. a, … Engel, J. D. (1993). A GATA family transcription factor is expressed
along the embryonic dorsoventral axis in Drosophila melanogaster. Development
(Cambridge, England), 119(4), 1055–1065.
Wolff, C., Schröder, R., Schulz, C., Tautz, D., & Klingler, M. (1998). Regulation of the
Tribolium homologues of caudal and hunchback in Drosophila: evidence for maternal gradient systems in a short germ embryo. Development (Cambridge, England), 125(18), 3645–3654.
Wolff, C., Sommer, R., Schröder, R., Glaser, G., & Tautz, D. (1995). Conserved and
divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in
the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development (Cambridge, England), 121(12), 4227–36.
Wreden, C., Verrotti, a C., Schisa, J. a, Lieberfarb, M. E., & Strickland, S. (1997).
Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development (Cambridge, England),
124(15), 3015–23.
Wu, L. H., & Lengyel, J. a. (1998). Role of caudal in hindgut specification and gastrulation suggests homology between Drosophila amnioproctodeal invagination and
vertebrate blastopore. Development (Cambridge, England), 125(13), 2433–2442.
Zallen, J. A., & Wieschaus, E. (2004). Patterned gene expression directs bipolar
planar polarity in Drosophila. Developmental Cell, 6(3), 343–355.
Zeng, L., Fagotto, F., Zhang, T., Hsu, W., Vasicek, T. J., Perry, W. L., … Costantini,
F. (1997). The mouse Fused locus encodes axin, an inhibitor of the Wnt
signaling pathway that regulates embryonic axis formation. Cell, 90(1), 181–192.
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Literaturverzeichnis
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Danksagung
Danksagung
Ohne die Hilfe ganz vieler Leute wäre diese Arbeit niemals entstanden. An dieser
Stelle möchte ich mich also bei eben allen diesen Leuten bedanken, die mir irgendeiner Art und Weise (und vielleicht auch ohne es zu wissen) bei meiner Doktorarbeit
geholfen haben.
Zuerst möchte ich natürlich Michael Schoppmeier danken. Nicht nur dafür, dass er
mir diese Arbeit ermöglicht hat und mit mir durchgestanden hat, sondern auch für die
viele Hilfe und Unterstützung, das beste Arbeitsklima und die vielen Gespräche und
Diskussionen über alles Mögliche.
Danke an Martin Klingler, für die Erstellung des Zweitgutachtens und an Benedikt
Kost und Andreas Burkovski für die Abnahme meiner Prüfung.
Ganz besonders möchte ich Irene Schnellhammer und Denise Mackrodt danken.
Beide haben mich all die Zeit als Laborkollegen ertragen und immer versucht, alle
meine Fragen zu beantworten. Ohne die beiden hätte ich nur halb so viel gelernt und
nur halb so viel Spaß in meiner Zeit in der Entwicklungsbiologie gehabt.
Die Zusammenarbeit mit Matthias Weiskopf, Andreas Sulzmaier und Matthias Teuscher, war für diese Arbeit essentiell. Aber auch Privat möchte ich mich bei ihnen für
ihre Unterstützung, Diskussionen, Anregungen und Hilfe bedanken.
Bei Nadi Ströhlein und Jutta Distler möchte ich mich ebenfalls für alles was ich von
ihnen gelernt habe und für die Unterstützung meiner Arbeit bedanken
Ralf Rübsam, Klaus Griebel und Enrico Konrad möchte ich für viele spannende Diskussionen und andere Blickwinkel danken.
Bei Christoph Schaub und Ingolf Reim möchte ich mich dafür bedanken, dass sie alle
meine Fragen zu Drosophila beantwortet haben und mich ebenfalls immer unterstützt
haben.
Zum Schluss möchte ich noch Claudia Obermeier, Tina Loy und Maria Ricca bedanken, die auch unglaublich viel zu dieser Arbeit beigetragen haben, ohne es vielleicht
selbst zu wissen.
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