Gentherapie: Klinische Erfolge und Forschungsdesiderate Individuum Organe/Gewebe Zellen 100.000.000.000.000 im Erwachsenen > 1.000 Varianten lebenslange l b l R Regeneration i Omnis cellula e cellula (Virchow) Gene ~ 25.000 pro Zelle Mehrere Editionen Komplexe Interaktionen Epigenetische Kontrolle Gefahr von Mutationen ~1017 Gene pro Individuum! Ek k Erkrankungen infolge i f l von Genfehlern G f hl Therapie mit korrigierten Genen Information – Wirkort - Quantität Wirkort im Genom http://www.biotechnologie.de/BIO/Redaktion/Bilder/de/ Auswirkungen im Organismus? Gentransfer: Prinzip p Milieu, Pharmaka = extrinsisch Gene = intrinsisch Korrektur • Genetische G ti h Erkrankung Ek k • Infektion • Krebs • Degenerative Erkrankung g Funktionskontrolle • Proliferation P lif ti • Fitness • Migration • Differenzierung • Reprogrammierung g g • Eliminierung Aber nicht: Enhancement http://www.ksta.de/ks/images/mdsBild/126 4186552512l jpg 4186552512l.jpg Auf keinen Fall: Transgene Menschen Man Dr. Jekyll D F Dr. Faustt http://www.ksta.de/ks/images/mdsBild/126 4186552512l jpg 4186552512l.jpg Somatischer Gentransfer: Dreifache Dosisfindung 1-10: 1 10 25000 Transgen : Zelluläre Gene 1:100-1:1.000.000 Transgenprodukt: andere RNA/Proteine 6 1011:10 1061014 Genmodifizierte Zellen : Körperzellen Besonders geeignet: kleines Ziel Ebenfalls besonders interessant: expandierbare p Zellen http://www.jyi.org/articleimages/1077/origin htt // j i / ti l i /1077/ i i als/img0.jpg GENTHERAPIE: Erfolge in klinischen Studien ~2000: Einzelfälle ~2020: Tausende Krebs (Phase III) Hä hili Hämophilie Stoffwechseldefekte ALD, MLD, M. Parkinson Netzhautdegeneration S Spender-gegen-Wirt d Wi t Epidermolysis bullosa Immundefekte (SCID, CGD, WAS, AIDS) Speicherkrankheiten (ALD (ALD, MLD) Thalassämie GENTHERAPIE: wachsendes Interesse Pharma/Biotech ~2000: Einzelfälle ~2020: Tausende Roche ALD, MLD, M. Parkinson OBM Novartis Pfizer Juno, … Krebs (Phase III) Netzhautdegeneration MolMed, … Hä hili Hämophilie Stoffwechseldefekte TBD… S Spender-gegen-Wirt d Wi t Epidermolysis bullosa Roche BBB Roche, BBB, Sangamo,… Sangamo Immundefekte (SCID, CGD, WAS, AIDS) (ALD MLD) Speicherkrankheiten (ALD, Thalassämie Wachsende Bedeutung • Vektor- und Zellproduktion • Skalierung, Automatisierung • Long-term follow-up Gentransfer:: Vektorvielfalt Gentransfer Barrieren: Serum Blutzellen Gewebeverbund Zellmembran Rezeptor E d Endosom Electroporation Kernmembran Chromatin Effizienz? Spezifität? Antwort der Zelle? Modified from Seow and Wood, Mol Ther 2009 Neue Werkzeuge für Gen Gen--K.O. und homologe Rekombination Zunehmend simpleres Design Electroporation Nach Qasim & Thrasher, 2014 Zunehmende Sicherheit Off-Target Aktivität schwer zu detektieren F kti Funktionelle ll Assays A notwendig t di Neue retrovirale Vektoren reduzieren das Risiko der Insertionsmutagenese Transgen, nächste Generation Retrovirales Transgen En‐ hancer SD En‐ hancer SA cDNA Pro‐ p(A) moter cDNA Pro‐ p(A) moter Exon Enhancer Pro‐ codon‐ Ex‐ moter optim. port lenti SD Repressive Histone SIN p(A) Promoter SIN p(A) SA Exon Intron p(A) Zelluläres Gen Chromosom Alpharetroviral SIN Vectors Suerth et al., J Virol 2010 Suerth et al., Mol Ther 2012 Kaufmann et al., Mol Ther 2013 High titer SIN vector production Long-term Long term expression in mHSC Reduced genotox in IVIM assay Intergene Region Vektorbiologie Zellinteraktionen zunehmend besser verstanden, erweitertes Repertoir Vektorforschung von zentraler Bedeutung für die Entwicklung der Gentherapie Brass, Elledge et al., Science 2008 GENTHERAPIE: Prima Blut bald verfügbar? g Klinische Erfolge bei Selektionsvorteil oder nach hoher Gentransferrate und starker Konditionierung Hämatopoese:: Gentherapie Hämatopoese Transfer redirected immune cells Induce or overcome tolerance Autoimmunity Infection (anti HIV) Cancer (redirected T cells) Vaccination Infection Cancer Monogenetic disorders SCID-X1, SCID-ADA, CGD, WAS Thalassemia ALD, MLD Sickle cell anemia, Aplastic anemia (Fanconi, CAMT) … Acquired disorders Cancer (Chemoprotection) Infection (HIV) Red = efficiency demonstrated in clinical trials Underlined = SAE related to insertional mutagenesis Italics = clonal skewing observed without SAE Blue = animal model promising Protein delivery y Metabolic enzymes Coagulation factors Erste Erfolge und Probleme Gene marking Brenner et al al., Lancet 1993 Trace origin of relapse ADA-SCID 36 pts. treated Most patients with benefit No SAE SCID X1 SCID-X1 20 pts. treated in Paris/London Most patients with benefit 5 SAE, Leukemias CGD 2 pts. t treated t t d in i F Frankfurt, kf t 2 pts. in Zürich Transient benefit 3 Pre-MDS,, Monosomyy 7 WAS 9 pts. treated in Hannover, >5 5 pts. t in i Mil Milan, P Paris, i … Strong benefit High risk of ALL, AML in Hannover Gene transfer for SCID‐X1 using a self‐inactivating gammaretroviral vector A multi‐institutional phase I/II trial evaluating the treatment of SCID‐X1 patients with retrovirus‐mediated gene transfer Sites: Great Ormond Street Hospital, UK (1) Hôpital Necker Enfants Malades, France (5) Children’s Hospital Boston, US (2) Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, US (2) M Mattel Children’s Hospital, Los Angeles, US (1) l Child ’ H i l L A l US (1) Pei et al., in revision Kinetics of T lymphocyte recovery Combined first trial ((UK + Paris)) and current trial (US) data p = 0.4 10000 CD3++/l 1000 Integrome (F. Bushman) LMO2 cluster not detected Evi1 cluster not detected Significantly less clones with integrations in protooncogenes 100 10 SCID 1 SCID 2 m 12 6m 4m 3m 2m 1m G e pr 2‐sided Wilcoxon rank‐sum test T 1 Months after gene therapy David Williams, SYP, previous trial data courtesy of A. Thrasher, S. Hacein-Bey-Abina Hämatopoetische Stammzellen Effizienz nicht mehr limitierend (Biffi et al., 2013) Prävention der Insertionsmutagenese durch Vektordesign (Pei et al al., in revision) Allerdings: interindividuelle Varianz Langzeitrisiko unklar Ziele Aussagefähige Toxikologie - Insertionsmutagenese - Änderung der Stammzelleigenschaften Vektorentwicklung - Integrationsspektrum - Gestaltung der Transgenkassette Vektor- und Zellproduktion - reproduzierbar, semi-automatisch Aussicht Routine für monogene Defekte - Speicherkrankheiten - Thalassämie, Sichelzellanämie - Immundefizienzen - … Anwendung A d für fü erworbene b Erkrankungen - HIV - Krebs K b Entwicklung „reifzelliger“ Produkte - Monozyten - Granulozyten - Plättchen, ... Redirektionierte T-Zellen Cancer Cell T lymphocyte infusions against cancer Qasim & Trasher 2014 Redirektionierte T-Zellen Effizienz nicht mehr limitierend Beginnende Routine bei ausgewählten Indikationen Risiko infolge hoher Wirksamkeit - Tumorlyse y - Zytokinsturm - Antigen auf gesunden Zellen Ziele Aussagefähige Toxikologie - Antigenspezifität Vektorentwicklung - Gestaltung der Transgenkassette - Suizidgen Vektor und Zellproduktion Vektor- reproduzierbar, semi-automatisch Aussicht Routine bei definierten Antigenen - CD19 - … Universelle T-Zellen - TCR k.o. - Induzierte T-Zellen Hämophilie Effizienzgrenze überwunden (F. IX) Langzeiteffekte nachweisbar Risiko der T-Zellantwort - Transienter Effekt,, beherrschbar Unklares Risiko der Insertionsmutagenese Aussicht Massive Reduktion der Therapiekosen und erhöhte LQ Applikation auch für andere Gendefekte Ziele Aussagefähige Toxikologie - Insertionsmutagenese in Hepatozyten - Kofaktoranalyse Vektorentwicklung - „Stealth“ AAV - Dosisreduktion durch Effizienzsteigerung Vektorproduktion - Skalierung Nair et al., 2014 Patient-specific iPSCs creates fascinating avenues in Patientin disease modeling g and regenerative g medicine Nishikawa et al. 2008, Nat Rev Mol Cell Biol „Alles in 1“‐Genvektor zur Reprogrammierung Titer determined by qPCR ≈ 1x107 t.u./ml Geburt einer Stammzelle Unmodifiziert/ keine Zelle Day 4.5 Genmodifizierte Zelle Reprogrammierte Zelle (pluripotent) fibroblasts Day 8 Day 11 11.5 5 iPS cells Eva Warlich T bi C Tobias Cantz t Hans Schöler Timm Schröder Axel Schambach iPSC entstehen in Patchwork-Kolonien Kulturadaptierung induziert pluripotenter Stammzellen (iPSC) 1 Amplifikationen • Chr 12p (or Trisomy) [NANOG, CCND2; …] • Chr 17q [BIRC5, …] • Chr X [ELK1, ARAF, …] • … Mutanten M nfrequenzz in Popu ulation Humane pluripotente Stammzellen 0,1 0,01 SCF, IL3 , Medium Medium 1 1 0 001 0,001 Medium 2 ? STIF 0,0001 0 00001 0,00001 Ähnlich in Keimbahntumoren 0,000001 0 10 20 30 Tage in Kultur in Kultur Zelldichte Medium Additiva Medium, Additiva Stromazellen Splitting Methode O2 Sättigung O2 Sättigung … Schlechte Kulturen fördern Mutanten Gute Kulturen unterdrücken Mutanten 40 50 Identität und Kontrolle induziert pluripotenter Stammzellen (iPSC) RMCE Genkassettenaustausch (RMCE) zur Kontrolle des Zellverhaltens Fußabdruck des Vektors als Personalausweis“ als „Personalausweis des iPSC‐Klons = Genmarkierung (Sensitivität 1:100.000) (Sensitivität ~1:100.000) Voelkel et al., PNAS 2010; Ellis et al., Cell Stem Cell 2010; Kühle et al., Mol Ther 2014 Induzierte Stammzellen Forschung top, Applikation ? Klonale Herkunft per se kein Heilsversprechen Risiko der genetischen Instabilität Unklares Risiko der Immunantwort Ziele Aussagefähige Toxikologie Zellproduktion - Prozessoptimierung - Skalierung Aussicht Transdifferenzierung (polyklonal) Gentransfer zur Kontrolle des Zellverhaltens • Gentherapie öffnet neue therapeutische Möglichkeiten für schwere Erkrankungen • Aussichten maßgeblich abhängig von methodischer Entwicklung, adäquaten p , quantitativer q Toxikologie g Krankheitsmodellen und spezifischer, • Technische, biologische und ethische Grenzen der Anwendungen antizipierbar • Faire, evidenzbasierte Risiko-Nutzen-Abwägung notwendig • Wachsendes Engagement der Pharmaindustrie • Balance von Grundlagenwissenschaft und translationaler Forschung notwendig • Zunehmende Bedeutung der synthetischen Biologie Thank you! y Vector development, reprogramming: Julia Sürth, Johannes Kühle, Juliane Schott, Verena Thies, Tobias Mätzig, M l i Galla, Melanie G ll A Axell S Schambach h b h Collaborators Insertional mutagenesis, transformation, hematopoietic regeneration: David Williams Olga Kustikova, Martijn Brugman, Adrian Schwarzer, Bernhard Schiedlmeier. Punam Malik Niels Teng Cheong Ha, Ute Modlich Manuel Grez Heinz Adrian Thrasher Marina Cavazzana-Calvo Targeted genome modification: Daniel Boris Fehse Sö T Jü B d Sören Jürgen Bode Dirk Turan, Wicke Christof von Kalle Heckl Hans Schöler Tobias Cantz Thomas Moritz Timm Schröder Brigitte Schlegelberger