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Aus dem
ZENTRUM FÜR KINDER- UND JUGENDMEDIZIN
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Untersuchungen zur Substratspezifität der
Aminoacylase 1
aus Schweineniere unter besonderer Berücksichtigung
der Kettenlänge der Acylreste und der Suche nach
bisher unbekannten Substraten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2011
von Sarah Meincke
geboren in Hamburg
Inhaltsverzeichnis
II
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum
1. Gutachter:
Prof. Dr. rer. nat. Jörn Oliver Sass
2. Gutachter:
PD Dr. Wolfgang Schäfer
Jahr der Promotion: 2012
II
Inhaltsverzeichnis
III
Für meine Familie
Für Sebastian
III
Inhaltsverzeichnis
IV
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................................ IV Abbildungsverzeichnis.................................................................................... IX Tabellenverzeichnis ......................................................................................... XI Abkürzungsverzeichnis.................................................................................. XII 1 Einleitung ...................................................................................................... 1 1.1 Zelluläre Lokalisation.................................................................................. 1 1.2 Genlokalisation ........................................................................................... 2 1.3 Sequenzanalyse ......................................................................................... 3 1.4 Speziesvergleich ........................................................................................ 3 1.5 Gewebeverteilung ...................................................................................... 4 1.6 Struktur der Aminoacylase 1 ...................................................................... 5 1.6.1 Zinkzentrum und PWW-Motive............................................................ 5 1.6.2 Metallbindung ...................................................................................... 6 1.6.3 Dimere Struktur ................................................................................... 7 1.7 Funktion der Aminoacylase 1 im Stoffwechsel ........................................... 8 1.8 N-terminale Acetylierung .......................................................................... 10 1.8.1 Entstehung von N-acetylierten Aminosäuren .................................... 11 1.8.2 Pharmakologische Bedeutung der Acetylierung ............................... 12 1.8.3 Abbau von N-terminal-acetylierten Proteinen.................................... 13 1.8.4 Glykolysierung des pAcy1-Proteins................................................... 14 1.9 Aminoacylase-1-Mangel ........................................................................... 14 1.9.1 Klinische Symptome.......................................................................... 15 1.9.2 Mutationen......................................................................................... 15 1.10 Morbus Canavan .................................................................................... 17 1.11 Weitere Funktionen der Acy1 ................................................................. 18 1.11.1 Interaktion mit der Sphingosin-1-Kinase ........................................... 18 1.11.2 Acy1 und andere neurodegenerative Erkrankungen......................... 18 1.11.3 Aminoacylase 1 und Karzinome........................................................ 19 IV
Inhaltsverzeichnis
V
1.12 Pharmaka und Hormone......................................................................... 19 1.12.1 Medikamente..................................................................................... 19 1.12.1.1 Paracetamol ............................................................................... 19 1.12.1.2 N-Acetylcystein ........................................................................... 20 1.12.1.3 N-Carbamoyl-L-Glutamat ........................................................... 20 1.12.1.4 N-Acetyl-Procainamid ................................................................. 21 1.12.2 Serotonin, N-Acetyl-Serotonin und Melatonin ................................... 21 1.12.3 N-Acetyl-Glukosamin......................................................................... 22 1.13 N-Acyl-Homoserin-Laktone..................................................................... 23 1.14 Acylglycine .............................................................................................. 23 1.14.1 N-Palmitoylglycin und N-Arachidonoylglycin ..................................... 24 1.15 Fragestellung .......................................................................................... 25 2 Material und Methoden............................................................................... 26 2.1 Material..................................................................................................... 26 2.1.1 Enzym ............................................................................................... 26 2.1.2 Kontrollsubstanzen............................................................................ 26 2.1.3 Substrate der Aminoacylase 1 .......................................................... 27 2.1.4 Potentielle Substrate der Aminoacylase 1......................................... 29 2.1.4.1 Acylglycine ..................................................................................... 29 2.1.4.2 Acyl-Methionin................................................................................ 30 2.1.4.3 Hormone und Medikamente ........................................................... 31 2.1.4.4 N-Acyl-Homoserin-Lakton .............................................................. 32 2.1.4.5 Unterscheidung nach Art des Acylrestes ....................................... 32 2.1.4.6 Carbamoyl-Aminosäuren ............................................................... 34 2.1.4.7 Aspartate ........................................................................................ 34 2.1.5 Mögliche Inhibitoren der Aminoacylase 1.......................................... 34 2.1.6 Pufferlösungen .................................................................................. 35 2.1.7 Geräte ............................................................................................... 36 2.1.8 Verbrauchsmaterial ........................................................................... 37 2.2 Methoden ................................................................................................. 37 2.2.1 Nachweis der NH2-Gruppe durch Ninhydrin...................................... 37 V
Inhaltsverzeichnis
VI
2.2.2 Aminoacylase-Ninhydrin-Assay......................................................... 40 2.2.3 Versuchsablauf.................................................................................. 40 2.2.3.1 Weitere Berechnungen .................................................................. 45 2.2.4 Palmitoylglycin-Synthese .................................................................. 45 3 Ergebnisse .................................................................................................. 48 3.1 Bestimmung der für den Assay idealen Aminoacylase 1 Aktivität............ 48 3.2 Ninhydrin-Assay ....................................................................................... 50 3.3 Beeinflussung der Enzymreaktion durch Lösen der Substrate in
alkoholischen Lösungen ..................................................................... 51 3.4 Reproduzierbarkeit des Assays................................................................ 54 3.5 Enantioselektivität der pAcy1 ................................................................... 54 3.6 Methionin .................................................................................................. 55 3.7 Verschiedene Acylglycine im Vergleich.................................................... 56 3.7.1 Kettenlänge ....................................................................................... 56 3.7.2 Acylglycine unterschiedlicher Struktur und Konzentration ................ 58 3.8 N-Acyl-Homoserin-Lakton ........................................................................ 61 3.8.1 Acylhomoserin-Lakton-Konzentration 1 mmol/l................................. 61 3.8.2 Acylhomoserin-Lakton-Konzentration 5 mmol/l................................. 62 3.9 Vergleich der Hydrolyse von N-Acetyl-, N-Benzoyl-, N-Chloroacetyl- und
N-Formyl-Aminosäuren ...................................................................... 63 3.9.1 Vergleich von N-Acetyl- und N-Benzoyl- substituierten Aminosäuren .
.......................................................................................................... 63 3.9.2 Vergleich von N-Acetyl- und N-Chloroacetyl- substituierten
Aminosäuren ..................................................................................... 64 3.9.3 Vergleich von N-Acetyl und N-Formyl substituierten Aminosäuren... 65 3.10 Inhibitoren ............................................................................................... 65 3.11 N-Carbamoyl Aminosäuren .................................................................... 67 3.11.1 N-Carbamoyl-β-Alanin (3-Ureidopropionat)....................................... 67 3.11.2 N-Carbamoyl-DL-Aspartat (Ureidosuccinat)...................................... 67 3.11.3 N-Carbamoyl-L-Glutamat und N-Acetyl-Glutamat............................. 67 3.12 Pharmakologisch relevante Substanzen ................................................ 68 VI
Inhaltsverzeichnis
VII
3.12.1 Acetaminophen, Handelsname Paracetamol, N-Acetyl-4-Aminophenol
........................................................................................................ 68 3.12.2 N-Acetyl-Procainamid........................................................................ 68 3.12.3 Chloramphenicol ............................................................................... 69 3.12.4 N-Acetyl-L-Cystein ............................................................................ 69 3.13 Hormone ................................................................................................. 70 3.13.1 Melatonin (N-Acetyl-5-Methoxytryptamin) ......................................... 70 3.13.2 N-Acetyl-5-Hydroxytryptamin ............................................................ 70 3.14 Einfluss des pH-Wertes .......................................................................... 70 3.15 Sonstige untersuchte bekannte Substrate .............................................. 72 3.16 Potentielle neue Substrate der Acy1 ...................................................... 73 4 Diskussion................................................................................................... 75 4.1 Die Enzymreaktion-beeinflussende Faktoren........................................... 75 4.1.1 pH-Wert ............................................................................................. 75 4.1.2 Alkoholische Lösung ......................................................................... 76 4.2 Enantioselektivität .................................................................................... 76 4.3 Bekannte Substrate .................................................................................. 76 4.3.1 N-Acyl-Homoserin-Lakton ................................................................. 76 4.3.2 Vergleich von N-Acetyl-, N-Chloroacetyl-, N-Formyl- und N-BenzoylAminosäuren ..................................................................................... 78 4.3.3 Inhibitoren.......................................................................................... 79 4.4 N-Acyl-Amide ........................................................................................... 79 4.5 Die Rolle von Acy1 im Stoffwechsel ......................................................... 81 4.5.1 Niere.................................................................................................. 81 4.5.2 Gehirn................................................................................................ 82 4.6 Pharmakologische Bedeutung ................................................................. 82 4.6.1 Medikamente und Hormone .............................................................. 83 4.7 Perspektive............................................................................................... 84 5 Zusammenfassung ..................................................................................... 85
VII
Inhaltsverzeichnis
VIII
6 Anhang ........................................................................................................ 86 6.1 Copyright .................................................................................................. 86 6.2 Hydrolyse verschiedener Acyl-Methionin-Lösungen bei einer StandardEnzymaktivität von 4,6*104 U/l und 17,25*104 U/l .............................. 88 6.3 SOP Acylase 1-Ninhydrin-Assay .............................................................. 90 6.4 Acylase-Assay Anleitung Sigma............................................................... 95 6.5 Matlab Code für Polynominterpolation ................................................... 100 6.6 Enzym .................................................................................................... 101 6.7 Als Substrate getestete Substanzen ...................................................... 102 6.8 Weitere Reagenzien ............................................................................... 107 6.9 Für verschiedene Eichgeraden verwendete Substanzen ....................... 108 7 Literaturverzeichnis.................................................................................. 110 Danksagung ....................................................................................................XV Lebenslauf .......................................................Fehler! Textmarke nicht definiert. VIII
Abbildungsverzeichnis
IX
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Vergleich der Acy1-Aktivität ........................................................... 4 Abbildung 2: Faltungsmodell eines Acy1-Monomers .......................................... 5 Abbildung 3: Schleifendiagramm des Zink-Bindungsbereiches der T347GMutante der hAcy1 ................................................................................... 7 Abbildung 4: Quartärstruktur des pAcy1-Modells. .............................................. 8 Abbildung 5: Abbau von N-terminal acetylierten Proteinen .............................. 13 Abbildung 6: Aminoacylase-Reaktion ............................................................... 37 Abbildung 7: Ninhydrin-Reaktion ...................................................................... 38 Abbildung 8: Ruhemanns Purpur8..................................................................... 38 Abbildung 9: Graphische Darstellung der Methionin-Eichgerade ..................... 43 Abbildung 10: Massenspektrum von Palmitoylglycin ........................................ 47 Abbildung 11: Gaschromatogramm von Palmitoylglycin................................... 47 Abbildung 12: Hydrolyserate in Abhängigkeit von der StandardEnzymaktivität bei 20 mmol/l Substrat ................................................... 49 Abbildung 13: Hydrolyserate in Abhängigkeit von der StandardEnzymaktivität bei 1 mmol/l Substrat ..................................................... 49 Abbildung 14: Umsatz von NAM und NAA in Ethanol-Lösung mit einer
Endkonzentration von 10 % im Enzymansatz ........................................ 52 Abbildung 15: Umsatz von 1 mmol/l NAM und NAA in Methanol-Lösung mit
einer Endkonzentration von 5 % bis 10 % Methanol im Enzymansatz .. 53 Abbildung 16 Umsatz von 20 mmol/l NAM und NAA in Methanol-Lösung mit
einer Endkonzentration von 5 % bis 10 % im Enzymansatz .................. 53 Abbildung 17: Enantiomerabhängige Hydrolyse verschiedener N-AcylAminosäuren durch die pkAcy1, Standard-Enzymkonzentration
4,6*104 U/l .............................................................................................. 55 Abbildung 18: Hydrolyse verschiedener Acyl-Methionin-Lösungen bei einer
Standard-Acylaseaktivität von 4,6*104 U/l .............................................. 56 Abbildung 19: Hydrolyse von 1 mmol/l Acylglycinen unterschiedlicher
Kettenlänge ............................................................................................ 57 Abbildung 20: Hydrolyse von Acylhomoserin-Lakton........................................ 62 Abbildung 21: Hydrolyse von Acylhomoserin-Lakton........................................ 63 IX
Abbildungsverzeichnis
X
Abbildung 22: Hydrolyse von 1 mmol N-Acetyl- und N-BenzoylAminosäuren (bei N-Benzoyl-Glycin n=5, alle anderen N-BenzoylAminosäuren n=2) .................................................................................. 64 Abbildung 23: Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-ChloroacetylAminosäuren .......................................................................................... 64 Abbildung 24: Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-FormylAminosäuren .......................................................................................... 65 Abbildung 25: Isobutyrylglycin und Isovalerylglycin als mögliche Inhibitoren
der pAcy1 bei der Hydrolyse von 10 mmol/l NAM, StandardEnzymaktivität 4,6*104 U/l ...................................................................... 66 Abbildung 26: Isobutyrylglycin und Isovalerylglycin als mögliche Inhibitoren
der pAcy1 bei der Hydrolyse von 10 mmol/l NAM, StandardEnzymaktivität 17,25*104 U/l .................................................................. 66 Abbildung 27: Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-CarbamoylAminosäuren .......................................................................................... 68 Abbildung 28: Hydrolyse verschiedener Medikamente ..................................... 69 Abbildung 29: Hydrolyse von Hormonen .......................................................... 70 Abbildung 30: Hydrolyse von N-Acetyl-L-Methionin bei einer StandardEnzymaktivität von 4,6*104 U/l ............................................................... 71 Abbildung 31: Enzymkinetik-Darstellung nach Lineweaver-Burk zur
Berechnung von KM und vmax; pH-adaptierter Umsatz von NAM bei
einer Standard-Enzymkonzentration von 4,6*104 U/ml. ......................... 72 X
Tabellenverzeichnis
XI
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verdünnungsreihe Methionin ........................................................... 42 Tabelle 2: Ergebnisse der NAM-Ansatz-Werte bei 570 nm .............................. 43 Tabelle 3: Berechnung der entstandenen L-Methionin-Konzentration.............. 44 Tabelle 4: Verdünnungsreihe Acy1 ................................................................... 48 Tabelle 5: Extinktionskoeffizienten im Ninhydrin-Assay.................................... 51 Tabelle 6: Acylglycine verschiedener Struktur und Konzentration .................... 59 Tabelle 7: Hydrolyse bereits bekannter Acy1-Substrate ................................... 73 Tabelle 8: Hydrolyse von potentiellen Substraten............................................. 74 XI
Abkürzungsverzeichnis
XII
Abkürzungsverzeichnis
APH
N-Acylpeptid-Hydrolase
B.
Bacillus
°C
Grad Celcius
5-HT
5-Hydroxytryptamin; Serotonin
Å
Ångström, Einheit der Länge (1 Å = 10-10 Meter)
Ac
Acetyl
ACY
menschliche Aminoacylase
Acy1
tierische Aminoacylase 1
Acy2
Aminoacylase 2; Aspartoacylase
AM-404
Arachidonoylaminophenol
ANS
1-Anilinonaphthalen-8-Sulfonsäure
APH
N-Acylpeptid-Hydrolase
Aqua dest.
Aqua destillata, destilliertes Wasser
AS
Aminosäure
Asn
Asparagin
Asp
Aspartat
B.
Bacillus
BHSL
N-Butyryl-Homoserin-Lakton
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
bp
Basenpaare
C
Kohlenstoff
CB
Cannabinoid-Rezeptor
cDNA
complementary deoxyribonucleic acid, komplementäre Deoxyribonukleinsäure
CO2
Kohlenstoffdioxid
Co2+
Kobalt-II-Ion
CoA
Coenzym A
CV
Carnivore; Fleischfresser
D
dextro; rechts
DNA
Deoxyribonukleinsäure
XII
Abkürzungsverzeichnis
DYDA
Diketohydrindylidenediketohydrindamin
EBV
Epstein-Barr Virus
FAAH
Fettsäureamidhydrolase
Fe-NT
Eisen-Nitrilotriacetat
G-PI
Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol
GC-MS
Gas-Chromatographie-Massen-Spektrometrie
Glu
Glutamat
H+
Wasserstoff
hAcy1
human aminoacylase 1, menschliche Aminoacylase 1
HCl
Chlorwasserstoff
His
Histidin
HV
Herbivore; Pflanzenfresser
kAcy1
kidney Aminoacylase 1, Aminoacylase 1 aus der Niere
kb
Kilobasen, 103 Basen
kDa
Kilo-Dalton
L
levo; links
l
Liter
LDH
Laktatdehydrogenase
Lys
Lysin
M
Molar
mb
Megabasen, 106 Basen
MEROPS
Datenbank für Peptidasen, http://merops.sanger.ac.uk/
Met
Methionin
mg
Milligramm
min
Minute
ml
Milliliter
mM
Millimolar
mmol
Millimol
mRNA
messenger ribonucleic acid, Boten-Ribonukleinsäure
MSH
Melanozyten-stimulierendes Hormon
N
Stickstoff
NAA
N-Acetyl-Aspartat
NAGS
N-Acetylglutamatsynthetase
NAHSL
N-Acyl-Homoserin-Lakton
XIII
XIII
Abkürzungsverzeichnis
XIV
NAM
N-Acetyl-Methionin
NaOH
Natriumhydroxid
NAS
N-Acetyl-Serotonin
NAT
N-Acetyl-Transferase
NH2
Aminogruppe
nm
Nanometer
NMR
nuclear magnetic resonance, Kernspinresonanzspektroskopie
NO
Stickoxid
O
Sauerstoff
OHSL
N-Octanoyl-Homoserin-Lakton
OP
1,10-Phenanthrolin
OV
Omnivore; Allesfresser
pkAcy1
porcine
kidney
Aminoacylase
1,
Aminoacylase
1
aus
Schweineniere
Pro
Prolin
PSI-BLAST Position-Specific Interated Basic Local Alignment Search Tool
RCC
Renal cell carcinome; Nierenzellkarzinom
S.
Saccharomyces
S1P
Sphingosin-1-Phosphat
SCLC
Small Cell Lung Cancer, kleinzelliges Lungenkarzinom
SH
Thiolgruppe
SphK1
Sphingosinkinase 1
TFA
Trifluoroacetyl
U
Units; Enzymmenge, die unter Standardbedingungen je min ein
µmol Substrat umsetzt
UDP
Uridindiphosphat
UTP
Uridintriphosphat
Zn2+
Zink-II-Ion
ZnCl2
Zinnchlorid
ZNS
Zentralnervensystem
µl
Mikroliter
XIV
1 Einleitung
1
1
Einleitung
Bereits 1881 wurde das mit der Aminoacylase 1 (Acy1) identische Enzym
Histozym von Schmiedeberg (Schmiedeberg, 1881) erstmals beschrieben.
Seither wurden viele Arbeiten publiziert, die sich mit der Lokalisation, Funktion,
Struktur und Bedeutung der Aminoacylase 1 beschäftigten. Nachdem ein
Aminoacylase-1-Mangel 2005 erstmals bei jungen Patienten beschrieben wurde
(Sass et al., 2006; Van Coster et al., 2005), haben verschiedene Wissenschaftler sich mit der klinischen Relevanz dieses Stoffwechseldefekts beschäftigt. Am
Ende der Einleitung wird auf einige Substanzen eingegangen, die in dieser Arbeit als mögliche neue Substrate der Aminoacylase 1 aus Schweineniere
(pkAcy1) getestet wurden.
1.1
Zelluläre Lokalisation
Als Schmiedeberg die Acy1 (Aminoacylase 1) 1881 erstmals beschrieb
(Schmiedeberg, 1881), nannte er das neu entdeckte Enzym in Anlehnung an
die Lokalisation im Gewebe „Histozym“. Eine Arbeit von Lindner untersuchte die
Lokalisation von mRNA (mitochondriale Ribonukleinsäure) der pkAcy1
(Aminoacylase 1 aus Schweineniere) mittels in situ-Hybridisierung. Er konnte
die gleichmäßige Verteilung in allen Teilen des tubulären Systems nachweisen.
Im Glomerulus und im Interstitium wurde keine mRNA gefunden (H. Lindner et
al., 2000).
Es wurde mehrfach über eine Membranassoziation der Acy 1 spekuliert. Heese
et al. zeigten, dass in situ ein erheblicher Teil der Enzymaktivität der Nierenrinde an der Membran zu finden ist. Die Inkubation von Membranfraktionen mit
Phospholipase C aus Bacillus cereus führt zur Freisetzung von Aminoacylase.
Daher nahmen sie an, dass Acy1 über ein phosphatidylinosithaltiges Glycolipid
in der Membran verankert ist (Heese et al., 1988). Die Arbeit von Palm und
Röhm weist darauf hin, dass die N-terminale Hälfte und das C-terminale Viertel
des Moleküls zwei unabhängig voneinander gefaltete Domänen bilden. Diese
enthalten auffällige PWW (A,L) –Sequenz-Motive, denen mehrere stark polare
Reste vorangehen. Dies könnte darauf hindeuten, dass diese Sequenzen
1
1 Einleitung
2
Oberflächenschleifen bilden, die eine Membranassoziaton der Acy1 vermitteln
(Palm & Röhm, 1995).
Gegen eine Membranassoziation der Acy1 spricht die Untersuchung von
Greenhough und Turner (Greenhough & Turner, 1991). Hier wurde gezeigt,
dass nur 3,7 %1 der Mikrovili-assozierten pkAcy1 beim Fraktionieren mit Triton
X-114 in der Detergenzphase zu finden waren. Daher konnte angenommen
werden, dass es sich bei pkAcy1 um ein hydrophiles Protein handelt und nicht
um ein Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol (G-PI) verankertes integrales Membranprotein. Auch Cook et al. charakterisierten die Acy1 als zytosolisches Enzym
(Cook et al., 1993). Lindner et al. (H. Lindner et al., 2000) unterstützen die
These, dass es sich bei der Acy1 um ein lösliches Enzym handelt, da es sich
ähnlich verhält wie das zytosolische Markerenzym Laktat-Dehydrogenase
(LDH).
1.2
Genlokalisation
Die Lokalisation des Gens, dass für die humane Aminoacylase 1 (hAcy1) kodiert, wurde erstmals von Naylor et al. (Naylor et al., 1979) beschrieben. Sie
ordneten das Gen Chromosom 3 zu. In einer späteren Arbeit (Naylor et al.,
1982) wurde mit 3p21, also dem kurzen Arm von Chromosom 3, der Ort genauer lokalisiert. Die Größe der cDNA (copy-Desoxyribonukleinsäure) aus
menschlichen Zelllinien beträgt 0,9 Kilobasen (kb) und das Acy1-Gen liegt im
distalen Abschnitt von 3.p21.1 (Miller et al., 1990). Acy1 wurde im zentromerischen Teil eines 2,5 Megabasen (mb) großen Bereichs in 3.p21.1 gefunden
(Gemmill et al., 1991).
Dieser Bereich von Chromosom 3p ist bei einer Reihe von Neoplasmen
betroffen. Die Deletion tritt beim kleinzelligen Bronchialkarzinom (SCLC) auf
und führt zu einem Verlust der Heterogenität. Die Inaktivierung von Acy1 ist
hochspezifisch für das SCLC (Miller et al., 1989). Deletionen auf dem kurzen
Arm von Chromosom 3 finden sich auch beim Nierenzellkarzinom (Zbar et al.,
1987).
1
Integrale Membranproteine der Mikrovili der Niere lösen sich beim Fraktionieren mit Triton X144 zu > 90 % in der Detergenzphase (Greenhough & Turner, 1991)
2
1 Einleitung
3
Die Acylpeptid-Hydrolase, welche die Hydrolyse von einem N-terminal acetyliertem Peptid katalysiert, so dass eine N-Acetyl-Aminosäure freigesetzt werden
kann, wird ebenfalls im Abschnitt 3.p21 kodiert (Jones et al., 1991). Scaloni et
al. stellten fest, dass die Acylpeptid-Hydrolase (APH) und Acylase-Aktivität in
sechs SCLC-Zell-Reihen praktisch nicht vorhanden ist (Scaloni et al., 1992).
1.3
Sequenzanalyse
Mitta et al. gelang die Sequenzierung von Acy1 aus Schweineniere und -leber
(Mitta et al., 1992). Sie stellten fest, dass beide Proteine identisch sind und aus
zwei Untereinheiten mit je 406 Aminosäureresten bestehen. Die Sequenz der
hAcy1 wurde erstmals 1993 entschlüsselt (Cook et al., 1993). Die Analyse der
cDNA ergab eine Länge von 1438 Basenpaaren (bp) mit einem offenen Leserahmen von 1224 bp. Das Protein besteht demnach aus 408 Aminosäuren und
hat eine berechnete Molekularmasse von 45.822 Dalton.
Zeitgleich entschlüsselten und verglichen Mitta et al. (Mitta et al., 1993) die Sequenzen von hAcy1 und pAcy1. Die Aminosäuresequenzen der beiden Proteine
waren zu 87,7 % identisch. Im menschlichen Protein fand sich an Position 241
ein zusätzlicher Aminosäurerest (Prolin).
1.4
Speziesvergleich
Lindner (H. Lindner et al., 2000) verglich die Aktivität der Aminoacylase 1 in
Niere und Leber von elf verschiedenen Säugerspezies (Abbildung 1). Die höchste Aktivität wurde in der Schafniere gemessen. Eine mittlere Aktivität fand sich
in den Nierenhomogenaten von Kühen, Meerschweinchen, Pferden, Schweinen, Hunden, Kaninchen und Menschen. Wenig Aktivität zeigte die aus den
Nieren isolierte Acy1 (kAcy1) von Ratten, Katzen und Mäusen. Die Aktivität in
den Leberhomogenaten war in allen Spezies geringer ausgeprägt und bei Hunden konnte keine Aktivität nachgewiesen werden. Insgesamt fand sich die
höchste Aktivität bei den Herbivoren und Omnivoren.
3
1 Einleitung
4
Abbildung 1: Vergleich der Acy1-Aktivität
Die Homogenate stammen aus der Niere (blaue Balken) und der Leber (rote
Balken) verschiedener Säugerspezies. Die spezifische Aktivität (in Units/mg)
wurde mit N-Chloroacetyl-L-Alanin als Substrat bestimmt. Modifiziert aus (H.
Lindner et al., 2000) HV: Herbivoren (Pflanzenfresser) OV: Omnivoren
(Allesfresser) CV: Carnivoren (Fleischfresser). Copyright © 2000 by Elsevier
1.5
Gewebeverteilung
Goldstein wies Aminoacylase 1-Aktivität im Gehirn von Tauben, Mäusen,
Ratten, Hamstern, Meerschweinchen, Kaninchen und Affen nach (Goldstein,
1976). Vermutlich ist das Enzym gleichmäßig im Gehirn verteilt. In einer Arbeit
von Endo (Endo, 1978) finden sich hohe Acy1-Aktivitäten in der Niere von
Schweinen, Meerschweinchen, Ratten und Mäusen sowie in weiteren Organen
von Ratten und Mäusen. Miller und Kao konnten die Expression von humaner
ACY1 in Niere, Leber, Lunge, Gehirn und Nebennierenmark nachweisen (Miller
& Kao, 1989). Beim Menschen konnte das Enzym außerdem in Erythrozyten
und im Herz nachgewiesen werden, beim Schwein im Gastro-Intestinal-Trakt,
Leber und Niere und bei Ratten in Milz, Erythrozyten, Herz, Muskel, Niere, Leber und Gehirn (Perrier et al., 2005).
4
1 Einleitung
1.6
5
Struktur der Aminoacylase 1
Die Acy1 gehört in die M20-Untergruppe in der Familie der Zink-Metalloenzyme.
Diese Gruppe enthält viele Carboxypeptidasen und Peptidasen. Biagini und
Puigsaver (Biagini & Puigserver, 2001) nutzten das Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST) und das Position-Specific Interated BLAST (PSI-BLAST),
um
die
Acy1-Sequenz
unterschiedlicher
Spezies
zu
vergleichen.
Sie
postulierten die Existenz einer separaten Gruppe in der MetalloexopeptidasenFamilie aufgrund von drei Aminosäuresequenz-Motiven. Diese Gruppe enthält
die pAcy1 und hAcy1 sowie weitere Enzyme. Aminoacylase anderer Spezies
wurden in dieser Arbeit nicht untersucht.
1.6.1 Zinkzentrum und PWW-Motive
Acy1 ist ein Zn2+(Zink-II-Ion)-Metalloprotein und besteht aus zwei 45-kDa Untereinheiten. Palm und Röhm identifizierten zwei 30-kDa schwere, Trypsinresistente Bereiche pro Monomer, welche die Aminosäure-Reste 6-196 im Nterminalen Bereich und 307-406 im C-terminalen Anteil enthalten. Die N-terminale Hälfte und das C-terminale Viertel des Moleküls bilden zwei unabhängig
voneinander gefaltete Bereiche. Beide enthalten ein auffälliges PWW (A,L) Sequenz-Motiv, dem mehrere stark polare Reste vorangehen (Abbildung 2).
Abbildung 2: Faltungsmodell eines Acy1-Monomers
aus (Palm & Röhm, 1995)
Copyright © 1995 by Springer-Verlag
Palm und Röhm stellten die Hypothese auf, dass diese Sequenzen Schleifen
auf der Oberfläche bilden, welche die Membranassoziation der Acy1 vermitteln
5
1 Einleitung
6
könnten (Palm & Röhm, 1995). Andere Autoren gehen von einer zytosolischen
Lokalisation der Acy1 aus (siehe 1.1).
Es gibt unterschiedliche Meinungen zur Rolle des Zinks bei der Acy1. Heese et
al. postulierten, dass das Metallzentrum der Acy1 zu weit von der Ligandenbindenden Domäne entfernt liegt, um eine direkte Rolle bei der Katalyse oder
Substrat-Bindung zu spielen. Daher gehen sie davon aus, dass das Metall-Ion
wichtig für die Struktur der Acy1 ist (Heese et al., 1990).
Wu und Tsou (Wu & Tsou, 1993) verglichen die Enzymkinetik von Aminoacylase mit Zn2+- und Co2+-Zentrum bei der Inaktivierung des Enzyms mit 1,10Phenanthrolin2 (OP). Dabei zeigte sich, dass die Co2+-Aminoacylase die gleiche
Aktivität besitzt wie das Zn2+-Enzym, die beiden Enzyme sich jedoch unterschiedlich verhalten in Bezug auf die Kinetik bei Inaktivierung durch OP und der
Wiederherstellung des Apoenzyms. Im Überschuss inhibiert Zn2+ sowohl das
ursprüngliche Enzym als auch das Co2+ rekonstituierte Enzym und beeinflusst
die enzymgebundene Fluoreszenz-Sonde 1-Anilinonaphthalen-8-Sulfonsäure
(ANS), was Co2+ nicht tut.
1.6.2 Metallbindung
Lindner et al. (H. A. Lindner et al., 2003) berichteten, die Kristallstruktur der Metallbindungs-Domäne einer Mutante der hAcy1 entdeckt zu haben. Ein
räumlicher Vergleich verschiedener Enzyme des MH-Stammes3 zeigte eine
hohe strukturelle Konservierung des dinukleären Zink-Zentrums, aber auch einen Unterschied in der Zink-Bindung, der mit den Unterschieden in der
Substrat-Bindung der bekannten Enzyme der Acy1/M20 Familie korreliert. Es
wurde angenommen, dass beide Zink-Stellen und ein konservierter GlutamatRest in unmittelbarer Nähe grundlegend für die Katalyse sind.
Mutationsanalysen unterstützen die Annahme, dass die Zink-Ionen, ein benachbarter Glutamat-Rest und Histidin im Dimerisation-Bereich eine wichtige
Rolle bei der Katalyse spielen. Dazu wurden verschiedene im aktiven Zentrum
2
3
1,10-Phenanthrolin komplexiert verschiedene Metalle (u. a. Eisen und Nickel) und findet
Anwendung als Inhibitor von Metalloproteasen.
http://www.applichem.com/produkte/produktdetail/as/110-phenanthrolin-monohydrat/,
aufgerufen am 12.05.2010 um 11.51 Uhr
bezieht sich auf die MEROPS-Klassifikation für Peptidasen, einsehbar unter
http://merops.sanger.ac.uk, aufgerufen am 16.08.2010 um 17.43 Uhr
6
1 Einleitung
7
veränderte hAcy1-Mutanten (Abbildung 3) komplementiert, und es wurde
gezeigt, dass die Katalyse an der Verbindungsfläche des Dimers stattfindet.
Abbildung 3: Schleifendiagramm des Zink-Bindungsbereiches der T347GMutante der hAcy1
aus (H. A. Lindner et al., 2003)
Copyright © 2003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
1.6.3 Dimere Struktur
D’Ambrosio et al. (D'Ambrosio et al., 2003) beschäftigten sich mit der Beschreibung des Redox- und Dimer-Zustandes der pAcy1 durch die Kombination von
biochemischen
und
massenspektrometrischen
Untersuchungen.
Eine
topografische Analyse des Enzyms wurde durch limitierte Proteolyse und
selektive chemische Modifikationen abgeleitet. Die Analyse der Reaktionsprodukte zeigte, dass 26 Aminosäuren auf der Moleküloberfläche lagen, die
freiliegende Polypeptid-Bereiche in der Struktur des dimeren Proteins
definieren. Die räumliche Nähe von den Lysin-Resten Lys220 und Lys231 auf der
Dimerisations-Fläche wurde demonstriert. Es konnte kein dimeres Modell berechnet werden, dass mit den experimentellen Daten übereinstimmt. Darum
wurde ein Modell berechnet, dass auf dem am ehesten mit den experimentellen
Daten übereinstimmenden Modell basiert. Nach diesem Modell besteht jedes
Schweine-Aminoacylase-Monomer aus zwei Bereichen (Abbildung 4):
7
1 Einleitung
8
-
einer kugelförmigen katalytischen Untereinheit (Reste 1-188 und
311-399), die aus einem β-Faltblatt zwischen zwei α-Helices und
einem zweiten β-Faltblatt auf der Oberfläche bestehen.
-
einem Dimerisations-Bereich (Reste 189-310), der in ein β-Faltblatt gefaltet ist, dass auf einer Seite von zwei α-Helices begrenzt
wird.
Abbildung 4: Quartärstruktur des pAcy1-Modells.
Die beiden Monomere sind türkis und grün, wobei die katalytischen Bereiche
(außen) dunkler schattiert sind. Zink-Ionen sind in gelb dargestellt. (D'Ambrosio
et al., 2003)
Copyright © 2003 by American Chemical Society
1.7
Funktion der Aminoacylase 1 im Stoffwechsel
Bereits bei der Erstbeschreibung der Acy1 als „Histozym“ (Schmiedeberg,
1881) wurde festgestellt, dass diese Substanz in der Lage ist, Hippursäure in
Benzoat und Glycin zu spalten. Smorodinzew prägte den Begriff „Acylase“
(Smorodinzew, 1922) und konnte zeigen, dass das Enzym auch Benzoylalanin,
Benzoylleucin und Benzoylaminobuttersäure spaltet. Weitere Untersuchungen
zeigten, dass die Aminoacylase 1 eine ganze Reihe von Acylaminosäuren hydrolysiert. Bevorzugte Substratkomponenten sind unverzweigte, aliphatische
Aminosäuren mit einem kurzkettigem Acylrest, vor allem N-Acetyl-L-Methionin
(NAM) (Birnbaum et al., 1952b) (Birnbaum & Greenstein, 1952; Birnbaum et al.,
1952a), (Rao et al., 1952), (Fones & Lee, 1953), (Gade & Brown, 1981), (Löffler
et al., 1988), (Chenault et al., 1989), (Anders & Dekant, 1994), (H. A. Lindner et
al., 2008). Das Enantiomer N-Acetyl-D-Methionin wird hingegen nicht hydrolysiert (Bruns & Schulze, 1962). Diese Enantioselektivität der Acy1 wird in der
Racematespaltung bei der chemischen Synthese von Methionin genutzt. N8
1 Einleitung
9
Acetyl-L-Asparaginsäure ist ein Substrat der Aminoacylase 2 (Acy2) und wird
nicht durch Acy1 hydrolysiert (Goldstein, 1976).
Die
verschiedenen
Acylreste
werden
generell
unabhängig
von
dem
Aminosäurerest unterschiedlich gut hydrolysiert. Meistens gilt die Reihenfolge
Trifluoroacetyl- > Chloroacetyl- > Propionyl- ≅ Acetyl- > Formyl- > Benzoyl-Aminosäuren (Fodor et al., 1950), (Fones & Lee, 1953).
Bruns und Schulze (Bruns & Schulze, 1962) zeigten, dass es sich bei der Acy1
und dem Histozym um identische Enzyme handelt.
Beim Vergleich von menschlicher ACY1 und Schweine-Acy1 zeigt sich, dass
beide Enzyme Aminosäuren mit unverzweigten aliphatischen Seitenketten und
kurzkettige N-Acyl-Reste bevorzugen (H. A. Lindner et al., 2008). Acy1 aus
Schweineniere kann in größeren Mengen in reiner Form von Sigma-Aldrich,
Inc., St. Louis, Missouri, USA (Artikelnummer A3010) bezogen werden, bei dem
menschlichen Enzym gestaltet sich die Gewinnung größerer Mengen
wesentlich schwieriger. Aus diesem Grund wurde für die Versuche in der
vorliegenden Arbeit Acy1 aus Schweineniere verwendet.
Auch bei der Detoxifikation und Bioaktivierung von Xenobiotika4 spielen
Aminacylasen eine Rolle. Ausgehend von Xenobiotika werden über mehrere
Stoffwechselschritte nephrotoxische Merkapturate hergestellt. Merkapturate aus
halogenierten Alkenen müssen durch die Aminoacylase deacyteliert werden,
bevor sie in der Niere zu reaktiven Zwischenprodukten katalysiert werden können. In der Niere werden Merkapturate akkummuliert, dort gibt es auch eine
hohe Aminoacylase-Aktivität. Möglicherweise erklärt dies die selektive Nephrotoxizität von Merkapturaten (Anders & Dekant, 1994).
Lindner et al. (H. Lindner et al., 2000) entwickelten die Theorie, dass die
Benzoylglycin-(Hippursäure)-Synthese,
die
durch
Acy1
katalysiert
wird,
möglicherweise einen alternativen Weg zur Detoxifixierung von Benzoat darstellt. Die Hauptquelle für Benzoat sind pflanzliche Lebensmittel, die viele
aromatische Komponenten enthalten. Im Laufe der menschlichen Evolution
nahm der Anteil von pflanzlichen Lebensmitteln zu Gunsten von tierischen Nah4
Xenobiotika sind chemische Stoffe, die dem biologischen Stoffkreislauf eines Organismus
fremd sind. Dazu gehören zum Beispiel synthetisch hergestellte Farbstoffe, Pestizide,
Pharmaka, Konservierungsmittel und chlorierte Lösungsmittel (McNaught & Wilkinson,
1997).
9
1 Einleitung
10
rungsquellen ab. Daher war der Acy1-abhängige Abbau von Benzoat eventuell
früher von Vorteil und hat möglicherweise heute noch einen Nutzen bei Vegetariern (Sass et al., 2006).
Bei ACY1-Defekten werden N-acetylierte Aminosäuren im Urin ausgeschieden.
Dies deutet darauf hin, dass durch den Defekt N-acetylierte Aminosäuren im
Körper nicht umgesetzt werden (Sass et al., 2006). Die Exkretion von Nacetylierten Aminosäuren im Urin gibt einen Hinweis darauf, dass die Rolle der
Acy1 in der Niere darin besteht, N-acetylierte Aminosäuren zu recyceln (Cook
et al., 1993), (H. Lindner et al., 2000).
1.8
N-terminale Acetylierung
Die N-Acetylierung von Aminosäuren ist ein weitverbreiteter Mechanismus, der
in vielen eukaryotischen und seltener bei prokaryotischen und Viruszellen zu
finden ist. Ungefähr 85% aller eukaryotischen Proteine (Polevoda & Sherman,
2000) sind durch N-Acylierung an ihrem Ende blockiert, vor allem durch Acetylund Formyl-Reste. Ein großer Teil (ca. 40 %) der N-Acylierten Proteine sind
Strukturproteine, zum Beispiel Histone, Virus-Hüll-Proteine, Keratin, Aktin, ribosomale
Proteine,
Myelinproteine
und
Tropomyosin.
Die
N-terminale
Acetylierung von Proteinen wird von N-Acetyl-Transferasen katalysiert, die
Acetyl-Gruppen von Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) an das Ende von α-Aminosäuren übertragen. Eukaryotische Proteine, die sensibel für N-terminale
Acetylierung sind, haben eine Anzahl von verschiedenen N-terminalen Sequenzen, die kein gemeinsames Motiv zeigen, und sind nicht abhängig von einem
bestimmten Rest. Am häufigsten werden eukaryotische Proteine mit Serin- oder
Alanin-Enden acetyliert. Diese Reste machen zusammen mit Methionin, Glycin
und Threonin 95% aller N-terminal acetylierten Reste aus (R. A. Bradshaw et
al., 1998), (Persson et al., 1985).
Es gibt mehrere Hypothesen, die als Grund für eine N-terminale Acetylierung
von Proteinen diskutiert werden. Die Acetylierung von Proteinen und Peptiden
kann zum einen dem Schutz vor dem proteolytischen Abbau dienen, so dass
die Halbwertszeit verlängert wird (Jornvall, 1975). N-terminale Modifikationen
können die biologische Funktion, die Stabilität, die Proteinfaltung und den Abbau beeinflussen (Kendall et al., 1990). Schwyzer stellte fest, dass die
10
1 Einleitung
11
posttranslationale N-terminale Acetylierung vom Melanozyten-stimulierenden
Hormon (MSH) dessen melanotrope Effekte verstärkt (Schwyzer & Eberle,
1977). Die analgesierende Wirkung von β-Endorphin wird hingegen gesenkt
(Smyth et al., 1979), (Smyth & Zakarian, 1980).
Wahrscheinlich benötigt nur eine geringe Menge von Proteinen diese Modifikation für die Aktivität und Stabilisierung und die restlichen Proteine sind Nterminal acetyliert, weil ihr Terminus zufällig mit der typischen Sequenz übereinstimmt. N-terminale Acetylierung schützt jedoch nicht unbedingt vor dem
Abbau.
Die Rolle der N-terminalen Acetylierung beim Schutz von Proteinen vor dem
Abbau durch die „N-end rule“5 ist noch unklar (Polevoda & Sherman, 2000).
1.8.1 Entstehung von N-acetylierten Aminosäuren
Die N-terminale Acetylierung wird durch N-Acetyl-Transferasen (NAT) katalysiert. Studien an der Hefe Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) zeigten die
Existenz von drei verschiedenen N-Acetyl-Transferasen, NatA, NatB und NatC,
die jeweils bestimmte Substrat-Gruppen abbauen. Da die kodierenden Gene für
die NATs bei S. cerevisiae und anderen Eukaryoten ortholog sind und das
Muster für die N-Acetylierung ähnlich ist, gingen Polevoda und Sherman davon
aus, dass Eukaryoten das gleiche System für die N-terminale Acetylierung
nutzen. Im Allgemeinen kann die Acetylierung nicht aufgrund der primären
Aminosäure-Sequenz vorhergesagt werden. Nur die Substrate der NatB haben
eine gemeinsame Sequenz, die leicht entschlüsselt werden kann. Sie besteht
bei S. cerevisiae aus Ac-Met-Glu, Ac-Met-Asp, Ac-Met-Asn-Asn und wahrscheinlich Ac-Met-Met-Asn (Polevoda & Sherman, 2000). Der Grad der
Acetylierung wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst (Polevoda &
Sherman, 2000):
5
Das Erkennen eines Amino-terminalen Restes scheint sowohl die metabolische Stabilität
eines Proteins als auch das Potential für die Regulation seiner Stabilität zu
vermitteln(Bachmair et al., 1986). Die N-end rule setzt die in vivo Halbwertszeit eines
Proteins in Beziehung zum N-terminalen Rest (Varshavsky, 1992).
11
1 Einleitung
12
-
Substrate mit spezifischen Sequenzen
-
suboptimale Reste vermindern die Aktivität
-
inhibitorische Reste in der entstehenden Kette
-
dem Fehlen von benötigten Resten
Der Grad der Acetylierung entsteht durch ein Gleichgewicht an positiven optimalen oder suboptimalen Resten und negativen inhibitorischen oder fehlenden
Resten (Polevoda & Sherman, 2000).
Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass am häufigsten Proteine mit Serinoder Alanin- Ende, und seltener mit Methionin-, Glycin- oder Threonin-Ende,
acetyliert sind (Polevoda & Sherman, 2002), (Jornvall, 1975), (Persson et al.,
1985), (Brown & Roberts, 1976).
1.8.2 Pharmakologische Bedeutung der Acetylierung
Substanzen mit Aminogruppen, die nicht oxidativ abgebaut werden können,
werden teilweise mittels zytosolischer N-Acetyltransferasen acetyliert. Die beiden Isoenzyme sind die beim Menschen ubiquitär vorkommende NAT1 und die
überwiegend im Gastrointestinaltrakt und in der Leber exprimierte NAT2. Zu
den Substraten gehören die aromatischen Amine (z.B. Anilin) und Alkylamine,
bei denen sich die Aminogruppe an einem tertiären Kohlenstoffatom befindet.
Die Acetylierung der Sulfonamide (Antibiotika) und von Isoniazid (Antituberkulotikum) sind Beispiele für eine derartige Konjugation, die im Allgemeinen zu einer
Abnahme der Hydrophilie führt (Mutschler, 2008). Dies kann Komplikationen
auslösen, z.B. eine Kristallurie, wie sie als Nebenwirkung von Sulfonamiden
beschrieben wurde. Andererseits reduziert die Acetylierung die Wirksamkeit der
Sulfonamide, da die für die biologische Aktivität essentielle Aminogruppe durch
die Acetylierung maskiert wird. Außer den Sulfonamiden sind weitere Substrate
für NAT Aminosalicylsäure, Koffein und Clonazepam (Mutschler, 2008). Für
beide NAT ist eine Vielzahl genetischer Varianten beschrieben, wobei nur die
genetischen NAT2-Polymorphismen mit dem Status der Acetylierung und den
damit verbundenen Nebenwirkungen assoziert sind (Lee et al., 2002). Aufgrund
dieser Variation wird Isoniazid von ca. der Hälfte der europäischen Bevölkerung
und von etwa 70-90 % der Japaner, Chinesen und Eskimos rasch, von dem
anderen Teil der Bevölkerung dagegen nur langsam durch Acetylierung inakti12
1 Einleitung
13
viert (Mutschler, 2008). Letztere bilden vermehrt Oxidationsprodukte von
Isoniazid, wodurch dessen Hepatotoxizität steigt und damit das Risiko eine Hepatitis zu entwickeln. Außerdem steigt auch das Risiko einer Isoniazidinduzierten Polyneuropathie. Hinsichtlich des Ansprechens auf die TuberkuloseTherapie unterscheiden sich schnelle und langsame Acetylierer dagegen nicht
(Mutschler, 2008).
Wiame et al. zeigten, dass die NAT8L, ein Neuronen-spezifisches Enzym, die
Synthese von N-Acetyl-Aspartat aus L-Aspartat und Acetyl Co-A katalysiert. Sie
nehmen an, dass NAT8L beim primären N-Acetyl-Aspartat-Mangel mutiert ist
(Wiame et al.).
1.8.3 Abbau von N-terminal-acetylierten Proteinen
Bisher ist relativ wenig über den Abbau von N-acetylierten Proteinen bekannt.
Zwei zytosolische Enzyme sind nacheinander an der Entstehung von N-terminalen Acetyl-Aminosäuren und der darauf folgenden Entfernung der AcetylGruppe beteiligt.
Blockierte NH2-Enden von Peptiden, die beim Protein-Umsatz oder –Abbau
entstehen, werden durch die N-Acylpeptid-Hydrolase (APH) gespalten. Die freigesetzte Aminosäure wird dann in einem zweiten Schritt durch die
Aminoacylasen in eine freie Aminosäure und Acetat hydrolysiert (Greenstein &
Winitz, 1961), (Gade & Brown, 1981), (Giardina et al., 1997), (Pittelkow et al.,
1998). Am Ende dieser Reaktion steht die Freisetzung der entsprechenden
freien Aminosäure ins Plasma (Abbildung 5). Diese Aminosäure ist dann wieder
für die Protein-Synthese verfügbar (Perrier et al., 2005).
APH
Acetyl-AS1-AS2-...ASn 
ACY1
Acetyl-AS1 + AS2-...ASn 
Acetat + AS1 + AS2-...ASn
Abbildung 5: Abbau von N-terminal acetylierten Proteinen
Dabei wirken die Substrate der APH als kompetitive Inhibitoren bei der Hydrolyse von N-Acetyl-Aminosäuren durch die Acylase (Gade & Brown, 1981), und
N-acetylierte Aminosäuren wiederum als kompetitive Inhibitoren bei der Hydrolyse von N-Acetyl-Peptid-Substraten der APH (Kobayashi et al., 1989).
13
1 Einleitung
14
Die Substratspezifität der Aminoacylase 1 ist sehr weit gefasst, mit einer Präferenz für Aminosäuren mit unverzweigten aliphatischen Seitenketten und kurzen
N-Acyl-Resten (Birnbaum et al., 1952b), (Fu & Birnbaum, 1953), (Pittelkow et
al., 1998). Die besten Substrate für die Acy1 sind N-Acetyl-L-Methionin und NAcetyl-L-Alanin (Henseling & Röhm, 1988).
In der Ratten-Hepatozyten-Kultur zeigte sich eine dosisabhängige Aktivierung
der Acy1 durch N-Acetyl-L-Methionin (Perrier et al., 2002).
1.8.4 Glykolysierung des pAcy1-Proteins
Pittelkow et al. beschreiben zwei potentielle Glykolysierungs-Bereiche im
pkAcy1- Enzym, bisher konnten jedoch keine Kohlenhydrate im gereinigten Enzym nachgewiesen werden (Pittelkow et al., 1998).
1.9
Aminoacylase-1-Mangel
Erstmals beschrieben wurde ein Aminoacylase 1-Mangel 2005 von Van Coster
et al. (Van Coster et al., 2005) und Sass et al. (Sass et al., 2006).
Van Coster et al. fanden eine große Menge von N-acetylierten Aminosäuren,
inklusive der Derivate von Serin, Glutamat, Alanin, Methionin, Glycin, Threonin,
Leucin, Valin und Isoleucin im Urin. Der Nachweis fand mittels GasChromatographie-Massen-Spektrometrie (GC-MS) für organische Säuren statt
(Van Coster et al., 2005). Zur gleichen Zeit entdeckten Sass et al. (Sass et al.,
2006) durch GC-MS ein ähnliches Muster von Derivaten N-acetylierter
Aminosäuren im Urin von vier Kindern.
Die NMR-Spektroskopie des Urins bestätigte das Muster von N-acetylierten
Metaboliten, die mit einem ACY1-Mangel vereinbar sind (Sass et al., 2006). In
der Nuklear-Magnet-Resonanz (NMR)-Spektroskopie wurden außerdem NAcetyl-Asparagin und N-Acetyl-Glutamin detektiert (Engelke et al., 2008).
Engelke et al. definierten mittels NMR-Spektroskopie den Acy1-Mangel auf der
Ebene der Stoffwechselprodukte und erstellten ein spezifisches Profil der im
Urin akkumulierten N-Acetyl-Aminosäuren (Engelke et al., 2008).
In Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierten Lymphoblasten konnten sowohl
Van Coster et al. als auch Sass et al. eine verringerte ACY1-Aktivität
nachweisen (Van Coster et al., 2005), (Sass et al., 2006).
14
1 Einleitung
15
1.9.1 Klinische Symptome
Der Patient von van Coster (Van Coster et al., 2005) fiel durch eine akute Encephalopathie am dritten Lebenstag auf, die ca. zwei Wochen andauerte.
Die analysierten Patienten von Sass (Sass et al., 2006) zeigten in der klinischen
Untersuchung verschiedene Auffälligkeiten. Der erste Patient fiel erstmals durch
eine Muskelschwäche und ein positives Trendelenburg-Zeichen auf. Die kognitive Entwicklung war soweit unauffällig. Bei dem zweiten Patienten
wurde
durch das Neugeborenen-Screening ein Biotinidase-Mangel diagnostiziert und
in den Folgeuntersuchungen wurde die Ausscheidung von N-acylierten Aminosäuren im Urin festgestellt. Bis zum Berichtsalter von siebzehn Monaten verlief
die geistige und motorische Entwicklung normal. Der dritte Patient zeigte früh
eine gestörte psychomotorische Entwicklung, bei der vor allem die zentrale Koordination
und
der
verminderte
Muskeltonus
führend
waren.
In
der
Kernspintomographie fielen im Alter von drei Monaten eine Hypoplasie des
Corpus callosum und des Vermis cerebelli sowie eine Syringomyelie auf. Der
vierte Patient zeigte im Alter von zwei Jahren eine leicht gestörte kognitive und
motorische Entwicklung. Diese phänotypische Variabilität deutet nicht darauf
hin, dass es sich beim ACY1-Mangel um eine Krankheit handelt (Sass et al.,
2006).
1.9.2 Mutationen
Sass et al. suchten bei vier Individuen mit einer erhöhten Ausscheidung von Nacetylierten Aminosäuren und nachgewiesenem zellulären ACY1-Mangel nach
Mutationen im ACY1-Gen. Die vier Patienten gehörten zu Familien aus der Türkei, Deutschland und Italien. Bei den Eltern der Individuen gab es keine
klinischen Hinweise auf eine Erkrankung. In zwei Familien waren die Eltern
blutsverwandt und heterozygote Mutationsträger, darum gingen Sass et al. von
einem autosomal-rezessiven Erbgang aus.
Die Sequenzanalysen bei zwei betroffenen Kindern zeigten homozygote
Funktionsverlust-Mutationen, die zu abnormalem Splicing und aberranter
Translation führten.
In den anderen beiden Familien wurden homozygote (R353C) und compoundheterozygote (R353C und E233D) Missense-Mutationen identifiziert.
15
1 Einleitung
16
Um seltene Polymorphismen auszuschließen, wurden 210 Kontroll-Chromosomen auf das Vorhandensein von dieser Missense-Mutation untersucht und
waren für E233D negativ. Es wurde jedoch ein R353C-Allel in der
Kontrollpopulation entdeckt, was zu einem seltenen Polymorphismus oder einer
häufigeren Mutation passt. Dies passt auch zu der Identifikation dieser Sequenz-Variante bei zwei der vier Individuen mit Acy1-Mangel. Ein EnzymAktivitätstest zeigte bei beiden Individuen eine verminderte Enzymaktivität
(Sass et al., 2006).
Insgesamt konnte demonstriert werden, dass rezessive ACY1-Mutationen für
das typische metabolische Profil im Urin bei ACY1-Dysfunktion verantwortlich
sind. Mutationen konnten bei allen Individuen mit erhöhter Konzentration von
mehreren N-Acetyl-Aminosäuren im Urin festgestellt werden. Es gibt also kein
Anzeichen für genetische Heterogenität. Segregationsanalysen zeigten, dass
alle untersuchten Eltern heterozygote Träger der Mutation waren. Die UrinAnalysen der Eltern ergaben unauffällige Befunde, was die rezessive Vererbung des Acy1-Mangels unterstützt (Sass et al., 2006).
Tylki-Szymanski et al. beschrieben den Fall eines vierjährigen autistischen6
Jungens
aus
Polen.
Bei
einem
Screening
auf
angeborene
Stoffwechselerkrankungen zeigte sich bei der Analyse der organischen Säuren
in der GC-MS eine erhöhte Ausscheidung von einigen N-acetylierten
Aminosäuren und ein Acy1-Mangel wurde mit Hilfe von EBV-transformierten
Lymphoblasten bestätigt. Bei der Mutationsanalyse des Acy1-Gens ließ die
homozygote Mutation c.1057C>T in Exon 14 nachweisen, die einen Austausch
von Arginin gegen Cystein bewirkt (p.Arg353Cys) und bereits bei einigen
anderen Acy1-Mangel-Patienten nachgewiesen werden konnte.
Zu diesem Zeitpunkt gibt es jedoch nicht genug Beweise für einen kausalen
Zusammenhang zwischen ACY1-Mangel und Autismus. Möglicherweise lagen
bei dem Patienten zufällig beide Zustände vor.
Es sind in Zukunft weitere Studien nötig, um die wirkliche Carrier-Frequenz der
Mutation in unterschiedlichen Populationen zu evaluieren und eine mögliche
6
Autistische Syndrome sind durch eine hochgradige interpersonelle Kontaktstörung mit einer
generellen Entwicklungsverzögerung, einer Unfähigkeit, Emotionen auszudrücken,
Stereotypien sowie Sprachauffälligkeiten gekennzeichneit (Muntau, 2003).
16
1 Einleitung
17
Rolle des ACY1-Mangels beim Autismus zu ergründen (Tylki-Szymanska et al.,
2010).
Solange nicht klar ist, ob es sich beim ACY1-Mangel um eine Krankheit handelt,
sind gezielte routinemäßige Untersuchungen auf diesen Defekt bei allen
Neugeborenen nicht indiziert. Bei neurologisch auffälligen Kindern wird im
Rahmen der Stoffwechseldiagnostik nicht spezifisch auf einen ACY1-Mangel
untersucht, aber dieser Defekt wird beim Screening auf verschiedene
Organoacidopathien automatisch miterfasst.
1.10 Morbus Canavan
Der Morbus Canavan ist eine seltene, autosomal-rezessiv vererbte, genetische
Kankheit, die durch einen frühen Beginn gekennzeichnet ist und mit einer charakteristischen und fortschreitenden Degeneration des Gehirns einhergeht. Es
kommt zu einer Zerstörung der Myelinscheiden der Axone, wobei die Axone
selber intakt bleiben (Canavan, 1930). Ein Mangel an Aminoacylase 2 (ACY2,
Aspartoacylase; EC 3.5.1.15), welche die Hydrolyse von N-Acetyl-Aspartat zu
Aspartat und Acetat katalysiert, ist die Ursache des M. Canavan (Kaul et al.,
1993), (Baslow & Resnik, 1997). Dadurch kommt es zu einer Akkumulation von
N-Acetyl-Aspartat. Die klinischen Symptome beim M. Canavan können sich in
Form von progressiv rückläufiger psychomotorischer Entwicklung, muskulärer
Hypotonie, Megalocephalie, Spastik, Sehbehinderung und dem Tod im Kleinkindalter äußern (Canavan, 1930), (Gordon, 2001). Die Diagnose wird aufgrund
von einer abnormal erhöhten Ausscheidung von N-Acetyl-Aspartat im Urin und
durch Enzym- und Mutationsanalysen gestellt. Die zugrundeliegende Pathophysiologie ist beim M. Canavan im Vergleich zum
Aminoacylase 1-Mangel wesentlich besser verstanden worden. Beim M.
Canavan kommt es häufig zu neurologischen Symptomen, und auch Patienten
mit einem ACY1-Mangel zeigen oft neurologische Auffälligkeiten. In Zukunft
zeigen sich eventuell auch beim Acy1-Mangel die Zusammenhänge zwischen
biochemischer Grundlage und den klinischen Symptomen der betroffenen
Patienten.
17
1 Einleitung
18
1.11 Weitere Funktionen der Acy1
In den letzten Jahren sind einige Publikationen veröffentlich worden, die darauf
hinweisen, dass die Acy1 außer der Hydrolyse von N-Acyl-Bindungen noch
weitere Aufgaben im Stoffwechsel erfüllt.
1.11.1 Interaktion mit der Sphingosin-1-Kinase
Eine Arbeit von Maceyka et al. befasste sich mit dem Einfluss von Acy1 auf die
Sphingosin-Kinase 1 (SphK1) (Maceyka et al., 2004). Dieses Enzym und sein
Produkt Sphingosin-1-Phosphat begünstigen das Zellwachstum und inhibieren
die Apoptose von Tumorzellen. Dabei zeigte sich, dass das C-terminale Fragment der Acy1 den Effekt von SphK1 auf Proliferation und Apoptose inhibiert,
während die komplette Acy1 die Wirkung potenziert.
Das zelluläre Level des bioaktiven Sphingolipid-Mediators Sphingosin-1-Phosphat (S1P) ist niedrig und stark reguliert. Acy1 kann die enzymatische Aktivität
von SphK1 regulieren und hat außerdem Einfluss auf dessen zelluläre Lokalisation, indem das Enzym gezielt an bestimmten Membranen exprimiert wird, wo
es die Produktion von S1P steuert. Dieses kann dann räumlich und zeitlich reguliert werden und sowohl intra- als auch extrazelluläre Signalwege
beeinflussen (Maceyka et al., 2004).
Zhoung et al. fanden eine erhöhte Expression von SphK1 in durch EisenNitrilotriacetat (Fe-NTA) induziertem Nierenzellkarzinom (RCC) im Vergleich zu
gesunder Niere. Möglicherweise ist dies auf Aktivierung von SphK1 durch Acy1
in Fe-NTA induziertem RCC zu erklären (Zhong et al., 2009).
1.11.2 Acy1 und andere neurodegenerative Erkrankungen
Zabel et al. untersuchten verschiedene neurodegenerative Erkrankungen (M.
Parkinson, Chorea Huntington, Scrapie und gestörte synaptische Übertragung)
und neurologische Erkrankungen ohne neurodegenerativen Effekt (Fragiles-XSyndrom, oxidativer Stress und Alter) im Mausmodell und verglichen die gefundenen Proteinveränderungen (Zabel et al., 2006). Für die Aminoacylase wurden
Veränderungen
sowohl
bei
neurodegenerativen
als
auch
bei
nicht-
neurodegenerativen Erkrankungen gefunden. Es zeigte sich eine verminderte
Expression der Acy1 bei Chorea Huntington und beim Fragilen-X-Syndrom und
18
1 Einleitung
19
eine Überexpression im Alter. Dies deutet möglicherweise auf die Rolle dieses
Enzyms
als
Knotenpunkt
in
Übertragungswegen
bei
zentralnervösen
Erkrankungen hin (Zabel et al., 2006).
1.11.3 Aminoacylase 1 und Karzinome
Bei einigen Karzinomen lassen sich Veränderungen im Acy1-Gen nachweisen,
z.B. bei beim kleinzelligen Bronchialkarzinom und Nierenzellkarzinomen.
Zhong et al. untersuchten die Funktion der Acy1 in der Tumorsuppression. Sie
fanden
eine
erniedrigte
Expression
des
Acy1-Gens
8q32,
das
dem
menschlichen Genort 3p21.31-24.1 entspricht. 3p-Deletionen finden sich beim
kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC) (3p14-21) (Miller et al., 1989), (Cook et
al., 1993), Nierenzellkarzinom (3p) (Zbar et al., 1987) und Cervixkarzinom (3p)
(Kohno et al., 1993).
Bei der Transfektion der RCC-Zelllinien mit Acy1 zeigte sich eine Inhibition der
Proliferation und Koloniebildung, sowie eine erhöhte Anzahl von apoptotischen
Zellen. Der molekulare Mechanismus blieb weiterhin unklar, mögliche Erklärungen sind eine Methylierung der Promoter-Region oder eine Modulation der GenExpression durch mikro-RNAs durch Acy1 (Zhong et al., 2009).
1.12 Pharmaka und Hormone
1.12.1 Medikamente
Die Rolle der Aminoacylase 1 bei der Verstoffwechselung von verschiedenen,
für den Menschen bedeutsamen, Medikamenten ist noch weitgehend unbekannt. Gerade hier ist es jedoch wichtig, mögliche Substrate der Acy1 zu
kennen, da Patienten mit einem ACY1-Mangel eventuell bei Einnahme erhöhte
Spiegel des Medikamentes aufweisen könnten oder Vorstufen nicht in aktive
Metabolite umwandeln können.
1.12.1.1
Paracetamol
Paracetamol (Acetaminophen, N-Acetyl-4-Aminophenol) ist ein Anilin-Derivat
und gehört zur Gruppe der nicht sauren antipyretischen Analgetika. Es überschreitet rasch die Blut-Hirn-Schranke und hemmt auf Rückenmarksebene und
19
1 Einleitung
20
in übergeordneten zentralnervösen Zentren die durch Schmerzreize ausgelöste
Prostaglandinsynthese (Mutschler, 2008). Paracetamol wird im Organismus zu
4-Aminophenol deacetyliert, das im Zentralnervensystem (ZNS) mit Arachidonsäure zum Arachidonoylaminophenol (AM-404) reagiert. AM-404 inhibiert nichtselektiv die Cyclooxygenasen (Mutschler, 2008).
Die größte Gefahr bei einer Paracetamol-Vergiftung besteht durch die hepatotoxische Wirkung. Die Glukuronidierungs- und Sulfatierungskapazität der Leber
ist bei höheren Dosen oder durch Leberinsuffizienz erschöpft, und es entstehen
toxische Paracetamol-Metabolite durch mikrosomale Oxidation, von denen das
N-Acetylchinonimin am bedeutsamsten ist. Bei der Therapie einer ParacetamolIntoxikation werden SH-Donatoren eingesetzt, z.B. Methionin, Cysteamin und
Acetylcystein (Mutschler, 2008).
Aminoacylasen
spielen
eine
Rolle
bei
der
Verstoffwechselung
von
Merkapturaten, die beispielsweise aus Paracetamol gebildet werden (Anders &
Dekant, 1994). 1.12.1.2
N-Acetylcystein
N-Acetylcystein bzw. sein aktiver Metabolit Cystein spalten Disulfidbrücken im
Proteinanteil der Schleimmoleküle und erniedrigen so die Viskosität des Bronchialschleims. N-Acetylcystein wird als Expektorans und zur Behandlung einer
Paracetamol-Vergiftung eingesetzt (Mutschler, 2008). Möglicherweise hat NAcetylcystein einen schützenden Effekt gegenüber Sauerstoffradikal-vermittelter Schädigung der Koronararterien (Rodrigues et al., 2004).
1.12.1.3
N-Carbamoyl-L-Glutamat
Bei Patienten, die an der seltenen Harnstoffzyklusstörung N-AcetylglutamatSynthetase (NAGS-) Mangel leiden, senkt die Supplementation mit 100-300
mg/kg/Tag N-Carbamoyl-L-Glutamat (Carbaglu®) den krankheitsbedingt erhöhten Ammoniakspiegel im Blutplasma (Zschocke & Hoffmann, 2004). Durch
einen Mangel an N-Acetylglutamat-Synthethase, die aus Acetyl-CoA und LGlutamat N-Acetylglutmat bildet, kommt es zu einer gestörten Ammoniakverwertung im Harnstoffzyklus. N-Carbamoyl-L-Glutamat gleicht strukturell NAcetylglutamat und kann dieses in vivo ersetzen. Dadurch werden die bereits
beim Neugeborenen auftretenden Symptome einer Hyperammonämie wie bei20
1 Einleitung
21
spielsweise
Trinkunlust,
Erbrechen,
Lethargie,
Hypotonie,
erhöhte
Atemfrequenz, Reizbarkeit und Krampfanfälle gemindert. Unbehandelt führt die
Krankheit zu Koma und Tod (Mutschler, 2008).
1.12.1.4
N-Acetyl-Procainamid
Procainamid wird bei der Therapie von Herzrhythmusstörungen eingesetzt und
gehört zur Klasse 1A der Antiarrhythmika. Beim Abbau wird die Substanz Nacetyliert und das entstehende Produkt zeigt die gleichen pharmakologischen
Wirkungen wie die Ausgangssubstanz. Bei Personen von langsamem
Acetylierungstyp findet dagegen in erster Linie eine N-Hydroxylierung statt. NHydroxyprocainamid bildet eine Reihe weiterer reaktionsfähiger Zwischenprodukte, die kovalente Verbindungen mit zellulären Makromolekülen, z.B.
Nukleinsäuren, eingehen können. Diese wirken als Antigene. Personen vom
langsamen Acetylierungstyp erkranken nach Behandlung mit Procainamid häufiger an systemischem Lupus erythematodes, einem mit Autoantikörpern gegen
DNA einhergehenden Krankheitsbild (Löffler et al., 2007). N-Acetyl-Procainamid
lässt sich im Urin von Patienten nachweisen, die mit Procainamid behandelt
wurden. Diese Substanz wurde sowohl als Metabolit von Procainamid wie auch
auf die Eigenschaft als separates Antiarrhythmikum untersucht. Verschiedene
Studien konnten zeigen, dass N-Acetyl-Procainamid chronische ventrikuläre
Extrasystolen unterdrücken kann (Connolly & Kates, 1982).
1.12.2 Serotonin, N-Acetyl-Serotonin und Melatonin
Serotonin
(5-Hydroxytryptamin)
wird
im
Zentralnervensystem
und
den
enterochromaffinen Zellen des Gastro-Intestinaltraktes gebildet. Es wird in den
Thrombozyten gespeichert und aus diesen freigesetzt. Serotonin ist das
hydroxylierte
biogene
Amin
der
essentiellen
Aminosäure
Tryptophan.
Serotoninrezeptoren finden sich auf Neuronen, Gliazellen, glatter Muskulatur,
Endothel- und Epithelzellen und Thrombozyten. Die Rezeptoren lassen sich
pharmakologisch in verschiedene Subtypen einteilen, die unterschiedliche biologische Effekte vermitteln:
21
1 Einleitung
22
-
5HT1-Rezeptoren verursachen eine Tonusminderung der glatten
Muskulatur in Gefäßen und im Gastrointestinaltrakt und eine Kontraktion der glatten Muskulatur von Gehirngefäßen
-
5HT2-Rezeptoren sorgen für eine Kontraktion der glatten Muskulatur und die Aggregation von Thrombozyten
-
5HT3-Rezeptoren
Erbrechen,
sind
Schmerzen
an
der
und
Entstehung
Angst
von
Übelkeit,
beteiligt.
5HT3-
Rezeptorantagonisten besitzen deshalb eine wichtige Bedeutung
bei der Behandlung von Übelkeit und Erbrechen (Löffler et al.,
2007).
N-Acetyl-Serotonin (NAS, Normelatonin) ist ein Zwischenprodukt bei der Synthese von Melatonin aus Serotonin (Weissbach et al., 1960). NAS aktiviert den
TrkB-Rezeptor und zeigt eine antidepressive Wirkung (Jang et al.). Melatonin (N-[2-(5-Methoxyindol-3-yl)ethyl]acetamid) wird im ZNS in der
Epiphyse (Glandula pinealis) sowie in der Retina synthetisiert. Ausgangspunkt
der Biosynthese ist Serotonin, das mit Acetyl-CoA N-acetyliert und anschließend an der 5-Hydroxygruppe O-methyliert wird. Die Melatoninsynthese und sekretion unterliegt einem zirkadianen Rhythmus, der über die Lichtwahrnehmung
der
Retina
gesteuert
und
über
suprachiasmatische
Kerne
im
Hypothalamus und die Formatio reticularis auf die Epiphyse weitergeleitet wird.
Aus diesem Grund ist die Plasma-Melatonin-Konzentration tagsüber niedrig,
steigt am frühen Abend vor dem Einschlafen an und hat das Maximum gegen
Mitternacht erreicht. Bei Reisen durch Zeitzonen wird dieser Rhythmus gestört,
so dass die vorübergehende Desynchronisierung der Melatoninsekretion am
Jetlag beteiligt sein könnte. Daher wird Melatonin häufig zur Prävention des
Jetlags verwendet. Außerdem beeinflusst Melatonin neuroendokrine Funktionen
(Löffler et al., 2007).
1.12.3 N-Acetyl-Glukosamin
In Glykoproteinen und Glykosaminoglykanen kommen oft Monosaccharide mit
Aminogruppen vor.
N-Acetyl-Glukosamin bildet beispielsweise als Disaccharid zusammen mit Glukoronsäure die Hyaluronsäure, der Flüssigkeit zwischen Gelenkknorpeln.
22
1 Einleitung
23
Gemeinsam mit N-Acetyl-Muraminsäure bildet es das gitterförmige Makromolekül Murein, aus dem die Zellwand von Bakterien besteht. Die Biosynthese von
Murein wird durch Penicillin gehemmt (Löffler et al., 2007).
1.13 N-Acyl-Homoserin-Laktone
N-Acyl-Homoserin-Laktone spielen eine wichtige Rolle beim Quorum sensing,
einer Form der bakteriellen Zell-zu-Zell Kommunikation (Andersen et al., 2001). Bakterien kommunizieren untereinander, indem sie chemische Signalmoleküle
verwenden. Diese Moleküle sind wichtig, um Aktivitäten von großen Zellgruppen zu koordinieren und die Zelldichte der Population zu bestimmen. Die
meisten Prozesse, die durch Quorum sensing kontrolliert werden, wären undurchführbar, wenn sie nur von einem einzelnen Bakterium unternommen
würden. Wenn sie jedoch simultan durch eine große Anzahl von Zellen erfolgen, sind sie wesentlich effizienter, wie z.B. bei der Biofilmbildung, der
Biolumineszenz und der Sekretion von Proteasen und Antibiotika.
Acyl-Homoserin-Laktone werden als Autoinducer-1 bezeichnet, als ein Signalmolekül, das der Kommunikation zwischen Bakterien einer Art dient (Waters &
Bassler, 2005).
Xu et al. (Xu et al., 2003) konnten zeigen, dass die pkAcy1 in der Lage ist, NAcyl-Homoserin-Laktone zu deacetylieren. Das Enzym baute N-Butyryl- und NOctanoyl-L-Homoserin-Lakton zu L-Homoserin ab. Außerdem reduzierte sich
durch das Enzym die Bildung von Biofilmen in Wasser aus einem Aquarium.
1.14 Acylglycine
Verschiedene Acylglycine sind mit zahlreichen Substituenten im Handel erhältlich. Aus diesem Grund erschien diese Substratgruppe geeignet, um
vergleichende Untersuchungen durchzuführen und mögliche neue Substrate
der Acy1 zu testen. Aus zahlreichen Untersuchungen ist bekannt, das
Acylglycine von der Acy1 deacetyliert werden. Die ersten Untersuchungen von
Smorodinzew befassten sich unter anderem mit Benzoylglycin (Hippursäure)
(Smorodinzew, 1922).
23
1 Einleitung
24
1.14.1 N-Palmitoylglycin und N-Arachidonoylglycin
Palmitoylglycin
besteht
aus
einer
gesättigten
Fettsäure
mit
16
Kohlenstoffatomen, die über eine Amid-Bindung mit Glycin verbunden ist. Die
Struktur ist somit ähnlich wie die von Phospholipiden abgeleiteten N-Acyl-Ethanolaminen (H. B. Bradshaw et al., 2009).
Wegen der Existenz von Enzymen, die Fettsäuren mit Glycin konjugieren und
der großen Menge von Palmitinsäure im Gehirn kann die endogene Synthese
von N-Palmitoylglycin angenommen werden. Es konnte gezeigt werden, dass
Palmitoylglycin nach zellulärer Stimulation gebildet wird (Rimmerman et al.,
2008). Hohe Konzentrationen wurden im Rückenmark und in der Haut von Ratten
gefunden.
Palmitoylglycin
inhibierte
die
durch
Hitze
induzierte
Reizweiterleitung in nozizeptiven Neuronen der Hinterhörner. Außerdem hatte
es einen Effekt auf den Kalzium-Einfluss in den Ganglionen der Hinterwurzel.
Zusätzlich
zeigte
sich
eine
Steigerung
der
Stickoxid
(NO)-Produktion
(Rimmerman et al., 2008).
N-Arachidonoylglycin ist eine endogenes Arachidonoylamid, das über einen GProtein-gekoppelten Rezeptor antinozizeptive und antiinflammatorische Effekte
vermittelt. Es wird durch die direkte Konjugation von Arachidonsäure mit Glycin
und durch den oxidativen Abbau des endocannabinoiden Anandamids gebildet
(H. B. Bradshaw et al., 2009).
24
1 Einleitung
25
1.15 Fragestellung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Substanzen, die aufgrund ihrer chemischen
Struktur als Substrate für die Aminoacylase 1 in Frage kamen, auf ihre Eignung
als Substrat der Acy1 untersucht.
Auf folgenden Fragen liegt der Schwerpunkt dieser Arbeit:
-
Welchen Einfluss hat es auf das Enzym, wenn mögliche Substrate
nicht in Hepes-Puffer sondern in Ethanol oder Methanol gelöst
werden?
-
Bis zu welcher Kettenlänge werden Aminosäuren mit langkettigen
Fettsäure-Resten, die eine wichtige Funktion als endogene
Signalmoleküle besitzen, von der pkAcy1 hydrolysiert?
-
Sind die Metabolite Isobutyrylglycin oder Isovalerylglycin, die bei
bestimmten Stoffwechseldefekten akkumulieren, Inhibitoren der
pkAcy1 und führen so möglicherweise zu einem sekundären
ACY1-Mangel?
-
Wie gut werden diese neuen Substrate im Vergleich zu den bekannten
typischen
acetylierten
proteinogenen
Aminosäuren
hydrolysiert?
Die Entdeckung neuer Substrate der Acy1 kann einen Beitrag dazu leisten, die
Pathomechanismen bei dem seit einigen Jahren bekannten Aminoacylase 1Mangel besser zu verstehen und den möglichen Krankheitswert zu definieren.
Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit in vitro-Tests mit gereinigter Acylase 1 aus Schweineniere durchgeführt, die mit dem menschlichen
Enzym zu mehr als 85 % übereinstimmt.
25
2 Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Material
26
Im folgenden Abschnitt werden alle für diese Arbeit verwendeten Materialien
genannt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird hier lediglich der deutsche
Name und der Hersteller aufgeführt. Eine ausführliche, alphabetisch sortierte
Liste inklusive aller Bestell- und Lot-Nummern befindet sich im Anhang.
Bei einigen Aminosäuren unterscheiden sich die Extinktionskoeffizienten in der
Ninhydrin-Reaktion (näheres siehe Methodenteil). Die für die Eichgerade verwendeten Substanzen werden darum mit in den Abschnitten für die
verwendeten potentiellen Acy1-Substrate aufgeführt.
Substanzen, die für mehrere Versuche verwendet wurden, erscheinen zum Teil
mehrfach.
2.1.1 Enzym
Für alle Versuchsreihen wurde gereinigte, gefriergetrocknete Aminoacylase 1
der Reinheitsklasse 1 aus Schweineniere verwendet. Das Enzym wurde in der
Menge von 1 g von der Firma Sigma bezogen. Für den Assay wurden jeweils
10 mg Acy1 benötigt. Um eine Verunreinigung oder Änderung der Aktivität zu
verhindern, wurde das Enzym nach dem Öffnen in 10 mg Aliquots abgewogen,
luftdicht verschlossen und bei -20°C gelagert. Zu Beginn einer Versuchsreihe
wurde das Enzym jeweils frisch in Homogenisierungs-Puffer gelöst und auf Eis
gelagert.
Name
Bezugsquelle
Aminoacylase 1 aus Schweineniere
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
2.1.2 Kontrollsubstanzen
Bei jedem Versuch wurden drei Substanzen als Kontrolle mitgeführt, um Veränderungen in der Enzymaktivität oder im Ninhydrinassay festzustellen. Aus
anderen Arbeiten ist bekannt, dass die Positivkontrolle N-Acetyl-L-Methionin gut
26
2 Material und Methoden
27
von der Acy1 hydrolysiert wird, das Enantiomer N-Acetyl-D-Methionin (Negativkontrolle) wird hingegen nicht hydrolysiert (Bruns & Schulze, 1962). Als
zusätzliche Negativkontrolle wurde bei jedem Versuch N-Acetyl-L-Aspartat, ein
Substrat der Acy2, mitgeführt.
Name
Bezugsquelle
N-Acetyl-D-Methionin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Asparaginsäure
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Methionin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
L-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
2.1.3 Substrate der Aminoacylase 1
Durch zahlreiche Arbeiten (Schmiedeberg, 1881), (Smorodinzew, 1922),
(Birnbaum & Greenstein, 1952; Birnbaum et al., 1952b), (Rao et al., 1952),
(Fones & Lee, 1953), (Bruns & Schulze, 1962), (Goldstein, 1976) ist bereits
eine Vielzahl von Substraten der Acy1 bekannt. Diese Untersuchungen sollten
vor allem Vergleichsmöglichkeiten schaffen bzw. Plausibilitätsüberprüfungen
ermöglichen.
Name
Bezugsquelle
Acetylglycin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-D-Alanin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Acetyl-D-Methionin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Alanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Asparaginsäure
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Glutaminsäure
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Methionin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Acetyl-DL-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Tryptophan
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
27
2 Material und Methoden
28
N-Acetyl-L-Alanin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Acetyl-L-Asparaginsäure
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Glutaminsäure
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Leucin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Methionin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Acetyl-L-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Tryptophan
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Acetyl-L-Tyrosin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Valin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Benzoylglycin
Merck KGaA, Darmstadt
N-Chloroacetyl-Glycin Ethylester
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Tryptophan
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Tyrosin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Valin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Formyl-L-Alanin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Formyl-L-Phenylalanin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
Glycin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Alanin
Merck KGaA, Darmstadt
L-Arginin
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
L-Asparaginsäure
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
L-Glutaminsäure
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Leucin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Prolin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Trytophan
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Valin
Merck KGaA, Darmstadt
28
2 Material und Methoden
29
2.1.4 Potentielle Substrate der Aminoacylase 1
In dieser Arbeit wurden zusätzliche Substanzen auf ihre Eignung als Substrat
der Acy1 überprüft, um die Relevanz dieses Enzyms im Stoffwechsel weiter zu
ergründen.
2.1.4.1
Acylglycine
Glycin ist im Handel mit einer Vielzahl an unterschiedlichen Substituenten erhältlich, die sich in ihrer Länge und Verzweigung unterscheiden. Daher erschien
dieses Substrat geeignet, um den Einfluss der Kettenlänge und Verzweigung
auf die Enzymaktivität zu untersuchen.
Name
Bezugsquelle
2-Methylbutyrylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
2-Methylvaleroylglycin
Dept. Química Organíca, Universidad
Autónoma de Madrid
3-Methylcrotonylglycin
Dept. Química Organíca, Universidad
Autónoma de Madrid
Acetylglycin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Acryloylglycin
Dept. Química Organíca, Universidad
Autónoma de Madrid
Arachidonylglycin
Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan
Butyrylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Dimethyloxallylglycin
Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan
Furyl-Acryloyl-Glycin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
Heptanoylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Hexanoylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Hippursäure
Merck KGaA, Darmstadt
Isobutyrylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
29
2 Material und Methoden
Isovalerylglycin
30
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Myristoyl-Glycin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
N-(2-Furoyl)-Glycin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Allylglycin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Benzoylglycin
Merck KGaA, Darmstadt
N-Chloroacetyl-Glycin Ethylester
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Formylglycin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
Palmitoylglycin
Eigensynthese
Phenylacetyl-Glycin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
Phenylpropionylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Propionylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Retinoylglycin
7
Suberylglycin
Dr. R. Rühl, Debrecen, Ungarn
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Tiglylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Trans-N-(2-Furfurylideneacetyl)-Glycin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Valerylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Palmitinsäure-N-Hydroxysuccinimidester
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Glycin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
2.1.4.2
Acyl-Methionin
N-Acetyl-L-Methionin ist dafür bekannt, dass es von der Acy1 gut hydrolysiert
wird. Daher wurden weitere N-acylierte Methionine als mögliche Substrate getestet.
7
Über diese Substanz ist wenig bekannt, daher alle Ergebnisse unter Vorbehalt. Die Substanz
ist eine Synthese aus dem o.g. Labor, über die Konzentration und die Reinheit liegen keine
Angaben vor.
30
2 Material und Methoden
31
Name
Bezugsquelle
Caproyl-Methionin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
Furyl-Acryloyl-Methionin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
N-Acetyl-D-Methionin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-DL-Methionin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Acetyl-L-Methionin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Benzoyl-DL-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Formyl-L-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Formyl-L-Methionin-β-Naphthylamid
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-TFA-L-Methionin-Methylester
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Palmitoyl-L-Methionin
Bachem AG, Bubendorf, CH
L-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
2.1.4.3
Hormone und Medikamente
Es wurden außerdem einige Medikamente und Hormone auf ihre Eignung als
Substrate der Acy1 untersucht.
Name
Bezugsquelle
Acetaminophen (Paracetamol)
MP Biomedicals, Solon, Ohio
Chloramphenicol
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Melatonin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-5-Hydroxytryptamin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Cystein
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetylprocainamid
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Carbamoyl-L-Glutamat
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
4-Aminophenol (Deacetyliertes
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
Acetaminophen)
(1S,2S)-(+)-2-Amino-1-(4-nitro-phenyl)-1,3-
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
31
2 Material und Methoden
32
propandiol (Deacetyliertes Chloramphenicol)
5-Methoxytryptamin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
Serotonin Hydrochlorid
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Cystein
Merck KGaA, Darmstadt
L-Glutamat
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
2.1.4.4
N-Acyl-Homoserin-Lakton
Xu (Xu et al., 2003) berichtete, dass die pkAcy1 eine Rolle beim Abbau der
bakteriellen Quorum-sensing Moleküle N-Acyl-Homoserin-Laktone spielt. Daher
wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine Versuchsreihe dazu durchgeführt.
Name
Bezugsquelle
N-(3-Oxooctanoyl)-L-Homoserin-Lakton
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-(β-Ketocaproyl)-L-Homoserin-Lakton
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Butyryl-DL-Homoserin-Lakton
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Dodecanoyl-DL-Homoserin-Lakton
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Heptanoyl-DL-Homoserin-Lakton
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Hexanoyl-DL-Homoserin-Lakton
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Octanoyl-DL-Homoserin-Lakton
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
L-Homoserin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
2.1.4.5
Unterscheidung nach Art des Acylrestes
Es ist bekannt, dass acylierte Aminosäuren in Abhängigkeit vom Acylrest unterschiedlich gut hydrolysiert werden. Es wurden Versuchsreihen mit Acetyl-,
Benzoyl-, Chloroacetyl- und Formyl-Resten durchgeführt.
Name
Bezugsquelle
N-Acetyl-D-Glucosamin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Acetyl-L-Cystein
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Benzoyl-DL-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
32
2 Material und Methoden
33
N-Benzoyl-DL-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Benzoyl-L-Glutamat
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Benzoyl-Valin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
N-Benzoylglycin
Merck KGaA, Darmstadt
N-Chloroacetyl-L-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Tryptophan
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Tyrosin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Chloroacetyl-L-Valin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Formyl-Valin-OH
Bachem AG, Bubendorf, CH
N-Formyl-L-Alanin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Formyl-L-Leucin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Formyl-L-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Formyl-L-Phenylalanin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
N-Formyl-L-Tyrosin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
N-Formylglycin
MP Biomedicals, Solon, Ohio
D-(+)-Glucosamin Hydrochlorid
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
Glycin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Alanin
Merck KGaA, Darmstadt
L-Cystein
Merck KGaA, Darmstadt
L-Glutamat
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Leucin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Methionin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Phenylalanin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Trytophan
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis, Missouri
L-Valin
Merck KGaA, Darmstadt
33
2 Material und Methoden
2.1.4.6
34
Carbamoyl-Aminosäuren
3-Ureidopropionat (N-Carbamoyl-β-Alanin)
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Ureidosuccininsäure (N-Carbamoyl-DL-
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Aspartat)
N-Carbamoyl-L-Glutamat
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
L-Alanin
Merck KgaA, Darmstadt
L-Asparaginsäure
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
L-Glutamat
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
2.1.4.7
Aspartate
Ureidosuccininsäure (N-Carbamoyl-DL-
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
Aspartat)
N-(Trifluoroacetyl)-DL-Aspartat
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri
L-Asparaginsäure
Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg
2.1.5 Mögliche Inhibitoren der Aminoacylase 1
Es wurde ein Versuch durchgeführt um zu sehen, ob die Acy1 durch verzweigtkettige Glycin-Derivate inhibiert wird. Dazu wurden Isobutyrylglycin und
Isovalerylglycin zuerst als mögliche Substrate der pAcy1 untersucht. Dann wurden je 2,5 mmol, 5 mmol und 10 mmol Isobutyrylglycin bzw. Isovalerylglycin zu
einem Enzymansatz mit einer Endkonzentration von 10 mmol NAM und einer
Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l gegeben und die Auswirkung auf die
Hydrolyse von NAM analysiert. Um das Volumen konstant zu halten wurden wie
immer 270 µl Acylase genommen, aber die Konzentration der NAM-Lösung
wurde auf 200 mM erhöht und nur 15 µl statt wie sonst üblich 30 µl zur Acylase
gegeben, plus 15 µl Inhibitor, das entspricht dann einer Endkonzentration von
10 mM NAM im Ansatz. Dann wurden 15 µl 200 mM/100 mM/50 mM Isobutyrylglycin- bzw. Isovalerylglycin-Lösung in den Ansatz gegeben, so dass die
Endkonzentration des möglichen Inhibitors im Ansatz mit dem Enzym 10 mM/5
mM/2,5 mM betrug.
34
2 Material und Methoden
35
Name
Bezugsquelle
Isobutyrylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
Isovalerylglycin
VU Medical Center, Metabolic Laboratory,
Amsterdam
2.1.6 Pufferlösungen
Hepes-Puffer 0,1 M
Hepes
pH 8 bei Raumtemperatur
Aqua dest.
1 M NaOH-Lösung zum Titrieren
Tris HCl Homogenisierungs-Puffer8
20 ml 1 M Tris HCl pH 8,5
pH 8 bei Raumtemperatur
2 ml 1 mM ZnCl2
400 µl Triton X 100
Aqua dest. 400 ml
6 M HCl zum Titrieren
Citrat-Puffer 0,2 M
Citronensäure Monohydrat
pH 5 bei 37°C
Aqua dest.
NaOH-Tabletten zum Titrieren
1 M NaOH-Lösung zum Titrieren
Ninhydrin-Lösung 2 %
11,23 mM Ninhydrin
50 ml 0,2 M Citrat-Puffer
50 ml Ethylen Glykol Monomethyl
Ether
8
Normalerweise wird dieser Puffer verwendet, um Zellen zu homogenisieren. In diesem Fall
diente er lediglich als Lösungsmedium für die Aminoacylase1.
35
2 Material und Methoden
50 % 1-Propanol
36
je zu gleichen Teilen
1-Propanol
Aqua dest.
2.1.7 Geräte
Feinwaage Mettler H20T 0001g-160g
Mettler-Toledo GmbH, Giessen
Vortex–Genie™
Bender & Hobein AG, Zürich,
Schweiz
Synergy™ HT Multi-Detection
BioTek Instruments GmbH, Bad
Microplate Reader
Friedrichshall
Inkubationsofen kelvitron® t
Heraeus Instruments GmbH, Hanau
Pipette 2-20 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl
Eppendorf AG, Hamburg
Mehrkanalpipette Biohit Proline 0,5-10
Biohit Deutschland GmbH, Rosbach
µl
v. d. Höhe
Mehrkanalpipette 10-100 µl
Eppendorf AG, Hamburg
Mehrkanalpipette 20-200 µl
Brand GmbH + Co KG, Wertheim
Glaspipette 5 m, 10 ml
Braun
Photometer
Perkin Elmer UV/Vis Spectrometer
Lambda 20
Exsikkator
Glaswerk Wertheim
Rotavapor R
Büchi Labortechnik GmbH, Flawil,
Schweiz
Kühlschrank 8°C (Innenraum
Dometic ML 305C
explosionsgeschützt)
Gefrierschrank -20°C (Innenraum
Dometic ML 305C
explosionsgeschützt)
36
2 Material und Methoden
37
Gefrierschrank -20°C
Liebherr Premium NoFrost
Gefrierschrank -80°C
Heraeus HERAfreeze
Gaschromotographie-
Hewlett Packard 5890 Series II
Massenspektrometer
Gas Chromotograph
2.1.8 Verbrauchsmaterial
SafeSeal-Reagiergefäße 1,5 ml, 2 ml
SARSTEDT AG & Co., Nümbrecht
BD Falcon™ Conical Centrifuge Tubes BD Biosciences, Heidelberg
15 ml, 50 ml
96 Well Microplates, PS, F-bottom
Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
Pipettenspitzen 10 µl, Art. Nr. 720011
Biozym Scientific GmbH, Hess.
Oldendorf
Pipettenspitzen 200 µl
Eppendorf AG, Hamburg
Pipettenspitzen 1000 µl
Eppendorf AG, Hamburg
2.2
Methoden
Die Aminoacylase 1 spaltet Acetylreste von N-Acetyl-Aminosäuren ab. Dabei
entsteht eine freie Aminosäure und Acetat (Abbildung 6).
ACY1
Acetyl-AS1 + AS2-...ASn 
Acetat + AS1 + AS2-...ASn
Abbildung 6: Aminoacylase-Reaktion
Durch die Reaktion mit Ninhydrin kann die freie Aminosäure nachgewiesen
werden.
2.2.1 Nachweis der NH2-Gruppe durch Ninhydrin
Die charakteristische Farbreaktion von Ninhydrin (2,2-Dihydroxy-1,3-Indandion)
mit Aminosäuren wurde 1910 zufällig von dem Berliner Chemiker Siegfried
Ruhemann entdeckt (Ruhemann, 1910).
37
2 Material und Methoden
38
Abbildung 7: Ninhydrin-Reaktion9
Copyright © 2009 Blexon, S. Gloor
Ninhydrin bildet nach der Reaktion mit der Aminogruppe einer Aminosäure ein
Aminoketon. Das restliche Aminosäurengerüst bildet sich zum entsprechenden
Aldehyd um. Lediglich das N-Atom der Aminosäure findet sich im Aminoketon
wieder (Abbildung 7).
Abbildung 8: Ruhemanns Purpur8
Copyright © 2009 Blexon, S. Gloor
Das Aminoketon reagiert anschließend mit einem weiteren Ninhydrinmolekül
unter Abspaltung von Wasser und H+ zu einem blauvioletten Farbstoff
(Abbildung 8), Ruhemanns Purpur (Gloor et al., 2009).
Moore und Stein beschrieben 1948 eine photometrische Methode zum quantitativen Nachweis von Aminosäuren und verwandten Substanzen. Die Reaktion
von Ninhydrin mit NH2-Gruppen zu Diketohydrindylidendiketohydrin-damin
(DYDA) wurde als Basis für die photometrische Bestimmung benutzt, da das
Produkt eine blau-violette Färbung erzeugt. Durch die Beimischung von Hydrindantin10 oder Zinnchlorid11 zur Reagenz, um oxidative Nebenreaktionen zu
verhindern, war die Farbausbeute reproduzierbar. Obwohl die Farbausbeute
9
Abbildungen aus: http://www.bioc.uzh.ch/blexon/n:ninhydrin, aufgerufen am 15.07.2010 um
14.32 Uhr
10
reduzierte Form des Ninhydrins
11
Zinnchlorid reduziert einen Teil des Ninhydrins, sodass die Zubereitung von Hydrindantin in
kristalliner Form nicht nötig ist (Moore & Stein, 1948).
38
2 Material und Methoden
39
einer bestimmten Aminosäuren konstant ist, gibt es Unterschiede zwischen den
einzelnen Aminosäuren. Daher müssen verschiedene Aminosäuren vor dem
Gebrauch der Methode getrennt werden. Wahrscheinlich ist der zugrunde liegende Mechanismus komplexer als bisher angenommen, da die zu
beobachtenden Unterschiede in der Farbintensität in Abhängigkeit von der
Aminosäure durch das bisherige Modell nur unzureichend erklärt werden können.
Die Entwicklung einer Farbreaktion konnte bei einer Vielzahl von Substanzen,
die NH2-Gruppen beinhalten, beobachtet werden, z.B. bei α-Aminosäuren, jedoch nicht bei β-Aminosäuren, Peptiden, primären Aminen und Ammoniak. Die
Reaktion wurde bei einem pH von 5 und einer Temperatur von 100° C durchgeführt. Das Absorptionsmaximum des blauen Produktes lag bei 570 nm
(Moore & Stein, 1948).
Moore und Stein bemerkten außerdem, dass die Farben, die während der Reaktion gebildet wurden, innerhalb von ein paar Stunden bei Raumtemperatur
allmählich verblassten (Moore & Stein, 1948). Verschiedene Arbeitsgruppen
versuchten über die Jahre, dieses Problem zu lösen (Troll & Cannan, 1953).
Häufig war dann jedoch die Lösung mit dem reduzierten Ninhydrin an der Luft
instabil und musste entweder unter Stickstoffatmosphäre zubereitet und gelagert werden oder alle paar Tage neu hergestellt werden muss (Moore & Stein,
1954), (Yemm & Cocking, 1955).
Rosen entwickelte die Methode von Yemm und Cocking weiter. Er machte die
Zubereitung von instabiler Ninhydrin-Lösung überflüssig und fügte direkt nach
dem Erhitzen der Ninhydrin-Proben-Lösung eine Isopropyl-Wasser Lösung (1:1)
hinzu. Dadurch sind die Farben stabiler und verblassen nur ca. 1-2 % innerhalb
von Stunden (Rosen, 1957).
Yemm und Cocking stellten außerdem fest, dass fast alle Aminosäuren Farbäquivalente ergaben, die zu 100 +/- 1 % dem von reinem DYDA entsprachen.
Ausnahmen waren Tyrosin und Phenylalanin (89 %), Tryptophan (83 %) und
Lysin (108 %). Prolin bildet ein gelbes Endprodukt (Yemm & Cocking, 1955).
39
2 Material und Methoden
40
2.2.2 Aminoacylase-Ninhydrin-Assay
Dem Versuchsablauf dieser Arbeit liegt eine Anleitung von Sigma-Aldrich, Inc.,
San Louis, Missouri vom 11.11.1995 (siehe Anhang) zugrunde, die auf dem
Versuchsablauf von Mitz und Schlueter aufbaut (Mitz & Schlueter, 1958).
2.2.3 Versuchsablauf
Die Acy1 wurde direkt nach dem Öffnen aliquotiert und luft- unf feuchtigkeitsdicht bei -20°C gelagert. Ein Aliquot der Acy1 wurde zu Versuchsbeginn bei
Raumtemperatur von -20°C aufgetaut. Nach dem Erreichen der Raumtemperatur wurde die Acy1 zunächst je nach Einwaage in der angepassten
Flüssigkeitsmenge Tris HCl-Homogenisierungs-Puffer gelöst. Bei einem 10,0mg-Aliquot entsprach dies 100 µl Tris HCl-Homogenisierungs-Puffer. Bei einer
neuen Charge mit einer niedrigeren Enzymaktivität (statt 3450 units/mg
Feststoff 3442 units/mg Feststoff) wurde die Einwaage mit dem Faktor
0,9976811 multipliziert, um die Standard-Enzymaktivität in der Lösung konstant
zu halten. Die Lösung wurde dann weiter mit Homogenisierungs-Puffer im
Verhältnis 1:100 verdünnt. Die Standard-Enzymaktivität des Enzyms beträgt
nun 34,5*105 Units/Liter (U/l). Erneut wurde die Acylase-Lösung 1:75 mit Tris
HCl-Homogenisierungs-Puffer verdünnt, die Aktivität lag nun bei 4,6*104 (ACY
1:75) U/l. Die meisten Messungen wurden mit diesem Ansatz durchgeführt. Bei
einigen Versuchen, bei denen mögliche neue Substrate schlecht hydrolysiert
wurden, wurde zusätzlich eine Verdünnung mit einer höheren Acy1-Aktivität
17,25*104 U/l (ACY 1:20) eingesetzt. Dies ist bei den Ergebnissen der
jeweiligen Versuche vermerkt.
Die
möglichen
Substrate
wurden
in
Hepes-Puffer
gelöst
und
Verdünnungsreihen hergestellt. Einige mögliche Substrate waren nicht in
Hepes-Puffer löslich und mussten darum in Methanol oder Ethanol gelöst werden. Die Substanzen wurden entweder in einer 100 %-Lösung aus Methanol
oder Ethanol gelöst, oder Methanol bzw. Ethanol wurden vor dem Lösen des
Substrates zu gleichen Teilen mit Hepes-Puffer verdünnt, sodass eine 50Prozentige Lösung entstand. Die alkoholische Lösung hatte bei den
40
2 Material und Methoden
41
untersuchten Konzentrationen im Ansatz keinen Einfluss auf die Enzymaktivität
im weiteren Versuchsablauf.
Im
nächsten
Schritt
werden
30
µl
des
möglichen
Substrates
in
unterschiedlichen Konzentrationen zu 270 µl Acylase-Lösung hinzugefügt und
in einem verschließbaren Reaktionsgefäß vermischt.
Die alkoholischen Lösungen lagen dementsprechend im Ansatz mit dem Enzym
in einer Endkonzentration von 10 bzw. 5 % vor.
Beispiel N-Acetyl-L-Methionin (NAM):
30 µl 200 mM NAM
+ 270 µl Acy1
= 20
mM NAM im Reaktionsansatz
30 µl
10 mM NAM
+ 270 µl Acy1
= 1
mM NAM im Reaktionsansatz
30 µl
2,5 mM NAM
+ 270 µl Acy1
= 0,25 mM NAM im Reaktionsansatz
30 µl
0,5 mM NAM
+ 270 µl Acy1
= 0,05 mM NAM im Reaktionsansatz
Der Ansatz wird 30 min bei 37°C inkubiert und dann bei -20°C eingefroren, um
die enzymatische Reaktion zu stoppen.
Im weiteren Verlauf wird der Ansatz erneut auf Raumtemperatur gebracht, gut
vermischt und gegebenenfalls mit Hepes-Puffer verdünnt, da bei einer zu hohen
Konzentrationen der Aminosäure der Extinktionskoeffizient in der Ninhydrinreaktion zu hoch ist und die Messung nicht verwendet werden kann. Die
Konzentration im inkubierten Ansatz sollte, wenn die N-Acyl-Aminosäure zu 100
% hydrolysiert wird, nicht höher als 1 mM sein.
Beispiel NAM (wird zu L-Methionin hydrolysiert):
20 mM NAM 1:40 mit Hepes-Puffer verdünnt = 0,05 mM NAM im Messansatz
Die Verdünnung muss später bei der Berechnung berücksichtigt werden.
Nun werden 20 µl des Reaktionsansatzes in eine 96-Well-Mikrotiterplatte pipettiert. Dann werden 2 µl 1,6 % Zinn(II)-chlorid-Lösung und 40 µl 2 % NinhydrinLösung hinzugefügt und vermischt und die Mikrotiterplatte 20 min bei 80°C inkubiert.
41
2 Material und Methoden
42
Nach dem Abkühlen der Platte werden die Ansätze mit 200 µl 50 % 1-Propanol
in Aqua dest. verdünnt und bei 570 nm im Synergy HT gemessen. Anhand
einer dem entstandenen Produkt entsprechenden Eichkurve erfolgt dann die
Berechnung.
Beispiel:
Tabelle 1: Verdünnungsreihe Methionin
L-MethioninEndkonzentration [Substrat]
Um
L-Methionin-Extinktion unter
Extinktion
Berücksichtigung des
in mmol/l
Verdünnung
Rohdaten
Verdünnungsfaktors
20
1:40
0,47
18,74
10
1:10
0,86
8,65
5
1:10
0,45
4,47
1
0,86
0,86
0,5
0,47
0,47
0,25
0,24
0,24
0,1
0,12
0,12
0,05
0,09
0,09
0
0,0435
0,0435
die
Eichgerade
zu
erstellen,
wird
zunächst
eine
Methionin-
Verdünnungsreihe in den Konzentrationen 0 bis 20 mM angelegt. Von den
einzelnen Verdünnungen werden je 20 µl in eine 96-well-Platte gegeben und
weiter analog wie bei der Messung der Reaktionsansätze verfahren. Auch bei
der Messung der Methionin-Verdünnungsreihe darf die Konzentration der Aminosäure im Ninhydrin-Assay nicht höher als 1 mM sein, da sonst die
Extinktionswerte bei 570 nm nicht gemessen werden können. Die L-Methionin
Rohdaten entsprechen den direkten Messwerten aus dem Photometer (Synergy
HT zum Lesen von Mikrotiterplatte) und werden bei entsprechender Verdünnung mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert.
42
2 Material und Methoden
43
Als nächstes folgen die graphische Darstellung der Ergebnisse und die
Berechnung der Steigung.
Abbildung 9: Graphische Darstellung der Methionin-Eichgerade
Anhand der Geradengleichung
y = mx + c und für x gelöst
x = (y-c) / m
x = errechnete Konzentration des Reaktionsproduktes
y = photometrisch gemessener Extinktionskoeffizient
c = Achsenabschnitt (in diesem Beispiel – 0,0498)
m = Steigung (in diesem Beispiel 0,9245)
kann nun die Konzentration des im Reaktionsansatz durch die Acy1 hydrolysierten Produktes berechnet werden.
Tabelle 2: Ergebnisse der NAM-Ansatz-Werte bei 570 nm
Acylase +
Acylase +
N-Acetyl-L-
Endkonzentration
N-Acetyl-L-
Methionin
Acetyl-L-Methionin
[Acylase +
[Substrat]
Methionin
abzüglich
Berücksichtigung des
Hepes-
Acylase +
N-
Leerwert
in mmol/l
Verdünnung
Rohdaten
Leerwert
Verdünnungsfaktors
Puffer]
20
20
0,66
0,61
12,20
0,05
1
unverdünnt
0,83
0,78
0,78
0,25
unverdünnt
0,25
0,19
0,19
0,5
unverdünnt
0,09
0,04
0,04
43
2 Material und Methoden
44
In diesem Beispiel wurde NAM in den Konzentrationen 0,05 mM, 0,25 mM, 1
mM und 20 mM zur Acy1-Lösung gegeben. Der Ansatz mit 20 mM wurde nach
der Inkubation mit Acy1 1:20 mit Hepes-Puffer verdünnt. Die Rohdaten
entsprechen den im Photometer (Synergy HT) gemessenen Werten. Davon
wird zunächst der Leerwert (Acylase + Hepes-Puffer) subtrahiert und dann
werden die verdünnten Lösungen mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert.
Diese Werte können nun in die oben genannte Formel eingesetzt werden.
Tabelle 3: Berechnung der entstandenen L-Methionin-Konzentration
Endkonzentration [Substrat] in
Acylase + N-Acetyl-L-Methionin
L-Methionin-Konzentration
mmol/l
abzgl. Leerwert
berechnet
20
12,20
13,25
1
0,78
0,90
0,25
0,19
0,26
0,05
0,04
0,09
x = (y-c) / m
Für NAM in der Konzentration 1 mM folgt also:
x = (0,78 – (– 0,0498)) /0,9245)
x = 0,9
1 mM NAM wurde demnach zu 0,9 mM L-Methionin hydrolysiert, was einem
Ertrag von 90 % entspricht.
Dieser Versuchsablauf war bei allen Aminoacylase-Ninhydrin-Assays gleich.
Der Ablauf wurde lediglich für die Acyl-Homoserin-Lakton-Versuchsreihe und
die pH-Wert-Messung modifiziert. Dabei gab es für die Acyl-Homoserine drei
verschiedene Versuchsreihen:
1. Inkubation bei 37°C für 30 min, pH 8
2. Inkubation bei 23°C für 30 min, pH 10
3. Inkubation bei 75°C für 30 min, pH 9
Bei der Überprüfung, ob der pH-Wert die Enzymreaktion beeinflusst, wurde NAcetyl-L-Methionin bis zu einer Endkonzentration von 100 mmol für den Enzym44
2 Material und Methoden
45
Assay verwendet. In der Kontrolle wurde das NAM wie immer in Hepes-Puffer
gelöst. Für die Vergleichsreihe wurde der pH-Wert bei gleichbleibender NAMEndkonzentration durch Zugabe von Natronlauge zum Hepes-Puffer konstant
bei pH 8 gehalten.
2.2.3.1
Weitere Berechnungen
Bei den Ergebnissen wurde außer dem Mittelwert aus mehreren Versuchen
jeweils die Standardabweichung und der Variationskoeffizient berechnet.
Für die Standardabweichung wurde folgende Formel benutzt:
x ist dabei der Mittelwert und n ist die Stichprobengröße.
Für den Variationskoeffizienten gilt:
2.2.4 Palmitoylglycin-Synthese
Für weiterführende Versuche wurde Palmitoylglycin benötigt. Da dieses nicht
kommerziell erhältlich ist, wurde es durch Eigensynthese hergestellt.
Lapidot et al. (Lapidot et al., 1967) beschrieben 1967 erstmals die Synthese von
N-Acyl-Aminosäuren durch die Reaktion von N-Hydroxysuccinimidester einer
Fettsäure und dem Natriumsalz von freien Aminosäuren in wässriger Lösung.
Für die Synthese von N-Lauroyl-L-Serin wurde eine Ausbeute von 78 % mit
einem Schmelzpunkt von 87°C angegeben.
In Anlehnung an den Versuchsablauf von Lapidot er al. wurde für die Synthese
von Palmitoylglycin der Fettsäureesther äquivalent ausgetauscht und ein Doppelansatz
gefahren.
Es
wurden
2
mmol
(707
mg)
Palmitinsäure-N-
Hydroxysuccinimidester in 10 ml Tetrahydrofuran zu einer Lösung von 2 mmol
45
2 Material und Methoden
46
(150 mg) Glycin und 2 mmol (168 mg) Natriumhydrogencarbonat in 10 ml Aqua
destillata (Aqua dest.) gegeben.
Anschließend wurde der Ansatz 16 Stunden in einem großen verschlossenen
Rundkolben bei Raumtemperatur auf mittlerer Stufe gerührt, der pH-Wert mit 1
M Salzsäure auf pH 2 eingestellt und das Tetrahydrofuran mittels Rotationsverdampfer abgezogen.
Dann wurden 50 ml Aqua dest. zum Rückstand gegeben und unter Vakuum
filtriert. Der Rückstand wurde aus dem Filter entfernt und in 10 ml Ethanol gelöst. Es folgte die Umkristallisation. Da die entstandene Substanz nicht trocken
war wurde das Produkt sieben Tage im Exsikkator getrocknet und anschließend
eingewogen.
Es wurden 334,92 mg Palmitoylglycin synthetisiert, das entspricht einer Ausbeute von 53,48 %. Der Schmelzpunkt lag bei 92-95°C.
Das Produkt wurde im Gaschromotographen mit gekoppeltem Massenspektrometer analysiert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 10 und Abbildung 11
dargestellt. Dabei dient der Gaschromatograph zur Auftrennung des zu untersuchenden Stoffgemisches und das Massenspektrometer zur Identifizierung
und gegebenenfalls auch Quantifizierung der einzelnen Komponenten. Jede
Komponente des Stoffgemisches hat durch ihre physiko-chemischen Eigenschaften eine charakteristische Mobilität in der Trennsäule. Nach Durchlaufen
der Chromatographiesäule werden die getrennten Stoffe ionisiert. Aus dem
Massenzahlen des Molpeaks, charakteristischer Bruchstücke und eventuell
vorhandenen Isotopenmustern kann auf die Struktur- und Summenformel der
Substanz geschlossen werden.
Im Gaschromatogramm (Abbildung 11) zeigte sich bei einer Einzelmessung der
Reinsubstanz ein prozentualer Anteil von 92,34 % Palmitoylglycin und 1,6 %
Palmitinsäure.
Im
Massenspektrum
(Abbildung
10)
gibt
es
einen
Molekülmassenpeak bei 327, was der errechneten Molekülmasse des Monomethylesters von Palmitoylglycin (327,5) in etwa entspricht.
46
2 Material und Methoden
47
Abbildung 10: Massenspektrum von Palmitoylglycin
Abbildung 11: Gaschromatogramm von Palmitoylglycin
47
3 Ergebnisse
48
3
Ergebnisse
3.1
Bestimmung der für den Assay idealen Aminoacylase 1
Aktivität
Gemäß Herstellerangaben hatte die verwendete Acylase 1 eine Aktivität von
3450 Units/mg Feststoff (Lot-Nummer 074K0731) bzw. 3442 Units/mg Feststoff
(Lot-Nummer 077K1147). Ein Unit hydrolysiert 1 µmol N-Acetyl-L-Methionin pro
Stunde bei pH 8 und 37°C (Sigma-Versuchsanleitung nach (Mitz & Schlueter,
1958). Es wurden jeweils 10 mg Acylase 1 in 100 µl Tris HClHomogenisierungs-Puffer gelöst (bei abweichender Einwaage oder Aktivität
entsprechende Anpassung des Volumens) und 1:100 mit demselben Puffer
weiter dilutiert. Die Standard-Enzymaktivität in dieser Stammlösung beträgt
345*104 U/l. Für den Assay wurde in der Regel eine Enzymkonzentration von
4,6*104 U/l verwendet, bei einigen Versuchen auch 17,25*104 U/l. Dies ist bei
den Ergebnissen vermerkt.
Diese Stammlösung wurde mit Tris HCl-Homogenisierungs-Puffer bis zu 75fach
weiterverdünnt (siehe Tabelle 4).
Tabelle 4: Verdünnungsreihe Acy1
Verdünnung der Acy1
Standard-Enzymaktivität in
der Lösung
4
Stammlösung Acy1
345*10 U/l
1:2
172,5*10 U/l
1:10
34,5*10 U/l
1:20
17,25*10 U/l
1:75
4,6*10 U/l
4
4
4
4
mg Enzym/ml Lösung
1 mg/ml
0,5 mg/ml
0,1 mg/ml
0,05 mg/ml
0,013 mg/ml
In den folgenden Versuchen fungierte N-Acetyl-L-Methionin als Positivkontrolle
sowie N-Acetyl-D-Methionin und N-Acetyl-L-Aspartat als Negativkontrolle. Ziel
der Versuchsreihe war, eine Acylase-1-Konzentration zu finden, bei der die
48
3 Ergebnisse
49
Positivkontrolle komplett hydrolysiert wird und die Negativkontrollen gespalten
werden.
Abbildung 12: Hydrolyserate in Abhängigkeit von der Standard-Enzymaktivität
bei 20 mmol/l Substrat
Abbildung 13: Hydrolyserate in Abhängigkeit von der Standard-Enzymaktivität
bei 1 mmol/l Substrat
Bei einer Standard-Enzymaktivtät von 4,6*104 U/l und 17,25*104 U/l wird NAM
optimal umgesetzt, bei der Negativkontrolle findet kein Substratumsatz statt. Ist
49
3 Ergebnisse
50
die Standard-Enzymaktivität höher, so wird auch ein Teil der Negativkontrolle
hydrolysiert. Die Ergbnisse sind in Abbildung 12 und Abbildung 13 dargestellt.
Das Enzym lag immer im Überschuss vor.
Für die folgenden Versuche wurde ein Ansatz mit einer StandardEnzymaktivität von 4,6*104 units/l gewählt. Bei dieser Aktivität wird die
Positivkontrolle noch maximal hydrolysiert und Negativkontrolle nur minimal
umgesetzt. Der Mittelwert aller Messungen (n=33) mit NAM 1 mmol bei dieser
Standard-Enzymaktivität ergibt einen Umsatz von 0,87 mmol/l in 30 min,
umgerechnet auf U/l sind das 29,16 µmol/min.
3.2
Ninhydrin-Assay
Um die Konzentration der in der Acylase-Reaktion enstandenen deacylierten
Aminosäuren zu bestimmen, wurde die von Moore and Stein 1948 entwickelte
Ninhydrin-Methode benutzt. Obwohl die Ergebnisse für einzelne Substanzen
reproduzierbar waren, gab es Schwankungen in der Farbausbeute pro mol
zwischen den verschiedenen Substanzen. Darum war es für die weiteren
Versuche wichtig, für die unterschiedlichen möglichen Substrate spezifische
Eichkurven zu ermitteln, mit denen die Konzentration der entstandenen Aminosäure berechnet werden konnte.
Für die folgende Tabelle 5 wurde wie unter 2.2.3 beschrieben vorgegangen. Die
Messung erfolgte bei 570 nm12 im Synergy KC4. Je höher der millimolare
Extiktionskoeffizient bei 570 nm, desto dunkler ist das Extinktionsprodukt., z.B.
bei Glycin, Methionin und Aspartat. Dies sagt nichts über die Reaktion der
Substanz mit dem Ninhydrin aus, lediglich die Absorption ist unterschiedlich.
Eine sehr niedrige bzw. keine Absorption zeigten beispielsweise 4-Aminophenol
und 5-Methoxytryptamin.
12
Für Prolin liegt das Absorptionsmaximum bei 440 nm und wurde darum in diesem Bereich
gemessen
50
3 Ergebnisse
51
Tabelle 5: Extinktionskoeffizienten im Ninhydrin-Assay
Millimolarer
Mit Ninhydrin umgesetzte Substanz (1 mmol)
Extinktionskoeffizient bei 570
nm
(1S,2S)-(+)-2-Amino-1-(4-Nitro-Phenyl)-1,3-Propandiol
0,56
4-Aminophenol
0,10
5-Methoxytryptamin
0,15
D-Glucosamin Hydrochorid
0,63
Glycin
0,91
L-Alanin
0,53
L-Arginin
0,65
L-Asparaginsäure
0,69
L-Citrullin
0,66
L-Cystein
0,10
L-Glutaminsäure
0,81
L-Glutamin
0,80
L-Histidin
0,56
L-Homocystein Thiolakton Hydrochlorid
0,19
L-Homoserin
0,66
L-Homoserin-Lakton Hydrochlorid
0,66
L-Leucin
0,75
L-Methionin
0,86
L-Phenylalanin
0,71
L-Prolin
12
0,12
L-Serin
0,69
L-Threonin
0,57
L-Tryptophan
0,89
L-Valin
0,46
Serotonin Hydrochlorid
0,10
Taurin
0,31
3.3
Beeinflussung der Enzymreaktion durch Lösen der
Substrate in alkoholischen Lösungen
Viele der getesteten Substrate waren nicht in Hepes-Puffer löslich und mussten
in anderen Lösungsmitteln wie Methanol oder Ethanol gelöst werden. Darum
musste in Vorversuchen getestet werden, ob eine Alkoholkonzentration
51
3 Ergebnisse
52
zwischen 50 % und 100 % in der Substratlösung, das entspricht einer
Endkonzentration von fünf bis zehn Prozent im Ansatz mit dem Enzym, die
Acylase inhibiert. Als Testsubstrate wurden N-Acetyl-L-Methionin (NAM) und NAcetyl-L-Asparaginsäure (NAA) verwendet. Von NAA ist bekannt, dass es nicht
durch die Acy1 hydrolysiert wird, sondern durch die Aspartoacylase (Acy2)
(Birnbaum et al., 1952b).
Bei einer NAM-Konzentration von 20 mmol/l, einer Endkonzentration von 10 %
Ethanol im Enzymansatz und einer Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l
zeigte sich ein stark verminderter Substratumsatz (Abbildung 14). Bei einer
NAM-Konzentration von 1 mmol/l bzw. einer höheren Standard-Enymaktivität
von 17,25*104 U/l war der Substratumsatz nicht durch den Zusatz von Ethanol
beeinträchtigt.
Abbildung 14: Umsatz von NAM und NAA in Ethanol-Lösung mit einer
Endkonzentration von 10 % im Enzymansatz
Wenn Methanol als Lösungsmittel genutzt wurde, zeigte sich ein ähnliches Bild.
Die Hydrolyse von 1 mmol NAM in einer Methanol-Lösung zeigte eine leichte
Abnahme des Substratumsatzes unabhängig von der Standard-Enzymaktivität
mit steigendem Methanol-Anteil im Enzymansat (Abbildung 15). Der Umsatz
von 20 mmol NAM ist abhängig von der Standard-Enzymaktivität und dem Methanolgehalt im Enzymansatz. Bei einer Standard-Enzymaktivität von 17,25*104
U/l ist der Substratumsatz bei einer Endkonzentration von 5 % Methanol im
52
3 Ergebnisse
53
Enzymansatz unverändert im Vergleich zu einer Hepes-Lösung und nimmt mit
steigendem Methanolgehalt nur geringfügig ab.
Abbildung 15: Umsatz von 1 mmol/l NAM und NAA in Methanol-Lösung mit
einer Endkonzentration von 5 % bis 10 % Methanol im Enzymansatz
Bei einer niedrigeren Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l ist der Umsatz
von NAM bei einer Ethanol-Endkonzentration von 5 % im Enzymansatz noch
stabil und fällt dann bei steigender Methanol-Konzentration um mehr als die
Hälfte ab (Abbildung 16).
Abbildung 16 Umsatz von 20 mmol/l NAM und NAA in Methanol-Lösung mit
einer Endkonzentration von 5 % bis 10 % im Enzymansatz
53
3 Ergebnisse
54
Wenn ein bisher unbekanntes mögliches Substrat nur in Methanol löslich war,
wurde stets eine Kontrolle NAM in gleicher Methanol-Konzentration mitgeführt,
um die Hemmung des Enzyms durch den Methanol-Gehalt im Enzym-Assay
beurteilen zu können. Bei der Auswertung war dies jedoch nicht relevant, da
keine Substanz in einer Endkonzentration von 20 mmol/l in mehr als 50 %
Methanol gelöst wurde, entsprechend einer Endkonzentration von 5 %
Methanol im Enzymansatz.
3.4
Reproduzierbarkeit des Assays
Anhand der bei jedem Versuch als Kontrolle mitgeführten Substanz N-Acetyl-LMethionin (Positivkontrolle) lässt sich eine Aussage zur Interday-Reproduzierbarkeit des Assay machen. Bei n=35 und einer Standard-Enzymaktivität von
4,6*104 U/l der pkAcy1 liegt die Standardabweichung bei 20 mmol/l NAM bei
1,6 mmol/l und der Variationskoeffizient bei 9,59 %. Bei gleicher StandardEnzymaktivität und einer NAM-Konzentration von 1 mmol/l ergibt sich sich eine
Standardabweichung von 0,09 mmol/l und ein Variationskoeffizient von 10,53
%. Zur Intraday-Varianz kann keine Aussage getroffen werden, weil pro Tag jeweils nur eine Versuchsreihe durchgeführt wurde.
3.5
Enantioselektivität der pAcy1
Es ist bekannt, dass viele Aminoacylasen nur bestimmte Enantionmere hydrolysieren. Die pkAcy1 spaltet vor allem N-Acyl-L-Aminosäuren. In dieser
Versuchsreihe wurden die unterschiedlichen Enantiomere verschiedener
Aminosäuren untersucht. Bei N-Acetyl-Aminosäuren, die gute Substrate der
pkAcy1 sind, wie beispielsweise N-Acetyl-Methionin und N-Acetyl-Alanin, zeigte
sich, dass die Hydrolyserate der DL-Racemate wie erwartet bei ca. 50 % der LEnantiomere lag.
54
3 Ergebnisse
55
Abbildung 17: Enantiomerabhängige Hydrolyse verschiedener N-AcylAminosäuren durch die pkAcy1, Standard-Enzymkonzentration 4,6*104 U/l
3.6
Methionin
In dieser Messreihe wurden Methionin-Derivate mit unterschiedlichen Substituenten verglichen. Die Hydrolyse durch die pAcy1 ist enantioselektiv, N-AcetylL-Methionin wird sehr gut umgesetzt, N-Acetyl-D-Methionin hingegen kaum. Es
zeigte sich, dass bei kurzer Kettenlänge die Anzahl der Kohlenstoffatome keine
Rolle spielt. Bei zunehmender Länge der substituierten Kohlenstoffkette nimmt
der Substratumsatz wieder ab. Furyl-Acryloyl-Methionin wird trotz eines fünfgliedrigen aromatischen Heterocyklus gut hydrolysiert. N-TrifluoroacetylMethionin wird nicht durch die pkAcy1 hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 18 und ausführlich in 6.2 dargestellt. 6.2 zeigt, dass nicht nur der
Acylrest von Methionin, sondern auch die Endkonzentration und das
Lösungsmittel die Hydrolyse beeinflusst. Eine Endkonzentration von 5 %
Methanol beeinträchtigt die Reaktion nicht, eine Endkonzentration von 10 % im
Enzymansatz hingegen schon. Aufgrund der besseren Vergleichbarkeit der
Ergebnisse sind nur die Werte für die Endkonzentration von 1 mmol/l AcylMethionin dargestellt. Bei der Endkonzentration von 1 mmol spielt die StandardEnzymaktivität keine Rolle.
55
3 Ergebnisse
56
Abbildung 18: Hydrolyse verschiedener Acyl-Methionin-Lösungen bei einer
Standard-Acylaseaktivität von 4,6*104 U/l
Eine ausführliche Tabelle mit allen Werten findet sich unter 6.2 im Anhang.
3.7
Verschiedene Acylglycine im Vergleich
3.7.1 Kettenlänge
Für diesen Versuch wurden Acylglycine mit einer Länge von einem bis 16 Kohlenstoffatomen verglichen. Die möglichen Substrate lagen alle in der
Konzentration von 1mmol/l vor. Es zeigte sich, dass die Hydrolyse durch die
pAcy1 bei einer Kettenlänge von zwei bis fünf Kohlenstoffatomen (Valerylglycin)
kontinuierlich zunahm. Bei steigender Kettenlänge wurde der Umsatz wieder
geringer (Abbildung 19). Bei Palmitoylglycin kann nicht sicher von einer
Konzentration von 1mmol/l ausgegangen werden, weil diese Substanz selbst
synthetisiert wurde und keine vollständige Charakterisierung erfolgt ist. Die
tatsächliche Konzentration ist möglicherweise niedriger. Das Ergebnis im Assay
entspricht aber der Erwartung auf Grundlage der mit anderen Substraten
erhaltenen Ergebnisse. In der vorhandenen Literatur gibt es keine Angaben
zum Schmelzpunkt dieser Substanz. Der Schmelzpunkt von 92-95°C erscheint
56
3 Ergebnisse
57
jedoch im Vergleich zu Lauroylglycin mit einem Schmelzpunkt von 117°C
(Lapidot et al., 1967) durchaus plausibel.
Abbildung 19: Hydrolyse von 1 mmol/l Acylglycinen unterschiedlicher
Kettenlänge
Die
von
Rimmermann
et
al.
veröffentlichten
Massenspektrogramme
(Rimmerman et al., 2008) zeigen ähnliche Molekülmassenpeaks. Bei
Rimmermann et al. zeigte sich ein Molekülmassenpeak bei 314, was der
Molekülmasse von Palmitoylglycin entspricht, bei uns lag Palmitoylglycin
wahrscheinlich als Monomethylester vor mit einer Masse von 327. Die
Molekülmassenpeaks bei 296, 268 und 238 konnten reproduziert werden. Seit
Juli 2010 ist Palmitoylglycin kommerziell über Cayman Chemical Company, Ann
Arbor, Michigan, USA erhältlich. Zu dem Zeitpunkt war der experimentelle Teil
der Arbeit bereits beendet.
57
3 Ergebnisse
58
Name
Anzahl C-Atome im
Acylrest
Formylglycin (n 1 mmol/l = 2; n 20 mmol/l = 2)
1
Acetylglycin (n 1 mmol/l = 5, n 20 mmol/l = 2)
2
Propionylglycin (n 1 mmol/l = 3, n 20 mmol/l = 3)
3
Butyrylglycin (n 1 mmol/l = 3, n 20 mmol/l = 2)
4
Valerylglycin (n 1 mmol/l = 5, n 20 mmol/l = 3)
5
Hexanoylglycin (n 1 mmol/l = 5, n 20 mmol/l = 4)
6
Heptanoylglycin (n 1 mmol/l = 5, n 20 mmol/l = 2)
7
Myristoylglycin (n 1 mmol/l = 2; n 20 mmol/l = 2)
14
Palmitoylglycin (n 1 mmol/l = 2; n 20 mmol/l = 2)
16
Die Substanzen mit den roten Balken wurden in Hepes-Puffer gelöst, die mit
den blauen Balken in 100 % Methanol (entspricht einer Endkonzentration von
10 % Methanol im Enzymansatz)
3.7.2 Acylglycine unterschiedlicher Struktur und Konzentration
Im Gesamtvergleich aller N-substituierten Glycine wurde festgestellt, dass Acylglycine mit unverzweigten Substituenten hydrolysiert werden. Wenn jedoch am
Ende der Kette beispielsweise eine Carboxylgruppe steht (Suberylglycin) findet
keine Hydrolyse durch die pAcy1 statt. Die Kettenlänge scheint ein weiterer
limitierender Faktor zu sein, da Arachidonoylglycin mit einer Kettenlänge von 20
Kohlenstoffatomen
Arachidonoylglycin
nicht
mehrfach
mehr
hydrolysiert
ungesättigt.
Eine
wird.
Außerdem
ist
Kohlenstoffdoppelbindung
beeinflusst die Hydrolyse nicht. Sobald der Substituent verzweigt ist, findet kein
Verdau durch die pAcy1 statt.
Wenn der Substituent einen aromatischen Ring beinhaltet, kann die Substanz
meistens nicht hydrolysiert werden. Substrate mit furanhaltigen Substituenten
können hydrolysiert werden (Tabelle 6).
Bei einigen Substanzen wurde sowohl im Ansatz mit Enzym als auch im Ansatz
ohne Enzym keine Absorption beobachtet. Daher konnte davon ausgegangen
werden, dass keine Hydrolyse stattfindet.
58
3 Ergebnisse
59
Tabelle 6: Acylglycine verschiedener Struktur und Konzentration
Acylaseaktivität 4,6*104 U/l
Mittelmmol
/l
Substrat
Lösungsmittel13
wert in
mmol/l
(30
min)
Standardabweichung
Variationskoeffizient in
%
unverzweigt+gesättigt
20
Formylglycin (n=2)
Hepes
1,01
0,19
19,14
1
Formylglycin (n=2)
Hepes
20
Acetylglycin (n=2)
Hepes
2,87
0,01
0,27
1
Acetylglycin (n=5)
Hepes
0,39
0,07
16,56
20
Propionylglycin (n=3)
Hepes
3,19
0,34
10,72
1
Propionylglycin (n=3)
Hepes
0,68
0,06
8,91
20
Butyrylglycin (n=2)
Hepes
7,48
0,79
10,56
1
Butyrylglycin (n=3)
Hepes
0,86
0,03
3,14
20
Valerylglycin (n=3)
Hepes
3,34
0,71
21,22
1
Valerylglycin (n=5)
Hepes
0,99
0,05
4,66
20
Hexanoylglycin (n=4)
Hepes
0,94
0,18
19,08
1
Hexanoylglycin (n=5)
Hepes
0,52
0,09
17,63
10
Heptanoylglycin (n=2)
Hepes
2,57
0,15
5,84
1
Heptanoylglycin (n=5)
Hepes
0,62
0,05
7,95
5
Myristoylglycin (n=2)
10% Methanol
0,22
0,01
4,91
1
Myristoylglycin (n=2)
10% Methanol
0,30
0,06
18,42
2,5
Palmitoylglycin (n=2)
10% Methanol
0,28
0,03
9,71
1
Palmitoylglycin (n=2)
10% Methanol
0,13
0,01
5,97
Absorption negativ
verzweigt+gesättigt
13
20
Isobutyrylglycin (n=3)
Hepes
0,15
0,03
20,23
1
Isobutyrylglycin (n=3)
Hepes
0,06
0,02
38,55
20
Isovalerylglycin (n=3)
Hepes
0,15
0,02
14,50
5
Isovalerylglycin (n=2)
Hepes
0,06
0,02
30,24
1
Isovalerylglycin (n=3)
Hepes
0,06
0,03
40,03
Bei den in Methanol und Ethanol gelösten Substanzen handelt es sich bei den
Prozentangaben immer um die Endkonzentration des Lösungsmittels im Enzymansatz.
59
3 Ergebnisse
60
20
2-Methylbutyrylglycin (n=3)
Hepes
0,10
0,03
29,37
5
2-Methylbutyrylglycin (n=2)
Hepes
0,06
0,01
21,04
1
2-Methylbutyrylglycin (n=3)
Hepes
0,07
0,03
40,62
10
2-Methylvalerylglycin (n=2)
Hepes
0,16
0,00
2,65
1
2-Methylvalerylglycin (n=3)
Hepes
Absorption negativ
verzweigt+ungesättigt
3-Methylcrotonylglycin14
Hepes
0,03
-
-
20
Tiglylglycin (n=2)
Hepes
0,17
0,01
6,89
1
Tiglylglycin (n=3)
Hepes
0,07
0,03
36,85
1
unverzweigt+ungesättigt
20
Acryloylglycin (n=3)
Hepes
1,44
0,06
3,85
1
Acryloylglycin (n=3)
Hepes
0,37
0,05
12,42
5
Arachidonoylglycin (n=2)
10% Ethanol
Absorption negativ
1
Arachidonoylglycin (n=2)
10% Ethanol
Absorption negativ
N-Acetyl-DL-Allylglycin
Hepes
5,24
0,84
16,11
Hepes
0,28
0,06
20,29
20
(n=3)
1
N-Acetyl-DL-Allylglycin
(n=5)
aromatisch
5
Benzoylglycin (n=2)
Hepes
0,08
0,03
34,81
1
Benzoylglycin (n=5)
Hepes
0,06
0,07
133,95
10
Phenylacetylglycin (n=2)
Hepes
Absorption negativ
1
Phenylacetylglycin (n=2)
Hepes
Absorption negativ
5
Phenylpropionylglycin (n=2)
Hepes
0,17
0,04
24,70
1
Phenylpropionylglycin (n=5)
Hepes
0,06
0,07
105,66
Furan
14
20
N-(2-Furoyl)-Glycin (n=3)
Hepes
0,37
0,09
23,53
1
N-(2-Furoyl)-Glycin (n=5)
Hepes
0,25
0,08
31,31
5
Furyl-Acryloylglycin (n=2)
5% Methanol
3,33
0,08
2,32
Die Substanz wurde nur in einem Versuch getestet, daher konnte keine Standardabweichung
und kein Variationskoeffizient berechnet werden. Der angegebene Wert ist kein Mittelwert.
60
3 Ergebnisse
61
1
Furyl-Acryloylglycin (n=2)
5% Methanol
0,74
0,09
11,88
1
trans-N-(2-
Hepes
0,56
0,04
8,07
Furfurylideneacetyl)glycin (n=3)
Retinoylglycin15 (n=2)
10% Methanol
Absorption negativ
5
Dimethyloxallylglycin (n=2)
10% Ethanol
Absorption negativ
1
Dimethyloxallylglycin (n=2)
10% Ethanol
Absorption negativ
20
Suberylglycin (n=2)
Hepes
Absorption negativ
1
Suberylglycin (n=5)
Hepes
Absorption negativ
3.8
N-Acyl-Homoserin-Lakton
3.8.1 Acylhomoserin-Lakton-Konzentration 1 mmol/l
In allen Proben war mit 1 mmol/l die Substrat-Konzentration im Enzym-Assay
konstant. Die Hydrolyse der möglichen Substrate durch die pAcy1 wurde zusätzlich zur üblichen Temperatur von 37°C auch bei 23°C und 76°C
durchgeführt.
Der Versuchsablauf mit einer Variation von Temperatur und pH beruht auf
einem Vesuch von Xu et al. (Xu et al., 2003). Xu et al. fanden einen optimalen
pH 10 bei 23 °C und einen optimalen pH 9 bei 76°C für die Hydrolyse von NButyryl-Homoserin-Lakton durch die pkAcy1. Aus diesem Grund wurden
zusätzliche Versuchreihen bei 23°C/pH 10 und 76°C/pH 9 zum Standard-Versuchsablauf bei 37°C/pH 8 durchgeführt (n=2).
Es zeigte sich, dass die Hydrolysen von N-Hexanoyl-DL-Homoserin-Lakton, NOctanoyl-DL-Homoserin-Lakton und N-Butyryl-DL-Homoserin-Lakton durch die
Temperatur- und pH-Variation gesteigert werden (Abbildung 20).
15
Retinoylglycin ist ein Synthese-Produkt von Dr. R. Rühl, Debrecen, Ungarn. Bei dieser
lichtempfindlichen Substanz ist die Konzentration und die Qualität nicht bekannt. Eine
weitgehende Zersetzung erscheint wahrscheinlich. Diese Ergebnisse sind daher mit
Vorbehalt zu verstehen.
61
3 Ergebnisse
62
Abbildung 20: Hydrolyse von Acylhomoserin-Lakton
1 mmol/l, n=2
Bei den übrigen Substanzen gab es keine Änderung der Hydrolyserate bei erhöhter oder erniedrigter Reaktionstemperatur. Die Acylasekonzentration in
diesem Versuch betrug 4,6*104 U/l. Auch in dem hier durchgeführten Versuch
zeigte sich, dass die maximale Hydrolyse bei einer Temperatur von 23°C und
einem pH von 10 stattfindet. Dies gilt vor allem für N-Hexanoyl-DL-HomoserinLakton, N-Octanoyl-DL-Homoserin-Lakton und N-Butyryl-DL-Homoserin-Lakton.
Bei pH 10 wird in der Kontrolle ohne Enzym kein Substrat umgesetzt, es findet
also bei diesem pH-Wert keine spontane Hydrolyse statt. In der Abbildung wird
die Positivkontrolle und Negativkontrolle für 37°C dargestellt, bei 23°C und
76°C gab es dabei keine Unterschiede. Der Versuch wurde bei gleichem Ablauf
insgesamt zweimal mit sehr ähnlichen Ergebnissen durchgeführt, in der
Abbildung werden jeweils die Mittelwerte gezeigt.
3.8.2 Acylhomoserin-Lakton-Konzentration 5 mmol/l
Der gleiche Versuch (n=2) wurde auch mit einer Probenkonzentration von 5
mmol/l und gleicher Standard-Acylaseaktivität durchgeführt. Dabei zeigte sich
bei 23°C/pH 10, 37°C/pH 8 und 76°C/pH 9 eine ähnliche Verteilung wie bei der
Konzentration von 1 mmol/l. In der Kontrolle ohne Enzym fand keine
Spontanhydrolyse
bei
einem
pH-Wert
von
10
statt.
Die
Standard62
3 Ergebnisse
63
Acylaseaktivität in diesem Versuch betrug 4,6*104 U/l (Abbildung 21). Auch hier
sind wieder die Mittelwerte aus zwei Versuchen mit der Positiv- und
Negativkontrolle bei 37°C dargestellt.
Abbildung 21: Hydrolyse von Acylhomoserin-Lakton
5 mmol/l, n=2
3.9
Vergleich der Hydrolyse von N-Acetyl-, N-Benzoyl-, NChloroacetyl- und N-Formyl-Aminosäuren
Alle Versuche wurden mit einer Standard-Acylaseaktivität von 4,6*104 U/l
durchgeführt.
3.9.1 Vergleich von N-Acetyl- und N-Benzoyl- substituierten Aminosäuren
Im Vergleich der Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-Benzoyl-Aminosäuren
zeigte sich, dass N-Benzoyl-substituierte Aminosäuren in der Regel nicht durch
die pAcy1 hydrolysiert werden. Eine Ausnahme stellte N-Benzoyl-Valin dar
(Abbildung 22) .In unseren Versuchen konnte keine Hydrolyse von N-BenzoylGlycin (Hippursäure) nachgewiesen werden. Möglicherweise hängt dies mit der
schlechten Löslichkeit von N-Benzoyl-Glycin in Hepes-Puffer zusammen.
63
3 Ergebnisse
64
Abbildung 22: Hydrolyse von 1 mmol N-Acetyl- und N-Benzoyl-Aminosäuren
(bei N-Benzoyl-Glycin n=5, alle anderen N-Benzoyl-Aminosäuren n=2)
3.9.2 Vergleich von N-Acetyl- und N-Chloroacetyl- substituierten
Aminosäuren
Abbildung 23: Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-ChloroacetylAminosäuren
Bei dem Vergleich von N-Acetyl- und N-Chloroacetyl-Aminosäuren in einer
Konzentration von 1 mmol/l wird bei Aminosäuren, die gute Substrate der
64
3 Ergebnisse
65
pAcy1 sind, in der Regel die N-Chloroacetyl-Aminosäure besser hydrolysiert als
die acetylierte Aminosäure (Abbildung 23).
3.9.3 Vergleich von N-Acetyl und N-Formyl substituierten Aminosäuren
Die N-acetylierte Form der Aminosäure wurde in allen Proben von der pAcy1
besser hydrolysiert als die N-formylierte Variante. Bei L-Alanin und Glycin
wurde die acetylierte Form gut hydrolysiert, N-Formyl-L-Alanin und -Glycin hingegen kaum (Abbildung 24).
Abbildung 24: Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-Formyl-Aminosäuren
3.10 Inhibitoren
Isobutyrylglycin und Isovalerylglycin wurden auf ihre Eigenschaft als mögliche
Inhibitoren der pAcy1 untersucht. Es zeigte sich, das beide Substanzen unabhängig von ihrer Konzentration im Enzymansatz in diesem Versuch keinen
Einfluss auf die Hydrolyse von NAM haben (Abbildung 25). Beide Substanzen
wurden in unseren Versuchen nicht von der Acy1 hydrolysiert. Isovalerylglycin
und Isobutyrylglycin wurden in einer Endkonzentration von jeweils 2,5 mM, 5
mM und 10 mM und der Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l in einen Ansatz mit einer NAM-Endkonzentration von 10 mM gegeben. Zum genauen
Ablauf des Versuches siehe auch 2.1.5. Eine Erhöhung der StandardEnzymaktivität auf 17,25*104 U/l hatte keinen Einfluss auf die Ergebnisse
65
3 Ergebnisse
66
Abbildung 25: Isobutyrylglycin und Isovalerylglycin als mögliche Inhibitoren der
pAcy1 bei der Hydrolyse von 10 mmol/l NAM, Standard-Enzymaktivität 4,6*104
U/l
Abbildung 26: Isobutyrylglycin und Isovalerylglycin als mögliche Inhibitoren der
pAcy1 bei der Hydrolyse von 10 mmol/l NAM, Standard-Enzymaktivität
17,25*104 U/l
66
3 Ergebnisse
67
3.11 N-Carbamoyl Aminosäuren
Alle getesteten Substanzen wurden in Hepes-Puffer gelöst und in einer Endkonzentration von 1 mmol/l eingesetzt. Zum Vergleich wurde jeweils auch die
N-Acetyl-Aminosäure mit gemessen. Die dargestellten Ergebnisse wurden bei
einer Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l gemessen. Es zeigte sich, dass
die Carbamoyl-Aminosäuren nicht durch das Enzym hydrolysiert wurden.
3.11.1 N-Carbamoyl-β-Alanin (3-Ureidopropionat)
Es konnte kein Aussage darüber getroffen werden, ob N-Carbamoyl-β-Alanin
ein Substrat der pAcy1 ist, weil das Produkt β-Alanin nicht mit Ninhydrin reagieren kann, da es eine β-Aminosäure ist und Ninhydrin nur mit α-Aminosäuren
eine Farbreaktion erzeugt.
3.11.2 N-Carbamoyl-DL-Aspartat (Ureidosuccinat)
N-Carbamoyl-DL-Aspartat scheint in geringem Umfang durch die pAcy1 hydrolysiert zu werden (Abbildung 27). In der Kontrolle mit Substrat, aber ohne
Enzym war der Umsatz von N-Carbamoyl-DL-Aspartat gleich hoch wie mit Enzym. Das gleich gilt für N-Acetyl-DL-Aspartat.
3.11.3 N-Carbamoyl-L-Glutamat und N-Acetyl-Glutamat
Eine Hydrolyse von N-Carbamoyl-L-Glutamat durch die pkAcy1 konnte in nicht
nachgewiesen werden. N-Acetyl-L-Glutamat wird in geringem Umfang hydrolysiert N-Acetyl-L-Glutamat wird durch die pkAcy1 hydrolysiert (Abbildung 27).
67
3 Ergebnisse
68
Abbildung 27: Hydrolyse von 1 mmol/l N-Acetyl- und N-CarbamoylAminosäuren
3.12 Pharmakologisch relevante Substanzen
Alle Substanzen wurden in 50 % Methanol gelöst, das entspricht einer
Endkonzentration von 5 % Methanol im Enzymansatz, und bei einer StandardAcylaseaktivität von 4,6*104 U/l gemessen.
3.12.1 Acetaminophen, Handelsname Paracetamol, N-Acetyl-4Aminophenol
Es lässt sich keine Aussage dazu machen, ob Acetaminophen ein mögliches
Substrat der pAcy1 ist, weil die Referenzsubstanz 4-Aminophenol nicht mit dem
Ninhydrin reagiert und sich somit auch keine Hydrolyse durch die pAcy1 nachweisen lässt. Das Ergebnis im negativen Bereich erklärt sich dadurch, dass zur
Umsatzberechnung von N-Acetyl-4-Aminophenol 4-Aminophenol als Referenz
genommen wurde.
3.12.2 N-Acetyl-Procainamid
In dem Versuch zeigte sich keine Hydrolyse durch die pAcy1. Procainamid
stand nicht als Referenzsubstanz zur Verfügung. Es konnte daher nicht sicher
untersucht werden, ob N-Acetyl-Procainamid ein Substrat der Acy1 ist, weil
68
3 Ergebnisse
69
nicht nachgewiesen werden konnte, ob Procainamid überhaupt mit Ninhydrin
reagiert. Procainamid enthält eine freie NH2-Gruppe, die mit Ninhydrin reagieren kann.
3.12.3 Chloramphenicol
Auch hier reagiert die Referenzsubstanz (1S,2S)-(+)-2-Amino-1-(4-Nitrophenyl)1,3-Propandiol nicht mit Ninhydrin, so dass keine Aussage darüber getroffen
werden kann, ob Chloramphenicol durch die pAcy1 hydrolysiert wird.
3.12.4 N-Acetyl-L-Cystein
N-Acetyl-L-Cystein mit der Referenzsubstanz L-Cystein wird durch die pAcy1
hydrolysiert (Abbildung 28).
Abbildung 28: Hydrolyse verschiedener Medikamente
Es konnte bei den Substanzen Paracetamol, N-Acetyl-Procainamid und
Chloramphenicol nicht untersucht werden, ob sie durch die pAcy1 hydrolysiert
werden, da die jeweiligen Referenzsubstanzen nicht mit Ninhydrin reagieren.
Möglicherweise könnte durch Assays, die nicht auf Ninhydrin basieren, ein anderes Ergebnis gezeigt werden.
69
3 Ergebnisse
70
3.13 Hormone
Die möglichen Substrate wurden in 50 % Methanol gelöst, dessen Endkonzentration im Ansatz 5 % betrug.
3.13.1 Melatonin (N-Acetyl-5-Methoxytryptamin)
Die Referenzsubstanz für den Ninhydrin-Assay von Melatonin, 5-Methoxytryptamin, reagiert kaum mit Ninhydrin (Abbildung 29). Es konnte daher nicht
untersucht werden, ob Melatonin ein Substrat der pAcy1 ist.
3.13.2 N-Acetyl-5-Hydroxytryptamin
N-Acetyl-5-Hydroxytryptamin ist die direkte Synthesevorstufe von Melatonin. Als
Referenzsubstanz für den Ninhydrin-Assay wurde Serotonin benutzt, das keine
Reaktion mit dem Ninhydrin zeigte. Daher konnte nicht festgestellt werden, ob
N-Acetyl-5-Hydroxytryptamin von der pAcy1 hydrolysiert wird (Abbildung 29).
Abbildung 29: Hydrolyse von Hormonen
3.14 Einfluss des pH-Wertes
Bei diesem Versuch wurde N-Acetyl-L-Methionin in einer Endkonzentration bis
100 mmol/l zur Acylase-Lösung gegeben. In einem Ansatz wurde der pH-Wert
durch Zugabe von Natronlauge bei gleichbleibender Endkonzentration von NAM
70
3 Ergebnisse
71
und gleichbleibendem Volumen konstant bei pH 8 gehalten. Im zweiten Ansatz
erfolgte keine weitere Korrektur des pH-Wertes (Standard-Enzymansatz für die
Positivkontrolle). Es zeigte sich, dass es ab einer Endkonzentration von 22,5
mmol NAM und einer Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l zu einer Hemmung des Enzyms kommt. Bei einer höheren Standard-Enzymaktivität von
17,25*104 U/l kommt es bei einer NAM-Endkonzentration von 27,5 mmol zu
einem Abfall der Hydrolyserate. Bleibt der pH unverändert ergibt sich eine Hyperbel-Kurve, wobei ab einer Konzentration von 80 mmol NAM bei einer
Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l die Abflachung der Kurve zu
beobachten war (Abbildung 30).
Abbildung 30: Hydrolyse von N-Acetyl-L-Methionin bei einer StandardEnzymaktivität von 4,6*104 U/l
Um die Michealis-Menten-Konstante KM zu berechnen wurden die pH-adaptierten Werte nach Lineweaver-Burk dargestellt (Abbildung 31). Anhand der
Geraden lässt sich ein KM-Wert von 25,4 mmol/l und eine Maximalgeschwindigkeit (vmax) von 0,9365 mmol l-1 min-1 berechnen. Die Werte wurden mit dem
Programm Matlab (Version 7.10.0 (R2010a)) mittels Polynominterpolation ermittelt. Der Code ist im Anhang zu finden.
71
3 Ergebnisse
72
Abbildung 31: Enzymkinetik-Darstellung nach Lineweaver-Burk zur Berechnung
von KM und vmax; pH-adaptierter Umsatz von NAM bei einer Standard-Enzymkonzentration von 4,6*104 U/ml.
3.15 Sonstige untersuchte bekannte Substrate
Einige der untersuchten bekannten Substrate der Acy1 ließen sich in keine
weiteren Gruppen unterteilen. Darum erfolgt eine Übersicht in tabellarischer
Form. Die Versuche wurden mit einer Enzymkonzentration von 4,6*104 U/l
durchgeführt. Es zeigte sich, dass die meisten N-Acetyl-Aminosäuren von der
pkAcy1 umgesetzt werden. Alle Versuche wurden mindestens einmal reproduziert. In Tabelle 7 steht hinter dem Namen der N-Acetyl-Aminosäure jeweils die
Anzahl der durchgeführten Versuche. Der Mittelwert wurde immer auf den Substratumsatz in 30 min bezogen, weil die Inkubation des Enzyms und somit die
Enzymreaktion in den Versuchen nach 30 min gestoppt wurde. Die Inkubationszeit beruht auf den Angaben für den Acylase1-Enzym-Assay von Sigma-Alrich,
Inc. (siehe 6.4)
72
3 Ergebnisse
73
Tabelle 7: Hydrolyse bereits bekannter Acy1-Substrate
Acylaseaktivität 4,6*104 U/l
mmol/
l
20
Substrat
N-Acetyl-DL-
Mittel-
Stan-
Varia-
Lösungs-
wert in
dardab-
tions-
mittel
mmol/l
weich-
koeffizient
(30 min)
ung
in %
Hepes
0,261
0,07
27,37
Hepes
0,066
0,01
16,75
Hepes
0,100
0,15
148,46
Glutaminsäure (n=3)
1
N-Acetyl-DLGlutaminsäure (n=3)
1
N-Acetyl-DL-Homocystein
(n=3)
10
N-Acetyl-DL-Serin (n=4)
Hepes
3,550
0,09
2,50
1
N-Acetyl-DL-Serin (n=2)
Hepes
0,389
0,05
12,27
5
N-Acetyl-L-Histidin (n=2)
Hepes
2,843
0,58
20,43
1
N-Acetyl-L-Histidin (n=2)
Hepes
0,246
0,03
13,43
20
N-Acetyl-L-Leucin (n=2)
Hepes
8,764
0,43
4,95
1
N-Acetyl-L-Leucin (n=3)
Hepes
0,428
0,05
11,74
3.16 Potentielle neue Substrate der Acy1
N-Trifluoroacetyl-DL-Asparaginsäure wird in dem hier durchgeführten Versuch
überraschenderweise von der pkAcy1 hydrolysiert. In dem Ansatz mit Enzym
konnte im Gegensatz zu dem Ansatz ohne Enzym eine Hydrolyse nachgewiesen
werden.
Aspartam
und
N-Acetyl-DL-Asparaginsäure
werden
nicht
hydrolysiert. Aspartam zeigte auch ohne Enzym eine Reaktion im NinhydrinAssay, so dass von einer direkten Reaktion des Aspartams mit dem Ninhydrin
auszugehen ist. N-Acetyl-DL-Asparaginsäure zeigt im Ansatz mit und ohne
Enzym die gleichen Werte. N-Palmitoyl-L-Serin, N-Palmitoyl-L-Taurin und NArachidonoyl-L-Alanin werden hier nicht von der Acylase hydrolysiert. Der
negative Wert entsteht durch die Berechnung anhand der Eichgerade. Wenn in
einem Versuch Substabzen in Ethanol gelöst waren, wurde immer eine
entsprechende Positiv- und Negativkontrolle mitgeführt. Die Positivkontrolle
wurde trotz des Lösungsmittels Ethanol gut durch die Acylase1 hydrolysiert
(siehe auch 3.3).
73
3 Ergebnisse
74
Tabelle 8: Hydrolyse von potentiellen Substraten
Acylaseaktivität 4,6*104 U/l
mmol/
l
Substrat
Lösungsmittel
16
Mittel-
Stan-
Varia-
wert in
dardab-
tions-
mmol/l
weich-
koeffizient
(30 min)
ung
in %
5
Aspartam
Hepes
keine Hydrolyse nachweisbar
1
Aspartam
Hepes
keine Hydrolyse nachweisbar
N-Trifluoroacetyl-DL-
Hepes
0,464
0,03
5,68
Hepes
0,348
0,02
6,37
2,5
Asparaginsäure
1
N-Trifluoroacetyl-DLAsparaginsäure
2,5
N-Acetyl-DL-
Hepes
keine Hydrolyse nachweisbar
Hepes
keine Hydrolyse nachweisbar
Asparaginsäure
1
N-Acetyl-DLAsparaginsäure
16
1
L-Palmitoyl-L-Serin
10% Ethanol
Absorption negativ
1
N-Palmitoyl-L-Taurin
10% Ethanol
Absorption negativ
1
N-Arachidonoyl-L-Alanin
10% Ethanol
Absorption negativ
In Ethanol gelöste Substanzen wurden in 100 % Ethanol gelöst, dies entspricht einer
Endkonzentration von 10 % Ethanol im Enzymansatz.
74
4 Diskussion
4
Diskussion
4.1
Die Enzymreaktion-beeinflussende Faktoren
75
4.1.1 pH-Wert
Bei diesem Versuch zeigte sich, dass bei einer NAM-Konzentration von mehr
als 20 mM der pH-Wert der Reaktionslösung einen Rolle spielt. In unseren Versuchen konnte solch eine pH-Wertänderung vernachlässigt werden, da bei
keiner Untersuchung Substratkonzentrationen von mehr als 20 mM verwendet
wurden. Bei anderen stark sauren oder basischen Substraten (wie z.B. N-Acetyl-Asparaginsäure oder N-Acetyl-Glutaminsäure) könnte die pH-Wertänderung
auch bei niedrigeren Substratkonzentrationen relevant sein, dies sollte bei zukünftigen Versuchen untersucht und berücksichtigt werden. Der KM-Wert für
NAM liegt bei 25,4 mmol/min, so dass bei anderen Versuchen wahrscheinlich
mit einer suboptimalen Substratkonzentration gearbeitet wurde. Die unterlassene Bestimmung des pH-Wertes ist möglicherweise ein Schwachpunkt dieser
Dissertation. Bei den Versuchen wurde nicht standardmäßig eine Messung des
pH-Wertes durchgeführt. Bei sauren oder basischen Aminosäuren kann daher
eine Beeinflussung des pH-Wertes und somit ein suboptimaler pH-Bereich für
die Acylase1 nicht ausgeschlossen werden. Bruns und Schulze beschrieben
einen optimalen pH-Wert von pH 7 für die Acylase, das Optimum für die
Hydrolyse von Benzoylglycin liegt etwas weiter im schwach sauren Bereich bei
pH 6,4. Im Tris-HCl-Puffer zeigte das Enzym die größte Aktivität (Bruns &
Schulze, 1962).
In der Literatur werden für verschiedene Substrate unterschiedliche KM-Werte
angegeben. Für Benzoylglycin liegt der Wert bei 2,4 mmol/l, für Acetylglycin bei
20 mmol/l und für N-Acetyl-Methionin bei 2,0 mmol/l, gemessen jeweils bei
37°C (Bruns & Schulze, 1962). Andere Autoren beschrieben für NAM einen KMWert von 5,2 mmol/l bei 25°C (Mitz & Schlueter, 1958).
75
4 Diskussion
76
4.1.2 Alkoholische Lösung
Da einige untersuchte Substanzen nicht in Hepes-Puffer löslich waren, wurden
sie in alkoholischen Lösungsmitteln gelöst. Durch diese Lösungsmittel wird die
enzymatische Reaktion beeinflusst.
Die Inhibition des Enzyms bei einem Alkoholgehalt von über 5 % im Reaktionsansatz muss bei der Interpretation der Ergebnisse bedacht werden. Aus diesem
Grund wurden bei Versuchen, in denen Substrate in alkoholischer Lösung verwendet wurden, auch immer die Kontrolle in der entsprechend konzentrierten
alkoholischen Lösung mitgeführt. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Endkonzentrationen beeinflusst das Lösungsmittel die Ergebnisse nicht.
4.2
Enantioselektivität
Auch in dieser Arbeit wurde die Enantioselektivität der pkAcy1 für N-Acyl-LAminosäuren festgestellt. Dabei wurde bei sehr hohen Enzymaktivitäten eine
Restaktivität gegenüber N-Acyl-D-Aminosäuren beobachtet. Diese Beobachtung entspricht den bereits von anderen Autoren veröffentlichten Daten
(Birnbaum et al., 1952b).
Diese Eigenschaft der Aminoacylase 1 wird in der industriellen Herstellung von
reinen Methionin genutzt. Bei der Synthese entsteht zunächst racemisches
Methionin. Nach der Acetylierung spaltet die Acylase1 enantioselektiv, so dass
L-Methionin gebildet wird, die D-Form bleibt unverändert (Degussa-Prozess)
(Aehle, 2007). Das entstandene L-Methionin wird in der z.B. in der Medizin zur
Prophylaxe von chronischen Harnwegsinfekten genutzt (Funfstuck et al., 1997),
als Bestandteil von Aminosäure-Lösungen zur parenteralen Ernährung oder zur
Optimierung der Wirkung von Antibiotika im sauren Urin (Rote Liste, 2009).
4.3
Bekannte Substrate
4.3.1 N-Acyl-Homoserin-Lakton
In einer Arbeit von Xu et al. (Xu et al., 2003) untersuchten diese, ob die pkAcy1
in der Lage ist, N-Acyl-Homoserin-Laktone (NAHSL) zu deacylieren. Sie konnten zeigen, dass N-Butyryl-L-Homoserin-Lakton (BHSL) und N-Octanoyl-L76
4 Diskussion
77
Homoserin (OHSL) Lakton zu L-Homoserin hydrolysieren. Das pH-Optimum für
BHSL lag bei pH 10 bei 23°C und pH 9 bei 76°C.
In der für diese Arbeit durchgeführten Versuchsreihe wurde außerdem die Hydrolyse von weiteren N-Acyl-Homoserin-Laktonen untersucht. Als potentielle
neue Substrate kamen N-Hexanoyl-DL-Homoserin-Lakton, N-Heptanoyl-DLHomoserin-Lakton, N-Dodecanoyl-DL-Homoserin-Lakton, N-(3-Oxooctanoyl)-LHomoserin-Lakton und N-β-Ketocaproyl-L-Homoserin-Lakton hinzu. N-ButyrylDL-Homoserin-Lakton und N-Octanoyl-DL-Homserin-Lakton lagen als Racemat
vor und nicht wie bei Xu et al. als reine Enantiomer-Lösung. Es konnte gezeiget
werden, dass bei einer Temperatur von 23°C und 76°C nicht nur BHSL undOHSL von der pkAcy1 in L-Homoserin gespalten werden sondern in geringerem
Maße auch N-Hexanoyl-DL-Homoserin-Lakton. N-Hexanoyl-Homoserin-Lakton
spielt eine Rolle beim Quorum sensing, z.B. bei Aeromonas (Chan et al., 2011)
In den hier durchgeführten Versuchen wurden die übrigen N-Acyl-HomoserinLaktone
(N-Heptanoyl-DL-Homoserin-Lakton,
N-Dodecanoyl-DL-Homoserin-
Lakton, N-(3-Oxooctanoyl)-L-Homoserin-Lakton und N-β-Ketocaproyl-L-Homoserin-Lakton) nicht von der pkAcy1 hydrolysiert. Xu et al. beschrieben einen KMWert von 81±3 mM für die Hydrolyse von BHSL bei pH 9 und 23°C (Xu et al.,
2003). In dieser Arbeit wurde also mit Substrat-Konzentrationen unterhalb der
mehrfachen KM gearbeitet.
Es wäre interessant, den gleichen Versuchen mit reinen Enantiomeren der NAcyl-Homoserin-Laktone durchzuführen, da die Selektivität der Acy1 für LEnantiomere bekannt ist (Birnbaum et al., 1952b).
Die erhöhte Aktivität der pkAcy1bei einem pH-Wert von 10 und einer Temperatur von 23°C bzw. pH 9 bei 76°C bei der Hydrolyse von NAHSL konnten
bestätigt werden, wohingegen das pH- und Temperatur-Optimum bei anderen
Substraten, z.B. NAM, bei pH 7 und 25°C liegt (Henseling & Röhm, 1988). Am
häufigsten wird in der Literatur jedoch für die Acylase 1 für die meisten Substrate ein optimaler pH von 7 und eine Temperatur von 37°C angegeben (Bruns
& Schulze, 1962).
Die Reaktion kann noch weiter verbessert werden, indem man nur die L-Formen von Homoserin verwendet, da die D-Enantiomere nicht gut von der Acy1
hydrolysiert werden können (siehe 4.2). Außerdem sollte in weiteren Versuchen
der pH-Wert bei den verschiedenen Temperaturen konstant sein, da sonst nicht
77
4 Diskussion
78
sicher bewertet werden kann, ob die Unterschiede auf die Temperaturdifferenz
oder auf die verschiedenen pH-Werte zurückzuführen sind.
Die Untersuchung der NAHSL ist wegen ihrer wichtigen Bedeutung beim Quorum sensing (siehe Einleitung) interessant. Im medizinischen Bereich spielt vor
allem die Biofilmbildung in diesem Zusammenhang eine Rolle, z.B. bei der Behandlung von Pneumonien bei Mukoviszidose durch Pseudomonas aeruginosa
(Costerton et al., 1999).
4.3.2 Vergleich von N-Acetyl-, N-Chloroacetyl-, N-Formyl- und N-BenzoylAminosäuren
In dieser Arbeit wurde die Hydrolyse von drei Aminosäuren (Valin, Phenylalanin
und Glycin) mit unterschiedlichen N-Acyl-Resten verglichen. Es zeigte sich,
dass N-Chloroacetyl-Valin und N-Chloroacetyl-Phenylalanin am besten durch
die pkAcy1 hydrolysiert werden, gefolgt von N-Acetyl-Valin und N-Acetyl-Phenylalanin und dann N-Formyl-Valin und N-Formyl-Phenylalanin. N-BenzoylValin und N-Benzoyl-Phenylalanin werden nicht hydrolysiert. Diese Untersuchungen decken sich mit früheren Analysen (Birnbaum et al., 1952b), (Anders &
Dekant, 1994). Denton vermutete, dass die höhere Reaktivität von Chloroacetyl-Derivaten im Vergleich zu den Acetyl-Derivaten auf Elektronen-Effekte
zurückzuführen sind. Durch das Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch ein
Chloratom steigt die Elektrophilie des Carbonylrestes (Denton, 2000).
Beim Glycin-Konjugaten weichen die Ergebnisse von früheren Untersuchungen
ab. Hier wird am meisten N-Acetylglycin umgesetzt, gefolgt von N-Formylglycin.
N-Benzoylglycin wird nicht hydrolysiert. In anderen Arbeiten war Benzoylglycin
(Hippursäure) durchaus ein Substrat der Acylase 1 (Schmiedeberg, 1881), obwohl es bei weitem nicht so gut umgesetzt wird wie beispielsweise N-Acetyl-LMethionin (Bruns & Schulze, 1962). Bruns und Schulze beschreiben für
Hippurat ein pH Optimum von 6,4 und einen KM von 2,4x10-3 Mol/l bei 37°C, für
NAM liegt der pH von 7 im optimalen Bereich, die KM beträgt bei 37°C 2,0x10-3
Mol/l (Bruns & Schulze, 1962). Möglicherweise war für die Hydrolyse von
Hippurat in unserem Versuch der pH-Wert nicht optimal und es wurde nicht
genug Substrat eingesetzt.
78
4 Diskussion
79
4.3.3 Inhibitoren
Isobutyrylglycin und Isovalerylglycin wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaft als
Substrat und Inhibitor der pAcy1 untersucht. Beide spielen eine Rolle bei Organoacidurien. Isovalerylglycin wird bei der Isovalerianacidurie (Tanaka et al.,
1966), einem Defekt der Isovaleryl-CoA-Dehydrogenase (Rhead & Tanaka,
1980),
vermehrt
im
Urin
ausgeschieden.
Bei
rascher
Diagnose
und
entsprechender Therapie (Naglak et al., 1988) haben die Patienten eine gute
Prognose (Vockley & Ensenauer, 2006). Bei der Isobutyracidurie fällt vermehrt
Isobutyrylglycin an, die klinische Relevanz dieser Organoacidurie ist jedoch
fraglich (Roe et al., 1998) (Roe et al., 1998; Sass et al., 2004; Zschocke &
Hoffmann, 2004). Wenn diese Stoffe im Körper akkumulieren, könnten sie
durch eine Inhibition der Acy1 zu einem sekundären Aminoacylase-1-Mangel
führen. In unseren Versuchen wirkten die beiden Substanzen jedoch nicht als
Inhibitoren der pAcy1 und werden auch nicht von ihr hydrolysiert. Denton
beschrieb, dass Seitenketten von bis zu fünf Karbon-Atomen problemlos
hydrolysiert werden (Denton, 2000). Es ist denkbar, dass durch die
Verzweigung der Kohlenstoffkette bei Isovalerylglycin und Isobutyrylglycin die
Substanzen zu sperrig sind und nicht mehr im aktiven Zentrum des Enzyms
hydrolysiert werden können.
4.4
N-Acyl-Amide
Mit dem Wissen um langkettige N-Acyl-Amide beschäftigt sich der Forschungsbereich Lipidomics, der analog zu Bereich Proteinomics versucht, molekulare
Mechanismen zu erforschen und den Schwerpunkt dabei auf endogene LipidSignalmoleküle setzt. Anders als bei Proteinen gibt es keine genetische Information, von der auf mögliche Proteine geschlossen werden kann. Mögliche
neue N-Acyl-Amide ergeben sich aus den Kombinationsmöglichkeiten vorherrschender Fettsäuren (Acyl-Ketten) mit Aminen (Aminosäuren). Bradshaw et al.
beschrieben die Entdeckung des endogenen Cannabinoids und N-Acyl-Amids
Anandamide (N-Arachidonoyl-Ethanolamin) (H. B. Bradshaw et al., 2009).
Anandamid aktiviert den G-Protein gekoppelten Cannabinoid-Rezeptor 1 (CB1)
(Mutschler, 2008). Cannabinoide beeinflussen eine Vielzahl an physiologischen
Funktionen. Zum einen werden kognitive Funktionen beeinträchtigt, es kommt
79
4 Diskussion
80
zur Analgesie und Hypothermie, Cannabinoide werden als Antiemetika bei der
Chemotherapie verwendet, auch das kardiovaskuläre System wird beeinflusst
(Howlett et al., 1990).
Seit einiger Zeit ist es möglich, den Cannabinoid-Rezeptor gezielt pharmakologisch zu beeinflussen. Dies bietet möglicherweise neue Therapieansätze zur
Behandlung von Schmerzen, Übergewicht, neurologischen Erkrankungen wie
Multiple Sklerose, Angststörungen oder Abhängigkeitserkrankungen, besonders
Alkoholismus (Rodriguez de Fonseca et al., 2005).
Später wurde noch ein weiteres endogenes Cannabinoid, 2-Arachidonoyl-Glycerol isoliert (Mechoulam et al., 1995), und ein zweiter Rezeptor CB2,
beschrieben (Munro et al., 1993).
N-Acyl-Amide bilden Komplexe mit Cytochrom P450 BM-3, einer FettsäureMomooxygenase aus Bacillus megaterium. Cytochrom P450 BM-3 ähnelt eukaryontischen P450 in der Primärstruktur und der Funktion. Haines et al.
beschreiben den Komplex aus N-Pamitoylglycin und P450 BM-3 (Haines et al.,
2001). N-Palmitoyl-L-Methionin bindet mit einer noch höheren Affinität an P450
BM-3 (Hegde et al., 2007).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde Palmitoylglycin synthetisiert und wie auch NPalmitoyl-L-Methionin, N-Arachidonoyl-Glycin und N-Arachidonoyl-Alanin als
mögliches
Substrat
der
Acy1
untersucht.
N-Arachidonoylglycin
besitzt
antinozizeptive (Huang et al., 2001) und antiinflammatorische (Succar et al.,
2007) Eigenschaften und hat als endogenes Signalmolekül zahlreiche weitere
biologische Effekte. Weder N-Arachidonoyl-Glycin noch N-Arachidonoyl-Alanin
scheint als Substrat für die pkAcy1 geeignet zu sein, was wahrscheinlich auf die
Doppelbindungen in der Fettsäurekette zurückzuführen ist. Palmitoylglycin und
auch Palmitoyl-Methionin sind Substrate der pkAcy1. Die Ergebnisse aus den
Versuchen mit N-Acyl-Aminosäuren mit verschiedenen Fettsäureresten legen
nahe, dass die Acylase geradkettige Aminosäuren mit einem Acylrest einer
Kettenlänge von bis zu 16 C-Atomen umsetzen kann, solange dieser keine
Doppelbindungen enthält. Wenn die Reste Doppelbindungen enthalten oder
verzweigt sind werden sie wenig oder gar nicht von der pkAcy1 verstoffwechselt
(siehe Tab. 7). Denton geht davon aus, dass das aktive Zentrum Seitenketten
von bis zu fünf Karbon-Atomen problemlos aufnehmen kann, bei längeren Ketten nimmt die Hydrolyserate ab (Denton, 2000).
80
4 Diskussion
81
Der Zusammenhang zwischen der Acy1 und dem Stoffwechsel von N-AcylAminosäuren mit langkettigen Fettsäureresten bietet neue, interessante Forschungsansätze.
Vielleicht
kann
es
so
gelingen,
die
neurologischen
Auffälligkeiten von Patienten mit Acy1-Mangel zu verstehen und einzuordnen.
Weitere endogene N-Acyl-Glycine (N-Oleoylglycin, N-Stearoylglycin, N-Linoylglycin und N-Docosahexaenoylglycin) wurden vor kurzem von Bradshaw et al.
beschrieben. Die höchsten Konzentrationen dieser N-Acyl-Glycine werden in
der Haut, Lunge und im Rückenmark gefunden (H. B. Bradshaw et al., 2009).
Untersuchungen haben gezeigt, dass die neuen N-Acyl-Glycine zum Teil auch
antiinflammatorisch wirken (Burstein et al., 2007). Es wäre interessant, diese
neuen N-Acyl-Glycine auf ihre Eignung als Substrat der Acy1 zu testen, wobei
besonders N-Stearoyl-Glycin als unverzweigte, gesättigte Fettsäure mit 18
Kohlenstoffatomen geeignet erscheint.
4.5
Die Rolle von Acy1 im Stoffwechsel
4.5.1 Niere
Von mehreren Autoren wurde vermutet, dass die Acy1 in der Niere eine Rolle
bei der Wiederverwertung von Aminosäuren (Aminosäure-Salvage) spielt.
Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass man im Urin von Patienten mit
einem Acy1-Mangel eine Erhöhung der N-acetylierten Aminosäuren nachweisen konnte (Sass et al., 2006). Wenn es nun zu einer verminderten Aufnahme
von Proteinen kommt, z.B. durch eine Hungersnot, kann es bei einem Mangel
von Acy1 zu einer geringeren Verfügbarkeit von freien Aminosäuren kommen.
Es gibt Vermutungen, dass die Acy1 nicht nur die Fähigkeit zur Deacetylierung
von Aminosäuren besitzt, sondern auch bei der Acylierung von AS eine Rolle
spielt. Lindner et al. vermuteten, dass die Synthese von Benzoylglycin aus Benzoat und Glycin durch die Acy1 als alternativer Benzoat-Detoxifizierungsweg
eine Rolle spielt (H. Lindner et al., 2000). Sie wiesen nach, dass die Acy1-Konzentration bei Herbi- und Omnivoren wesentlich höher ist als bei Carnivoren.
Benzoat kommt vor allem in pflanzlichen Nahrungsmitteln vor. Möglicherweise
war die Acy1-abhängige Detoxfizierung von Benzoat bei der Evolution vom
Pflanzen- zum Allesfresser von Vorteil und ist es bei Vegetariern noch heute.
81
4 Diskussion
82
Lindner et al. publizierten 2008 eine Arbeit zur Verarbeitung der N-Acetyl-Aminosäuren durch Nierenaminoacylase. Sie arbeiteten dabei mit LLC-PK1-Zellen,
einem Modell des proximalen Tubulusepithels der Schweineniere, das Acy1
stark exprimiert. Im Modell konnte nachgewiesen werden, dass N-Acetyl-Leucin
und N-Acetyl-Methionin statt der freien Aminosäure in die kultivierten Epithelzellen aufgenommen und beim Wachstum der Zellen verarbeitet wird. Sie
schlossen daraus, dass die Acy1 in der Niere eine besondere Rolle im Salvage
von Aminosäuren spielt (H. A. Lindner et al., 2008).
4.5.2 Gehirn
Im Gehirn ließ sich eine hohe Expression von Acy1 nachweisen (Goldstein,
1976). Patienten mit einem Acy1-Mangel zeigen häufig neurologische Auffälligkeiten (Sass et al., 2007). Dies sind Hinweise auf eine funktionelle Rolle des
Enzyms im ZNS. Beim M. Canavan kommt es durch die reduzierte
Aspartoacylase-Aktivität zu einer Akkumulation von N-Acetyl-L-Asparaginsäure
und einem Mangel an Aspartat im Gehirn, die im Zusammenhang mit den klinischen Symptomen stehen (Baslow & Resnik, 1997). Der Zusammenhang
zwischen Acy1-Mangel und neurologischer Symptomatik konnte bisher nicht
geklärt werden. Zabel et al. konnten Veränderungen der Acy1 bei Chorea Huntington und dem Fragilen-X-Syndrom zeigen (Zabel et al., 2006). Daraus kann
man die Hypothese ableiten, dass die Acy1 möglicherweise den Schweregrad
oder die Manifestation verschiedener neurologischer Krankheiten beeinflusst.
Eventuell lässt sich so auch die große phänotypische Variabilität der ACY1Mangel-Patienten erklären.
4.6
Pharmakologische Bedeutung
Die Acetylierung von bestimmten Medikamenten, z.B. Sulfonamiden, Isoniazid,
Clonazepam und Koffein, spielt eine wichtige Rolle bei deren Metabolisierung
und Elimination (Phase-II-Reaktion, Konjugationsreaktion) (Mutschler, 2008).
Veränderungen der ACY1-Funktion beeinflussen möglicherweise durch eine
Steigerung oder Abnahme der Deacetylierung die Pharmakokinetik dieser Medikamente.
82
4 Diskussion
83
Außerdem beeinflusst die ACY1 den Stoffwechsel von Merkapturaten, die v.a.
beim Abbau von Paracetamol eine Rolle spielen (Anders & Dekant, 1994).
4.6.1 Medikamente und Hormone
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die pAcy1 in der Lage ist, bestimmte Medikamente direkt zu verstoffwechseln. Als mögliche Substrate wurden
Paracetamol, N-Carbamoyl-Glutamat, N-Acetyl-Procainamid und Chloramphenicol untersucht.
Beim Paracetamol, N-Acetyl-Procainamid und Melatonin bestand das Problem,
dass die Produkte 4-Aminophenol, Procainamid und Serotonin nicht mit Ninhydrin reagiert bzw. das Produkt nicht zur Verfügung stand und daher die
Hydrolyse nicht quantifiziert werden konnte. Zur Überprüfung in zukünftigen
Arbeiten würden sich andere Methoden empfehlen. N-Carbamoyl-L-Glutamat
und Chloramphenicol wurden in unseren Versuchen nicht von der pAcy1 hydrolysiert.
N-Carbamoyl-Glutamat wird bei einem Harnstoffzyklus-Defekt (NAGS-Mangel)
substituiert.
Es
aktiviert
die
Ammoniak,
Hydrogencarbonat
Carbamoylphosphat-Synthetase,
und
Phosphat
im
ersten
die
aus
Schritt
der
Stickstoffauscheidung Carbamoyl-Phosphat synthetisiert (Kim et al., 1972;
Zschocke & Hoffmann, 2004). Da die Acy1 in unseren Versuchen N-CarbamoylGlutamat nicht hydrolysiert, hat auch ein Acy1-Mangel wahrscheinlich keinen
Einfluss auf die Therapie eines NAGS-Mangels. Kim et al. konnten zeigen, dass
N-Acetyl-Glutamat von der Acy1 hydrolysiert wird, N-Carbamoyl-Glutamat
hingegen selbst in einer 25fach höheren Konzentration als N-Acetyl-Glutamat
nicht (Kim et al., 1972). Dabei muss außerdem bedacht werden, dass die NAcetylglutamatsynthetase (NAGS), die im Harnstoffzyklus N-Acetyl-Glutamat
synthetisiert, ein mitochondriales Enzym ist. Das gebildete N-Acetyl-Glutamat
aktiviert dann die Carbamoylphosphat-Synthetase I (Zschocke & Hoffmann,
2004). Die ACY1 hingegen ist ein zytosolisches Enzym. Wenn jetzt N-AcetylGlutamat primär in den Mitochondrien entsteht, muss es zuerst ins Zytosol
gelangen, um dort von der ACY1 hydrolysiert zu werden. Das die ACY1 durch
die Hydrolyse von N-Acetyl-Glutamat indirekt über eine Nicht-Aktivierung der
Carbamoylphosphat-Synthetase I den Harnstoffzyklus hemmt ist daher
unwahrscheinlich.
83
4 Diskussion
4.7
84
Perspektive
In dieser Arbeit wurden alle Substrate mit Acy1 aus Schweineniere untersucht.
Unklar ist, ob die Ergebnisse so auch auf das menschliche Enzym übertragbar
sind, dies müsste in weiteren Versuchen geklärt werden (Mitta et al., 1993).
Des weiteren würde es sich anbieten, weitere Substanzen auf ihre Eignung als
Substrate der Acy1 zu untersuchen. Gerade im Bereich der langkettigen NAcyl-Amide, denen eine wichtige Rolle im ZNS und bei zahlreichen weiteren
physiologischen Vorgängen zugestanden wird, gibt es viele interessante Substanzen, z.B. N-Stearoylglycin (H. B. Bradshaw et al., 2009).
Bis heute ist es unklar, ob es sich bei dem Aminoacylase-1-Mangel um eine
eigenständige Krankheit handelt, oder ob es lediglich eine biochemische Variante ist, die zufällig zusammen mit neurologischen Auffälligkeiten auftritt (Sass
et al., 2006). Daher können Substrate der Acy1, die im Zusammenhang mit
dem Hirnmetabolismus stehen, wichtige Hinweise zur Relevanz der ACY1Mangels liefern.
Zur weiteren Abklärung der klinischen Relevanz eines ACY1-Mangels wäre es
interessant, ein größeres Kollektiv von Patienten mit neurologischen Auffälligkeiten auf einen ACY1-Mangel zu untersuchen, oder gesunde Menschen auf
die Mutation und eine Defizienz zu überprüfen, um zu sehen, ob auch klinisch
gesunde Menschen betroffen sind. Auch Patienten mit nephrologischen Erkrankungen oder bestimmten Tumoren könnte man auf Mutationen im Acy1-Gen
untersuchen, da Deletionen im Bereich des Acy1-Gens, wie sie bei einigen Tumoren vorkommen (Kohno et al., 1993; Miller et al., 1989; Zbar et al., 1987),
auch zu einem Acy1-Mangel führen könnten.
Die Mutationen im Acy1-Gen bei verschiedenen Tumorerkrankungen können in
Zukunft einen Hinweis zum Risiko der Entwicklung von Karzinomen geben werden.
Auch die Rolle der Acy1 im Metabolismus von Medikamenten, bei der Beeinflussung anderer neurologischer Erkrankungen wie z.B. Chorea Huntington
(Zabel et al., 2006) und bei der Interaktion mit anderen Proteinen, beispielsweise der Sphingosin-Kinase 1 (Maceyka et al., 2004) bietet weitere
Forschungsansätze.
84
5 Zusammenfassung
5
85
Zusammenfassung
Die Aminoacylase 1 (Acy1) katalysiert die hydrolytische Spaltung von
zahlreichen
N-Acyl-Aminosäuren
zu
freien
Aminosäuren
und
dem
entsprechenden Acyl-Rest. Das Aminoacylase-1-Gen ist auf dem kurzen Arm
von Chromosom drei (3p21.1) lokalisiert. Eine Enzymaktivität lässt sich in
unterschiedlichen Geweben nachweisen, vor allem aber in Niere und Gehirn.
Acy1 ist die am häufigsten vorkommende Aminoacylase und gehört zur M20Metallopeptidasen-Familie. Eine ACY1-Defizienz wurde bei einigen Patienten
mit neurologischen Auffälligkeiten beschrieben. Das menschliche Enzym und
das
Enzym
aus
Schweineniere
weisen
eine
Übereinstimmung
der
Aminosäurensequenzen von 87,7 % auf.
Diese Arbeit hatte zum Ziel, neue Substrate im Aminosäure-Bereich für die
Acy1 aus der Schweineniere zu finden, mit einem Schwerpunkt auf Substanzen, die eine Rolle bei der endogenen Signalübertragung spielen. Dazu wurde
verschiedene Substanzen mit einem Ninhydrin-Assay untersucht.
Es wurde gezeigt, dass die pkAcy1 Aminosäuren mit langkettigen FettsäureSubstituenten mit bis zu 16-Karbonatomen hydrolysieren kann. Langkettige
Acyl-Amide spielen eine Rolle bei neuronalen Signalübertragungswegen.
Zusätzlich zu den bereits bekannten Substraten N-Octanoyl-Homoserin-Lakton
und N-Butyryl-Homoserin-Lakton wurde auch die Hydrolyse von N-HexanoylHomoserin-Lakton von der pkAcy1 katalysiert. Die Acyl-Homoserin-Laktone
sind wichtige Quorum-Sensing-Moleküle und sind z.B. an der Bildung von Biofilmen beteiligt.
Über die Suche nach weiteren ACY1-Substraten mit neuroregulatorischer
Funktion kann die Bedeutung der ACY1 im Stoffwechsel in Zukunft vielleicht
besser verstanden werden.
Der Aminoacylase-Ninhydrin-Assay bietet eine einfache und günstige Möglichkeit,
um
ausgewählte
neue
Substrate
der
Acy1
zu
erforschen.
85
6 Anhang
6
Anhang
6.1
Copyright
86
Folgende Abbildungen wurden aus den Originalarbeiten übernommen, die
Zustimnung zur Benutzung wurde im jeweiligen Verlag oder Rechteinhaber
eingeholt.
Abbildung 1 modifiziert aus:
Lindner, H., Hopfner, S., Tafler-Naumann, M., Miko, M., Konrad, L., & Röhm, K.
H. (2000). The distribution of aminoacylase I among mammalian species
and localization of the enzyme in porcine kidney. Biochimie, 82(2), 129137.
Copyright © 2000 by Elsevier
Abbildung 2:
Palm, G. J., & Röhm, K. H. (1995). Aminoacylase I from porcine kidney:
identification and characterization of two major protein domains. J
Protein Chem, 14(4), 233-240.
Copyright © 1995 by Springer-Verlag
Abbildung 3:
Lindner, H. A., Lunin, V. V., Alary, A., Hecker, R., Cygler, M., & Menard, R.
(2003). Essential roles of zinc ligation and enzyme dimerization for
catalysis in the aminoacylase-1/M20 family. J Biol Chem, 278(45),
44496-44504.
Copyright © 2003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
86
6 Anhang
87
Abbildung 4:
D'Ambrosio, C., Talamo, F., Vitale, R. M., Amodeo, P., Tell, G., Ferrara, L., et
al. (2003). Probing the dimeric structure of porcine aminoacylase 1 by
mass spectrometric and modeling procedures. Biochemistry, 42(15),
4430-4443.
Copyright © 2003 by American Chemical Society
Abbildung 7 und Abbildung 8:
Blexon, University of Zurich, Department of Biochemistry, S. Gloor, 2009
http://www.bioc.uzh.ch/blexon/n:ninhydrin, aufgerufen am 15.07.2010 um 14.32
Uhr
Copyright © 2009 by S. Gloor
87
6 Anhang
6.2
88
Hydrolyse verschiedener Acyl-Methionin-Lösungen bei
einer Standard-Enzymaktivität von 4,6*104 U/l und
17,25*104 U/l
Acylaseaktivität 4,6*104 U/l
Mittel
mmol
Substrat (n)
/l
unabhängige Messserien
wert
Lösungsmittel
in
mmol
/l
Standardabweichung
Variationskoeffizient in
%
20 N-Acetyl-L-Methionin (32)
Hepes
16,72
1,60
9,59
1 N-Acetyl-L-Methionin (32)
Hepes
0,87
0,09
10,53
20 N-Acetyl-L-Methionin (15)
5 % Methanol
17,27
4,41
25,56
1 N-Acetyl-L-Methionin (15)
5 % Methanol
0,92
0,17
18,78
20 N-Acetyl-L-Methionin (10)
10 % Methanol
6,46
3,83
59,26
1 N-Acetyl-L-Methionin (10)
10 % Methanol
0,75
0,14
18,93
20 N-Acetyl-DL-Methionin (2)
Hepes
8,33
0,32
3,83
1 N-Acetyl-DL-Methionin (2)
Hepes
0,43
0,01
3,10
20 N-Acetyl-D-Methionin (31)
Hepes
0,21
0,11
51,68
1 N-Acetyl-D-Methionin (31)
Hepes
0,07
0,10
137,50
20 N-Formyl-L-Methionin (4)
Hepes
15,09
0,54
3,60
10 N-Formyl-L-Methionin (3)
Hepes
7,94
0,10
1,26
1 N-Formyl-L-Methionin (6)
Hepes
0,87
0,10
11,20
10 Caproyl-Methionin (4)
5 % Methanol
8,83
0,32
3,68
1 Caproyl-Methionin (4)
5 % Methanol
0,85
0,06
6,72
10 Palmitoyl-Methionin (4)
10 % Methanol
1,39
0,30
21,48
2,5 Palmitoyl-Methionin (2)
10 % Methanol
1,83
0,18
9,83
1 Palmitoyl-Methionin (6)
10 % Methanol
0,71
0,13
17,97
10 Furyl-Acryloyl-Methionin (2)
5 % Methanol
9,25
0,58
6,31
5 Furyl-Acryloyl-Methionin (2)
5 % Methanol
4,28
0,19
4,39
1 Furyl-Acryloyl-Methionin (5)
5 % Methanol
0,82
0,12
14,50
5 % Methanol
0,83
0,07
8,33
5 % Methanol
0,07
0,03
39,10
20 N-Trifluoroacetyl-LMethionin (2)
1 N-Trifluoroacetyl-LMethionin (2)
88
6 Anhang
89
Acylaseaktivität 17,25*104 U/l
Mittel
wert
m
mo
Substrat (n)
Lösungsmittel
l/l
in
mmol
/l
Standardabweichung
Variationskoeffizient in
%
20
N-Acetyl-L-Methionin (15)
Hepes
16,98
0,94
5,55
1
N-Acetyl-L-Methionin (15)
Hepes
0,90
0,13
14,51
20
N-Acetyl-L-Methionin (13)
5 % Methanol
17,40
1,51
8,67
1
N-Acetyl-L-Methionin (13)
5 % Methanol
0,93
0,18
19,53
20
N-Acetyl-L-Methionin (8)
10 % Methanol
14,23
2,04
14,33
1
N-Acetyl-L-Methionin (8)
10 % Methanol
0,74
0,13
17,94
20
N-Acetyl-DL-Methionin (2)
Hepes
8,43
0,39
4,68
1
N-Acetyl-DL-Methionin (2)
Hepes
0,46
0,03
7,37
20
N-Acetyl-D-Methionin (14)
Hepes
0,40
0,09
21,45
1
N-Acetyl-D-Methionin (14)
Hepes
0,07
0,07
106,96
20
N-Formyl-L-Methionin (4)
Hepes
16,82
1,40
8,32
10
N-Formyl-L-Methionin (3)
Hepes
8,56
0,36
4,15
1
N-Formyl-L-Methionin (6)
Hepes
0,91
0,06
7,02
10
Caproyl-Methionin (4)
5 % Methanol
9,11
0,38
4,15
1
Caproyl-Methionin (4)
5 % Methanol
0,91
0,09
10,37
10
Palmitoyl-Methionin (4)
10 % Methanol
7,10
0,49
6,92
2,5
Palmitoyl-Methionin (2)
10 % Methanol
2,33
0,22
9,40
1
Palmitoyl-Methionin (6)
10 % Methanol
0,83
0,18
22,13
10
Furyl-Acryloyl-Methionin (2)
5 % Methanol
9,47
0,60
6,30
5
Furyl-Acryloyl-Methionin (2)
5 % Methanol
4,41
0,08
1,84
1
Furyl-Acryloyl-Methionin (4)
5 % Methanol
0,86
0,03
3,97
N-Trifluoroacetyl-L-Methionin
5 % Methanol
0,76
0,03
4,15
5 % Methanol
0,08
0,04
44,16
20
(2)
1
N-Trifluoroacetyl-L-Methionin
(2)
89
6 Anhang
6.3
90
SOP Acylase 1-Ninhydrin-Assay
90
6 Anhang
91
91
6 Anhang
92
92
6 Anhang
93
93
6 Anhang
94
94
6 Anhang
6.4
95
Acylase-Assay Anleitung Sigma
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/General_Information/acyl
ase_i_-_colorimetric.Par.0001.File.dat/acylase_i_-_colorimetric.pdf
Aufgerufen am 8. August 2010, 11.54 Uhr
95
6 Anhang
96
96
6 Anhang
97
97
6 Anhang
98
98
6 Anhang
99
99
6 Anhang
6.5
100
Matlab Code für Polynominterpolation
%Input
x=[0.01
0.0125
0.044444444
0.016666667
0.05
0.066666667
0.025
0.033333333
0.1
0.111111111
0.036363636
0.04
0.125
0.142857143
1.214256038
1.275782321
0.166666667 0.2 0.25 0.333333333 0.4 0.5 1 2 4];
y=[0.887121896
0.903376739
1.000655352
1.34870808 1.510245396 1.573578005 1.704559005 2.11483381 3.102249296
3.531251043
4.041432545
4.805737341
5.594863574
6.789979456
8.241067248
10.67512312
12.31761388
16.38618365
31.05589713
61.05865095 105.973784919978];
f = polyfit(x,y,1) %Polynom ersten Grades
Steigung=f(1);
Schnittpunkty=f(2);
vmax=1/Schnittpunkty
Km=vmax*Steigung
%Output
f=
27.1677
1.0678
vmax =
0.9365
Km =
25.4422
100
6 Anhang
6.6
101
Enzym
Name
Artikelnummer
Lot-Nummer
Acylase 1, Grade 1, From
A3010
074K0731
Porcine Kidney
17
Bezugsquelle
(3450
units/mg solid) und
077K1147
(3442
units/mg) solid
17
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
Es wurden zwei unterschiedliche Chargen verwendet, die sich in der Aktivität unterscheiden. Beim
Lösen wurde das Volumen entsprechend angepasst, sodass die Standard-Enzymaktivität konstant
bleibt.
101
6 Anhang
6.7
102
Als Substrate getestete Substanzen
Name
Artikelnummer Lot-Nummer
Bezugsquelle
2-Methylbutyrylglycin
7425
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
2-Methylvaleroylglycin
Dept. Química Organíca,
Universidad Autónoma de
Madrid, E
3-Methylcrotonylglycin
Dept. Química Organíca,
Universidad Autónoma de
Madrid, E
3-Ureidopropionat (N-
94295
1150712
Carbamoyl-β-Alanin)
Acetaminophen
Louis, Missouri, USA
190091
4792D
(Paracetamol)
Acetylglycin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
1016
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Acryloylglycin
Dept. Química Organíca,
Universidad Autónoma de
Madrid, E
Arachidonylglycin
90051
139486
Cayman Chemical, Ann Arbor,
Michigan, USA
Aspartam
47135
LB47114
Supelco, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
Butyrylglycin
7418
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Caproyl-Methionin-OH
E-3495
520425
Bachem AG, Bubendorf, CH
Chloramphenicol
23275
1336461
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
Dimethyloxallylglycin
71210
178096-
Cayman Chemical, Ann Arbor,
197832
Michigan, USA
Formyl-Valin-OH
E-1855
1007732
Bachem AG, Bubendorf, CH
Furyl-Acryloyl-Glycin-OH
M-1360
543008
Bachem AG, Bubendorf, CH
102
6 Anhang
Furyl-Acryloyl-Methionin-
103
M-2400
524726
Bachem AG, Bubendorf, CH
OH
Heptanoylglycin
1090
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Hexanoylglycin
1002
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Isobutyrylglycin
1013
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Isovalerylglycin
1065
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Melatonin
63610
1208354
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
Myristoyl-Glycin-OH
F-2550
123151
Bachem AG, Bubendorf, CH
N-(2-Furoyl)-Glycin
407143
18629HC
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-(3-Oxooctanoyl)-L-
O 1764
037K3776
Homoserin-Lakton
N-(Trifluoroacetyl)-DL-
Missouri, USA
S652644
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Aspartat
N-(β-Ketocaproyl)-L-
Missouri, USA
K 3007
102K3851
Homoserin-Lakton
N-Acetyl-5-
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
A 1824
066K4060
Hydroxytryptamin
N-Acetyl-D-Alanin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
150226
6815B
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Acetyl-D-Methionin
88616
426638/1
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
N-Acetyl-DL-Alanin
A-4500
94C-0230
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-DL-Allylglycin
A7637
085K5015
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-DL-
A5625
Asparaginsäure
N-Acetyl-DL-
A 8875
064K0663/12
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
2C-0890
Missouri, USA
A7866
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
103
6 Anhang
104
Glutaminsäure
N-Acetyl-DL-Methionin
Missouri, USA
100113
3595H
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Acetyl-DL-
A4001
20F-0400
Phenylalanin
N-Acetyl-DL-Serin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
A 2638
054K0744
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-DL-Tryptophan
A6251
108H1436
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-L-Alanin
150227
5120H
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Acetyl-L-
´00920
1228730
Asparaginsäure
N-Acetyl-L-Cystein
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
A7250
034K0604
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-L-
A-9000
91F-0313
Glutaminsäure
N-Acetyl-L-Leucin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
01260
B 918178
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
N-Acetyl-L-Methionin
154705
R13271
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Acetyl-L-Phenylalanin
A4126
028H119
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-L-Tryptophan
100147
8240E
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Acetyl-L-Tyrosin
A2513
012K0890
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetyl-L-Valin
A6895
032K1310
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Acetylprocainamid
A-5513
125H3607
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Benzoyl-DL-Methionin
B1754
055F0344
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Benzoyl-DL-
B1879
30C-1690
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
104
6 Anhang
105
Phenylalanin
N-Benzoyl-L-Glutamat
Missouri, USA
100111
9773H
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Benzoyl-Valin-OH
E-2540
560783
Bachem AG, Bubendorf, CH
N-Benzoylglycin
296
6168581
Merck KGaA, Darmstadt, D
N-Butyryl-DL-
10942
393193/1
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Homocystein-Lakton
Louis, Missouri, USA
N-Butyryl-DL-Homoserin- 09945
1273030
Lakton
N-Carbamoyl-L-Glutamat
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
C-4375
51K5010
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Chloroacetyl-L-
C-1503
36F-0021
Phenylalanin
N-Chloroacetyl-L-
Missouri, USA
C-1753
96C-03571
Tryptophan
N-Chloroacetyl-L-Tyrosin
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
C-1878
52H0570
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Chloroacetyl-L-Valin
C-2253
125F0637
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Dodecanoyl-DL-
17247
1178821
Homoserin-Lakton
N-Formyl-L-Alanin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
151163
4278F
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Formyl-L-Leucin
151167
151167
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Formyl-L-Methionin
F3377
076K1344
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Formyl-L-Phenylalanin
151171
151171
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Formyl-L-Tyrosin
F9751
026H0166
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
N-Formylglycin
151164
3694F
MP Biomedicals, Solon, Ohio,
USA
N-Heptanoyl-DL-
10939
1244270
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
105
6 Anhang
106
Homoserin-Lakton
N-Hexanoyl-DL-
Louis, Missouri, USA
09926
1104555
Homoserin-Lakton
N-Octanoyl-DL-
Louis, Missouri, USA
10940
1190713
Homoserin-Lakton
N-TFA-L-Methionin-
T-4011
14H7702
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
P1162
096K5212
Hydroxysuccinimidester
Palmitoyl-L-Methionin
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
Methylester
Palmitinsäure-N-
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
E-3365
513818
Palmitoylglycin
Bachem AG, Bubendorf, CH
Eigensynthese
Phenylacetyl-Glycin-OH
F-2625
Phenylpropionylglycin
1005
536815
Bachem AG, Bubendorf, CH
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Propionylglycin
1010
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Retinoylglycin
Suberylglycin
Dr. R. Rühl, Debrecen, Ungarn
7441/1091
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Tiglylglycin
7415
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
Trans-N-(2-
40,840-9
05406MF
Furfurylideneacetyl)-
Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
Missouri, USA
Glycin
Ureidosuccininsäure (N-
94290
Carbamoyl-DL-Aspartat)
Valerylglycin
436095/1
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., St.
Louis, Missouri, USA
1014
VU Medical Center, Metabolic
Laboratory, Amsterdam, NL
106
6 Anhang
6.8
107
Weitere Reagenzien
Name
Artikelnummer Lot-Nummer
Bezugsquelle
Citronensäure-
C1909
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
027K0122
Monohydrat
Missouri, USA
Ninhydrin
G115562
036
Merck KGaA, Darmstadt, D
Ethylen Glycol
K12460359
924
Merck KGaA, Darmstadt, D
31669
70510
Honeywell Riedel-de Haën AG,
Monomethyl Ether
Zinn-II-Chlorid Dihydrat
Seelze, D
1-Propanol
K25362497
847
Merck KGaA, Darmstadt, D
Hepes
104K5418
H3375
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
107
6 Anhang
6.9
108
Für verschiedene Eichgeraden verwendete Substanzen
Name
Artikelnummer Lot-Nummer
Bezugsquelle
(1S,2S)-2-Amino-1-(4-
471674
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
05921HE
nitro-phenyl)-1,3-
Missouri, USA
propandiol
4-Aminophenol
A6161
114K2608
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
5-Methoxytryptamin
28,658-3
S28166-327
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
D-Glucosamin-
22670
Serva Electrophoresis GmbH,
Hydrochlorid
Glycin
Heidelberg, D
G-7126
607-0275
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
G-7126
086K0033
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
L-Alanin
1007
L-Asparaginsäure
14170
9616869
Merck KGaA, Darmstadt, D
Serva Electrophoresis GmbH,
Heidelberg, D
L-Cystein
1.028.380.025
K32296038
Merck KGaA, Darmstadt, D
L-Glutaminsäure
G-1251
129C-0212
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
L-Homoserin
53600
1118183
Fluka, Sigma-Aldrich, Inc., San
Louis, Missouri, USA
L-Homoserin-Lakton-
H7890
104K5008
Hydrochlorid
L-Leucin
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
L-8000
79C-0312
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
L-Methionin
M-9625
109C-0336
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
L-Phenylalanin
7256
5229101
Merck KGaA, Darmstadt, D
L-Trytophan
T-8941
063K0381
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
108
6 Anhang
109
L-Valin
8459
4127444
Merck KGaA, Darmstadt, D
Serotonin-Hydrochlorid
460559
19018LE
Sigma-Aldrich, Inc., San Louis,
Missouri, USA
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Danksagung
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Danksagung
Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei:
meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Jörn Oliver Sass für die Überlassung des
spannenden Themas und die stets unkomplizierte und aufschlussreiche fachliche Unterstützung während der Arbeit
allen Mitarbeitern des Labors für Klinische Biochemie und Stoffwechsel, insbesondere Frau M. Walter, Frau M. Fernando, Herrn S. Behringer und Herrn D.
Zloporubovic für die Einweisung und die Unterstützung bei der Laborarbeit, die
zahlreichen kleinen und großen Hilfestellungen sowie die tolle Zeit inner- und
außerhalb des Labors
bei Sebastian Haller für die Motivation und die Hilfe bei der Formatierung
und natürlich ganz besonders bei meiner Familie, ohne deren Unterstützung
mein Studium und diese Dissertation nicht möglich gewesen wären.
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Die Seite XVI (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb
nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung.
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