Skript zum Praktikum
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Zentrum für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie Universitätsklinikum Gießen und Marburg Standort Marburg Praktikum der Medizinischen Mikrobiologie für Studierende der Zahnmedizin Altes Hygieneinstitut am Pilgrimstein Wintersemester 2016-17 Kursleitung: Dr. Claudia Nonnenmacher Kursorganisation: Ingrid Nau ([email protected]) 2 Inhaltsverzeichnis Seite Kurstag Kursplan Verhaltensregeln Händedesinfektion 3 4 5 1 Abschnitt I: Bakteriologie A. Mikroskopieren, Kultivieren Färben und Identifizieren von Bakterien Übung 1: Mikroskopie (Lebendbeobachtung) von Bakterien Übung 2: Kultivierung von Bakterien Übung 3: Färben und Identifizierung von Bakterien 6 9 10 1 1 2/3 B. Bakterienflora der Umwelt Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens 16 18 2/3 2/3 C. Normale Bakterienflora des Menschen Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen Übung 9: Abgrenzung von S.aureus geg. anderen Mikrokokken Übung 10: Optochin-Test zur Identifizierung von S.pneumoniae Übung 11: Technik der Neisserfärbung Übung 12: Technik der Kinyoun-Färbung 20 22 24 26 28 29 30 4/5 4/5 4/5/6 5 5/6 6 6 D. Temperaturresistenz und Austestung von Antibiotika Übung 13: Sterilitätskontrolle Übung 14: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) Übung 15: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (MHK) 31 32 34 6/7 7/8 7/8 35 8 9 Abschnitt III Parasitologie Übung 17: Parasitologie 43 10 Anhang 44 Abschnitt II: Hygiene Übung 16: Wasserhygiene Wasserhygiene Sicherheitsbelehrung nach UVV Biotechnologie, Arbeitssicherheit, Unfallverhütung und Hygieneunterweisung Der/die Beschäftigte bestätigt mit seiner/ihrer Unterschrift auf der Anwesenheitsliste die Teilnahme an der Unterweisung 3 Kurstag → 1 2 3 4 5 3 X X 4 X X 5 X X 6 X X 7 X X 8 X X 6 7 8 9 10 Übung ↓ 1 X 2 X 9 X 10 X X X 11 X 12 X 13 X X 14 X X 15 X X 16 17 X X X 4 Verhaltensregeln zum Schutz vor Infektionen Während des Kurses besteht eine nicht vollständig vermeidbare, geringe Infektionsgefahr. Um ein unnötiges Risiko zu vermeiden ist deshalb jeder zu peinlichster Sauberkeit und Ordnung am Arbeitsplatz verpflichtet. (Es bestehen gesetzliche Vorschriften über das Arbeiten mit Krankheitserregern; siehe Infektionsschutzgesetz vom Juli 2000). Während der Kursstunde ist ein Kittel zu tragen. Für die Oberkleidung stehen Spinde zur Verfügung. Hautwunden an den Fingern sind durch einen Verband (Pflaster) zu schützen. Essen, Trinken und Rauchen sind im Kurssaal zu unterlassen. Lebensmittel sollen nicht mit in den Kurssaal genommen werden. Vor und unmittelbar nach Gebrauch ist die Öse abzuflammen. Verunreinigte und infizierte Objektträger, Pipetten und sonstige Materialien sind ohne Verzug in die Glasbehälter mit Desinfektionsmittel zu legen. Verunreinigungen der Hände, Kleidung oder des Arbeitsplatzes mit Erregern müssen sofort einem(r) Kursassistenten(in) zur Einleitung der Desinfektion gemeldet werden. Besondere Desinfektionsmaßnahmen sind unverzüglich einzuleiten, wenn Erreger in Hautwunden, den Mund oder das Auge eingebracht wurden. Vor Verlassen des Kurssaales muss eine sorgfältige Händedesinfektion erfolgen: Die Hände sind 2-3 min mit 5-8 ml Schnelldesinfektionsmittel aus den Wandspendern bis zur Trocknung einzureiben (Nagelspalte nicht vergessen), danach unter steter Zufuhr von warmen Wasser einzuschäumen und abzuspülen. Die Teilnahme am Mikrobiologischen Praktikum, zu dem auch die theoretische Einführung gehört, wird durch Anwesenheitskontrolle überprüft. Bei unentschuldigtem Fehlen ist die Scheinvergabe in Frage gestellt. Das Bestehen der Abschlussklausur ist Voraussetzung für die Scheinvergabe! Technische Hinweise Die Grundausstattung jedes Arbeitsplatzes umfasst ein Mikroskop mit Okular (8-10x) und mehreren Objektiven, darunter ein schwächeres (10x) und ein stärkeres (45x) Trockensystem sowie ein Immersionsobjektiv (90-100x), ferner eine Flasche mit Immersionsöl, einen Halter mit Platinöse, Platinnadel und Pinzette, plane und Hohlgeschliffene Objektträger sowie Deckgläser (18 x 18mm2), einen Bunsenbrenner, ein Glasgefäß mit Desinfektionslösung, ein Färbegestell über dem Abguss sowie Farblösungen, einem Reagenzglasständer und einem Filzstift. Für besondere Übungen werden die jeweils erforderlichen Geräte und Materialien ausgegeben. Jeder Kursteilnehmer ist für das ihm an seinem Arbeitsplatz überlassene Arbeitsgerät verantwortlich; dessen Verlust oder Beschädigung ist sofort der Kursleitung zu melden. Präparate und Kulturen dürfen auf keinen Fall aus dem Kurssaal entfernt werden. Die Kittel sind für die Kursdauer im BMFZ zu belassen; Wertgegenstände sind herauszunehmen. Im Erdgeschoß stehen zu diesem Zweck Spinde zur Verfügung, diese werden am Ende des Semesters geöffnet und der Inhalt nicht länger als 3 Monate aufbewahrt. Es ist darauf zu achten, dass die Bunsenflamme zum Gebrauch entleuchtet wird. Nach Gebrauch ist sofort auf Sparflamme umzustellen. Der Hahn muss rasch geschlossen werden, da sonst ein Rückschlag der Flamme eintritt. Achte auf die offene Flamme (Labormäntel, offenes Haar)! Ein Verschütten von Farblösungen ist tunlichst zu vermeiden. Farbflecke an den Händen lassen sich mit Desinfektionslösung entfernen. Nach Beendigung der Kursstunde sind die Arbeitsplätze wieder aufzuräumen. Das Immersionsobjektiv ist mit einem Leinenläppchen vom Immersionsöl zu säubern, Farbstoff-Flaschen und Schalen sind zu schließen. Abfälle, wie Streichhölzer, Papierschnipsel, Glasscherben usw. gehören nicht in die Färbebecken, sondern in die Abfalleimer. Vor Verlassen der Arbeitsplätze müssen Bunsenbrenner, Mikroskoplampen und Wasserhähne ausgestellt werden. 5 Händedesinfektion Begriffserklärung: Ziel der Klinikhygiene ist die Verhinderung nosokomialer Infektionen. Dies sind Infektionen, die im Rahmen der stationären oder auch ambulanten Behandlung im Krankenhaus selbst erworben werden. Unter Desinfektion versteht man die Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung von Krankheitserregenden Mikroorganismen (DIN 58 949) an und in kontaminierten Objekten. Erfasst werden vegetative Keime einschließlich Mykobakterien sowie Pilze (Wirkbereich A), Viren (Wirkbereich B) und Milzbrandsporen (Wirkbereich C). In der Regel wird eine Keimreduktion um 3-5 LogStufen (99,9 – 99,999%) erreicht. Zur Abtötung von Sporen der Erreger von Gasbrand oder Wundstarrkrampf (Wirkbereich D) müssen Sterilisationsverfahren angewandt werden. Sterilisation bedeutet das Abtöten bzw. das irreversible Inaktivieren aller vermehrungsfähigen Mikroorganismen (DIN 58 900). Bei der Sterilisation werden auch Bakteriensporen erfasst. Dies ist nicht gleichbedeutend mit Keimfreiheit, da tote Keime bzw. Bestandteile von Keimen vorhanden sein können: Toxine Polysaccharide Lipopolysaccharide (LPS) Bakterielle DNA Die hygienische Händedesinfektion dient der Keimverminderung und soll das Personal vor Infektionen schützen, sowie eine Weiterverbreitung von Krankheitserregern entgegenwirken. Erfasst wird die transiente Flora. Um die Keimverbreitung kontaminierter Hände zu verhindern, wird vor dem Waschen desinfiziert. Vorschrift Händedesinfektion: Entnahme des Desinfektionsmittels aus dem Spender durch Betätigung des Hebels mit dem Ellbogen, um Kontamination des Spenders zu vermeiden. - Nur trockene Hände desinfizieren! (Verdünnungseffekt) - Mindestens 3 ml (1-2 Hübe) Desinfektionsmittel bis zur Antrocknung in die Hände einreiben. - Hände waschen, abtrocknen (Einmalhandtuch), eincremen (Hautschutz) Die chirurgische Händedesinfektion soll Keime der Hautoberfläche und solche, die in der Haut angesiedelt sind, abtöten. Nicht kontaminierte Hände werden nach dem Waschen desinfiziert. Nicht selten kommt es bei Handschuhen zu Mikroperforationen, deshalb ist nach dem Tragen der Handschuhe eine Händedesinfektion sinnvoll. Händedesinfektion muss im mikrobiologischen Labor immer durchgeführt werden! Aufgabe: Kontrolle der hygienischen Händedesinfektion - Durchführung der hygienischen Händedesinfektion mit einem speziell präparierten Mittel - Betrachtung und Beurteilung der Verbreitung des Desinfektionsmittel unter einer Fluoreszenzlampe - Abwaschen der Farbstoffreste mit Seife und Wasser - Eincremen der Hände 6 Abschnitt I: Bakteriologie A. Mikroskopie, Kultivierung, Färben und Identifizierung von Bakterien Kurstag 1 Übung 1: Mikroskopieren von Bakterien im ungefärbten Präparat Die lichtmikroskopische Untersuchung steht am Anfang jeder bakteriologischen Untersuchung, sie ist, auch für Reinheitskontrollen, unentbehrlich. Form und Größe sowie Eigenbeweglichkeit der Bakterien können einfach beurteilt werden. Die Größe der Bakterien bewegt sich im Bereich des Auflösungsvermögens eines Lichtmikroskops, deshalb ist immer zur exakten Beurteilung die Ölimmersionstechnik notwendig. Die direkte Mikroskopie lebender, unfixierter Keime hat vor allem die Kontrastarmut der Objekte (Bakterien) zu überwinden. Dies kann durch spezielle Beleuchtungstechniken (Phasenkontrast, Dunkelfeldmikroskopie) erreicht werden. Aber auch im normalen Durchlichtmikroskop können ungefärbte Objekte beurteilt werden. Dazu stehen zwei Methoden zur Verfügung: Deckglaspräparat „Hängender Tropfen“. Ungefärbte Lebendpräparate werden bei gesenktem Kondensor und geschlossener Kondensorblende beobachtet. Zuerst wird mit einer schwachen Vergrößerung (10er Objektiv) der Tropfenrand gesucht und scharf eingestellt. Danach schwenkt man das 40er Objektiv ein. Den hängenden Tropfen betrachtet man mit dem 100er Ölimmersionsobjektiv und mit geschlossener Blende. Form und Größe Kokken Erythrozyt Diplokokken in Haufen in Ketten Keulen Hefezellen Stäbchen 5 µm Schrauben Stäbchen mit zentraler Endospore Beweglichkeit Flüssigkeitsstrom (eine Richtung) Brown'sche Molekularbewegung aktive Eigenbewegung 7 Technische Durchführung Sterile Materialentnahme aus einem Kulturröhrchen Durchführung: Vor Entnahme der Probe das Kulturröhrchen aufschütteln! Öse schräg halten, in der Gasflamme ausglühen, erkalten lassen Verschluss des Röhrchens mit dem kleinen Finger der rechten Hand abnehmen, nicht in offenes Röhrchen atmen! Röhrchenrand abflammen Mit der Öse Material entnehmen Röhrchenrand abflammen Röhrchen verschließen Das in der Öse enthaltene Material auf Objektträger aufbringen Öse ausglühen Ausglühen der Impföse Herstellung eines "Deckglaspräparates" für Nativ- oder Lebendpräparate: Durchführung: Mit der Öse aus dem Kulturröhrchen die Probe entnehmen und auf den Objektträger bringen Tropfen mit einem Deckglas bedecken Mikroskopie: 40er Objektiv, Blende schließen Herstellung eines "Hängenden Tropfens" unter Verwendung eines Hohlschliffobjektträgers Durchführung: Höhlung eines Hohlschliffobjektträgers dünn mit Vaseline umranden Mit der Öse auf die Mitte eines Deckglases einen kleinen Tropfen der Probe bringen Den vorbereiteten Hohlschliffobjektträger mit der Höhlung nach oben, Vaselinerand nach unten, auf das materialbeschickte Deckglas auflegen Umdrehen des Objektträgers, so dass das Deckglas oben liegt und das zu untersuchende Tröpfchen frei in der durch den Hohlschliff gebildeten und luftdicht abgeschlossenen feuchten Kammer hängt Hängender Tropfen Deckglas Vaseline Hohlschliffobjektträger Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion 8 Aufgabe Übung 1: Mikroskopieren (Lebendbeobachtung) von Bakterien 1. Herstellen eines Deckglaspräparates aus den Bouillonkulturen: Röhrchen a = Hefezellen Röhrchen b = Erythrozyten Röhrchen c = Pseudomonas fluorescens (gramneg. Stäbchen) Röhrchen d = Staphylococcus epidermidis (grampos. Kokken) Mikroskopie: 10er und 40er Objektiv 2. Herstellen eines „Hängenden Tropfens“ aus den Röhrchen c und d Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion Protokollieren der Ergebnisse Protokoll Übung 1: Lebendbeobachtung von Bakterien Form, Größe Deckglaspräparat von a Deckglaspräparat von b Deckglaspräparat von c Deckglaspräparat von d Deckglaspräparat vom Testkeim Hängender Tropfen von c Hängender Tropfen von d Hängender Tropfen vom Testkeim Beweglichkeit 9 Übung 2: Kultivieren von Bakterien Bakterien können in Flüssigkulturen und in semisoliden Agarnährmedien kultiviert werden. Die Anzüchtung auf Agarnährmedien bietet den Vorteil, einzelne Kolonien zu erhalten. Damit kann eine Keimisolierung aus einem Keimgemisch erreicht werden. Man unterscheidet Optimal-, Selektiv- und Differentialnährmedien. Ein Optimalnährboden bietet für sehr viele unterschiedliche Bakterien gute Wachstumsbedingungen (Beispiel: Blutagar). Ein Selektivnährboden lässt aufgrund von Zusätzen nur das Wachstum einiger Bakterienspezies zu (z.B. McConkey Agar zum selektiven Wachstum von gram-negativen Enterobacteriaceae). Ein Differentialnährboden macht bestimmte Stoffwechselleistungen oder Produkte von Bakterien sichtbar (z.B. Hämolyse auf Blutagar, Laktoseverstoffwechslung auf McConkey Agar). Darüber hinaus sind viele Bakterien durch ihre typische Koloniemorphologie erkennbar (z.B. schleimiges Wachstum von Klebsiella, schwärmendes Wachstum von Proteus, raues Wachstum von Bazillus). Technische Durchführung Beimpfung von Flüssigkulturen führung: Mit ausgeglühter und wieder erkalteter Öse die Bakterien aufnehmen Durch Schräghalten der Flüssigkulturen werden die Bakterien in den oberen Bereich der Flüssigkeit gebracht und dort verteilt Öse wieder ausglühen. DurchA Beimpfen flüssiger Medien an der Wand einreiben Fraktionierte Beimpfung der Nährbodenoberfläche mit der Öse Durchführung: Nach dem Ausglühen und Abkühlen der Öse wird ein Tropfen aus einem flüssigen Nährmedium, bzw. eine Kolonie von einer Bakterienkultur entnommen und auf der Hälfte der Agaroberfläche in engen, serpentinenartigen Impfstrichen verteilt. Anschließend wird die Öse wieder ausgeglüht. Mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse berührt man das bereits vorher beimpfte Feld und streicht dann ein Viertel der Agaroberfläche aus. Das gleiche wird noch ein zweites Mal durchgeführt. Beim Beimpfen der Agaroberfläche ist zu beachten, dass die Öse nur ganz leicht und locker auf dem geleeartigen Nährboden gleiten und die Agaroberfläche nicht verletzen wird. Die beimpften Agarplatten sind mit dem Deckel nach unten auf den Arbeitsplatz abzulegen. Durch diese sog. „fraktionierte Aussaat“ erreicht man verschiedene Bakterienkonzentrationen auf der Agaroberfläche und damit auch unterschiedlich dichtes Bakterienwachstum, was die Voraussetzung für das Anlegen von Reinkulturen ist. 3 Ö s e n a u s s tric h 1 . A u ss tric h Ö s e w e c h se ln 2 . A u ss tric h Ö s e w e c h se ln 3 . A u ss tric h S ch rä g h a lte n d e r A g a rp la tte B e sc h riftu n g a u f d e r N ä h rb o d e n se ite ! Aufgabe Übung 2: Kultivieren von Bakterien Ausstreichen des Testkeims auf: - Blutagar - MacConkey-Agar - Peptonagar Kulturen mit der Platznummer beschriften! Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet, am nächsten Kurstag weiter bearbeitet. 10 Kurstag 2 Übung 3: Färben und Identifizieren von Bakterien Färben von Bakterien Die Anfertigung und Beurteilung gefärbter Präparate gehört zu den wichtigsten Fertigkeiten, die in diesem Kurs vermittelt werden sollen. Ein Präparat ist die schnellste und kostengünstigste Methode eines Keimnachweises. Die Unterscheidung von grampositiv und gramnegativ hat nicht nur systematische Bedeutung, sondern ist auch ganz entscheidend für die Auswahl von Antibiotika für eine initiale Therapie. Bakteriologische Färbungen: Für Färbungen stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Man unterscheidet Einfachfärbungen, die zur Kontrastverstärkung dienen, von Differentialfärbungen, die besondere Eigenschaften von Bakterien nachweisen. Beispiel von Einfachfärbungen ist die Methylenblaufärbung, für Differentialfärbungen die GramFärbung, die Kinyoun-Färbung (Ziehl-Neelsen-Färbung) und die Neisserfärbung. Beim Mikroskopieren von gefärbtem Untersuchungsmaterial sind ggf. weitere Punkte zu berücksichtigen wie z. B.: sonstige Gebilde (Zellkerne, Epithelien, Leukozyten, Zelldetritus), die Lagerung von Bakterien und Körperzellen zueinander, die ungefähre Menge der Bakterien pro Blickfeld (vereinzelt, mäßig viel, reichlich, massenhaft). Technische Durchführung Herstellen eines Färbepräparates Durchführung: Von Bakterienkolonien auf der Agarplatte: Auf einem sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse ein Wassertröpfchen bringen. Mit einer in gleicher Weise sterilisierten Öse sehr wenig Bakterienmasse aus einer Kolonie aufnehmen. Die Bakterienmasse an den Rand des Wassertröpfchens aufbringen und von dort in dieses homogen einreiben und das Tröpfchen ausbreiten. Von Suspensionskultur (Flüssigkultur): Flüssigkultur aufschütteln, auf einen sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse einen Tropfen Kulturmaterial bringen und verteilen. Präparat lufttrocknen lassen (Keine Trocknung in der Flamme!) Hitzefixierung: Objektträger (Schichtseite nach oben) 3x durch die blaue Flamme des Brenners ziehen Gramfärbung (Differenzialfärbung) Durchführung: Präparat Hitzefixieren Karbol-Gentianaviolett-Lösung Lugolsche Lösung Entfärben mit 96%igem Alkohol Abspülen mit Leitungswasser Gegenfärbung Safraninlösung Abspülen mit Leitungswasser Trocknen zwischen Filterpapier Mikrokopie: 100er Objektiv, Ölimmersion 3 Minuten 2 Minuten einige Sekunden 1 - 2 Minuten Beurteilung: Grampositive Bakterien = blauschwarz, Gramnegative Bakterien = rot 11 Identifizieren von Bakterien Identifizierung von Bakterien durch Bestimmung biochemischer Merkmale Biochemische Leistungen von Enzymen des Kohlehydrat- (Zuckerspaltung) und Aminosäurestoffwechsels (z.B. Decarboxylasen, Desaminasen) können durch Farbumschläge spezieller Indikatoren in sichtbar gemacht werden. Indikatoren sind entweder bereits in den Wachstumsmedien enthalten oder werden nachträglich zugegeben. Einige Teste können auch direkt mit isolierten Bakterienkolonien durchgeführt werden: Technische Durchführungen und Beurteilung der Reaktionen Beurteilung der Primärkulturen: Beschreibung des Wachstums auf den Kulturen von Pepton-, Blut-, MacConkey-Agar (Vorschläge dazu im Protokoll „Ergebnisse der kulturellen und biochemischen Prüfung“). Oxidase-Reaktion (Nadi-Oxidase): Die Chromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette. Die positive Oxidase-Reaktion korreliert mit einem relativ hohen Gehalt an c-typischen Cytochromen. Durchführung: Eine Kolonie wird mit der Öse auf einem farblosen Oxidase-Testfeld verrieben. Positiv: Intensive Blaufärbung nach wenigen Sekunden. Katalase-Reaktion: Katalasebildende Bakterien spalten Wasserstoff, wobei der freiwerdende Sauerstoff zu einer Bläschenbildung führt. Katalase-positive Keime besitzen stets auch andere Hämenzyme, insbesondere ein Cytochrom-System, katalase-negative Keime sind meist cytochromlos. Durchführung: Einige Kolonien werden auf einen Objektträger übertragen, anschl. 2-3 Tropfen KatalaseReagenz (3%ige H2O2) dazugeben. Positiv: Sofortige Bläschenbildung Glucose-Medium: Säurebildung nach Kohlehydratabbau Es wird geprüft, ob Glucose unter aeroben Bedingungen, wie sie im flüssigen Glucosemedium herrschen (oxydativ), abgebaut werden kann. Der Indikator Bromthymolblau zeigt im positiven Fall einen Farbumschlag an. Das Glucosemedium enthält ferner ein DURHAM-Röhrchen zum Auffangen von Gas, das während des fermentativen Kohlenhydratabbaues entstehen kann. Durchführung: Glucose-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten. Beurteilung: Säurebildung positiv: Umschlagen des Indikators von blau nach gelb Gasbildung positiv: Gasblase im Durhamröhrchen Zitratverwertung: Das Substrat enthält als alleinige Kohlenstoffquelle Zitrat und als alleinige Stickstoffquelle ein Ammoniumsalz. Keime, die mit beiden Substanzen ihren Stoffwechsel bestreiten können, wachsen in diesem Medium. Die entstehende Alkalisierung führt zur Trübung des Mediums. Durchführung: Zitrat-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten. Positiv: Wachstum und Indikatorfarbumschlag nach blau 12 Nitratreduktionstest: Bei Vorhandensein des Enzyms Nitratreduktase wird Nitrat zu Nitrit und ggf. weiter zu Ammoniak oder molekularem Stickstoff reduziert. Entstandenes Nitrit kann durch das Griess-Reagenz (Sulfanilsäure + Alpha-Naphthalin) nachgewiesen werden. Wird Nitrat nur bis Nitrit reduziert, wird die Reaktion mit dem Griess-Reagenz positiv (Rotfärbung). Erfolgt eine weitergehende Reduktion, wird Nitrit vollständig zu Ammoniak und N2 reduziert, als Folge wird die Griess-Reaktion negativ. Eine negative Griess-Reaktion kann daher durch ein Fehlen der Nitratreduktase (keine Nitratreduktion) oder durch eine vollständige Reduktion von Nitrat zu Ammoniak oder elementaren Stickstoff verursacht werden. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wird Zinkstaub zu der Reaktion hinzu gegeben. Zinkstaub reduziert Nitrat ebenfalls zu Nitrit. Tritt nach Zugabe von Zinkstaub eine Rotfärbung auf heißt dies, dass Nitrat noch vorhanden war, als keine bakterielle Nitratreduktase vorlag (Negative Reaktion). Erfolgt nach Zinkstaubzugabe keine Rotverfärbung, bedeutet dies, dass das Nitrat vollständig reduziert wurde (Positive Reaktion). Prinzip: Nitrat Nitratreduktase → Nitrit Zinkstaub → Ammoniak, Stickstoff ↑ Nachweis durch Griess-Reagenz Durchführung: Nitrat-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten. Beurteilung Nitratreduktionstest: Gasbildung: (Gasblase im Durham-Röhrchen) Alkalisierung: (Messung mit pH-Indikatorstäbchen) Anschl. einige Tropfen des Griess-Reagenz hinzufügen und ca. 5 Minuten warten. Rotfärbung: Positiv Tritt Keine Verfärbung auf: wird eine kleine Spatelspitze Zinkstaub in das Röhrchen gegeben. Tritt jetzt eine Rotverfärbung auf: negatives Ergebnis. Farblosigkeit bleibt: positives Ergebnis Kligler-Agar (Zwei-Zucker-Eisen-Agar): Durch den Gehalt an Glukose (0,1%), Laktose (1%), Phenolrot und Eisen-II-Sulfat ermöglicht der Kligler-Agar die gleichzeitige Erkennung mehrerer biochemischer Leistungen. Bei alleinigem Abbau der in limitierten Mengen vorhandenen Glukose kommt es nach 6 Stunden zur Säuerung (fermantativ) und zum Indikatorfarbumschlag (von rot nach gelb) der Agarschrägfläche und der Hochschicht. Durch aeroben Abbau von Proteinen wird bei weiterer Bebrütung im Schräganteil eine Realkalisierung bewirkt, in deren Folge der Indikator wieder umschlägt (von gelb nach rot). Bei Abbau der in großen Mengen vorhandenen Laktose findet die Realkalisierung nicht statt. Durchführung: - Impfnadel ausglühen und erkalten lassen C Beimpfen Schräg- Mit Impfnadel Bakterienkolonie aufnehmen Stichagarmedien (Kligler) - Impfnadel tief in den Agar einstechen - Impfnadel aus der tiefen Agarschicht ziehen und dabei zickzackförmig auf der Agarschrägfläche ausstreichen 1. - Impfnadel ausglühen 3. 16-24h bei 37°C bebrüten. 2. Beurteilung: Schrägfläche rot, Hochschicht gelb: Schrägfläche gelb, Hochschicht gelb: Schrägfläche rot, Hochschicht rot: Schwarzfärbung der Hochschicht: Blasen- und Rissbildung: Abbau von Glukose Abbau von Glukose und Laktose kein Abbau von Glukose und Laktose Bildung von H2S Gasbildung beim Glukoseabbau 13 SIM-Agar (Schwefelwasserstoffbildung-Indol-Motilität): Beim SIM-Agar handelt sich es um einen komplexen Agar, der mehrere Leistungen überprüft. Die Agarkonzentration ist so gewählt, dass gerade keine Verflüssigung eintritt. Bewegliche Bakterien beschwärmen diesen Leicht-Agar vollständig, während unbewegliche Bakterien nur am Impfstrich wachsen. B Außerdem wird Bildung von H2S und Indol nachgewiesen. Beimpfen Durchführung: Stichagarmedium - Impfnadel ausglühen und erkalten lassen - Mit Impfnadel eine Bakterienkolonie aufnehmen 1. - Impfnadel tief in den Agar einstechen - Impfnadel rausziehen und ausglühen 16-24h bei 37°C bebrüten 2. Beurteilung: Schwefelwasserstoffbildung (H2S): Positiv: Schwarzfärbung Indol-Bildung: Einige Tropfen Indol-Reagenz (Kovacs Reagenz) zusetzen Positiv: Roter Ring Motilität: Positiv: Homogenes Wachstum = beweglich Negativ: Wachstum nur am Impfstrich = unbeweglich Aufgabe Übung 3: Färben und Identifizieren von Bakterien Färben: 1. Von der Bakterienkultur 1 Färbepräparate herstellen, lufttrocknen, hitzefixieren 2. Präparat nach Gram färben 3. Protokollieren im Protokollblatt Übungen 1-3 Mikroskopie: Objektiv 100er, Blende geöffnet, ohne Deckglas, mit Immersionsöl Identifizieren: 1. Beurteilung der Kulturen und Durchführung der biochemischen Tests (siehe Protokoll) 2. Protokollieren im Protokollblatt Übungen 1-3: 3. Beimpfen einer „Bunten Reihe“ Die Kulturen werden 16-24 h bei 37°C bebrütet, am nächsten Kurstag ausgewertet und der Keim identifiziert. 14 Protokoll Übungen 1-3: Ergebnisse der mikroskopischen, kulturellen und biochemischen Prüfungen Gramverhalten: positiv / negativ Morphologie: Kokken / Stäbchen Kolonieform: (auf Blutagar) Größe: mm im Durchmesser………. Kontur: rund / unregelmäßig / gekerbt / rhizoid /…. Profil: flach / erhaben / konvex / hochkonvex /…. Oberfläche: glatt / glänzend / matt / rau / gestreift/…. Konsistenz (Prüfung mit der Öse): salbenartig / membranös / schleimig Pigmentierung (auf Peptonagar): positiv / negativ Bildung löslicher Farbstoffe: positiv / negativ Katalase (auf Objektträger): positiv / negativ Oxidase (auf Oxidase Testfeld): positiv / negativ Hämolyse (auf Blutagar): positiv / negativ Wachstum auf MacConkey-Agar: positiv / negativ Laktosespaltung (auf MacConkey-Agar) positiv / negativ Kligler-Medium: (Anaerobe Säurebildung) Glukose: Gasbildung: positiv / negativ positiv / negativ Dextrose-Medium: (Aerobe Säurebildung) Glukose: Gasbildung: positiv / negativ positiv / negativ Nitrat-Medium: (Nitrit aus Nitrat) Gasbildung: Alkalisierung: Nitritreduktion: positiv / negativ positiv / negativ positiv / negativ SIM-Agar: Schwefelwasserstoffbildung: (H2S) Indol-Bildung: Motilität: positiv / negativ positiv / negativ positiv / negativ Zitrat-Medium: positiv / negativ 15 Identifizierungsschlüssel für grampositive und gramnegative Bakterien: Klebsiella pneumoniae - - - - - - - Morphologie 1 1 1 1 2 2,4,5 2 2 2 2 2 1 1,2,3, 4 Sporenbildung - - - - + - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - + + + + + + (+) - - - - (+) + - + - + - - gelb weiß - - - - - - rot - - gelb schw arz Oxidase v - - - v + + - - - - + v Katalase + + - - + + + + + + + v Kligler/Säure - - - + V + - + + + + - + Kligler/Gas - - - - - - + - + - Dextrose/Säure V - + + V + V + + + + V - Dextrose/Gas - - - - - V - + V + - Nitrat-Medium V - + - V - + + + + + V - SIM-Agar/H2S - - - - V - - V V V + - V SIM-Agar/Indol - - - V - - - V V V + - V SIM-Agar/ Motilität - - - - - V + V V V + - V Zitrat-Medium - - - - V V + - + + V Aerobes Wachstum Wachstum auf MacConkey Laktosespaltung (auf MacConkey) Pigmentierung Zeichenerklärung: + = positiv - = negativ v = variabel 1 = Kokken 2 = Stäbchen 3 = Keulenform 4 = Fadenform 5 = Schraubenform Schlussfolgerung aus den Ergebnissen der Übungen 1 und 2: Welcher der in der Tabelle aufgeführten taxonomischen Gruppe ist der untersuchte Keim zuzuordnen? ................................................................................. Bacteroidaceae Serratia marcescens - Neisseria Escherichia coli + Proteus vulgaris Pseudomonas + Bacillus sp. + Enterococcus + Streptococcus + Staphylococcus Gramverhalten Biochemische Leistungen Micrococcus Vibrio, Aeromonas Wahrscheinlichste taxonomische Gruppe 16 Kurstag 3 B. Bakterienflora der Umwelt Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld Die atmosphärische Luft hat im Gegensatz zum Erdboden und Wasser keine endogene Bakterienflora. Bakterielle Luftkontaminanten sind an schwebende Staubpartikel oder Flüssigkeitströpfchen gebundene Keime des Erdbodens oder stammen aus der endogenen physiologischen oder pathologischen tierischen Flora (Raumluft). Entsprechendes gilt für die meisten Gebrauchsgegenstände und mit Einschränkung für die äußere Haut des Menschen. Von primären Reservoirs über das Vehikel Luft (aerogene Infektion) oder durch kontaminierte Gegenstände (Schmierinfektion) übertragene Krankheitserreger spielen in der medizinischen Praxis eine erhebliche Rolle. Die Anzahl der übertragenen Keime steht dabei in der Regel in einem direkten Verhältnis zu der Wahrscheinlichkeit einer Infektion. Es gibt eine große Anzahl von Verfahren zur Luftkeimzahlbestimmung nebst unzähligen Modifikationen, die insbesondere von Krankenhaushygienikern verwendet werden (Operationssäle). Eine 100%ige Keimerfassung gibt es nicht. Dagegen lässt sich natürlich eine praktisch 100%ige Entfernung von Luftkeimen z.B. durch Luftfilter erreichen. Bei Luftkeimbestimmungen müssen theoretisch folgende 2 Vorraussetzungen gegeben sein: Schonender und umfassender Keimeinfang Optimale Kulturbedingungen Einige der gebräuchlichsten Verfahren sind: A: Keimeinfang (über Druck- oder Saugluft) B: Kultivierung 1. Wasserlöslicher Filter (Algen-, Gelatinetrockenfilter u.a.) 2. Membran-Filter(Cellulose-Acetat) nach Auflösung der Filter in Nährflüssigkeit → Membranfiltrierung wie A-2 nach Auflegen der Filter auf Agarplatten 3. Schlitzsammler auf Agarplatten der Keimeinfangagarplatten 4. Porensammler (z.B. 6-Stufensammler auf Agarplatten) wie A-3 5. Waschflaschen (mit Phosphatpuffer) a) als Luftdurchperler (geringer Durchfluss) b) als sog. Impinger (Flüssigkeitszerstäuber; to impinge = aufprallen) 6. Als grobquantitativer Sedimentationsverfahren siehe unter A-1 siehe unter A-1 auf Agarplatten 17 Aufgabe Übung 4 am Kurstag 2: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld A = äußere Haut (vor Händedesinfektion) B = äußere Haut (nach Händedesinfektion) 1 = Raumluft 2 = Fußboden 3 = Arbeitstisch 4 = Gegenstand nach Wahl 5 = Gegenstand nach Wahl 6 = Gegenstand nach Wahl 7 = Gegenstand nach Wahl - Die Untersuchungen A und B werden von jeder Person durchgeführt für die Untersuchung die Fingerspitzen in direkten Kontakt mit der sterilen Agaroberfläche bringen - für die Raumluftuntersuchung wird die Agarplatte für die Dauer von 1 Stunde offen auf dem Arbeitstisch gelegt und anschließend mit dem Deckel verschlossen - zur Untersuchung des Fußbodens und des Arbeitstisches (2 und 3) wird mit einem angefeuchteten Watteträger ein Abstrich genommen und das Material auf Agarplatte ausgestrichen - Platten mit der Platz-Nr. und zusätzlich mit dem Buchstaben oder der Zahl des gewählten Untersuchungsmaterials beschriften - Die Kulturen werden eingesammelt und 16 – 24 h bei 37°C bebrütet Aufgabe Übung 4 am Kurstag 3: Auswertung der Kulturen „Bakterien aus dem direkten Umfeld“ - Makroskopische Beschreibung von je 3 unterschiedlichen Kolonien auf den Agarplatten (Morphologie, Nährbodenveränderung) - Präparate herstellen - Präparate nach Gram färben - Protokollieren in nachfolgender Tabelle Protokoll Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld: Keim Nr. Koloniemorphologie a. d. Nährboden Nährbodenveränderung Gramreaktion/ Morphologie Vermutete Gattung 1 2 3 Welche Bakteriengattungen bzw. -spezies werden typischerweise nachgewiesen? auf der Haut vor Desinfektion:.......................................................................................................... auf der Haut nach Desinfektion:....................................................................................................... in der Raumluft:................................................................................................................................ auf dem Fußboden:.......................................................................................................................... auf dem Arbeitstisch:........................................................................................................................ auf dem Gegenstand nach Wahl:………………………………………………………………………… 18 Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens Abbildung und Tabelle geben einige Hinweise auf die ökologische Bedeutung und die Gattungen der im Erdboden vorkommenden Bakterien. Einige Vertreter mit medizinischer Bedeutung sind in der Tabelle unterstrichen. Ungefähre Zusammensetzung der Biomasse des Erdbodens Mikroorganismen im Erdboden (Bakterien-Gattungen mit med. Bedeutung sind fett gedruckt) Symbiotische Frei lebende Bakterien Rhizobium sp. Klebsiella sp. Actinomyceten und Pilze Azotobacter sp. Azotomonas sp. Spirillum sp. Bacillus sp. Enterobacter sp. Nocardia sp. Pseudomonas sp. Clostridium sp. etc. Algen Anabaena Calothrix Nostoc Stigonema Chlorogloea etc. Hefen Pullularia Rhodotorula 19 Aufgabe Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens - Eine Suspension von Gartenerde wird auf einem Blutagar fraktioniert ausgestrichen - Platten mit ungeraden Platznummern werden 16 – 24 h bei 37°C aerob bebrütet - Platten mit geraden Platznummern werden 16 – 24 h bei 37°C anaerob bebrütet Auswertung der Kulturen „Bakterien des Erdbodens“ am Kurstag 3: Aerobe Platte: Beschreibung von Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse) 3 verschiedener Kolonien Präparate herstellen und nach Gram färben Anaerobe Platte: Beschreibung von Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse) 3 verschiedener Kolonien Präparate herstellen und nach Gram färben Protokollieren in nachfolgender Tabelle Aerobe Keime Wachstum a. d. Nährboden: (Form, Größe, Hämolyse) Gramfärbung: (Morphologie, Gramverhalten) Wachstum a. d. Nährboden: (Form, Größe, Hämolyse) Gramfärbung: (Morphologie, Gramverhalten) Vermutete Gattung 1. 2. 3. Anaerobe Keime 1. 2. 3. Vermutete Gattung 20 Kurstag 4 C. Normale Bakterienflora des Menschen Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel Die Mundhöhle des Erwachsenen beherbergt im Vergleich zu anderen Körperarealen eine große Zahl und Vielfalt an aeroben und anaeroben Mikroorganismen (ca. 30-50% sind Anaerobier). Die folgenden Tabellen geben Aufschluss über Zahl, Verteilung und Art der Mikroorganismen. Aufgabe Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel 1. Verdünnungsreihe nach Pipettierschema herstellen: - 10,0ml Glucosebouillon in die Reagenzgläser 1 - 3 pipettieren - 4,5ml Glucosebouillon in die Reagenzgläser 4 - 7 pipettieren (s. Schema) - 0,1ml eigener Speichel mit der Glucosebouillon in Reagenzglas 1 vermischen Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet Auswertung: es wird beurteilt bis zu welcher Verdünnungsstufe Wachstum vorhanden ist Protokoll: siehe Kurstag 5 2. Bestimmung der Anzahl aerober Keime pro ml: - aus Reagenzglas 5, 6, 7 je 1,0 ml auf je einen Peptonagar geben, mit einem Spatel verteilen - Platten mit Platznummer und Verdünnungsstufe beschriften Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet Auswertung: es werden auf jeder Agarplatte alle Kolonien gezählt Protokoll: siehe Kurstag 5 21 Pipettierschema: Protokoll Übung 6: Keimzahlbestimmung des Speichels 1. Verdünnungsreihe: Verdünnungsstufen: 10-2 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 Wachstum: (=Trübung) Protokoll Übung 6: Keimzahlbestimmung des Speichels 2. Bestimmung der Anzahl aerober Keime pro ml Speichel mit Hilfe des arithmetischen Mittels: Beispiel: Anzahl gezählter Kolonien: Bei einer Verdünnung von 10-8 ml: 150 Kolonien →150 Kolonien Bei einer Verdünnung von 10-9 ml: 10 Kolonien →100 Kolonien Bei einer Verdünnung von 10-10 ml: 5 Kolonien → 500 Kolonien Summe =750 Kolonien 750 : 3 = 250 Kolonien pro 10-8 ml Speichel (oder pro 1 ml Speichel: 2,5 x 10-10) Errechnen der ungefähren Keimzahl des eigenen Speichels: Anzahl gezählter Kolonien: Bei einer Verdünnung von 10-8 ml: ……. Kolonien → ……. Kolonien Bei einer Verdünnung von 10-9 ml: ……. Kolonien → ……. Kolonien Bei einer Verdünnung von 10-10 ml: ……. Kolonien →……. Kolonien Summe = Kolonien ……. : 3 = ……. Kolonien pro 10-8 ml Speichel (oder pro 1 ml Speichel: 2,5 x 10-10) 22 Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque Der als "Plaque" bezeichnete Zahnbelag, der eine Vielzahl aerober und anaerober Bakterien enthält (s. Tabelle), soll in dieser Übung mikrobiologisch untersucht werden. (Tabelle aus: Sauerwein, Kariologie) Aufgabe Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque 1. Herstellen eines Direktpräparates von Plaque - Mit einem Wattetupfer wird auf die Außenseite der Backenzähne Färbelösung aufgetragen - Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wird von dem rot gefärbten Zahnbelag vorsichtig Material abgeschabt und in einem winzigenTropfen Wasser auf einem Objektträger suspendiert - lufttrocknen, nach Gram färben 2. Aerobe und anaerobe Kultivierung von Plaque - Identisch entnommene Proben des Plaquematerials werden zur Anzucht auf zwei getrennte Blutplatten geimpft und fraktioniert ausgestrichen - eine Kultur wird aerob, die andere wird anaerob 16 – 24 h bei 37°C bebrütet Kurstag 5: - von je 3 unterschiedlichen Kolonien auf den Agarplatten (aerobe und anaerobe Platte) die Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse) beschrieben - Von diesen Kolonien Präparate herstellen und nach Gram färben Protokollieren in nachfolgender Tabelle Protokoll Übung 7: Skizze vom Direktpräparat „dentale Plaque“ (Gramfärbung) 23 Protokoll Übung 7: Zahnbelag, aerobe und anaerobe Kultivierung Aerobe Keime Wachstum a. d. Nährboden: (Form, Größe, Hämolyse) Gramfärbung: (Morphologie, Gramverhalten) Vermutete Gattung Wachstum a. d. Nährboden: (Form, Größe, Hämolyse) Gramfärbung: (Morphologie, Gramverhalten Vermutete Gattung 1. 2. 3. Anaerobe Keime 1. 2. 3. 24 Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen Identifizierung des Trägerstatus für potentielle pathogene Keime: Die nachfolgenden Tabellen geben einige Hinweise auf die Beteiligung der Gattung Streptococcus an zahnmedizinisch relevanten Krankheitsprozessen in der Mundhöhle. Normale Rachenflora (durchschnittliche Häufigkeit in der aufgeführten Reihenfolge abnehmend) Vergrünende Streptokokken Anhämolysierende Streptokokken Neisseria spp. Koagulase-neg. Mikrokokken Laktobakterien Corynebacterium sp. Candida sp. Borrelia sp. Fusobacterium sp. (~80%) (~5%) (~5%) (~5%) (~1%) (~1%) (~1%) (~1%) (~1%) Pathologische Rachenflora (im Erkrankungsfall und bei sog. Gesunden Trägern) Staphylococcus aureus (Koagulase positiv) Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Haemophilus influenzae (Kapseltyp b) Opportunistische Enterobacteriaceae Candida albicans Aufgabe Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen Herstellen eines Grampräparates und einer Kultur von der eigenen Rachenflora - Jeder Kursteilnehmer entnimmt bei seinem Nachbarn mit den Wattetupfern 2 Rachenabstriche - Mit dem 1. Wattetupfer ein Objektträger-Präparat herstellen, dabei den Tupfer kräftig auf dem Objektträger ausdrücken (kein Wasser zufügen!) - Objektträger lufttrocknen, Hitzefixieren und nach Gram färben - der 2. Rachenabstrich auf dem ersten Drittel einer Blutplatte ausstreichen, die beiden anderen Drittel mit der Öse ausstreichen - Kultur 16 – 24 h bei 37°C bebrüten Mikroskopie: - Zeichnen der verschiedenartig aussehenden Keime des Direktpräparates (Neben Plattenepithelien, Schleimfäden, gelegentlich Nahrungsresten sieht man in der Regel eine Vielzahl, z. T. sehr unterschiedlicher Bakterienformen) 25 Nächster Kurstag: Beurteilung der Kultur von der eigenen Rachenflora Ziel der Übung ist, in der Gruppe der Kursteilnehmerinnen die gesunden und kranken "Träger" dieser Infektionserreger zu identifizieren (Trägerstatus, Durchseuchung) - mit dem Filzstift verdächtige Kolonien markieren (auf dem Plattenboden) und deren Eigenart protokollieren - anlegen von Reinkulturen potentiell pathogener Erreger, insbesondere: S. aureus, S. pyogene, S. pneumoniae, gramnegative Stäbchen = "Opportunisten" - Kultur 16 – 24 h bei 37°C bebrüten Übernächster Kurstag: - Die Kultur wird beurteilt und falls erforderlich, eine weitere Keimdifferenzierung vorgenommen (z. B. Plasmakoagulase, Streptex-Test Bacitracin-, Optochin-Test) - herstellen von Grampräparat(en) Protokoll Übung 8 : Grampräparat vom Rachenabstrich Protokoll Übung 8: Kultur der eigenen Rachenflora Keim Wachstum a. d. Nährboden: (Form, Größe, Hämolyse) Gramfärbung (Morphologie, Gramverhalten) Vermutete Gattung 1 2 3 Protokoll Übung 8: Trägerstatus bei Kursteilnehmern Keime Positiv für S.aureus Positiv für S.pyogenes Positiv für S.pneumoniae Sonstiges Anzahl potenziell pathogener Keime im Kurs Gesamtzahl der Rachenabstriche Trägerstatus (% positiv) 26 Kurstag 5 Übung 9: Abgrenzung von S.aureus gegenüber anderen Micrococcaceae Grampositive Haufenkokken gehören zur Familie der Micrococcaceae mit den beiden wichtigsten Genera Staphylococcus und Micrococcus. Bei letzteren handelt es sich meist um so genannte Luftkokken. Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Eiter- und Entzündungserreger beim Menschen. Er bildet invitro u.a. Plasmakoagulase, deren Nachweis neben dem einer DNase seine sichere Identifizierung ermöglicht. Dieses Enzym vermag Menschen- oder Kaninchenplasma (Citrat-, Oxalat- oder Heparinplasma) auf nicht ganz geklärte Weise zu koagulieren (Ausfällung von Fibrin). (Herstellung von Citratplasma: Mischen von Vollblut mit 3,8% Na-Citrat (4 Teile + 1 Teil) zentrifugieren, Überstand = Plasma). S. aureus-Stämme bilden meist gelbes oder gelbweißliches Pigment und auf Blutagar meist beta-Hämolyse. S.epidermidis und S.saprophyticus sind normale Haut- und Schleimhautkeime, kommen aber auch als opportunistische Infektions-Erreger (bei Abwehrschwäche, z.B. bei Immunsuppression u. postoperativ) vor. Sie sind wie alle Micrococcaceae (mit Ausnahme von S. aureus) Plasmakoagulase negativ. Koagulase-Reaktion: Durch das Enzym Koagulase wird das Fibrinogen im Zitratplasma von Menschen und Kaninchen in Fibrin überführt. Die Koagulase ist ein Pathogenitätsfaktor von Staphylococcus aureus. Suspendiert man Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen Zitratplasmatropfen, so kommt es zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken eingebettet sind. Makroskopisch erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit (positives Ergebnis), die eine Agglutination erkennen lassen. Im Gegensatz zu anderen Staphylokokken besitzen fast alle Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer Zelloberfläche. Durchführung: Das verdächtige Keimmaterial wird mit einem sehr kleinen Wassertropfen auf einem Objektträger bis zur Homogenität verrieben. Dann wird mit der Pasteurpipette ein Tropfen Zitratplasma mit dem Keimmaterial vermischt. Positiv: Plasma koaguliert (Flockenbildung) Aufgabe Übung 9: Abgrenzung von S. aureus gegenüber sonstigen Mikrokokken - Betrachtung der Blutagarkulturen (bei Auflicht sowie gegen das Licht) auf erkennbare Unterschiede, z.B. Hämolyse etc. - Herstellen von Gram-Präparaten (von allen 3 Kulturen auf einem Objektträger) - Nachweis des Clumping-Faktors (Koagulase-Reaktion) im Objektträgertest - Protokolliere die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Kriterien für die Keime A, B und C zur Identifizierung von S.aureus. 27 Protokoll Übung 9: Abgrenzung von S. aureus gegenüber sonstigen Mikrokokken Kriterien: Koloniefarbe Hämolyse (Blutagar) Gramfärbung Kokkenform (Zeichnung) Clumping-Faktor Mutmaßliche Beweglichkeit Mutmaßliches Wachstum auf MacConkey-Agar Diagnose: Keim A Keim B Keim C 28 Übung 10: Optochin-Test zur Identifizierung von S. pneumoniae Im Gegensatz zu sonstigen vergrünenden Streptokokken, die auf der Blutplatte ebenfalls mit Vergrünung und oft auch als Diplokokken wachsen ist S. pneumoniae sensibel gegenüber Optochin. Nach der Kultur bildet sich um das Testplättchen ein Hemmhof. Mit gruppenspezifischen Agglutinationstesten steht außerdem eine modernere immunologische Methode zur Streptokokken-Differenzierung zur Verfügung. Ein anderer Differenzierungstest ist der Nachweis der Gallelöslichkeit von Pneumokokken; aufgrund dieser Eigenschaft können Pneumokokken - im Gegensatz zu sonstigen vergrünenden Streptokokken - nicht als Erreger einer Cholangitis oder Cholecystitis vorkommen. Aufgabe Übung 10: Optochin-Test - Blutagarplatte mit der Platznummer und einer Halbierungslinie versehen, die obere Hälfte der Platte wird mit I, die untere Hälfte mit II beschriftet - Feld I wird mit Kultur I, Feld II mit Kultur II im dichten Ausstrich beimpft, in die Mitte beider Impffelder wird mittels abgeflammter / abgekühlter Pinzette je 1 Optochin-Testplättchen aufgelegt und leicht angedrückt Kulturen werden 16 – 24 h bei 37oC bebrütet Protokoll Übung 10: Optochin-Test Bei welchem Streptokokkenstamm handelt es sich um S. pneumoniae? …………………………………………………………………………………. 29 Kurstag 6 Übung 11: Neisser-Färbung zum Nachweis von Corynebacterium Energiereiche Phosphatbindungen werden von zahlreichen Bakterienarten in Form von hauptsächlich aus Polyphosphat bestehenden Plasmaeinschlüssen als Reservestoffe gespeichert, z.B. von Spirillum volutans ("Volutin"), Lactobacillus- u. Corynebacterium-Arten. Die Darstellung von Polyphosphat (dunkelbraun bis schwarz bei gelbem Cytoplasma) mit Hilfe der NeisserFärbung ist keineswegs für Diphtheriebakterien spezifisch, aber als positives Merkmal zur Charakterisierung von Diphtheriebakterien unerlässlich als frühester und schnellster diagnostischer Hinweis bei der Untersuchung von Rachen- bzw. Wundsekret in Diphtherie-Verdachtsfällen. (Endgültige Diagnose: Nachweis der Toxinbildung (z.B. Agardiffusionstest nach ELEK bei verdächtigen Reinkulturen). Neisser-Färbung (Differenzialfärbung) - Präparat hitzefixieren - Lösung "Neisser I", 30 Sekunden, abgießen, nicht mit Wasser abspülen! - Lösung "Neisser II", 15 Sekunden, abgießen, nicht mit Wasser abspülen! - zwischen Filterpapier trocknen Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl Aufgabe Übung 11: Neisser- und Gram-Färbung - Präparate von den ausliegenden Kulturen herstellen Für die Gram-Färbung: je ein Präparat von C. diphtheriae und C. pseudodiphtheriae Für die Neisser-Färbung: je ein Präparat von C. diphtheriae und C. pseudodiphtheriae Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl Protokollieren Protokoll Übung 11: (Farbskizzen!) Neisserfärbung Gramfärbung Gram-Färbung: [Reaktion von C. diphtheriae oben und von C. pseudodiphthericum unten einzeichnen] Neisser-Färbung: [Reaktion von C. diphtheriae oben und von C. pseudodiphthericum unten einzeichnen] 30 Übung 12: Kinyoun-Färbung zum Nachweis von Mykobakterien Die Kinyoun-Färbung ist eine modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbung. Die Mykobakterien sind „säurefest“. Freie Mykolsäuren in der Zellwand gehen mit Karbolfuchsin (Fuchsin + Phenol) eine Komplexbildung ein, die einer Entfärbung mit HCL-Alkohol standhält, während die nicht-säurefesten Bakterienarten dadurch entfärbt werden. Kinyoun-Färbung: (Differenzialfärbung) - Präparat hitzefixieren (ist bereits geschehen) - Karbolfuchsin → 4 Min. - kurz mit Leitungswasser abspülen - Salzsäurealkohol → 3-5 Sekunden - kurz mit Leitungswasser abspülen - Methylenblau → 30 Sekunden - kurz mit Leitungswasser abspülen - trocknen zwischen Filterpapier Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl Aufgabe: Übung 12: Kinyoun-Färbung Sputum-Präparat nach Kinyoun färben Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl Da Mykobakterien in klinischen Materialien in geringer Konzentration vorhanden sein können, müssen zahlreiche Gesichtsfelder durchmustert werden, wobei das Objektiv die Ausstrichfläche auf mäanderförmiger Bahn durchläuft. Protokollieren Protokoll Übung 12: Säurefeste Stäbchen (farbige Skizze!) 31 D.Temperaturresistenz Übung 13: Sterilitätskontrolle Aufgabe Übung 13: Testen der Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien Um zu beurteilen wie sich Hitze auf das Wachstum von Bakterien auswirkt, werden 2 verschiedene Bakteriensuspensionen und 3 unterschiedlich vorbehandelte Sporenstreifen bearbeitet. Untersuchungsmaterial: 1. A = S. aureus 2. B = E. coli 3. C = Sporenstreifen 4. D = Sporenstreifen 5. E = Sporenstreifen 30 Min. bei 60°C vorbehandelt 30 Min. bei 60°C vorbehandelt unbehandelt bei 120°C, 1,2 atü Wasserdampf sterilisiert bei 160°C 2, Stunden im Heißluftsterilisator sterilisiert Reagenzien und Werkzeug: 6 sterile Glukosebouillons Sterile Pipetten (in den Metalldosen) Holzklammern Pipettierschema: Die Suspensionen A + B gut aufschütteln! (Achtung: Deckel sind nicht dicht) 1. Suspension A → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A1 2. Suspension A, aufkochen → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A2 3. Suspension B → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit B 4. Sporenstreifen C → ca. 2ml Leitungswasser zugeben, aufkochen, anschl. den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben 5. Sporenstreifen D → den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben 6. Sporenstreifen E → den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben Die 6 Bouillonkulturen werden 16-24 h bei 37°C bebrütet und am nächsten Kurstag ausgewertet und protokolliert. Protokoll Übung 13: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien Untersuchungsmaterial Behandlung A1 = Staphylokokken-Bouillon bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt A2 = Staphylokokken-Bouillon bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt und anschl. aufgekocht bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt B = E. coli-Bouillon C = Sporenstreifen D = Sporenstreifen E = Sporenstreifen Schlussfolgerung: Aufgekocht mit Leitungswasser (ca. 100°C) bei 120°C, 1,2 atü Wasserdampf autoklaviert 2 Stunden bei 160°C im Heißluftsterilisator sterilisiert Wachstum (+/-) 32 Kurstag 7 Übung 14: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) Die Resistenztestung von Bakterien gegenüber Antibiotika wird entweder mit dem Agardiffusionstest auf festen Nährböden oder mit dem Reihenverdünnungstest in flüssigen Medien durchgeführt. Mit dem Diffusionstest werden Hemmhöfe, mit dem Reihenverdünnungstest minimale Hemmstoffkonzentrationen ermittelt. Aufgabe Übung 14: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) - Auf den Boden der beiden Müller-Hinton-Agarplatte wird die Platz-Nr.und der Name des zu prüfenden Stammes geschrieben. (S .aureus, E. coli oder häm.Streptokokken) - Mit der Öse wird von der zu testenden Kultur Material entnommen und in der Mineralbasis zu einer deutlich trüben Suspension aufgeschwemmt. - Die gesamte Oberfläche der beiden Müller-Hinton-Agarplatte wird unter Verwendung eines Wattetupfers mit der Bakteriensuspension bestrichen. - Anschließend werden mit den beiden Dispenser die Antibiotika-Plättchen auf den Agar aufgebracht. Getestet werden 12 verschiedene Antibiotika (6 pro Platte) - Kulturen (mit der Agarschicht nach oben) 16 - 24 h bei 37oC bebrüten Am nächsten Kurstag: Auswertung und Protokollierung nach folgendem Bewertungsmaßstab: Hofdurchmesser von 14 mm und größer = empfindlich = ++ Hofdurchmesser von <11-13 mm = schwach empfindlich = + kein Hemmhof <11 mm = resistent = Zur Therapie im Erkrankungsfall werden nur doppelt-wirksame (++) Antibiotika verwendet. Protokoll Übung 14: Agardiffusionstest Wirkstoffe S. aureus Isolat in mm E. coli Isolat in mm Code Wildtyp in mm Penicillin P 14 14 14 Ampicillin AM 14 14 14 Ampicillin/Sulbactam SAM 14 14 14 Piperacillin PIP 14 14 14 Cefazolin CZ 14 14 14 Cefotaxim CTX 14 14 14 Dispenser II Code Wildtyp in mm IPM 14 14 14 Erythromycin E 14 Wird nicht beurteilt 14 Ciprofloxacin CIP 14 14 14 Gentamicin GM 14 14 14 Co-Trimoxazol SXT 14 14 < 11 TE 14 14 14 Dispenser Imipenem Tetracyclin Isolat in mm Wildtyp in mm Häm. Streptokokken Wildtyp in mm Isolat in mm Wildtyp in mm Wildtyp in mm Isolat in mm Isolat in mm 33 Protokoll Übung 14: Der Vergleich aller im Kurs untersuchten Kulturen ergibt: Stämme Anzahl untersuchter Stämme Anzahl sekundärresistenter Stämme Anzahl mehrfachresistenter Stämme S.aureus E. coli Häm. Streptokokken Hinweis auf Sekundärresistenz durch chromosomale Mutation oder plasmidgebundene Resistenzfaktoren: Streptococcus pyogenes (Gruppe A), Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum neigen nicht oder selten zur Ausbildung einer Resistenz gegen Penicillin. Für die entsprechenden Krankheiten stellt Penicillin das Antibiotikum der Wahl dar. Bei bestehender Penicillin-Allergie muss allerdings ein anderes Antibiotikum genommen werden (Erythromycin). 34 Übung 15: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (Minimale Hemmkonzentration) Aufgabe Übung 15: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (Minimale Hemmkonzentration, MHK) Je 3 Kursteilnehmer bearbeiten einen Testkeim (Keim A, B oder C, auf Peptonagar) 1. Herstellen eines Grampräparates vom Testkeim auf der Peptonagarkultur 2. Herstellen einer Testkeim-Suspension: 3-5 Kolonien des Testkeims in ein Röhrchen mit Mineralbasis suspendieren (leichte Trübung) 3. Beschriften der sterilen Glukosebouillonröhrchen mit: Platznummer, 100 I.E., 10 I.E., 1 I.E., Kontrolle (I.E. = Internationale Einheiten Penicillin/ml) In dem Glukosebouillonröhrchen das bereits 1000 I.E. beschriftet ist, befinden sich schon 1000 I.E. Penicillin 4. Herstellen einer Penicillin-Verdünnungsreihe nach unterem Schema Verdünnungsreihe 16-24h bei 37°C bebrüten Pipettierschema für die MHK Beschriftung der Röhrchen 1000 I.E. 100 I.E. 10 I.E. 1 I.E. Kontrolle Volumen im Röhrchen (ml) Penicillinkonzentration I.E./ml 5,0 1000 4,5 0 4,5 0 4,5 0 4,5 0 0,5 4,5 1000 1 Öse 0,5 4,5 100 1 Öse 0,5 4,5 10 1 Öse 0,5 4,5 1 1 Öse Überpipettieren Überpipettiertes Volumen (ml) Endvolumen im Röhrchen (ml) Endpenicillinkonzentration I.E./ml Beimpfung mit der Testkeim-Suspension verwerfen 0 4,5 0 1 Öse Protokoll Übung 15: MHK Internationale Einheiten Penicillin / ml (I.E. Pen.) (Trübung = Bakterienwachstum) Gattung od. Gruppe 1000 IE/ml 100 IE/ml 10 IE/ml 1 IE/ml Kontrolle A = Bacillus sp. B = E. coli C = S. aureus Schlussfolgerung: Hinsichtlich der wildtypischen Empfindlichkeit gegenüber Penicillin unterscheiden sich die untersuchten Spezies wie folgt: ……………………………………………………………………………………………………………… 35 Abschnitt II: Hygiene Kurstag 8 + 9 Übung 16: Wasserhygiene Nachweis von Keimen im Trinkwasser Theoretischer Hintergrund: Trinkwasser ist das wichtigste Lebensmittel, da es durch nichts anderes ersetzt werden kann. Daher sind der Schutz des Wassers und der sparsame Umgang mit Trinkwasser eine der wichtigsten Aufgaben des Menschen. Eine wichtige Grundlage zur Sicherung der Ressource Wasser ist die hygienische Überwachung des Trinkwassers, gesichert im Infektionsschutzgesetz und darauf basierend, der Trinkwasserverordnung (TrinkwV oder auch TVO) in ihrer letztmalig 2001 geänderten Fassung (Novellierung), die am 1. Januar 2003 in Kraft trat. Mit der Trinkwasserverordnung wurde die Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft in deutsches Recht umgesetzt. Ziel dieser Verordnungen ist die Sicherstellung von sauberem und hygienisch kontrolliertem Trinkwasser, das eine Gefährdung der menschlichen Gesundheit ausschließt. Dieses wird vor allem durch die Einführung von Grenzwerten für gesundheitsschädliche biologische und chemische Parameter erreicht. Von zentraler Bedeutung ist dabei die mikrobiologische Überwachung des Wassers (Anlage 1 der TrinkwV) sind die sicherstellen soll, dass keine potenziell gesundheitsschädlichen Darmkeime wie z.B. Escherichia coli und andere Enterobakterien im Wasser nachweisbar sind. Die Liste der in der Anlage 2 der TrinkwV aufgenommenen toxikologisch relevanten chemischen Schadstoffe enthält erstmalig auch solche Substanzen, deren Konzentration oder Giftigkeit durch das Leitungsnetz oder die Wasseraufbereitung verändert wird. Die Anlage 3 der Verordnung enthält Grenzwerte für weniger gefährliche Inhaltsstoffe oder Stoffe, deren Giftigkeit nicht genau bekannt ist, die aber als wichtige als Indikatorparameter den Zustand des Trinkwassers beschreiben und vor allem der Vorsorge dienen. In der Anlage 3 sind auch mikrobielle Indikatoren gelistet. Außerdem sind in der Verordnung die Abstände, in denen das Wasser untersucht werden muss und auch die, für die Überwachung zuständige Behörde (Gesundheitsamt) sowie weitere Anforderungen festgelegt Die Liste der zu untersuchenden chemischen Inhaltsstoffe ist sehr lang, daneben nehmen sich die mikrobiologischen Anforderungen, zumindest was den Umfang der Parameter betrifft, eher bescheiden aus: Neben der Koloniezahl (KBE bei 22°C und 37°C) sind es vor allem der Darmkeim Escherichia coli, die coliformen Keime und Enterokokken, die als Indikatoren für mögliche fäkale Verunreinigungen des Wassers dienen und somit ein Hinweis auf Krankheitserreger im Wasser sein können. Zusätzlich kann das Gesundheitsamt Untersuchungen auf weitere Keime anordnen, wenn ein Kontaminationsverdacht es erfordert. Krankheitserreger im Trinkwasser Grundwasser aus ausreichender Tiefe enthält normalerweise nur wenige, unproblematische Keime. Mikrobielle Verunreinigungen entstehen durch: Unzureichende Filterwirkung des Bodens, v. a. bei Flachbrunnen Undichtigkeiten des Brunnens (Regenwasser, Hochwasser) Sekundärverkeimungen durch die Versorgungssysteme 36 Unzureichende Aufbereitung (Desinfektion) Infektionen durch Trinkwasser: Bakterien: - Salmonellen (S. typhi, S. paratyphi, S. dysenteriae, S. montevideo: Typhus, Paratyphus, Enteritis) - Kolibakterien: (E. coli: meist Enteritis) - Shigellen (Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, Ruhr) - Vibrionen (V. cholerae, V. fluvialis, V. mimicus, V. parahaemolyticus, V. vulnificus u.a.: Cholera, Enteritis, and Wundinfektionen), - Campylobacter (C. jejuni, C. coli: Enteritis) - Chromobacterium violaceum (Enteritis) - Aeromonaden (A. hydrophilia, A. sobria, A. caviae: Enteritis, Wundinfektionen) - Mykobakterien (M. tuberculosis, M. marinum, M. chelone u.a.: TBC, Granulome) - Yersinia entorocolitica (Enteritis) - Chlamydien (C. trachomatis: Trachom, evtl. Erblindung) - Fusobakterium necroforum (Leberabszess) - Staphylokokken (S. aureus: Wundinfektionen, Lebensmittelvergiftung) - Clostridium perfringens (Lebensmittelvergifter) - Pseudomonaden (P. aeruginosa: über Kontakt: Wundinfektionen, Ohrinfektionen, Pneumonie) - Legionellen (L. pneumophila u.a.: indirekt über Aerosole: Pneumonie, Pontiac-Fieber), Viren: - Poliovirus (Polio: Kinderlähmung) - Coxsackievirus A und B (grippaler Infekt, Meningitis) - Echovirus (Enteritis, "Sommergrippe", Meningitis) - Astrovirus (Enteritis, harmlose Durchfälle) - Adenovirus (Enteritis, "Sommergrippe", Pharyngitis) - Hepatitisvirus A und E (Hepatitis) - Rotavirus (Gastroenteritis v .a. bei Kleinkindern), - Reovirus (Enteritis) - Norwalkvirus (Enteritis), - Calicivirus (Enteritis bei Kleinkindern) - SRV: "small round virus": (Durchfälle) - Coronavirus (grippale Infekte) - Parvoviren ("atypische Röteln", nicht gesichert) Protozoen: - Cryptosporidium parvum (Enteritis) - Entamoeba histolytica (Amöbenruhr) - Giardia lamblia (Lambliasis: Enteritis) Wurmkrankheiten: - V. a. in den Tropen und häufig indirekte Infektionen über das Wasser (z.B. Eindringen der Würmer oder Larven über die Haut: Schistosoma, Necator, Ancylostoma, Dracunculus, Strongyloides u.a.) - Ascaris lumbricoides (Spulwurm: Aufnahme der Eier aus Abwasserkontaminationen) - Enterobius vermicularis (Madenwurm v. a. bei Kindern. Infektion durch Wasser ist eine Ausnahme) Pilze: - Candida (Soor, Candidamykose: Infektion durch Wasser unwahrscheinlich) Algentoxine: evtl. bei Oberflächenwasser wie Badeseen 37 Der Infektionsweg ist normalerweise fäkal-oral, aber auch aerogene Infektionen (z.B. Legionellen über Aerosole) sowie Infektionen der Haut (Wunden, äußerer Gehörgang: Pseudomonas aeruginosa) oder der Augen (Konjunktiva: Chlamydia trachomatis) sind möglich. Einige Erreger verursachen Explosivepidemien (z.B. Cholera). Die kritische Infektionsdosis ist äußerst unterschiedlich: Vibrio cholerae 108 KBE E. coli, Salmonella enteritidis 106 KBE Salmonella typhi, Shigella dysenteriae 103 KBE Legionella pneumophila, Yersinia enterocolitica 10 KBE Enteroviren 1 - 10 PFU (plaque forming unit) Giardia 1 Oozyste Probleme der mikrobiologischen Überwachung des Trink- und Badewassers mittels bakterieller Indikatoren: Einige Mikroorganismen erreichen im Wasser und im Boden lange Überlebenszeiten (Tenazität), die weit über 50 Tage („50-Tages-Linie“: Grundlage von Schutzmaßnahmen gegen mikrobielle Beeinträchtigung der Wassers) hinausreichen können. Der Indikator für mögliche fäkale Infektionserreger im Trinkwasser Escherichia coli und Coliforme Keime nach der Trinkwasserverordnung (TVO) ist nicht für alle Erreger anwendbar. Auch im gechlorten Wasser ist der Indikatorwert von E. coli nur eingeschränkt anwendbar, da E. coli im Vergleich zu einigen Krankheitserregern sehr chlorempfindlich ist. Für Mikroorganismen, die nicht fäkal-oral übertragen werden (Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila u.a.) sind die enterobakteriellen Indikatoren ebenfalls nicht sinnvoll. Die bakteriellen Indikatoren gelten auch für Viren und Protozoen, die teilweise auch gegen Desinfektionsmaßnahmen völlig anders reagieren. Im Trinkwasser werden regelmäßig Bakterien mit unterschiedlicher Signifikanz nachgewiesen: Potentielle Pathogene, d.h. Keime, die vor allem opportunistische Infektionen z.B. im Krankenhaus oder bei Immungeschwächten verursachen können. Weiterhin Bakterien, die Korrosionen, Färbungen oder Gerüche verursachen aber meist unproblematisch sind (Umweltkeime). Wasservermittelte Epidemien wurden meist verursacht durch: Kurzschlüsse in der Wasserversorgung mit dem Abwassersystem (Hamburg u.a.), heute besonders bei Kleinversorgungen (Ismaning) oder Campingplätzen (Worchester) und noch häufig in sog. Entwicklungsländern. Verschneiden mit kontaminiertem Wasser aus „krimineller Geldgier“ (Gelsenkirchen) Einschwemmen von Fäkaldünger in das Trinkwasserreservoir (Pforzheim, Milwaukee). Stagnationen und Verkeimungen in Installationen und dem Netz (Biofilm). 38 Exemplarische Trinkwasserepidemien (Explosivepidemien) in Europa und USA nach dem Institut für Wasser-Boden-Luft-Hygiene (WaBoLu) 1997: Cholera Hamburg 1892. 16.000 Erkrankte, fast 9.000 Tote: Eines der letzten großen Ausbrüche in Mitteleuropa. Vorher wurden fast alle großen europäischen Städte regelmäßig von der Cholera heimgesucht, wie z.B. Mitte des 19. Jahrhunderts: Paris, München, Berlin, London, New York u.a. Typhus, Salmonellose (Auswahl) Gelsenkirchen 1901: 3.200 Erkr./ 350 Tote, Detmold 1904: 780 Erkr./ 54 Tote Pforzheim 1919: 4.000 Erkr./ 400Tote) Neu-Ötting 1946: 600 Erkr./ 96 Tote Waldbröl 1949: 127 Erkr./ 11 Tote Thereker Mühle 1953: 51 Erkr. (Paratyphus) Hagen 1956: 500 Erkr. Zermatt 1963: 437 Erkr. 3 Tote Riverside 1965 (USA, Salmonellose): 16.000 Erkr. 3 Tote Baden Württemberg 1974: 423 Erkr. Missouri (USA) 1993: 625 Erkr. Ruhr, EHEC Worbis (Thüringen) 1972: 1.400 Erkr. Ismaning/München 1980: 2.450 Erkr. Cabool (USA) 1889: 243 Erkr. 4 Tote New York (Staat, USA) 1994: 230 Erkr. (EHEC?). Hepatitis A Philadelphia 1944: 344 Erkrankten in einem Jugendlager. Worchester 1969-71: über 1.200 Erkr. Dingelstedt (Thüringen) 1972: 40 Erkr. Rotavirus Schweden 1977: 3.172 Erkr. Georgetown (USA) 1980: 8.000 Erkr. Eagle-Vail-Avon (USA) 1981: 1.500 Erkr. Halle/Saale 1981: 11.600 Erkr. Cryptosporidien Carrolton (USA) 1987: 13.000 Erkr. Milwaukee (USA) 1993: 403.000 Erkr. Las Vegas (USA) 1993/94: 103 Erkr. 20 Tote 39 Legionellen: Infektionen durch „technische Vektoren“ (seit 1998) Fälle 1998 1999 2000 2001 2001 2001 2001 2002 2002 2002 2003 2003 2003 2003 Tote Schweiz, verschiedene Orte und Ursachen Amsterdam: (Blumenschau, Springbrunnen) Melbourne (Kühltürme) Valencia: (Kühltürme vermutet) Ohio (Ford Motor Comp., Ursache unbekannt) Paris (Hospital) Pamplona, Sp (Hospital) Japan (heiße Quellen) Cumbria, UK (Klimaanlage) Matara, Sp (Klimaanlage) Valencia (Heißwassersystem) Deutschland, Frankfurt/ Oder (Altenheime, Wasser) Frankreich (Chemiefabrik bei Lens, Kühlsystem) Kreuzfahrtschiff „Ocean Monarch“ (Warmwassersystem) 78 192 101 98 4 12 18 252 131 124 25 ? 68 4 8 21 21 4 2 2 3 6 4 2 1 6 8 1 Grenzwerte nach der Trinkwasserverordnung Parameter (Anl.1) Grenzwert E. coli 0/100ml Enterokokken 0/100ml Coliforme 0/100ml Indikatorparameter (Anl. 3) Clostridium perfringens: Koloniezahl bei 22°C Koloniezahl bei 36°C Pseudomonas aeruginosa: 0/100ml 100/ml am Zapfhahn 20/ml nach Abschluss der Aufbereitung 1000/ml bei Anlagen bis 1000m 3/Jahr 100/ml Bei Koloniezahl „Grenzwert“: Keine wesentlichen Änderungen 0/100ml Nachweis von Mikroorganismen nach der Trinkwasserverordnung: Koloniezahl: Als Koloniezahl (KBE: Koloniebildende Einheiten) wird die Zahl sichtbaren Kolonien definiert, die aus 1ml Wasser auf nährstoffreichen Agarnährböden bei einer Bebrütungstemperatur von 20°C + 2°C und 36°C + 1°C nach 44 + 4 Stunden gewachsen sind. Nach der neuen TrinkwV von 2001 wird die Koloniezahl nach Membranfiltration bestimmt. Über den Indikatorparameter KBE wird nur ein geringer Teil der tatsächlichen bakteriellen Belastung des Wassers erfasst. Der Nachweis von Escherichia coli und coliformen Keimen gilt als Indikator einer fäkalen Verunreinigung des Wassers. Die Definition von Escherichia coli nach der Trinkwasserverordnung (TrinkwV) von 1990: „Laktosefermentation zu Säure und Gas, negative Oxidase-Reaktion, positive Indol-Bildung, negative Citratreaktion und Glukose- und Mannitfermentation zu Säure und Gas bei 44° C“ wurde in der neuen TrinkwV von 2001 durch die Referenznorm ISO 9308-1: „Säurebildung durch Laktosefermentation (Besitz des Enzyms - Galaktosidase), negative Oxidase-Reaktion und positive Indol-Bildung“ ersetzt. Nur wenige Promille der Mikroflora im menschlichen Stuhl sind E. coli, pro Tag werden dennoch von einer Person jedoch bis 1 Trillionen E. coli ausgeschieden. Neuere Untersuchungen lassen aber an der Verlässlichkeit dieses Indikators zweifeln. Vor allem einige im Trinkwasser vorkommende Viren (Hepatitis, Polio, Coxsackie, Gastroenteritis Viren) 40 und auch Protozoen (Cryptosporidium) überleben länger als E. coli im Wasser oder verhalten sich gegenüber Aufbereitungswirkungen anders. So konnten Viren Desinfektion Schritte die Wasseraufbereitung passieren, ohne inaktiviert zu werden, obwohl die bakteriologischen Anforderungen erfüllt wurden. Coliforme Bakterien sind häufig „Umweltkeime“ und nur teilweise fäkalen Ursprungs. Neben der Gattung Escherichia sind dies z.B. Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Klebsiella u.a. Coliforme Bakterien wurden nach der alten TrinkwV von 1990 als eine physiologische Gruppe innerhalb der Enterobakterien bezeichnet, die durch „Laktosefermentation mit Säure und Gasbildung innerhalb von 48 Stunden bei 36°C“ definiert ist. Die Referenznorm der neuen TrinkwV von 2001 definiert sie durch die Merkmale: „Säurebildung durch Laktosefermentation und Besitz des Enzyms - Galaktosidase sowie negative Oxidase-Reaktion“. Die Gasbildung als diagnostisches Merkmal wurde in der neuen TrinkwV von 2001 sowohl bei E. coli wie auch bei den coliformen Keimen weg gelassen. Nach der EG- Badegewässerverordnung werden Fäkalcoliforme (thermotolerante Coliforme keime wie E. coli) von den Gesamtcoliformen unterschieden. Diese werden zum Teil auch als Umweltcoliforme oder als nicht fäkale Coliforme (engl. Non-faecal coliforms) bezeichnet, obwohl sie auch über den Darm von Mensch und Tier ausgeschieden werden können. Als weiterer Indikator für Darmkeime wurden in die TrinkwV die so genannten Enterokokken eingeführt: „Grampositive, katalase-negative Kokken, die resistent gegen Natriumchlorid und Rindergalle sind und in einem Temperaturbereich von 10°C bis 45°C bis zu einem pH-Wert von 9,6 wachsen“ und außerdem Aesculin hydrolysieren. In der alten TrinkwV von 1990 wurden sie als Fäkal-Streptokokken (D-Streptokokken) bezeichnet. Der Parameter „Enterokokken“ zielt im Wesentlichen auf humane Fäkalindikatoren wie Enterococcus faecalis, E. durans, E. faecium), aber auch Umweltkeime, die z.B. auf pflanzlichen Rückständen leben, werden erfasst. Enterokokken sind wesentlich resistenter als coliforme Keime gegen chemische Desinfektionsmittel wie Chlor. Die TrinkwV lässt die Anwendung anderer Nachweisverfahren zu, sofern sie im Vergleich zur Referenzmethode mindestens gleichwertige Ergebnisse liefert. Der Nachweis von Clostridium perfringens (früher nach der alten TrinkwV von 1990: Sulfitreduzierende, sporenbildende Anaerobier) erfolgt über Membranfiltration (aus 100ml). Es ist ein Indikatorparameter, der die möglich Beeinträchtigung des Trinkwassers durch Oberflächenwasser anzeigen soll. Wegen der hohen Stabilität dieser Keime gegen Desinfektionsmaßnahmen (Sporenbildner!) gilt Clostridium perfringens auch als Indikator für Chlor-resistente Organismen wie beispielsweise Oozysten von Cryptosporidium parvum. Die TrinkwV schreibt für spezielle Wasserversorgungssysteme und Anwendungen weitere bakterielle Untersuchungen vor wie zum Beispiel Legionellen (L. pneumophila) in Warmwassersystemen und aerosolbildenden Einheiten) und Pseudomonas aeruginosa im Badewasser und in Behälter abgefülltem Wasser. Im Verdachtsfall kann das Gesundheitsamt zusätzliche Untersuchungen fordern, so zum Beispiel: Darmpathogene Keime wie Salmonellen, Shigellen, Campylobacter, Yersinien, Parasiten wie Cryptosporidien oder Lamblien oder Viren. Nachweis und Differenzierung von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden (nach TrinkwV u.a.) „Einfache“ Differenzierungsmöglichkeiten: 1. Blutagar: Optimalnährboden, Hämolysenachweis 2. MacConkey-Agar: Selektivnährboden für gramnegative Bakterien. Laktoseverwertung-positiv: Bakterien bilden rötlich bis rötlich-violette Kolonien. Laktoseverwertung-negativ: Bakterien bilden helle Kolonien. 3. Cytochromoxidase-Reaktion: Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette. Oxidase-Reagenz wird im Bereich verdächtiger Kolonien aufgetropft. Positive Reaktion: blauviolette Färbung der Kolonien nach 10-15 Sekunden 41 4. Laktose-Pepton-Bouillon (Vergärung von Laktose): a) enthält einen Indikator zum Nachweis von Säurebildung. Positiv: Farbumschlag von purpur nach gelb nach 24-44 h bei 36°C und 44°C b) enthält ein Durham-Röhrchen zum Nachweis von Gasbildung: Positiv: Deutlich sichtbare Gasblase im Durham-Röhrchen nach 24-44 h bei 36°C und 44°C 5. Weitere Differenzierungen: „Bunte Reihe“, standardisierte Mikromethoden Einige Merkmale von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden +/- Coliforme Keime +/- Pseudomonaden +/- auf MacConkey-Agar + + - Gas- und Säurebildung bei 36°C: in Laktose-PeptonBouillon + + - Gas- und Säurebildung bei 44°C: CytochromoxidaseReaktion in Laktose-PeptonBouillon Test + - - - - + Nachweis: Wie: Hämolyse: auf Blutagar Laktoseverwertung: E. coli Aufgabe: (3er Gruppe pro Tisch) Nachweis und Differenzierung von Keimen im Wasser nach TrinkwV u.a. Es werden folgende Wasserproben aus Wassersystemen untersucht: - Trinkwasser aus Wasserhahn - Wasser aus dem Duschschlauch einer Patientendusche - Wasser aus einer lange nicht benutzten Augendusche 1. Von jeder Wasserprobe werden jeweils 0,5ml Wasser mit einer Pipette auf 2 Agarplatten getropft und mit einem Wattetupfer ausgestrichen: - Blutagar = Optimalnährboden (hämolysierende Mikroorganismen) - MacConkey-Agar = Selektivnährboden für gramnegative, insbesondere coliforme Keime in Wasser und Lebensmittel 2. Von jeder Wasserprobe werden jeweils 1ml Wasser in eine 1,5-fach konzentrierter Laktose-Pepton – Bouillon zum Nachweis Laktose-Abbauender Bakterien überführt Platten und Reagenzgläser mit Platznummer und Ort der Entnahmestelle beschriften, sie werden am Ende des Kurstages eingesammelt und über Nacht bei 36°C inkubiert Auswertung und Protokollierung am nächsten Kurstag. 42 Protokoll: Nachweis von coliformen Keimen und von Pseudomonaden Entnahmestellen Nachweis: Wie: Hämolyse: auf Blutagar Laktoseverwertung: auf MacConkey-Agar Augendusche (Labor) Gas- und Säurebildung in Laktose-PeptonGas: bei 36°C: Bouillon Säure: CytochromoxidaseSiehe Anleitung Seite 11 Reaktion Beurteilung: Duschschlauch (Patientenzimmer) Gas: Säure: Trinkwasser (Wasserhahn) Gas: Säure: 43 Abschnitt III Parasitologie Kurstag 10 Übung 18: Übersicht über die wichtigsten humanpathogenen Parasiten A. PROTOZOEN B. VERMES 1. Apicomplexa: Toxoplasma gondii Plasmodium sp. Isospora Pneumocystis carinii 1. Plathelminthes (Plattwürmer) a) Trematoda (Saugwürmer) Fasciolopsis Faciola hepatica Opistorchis Schistosoma mansoni 2. Mastigophora: Trichomonas vaginalis Giardia lamblia Trypanosoma cruzi T. gambiense Leishmania donovani 3. Rhizopoda: Entamöba histolytica 4. Ciliaten: Balantidium coli C. ARTHROPODEN Krätzmilbe (Sarcoptes scabiei) Insekten als Überträger und Zwischenwirte. b) Cestoda: (Bandwürmer) Taenia solium, saginata Echinococcus multilocularis Diphyllobothrium latum Hymenolepsis nana 2. Nemathelminthes (Fadenwürmer) Nematoda: Trichuris trichiura Ascaris lumbricoides Wuchereria bancrofti Trichinella spiralis 44 Aufgabe Übung 18: Mikroskopie von parasitologischen Fertigpräparaten 1. Malaria Die Diagnose einer akuten Malaria beruht auf dem mikroskopischen Nachweis der Plasmodien (vivax, malariae, falciparum) und Gameten im Blut (Ausstrich und Dicker Tropen), am besten kurz vor dem Schüttelfrost, gestellt. Die Entwicklungsformen liegen in Erythrozyten. Der Nachweis erfolgt meist nach Giemsa-Färbung (Plasma blau, Chromatin rot) der Präparate. Mikroskopieren Sie die bereits gefärbten Malariapräparate vom Menschen, fertigen Sie Zeichnungen verschiedener Parasitenformen an und stellen Sie eine Verdachtsdiagnose. Die Präparate bitte auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung geben! 2. Trypanosoma brucei Anstelle des Erregers der Schlafkrankheit Tr. gambiense bzw. rhodesiense (15 - 30m) verteilen wir Tr. brucei, den für den Menschen ungefährlichen Erreger der Nagana (Tierseuche), der in Form und Bewegungsmodus dem Erreger der menschlichen Schlafkrankheit gleicht und ebenfalls durch den Stich der Glossinen übertragen wird. Mikroskopieren Sie die bereits gefärbten Präparate von Trypanosoma brucei und fertigen Sie Zeichnungen an. Präparate auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung geben! 45 Vermes: Wichtig: Wurmeier-Präparate mit den Trockensystemen (10er und 40er Objektiv) und ohne Öl mikroskopieren, Blende schließen. Fertigen Sie Zeichnungen von Ascaris-, Trichuris- und Taenia-Eiern (Spul-, Peitschen- und Bandwurm) an. Präparate auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung! Ascaris (Nematoda) Taenia (Cestoda) Trichuris (Nematoda) 46 Anhang: Zusammensetzung von Kulturmedien, Reagenzien und Farblösungen Kulturmedien: 1. Flüssiges Thioglykolatmedium: Universelles Anzüchtungsmedium für aerobe und anaerobe Bakterien Tryptisch verdautes Casein 15,0 (g/l) 1-Cystin 0,5 Dextrose 5,0 Hefeextrakt 5,0 NaCl 2,5 Natrium-Thioglycolat 0,5 Resazurin (Redoxindikator) 0,001 Agar 0,75 End-pH 7,1 in 8 ml-Mengen in Kulturröhrchen abfüllen, 15 min bei 120 oC sterilisieren, bei Zimmertemperatur lagern (Haltbarkeit etwa 6 Wochen, danach muss durch Erhitzen auf 100oC erneut entgast werden). 2. Trypticase Soy Agar (Peptonagar für Anzüchtung und Stammhaltung): Trypticase (Casein-Digest) 15,0 (g/l) Phytone (Soja-Pepton) 5,0 NaCl 5,0 Agar 15,0 In 200 ml-Portionen 20 min bei 120oC sterilisieren, auf 50oC abkühlen, in Petrischalen gießen. 3. Blutagar: Universelles Anzüchtungsmedium und Medium zum Nachweis von Veränderungen des Erythrozytenstroma bzw. des Hämoglobins durch den bakteriellen Stoffwechsel. Herstellung: durch Zusatz von 6 Vol% sterilen, defibrinierten Hammelbluts zu dem sterilisierten und auf 50oC abgekühlten Peptonagar. 4. Kochblutagar: Hochwertiges Anzüchtungsmedium, insbesondere für Neisseria und Haemophilus. Herstellung: durch Zusatz von 5-10% sterilen defibrinierten Hammelbluts zu dem sterilisierten und auf 80oC abgekühlten Peptonagar, Inkubation des Gemisches für 15 min bei 80oC, Abkühlung auf 50oC und gießen. 5. Endo-Agar (Fuchsin-Laktoseagar): Selektivmedium für gramnegative Bakterien und Indikatormedium für Laktosefermentation Herstellung: Pepton "Witte" 10,0 (g/l) Na2HPO4 2,0 NaCl 6,0 Hefeextrakt 1,0 Fleischextrakt 3,0 Agar 20,0 NaOH q.s. pH 7,4-7,6 Für 15 min bei 120oC sterilisieren, auf 100oC abkühlen. Hitzeempfindliche Komponenten zusetzen: Lactose 10,0 (g/l) gesättigte alkohol. Fuchsinlösung (filtriert) 5 ml Natriumsulfitlösung, 10%ig, so viel, dass der in heißem Zustand rosa gefärbte Nährboden nach dem Erkalten farblos wird (Probeplatte gießen!). Da die grampositiven Kontaminanten aus der Luft durch Fuchsin gehemmt werden, erfordert die Herstellung des Endoagars nicht die strengsten Sterilitätskautelen. 47 6. Polytropes Medium nach KLIGLER: Indikatormedium für Glucose- und Laktosefermentation einschl. Gasbildung, H2SBildung sowie oxydativen Aminosäureabbau. Herstellung: Pepton 15,0 (g/l) Fleischextrakt 3,0 Hefeextrakt 3,0 Proteose-Pepton 5,0 Lactose 10,0 Dextrose 1,0 FeSO4 0,2 NaCl 5,0 Na-Thiosulfat 0,3 Agar 12,0 Phenolrot, atoxische Charge 0,024 pH = 7,0 In 5 ml-Portionen in Kulturröhrchen abfüllen, 15 min bei 120oC sterilisieren, in Schräglage erstarren lassen (Schrägfläche und Stichteil sollen etwa gleich groß sein). 7. Medium z. Nachweis der Säurebildung aus Kohlenhydraten, Zuckeralkoholen und Glykosiden : Herstellung: Peptonwasser-Basis: Liebigs Fleischextrakt 5,0 (g/l) Pepton "Witte" 10,0 NaCl 3,0 Na2HPO4 x 12 H2O 2,0 Indikator-Stammlösung: Bromthymolblau 1,0 g 0,1 N NaOH 25,0 ml A. dest. Ad 500,0 ml 12 ml der Bromthymolblau-Stammlösung/Liter Peptonwasserbasis zusetzen, 100 ml Portionen abfüllen und mit 0,5 Gew. % der Substrate versetzen. Die zu 5 ml Portionen in entsprechend gekennzeichnete Kulturröhrchen abgefüllten Medien werden fraktioniert sterilisiert, indem man sie an drei aufeinander folgenden Tagen für jeweils 15 min im Kochschen Dampftopf auf 90100°C erhitzt. Alternativ: Sterilisation durch Filtration. 8. Medium zum Nachweis der Nitratreduktion Herstellung: KNO3(nitritfrei!) 0,2 (g/l) Pepton "Witte" 5,0 pH 7,4 DURHAM-Röhrchen zum Nachweis von Gas sind vor der Sterilisation blasenfrei einzulegen. 5 ml Portionen in Kulturröhrchen abfüllen und 15 min auf 120°C erhitzen. 9. Trypsinbouillon, Medium zum Nachweis der Indolbildung Herstellung: Pepton "Witte" 10,0 (g/l) Liebigs Fleischextrakt 5,0 Na2HPO4 2,0 NaCl 5,0 NaOH, qs., pH 7,2 Trypsin 0,2 Chloroform 10,0 ml Gut durchschütteln, 24 Std. bei 37°C bebrüten, filtrieren, mit 2 Volumina physiologischer Kochsalzlösung verdünnen, in Röhrchen abfüllen, im Koch'schen Dampftopf sterilisieren. 48 10. Medium zum Nachweis von Urease Herstellung: Pepton "Witte" 1,0 (g/l) NaCl 5,0 KH2PO4 2,0 Phenolrot, 1:500 6,0 ml/l pH: 6,8-6,9 Für 15 min bei 120oC sterilisieren Glucose 1,0 Harnstoff 20,0 Durch Filtration sterilisieren und dem auf 60°C abgekühltem Medium zusetzen. Steril in 5 ml Portionen abfüllen und bei 4oC lagern. 11. Definiertes Medium zum Nachweis der Utilisation einer einzigen organischen Energie- und Kohlenstoffquelle Herstellung: Mineralbasis NaCl 5,0 (g/l) MgSO4 x 7 H2O 0,2 (NH4)H2PO4 K2HPO4 1,0 pH 6,9 15min bei 120oC sterilisieren. Substrate (z.B. Monosaccaride, Natriumsalze, organischer Säuren) steril filtriert zu einer Endkonzentration von 0,5Gew. % zusetzen. Steril in 0,5 ml Portionen abfüllen. Als pH-Indikator kann Bromphenolblau (12 ml/l der oben unter Nr. 7angegebenen Stammlösung) vor der Hitzesterilisation zugesetzt werden. Farblösungen 1. Alkalische Methylenblaulösung nach LÖFFLER: Gesättigte alkohol. Lösung von Methylenblau 30 ml KOH 0,01 % in Wasser 100 ml 2. Reagenzien für die Gram-Färbung: a) Karbol-Gentianaviolettlösung: Gesättigte alkohol. Lösung von Gentianaviolett Phenol 2,5 Gew.% in Wasser (frisch bereitet) Vor Gebrauch filtrieren! 10 ml 90 ml b) Verdünnte LUGOLsche Lösung: Jod 1g Kaliumjodid 2 g im Mörser mit wenig Wasser lösen, mit Wasser auf 300 ml auffüllen c) Safraninlösung: 5 Gew.% Safranin in 96% Äthanol H2O 10 ml 90 ml 3. Reagenzien für die ZIEHL-NEELSEN-Färbung: a) Karbol-Fuchsinlösung: gesättigte alkohol. Fuchsinlösung 10,0 ml Phenol 5,0 Gew. % in Wasser 90,0 ml b) Salzsäure-Alkohol: HCl 25% 3,0 ml Ethylalkohol 100,0 ml 49 6. Reagenzien für die Polkörperchenfärbung nach NEISSER: a) Lösung A: Methylenblau 1,0 g Äthanol 96% 20,0 ml Lösen Eisessig 50,0 ml H2O 1000,0 ml b) Lösung B: Kristallviolett Äthanol 1,0 g 10,0 ml Lösen 200,0 ml H2O Gebrauchslösung: 2 Teile Lösung A + 1 Teil Lösung B = NEISSER I (Die Gebrauchslösung ist nur wenige Tage haltbar) c) Lösung C: (für die Gegenfärbung): Chrysoidin 1,0 g Lösen in: 300,0 ml heißem Wasser = NEISSER II Reagenzien 1. TMPD-Oxydase Reagenz N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylen-diamin-dihydrochlorid, 1 Gew. %, wässrig, mit Ascorbinsäure partiell reduziert, wöchentlich frisch hergestellt. 2. Indolreagenz (Mod. KOVACS-HOFFMANN) p-Dimethyl-aminobenzaldehyd 5,0 g n-Butanol 75,0 ml HCl spez. Gew. 1,19 25,0 ml 3. Nitritreagenz (GRIESS-ILOSVAY) Lösung A: Sulfanilsäure 0,8 Gew.% in 5 N Essigsäure Lösung B: alpha-Naphthylamin, 0,5 Gew.% in 5 N Essigsäure Gebrauchslösung: Lösung A und B unmittelbar vor Gebrauch zu gleichen Teilen mischen.
