Vergleichende sero-immunologische Untersuchungen über die
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V I R E N DER I N F L U E N Z A UND K L A S S I S C H E N GEFLÜGELPEST 81 Vergleichende sero-immunologische Untersuchungen über die Viren der Influenza und klassischen Geflügelpest Von WERNER SCHÄFER Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen (Z. Naturforschg. 10 b, 81—91 [1955]; eingegangen am 1. Dezember 1954) Zwischen dem Virus der klassischen Geflügelpest und Vertretern des A-Typs der Influenza bestehen sero-immunologische Beziehungen, die mit Hilfe der Komplementbindungs-Probe und des Kreuzimmunisierungs-Versuches festgestellt wurden, durch den Präzipitations-, Hämagglutinations-Hemmungs- und Neutralisations-Versuch aber nicht nachzuweisen waren. Die serologische Untersuchung der Spaltprodukte des Influenza-FM/j- und GeflügelpestVirus ergab, daß die antigene Komponente, die beiden Erregern gemeinsam ist, im „gebundenen Antigen" der Virus-Elementarteilchen ihren Sitz hat. An Hand dieser Feststellung wurde eine Erklärung für den unterschiedlichen Ausgang der verschiedenen sero-immunologischen Reaktionen gesucht. Ebenso wie die Influenza-Viren ließ sich auch das Geflügelpest-Virus durch intranasale Impfung auf die Lunge der weißen Maus übertragen. Es wurde auf diese Weise bisher in 14 Passagen fortgeführt. Die Viren der Influenza und klassisdien Geflügelpest sind auf Grund der Übereinstimmungen, die sie in physikalisch-chemischer und sero-immunologischer Hinsicht zeigen, nunmehr endgültig in eine Gruppe einzuordnen. D as Virus der klassischen Geflügelpest (K.P.) wurde in den letzten Jahren eingehend in physikalisch-chemischer und biologischer Richtung u n t e r s u c h t 1 - 8 . Seine Stellung im System der Virusarten ist aber bis heute noch nicht eindeutig geklärt. Wegen seiner hämagglutinierenden Eigenschaften reihte man es ursprünglich mit anderen hämagglutinierenden Virusarten — wie dem Virus der atypischen Geflügelpest, dem Mumps- und InfluenzaVirus — in eine Gruppe ein. Mit dem atypischen Geflügelpest-Virus, das sehr ähnliche pathologischanatomische Veränderungen verursacht, kann es aber wegen seiner vollständig andersartigen physikalisch-chemischen und sero-immunologischen Eigenschaften nicht verwandt s e i n 9 - 1 1 . W i e es sich zum 1 W. S c h ä f e r u. G. S c h r a m m , Z. Naturforschg. 5 b, 91 [1950]. 2 W. S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 6b, 207 [1951], 3 K. M ü n k u. W. S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 6b, 372 [1951]. 4 W. S c h ä f e r , K. M ü n k u. O. A r m b r u s t e r , Z. Naturforschg. 7 b, 29 [1952]. 5 W. S c h ä f e r u. K. M ü n k , Z. Naturforschg. 7b, 608 [1952], e W. S c h ä f e r , Mh. Tierheilkunde 5, 229, 267, 316 [1953]. ^ W. S c h ä f e r u. W. Z i 11 i g , Z. Naturforschg. 9 b, 779 [1954], 8 G.Hotz u. W. S c h ä f e r , Z. Naturforschg. 10 b, 1 [1955], Mumps-Virus verhält, wurde noch nicht näher geprüft. Mit dem Influenza-Virus (s. 1. c . 1 2 ) stimmt es nach den bisherigen Untersuchungen zumindest in physikalisch-chemischer Hinsicht weitgehend überein. Letzteres hat nicht nur ein ähnliches elektronenoptisches Aussehen, sondern sedimentiert auch in der analytischen Ultrazentrifuge mit annähernd gleich großer Geschwindigkeit wie das K.P.-Virus. Wesentliche Unterschiede bestehen aber in den Infektiositäts-Spektren. Während das K.P.-Virus unter natürlichen Bedingungen ausschließlich Vögel befällt, ließ sich das Influenza-Virus bisher nur auf den Hühnerembryo, nicht aber auf Küken und erwachsene Vögel übertragen. Sero-immunologisch wurden die beiden Virusarten u. W . noch nicht verglichen. Durch die vorliegenden Untersuchungen sollte dies nachgeholt werden. Es wurden dazu neben der Komplementbindungs- und Präzipitations-Probe, der Hämagglutinations-Hemmungs-, der Neutralisationsund der Kreuzimmunisierungs-Versuch herangezogen. Daneben wurde noch geprüft, ob sich das K.P.Virus, ebenso wie die Influenza-Erreger, im Lungengewebe der Maus vermehrt. 9 W. S c h ä f e r , Tierärztl. Umschau 1950, 241. 10 Z. D i n t e r , Ardi. Virusforschg. 3, 207 [1944]. 11 H. E. M o s e s , M. S. B r a n d 1 y , E. E. J o n e s u. E. L. J u n g h e r r , Amer. J. Vet. Res. 9, 314 [1948]. i- G. S c h r a m m , Die Biochemie der Viren, Verlag Springer, 1954. Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. Zum 01.01.2015 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung „Keine Bearbeitung“) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On 01.01.2015 it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition “no derivative works”). This is to allow reuse in the area of future scientific usage. W. S C H Ä F E R 82 I. Material und Methoden 1. V i r u s m a t e r i a l Die Untersudiungen wurden mit den K.P.-Stämmen Rostock und Brescia und den Influenza-Stämmen FM/ r PR 8 und Lee durchgefühlt. Der Stamm Brescia wurde uns von Herrn Prof. H a l l a u e r , Bern, der Stamm Lee von Herrn Prof. H a a s , Marburg, zur Verfügung gestellt. Die Stämme FM/j und PR 8 erhielten wir von Herrn Prof. H e r z b e r g , Marburg. Alle erwähnten Virusarten passagierten wir in Hühnerembryonen; dabei wurden stets hochgradig verdünnte Eiflüssigkeiten (10 -5 bis 10"6) weiterverimpft. Von den Stämmen Rostock und FM/j zweigten wir Mäusepassagen ab, in diesen wurde der Stamm Rostock durch intracerebrale, der Stamm FM/j durch intranasale Impfung weiter übertragen. Als Antigen für die serologisdien Reaktionen benutzten wir aussdiließlidi hochgiadig gereinigte Konzentrate der versdiiedenen Viren. Die Reinigung und Konzentrierung erfolgte durch fraktioniertes Zentrifugieren 4. Als Ausgangsmaterialien wurden die Eiflüssigkeiten infizierter Embryonen benutzt. Ein Konzentrat von FM/j-Virus überließ uns Herr Prof. T r a u b , Tübingen. Es zeigte das gleiche serologische Verhalten wie die von uns hergestellten FM/j-Konzentrate. gleichen Wege impften. 8 Tage nadi der zweiten Impfung wurde dann das Serum gewonnen. Weitere Influenza-Anti-Seren bezogen wir von anderen Laboratorien. Ein FM/j-Antiserum von Mäusen (Tr.) überließ uns Herr Prof. T r a u b , Tübingen, ein A'Antiserum vom Menschen Herr Dr. H oy 1 e, Northampton. Sämtliche Seren wurden 30 Minuten bei 56° C erhitzt. Die für die Neutralisations-Versuche vorgesehenen Antiseren wurden danach durch bakteriendichte Filter geschickt, die übrigen zumeist durch Zusatz von 0,5% Phenol konserviert. In den Komplementbindungs-Proben kamen nur solche Seren zur Verwendung, die keinerlei Eigenhemmung zeigten. 4. K o m p l e m e n t b i n d u n g s tations-Versuche und Präzipi- Genauere Angaben über die Durchführung dieser Reaktionen finden sich in früheren Veröffentlichungen2>3. Bei der Komplementbindungs-Probe (K.B.) wurden zwei 100-proz. lösende Dosen von Komplement verwandt und fallende Antigen- gegen fallende Serummengen angesetzt. Die Präzipitations-Probe führten wir nach dem von H e i d e l b e r g e r ! 3 entwickelten Verfahren als quantitative Beaktion durch. 2. V e r s u c h s t i e r e 5. Die Versuchsmäuse stammten aus einer weitgehend ingezüditeten eigenen Kolonie. Es wurde darauf geachtet, daß möglichst nur Tiere gleichen Alters und gleichen Gesdiledits in einem Versuch zur Verwendung kamen. Die Versuchshühner bezogen wir von einer Farm, die schon mehrere Jahre von uns überwacht wird. K.P. wurde in ihr bisher nicht festgestellt. Bei der Hämagglutinations-(H.A.)-Reaktion wurde das Material nach Potenzen von 2 verdünnt und zu 1 ccm dieser Verdünnungen ein Tropfen Hühnerblut 9 • 107 Erythrocyten) hinzugefügt. Die Teströhrchen blieben 45 Min. bei Zimmertemperatur stehen. Der Ausgang der Reaktion wurde dann nach der Art der Sedimente beurteilt 14. 1 hämagglutinierende (H.A.)-Einheit entspricht derjenigen Virusmenge, die in 1 ccm Lösungsmittel nach Zusatz von ~ 9 • 10" Erythrocyten noch eine positive H.A. bewirkt. 3. S e r e n Die gegen das Rostock-Virus gerichteten Mäuse- und Kanindien-Seren gewannen wir nach Verfahren, die bereits f r ü h e r 3 ausführlich beschrieben wurden. Für die Immunisierung der Mäuse wurde nur MäusepassageVirus, für die Immunisierung der Kaninchen nur Virus aus Hühnerembryonen verwandt. Die Kaninchenseren sättigten wir mit normaler Komponente aus Eiflüssigkeit von Hühnerembryonen 3 ab. Die Anti-Rostock-Seren von Hühnern stammten von Tieren, die zuerst mit FormolVakzine aus Viruskonzentraten1 immunisiert wurden und später große Mengen von aktivem Virus erhielten; 14 Tage nach der Injektion der Formol-Vakzine wurden 107 bis 10* und anschließend in 8-tägigen Zeitabständen noch 2-mal 10 ! bis 1010 tödliche Dosen von K.P.-Virus (infektiöse Eiflüssigkeit) intramuskulär verabfolgt. 7 Tage nach der letzten Impfung gewannen wir die Seren. Seren gegen das FMi^Influenza-Virus erzeugten wir dadu-ch, daß wir Mäuse mit einem dieser Tierart angepaßten FM/j-Stamm (15. bis 17. Mäuselungen-Passage) intranasal infizierten und 14 Tage später, nachdem sie die Krankheit überstanden hatten, nochmals auf dem 13 M. H e i d e l b e r g e r , Bacteriol. Rev. 3, 49 [1939]. 14 J. E. S a l k , J. Immunology 49, 87 [1944], Hämagglutinations-Reaktion 6. H.A. - H e m m u n g s p r o b e Ebenso wie in der Komplementbindungs-Reaktion wurde auch in der Hämagglutinations-Hemmungsprobe neben der Serum- (Verdünnung 1 : 10 bis 1 : 80) noch die Virusmenge (1 bis 256 hämagglutinierende Einheiten) variiert. Wir mischten 0,5 ccm Virusverdünnung mit 0,5 ccm Serumverdünnung, ließen das Gemisch 30 Min. bei Zimmertemperatur stehen, setzten dann einen Tropfen Hühnerblut zu und lasen das Ergebnis der Reaktion sdiließlich 45 Min. später ab. 7. Neutralisations-Versuche Die Neutralisations-Versudie wurden nach der von H i r s t 1 5 für Influenza empfohlenen Technik durchgeführt, bei der die Virus-Serumgemische in den Allantoissack von 11 Tage alten Hühnerembryonen verimpft werden. Gepiüft wurden die Virusstämme Rostock, FM/, und Lee, die in Eiflüssigkeiten vorlagen, mit den AntiK.P.-Seren von Maus und Huhn und den entsprechenden 15 G. K. H i r s t , J. Immunology 45, 285 [1942], V I R E N DER I N F L U E N Z A UND K L A S S I S C H E N H.A.-EinSerumverdünnung Anti- heiten im an- Antigenvergen gesetzten dünnung Antigen Antigen Rostode Rostock Brescia FM/I PRa Lee 512 256 128 64 32 16 128 64 32 16 4096 2048 1024 512 256 128 64 4096 2048 1024 512 256 128 2048 1024 512 256 128 64 1/32 1/64 4 4 4 4 4 2,5 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/8 1/16 1 32 1/64 1/128 1/256 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 4 4 4 4 3 0,5 0,5 1 4 3 2,5 FMJ 2 2 2 0,5 Lee 0,5 3,5 0,5 4 2 4 0,5 2 1/16 1/32 1/64 4096 2048 1024 512 256 128 83 Antigen- Serumverdünnung verdünnung 1/4 1/8 1/16 1 32 1/64 1/128 2048 1024 512 256 128 64 32 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 2048 1024 512 256 128 64 32 1/8 1 16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 2,5 3 3 2 0,5 1 2,5 3 3,5 4 4 4 2 3 3,5 Tab. 2. Komplementbindungs-Versuche mit FMI i-Mäuseserum (Tr.). 1/2 1/4 1/8 H.A.- Einheiten im angesetzten Antigen GEFLÜGELPEST 0,5 Antigen 1/2 1/4 1/8 Rostock 1 16 1/32 1/64 AK = Ant'genkontrolle mit Komplement ohne Serum, AKOK = Antigenkontrolle ohne Komplement und ohne Serum, 4 = keine Hämolyse, 3 = geringe Hämolyse usw., — = vollständige Hämolyse, 0 = nicht angesetzt. T a b . l . Komplementbindungs-Versuche mit K.P.-Serum Normalseren. Es wurden fallende Virusmengen (Potenzen von 10) mit gleichbleibenden Serummengen (konzentriert) gemischt. Die Gemische ließen wir 1 Stde. bei 4° C stehen und verimpften dann jede Verdünnung an 7 Eier. Die Impfdosis pro Ei betrug 0,1 ccm. Als Merkmal für das Angehen der K.P.-Infektion diente das Absterben der Embryonen. Die Vermehrung der InfluenzaViren wurde durch Prüfung der Eiflüssigkeiten in der H.A.-Probe festgestellt. Sowohl bei Influenza als auch bei K.P. wurden die Versuche 3 Tage nach Beimpfung der Eier abgeschlossen. Die MID 50 errechneten wir nach der Methode von R e e d und M u e n c h " . Der Neutralisations-Index ist der Quotient: MID-j>a0 des Gemisches mit Antiserum MID 50 des Gemisdres mit Normalserum # FM/, H.A.-Einheiten im Antigenverangesetzten dünnung Antigen 1024 512 256 128 64 32 16 256 128 64 32 16 8 4 2 Lee 1024 512 256 128 64 32 16 Serumverdünnung 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Tab. 3. Komplementbindungs-Versudie mit Influenza-A'- Serum vom Mensdien. 0,5 84 W. S C H Ä F E R II. Ergebnisse 1. K o m p l e m e n t b i n d u n g s - P r o b e In der Komplementbindungs-Probe verwandten wir als Antigene Konzentrate von sämtlidien uns zur Verfügung stehenden K.P.- und Influenza-Virusarten (Rostock, Brescia, PR 8, FM/j und Lee). Als komplementbindende Antiseren wurden die Rostockund FM/ r Seren von Mäusen sowie das A'-Serum vom Menschen verwandt. Die Versuchsergebnisse sind in den Tab. 1 — 3 zusammengefaßt. Es ließ sich zeigen, daß mit dem K.P.-Antiserum nicht nur die K.P.-Viren, sondern auch das F M / r Virus der Influenza reagieren (s. Tab. 1). Ein gewis- \ '^0,15 l 0,10 0,05 0,05 0,10 0,15 0,20 mg Antigen N— Abb. 1. Präzipitation von Rostock-, FM/i- und Lee-Virus durdi Anti-K.P -Serum vom Kaninchen, x = Rostock, o = FM/i, # = Lee. ser Untersdiied im antigenen Aufbau der beiden Erregerarten kommt allerdings dadurdi zum Ausdruck, daß für eine positive KomplementbindungsReaktion beim FM^-Virus eine 4-fach größere Menge von K.P.-Serum erforderlich ist als beim K.P.-Virus. Audi die Antigenmenge, die man für eine positive Reaktion benötigt, ist beim FM/j-Virus größer als beim K.P.-Virus; gemessen nach hämagglutinierenden Einheiten ist etwa die 8-fache Dosis erforderlidi. — In sehr geringem Grade greift das K.P.-Antiserum audi auf den zweiten Vertreter des A-Typs der Influenza (PR 8) über. Mit dem BVirus (Stamm Lee) dagegen reagiert es nicht. Überkreuzreaktionen, bei denen F M l A n t i s e r e n von Mäusen als spezifisdie Amboceptoren verwandt wurden (s. Tab. 2), sicherten diese Ergebnisse. Eine Hemmung der Hämolyse erfolgte hier nur in den Ansätzen mit F M / r und K.P.-, nidit aber in denen iß L. J. R e e d 493 [1938], Das K.P.-Virus besitzt also auf Grund des Ausgangs der Komplementbindungs-Reaktionen antigene Gruppen, die sidi in Vertretern des A-Typs der Influenza wiederfinden. 2. 0,25 ^0,20 E mit Lee-Virus. Die quantitativen Verhältnisse entsprechen annähernd den vorher beschriebenen. In einem Versuch, in dem wir die eingesetzten AntigenN-Mengen kannten, fanden wir, daß vom RostockVirus etwa 6 y N für eine positive Komplementbindungs-Probe mit FM/j-Serum benötigt werden. Eindeutig positiv reagierte auch das A'-InfluenzaSerum vom Menschen mit dem K.P.-Stamm Rostock (s. Tab. 3). Hier waren noch Serumverdünnungen von Vso bis Vieo wirksam. u. H. M u e n c h , Amer. T. Ilvg. 27, Präzipitations-Probe Durch die quantitative Präzipitations-Probe mit K.P.-spezifischem Kaninchenserum ließ sich dieses Ergebnis nicht bestätigen. Hier wurde ein eindeutiges Präzipitat nur gefunden (Abb. 1), wenn zu dem K.P.-spezifischen Antiserum vom Kanindien K.P.Virus hinzugefügt wurde. Das FM/^Virus dagegen wurde von diesem Serum ebensowenig präzipitiert wie das Lee-Virus. Die geringen Niederschläge, die in den Ansätzen mit diesen beiden Viren vorhanden waren, können nicht als spezifisdi gewertet werden. Sie sind wahrsdieinlich auf die Einwirkung einer schon im normalen Kanindienserum enthaltenen Inhibitorsubstanz zurückzuführen 3 . 3. H ä m a g g l u t i n a t i o n s - H e m m u n g s p r o b e Für die Durchführung der H.A.-Hemmungs-Probe standen uns K.P.-spezifisdie Immunseren von Huhn und Maus sowie die entsprechenden Normalseren zur Verfügung. Mit ihnen prüften wir die Virusstämme Rostock, FM/j und Lee. Gehemmt wurde durdi die genannten Seren lediglich die hämagglutinierende Wirksamkeit des K.P.Virus (s. Tab. 4), und zwar wirkten hier unsere hödisten Serumverdünnungen ( 1 : 80) noch eindeutig inhibierend. Der Hämagglutinations-Effekt der Influenza-Viren dagegen wurde selbst durch SerumKonzentrationen von 1 : 10 nidit beeinflußt. 4. N e u t r a l i s a t i o n s - V e r s u c h Neben der H.A.-Hemmungs-Probe lieferte auch der Neutralisations-Versudi keinen Anhaltspunkt für eine Verwandtschaft der Influenza- und K.P.-Viren. Geprüft wurden darin wieder Anti-K.P.- und Nor- V I R E N DER I N F L U E N Z A UND K L A S S I S C H E N Serumverdünnung 1 Ol Virusverdünnung 0 * 1 1 1 1 1 1 1 1 Ol 01 Ol Ol Ol Ol Ol Ol Huhn, normal 1/20 1/40 1/80 4 4 4 4 4 4 Huhn, K.P. 1/20 1/40 1/80 4 Maus, normal 1/10 1/20 1/40 1/80 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 3 3 4 1 0,5 0,5 2 1/10 1/20 1/40 1/80 0 4 4 4 4 4 4 4 0,5 — — 4 0,5 — 4 4 1 4 4 4 0 0 0 — — — — — — 0,5 — — 4 4 4 4 Serum Maus, K.P. ohne 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0,5 _ 0 3 — 0 4 0,5 0 0 0 0 4 4 4 4 4 4 4 4 — — — 0 0 0 0 1 0,5 bis 4 = schwacher bis starker H.A.-Effekt, — = keine H.A. Tab. 4. Hämagglutinations-Hemmungsversuche mit Rostock-Virus. Hühner-Serum Virus Rostock FM/, Lee normal MID50 + K.P. MID 50 + 8,63 7,92 8,35 < 3 7,42 7,64 NeutralisationsIndex j» 400 000 3,2 5,1 85 GEFLÜGELPEST über Kreuz schützen könnte. Die Immunisierungs- Versuche zeigten aber, daß das in gewissem Grade möglich ist. Als Versudistiere wurden in diesen Experimenten Mäuse und Hühner verwandt. Einen Teil der Mäuse immunisierten wir in der früher besdiriebenen Weise 2 mit dem im Gehirn dieser Tierart fortgeführten Rostock-Stamm und infizierten sie dann 7 Tage nadi der letzten Impfung intranasal mit einem der Mäuselunge adaptierten FM/,Stamm (10. bzw. 12. Mäusepassage). Dabei wurden, wie eine Austestung des zur Infektion benutzten InfluenzaMaterials an Mäusen ergab, etwa 10 s MID 5 0 appliziert. In einem weiteren Experiment wurde bei Mäusen eine Immunität gegen Influenza (FM/.,) erzeugt (Verfahren s. S. 82) und dann das Verhalten dieser Tiere gegenüber einer Nachinfektion mit dem der Maus adaptierten K.P.-Rostock-Stamm geprüft. Das K.P.-Material (80. Mauspassage, Gehirnsuspension) wurde 7 Tage nach der letzten Impfung mit FM/j-Virus subkutan injiziert. Es enthielt nach einer an Mäusen durchgeführten Infektiositätsprüfung (subkutane Impfung) etwa 103 MLD_ 0 *. Die Hühner wurden mit den Influenza-Stämmen FM/, und Lee geimpft und mit dem Stamm Rostock auf Immunität geprüft. Als Impfmaterial dienten hier gereinigte Konzentrate der beiden Influenza-Viren, die nodi bei einer Verdünnung von 1 : 32 000 eine positive Häm- Mäuse-Serum normal K.P. MID50 + MID50 + 8,66 8,46 8,39 < 3 7,88 8,53 NeutralisationsIndex Kontrolle mit NaCl > 400 000 3,9 0 8,00 ~ 8 8,25 MID50 — MID50 des Gemisches aus Virus und Serum. Tab. 5. Neutralisations-Versudie. malseren von Huhn und Maus. Von den VirusStämmen benutzten wir Rostock, FM/, und Lee. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tab. 5 zusammengestellt. Sie zeigt, daß die K.P.-spezifischen Seren lediglich die Vermehrung des Rostock-Virus neutralisierten. Auf das Lee- und vor allem auf das FM/ !-Virus zeigten sie aber keine Wirkung; die Indices von 3,2 bis 5,1, die hier festgestellt wurden, sind auf die normale Streuung der Infektions-Teste zurückzuführen. 5. Kreuzimmunisierungs-Versuche D a das K.P.-Virus keine Antikörper erzeugt, die das FM/j-Virus neutralisieren, rechneten wir auch nicht damit, daß man Tiere mit den beiden Viren agglutinations-Reaktion lieferten. Die Tiere erhielten davon bei der ersten Impfung 0,6 ccm und bei der 13 Tage später erfolgenden zweiten Impfung 0,5 ccm in den Brustmuskel injiziert. 7 Tage nach der letzten Injektion wurden sie durch intramuskuläre Injektion von ~ 103 tödlidien Dosen des Virus Rostock auf Immunität geprüft. Im ersten Mäuseversuch (Abb. 2) starben nach der Infektion mit FM/j-Virus innerhalb der 10-tägigen Beobachtungszeit von den 31 nicht-immunisierten Kontrollen 30 Tiere, von 31 K.P.-immunen Mäusen aber nur zwölf. Die überlebenden immunisierten Tiere wiesen z. T. nicht einmal Lungenveränderungen auf. Dieses Ergebnis kann nur in dem Sinne gedeutet werden, daß der an die Maus adaptierte * Der in Gehirnpassagen fortgeführte Stamm tötet die Mäuse audi nadi subkutaner Infektion. Er wird durdi Anti-Rostock-Serum vom Huhn neutralisiert. 86 W. S C H Ä F E R Geflügelpest-Stamm Rostock in der Lage ist, diesem Tier einen Schutz gegen eine nadifolgende Infektion mit Influenza-FM/j-Virus zu verleihen. Bei einem zweiten Versuch (Abb. 2) war das Ergebnis nicht ganz so eindeutig. Es war aber auch hier zu erkennen, daß die K.P.-immunen Mäuse der Influenza-Infektion eher widerstanden als die nichtimmunisierten Kontrollen. Im letzten Immunisierungs-Versuch an Mäusen wurden 10 FMj\-immune Tiere und 10 unbehandelte Kontrollen mit K.P.-Virus infiziert. Sämtliche 1. Versuch K.P. immunisiert 4 • • - w 9 mk W< WA w m m Kontrolle, nicht immunsiert IP ff 1 i Die im Immunisierungs-Versuch verwandten Tiere waren 8 Wodien alte Leghornhähndien, die alle dem gleichen Schlupf entstammten. Es wurden 3 Gruppen angesetzt, die je 10 bzw. 9 Tiere enthielten. Die Tiere der 1. Gruppe wurden mit FM/ t , die der 2. mit Lee immunisiert, während die der 3. Gruppe als Kontrollen dienten 2. Versuch Kontrolle, nicht 5 * K.P. immuniV • siert „ immunisiert^ P partielle Immunität erzeugt man regelmäßig, wenn man Hühner mit dem Stamm Rostock gegen den Stamm Brescia immunisiert. Ungeschützte Hühner sterben, wenn sie mit den von uns gewählten Virusdosen infiziert werden, im allgemeinen innerhalb der ersten 3 0 — 4 0 Stdn. p . i . m V' W' VM y/A'M WMm m m HP Jedes Quadrat versinnbildlicht eine Maus. IUI verendet 20 30 HO 50 60 Stunden (Überlebensdauerp.i) 70 80 *• Abb. 3. Immunisierungsversuch bei Hühnern, x = ungeimpfte Kontrollen (9 Tiere), • = mit Lee immunisiert (10 Tiere), o = mit FM/i immunisiert (10 Tiere). Testinfektion mit K.P.-Virus. schwer mittel Grad der pneumonischen Veränderungen bei der Tötung am 11. Tage p.i. s di wach IJ Keine Lungenveränderungen. Abb. 2. Immunisierungs-Versuche bei Mäusen. Tiere mit K.P.-Virus immunisiert. Testinfektion mit FM/i-Virus. Beobachtungsdauer nach Testinfektion: 11 Tage. und nicht geimpft wurden (9 Tiere). Alle Versuchstiere wurden nach der Infektion fortlaufend im Abstand von 2—3 Stdn. kontrolliert. Wie aus Abb. 3 hervorgeht, starben die mit FM/j geimpften Tiere in der Mehrzahl erst 6 0 — 7 0 Stdn. nach der Infektion mit K.P.-Virus, während die mit Stamm Lee immunisierten Hühner nicht länger als Versudisgruppe Kontrolltiere starben schon in den ersten 6 Tagen nach der Infektion. Von den FM/j-immunen Tieren verendeten dagegen während der Beobachtungszeit von 4 Wochen nur 3 Mäuse. Die restlichen 7 ließen keinerlei Krankheitsersdieinungen erkennen. Bei der Beurteilung des Hühnerversuches ist zu bedenken, daß hier Tiere verwandt wurden, die sich auch mit homologem Virus nur schwer gegen K.P. voll immunisieren lassen. Häufig kann nur eine partielle Immunität erzeugt werden, die sich dadurdi äußert, daß die Tiere nadi der Testinfektion eine längere Inkubationszeit durchlaufen als es bei nichtimmunisierten Hühnern der Fall ist. Eine derartige Zahl der Versudistiere M (Mittlere Überlebenszeit nach Testinfektion mit BostockVirus) in Stdn. ö (Stunden) FM/i Lee Kontrolle 10 10 9 61,5 30,7 33,9 + 10,7 ± 4 , 9 ±5,5 * MFM/i— M Lee / oDiff. = 8,3 (Zufallsbereich bis 3,48) MFM/i — MKontr./ oDiff. = 7,0 (Zufallsbereich bis 3,50) M Lee — MKontr./ oDiff. = 1,3 (Zufallsbereich bis 3,50) * s. S. K o l l e r , Graphische Tafeln, Steinkopf, Darmstadt. Tab. 6. Statistische Auswertung des ImmunisierungsVersudies mit Hühnern V I R E N DER I N F L U E N Z A Serum Antigen 1/5 1/10 4 4 4 2 0,5 1 0,5 0,25 0,13 0,06 0 0 0 0 0 1/16 1/32 1/64 1/128 5 2,5 1,25 0,62 0 0 0 0 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 1/8192 1/16384 3,6 1,8 0,9 0,45 0,22 0,11 0,06 0,03 0,015 1,5 2,5 4 4 4 4 3 1 0,5 0,5 2 2,5 4 ' 4 2 0,5 Rostock Hämagglutinin 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 5,4 2,7 1,35 0,68 0,34 0,17 0,09 2 0,5 0 Rostock gebundenes Antigen 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 1/4096 1/8192 1/16384 1,8 0,9 0,45 0,22 0,11 0,06 0,03 0,015 0 0 0 0 0 0 0 0 Lee -Virus Rostode gebundenes Antigen A' Mensch y N/Ansatz 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 FM h -Virus FM/t Maus Antigenverdünnung UND K L A S S I S C H E N Serunnverdürmung 1/40 1/20 1/80 4 4 4 2 0,5 4 4 4 2 0,5 4 4 4 4 4 4 2,5 0,5 1 1 0 0,5 2 4 4 4 4 2 0,5 1/160 1/320 3 3 3,5 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 — 2 3,5 4 4 2 0,5 87 GEFLÜGELPEST 0,5 1 2 2 0,5 AK — — — — — 0,5 0,5 — AKOK 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Tab. 7. Prüfung der Spaltprodukte des Rostock-Virus in der Komplementbindung mit Influenza-Seren. die ungeimpften Kontrollen lebten. Der größte Teil von ihnen war bereits ~ 30 Stdn. nach der Infektion verendet. Die statistische Auswertung des Versuches (s. Tab. 6) ergibt, daß der Unterschied zwischen Leeund Kontrollgruppe in den Zufallsbereich fällt. Die Differenzen, die zwischen jeder dieser beiden Gruppen und der FM/ X -Gruppe bestehen, sind jedoch signifikant. Es schützt also nicht nur die Impfung mit RostockVirus gegen FM/j-Infektion, sondern auch umgekehrt die Immunisierung mit FM/i-Virus in gewissem Grade gegen Rostock-Infektion. Zwischen Leeund Rostock-Virus bestehen nach dem Hühnerversuch keine derartigen Beziehungen. Die Kreuzimmunisierungs-Versuche bestätigen demnach die Ergebnisse der KomplementbindungsReaktionen, deren Gültigkeit durch die übrigen sero- immunologischen Versuche nicht bewiesen konnte. werden 6.Verteilung der g e m e i n s a m e n Antigene auf die U n t e r e i n h e i t e n der V i r u s - E l e mentarteilchen Die Virusteilchen der Influenza und K.P. lassen sich nach neueren Untersuchungen 1 7 ' 7 mit Hilfe chemischer Methoden schonend abbauen. Man erhält dann bei beiden Virusarten zwei Untereinheiten, die als Hämagglutinin und gebundenes bzw. lösliches (Influenza) Antigen bezeichnet werden und sich u. a. auch in ihrem antigenen Aufbau unterscheiden. Wir versuchten festzustellen, welche dieser Untereinheiten das dem F M / r und Rostock-Virus gemeinsame Antigen enthält. L. H o y l e , J. Hyg. 50, 229 [1952]. W. S C H Ä F E R 88 Der Versuch wurde so durchgeführt, daß wir gereinigte Elementarteilchen des Rostock- und FM/XVirus mit Hilfe von Äther 7 spalteten. Die Spaltprodukte wurden dann voneinander getrennt, gereinigt und konzentriert 7 und schließlich mit Influenza-A' bzw. K.P.-Antiserum in der Komplementbindung geprüft. Als Influenza-A'-Seren kamen ein FM/ X -Mäuseserum und das A'-Influenza-Menschenserum zur Verwendung. Die damit durchgeführten Reaktionen faßt Tab. 7 zusammen. Es läßt sich daraus entnehmen, daß in der Hämagglutinin-Fraktion des RostockVirus nur Spuren desjenigen Antigens enthalten sind, das dieses mit dem FM/j-Virus gemeinsam hat. Mindestens 90-mal größer ist die antigene Wirksamkeit des gebundenen Antigens. Von ihm reichen noch 0,06 y N für eine eindeutig positive Komplementbindungs-Reaktion mit FM/ X -Maus- oder A'-Menschenserum aus. Das ist die gleiche N-Menge, die man für eine positive Reaktion benötigt, wenn man das gebundene Antigen des Rostock-Virus mit homologem, K.P.-spezifischem Antiserum reagieren läßt 7 . In der Gegenprobe wurde als komplementbindendes Antiserum ein Rostock-Mäuseserum verwandt und dieses mit den Spaltprodukten des FM/t-Virus geprüft. Wegen Materialmangels wurde hierbei nur eine Serum Verdünnung ( 1 : 5 ) benutzt, die wir mit fallenden Antigenkonzentrationen ansetzten. Auch bei dieser Prüfung stellte sich heraus, daß fast die gesamte antigene Aktivität im gebundenen Antigen enthalten ist. Dieses war, bezogen auf Stickstoff, mindestens 16- bis 32-fach stärker wirksam als das entsprechende Hämagglutinin. In einem Kontrollversuch, in dem die Spaltprodukte des K.P.-Virus mit homologem Serum geprüft wurden, war in Übereinstimmung mit früheren Experimenten 7 die Wirksamkeit des gebundenen Antigens nur 2-mal stärker als die des Hämagglutinins. Aus der serologischen Prüfung der Spaltprodukte ergibt sich, daß der dem FM/ t - und Rostock-Virus gemeinsame Antigen-Anteil bei beiden Viren in dem Nucleoproteid lokalisiert ist, das wir als gebundenes Antigen bezeichnen. Die sehr geringen Mengen, die sich in der Hämagglutinin-Fraktion feststellen ließen, sind wahrscheinlich auf eine leichte Verunreinigung derselben mit gebundenem Antigen zurückzuführen. 7. Ü b e r t r a g b a r k e i t des K.P.-Virus auf die Mäuselunge Vom Influenza-Virus weiß man, daß sich viele seiner Stämme leicht auf die Mäuselunge übertragen lassen. Vom K.P.-Virus ist bisher nur bekannt, daß es durch intracerebrale Verimpfung im Gehirn der Maus zur Vermehrung gebracht werden kann. Wenn dieser Erreger aber dem Influenza-Virus nahesteht, ist mit der Möglichkeit zu rechnen, daß auch er sich im Lungengewebe der Maus vermehrt. Die Infektion der Lunge erfolgte durdi intranasale Impfung, bei der wir jeweils 3 Tropfen der virushaltigen Lösungen von den in Chloroform-Äther-Narkose liegenden Mäusen aspirieren ließen. Das nach dem Tode der Tiere entnommene Lungengewebe wurde für die Weiterverimpfung im Glasmörser nach Ten Broeck zerkleinert und in gepufferter NaCl-Lösung (3 ccm je Lunge) aufgeschwemmt. Mit Hilfe dieser Technik gelang es ohne Schwierigkeit, sowohl den durch intracerebrale Passagen bereits der Maus adaptierten, als auch den bisher im Hühnerembryo gehaltenen Stamm in der Mäuselunge fortzuführen. Ein Unterschied zwischen den beiden K.P.-Stämmen bestand lediglich insofern, als das bereits der Maus adaptierte Virus schon bei den ersten Lungenpassagen die Tiere nach 2 — 3 Tagen tötete, während der Embryo-Stamm dazu 4 — 5 Tage benötigte; in den späteren Passagen zeigte aber auch er die gleiche pathogene Wirksamkeit. Die Mäuse erkrankten unter schweren pneumonischen Erscheinungen. Die diesen zugrunde liegenden pathologischanatomischen Veränderungen waren makroskopisdi von den bei Influenza entstehenden nicht zu unterscheiden. Mit beiden K.P.-Virus-Stämmen wurden je 14 Lungenpassagen bei Mäusen durdigeführt Um sicherzustellen, daß die pathologischen Veränderungen der Mäuse durdi das K.P.-Virus und nidit durch irgendein latent vorhandenes Mäusevirus verursacht wurden, prüften wir das Material der 11. Lungenpassage noch in einem Neutralisations-Versuch. Es wurde dafür der Stamm ausgewählt, der vom Mäusegehirn-Virus ausging. Wir misditen steigende Verdünnungen eines 10-proz. Mäuselungen-Extraktes (0,4 ccm) mit einer gleichbleibenden Menge Anti-K.P.-Serum vom Huhn (0,4 ccm), ließen das Gemisdi 1 Stde. bei 4° C stehen und verimpften es dann intranasal an mit Chloroform-Äther narkotisierte Mäuse. Jedes Tier erhielt 4 Tropfen des Gemisches; pro Verdünnung wurden 6 Mäuse eingesetzt. Die Beobachtungsdauer betrug 20 Tage. Tab. 8 gibt das Ergebnis des Versudies wieder. Es ist daraus klar zu ersehen, daß das pathogene Agens, das in den Mäuselungen weitergeführt * Anm. b. d. Korr.: Inzwisdien beriditeten C. H a 11 a u e r u. G. K r o n a u e r (Ardi. Virusforsdig. 5, 441 [1954]), daß ihnen ebenfalls die Übertragung des K.P.-Virus auf die Lunge der weißen Maus gelang. V I R E N DER I N F L U E N Z A Virusverdünnung Geimpfte/überlebende Mäuse Huhn, normal KT"1 10~ 2 10-3 6/0 6/0 6/1 6/0 Huhn, K.P. 10"1 6/0 6/5 6/6 Serum io-'2 io-3 UND K L A S S I S C H E N Tab. 8. Neutralisations-Versuch mit dem K.P.-Mäuselungen-Passage-Virus. wurde, vom K.P.-spezifischen Hühnerserum neutralisiert wird und demnach mit dem K.P.-Virus identisch ist. Die Pathogenität des Virus für das Huhn wurde durch die Mäusepassagen nicht abgeschwächt. Vier mit der 11. Lungenpassage geimpfte Hühner starben innerhalb kürzester Zeit (2 Tage p.i.). III. Besprechung der Ergebnisse Die Viren der Influenza und K.P. sind sich, wie bereits eingangs erwähnt, physikalisch-chemisch sehr ähnlich. Beide sinken in der analytischen Ultrazentrifuge mit einer Konstanten von etwa 700 S ab und zeigen elektronenoptisch die Form von Kugeln, deren Durchmesser zwischen 70 und 100 m/u liegen. Biologisch verhalten sie sich insofern gleichartig, als beide in der Lage sind, Erythrocyten verschiedener Tierarten zusammenzuballen. Nunmehr ließen siel"» auch noch sero-immunologisch gewisse Ubereinstimmungen aufzeigen. Sie erstrecken sich bei den geprüften Influenza-Viren auf die Vertreter des ATyps, insbesondere auf den Stamm FM/ X , und sind lediglich mit Hilfe des Komplementbindungs- und Kreuzimmunisierungs-Versuches nachzuweisen. Von diesen Reaktionen kann insbesondere der Komplementbindungs-Versuch leicht durch unspezifische Faktoren beeinflußt werden. Die Spezifität unserer Befunde ist aber weitgehend gesichert. Dafür sprechen einmal frühere Versuche 2 , in denen K.P.Antiseren von der Maus mit Konzentraten des atypischen Geflügelpest-Virus und einem Antigen aus normaler Hühnerchorioallantois geprüft wurden sowie die Beobachtung, daß die von uns verwandten AntiK.P.- und Anti-Influenza-A'-Seren wohl mit dem K.P.- und FM/i-Virus, nicht aber unter den gleichen Bedingungen mit dem ebenfalls aus infizierter Eiflüssigkeit gewonnenen Lee-Virus reagierten. Weiter- GEFLÜGELPEST 89 hin spricht für die Spezifität der Komplementbindungs-Proben die Feststellung, daß mit K.P.-Virus reagierendes Serum nur erzeugt werden konnte, wenn wir die als Serumspender dienenden Mäuse mit K.P.-virushaltigem Mäusegehirnmaterial oder FM/ 1 -haltigem Mäuselungenmaterial immunisierten; wurde herpes - virushaltiges Gehirnmaterial verwandt 7 , so hemmte das betreffende Serum niemals zusammen mit K.P.-Virus als Antigen die Hämolyse. Schließlich werden die Ergebnisse der Komplementbindungs-Reaktionen noch dadurch gesichert, daß auch die Kreuzimmunisierungs-Versuche die gleichen Beziehungen aufzeigten. Zu klären bleibt, warum im Gegensatz zu den Befunden bei diesen beiden Proben die übrigen sero-immunologischen Reaktionen keine Anhaltspunkte für eine Verwandtschaft der beiden Virusarten lieferten. Es liegt nahe, die Ursache hierfür in einer geringeren Empfindlichkeit der betreffenden Teste zu suchen. Bei der Präzipitations-Probe könnte dies zutreffen, nicht jedoch bei der H.A.Hemmungsprobe und dem Neutralisations-Versuch, die neben der Komplementbindungs-Probe zu den empfindlichsten sero - immunologischen Reaktionen der Virusforschung zählen und trotzdem negative Resultate lieferten. Man muß deshalb damit rechnen, daß noch andere Gründe für den unterschiedlichen Ausgang der Proben maßgebend sind. Wie schon länger bekannt, ist das einzelne Influenza-Virusteilchen wohl vom Standpunkt der Infektiosität aus eine Einheit, nicht aber in seroimmunologischer Hinsicht. Nach H o y 1 e 1 7 ist es nunmehr sogar möglich, die infektiösen ElementarTeilchen der Influenza in zwei serologisch verschiedene Untereinheiten zu zerlegen. Ähnliche Verhältnisse wie beim Influenza-Virus liegen auch beim K.P.-Virus vor, bei dem die beiden Untereinheiten bereits näher untersucht und als gebundenes Antigen und Hämagglutinin bezeichnet wurden 7 . E s sind Hinweise dafür vorhanden, daß das pentosenucleinsäurehaltige gebundene Antigen im Innern der kugelförmigen Elementar-Partikel angeordnet ist, während das Hämagglutinin, das neben der antigenen noch hämagglutinierende Fähigkeit besitzt und keine Nucleinsäure enthält, sehr wahrscheinlich an der Oberfläche seinen Sitz h a t 7 . Diejenige serologische Komponente, die dem FM/j- und K.P.-Virus gemeinsam ist, scheint, wie die Prüfung der Spaltprodukte der beiden Viren ergab, im gebundenen Antigen der Elementarteilchen lokalisiert zu sein. Bei der sero-immunologischen Uberkreuzprüfung der 90 V I R E N DER I N F L U E N Z A U N D K L A S S I S C H E N G E F L Ü G E L P E S T 90 beiden Viren können wir daher positive Ergebnisse nur in solchen Versuchsanordnungen erwarten, in denen das Reagieren des gebundenen Antigens mit dem ihm entsprechenden Antikörper angezeigt wird. Die H .A.-Hemmungsprobe ist dafür nicht geeignet, weil durch sie nur Hämagglutinin-Antihämagglutinin-Bindungen nachgewiesen werden. Die Präzipitations-Probe zeigt das Vorliegen von Antikörpern an, die mit Antigenen der Virusoberfläche reagieren. Derartige Antikörper waren aber nach den obigen Ausführungen in den von uns angesetzten Virus-Serum-Gemischen nicht enthalten; es konnte deshalb darin auch nicht zu einer PräzipitatBildung kommen. Über den Mechanismus der Neutralisations-Reaktion sind wir noch nicht so weit orientiert, daß wir das Zustandekommen ihres negativen Ergebnisses in ähnlicher Weise erklären könnten. Es ist aber möglich, daß auch für diese Reaktion Antikörper erforderlich sind, welche die an der Oberfläche des Virus gelegenen Haftgruppen blockieren. Der positive Ausgang der KomplementbindungsReaktion mit den ungespaltenen Virus-Elementarteilchen wird verständlich, wenn man annimmt, daß es den Antikörper-Molekülen möglich ist, durch winzige Lücken in der Hämagglutinin-Hülle der Virusteilchen in ihr Inneres zu gelangen, dort mit dem gebundenen Antigen in Kontakt zu treten und das Komplement zu fixieren. Eine andere Möglichkeit wäre die, daß in den Konzentraten einige Virusteilchen vorhanden sind, bei denen das gebundene Antigen freiliegt. Jedenfalls ist immer nur ein geringer Teil des in den Viruskonzentraten vorhandenen gebundenen Antigens für den spezifisdien Antikörper zugänglich. Für das K.P.-Virus geht das aus folgenden Überlegungen hervor: Vom isolierten gebundenen Antigen des K.P.-Virus genügen bereits 0,06 y N für eine positive Komplementbindungs-Probe mit FM/j-Serum (s. S. 88). Wenn nun das gesamte gebundene Antigen, das in den Elementarteilchen vorliegt, serologisdr zugänglich wäre, müßten bei Verwendung von Viruskonzentraten als Antigen etwa 0,18 y N für eine positive Komplementbindungs-Reaktion ausreichen, weil etwa 35% des im Elementarteildren enthaltenen N auf das gebundene Antigen entfallen 18. Die Versudie ergaben aber, daß hierfür 6 y Virus-N erforderlich sind. Für die Erklärung des Ausgangs der Kreuzimmunisierungs-V ersuche sind Ergebnisse von Bedeutung, die bei der immunologischen Untersuchung is W. Z i 11 i g u. W. S c h ä f e r , Versuche. Unveröffentlidite der Spaltprodukte des K.P.-Virus erhalten wurden 7 . Durch sie wurde wahrscheinlich gemacht, daß das aus dem Virusteilchen isolierte gebundene Antigen im Gegensatz zu dem frei vorkommenden löslichen Antigen 1 9 in der Lage ist, eine Immunität gegen eine nachfolgende K.P.-Infektion zu erzeugen. Danach war mit der Möglichkeit zu rechnen, daß auch zwei Viren gegenseitig immunisieren, die, wie FM/ t und K.P., nur in dieser Komponente übereinstimmen. Da nun aber das gebundene Antigen vom Innern der Elementar-Teilchen aus seine immunogenen Fähigkeiten nicht entfalten kann 7 , muß man annehmen, daß es in den zur Immunisierung benutzten Tieren (Mäusen und Hühnern) auf irgendeine Weise aus dem Virus-Teilchen in Freiheit gesetzt wird. Die darauf von ihm ausgelöste, gegen das heterologe Virus gerichtete Immunität scheint, wie unsere Versudie zeigten, nicht an das Auftreten neutralisierender Antikörper gebunden zu sein. Welcher Mechanismus ihr zugrunde liegt ist noch nicht bekannt. Eine ähnliche Immunität ließ sich bei Choriomeningitis erzeugen. Hier nahm man an, daß sie nicht humoraler, sondern zellulärer Natur wäre 2 0 . Eine Affinität zum Lungengewebe, die den Influenza* Viren in starkem Maße innewohnt, scheint auch beim K.P.-Virus noch in gewissem Grade vorhanden zu sein. Es war jedenfalls ohne besondere Schwierigkeit möglich, diesen Erreger durch intranasale Impfung an die Mäuselunge zu adaptieren. Die Beziehungen, die zwischen den Vertretern des A-Typs der Influenza und dem K.P.-Virus aufgedeckt wurden, lassen es berechtigt erscheinen, beide Erreger nunmehr endgültig in eine Gruppe einzuojdnen. Man könnte sidi vorstellen, daß die Vertreter dieser Gruppe gelegentlich ihre Wirtsspezifität ändern und daß so ein neuer Typ von InfluenzaErregern aus K.P.-Viren entstehen kann oder umgekehrt. Für die Aufstellung eines Systems der Virusarten ergibt sich aus den vorliegenden Untersuchungen der Hinweis, daß es nicht angängig ist, ein Virus allein nach dem Krankheitsbild, das es auslöst, einzuordnen. Wesentlich bessere Kriterien liefern hierfür das physikalisdi-diemische und sero-immunologische Verhalten der Erreger. Das eingehende Studium des letzteren wurde in unserem Falle erst möglich, als es gelang, hochgradig konzentrierte Viruspräparate if K. M ü n k , W. S c h ä f e r , W. Z i 11 i g u. M. M u s s g a y , Unveröffentlichte Versuche. 20 E. T r a u b u. W . S c h ä f e r , Zbl. Bakteriol. I.Abt. Orig. 144, 331 [1939]. GAMONWIRKUNG BEI CH L AMYD OMONA S REINHARD1 91 herzustellen und die Erreger schonend in ihre Untereinheiten zu zerlegen. Erst danach war man in der Lage, die für den Nachweis des gemeinsamen serologischen Anteils erforderliche Antigen-Menge in den angewandten Testen einzusetzen. Man kann wohl damit rechnen, daß es auf diesem Wege gelingt, auch noch bei anderen Virusarten verwandtschaftliche Beziehungen aufzudecken. zuschälen; außerdem weisen sie auf die Möglichkeit hin, durch Zerlegung der Virus-Elementarteilchen Vakzinen mit breiteren Immunitätsspektren zu gewinnen. Vom Standpunkt der Immunologie aus gesehen dürften die beschriebenen Ergebnisse deshalb von Interesse sein, weil nach ihnen die Aussicht besteht, die Bedeutung der verschiedenen Virus-Untereinheiten für das Immunitätsgeschehen mit Hilfe des Influenza* und K.P.-Virus experimentell besser heraus- Den Herren Prof. Dr. H a a s , Prof. Dr. H a 11 a u e r, Prof. Dr. H e r z b e r g , Dr. H o y 1 e und Prof. Dr. T r a u b bin ich für die Überlassung von Virus-Stämmen bzw. Seren zu großem Dank verpflichtet. Gamonwirkung bei Von Mittel für die Untersuchungen stellten die D e u t s c h e F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und das B u n d e s m i n i s t e r i u m für E r n ä h r u n g , Landwirts c h a f t u n d F o r s t e n zur Verfügung. I. K l o e t z e l , U. J o h n , U. L i l j e und P. G i e b l e r danke ich für ihre Mitarbeit. Chlamydomonas reinhardi HERBERT FÖRSTER u n d LUTZ WIESE Aus dem Max-Planck-Institut für Biologie, Abt. Hartmann, Tübingen (Z. Naturforschg. 10 b, 91—92 [1955]; eingegangen am 10. Januar 1955) Es werden bei Chlamydomonas reinhardi agglutinierende Gamonwirkungen der gleichen Art beschrieben, wie sie für Chi. eugametos mitgeteilt wurden. B agglutinierend Entsprechende Chi. reinhardi durch die Arbeit von S a g e r und G r a n i c k 3 hinreichend erklärt. Auf der Basis ihrer Befunde konnten wir durch die Ausschaltung von Stickstoff die Sexualität jederzeit sicher auslösen. Die Zellen beider Geschlechter geben im kopulationsbereiten Zustand Stoffe an das Medium ab, die auf kopulationsbereite Zellen des Gegengeschlechts agglutinierend wirken. Die Gamonwirkungen von eugametos und reinhardi sind artspezifisch: Filtrate von eugametos wirken nur auf eugametos, und umgekehrt wirken Filtrate von reinhardi nur auf reinhardi. Ubereinstimmend mit dieser Artspezifität sind beide Formen nicht miteinander kreuzbar. Die Zellen werden zunächst auf einem nährstoffreichen Agar untenstehender Zusammensetzung *, die eine geringfügige Modifikation der Vorschrift von S a g e r und G r a n i c k darstellt, herangezüchtet und dann auf einen stickstoff-freien Agar folgender proz. Zusammensetzung übertragen: ei Chi. eugametos wurde über wirksame Gamone berichtet 1 . Untersuchungen wurden jetzt bei durchgeführt 2 . Zwischen reinhardi und eugametos bestehen charakteristische Unterschiede im physiologischen Vermacht die halten bei der Kopulation. Bei eugametos Auslösung der Sexualität nie Schwierigkeiten, während wir bei unsern Untersuchungen mit reinhardi oft Mißerfolge verzeichnen mußten. Die methodischen Ursachen dieser Mißerfolge sind offenbar 1 H. F ö r s t e r u. L. W i e s e , Z. Naturforschg. 9 b, 548—550 [1954]. 2 Für die Überlassung des Ausgangsmaterials von Chi. reinhardi sind wir Herrn Prof. G. M. S m i t h von der Stanford Universität zu Dank verpflichtet. Agar 1,5 CaCl 2 0,01 MgS04 0,01 KH2P04 0,01 Na-Acetat 0,005 3 R. S a g e r u. S. G r a n i c 729—742 [1954]. 0,05 * Nas-Citrat 0,2 k0hpo4 0,3 kh0po4 0,2 Na-Acetat 0,03 nh,no3 0,03 MgS0 4 0,004 CaCl2 0,001 FeCU k , J. gen. Physiol. 37, h3bo3 ZnCl2 MnCU Co(N0 3 ) 2 na-imoo« CuCU Agar 0,0001 0,00005 0,000035 0,000025 0,00002 0,0000025 1,5
