Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000 - 2001
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Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg 2002 Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000 - 2001 Deutsche Zentren für Gesundheitsforschung (DZGF) Kurzfassung 2 Der “Wissenschaftliche Ergebnisbericht” des Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ) wird alle zwei Jahre alternierend zum englischsprachige “Research Report“ herausgeben. Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht hat die Aufgabe, die Berichtsverpflichtung des DKFZ als Großforschungseinrichtung gegenüber den Zuwendungsgebern (Bund sowie Land Baden-Württemberg) zu erfüllen. Zur Erschließung des Berichts im Rahmen der Berichtsverpflichtung werden die Nummern des Forschungsprogramms 2001/2002 des DKFZ (ein internes Planungspapier) in Klammern an die Titel angehängt. Das DKFZ hat diesen Bericht so konzipiert, daß neben dieser Aufgabe die Berichte über die Aktivitäten des DKFZ auch zur Information von Fachkollegen und wissenschaftlich Interessierten dienen. Der „Research Report“, der sich an die internationale wissenschaftliche Öffentlichkeit wendet, wurde 2001 für die Periode 1999 / 2000 erstellt. Beide Bücher werden nach den derzeit acht Forschungsschwerpunkten des DKFZ gegliedert. Die neue deutsche Rechtschreibung wurde von einer Reihe von Autoren angewandt. Eine Vereinheitlichung der Rechtschreibung wurde nicht vorgenommen, so daß beide Formen vorkommen. Abstract The Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ, German Cancer Research Center) publishes alternating every year the “Wissenschaftlicher Ergebnisbericht” (in German) and the “Research Report” (in English). Both volumes are reports on the present state of research activities of the DKFZ as a National Research Center to the funding federal and state authorities [Federal Republic of Germany, Land (state) Baden-Württemberg]. Furthermore they shall inform colleagues and the scientifically interested public. Both reports are structured according to the center’s eight research programs. The last Research Report was published in 2001. In Germany a new orthography has been accepted. Some authors used the new form others the traditional one. The orthography was not standardized. Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 © DKFZ 2002 Herausgeber: Deutsches Krebsforschungszentrum Postfach 101949, D-69009 Heidelberg Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg Tel. (06221) 42-0; Fax (06221) 42 29 95 Internet: http://www.dkfz-heidelberg.de Redaktion: Dr. Horst Metzler, Zentralbibliothek (e-mail: [email protected]) Layout: Heidi Hnatek, DKFZ Satz: DKFZ (Adobe Page Maker) Druck: Printed in the Federal Republic of Germany ISSN 0931-8364 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Vorwort ............................................................................................................................................. 5 Stellung und Auftrag ....................................................................................................................... 7 Erforschung der Krebsursachen ....................................................................................................... 7 Identifizierung von Krebsrisikofaktoren und Verbesserung der Krebsvorbeugung............................. 8 Diagnostik und Therapie - Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung ................................ 8 Forschungsschwerpunkte des DKFZ ............................................................................................... 9 Nationale und internationale Zusammenarbeit .................................................................................. 9 Interdisziplinarität mit oder ohne Fokussierung Gedanken zur Strukturreform der Großforschungseinrichtungen ................................... 14 Forschungsschwerpunkt Krebsentstehung und Differenzierung .......................................... 16 Abteilung Zellbiologie (A0100) .......................................................................................................... 18 Zytometrie (A0102) .......................................................................................................................... 25 Abteilung Molekularbiologie der Zelle I (A0200) ................................................................................ 26 Abteilung Molekularbiologie der Zelle II (A0300) ............................................................................... 30 Abteilung Entwicklungsgenetik (A0400) ........................................................................................... 34 Abteilung Molekulare Embryologie (A0500) ..................................................................................... 39 Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung (A0600) .............................................. 42 Arbeitsgruppe Epigenetik (A0700) ................................................................................................... 49 Zentrale Proteinanalytik (R0800) ..................................................................................................... 51 Forschungsschwerpunkt Tumorzellregulation ......................................................................... 53 Abteilung Pathochemie (B0100) ...................................................................................................... 56 Biochemische Zellphysiologie (B0200) ........................................................................................... 61 Abteilung Biochemie der Zelle (B0300) ........................................................................................... 66 Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (B0400) ........................................................................... 67 Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (B0401) ..................................................................... 70 Abteilung Biochemie der Gewebsspezifischen Regulation (B0500) ............................................... 71 Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (B0600) .................................................................. 76 Abteilung Tumorbiochemie (B0700) ................................................................................................ 82 Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) ..................................................... 87 AG Hormonwirkung und Signaltransduktion (B0810) ...................................................................... 93 Abteilung: Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) ........................................................................ 96 Zentrale Spektroskopie (R0400) ...................................................................................................... 99 Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ................................. 109 Abteilung: Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200) .................................................................112 Abteilung Molekulare Toxikologie (C0300) ..................................................................................... 133 Abteilung Klinische Epidemiologie (C0500) ................................................................................... 139 Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie (C0600) ............................................................................. 148 Abteilung Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese (C0700) ........................................ 153 Stabsstelle Krebsprävention (S0103) ............................................................................................ 155 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe (S0108) ................................................................ 157 Abteilung Mechanismen der Tumorigenese (S0109) ..................................................................... 160 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 3 Inhaltsverzeichnis 4 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie ................................ 163 Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100) ................................................................. 165 Arbeitseinheit Pharmakologie der Krebsbehandlung (D0200) ....................................................... 170 Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie (D0301) ............................................................... 174 Kooperation des DKFZ mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg (D0302) ............................................................................................................................ 176 Rekombinante Antikörper (D0500) ................................................................................................ 179 Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600) ............................................................. 181 Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700) ............................... 190 Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800) ................................................... 191 Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie des DKFZ an der Klinik für Dermatologie des Klinikum Mannheim (D0900) ..................................................................................................... 195 Zentrales Tierlabor (ZTL, R0200)................................................................................................... 203 Forschungsschwerpunkt Radiologische Diagnostik und Therapie ...................................... 209 Abteilung Onkologische Diagnostik und Therapie (E0100) ............................................................211 Abteilung Biophysik und medizinische Strahlenphsik (E0200) ...................................................... 228 Abteilung Radiochemie und Radiopharmakologie (E0300) ........................................................... 236 Abteilung Medizinische Physik (E0400) ......................................................................................... 242 Klinische Kooperationseineit Strahlentherapeutische Onkologie (E0500) ..................................... 259 Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin (E0600) ................................................................ 272 Forschungsschwerpunkt Angewandte Tumorvirologie ........................................................ 280 Abteilung Tumorvirologie (F0100) .................................................................................................. 282 Abteilung Genomveränderungen und Carcinogenese (F0200) ..................................................... 290 Abteilung Tumorvirusimmunologie (F0300) ................................................................................... 295 Pathogenitätsmechanismen (F0400) ............................................................................................ 304 Zelldifferenzierung (F0500) ............................................................................................................ 308 Abteilung: Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen (F0600) ................................................................. 310 Abteilung Tumorvirus-Charakterisierung (F0700) .......................................................................... 314 Abteilung Retrovirale Genexpression (F0800) ............................................................................... 316 Forschungsschwerpunkt Tumorimmunologie ........................................................................ 318 Abteilung Zelluläre Immunologie (G0100) ..................................................................................... 320 Abteilung Immunchemie (G0200) .................................................................................................. 327 Abteilung: Immungenetik (G0300) ................................................................................................. 332 Arbeitsgruppe Apoptose Regulation (G0310) ................................................................................ 338 Abteilung Molekulare Immunologie (G0400) .................................................................................. 341 Forschungsschwerpunkt Genomforschung und Bioinformatik ............................................ 351 Abteilung Medizinische und Biologische Informatik (H0100) ......................................................... 354 Molekulare Biophysik (H0200) ....................................................................................................... 360 Abteilung Klassische und Molekulare Zytogenetik (H0400) ........................................................... 365 Abteilung Biophysik der Makromoleküle (H0500) ........................................................................... 368 Molekulare Genomanalyse (H0600) .............................................................................................. 377 Arbeitsgruppe: Molekulargenetik des Mammakarzinoms (H0602) ................................................ 387 Abteilung Molekulare Genetik (H0700) ........................................................................................... 389 Abteilung für Funktionelle Genomanalyse (H0800) ........................................................................ 395 Abteilung Intelligente Bioinformatik Systeme (B0900) ................................................................... 400 Zentrale Einheit Biostatistik (ZEB) (R0700) ................................................................................... 408 Autoren-Index .............................................................................................................................. 415 Schlagwort-Index ........................................................................................................................ 421 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Vorwort Vorwort Das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg legt hiermit seinen Wissenschaftlichen Ergebnisbericht für die Jahre 2000/2001 vor. Der Bericht informiert über die in dieser Zeit gewonnenen Ergebnisse und Fortschritte der Arbeiten im Rahmen des Forschungsprogrammes des DKFZ. Damit wollen die Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen auch gegenüber dem Kuratorium, den Zuwendungsgebern und den Parlamenten Rechenschaft über ihre Forschungsarbeit ablegen. Die zusammenfassenden Darstellungen wenden sich darüber hinaus an die wissenschaftlich interessierte Öffentlichkeit und dienen dem Überblick über die am DKFZ vertretenen Forschungsrichtungen für Studenten und Wissenschaftler, die eine Mitarbeit im DKFZ erwägen. Neben der durch die kurzen Artikel gegebenen Übersicht bieten die dazu zitierten Publikationen dem an Einzelheiten interessierten Leser die Möglichkeit zur Vertiefung der Information. Eine vollständige Liste aller Veröffentlichungen der Mitarbeiter des DKFZ wird jährlich in Buchform und im Internet vorgelegt. Wir hoffen, daß dieser Wissenschaftliche Ergebnisbericht dazu beiträgt, die von den Mitarbeitern und Kooperationspartnern des Deutschen Krebsforschungszentrums erarbeiteten Ergebnisse über den Kollegenkreis hinaus zu verbreiten. Heidelberg, im Juni 2002 Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Harald zur Hausen Vorsitzender des Stiftungsvorstands DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 5 Organigramm Kuratorium Vorsitzender Parlamentar. Staatssekrär Wolf-Michael Catenhusen Bundesministerium für Bildung und Forschung Stellvertretender Vorsitzender MinDirig. Dr. phil. Heribert Knorr Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg Vorsitzender des Wissenschaftlichen Komitees Prof. Dr. Paul Kleihues 6 Stabsstellen Presse- und Öffentlichkeitsarbeit Hilke Stamatiadis-Smidt, M.A. 42-2854 Krebsprävention Dr. med. Martina Pötschke-Langer 42-3007 Sicherheit Dipl.-Ing Edgar Heuss 42-2866 Innenrevision Dipl. Kfm. Dietmar Elspaß 42-2863 Zentrale Einrichtungen Zentrale Datenverarbeitung Dr. rer. pol. Kurt Böhm 42-2358 Zentrales Tierlabor Dr. med. vet. Uwe Zillmann 42-4260 Zentralbibliothek Dr. phil. nat. Horst Metzler 42-3666 Zentrale Spektroskopie Dr. (PhD) William E. Hull 42-4515 Strahlenschutz und Dosimetrie Dr. rer. nat. Karl Heinz Hoever 42-2556 Zentrale Einheit Biostatistik Dr. rer. nat Lutz Edler 42-2392 Stiftungsvorstand Vorsitzender und Wissenschaftliches Mitglied Prof. Dr. med. Dr. h. c. mult. Harald zur Hausen 42-2850 Administrativ-kaufmännisches Mitglied Dr. rer. pol. Josef Puchta 42-2860 Forschungsschwerpunkte Krebsentstehung und Differenzierung Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Werner W. Franke 42-3212 Tumorzellregulation Sprecher: Dr. rer. nat. Peter Angel 42-4570 Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch 42-3300 Diagnostik und Experimentelle Therapie Sprecherin: Prof. Dr. med. Margot Zöller 42-2454 Radiologische Diagnostik und Therapie Sprecher: Prof. Dr. med. Dr. rer. nat Wolfhard Semmler 42-2563 Angewandte Tumorvirologie Sprecher: Prof. Dr. (PhD) Jean Rommelaere 42-4960 Wissenschaftlicher Rat Vorsitzender Priv.-Doz. Dr. med. Dr. rer. nat. Jürgen Debus 42-2867/42-2868 Verwaltung Leiter Dr. jur. Wolfgang Henkel 42-2750 Admin. Projektmanagement/Gremien Bettina Crispin 42-2700 Personal- und Sozialwesen Klaus Pregartner 42-2760 Finanz- und Rechnungswesen Winfried Schwarz 42-2776 Beschaffung/Materialwirtschaft Dr. jur. Rolf Zimmermann 42-2775 Technik Rudi Lange 42-2800 Tumorimmunologie Sprecher: Prof. Dr. med. Peter Krammer 42-3717 Technologie Transfer Büro Dr. rer. nat. Ruth Herzog 06221 42-2955 FAX 06221 42-2956 e-mail: [email protected] Genomforschung und Bioinformatik Sprecher: Prof. Dr. rer. nat. Peter Lichter 42-4609 Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) Postfach 101949, D-69009 Heidelberg Im Neuenheimer Feld 280, D-69120 Heidelberg 06221 42 - 0 (Zentrale); FAX 06221 422995 Internet: http://www.dkfz-heidelberg.de (Stand:Juni 2002) DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Einführung Stellung und Auftrag Erforschung der Krebsursachen Das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), Stiftung des öffentlichen Rechts des Landes Baden-Württemberg, wurde 1964 mit Sitz in Heidelberg gegründet. Als eine überregionale Forschungseinrichtung ist das DKFZ Mitglied der Hermann von Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF) und wird im Rahmen der institutionellen Förderung finanziell zu 90% vom Bund und zu 10 % vom Bundesland Baden-Württemberg getragen. Seit 1977 ist das DKFZ Mitglied der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Darüber hinaus wird ein wesentlicher Anteil der Projekte durch Mittel der Projektförderung finanziert. Die Krebsforschung hat in den letzten Jahren stark von der Entdeckung der genetischen Grundlagen der Krebserkrankungen profitiert. Dennoch stellt die detaillierte Aufklärung der molekularen Ereignisse bei der Entstehung eines Tumors nach wie vor eine große Herausforderung in der Krebsforschung dar. Das Ziel der Stiftung Krebs ist ein weltweites Problem von enormem Ausmaß. Auch wenn sich seit den 90er Jahren mit dem leichten Rückgang der Krebssterblichkeit eine mögliche Trendwende in Deutschland anzeigt, wird unter Berücksichtigung der steigenden Lebenserwartung voraussagbar jede dritte lebende Person an Krebs erkranken und jede vierte an Krebs sterben. Der klar definierte und programmorientierte Forschungsauftrag des Zentrums läßt sich daher wie folgt umreißen: 1. Erforschung der Krebsursachen 2. Identifizierung von Krebsrisikofaktoren 3. Verbesserung der Krebsvorbeugung 4. Verbesserung der Frühdiagnostik von Krebserkrankungen 5. Optimierung der Krebstherapie und Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung Die Organe der Stiftung sind: Das Kuratorium überwacht die Rechtmäßigkeit, Zweckmäßigkeit und Wirtschaftlichkeit der Führung der Stiftungsgeschäfte. Es besteht aus Vertretern des Bundes und des Landes Baden-Württemberg, der Universität Heidelberg, Mitarbeitern der Stiftung sowie dem Wissenschaftlichen Komitee, welches aus externen Fachwissenschaftlern zusammengesetzt ist. Das Wissenschaftliche Komitee bereitet die Entscheidungen des Kuratoriums in allen wissenschaftlichen Angelegenheiten vor und trägt die Verantwortung für die fortlaufenden Ergebnisbewertungen der Forschungsschwerpunkte und Abteilungen durch wissenschaftliche Begutachtungen. Der Stiftungsvorstand leitet die Stiftung und setzt sich aus einem wissenschaftlichen Mitglied (Vorsitz) und einem kaufmännisch-administrativen Mitglied zusammen. Der Wissenschaftliche Rat ist ein DKFZ-internes Gremium zur Beratung des Stiftungsvorstands und des Kuratoriums in allen bedeutsamen wissenschaftlichen Angelegenheiten. Eingeleitet wird die Entartung zur Krebszelle durch eine Veränderung im Erbgut und den damit verbundenen Folgen im funktionellen Zellgeschehen. Entgeht die so veränderte Zelle einer Erkennung durch das Immunsystem, wird in der nächsten Zellteilung die mutierte Information an die Tochterzellen weitergegeben. In den folgenden Zellzyklen können sich schrittweise weitere Mutationen akkumulieren. Wenn schließlich einzelne veränderte Zellen den Primärtumor über angrenzende Blut- oder Lymphgefäße verlassen und sich an anderer Stelle im Körper ansiedeln, ist es zu der in der Klinik so gefürchteten Metastasierung gekommen. Eine vergleichende Analyse der genetischen Veränderungen von Tumoren gibt Hinweise darauf, daß unterschiedliche Krebserkrankungen auf verschiedenartigen Mustern von Genveränderungen beruhen. Hinter dem eingängigen Begriff ‚Krebs‘ versteckt sich somit die Tatsache, daß es sich um viele unterschiedliche Erkrankungen handelt, von denen jede über ihre eigenen Charakteristiken verfügt. Aus der Entschlüsselung der zentralen Ereignisse bei der Entstehung von Tumoren und bei der Metastasierung werden neue Ansatzpunkte sowohl für eine verbesserte Diagnostik wie auch für die gezielte Entwicklung neuer Therapien erwartet. In den letzten Jahren haben Untersuchungen der Differenzierung embryonaler Zellen zur Identifizierung von Entwicklungskontrollgenen geführt, die zum Verständnis von pathophysiologischen Ereignissen in der Zelldifferenzierung beigetragen haben. Auch in Zukunft verspricht die Entwicklungsgenetik weitere, wertvolle Anhaltspunkte für die Krebsforschung. Über die Identifizierung von neuen Krankheitsgenen hinaus bietet die Analyse des Expressionsprofils embryonaler Entwicklungsvorgänge auch Potential für medizinische Anwendungen, wie beispielsweise im Stammzellbereich. Da umgekehrt die Transformation einer Zelle zur Krebszelle als Auflösung der Alterungsvorgänge verstanden werden kann, wird gleichermaßen aus der Analyse der genetischen Steuerung von Alterungsprozessen mit aufschlußreichen Erkenntnissen für die Krebsforschung gerechnet. Gegenwärtig wird im Zentrum zudem den Mechanismen der Metastasierung sowie der Tumorangiogenese, der Induktion der Gefäßversorgung eines Tumors, großes Interesse entgegen gebracht. Die Aufklärung beider Prozesse profitiert stark von weitreichenden Kenntnissen über krebsrelevante Signaltransduktionsprozesse und vom zunehmenden Verständnis für die Regulation der Genexpression. Gemeinsam mit den grundlagenwissenschaftlichen Disziplinen wie der Zellbiologie, der Histologie und den Techniken der Molekularbiologie soll Einblick in die Mechanismen erlangt werden, mit deren Hilfe DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 7 Einführung in Zukunft dem Tumor die notwendige Anbindung an die Gefäßversorgung des Körpers unterbunden werden soll. 8 Aus dem Human-Genom-Projekt liegt umfangreiches Datenmaterial aus den DNA-Sequenzanalysen vor. Um eine sinnvolle Interpretation dieser Informationen im Kontext von Ereignissen wie Krankheit, Alterung oder Tumorgenese zu ermöglichen, sind den jeweiligen physiologischen Rahmenbedingungen angepaßte funktionelle Testsysteme erforderlich. Da auf zellulärer Ebene Proteine die eigentlichen Funktionsträger sind, muß bei der Analyse der veränderten Genexpression konsequenterweise die Frage nach qualitativen und quantitativen Unterschieden in der Proteinbiosynthese berücksichtigt werden. In jüngerer Zeit sind verschiedene Verfahren zur umfassenden Untersuchung von Proteinen im Kontext von physiologischen Fragestellungen unter dem Begriff Proteomics zusammengefaßt worden. Die Mutation in der DNA-Kodierung eines bestimmten Proteins wirkt sich in krebsrelevanten Ereignissen nicht nur auf die posttranslationale Modifizierung und Aktivität anderer Proteine aus, sondern beeinflußt auch deren relative Konzentration. Der Analyse von Protein-Expressionsmustern in der Krebsforschung wird daher im Hinblick auf die Analyse von Ereignissen bei Tumorgenese und Metastasierung große Bedeutung beigemessen. Die Erfahrungen im genomischen Informationsmanagement im Zentrum werden der Auswertung des zu erwartenden umfangreichen Datenmaterials aus den Proteomics zu Gute kommen. Die frühzeitig erfolgte, aktive Förderung der Genomforschung im Zentrum hat bereits ausgezeichnete Entwicklungen hervorgebracht, hier sind insbesondere die DNAChip-Technologie wie auch die Entwicklung zytogenetischer Techniken (Matrix-CGH) zu erwähnen. Gegenwärtig profitieren von dieser nicht nur die biomedizinische Grundlagenforschung, sondern auch epidemiologische Forschungsansätze. Virale Onkogene beeinflussen die Zellproliferation. Sie werden gleichzeitig durch intrazelluläre und extrazelluläre Kontrollmechanismen in ihrer Expression reguliert. Da bei Krebserkrankungen durch Viren in der Regel Mutationen in den zellulären Regulationsgenen vorliegen, wird daher im Zentrum auch der Entschlüsselung von genetischen bzw. epigenetischen Kontrollmechanismen nachgegangen. Ferner existiert im Zentrum ein Programm zur Identifizierung von neuen, noch nicht als tumorigen beschriebenen Viren und deren molekulargenetischer Charakterisierung. Identifizierung von Krebsrisikofaktoren und Verbesserung der Krebsvorbeugung Als Ursache von Krebserkrankungen sind genetische Veränderungen im Erbgut wie Mutationen, Infektionen, Einwirkung Strahlen oder Chemikalien nachgewiesen worden. Die Krebsvorbeugung erfordert daher eine rationale Strategie zur Aufklärung von Krebsrisiko-faktoren und wurde frühzeitig als eine besonders wichtige Aufgabe des Deutschen Krebsforschungszentrums definiert. Bei der Prävention von Krebserkrankungen gewinnen zwei Bereiche Bedeutung, dies sind zum einen vorbeugende Impfungen bei Virus-bedingten Krebserkrankungen sowie die sogenannte Chemoprävention. Die Entwicklung von präventiven Impfstoffen gegen humanpathogene Viren ist im DKFZ fest etabliert, mit den ersten klinischen Testergebnissen wird im Jahr 2003 gerechnet. In der sogenannten Chemoprävention steht die Identifizierung von pharmakologisch wirksamen Substanzen mit dem Ziel, eine potentiell mögliche Tumorgenese zu verhindern, im Vordergrund. Die zunehmende Anzahl neu isolierter Verbindungen aus verschiedenen Nahrungsmitteln gibt Hoffnung auf ihren künftigen Einsatz zum Schutz gegen Krebs. Ergänzung finden diese Untersuchungen in der breit angelegten Studie ‚Gesundheit, Ernährung und Krebs‘, die Teil der großen europäischen EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition)-Studie ist und die Zusammenhänge zwischen Ernährungsgewohnheiten und Krebs in verschiedenen Ländern Europas erforscht. Neben Ernährungsfaktoren wird in der Studie auch der Einfluß von Alkoholund Tabakkonsum sowie der Lebensstil erfaßt. Wissenschaftler des DFKZ sind aktiv an der Durchführung und Auswertung der Heidelberger Komponente dieser Studie beteiligt, die allein 25.000 Personen einschließt. In Untersuchungen zu umweltrelevanten Krebsursachen werden Wechselbeziehungen zwischen krebserzeugenden Stoffen und genetischen Faktoren berücksichtigt. Die Aufklärung der Bevölkerung über die Risiken des Tabakkonsums ist seit einigen Jahren aktiver Bestandteil des Forschungsprogramms im DKFZ und umfaßt Befragungen von Schülern zu Rauchverhalten, Passivrauchen und Gesundheitsproblemen, die Gründung eines wissenschaftlichen Netzwerks zur Tabak- und Krebsprävention und den Aufbau eines nationalen Rauchertelefons zur Raucherentwöhnung. Mit der Einrichtung des Krebsinformationsdienstes (KID) und eines KrebsSchmerztelefons werden über den Stiftungsauftrag hinausgehende, projektfinanzierte Aufgaben der nationalen Gesundheits-fürsorge wahrgenommen. Diagnostik und Therapie - Entwicklung neuer Konzepte zur Krebsbehandlung Im Hinblick auf eine Optimierung der Krebstherapie und die erforderliche Entwicklung neuer effizienter Konzepte in der Krebsbehandlung wird die Interaktion zwischen den grundlagenwissenschaftlich orientierten Disziplinen im Zentrum und den behandelnden Ärzten in der Klinik als wichtige Schnittstelle angesehen, da nur so ein direkter Transfer wissenschaftlicher Erkenntnisse in die klinische Anwendung möglich ist. Im Zentrum wurde daher ein Konzept zur Etablierung von klinischen Kooperationseinheiten aufgelegt, deren weiterer Ausbau in den nächsten Jahren als eine wichtige Aufgabe gesehen wird. Neben einem Kooperationsprojekt mit der Chir- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Einführung urgischen Klinik der Universität Heidelberg sind gegenwärtig fünf klinische Kooperationeinheiten im DKFZ etabliert. Aus der Zusammenarbeit des Zentrums mit der GSI in Darmstadt und dem Forschungszentrum Rossendorf ist ein strahlentherapeutischer Ansatz hervorgegangen: Inzwischen können Schwerionenstrahlen zur Behandlung sonst nur mit unbefriedigenden Ergebnissen zu therapierender Tumoren eingesetzt werden. Dieses innovative Verfahren gestattet es, auch tiefliegende Tumore, wie Glioblastome, ohne Beschädigung des umliegenden Nervengewebes zu bestrahlen. Bislang hat die eingeschränkte Kapazität der Pilotanlage nur eine Behandlung von 30 Patienten pro Jahr erlaubt, der Aufbau einer entsprechenden Anlage durch die Universitätsklinik Heidelberg ist in Vorbereitung. Weiterhin wird im Rahmen neuartiger Entwicklungen in der Medizintechnik die Visualisierung von CT-, MR- und Ultraschall-Darstellungen, die gleichzeitig eine interventionelle Steuerung zulassen, verfolgt. Von der Gen- und Immuntherapie, d.h. der Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten mittels Gentransfer, wurde lange Zeit erwartet, daß sie Möglichkeiten zu einer gezielten und lokalisierten Behandlung eröffnet. In der jüngeren Vergangenheit sind im Hinblick auf eine verbesserte Genvektortechnologie einige Fortschritte erzielt worden, die damit verbundenen Erwartungen lassen die Gen- und Immuntherapie wieder in eine größere Anwendungsnähe rücken. Im Zentrum werden dazu in erster Linie die Helfer-unabhängigen Parvoviren sowie Adeno-assoziierte Viren, Herpes-Viren, HI- und Spumaviren verwendet. Die Entwicklung therapeutischer Strategien wird voraussichtlich in den nächsten Jahren von aktuellen Erkenntnissen zum programmierten Zelltod, der Apoptose, profitieren können. Auf diesem Gebiet ist der Transfer herausragender Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in anwendungsorientierte Fragestellungen gelungen: Er führte nicht nur zu einem Einblick in die Pathogenese von AIDS und Sepsis, sondern auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Schlaganfällen, die gegenwärtig auf ihre generelle Anwendbarkeit überprüft werden. Mit der Entdeckung der TRAIL-induzierten Apoptose (TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie) haben sich auch für die Krebstherapie wertvolle Möglichkeiten für vielversprechende therapeutische Ansätze ergeben: TRAIL induziert den Zelltod in Tumorzellen, wohingegen eine Wirkung auf normale Körperzellen, mit Ausnahme der Leber, nicht nachweisbar ist; ein Ansatz, der in Zukunft für die Entwicklung rationaler Therapien ausgeschöpft werden soll. Die Kenntnis der Ursachen ist eine grundlegende Voraussetzung für die Frühdiagnostik ebenso wie für die Entwicklung neuer Konzepte und Strategien in der Krebstherapie. Sie ist neben der Erfassung der Krebsrisikofaktoren auch entscheidend für Entwicklungen auf dem Gebiet der Krebsvorbeugung. Da Probleme der Krebsforschung im Zusammenwirken vieler für die Krebsforschung relevanter Fachrichtungen besser bearbeitet werden können, wird das gemeinsame Forschungsziel mit dem jeweiligen Instrumentarium der einzelnen wissenschaftlichen Disziplinen angegangen. Vor diesem Hintergrund hat sich das Forschungsprogramm des DKFZ entwickelt und wird konsequent fortgeführt. Die Forschungsaufgaben werden von 50 Abteilungen und zeitlich befristeten Abteilungen sowie von Projektund Arbeitsgruppen im Rahmen definierter Forschungsschwerpunkte wahrgenommen. Die Mehrzahl der Abteilungsleiter wurde dabei gemeinsam mit der Universität Heidelberg berufen. Unterstützt werden die Projekte und die Arbeit der Abteilungen durch die Zentralen Einrichtungen und Dienste wie Tierlabor, Zentralbibliothek, Strahlenschutz und Dosimetrie, Histodiagnostik, Cytometrie, Tumorbank, Spektroskopie, Proteinanalytik, Biostatistik, Zentrale Datenverarbeitung und verschiedene Informationssysteme sowie durch die Abteilungen der Verwaltung. Für die kommenden Jahre werden durch den multidisziplinären Einsatz des Forschungspotentials, konzentriert auf die Forschungsschwerpunkte, vielversprechende Möglichkeiten gesehen, in der Analyse der Tumorentstehung und -entwicklung sowie in Krebsdiagnostik und -therapie wesentliche Fortschritte zu erreichen. Gegenwärtig werden die vielfältigen Aufgaben in der Krebsforschung und Prävention im Rahmen von derzeit acht Forschungsschwerpunkte wahrgenommen. Forschungsschwerpunkte des DKFZ (A) Krebsentstehung und Differenzierung (B) Tumorzellregulation (C) Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention (D) Diagnostik und Experimentelle Therapie (E) Radiologische Diagnostik und Therapie (F) Angewandte Tumorvirologie (G) Tumorimmunologie (H) Genomforschung und Bioinformatik In der Haushaltsplanung sind für die Forschungsarbeiten 2002 ein Personaleinsatz von 1440 Personenjahren (PJ) und ein Finanzmitteleinsatz von 129,6 Mio Euro vorgesehen. Nationale und internationale Zusammenarbeit Der nationalen und internationalen Zusammenarbeit widmet das Zentrum besondere Aufmerksamkeit. So weist das Forschungsprogramm 2001/2002 über 900 Kooperationen mit Wissenschaftlern in 45 Ländern aus. Daraus resultiert auch der hohe Anteil (etwa 60%) von gemeinsamen Veröffentlichungen aus dem DKFZ mit anderen Forschungsinstituten. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 9 Einführung 10 Erwähnt seien hier national die Kooperationen innerhalb der DFG-Sonderforschungsbereiche 352 ‘Molekulare Mechanismen intrazellulärer Transportprozesse’, 405 ‘Immuntoleranz und ihre Störungen’, 601 ‘Molekulare Genese hepato-gastroenterologischer Erkrankungen’, 414 ‘Informationstechnik in der Medizin - Rechner- und sensorgestützte Chirurgie’, sowie im Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim und mit weiteren Instituten und Forschungsstätten im Heidelberger Raum. Einzelkontakte bestehen zu über 60 Universitäten und außeruniversitären Forschungsinstituten in der Bundesrepublik Deutschland. Der Klinisch-Biomedizinische Forschungsverbund (KBF), dessen Gründung vom DKFZ initiiert wurde, zählt inzwischen insgesamt 17 Mitgliedseinrichtungen, darunter 10 HGF-Zentren und 7 assoziierte Einrichtungen. Der Verbund hat sich zum Ziel gesetzt, durch die Qualitätsoptimierung entsprechender Forschungsansätze sowie die gezielte Förderung von Gemeinschaftsprojekten mit dem klinischen Umfeld einen Beitrag zur Verbesserung der klinisch-orientierten biomedizinischen Forschung zu leisten. Die Qualitätsoptimierung soll im wesentlichen durch eine entsprechende Berufungspolitik und die Leistungsbewertung der eigenen Forschung erzielt werden. Als HGF-Zentrum ist das DKFZ Mitglied im Forschungsverbund Gesundheit - der auch dem KBF als Dachverband dient - und sich in drei Forschungsbereiche gliedert: die biomedizinische Forschung, die Medizintechnik und den Bereich „Public Health“. Der Forschungsverbund Gesundheit wird sich auf HGF-Ebene medizinischen Fragestellungen widmen, die wissenschaftliche Netzwerke und interdisziplinäre Ansätze zu ihrer Bearbeitung erfordern. Im Rahmen der ersten Runde des HGF-Strategiefonds warben Wissenschaftler des Zentrums in zwei kooperativen biomedizinischen Anträgen eine Fördersumme von 5,37 Mio DM für den Zeitraum Juli 1998 - Juni 2001 ein. In der zweiten - den Zeitraum Juli 1999 - Juni 2002 umfassenden - Runde des Strategiefonds, flossen Mittel für insgesamt 10,95 Mio DM an das Zentrum zurück. In der dritten Antragsrunde sind Wissenschaftler des DKFZ an insgesamt 6 Anträgen aus den Gebieten Biomedizin, Bioinformatik und Epidemiologie beteiligt. Das DKFZ war am Aufbau der 1980 gegründeten Sektion und heutigen Arbeitsgemeinschaft Experimentelle Krebsforschung (AEK) der Deutschen Krebsgesellschaft deutlich beteiligt und veranstaltet alternierend zum Deutschen Krebskongreß alle zwei Jahre AEK-Symposien in Heidelberg, die ein Diskussionsforum der verschiedenen Sektoren der experimentellen und klinischen Krebsforschung darstellen. Die internationale Zusammenarbeit entwickelt sich ebenfalls in erfreulicher Weise weiter und wurde besonders durch aktive Zusammenarbeit im Rahmen der „Organisation of European Cancer Institutes (OECI)“ verstärkt. Diese Organisation, die zur Zeit etwa 70 europäische Krebszentren umfaßt, hat insbesondere auf dem Gebiet der Datenverarbeitung und -übertragung eine enge Kooperation begonnen und gleichzeitig den Ausbau von Krebsinformationsdiensten, vor allem auch im osteuropäischen Raum vorgesehen. Darüber hinaus ist das DKFZ Mitglied der UICC (International Union against Cancer). Nach gemeinsamem Beschluß der UICC wird die Herausgabe des „International Journal of Cancer“, einer internationalen Fachzeitschrift auf dem Gebiet der Krebsforschung, ab dem Jahre 2000 an das DKFZ übertragen. Wissenschaftler des DKFZ arbeiten in der EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer), der EACR (European Association for Cancer Research) und in der WHO (World Health Organization) mit. Mit der IARC (International Agency for Research on Cancer) der WHO in Lyon, Frankreich, arbeitet das DKFZ eng zusammen. Die Projekte der Forschungskooperation mit dem MOS (Ministry of Science) Israels wurden von Gutachtern hervorragend beurteilt und werden fortgesetzt bzw. erweitert werden. Weiter bestehen besondere institutionalisierte Kooperationen mit dem NCI (National Cancer Institute) der USA. Durch Aufnahme einer Forschergruppe, die gleichzeitig zum INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) gehört, sollen die traditionell guten Kontakte zu französischen Forschern in Universitäten und CNRS (Centre Nationale de la Recherche Scientifique) weiter vertieft werden. Mit verschiedenen Einrichtungen der Volksrepublik China und dem Chulabhorn Research Institute, Thailand, bestehen Kooperationsverträge. Im Rahmen der deutsch-japanischen Forschungskooperation wird die wissenschaftliche Zusammenarbeit durch den Austausch von Wissenschaftlern weiter intensiviert und durch die Organisation Deutsch-Japanischer Workshops (beispielsweise 1996 in Heidelberg, 1998 in Kumamotu, Japan) unterstützt. Gemeinsame Forschungsarbeiten von Wissenschaftlern aus Indien und dem DKFZ werden fortgesetzt. In Rahmen eines von der Europäischen Union geförderten Kooperationsprojektes zwischen dem DKFZ und der Semmelweis Universität in Budapest werden Kurse und Austauschprogramme zur Harmonisierung der Ausbildung medizinischer Doktoranden in Ungarn durchgeführt. Die internationalen Kooperationen werden erheblich durch Gastaufenthalte von Wissenschaftlern aus aller Welt (2000 122 Gäste aus 38 Ländern, 2001 127 Gäste aus 38 Ländern) gefördert. Aufgrund der begrenzten Finanzierungsmöglichkeiten mußte die Anzahl der DKFZfinanzierten Gastwissenschaftleraufenthalte trotz stetig steigender Nachfrage leicht abgesenkt werden. Das DKFZ bemüht sich, trotz dieser Problematik insbesondere den Staaten Osteuropas und Asiens durch Gastwissenschaftler-Finanzierungen Hilfestellung zu leisten. Die Förderung gemeinsamer wissenschaftlicher Projekte im Rahmen der Europäischen Union hat darüber hinaus zu zahlreichen Kooperationen mit Forschern anderer Länder der Gemeinschaft geführt, die hier nicht im Detail aufgeführt werden. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Einführung Prüfung und Bewertung des Forschungsprogramms Das Forschungsprogramm des DKFZ unterliegt einer permanenten Überprüfung: Die internen Begutachtungen finden auf der Basis von Präsentationen sämtlicher Abteilungen eines Forschungsschwerpunktes (etwa alle zwei Jahre für jede Abteilung) statt. Diese Präsentationen sowie die vorbereiteten schriftlichen Unterlagen führen zu einer vergleichenden Bewertung der Qualität der wissenschaftlichen Arbeit der Abteilungen, welche unter Berücksichtigung des Erfolgs bei der Drittmitteleinwerbung Einfluß auf die Höhe der leistungsabhängigen Mittelzuweisung an die Abteilungen hat. Nach den internen Begehungen wird auch beraten, welche der laufenden Forschungsaktivitäten in dem Ausmaß der Förderung oder in der Laufzeit begrenzt werden sollen. Bei den externen Begutachtungen der Forschungsschwerpunkte (alle 5 Jahre) werden unter der Federführung des Wissenschaftlichen Komitees des Kuratoriums des DKFZ unabhängige, wissenschaftlich besonders ausgezeichnete und überwiegend ausländische Gutachtergruppen benannt. Während der 2-tägigen Begutachtung machen sich die Gutachter durch eine Vielzahl von Gesprächen mit Mitgliedern der jeweiligen Abteilungen und durch die Präsentationen des Forschungsschwerpunktes ein Bild über die wissenschaftliche Qualität der betreffenden Abteilungen. Die Eindrücke dieser Gespräche sowie die vorbereiteten schriftlichen Unterlagen dienen dann als Basis für die Erstellung des schriftlichen Gutachtens. Um für die im biomedizinischen Bereich arbeitenden Forschungseinrichtungen, die im Verbund ‘Klinisch-Biomedizinische Forschung’ (KBF) zusammengeschlossen sind, einheitliche Bewertungsmaßstäbe anzulegen, sind an den externen Begutachtungen der Forschungsschwerpunkte des DKFZ jeweils 1-2 Vertreter des Verbundes als Beobachter anwesend. Im Gegenzug entsendet das DKFZ ebenfalls Gutachter zu Begutachtungen von Instituten/ Forschungsschwerpunkten der anderen Mitglieder des Verbundes. Struktur und Stellung des Wissenschaftlichen Ergebnisberichts Die Arbeiten der Wissenschaftler des DKFZ werden in wissenschaftlichen Zeitschriften, Sammelbänden, Monographien und durch Beiträge zu Kongressen sowie Vorträge veröffentlicht. Die Literaturliste wird jährlich in den „Veröffentlichungen des DKFZ“ als Buch und im Internet (http://www.dkz-heidelberg.de/zbi/pub/pv2000.pdf) publiziert. Das DKFZ erstellt jährlich einen zusammenfassenden wissenschaftlichen Bericht für die zurückliegenden zwei Jahre: Alternierend den „Wissenschaftlichen Ergebnisbericht“ und den englischen „Research Report“. Der Wissenschaftliche Ergebnisbericht hat primär die Aufgabe, eine Berichtsverpflichtung des DKFZ als Großfor- schungseinrichtung gegenüber den Zuwendungsgebern (Bund sowie Land Baden-Württemberg) zu erfüllen. Das DKFZ hat diesen Bericht aber von Anfang an so konzipiert, daß neben diesen Adressaten die Berichte über die Aktivitäten des DKFZ auch zur Information von Fachkollegen und wissenschaftlich Interessierten dienen. Seit 1986 wird ein englischer Bericht, der „Research Report“, erstellt, der sich an die internationale wissenschaftliche Öffentlichkeit wendet. Die letzte Ausgabe des Research Reports erschien 2001 für die Jahre 1999/2000. Beide Bücher werden nach den derzeit acht Forschungsschwerpunkten des DKFZ gegliedert. Zur Erschließung des Berichts im Rahmen der Berichtsverpflichtung werden die Nummern des Forschungsprogramms 2001/ 2002 des DKFZ (ein internes Planungspapier) in Klammern an die Titel angehängt (beginnend mit einem Buchstaben für die Zugehörigkeit zu einem Forschungsschwerpunkt [A-H], den Zentralen wissenschaftlichen Einrichtungen [R]) oder dem Vorstandsbereich [S]). Für die interessierte Öffentlichkeit sind eine im Buchhandel erhältliche Sammelbände mit Darstellungen einzelner Aspekte der Forschung und der Arbeit des DKFZ unter dem Titel „Krebsforschung heute“ (englische Fassung „Current Cancer Research“) (beide Steinkopff Verlag Darmstadt) sowie die viermal jährlich erscheinende Zeitschrift „einblick“ bestimmt. Chancengleichheit im DKFZ Ende der 90er Jahre einigten sich Bund und Länder darauf, daß auch die außeruniversitären Einrichtungen Frauenbeauftragte bestellen konnten, die die Bezeichnung „Beauftragte für Chancengleichheit“ erhielten. Mit Hilfe der Beauftragten soll es Frauen in der HGF durch geeignete Maßnahmen ermöglicht werden, Wege in Führungspositionen zu finden. Bei den Stellenbesetzungsverfahren sollen die Beauftragten die Transparenz der Auswahlverfahren erhöhen - angesichts des in den kommenden Jahre anstehenden Generationswechsels und daraus ergebenden Neubesetzungen von Professuren eine große Chance. Für die Beauftragten allein sind die damit verbundenen Aufgaben natürlich nicht zu leisten; mit Unterstützung war jedoch einiges zu erreichen. 1999 wurde die erste Vorstandsbeauftragte für Chancengleichheit im DKFZ, Dr. Barbara Bertram, von den Frauen des Zentrums gewählt und vom Vorstand für 2 Jahre bestellt, 2001 für weitere 2 Jahre verlängert. Sie verfolgt mit 50% ihrer Arbeitszeit ihre frauenpolitischen, mit den übrigen 50% weiterhin ihre wissenschaftlichen Ziele. 2001 wurde Dr. Bertram zur Vorsitzenden des „Arbeitskreis Frauen in Forschungszentren“ der HGF gewählt. Bevor die Beauftragte für Chancengleichheit ihre Arbeit aufnahm, hatte die 1989 gegründete „Fraueninitiative“ die Arbeit auf dem Gebiet der Chancengleichheit geleistet. Die Fraueninitiative löste sich auf und im März 2001 wurde der „Arbeitskreis Chancengleichheit“ gegründet. Auch zu diesem Gremium hält die Beauftragte engen Kontakt. Maßnahmen zur Förderung der Chancengleichheit DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 11 Einführung 12 Personalentwicklungsplan Die Fraueninitiative des DKFZ und die Beauftragte für Chancengleichheit haben den Entwurf eines Personalentwicklungsplans erarbeitet. Er stellte inhaltlich den Vorläufer des „Plan zur Förderung der Chancengleichheit“ dar, der im Mai 2001 in Kraft trat. Der Plan bezieht sich auf Männer und Frauen aus dem wissenschaftlichen und dem nichtwissenschaftlichen Personal und regelt u.a. die Auswahl von Bewerberinnen und Bewerbern, den Wiedereinstieg, die Fort- und Weiterbildung, die Arbeitszeit, die Teilzeit, die Beurlaubung sowie die Rechte und Pflichten der Beauftragten für Chancengleichheit. Zur Zeit ist ein Plan zu Wiedereinstiegsmaßnahmen in Arbeit. Die vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) zur Verfügung gestellten „Stellenermächtigungen“ sind an hervorragende Wissenschaftlerinnen des Hauses vergeben worden. Insgesamt 18 Stellen konnten so besetzt werden. Kinderbetreuung Das BMBF hat das DKFZ ermächtigt, Maßnahmen zur Kinderbetreuung (mit) zu finanzieren. Diese Unterstützung erhält der Verein „Die Wichtel“ für das Betreiben einer vom DKFZ mitgenutzten Kindertagesstätte in Heidelberg. Netzwerke / Vorbilder Das Mentoring Programm „MuT“ (Mentoring und Training) des Landes Baden-Württemberg wurde im DKFZ etabliert. In Kooperation mit der Pädagogischen Hochschule Heidelberg haben die Beauftragte für Chancengleichheit und die Abteilung für Presse- und Öffentlichkeitsarbeit „Science goes public“ konzipiert, eine Veranstaltungsreihe, die als Satellitenveranstaltung im Jahr der Lebenswissenschaften anerkannt wurde und in zwei Jahren 6 8 Veranstaltungen anbieten wird. Bislang haben drei Veranstaltungen stattgefunden:1. „Dem Tumor den Saft abdrehen - Modelle zur Antiangiogenese“ mit Dr. Maren Hansen, 2. „Krebsprävention mit Messer und Gabel“ mit Dr. Clarissa Gerhäuser und 3. „Das Unsichtbare sichtbar machen. Proteine - Bausteine des Lebens“ mit Dr. Martina Schnölzer. Information / Transparenz Eine mailing-list mit aktuellen Infos und Tipps für Habilitandinnen und post-docs im DKFZ wurde eingerichtet. Daraus ist das Netzwerk für Habilitandinnen hervorgegangen. Stabsstelle Technologietransfer Die Infrastruktur der Stabstelle Technologietransfer am Zentrum stellt den Schutz von geistigem Eigentum am Zentrum sicher und trägt dazu bei, Fortschritte aus der Krebsforschung zur klinischen Anwendung zum Wohl der Krebspatienten voran zu bringen. Die aktive Verwertung von Ergebnissen der Grundlagenforschung hilft die Lükke zwischen wissenschaftlicher Forschung und kommerzieller Entwicklung zu überbrücken. Kontakte bestehen zwischen Forschung am Zentrum und der Industrie durch wissenschaftliche Kooperationen, Workshops und vielfältigen Netzwerkaktivitäten wie z.B. in der BioRegion Rhein-Neckar-Dreieck. National und weltweit werden Kooperations- und Lizenzvereinbarungen mit kleinen, mittleren und großen Unternehmen getroffen. Auch Prototypen werden mit Industriepartnern zur Evaluierung und Testung ausgetauscht. Das Zentrum unterstützt Wissenschaftler darüber hinaus bei der Gründung von spin-off-Unternehmen. Die Stabsstelle Technologietransfer sensibilisiert die Wissenschaftler für die kommerzielle Verwertbarkeit ihrer Ergebnisse und motiviert sie, ihre Erfindungen parallel zu einer Publikation zum Patent anzumelden. Bei einer Patentanmeldung werden die Forscher von der Stabsstelle beraten und unterstützt und die Kommerzialisierung von Ideen bereits zu einem frühen Stadium mit den Wissenschaftlern abgestimmt und vorbereitet. Erfindungen des Deutschen Krebsforschungszentrums werden an den bestmöglichen Industriepartner lizenziert, der von der Stabsstelle Technologietransfer hinsichtlich einer möglichst raschen Entwicklung von Produkten identifiziert wurde. Von den lizenzierten Patenten des Zentrums, die schließlich als Produkte auf dem Markt verkauft werden, wie beispielsweise ein neues Medikament gegen Krebs, profitieren die Erfinder und das Zentrum und letztlich insbesondere die Krebspatienten. In Jahr 2001 reichte das Deutsche Krebsforschungszentrum 45 neue Anmeldungen zum Patent ein. Derzeit verfügt das DKFZ über einen Gesamtbestand von 1328 angemeldeten (darunter 510 erteilten) Schutzrechten weltweit. Die Stabsstelle Technologietransfer unterhält Internetseiten mit einem aktualisierten Patentportfolio. Die Seiten sind abrufbar unter der Homepage des DKFZ (http://www.dkfz.de/techtrans/htm). Tierschutz und Tierversuche Trotz zunehmender Entwicklung von Ersatzmethoden haben Tierexperimente im DKFZ ihren Stellenwert; dies spiegelt sich in Hinweisen auf die Verwendung von Versuchstieren oder tierischen Geweben und Zellen in nahezu jeder dritten Publikation des Zentrums wieder. Der Tierbestand im DKFZ beträgt durchschnittlich ca. 27.000 Tiere pro Jahr (2001), wobei ein stetiger leichter Anstieg - bedingt durch die zunehmende Generierung transgener Mausmodelle - (1997: 20.000 T., 1998: 23.000 T., 1999: 24.000 T.) zu verzeichnen ist. Die Zahl der genehmigten und angezeigten Versuchsvorhaben in den Jahren 1990 bis 2001 schwankte zwischen 160 und 198 Vorhaben (davon bis zu 65 % genehmigungs- und bis zu 53 % anzeigepflichtige Versuchsvorhaben). Der Hauptanteil der Versuchstiere (ca. 97 % Mäuse, ca. 2 % Ratten) wird zur Erforschung oder Erprobung von Methoden zur Diagnostik, Prophylaxe oder Therapie, in der Grundlagenforschung, zur Entnahme von Geweben und Organen und zur Aus-, Fort- und Weiterbildung eingesetzt. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Einführung Die Tierschutzbeauftragten (TSB) des DKFZ werden vom Stiftungsvorstand bestellt und sind nebenamtlich tätig, sie vertreten die Berufsgruppen der Veterinärmedizin, Humanmedizin und Biologie. Sie sind nach dem Tierschutzgesetz von 1986 verpflichtet, auf die Einhaltung von Vorschriften, Bedingungen und Auflagen im Interesse des Tierschutzes zu achten und die Einrichtung und die mit den Tierversuchen und mit der Haltung der Versuchstiere befassten Personen zu beraten. Des weiteren müssen sie zu jedem Antrag auf Genehmigung eines Tierversuches Stellung nehmen und innerbetrieblich auf die Entwicklung und Einführung von Verfahren und Mitteln zur Vermeidung oder Beschränkung von Tierversuchen hinwirken. Jeder Antrag (Genehmigung oder Anzeige von Versuchsvorhaben) wird in der Internen Tierschutzkommission (ITSK) zur Beurteilung seiner wissenschaftlichen und statistischen Relevanz vorgelegt. Die ITSK wurde 1986 vom Stiftungsvorstand des DKFZ einberufen und setzt sich aus Wissenschaftlern verschiedener Fachrichtungen zusammen. Die Stellungnahme und das Votum der ITSK werden dem TSB mitgeteilt, der dann in seiner Stellungnahme zum Antrag darauf Bezug nimmt. Darüberhinaus sind die TSB des DKFZ Mitglieder der ‚Arbeitsgemeinschaft der Tierschutzbeauftragten BadenWürttembergs’ (ATBW). Diese Arbeitsgruppe erarbeitet und veröffentlicht gemeinsam mit Behördenvertretern Richtlinien und Empfehlungen, wie: Empfohlene maximale Injektionsvolumina, Kriterien zur vorzeitigen Tötung tumortragender Ratten und Mäuse, Blutentnahme und Immunisierung von Versuchstieren, Herstellung transgener Mäuse und Ratten, ect.. Zu dem ist ein Großteil der TSB aktiv am ‚Einführungskurs in das tierexperimentelle Arbeiten’ beteiligt, in dem Doktoranden, Diplomanden und weitere interessierte Mitarbeiter auf das fachkundige und damit tierschutzgerechte tierexperimentelle Arbeiten vorbereitet werden. Biologische Sicherheit am DKFZ Fragen der Biologischen Sicherheit werden durch eine Vielzahl von Gesetzen, Verordnungen und Vorschriften geregelt. Für die am DKFZ weitverbreiteten molekularbiologischen Arbeiten spielen neben dem Infektionsschutzgesetz, dem Tierseuchenerregergesetz und der Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen (Biostoffverordnung) das Gentechnikgesetz (GenTG), und die Gentechniksicherheitsverordnung eine besondere Rolle. Gentechnische Arbeiten und solche mit biologischen Agenzien werden an Hand des Risikopotentials in vier Sicherheitsstufen eingeteilt. Am DKFZ werden nur Arbeiten der Stufen S1, S2 und S3 durchgeführt: - Sicherheitsstufe S1(ohne Risiko für Mensch und Umwelt) gilt z. Z. für über 40 Labors des DKFZ. - Sicherheitsstufe S2 umfaßt Arbeiten mit geringem Risiko für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt in 24 besonders gekennzeichneten Labors des DKFZ, in denen ca. 100 S2-Projekte angemeldet sind. - Sicherheitsstufe S3 beinhaltet Arbeiten mit krankheitserregenden Organismen, bei denen von einem mäßigen Risiko für Mensch und Umwelt auszugehen ist. Dem DKFZ stehen vier S3 Laboratorien für Untersuchungen z.B. an HI-Viren und für Hepatitis-Viren zur Verfügung. Zur Beratung der Projektleiter im Sinne des GenTG und des Stiftungsvorstands hat dieser einen Ausschuß für Biologische Sicherheit (ABS) bestellt. Dieser unmfaßt derzeit 14 Wissenschaftler, die selbst im Labor arbeiten und die Funktion von Beauftragten für Biologische Sicherheit (BBS) nebenamtlich wahrnehmen. Die fachnahen BBS betreuen die gentechnische Projekte und Projektleiter, beraten die Antragsteller und empfehlen Sicherheitsmaßnahmen. Der ABS verfaßt Muster-Betriebsanleitungen für die gentechnischen Anlagen und setzt seine fachliche Kompetenz zur Aufstellung hausinterner Sicherheitsregelungen ein. Voraussetzung für eine erfolgreiche Arbeit ist dabei die Unterstützung aus dem Bereich des Stiftungsvorstands und die enge Zusammenarbeit aller für die Arbeitssicherheit verantwortlichen Gremien am DKFZ. Die gentechnischen Bereiche des Hauses werden regelmäßig durch das Regierungspräsidium Tübingen als zuständiger Aufsichtsbehörde begangen. Bei diesen Begehungen, die über die Kontrolle hinaus auch der fachlichen Diskussion zwischen den verschiedenen Verantwortungsebenen dienen, fungieren die BBS als Anlaufstelle für Behörde und Projektleiter. Ein enges Zusammenwirken mit der Stabsstelle Sicherheit ermöglicht die fruchtbare Zusammenarbeit mit dem Regierungspräsidium. Seit Inkrafttretens des Gentechnikgesetzes (1990) ist nach anfänglichen Schwierigkeiten die Lösung vieler organisatorischer und bürokratischer Probleme zur Routine geworden. Die Risikobewertung wurde durch die ständig erweiterten Empfehlungen der Zentralen Kommission für die Biologische Sicherheit und die von ihr erstellten Listen bereits bewerteter Organismen und Arbeiten vereinfacht. Die bisherigen Novellierungen der gentechnikrechtlichen Bestimmungen haben für den Bereich der Grundlagenforschung nicht zu den von vielen Wissenschaftlern erhofften Erleichterungen der Arbeitsbedingungen geführt. Als problematisch empfindet der ABS die geltenden Vorschriften für gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe S1, also für Arbeiten, bei denen von keinem Risiko für Mensch und Umwelt auszugehen ist . Der ABS befürwortet daher eine kritische Überprüfung aller S1-Arbeiten mit dem Ziel, diese weitgehend aus dem Regulierungsbereich des Gentechnikgesetzes herauszunehmen, da ausreichende Sicherheitsbestimmungen außerhalb des GenTG vorhanden sind. Dies könnte zur Konzentration auf die eigentlich risikobehafteten Arbeiten führen und letztlich die biologische Sicherheit erhöhen. In diesem Sinne versucht der ABS auf nationaler und europäischer Ebene auf die Gesetzgebung Einfluß zu nehmen. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 13 Interdisziplinäre Forschung Interdisziplinarität mit oder ohne Fokussierung Gedanken zur Strukturreform der Großforschungseinrichtungen 14 Harald zur Hausen In einer Vielzahl von Kommentaren zur Hochschulreform, aber auch zur Neustrukturierung der Einrichtungen der Helmholtz-Gemeinschaft (HGF, frühere AGF) wird mit besonderer Betonung Wert auf interdisziplinäre Forschung gelegt. Gab es sie bisher nicht? Ist sie verbesserungswürdig? Wird diesem Begriff überall die gleiche Bedeutung zugrunde gelegt? Die Verbindung unterschiedlicher Fachbereiche, das Ineinanderfließen neuer Denkansätze zur Lösung oft langanstehender Fragen, das Aufkeimen eines neuen Verständnisses für schwer durchdringbare Problemkreise durch sachfremde, aber eben darum unvoreingenommene Einwürfe nicht unmittelbar Beteiligter hat so häufig zum wissenschaftlichen Fortschritt beigetragen, dass dies eigentlich keiner weiteren Erörterung bedarf. Wie aber können wir einen solchen Prozess beflügeln, ihn sozusagen institutionalisieren, um damit nicht nur eine Optimierung anstehender Forschung zu erreichen, sondern auch originelle - wirklich innovative - Ideen in den Forschungsprozess einmünden zu lassen? In besonders nachhaltiger Weise wird diese Fragestellung zur Zeit über das Bundesministerium für Bildung und Forschung in die Mitgliedseinrichtungen der Helmholtz-Gemeinschaft hineingetragen und hat hier zu vielfältigen Resonanzen geführt. Die Aufwendungen für den Unterhalt dieser Einrichtungen mit annähernd 22.000 Beschäftigten übersteigen die zwei Milliarden Euro Grenze pro Jahr. Es ist daher mehr als verständlich, wenn sich vor allem das zuständige Bundesministerium die Frage stellt, ob hier ein möglichst effizienter Mitteleinsatz gewährleistet ist und wenn Überlegungen angestellt werden, in welchem Umfang Strukturveränderungen mögliche Verkrustungen aufbrechen und Effizienzsteigerungen bewirken können. Das Zauberwort der Interdisziplinarität der Forschung steht hierbei ganz im Vordergrund der Diskussion. Diese Interdisziplinarität wird nun über Programme angestrebt, die eine möglichst enge Vernetzung der Zentren untereinander erzeugen sollen. Der Kernpunkt laufender Diskussionen ist die Frage nach Art und Gestaltung dieser Programme. Die Forschungszentren der HGF sind sehr unterschiedlich strukturiert. Frühere Kernforschungszentren haben in der Zwischenzeit eine Reihe unterschiedlicher neuer Aufgaben übernommen, die von technischen Neuentwicklungen, physikalischer Grundlagenforschung, über Umweltforschung bis hin zu gesundheitsrelevanten Fragestellungen führen. Wieder andere Forschungszentren stellen Großgeräte überwiegend für die Grundlagenforschung zur Verfügung, die gleichzeitig die fachliche Basis für die Mehrzahl ihrer Mitarbeiter darstellt, wie etwa DESY in Hamburg und die GSI in Darmstadt. Zwei Zentren (DKFZ in Heidelberg und MDC in Berlin-Buch) betreiben eine eher anwendungsorientierte medizinische Grundlagenforschung, deren Ergebnisse rasch in die klinische Anwendung einmünden sollen. Wiederum andere betrei- ben Umweltforschung, die neben anderen Aspekten Klimaforschung, Bodenveränderungen und Gesundheitsaspekte einschließt. Diese Liste ließe sich noch von meeresbiologischer Forschung bis hin zur Weltraum- und Verkehrsforschung erweitern, um nur zwei weitere Beispiele zu benennen. Die Bemühungen um verbesserte interdisziplinäre Forschung stehen schon aufgrund der Heterogenität der Einrichtungen vor einem beträchtlichen Problem. Ist Interdisziplinarität dann am besten zu erreichen, wenn eher Methoden-orientierte Themenkreise, die in verschiedenen Einrichtungen bearbeitet werden, in einen gemeinsamen „Topf“ geworfen werden? Dies könnte zum Beispiel für die Genomforschung, die alle Bereiche der Gesundheitsforschung umfasst, die sogenannten Proteomics (die Analyse der Eiweißprofile von Zell- und Organstrukturen) oder auch in einem gewissen Umfang für die Zellbiologie als Grundlage für Herz-Kreislauf-, Krebs-, Infektions- und Allergieforschung gelten. Ein gemeinsames „Programm“ aller beteiligten Einrichtungen wäre dann jeweils auf diesen Sektoren zu erarbeiten, dessen Koordinator primär die innere Abstimmung aller Programm-Beteiligten im Auge behalten sollte, möglicherweise sogar unter Einflussnahme auf die gemeinsame Forschungsrichtung durch Budget- und Programmsteuerung. Wäre es als Alternative nicht sinnvoller - um im Bereich der Gesundheitsforschung zu bleiben - Themenkreise, die komplexe Krankheitsinhalte bearbeiten, also etwa Herz-Kreislaufforschung, Krebs und Allergien, interdisziplinär anzugehen? Ist es sinnvoll, etwa über eine Einrichtungs-übergreifende Struktur, die Themenkreise mit sehr unterschiedlicher Zielsetzung aber mit ähnlicher Methodik (also etwa die Genomforschung, die Zellbiologie, die Medizintechnik) zusammenfasst, dieser Entwicklung entgegen zu wirken und damit ein über längere Zeiträume gewachsenes Gefüge interdisziplinärer Zusammenarbeit auseinander zu reißen? Ich halte es für wichtig, vor dieser Entwicklung zu warnen, die letztlich zu einer Verschiebung von gesundheitspolitisch wichtigen Forschungsthemen - im wesentlichen auf enggleisige Technologie-Entwicklungen und zu einer Verwässerung wirklicher Forschungsziele führen muss. Hier droht die Gefahr einer Entwicklung, die man als falsch verstandene Interdisziplinarität interpretieren kann. Zwar ist die anwendungsfreie Grundlagenforschung zweifellos nicht die Hauptaufgabe der staatlich geförderten Forschungszentren der Helmholtz-Gemeinschaft und der Institute der Leibniz-Gesellschaft. Sie ist sicherlich bevorzugt bei der Max-Planck-Gesellschaft und den universitären Instituten aufgehoben. Auf der anderen Seite ist die Bearbeitung komplexer Fragestellungen - wie etwa im Gesundheitsbereich der Krebs - sicherlich nur im interdisziplinären Zusammenspiel daran interessierter Gruppen möglichst aus verschiedenen Fachrichtun- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Interdisziplinäre Forschung gen zu erreichen. Unter dieser Prämisse sind eine Reihe der Großforschungseinrichtungen entstanden, wie etwa das Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung in Bremerhaven, das Deutsche Krebsforschungszentrum in Heidelberg und noch andere. Hier waren etwa die Berufungen von vornherein darauf ausgerichtet, möglichst viele Forschungsdisziplinen zu vereinen, um in interdisziplinären Programmen Fortschritte zu erzielen. Interdisziplinarität gedeiht dort, wo klare Profile bestehen und wo Fokussierungen auf langfristige Forschungsziele vorliegen. Programme können für Klarheit sorgen, sie können aber auch Probleme verwaschen - nämlich dann, wenn sie keine wirklichen Programme darstellen. Eine entscheidende forschungspolitische Zukunftsaufgabe liegt darin, für einen lokalen und überregionalen interdisziplinären Aufbau Sorge zu tragen, der Profile schafft und Fokussierungen ermöglicht. Wenn wir über bestehende institutionelle Grenzen hinweg denken, ist es keineswegs unmöglich, Konzepte zu entwickeln, die unter diesen Vorgaben auch Einrichtungs-übergreifende technische Zusammenarbeiten ermöglichen und Vernetzungen schaffen. Auch wenn es sicherlich notwendig ist, immer wieder über Verbesserungsmöglichkeiten unseres Forschungssystems nachzudenken und - wo immer dies sinnvoll ist - diese auch zu implementieren, lässt sich über eine falsch verstandene Interdisziplinarität auch vieles zerstören. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 15 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Übersicht Forschungsschwerpunkt Krebsentstehung und Differenzierung Sprecher: Prof. Dr. Werner W. Franke Zellbiologie (A0100) Prof. Dr. rer. nat. Werner W. Franke 06221 42-3212, FAX 06221 42-3404 e-mail: [email protected] 16 Molekularbiologie der Zelle I (A0200) Prof. Dr. med. Günther Schütz 06221 42-3411, FAX 06221 42-3470 e-mail: [email protected] Molekularbiologie der Zelle II (A0300) Prof. Dr. rer. nat. Ingrid Grummt 06221 42-3423, FAX 06221 42-3404 e-mail: [email protected] Entwicklungsgenetik (A0400) Prof. Dr. rer. nat. Bernard Mechler 06221 42-4502, FAX 06221 42-4552 e-mail: [email protected] Molekulare Embryologie (A0500) Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs 06221 42-4690, FAX 06221 42-4692 e-mail: [email protected] Biomedizinische Strukturforschung (A0600) Prof. Dr. Michael Trendelenburg 06221 42-3241, FAX 06221 42-3459 e-mail: [email protected] Prof. Dr. Eberhard Spiess 06221 42-3426, FAX 06221 42-3459 e-mail: [email protected] Epigenetik (A0700) Dr. rer. nat. Frank Lyko 06221 42-3800, FAX 06221 42-3802 e-mail: [email protected] Zentrale Proteinanalytik (R0800) Dr. rer. nat. Martina Schnölzer 06221 42-4599, FAX 06221 42-4562 e-mail: [email protected] In den Abteilungen des Forschungsschwerpunktes werden - vorwiegend mit zell- und molekularbiologischen Methoden und auch in transfizierten Zellen bzw. transgen veränderten Tieren - verschiedene Aspekte der Spezialisierung von Zellen und Geweben (Differenzierung) erforscht. Insbesondere die Regulationsmechanismen der Synthese Zelltyp-spezifischer Proteine und ihrer Funktionen sowie funktionell bedingte bzw. die Tumorbildung fördernden Veränderungen in den Genen bzw. im Chromatin des Zellkerns stehen dabei im Mittelpunkt der Untersuchungen. Die den Arbeiten der Abteilung Zellbiologie zugrundeliegende Frage ist die nach den molekularen Grundlagen der zelltypischen Architektur normaler und maligne veränderter Zellen. Hierbei stehen zur Zeit die Filamente des Cytoskeletts und ihre Verankerungsstellen an der Plasmamembranen im Vordergrund, besonders die transmembranen Cadherine der Desmosomen als duale Ordnungsmoleküle. Die hierbei gefundenen zelltypischen Unterschiede in der molekularen Ausstattung der jeweiligen Intermediärfilamente und der Zellverbindungen (Junctions) werden systematisch auf ihr mögliches Einsatzpotential als molekulare Leitmerkmale (Marker) in der histologischen Diagnostik untersucht. In entsprechender Weise wie die Cytoskelettproteine werden auch die strukturbildenden Proteine des Zellkerns (Karyoskelett) untersucht, vor allem die der Kernhülle und des Nukleolus, vor allem auch mit dem Ziel, molekulare Prinzipien der intranukleären Topogenese und der Kerncytoplasmakompartimentierung und ihre funktionelle Bedeutung aufzuklären. Die Arbeit der Abteilung Molekularbiologie der Zelle I konzentriert sich auf: (1) Die Analyse der Rolle hormonabhängiger Signalketten in der Entwicklung und in physiologischen una pathologischen Prozessen. Um die Rolle hormonabhängiger Genexpression zu bestimmen, haben wir Mutantionen in wichtigen Komponenten der cAMP- und Glucocorticoid-abhängigen Signalübertragungswege gesetzt und untersuchen jetzt die Auswirkungen dieser Mutationen. (2) die Analyse der Leber und Darmentwicklung. Ziel dieses Projekts ist, die Funktion von Genen der HNF3/ forkhead - Gruppe durch Erstellung von Mutationen zu charakterisieren. (3) Mit der in der Abteilung entwickelten Technik der Erstellung transgener Mäuse mit Hilfe künstlicher Hefechromosomen soll die Existenz und Wirkungsweise von Expressionsdomänen analysiert werden. In der Abteilung Molekularbiologie der Zelle II werden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Genregulation in Säugerzellen durchgeführt. Der Schwerpunkt der Arbeiten liegt daher auf der Analyse der Prozesse, durch die extrazelluläre Signale in den Zellkern übertragen werden und dort die Transkriptionsrate positiv oder negativ beeinflussen. Dies erfordert die strukturelle und funktionelle Analyse der am Transkriptionsprozess beteiligten Proteinfaktoren, die Aufklärung deren intermolekularen Wechselwirkungen sowie die Identifizierung modifizierender Enzyme (Proteinkinasen und Phosphatasen), die die Aktivität DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung definierter Transkriptionsfaktoren in Abhängigkeit von Zellwachstum und Differenzierung steuern. Die Zielsetzung der Abteilung Entwicklungsgenetik ist die Identifizierung und funktionelle Analyse von Tumorsuppressorgenen bei Drosophila. Die Anwendung der gegenwärtig verfügbaren molekularen Methoden für die rasche Isolierung derartiger Gene und von Techniken der Analyse ihrer Funktion sollen neue Einsichten in die Mechanismen, die die Zellproliferation steuern, gewähren. Es konnte gezeigt werden, daß das erste Tumorsuppressorgen, welches für ein Cytoskelettprotein kodiert, mit nichtmuskulärem Myosin II interagiert. Beide Proteine sind Komponenten des Cytoskelettnetzwerkes, welches das gesamte Cytoplasma der Zellen durchzieht und mit der peripheren Matrix, die an die Plasmamembran angelagert ist, assoziiert ist. Ein weiteres Ziel der Abteilung ist die Identifizierung der anderen Zellbestandteile, die mit den identifizierten Tumorsuppressorgenen interagieren, um so die Regulationsmechanismen für die Zellproliferation aufzuklären. Die Kenntnis molekularer Anatomie von Differenzierungsvorgängen stellt eine wichtige Basis für die Untersuchung pathologischer Zelldifferenzierung, beispielsweise von Krebszellen, dar. Ziel der Abteilung Molekulare Embryologie ist daher die Charakterisierung molekularer Mechanismen, die verantwortlich für die Entwicklung des mittleren Keimblatts (Mesoderm) sind. Spezifisch sollen (1) unbekannte Entwicklungskontrollgene identifiziert, (2) die Musterbildung des Mesoderms mit molekularen Markern charakterisiert und (3) die zellulären Grundlagen morphogenetischer Bewegungen untersucht werden. Übersicht re mit definierten Mutationen in den Kernkomponenten des Drosophila DNA-Methylierungssystems. Außerdem werden Hypermethylierungs-induzierte Phänotypen in Fliegen untersucht, um einen Einblick in die zellulären Signalwege zu erhalten, die während der Krebsentstehung von der DNA-Methylierung beeinflußt werden. Darüberhinaus entwickelt die Gruppe spezifische Hemmstoffe für DNA-Methyltransferasen, um die Hypermethylierung in Krebspatienten zu blockieren. Dem Forschungsschwerpunkt eng verbunden ist die Zentrale Proteinanalytik. Aufgabenschwerpunkt ist die Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung von Proteinen und Peptiden im Subpikomol-Bereich. Für diese Aufgaben werden überwiegend moderne massenspektrometrische Methoden wie MALDI-MS und Electrospray-MS gekoppelt mit nanoHPLC-Techniken eingesetzt. Um den Probendurchsatz zu erhöhen, soll die Probenvorbereitung für die MS-Analyse in verstärktem Maß durch den Einsatz von Robotern automatisiert werden. Die Identifizierung und Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen in Proteinen werden im Rahmen von Kooperationen mit Arbeitsgruppen des DKFZ durchgeführt. In Kooperation mit klinischen Partnern in Berlin und Mannheim werden Proteomprojekte bearbeitet, um diejenigen Proteine in verschiedenen Tumorzelllinien zu identifizieren, die an der Entwicklung von Chemoresistenz beteiligt sind. Die Arbeiten der Abteilungen des Forschungsschwerpunktes Krebsentstehung und Differenzierung werden in entscheidender Weise durch die zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung unterstützt. Im Service-Betrieb und in den eigenen Forschungsprojekten dieser zentralen Arbeitsgruppe werden die Techniken der hochvergrößernden digitalen Lichtmikroskopie (konfokale Mikroskopie, Videomikroskopie) für spezifische Lokalisationen, insbesondere durch Mehrfachfluoreszenz im subzellulären Bereich, eingesetzt. Auf dem Gebiet der Elektronenmikroskopie soll die in den letzten Jahren entwickelte Technologie der elektronenoptischen Spektroskopie eingeführt werden. Das Potential dieser Technik soll für biologische Objekte ausgenützt werden, um auf molekularer Ebene in direkter Abbildung die Wechselwirkung von DNA und Proteinen zu studieren. Hier bieten sich vor allem in Zusammenarbeit mit anderen Abteilungen des Schwerpunktes Untersuchungen an Transkriptionskomplexen an. Epigenetische Mechanismen regulieren die Interpretation der gentetischen Information und spielen eine zentrale Rolle in der Entstehung von Krebs. Die Arbeitsgruppe Epigenetik wechselte Ende 2000 an das DKFZ. Sie entdeckte vor kurzem ein einfaches DNA-Methylierungssystem in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster: Diese Entdeckung eröffnet die Möglichkeit, komplexe Regulationsmechanismen in einem einfachen Modellorganismus zu untersuchen. Dazu etabliert die Gruppe transgene Tie- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 17 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Abteilung A0100 Zellbiologie Abteilung Zellbiologie (A0100) Leiter: Prof. Dr. Werner W. Franke 18 Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Leonid Eshkind ( - 03/00) Dr. Hans Heid PD Dr. Harald Herrmann-Lerdon Dr. Ilse Hofmann Prof. Dr. Jürgen Kartenbeck Dr. Lutz Langbein Dr. Hans-Richard Rackwitz (-06/00) Dr. Thorsten Ralle (05/99-04/00) Dr. Ansgar Schmidt (-09/00) PD Dr. Marion Schmidt-Zachmann PD Dr. Reimer Stick (10/98-08/00) Doktoranden Kemal Akat (med.; 02/00 - ) Angelika Alonso (med.; 03/01-) Judit Boda (10/01 - ) Carola Borrmann ( - 02/01) Christine Dreger (02/01 - ) Jens Eilbracht Bettina Hämmerling (med.; 12/01 - ) Sandra Kneissel Alexandra König (02/01 - ) Claudia Mertens ( - 08/00) Michaela Reichenzeller Wiebke Peitsch (med.; -08/00) Beate Straub (med.) Qi Tian ( - 03/01) Gastwissenschaftler/Stipendiaten Dr. Barbara Deumling (Köln, Deutschland; MPG; - 08/00) Dr. Birgit Kräling (Deutschland/USA; DKFZ-Stip.; - 04/00) Technisches Personal Jutta Arlt (85%; - 05/01) Katrin Götzke (65%; - 09/00) Michaela Hergt Andreas Hunziker ( - 05/01) Monika Mauermann (- 02/00) Jutta Osterholt Sonja Reidenbach (¼) Tatjana Wedig (½) Peter Eichhorn Christine Grund (80%) Astrid Hofmann Cäcilia Kuhn Edeltraut Noffz (½) Silke Prätzel Heiderose Schumacher (½) Stefanie Winter-Simanowski Ralf Zimbelmann Die Abteilung Zellbiologie arbeitet über zelluläre Strukturelemente - sowohl des Zellkerns als auch des Cytoplasma - und deren Verankerungsstrukturen an der Kernhülle wie an Zell-Zell-Verbindungen (“Junctions”). Mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und morphologischer Untersuchungen (hier insbesondere Elektronenmikroskopie und Immunlokalisierung) werden die beteiligten Proteine charakterisiert und ihre Wechselwirkungen sowie Funktionen aufgeklärt, sowohl durch in vitro als auch in vivo Experimente, von der Transfektion von Kulturzellen bis zur Erzeugung transgener Mäuse. Neben der Aufklärung grundsätzlicher zellbiologischer Fragestellungen sollen diese Erkenntnisse einem besseren Verständnis entwicklungsbiologischer Vorgänge der Zell- und Gewebsdifferenzierung sowie der malignen Transformationen dienen. Mehrere im Rahmen dieser Forschungsarbeiten gewonnene Reagenzien, besonders monoklonale Antikörper, werden bereits zur Zelltypisierung in der Tumordiagnostik und zur Früherkennung von Metastasen eingesetzt. Cytoskelett und Karyoskelett von normalen und transformierten Zellen: Molekulare Charakterisierung der Hauptkomponenten und funktionellen Domänen W.W. Franke, H. Herrmann, L. Langbein In Zusammenarbeit mit: U. Aebi, P. Burkhard, Biozentrum, Basel, Schweiz; H. Baribault, La Jolla Cancer Research Foundation, USA; R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; A. Ben Ze’ev, Dept. of Molecular Genetics and Virology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; B. Bernard, L’Oréal, Paris, Frankreich; W. Birchmeier, P. Ruiz, MDC Berlin; V. Bosch, Abt. F0200, DKFZ; D. Fürst, P. van der Ven, Universität Potsdam; B. Geiger, Dept. of Chemical Immunology, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; R.D. Goldman, V.E. Gould, Department of Pathology, Rush-Presbyterian-St. Luke’s Medical Center, Chicago, USA; T. Hashimoto, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan; N. Hernandez, S. Sepehri Chong, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA; G. Krohne, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; P. Krammer, Abt. G0300, DKFZ; H. Kurzen, W. Hartschuh, Hautklinik, Universität Heidelberg; B. Lane, CRC Labs, Dundee, Scotland; I. Leigh, Royal College London, U.K.; R. Leube, Anatomisches Institut, Universität Mainz; T. Magin, Institut für Genetik, Universität Bonn; J. Markl, Institut für Zoologie, Universität Mainz; I. Moll, Haut- und Poliklinik, UKE Hamburg; R. Moll, Zentrum für Pathologie, Universität Marburg; D. Olins, A. Olins, Foundation for Blood Research, Scarborough, USA; D. Parry, Massey University, Palmerston North, New Zealand; R.G. Roeder, M. Teichmann, Z. Wang, Rockefeller University, New York, USA; R. Schröder, C. Klasen, J. Reimann, Abt. Neurologie, Universitätskrankenhaus Bonn; J. Schweizer, M. Rogers, Abt. B0500, DKFZ; K. Sperling, A. Reis, Institut für Humangenetik, FU Berlin; P.M. Steinert, NIH, Bethesda, USA; J.-P. Thiery, CNRS, Laboratoire de Physiopathologie du Développement, Paris, Frankreich; M. Trendelenburg, H. Tröster, Abt. A0601, DKFZ; S.M. Troyanovsky, Washington University School of Medicine, St. Louis, USA; K. Weber, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen; K. Zatloukal, H. Denk, Pathologisches Institut, Universität Graz, Österreich. Die Architektur der einzelnen Zelle und ihre Wechselwirkung mit Nachbarzellen oder nicht-zellulären Komponenten wird u.a. durch komplexe, zelltyp-spezifische Anordnungen verschiedener cytoplasmatischer Strukturen bestimmt, die als “Cytoskelett” zusammengefaßt werden. Die Mechanismen der zelltyp-spezifischen Synthese der verschiedenen Cytoskelett-Proteine, ihrer Polymerisation (“Assembly”) und der Anordnung der so gebildeten Strukturen in der jeweiligen Zelle können folglich in unterschiedlichen Zell- und Gewebetypen - normalen wie transformierten - voneinander abweichen. Eine Grundvoraussetzung für das Verständnis dieser Entwicklungsprozesse ist die Identifizierung und Lokalisierung der beteiligten Proteine, ihrer Synthese und Modifikation sowie die Charakterisierung ihrer funktionellen Domänen. Deshalb ist es ebenfalls von großer Wichtigkeit, die Mechanismen der Topogenese solcher cytoskeletärer Proteine aufzuklären, da sie in unterschiedlichen Zellkompartimenten durchaus unterschiedliche Funktionen übernehmen können. Hatten wir früher schon gezeigt, daß Mutationen in typischen cytoplasmatischen Proteinen oder auch ihre ektopische Expression in bestimmten Zelltypen zu einer “Fehllokalisa- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung tion” im Zellkern führen kann, so konnten wir nun sogar zeigen, daß bestimmte Cytoskelett-Proteine sowohl in Zell-Zell-Verbindungen als auch im Zellkern - und zwar in einer Vielzahl unterschiedlicher Zellarten - konstitutiv vorkommen. Die Bedeutung dieser spezifischen Doppellokalisation für die Regulation des Differenzierungsgeschehens gilt es nun aufzuklären. I. Organisationsfaktoren und strukturbestimmende Prinzipien zellulärer Filamentsysteme Die Intermediärfilament-(IF-)Proteine stellen - wie die anderen filamentbildenden Proteine - eine große Multi-GenFamilie dar, deren etwa 50 Vertreter zelltyp-spezifisch exprimiert werden und deren Gen-Produkte sich im Cytoskelett des Cytoplasma (z. B. Cytokeratine, Vimentin und Neurofilament-Proteine) oder im Karyoskelett des Zellkerns (Lamine) anreichern [13, 26-29, 31-33, 46]. Besonders komplexe Bildungsmuster weisen die Cytokeratine (CK) auf - beim Menschen mit 22 verschiedenen epithelialen Polypeptiden und 15 weiteren, an der Bildung von Haaren und Nägeln beteiligten (“trichocytären”) Vertretern. Diese Komplexität wird noch weiter erhöht durch die generelle bzw. zelltyp-spezifische Wechselwirkung mit IF-assoziierten Proteinen wie Plectin [5, 12, 45], Plakophilin [3, 4, 17, 18] und anderen IF-verankernden Proteinen der Desmosomen und Hemidesmosomen (s. Kap. III). Am Beispiel der Typ-III IF-Proteine Vimentin und Desmin haben wir den Ablauf der in vitro Filamentbildung (Assembly) für cytoplasmatische IF-Proteine neu beschrieben ([13, 43]; siehe auch [29]). Den molekularen Mechanismus des Assembly-Vorganges sowie die atomaren Voraussetzungen für die Wechselwirkung mit anderen Cytoskelett-Komponenten klären wir im Augenblick durch die Ermittlung der IF-Struktur mittels Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse einzelner IF-Proteine und IF-ProteinFragmente sowie ganzer “unit-length”-Filamente [14, 48]. In bezug auf die Dynamik der IF-Cytoskelett-Wechselwirkung haben wir kürzlich gezeigt, dass gerade Integrationsfaktoren wie Plectin primäre Angriffsziele des zellulären apoptotischen Apparates sind, noch vor den IF-Proteinen selbst, und daß sich hieraus wichtige Fragen zu Differenzierungsereignissen ergeben. Die Kenntnis des Assembly-Verhaltens individueller IFProteine erlaubte es uns, diese cytoplasmatischen Komponenten in einem völlig neuen Zusammenhang, als experimentelle Arbeitswerkzeuge zur Erkundung des reaktiven Raumes im Zellkern, einzusetzen [25]. Und zwar haben wir Amphibien-Vimentin gentechnisch durch Integration eines Kernwanderungssignals (NLS) in seiner Sequenz dermaßen verändert (NLS-Vimentin), daß es nach Transfektion der entsprechenden cDNA vollständig in den Zellkern transportiert wird. Je nach Temperatur, bei der die Zellen gehalten werden, ist NLS-Vimentin in “Nuclear Body”-ähnlichen Strukturen (37°C) oder in räumlich relativ begrenzten Filamentsystemen (28°C) zu finden. Dieser Raum wurde als identisch mit dem bisher nur aus funktionellen Überlegungen postulierten “Interchromosomal Domain Compartment” nachgewiesen und in vivo durch “live cell imaging”-Techniken beschrieben [39]. Es bot sich somit an, das NLS-Vimentin-Konstrukt als “Raumfähre” zu be- Abteilung A0100 Zellbiologie nutzen, um in chimärer Form Wechselwirkungsdomänen von Kernproteinen zwecks Interaktionstest in den Kern einzubrigen. Diese Technik wurde bereits erfolgreich für einen direkten in vivo Nachweis der Wechselwirkung der Lamin-B1-Schwanzdomäne mit dem N-terminalen, nukleoplasmatischen Teil vom Lamin-B-Rezeptor (LBR) angewendet [9]. Die Versuche sind u.a. mit der menschlichen promyelozytischen Leukämie-Zelllinie HL-60 fortgesetzt worden, die im Verlauf ihrer Retinsäure-induzierten Differenzierung eine komplexe Umwandlung der Kernmorphologie, insbesondere des Chromatins und der Kernhülle, durchmacht [32, 33]. II. Keratin-Intermediärfilamente - Bildung, Struktur und Funktion während der Differenzierung Nachdem Genomanordnung und Genstruktur und die Expression der sauren (Typ I) Haarkeratine aufgeklärt waren, konnte die genetische Zuordnung für die basischen (Typ II) Haarkeratine abgeschlossen werden. Die Zahl der Gene, die in einem Gencluster auf Chromosom 12q13 liegen, hat sich von früher 4 auf 6 (hHb1-6) erhöht ([40]; vgl. auch [38, 42]). In umfangreichen Genexpressionsstudien zeigten wir mittels in situ Hybridisierung und Immunhistochemie (gegen alle Haarkeratine wurden spezifische Antiseren hergestellt), daß die Haarkeratine - wie die Cytokeratine - in einer differentiellen Abfolge gebildet werden. Einige sind sogar auf bestimmte Strukturen (z.B. die Cuticula) im Haarfollikel beschränkt. Eines der Typ-II-Haarkeratine wird, obwohl es ein echtes Haarkeratin ist, aber nicht im Haar, sondern lediglich in bestimmten Bereichen des Zungenepithels (filiforme Papillen) gebildet. Aus diesen Ergebnissen konnte der Katalog der Typ-II-Haarkeratine erstellt werden [27] und somit der Gesamtkatalog der Haarkeratine fertiggestellt werden. Nach dem heutigen Erkenntnisstand sind alle Haarkeratin-Gene bekannt: 9 Typ I (hHa1, 2, 3-I, 3-II, 4-8) und 6 Typ II (Hhb1-6). Damit können dann Schlußfolgerungen zur Filamentbildung (Heteropolymere aus Typ-I- und -II-Proteinen) gezogen werden. Innerhalb dieser Studie wurde ein neues Cytokeratin (K6irs1) entdeckt [65]. Hier konnten wir zeigen, daß seine Synthese auf eine genau definierte Struktur des Haarfollikels beschränkt ist, die innere Wurzelscheide (IRS). K6irs1 wird in allen Bereichen der IRS, der Henle- wie der Huxley-Schicht und der Cuticula synthetisiert. Dieses neue Protein ist auch in spezialisierten Zellen (Flügelzellen) darstellbar, die damit eindeutig als Huxley-Zellen identifizierbar sind. Es gibt bereits erste Hinweise, daß in der IRS drei weitere, neue Typ-I-Cytokeratine gebildet werden (K6irs2-4). Einen besonderen evolutionären Aspekt betrifft ein Pseudogen der Typ-I-Haarkeratine (ΨhHa). Es ist im Menschen nicht funktionell, wird aber in Schimpansen- und GorillaHaar als “zusätzliches” Haarkeratin gebildet. Vor ca. 240.000 Jahren - so ließ sich berechenen - wurde es während der menschlichen Evolution zum nicht-funktionellen Pseudogen [53]. Ferner wurden erste Arbeiten zur Genregulation der Haarkeratine begonnen und die Rolle des Transkriptionsfaktors Hox C13 beschrieben werden [62]. Diese Arbeiten wurden erweitert, indem auch die gro- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 19 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung ße Genfamilie der Keratin-assoziierten Proteine (KAPs) einbezogen und deren Expressionsmuster dargestellt wurde [38, 41, 66]. KAPs vernetzen die Keratinfilamente zu einer sehr festen Struktur, wie sie besonders im Haar auftritt. Die Arbeiten zur Synthese der Haarkeratine und die neu entdeckten Cytokeratine im Haarfollikel sind Grundlagen für Untersuchungen an Tumoren des haarbildenden Systems (s. auch Kap. IV, [6, 26, 58]). 20 In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pathologie der Universität Graz konnte erstmals eine neue Art von Funktion, nämlich Schutz vor zelltyp-spezifischer Toxizität am Beispiel des Cytokeratin 8 der Leber, in Genausschaltungsversuchen bestimmt werden [54]. III. Desmosomen: zelltyp-spezifische Zell-Verbindungsstrukturen und Verankerungsstellen des Zellskeletts Die räumlich und zeitlich regulierte Ausbildung von ZellZell-Verbindungsstrukturen (“Junctions”) ist eine Voraussetzung für die Bildung und den Bestand von Geweben und Organen. Die Kenntnis ihrer Struktur, ihrer molekularen Zusammensetzung und der Mechanismen, die ihren Auf- und Abbau steuern, sind daher für das Verständnis normaler Entwicklungsvorgänge und bestimmter maligner Prozesse, insbesondere der Bildung von Tumormetastasen, von besonderer Wichtigkeit. Eine auffällige und häufige Zell- Verbindungsstruktur epithelialer und myokardialer Zellen ist das Desmosom. Dieser Junction-Typ dient sowohl der Zellkopplung als auch der Verankerung bestimmter Elemente des Zellskeletts, der Intermediärfilamente, an der Plasmamembran. Während des Berichtszeitraums wurden vor allem die Untersuchungen zur speziellen Topogenese und Funktion der Plakophiline (PP) vorangetrieben, wobei sowohl die desmosomale als auch die kernständigen Formen biochemisch charakterisiert wurden [3, 4, 17, 18, 30, 50]. Im Zellkern diverser Zellen konnte ein Partikel nachgewiesen werden, das PP2 als konstitutiven Bestandteil eines Polymerase-III-Komplexes enthielt [30]. Auch stellte sich bei den Ausschaltungsexperimenten für das Gen des Cytokeratins 8 eine topogene wie funktionelle Unabhängigkeit der Plakophiline, hier besonders des PP2, heraus [54]. IV. Cytoskelett-Proteine als Zelldifferenzierungsmerkmale in der Tumordiagnostik Antikörper gegen bestimmte Cytoskelett-Proteine wurden zur Unterstützung der histologischen Zelltyp-Ansprache in der pathologischen Diagnostik eingesetzt. Nach Ergebnissen, die zur Aufklärung einer genetisch bedingten Haarerkrankung durch Mutation eines Haarkeratins führten, sind die Ergebnisse der Expression der Typ-I- und Typ-IIHaarkeratine, von CK6hf und von Ck6irs1 Bestandteil laufender Untersuchungen zur Charakterisierung und Diagnose trichozytärer Tumoren und anderer Tumoren der Haut [6, 26, 58]. Ferner wird die ektopische Expression von Haarkeratinen und den neuen Cytokeratinen in Plattenepithelcarcinomen und Teratomen untersucht (zusammen mit Prof. Dr. Roland Moll, Klinisches Zentrum für Pathologie, Universität Marburg). Abteilung A0100 Zellbiologie Intranukleäre Kompartimentierung und molekulare Grundlagen der Topogenese von Proteinen des Zellkerns M.S. Schmidt-Zachmann, I. Hofmann In Zusammenarbeit mit: R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; M.-C. Dabauvalle, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; J. Gall, Carnegie Institution, Baltimore, USA; W. Keller, Biozentrum, Universität Basel, Schweriz; A. Krämer, Universität Genf, Schweiz; N. Hernandez, S. Sepehri Chong, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA; R.G. Roeder, M. Teichmann, Z. Wang, Rockefeller University, New York, USA; Michael Stoehr, A0102, DKFZ; M. Schnölzer, R0800; DKFZ. Die Kompartimentierung der Zelle und ihrer Funktionen beruht wesentlich auf der Topogenese der Zellproteine. Während für die Cytoplasma-Zellkern-Verteilung von Proteinen in den letzten Jahren die molekularbiologischen Prinzipien weitestgehend aufgeklärt werden konnten, sind die Mechanismen der intranukleären Subkompartimentierung von Proteinen noch großteils unbekannt. Die in eukaryotischen Zellen morphologisch auffälligste intranukleäre Substruktur ist der Nukleolus. Diese charakteristische Kernstruktur ist ein Beispiel für eine multifunktionelle Kerndomäne. Neben seiner bekannten Grundfunktion in der Ribosomenbiosynthese konnten dem Nukleolus in jüngster Zeit zusätzliche Funktionen sowohl bei der Zellzyklus-Kontrolle, dem Kernexport von Proteinen, bei Alterungsprozessen als auch bei der Bildung oder dem Transport verschiedenster Ribonukleoproteinpartikel, nachgewiesen werden. Nukleolen sind darüber hinaus durch eine spezifische Anreicherung von Proteinen in definierten nukleolären Substrukturen charakterisiert. Aufbauend auf früheren und aktuellen Ergebnissen ist eines der Hauptziele dieser Arbeitsgruppe, neue nicht-ribosomale Proteine des Nukleolus zu identifizieren, biochemisch und molekularbiologisch zu charakterisieren und in ihrer strukturellen Anordnung innerhalb des Nukleolus aufzuklären. Als biologisches Ausgangsmaterial dienen dafür häufig die Oocytenkerne des Krallenfrosches Xenopus laevis. Diese enthalten eine hohe Anzahl extrachromosomaler, amplifizierter Nukleolen (ca. 1000/Kern) und sind somit prädestiniert für die Untersuchung topologischer Prinzipien der Ribosomen-Biosynthese sowie der strukturellen Organisation dieser intranukleären Hauptkomponente. Kürzlich gelang uns die Identifizierung und molekulare Charakterisierung eines neuen 61 kDa großen Nukleolusproteins, das als NOH61 („Nucleolar Helicase of 61 kDa“) bezeichnet wurde. Dieses Protein, das in allen untersuchten Arten (von Mensch bis Xenopus) nachgewiesen werden konnte, gehört zur Familie der „DEAD-Box“(Asp-Glu-Ala-Asp)-Proteine. Hierbei handelt es sich um eine Subklasse der ATP-abhängigen RNA-Helikasen. Die bemerkenswert hohe evolutionäre Konservierung, seine ausschließliche Lokalisierung in Nukleolen und vor allem seine spezifische Assoziation mit den Vorläuferpartikeln für die große ribosomale Untereinheit, legten den Schluß nahe, daß das ubiquitär vorkommende Protein NOH61 eine wichtige Funktion bei der Ribosomenbiosynthese spielt [55]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Während über die molekulare Zusammensetzung des Nukleolus in den letzten Jahren einige neue Erkenntnisse gesammelt werden konnten, ist die Existenz von Faktoren bzw. Proteinen, die zur Bildung eines funktionell und morphologisch intakten Nukleolus benötigt werden, noch weitestgehend ungeklärt. Von besonderer Bedeutung war daher die kürzlich gelungene Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung eines neuartigen, nukleolären Proteins NO145 aus Oocytenkernen, das sich in seinen Eigenschaften und insbesondere in seiner Topologie von allen bisher bekannten Nukleolusproteinen unterscheidet. Die biochemischen Eigenschaften von NO145 (resistent gegen Extraktionen mit Puffern hoher Ionenstärke und Detergenz) lassen den Schluß zu, daß es sich hierbei um ein Nukleolus-spezifisches „Karyoskelett-Protein“ handelt. Die Analyse seiner Primärsequenz zeigte, daß es sich um ein neuartiges Protein handelt, das interessanterweise in einem kurzen N-terminalen Abschnitt auffällig hohe Sequenzhomologie zum Protein SCP2 der Ratte, einem strukturbildenden Protein des meiotischen Synaptonemalkomplexes, aufweist. Letzteres deutet auf eine funktionelle Verwandtschaft dieser beiden strukturbeteiligten Kernproteine hin. Die Gewinnung NO145-spezifischer Antikörper ermöglichte eine detaillierte Untersuchung dieser neuen Nukleoluskomponente. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Immunlokalisierungsstudien konnte gezeigt werden, daß NO145 spezifisch in einem filamentösen Netzwerk im Cortex der amplifizierten Nukleolen vorliegt, wobei seine Anordnung von der Konzentration bivalenter Ionen abhängig ist. Seine intranukleoläre Verteilung unterscheidet NO145 von allen bisher beschriebenen Nukleolusproteinen. Protein NO145 ist in allen Stadien der Oogenese vorhanden. Kommt es allerdings zur Eireifung und damit zur Auflösung der Kernhülle und der Nukleolen, ist es nicht mehr nachweisbar. „Northern-Blot“-Analysen haben allerdings gezeigt, daß das Verschwinden von NO145 nicht auf der RNA-Ebene reguliert wird. Den für die spezifische Degradation von NO145 verantwortlichen Mechanismus gilt es in weiterführenden Studien zu entschlüsseln. Da Protein NO145 bisher nur in den Nukleolen der Xenopus-Oocyte nachgewiesen werden konnte, sollen künftige Untersuchungen zeigen, ob eine ähnliche nukleoläre Gerüststruktur in anderen Zelltypen und Spezies durch ein homologes oder analoges Protein gebildet wird. Als Arbeitshypothese zur Funktion dieses Proteins wird eine tragende Rolle als topogenes Karyoskelettelement vorgeschlagen: Protein NO145 bildet unter physiologischen Bedingungen ein filamentöses Netzwerk, das den nukleolären Cortex bestimmt, der nukleoläre Strukturen zu einem spezifischen Reaktionsraum (Subkompartiment) umschließt und so Größe und Aussehen der amplifizierten Oocyten-Nukleolen beeinflußt [21,22]. Untersuchungen des Xenopus-Oocytenkerns bzw. daraus gewonnener Kernfraktionen führten außerdem zur Identifizierung und molekularen Charakterisierung eines während der Evolution hoch konservierten Kernproteins, das als Komponente des Spleiß-Faktors SF3b identifiziert werden konnte („SF3b155“; Schmidt-Zachmann et al., 1998, Mol. Abteilung A0100 Zellbiologie Biol. Cell 9, 143-160). Es liegt im Zellkern sowohl in einer löslichen als auch in einer Struktur-assoziierten Form vor, wobei letztere als Kern-“Speckles“ identifiziert werden konnte. Für diese intranukleäre Substruktur ist bekannt, daß sie eine große Anzahl von Spleiß-Faktoren enthält. Die Primärsequenz von SF3b155 weist im Gegensatz zu allen anderen bisher untersuchten „Speckles-Proteinen“ keine RS-Domäne (Sequenzbereich reich an Arginin-SerinResten) auf. In einer weiterführenden Studie wurden deshalb topogene Sequenzelemente, welche die Aufnahme in den Zellkern sowie die spezifische Anreicherung dieses Proteins in den „Speckles“ vermitteln, identifiziert. Durch detaillierte Mutationsanalyse konnte gezeigt werden, daß SF3b155 ein klassisches Kernwanderungssignal besitzt. Für die Akkumulation in den Kern-“Speckles“ dagegen wird ein Sequenzbereich von 232 Aminosäuren benötigt, der durch die gehäufte Anwesenheit des Dipeptids Threonin/Prolin („TP-Domäne“) gekennzeichnet ist. Es gelang somit die Identifizierung eines bisher unbekannten Sequenzsignals, das ein Protein in „Speckles“ dirigiert [10]. Diese und frühere Studien (zur Topogenese von Nukleolusproteinen siehe Schmidt-Zachmann und Nigg, 1993, J. Cell Sci. 105, 799-806; Zirwes et al., 1997, Mol. Biol. Cell 8, 231-248) haben gezeigt, daß die Lokalisierung von Proteinen in bestimmten Kernstrukturen offensichtlich in zwei aufeinander folgenden Schritten erfolgt: 1. Aktiver Transport in den Zellkern mit Hilfe des Kernwanderungssignals. 2. Anreicherung in der jeweiligen Kernstruktur durch spezifische Wechselwirkungen mit anderen dort befindlichen Komponenten, die unterschiedlicher Natur sein können (Nukleinsäure, Proteine). Mechanismen der Biogenese und Dynamik von Membrandomänen J. Kartenbeck In Zusammenarbeit mit: Angel Alonso, Abt. F0500, DKFZ; Ursula Bantel-Schaal, Abt. F0400, DKFZ; Franz Bosch, HNO-Klinik, Universität Heidelberg; Nikolaus Gassler, Institut für Pathologie, Universität Heidelberg; Ari Helenius, ETH Zürich, Schweiz; W.W. Just, Biochemie-Zentrum, Universität Heidelberg; T.W. Keenan, Virginia Polytechnic Institute, Blacksburg, USA; Dietrich Keppler, Abt. B0700, DKFZ; Rudolf Leube, Institut für Anatomie, Universität Mainz. Hemidesmosomale Strukturen vermitteln die stabile Anheftung von mehrschichtigen Epithelien an das darunter liegende Bindegewebe. Aufgebaut werden diese an der basalen Plasmamembran durch bestimmte, nicht-desmosomale Proteine wie z.B. dem Bullösen Pemphigoid-Antigen (BPA1) und α6β4-Integrin-Komplexen. Am Gewebematerial von Patienten, die an Plattenepithelkarzinomen erkrankt waren, wurde Synthese und Anordnungsverhalten dieser Proteine bei der Tumorzellinvasion und bei Metastasierungsprozessen untersucht. Dabei zeigte sich, daß bei invasivem Wachstum eine erhöhte Synthese von BPA1 und α6β4-Integrinen einsetzt, die sich über mehrere untere Zelllagen und dabei zusätzlich über fast die gesamten Zelloberflächen erstreckt. Trotz der erhöhten Synthese hemidesmosomaler Proteine war jedoch ein Rückgang - DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 21 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung fast bis zum vollständigen Verlust - hemidesmosomaler Strukturen in den metastasierenden Tumorbereichen feststellbar. Dieser Nachweis und das veränderte Expressionsmuster über mehrere basale Zellreihen kann als deutlicher diagnostischer Hinweis auf einen metastasierenden Phänotyp eines Plattenepithels angesehen werden [15]. 22 Ein häufig beschriebener Verlust oder eine stark reduzierte Expression von Proteinen, die am Aufbau interzellulärer Zellkontakte wie z.B. Zonulae adhaerentes und Desmosomen, beteiligt sind, wird z.Z. allgemein als Hinweis für eine vorliegende maligne Entartung und als prognostischer Faktor angesehen. In einer Langzeitstudie bei 190 Patienten ist ein spezieller Tumortyp, das Plattenepithelkarzinom, auf das Vorkommen verschiedener Zellkontaktproteine wie z.B. Desmoplakin, Desmoglein und E-Cadherin untersucht worden - und zwar in Primärtumoren wie Metastasen. In der Mehrzahl der Fälle wurde zwar eine reduzierte Expression der untersuchten Proteine gesehen, ein Verschwinden der Kontaktstrukturen wurde jedoch nicht beobachtet. Die statistische Auswertung zeigte außerdem, daß es keine klare Korrelation zwischen einer Abnahme der Expressionsmuster und der Zunahme der Metastasierungsvorgänge gibt. In einer weiteren Untersuchung wurde das Verhalten von interzellulären Zellverbindungen bei entzündlichen Darmprozessen, sie sich häufig zu Krebsvorstufen entwickeln können, untersucht [11]. Um herauszufinden, ob eine schnelle Degeneration und Instabilität einer mutierten kanalikulären Isoform der MRP2-RNA oder ein defektes MRP2-Protein für das Fehlen dieser Ionenpumpe beim Dubin-Johnson-Syndrom (vgl. Kartenbeck et al., 1996, Hepatology 23, 1061-1066) verantwortlich ist, wurde die Synthese und die subzelluläre Anordnung eines mutierten MRP2-Proteins in transfizierten Zellkulturen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß das veränderte Protein im rER akkumuliert und danach über Proteasomen abgebaut wird und so nicht zum Einbau in die apikale Plasmamembran zur Verfügung steht [20]. Bei der viralen Infektion von Zellen nutzen die Viren endozytotische Passagewege, die in den Zellen vorhanden sind. Mit Hilfe von Viren ist es daher möglich, auch Routen und Organellen zu erkennen, deren Beteiligung bei der zellulären Partikelaufnahme bisher nicht beschrieben ist. So konnte bei der Aufnahme von SV40-Viren ein neues Organell, das Caveosom, entdeckt werden [37] und die Teilnahme von Anteilen des Golig-Anteilen bei der Endocytose von AAV5 aufgezeigt werden [56]. Abteilung A0100 Zellbiologie Besondere zelltyp-spezifische Cytoskelettstrukturen H. Heid, W.W. Franke In Zusammenarbeit mit: R. Benavente, Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg; H. Denk, K.Zatloukal, Pathologisches Institut, Universität Graz, Österreich; W. Kriz, Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg; I. Moll, W. Peitsch, Hautklinik des Universitätsklinikums Eppendorf, Hamburg; T. Magin, Institut für Genetik, Universität Bonn; M. Schnölzer, R0800, DKFZ; W. Schulze, Abt. für Andrologie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf. Das Cytoskelett der Spermien: Spezifische Strukturproteine der perinukleären Kalyx In Weiterführung unserer früheren Untersuchungen zur molekularen Zusammensetzung der Kalyxstruktur der Spermienköpfe von Säugetieren - besonders von Bullen und Menschen - und der Identifizierung und Charakterisierung der Spermien-spezifischen basischen Proteine Cylicin I, Cylicin II und Calicin sowie des “Capping Protein β3” (Hess et al., 1993, J. Cell Biol., 122, 10543-1052; Hess et al., 1995, Exp.Cell Res., 218, 174-182; von Bülow et al., 1995, Exp.Cell Res., 219, 407-413; von Bülow et al., 1997, Exp.Cell Res., 233, 216-224 ) haben wir aus SpermienPräparationen u.a. zwei Actin-verwandte Proteine (“Actinrelated proteins”, Arps), das Arp-T1 und das Arp-T2, und das Selenoprotein PHGPx entdeckt und mit Hilfe spezifischer Antikörper in der Kalyx-Struktur lokalisiert (Heid et al.: A novel actin-related protein: ARP-T is a component of the cytoskeletal calyx of the mammalian sperm head. (Poster). 2001. Biol. Cell 93:233). Bei beiden Proteinen, ArpT1 und Arp-T2, handelt es sich um neuartige Proteine, die hier offenbar auch eine neuartige Funktion haben, jedenfalls keine Kristallkeimbildung für Aktinfilamente. Die Bedeutung und genaue Anordnung dieser spezifischen Proteine bei der Bildung der Cytoskelettstruktur von Spermien und die Regulation ihrer Synthese soll näher untersucht werden. Berichte zu Spermien-Mißbildungen (Teratozoospermien; u.a. sog. “Rundköpfe”) bei Fehlen oder falscher Anordnung einiger dieser Proteine geben Hinweise auf die Wichtigkeit solcher Proteine. Drebrin-haltige Strukturen in nichtneuronalen Zellen und ihre Funktionen Ausgehend von unserem Befund, daß das Actin-bindende Protein Drebrin keineswegs auf Neuronen beschränkt ist, sondern in vielen verschiedenen Zelltypen z.T. in beträchtlichen Mengen und in bestimmten Strukturen ([36]; vgl. Peitsch et al., 1999, Eur. J. Cell Biol., 78, 767-778) auftritt, ist die Form des Vorkommens in verschiedenen Geweben biochemisch bestimmt worden, wobei auch Hinweise auf besondere Drebrin-haltige Partikel (“Drebrosomen”) gefunden wurden. Das auffällige Vorkommen von Drebrin bzw. Drebrosomen an - oder in - Filopodium-artigen Zellfortsätzen sowie in überaus enger Bindung an die Plasmamembran hat zur Arbeitshypothese einer Beteiligung von Drebrin bei der Bildung solcher Zellausläufer-Strukturen und deren Funktionen geführt. In Rahmen der Mikrosequenzierung von Proteinen und Peptiden wurden in Kooperation mit verschiedenen Arbeitsgruppen weitere neue Proteine entdeckt und charakterisiert [2, 17, 19, 22, 23, 52, 60, 68]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Aleem, E.A., Flohr, T., Hunziker, A., Mayer, D., Bannasch, P., Thielmann, H.W. 2001. Detection and quantification of protein phosphatase inhibitor-1 gene expression in total rat liver and isolated hepatocytes. Mol. Cell. Biochem. 217, 1-12. [2] *Alsheimer, M., *von Glasenapp, E., Schnölzer, M., Heid, H., *Benavente, R. 2000. 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Hutter 25 Überblick Auftragsgemäß bestanden die Aktivitäten im Wesentlichen aus: * Analysen, Beratung, und Einweisung bei allen Fragen, zu denen zytometrische Techniken routinemäßig in wissenschaftliche Experimente mit Zellmodellen einbezogen wurden. * technische Weiterentwicklung des Instrumentariums unter besonderer Berücksichtigung der Integration von PC-Technologie in die Erfassung und Verarbeitung von Meßdaten; * Organisation und Durchführung des jährlichen Heidelberger Zytometrie Symposiums. Routineanalysen und Kooperationen Im Einzelnen wurden Analysen zu folgenden Themen bearbeitet: Thema * Zellzyklusanalyse, Apoptose und Wachstumssynchronisation Anzahl Aufwand (%) 600 70 * Elektronische Zellsortierung 20 20 * Immunphenotypisierung 25 5 * Photosensibilisierung durch Laserbestrahlung 15 5 Hard- und Software Entwicklung Eigene Entwicklungen führten zu einem weiteren Ausbau der Datenerfassung auf PC - Basis und C - sowie FORTRAN - Hochsprache, welches die simultane Messung, Speicherung, Analyse und Dokumentation von vier zellulären Merkmalen im Durchflußverfahren gestattet. Die Transportierbarkeit der Meßdaten und Ergebnisse in geläufige Anwendungen zur Text- und Graphikverarbeitung (Word, Designer, Paint brush, Harward Graphics etc.) lag dabei im Vordergrund der Bemühungen. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I Abteilung Molekularbiologie der Zelle I (A0200) Leiter: Prof. Dr. med. Günther Schütz 26 Rolle hormonabhängiger Signalketten in der Entwicklung und Funktion von Zellen und Geweben Wissenschaftliche Mitarbeiter PD Dr. Wolfgang Schmid Dr. Holger Reichardt (-04/01) Dr. Theo Mantamadiotis (-08/00) Dr. Christiane Otto Dr. Erich Greiner Dr. François Tronche (-06/00) Dr. Oliver Kretz (-04/01)) Dr. Stefan Berger Dr. Susanne Bleckmann Dr. Anton Bauer (-08/01) Dr. Rosa Arribas (-10/01) Dr. Emilio Casanova Dr. Lukas Schwake (09/01-) Dr. Thomas Lemberger Dr. Marc Kenzelmann Dr. Jan Tuckermann G. Schütz Stipendiaten Dr. Brenda Stride, Kanada (01/99 -) Gastwissenschaftler Dr. Minqiang Chai, China (12/01 -) Doktoranden Igor Borissevitch (-03/01) Tim Wintermantel Maja Vujic Daniel Gau (-11/01) Tim Beißbarth (-11/01) Milen Kirilov (01/01-) Technisches Personal Dagmar Bock Frank Exner Heidrun Kern (-12/00) Sandra Fehsenfeld Stefanie Päbst (09/00-) Katrin Anlag (-03/00) Ralf Klären Annette Klewe-Nebenius Heike Alter Myriam Grüner (12/00-) Magdalena Westphal (11/01-) Christiane Zacher (-03/00) Sekretariat Monika Bock Die Abteilung Molekularbiologie der Zelle I untersucht mit genetischen Methoden die Rolle von hormonabhängigen Signalketten in der zell- und entwicklungsspezifischen Genaktivierung. Durch gezielte Geninaktivierung werden Komponenten in den Signalwegen für Gluko-/Mineralokortikoide und Östrogen sowie cAMP inaktiviert und die Auswirkung dieser Mutationen auf Differenzierung, Physiologie in der Maus im einzelnen untersucht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, PACAP-Typ-I-Rezeptor, charakterisiert. Von diesen Untersuchungen erwarten wir wichtige Einblicke in die Mechanismen des normalen und entarteten Zellwachstums, der Differenzierung und der Funktion von Zellen und Geweben. Ziel unserer Arbeiten ist die Charakterisierung von Mechanismen, die zur Aktivierung von Genen in spezifischen Zellen und Geweben in Abhängigkeit von externen Signalen führen. Hormonabhängige Signalketten sind in vielen Zellen vorhanden, viele davon sind ubiquitär. Eine Frage, die uns seit langem beschäftigt, ist, wie solche ubiquitären Signale letztlich zu zellspezifischen Antworten führen. Von besonderem Interesse für uns ist die Rolle der cAMP-abhängigen und der Glukokortikoid-/Mineralokortikoid- und Östradiol-vermittelten Genexpression während der Entwicklung und in der Physiologie. Um die Rolle dieser Rezeptoren und von cAMP -abhängigen Transkriptionsfaktoren in der Entwicklung und in physiologischen und pathologischen Prozessen zu verstehen, haben wir die Gene, die für diese Proteine kodieren, in der Maus gezielt zerstört. Da Mutationen in diesen Genen häufig zur Lethalität führen (dies gilt für den Gluko- und Mineralokortikoid-Rezeptor und für CREB), haben wir mit Hilfe des Cre/loxP-Rekombinationssystems organspezifische Mutationen erzeugt. Selektive Inaktivierung des CREB-Gens und des Glukokortikoid- und Mineralokortikoid-Rezeptorgens erlauben uns nun, die Funktion dieser Signalmoleküle genau zu beschreiben. Diese Mutationen werden genuzt, um Zielgene für diese Transkriptionsfaktoren in den jeweiligen Zielzellen mit Hilfe von Expressionsprofilanalysen zu definieren und zu isolieren. Analyse der Funktion von cAMP-abhängigen Transkriptionsfaktoren durch gezielte GenInaktivierung S. Bleckmann, E. Casanova, D. Gau, T. Lemberger, T. Mantamadiotis, C. Otto, W. Schmid, I. Borissevitch, T. Beißbarth Extrazelluläre Signale steuern die Genaktivität durch Kontrolle von intrazellullären Signaltransduktionswegen. Während Steroidhormone durch die Bindung an ihren Rezeptor direkt die Genaktivität beeinflussen, wirken Hormone, die an Rezeptoren an der Zelloberfläche binden, durch intrazelluläre Signalkaskaden. Viele Hormone, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter regulieren die Genaktivität über Aktivierung der Proteinkinase A und anderer Kinasen, die die Proteine CREB, CREM und ATF-1 modifizieren. Diese Proteine enthalten eine bZIP-DNA Bindungsdomäne und wirken als Homo- oder Heterodimere. Um die Rolle dieser drei Proteine in der signalabhängigen Genexpression zu definieren, haben wir Mausmutanten erzeugt, bei denen die Gene für CREB, CREM und ATF-1 gezielt zerstört wurden. Da Tiere ohne CREB-Funktion kurz nach der Geburt sterben, haben wir sowohl Keim- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung bahnmutationen wie auch somatische Mutationen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems entwickelt. Homozytoge Nullmutanten für CREB sterben kurz nach der Geburt wegen Atelektase der Lunge. Diese Tiere sind kleiner und zeigen eine Reduktion in der T-Zellreifung [1]. Verlust von CREB führt zu stark beeinträchtigter Glukoneogenese [2]. CREB- und Ko-Aktivator-Wechselwirkung ist wichtig für die Genaktivierung [3]. Mäuse mit einem hypomorphen CREB-Allel überleben und haben erlaubt, die Rolle von CREB im erwachsenen Tier zu studieren. Reduzierte CREB-Aktivität führt zur beeinträchtigten Gedächtnisleistung und synaptischen Plastizität [4,5]. Analyse der Rolle dieses Proteins in der Morphinabhängigkeit zeigte, daß CREB für die Entwicklung der körperlichen Abhängigkeit notwendig ist. [6]. Doppelmutanten für CREB und ATF1 haben einen sehr dramatischen Phänotyp, da die Entwicklung schon auf der Stufe von Blastozysten inhibiert ist. Bleibt ein ATF1-Allel erhalten, entwickeln sich die Embryonen bis zu E7 [7]. Mutation im CREM-Gen führt zum Abbruch der Spermatogenese auf der Stufe der runden Spermatiden. Wir haben diese Mutation eingesetzt, um Zielgene für CREM im Hoden zu beschreiben. Dies erfolgte sowohl durch differentielle Hybridisierung wie auch durch Einsatz von Affymetrix-Chips. Auf diese Weise konnten mehrere hundert Gene als direkte Zielgene bzw. als Produkte von runden Spermatiden charakterisiert werden. Da Mäuse ohne CREB kurz nach der Geburt sterben, haben wir zell- und organspezifische Mutationen unter Einsatz des Cre/loxP-Systems entwickelt. Das CREB-Gen wurde durch homologe Rekombination so verändert, daß loxP-Erkennungssequenzen für die Cre-Rekombinase um das Exon für die DNA-Bindungsdomäne in embryonalen Stammzellen zu liegen kommen. Um Mutationen im zentralen Nervensystem, in Thymus und Makrophagen zu entwickeln, wurde die Cre-Rekombinase nach Transgenese in diesen Zellen und Geweben zur Expression gebracht und mit Mäusen verpaart, bei denen das CREB-Gen durch Insertion von loxP-Sequenzen gezielt verändert worden ist. Durch entsprechende Wahl eines geeigneten Promoters konnte die CREB-Funktion während der Entwicklung (mit Hilfe des Nestin-Promoters) oder postnatal (mit Hilfe des CaMKIIα- oder des Dopamin I-Rezeptorgens) exprimiert werden. Mäuse ohne CREB auf einem CREM-/- Hintergrund zeigen extensive Apoptose von postmitotischen Neuronen während der Entwicklung [8]. Im Gegensatz dazu zeigen Mäuse, bei denen das CREB-Gen in der postnatalen Periode inaktiviert wird, progressive Neurodegeneration in selektiven Regionen, im Hippocampus und dem dorsolateralen Striatum. Diese Untersuchungen zeigen, daß die CREB-Familienmitglieder CREB und CREM für Überleben von Neuronen in vivo notwendig sind. Fehlen von CREB und CREM im sich entwickelnden Gehirn führt zu generalisierter Apoptose, während postnatale Unterbrechung der Transkription, die durch CREB und CREM vermittelt wird, zur selektiven und fortschreitenden Neurodegeneration führt. Interessant ist, daß nur das Fehlen von CREB alleine nicht das neuronale Überleben beeinträchtigt. Diese Beobachtungen zeigen die Bedeutung der Proteine der CREB-Familie für das zelluläre Überleben. Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I Die Funktion von CREB wird durch Phosphorylierung am Ser133 reguliert. Es war gezeigt worden, daß die CaMKIIα in der Lage ist, neben Ser133 auch Ser142 zu modifizieren. Die Rolle der Phosphorylierung am Ser142 und ihre mögliche funktionelle Bedeutung war unbekannt. Mit Hilfe eines Antikörpers gegen das phosphorylierte Ser142 haben wir nachweisen können, daß diese Phosphorylierung in der Tat in vivo vorkommt. Wir konnten ferner zeigen, daß diese Modifikation für die Einstellung der cirkadianen Uhr wichtig ist. Im suprachismatischen Nukleus (SCN) führt Licht zu einer Phosphorylierung von CREB an Ser133 und auch an Ser142. Um die Bedeutung dieser Modifikation in vivo zu definieren, haben wir eine Mausmutante, CREBS142A, erzeugt, bei der diese Phosphorylierung nicht erfolgen kann. Lichtabhängige Phasenverschiebungen in der Aktivität und Expression von c-fos und mPER1 im SCN sind in CREBS142A-Mutanten stark abgeschwächt. Diese Beobachtungen zeigen, daß CREB Ser142Phosphorylierung bei der Einstellung der cirkadianen Uhr wichtig ist, und zeigen ferner eine neue phosphorylierungsabhängige Regulation der CREB-Aktivität [9]. Der PACAP-Typ-I- Rezeptor (PAC1) entfaltet seine Wirkung über Beeinflussung der PKA, der PKC und des MAPKinase-Pathways. PAC1 wird vorwiegend im zentralen Nervensystem exprimiert und ist an einer Reihe von physiologischen Abläufen beteiligt, z.B. Neurotransmitter/Neurotrophin-Wirkung, neuronale Differenzierung, und synaptische Plastizität [10]. PACAP-abhängige Genexpression spielt aber auch eine Rolle in der frühen Entwicklung [11]. Mäuse mit einer Keimbahn-Mutation oder einer Vorderhirn-spezifischen Mutation zeigen spezifische Defizite im Hippocampus-abhängigen assoziativen Lernen [12,13] und im emotionalen Verhalten [14]. Da die Expression von PAC1 fast ausschließlich auf die ´mossy fibres´ begrenzt ist, liegt es nahe, daß präsynaptische PAC1-vermittelte Signalgabe an der Plastizität in dieser Synapse beteiligt ist. Durch Lernversuche konnte gezeigt werden, daß PAC1 eine wichtige Rolle in Hippocampus-abhängigen assoziativen, nicht aber in deklarativen Lernvorgängen hat. Es ist interessant, daß Drosophila-Mutanten im PACAP-verwandten Gen Amnesiac starke Defizite im assoziativen Lernen zeigen. Dies legt nahe, daß die starke evolutionäre Konservierung dieses Signalweges eine wichtige Rolle in einem phylogenetisch alten Lernparadigma, assoziativem Lernen, hat. Analyse der Funktion des Glukokortikoidund Mineralokortikoid-Rezeptors A. Bauer, S. Berger, E. Greiner, F. Tronche, O. Kretz, H. Reichardt, B. Stride, W. Schmid, R. Arribas, L. Schwake, M. Kenzelmann, J. Tuckermann, M. Vujic Die Wirkung von Steroidhormonen wird über spezifische Rezeptoren, die die Transkription von Zielgenen aktivieren oder hemmen, vermittelt. Gluko- und Mineralokortikoide kontrollieren die Expression von überlappenden Genen durch zwei verwandte Rezeptoren, die beide Glukokorti- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 27 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung 28 koide binden können [15]. In der Niere bindet nur der Mineralokortikoid-Rezeptor an Mineralokortikoide, da durch einen spezifischen enzymatischen Mechanismus Glukokortikoide inaktiviert werden. Im Gehirn und anderen Zielzellen können sowohl der Gluko- wie auch der Mineralokortikoid-Rezeptor zur Wirkung kommen. Mäuse ohne Glukokortikoid-Rezeptor sterben kurz nach der Geburt wegen schwerer Atelektase der Lunge [16]. Aktivierung glukoneogenetischer Enzyme und die Synthese von Epinephrin im Nebennierenmark ist aufgehoben [17] und die Proliferation von Vorläufern für rote Blutzellen ist beeinträchtigt [18]. Tiere ohne Mineralokortikoid-Rezeptor sterben wegen extremen Salzverlustes kurz nach der Geburt [19,20]. Wir vermuten, daß Mineralokortikoide die Stabilität bzw. Aktivität des Natriumkanals in einer bisher nicht bekannten Weise verändern. Daher werden wir versuchen, die Zielgene, die für diesen lethalen Defekt verantwortlich sind, zu definieren [21]. In MR-defizienten Mäusen ist die Neurogenese der granulären Zellen im Hippocampus beeinträchtigt [22]. Durch eine funktionsselektive Mutation im Rezeptor gelang es, Wirkungen über DNA-Bindung von solchen, die durch direkte Protein/Protein-Wechselwirkung zustande kommen, zu definieren. Mäuse mit dieser Mutation überleben und sind fertil. Mit diesen Mäusen gelang es, die Wirkungsweise des Glukokortikoid-Rezeptors in einer Vielzahl von Glukokortikoid-abhängigen Funktionen zu definieren [15,23-26]. DNA-bindende Aktivität ist notwendig für einige Funktionen des Glukokortikoid-Rezeptors im Hippocampus [27]. Der Dimerisierungs-defekte Rezeptor ist in der Lage, die Aktivierung von Zytokinen nach LPS-Behandlung in T-Zellen und Makrophagen zu blockieren [28]. Erhöhte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors durch erhöhte Kopienzahl nach Transgenese macht die Tiere resistent gegenüber endotoxischem Schock [29]. Verschiedene Aktivitäten des Rezeptors spielen auch eine Rolle in der Entwicklung der Brustdrüse [30]. Daher stellen diese Mäuse ein interessantes Modell für die Analyse von Substanzen mit immunosuppressiver und anti-inflammatorischer Wirkung dar. Sie werden von großem Nutzen bei der Suche von neuen pharmakologischen Substanzen sein, die mit der inflammatorischen Wirkung interferieren, aber nicht DNA-Bindungs-abhängige Vorgänge des Rezeptors beeinflussen. Da Mäuse mit der Rezeptor-Null-Mutation kurz nach der Geburt sterben, haben wir das Cre/loxP-System eingesetzt, um zellspezifische Mutationen zu entwickeln [31,32]. Mit diesem Ansatz wurden Mäuse entwickelt, die spezifische Glukokortikoid-Rezeptor-Mutanten in Thymozyten, Monozyten/Makrophagen, Leber und Haut haben. Mäuse ohne Glukokortikoid-Rezeptor im Gehirn zeigen eine beeinträchtigte Regulation über die HPA-Achse [16]. Leberspezifische Inaktivierung des Glukokortikoid-Rezeptors führt zu einer starken Wachstums-Beeinträchtigung. Dies deutet auf eine wichtige Funktion des GlukokortikoidRezeptors in der Kontrolle des Wachstums. Interessanterweise haben die GRdim-Mutanten normale Größe. Offensichtlich ist der monomere Rezeptor hinreichend für die Abteilung A0200 Molekularbiologie der Zelle I Kontrolle des Wachstums. Zielgene in der Wachstumshormon-IGFI-Kaskade werden charakterisiert, um die Ursache für den Minderwuchs zu charakterisieren. Verlust des Rezeptors reduziert auch die Hyperglykämie, die in experimentell induziertem Diabetes beobachtet wird. Dies ist ein weiterer, sehr bedeutender Hinweis darauf, daß Glukokortikoid-abhängige Genexpression in der Leber eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Typ-II-Diabetes spielt [33]. YAC-transgene Mäuse, die zwei zusätzliche Kopien des Glukokortikoid-Rezeptorgens enthalten, sind resistenter gegenüber endotoxischem Schock [29]. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von U. Schibler, Universität Genf, konnte gezeigt werden, daß Glukokortikoide die cirkadiane Genexpression regulieren, indem sie die Phase der circadianen Genexpression im peripheren Gewebe verändern [34,35]. Mäuse mit selektiver Inaktivierung des Glukokortikoid-Rezeptors in Makrophagen und Granulozyten sind weniger resistent bei induzierter Sepsis [28]. Ein weiteres Mitglied der Kernrezeptorfamilie HNF4γ wurde in unserer Gruppe isoliert. Dieses Gen wird im Pancreas, in der Niere, im Darm und Hoden exprimiert [36]. Um die Funktion dieses Gens zu charakterisieren, bereiten wir eine gewebsspezifische Mutation mit Hilfe des Cre/loxP-Systems vor. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Rudolph, D., Tafuri*, A., Gass, P., Hämmerling, G. J., Arnold, B. and Schütz, G. (1998). Impaired fetal T-cell development and perinatal lethality in mice lacking the cAMP response element binding protein (CREB). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 44814486. 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Ingrid Grummt Genregulation durch Wachstumsfaktoren Arbeitsgruppenleiterin PD Dr. Renate Voit 30 I. Grummt Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Sebastian Iben Dr. Raffaela Santoro (EU) Theologos Michaelidis (DFG, - 09/00) Dr. Jochen Bodem (DFG, - 08/01) Sonja Ghidelli (12/00-08/01) Gastwissenschaftler Dr. Yonggang Zhou (China 09/00 -) Doktoranden Sonia Ciarmatori (DFG, - 10/00) Attila Nemeth (DFG, - 03/01) Yuan Xuejun (04/99 -) Jian Zhao (10/00 -) Corina Popovici (DFG, 09/01 -) Alex Epanchinsev (DFG, 10/01 -) Technische Assistenten Bettina Dörr Urs Hoffmann-Rohrer Nadine Wagner Petra Elbert (- 08/01) Die Abteilung “Molekularbiologie der Zelle II” untersucht die molekularen Mechanismen, die Zellwachstum und Genregulation koordinieren. Der Schwerpunkt der Forschungsarbeiten liegt daher in der Aufklärung der komplexen Vorgänge, über die äußere Signale in den Zellkern gelangen und dort Genaktivitäten stuern. Dies schließt die Identifizierung, Klonierung und funktionelle Charakterisierung der Proteine ein, die an Einzelschritten der Transkription beteiligt sind, sowie die Aufklärung der Signalübertragungswege und Kontrollmechanismen, die Genaktivitäten in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen bzw. während distinkter Phasen des Zellzyklus regulieren. Derartige Untersuchungen sind die Voraussetzung für das Verständnis der Prozesse, die kontrollierte Genexpression außer Kraft setzen und somit ursächlich für maligne Entartung und eine Vielzahl genetischer Krankheiten verantwortlich sind. (www.dkfz-heidelberg.de/polymeraseI/mainpage.htm) Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die das Anund Abschalten einzelner Gene bzw. ganzer Genfamilien regulieren, steht seit Jahren im Zentrum molekularbiologisch orientierter Krebsforschung. Eine effektive Steuerung der Aktivität verschiedener Gene während zellulärer Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse setzt das Vorhandensein äußerst wirksamer Kontrollmechanismen voraus, die die Genexpression regulieren und somit die Synthese verschiedener zellulärer Proteine dem Bedarf der Zelle anpassen. Die vielfältigen Regulationsvorgänge werden durch extrazelluläre Signale eingeleitet und koordiniert. Bei vielzelligen Organismen spielen dabei durch Zell-Zell-Kontakte vermittelte Signale, aber auch extrazelluläre Faktoren eine wichtige Rolle. Fallen bestimmte Signalübertragungswege oder Steuerungszentralen aus, erleidet die Zelle meist irreversible Schäden, die entweder zum Zelltod oder aber zur Verwandlung in eine Krebszelle führen. Für die experimentelle Analyse der Transkriptionskontrolle bei der Regulation komplexer biologischer Vorgänge sind besonders solche Systeme interessant, bei denen Genaktivitäten in Abhängigkeit von der Vermehrungsrate der Zellen positiv oder negativ beeinflußt werden. Dies geschieht, indem die Aktivität bestimmter Proteine verändert wird, die für die Umschreibung der in den Genen verschlüsselten Information erforderlich sind. Auf diese Weise wird eine Feinregulation der Transkription definierter Gene erreicht, die es der Zelle ermöglicht, auf eine Vielzahl von Umwelteinflüssen rasch und wirksam zu reagieren. Ein geeignetes Untersuchungsobjekt für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Genaktivität und Zellwachstum miteinander koppeln, stellen die Gene dar, die für ribosomale RNA kodieren. Diese Gene werden von RNA Polymerase I (Pol I) transkribiert und stellen die aktivsten Transkriptionseinheiten der Zelle dar. Ihre Aktivität fluktuiert in Abhängigkeit von zellulärem Wachstum und Differenzierung. Der Schwerpunkt unserer Forschungsarbeiten liegt auf der Aufklärung der komplexen Vorgänge, über die äußere Signale in den Zellkern gelangen und dort Genaktivitäten steuern. Dies schließt zum einen die Identifizierung sowie funktionelle und strukturelle Charakterisierung der Proteine ein, die für Gen-Erkennung und Transkripition notwendig sind, zum anderen die Identifizierung und Charakterisierung der Signalübertragungswege, die für die Modulation von Genaktivitäten in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Zellen verantwortlich sind. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Regulation der rRNA Synthese durch den Wachstums-abhängigen Transkriptionsfaktor TIF-IA J. Bodem, W. Ross, G. Dobreva, S. Iben, U. Hoffmann-Rohrer In Zusammenarbeit mit M. Vingron (DKFZ, jetzt MPI Berlin) Werden Zellen essentielle Nahrungsstoffe entzogen oder die Proteinsynthese gehemmt, wird die rRNA Synthese rasch und effizient reduziert. Diese Wachstums-abhängige Regulation der rRNA Synthese wird durch den basalen Transkriptionsfaktor TIF-IA vermittelt. Die Aktivität von TIF-IA korreliert mit dem physiologischen Zustand der Zelle, d.h. TIF-IA aus exponentiell wachsenden Zellen weist eine hohe Transkriptionsaktivität auf, während TIF-IA aus Wachstums-arretierten Zellen praktisch inaktiv ist. Die molekularen Mechanismen, die die Aktivität dieses mit RNA Polymerase I-assoziierten Transkriptionsfaktors modulieren und dem Zellwachstum anpassen, sind noch gänzlich unverstanden. Zur Aufklärung der Signaltransduktionswege, die die Aktivität von TIF-IA regulieren, haben wir die für TIF-IA kodierende cDNA von Mensch und Maus kloniert sowie in Transfektions- und in vitro Transkriptionsexperimenten funktionell charakterisiert. Diese Untersuchungen zeigten, dass das rekombinante Protein zellulären TIF-IA zu substituieren vermag, d.h. die Transkriptionsaktivität von Extrakten aus Wachstums-arretierten Zellen stimuliert [1]. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass TIF-IA an mehreren Serin-Resten phosphoryliert ist [9]. Dies läßt vermuten, dass die Aktivität von TIF-IA durch spezifische, Wachstums-abhängige Phosphorylierungsprozesse reguliert und somit eine entscheidende Rolle im Prozess des Transfers extrazellulärer Signale in den Nukleolus spielt. Die Verfügbarkeit von rekombinantem TIF-IA und der entsprechenden Antikörper versetzt uns jetzt in die Lage, die Signaltransduktionswege zu analysieren, die die Aktivität von TIF-IA modulieren und somit die biosynthetische Kapazität der Zellen steuern. Regulation der rRNA Synthese durch Zellzyklus-abhängige Phosphorylierung basaler Transkriptionsfaktoren R. Voit Die Transkription ribosomaler Gene fluktuiert während distinkter Phasen des Zellzyklus. Sie ist am höchsten in der S- und G2-Phase, dem Zeitpunkt innerhalb des Zellzyklus, der eine hohe Neusynthese von Ribosomen zur Aufrechterhaltung der Proteinbiosyntheserate in der nachfolgenden Zellgeneration erfordert. Hingegen ist die Pol I Transkription während der Mitose völlig abgeschaltet. Die molekularen Mechanismen, die der Kontrolle der rRNA Synthese während Zellzyklus zugrunde liegen, waren weitgehend unbekannt. Wir haben ein zellfreies Transkriptionssystem etabliert, das die Zellzyklus-abhängige Oszillationen der rDNA Transkription in vitro reproduziert. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die nukleoläre Transkriptionsaktivität während der Mitose und in der frühen G1 Phase des Zellzyklus reprimiert ist, und dass rever- Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II sible Phosphorylierung von essentiellen Transkriptionsfaktoren durch Cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) das Abschalten der rRNA-Synthese während der Mitose bewirkt. Wir konnten zeigen, dass die Kinase cdc2/cyclin B in vivo und in vitro die größte Untereinheit des TBP-TAFIKomplexes SL1, TAFI110, an Threonin-852 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung verhindert die Interaktion zwischen SL1 und UBF. Die Interaktion von UBF mit SL1 ist essentiell für den ersten Schritt der Transkription, dem Aufbau aktiver Präinitiationskomplexe. Für die Reaktivierung der rRNA-Synthese nach Austritt aus der Mitose genügt nicht nur die Entfernung der mitotischen Phosphorylierungen, sondern UBF muß an den Serinresten 484 und 388 phosphoryliert werden, um seine Funktion auszuüben. Wir konnten über tryptische Phosphopeptidkartierung zeigen, dass die Phosphorylierung an Serin-484 in vivo durch die G1-spezifische Kinase cdk4/cyclin D1 und die Phosphorylierung von UBF an Serin-388 durch S- und G2-spezifische Cdks vermittelt wird. Die Phosphorylierung an Serin-388 ist essentiell für die Assoziation von UBF mit RNA Polymerase I, ein essentieller Schritt bei der Ausbildung von Präinitiationskomplexen [2]. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl positiv als auch negativ wirkende Proteinkinasen die Aktivität essentieller Transkriptionsfaktoren modulieren und somit die rRNA-Synthese während distinkter Phasen des Zellzyklus regulieren. Regulation der rRNA Synthese durch Acetylierung von Transkriptionsfaktoren R. Voit, V. Muth, S. Ghidelli Die funktionelle Analyse verschiedener Regionen des ribosomalen Gen-Promotors in Säugerzellen zeigte, dass die Promotorregion ca. 160 bp stromaufwärts vom Transkriptionsstart ein Sequenz-spezifisches DNA-Bindungsmotif (T0) für den Pol I Transkriptions-Terminationsfaktor TTF-I enthält. Bei der Analyse von Proteinen, die mit TTF-I assoziieren, konnten wir zeigen, dass TTF-I mit der Histon-Acetyltransferase PCAF interagiert [3]. Dieser Befund weist darauf hin, dass TTF-I für die gezielte Rekrutierung von Histon-Acetyltransferase Aktivität an den rDNA Promoter verantwortlich ist. Weiterführende Experimente haben gezeigt, dass in transkriptionell aktiven Zellen TAFI68, die zweitgrößte Untereinheit des Promotor-bindenden Transkriptionsfaktors TIF-IB/SL1, acetyliert ist. Die Acetylierung wird in vitro sowohl durch PCAF als auch GCN5 vermittelt. Acetylierung durch PCAF und GCN5 stimuliert die Bindung von TAFI68 an das Core-Element des rDNA Promotors und aktiviert die Pol I Transkription in vitro. Umgekehrt geht die Deacetylierung von TAFI68 mit einer Reduktion der rDNA Transkription einher. Die Deacetylierung von TAFI68 ist insensitiv gegenüber dem HDAC-Inhibitor Trichostatin A (TSA), wird jedoch durch NAD+ gehemmt. Wir konnten zeigen, dass Sir2, eine NAD+-abhängige Deacetylase, TAFI68 spezifisch deacetyliert und die rDNA Transkription hemmt. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass Acetylierungs-/Deacetylierungsprozesse die Aktivität des basalen Pol I Transkriptionsapparates regulieren. Somit ist die reversible Acetylierung des TAFI/TBPKomplexes TIF-IB/SL1 ein wichtiger regulatorischer DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 31 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Schritt, der nicht nur die zelluläre rRNA Synthesekapazität sondern auch die Ribosomenbiosynthese und die metabolische Aktivität der Zelle kontrolliert. Repression der rRNA Synthese durch Tumorsuppressoren der “Pocketprotein”Familie 32 R. Voit, S. Ciamatori In Zusammenarbeit mit R. White (University of Glasgow, UK) Dem Tumorsuppressor-Gen pRb sowie dessen Verwandten p107 und p130 kommt eine Schlüsselfunktion bezüglich des korrekten Ablauf des Zellzyklus und der Regulation von Differenzierungsprozessen zu. Es besteht eine Korrelation zwischen der Inaktivierung von Tumorsuppressoren und dem Auftreten verschiedener menschlicher Tumorarten, was die Bedeutung dieser Proteine für die Kontrolle des Zellwachstums und maligner Entartung unterstreicht. pRb moduliert die Transkriptionsaktivität verschiedener Gene, insbesondere von solchen, die eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus spielen. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass pRb mit dem basalen Transkriptionsfaktor UBF interagiert, dessen Bindung an den rDNA Promoter blockiert und somit die rRNA Synthese hemmt (Voit et al., 1997, Mol. Cell. Biol. 17, 4230-4237). In homozygoten knock-out Zellen (Rb-/-) wird jedoch kein signifikanter Abfall der rRNA Syntheseleistung beobachtet. Dies legt den Schluss nahe, dass die verwandten “Pocket”-Proteine p107 und p130 die Funktion von pRb übernehmen können. Wir haben daher den Einfluß von p107 und p130 auf die rDNA Transkription analysiert. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass neben pRb auch p130, nicht jedoch p107, die rDNA Transkription reprimiert. p130 inaktiviert - ähnlich wie pRb - die rDNA Transkription über eine direkte Interaktion mit UBF [6]. Dies zeigt, dass die einzelnen Mitglieder der “Pocketprotein” Genfamilie einander funktionell zu komplementieren vermögen, obwohl sie distinkte zelluläre Funktionen während des Zellzyklus oder zellulärer Differenzierungsprozesse ausüben. Diese Untersuchungen geben nicht nur Aufschlüsse über Zellzyklus-abhängige Regulationskaskaden, die die rRNA-Syntheseaktivität der Zelle steuern, sondern darüber hinausgehende neue Erkenntnisse zur Wirkungsweise von pRb und p130 bei der Kontrolle des Zellzyklus. Transkriptionsaktivierung an ChromatinMatrizen A. Nemeth, R. Strohner, U. Hoffmann-Rohrer In Zusammenarbeit mit G. Längst (LMU München) Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Transkriptions-Terminationsfaktor TTF-I neben seiner Funktion bei der Termination der Transkription eine entscheidende Rolle bei der Transkriptions-Aktivierung an nukleosomal organisierten DNA-Matrizen spielt (Längst et al., 1997, 1998). Bindung von TTF-I an seine Zielsequenz, den “upstream terminator” verschiebt in einem ATP-abhängigen Prozeß die Nukleosomen am Promoter und führt zur Akti- Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II vierung der Transkription. Auf der Suche nach Proteinen, die durch Interaktion mit TTF-I die Struktur des Chromatins am rDNA Promoter verändern, haben wir mittels eines genetischen ‘screens’ in Hefezellen ein unbekanntes Gen, TIP5 (TTF interacting protein #5), identifiziert. TIP5 kodiert für ein > 200 kDa Protein, das mit der ATPase SNF2h assoziiert ist und die Mobilität von rekonstitierten Nukleosomen zu verändern vermag [8]. Immunfluoreszenz-Experimente haben gezeigt, dass der TIP5/SNF2h Komplex, genannt NoRC (nucleolar remodeling complex), präferenziell im Nukleolus lokalisiert ist. Dieser Befund weist darauf hin, dass die bevorzugte oder gar ausschließliche Funktion von NoRC darin besteht, die Positionierung von Nukleosomen am rDNA Promoter zu steuern bzw. durch Interaktion mit Histon-modifizierenden Enzymen die Chromatinstruktur und somit die Aktivität ribosomaler Gene zu regulieren. Epigenetische Kontrollmechanismen der rDNA Transkription R. Santoro, Y. Zhou Veränderungen bzw. Fehler im Methylierungsmuster bestimmter Gene sind maßgeblich an der Entstehung von Krebs und anderen Krankheiten beteiligt. In unserer Gruppe wurden die den Genen übergeordneten, d.h. epigenetischen, Regulationsmechanismen aufgeklärt, die das Anund Ausschalten der Aktivität ribosomaler Gene bewirken. Es wurde gezeigt, dass die Methylierung von einem CpG Rest im ‘upstream control element’ (UCE) des rDNA Promoters die Erbsubstanz dichter packt, so dass der Transkriptionsapparat die Gene nicht mehr ablesen kann. Der reprimierende Effekt der DNA-Methylierung wird ausschließlich bei Transkription an Chromatin-Matrizen beobachtet, nicht aber an nackter DNA. Dies läßt die Schlußfolgerung zu, dass Methylierung direkt oder indirekt die Chromatinstruktur am rDNA Promotor beeinflußt. Tatsächlich haben wir durch Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente (ChIP assays) und RT-PCR nachgewiesen, dass inaktive ribosomale Gene methyliert sind und andere Histonmodifikationen aufweisen als aktiv transkribierte GenKopien. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen. In metabolisch aktiven Zellen ist etwa die Hälfte der ribosomalen Gene transkriptionell inaktiv. Diese inaktiven Gene sind an CpG Resten methyliert und liegen in heterochromatischer Konfiguration vor, d.h. die assoziierten Histone sind nicht acetyliert, jedoch an Lysin 9 von Histone 3 methyliert. Aktive Genkopien sind hingegen nicht methyliert, liegen in offener, euchromatischer Struktur vor und die Nukleosomen sind im N-terminalen Bereich der Histone acetyliert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Chromatinremodellierung, DNA-Methylierung und Histon-Modifikation eng vernetzte Prozesse sind, die sowohl für die Etablierung als auch die Aufrechterhaltung des konstanten Verhältnisses von aktiven und inaktiven Genen verantwortlich sind. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Abteilung A0300 Molekularbiologie der Zelle II Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bodem, J., Dobreva, G., Hoffmann-Rohrer, U., Iben, S., Zentgraf, H., Delius, H., Vingron, M. and Grummt, I.: TIF-IA, the factor mediating growth-dependent control of ribosomal RNA synthesis, is the mammalian homolog of yeast Rrn3p. EMBO Reports (2000) 1, 171-175. [2] Jansa, P., Burek, C., Sander, E.E., and Grummt, I.: The transcript release factor PTRF augments ribosomal gene transcription by facilitating reinitiation of RNA polymerase I. Nucleic Acids Res. (2001) 29, 423-429. [3] Voit, R. ,and Grummt, I.: Phosphorylation of UBF at serine 388 is required for interaction with RNA polymerase I and activation of rDNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 24, 1363113636. [4] Muth, V., Nadaud, S., Grummt, I., and Voit, R.: Acetylation of TAFI68, a subunit of TIF-IB/SL1, augments DNA binding and activates RNA polymerase I transcription. EMBO J. (2001) 20, 1353-1362. [5] Santoro, R. and Grummt, I.: Molecular mechanisms mediating methylation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Molec. Cell (2001) 8, 719-725. [6] Ciarmatori, S., Scott*, P.H., Sutcliffe*, J.E., McLees*, A., Alzuherri*, H.M., Dannen*, J.-H., te Riele*, H., Grummt, I., Voit, R., and White*, R.J.: Overlapping functions of the pRb family in the regulation of rRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. (2001) 21, 58065814. [7] Seither, P., Iben, S., Thiry, M.,* and Grummt, I.: PAF67, a novel protein that is associated with the initiation-competent form of RNA polymerase I. Biol. Chem. (2001) 382,1163-1170. [8] Strohner, R., Nemeth, A., Jansa, P., Hoffman-Rohrer, U., Santoro, R., *Längst, G. and Grummt, I.: NoRC - a novel member of mammalian ISWI-containing chromatin remodeling machines. EMBO J. (2001) 20, 4892-4900. [9] Schlosser, A., Bodem, J., Bossemeyer, D., Grummt, I., and Lehmann, W.D.: Identification of protein phosphorylation sites by combination of elastase digestion, immobilized metal affinity chromatography, and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Proteomics (2002), in press. [10] Dagher*, J.H., Scheer*, U., Voit, R., Grummt, I., Lonzetti*, L., Raymond*, Y. and Senécal*, J.-L.: Autoantibodies to NOR90/ hUBF: Long-term clinical and serological followup from childhood to adulthood in a patient with limited systemic sclerosis suggests an antigen-driven immune response. J. Rheumatology, in press. [11] Iben, S., Bier*, M., Tschochner*, H., Hoogstraten*, D., Hozak*, P., Egly*, J.-M. and Grummt, I.: TFIIH plays a role in RNA polymerase I transcription. Cell (2002)109,297-306 [12] Michaelidis, T.M. and Grummt, I.: Inhibition of RNA polymerase I transcription by DNA-dependent protein kinase: Phosphorylated Ku protein binds to the rDNA promoter and prevents initiation complex formation. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 33 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik Abteilung Entwicklungsgenetik (A0400) Leiter: Prof. Dr. Bernard Mechler 34 Wissenschaftliche Mitarbeiter: PD Dr. Dirk-Henner Lankenau (04/00 - 03/01) Dr. Mingfa Li (-12/01) Dr. Joachim Marhold (08/01 - ) PD Dr. Heide Schenkel (- 07/01 - 12 h/Mo) Dr. István Török 1. Untersuchungen über Tumorsuppressorgene bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster Gastwissenschaftler: Dr. Joël Anne (Paris, Frankreich (11/00 - ) Dr. Robert Farkas (Bratislava, Slowakei 02/00, 03/00, 06/ 00, 08/00, 11/00, 03/01, 07/01, 09/01, 11/01)) Dr. Mathias Gorjanacz (Szeged, Ungarn 01+11/00, 06-09/01) Dr. István Kiss (Szeged, Ungarn 01/01, 07/01) Dr. Susanne Lankenau (04-09/01) Dr. Arati Mishra (Indore, Indien 06/99-05/00) Prof. Ivan Raska (Prag, Tschechische Republik 09/01) Dr. Jagat Roy (Varanasi, Indien 05/00-06/00) Dr. Pradip Sinha (Indore, Indien 04/00) Peter Danis (Bratislava, Slowakei 04/01) Lucia Medved’ova (Bratislava, Slowakei 03/01) Satish Sasikumar (Varanasi, Indien 06/01-10/01) In Zusammenarbeit mit: I. Kiss, M. Gorjanacz und G. Adam. Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, Szeged, Ungarn; I. Raska, Czech Academy of Sciences, Prag, Tschechische Republik; R. Farkas, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slowakei; P. Sinha und A. Mishra, School of Life Sciences, Indore, Indien; J. Roy, University of Varanasi, Banares, Indien Doktoranden Joachim Marhold (01/00-07/01) Fani Papagiannouli (01/00-12/01) Jingyang Wu (04/00 - ) Diplomanden Muhammad Kashif (05/01 - 12/01) Techniker Dorothee Albrecht (1/2) Hartmut Kalisch (01/00 - ) Heinrich Kocher ( - 07/00) Katja Kühle (11/01 - ) Sylvia Oksas (07/00 - 08/01) Gabriele Robinson Rolf Schmitt Sekretariat Karin Helm Die meisten menschlichen Gene (ca. 80 %) besitzen genetische Gegenstücke in Drosophila melanogaster. Obwohl das Genom der Fruchtfliege nur aus 15 bis 20.000 Genen - verglichen mit den ca. 100.000 Genen bei höheren Vertebraten besteht - weiß man, daß viele dieser Gene beim Menschen Duplikationen ihrer Insektenäquivalente sind oder Mitglieder von Multigenfamilien. Da die wesentlichen zellulären Prozesse und „multistep pathways“ im Verlauf der Evolution konserviert wurden, kann man davon ausgehen, daß das Studium von Drosophila unzweifelhaft zum Verständnis der Reaktionsmechanismen der homologen menschlichen Gene beitragen wird. Die Bedeutung von Mutationsereignissen bei der Entstehung von Tumoren konnte bei Drosophila eindeutig nachgewiesen werden. Für eine Reihe von Genen konnte gezeigt werden, daß durch Mutationen maligne Tumoren in bestimmten Geweben im Verlauf der Entwicklung entstehen. Diese Tumore weisen alle charakteristischen Eigenschaften von Krebs des Menschen auf. Die Abteilung für Entwicklungsgenetik untersucht seit einigen Jahren Gene bei Drosophila, die an der Entstehung und Suppression von Krebs beteiligt sind. Hauptziel dabei ist, die Funktion dieser Gene aufzuklären und genetische Interaktionen zu identifizieren. Außerdem wird die Funktion von besonders interessanten Drosophila-Genen sowie jeder Reparatur-Mechanismus von DNA-Doppelstrangbrüchen in Keimbahnzellen von Drosophila untersucht. B.M. Mechler, M. Li, H. Schenkel, I. Török Tumoren bei Drosophila können in zwei große Kategorien unterteilt werden: neoplastische und hyperplastische. Der Unterschied zwischen beiden Kategorien wird insbesondere deutlich am Beispiel der Imaginalscheiben. Neoplastisches Wachstum wird durch massive Zellproliferation und durch Zerstörung der mono-layer Struktur des Epithels der Imaginalscheiben charakterisiert. Im Gegensatz dazu: hyperplastische Imaginalscheiben, ungeachtet dessen, daß sie ein Mehrfaches ihrer Normalgröße erreichen, behalten ihre monolayer Struktur des Epithels mit Zellen, die ein säulenförmiges Muster und eine normale apiko-basale Polarität aufweisen. Mutationen der lethal(2)giant larvae [l(2)gl], discs large [dlg] und scribble [scrib] Gene, rufen neoplastisches Wachstum hervor. Allen drei Genen ist gemeinsam, daß sie für Proteine kodieren, die an der Organisation des Zytoskeletts und/oder der Membran-Junctions beteiligt sind [1, 2]. Neoplastisches Wachstum beobachtet man auch bei Mutationen, welche die hämatopoetischen Organe betreffen. Hierauf weist das autonome Wachstum von transplantierten Zellen hin. Die Aufklärung der Funktion von Genen, welche die Proliferation der hämatopoetischen Zellen kontrollieren, läßt auf einen, im Vergleich mit Epithelzellen, anderen Mechanismus schließen. Wir konnten zeigten, daß der massive „overgrowth“ der hämathopoetischen Organe durch die down-Regulation von ribosomalen oder Ribosomen assoziierten Proteinen, einschließlich RpS6, RpS21 und P40, verursacht wird genauso wie durch die down-Regulation des spliceosome core Proteins SmD3 [3]. 1.1. Zytoskeletale Proteine und ihre Funktion bei scaffolding und Signal-Transduktion Zu den Genen, welche die Entstehung von Tumoren in Drosophila kontrollieren, gehören das lethal(2)giant larvae, das discs large und das scribble Gen. Unsere Analysen zeigten, daß ihre Produkte an der Struktur und Funktion der Zelloberfläche beteiligt sind, indem sie für die Rekrutierung, Lokalisation und Organisation weiterer Proteine an der Zellmembran verantwortlich sind [1, 2]. Durch die Stabilisierung der zytoskeletalen Matrix und der ZellJunctions, tragen diese Proteine sowohl zur Struktur als auch zur Erhaltung der Zellgestalt genauso bei wie zur Organisation der Proteine, welche in signal-pathways involviert sind. Obwohl es schwierig ist, die Funktion eines Proteins bei der Signaltransduktion nachzuweisen, waren wir DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung in der Lage zu zeigen, daß p127, das von dem l(2)gl Gen kodiert wird, an dem Mechanismus beteiligt ist, der die Histolyse der Speicheldrüsen während der Metamorphose kontrolliert [4]. Unsere kürzlich durchgeführten Mosaikanalysen mit scribble zeigten, daß auch scribble eine kritische Rolle für Signale spielt, die zwischen Zellen ausgetauscht werden. Die Inaktivierung von scribble in bestimmten Domänen der Imaginalscheiben führte zur Bildung neuer Organisationszentren in den dem scribble Klon benachbarten Geweben sowie zu Duplikationen der Anhänge. 1.1.1. Das lethal(2)giant larvae Gen Unter den bisher identifizierten Tumorsuppressorgenen von Drosophila partizipiert p127 an der Strukturierung und Funktion der zytoskeletalen Matrix, indem es andere Komponenten rekrutiert, lokalisiert und organisiert. Über die Stabilisierung der zytoskeletalen Matrix ist p127 beteiligt an der Strukturierung und Erhaltung der Form der Zellen, sowie an der Organisation von Proteinen, die eine Rolle in Signalpfaden spielen [1, 2]. Das lethal(2)giant larvae Gen war das erste Gen, das als Tumorsuppressorgen identifiziert und isoliert wurde. Mutationen in l(2)gl führen zu Formationen von Tumoren im Gehirn und Imaginalscheiben der Tiere. Das Gen kodiert für ein zytoskeletales Protein, das als p127 bezeichnet wird und in allen eukaryotischen Spezien von Hefe bis zum Menschen vorkommt. p127 besitzt drei Homomerisierungsdomänen, welche an der Formation von komplexen Strukturen beteiligt sind, die entweder im Zytoplasma als diffuse Aggregate vorliegen oder an der zytoskeletalen Matrix assoziiert sind. Unter den mit p127 interagierenden Partnerproteinen gelang uns die schwere Kette von Myosin II, eine p127 spezifische Kinase, welche aus der Assoziierung von p127 an Myosin II resultiert und das nucleosome protein-1 (NAP1) zu identifizieren. Das Erforschen der Interaktionen zwischen p127 und dessen Partnerproteinen könnte eine Möglichkeit sein, die Funktion von p127 an der Organisation von Zellform und Zellzyklus zu erklären. Die Organisation des Zytoskeletts wird kontrolliert über die Bindung von p127 an die rod-Domäne von Myosin II, des weiteren konnten wir zeigen, daß p127 ein negativer Regulator der kontraktiellen Aktivität von Myosin II ist [1, 2]. Die Interaktion von p127 an NAP1 könnte die Beteiligung von p127 am Zellzyklus erklären, da NAP1 wiederum mit dem Cyclin Bp34cdc2 Kinase-Komplex assoziiert ist, der den Eintritt in die Mitose einleitet [5]. NAP1 zeigt eine dynamische Verteilung während des Zellzyklus; es ist am Zytoskelett während der Interphase gebunden und assoziiert an den Kernspindeln im Laufe der Mitose. Wir fanden, daß die Casein Kinase 2 (oder CK2) an NAP1 binden und so NAP1 phosphorylieren kann. Die Interaktion zwischen p127, NAP1 und CK2 könnte an kritischen mitotischen Ereignissen beteiligt sein. Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik 1.1.2. p127 und Myosin II regulieren die transkriptionelle Zugänglichkeit des Transkriptionsfaktors BR-C Z1 und der Histon-Deacetylasen SIN3 und RPD3 in den Speicheldrüsen von Drosophila melanogaster und kontrollieren hiermit deren Degeneration Die Degeneration der Speicheldrüsen wird zu Beginn der Metamorphose von Drosophila durch die Einleitung eines Programms herbeigeführt, welches durch das Steroidhormon Ecdyson gestartet wird. Hierbei spielt der heterodimere Kernrezeptor, bestehend aus dem Ecdyson-Rezeptor (EcR) und Ultra-Spiracle (USP) eine vermittelnde Rolle. Dieser EcR/USP-Komplex reguliert direkt die sogenannten frühen „response“ Gene, zu denen das Broad-Complex (BR-C) Gen gehört, welches für eine Familie von Zink-Finger-BTB Transkriptionsfaktoren kodiert. Die Isoform Z1 ist hierbei kritsch für die Degeneration der Speicheldrüsen. Der Verlust der l(2)gl-Genaktivität führt zu einem Arrest der Entwicklung der Tiere während der larvalen zur pupalen Metamorphose. Zu dieser Zeit ist das p127 Protein in den Speicheldrüsen von Wildtyplarven exprimiert. Die Speicheldrüsen werden ca. 12 - 13 h nach der Verpuppung der Larven komplett abgebaut. Im Gegensatz zu Wildtyplarven kann die Zugabe von 20-Hydroxy-Ecdyson zu Speicheldrüsen von l(2)gl-defizienten Larven keinerlei Histolyse der Speicheldrüsen bewirken. Die Histolyse wird durch das Freisetzen von sogenannten Speichel-Granularen bewirkt. In den l(2)gl-defizienten Larven werden diese Granulare nicht freigesetzt und es kann zu einer normalen Verpuppung inklusive der normalen Entstehung von „Puffs“ auf den Chromosomen kommen. Diese Daten belegen, daß das p127-Protein notwendig ist für die Apoptose der Speicheldrüsen. Um die Rolle von l(2)gl in diesem Gewebe näher zu bestimmen, wurden transgene Fliegen verwendet, die entweder zu wenig (~ 0,1) oder zu viel (3,0) p127-Protein herstellen können. Es konnte gezeigt werden, daß der Zeitpunkt der Histolyse der Speicheldrüsen abhängig ist von der Menge des vorhandenen p127-Proteins. Zu geringe Mengen an p127-Protein verzögern die Histolyse, zu hohe Mengen hingegen führen zu einer beschleunigten Histolyse, wobei weder die Entwicklung der Larven des dritten Stadiums, noch die vorpupale- bzw. pupale Entwicklung betroffen ist. Ein ähnlicher Effekt konnte auch bei der Expression von cell-death Genen beobachtet werden, was die Annahme erhärtet, daß das p127-Protein eine wichtige Rolle bei der Ecdyson-vermittelnden Apoptose der Speicheldrüsen von Drosophila spielt. Ebenfalls konnte beobachtet werden, daß der Zeitpunkt der Apoptose der in den Speicheldrüsen beeinflußt werden kann, ohne dabei die normale Entwicklung der Tiere zu verändern. Diese Daten führen möglicherweise zu einer neuen Sichtweise der Funktion des Apoptose-Signalpfades und deren Komponenten in den Speicheldrüsen [4]. Aufgrund der Tatsache, daß die Degeneration der Speicheldrüsen auch bei rbp-mutierten Tieren nicht stattfindet, wurde die Verteilung des BR-C Z1-Transkriptionsfaktors untersucht. Rbp ist eines der Gene, welches im Ecdysoninduzierbaren Broad Complex (BR-C) Lokus liegt und für DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 35 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung 36 die BR-C Z1 Isoform kodiert. In Speicheldrüsen von Wildtyplarven konnte BR-C Z1 assoziiert am Chromatin gefunden werden. In Speicheldrüsen von l(2)gl-defizienten Tieren hingegen, konnte BR-C Z1 an der Kernlamina und im Zytoplasma, nicht jedoch am Chromatin, nachgewiesen werden. Ähnliche Ergebnisse konnten ebenfalls gefunden werden, wenn zipper vor der Verpuppung ektopisch exprimiert wurde. Zipper kodiert für das nicht-muskuläre Myosin II, einem Partnerprotein von p127. Die Analyse des EcR/Usp-Heterodimers, welches die Transkription von BR-C kontrolliert, ergab, daß beide Komponenten mit dem Chromatin der Speicheldrüsen von l(2)gl-defizienten Tieren assoziiert vorliegen. Dieses Ergebnis zeigt, daß Ecdyson in den mutierten Tieren eine frühe „response“ in den Speicheldrüsen bewirken kann. Die beiden Histon-Deazetylasen SIN3 und RPD3, welche die Kondensation des Chromatins kontrollieren, konnten im Zytoplasma der Zellen von Speicheldrüsen der l(2)gldefizienten Tiere nachgewiesen werden. Zusammenfassend wurde gezeigt, daß die Kooperation zwischen p127 und Myosin II an der Assoziation von BR-C Z1 an das Chromatin beteiligt ist und somit die transkriptionelle Kaskade von Genen blockiert, welche die Degeneration der Speicheldrüsen bewirkten [zur Veröffentlichung eingereicht]. Weitergehende Analysen der Strukturveränderungen in den Speicheldrüsen ergaben, daß Komponenten des Zytoplasmas wie p127 und Myosin II ca. 6 - 8 h nach Verpuppung spezifisch in das Lumen der Drüsen sezerniert werden. Diese Sezernierung findet ca. 3 bis 4 h vor der Expression von „cell-death“-Genen statt, zu einer Zeit, in der die apikalen Domänen der Plasmamembranen teilweise aufgelöst vorliegen, was mit Hilfe von Elektronenmikroskopie gezeigt werden konnte [6]. Die Transkriptions- und Translationsmaschinerie bleibt zu diesem Zeitpunkt jedoch aktiv, was durch den Nachweis von Transkriptionen spezifischer RNAs während der späten Phase der Degeneration von Speicheldrüsen, sowie dem Nachweis der Synthese der Untereinheit D der vesikulären ATPase gezeigt werden konnte. 1.1.3. Das scribble Gen Wir haben zeitgleich mit einer anderen Gruppe das scribble Gen isoliert [7]. Das Scribble-Protein kolokalisiert mit dem Dlg-Tumorsuppressorprotein an spezifischen Domänen der Zellmembran. Mutationen in scribble führen zu Tumorbildung in den Gehirnhemisphären und einigen Imaginalscheiben mit veränderter Lokalisierung von p127 und Dlg. Genetische Mosaikstudien zeigten, daß der Verlust der scribble-Aktivität zu Wachstumsstörungen in Imaginalscheiben und dem follikulären Epithel der Eikammern führt, die Ähnlichkeiten zu den Mosaiken von dlg-defizienten Klonen haben. Wir konnten ebenso zeigen, daß die Letalität, die durch scribble-Verlust verursacht wird, durch Zufuhr von zusätzlichem Dlg-Protein verhindert werden kann. Das Dlg-Protein besitzt wie auch das Scribble-Protein, mehrere sogenannte PDZ-Domänen. Diese Ergebnisse zeigen, daß Scribble wie auch Dlg an einem Mechanismus beteiligt sind, welcher die Bildung und Erhaltung epithelialer Strukturen reguliert. Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik Mutationen des scribble-Gens führen zur Bildung von Tumoren im Gehirn und einigen Imaginalscheiben, wie z.B. Thorax-, Flügel-, Haltere-, drittes Bein- und Genitalimaginalscheiben. Die anderen Imaginalscheiben entwickeln sich nicht. Das scribble-Gen erstreckt sich über einen Bereich von über 53 kb genomischer DNA und kodiert für zwei Klassen von Transkripten, welche in insgesamt drei Transkripten resultieren [7]. Die beiden größten Transkripte werden von 23 Exons gebildet, das kleinste Transkript wird aus 14 Exons gebildet, wobei die ersten 13 Exons identisch mit denen der beiden großen Transkripte sind. Das scribble Gen kodiert für zwei Proteine von je 1756 bzw. 1247 Aminosäuren Länge, mit multiplen leucinrich repeats (LRR) und PDZ-Domänen, welche an ProteinProtein Interaktionen, speziell in den zellulären junctions verantwortlich sind. Proteine, welche mehrfach LRR- und PDZ-Domänen besitzen, werden als sogenannte LAP-Proteine bezeichnet [8]. Das Auftreten dieser Domänen in den Scribble-Proteinen könnte eine Funktion als scaffoldingKomponente oder als Mediator in Signalketten implizieren. Es wurden genetische Mosaike erzeugt, um die Rolle von scribble während der Entwicklung der Fliege zu studieren. Die Analyse zeigt, daß scrib-defiziente Zellen, die während der larvalen Entwicklung induziert wurden, voll differenziertes kutikuläres Gewebe bilden können, welches in Abhängigkeit der Position, oftmals zu Duplikationen ganzer Organe führten. So führte z.B. die Erzeugung von scribbledefizienten Zellen im Äquator des Komplexauges zu einer spiegelbildlichen Duplikation des gesamten Auges. Unsere Daten zeigen, daß (a) scribble eine wichtige Rolle in bestimmten Signal-pathways spielt, (b) für bestimmte Gewebe notwendig ist und (c) daß der zygotische Verlust von scribble zu gewebsspezifischen Tumoren führt. Das Vorhandensein von multiplen PDZ-Domänen in beiden Proteinen und ihre gemeinsame Lokalisierung in den „septate junctions“ führte zu der Frage, ob Dlg-Protein Scribble-Protein ersetzen kann und umgekehrt. Daher exprimierten wir entweder FLAG-markiertes Dlg-Protein oder V5-markiertes Scribble 1-Protein in dlg oder scribdefizienten Tieren mit Hilfe des dualen UAS GAL4-Systems. Wir fanden heraus, daß das AUS::scrib+-Transgen, wenn es mit dem dpp::GAL4-Treiber exprimiert wurde, scrib-defiziente Tiere vollständig retten kann, nicht jedoch dlg-defiziente. Im Gegensatz hierzu kann das UAS-dlg+Transgen, welches mit dppGAL4 exprimiert wird, etwa die Hälfte aller scrib-defizienten Tiere retten. Die Rettung konnte ebenfalls durch den Einsatz von T80-GAL4 erreicht werden, jedoch mit geringerer Effizienz (16 %). Obwohl die Expression von UAS-dlg+ mit Hilfe von 69B-GAL4 oder patched-GAL4 dlg-defiziente Tiere retten kann, was bereits beschrieben wurde, gelang uns keine Rettung dieser Tiere mit Hilfe von dpp-GAL4. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Dlg-Protein Scribble-Funktion übernehmen kann, jedoch besitzen Dlg und Scribble unterschiedliche spatiotemporale Expressionsmuster. Weitergehende Immunofluoreszenz-Studien zeigen, daß Scribble-1 und Scribble-2 Proteine weitaus spezifischere Expressionsmuster aufweisen, als das mehr ubiquitär exprimierte Dlg-Protein. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung 1.1.4. Das SmD3 Gen Das Drosophila snRNP SmD3 Gen oder SmD3, ist in umgekehrter Transkriptionsrichtung im ersten Intron des Ornithine Decarboxylase Antizyme (AZ) Gens lokalisiert. Frühe Untersuchungen zeigten, daß der gutfeeling Phänotyp der gekennzeichnet ist durch embryonale Letalität und abnorme neuronale und muskuläre Zelldifferenzierung, in zwei Mutanten auftritt, die durch die Insertion eines P-Elements hervorgerufen wurden. Das oder die, durch die PElementinsertion betroffenen Gene, waren nicht bekannt. Wir konnten weiterhin zeigen, daß in einer Reihe von PElementmutationen die P-Elementinsertionen in der 5‘ nicht-translatierten Region (UTR) des SmD3 Gens oder seines Promotors lokalisiert sind und ausschließlich die Expression des SmD3 Gens betreffen. Unsere weiteren Analysen ergaben, daß der „gutfeeling“ Phänotyp, der mit den P-Elementinsertionen im 5‘UTR von SmD3 assoziiert ist, aus einer amorphen oder stark hypomorphen Mutation resultiert. Dagegen reduzieren P-Elemente, die im Promotorbereich des SmD3 Gens insertiert sind, die Expression von SmD3 und rufen larvale Letalität sowie Entartung der Imaginalscheiben, der Gehirnhemisphären und der hämatopoetischen Organe hervor. Diese Mutationen konnten vollständig durch ein SmD3+ Transgen gerettet werden. Die Komplementierung von Df(2R)gufLex47, einer Mutante, in welcher das SmD3 sowie das AZ-Gen deletiert sind, mit dem SmD3+ Transgen, machte den Phänotyp des inaktivierten AZ deutlich. Interessanteweise verursacht die Inaktivierung des AZ einen neuen Phänotyp, der durch späte larvale Letalität, Atrophie des Gehirns sowie der Imaginalscheiben, der hämatopoetischen Organe und der Speicheldrüsen [9] gekennzeichnet ist. 2. Homologe Rekombination D.-H. Lankenau, S. Lankenau, B.M. Mechler Die Etablierung der gene targeting-Methode für Drosophila könnte die Analyse von genetischen Interaktionen verbessern, insbesondere die Analyse von gering analysierten Mutationen von bestimmten Genen oder zur Einführung von Mutationen in bisher nicht mutierte Gene. Die Mutagenese des Drosophila Genoms durch Chemikalien bzw. PElementen ergab, daß etwa nur ein Drittel der putativen Protein-kodierenden Gene mutiert werden können. Im Falle der P-Elemente können sogar nur etwa ein Viertel der putativen Protein-kodierenden Gene mutiert werden. Es ist von größter Wichtigkeit, interessante Gene mutieren zu können, für die bisher noch keine Mutationen erhältlich sind. Daher untersuchten wir in der Keimbahn von Drosophila den Mechanismus von DNA Doppelstrangreparatur, welcher für die Etablierung der gene-targeting Methode bedeutend ist. Zusätzlich benutzten wir die von Rong und Golic (2000, Science 288:2013-2018) entwickelte Methode, um das NAP-1 Gen zu mutieren. 2.1. Der Mechanismus der DNA DoppelstrangReparatur in Keimbahnzellen von Dosophila Bei Metazoen ist die DNA-Reparatur in der Keimbahn präziser als in somatischen Zellen, da das Genom fehlerfrei von einer Generation zur anderen überführt werden muß Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik (Lankenau and Gloor*, 1998, BioEssays 20:317-327; Gloor* and Lankenau 1998, Trends in Genet. 14:43-46.). Drosophila bietet hierbei einige Vorteile zur Erforschung von diesem Mechanismus: 1.) In der männlichen Keimbahn gibt es keine meiotische Rekombination, die mit der DNA Doppelstrang-Reparatur interferieren könnte, 2.) über 90 % aller DNA-Doppelstrangbrüche werden durch den sogenannten „Synthesis dependent strand annealing“ (SDSA)-Mechanismus repariert, 3.) die beiden Enden des Doppelstrangbruchs können unabhängig voneinander das gesamte Genom nach geeigneten Matrizen „absuchen“, welche zur Reparatur benötigt werden. Insbesondere letzteres könnte helfen, Fragen zu klären, inwieweit Struktur und Organisation des Genoms die „Suche“ dieser beiden Enden des Doppelstrangbruchs beeinflussen könnten. Das Su(Hw)-Chromatin-Insulator-Protein wurde zur Erforschung des Mechanismus der DNA-DoppelstrangbruchReparatur in der Keimbahn von Drosophila hinzugezogen. Um die Frequenz der Reparatur zu bestimmen, wurden Bitarget gene conversions der Gene „forked“ und „white“ in einem Su(Hw)-defizienten oder normalen background benutzt. Im Wildtyp konnte eine Reduktion der conversion im „forked“-Lokus relativ zum „white“-Lokus beobachtet werden. Dieser Unterschied konnte auch nicht durch die Einführung von ektopischer DNA-Matrize behoben werden, die von „gypsy-insulator-binding-sites“ flankiert wird. Die Ergebnisse zeigen, daß der DNA-DoppelstrangbruchReparaturmechanismus unabhängig ist von lokalen Effekten der Chromatin-Insulatoren. Weitergehende Analysen zeigten, daß die Frequenz der gene-conversion in einem Su(Hw)-defizient background am „forked“-Lokus zunahm, jedoch am „white“-Lokus abnahm, wenn bestimmte allelic-target-combinations getestet wurden. Im Gegensatz hierzu, konnte die Frequenz der gene-conversion an beiden Loci dreifach erhöht werden, wenn ektopische Matrizen in einem su(Hw)v/Su(Hw)fbackground verwendet wurden. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß dem Reparaturmechanismus eine genomweite Suche nach Homologen DNA-Matrizen zu Grunde liegt, der stark beeinflußt wird durch die Entfernung von Insulatorproteinen von den Chromosomen. Basierend auf einem Modell der Insulatorfunktion und subnukleärer Chromatinarchitektur propagieren wir ein Modell, in dem die Homologiesuche stattfindet, wenn das Chromatin dekondensiert vorliegt. Durch die Dekondensation des Chromatins könnten die 3‘DNA-Enden eine höhere Bewegungsfreiheit zur Suche erhalten (Gloor* and Lankenau 1998, Trends in Genet. 14:43-46, [11]). In einer weiteren Arbeit wurde die DNA-Reparatur in somatischen Zellen untersucht. Man vermutet, daß in diesen Zellen die DNA-Enden am Doppelstrangbruch gebunden an poly(ADP-ribose) Polymerase (PARP) vorliegen. PARP ist zuständig für den Transfer von ADP-Ribose-Derivate von NAD+ zu Akzeptor-Proteinen und zu ADP-ribosyl Addukten, was in verzweigten Polymeren von Protein gekoppelten poly(ADP-ribose) (pADPr) resultiert. PARP-gebundene Polymere könnten als Ankerpunkte dienen, die spezifische Proteine zu dem DNA-Bruch rekrutieren könnten und somit die geschädigte DNA zur Reparatur vorbe- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 37 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung 38 Abteilung A0400 Entwicklungsgenetik reiten. Daher erforschten wir den Effekt von Gamma-Bestrahlung während der Spermatogenese von Drosophila auf die katalytische Aktivität von PARP. Mit Hilfe von antipADPr Antikörpern gelang es nachzuweisen, daß in Gamma-bestrahlten Hoden die PARP Aktivität signifikant erhöht ist. Darüber hinaus fanden wir, daß die subnukleäre Lokalisierung von pADPr während der Spermatogenese variiert, wobei in prä- und postmeiotischen Zellen eine periphere Akkumulation im Zellkern beobachtet wird und in primären Spermatozyten eine Assoziation an den bivalenten Chromosomen festgestellt werden konnte [10]. [7] Li, M., Marhold, J., Gatos, A., Török, I., Mechler, B.M. (2001) Differential expression of two scribble isoforms during Drosophila embryogenesis. Mech. of Dev. 108:185-190. 2.2. Gen-targeting mit Hilfe homologer Rekombination in Drosophila [10] Lankenau S., Bürkle A., and Lankenau D.-H. (1999). Detection of poly(ADP-ribose) synthesis in Drosophila testes upon gamma-irradiation. Chromosoma 108:44-51. Wir benutzten die von Rong und Golic entwickelte Methode zur Mutagenese des NAP-1 Gens, welches sich in der chromosomalen Region 60C befindet. Das NAP-1 Protein ist ein potentiell mit dem p127 Tumorsuppressorprotein interagierendes Protein, das mit Komponenten des Zytoskeletts während der Interphase kolokalisiert und während der Mitose an den Kernspindeln assoziiert ist. Von sechs Rekombinationsereignissen, konnten drei Ereignisse als Null-Knockout des NAP-1-Gens identifiziert werden. Der Verlust der Genfunktion resultiert in einem semi-letalen Phänotyp. Es konnte kein NAP-1-Protein in Proteinextrakten von knock-out Fliegen nachgewiesen werden. In fast allen Fällen wurde die Nukleotid-Sequenz des Nap1-Donorkonstrukts, welches nahe dem Doppelstrangbruch liegen sollte, durch Wildtyp Nap1-Sequenz ausgetauscht. Dieses Ergebnis zeigt, daß das durch Exonukleaseaktivität veränderte Donorkonstrukt mit Hilfe der Wirts-DNA-Sequenz als Matrize repariert wurde. Die Analyse von „Recombination-tracts“ zeigte, daß der „break-inducedreplication“ Mechanismus mit hoher Wahrscheinlichkeit der Mechanismus für „ends-in gene targeting“ ist. [8] Bilder, D.*, Birnbaum, D.*, Borg, J.-P., Bryant, P.*, Huigbretse, J.*, Jansen, E., Kennedy, M. B.*, Labouesse, M.*, Legouis, R.*, Mechler; B. M., Perrimon, N.*, Petit, M.*, and Sinha, P.* (2000) Collective nomenclature for LAP proteins. Nature Cell Biology 2:114. [9] Schenkel, H., Hanke, S., DeLorenzo, C., Schmitt, R., und Mechler, B. M. P-elements inserted in the vicinity of within the Drosophila snRNP SmD3 gene nested in the first intron of the Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression of SmD3. Genetics, in press. [11] Lankenau D.H., Peluso M., and Lankenau S. (2000). The Su(Hw) chromatin insulator proteins alters double-strand breakpoint repair frequencies in the Drosophila germ line. Chromosoma 109:148-160. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] De Lorenzo, C., Mechler B. M., and Bryant P.J.* (1999) What is Drosophila telling us about cancer. Cancer and Metastasis Reviews. 18:295-311. [2] Mechler, B. M., Li, M., Papagiannouli, F., and Farkas, R. (2000) Exploring the l(2)gl tumour suppressor of Drosophila: A regulator of the cytoskeletal dynamic is involved in the control of cell proliferation and programmed cell death. In: New Frontiers in mechanistic Cancer research in Animal Models. Symposium Princess Takamatsu. Cancer Res. Fund. Vol. 30:38-44. [3] Török, T, Herrmann-Horle, D., Kiss, I.*, Tick, G.*, Speer, G., Schmitt, R., and Mechler, B. M. (1999). Down-regulation of RpS21, a putative translation initiation factor interacting with P40stubarista, produces viable Minute imagos and larval lethality with overgrown hematopoietic organs and imaginal discs. Mol. Cell. Biol., 19: 2308-2321. [4] Farkas, R., and Mechler, B. M. (2000) The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays and l(2)gl-dose response. Cell Death and Diff. 7:89-101. [5] Li, M., Strand, D., Krehan, A., Pyerin, W., Heid, H. W., Neumann, B., and Mechler B. M. (1999) Casein kinase II binds and phosphorylates the nucleosome assembly protein (NAP1) in Drosophila melanogaster. J. Mol. Biol. 293:1067-1084. [6] Farkas R., and Sutakova G.* (1999). Ultrastructural changes of Drosophila larval and prepupal salivary glands cultured in vitro with ecdysone. In vitro Cell. Dev. Biol. 34:813-824. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Abteilung A0500 Molekulare Embryologie Abteilung Molekulare Embryologie (A0500) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Christof Niehrs Mechanismen der Achsenentwicklung im Frosch Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Mao Bingyu Dr. Gary Davidson (02/00 - ) Dr. Andrei Glinka Dr. Christop Hansis (10/01 - ) Dr. Olga Kazanskaya Dr. Ryu Maeda (03 - 06/01) Dr. Wei Wu (05/01 - ) In Zusammenarbeit mit: S.-L. Ang, A.P. Gomez, IGBMC Strasbourg, Frankreich; K. Cho, Univ. California, Irvine, USA; J.-C. Izpisua-Belmonte, W.-C. Jen, C. Kintner, Salk Inst., San Diego, USA; M. Muenke, Heiner Westphal, NIH, Bethesda, USA; E. Nigg, MPI München; T. Pieler, Uni Göttingen; A. Skerra, TU München; H. Delius, R. Eils, G. Schütz, M. Vingron, DKFZ. Gastwissenschaftler Dr. Nicolas Pollet, Universität Paris, Frankreich ( - 01/01) Dr. Bao Sujin, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China ( - 05/01) Doktoranden Danila Baldessari (02/00 - ) Ralph Boettcher Ivan Del Barco Emil Karaulanov (05/00 - ) Clemens Kiecker ( - 10/01) Technische Assistenten Ursula Fenger Dana Hoppe Markus Klenk (02 - 08/01) Peter Stannek Carmen Walter Sekretariat Bianca Dornseiff ( - 06/01) Kerstin Garbe (07/01 - ) Eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie der Wirbeltiere befasst sich mit der Anlage der embryonalen Achsen, d. h. Kopf-Schwanz- (anterior-posterior) und RückenBauch- (dorsal-ventral) Achse. Für die Achsenentwicklung hat der sogenannte Spemann Organisator eine herausragende Bedeutung. Dieses Gewebe wurde 1926 von Spemann und Mangold durch Transplantationsexperimente entdeckt. Der transplantierte Organisator ist in der Lage in einem Embryo einen kompletten sekundären Embryo zu induzieren und somit die Achsenanlagen zu duplizieren. Die Tiere entwickeln sich dann ähnlich siamesischen Zwillingen [3]. Die Arbeitsgruppe analysiert die molekularen Grundlagen, die zu den vielfältigen Eigenschaften des Organisators führen. Der Spemann Organisator wird durch die antagonisierenden Effekte von Wnt und BMP Wachstumsfaktoren reguliert. Die Aufklärung dieser Signalwege ist daher für das Verständnis der molekularen Vorgänge im Spemann Organistaor aufschlußreich. Whole-mount in situ Hybridisierungs Screening Die Abteilung beschäftigt sich mit der Frage, wie das Schicksal embryonaler Zellen während der Frühentwicklung der Wirbeltiere reguliert wird. Dies wird am Frosch studiert, einem traditionellen Objekt der Embryologie, das erlaubt klassische Techniken wie Transplantationen und Explantationen mit modernen molekularbiologischen Techniken zu verknüpfen. Durch Mikroinjektion von einzelnen mRNAs in Embryonen wird die Funktion von Genen im Kontext des sich entwickelnden Organismus studiert. Hybridisierungstechniken ermöglichen die räumliche Detektion der Expression einzelner Gene in den verschiedenen Geweben des Wirbeltierkeims. Im Vordergrund steht die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Achsenentwicklung sowie der Zellinteraktionen, die eine Rolle im Spemann Organisator spielen. Mit molekularbiologischen Ansätzen werden in diesem Zusammenhang neue Entwicklungskontrollgene identifiziert und charakterisiert. Die in Embyronen gewonnenen Erkenntnisse sind bedeutsam für das Verständnis von Zellwachstum und Differenzierung in normalen und malignen Zellen. R. Boettcher, N. Pollet, C. Niehrs In einem screening Projekt zur Identifizierung entwicklungsregulatorischer Gene mit Funktion im Mesoderm werden in der Abteilung in großem Maßstab cDNAs mit Hilfe von in situ Hybridisierung auf ihr Expressionsmuster hin untersucht. cDNAs, die ein interessantes Muster zeigen, werden in Zusammenarbeit mit Dr. Hajo Delius (DKFZ) ansequenziert und gegebenenfalls näher untersucht. In unserem Pilotscreen wurden wahllos cDNAs einer Neurula cDNA Bibliothek aus Xenopus Embyronen isoliert und das Expressionsmuster der entsprechenden Gene in verschiedenen Embryonalstadien untersucht. Es wurden ca. 10.000 cDNAs analysiert und 1.400 differentiell exprimierte Gene ansequenziert. Nach Abzug mehrfach identifizierter Gene resultierten 900 differentiell exprimierte Gene, von denen 388 Gene keine signifikante Sequenzhomologie zu bekannten Genen zeigen. Auf Grund der Erfahrungen mit einem vorangegangenen Pilotscreen wissen wir, daß ca. 300 dieser Gene potentielle Entwicklungskontrollgene darstellen, z. B. Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, Komponenten von Signalwegen, Transkriptionsfaktoren. Unter den identifizierten Klonen waren solche mit einer belegten regulatorischen Funktion in der Embryonalentwicklung. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 39 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung 40 Im vorangegangenen Pilotscreen war die Beobachtung sogenannter Synexpressionsgruppen, d. h. Gruppen von Genen, die ein gemeinsames, komplexes Expressionsmuster aufweisen von besonderer Bedeutung. Interessanterweise sind diese Gene nicht nur durch ihre Expressionen sondern auch ihre potentielle Funktion verknüpft. So zeigen die vier Mitglieder der Delta-Gruppe alle das charakteristische Expressionsmuster von Delta-1, einem Liganden des Notch-Rezeptors. Die DNA Sequenzhomologien dieser Gene weist darauf hin, daß sie Komponenten des Delta-Notch-Signalwegs sind, und dies konnte für einen neuen HLH Transkriptionsfaktor gezeigt werden. Somit machen Synexpressionsgruppen wertvolle Voraussagen über die potentielle Funktion unbekannter Gene. Alle 900 Gene des gegenwärtigen Screens werden momentan einer Synexpressionsanalyse unterworfen [1, 10, 11, 15, 17, 18, 22]. ADMP und Regulation des Spemann Organisators R. Dosch, C. Niehrs Der Spemann Organisator kann in Kopf- und Rumpforganisator unterteilt werden und es ist unklar, wie diese Regionalisierung reguliert wird. Der Rumpforganisator in Xenopus exprimiert Anti-Dorsalizing Morphogenetic Protein (ADMP), ein potenter Organisatorantagonist. Wir konnten zeigen, daß ADMP die Kopfinduktion während der Gastrulation unterdrückt, indem es die Expression von BMP Antagonisten inhibiert. Dominant-negatives ADMP anteriorisiert Embryos und seine Ko-expression mit BMPAntagonisten induiziert die Ausbildung sekundärer Köpfe und die Expression von Kopfinduktoren. Anders als andere BMPs wird ADMP nicht durch dominant-negativen BMP Rezeptor I, Noggin, Cerberus und Chordin, wohl aber durch Follistatin gehemmt. ADMP weist damit deutlich unterschiedliche Eigenschaften zu anderen BMPs auf. Die Resultate zeigen, daß ADMP im Rumpforganisator fungiert, um dort die ektopische Kopfbildung zu hemmen [2, 4]. Dickkopf1 und der Wingless Signalweg im Spemann Organisator Abteilung A0500 Molekulare Embryologie Wenn dkk1 zusammen mit BMP Inhibitoren überexprimiert wird, so führt dies zur Induktion von sekundären Köpfen, mit Augen und Vorhirnstrukturen. Im Gegensatz dazu führt die Injektion von inhibitorischen dickkopf Antikörpern zum Verlust von Köpfen in Kaulquappen. Das dkk1 Gen ist also hinreichend und notwendig für die Kopfinduktion durch den Spemann Organisator im Frosch. Wir konnten ferner zeigen, daß dkk1 als Wnt-Inhibitor wirkt. Genauere Analysen im Frosch belegen, daß dkk1 für die Ausbildung des anterioren Endomesoderms (prechordales Mesoderm) notwendig ist, welches seinerseits an der Induktion des anterioren Nervensystems zentral beteiligt ist [9, 13, 14, 21]. Heiner Westphal (NIH) hat in Zusammenarbeit mit uns das Maus dkk1 Gen durch homologe Rekombination inaktiviert. Diesen dkk1 Mausmutanten fehlt der anteriore Bereich des Kopfs bis zum Mittelhirn, während der Rumpf der Mäuse normal ist. Molekulare Markeranalysen zeigten, daß bereits während der Gastrulation das anteriore Endomesoderm nicht normal differenziert ist. Außer den Kopfdefekten zeigen die dkk1 Mausmutanten auch Mißbildungen der Extremitäten, die eine Rolle des dkk1 Gens im programmierten Zelltod (Apotose) belegen [5, 20]. Dkk1 Protein inhibiert den Wnt Signalweg, indem es als Antagonist für den Wnt Korezeptor Lipoprotein-related protein6 (LRP6) fungiert. LRP6 ist zusammen mit dem Wnt Rezeptor Frizzled an der Signalweiterleitung von Wnt Ligand beteiligt, vermutlich indem ein ternärer Komplex zwischen Wnt, LRP6 und Frizzled ausgebildet wird. LRP6 vermittelt lediglich einen von drei möglichen Signalwegen, die von Wnt Liganden ausgelöst werden können, nämlich den sog. β-catenin Weg. Dkk1 bindet mit hoher Affinität an LRP6 und verhindert dadurch spezifisch die Signaltransduktion durch β-catenin aber nicht durch die alternativen Wnt Kaskaden [16]. Dkk1 ist Mitglied einer unbekannten Multigenfamilie und beim Mensch kommen neben dem Xenopus Homologen dickkopf1 drei weitere dickkopf Gene vor. Die Funktion von dkk2 wurde mittels Mikroinjektion in Xenopusembryonen untersucht. Dkk2 aktiviert im Gegensatz zu dkk1 den Wnt/ β-catenin Weg, und zwar synergistisch zusammen mit koexprimierten Frizzled Rezeptoren. Andererseits ist dkk1 in B. Mao, I. del Barco, A. Glinka, O. Kazanskaya, C. Kiecker, W. Wu, C. Niehrs Der Spemann’sche Kopforganisator wird von Mitgliedern der Wnt und BMP Wachstumsfaktorfamilie antagonisiert. Dies sind Wachstumshormone, die in zahlreichen Prozessen in der Embryonalentwicklung Zellwachstum und Differenzierung regulieren. Wir haben ein 2-Inhibitor Modell vorgeschlagen, nach dem das wirksame Prinzip des Spemann’schen Kopfinduktors die gleichzeitige Inhibition von BMP und Wnt Signalen ist [8]. In einem molekularen Screen für neue Kopfinduktoren haben wir das dickkopf (dkk1) Gen identifiziert, dessen Überexpression zu Kaulquappen mit vergrößerten Köpfen führt. Das Gen kodiert für ein sekretiertes Protein von ca. 30 kDa, das spezifisch im Kopforganisator exprimiert ist. Abb.1: Dickkopf1 Mausmutanten fehlt der Kopf Wildtyp (links) und dkk1-mutante Mausembryonen (rechts) am Tag 17 p.c.. In dkk1-/- Mäusen fehlen Kopfstrukturen bis zum Mittelhirn [20]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung der Lage die Aktivität von dkk2 zu hemmen. Somit können dkk1 und dkk2 als gegenseitige Antagonisten wirken und den Wnt/β-catenin Weg regulieren. Dkk3 ruft im Gegensatz zu dkk1 und dkk2 nach Überexpression in Xenopus keine messbaren Effekte hervor und seine Beteiligung am Wnt/β-catenin Weg ist noch unklar [12]. Ein Aktivitätsgradient von Wnt/β β-catenin Signalen reguliert die antero-posteriore Musterbildung des frühen embryonalen Nervensystems C. Kiecker, C. Niehrs Die anteroposteriore (AP) Musterbildung der Neuralplatte von Wirbeltieren beginnt während der Gastrulation und wird durch den Spemann Organisator und seine Derivate reguliert. Das klassische Nieuwkoop Modell für AP-Musterbildung sagt in diesem Zusammenhang die Existenz eines nach kaudal zunehmenden Morphogens voraus, das anterior spezifizierte neurale Zellen in posteriore umwandelt. Jedoch ist die molekulare Identität dieses transformierenden Morphogens noch ungeklärt. Unsere Untersuchungen zeigen, daß ein Aktivitätsgradient der Wnt/β-catenin Signalkaskade Kandidat für ein solches Morphogen ist. Wnt3a Protein ist in der Lage dosisabhängig mindestens drei verschiedene Hirnregionen zu spezifizieren. Wnts vermitteln den posteriorisierenden Einfluß auf ektodermale Zellen über eine längere Reichweite und zwar direkt, ohne daß eine Kaskade sekundärer sezernierter Faktoren notwendig zu sein scheint. Ergebnisse mit Wnt Inhibitoren zeigen, daß die Wnt/β-catenin Signalkaskade auch notwendig für die AP-Musterbildung der Neuralplatte ist. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen ist mit Antikörpern ein Gradient von aktivem β-catenin in der Neuralplatte nachweisbar, mit höchster Aktivierung in der posterioren Neuralplatte und geringer Aktivierung in der anterioren Neuralplatte. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich ein Model, in dem ein Aktivitätsgradient von Wnt/βcatenin Signalen die AP-Musterbildung der Neuralplatte reguliert [19]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Pollet, N., *Schmidt, H.A., Gawantka, V., Vingron, M. and Niehrs, C. (2000): Axeldb: A Xenopus laevis database focussing on gene expression. Nucleic Acids Res. 28, 139-140. [2] Dosch, R. and Niehrs, C. (2000): Requirement of anti-dorsalizing morphogenetic protein in organizer patterning. Mech. Dev. 90, 195-203. [3] Niehrs, C. (2000): Amphibian organizer activity. In: Developmental Biology Protocols, Vol III (eds. R. S. Tuan and C. W. Lo), Humana Press, Totowa. pp. 179-183. [4] Niehrs, C., Dosch, R. and Onichtchouk, D. (2000): Embryonic patterning of Xenopus mesoderm by BMP-4. Proceedings of the E. Schering Research Foundation (eds. C. Nüsslein-Volhard and J. Kräztschmer) 29, 165-190. Abteilung A0500 Molekulare Embryologie [6] Otto, C., Schütz, G., Niehrs, C. and Glinka, A. 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[17] *Lamar, E., *Deblandre, G., *Wettstein, D., Gawantka, V., Pollet, N., Niehrs, C. and *Kintner, C. (2001): Nrarp is a novel intracellular component of the Notch signaling pathway. Genes Dev 15, 1885-99. [18] Pollet, N. and Niehrs, C. (2001): Expression profiling by systematic high-throughput in situ hybridization to whole-mount embryos. Methods Mol Biol 175, 309-21. [19] Kiecker, C. and Niehrs, C. (2001): A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signaling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. Development 128, 4189-4201. [20] *Mukhopadhyay, M., *Shtrom, S., *Rodriguez-Esteban, C., *Chen, L., *Tsuku, T., *Gomer, L., *Dorward, D. W., Glinka, A., *Grinberg, A., *Huang, S.-P., Niehrs, C., *Izpisúa Belmonte, J.-C. and *Westphal, H. (2001): Dickkopf1 is required for embryonic head induction and limb morphogenesis in the mouse. Developmental Cell 1, 423-434. [21] Niehrs, C. (2001): Dickkopf-1, a secreted protein involved in head induction. Human Frontier Science Program Workshop X (Ang, S.-L et al. editors) p. 128-132. [22] *Duncan, P. I., Pollet, N., Niehrs, C. and *Nigg, E. A. (2001): Cloning and Characterization of Plx2 and Plx3, Two Additional Polo-like Kinases from Xenopus laevis. Exp Cell Res 270, 78-87. [23] Niehrs, C. (2001): Solving a sticky problem. Nature 413, 787788. [5] *Roessler, E., *Du, Y., Glinka, A., *Dutra, A., Niehrs, C. and *Muenke, M. (2000): The genomic structure, chromosome location, and analysis of the human DKK1 head inducer gene as a candidate for holoprosencephaly. Cytogenet Cell Genet 89, 220224. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 41 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung A0600 Biomedizinische Strukturforschung Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung (A0600) Leiter: Prof. Dr. Michael F. Trendelenburg, Prof. Dr. Eberhard Spiess 42 A0601: Strukturelle Genanalyse und Service Betriebseinheiten (A0603/A0601): Konfokale Mikroskopie und Videomikroskopie Mikroinjektion Analytische Elektronenmikroskopie in Zell- und Molekularbiologie Arbeitsgruppenleiter: Prof. Dr. Michael F. Trendelenburg Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Herbert Spring Dr. Karin Schwab (08/99 - 08/02) Technische Mitarbeiter Roger Fischer Doktoranden, Diplomanden Dipl. Chem. Marco Marcello (09/01-07/02) Gastwissenschaftler Prof. Dr. Luiz Monteiro Leal (03/2001-02/2002) Dr. Aurora Marques Cianciarullo (08/2001-04/2002) Dr. Marcelo Pelajo Machado (01/2002-12/2002) Loraine Campanati Araujo (09/2001-02/2002) A0602: Modellversuche zur Invasion und Metastasierung und Service Betriebs Einheit (A0603/A0602) Konventionelle Elektronenmikroskopie Arbeitgruppenleiter: Prof. Dr. Eberhard Spiess Doktoranden, Diplomanten Dipl. Biol. Felix Bestvater (11/1997 - 11/2000) Technische Mitarbeiter Anna Heckel-Pompey (Techniker ½ ; 08/00) Mit dem Beginn des Jahres 1993 wurde am DKFZ eine Zentrale Arbeitsgruppe Biomedizinische Strukturforschung eingerichtet, die im Bereich der modernen sehr Apparate aufwändigen licht- und elektronenmikroskopischen Verfahren die Abteilungen des DKFZ unterstützt. Ein - begrenztes - Service-Angebot (A0603) der Gruppe besteht für folgende Gebiete: Konfokale Laserscan-Mikroskopie, Videomikroskopie, Automatisierte Mikroinjektion, Elektronenspektroskopische Strukturanalysen im Nanometer Bereich durch Elektron Spectroscopic Imaging (ESI) Videomikroskopie und konfokale Mikroskopie erlauben durch die Kombination molekularbiologischer und optischer Detektionsverfahren und der Digitalisierung der Bilder eine vielseitige rechnergestützte Auswertung inklusive 3D-Rekonstruktion. Die konfokale Technik ermöglicht eine Erweiterung der Bildinformation auf einen in der Z-Achse definierbaren Focusbereich, der im Sub-Mikrometer-Bereich liegt. Durch Bewegen des Präparats in der optischen Achse sowie durch Unterdrückung der nicht zur Fokusebene gehörenden Bildinformationen durch die sogenannte konfokale Blende werden lichtmikroskopische Schnittserien vom Ob- jekt im Fluoreszenzverfahren möglich, ohne dieses zu zerstören. Über die computergestützte Rekonstruktion wird dann z.B. ein 3-dimensionales Bild des Objektes erhalten. In Verbindung mit Mehrfach-Fluoreszenzmarkierungen und simultaner Detektion kann auf diese Weise die räumliche Struktur intrazellulärer Kompartimente sichtbar und quantifizierbar gemacht werden. Darüberhinaus ermöglicht diese Technik auch einen Einblick in relativ “dicke” mikroskopische Präparate wie bespielsweise Zellverbände, Eizellen oder Embryonen. In sehr raschem Ausbau befinden sich gegenwärtig Technologien zur in -vivo Zell-Fluoreszenzmikroskopie. Von besonderem Interesse ist dabei die Zeit-aufgelöste Dokumentation verschiedenster GFP (Green Fluorescent Protein) Konstrukte. Eine wesentlich verbesserte Analytik der hierbei verwendeten Fluorochrome/ oder Fluorophore ermöglicht das als Zusatz zum verwendeten ZEISS LSM 510 einsetzbare META-Erweiterungssystem. Erstmals ist es möglich, Fluoreszenzen rein spektral quantitativ zu erfassen, also ohne die überlappenden Mischspektren („cross-talk“), die mit den bisherigen Verfahren meist mehr oder weniger vollständig aus dem Bild herausgerechnet werden mußten. Das mit der Lichtmikroskopie eng verbundene Gebiet der automatisierten Mikroinjektion ermöglicht einen gezielten Transfer unterschiedlichster Proben in lebende Gewebekulturzellen. In Verbindung mit den beiden zuvor genannten Techniken ist sie ein elegantes Verfahren zum Studium komplexer Regulations- und Transportvorgänge auf zellulärer Ebene. Gründliche Beratung wird auch für den Bereich elektronenmikroskopischer Präparations- und Fixierungstechniken angeboten: Speziell für die Präparation und Strukturuntersuchung von Makromolekülkomplexen sowie für Detailuntersuchungen an definierten subzellulären Domänen. Im Jahr 1995 wurde zusätzlich eine Serviceeinheit „Analytische Elektronenmikroskopie für Biomedizinische Proben“ eingerichtet (Förderung durch das BMBF Programm Biotechnologie 2000). In enger Zusammenarbeit mit anderen Abteilungen des DKFZ werden gegenwärtig sowohl Probenvorbereitung als auch Analyseparameter dieser neuartigen Spektroskopie-Technik soweit optimiert, daß ein Einsatz dieses hochauflösenden Analyseverfahrens in weiten Gebieten der molekularen Biomedizin möglich wird. Parallel hierzu werden neuartige molekulare Markierungstechniken für diesen Anwendungsbereich entwickelt. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Service Betrieb (A0603/A0601) Konfokale - und Videomikroskopie H. Spring, M.F. Trendelenburg, K. Schwab, R. Fischer Konfokale und Video Mikroskopie Für die konfokale Mikroskopie wird ein Zeiss LSM S10 UVMikroskop verwendet. Dieses Instrument ist mit vier Lasern (insgesamt sechs Wellenlängen) ausgerüstet. Eine entsprechende Peripherie inklusive 3D-Dekonvolution und Fotodrucker ist vorhanden. Im Bereich der hochvergrößerten Videomikroskopie steht ein Argus 20 System (Hamamatsu Photonics, Japan) zur Verfügung. Dieses System wird vor allem zur Analyse dynamischer Prozesse in lebenden Zellen verwendet. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Herrmann, H., U. Aebi*: Intermediate filaments and their associates: Multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr. Opin. Struct. Biol 12, 79-90, 2000 (mit Titelbild) [2] Tajbakhsh, J. H. Luz*, H. Bornfleth*, S. Lampel, C. Cremer*, P. Lichter: Spatial distribution of GC- and AT-rich DNA sequences within human chromosome territories. Exp. Cell Res. 225, 229237, 2000 [3] Cziepluch, C., S. Lampel, A. Grewenig, C. Grund, P. Lichter, J. Rommelaere: H-1 parvovirus-associated replication bodies: A distinct virus-induced nuclear structure. J. Virology 74, 4807-4815, 2000 [4] Reichenzeller, M., A. Burzlaff, P. Lichter, H. Herrmann: In vivo observation of a nuclear channel-like system: Evidence for a distinct interchromosomal domain compartment in interphase cells. J. Structural Biology, 129, 175-185, 2000 [5] Keitel, V., J. Kartenbeck, A.T. Nies, H. Spring, M. Brom, D. Keppler: Impaired protein maturation of the conjugate export pump multidrug resistance protein 2 as a consequence of a deletion mutation in Dubin-Johnson syndrome. Hepatology, 32, 13171327, 2000 (mit Titelbild) [6] Hofemeister*, H., K. Weber*, R. Stick: Association of prenylated proteins with the plasma membrane and the inner nuclear membrane is mediated by the same membrane-targeting motifs. Mol. Biology of the Cell 11, 3233-3246, 2000 [7] Oxelmark, E., A. Marchini*, I. Malanchi*, F. Magherini*, L. Jaquet, M.A. Nasser Hajibagheri*, K.J. Blight*, J.-C. Jauniaux, M. Tommasino: Mmf1p, a novel yeast mitochondrial protein conserved throughout evolution and involved in maintenance of the mitochondrial genome. Mol. Cell. Biol. 20, 7784-7797, 2000 [8] Borrmann, C.M., C. Mertens, A. Schmidt, L. Langbein, C. Kuhn, W.W. Franke: Molecular diversity of plaques of epithelialadhering junctions. Annals of the New York Acad. Sci. 915, 144150, 2000 [9] Henzler, T., A. Harmache, H. Herrmann, H. Spring, M. Suzan*, G. Audoly*, T. Panek, V. Bosch: Fully functional, naturally occurring and C-terminally truncated variant human immunodeficiency virus (HIV) Vif does not bind to HIV Gag but influences intermediate filament structure. J. General Virology 82, 561-573, 2001 A0600 Biomedizinische Strukturforschung [12] Mertens, C., I. Hofmann, Z. Wang*, M. Teichmann*, S.S. Chong*, M. Schnölzer, W.W. Franke: Nuclear particles containing RNA polymerase III complexes associated with the junctional plaque protein plakophilin 2. Proc. Nat. Acad. Sci USA 98, 7795-7800, 2001 [13] Peitsch, W.K., I. Hofmann, S. Prätzel, C. Grund, C. Kuhn, I. Moll*, L. Langbein, W.W. Franke: Drebrin particles: Components in the ensemble of proteins regulating actin dynamics of lamellipodia and filopodia. Eur.J. Cell Biol. 80, 567579, 2001 (mit Titelbild) [14] Langbein, L., M.A. Rogers, H. Winter, S. Praetzel, J. Schweizer: The catalog of human hair keratins. II. Expression of the six type II members in the hair follicle and the combined catalog of human type I and II keratins. J. Biol. Chemistry 276, 3512335132, 2001. [15] *Zhang, J.B., H. Spring, M. Schwab: Neuroblastoma tumor cell-binding peptifed identified through random peptide phage display. Cancer Letters 171, 153-164, 2001. [16] *Constien, R., A. Forde*, B. Liliensiek*, H.J. Gröne, P. Nawroth*, G. Hämmerling, B. Arnold: Characterization of a novel EGFP reporter mouse to monitor Cre recombination as demonstrated by a Tie2 Cre mouse line. Genesis 30, 36-44, 2001. [17] Cui, Y.H., J. König, D. Keppler: Vectorial transport by doubletransfected cells expressing the human uptake transporter SLC21A8 and the apical export pump ABCC2. Mol. Pharmacol. 60, 934-943, 2001. [18] Kneissel, S., W.W. Franke, J.G. Gall, H. Heid, S. Reidenbach, M. Schnölzer, H. Spring, H. Zentgraf, M.S. SchmidtZachmann: A novel karyoskeletal protein: Characterization of protein NO145, the major component of nucleolar cortical skeleton in Xenopus oocytes. Mol. Biol. Cell, 12, 3904-3918, 2001. Mikroinjektion R. Fischer, M.F. Trendelenburg Mikroinjektionsexperimente an Gewebekulturzellen werden an einem automatisierten Injektionssystem AIS (Carl Zeiss) sowie an einem Eppendorf-System durchgeführt. Injektionsapparaturen und Beratung werden auch für Injektionsexperimente an Amphibien Oocyten und Embryonen zur Verfügung gestellt. Publikationen(* = externe Autoren) [1] *Bayerl, C., *Jung, E.G.,: Microinjection of an antibody against HSP 72 in keratinocytes to study acute UV in jury. Exp. Dermatol.8; 247-253 (1999) 8 [2] Marcello, M., Fischer, R., Troester, H., Trendelenburg, M., Sczakiel, G.,: Selecting karyophilic DNA cis elements in Xenopus laevis oocytes: a new approach. Int. J. Dev. Biol. (2002), in press Organisation Internationaler DKFZ Laborkurse und Symposien auf den Gebieten: Digitale Mikroskopie und Proben Detektion in der Biomedizin Koordination: M.F. Trendelenburg und H. Spring. A. Burzlaff, K. Schwab, H. Tröster, R. Fischer [10] Bashir, T., J. Rommelaere, C. Cziepluch: In vivo accumulation of cyclin A and cellular replication factors in autonomous parvovirus minute virus of mice-associated replication bodies. J. Virology 75, 4394-4398, 2001 Konzeption und Durchführung internationaler DKFZAdvanced Courses on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Biomedical Cell Biology und [11] Rogers, M.A., L. Langbein, H. Winter, C. Ehmann, S. Praetzel, B. Korn, J. Schweizer: Characterization of a cluster of human high/ultrahigh sulfur keratin-associated protein genes embedded in the type I keratin gene domain on chromosome 17q12-21. J. Biol. Chem. 276, 19440-19451, 2001 Mitarbeit bei EMBO Practical Courses in Zusammenarbeit mit: W.W. Franke, H. Herrmann, J. Kartenbeck , L. Langbein (A0100), P. Lichter, St. Joos (H0700). Th. Bächi (Zürich, Schweiz), H. Bauch, D. Brocksch, H. Gundlach, DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 43 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung R. Käthner, W. Malkusch (Fa.Carl Zeiss), J.C. Bulinski, M. Sheetz (New York, USA), W. Gräwe, B. Moomaw, N.Sugiyama, L. Schleinkofer, K. Weinbuch (Fa. Hamamatsu Photonics), W. Ansorge, T. Hyman, E.Stelzer, R. Saffrich (EMBL, Heidelberg), R. Leube (Mainz), S.Terakawa (Hamamatsu, Japan), M. White (Liverpool, UK.) DKFZ Advanced Practical Courses 44 2. - 6. Oktober 2000 DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Fluorescent Protein Technology in Living Cells, Multiparameter Fluorescence, Advanced Digital Microscopy, Confocal Microscopy Calcium Imaging, 3-D Procedures, FISH) 8. - 12. Oktober 2001 DKFZ-Advanced Course on Digital Microscopy and Fluorescence Techniques in Cell Biology (Advanced Digital Microscopy, Green Fluorescent Protein Technology, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Multifluorescence Microscopy, Confocal Microscopy, Image Processing, 3-D Procedures, Calcium Imaging, FISH & CHIPS) EMBO Practical Courses M.F. Trendelenburg, R. Fischer: Kursteil Microinjection into Xenopus Oocytes and Eggs. EMBO Practical Courses on Microinjection and Probe Detection EMBL Heidelberg June 5-9,2000 EMBL Heidelberg, June 18-23,2001 H. Spring: Kursteil Fluorescent live cell microscopy EMBO Practical Course on Confocal and Multi-Photon Microscopy of Live Specimens EMBL, Heidelberg; April 16-23,1999 A0600 Biomedizinische Strukturforschung Analytische Elektronenmikroskopie in Zellund Molekularbiologie Koordination: M.F. Trendelenburg, H. Spring. C. Crucifix, H. Tröster, L. Monteiro-Leal, L. Campanati-Araujo, A. Marques-Cianciarullo. in Zusammenarbeit mit W.W. Franke, J. Kartenbeck (A0100); I. Grummt, R. Voit (A0300); M. Wießler (C0300); W. Schlegel (E0400); M. Pawlita (F0200) alle DKFZ E. Delain (Inst. Gustave Roussy, Villejuif/Frankreich); S. Fakan (Univ. Lausanne / Schweiz); P. Oudet, P. Schultz (Univ. Strasbourg, Frankreich); Steinbeis Transferzentrum Analyt. EM in Biomedizin u. Biotechnologie (Heidelberg), H. Kohl (Univ. Münster) M. Schwarz (Orthopädie, Univ. Klinikum Mannheim), M. Hafner (FH Mannheim). Gerätekonfiguration: ZEISS < LEO > EM 912, Omega, Slow Scan CCD Kamera, Electron Spectroscopic Imaging System und Software Programm, EELS Detektor, Komponenten für Kryo-EM. Grundlage des Electron Spectroscopic Imaging ist die inelastische Elektronenstreuung in den inneren Atomschalen, d.h. wird ein Hüllelektron durch Energieübertragung angeregt oder ionisiert, als Folge ergibt sich ein elementcharakteristischer Energieverlust des Strahlelektrons. Sind in einem elektronmikropskopischen Präparat Elemente in einer nachweisbaren Masse vorhanden, so entstehen im Energieverlustspektrum definierte Absorptionskanten. Aus diesen Absorptionskanten lassen sich dann Rückschlüsse auf das Element, das Hüllenelektron und die Konzentration ziehen (vgl. Darstellung in Abb.1). Hauptzielsetzung dieses Projekts (unterstützt durch Fa. LEO Elektronenmikroskopie, Oberkochen und durch das BMBF, Bonn-Berlin) ist der Einsatz des ESI-Verfahrens in Zell- und Molekularbiologie. Im Speziellen, ein hochauflösender, quantitativer Phosphor-Nachweis in DNA und RNA sowohl in EM Spreitungspräparaten, als auch in Ultradünnschnitten. Parallel hierzu werden orientierende Untersuchungen an Bor- und Halogen markierten Biomolekülen durchgeführt. Hauptprojekte: Forschung und Entwicklung I. Quantifizierung erforderlicher Objekte- und Analyse Parameter biomedizinischer Proben für das Electron Spectroscopic Imaging (ESI) und die Electron Energy Loss Spektroskopie (EELS). Als Hauptsächliche Präparattypen verwenden wir Adsorptionspräparate von DNA bzw. RNA/ Nukleinsäurekomplexen, sowie nichtkontrasAbb. 1 : Prinzip und Anwendung der elektronenspektroskopischen Abbildung (ESI) in der biomedizinischen Strukturanalyse. A: Strahlengang im analytischen Mikroskop für das Abbildungsverfahren mit inelastisch gestreuten Elektronen. B: Prinzip der elementarspezifischen Information durch inelastische Streuprozesse, bei welchen elementcharakteristische Energieverluste entstehen. C,D: Beispiele für eine Phosphor-spezifische Abbildung durch Elektronenspektroskopie simultan absorbierten TYMV und TMV Viruspartikeln. C: Typisches P-spezifisches Absorptionskantenbild bei 150 eV, der maximalen P-L2,3 Absorptionskante. Zusätzlich zu der Information über die spezifische P-Verteilung enthält dieses Bild auch Signalbeiträge aus dem „unspezifischen“ Untergrund. D: Differentiell errechnetes Bild der spezifischen P-Verteilung in TYMV und TMV Viren. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung tierte Ultradünn-Schnitte durch fixierte Zellen. An diesen Präparaten soll die Elementverteilung von Struktur gebundenem Phosphor quantitativ dargestellt werden [1-4]. II. Schritte zur Quantifizierung des Phosphor (P)Gehalts definierter viraler Genome. Ein besonderes Problem bei der Quantifizierung von Phosphor Signalen ist die Definition des Präparat Untergrund Signals. Um die Relation der Beiträge von spezifischem Phosphat (P) Signal gegenüber dem unspezifischen UntergrundSignal zu definieren, haben wir verschiedenen Virale Proben auf EM-Träger Kohlenstoff Membranen adsorbiert. Hierbei konnte ein speziell konfigurierter Präparatetyp entwickelt werden, der es erlaubt Virus Partikel, die DNA oder RNA in einer Packungsdichte von 3-5 P-Atomen/um² enthalten, in Bezug auf das P-spezifische Signal reproduzierbar zu analysieren [1-4, 7,8]. III. Entwicklung neuer Verfahren zur Elementspezifischen Darstellung von Immunogold markierten Ultradünnschnitten. Das gegenwärtig intensivst genutzte EM-Markierungsverfahren besteht in der Verwendung von zum Antikörper gekoppelter Nanogoldpartikeln. Abgesehen von den bekannten Problemen der Erreichbarkeit der Antigene für die verwendeten gekoppelten Immuno-Gold-Proben ergibt sich sehr häufig das Problem, daß die genaue Position der spezifisch gebundenen Gold Partikel in vielen Fällen nicht genau definiert werden kann, da der Präparatuntergrund partikuläre Bereiche ähnlich hoher Elektronendichte aufweist, wie die der zur Immundedektion verwendeten Nanogold Partikel. Durch die von uns entwickelte Methode kann der Kontrastbeitrag der Nanogoldpartikel selektiv gegenüber dem Präparatkontrast reproduzierbar ermittelt werden. Hiermit ist eine neue Möglichkeit gegeben, Immunogold markierte EM-Präparate quantitativ auszuwerten. Eine weitere, entscheidende Verbesserung der Detektion konnte kürzlich durch den Einsatz einer speziell konfigurierten 2k Slow Scan CCD Kamera erreicht werden [2,4-6, 10] IV. Einsatz der EM Spektroskopie für die Lokalisation speziell konfiguirieter Bor-Verbindungen in Patienten Tumoren. Seit mehreren Jahren wird das Verfahren der BorNeutronen Einfang Therapie (BNCT: boron neutron capture therapy) im Rahmen eines EG-Vorhabens weiterentwickelt. In den letzten Jahren werden mehr und mehr speziell konfigurierte Borverbindungen (vgl. Feakes et. al. PNAS 96, 6406,1999) eingesetzt. In Zusammenarbeit mit der Abt. Molekulare Toxikologie gelang es vor kurzem, ein für die EM-Detektion besonders geeignetes Borkonstrukt zu synthetisieren [4,6,7,9]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Crucifix, C., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Trendelenburg, M.F., Probst, W., Haking, A., Tröster, H.: Electron spectroscopic imaging (ESI) if viral DNA- and RNA-distribution using a new method of background substraction. Microscopy & Microanalysis (1999) Vol. 5, Suppl. 2, 216-220 Proc. Micr. Soc. America (Portland, OR, USA) A0600 Biomedizinische Strukturforschung [2] Haking A., Tröster, H., Richter, K., Crucifix, C., Spring, H., Trendelenburg, M.F. An approach to an objektive background substraction for elemental mapping with core-edges down to 50 eV: description, evaluation and application. Ultramicroscopy (1999) 80:163-182 [3] Crucifix, C., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Trendelenburg, M.F., Probst, W., Haking, A., Tröster, H.: Electron spectroscopic imaging (ESI) if viral DNA- and RNA-distribution using a new method of background substraction. Acta Microscopia (1999) 8, Suppl. B: VI-X [4] Tröster, H., Crucifix, C., Haking, A., Spring, H., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Raddatz, S., Wiessler, M., Probst, W., Trendelenburg, M.F. A Novel Concept for Application of EnergyFiltering Transmission Electron Microscopy in Biomedicine and Biotechnology in Perspective Imaging, 7th APEM Committee Singapore: Life Sciences, pp.127-130, Times Publ. Singapore 2000 [5] Hiller, S.A., Kabius, B., Probst, W., Tröster, H., Trendelenburg, M., Crucifix, C. Tröndle, A. Performance data of a new 2048 x 2048 pixel Slow-Scan CCD camera for TEM. Microsc. & Microanalysis 2000, Vol. 6, Suppl.. 2, pp. 732-735, 2000 [6] Tröster, H., Bub S., Hunziker, A., Trendelenburg, M.F. (2000): Stability of DNA repeats in Escherichia coli dam mutant strains indicates a Dam-methylation-dependent DNA deletion process. Gene 258: 95-08 (2000) [7] Trendelenburg, M. F., Spring, H. Haking, A., Tröster, H., Pawlita, H., Crucifix, C.: From Mille spreads to phosphorus maps of nucleoproteins: Transcription seen by complementary microscopies: EUREM 12, BRNO Czech Repubic, Vol. I, pp. B 283-287, 2000 [8] Crucifix, C., Tröster, H., Pawlita, M., Witz, J., Haking, A., Spring, H., Troendle, A., Probst, W., Trendelenburg, M. F.: Viral vectors in gene therapy: Rapid screening of recombinant viral vector samples using genomic phosphorous (P)-map electron microscopic imaging [ESI]. 40th Annual Meeting Americ. Soc. Cell Biol., San Francisco 2000, Molec. Cell Biol. 11, Suppl., p. 130a, 2000 [9] Raddatz, S., Mark, E. P., Haking, A., Probst, W.,Wiessler, M., Trendelenburg, M.F., Troester, H.: Development of new marker compounds for the detection of chemical element labels by elelctron spectroscopic imaging (ESI). Microscopy & Microanalysis (2001), Vol. 7, Suppl. 2, pp.1038-1041. [10] Monteiro-Leal, L. H., Troester, H., Campanati, L., Spring, H., Trendelenburg, M.: A New Computerised Method of Multiple Labelling Detection and Particle Evaluation. Microscopy & Microanalysis (2002), Vol. 8, Suppl. 2 (in press) Patente: 1.(P:I) Synthese eines Bor-Konstrukts zur Markierung von Oligonukleotiden zur Markierung für die energiefilternde Transmissionselektronenmikroskopie M. Wießler, S. Raddatz (C0300), M.F. Trendelenburg, H. Tröster, E. Spiess (A0600) 2.(P:II) Elementardetektion im energiefilternden Elektronenmikroskop mit Hilfe eines Untergrundmarkers A. Haking, K. Richter (A0600) 3.(P:III) Selektive Kontrastoptimierung für hochauflösende Markerdetektion in biomedizinischen Ultradünnschnitten A. Haking, H. Tröster, K. Richter, M.F. Trendelenburg (A0600) 4.(P:IV) Ein molekularbiologischer Marker mit hochrepetitiven DNA-Elementen für die analytische Elektronenmikroskopie S. Bub, H. Tröster, K. Richter, A. Haking, E. Spiess, M.F. Trendelenburg (A0600) S. Raddatz, M. Wießler (C0300) DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 45 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung Strukturelle Genanalyse (A0601) Projektkoordination: M.F. Trendelenburg, H. Spring, L. Campanati-Araujo, L. Monteiro-Leal, A. Marques-Cianciarullo, M. Pelajo-Machado, H. Tröster, C. Crucifix, K. Schwab, R. Fischer 46 Zusammenarbeit mit: Intern: Prof. A. Alonso (F0500), Dr. M. Schmidt-Zachmann (A0100), Prof. M. Wießler (C0300), Prof. W. Schlegel (E0400), Dr. M. Pawlita (F0200), Prof. G. Sczakiel (F 0200) Extern: Dr. N. Angelier (CNRS/Univ. Paris, Frankreich) Prof. W. Ansorge, EMBL. Heidelberg,Prof. M. Hafner, (FH Mannheim) Dr. S. Fakan (Univ. Lausanne, Schweiz),Prof. Prof. O.L. Miller (Univ. Virginia, USA), Prof. P. Oudet, Dr. P. Schultz, (CNRS, INSERM, Univ. Strasbourg, Frankreich), Prof. O.V. Zatsepina (Moscow State University, Moskau, Russland), Prof. S. A. Gerbi (Brown Univ. Providence, RI, USA) 1. Hochauflösende Lichtmikroskopie transkriptionell aktiver Genbereiche und Transkripttransport aus dem Zellkern Das von G. Blobel vorgestellte ‘gene gating‘ Konzept und das von der Arbeitsgruppe Laemmli entwickelte Loop-Modell des Interphase-Chromatins stellen weiterführende Konzepte für die strukturelle Chromatinanalyse dar. In beiden Konzepten ist die räumliche Anordnung aktiver GenDomänen eine wesentliche Komponente. Für die direkte Sichtbarmachung aktiver Genbereiche im Zellkern - bisher vorwiegend mit Elektronenmikroskopie Verfahren untersucht - ergeben sich weitgehende Limitierungen: Zum Einen sind transkriptionell aktive Genbereiche meist von sehr elektronendichten Komponenten umgeben, so daß die eigentliche Gen- und Transkriptstruktur der direkten Beobachtung nicht zugänglich ist. Zum Anderen müßen die vergleichsweise geringen Größen der meisten Genabschnitte berücksichtigt werden. In Anlehnung an die bisher verwendete EM-Methodik haben wir für die Untersuchung der in situ Struktur und der räumlichen Gen-Anordnung im intakten Zellkern neuartige lichtmikroskopische Abbildungsverfahren verwandt: Durch Ausarbeitung auf die Videomikroskopie optimierter Präparationsbedingungen gelang es unserer Gruppe erstmals, transkriptionell aktive rDNA Gene in ihrem ‘nativen‘ d.h. hydratisierten Chromatinzustand darzustellen [6]. Durch Einsatz modernster Video Kamera Technologie können seit kurzem auch rasch ablaufende zelluläre Bewegungsprozesse bei hoher Auflösung dokumentiert werden [9]. Bezüglich der ultrastrukturellen Lokalisation definierter nukleolärer Proteine konnte - in Zusammenarbeit mit der A.v.H. Stipendiatin O. Zatsepina (Moskau) - ein neuartiger Ansatz entwickelt werden: Die extrem kompakte in situ Struktur der Nukleolen konnte erstmals vollständig in vivo dispergiert und die anschließende funktionelle Rekonstitution analysiert werden [6]. Durch das von uns entwickelte Verfahren zur hochaufgelösten Detektion unterschiedlich großer Nanogoldpartikel, wie Sie für die simultane EM Doppel-Immundetektion verwendet werden, kann die bisher vorwiegend durch Konfokale Fluoreszenzmikroskopie erfolgte Lokalisation mit entsprechenden EM Daten korreliert werden [1, 3,4,6,10]. A0600 Biomedizinische Strukturforschung 2. Strukturelle Untersuchungen zur Regulation der Transkription. Eines der sowohl molekularbiologisch als auch strukturell best untersuchten Gen-Systeme stellt das für ribosomale RNA (rRNA) kodierende rDNA Gen aus Xenopus laevis Oocyten dar. Unter Verwendung des oben beschriebenen Videomikroskopie Verfahrens an ‘nativen’ hydratisierten rRNA Genen konnte für die Regulation der Transkription dieser Gene eine erhebliche Diskrepanz in der Interpretation molekularbiologischer und struktureller Daten aufgeklärt werden. Das lange Zeit gültige Modell der Transkriptionskontrolle besagte folgendes: Die Transkription des 40 S pre-rRNA kodierenden Bereichs stoppt an der Stelle T1/T2 und nicht an der Terminationssequenz T3. Aus molekularbiologischen in vitro Untersuchungen war von mehreren Arbeitsgruppen das Modell einer konstitutiven Terminierung ausschließlich an der T3-Stelle postuliert worden, das eine vollständige Transkription des NTSrDNA-Bereichs voraussetzt. Unter Verwendung von Daten aus Videomikroskopie, Elektronenmikroskopie und S1 Transkript Analyse unter in vivo Bedingungen konnten wir zeigen, daß in vivo, tatsächlich an der Position T1/T2 korrekt und effizient terminiert wird [6]. Unsere gegenwärtigen Untersuchungen konzentrieren sich auf die folgenden Fragestellungen: 1. In situ Detektion der nukleolären DNA während unterschiedlicher Transkriptionszustände [1-3, 6]. 2. Ergänzung dieser Untersuchungen durch in situ Lokalisation der hauptsächlichen Komponenten des Transkriptionskomplexes, wie RNA-Polymerase I Partikel und ‘upstream binding factor’ (UBF) [3,6]. Aufgrund der kürzlich erzielten Fortschritte beim Phosphor-Mapping durch die analytische Elektronenmikroskopie (vgl. Abb.1) soll dieses Verfahren auch zur Phosphordetektion in naszierenden pre-rRNA Transkripten eingesetzt werden. [1,3,4,6]. 3. Analyse der Integration und Expression injizierter Gene während der Frühembryogenese. Mikroinjektionsexperimente unter Verwendung viraler und nicht-viraler DNA Sequenzen in Oocyten und/oder befruchtete Eizellen von Xenopus laevis bieten eine Vielfalt experimenteller Ansätze für detaillierte Untersuchungen zu Transkriptions-Kontrollfaktoren, Chromatin-Rekonstitution und Gen-Replikation]. Neben Mikroinjektionsexperimenten werden vermehrt Inkubationsexperimente unter Verwendung von Protein Extrakten aus Xenopus Eizellen für die experimentelle Analyse von Chromatin-Rekonstitution und DNA-Replikation verwendet. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von G. Sczakiel konnten wir einen neuartigen methodischen Ansatz zur spezifischen Selektion karyophiler DNA cis Elemente durch Mikroinjektion in Xenopus Oocyten entwickeln [8]. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die detaillierte Untersuchung der rDNA Topologie in intakten Oocyten Nukleolen. Ziel ist es, Veränderungen der rDNA Topologie mit dem Beginn der extrem hohen Transkriptionseffizienz dieser rDNA zu korrelieren. Durch einen kombi- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung nierten Einsatz von UV-Laser-Scan Mikroskopie, Elektronenmikroskopie und S1 Transkript Analyse, konnten wir zeigen, daß die beobachtete massive Umordnung der rDNA Anteile in den Oocyten Nukleolen korreliert ist einem plötzlichen Start der massiven pre-rRNA Transkription [6]. In weiterführenden Untersuchungen sollen derartige Lokalisationen [6] vergleichend auch für Nukleolen während der Xenopus Früh-Embryogenese durchgeführt werden. A0600 Biomedizinische Strukturforschung chungen unter Verwendung folgender EM-Techniken durchgeführt werden: Negativ-Kontrastierung, DNASpreitung, EM von Ultradünnschnitten inkl. Immuncytochemie. Publikationen(* = externe Koautoren) [1] Nehls, P., Keck, Th., Greferath, R., Spiess, E., Glaser, T., Rothbarth, K., Stammer, H., Werner, D.: cDNA cloning, recombinant expression and characterization of polypeptides with exceptional DNA affinity. Nucl. Acids Res. 26, 1160-1166, (1998) Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Haking A., Tröster, H., Richter, K., Crucifix, C., Spring, H., Trendelenburg, M.F. An approach to an objektive background substraction for elemental mapping with core-edges down to 50 eV: description, evaluation and application. Ultramicroscopy (1999) 80:163-182 [2] Crucifix, C., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Trendelenburg, M.F., Probst, W., Haking, A., Tröster, H.: Electron spectroscopic imaging (ESI) if viral DNA- and RNA-distribution using a new method of background substraction. Acta Microscopia (1999) 8, Suppl. B: VI-X [3] Tröster, H., Crucifix, C., Haking, A., Spring, H., Witz, J., Schultz, P., Pawlita, M., Raddatz, S., Wiessler, M., Probst, W., Trendelenburg, M.F., A Novel Concept for Application of EnergyFiltering Transmission Electron Microscopy in Biomedicine and Biotechnology in Perspective Imaging, 7th APEM Committee Singapore: Life Sciences, pp.127-130, Times Publ. Singapore 2000 [4] Hiller, S.A., Kabius, B., Probst, W., Tröster, H., Trendelenburg, M., Crucifix, C. Tröndle, A. Performance data of a new 2048 x 2048 pixel Slow-Scan CCD camera for TEM. Microsc. & Microanalysis 2000, Vol. 6, Suppl.. 2, pp. 732-735, 2000 [5] Tröster, H., Bub S., Hunziker, A., Trendelenburg, M.F. (2000): Stability of DNA repeats in Escherichia coli dam mutant strains indicates a Dam-methylation-dependent DNA deletion process. Gene 258: 95-08 (2000) [6] Trendelenburg, M. F., Spring, H. Haking, A., Tröster, H., Pawlita, H., Crucifix, C.: From Mille spreads to phosphorus maps of nucleoproteins: Transcription seen by complementary microscopies: EUREM 12, BRNO Czech Repubic, Vol. I, pp. B 283287, 2000 [7] Crucifix, C., Tröster, H., Pawlita, M., Witz, J., Haking, A., Spring, H., Troendle, A., Probst, W., Trendelenburg, M. F.: Viral vectors in gene therapy: Rapid screening of recombinant viral vector samples using genomic phosphorous (P)-map electron microscopic imaging [ESI]. 40th Annual Meeting Americ. Soc. Cell Biol., San Francisco 2000, Molec. Cell Biol. 11, Suppl., p. 130a, 2000 [8] Marcello, M., Fischer, R., Troester, H., Trendelenburg, M., Sczakiel, G.,: Selecting karyophilic DNA cis elements in Xenopus laevis oocytes: a new approach. Int. J. Dev. Biol. (2002), in press [9] Campanati, L., Holloschi, A., Troester, H., Spring, H., de Souza, W., Monteiro Leal, L.H.: Video-microscopy observations of fast dynamic processes in the protozoan Giardia lamblia. Cell Motility, 51, 213-224, (2002). [10] Monteiro-Leal, L. H., Troester, H., Campanati, L., Spring, H., Trendelenburg, M.: A New Computerised Method of Multiple Labelling Detection and Particle Evaluation. Microscopy & Microanalysis (2002), Vol. 8, Suppl. 2 , in press. Service Betriebs Einheit (A0603) Konventionelle Elektronenmikroskopie E. Spiess Für Service-Leistungen im Bereich der TransmissionsElektronenmikroskopie steht ein Transmissions-Elektronenmikroskop zur Verfügung. Hiermit können Untersu- Modellversuche zur Invasion und Metastasierung (A0602) F. Bestvater, E. Spiess In Zusammenarbeit mit: Dipl. Phys. T. A. Knoch, DKFZ; Dr. B. Werle, Med. Klinik und Poliklinik, Universität Heidelberg; Prof. Dr. W. Ebert, Thoraxklinik Rohrbach, Heidelberg; Dr. T. Porwol und Prof. Dr. H. Acker, MPI für Molekulare Physiologie, Dortmund; Dr. A.-R. Strohmaier, Nikon GmbH, Düsseldorf; Dr. T. Feurer, Institut für Quantenphysik und Optik, Universität Jena; Prof. Dr.T. Lah, National Institute of Biology, Ljubljana, Slowenien; Dr. J. Kos, KRKA, Nove Mesto, Ljubljana, Slowenien. Unterstützt durch Mittel der „Deutschen Krebshilfe“ und dem „Internationalen Büro des BMBF“ Cathepsin B Invasion von Zellen durch Gewebsgrenzen und intrazelluläre Räume ist ein in der Embryogenese und in der Homoeostase von höheren Organismen ein ständig wiederkehrender komplexer, in Raum und Zeit strikt programmierter Vorgang. Bei Tumorzellen kann diese Regulation ausfallen was schließlich zur Entstehung der Metastasen mit all ihren Komplikationen für das Überleben betroffener Patienten führen kann. Wichtige zelluläre Werkzeuge für invasive Prozesse sind Proteasen, über die extrazelluläre Matrix der Basalmembran und der interstitiellen Räumesoweit aufgelöst werden kann, daß Tumorzellen passieren können. Hierbei arbeiten mehrere Proteasen in einer Aktivierungskasade zusammen. Bestimmten Cathepsinen und den ihre Aktivität regulierenden Inhibitoren (Cystatine) kommt dabei möglicherweise eine Schlüsselfunktion zu als Aktivatoren anderer Enzyme bzw. direkt beim Abbau der extrazellulären Matrix. Diese Annahmen beruhen insbesonders auf einer erhöhten Aktivität des Cathepsin B in Tumoren und isolierten Tumorzellen. Dies ist inzwischen eine für zahlreiche Tumorarten beschriebene Erscheinung, so auch für Lungentumoren, wie unsere früheren Untersuchungen gezeigt haben. Die Frage, ob dieses Phänomen für klinische Zwecke genutzt werden kann, ist bereits in unseren vorangegangenen Untersuchungen angegangen worden. In einer ausgedehnten immunhistochemischen Studie haben wir jetzt belegt, daß Cathepsin B ein unhabhängiger prognostischer Faktor für die Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten mit Plattenepithelkarzinom ist: hohe Expression ist mit geringer Überlebenswahrscheinlichkeit korreliert[1]. Eine Kernfrage ist die Beteiligung der verschiedenen Zelltypen, die ein Tumor enthält, an der Produktion der Cathepsine. Dazu analysieren wir gegenwärtig routinemäßig anfallendes Schnittmaterial über Immunhistochemie und In-situ Hybridisierungstechniken mit Genson- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 47 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung den die Expression von Cathepsin B auf mRNA- und Proteinebene mit einem morphometrischen Verfahren. Dadurch werden Aussagen Zelltypspezifität und räumliche Muster der Expression in einem Tumor möglich. In Verbindung mit klinischen Daten soll darüber eine Verbesserung der Diagnosemöglichkeiten im Hinblick auf die Metastasierungskapazität von Tumoren erreicht werden [1]. 48 Die Untersuchungen auf zellulärer Ebene haben eine über die Lysosomen hinausgehende Lokalisation des Cathepsin B in Tumorzellen ergeben. Die dabei benutzten computergestützten mikroskopischen Aufnahme- und Auswerteverfahren haben wir weiter verfeinert [3]. Solche Untersuchungen wurden auf lebende Zellen ausgedehnt. Dies wurde durch die Kopplung autofluoreszierender Proteine (Green Fluorescent Protein = GFP) ermöglicht. Über die Transfektion einer Reihe unterschiedlicher Molekülvarianten des Cathepsin B in Tumorzellen untersuchen wir so gegenwärtig ihre Expression, ihre intrazelluläre Verteilung und ihre mögliche Funktion [4]. Zwei-Photonen Mikroskopie In den letzten 10 Jahren sind in der Fluoreszenzmikroskopie zahlreiche neue Verfahren eingeführt worden, die eine Untersuchung von Prozessabläufen in molekularen Dimensionen in lebenden Zellen erlauben. Dazu ghört die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM). Bei biologischen Proben ist dieSituation momentan noch durch einen Mangel an Grundwissen gekennzeichnet. In einer Kooperation mit Gruppen am MPI in Dortmund und der Universität Jena haben wir Absorptionsspektren und Emissionsspektren zahlreicher Fluorochrome vermessen, die für Physiologie, Zell-, und Entwicklungsbiologie bedeutsam sind. Diese Erkenntnisse führen zur Möglichkeit einer effektiven Vielfarben-Markierung zellulärer Komponenten und ihrer Abbildung. Mit der Abbildung 1 wird ein Doppelfärbung mit zwei unterschiedlichen „grün fluoreszeierenden Proteinen“, eGFP und eCFP, in lebenden Zellen vorgestellt. A0600 Biomedizinische Strukturforschung [2] Baumhäkel, J.-D.*, Kayser, K.*, Kalman, E.*, Kos, J.*, Lah, T.*, Spiess, E., Ebert, W.*, Fiehn, W.*, Werle, B.* (2001) Histological and thermodynamic features of cathepsin B-positive tumors of non-small cell lung cancer obtained by syntactic structure analysis. Electronic Journal of Pathology and Histology 7: 011-06. [3] Strohmaier, A.-R.*, Porwol, T.*, Acker, H.* Spiess, E. (2000) Three-dimensional organization of microtubles in tumor cells studied by confocal laser scanning microscopy and computer assisted deconvolution and image reconstruction. Cells Tissues Organs, 167, 1 - 8. [4] Bestvater, F., Knoch, T.A., Langowski, J., Spiess, E. (2002) Construct conversions caused by simultaneous cotransfection: „GFP-Walking“. BioTechniques 34, 720-729. Abbildung 1: Drei-dimensionale Rekonstruktion einer TPM Schnittserie durch lebende Lungentumorzellen. Eine Zelllinie welche konstitutiv die Histon-GFP Chimaere (H2A-eGFP) exprimiert, wurde mit einem Cytoplasma-Membranmarker (mem-eCFP) supertransfiziert. Aufgrund der hohen Auflösung erscheint die Zelloberfläche stark profiliert. Die Membran (grau) ist transparent abgebildet, so dass ein Blick auf die fein strukturierte Verteilung des Histon H2A (blau) im Kern der Zellen möglich wird. Das rekonstruierte Volumen beträgt 99x99x32 µm3. Publikationen (*externer Koautor) [1] Werle, B.*, Kraft, C.*, Lah, T.T.*, Kos, J.*, Schanzenbächer, U.*, Kayser, K.,* Ebert, W.*, Spiess; E. (2000) Cathepsin B in Infiltrated Lymph Nodes Is of Prognostic Significance for Patients with Nonsmall Cell Lung Carcinoma. Cancer 89, 2282-2291. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung A0700 Epigenetik Arbeitsgruppe Epigenetik (A0700) Leiter: Dr. Frank Lyko Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Susanne Lankenau (04/01-09/01) Dr. Joachim Marhold (12/01-) Doktoranden Regine Garcia Boy (03/01-) Frank Weißmann (05/01-) Charakterisierung methylierungsabhängiger Chromatinstrukturen in Drosophila J. Marhold, M. Zbylut, F. Lyko In Zusammenarbeit mit B. Mechler, DKFZ Technische Assistentin Tanja Musch (01/01-) Studenten Natascha Kunert (11/01-) Cora Mund (04/01-) Marcin Zbylut (01-10/01) Die epigenetische Regulation der Genexpression spielt eine zentrale Rolle in der Säugerentwicklung sowie in der Entstehung von Krebs. Die Forschungsaktivitäten der Arbeitsgruppe Epigenetik konzentrieren sich auf die zentralen epigenetischen Mechanismen, die epigenetische Programme etablieren und aufrechterhalten. Dies geschieht im wesentlichen durch DNA-Methylierung und bestimmte höhergeordnete Chromatinstrukturen. Diese Mechanismen werden in verschiedenen Modellorganismen untersucht. An zentraler Stelle steht dabei die funktionelle Charakterisierung von DNA-Methyltransferasen in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. In diesem System lassen sich wesentliche Aspekte der epigenetischen Regulation im Menschen in zahlreichen Details und mit hoher Effizienz untersuchen. Darüber hinaus werden auch die DNAMethylierungsmuster von Krebspatienten eingehend analysiert und Verbindungen zur spezifischen Inhibition menschlicher DNA-Methyltransferasen synthetisiert. Diese Projekte sollen die Entwicklung neuartiger Ansätze zur Diagnose und Therapie von Krebs erlauben. Methyl-DNA-bindende Proteine fungieren als Bindeglieder zwischen methylierter DNA und repressorischen Chromatinstrukturen. Wir verwenden mehrere Ansätze, um methylierungsabhängige Chromatinstrukturen in Drosophila zu untersuchen. Unsere Forschungsaktivitäten konzentrieren sich derzeit auf das dMBD2/3 Protein, das signifikante Homologien zu den methyl-DNA-bindenden Proteinen MBD2 und MBD3 aus der Maus aufweist [4]. Unsere Resultate haben gezeigt, dass dMBD2/3 hochspezifisch mit den Chromosomen interagiert. Diese Interaktionen werden nun genauer untersucht, um die genaue Funktion von dMBD2/3 und seiner Interaktionspartner aufzuklären. Von den Ergebnissen erhoffen wir uns wichtige Aufschlüsse über die Integration epigenetischer Signale während der Drosophila-Entwicklung. Funktionelle Charakterisierung des Drosophila dDnmt2-Gens N. Kunert, S. Lankenau, F. Lyko In Zusammenarbeit mit D. Lankenau, Universität Heidelberg Genomische DNA von Drosophila wird spezifisch während der frühen Embryonalentwicklung methyliert [3]. Die Sequenzierung des kompletten Drosophila-Genoms führte zur Identifikation des dDnmt2- Gens, das signifikante Sequenzhomologien mit funktionellen DNA- Methyltransferasen aufweist. dDnmt2 wird spezifisch während der frühen Embryonalentwicklung exprimiert, was mit dem beobachteten DNA-Methylierungsmuster übereinstimmt [2-4]. Um die Funktion der DNA-Methylierung in Drosophila aufzuklären, sollen mutante Allele des dDnmt2 Gens untersucht werden. Derartige Allele sind bislang noch nicht verfügbar und müssen deshalb erst hergestellt und isoliert werden. Dazu werden wir das dDnmt2 Gen durch die Insertion einer Markerkassette gezielt inaktivieren. Diese Experimente werden ergänzt durch die gezielte Überexpression von dDnmt2 in einem transgenen System. Die detaillierte Untersuchung mutanter Fliegen wird einen entscheidenden Beitrag zum funktionellen Verständnis der DNA-Methylierung für die Fliege leisten und auch Aspekte der Rolle der DNA-Methylierung im Menschen klären. Vergleichende Charakterisierung von DNAMethyltransferasen aus der Maus F. Weißmann, C. Mund, T. Musch, F. Lyko In Zusammenarbeit mit R. Paro, Universität Heidelberg und J. Walter, Universität des Saarlandes Im Rahmen einer vergleichenden Charakterisierung von DNA-Methyltransferasen haben wir transgene DrosophilaSysteme zur Überexpression aller bekannten Methyltrans- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 49 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung 50 ferasen aus der Maus etabliert. Dies erlaubt uns nun eine detaillierte Analyse ihrer biologischen Funktion. Beispielsweise führt die Überexpression der de novo Methyltransferase Dnmt3a zu schweren Entwicklungsstörungen in der Fliege. Diese Entwicklungsstörungen sind auf die Hypermethylierung des Genoms zurückzuführen. Unsere Experimente zeigen, dass die Hypermethylierung zu einem verzögerten Zellzyklus führt. Darüber hinaus konnten wir auch definierte strukturelle Chromosomenabnormalitäten sowie eine Fehlregulation der epigenetischen Histon-Modifikationen nachweisen. Diese Resultate zeigen, wie Zellen auf die Methylierung ihrer DNA reagieren. Damit können weit reichende Schlussfolgerungen bezüglich der molekularen Wirkungsweise von DNA-Methylierung und ihrer Rolle in der Krebsentstehung gezogen werden. Untersuchung der DNA-Methylierung in Tumorpatienten T. Musch, F. Lyko In Zusammenarbeit mit M. Wießler, DKFZ, A. Benner, DKFZ, und S. Stilgenbauer, Universität Ulm Die genomischen Methylierungsmuster von Tumoren unterscheiden sich erheblich von denen gesunder Gewebe. Da die DNA-Methylierung die epigenetische Programmierung der Genexpression reflektiert, würde ein Nachweis von tumorspezifischen DNA-Methylierungsmustern eine sehr frühe und präzise Krebsdiagnose erlauben. Die Untersuchung von genomischen DNA-Methylierungsmustern wird weiterhin durch die chemische Stabilität der Methylierung sowie durch die allgemein hohe Sensitivität der Nachweisverfahren erleichtert. In einer ersten Serie von Experimenten zur Untersuchung von Methylierungsmustern in Krebspatienten haben wir in Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Toxikologie die DNA-Methylierung von Leukämie (B-CLL)-Patienten untersucht. Die Ergebnisse führten zur Identifikation einer Subgruppe von Patienten bei denen verhältnismäßig starke DNA-Methylierung mit aggressiveren Krankheitsverlaufsformen assoziiert ist. Die Therapie dieser Patienten könnte möglicherweise mit Hilfe von Methyltransferase-Inhibitoren gezielt unterstützt werden. A0700 Epigenetik Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Biophysik verwenden wir deshalb 3-dimensionale Modelle von DNAMethyltransferasen zur Synthese neuer Inhibitor-Moleküle. Darüber hinaus derivatisieren wir das 5-aza-Cytidin (in Zusammenarbeit mit der Abteilung Molekulare Toxikologie) mit dem Ziel einer weniger toxischen Wirkweise. Die von uns hergestellten Substanzen werden dann in verschiedenen Testsystemen auf ihre Wirksamkeit hin untersucht. Positiv getestete Substanzen sollen schließlich die Grundlage für eine epigenetische Krebstherapie bilden. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] *Ramsahoye, B.H., *Biniszkiewicz, D., Lyko, F., *Clark, V., *Bird, A., *Jaenisch, R.: Non-CpG methylation is prevalent in ES cells and may be mediated by Dnmt3a. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 5237-5242. [2] Lyko, F., *Whittaker, A.J., *Orr-Weaver, T.L., and *Jaenisch, R.: The putative Drosophila methyltransferase gene dDnmt2 is contained in a transposon-like element and is expressed specifically in ovaries. Mech. Dev. 95 (2000) 215-217. [3] Lyko, F., *Ramsahoye, B.H., and *Jaenisch, R.: DNA methylation in Drosophila melanogaster. Nature 408 (2000) 538540. [4] Lyko, F. DNA methylation learns to fly. Trends Genet. 17 (2001) 169-172. Synthese neuartiger DNA-MethyltransferaseInhibitoren R. Garcia Boy, F. Lyko In Zusammenarbeit mit S. Suhai, und M. Wießler, DKFZ Die Hypermethylierung des Genoms stellt einen wichtigen Schritt in der Entstehung einer Vielzahl von Tumoren statt. Diese Hypermethylierung führt zu Epimutationen, die in einer Fehlsteuerung der epigenetischen Programmierung resultieren. Im Gegensatz zu genetischen Mutationen sind Epimutationen aber reversibel und können beispielsweise durch die Inhibition der DNA-Methylierung wieder ausgelöscht werden. Dies eröffnet völlig neuartige Möglichkeiten in der Krebstherapie. Leider ist der derzeit gebräuchlichste Inhibitor, das 5-aza-Cytidin, äußerst toxisch und kann daher nur in sehr beschränktem Maße eingesetzt werden. In DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung R0800 Zentrale Proeinanalytik Zentrale Proteinanalytik (R0800) Leiterin: Dr. Martina Schnölzer Analyse von Peptiden und Proteinen Wissenschaftl. Mitarbeiter Dr. Tore Kempf Dr. Ulrike Korf (09/00-03/01) T. Kempf, M. Schnölzer Gastwissenschaftler Dr. Andrea Urbani , Rom, Italien (07/01 -) Doktoranden Wilma Dormeyer (11/00 -) Technische Mitarbeiter Sabine Fiedler ( - 06/00, 03/01 - 4Std. pro Woche) Gerda Baumann (01/01 - ) Silke Klee (12/00 - 06/01) Das Hauptinteresse der Einheit „Zentrale Proteinanalytik“ gilt der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und ihrer posttranslationalen Modifikationen. Für die Analytik stehen der Einheit folgende Geräte zur Verfügung: ein MALDI-TOF-Massenspektrometer (Reflex II, Bruker), ein ESI-Iontrap-Massenspektrometer (LCQ, Thermo Finnigan) und ein Edman-Sequenzer (Procise cLC, Applied Biosystems). Mit Hilfe von Peptidmassenfingerprints und Sequenzinformationen werden die Proteine identifiziert. Die gewonnenen Informationen dienen als Grundlage für die Synthese von Peptiden und Oligonukleotiden, welche als Werkzeuge für weitere Studien eingesetzt werden können. Für Arbeitsgruppen innerhalb und außerhalb des DKFZ werden proteinanalytische Serviceleistungen erbracht. In Forschungskooperationen werden umfangreiche Projekte bearbeitet und neue analytische Verfahren entwickelt. Innnerhalb des angegebenen Zeitraums konnten auf verschiedenen Gebieten Ergebnisse erzielt werden. Neben der Identifizierung und Charakterisierung einzelner Proteine konnten Proteinmodifikationen lokalisiert werden. Im Rahmen weiterer Arbeiten konnten Proteininteraktionen funktionelle Bestandteile von Proteinkomplexen und Proteome analysiert werden. Identifizierung von Proteinen In Kooperation mit: T. Davis, Arizona Cancer Center, Tucson AZ, USA Alpha (6) Integrin ist ein Laminin Rezeptor mit einem Molekulargewicht von 140 kDa. Durch massenspektrometrische Analyse, Edman Sequenzierung und die Kombination beider Methoden konnte eine neue 70kDA Variante, das Alpha(6)p Integrin, identifiziert und charakterisiert werden. Die neue Variante konnte in verschiedenen Prostatakrebs- und in einer Lungenkrebs-Zellinie nachgewiesen werden und besitzt eine stark veränderte extrazelluläre Domäne [1]. In Kooperation mit: AM. Estevez, ZMBH, Heidelberg Das Hefe Exosom ist ein Komplex aus wenigstens 10 3’-5’ Riboexonukleasen. Exosomale Proteine, die in Eukaryonten bei der Reifung vieler RNA Species eine Rolle spielen, finden sich auch in dem einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei, der sich schon sehr früh in der Evolution von anderen Eukaryonten abgespalten hat. Es konnten 8 Proteine identifiziert werden, die zu exosomalen Proteinen aus der Hefe homolog sind. Doch nur einige von diesen sind in einem Komplex assoziiert. Entsprechend ist das Exosom in T. brucei kleiner. Für die Lebensfähigkeit von T.brucei sind sowohl komplexassoziierte als auch freie Homologe essentiell [2]. In Kooperation mit: M. Schmidt-Zachmann, DKFZ A0100 Das Protein NO145 konnte als Hauptkomponente des nukleolaren Cortex in Xenopus laevis Oocyten identifiziert werden. Es ist in einer käfigartigen Struktur rund um den Nukleolus lokalisiert. Während der Ausbildung des Eis kommt es zur spezifischen und schnellen Degradation des Proteins [3]. In Kooperation mit: J. Kuhn, Herz- und Diabetes Zentrum, Bad Oeynhausen Durch die Übertragung von UDP-Xylose auf ein Serin des Proteoglykan Core Proteins beta-D-Xylosyltransferase wird die Synthese von lateralen Glykosaminoglykanketten in Proteoglykanen angeschaltet. 11 Peptide, die in keiner Datenbank vorhanden waren, konnten sequenziert werden und dienten als Ausgangsbasis zur Produktion spezifischer Antikörper und zur Synthese spezifischer Oligonukleotide [4]. In Kooperation mit: D. Werner, DKFZ B0300 3 Proteine aus Proteinase K- und SDS- und Hochsalz-resistentem Chromatinmaterial konnten als die Serpine spi-1, spi-2 und spi-3 identifiziert werden [5]. In Kooperation mit: S. Schneider, J. Trotter, Universität Heidelberg Das Oberflächen-Glykoprotein AN2 wird in unreifen Schwannschen Zellen in vitro und in vivo exprimiert und wird herunterreguliert, wenn die Myelingene hochreguliert werden. Damit ist AN2 ein neuer Marker für die Abstammung von Schwannschen Zellen. Durch massenspektro- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 51 Forschungsschwerpunkt A Krebsentstehung und Differenzierung metrische Analysen konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem AN2-Glykoprotein aus Maushirn und NG2 Proteoglykan aus Ratte um homologe Proteine handelt [7]. A0700 Epigenetik Methodenentwicklung In Kooperation mit: T. Rabilloud, Grenoble, Frankreich Entwicklung einer Silberfärbemethode, die für den Einsatz in der Massenspektrometrie geeignet ist [13]. Interaktion von Proteinen In Kooperation mit: C. Mertens, I. Hofmann, DKFZ A0100 52 Plakophilin 1 und 2 werden in den meisten VertebratenZellen konstitutiv exprimiert. Sie treten in den zwei Splicevarianten a und b auf. Sie kommen im Zellkern und bei epithelialen Zellen an der Plasmamembran innerhalb der desmosomalen Plaques vor. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analyse konnten die Interaktionen von Plakophilin 1a mit intermediären Filamenten und mit Desmoplakin untersucht werden [6]. Als Interaktionspartner von Plakophilin 2 in Kernpartikeln wurden Untereinheiten der RNA Polymerase III und der Transkriptionsfaktor TFIIIB identifiziert [8]. Modifikation von Proteinen In Kooperation mit: R. Benavente, Universität Würzburg Lamin C2 wird während der Säuger Spermatogenese exprimiert und ist in der Kernhülle lokalisiert. Durch massenspektrometrische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der Aminoterminus von Lamin C2 durch Myristoylierung modifiziert ist. Deletion des aminoterminalen Glycins verhindert die Lokalisation an der Kernhülle [9]. Proteomanalyse In Kooperation mit: R. Hermann, R. Frank, ZMBH, Heidelberg Mycoplasma pneumoniae ist ein humanpathogenes Bakterium, dessen Genom 816 Kilobasenpaare umfasst und 688 offene Leseraster enthält. Mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischen Analysen konnte eine zweidimensionale Proteomkarte mit 350 Proteinen erstellt und diese 224 Genen zugeordnet werden [10]. In Kooperation mit: D. Schadendorf, DKFZ D0900, P. Sinha, Charité, Berlin Bei einem differentiellen Vergleich des Proteinmusters parentaler Melanomzelllinien mit daraus abgeleiteten chemoresistenten Zelllinien konnten Proteine identifiziert werden, die in chemoresistenten Melanomzelllinien überexprimiert waren [11]. Ein Vergleich des Proteinmusters parentaler humaner Magencarcinom Zelllinien mit daraus abgeleiteten thermoresistenten Zelllinien führte zur Charakterisierung thermoresistenzspezifischer Proteine [12]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Davis, T.L.*, Rabinovitz, I.*, Futscher, B.W.*, Schnölzer, M., Burger, F.*, Liu, Y.*, Kulesz-Martin, M.*, Cress, A.E.* (2001) Identification of a novel structural variant of the alpha 6 integrin. J. Biol. Chem. 276(28), 26099-106. [2] Estevez, A.M.*, Kempf, T., Clayton, C.* (2001) The exosome of Trypanosoma brucei. EMBO J. 20(14), 3831-3839. [3] Kneissel, S., Franke, W.W., Gall, J.G., Heid, H., Reidenbach, S., Schnölzer, M., Spring, H., Zentgraf, H., Schmidt-Zachmann, M.S. (2001) A Novel Karyoskeletal Protein: Characterization of Protein NO145, the Major Component of Nucleolar Cortical Skeleton in Xenopus Oocytes. Mol. Biol. Cell 12(12), 3904-3918. [4] Kuhn, J.*, Götting, C.*, Schnölzer, M., Kempf, T., Brinkmann, T.*, Kleesiek, K.* (2001) First Isolation of human UDP-D-Xylose: Proteoglycan Core Protein ß-D-Xylosyltransferase secreted from cultured JAR choriocarcinoma cells. J. Biol. Chem. 276(7), 49404947. [5] Rothbarth, K., Kempf, T., Juodka, B.*, Glaser, T.*, Stammer, H., Werner, D. (2001) Intracellular location and nuclear targeting of the Spi-1, Spi-2 and Spi-3 gene-derived serine protease inhibitors in non-secretory cells. Eur. J. Cell Biol. 80, 341-348. [6] Schneider, S.*, Bosse, F.*, D’Urso, D.*, Müller, H.W.*, Sereda, M.W.*, Nave, K.A.*, Niehaus, A.*, Kempf, T., Schnölzer, M., Trotter, J.* (2001) The AN2 protein is a novel marker for the Schwann cell lineage expressed by immature and nonmyelinating Schwann cells. J. Neurosci. 21, 920-933. [7] Hofmann, I., Mertens, C., Nimmrich, V., Schnölzer, M., Brettel, M., Herrmann, H. (2000) Interaction of plakophilins with desmoplakin and intermediate filament proteins: an in vitro analysis. J. Cell Sci. 113, 2471-2483. [8] Mertens, C., Hofmann, I., Wang, Z., Teichmann, M., Sepehri Chong, S., Schnölzer, M., Franke, W.W. (2001) Nuclear particles containing RNA polymerase III complexes associated with the junctional plaque protein plakophilin 2. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98(14), 7795-800. [9] Alsheimer, M.*, Glasenapp, E. v.*, Schnölzer, M., Heid, H., Benavente, R.* (2000) Meiotic lamin C2: The amino-terminal hexapeptide is myristoylated and essential for the nuclear envelope association. 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Herwig Ponstingl 06221 42-3408, FAX 06221 42-3460 e-mail: [email protected] Biochemie der gewebsspezifischen Regulation (B0500) Prof. Dr. rer. nat. Friedrich Marks 06221 42-4531, FAX 06221 42-4406 e-mail: [email protected] Differenzierung und Carcinogenese in vitro (B0600) Prof. Dr. med. Norbert Fusenig 06221 42-4507, FAX 06221 42-4551 e-mail: [email protected] Tumorbiochemie (B0700) Prof. Dr. med. Dietrich Keppler 06221 42-2400, FAX 06221 42-2402 e-mail: [email protected] Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) Dr. rer. nat. Peter Angel 06221 42-4570, FAX 06221 42-4554 e-mail: [email protected] Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) PD Dr. rer. nat. Petra Boukamp 06221 42-4516, FAX 06221 42-4551 e-mail: [email protected] Zentrale Spektroskopie (R0400) William E. Hull PhD 06221 42-4515, FAX 06221 42-4554 e-mail: [email protected] Im Zentrum der Arbeit des Forschungsschwerpunktes Tumorzellregulation steht der Prozess der zellulären Signalübertragung und -verarbeitung. Eine Schlüsselreaktion der zellulären Signalverarbeitung ist die Proteinphosphorylierung. Die dabei beteiligten Enzyme, die Proteinkinasen und Phosphatasen, werden von mehreren Abteilungen untersucht. Auch das Gebiet der Lipidmediatoren, die nahezu jeden zellulären Prozess beeinflussen, werden von mehreren Abteilungen des Schwerpunktes bearbeitet. Die für die Biosynthese von Lipidmediatoren verantwortlichen Enzyme werden zunehmend als Angriffspunkte für krebsverhütende Ansätze diskutiert. Einen speziellen Aspekt der zellulären Signalübertragung stellen Transportkomplexe dar, die u.a. auch für das Ausschleusen von Giftstoffen aus der Zelle verantwortlich sind und deren Überaktivierung eine Ursache für die in der Klinik so gefürchtete Resistenzentwicklung von Tumoren gegen Chemotherapeutika sein kann. Grundlegende Eigenschaften dieser Transportkomplexe sowie Aspekte der sogenannten Multidrogenresistenz werden in mehreren Abteilungen des Schwerpunktes untersucht, wobei das vordringliche Ziel die therapeutische Überwindung der Zytostatikaresistenz darstellt. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeiten konzentriert sich auf die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen der Zell-Zell und Zell-MatrixWechselwirkungen und ihrer Rolle in der normalen Geweberegeneration sowie der Tumorentstehung und Progression. Funktionelle Analysen von Transkriptionsfaktoren in genetisch veränderten Mäusen und Zellkultursystemen sind ein weiterer wichtiger Bestandteil des wissenschaftlichen Programms des Forschungsschwerpunktes. Die Abteilung Pathochemie befaßt sich mit folgenden Aspekten der zellulären Signaltransduktion: (1) Molekulare Mechanismen und funktionelle sowie strukturelle Konsequenzen von Proteinphosphorylierung/Dephosphorylierung; (2) Mechanismen der Katalyse, Regulation und Hemmung von Proteinkinasen mit dem Ziel der Entwicklung und Verbesserung klinisch anwendbarer Proteinkinase-Inhibitoren; (3) Struktur und Dynamik aktuell interessanter Proteindomänen, speziell die Wechselwirkung des HIV Glykoproteins 120 (gp 120) mit dem T-Zellrezeptor CD4, mit dem Ziel, diese zu hemmen. Hier befinden sich HIV-Hemmstoffe zu therapeutischen Zwecken in Entwicklung. Die Arbeiten der Abteilung Biochemie der Zelle zielen auf die Analyse von zellulären Strukturen und Ereignissen, die für die Proliferation von Zellen von Bedeutung sind. Hierzu gehören die Identifizierung und die molekulare Charakterisierung von Proteinen, die am Proliferationsprozess beteiligt sind oder Bestandteile von Zellzyklus-relevanten Zellstrukturen sind. Dabei gilt das Hauptinteresse den Proteinen des Centrosoms und den chromosomalen Verpakkungsproteinen vom Nicht-Histon-Typ. Der Leiter Prof. Werner ging 2001 in Ruhestand. Weitergeführte Arbeiten gelten der zellbiologischen und funktionellen Identifizierung, Analyse und Revertierung DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 53 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation von Zytostatikaresistenz, auch im Rahmen klinischer Kooperationen. 54 Die Abteilung Biochemie der gewebsspezifischen Regulation untersucht die molekularen Mechanismen der Tumorentwicklung. Ab März 2002 ist sie auf zwei Arbeitsgruppen aufgeteilt. Die Arbeitsgruppe Differenzierung normaler und neoplastischer Epidermis untersucht die Differenzierungswege des menschlichen Haarfollikels, des größten und komplexesten Anhangsorganes der Epidermis. Die Untersuchungen konzentrieren sich auf die Differenzierung des Follikels unter normalen Bedingungen, und schließen die Veränderungen bei erblichen Haaranomalien sowie bei der Entstehung haarfollikel-abgeleiteter Tumoren ein. Als Differenzierungsmarker dienen die epithelialen Keratine, die Haarkeratine, sowie ihre assozierten Proteine. Die Arbeitsgruppe Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung untersucht molekulare Mechanismen der Eicosanoidwirkung in einfachen und stratifizierten Epithelien des Menschen und der Maus. Insbesondere interessieren in diesem Zusammenhang die physiologische Wundheilung, pathologische, entzündlich-degenerative Erkrankungen und die Entwicklung von Haut-, Brust- und Pankreastumoren. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen, den Schlüsselenzymen der Eicosanoidbiosynthese, deren Expression und Aktivität bei diesen Prozessen transient oder permanent gestört ist sowie auf Eicosanoid-abhängige Genexpressionsmuster. Darüber hinaus werden Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen auf ihre Eignung als Zielproteine für chemopräventive Maßnahmen geprüft. Die Untersuchungen der Abteilung Differenzierung und Carcinogenese konzentrieren sich auf Fragen zum molekularen Mechanismus der Zell-Zell Interaktion in der normalen Haut und ihrer Veränderungen im Rahmen der Hautcarcinogenese, insbesondere zur Tumor-StromaWechselwirkung. Im Rahmen der Untersuchungen von Epithel-Mesenchym-Wechselwirkungen bei der Geweberegeneration konnte ein neuer Mechanismus wechselseitiger Regulation über die Induktion parakriner Faktoren aufgezeigt werden. Die Detailanalyse dieser Steuerungsmechanismen und ihrer zunehmenden Entgleisung bei der Tumorprogression soll helfen, das autonome Wachstum von Tumorzellen in vivo besser verstehen und beinflussen zu können. An einem von uns entwickelten Hautcarcinogenese-Modell wird die Wachstumsregulation und TumorStroma-Wechselwirkung an verschiedenen Tumor-Entwicklungsstadien an Transplantations- und ZellkulturModellen untersucht. Derzeit im Vordergrund stehen Arbeiten zum Mechanismus der Tumor-Angiogenese und deren Blockade als Tumor-therapeutisches Prinzip. Diese neuen Tumortherapieverfahren werden in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen und Industriefirmen mechanistisch analysiert und für den praktischen Einsatz vorbereitet. Das Forschungsprogramm der Abteilung Tumorbiochemie konzentriert sich auf die molekulare und kinetische Charakterisierung von Membrantransportern. Die Hemmung von Transportern der MRP-Familie, die für eine Übersicht Mehrfachresistenz gegen Zytostatika verantwortlich sind, ist ein wichtiges Ziel bei der Verbesserung der klinischen Chemotherapie von Tumoren. Die Produkte von Resistenz-Genen und die Produkte der MRP-Genfamilie, welche mehrere Konjugat-Exportpumpen normaler und maligner Zellen umfaßt, werden nach gezielter Mutagenese mit zellbiologischen und transportkinetischen Methoden untersucht. Die Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung von Membrantransportern umfaßt auch Proteine, die für die Aufnahme physiologischer und zytotoxischer Substanzen in die Zelle verantwortlich sind und zur Familie der „organic anion transporting polypeptides“ (OATPs) zählen. Die Abteilung Molekulare Biologie der Mitose hat sich zum Ziel gesetzt, molekulare Mechanismen nachzuweisen, die den Ablauf von Zellteilungen regeln, ihre Störungen in Tumoren aufzuklären und neue Wege zur therapeutischen Hemmung unkontrollierter Zellteilungen zu finden. Den Schwerpunkt dieser Arbeiten bildet die Analyse des sogenannten RCC1-Ran-Regulationsweges (RCC = regulator of chromosome condensation). Dieser Signalübertragungsweg ist an der Kontrolle der DNA-Replikation und der Zellteilung sowie am Kerntransport von Proteinen und an der Prozessierung von mRNA beteiligt. Die Klärung der Regulationsmechanismen sowie ihrer Störungen soll dazu beitragen, Möglichkeiten zur gezielten Hemmung dieses Regulationsweges zu finden. Die Projektgruppe Biochemische Zellphysiologie arbeitet an der Aufklärung von Pathomechanismen proliferativer Prozesse. Zum einen werden Mechanismen untersucht, die durch Proteinkinase CK2 (Caseinkinase II) kontrolliert werden, einer lebenswichtigen, hoch konservierten Phosphotransferase, die an Signalvorgängen und Genexpressionen beteiligt und deren ungestörte Gegenwart Voraussetzung für das (Wieder)Eintreten von Zellen in den Zellzyklus ist. Insbesondere wird systematisch und genomumfassend nach Genen gesucht und ihre funktionelle Bedeutung charakterisiert, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die mit dem Auslösen der Zellproliferation verknüpft ist. Um zu erfahren, wie der Kontrolleur selbst kontrolliert wird, werden molekularphysiologisches Verhalten der CK2 sowie Struktur und Transkriptionskontrolle der CK2-kodierenden Gene analysiert. Zum anderen hat die Gruppe mit Untersuchungen zur zellulären und molekularen Biologie normaler und entarteter Knochenzellen begonnen und versucht mittels Chips-basierter Verfahren Gene zu identifizieren und in ihren zellulären Rollen zu charakterisieren, deren Expression mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen und Knochenschmerz korrelieren. Damit sollen Ansatzpunkte für individualisierte Diagnose- und Therapieverfahren gefunden werden. Die Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle untersucht die Mechanismen der Signalübertragung von physiologischen und pathologischen extrazellulären Signalen (Strahlung und andere genotoxische DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Übersicht Substanzen mit kanzerogenen oder tumorpromovierenden Eigenschaften) und die dadurch ausgelösten Veränderungen in der Expression spezifischer Gene. Die Arbeiten konzentrieren sich auf die Funktion und Regulation von Untereinheiten des Transkriptionsfaktors AP-1 (Fos/Jun) und der Identifizierung und funktionellen Analyse von AP-1 Zielgenen durch Genom-weite Expressionsanalyse. Es werden sowohl genetisch veränderte Mäuse (transgene und knockout Mäuse) als auch davon abgeleitete in vitro Zellkultursysteme eingesetzt, um die spezifische Funktion dieser Untereinheiten bei der Zellproliferation, Transformation, Apoptose, Embryonalentwicklung, Angiogenese und Regeneration der Haut aufzuklären. Durch die Etablierung krankheitsrelevanter Tiermodelle und davon abgeleitete in vitro Systeme versuchen wir die molekularen Ereignisse der Krebsentstehung auf der Ebene der Genregulation zu verstehen. Seit Oktober 1999 ist der Abteilung eine selbständige Arbeitsgruppe Hormonwirkung und Signaltransduktion angegliedert, die von Frau PD Dr. Doris Mayer geleitet wird und sich mit dem Einfluß von Steroidhormonen auf die Entstehung von Tumoren befaßt. Das Ziel der neu gegründeten Abteilung Genetik der Hautcarcinogenese ist, genetische Veränderungen zu identifizieren und funktionell zu charakterisieren, die bei der Entwicklung von UV-bedingten Hautcarcinomen eine Rolle spielen. In der dem Forschungsschwerpunkt angegliederten Zentralen Spektroskopie (ZS) wird, neben der routinemäßigen analytischen Dienstleistung (Aufklärung von Molekülstrukturen mittels Kernspinresonanz (NMR), Massenspektrometrie (MS) sowie IR- und UV-Spektroskopie), an der Entwicklung und Anwendung neuer Analyse-Verfahren in der Krebsforschung gearbeitet. Die Schwerpunkte der MSAnwendungen sind Phospholipid-, Protein- und Peptidanalytik. Mit der MR-Spektroskopie bzw. Hochfeld-MRBildgebung in vivo werden u.a. Pharmakokinetik, Tumormetabolismus und Metastasenwachstum untersucht. Im Bereich „molecular modeling“ wird ein über das Internet benutzbares Informationssystem bereitgestellt und Untersuchungen zur Konformation und Dynamik von Oligosacchariden und Glykoproteinen, sowie über denen Wechselwirkungen werden durchgeführt. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 55 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0100 Pathochemie Abteilung Pathochemie (B0100) Leiter: Prof. Dr. Volker Kinzel Proteinkinasen der Zelloberfläche und extrazelluläre Proteinphosphorylierung Senior Wissenschaftler Dr. Dirk Bossemeyer PD Dr. Dieter Kübler Prof. Dr. Jennifer Reed D. Kübler, D. Gosenca In Zusammenarbeit mit Prof. I. Friedberg, Universität Tel Aviv, Israel; W.D. Lehmann, M. Wind, H. Heid, DKFZ Zusatzfinanzierung: DKFZ-Israel Kooperation Post-docs Dr. Michael Gaßel (01-) Dr. Dan Mihailescu (00Gastwissenschaftler Dr. Saturnino Herrero (01-) 56 Doktoranden Karin Bettinger (01-) Frank Gesellchen Darko Gosenca Anna Lisa Picciolo (- 00) Andreas Schlosser (zusammen mit R0400) Thorsten Schneider (- 01) Techniker/innen Hannelore Horn (1/2) Norbert König James Richards Ursula Stanior Die Abteilung befaßt sich mit molekularen Aspekten der zellulären Signaltransduktion: - mit Liganden/Rezeptor-Wechselwirkungen, der Steuerung des Zellzyklus durch exogene Faktoren und schwerpunktmäßig - mit Proteinkinasen, deren Hemmung und Aspekten der Proteinphosphorylierung. Die reversible Proteinphosphorylierung ist ein universelles Werkzeug zur schnellen Steuerung der biologischen Aktivität von Proteinen. Auch beim Wachstum von Krebszellen spielt sie eine große Rolle. Das Verständnis dieser Reaktion erfordert die Kenntnis der für Proteinphosphorylierung verantwortlichen Schlüsselenzyme - der Proteinkinasen - auf molekularer Ebene bis hin zu ihrer Regulation, Funktion und Hemmung bei der lebenden Zelle. Proteinkinase-Hemmstoffe werden bereits zur Therapie verschiedener Krebsformen eingesetzt. Überraschend wenig ist über die reversiblen Konsequenzen der Proteinphosphorylierung für die Struktur von Peptiden bekannt. Als Beitrag dazu interessieren uns Teilaspekte, die sich z.B. aus dem Vergleich von Dephosphound Phosphopeptiden ergeben. Um eine ebenfalls reversible Strukturveränderung bei Peptiden und dafür verantwortliche Faltungsmotive geht es in einem HIV-Projekt, bei der Milieu-bedingte Veränderungen, wie sie bei LigandenRezeptor-Wechselwirkungen stattfinden, eine Rolle spielen. An Zellentwicklung und Einbindung in die zelluläre Umgebung sind enzymatische Aktivitäten der Zelloberfläche beteiligt. Durch diese Enzyme können sowohl gebundene Substrate auf der Zelloberfläche als auch fremde Substrate aus der Zellumgebung verändert werden. Die von uns in den letzten Jahren an vielen Zellen nachgewiesenen Ser/Thr Proteinkinasen an der Zelloberfläche (Ekto-PK) besitzen Eigenschaften cAMP-abhängiger PK (PKA) und von Proteinkinasen CK1 und CK2. Ekto-CK1 und CK2 können im Tandem von intakten Zellen in das extrazelluläre Kompartiment freigesetzt werden, womit der Wirkungsbereich der enzymatischen Aktivität erweitert ist. Ekto-PK ermöglichen es Zellen, Substratproteine in ihrer biologischen Wirkung spezifisch zu verändern. Damit zeigen unsere Befunde, dass das mächtige Werkzeug der Proteinphosphorylierung auch außerhalb der Zellen genutzt wird und als Mechanismus der extra-intrazellulären Signalvermittelung wirkt. Eine inzwischen große Zahl von Literaturdaten zu normalen und maligne veränderten Prozessen unterstreicht diese zentrale Rolle extrazellulärer Proteinphosphorylierung. Ekto-PK und ihre Substrate bieten somit vermutlich wichtige pharmakologische und therapeutische Ziele. Ekto-PK-Substrate der Zelloberfläche können mittels radioaktiver Markierung sichtbar gemacht werden. und zeigen sich nach SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie als Zelltyp-spezifische Spektren von Phosphoproteinen. Einzelne dieser Ekto-Substrate sind relativ hoch markiert und kommen häufig bei Zellen vor. Durch biochemische und immunologische Analysen einschließlich Mikrosequenzierung und Massenspektroskopie-Daten ist es uns gelungen, pp120 als ein weiteres dieser stark phosphorylierten Zelloberflächenproteine zu charakterisieren [1]. Es wurde als Homologes eines bisher nur intrazellulär (besonders im Nukleolus) nachgewiesenen Proteins enttarnt. Die funktionelle Charakterisierung dieses sowie anderer Ekto-Substrate, die Mechanismen ihrer Expression als Zelloberflächenproteine und vergleichende Untersuchungen an Normal- und Tumorzellen sind Ziele laufender Arbeiten. Zu den Substraten der Ekto-PK gehören Moleküle mit unterschiedlichen Funktionen wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Entzündungsmediatoren oder Komponenten der extrazellulären Matrix. In Zusammenarbeit mit I. Friedberg (Tel Aviv) wurden Untersuchungen zur Funktion von extrazellulären Nukleotiden (ATP) als Zellproliferationshemmer von transformierten und Tumorzellen durchgeführt. Die ATP-induzierte Zellwachstumshemmung korreliert mit der Inaktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptor gekoppelter DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Tyrosinkinase-Aktivität und nachgeschalteter Signalwege. Die durch Ekto-PK katalysierte Phosphorylierung eines extrazellulären kleinen Proteins, das als Abkömmling eines Plasma-Glykoproteins identifiziert wurde, ist für die Zellwachstumshemmung entscheidend. Untersuchungen zur Herstellung dieses Wachstumsinhibitors aus Vorstufen, seine (Phospho-)Aktivierung sowie die Suche nach Rezeptoren auf Zielzellen und nachgeschalteter Signalwege sind Schwerpunkte für das Verständnis der Mechanismen der ATP-induzierten Tumorzellhemmung. Bioregulation der cAMP-abhängigen Proteinkinase D. Bossemeyer, S. Herrero de Vega, M. Gassel, N. König, V. Kinzel In Zusammenarbeit mit Dr. R.A. Engh, Roche-Diagnostics Penzberg; Prof. Dr. R. Huber und Dr. T. Holak, MPI für Biochemie, Martinsried; Prof. Dr. F.W. Herberg, Ruhruniversität Bochum; W.-D. Lehmann, A. Schlosser, DKFZ Zusatzfinanzierung: Roche-Diagnostics, Penzberg Die Mehrzahl aller menschlichen Krebserkrankungen und viele andere Krankheiten sind eng mit der Fehlregulation von Proteinkinasen verknüpft. Proteinkinasen als zentrale Schalter der zellulären Regulation und Signaltransduktion phosphorylieren Proteine, wodurch deren Funktionszustand reversibel geändert wird. Der Grundzustand der meisten Proteinkinasen ist allerdings der der Inaktivität, ihre pathologischen Wirkungen resultieren in der Regel aus ihrer Überexpression oder Daueraktivierung. Hemmstoffe für die Aktivität von Proteinkinasen sind daher äußerst vielversprechende Agenzien in der Tumortherapie mit z. t. überwältigenden therapeutischen Erfolgen bei nur geringen Nebenwirkungen. Dies zeigt eindrucksvoll das Beispiel des Proteinkinaseinhibitors STI571 (Gleevec) bei der Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie. Dieser wurde auf der Basis der Struktur der ATP-Bindestelle von Proteinkinasen, wie sie von uns für die cAMP-abhängige Proteinkinase 1993 mit als erstes vorgelegt wurde, maßgeschneidert. Ein großes Hindernis bei der strukturbasierten Entwicklung von selektiven Proteinkinaseinhibitoren ist der Mangel an Kristallstrukturen therapeutisch relevanter Proteinkinasen. Von den über 600 verschiedenen Proteinkinasen des menschlichen Genoms sind bisher noch nicht einmal 5% kristallisiert. Die Arbeitsgruppe versucht daher, auf zwei Wegen räumliche Strukturinformationen von Proteinkinasen für die Inhibitorentwicklung zu gewinnen. Der direkte Weg führt über die rekombinante Expression, Reinigung und Kristallisation von Proteinkinasen, z. Z. überwiegend aus der Gruppe der AGC-Kinasen, zu der u. a. so wichtige Vertreter wie PKA, PKC, PDK1, PKB gehören. Hierzu werden sowohl bakterielle als auch eukaryontische (Insektenzell-) Expressionsysteme eingesetzt. Der indirekte Weg führt über die katalytische Untereinheit der PKA. Kokristallisationsstudien mit Proteinkinaseinhibitoren lassen Rückschlüsse darauf zu, welche Faktoren und Eigenschaften für die Bindung von Inhibitoren eine Rolle spielen [2]. Hierzu wurden von uns schon in der Vergangenheit eine Reihe von Kristallstrukturen von Proteinkinase/Inhibitorkomplexen veröffentlicht. Wegen der Abteilung B0100 Pathochemie hohen Konserviertheit des katalytischen Kerns von Proteinkinasen lassen sich bestimmte Eigenschaften und strukturelle Charakteristika anderer, verwandter Kinasen durch gerichtete Mutagenese von PKA nachahmen (dabei entstehen sogenannte Surrogatkinasen). Dieser Weg bietet den Vorteil der leichten Gangbarkeit, da für PKA vielfältige Aktivierungs- Reinigungs- und Kristallisationssysteme entwickelt wurden, die sich längst im Routineeinsatz bewährt haben. Um eine möglichst breite und solide Basis für die Entwicklung neuer Hemmstoffe zu schaffen, versuchen wir darüber hinaus, die strukturellen und funktionellen Mechanismen der Katalyse und der zellulären Inaktivierungsprozesse von Proteinkinasen zu verstehen. Hierzu kombinieren wir strukturelle Analysen [3], gerichtete Mutagenesen von ausgewählten Aminosäureresten und konservierten Strukturelementen und funktionelle sowie kinetische Studien, z. B. mittels Surface Plasmon Resonanz. Ein natürlicher Regelmechanismus von Proteinkinasen führt über die Phosphorylierung dieser Enzyme. PKAc z. B. verfügt, je nach Isoform, über mindestens 4 Phosphorylierungsstellen. Mit diesen Phosphorylierungen haben wir uns in einer Reihe von massenspektrometrischen Untersuchungen beschäftigt [4,5]. Außerdem gelang es uns, die unterschiedlichen strukturellen Eigenschaften dieser Phosphorylierungsstellen mittels NMR-Spektroskopie zu verstehen [6]. Die Wirkung zahlreicher Hormone wird über Änderungen des intrazellulären cAMP-Spiegels vermittelt. Hauptwirkort dieses sekundären Botenstoffes ist ein einziges Enzym, PKA. Die vielfältigen und für das jeweilige Hormon spezifischen zellulären Antworten lassen sich nur durch subzellulär unterschiedliche Verfügbarkeiten und individuell besondere Eigenschaften von PKA und PKA-Isoenzymen erklären. Genetisch kennt man Cα, Cβ, Cγ, sowie Cβ2 (entdeckt und kloniert in der Abteilung), und einige andere Splicevarianten. Cβ2 ist insofern ungewöhnlich, als es eine aminoterminale Extradomäne aufweist. Gegenwärtig untersuchen wir die Rolle von Cβ2 und seiner Extradomäne im Hinblick auf biochemische und biologische Wirkungen, wie Regulation, Protein-Proteinwechselwirkung, Translokation und Substraterkennung. Wir haben gefunden, dass Cβ2, welches ubiquitär in Säugern und auch in Vögeln vorkommt, funktionell einen Mangel an Cα ausgleichen kann [7]. Auf der Proteinebene wurden zwei isoelektrische Ladungsvarianten der Proteinkinase A detektiert und in der Abteilung charakterisiert. Dies führte zur Entdeckung einer konservierten in vivo Deamidierungsstelle am Aminoterminus aller myristoylierten PKAc Isoformen, möglich nur unter Einsatz massenspektrometrischer Techniken, wie bereits zuvor publiziert. Unser Verständnis der funktionellen Rolle dieser Deamidierungsstelle beginnt sich aus der Untersuchung lebender Zellen abzuzeichnen. Die intrazelluläre Verteilung und Lokalisation wird demnach in hohem Maße durch diese posttranslationale Modifikation bestimmt. Als Folge wird die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors CREB (cAMP-responsive element binding protein) durch PKA beeinflusst. Darüber hinaus wurde der eigentliche Prozess der Deamidierung von PKA, der von DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 57 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Razemisierungen begleitet wird, von uns bis ins Detail untersucht [8,9,10,11]. wirkungen im allgemeinen betrifft, zum anderen, wie posttranslationale Strukturveränderungen die biologische Aktivität beeinflussen. Kontrolle des Zellzyklus am G2/Mitose Übergang Der Konformations-Schalter im HIV1 Hüllprotein V. Kinzel, N. König, J. Richards In Zusammenarbeit mit W. D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind DKFZ 58 Abteilung B0100 Pathochemie Bei vielzelligen Organismen wird die Vermehrung der Zellen durch meist reversible Hemmung an physiologischen Restriktionspunkten im Zellzyklus, teils in G0, teils in G2 Phase vor der Zellteilung (Mitose, M) kontrolliert. ProteinPhosphorylierungs- und Dephosphorylierungsvorgänge spielen dabei eine Schlüsselrolle und damit implicite die dafür verantwortlichen Katalysatoren, Proteinkinasen und Proteinphosphatasen. Die Kenntnis deren Regulation auf molekularer Ebene ist daher Voraussetzung für das Verständnis der normalen sowie der gestörten Zellzykluskontrolle. Wir befassen uns mit der Regulation der Proteinphosphatase 2A (PP2A) am Übergang von G2 Phase in die Mitose. Dazu gab es bisher in der Literatur nur indirekte Hinweise. Es gelang erstmals, die Hemmung der PP2A am G2-M Übergang und in Mitose direkt zu zeigen [Klingler M. Dissertation 1999]. Vermutlich wird dabei die katalytischen Untereinheit der PP2A (PP2Ac) phosphoryliert , wie mit Antikörpern erhaltene Befunde andeuten. Der Befund dieser Gruppe, daß die CD4 Bindungsdomäne des Glykoproteins gp120 von HIV1 einen konservierten Konformations-Schalter enthält, d.h. einen Abschnitt, der eine kooperativen Umfaltung von einer β-Struktur zu einer 310 Helix bei Membranbindung erfährt, ermöglichte zwei Ansätze für eine neue Form anti-viraler Therapie. Beide zielen auf die Blockade des initialen Infektionsschrittes, der Bindung des Virus an den CD4 Rezeptor von Wirtszellen. Die Tatsache, daß die kooperative Umfaltung der Schalterdomäne absolut nötig ist zur Bindung an CD4, führte zur Suche nach Verbindungen, die diese Kooperativität hemmen. Die Suche war erfolgreich. Diese Substanzen verhindern in der Tat die Rezeptorbindung des gp120 Fragments an CD4 exprimierende Zellen. Im Zuge der Verfeinerung mit Hilfe von QSAR und Molekülmodellierung wurden Umfalt-Hemmer hergestellt mit einer ID50 im niedrigen nanomolaren Bereich, die auch nicht toxisch waren in Zellkulturen. An diesem Punkt schien das Projekt reif für eine industrielle Weiterentwicklung, die mit einer Steinbeis GMBH eingeleitet wurde (Transferzentrum für angewandte Biologische Chemie und Transferzentrum Glykoconjugate). In Zusammenarbeit mit: Prof. J.C. Smith, Universität Heidelberg, Prof. Dr. Langosch, Technische Universität München Zusatzfinanzierung: HGF Strategiefond, VW-Stiftung Das hohe Maß der Konservierung der Faltungseigenschaften der CD4 Bindungsstelle von gp120 - trotz einer erheblicher Sequenzvariabilität - eröffnet zusätzlich einen neuen immunologischen Ansatz. Die Strategie besteht in der präzisen Bestimmung des Peptid-Rückgrats dieser Domäne in freier, d.h. nicht an CD4 gebundener Form. Die diversen Aminosäuresequenzen in diesem Bereich der verschiedenen HIV1 Stämme kann dann auf die konservierte Rückgratstruktur aufmodelliert und die so erzeugten, Molekül-Oberflächen auf Ähnlichkeiten bezüglich der Ladungsverteilung, Hydrophobizität, sterische Charakteristika etc. überprüft werden. Sofern sich dann Regionen mit konservierten Oberflächeneigen-schaften identifizieren lassen, könnten sie als Schablone zur Herstellung eines Antigens dienen, das eine vom Virus-Stamm unabhängige Immunantwort auslösen kann. In jüngster Zeit wurde immer deutlicher, daß in einer Reihe von Fällen Domänen eines Proteins, die für eine bestimmte Funktion verantwortlich sind, in isolierter Form - ohne den Kontext der nativen Proteinmatrix - sowohl ihre Struktur als auch ihre Funktion bewahren. Dies erleichtert Untersuchungen von Struktur-Funktionsbeziehungen bei solchen Domänen ganz erheblich, weswegen solche Studien heute in der medizinischen Grundlagenforschung sowie bei der gezielten Entwicklung von Medikamenten üblich sind. Diese Gruppe benützt biophysikalische Techniken wie Cirkulardichroismus- (CD) und magnetische Kernresonanz-spektroskopie (NMR) in Verbindung mit computergestützter Molekülmodellierung zur Analyse kritscher Kontrollaspekte bei Proteindomänen von medizinischem Interesse - zum einen, was Liganden-Rezeptor Wechsel- Die starke Tendenz zur Aggregation erlaubte bisher keine NMR Messungen der Rückgrat-Struktur der verschiedenen CD4 Bindungsdomänen unter polaren Bedingungen (Lindemann et al., eingereicht). Wir haben dieses Problem dadurch gelöst, daß wir den unter apolaren Bedingungen ermittelten NMR Strukturen mit Hilfe molekulardynamischer Berechnungen erlaubten, in simuliertem Wasser zu relaxieren [12] (Mihailescu et al., submitted). Sie mündeten alle in dieselbe Grundstruktur, die dann für die Modellierung der Molekül-Oberflächen unterschiedlicher Sequenzen ( 19 von insgesamt 8 HIV1 clades, der Gruppen M und O) herangezogen wurden. Dabei ergab sich ein übereinstimmendes, zum Pharmakophor geeignetes Phantom für den Entwurf eines stammübergreifenden Antigens zur Vakzine-Entwicklung. Ziel ist nun, zu zeigen, ob Immunreaktivität und an Protein gebundenes Phosphat einander entsprechen, d.h. der physikalische Nachweis. Dafür ist isolierte PP2Ac nötig, deren Reinigung aus synchronen Zellen inzwischen annährend quantitativ in einem Schritt gelingt. Sobald die auf Phosphorylierung hinweisende Immunreaktivität dieser PP2Ac stabil gehalten werden kann, soll das Protein mit Hilfe der Massenspektrometrie analysiert werden. Strukturdeterminanten von Proteinen J. Reed, K. Bettinger, D. Mihailescu DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Post-translationale Modifikationen Obwohl post-translationale Modifikationen bekannterweise ganz entscheidend sind für die Regulation von ZellWachstum und Stoffwechsel, so ist doch nur in ganz wenigen Fällen die Art und Weise bekannt, wie sie die Funktion von Proteinen ändern. Deshalb haben wir untersucht, wie solche Modifikationen, speziell Phosphorylierung, die Protein-Struktur lokal wie auch global beeinflussen [13]. Mit Hilfe von CD- und NMR-Messungen wurden an nativen wie auch künstlichen Peptidsequenzen die strukturellen Konsequenzen von Phosphorylierung, Deamidierung und Myristoylierung gemessen. Dabei ergab sich erstmals, daß Phosphorylierung direkt den bevorzugten Dihedral-Winkel des Peptid-Rückgrats am modifizieten Aminosäurerest verändert. Untersuchungen der interaktiven Effekte multipler Modifikationen am N-Terminus der katalytischen Untereinheit der PKA als Modell haben gezeigt, wie diese in synergistischer Weise Struktur und Membran-Affinität beeinflussen [14]. Fusionsfördernde Peptide Die Fusion von biologischen Membranen ist essentiell bei zahlreichen zellulären Prozessen und unterliegt vielen mikrobiellen Infektionen. Meist wird sie in gezielter Weise durch einen Satz spezialisierter Peptide induziert. Es wäre medizinisch nützlich, diesen Vorgang kontrollieren zu können, doch ist nicht bekannt, wie fusionsfördernde Peptide arbeiten. In einem von der VW Stiftung geförderten Projekt versuchen wir herauszufinden, welche Eigenschaften dieser ziemlich kurzen Peptide für die Fusion verantwortlich sind. Mit Hilfe synthetischer Peptide, die die fusionsfördernden Signale von Synaptobrevin II und Syntaxin 1A nachahmen, konnten wir zeigen, daß die fusionsfördernde Wirkung mit deren Fähigkeit gekoppelt ist, 1) selbst mit einander zu assoziieren und 2) dabei β-Struktur anzunehmen [15]. Helix-fördernde Maßnahmen verringerten die fusionsfördernde Wirkung. Diese Untersuchungen sollen auf fusionsfördernde Sequenzen des vesicular stomatitis Virus ausgedehnt werden, um zu sehen, ob hier ein allgemeiner Mechanismus vorliegt. Die Aufklärung der zur Membranfusion erforderlichen Sequenzeigenschaften könnte die Entwicklung von Peptiden erlauben, mit deren Hilfe eine spezifisch gezielte, liposomale Applikation von Medikamenten möglich wird. Peptidsequenzen mit Schaltereigenschaften Der Konformations-Schalter der CD4 Bindungsdomäne von HIV1 gp120 ist kein Einzelfall. Wir haben in zahlreichen anderen Proteinen spezifische Sequenzen mit polaritätsgesteuertem Konformations-Schalter identifiziert. Wir sind nun dabei zu untersuchen, ob solche Schalter einen allgemeinen Mechanismus zur Förderung von ProteinMembran- und Protein-Protein-Wechselwirkungen darstellen und wie sie identifiziert werden könnten. Die Fähigkeit, zu benennen, welche Eigenschaften eine Schaltersequenz als solche kennzeichnen und welche Wechselwirkungen dadurch gesteuert werden, würde die Vorhersage von Proteinfunktionen allein aus Kenntnis der Sequenz stark erweitern - ein vitaler Aspekt in der Post-Genom Ära. Abteilung B0100 Pathochemie Kooperationen Die Erfahrungen auf dem Gebiet der CD-Analysen der Sekundärstruktur von Proteinen haben zu einer Reihe Kooperationen geführt, die alle innerhalb des oben skizzierten Forschungsrahmens angesiedelt sind [16,17,18,19]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Kübler, D. (2001) Ecto-protein kinase substrate p120 revealed as the cell-surface-expressed nucleolar phosphoprotein Nopp140: A candidate protein for extracellular Ca2+-sensing. Biochem. J. 360, 579-587 [2] *Engh, R.A., Bossemeyer, D. (2002) Structural aspects of protein kinase control - role of conformational flexibility. Pharmacology & Therapeutics, in press [3] *Engh, R.A., Bossemeyer, D. (2001) The protein kinase activity modulation sites: Mechanisms for cellular regulation - targets for therapeutic intervention. Adv. in Enzyme Regulation 41, 121-149 [4] Schlosser, A., Lehmann, W.D. (2000) Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35, 1382-1390 [5] Schlosser. A., Pipkorn, R., Bossemeyer. D., Lehmann, W.D. (2001) Analysis of protein phosphorylation by a combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry 73, 170-176 [6] *Seifert, M.H., *Breitenlechner, Ch., Bossemeyer. D., *Huber, R., *Holak, T.A., *Engh, R. (2002) Phosphorylation and flexibility of cyclic-AMP dependent protein kinase (PKA). using 31P NMR spectroscopy. Biochemistry, in press [7] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel, V., Bossemeyer, D. (2000) Cß2 - A splice variant ofthe Cß subunit ofthe cAMP-dependent protein kinase characterized at the protein level. Biochem. J. 351, 123-132 [8] Pepperkok, R., Hotz, A., König, N., Girod, A., Bossemeyer, D., Kinzel, V. (2000) Intracellular distribution ofmammalian protein kinase A catalytic subunit altered by conserved Asn2 deamidation. J. Cell Biol. 148, 715-726 [9] Lehmann, W.D., Schlosser, A., Erben, G., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Kinzel, V.(2000) Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Protein Science 9, 22602268 [10] Kinzel, V. , König, N., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Lehmann, W.-D. (2000) The amino terminus of PKA catalytic subunit - a site for introduction of posttranslational heterogeneities by conserved deamidation: D-Asp2 and D-isoAsp2 containing isozymes: Protein Science 9, 2269-2277 [11] *Eberle, H.B., *Serrano, R.L., *Radke, S., *Füllekrug, J., Schlosser. A., Lehmann, W.D., *Lottspeich, F., *Kaloyanova, D., *Wieland, F.T., *Helms, J.B. (2002) Identification and characterization of a novel human plant-pathogenesis related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex. J. Cell Sci., in press [12] Mihailescu, D., *Smith, J.C., Reed, J. (2002) Solution structure of a putative HIV1 immunogenic peptide: Computer simulation of the principal CD4 binding domain of gp120. J. Med. Chem. 45, 1019-1025 [13] *Eidenmüller, J., *Fath, T., *Pool, M., *Hellwig, A., Reed, J., *Sontag, E., *Brandt, R. (2000) Structural and functional implications oftau hyperphosphorylation: Information from paired helical filament (PHF)-like tau phosphomutants. Biochemistry 39, 13166-13175 [14] Tholey, A., Pipkorn, R., Bossemeyer, D., Kinzel, V., Reed, J. (2001) Influence of myristoylation, phosphorylation and deamidation on the structural behaviour of the N-terminus of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. Biochemistry 40, 225-231 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 59 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0100 Pathochemie [15] *Langosch, D., *Crane, J.M., *Brosig, B., *Hellwig, A., *Tamm, L.K., Reed, J. (2001) Peptide mimics of SNARE transmembrane segments drive membrane fusion depending on their conformational plasticity. J. Mol. Biol. 311,709-721 [16] Hofmann, I., Mücke, N., Reed, J., Herrmann, H., Langowski, J. (2000) Physical characterization of plakophilin 1 reconstituted with and without zinc. Eur. J. Biochem 267, 4381-4389 [17] *Schneikert, J., *Hübner, S., *Langer, G., *Petri, T., *Jäättelä, M., Reed, J., *Cato, A.C.B. (2000) Hsp70-RAP46/chaperonecochaperone interaction in downregulation ofDNA binding by the glucocorticoid receptor. EMBO J.19, 6508-6516 [18] Pfrepper, K.-I., Reed, J., *Rackwitz, H.-R., Schnölzer, M., Flügel, R.M. (2001). Characterization of peptide substrates and viral enzyme that affect the cleavage site specificity of the human spumaretrovirus protease. Virus Genes 22, 61-72 60 [19] *Simons, A., *Ruppert, T., *Schmidt, C., *Schlicksupp, A., Pipkorn, R., Reed, J., *White, A.R., *Bayer, T.A., *Cappai, R., *Multhaupt, G. (2002) Copper binding of APP-family members in an evolutionary reconstruction. J. Biol. Chem., in press DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation B0200 Biochemische Zellphysiologie Biochemische Zellphysiologie (B0200) Leiter: Prof. Dr. Walter Pyerin Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Karin Ackermann Dr. Andreas Krehan, (-07/00) Dr. Bernd Sorg Doktoranden Thomas Barz Oliver Böcher (-06/01) Gaelle Dubois (gem. m. Dr. R. Eils, H0900, DKFZ) Sabine Eisenberger Godehard Hoppe Kerstin Knerr Diplomanden Patrizia Bastone (-11/01) Jochen Gerber (-12/01) Tanja Neidhart Elke Schultz (-08/01) Anja Strasser (-03/01) Techniker Michael Emmenlauer Andrea Waxmann Wir untersuchen Pathomechanismen proliferativer Prozesse in zwei miteinander verzahnten Schwerpunkten. Zum einen analysieren wir einen konkreten Steuerungsmechanismus zellulärer Funktionen, den Proteinkinase-CK2Komplex, zum anderen Zusammenhänge von Genexpressionen mit Tumor-assoziierten Knochenerkrankungen. Proteinkinase CK2 ist eine hoch konservierte tetramere Ser/Thr-Phosphotransferase bestehend aus zwei katalytischen Untereinheiten (CK2α und/oder CK2α‘) und zwei regulatorischen Untereinheiten (CK2β). CK2 verhält sich janusköpfig. Einerseits lebenswichtig, kann CK2 andererseits Onkogencharakter entwickeln. Störungen von Aktivität oder Struktur ändern das Proliferationsverhalten von Zellen und in Modellsystemen wie Hefe oder Maus den Phänotyp. Zusammen mit der breiten Palette bekannter oder vermuteter CK2-Interaktionspartner, weist dies auf Beteiligung an einer großen Zahl zellulärer Funktionen hin. Trotz intensiver Arbeit in verschiedenen Laboratorien ist es bisher nicht gelungen, die erzielten Ergebnisse in eine eindeutige Vorstellung umzusetzen, welchen physiologischen Zweck CK2 besitzt und wie die Janusköpfigkeit zustande kommt. Es ist unser Ziel, zur Lösung dieses Rätsels beizutragen. Wir wollen Gene identifizieren und funktionell charakterisieren, deren Expression von CK2 kontrolliert wird und die an der Proliferationsauslösung beteiligt sind, und wir wollen zugehörige transkriptionsbestimmende CK2-Interaktionspartner finden [Grein und Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, 121-128; Li et al. 1999 J. Mol. Biol. 293, 1067-1084]. Untersucht werden die Transkriptome des Menschen sowie der Modellsysteme Maus und Hefe. Darüberhinaus wollen wir wissen, wie die Expression des Kontrolleurs CK2 selbst kontrolliert wird. Im Berichtzeitraum konzentrierten wir uns auf CK2-abhängige Genexpressionen des Hefegenoms, weil dieses komplett entschlüsselt und damit in seiner Gesamtheit untersuchbar ist sowie auf Bau und Transkriptionskontrolle der Gene, die die Untereinheiten menschlicher CK2 kodieren. Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen sind eine volkswirtschaftlich bedeutende Belastung; der Knochen ist nach Leber und Lunge das am dritthäufigsten von der Filialisierung maligner Tumore betroffene Organsystem. Das Wissen über die molekularen Hintergründe seiner tumorspezifischen Kolonisierung und die Pathogenese des begleitenden Knochenschmerzes ist lückenhaft und widersprüchlich. Proteinkinase CK2 spielt im Knochen wichtige intra- und extrazelluläre Rollen. Ziel unserer Arbeiten ist es, einen Beitrag zu liefern zu einer patientenspezifischen, DNA-Chips-gestützten, diagnose- und therapierelevanten molekularen Taxonomie von Metastasierung und Tumorschmerz. Mit den Arbeiten haben wir im Berichtzeitraum begonnen. Sie erfolgen im Rahmen des Tumorzentrums Heidelberg-Mannheim. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 61 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Proteinkinase CK2-Komplex im Kontext proliferativer Prozesse W. Pyerin, K. Ackermann, T. Barz, G. Dubois, T. Neidhart In Kooperation mit: U. Wirkner, EMBL Heidelberg; H. Ansuini, Universita Perugia, Italien; O. Filhol, C. Cochet, INSERM Grenoble, Frankreich; C. V. C. Glover, University of Georgia, Athens, USA; J. DeRisi, University of California, San Francisco, USA; P. Lichter, R. Eils, DKFZ. Gefördert von: HGF-Strategiefonds III. CK2-kontrollierte Genexpression 62 Ob eine Zelle den Weg der Proliferation, Differenzierung oder Apoptose einschlägt, entscheidet sich in der Zellzyklus-Anfangsphase und ist das Resultat spezifischer, temporärer Programme der Expression und Repression von Genen. Störungen sind häufige Ursache von Krankheiten, einschliesslich Krebs. Wir konnten zeigen, dass ohne die ungestörte Gegenwart des Proteinkinase-CK2-Komplexes menschliche Zellen die Zellzyklus-Anfangsphase nicht oder nicht korrekt durchlaufen [Pepperkok et al. 1994 J. Biol. Chem. 269, 6986-6991; Lorenz et al. 1999 FEBS Letters 448, 283-288], CK2 also an der Realisierung der dafür verantwortlichen Expressionsprogramme beteiligt ist. Mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie, die ein Erstellen von Expressionsprofilen von hunderten und tausenden von Genen gleichzeitig und unter identischen Bedingungen erlaubt, versuchen wir herauszufinden, welche der Gene in CK2-abhängiger Weise exprimiert werden. Wir ermitteln Genexpressionsprofile an Zellen, deren ProteinkinaseCK2-Komplex wir gezielt verändern (Nukleinsäure- und Proteinebene). Wenn wir CK2-Gene im Modellsystem Hefe mutieren oder deletieren, finden wir eine Reihe von Genen signifikant in ihrer Expression erhöht oder erniedrigt. Ein Grossteil davon lässt sich zu Gengruppen ordnen, die ganze Regulone repräsentieren. Zwei davon, das Phosphatregulon und das Flockungsregulon, haben wir bisher näher untersucht. Insgesamt zeigen etwa 5-10% aller Gene des Hefegenoms in der einen oder anderen Weise Abhängigkeit von CK2 in ihrer Expression [1]. Das Phosphatregulon interessiert, weil die Versorgung mit Phosphat essentiell ist für alle Zellen jeden Typs. Phosphatmangel hemmt Zellwachstum und löst Zellteilungsstop aus. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt für die Aufrechterhaltung der Phosphatversorgung den PHOStoffwechselweg, der transkriptionsreguliert ist und der sich aus einer Gruppe von etwa 20 Genen zusammensetzt. Die gezielte genetische Perturbation der vier Gene, die in Hefe die CK2-Untereinheiten kodieren, führt, wenn wir die Genexpressionsprofile beim Eintritt in den Zellzyklus erfassen (Übergang G0/G1-Phase; frühe G1-Phase), zu einer massiven Transkriptionsänderung der PHO-Gene. Ein Fehlen der regulatorischen CK2-Untereinheiten verursacht eine signifikante Depression der Gene, die für die Phosphat-versorgenden Phosphatasen (PHO5, PHO11, PHO12) und Phosphattransporter (PHO84, PHO89) kodieren sowie deren zentralen Transkriptionsaktivator (PHO4). Im Gegensatz zu diesen exekutiven PHO-Komponenten bleibt die CK2-Manipulation für die Komponenten des zentralen PHO-Regulationskomplexes aber ohne Konsequen- B0200 Biochemische Zellphysiologie zen: Die Gene PHO85, PHO80 und PHO81, die jeweils für eine Cyclin-abhängige Kinase (CDK), ein Cyclin, und einen CDK-Inhibitor kodieren, bleiben in ihrer Expression unverändert. Mit unseren Daten zeigen wir erstmals, dass die Gegenwart ungestörter CK2 für den PHO-Stoffwechselweg von essentieller Bedeutung ist. Störung reprimiert auf Dauer die Expression der Komponenten der Phosphatversorgung und des Phosphatsensoriums und entkoppelt sie damit von ihrem zentralen Cyclin-CDK-Kontrollkomplex, der CK2-unabhängig und Zellzyklus-verknüpft ist [2]. Das Flockungsregulon ist für massive Änderung der Lebensäusserung von Hefezellen verantwortlich. Hefen, die unter optimalen Kulturbedingungen ohne die Bildung flockender Verbände leben, flocken aus, wenn die Bedingungen ungünstig werden. Die Gene, die für Flockungsproteine und mit ihnen kooperierende Faktoren der Zellmembran kodieren, sind unter Optimalbedingungen reprimiert. Unsere Untersuchungen zeigen, dass diese Repression aufgehoben wird, wenn CK2 genetisch gestört wird. Folgerichtig führt dies unter Optimalbedingungen zum Ausflocken der Hefezellen. Wir finden dann eine signifikant erhöhte Expression der Flockungsgene (FLO1, FLO5, FLO9, FLO10, FLO11) und von Genen, die bestimmte Zellwandkomponenten und Kohlenhydrat-Stoffwechselfaktoren kodieren (AMS1, YDL223W, SKN1, FIT1, YMR317W) sowie einen zugehörigen Transkriptionsaktivator (SSN5). Interessanter Weise sind nicht nur Expressionsstärken verändert. Vielmehr wird die Expressionserhöhung etwa von FLO11 von einer neuen TranskriptSpezies verursacht, wahrscheinlich einem bisher unbekannten Splice-Produkt. Anders als bei den PHO-Genen (s.o.), bleiben Änderungen an den regulatorischen Untereinheiten der CK2 aber ohne Folgen für die Flockung, ebenso die Deletion einer der beiden katalytischen Untereinheiten. Flockung wird nur beobachtet, wenn nicht lebensfähige Doppelmutanten der katalytischen Untereinheiten (cka1 cka2) durch temperatursensitive Allele von CKA1 oder CKA2 gerettet wird und dabei die CK2-Aktivität unterhalb eines bestimmten, das Überleben gerade noch zulassenden Niveaus bleibt. Unsere Daten zeigen, dass der Proteinkinase CK2 im Flockungsregulon eine essentielle Gen-reprimierende Funktion zukommt, ohne die flockungsfreie Verbände nicht existieren können [3]. Unsere Daten weisen ferner aus, dass die CK2-Isoformen α und α‘ funktionell unterschiedliche Rollen spielen können, und dass der Untereinheit ß nicht immer dieselbe Bedeutung zukommt. Während im Falle der FLO-Gene die Expressionskontrolle eher von der Höhe der Kinaseaktivität abhängt als davon, durch welche Isoform sie zustande kommt, und eine Deletion der regulatorischen Untereinheiten folgenlos bleibt [3], ist bei der Expressionskontrolle der PHO-Gene eine deutliche Isofom-Spezifität der katalytischen Untereinheiten und eine starke Abhängigkeit von den regulatorischen Untereinheiten zu finden [2]. Obwohl gegensätzlich in der Wirkung auf die Transkription und unterschiedlich in der Wirkungsqualität auf die FLO- und PHO-Regulone, scheint derselbe zellphysiologische Zweck sichtbar zu werden, der eines Überlebensfaktors DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation (cell survival factor; vgl. auch [Ahmed et al. 2002 Trends in Cell Biology 12, 226-230]). Hefe ist nicht nur als zelluläres Modell interessant. Vielmehr können Hefezellen auch als „biologische Retorte“ vorteilhaft eingesetzt werden, etwa beim Studium menschlicher Genexpressionsmechanismen unter in vivo-Bedingungen im 1H-System (one hybrid system) mittels Reportergen-Expressionen. Wir haben damit beispielsweise die Frage beantworten können, ob der zu beobachtende stimulierende Effekt von CK2α auf die Expression des menschlichen Aromatase-Gens direkt oder indirekt ausgeübt wird [Ackermann and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem. 191, 129-134]. Die neue Generation von 1H-Systemen verwendet eine Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Reporter anstatt HIS3/lacZ. Das ist zeit- und arbeitssparend. Diese Alternative hat in seiner kommerziell erhältlichen Form allerdings das Manko einer fehlenden positiven Bezugsgrösse. Wir haben deshalb ein Kontrollvektor-Konstrukt mit Maus-p53-cDNA und seiner Bindungssequenz sowie Distanz-Modifizierungen zwischen Klonierungsstelle und Reportergen-Promotor entworfen und erfolgreich experimentell umgesetzt. Das Resultat ist eine positive Kontrollvektor-Kombination für GFP-1H-Systeme, eine notwendige Voraussetzung für genaue DNAProtein-Interaktionsstudien [4]. Die Kontrolle des Kontrolleurs: Die CK2-Gene des Menschen und ihre Transkriptionsregulation. Das menschliche Genom besitzt vier CK2-Gene, zwei Gene für α and je ein Gen für α’ und β [Pyerin et al. 1996 in: Protein Phosphorylation. F. Marks ed, VCH Weinheim, 117-147]. Wir konnten bisher drei der vier menschlichen Gene isolieren und ihre Strukturen entschlüsseln, das CK2β-Gen und die beiden CK2α-Gene, von denen allerdings nur eines aktiv ist, während das andere ein prozessiertes Pseudogen darstellt. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen im Berichtzeitraum standen vergleichende Promotoranalysen des aktiven CK2α-Gens und des CK2βGens. Darüberhinaus versuchten wir, das noch ausständige CK2α’-Gen zu isolieren und zu charakterisieren. Im Promoterbereich des etwa 70 kb grossen und aus 13 Exonen zusammengesetzten CK2α-Gens [Wirkner et al. 1998 Genomics 48, 71-78] fallen GC-Boxen auf, eine CpG-Insel, zwei Transkriptionsstarts (Positionen +1 and 50) und das Fehlen einer TATA-Box. Das Gen endet 3’wärts mit sechs potentiellen Poly-A-Stellen, wovon nur zwei verwendet zu werden scheinen. Stark Promotor-aktive Bereiche finden sich zwischen den Positionen -256 und 144 [Wirkner and Pyerin 1999 Mol. Cell. Biochem 191, 5964]. Wir haben diese Region mit Hilfe eines Bündels von Methoden im Detail analysiert, darunter ReportergenAssays (Luciferase; HeLa-, JEG-3-, SaOs-Zellen), ortsgerichtete Mutagenese, elektrophoretische Mobilitätsshifts und Supershifts, UV-Quervernetzung, Westernblots und DNA-Affinitätschromatographie. Die höchste Transkriptionsaktivität konnte auf den Abschnitt –9 bis 46 eingeengt und die Transkriptionsfaktoren Sp1, Ets1 und NF-κB als Interaktionspartner identifiziert werden. Mutationsanalyse einzelner ihrer Bindestellen und simultane Mutationen von zwei und mehr dieser Stellen, weisen wechselseitige B0200 Biochemische Zellphysiologie funktionsbestimmende Einflussnahmen aufeinander nach, und die Anwesenheit der Faktoren in den Kernen der verwendeten Zellen konnte experimentell bestätigt werden. Interessanterweise stellte sich mindestens einer der Faktoren, Sp1, als phosphorylierbar durch das CK2-Holoenzym (α2β2) heraus, nicht jedoch durch individuelles CK2α, dem Genprodukt. Die Phosphorylierung vermindert signifikant die Promotorbindung von Sp1. Bei Verfügbarkeit von CK2β ergibt sich daraus die Möglichkeit einer steuernden Rückwirkung des Genprodukts auf die Expression des eigenen Gens, indem das entstehende CK2α mit CK2β CK2-Holoenzym bildet, das dann Sp1 phosphorylieren und damit dessen Promotor-Bindung und/oder Interaktion mit Ets1 verändern und so die Transkriptionsaktivität des CK2α-Gens absenken kann [5]. Die Verfügbarkeit von CK2β für eine solche Regulation könnte sich aus einer synchronen Steuerung des CK2ßGens mit dem CK2α-Gen ergeben. Die vergleichende Analyse des Promotor-Bereichs des CK2β-Gens, das wir als ein 4.2 kb umfassendes und aus 7 Exonen bestehendes Gen charakterisiert haben [Voss et al. 1991 J. Biol. Chem. 266, 13706-13711], ergab tatsächlich starke Hinweise dafür. Wie das CK2α-Gen, besitzt auch das CK2βGen mehr als nur einen Transkriptionsstart, nämlich drei (Positionen +1, 33 und 113), und der Promotorbereich weist ebenfalls GC-Boxen auf, eine CpG-Insel und besitzt keine TATA-Box. Unter Anwendung des o.g. Methodenbündels fanden wir, dass auch hier den Transkriptionsfaktoren Ets1 und Sp1 herausragende Rollen in der Transkriptionsregulation zukommen. Und noch mehr: Im Bereich maximaler Promotoraktivität findet sich ein 12 BpHomologiebereich kompletter Sequenzidentität in beiden Genen, ein Ets1-Doppelmotiv. Mutationen in diesem Motiv haben vergleichbare negative Expressionseffekte auf beide Gene, während die Überexpression von Ets1 in beiden Fällen positive Effekte hat [6,7]. Wie in Fig.1 skizziert, scheinen diese Daten anzuzeigen, dass die Expression humaner CK2α und CK2β transkriptionell koordiniert wird, und dass diese Koordination massgeblich über das Ets1-Doppelmotiv und sein Zusammenwirken mit Sp1-Motiven gesteuert wird, die in den Promotoren der CK2-Gene zu finden sind. Die entstehenden Genprodukte, keines für sich befähigt auf die Transkription des jeweiligen Gens zurückzuwirken, werden nach Komplexierung zu CK2-Holoenzym in die Lage versetzt, Sp1 (und Ets1?) zu phosphorylieren und dadurch die Transkription beider Gene nach unten zu regulieren. Als Folge einer solchen negativen Rückkopplung sollte sich eine stabile zelluläre CK2α- und CK2ß-Transkripte-Situation ergeben. Tatsächlich finden wir zwar unterschiedliche Transkriptespiegel in unterschiedlichen Zelltypen, aber konstante Spiegel in jedem der Zelltypen, und das unabhängig vom Differenzierungs- und Proliferationszustand [6-8]. Im Berichtzeitraum gelang es uns, die Struktur auch des vierten der CK2-Gene des Menschen, CK2α’, weitgehend aufzuklären, die in der Literatur vorhandene chromosomale Lokalisierung zu korrigieren und einen ersten Satz an Daten zur Transkriptionskontrolle zu erarbeiten [Manuskript in Vorbereitung]. Ausserdem waren Mitglieder der DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 63 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation B0200 Biochemische Zellphysiologie zu etablieren und an Hand ausgewählter Gene vergleichend abzuschätzen. Ein Beispiel gibt der RT-PCR-Nachweis von Aromatase-mRNA bei sehr geringen TranskriptMengen [11]. 64 Abbildung 1. Hypothese einer Transkriptionskoordination der menschlichen Proteinkinase-Gene CK2α und CK2β. Die Promotoren der Gene, die für die katalytische Untereinheit CK2α und die regulatorische Untereinheit CK2β kodieren, enthalten in den transkriptionsaktivsten Abschnitten (Regionen -9 bis 46 und -42 bis 14) dasselbe Ets1-Bindeelement (gelb; Doppelmotiv) und Ansammlungen benachbarter Sp1-Bindeelemente (grau). Die Transkriptionsaktivierung benötigt Ets1-Sp1-Interaktion. Generierte CK2α- und CK2β-mRNAs werden in die entsprechenden CK2Untereinheiten translatiert (CK2α, rot ausgefüllter Kreis; CK2β, blau ausgefülltes Oval) und diese komplexieren zu tetramerem CK2-Holoenzym. Das Holoenzym, nicht hingegen katalytische Untereinheit alleine, kann Sp1 (und Ets1?) phosphorylieren und so allmählich die Transkription beider Gene hemmen (negative Rückkopplung). Gruppe an der Analyse von Varianten anderer Proteinkinasen beteiligt [9] sowie an der Strukturaufklärung von Naturstoffen mit karzinogenem Potential [10]. Tumor-assoziierte Knochenerkrankungen K. Ackermann, S. Eisenberger, G. Hoppe, K. Knerr, B. Sorg, W. Pyerin In Kooperation mit: Ch. Kasperk, G. Nöldge, P.J. Meeder, H.J. Bardenheuer, S. Kaul, Universitätsklinik Heidelberg; B. Korn, ResourcenZentrum Heidelberg; W. Weinig, J. Tuckermann, DKFZ; N. Schütze, Universitätsklinik Würzburg; J. Schmidt, GSF München. Gefördert von: Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim. Osteomimikry (Metastasierung). Metastasierende Tumorzellen ändern das Verhalten von Knochenzellen und ihr Verhalten wird, umgekehrt, von Knochenzellen verändert. Kolonisierung das Knochens sollte demnach mit metastasierungstypischen Genexpressionsmustern verbunden sein. Wir wollen daher umfassende Genexpressionsprofile (s.o.) an Mikrodissektaten schmerzverursachender und schmerzfreier Metastasen und Osteoporosen erheben und sie vergleichend unter Einbeziehung klinischer Parameter sowie Daten aus Modellversuchen analysieren. Da aus Mikrodissektaten, anders als aus Zellkulturen, nur begrenzte, meist äusserst geringe Mengen an RNA zu gewinnen sind, haben wir Wert darauf gelegt, verschiedene Amplifikationsverfahren Knochen ist u.a. bevorzugtes Ziel von Tumorabsiedelungen der Prostata. Damit sie im Knochen überleben und zu Metastasen anwachsen können, nehmen Prostatakarzinomzellen Eigenschaften von Knochenzellen an (Osteomimikry). Wir haben daher primäre Osteoblasten mit Prostatakarzinomzellen co-kultiviert und die Genexpressionsprofile der beiden Zelltypen mit Hilfe von Microarrays (cDNA-Chips) erfasst. Während das Genexpressionsprofil der Osteoblasten kaum verändert wurde (10.000 erfasste Gene), war das bei Prostatakarzinomzellen auffallend anders. Unabhängig vom Progressionsgrad und Metastasierungspotential der Zellen (LNCaP-Zellen; PC-3-Zellen), war die Expression von 78 Genen in einem Kollektiv von 1.600 Genen signifikant verändert. Zusätzlich waren weitere, Zelltyp-spezifische Expressionsänderungen zu sehen: 12 Gene waren nur in den LNCaP-Zellen, 39 andere Gene nur in den PC-3-Zellen verändert exprimiert. Unter diesen Genen finden sich solche, die für Adhäsions-spezifische Komponenten des Desmosomen-Adhäsions-Netzwerkes kodieren, beispielsweise desmosomale Cadherine (Desmocollin-1; Desmoglein-2), für das metastasierungs- und tumorprogressionsassoziierte N-Cadherin oder für Zelladhäsionskinasen. Darüberhinaus zeigen die Prostatakarzinomzellen deutliche Expression von Osteoblasten-spezifischen Genen, die beispielsweise für Kollagene, Biglykan, CBFA2, M-CSF-2-Rezeptor, Sonic hedgehog, u.a. kodieren und eindrücklich zeigen, wie das von Osteoblasten erzeugte Mikromilieu zur Osteomimikry-Basis der Prostatakarzinomzellen wird und damit wesentlich zu deren Fähigkeit beiträgt, sich im Knochen anzusiedeln [12]. Zelluläre und molekulare Biologie normaler und entarteter Knochenzellen. Knochenzellen können auch selbst zu Tumorzellen entarten. Um diese Osteotransformation zu charakterisieren, haben wir mit dem Studium unterschiedlicher Proliferations- und Differenzierungsstadien primärer Osteoblasten (Maus) begonnen und Vergleiche zu Osteosarkomzellen in Kultur (SaOS-2) angestellt. Neben morphologischen Parametern und Osteoblasten-spezifischen Markern, haben wir erste Genexpressionsprofile (cDNA-Arrays, 10.000 Gene) ermittelt. Es finden sich, wie zu erwarten, deutliche Expressionsunterschiede zwischen proliferierenden und differenzierten Osteoblasten, zwischen verschiedenen Stadien der Differenzierung, und zwischen differenzierten Osteoblasten und Osteosarcomzellen. Die Analysenauswertung ist im Gange. Darüberhinaus untersuchen wir den Einfluss der Proteinkinase CK2 auf Genexpression und Proliferationsverhalten (Zellzyklus-Eintritt; Zellvermehrung) von Osteoblasten und Osteosarkom-Zellen in Perturbationsansätzen (Transfektion katalytisch inaktiver CK2). Die knochenaufbauenden Osteoblasten stehen in permanentem Wechselspiel zu den knochenabbauenden Osteoklasten. Störungen dieses Gleichgewichtes führen zu Knochenerkrankungen, etwa der volkswirtschaftlich hoch signifikanten Osteoporose. Daher interessieren wir uns ex- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation perimentell auch für diesen Zelltyp. Wir haben bereits Knochenmark-Vorläuferzellen erfolgreich zu Osteoklasten differenziert und charakterisiert (Morphologie; Osteoklasten-spezifische Marker; Knochenmatrix-Resorption), und wir konnten alle drei Untereinheiten der Proteinkinase CK2 auf Transkriptions- und Proteinebene nachweisen [Manuskript in Vorbereitung]. Knochenwachstum und -stabilität hängen wesentlich von der Versorgung mit Östrogenen ab (ÖstrogenmangelOsteoporose). Andererseits sind Östrogene Wachstumsfaktoren für Tumoren, die bevorzugt in den Knochen metastasieren, beispielsweise für Mammatumoren. Einfaches Ändern des Körper-Östrogenspiegels kann hier untaugliches therapeutisches Konzept sein. Daher beschäftgen wir uns mit der Transkriptionskontrolle des AromataseGens in der Hoffnung, in Knochenzellen und Mammazellen therapeutisch nutzbare Unterschiede (Antisense-Technologie) in den Kontrollmechanismen zu finden. Das Produkt dieses Gens, Aromatase, ist Schlüsselenzym der Östrogensynthese. Interessanterweise besitzt dieses Gen, im Gegensatz zu den meisten Genen, ein ganzes Bündel von Promotoren (Exone 1), die mehr oder weniger weit vom Transkriptionsstart entfernt liegen und zu gewebsspezifischen 5’-Enden der Transkripte, aber stets demselben Genprodukt führen. Wir haben daher die PromotorVerwendung des Aromatase-Gens in Proben aus verschiedenen Knochen-Arealen und -Typen analysiert sowie in primären Knochenzell-Kulturen (verschiedene Auswüchse) und permanenten Knochenzelllinien. Die erhaltenen Promotor-Verwendungen haben wir mit denen in Mamma-Zellen verglichen. Wir finden sowohl in Knochen wie auch in Mamma mehrere Promotorverwendungen und -shifts. Im Gegensatz zu Literaturangaben zeigt unsere Analyse, dass die Verwendungsmuster nicht eindeutig Zelltyp-spezifisch sind, sondern eher überlappend und damit nur bedingt als therapeutischer Ansatzpunkt für gegenläufige Aromatase-Expression in Knochen- und Mamma-Zellen taugen [13]. B0200 Biochemische Zellphysiologie [7] Pyerin, W., Ackermann, K. (2001) Transcriptional coordination of the genes encoding catalytic (CK2α) and regulatory (CK2β) subunits of human protein kinase CK2. Mol. Cell. Biochem. 227, 45-57 [8] Pyerin, W., Ackermann, K. Protein kinase CK2-linked gene expression control. (Review) Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 73, in press [9] Thullner, S., Gesellchen, F., Wiemann, S., Pyerin, W., Kinzel, V., Bossemeyer, D. (2000) The protein kinase A catalytic subunit Cß2: molecular characterization and distribution of the splice variant. Biochem. J. 351, 123-132 [10] *Zayed, S.M.A.D., *Farghaly, M., *Soliman S.M., *Gotta, H., Sorg, B., Hecker, E. (2001) Dietary cancer risk from conditional cancerogens (tumor promoters) in produce of livestock fed on species of spurge (Euphorbiaceae): V. Skin irritant and tumorpromoting diterpene ester toxins of the tigliane and ingenane type in the herbs Euphorbia nubica and Euphorbia helioscopia contaminating fodder of livestock. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127, 40-47 [11] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2001) RT-PCR detection of aromatase mRNA with small amounts of template. QIAGEN News 4, 21-22 [12] Knerr, K., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) Osteomimicry of prostate carcinoma cells: Co-cultured osteoblasts provoke altered expression of adhesion-related genes. [13] Hoppe, G., Ackermann, K., *Kasperk, Ch., Pyerin, W. (2002) Transcriptional control of the human aromatase gene (CYP19): Comparative promoter usage analysis in cells derived from bone and mamma. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Ackermann, K., Waxmann, A., *Glover, C.V.C., Pyerin, W. (2001) Genes targeted by protein kinase CK2: A genome-wide expression array analysis in yeast. Mol. Cell. Biochem. 227, 59-66 [2] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) Perturbation of protein kinase CK2 uncouples phosphate maintenance pathway from cyclin-CDK control. [3] Ackermann, K., *Glover C.V.C., *DeRisi, J., Pyerin, W. (2002) Genome-wide transcript profiling of deletion mutants demonstrates protein kinase CK2 to control flocculation-linked gene expression in Saccharomyces cerevisiae. [4] Barz, T., Ackermann, K., Pyerin, W. (2002) A positive control for the green fluorescent protein-based one-hybrid system. Analyt. Biochem. 304, 117-121 [5] Krehan, A., *Ansuini, H., Böcher, O., Grein, S., Wirkner, U., Pyerin, W. (2000) Transcription factors Ets1, NFκB and Sp1 are major determinants of the promoter activity of human protein kinase CK2α gene. J. Biol. Chem. 275, 18327-18336 [6] Krehan, A., Schmalzbauer, R., Böcher, O., Ackermann, K., Wirkner, U., Brouwers, S., Pyerin, W. (2001) Ets1 is a common element in directing transcription of the α and β genes of human protein kinase CK2. Eur. J. Biochem. 268, 3243-3252 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 65 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0300 Biochemie der Zelle Abteilung Biochemie der Zelle (B0300) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Dieter Werner (- 09/01) Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. med. Christof Granzow Dr. rer. nat. Marijana Kopun-Granzow Dr. rer. nat. Karsten Rothbarth ( - 05/02) Examensarbeiten Tobias Baumbusch, medizinische Dissertation Debora Greco, medizinische Dissertation Michael Heuser, medizinische Dissertation 66 Technische Mitarbeiter Barbara Liebetrau, TA (1/2) Ilona Jung, TA (1/2; - 09/01) Maika Schubert, TA (1/2;-01/02) Hermann Stammer, BTA (-09/01) Die Abteilung bestand aus zwei Gruppen, der Kern-Protein-Gruppe, geleitet von Prof. Werner und der Zellpharmakologie-Gruppe, geleitet von Prof. Granzow. Prof. Werner ist in Ruhestand gegangen. Im Zentrum der Arbeiten der Zellpharmakologie-Gruppe steht die Identifizierung und Modulation der Resistenzentwicklung durch antineoplastische Pharmaka, sowie die Entwicklung eines verlässlichen Tests für Chemoresistenz bzw. Chemosensibilität. Genomveränderungen multidrogenresistenter Tumorzellen (B0301) C. Granzow, M. Kopun In Zusammenarbeit mit Manfred Wiessler, DKFZ Induktion von Glufosfamid-Resistenz in menschlichen Tumorzellen Glufosfamid ist ein neuartiges Zytostatikum, dessen zytostatisch wirkender Anteil zum Zwecke einer spezifischeren Adressierung von Tumorzellen mit Glucose gekoppelt wurde. Der Glucoseanteil wird von glucosetransportierenden Proteinen der Zellmembran erkannt und akzeptiert. Da Tumorzellen mehr Glucose verbrauchen als normale Zellen, nehmen sie auch mehr zytostatische Aktivität auf und werden infolgedessen stärker als normale Zellen geschädigt. Im Rahmen einer klinischen Phase I-Studie zeigte Glufosfamid beträchtliche antineoplastische Wirksamkeit bei guter Verträglichkeit für die Patienten. Es ist zu erwarten, dass diese innovative Substanz in naher Zukunft große klinische Bedeutung erlangen wird. existierten und imstande sind, die Zytostatika sehr effizient aus den resistent gewordenen Zellen zu entfernen. Im Falle von Glufosfamid dagegen benutzt das Zytostatikum ein vorbestehendes Transportsystem der Zellmembran, auf das die Tumorzellen für ihr Funktionieren angewiesen sind. Insofern fehlen hier die Voraussetzungen für die üblicherweise sehr früh einsetzende und äußerst nachhaltige, transportervermittelte Resistenzentwicklung. Es erschien deshalb sowohl unter zellbiologischen als auch unter klinischen Aspekten interessant, ob und gegebenenfalls mit welchem Aufwand Resistenz gegen Glufosfamid in glufosfamidempfindlichen menschlichen Tumorzellen erzeugt werden kann. Die Experimente wurden unter in vitro-Bedingungen durchgeführt. Bei epithelialen KB-Zellen gelang es unter größten Schwierigkeiten nach sechs Monaten Glufosfamidexposition lediglich, ein sehr niedriges Resistenzniveau zu etablieren und aufrechtzuerhalten. Nach Absetzen von Glufosfamid kehrte die ursprüngliche Sensibilität der Zellen gegenüber der Substanz rasch zurück. Bei CEMLeukämiezellen war die Resistenzinduktion noch weniger effizient. Anfangs wurde bei beiden untersuchten Zellstämmen keine Kreuzresistenz gegenüber weiteren Zytostatika beobachtet. Nach monatelanger Weiterkultivierung mit Glufosfamid entstand jedoch das von Glufosfamidanaloga bekannte Kreuzresistenzmuster. Der molekulare Mechanismus der induzierten low level-Resistenz ist noch unbekannt. Der geschilderte Verlauf der Resistenzentwicklung läßt erwarten, daß bei vorübergehender Anwendung von Glufosfamid beim Patienten Resistenzentwicklung keine Rolle spielen dürfte. Falls es dennoch dazu kommt, sind allenfalls geringgradige Minderungen der Sensibilität gegenüber Glufosfamid mit ausgeprägter Rückbildungstendenz zu erwarten. Dadurch unterscheidet sich Glufosfamid sehr vorteilhaft von konventionellen Zytostatika. Publikation: C. Granzow, M. Wiessler, M. Heuser und M. Kopun: Induction of glufosfamide resistance in human tumor cells without development of cross resistance to other cytostatic drugs. Proc. Amer. Ass. Cancer Res. 42, 323 (2001). Für eine Beurteilung der klinischen Wertigkeit von Zytostatika ist neben der Toxizität die Neigung zur Resistenzentwicklung besonders bedeutsam, weil diese eine Limitierung der Wirksamkeit zur Folge hat. Üblicherweise werden bei der Resistenzentwicklung starke Transportaktivitäten in den Tumorzellen induziert, die zuvor nicht DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (B0400) Leiter Prof. Dr. Herwig Ponstingl Das Ran-System im nucleocytoplasmatischen Transport Wissenschaftliche Mitarbeiter Priv.-Doz. Dr. Ralf Bischoff Dr. Simon Fernandez (BMBF) Dipl.-Ing. Klaus Leibe (BMBF) Dr. Gernot Maier Dr. Hans-Peter Zimmermann R. Bischoff, M. Sjölinder, L. Moiseenko, W. Wu, H. Ponstingl Gastwissenschaftler Dr. Alexander Marmé, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg Dr. Mikael Sjölinder, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden In Zusammenarbeit mit: D. Görlich, Zentrum für Molekulare Biologie der Universität Heidelberg; E. Hurt, Biochemiezentrum der Universität Heidelberg; U. Kutay, Institut für Biochemie der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich, Schweiz; I. Mattaj, EMBO Laboratorium Heidelberg; G. Schlenstedt, Institut für Biochemie der Universität des Saarlandes, Homburg. Die kleine GTPase Ran regelt mit ihren Kontrollfaktoren und Bindungspartnern den Transport von Proteinen und Ribonukleinsäuren durch die Porenkomplexe der Kernmembran. Wir haben die Hauptkomponenten des Systems und mehrere Transportfaktoren isoliert und die Rolle von Ran bei der Bildung von Transportkomplexen am Ausgangspunkt und ihrem Zerfall am Ziel untersucht. Danach liegt Ran auf der cytoplasmatischen Seite der Kernmembran vorwiegend als inaktives RanGDP vor, im Kern hingegen als aktives RanGTP. RanGAP, ein Aktivator der Nukleotidhydrolyse, ist verantwortlich für die Inaktivierung im Cytoplasma, die Aktivierung im Kern bewirkt ein Nukleotid-Austauschfaktor, RanGEF [6,7]. Doktoranden Kathrin Dellas-Kloor Lilia Moiseenko (DFG) Kerstin Weigl Weilin Wu Techniker Jürgen Kretschmer Olga Keberlein Antje Koppe Claudia Müller (DFG) Sabine Seib Sekretariat Sabine Hughes Die Forschungsarbeiten der Abteilung haben zum Ziel: • Die Aufklärung des Transports von Makromolekülen durch die Hülle des Zellkerns, um zu verstehen, wie Transportdefekte zur Entstehung von Tumoren beitragen, und um Transportwege therapeutisch zu nutzen. • Die Identifizierung neuer Tumormarker und Tumorsuppressoren in Ovarialkarzinomen durch systematische Analyse des Ablese-Profils von Genen. • Die Entwicklung hochkomplexer Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen. Die Transportfaktoren reagieren auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von RanGTP mit der Bildung von Komplexen mit der Fracht oder mit dem Zerfall solcher Komplexe. Importine und Exportine verhalten sich dabei gegensätzlich: Frachtproteine im Cytoplasma mit einem Kernlokalisations-Signal (NLS) binden in Abwesenheit von RanGTP an Importin, das Vehikel für den eigentlichen Import. Der Transport durch die Kernpore folgt einem bisher ungeklärten Mechanismus, der offenbar ohne energieliefernde Nukleotidspaltung auskommt. Im Kern wird der Import durch Zerfall des Komplexes beendet. Dabei bindet RanGTP sehr fest an das Importin und löst dort eine Änderung der Molekülgestalt aus, die das Transportgut freisetzt. Gleichzeitig wird dadurch verhindert, daß sich die Importkomplexe wieder bilden. Es gibt fast zwei Dutzend Transportfaktoren, die sich in ihrer Struktur ähneln [2, 3]. Im Gegensatz zu den Importinen binden Exportine ihre Frachten, die ein nukleäres Exportsignal (NES) besitzen, im Kern unter Ausbildung eines Komplexes mit RanGTP [2, 4]. Dieser sehr feste Exportkomplex wird ohne Hydrolyse des gebundenen GTP ins Cytoplasma befördert. Dort sind die Komplexe zunächst nicht für RanGAP zugänglich, das den Zerfall anregt. Hier greifen das kleine cytoplasmatische RanBP1 [1, 4] und das RanBP2 der cytoplasmatischen Fasern an den Kernporen ein: Sie binden an RanGTP an einer anderen Stelle als die Transportfaktoren und ändern die Gestalt des Exportkomplexes. Nun erst wird die Inaktivierung des Rangebundenen GTP durch RanGAP und damit der Zerfall des Komplexes angeregt. So wird verhindert, daß sich der exportierte Komplex wieder zurückbildet. Damit sind die beteiligten Faktoren wieder für eine neue Transportrunde bereit. Inaktives RanGDP schließlich wird durch einen be- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 67 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation sonderen Importfaktor NTF2 in den Kern zurückgebracht, um dort durch Nukleotidaustausch an RanGEF aktiviert zu werden. Während RanBP1 und RanBP2 auf der cytoplasmatischen Seite der Kernporen beim Entladen der Exportkomplexe aktiv sind, haben wir im Zellkern das RanBP1-ähnliche Protein RanBP3 gefunden, das die Bildung von Exportkomplexen steuert: durch Bindung von RanBP3 an den Exportfaktor Expo1 wird dessen Spezifität für unterschiedliche Frachten bestimmt [5]. 68 Wir identifizierten auch ein humanes Homologes zu RCC1, DelGEF, das zwar die wesentlichen bekannten Strukturmerkmale mit diesem Austauschfaktor gemeinsam hat, Ran aber trotzdem nicht aktivieren kann. Es wird im Chromosomenabschnitt 11p14 codiert, auf dem man ein Gen für erbliche Formen von Taubheit und Retinitis pigmentosa vermutet. Mit 2-Hybrid-Studien wurden für DelGEF Bindungspartner gefunden, die auf eine Rolle in intrazellulären Transportprozessen hinweisen. Systematische Analyse der Genexpressionsmuster in Ovarialkarzinomen K. Dellas-Kloor, G. Maier, A. Marmé, K. Weigl, H.-P. Zimmermann, H. Ponstingl In Zusammenarbeit mit G. Bastert, M. Lindner, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg; D. Wallwiener, R. Kurek, B. Gückel, Universitäts-Frauenklinik Tübingen. Ovarialkarzinome sind die gefährlichsten unter den gynäkologischen Tumoren, da sie ohne charakteristische Frühsymptome sind und in der Regel erst in Spätstadien erkannt werden. Die Abteilung vergleicht die Genexpressionsmuster von Tumorzellen und gesunden Epithelzellen jeweils derselben Patientin. Anhand wiederkehrender Merkmale werden diese Tumoren molekularbiologisch charakterisiert, mit dem Ziel, neue Kennzeichen von diagnostischer Bedeutung zu finden, Therapien an den Einzelfall anzupassen und die molekularen Ursachen der Tumorentwicklung zu verstehen. Mit Antikörpern gegen charakteristische Strukturen an den Zelloberflächen und mit pharmazeutisch veränderten Signalmolekülen sollen auch der Therapie neue Möglichkeiten eröffnet werden. Das Differential Display ist das bisher empfindlichste Verfahren zur systematischen Analyse von Unterschieden in der Genexpression. Es erlaubt in der Form von cDNAFragmenten den Vergleich, die Identifizierung und die Isolierung von mRNAs, die in Tumorzellen erheblich stärker oder geringer repräsentiert sind als in den entsprechenden gesunden Zellen. Etwa die Hälfte der bisher gefundenen Gene, deren Expressionsspiegel sich um mindestens eine Größenordnung unterschied, codieren für bereits bekannte Proteine [8], darunter einen Tumorsuppressor und Komponenten von Signalwegen. Die übrigen, bisher unbekannten, sind anhand ihrer Strukturmerkmale Signalwegen oder Zell-Zell-Kontakten zuzuordnen. Dieses aufwendige Verfahren kann immer nur mit Material aus einzelnen Patientinnen durchgeführt werden. Um diagnostisch brauchbare Marker zu erhalten, müssen Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose Expressionsunterschiede aber rasch und an möglichst vielen Patientinnen bestimmt und mit den histopathologischen Befunden und dem klinischen Verlauf der Erkrankung verknüpft werden. Dies geschieht zur Zeit durch quantitative PCR und durch cDNA-Chips, die noch in Entwicklung stehen. Gleichzeitig werden die Proteine, die von den interessierenden Genen codiert werden, in Bakterienzellen exprimiert, um gegen sie gerichtete Antikörper für schnellere Diagnosen zu gewinnen. In Tumoren überexprimierte Proteine werden auch auf ihre Eignung als Angriffspunkte für Immuntherapien geprüft. Hochkomplexe Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen R. Bischoff, S. Fernandez, K. Leibe In Zusammenarbeit mit Dr. Frank Breitling und Dr. Volker Stadler, DKFZ. Es wird ein Verfahren zur Herstellung von hochkomplexen Peptid-Arrays entwickelt. Es beruht auf einem modifizierten Laserdrucker, der statt des normalen Farbtoners Partikel druckt, in welche die Grundbausteine für die Peptidsynthese eingebettet sind. Durch Zufuhr von Wärme werden die Partikel geschmolzen, die darin eingeschlossenen Monomere freigesetzt und die Kopplungsreaktion gestartet. Die Partikel stellen somit eine stabile Transportform für die Monomere dar und liefern darüber hinaus den Reaktionsraum für die chemische Kopplung am Bestimmungsort. Durch wiederholtes Bedrucken desselben Trägers und nachfolgendes Koppeln der Monomere kann so eine große Zahl von unterschiedlichen Peptiden simultan auf einer Trägerfolie synthetisiert werden. Die Anzahl der nacheinander auszuführenden Druckvorgänge ergibt sich dabei aus der Zahl von Grundbausteinen, welche die fertigen Oligomere enthalten sollen. Die Möglichkeit, alle Teilschritte des Syntheseverfahrens kontrollieren zu können, ergibt eine einfache, robuste, schnelle und auch preiswerte Technologie zur Herstellung von komplexen PeptidArrays. Es gibt vielfältige Möglichkeiten, die Gestaltung der Peptid-Arrays an die Bedürfnisse des Anwenders anzupassen. Beispielsweise können Proteine in Form von überlappenden Bruchstücken (15-20mere) auf dem Array präsentiert werden. Es ist gezeigt worden, daß in vielen Fällen die Strukturinformation zur Wechselwirkung mit Bindungspartnern auch in den Peptiden erhalten bleibt. Dies gilt in besonderem Maße für die Bindung von Antikörpern, die oft nur kurze Abschnitte auf dem antigenen Protein erkennen. Ferner ist es möglich, „vollständige“ Bibliotheken von Lund D-Peptiden zu erstellen, die alle theoretisch möglichen Aminosäure-Kombinationen enthalten. Das so geschaffene Repertoire von unterschiedlichen Oberflächen kann für die Bindung von Makromolekülen jeglicher Art genutzt werden. Der Einsatz dieser Arrays kann Muster hervorbringen, die je nach Anwendung auch diagnostisches Potenzial haben [9, 10]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0400 Molekulare Biologie der Mitose 69 Abb. Vergleich eines normalen Tonerpartikels mit einem AminosäurenPartikel Publikationen (* = externe Koautoren) und Preise [1] Künzler*, M., Gerstberger*, T., Stutz*, F., Bischoff, F.R. & Hurt*, E. (2000) Yeast Ran-binding protein 1 (Yrb1) shuttles between nucleus and cytoplasm and is exported from the nucleus via a CRM1 (XPO1)-dependent pathway. Mol. Cell. Biol. 20, 4295-4308. [2] Lipowsky*, G., Bischoff, F.R., Schwarzmaier*, P., Kraft*, R., Kostka*, S., Hartmann*, E., Kutay*, U. &Görlich*, D. (2000) Exportin 4: a mediator of a novel nuclear export pathway in higher eukaryotes. EMBO J. 19, 4362-4371. [3] Kutay*, U., Hartmann*, E., Treichel*, N., Calado*, A., CarmoFonseca*, M., Prehn*, S., Kraft*, R., Görlich*, D., & Bischoff, F.R. (2000) Identification of two novel RanGTP-binding proteins belonging to the importin b superfamily. J. Biol. Chem. 275, 40163-40168. [4] Maurer*, P., Redd*, M., Solsbacher*, J., Bischoff, F.R., Greiner*, M., Podtelejnikov*, A.V., Mann*, M., Stade*, K., Weis*, K. & Schlenstedt*, G. (2001) The nuclear export receptor Xpo1p forms distinct complexes with NES transport substrates and the yeast binding protein 1 (Yrb1p). Mol. Biol. Cell 12, 539 - 549. [5] Englmeier*, L., Fornerod*, M., Bischoff, F.R., Petosa*, C., Mattaj*, I. & Kutay*, U. (2001) RanBP3 influences interactions between CRM1 and its nuclear protein export substrates. EMBO Rep 2, 926 - 932. [6] Bischoff, F.R., Scheffzek*, K. & Ponstingl, H. (2001) How Ran is regulated. In „Nuclear Transport“. K. Weis (Ed.),Results and Problems in Cell Differentiation 35, 49-66. Springer, Heidelberg, New York. [7] Bischoff, F.R. & Ponstingl, H. (2001) Ran regulation by RanGEF and RanGAP. In „The small GTPase Ran“. Mark Rush & Peter d’Eustachio (Eds.) pp163-176. Kluver, Boston, Dordrecht, New York. [8] Weigl, K., Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A., Bastert*, G., Kurek*, R., & Wallwiener*, D. (2001) Ovarial-Karzinom-Marker.Europäische Patentanmeldung 02 005 445.8. [9] Bischoff, F.R., Breitling, F., Saffrich, R., Poustka, A., Hoffmann, Th., Groß, K. & Breitling, F. (2001) Genius Biotech Award des Landes Baden-Württemberg. [10] Bischoff, F.R., Breitling, F., Wallich*, R., Poustka, A., Stadler, V. & Breitling, F. (2001) Förderpreis Medizintechnik für das Projekt „Borrelien Peptidomarrays“ im Rahmen des Innovations-Wettbewerbs 2001 des Bundesministeriums für Bildung und Forschung. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation B0401 Peptidsyntheseeinheit Zentrale Peptid- und Proteinsyntheseeinheit (B0401) Leiter: Dr. Rüdiger Pipkorn Publikationen: (* = externe Koautoren) Mitarbeiter Mario Koch 70 Aufgabe der Einheit ist die Synthese unterschiedlichster funktionaler Peptide zur Durchführung von Studien zum Verständnis der Wechselwirkung von Struktur und Aktivität [6,7]. Spezielle Fragen hinsichtlich Identifiaktion von AntiEpitopen innerhalb Proteinsequenzen können mittels individuell synthetisierter Peptide beantwortet werden. Dynamische zelluläre Prozesse auf DNA-, RNA- und auf Proteinebene [2,3,5] können mittels spezifischer funktionaler Peptideeinheiten simuliert und verstanden werden im Zusammenhang von inter-und intrazellulärem Transport von Proteineinheiten (‘Bioshuttle’, siehe Schema) [1]. Moderne Diagnostikverfahren wie beispielsweise ‚Molecular Imaging‘ in der MRT bzw. PET sind mittels speziell synthetisierter Peptideinheiten möglich. Molecular Modeling und Biocomputing Methoden an synthetischen Peptiden tragen zum Verständnis für Struktur und Funktion bei. Die Entwicklung von Therapieansätzen auf molekularer Ebene (Antisense- und Anti-Gen) ist in gleicher Weise zu verwirklichen. Die Synthese sämtlicher Peptide erfolgt vollautomatisiert auf dem AMS 422 Multiple Peptide Synthesizer (Abimed Analysentechnik) [4], Charakterisierung und Aufreinigung mit HPLC-, MALDI Massenspektrometrie-Methoden. [1] Braun K; Peschke P; Pipkorn R; Lampel S*; Wachsmuth M; Waldeck W; Friedrich E*; Debus J; A biological transporter for the delivery of peptides to the nuclear compartment in living cells. J Mol Biol in press (2002) [2] Schlosser, A., Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Lehmann, WD. Analysis of protein phosphorylation by combination of elastase digest and neutral loss tandem mass spectrometry. Protein Sci 11: 2260-8, 2000 [3] Kinzel,V ., König, N.,Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Lehmann, W-D. Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray mass spectrometry. Prot. Sci 11: 2269-77, 2000 [4] Pipkorn R, Boenke C*, Gehrke M*, Hoffmann R*. Highthroughput peptide synthesis and peptide purification strategy at the low micromol-scale using the 96-well format. J Peptide Res. 59: 105-114, 2002 [5] Lehmann, W-D, Schlosser, A., Erben, G., Pipkorn, R., Bossemeyer, D. and Kinzel, V. Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Prot Sci 9: 2260- 2268, 2000 [6] Langosch, D*, Brosig, B* and Pipkorn, R. Peptide mimics of the vesicular stomatitis virus G-protein transmembrane segment drive membrane fusion in vitro. J Biol Chem 276: 32016-32021, 2001 [7] Tholey, A, Pipkorn, R, Bossemeyer, D. and Kinzel, V. and Reed, J. Influence of myristoylation, phosphorylation and deamidation on the structural behavior of the N-terminus of the catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. Biochemistry 40: 225- 231, 2001 “Bioshuttle” - Strukturschema [1] Transport Modul Transportpeptid, -S%S- Adress Modul Adresspeptid, Spacer Substanz Wirk Substanz DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation Abteilung Biochemie der Gewebsspezifischen Regulation (B0500) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Friedrich Marks ( - 03/02) Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. rer. nat Gerhard Fürstenberger PD Dr. rer. nat. Peter Krieg PD Dr. rer. nat. Karin Müller-Decker Dr. rer. nat. Michael A. Rogers Dr. Kirsten Scholz Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Dr. rer. nat. habil. Hermelita Winter Gastwissenschaftler Dr. Tsevtomir Lukanov (Univ. Sofia, Bulgarien, 04 - 07/00) Dr. Nao Qiao (Kanazawa University, Kananzawa, Japan, 11/00 - 11/01) Dr. Svetlana Zoubova (St. Petersburg, Russland, 05/01 05/02) Doktoranden Thorsten Lau Karsten Müller Melanie Neumann Malte Siebert Anette Zagorski Diplomanden Wolfgang Hirschner Gwendolin Manegold Gitta Neufang Jin Kyun Park Lius-Felipe Jave-Suarez Fey-Yin Cheang Technische Mitarbeiter Dagmar Kucher (Teilzeit) Ina Kutschera Sandra Pfrang Andrea Pohl-Arnold (Teilzeit) Brigitte Steinbauer (Teilzeit) IngeborgVogt Ulrike Beckhaus Claudia Ehman Auszubildende (Stand 12/01) Sabrina Balaguer Jutta Bulkescher Sarah Wolf Sekretariat Wiltrud S. Bockemühl Andere technische Dienste Roswitha Epp Die Abteilung war in drei Arbeitsgruppen unterteilt: Gruppe 1: Eisosanoide und Tumorentwicklung (Dr. Gerhard Fürstenberger) Gruppe 2: Proteinkinase C (Dr. Michael Gschwendt, ausgeschieden) Gruppe 3: Differenzierung von normaler und pathologisch veränderter Epidermis (Dr. Jürgen Schweizer) Die Forschungsprojekte gehen auf die langjährigen Arbeiten der Abteilung über die Regulation von Wachstum und Differenzierung sowie Krebsentwicklung in der Haut zurück. In diesem Zusammenhang konzentrieren sich die Untersuchungen auf die Regulation des epidermalen Arachidonsäurestoffwechsels und die molekularen Mechanismen der Eicosanoid-Wirkung bei diesen Prozessen. Als Differenzierungsmarker der normalen Epidermis und ihrer Anhangsorgane, sowie der daraus entstehenden Tumore, dienen die Keratine Nach dem Ausscheiden von Prof. Marks in den Ruhestand werden nur die Gruppen von Dr. G. Fürstenberger und Dr. J. Schweizer als selbständige Einheiten weitergeführt. Eicosanoide und epitheliale Tumorentwicklung Leiter: Dr. rer. nat Gerhard Fürstenberger Unter den aus Arachidonsäure gebildeten Eicosanoiden sowie den entsprechenden Octadecanoiden (aus Linolsäure) finden sich zahlreiche hochaktive Wirkstoffe, die als Agonisten mit spezifischen Oberflächenrezeptoren sowie mit Transkriptionsfaktoren des Typs PPAR reagieren. Eicosanoide sind u.a. Entzündungsmediatoren und Wundfaktoren und werden von gereiztem Gewebe vorübergehend gebildet. Eine dauernde Überproduktion von Eicosanoiden findet man dagegen bei chronisch-degenerativen Prozessen (rheumatische Arthritis, Atherosklerose und Alzheimersche Demenz) sowie bei epithelialen Tumorerkrankungen. Die biologische Aktivität der Eicosanoide und Octadecanoide wird aufgrund ihrer Kurzlebigkeit in der Regel über die Biosynthese reguliert, welche von zwei Enzymfamilien, den Cyclooxygenasen und den Lipoxygenasen, beherrscht wird. Beide Stoffwechselwege können zugleich eine Quelle von reaktiven (gentoxischen) Sauerstoffspezies sein, die bei der enzymatischen Fettsäureoxidation als Nebenprodukte entstehen und zu „oxidativem Stress“ beitragen [1, 16-21]. Wir untersuchen die Rolle von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen in normalen Epithelien und bei der Tumorentwicklung in der Haut, Kolon, Brustdrüse, Pankreas und der Prostata von Mäusen. Durch flankierende Studien an Operationsmaterial versuchen wir eine Brücke vom Tierversuch zur Klinik zu schlagen. Unsere Arbeiten haben das Ziel, das Verständnis der normalen und pathologischen Funktionen des Stoffwechsels ungesättigter Fettsäuren zu vertiefen. Die so gewonnenen Kenntnisse über Mechanismen sollen als rationale Ansätze für die Verbesserung bestehender und die Entwicklung neuer Methoden zur Krebsprävention bzw. -therapie dienen. Für die beschriebenen Untersuchungen kommen transgene Mausmodelle mit gewebs- und differenzierungsspezifischer Überexpression oder Inaktivierung von Cyclooxygenasen und Lipoxygenasen und entsprechende Zellkultursysteme zum Einsatz, um die spezifischen Funktionen dieser Proteine bei der Entwicklung epithelialer Tumore im Kontext der jeweiligen Gewebe bzw. des Gesamtorganismus zu untersuchen. 1. Cyclooxygenasen K. Müller-Decker, W. Hirschner, T. Lau, G. Neufang, M. Neumann, A. Zagorski, F. Marks, G. Fürstenberger Zusammenarbeit mit der dermatologischen Universitätsklinik Mannheim (Dr. C. Bayerl), dem Pathologischen Institut der Universität Heidelberg, (Dr. I. Berger), der Mahodi Universität Bangkok (Prof. V. Sirikulchayanonta), der University of California, Los Angeles (Dr. H.R. Herschman), dem Institut für Pharmakologie der Universität Frankfurt (Dr. M. Kaszkin), dem Institut für Tumorbiologie der Universität Wien (Prof. Dr. B. Marian) und dem M.D. Anderson Cancer Center, Smithville Division (Prof. D. S.M. Fi- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 71 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation scher), sowie der Pharmacia, St. Louis, USA und der Bayer AG, Leverkusen. Zusatzfinanzierung: Industrikooperation, Deutsche Krebshilfe 72 Cyclooxygenasen (COX) katalysieren die Oxidation von Arachidonsäure zu einem Prostaglandin-Endoperoxid (PGH ), das durch weitere Enzyme in die eigentlichen 2 Prostaglandine sowie in Prostacycline und Thromboxane umgewandelt wird. Einige dieser Wirkstoffe sind entscheidend an der Tumorentwicklung beteiligt: sie hemmen terminale Differenzierung und Apoptose, fördern Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierung und wirken immunsuppressiv. Von den beiden bekannten COX-Isoenzymen wird COX-1 in praktisch allen Organen konstitutiv exprimiert, COX-2 dagegen in der Regel nur vorübergehend bei Stress-Situationen (Verwundung, Infektion, Entzündungen) induziert Eine permanente Überexpression von COX-2 wurde in allen bisher untersuchten epithelialen Neoplasien des Menschen und der Maus beobachtet [1, 8, 21]. Tierversuche und klinische Studien haben eine z.T. dramatische Reduktion der Tumorentwicklung durch Hemmung der COX-2Aktivität gezeigt. Unseren Untersuchungen am Maushautmodell zufolge geht die konstitutive Überexpression von COX-2 im proliferationsaktiven Kompartiment von prämalignen Tumoren mit einer extremen Überproduktion der Prostaglandine PGE2 und PGF2α einher, wobei PGF2α als endogener Tumorpromotor wirkt [1, 8, 21]. Auch Tumore von Menschen erzeugen erhebliche Mengen an Prostaglandinen, und eine Hemmung der Prostaglandinsynthese durch COX-Inhibitoren unterdrückt die Tumorentwicklung [1, 8, 21]. Hierauf beruht die bereits klinisch angewendete Chemoprävention des kolorektalen Karzinoms durch Entzündungshemmer vom Typ der nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAID) mit Aspirin als Prototyp. COX-Isoenzyme und epitheliale Wundheilung Die Heilung epithelialer Wunden geht einher mit einer transienten Induktion der COX-2-Expression. Im Modell der Maushaut zeigte sich, dass die Heilung von Schnittwunden bei systemischer Verabreichung von COX-1- oder COX-2-selektiven Inhibitoren allein nicht beeinträchtigt wird. Auch die gleichzeitige Hemmung beider Isoenzyme verzögert die Wundheilung nicht [19]. Diese Beobachtung ist von Bedeutung im Hinblick auf den Einsatz von COXInhibitoren, insbesondere COX-2-selektiver Inhibitoren zur postoperativen Prävention von kolorektalem Krebs. Zusatzfinanzierung: Industriekooperationen, Deutsche Krebshilfe. COX-Isoenzyme und epitheliale Tumorentwicklung: Untersuchungen an menschlichen Gewebeproben. In Zusammenarbeit mit dem Nationalen Krebsinstitut von Thailand haben wir eine Studie über menschlichen Gallengangkrebs durchgeführt. Dieser Tumor ist besonders häufig in Südostasien und wird vermutlich durch chronische Gewebsschäden, verursacht durch einen Leberegel, promoviert. Dieser Effekt entspricht der tumorpromovierenden Wirkung von chronischer Gewebsirritation im Mäusehautmodell. Gallengangtumoren unterscheiden sich von Hauttumoren dadurch, dass bei ihnen beide COX-Enzyme übermäßig gebildet werden. Im normalen Gallenganggewebe findet sich jedoch auch hier keine COX-2 [9,20]. Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation Eine Überexpression von COX-2 wurde auch in hepatozellulären Leberkarzinomen, die in Südostasien ebenfalls sehr häufig sind, beobachtet. Diese Untersuchungen sollen zur Klärung der Frage beitragen, ob eine generelle Prävention von Gallengang- und Leberkrebs mit Hilfe von Entzündungs-hemmern in Südostasien möglich ist. Funktion von COX-2 in Maushaut in vivo: Transgene Mausmodelle. Um einerseits die normalen Funktionen von COX-2, andererseits die Rolle dieses Enzyms bei der Tumorentwicklung genauer analysieren zu können, haben wir transgene Mauslinien entwickelt, die COX-2 unter Kontrolle des Keratin-5-Promotors im proliferativen Kompartiment der Epidermis und verwandter Epithelien konstitutiv exprimieren [13]. Der ausgeprägte transgene Phänotyp dieser Tiere hängt von der Expressionsstärke des Transgens und der COX-2-Aktivität ab und wird durch selektive COX-2-Inhibitoren vollständig unterdrückt. Auffallend sind Störungen der Haarfollikelentwicklung, eine starke Talgdrüsenhyperplasie und eine massive epidermale Hyperplasie als Folge einer gestörten epidermalen Differenzierung und Kompartimentalisierung. Die epidermalen Dysplasien gleichen präneoplastischen Veränderungen bei der chemisch induzierten Maushautkarzinogenese und bei seborrhoischen Keratosen des Menschen. Eine starke Gefäßneubildung in der unmittelbaren Umgebung der Dysplasien zeigt zudem einen proangiogenen Effekt des Transgens, der mit einer verstärkten Bildung des proangiogenen Prostaglandins PGE2 bei gleichzeitiger Verminderung des anti-angiogenen 15-Desoxy-PGJ2 korreliert. Durch das COX-2-Transgen wird die Krebsanfälligkeit extrem erhöht. So bilden sich Hauttumore allein nach Initiation, d.h. unter Bedingungen, bei denen bei Wildtyp-Tieren überhaupt keine Tumore entstehen. Dieser Befund belegt einen Kausalzusammenhang zwischen COX-2 und Tumorpromotion, indem er zeigt, dass die Haut COX-2-transgener Mäuse auto-promoviert ist. Darüber hinaus entwickeln transgene Tiere - nicht aber Wildtyp-Tiere - im Karzinogeneseexperiment zahlreiche Tumore in anderen das Transgen exprimierenden Epitehlien (unveröffentliche Ergebnisse). Die äußerst niedrigen Karzinogendosen, die bei COX-2Überexpression für eine Krebsentstehung ausreichen, dürften denen in unserer täglichen Umwelt entsprechen. Danach wäre eine aberrante COX-2-Überexpression, wie sie sich nicht nur in manifesten Neoplasien sondern auch in zahlreichen Präneoplasien des Menschen findet, ein Krebsrisikofaktor ersten Ranges, zugleich aber auch ein vielversprechender Angriffspunkt für Chemoprävention. Ziele zukünftiger Untersuchungen sind: 1. die Charakterisierung der COX-2-abhängigen Tumorentwicklung in der Brustdrüse, der Prostata und dem Pankreas der transgenen Mauslinien 2. die Identifizierung und Charakterisierung von „stromaufwärts“ und „stromabwärts“ von COX-2 plazierten Enzymen des Arachidonsäurestoffwechsels und Prostanoid-Rezeptoren, die an der COX-2-regulierten Prostaglandinsynthese bzw. der Prostanoidfunktion beteiligt DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation sind und deren Expression mit der COX-2-Überexpression gekoppelt ist (z.B. Phospholipasen vom A2-Typ (Freisetzung von Arachidonsäure) und Prostaglandinsynthasen sowie G-Protein-gekoppelte Oberflächenrezeptoren für Prostaglandine und Kernrezeptoren der PPAR-Transkriptionsfaktorfamilie. 3. die Analyse COX-2-abhängiger Protein-Expression 2. Lipoxygenasen P. Krieg, M. Heidt, K. Müller, M. Siebert, A. Zagorski, F. Marks, G. Fürstenberger Kooperation mit Prof. Dr. H. Bartsch und Dr. Nair, Prof. Dr. W. D. Lehmann, Dr. von der Lieth, DKFZ sowie Prof. Dr. B. Marian, Institut für Tumorbiologie der Universität Wien, Österreich; Prof. Dr. Hartmut Kühn, Institut für Biochemie der Charité, Berlin; Prof. A. Brash, Vanderbilt University, Nashville, USA; Prof. K. Honn, Wayne State University, Detroit, USA; Dr. P.L. Grover, Institute of Cancer Research, Haddow Laboratories, Sutton, UK und der Firma L’Oreal, Paris, Frankreich. Zusatzfinanzierung DFG, Deutsche Krebshilfe Lipoxygenasen (LOX) katalysieren die Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren und stellen so zusammen mit weiteren Enyzmen eine Reihe von bioaktiven Lipidmediatoren wie Hydroxyeicosatetraensäuren (HETE), Leukotriene u.a. bereit [1, 6, 18]. Die LOX- Reaktion ist zugleich eine Quelle für reaktive (gentoxische) Sauerstoffspezies und damit eine mögliche Ursache für „oxidativen Stress“ [1, 2].Im Maushautmodell zeigen Lipoxygenasehemmstoffe eine ähnliche Antitumorwirkung wie die Cyclooxygenaseinhibitoren. Damit werden auch die Lipoxygenasen zu potentiellen Angriffspunkten für Krebschemoprävention. Charakterisierung epidermaler Lipoxygenasen Ausgehend von cDNA aus normaler, hyperplastischer und neoplastischer Haut haben wir sechs verschiedene LOXFormen kloniert und charakterisiert. Zwei davon, die Blutplättchen- und die Leukozyten-12S-LOX (p12S-LOX und l12S-LOX) waren bereits bekannt, die anderen wurden erstmals von uns beschrieben. Dabei handelt es sich um eine e12S-LOX, eine 8S-LOX, eine 12(R)-LOX (die erste Säuger-LOX mit R-Chiralität!) und eine Epidermis-LOX-3. Mit diesen LOX haben wir eine Unterfamilie der LOX, die sog. Epidermis-Typ LOX (eLOX) entdeckt [1, 6, 12, 18]. Die entsprechenden Gene dieser Unterfamilie befinden sich eng benachbart in einem Cluster auf dem zentralen Abschnitt des Mauschromosoms 11, die orthologen menschlichen Gene auf dem syntenen Locus 17p13.1 [12]. Den epidermalen LOX gemeinsam ist, dass sie die konventionellen LOX-Substrate Arachidonsäure und Linolsäure nur mit sehr geringer Effizienz umsetzen [3, 11]. Vermutlich sind komplexere Lipide, wie sie speziell in der Haut vorkommen, Substrate dieser LOX-Familie. Expression epidermaler Lipoxygenasen. Die Haut von Mäusen zeigt ein charakteristisches, von der terminalen Keratinozyten-Differenzierung abhängiges Expressionsmuster von LOX, das sich bei Gewebsreizung und Tumorbildung ändert [6, 8]). So werden z.B. nach TPA-Behandlung die konstitutiv exprimierten p12S-LOX, e12S-LOX, 12R-LOX und Epidermis-LOX-3 sowie die in Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation normaler Epidermis nicht nachweisbare 8S-LOX transient induziert, und in Hauttumoren sind 8S- und p12S-LOX aberrant exprimiert und für die massiv erhöhten Spiegel der Eicosanoide 8- und 12-HETE im Tumorgewebe verantwortlich [1, 8, 18]. Diese hohen HETE-Spiegel korrelieren mit der Bildung von Nukleotid-Etheno-Addukten in der DNA der Tumore [2] und in primären Keratinozyten induzieren 8- und 12-HETE chromosomale Aberrationen [1, 18]. Danach wären 8S- und Blutplättchen-12S-LOX gentoxische und somit evtl. „prokarzinogene“ Enzyme. Im Gegensatz dazu wird die Expression von e12-LOX, Epidermis-LOX-3 und 12R-LOX bei der Tumorgenese unterdrückt. Hierbei könnte es sich also um „antikarzinogene“ Enzyme handeln. Funktion epidermaler LOX in vivo: Transgene Mausmodelle Hinweise auf pro- und antikarzinogene LOX-Wirkungen haben wir bei der Analyse von transgenen Tieren erhalten, die e12S-LOX unter Kontrolle des Keratin-6-Promotors konstitutiv überexprimieren. Bei solchen Tieren hängt die Tumorentwicklung von der Expressionsstärke des Transgens und einer dadurch veränderten Expression anderer LOX-Isoenzyme ab. So kommt es bei niedriger TransgenExpression zu einer Induktion der l12S-LOX und zu einer Akkumulation ihres Linolsäure-Produktes 13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE), was mit einer im Vergleich zum Wildtyp geringeren Tumorbildung korreliert. Dagegen führt eine hohe Expression des Transgens zu einer verstärkten Expression der p12S-LOX gepaart mit einer Akkumulation des Arachidonsäure-Produktes 12-HETE. Dieses korreliert mit einer verstärkten Tumorbildung. Unsere Beobachtungen unterstützen damit nicht nur Berichte anderer Autoren über eine antagonistische Wirkung von 12HETE und 13-HODE bei der epithelialen Tumorentwicklung, sondern auch zahlreiche Untersuchungen, denen zufolge eine Linolsäure-reiche (pflanzliche) Ernährung eher krebsverhütend, eine Arachidonsäure-reiche (tierische) Diät dagegen eher krebsfördernd wirkt. Wie es zu dem beobachteten „Cross-talk“ zwischen den verschiedenen LOX-Formen kommt, ist allerdings noch völlig unklar [22]. Zu den potentiell „antikarzinogenen“ LOX könnte auch die 12R-LOX gehören, da deren Expression bei der Tumorentwicklung ebenfalls unterdrückt wird. Die Rolle dieser Isoform bei der Karzinogenese soll mit Hilfe von Mauslinien untersucht werden, bei denen das 12R-LOX-Gen gewebsspezifisch (in der Epidermis) ausgeschaltet werden kann. Das entsprechende konditionale12R-LOX-KnockoutKonstrukt wurde bereits hergestellt. Ziele künftiger Untersuchungen sind: 1 Identifizierung der Substrate und Produkte der epidermalen LOX 2. Analyse der LOX-Funktion in Keratinocyten mit Hilfe von induzierbaren Expressionsystemen (TET-on/off) 3. Charakterisierung des „Cross-talk“ zwischen LOXIsoenzymen in vivo nach gewebesspezifischer Überexpression oder Ausschaltung individueller LOX in der Epidermis von Mäusen 4. Identifizierung von LOX-Isoenzymen als potentielle Targets für Krebschemoprävention. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 73 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Marks, F., Fürstenberger, G.: Cancer chemoprevention through interruption of multistage carcinogenesis: The lessons learned by comparing mouse skin carcinogenesis and human large bowel cancer. Europ. J. Cancer 36, 314-329 (2000). [2] Nair, J., Fürstenberger, G., Bürger, F., Marks, F., Bartsch, H.: Promutagenic etheno-DNA adducts in multistage mouse skin carcinogenesis: correlation with lipoxygenase-catalyzed arachidonic acid metabolism. Chem. Res. Toxicol. 13, 703-709 (2000). [3] Bürger, F., Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: Positional and stereo selectivity of fatty acid oxygenation catalyzed by murine 12S-lipoxygenase isozymes. Biochem. J. 348, 329-335 (2000). 74 [4] Müller, K., Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: Expression of PGF2? receptor mRNA in normal, hyperplastic, and neoplastic skin, and in other mouse tissues. Carcinogenesis 21, 1063-1066 (2000). [5] *Schadow, A., *Scholz-Pedretti, K., *Scholz, K., *Lambeau, G., *Gelb, M.H., Fürstenberger, G., *Pfeilschifter, J., *Kaszkin, M.: Characterization of group X phospholipase A2 as the major enzyme secreted by human keratinocytes and its regulation by the phorbol ester TPA. J. Invest. Dermatol. 116, 31-39 (2001). [6] Heidt, M., Fürstenberger, G., Vogel, S., Marks, F., Krieg, P.: Diversity of murine lipoxygenases: identification of subfamily of epidermal isozymes exhibiting a differentiation-dependent mRNA expression pattern. Lipids 35, 701-707 (2000). [7] Manzow, S., Richter, K.H., Stempka, L., Fürstenberger, G., Marks, F.: Evidence against a role of general protein kinase C downregulation in skin tumor promotion. Int. J. Cancer 85, 503507 (2000). [8] Marks, F., Müller-Decker, K., Fürstenberger, G.: A causal relationship between unscheduledeicosanoid signaling and tumor development: cancer chemoprevention by inhibitors of arachidonic acid metabolism. Toxicology 153, 11-26 (2000) [9] *Chariyalertsak, S., *Sirikulchayanonta, V., Mayer, D., KoppSchneider, A., Fürstenberger, G., Marks, F., Müller-Decker, K.: Aberrant cyclooxygenase isozyme expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Gut 48, 80-86 (2001) [10] *Richter, M., *Weiss, M., *Weinberger, I., Fürstenberger, G., *Marian, B.: Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by cyclooxygenase inhibitors. Carcinogenesis 22, 17-25 (2001). [11] Siebert, M., Krieg, P., Lehmann, W.D., Marks, F., Fürstenberger, G.: Enzymatic characterization of epidermisderived 12-lipoxygenase isoenzymes. Biochem J. 355, 97-104 (2001). [12] Krieg, P., Marks, F., Fürstenberger, G.: A gene cluster encoding human epidermis-Type lipoxygenases at chromosome 17p13.1: Cloning, physical mapping, and expression. Genomics, 73, 323-330 (2001). [13] Neufang, G., Fürstenberger, G, *Heidt, M., Marks, F., MüllerDecker, K.: Abnormal differentiation of epidermis in transgenic mice constitutively expressing cyclooxygenase-2 in skin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 98, 7629-7634 (2001). [14] Breitenbach, U., Tuckermann, J.P., Gebhardt, C., Richter, K.H., Fürstenberger, G., *Christofori, G., Angel, P.: Keratinocytespecific onset expression in experimental of serine protease BSSP carcinogenesis. J. Invest. Dermatol. 117, 634-640 (2001). [15] Marks, F.: Cancer-linked genes. Meeting Report. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126, 661-666 (2000). [16] Marks, F.: Der Stoffwechsel der Arachidonsäure: ein riskantes Bravourstück der biochemischen Evolution. Biologie in unserer Zeit 30, 342-352 (2000). [17] Marks, F.: Krebs- und Alzheimer-Prävention mit nichtsteroidalen Entzündungshemmern. Deutsche Medizin. Wschr. 126, 308-314 (2001). Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation [18] Fürstenberger, G., Marks, F., Krieg, P.: Arachidonate 8(S)Lipoxygenase. Prostaglandins and other lipid mediators. J. Lipid Med. Cell Signalling, in press [19] Müller-Decker, K., Hirschner, W., Marks, F., Fürstenberger, G.: The effects of COX isozyme inhibition on incisional wound healing in mouse skin. J. Invest. Dermatol., in press [20] Müller-Decker, K., Chariyalertsak, S., Albert, C., Reinerth, G., Marks, F., Fürstenberger, G.: Cyclooxygenase-2: A molecular target for chemoprevention of epithelial tumors of skin and colon. In: Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases, 6 (Ed. Honn et al.) Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. In press [21] Marks, F., Fürstenberger, G., Müller-Decker, K.: COX-2, an endogenous tumor promoter and target for the chemoprevention of colorectal cancer and other neoplastic diseases. In: „Hormone Replacement Therapy and Cancer“. In press. [22] Müller, K. Siebert, M., Heidt, M., Marks, F., Krieg, P., Fürstenberger, G.: Modulation of epidermal tumor development caused by targeted overexpression of epidermis-type 12Slipoxygenase. Cancer Res., in press Differenzierung von normaler und neoplastischer Epidermis Leiter: Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schweizer Die Proteinfamilie der Keratine umfaßt die epithelialen Keratine, die in Zellen der verschiedenen Epitheltypen das 10 nm Intermediärfilamentnetz ausbilden, und die Haarkeratine, die am Aufbau von Haaren und Nägeln beteiligt sind. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen steht die Charakterisierung der komplexen Multigenfamilien menschlicher Haarkeratine sowie Untersuchungen zu deren Expression und Regulation im normalen und pathologisch veränderten Haarfollikel. Darüberhinaus beginnen wir mit der Charakterisierung der Multigenfamilien Haarkeratin-assoziierter Proteine, KAP, die die Matrix für Haarkeratin-IFs bilden. In beiden Fällen untersuchen wir ebenfalls die Beziehungen zwischen erblichen Haaranomalien und Mutationen in den Mitgliedern der Multigenfamilien. 1. Aufklärung der humanen Haarkeratin- und KAP-Multigenfamilien J. Schweizer, M.A. Rogers, H. Winter In Zusammenarbeit mit Dr. L. Langbein, DKFZ; Drs. N. Aoki, Y. Shimomura, Hautklinik Niigata, Japan Zusatzfinanzierung DFG. Der Haarfollikel ist das morphologisch komplexeste Anhangsorgan der Epidermis. Am Aufbau seiner unterschiedlichen Gewebekompartimente spielen sowohl epitheliale Keratine als auch Haarkeratine als zelluläre Strukturproteine eine wesentliche Rolle. Mit Hilfe genomischer und cDNA-Banken konnten wir die gesamte Multigenfamilie der humanen Haarkeratine aufklären. Sie umfasst insgesamt 20 Gene, die in zwei Subfamilien auf Chromosom 12q13 (Typ II: 6 funktionelle Gene, 4 Pseudogene) bzw. Chromosom 17q12-21 (Typ I: 9 funktionelle Gene, 1 transkribiertes Pseudogen) geklustert sind [1, 2, 3]. Mit Hilfe spezifischer Antikörper und cDNA-Sonden konnten wir die exakte Abfolge der Haarkeratinexpression im haarbildenden Kompartiment des Follikels ermitteln und einen Katalog humaner Haarkeratine erstellen [1, 2, 3]. Im Verlauf der genomischen Untersuchungen gelang es uns, mehre- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation re neue Gene epithelialer Keratine zu identifizieren, von denen einige spezifisch in der inneren Wurzelscheide des Haarfollikels exprimiert werden [4]. Darüberhinaus konnten wir innerhalb der Typ I Keratingendomäne auf Chromosom 17 fünf KAP-Multigenfamilien charakterisieren und die Expression ihrer Mitglieder im Haarkortex nachweisen [5]. 2. Haarkeratin- und KAP-Mutationen und Haaranomalien J. Schweizer, H. Winter, M.A. Rogers In Zusammenarbeit mit Dr. P. Vabres, Hautklinik Poiters, Frankreich; Dr. A. Taieb, Hautklinik Bordeaux, Frankreich; Dr. D. Schissel, US Army Hospital, Heidelberg; Drs. M. Krawczak, D.N. Cooper, Humangenetik Cardiff, UK; Dr. P.Heidt, Primatenzentrum Nijmwegen, Niederlande. Zusatzfinanzierung DFG. In klinischen Kooperationsprojekten über Mutationen in Haarkeratingenen und erbliche Haaranomalien wurden die Untersuchungen der Haaranomalie Monilethrix abgeschlossen. Monilethrix stellt bisher die einzige bekannte Haarkeratinkrankheit dar [6]. Untersuchungen an Patienten, die am sogenannten „Loose Anagen Hair“ Syndrom leiden, ergaben Hinweise für die mögliche Involvierung eines mutierten epithelialen Keratins der inneren Wurzelscheide, das für die gestörte Verankerung des Haarschaftes im Follikel verantwortlich sein könnte [8]. Die Untersuchungen an der Haaranomalie Pseudofollicultis barbae, die in Zusammenarbeit mit der US Army Heidelberg erfolgen, stehen kurz vor dem Abschluß. An der Ausbildung der für diese Anomalie typischen entzündlichen Prozesse im Gesichtsbereich, die durch einwachsende Haare verursacht werden, scheint neben dem Haarphänotyp, die Beteiligung einer Mutation im epithelialen Keratin K6hf gesichert. Letzteres wird im sogenannten Companion layer, zwischen der äußeren und inneren Wurzelscheide exprimiert. In mutierter Form könnte es zu einer Destabilisierung des wachsenden Haares beitragen. Schließlich konnten wir nachweisen, daß das im Typ I Haarkeratin-Genlokus auftretende Pseudogen ϕhHaA , das durch eine Punktmutation inaktiviert wurde, im Schimpansen und Gorilla intakt ist. Augenblicklich untersuchen wir ob es in den Primatenhaaren auch zur Expression eines funktionellen Haarkeratins kommt. Abteilung B0500 Biochemie der gewebsspezifischen Regulation 3. Regulation der Haarkeratinexpression L.F. Jave-Suarez, H. Winter, J. Schweizer In Zusammenarbeit mit Dr. B. Cribier, Hautklinik Strassburg, Frankreich Mit der Aufklärung der Gene der humanen Haarkeratine waren die Voraussetzungen für Studien zur Regulation der Hairkeratinexpression gegeben. Ihm Rahmen einer Doktorarbeit konnten wir nachweisen, daß des das Homöobox-Protein HOXC13 an der Expressionskontrolle von Haarkeratingenen beteiligt ist, die während der frühen Differenzierungsphase im haarbildenden Kompartimente exprimiert werden. Die Expressionskontrolle verläuft dabei über mehrere Bindungselemente im proximalen Promotorbereich der Gene, von denen eines nicht von anderen HOX13 Paralogen erkannt wird. Es bestehen Evidenzen, daß der ß-Catenin/LEF-1 Transkriptionskomplex an der Regulation der Expression von Kortexkeratin-Genen beteiligt ist. Die Untersuchungen über die Expressionskontrolle eines in der Medulla von Sexualhaaren exprimierten Keratins durch den Androgenrezeptor stehen kurz vor dem Abschluß. Im engen Zusammenhang mit diesen Studien stehen Untersuchungen zur Expression von Haarkeratingenen und Transkriptionsfaktoren in humanen haarfollikelabgeleiteten Tumoren, die in Zusammenarbeit mit der Hautklinik Straßburg durchgeführt werden und deren Ziel eine verbesserte Klassifizierung dieser Tumoren ist [7]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Rogers M. A, Winter H, Langbein L, Schweizer J. Characterization of a 300 kpb region of human DNA containing the type II hair keratin gene locus. J. Invest. Dermatol. 114, 464472, 2000 [2] Langbein L, Rogers M. A, Winter H, Praetzel S, Schweizer J. The catalog of human hair keratins - II. Expression of the six type II members in the hair follicle and the combined catalog of human type I and II keratins. J. Biol. Chem. 276, 35123-35132, 2001 [3] Rogers M. A. Keratins and keratin diseases. In: Encyclopaedia of the Human Genome, Nature Publishing Group, Macmillan Press, Hampshire, England. Im Druck [4] Langbein L, Rogers M. A, Praetzel S, Winter H, Schweizer J. A novel epithelial keratin, hK6irs1, is expressed differentially in all layers of the inner root sheath, including specialized Huxley cells (“Flügelzellen”) of the human hair follicle. J. Invest. Dermatol, Im Druck [5] Rogers M. A, Langbein L, Winter H, Ehmann C, Praetzel S, Korn B, Schweizer J. Characterization of a cluster of human high/ ultrahigh sulfur keratin-associated protein genes embedded in the type I keratin gene domain on chromosome 17q12-21. J. Biol. Chem. 276, 19440-19451, 2001 [6] Winter H, Rogers M A, Vabres , P*. Larrègue M*, Schweizer J. A novel missense mutation, A118E, n the the helix initiation motif of the type II cortex keratin hHb6 causing monilethrix. Hum. Heredity 50, 322-324, 2000 [7] Cribier B*, Peltre B*, Langbein L, Winter H, Schweizer J, Grosshans E*. Expression of type I hair keratins in follicular tumors. Brit. J. Dermatol. 144, 977-982, 2001 [8] Chapalain, V, Winter H, Langbein L, LeRoy JM,* Labrèze C*, Nikolic M*, Schweizer, J, Taieb A*. Is the loose anagen hair syndrome a keratin disorder? A clinical and molecular study. Arch. Dermatol. Im Druck DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 75 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro Abteilung Differenzierung und Carcinogenese (B0600) Leiter: Prof. Dr. med. Norbert E. Fusenig Wissenschaftliche Mitarbeiter PD. Dr. Dirk Breitkreutz Dr. Nicole Maas-Szabowski Dr. Margareta Müller Dr. Hans-Jürgen Stark Dr. Silvia Vosseler Gastwissenschaftler Dr. Nicole Mirancea, Rumänien (01-12/00; 06-12/01) 76 Doktoranden Nicole Daum Lars Langeloh Joachim Mertens Martina Oehme Anja Stärker Claudia Gutschalk Wiltrud Lederle Eva Obermüller Cathrine Schmidt Michael Willhauck Diplomanden Martina Koci Technische Angestellte Regina Beck (50%) Angelika Krischke Heinrich Steinbauer Eva Goedecke Sekretariat Martina Kegel Silke Haid (25%) Iris Martin Elke Tomakidi Alexandra Krämer Im Mittelpunkt der Untersuchungen der Abteilung stehen zelluläre und molekulare Mechanismen der Zell-Zell und Zell-Matrix-Wechselwirkungen von Hautzellen und ihre steuernde Rolle für die Regeneration und Differenzierung des normalen Hautepithels einerseits und andererseits für die Entwicklung und Progression von epithelialen Hauttumoren. Die ebenfalls durchgeführten Arbeiten zum Mehrstufenprozess der Hautcarcinogenese sind im Bericht der Abteilung B0900 von der ehemaligen Mitarbeiterin Frau PD Dr. Petra Boukamp dargestellt. Ziel der Forschungsarbeiten ist ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge der Transformation humaner Epithelzellen zu Carcinomzellen und deren veränderter Wachstumsregulation im Vergleich zu den Steuerungsmechanismen im normalen Gewebe. Für diese überwiegend in Zellkultur durchgeführten Studien haben wir zelluläre Modelle und komplexe Kultursysteme entwickelt, die der natürlichen Situation im Organismus weitgehend entsprechen. Ausgehend von normalen Epithelzellen der adulten menschlichen Haut (Keratinozyten) wurde eine spontan immortalisierte Zellinie (HaCaT) entwickelt und als weitestgehend normal funktonierende Keratinozytenlinie charakterisiert. Ihre überwiegend regulären epidermalen Eigenschaften qualifizierten diese Zellen i) als Paradigma für humane Keratinozyten und machten sie ii) auch auf Grund ihrer vielfältigen Manipulierbarkeit zu einem weltweit begehrten Modellsystem, das derzeit in weit mehr als 2000 Laboratorien für verschiedene Fragestellungen verwandt wird. Nach genetischen (Transfektion des Ha-ras Onkogenes und von Wachstumfaktoren) und epigenetischen Manipulationen der HaCaTZellen (Stresseinwirkung, extensive Passagierung in vitro) konnten tumorigene Klone mit benignen, malignen und metastasierenden Wachstumseigenschaften identifiziert werden. Wenn auch die Entstehung von Tumoren sowie ihr autonomes Wachstumsverhalten ursächlich auf genetischen Veränderungen einer Einzelzelle begründet sind, ist das komplexe Phänomen des Tumorwachstums (mit Invasion und Metastasierung) nur im Rahmen der veränderten Wechselwirkung von Tumorzellen und ihrem umgebenden Gewebe im Organismus zu verstehen. Ohne die spezifische Interaktion mit Bindegewebe und Blutgefäßen ist das Wachstum auch der aggressivsten Tumorzellen auf mikroskopisch kleine Tumor-Knoten limitiert. Ebenso wird die Homöostase eines normalen Gewebes wie der Epidermis, d.h. die Balance zwischen Wachstum und Differenzierung der Epithelzellen, über komplexe Zell-Zell und Zell-MatrixWechselwirkungen gesteuert. Die zellulären und molekularen Mechanismen dieser epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen, durch die Wachstum, Differenzierung und Gewebestrukturierung normaler Keratinozyten, aber auch das Wachstumsverhalten von Tumorzellen gesteuert werden, waren und sind Gegenstand der Untersuchungen in den einzelnen Arbeitsgruppen der Abteilung. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation I. Mechanismen der Epithel-MesenchymWechselwirkungen zur Steuerung von Wachstum und Differenzierung normaler Keratinozyten Für den Erhalt der Funktion und Struktur von Geweben ist das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Differenzierung, die Gewebe-Homöostase, unabdingbare Voraussetzung. Dies wird maßgeblich über Zell-Zell und Zell-Matrix Interaktionen gesteuert, wobei insbesondere den EpithelMesenchym-Wechselwirkungen eine herausragende Rolle zukommt. Im Fall der Haut erfolgt dieser Austausch zwischen der Epidermis und der Dermis als dem zugehörigen Bindegewebe über die Basalmembran, einer speziellen Struktur der extrazellulären Matrix. Entsprechend hatten unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, daß zur Kontrolle epidermaler Wachstums- und Differenzierungs-Vorgänge zwischen beiden Gewebekompartimenten äußerst komplexe Regelkreise existieren. Als experimentelle Basis zur Analyse dieser Wechselwirkungen waren zunächst epidermale Keratinozyten und Fibroblasten aus verschiedenen Hautbereichen isoliert und die Expressionsprofile von relevanten Cytokinen und zugehörigen Rezeptoren in konventionellen Mono- und Kokulturen erfaßt worden [1, 2]. Im Gegensatz zu diesem herkömmlichen Ansatz konnte in organotypischen Zellkulturen eine der Haut ähnliche Situation rekonstruiert werden. Hierbei wachsen Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ 1) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Bindegewebszellen. So bilden unter dem Einfluß dermaler Fibroblasten die epidermalen Keratinozyten geschichtete und differenzierende Oberflächenepithelien, die im Gegensatz zu konventionellen Kulturen eine definierte Struktur und Polarität aufweisen. Dabei werden spezifische Gewebecharakteristika in Struktur und Funktion augebildet, vergleichbar mit dem Ursprungsgewebe der Epidermis [3, 4, 5]. Als experimentelles Bezugssystem für das Wachstumsund Differenzierungspotential individueller Zellpopulationen unter in vivo Bedingungen diente standardmäßig das etablierte Oberflächen-Transplantations-Modell auf der Nacktmaus. Mit retransplantierten normalen Keratinozyten hatten wir eine vollständige Wiederherstellung der epidermalen Gewebestruktur und Funktion erzielen können [6]. Dieser Prozeß erfolgte ähnlich der Wundregeneration über definierte Stadien und offensichtlich ohne direkte mesenchymale Zellkontakte, war also weitgehend über diffusible Faktoren reguliert. Während hierbei die Evidenz noch überwiegend morphologisch gestützt war, ermöglichten in neueren Arbeiten die organotypischen Kokulturen einen direkten funktionellen Nachweis von Regelkreisen über lösliche Mediatoren. Die getrennte Analytik des Epithelbzw. Bindegewebeanteils der dreidimensionalen organotypischen Kokulturen erlaubte hierbei eindeutige Aussagen über den wechselseitigen Steuerungsprozess zwischen Keratinozyten und Fibroblasten auf molekularer Ebene und damit über die regulatorische Bedeutung des dermalen Parts für die Steuerung der Epidermis-Struktur und -Funktion. Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro 1. Paracrine Regulation der Proliferation und Differenzierung normaler Keratinozyten N. Maas-Szabowski, H.-J. Stark, A. Stärker, M. Willhauck Kooperationen mit P. Angel, DKFZ; R. Wolber, Beiersdorf AG, Hamburg; Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme, Italien Nach früheren ersten Hinweisen, daß die Steuerung der epidermalen Proliferation und Differenzierung maßgeblich über diffusible Faktoren aus dermalen Zellen erfolgt, konnten wir in Kokulturen epidermaler Keratinozyten mit dermalen Fibroblasten einen neuen Mechanismus von doppelt-parakrinen Regelkreisen aufzeigen [6]. So konnte in organotypischen Kokulturen ein bisher nicht bekanntes Zusammenspiel einiger diffusibler Faktoren identifiziert werden. In Kultur sezernieren Keratinozyten verstärkt Interleukin 1 (IL-1), in etwa vergleichbar der Wundsituation in vivo. IL-1 induziert dann in Fibroblasten, neben Proliferation, die vermehrte Expression seines Signalempfängers, des IL-1-Rezeptors, sowie die Expression und Synthese verschiedener Wachstumsfaktoren und Interleukine. Unter anderem werden KGF (keratinocyte growth factor) und GM-CSF (granulocyte macrophage colonie stimulating factor) verstärkt exprimiert [7]. Während die Stimulation der Keratinozyten-Proliferation durch KGF bereits bekannt war, konnten wir in unserem System dies auch für den hämatopoietischen Faktor GM-CSF zeigen. Wie wir weiter in heterologen Kokulturen mit Mausfibroblastenlinien, die Defizienzen in AP-1-Transkriptionsfaktor-Untereinheiten aufwiesen, zeigen konnten, wird die Expression von KGF und GMCSF nach IL-1-Induktion antagonistisch von den AP-1-Untereinheiten c-Jun und Jun-B gesteuert. Hierbei induziert c-Jun die Transkription beider Cytokine, wohingegen JunB die transkriptionelle Aktivität von KGF und GM-CSF unterdrückt. In Hautäquivalenten konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß KGF und GM-CSF die Proliferation der Keratinozyten stimulieren und GM-CSF zusätzlich in den Differenzierungsprozess der Epithelregeneration eingreift [8, 9]. Neben KGF und GM-CSF spielen jedoch noch weitere Cytokine eine essentielle Rolle bei der Epithelbildung sowie der Aufrechterhaltung der Hautstruktur, da beide Faktoren gemeinsam die Abwesenheit von Fibroblasten in organotypischen Kulturen nicht kompensieren konnten. In heterologen Kokultursystemen mit genetisch veränderten Fibroblasten werden deshalb zur Zeit weitere Faktoren der dermal-epidermalen Kommunikation identifiziert. Darüberhinaus werden die molekularen Mechanismen eingehend analysiert, die KGF und GM-CSF in den Keratinozyten auslösen, insbesondere die von ihnen induzierten Zielgene, die für die Entwicklung einer normalen Epidermisstruktur verantwortlich sind. Der derzeitige Stand bei der Herstellung organotypischer Keratinozyten-Fibroblasten-Kokulturen erlaubt ihre reproduzierbare Bereitstellung für experimentelle Zwecke und hat es somit ermöglicht, grundlegende Phänomene der epidermalen Regeneration in vitro zu untersuchen. Wichtige Standardisierungsmaßnahmen an diesem Kulturmodell DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 77 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation 78 waren hierbei einmal die Einstellung auf definiertes Kulturmedium und zum anderen die Kontrolle der Fibroblastenpopulation durch Verwendung postmitotischer Zellen erreicht werden, ohne daß funktionelle Einbußen eintraten [3]. Weiterhin konnten neuerdings durch Verwendung von biokompatiblen Gerüstmaterialien und dermalen Fibroblasten Dermisäquivalente in vitro produziert werden, die sich durch autonome Produktion extrazellulärer Matrix auszeichnen und eine gut geeignete mesenchymale Unterlage für Keratinozyten in Kokultur bieten. Neben verbesserter mechanischer Stabilität liegt ihr Vorteil auch darin, daß sie im Hinblick auf klinische Anwendung (Tissue Engineering von Hautersatz) ein immunologisch völlig humanisiertes System ohne artfremdes Strukturprotein wie tierisches Kollagen darstellen. In derartigen Hautäquivalenten werden derzeit die Einflüsse des Epithels auf die ECM-Synthese untersucht, was auch im Kontext der Charakterisierung von (Wund- und Tumor-) Stromabildung in vivo von Bedeutung ist. Aufgrund ihrer genetischen Veränderungen, aber auch ihres in vitro Wachstumsverhaltens repräsentieren die Zellen der immortalen humanen Keratinozytenlinie HaCaT ein Frühstadium der Hautcarcinom-Entwicklung. Die detaillierte Analyse ihrer funktionellen Kompetenz unter optimalen, d.h. in vivo Bedingungen, hatte eine weitgehend normale Epithelbildung, allerdings mit verzögerter Kinetik gezeigt. Alle Differenzierungsmarker wurden regelrecht exprimiert, wobei allerdings der strukturelle Aufbau des neu gebildeten Epithels weniger geordnet war und erst nach drei Wochen eine weitgehend normale (othokeratotische) Hornschicht erkennen ließ [10]. Diese regulatorischen Defizite wurden in dem in vitro Modell der organotypischen Kokultur noch deutlicher. Obwohl HaCaT Zellen in konventionellen Kulturen eine größere Wachstumspotenz zeigen als normale Keratinozyten, war dies bei Kultivierung auf Kollagenmatrix und in Anwesenheit von Fibroblasten reduziert [11]. Die Analyse der molekularen Mechanismen dieser gestörten Epithel-Mesenchym-Wechselwirkung, insbesondere der für die Proliferation normaler Keratinozyten aufgezeigten Regelkreise, ist von großem Interesse und wird derzeit intensiv verfolgt. 2. Epithel-mesenchymale Wechselwirkungen in der Produktion der Basalmembran D. Breitkreutz, C. Schmidt, N. Daum, N. Mirancea Kooperation R. Nischt und T. Krieg, Dermatologie, Universität Köln; U. Werner und M. Gerl, Aventis Deutschland Entsprechend der Wachstumsregulation von Keratinozyten konnte auch die postulierte interaktive Bildung der Basalmembran (BM) durch Keratinozyten und Fibroblasten in organotypischen Kokulturen schlüssig demonstriert werden. Die separate Analyse beider Gewebekompartimente auf mRNA und Proteinebene hatte bereits die wechselseitige Induktion und Dynamik der Synthese der BM-Komponenten gezeigt [12]. Zellspezifisch erfolgte hierbei lediglich die Synthese der Laminin-Isoform LN-5 in Keratinozyten und von Nidogen in Fibroblasten. Darüberhinaus konnten wir unter Verwendung definierter Medien (ohne Serum Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro oder Gewebeextrakte) direkte Effekte externer Faktoren nachweisen. Dabei zeigte sich ein ausgeprägter Synergismus zwischen TGFß und Vitamin A-Säure, die beide auf der Regulation der epithelialen Differenzierung eher antagonistisch wirken. Eine weitere Regulationsebene bei der BM-Bildung stellt die reguläre Verknüpfung ihrer Einzelkomponenten zu stabilen Co-Polymeren (BM-Assembly) dar, ein wesentlicher Vorgang für die funktionelle BM-Stabilität. Mit einem definierten Laminin-Fragment konnten wir gezielt die Interaktion von Laminin-10 mit der Quervernetzungs-Komponente Nidogen unterbinden und damit die Polymerisation einzelner BM-Komponenten völlig blockieren. Konventionelle sowie Immun-Elektronenmikroskopie machten dabei deutlich, daß neben dem Verlust distinkter BM-Strukturen und der aberranten Lokalisation von BMMolekülen auch Matrix-Verankerungsstrukturen (Hemidesmosomen) der basalen Keratinozyten völlig fehlten. Entsprechend war ebenfalls die Organisation des KeratinCytoskeletts erheblich gestört. Die Effekte waren dosisabhängig und reversibel. Außerdem waren Epithelwachstum und epidermale Differenzierung nicht nachhaltig beeinflußt, was die Spezifität dieses Eingriffs in BM-Organisation und Zell-Matrix-Interaktion klar unterstreicht. Spätere Stadien der Zelltransformation in Richtung Krebszelle, wie sie nach Onkogen-Transfektion an dem HaCaTModellsystem in Form von benignen und malignen Tumorzellen charakterisiert werden konnte, zeigten weitergehende Veränderungen in der Mesenchym-Wechselwirkung und extrazellulären Matrixproduktion. Besonders deutlich wurde dies in Oberflächentransplantaten auf der Nacktmaus, bei denen benigne Zellen differenzierte, leicht dysplastische Epithelien auf aktiviertem Granulationsgewebe bildeten, während maligne Zellen invasives Tumorwachstum zeigten. Dies korrelierte mit einem massiven Verlust der Zellpolarität, erkenntlich an der stark expandierten Zone von proliferierenden Zellen mit BasalzellCharakter sowie aberranten Keratinmustern [13]. Ein weiterhin typisches Merkmal maligner Zellen waren erhebliche Störungen in der Produktion von BM-Strukturen, wobei BM-Komponenten auch diffus in das benachbarte Tumorstroma diffundierten (bestätigt durch Immun-Elektronenmikroskopie). Entsprechend waren im Elektronenmikroskop nur marginal BM-Strukturen sichtbar, einschließlich defekter Zellverankerungs-Komplexe (Hemidesmosomen) an der Zell-Matrix-Interphase. In Analogie zur Keratinozyten-Rekrutierung bei der Wundheilung mit ähnlichen Veränderungen dürften diese wesentlich zur erhöhten Mobilität der Tumorzellen - vor allem bei invasivem Wachstum - beitragen. Eine Schlüsselrolle fällt hierbei den Matrixrezeptoren der Integrin-Familie, insbesondere Integrin α6β4 zu, das ein integraler Bestandteil der Hemidesmosomen ist. Der Beitrag dieses Integrins zur normalen sowie gestörten Signaltransduktion in Tumoren unter Protein Kinase C ist Gegenstand derzeitiger Untersuchungen. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation 3. Parakrine und autokrine Mechanismen in Tumorprogression und Stromamodulation M. Müller, C. Gutschalk, E. Obermüller, M. Oehme, M. Koci Kooperation mit Ch. Herold-Mende, HNO Klinik (Dr. C. Reisser) und Neurochirurgie Heidelberg (Dr. H.-H. Stein); A. Marmé, Universitätsfrauenklinik, G. Neufeld, Technion Haifa, Israel Tumorprogression, d.h. die Entwicklung zunehmend malignerer Varianten, ist durch eine verstärkte Wachstums-Unabhängigkeit der Tumorzellen von ihrer Umgebung (Stroma) charakterisiert, großteils bedingt durch eine veränderte Wachstumsfaktorexpression. In dieser Gruppe ist es kürzlich gelungen, einen bisher unbekannten Weg der autonomen Wachstumsregulation von besonders aggressiven (metastasierenden) HaCaT Tumorzellen zu entschlüsseln und auch dessen Bedeutung für humane Tumore, wie Glioblastome, Meningiome und Kopf-Hals-Tumore zu belegen. Unabhängig von der Art der tumorigenen Transformation der HaCaT Zellen (H-ras Onkogen oder Kultur-Stress) konnte, durch in vivo Passage als s.c. Nacktmaustumore, reproduzierbar die Malignität (Aggressivität) von HaCaT Tumorzellen bis hin zur Metastasierung gesteigert werden [14]. Mit dieser Tumorprogression geht stets eine de novo Expression der hämatopoietischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF einher [15]. Beide, ursprünglich als regulierende Faktoren des hämatopoietischen Systems identifizierte Proteine, wurden von uns erstmals als Progressions-assoziierte Faktoren für epitheliale und neuronale Tumorzellen nachgewiesen. Während die Expression der Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF bereits in nicht tumorigenen HaCaT Zellen zu finden ist, werden die Faktoren ausschließlich in hochgradig malignen Zellen exprimiert. Benigne Tumorzellen, die normalerweise zystische Tumore bilden, konnten durch die Transfektion mit beiden Faktoren zu malignen Tumorzellen transformiert werden. Die Neoexpression von G-CSF und GM-CSF steuert die Tumorprogression durch eine autokrine Stimulation von Tumorzellproliferation und Migration, aber auch über eine verstärkte Induktion von Tumorstroma und Angiogenese in vivo. Darüberhinaus wirken beide Faktoren chemotaktisch für Leukozyten und könnten auf diesem Wege auch für die Expression und Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen in Makrophagen und Granulozyten und damit für die Gewebedegradation im Rahmen der Invasion eine entscheidende Rolle spielen. In Weiterführung dieses Projekts gilt unser Interesse jetzt besonders den Veränderungen in der Tumor-Stroma-Interaktion, die in den hochgradig malignen Zellen durch die de novo Expression von G-CSF und GM-CSF bewirkt werden. Zur weiteren Analyse der veränderten Wachstumsregulation in Früh- versus Spät-Stadien der HaCaT-Tumorzellen finden derzeit cDNA-Array Studien zur Identifizierung zusätzlicher verändert exprimierter Wachstumsfaktoren statt. Den Daten zur Wirkung von G-CSF und GM-CSF auf Tumorwachstum und Progression steht die zunehmende klinische Verwendung beider Faktoren in der adjuvanten Tumortherapie zur Vermeidung von Strahlen und Chemotherapie-induzierter Neutropenie und Mucositis gegenüber, die daher möglicherweise kritisch bewertet werden Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro muß. Dies wird unterstützt durch die von uns nachgewiesene funktionelle Rolle von G-CSF und GM-CSF als autokrine Stimulatoren von Tumorzell-Proliferation und Migration in humanen Gliomen und Meningiomen [16, 17]. Der Beitrag beider Faktoren zur Tumorprogression spiegelt sich außerdem in einer statistisch signifikanten Korrelation der Expression beider Faktoren in Gliomen und Kopf-Hals-Tumoren mit einer kürzeren Überlebenszeit für die Patienten sowie in einem Überlebensnachteil mancher Patienten bei G-CSF unterstützter Therapie von KopfHals-Tumoren. Daher wollen wir in Fortführung dieser Studien die funktionelle Bedeutung von G-CSF und GM-CSF für Tumorprogression, Invasion und Metastasierung dieser Tumortypen in vivo im Nacktmausmodell verifizieren. 4. Tumor-Stroma-Wechselwirkungen steuern Invasion und Angiogenese S. Vosseler, H.-J. Stark, W. Lederle, M.M. Müller, M. Willhauck, J. Mertens In Kooperation mit J.M. Foidart, Universität Lüttich, Belgien; E. Fink, Universität München, V.M. Kähäri, Universität Helsinki, Finnland, W. Hartschuh, Universität Heidelberg Zahlreiche Arbeiten aus jüngster Zeit belegen die entscheidende Rolle von stromalen Zell- und Matrix-Elementen für Tumorentstehung, Invasion und Metastasierung. Neben der bekannten induzierenden Rolle von Tumorzellen auf Stromaveränderungen wird die Bedeutung von stimulierenden und hemmenden stromalen Einflüssen auf das Tumorwachstum zunehmend erkannt. Epitheliale Tumore wie Hautcarcinome weisen große Ähnlichkeiten mit der Wundheilungssituation auf, bei der sich der mesenchymale Gewebeanteil in spezifischer Weise zu Granulationsgewebe umbildet. Daher liegt ein Schwerpunkt unserer Forschungsaktivitäten auf der Analyse und funktionellen Charakterisierung solchen Granulationsgewebes. Erste Ergebnisse zeigten, daß die Stroma-Modulation durch Induktion einer Fremdkörperreaktion das invasive Wachstum maligner Tumorzellen entscheidend beeinflußt, je nach chemischer Zusammensetzung der verwendeten Materialien. Von der weiteren eingehenden Untersuchung dieses Phänomens sind wertvolle Erkenntnisse über stromale Parameter, die den Tumorphänotyp kontrollieren, zu erwarten. In vitro Ansätze, bei denen Tumor-Stroma-Äquivalente durch dreidimensionale Kultivierung von isolierten Zellen aus dem Stroma von Plattenepithelkarzinomen hergestellt und mit malignen und prämalignen Zellen kombiniert werden, sollen über die tumorregulierenden Mechanismen der stromalen Zellen Aufschluß geben und diese einer detaillierten Analyse zugänglich machen. Eines der wesentlichsten Elemente der veränderten Tumor-StromaWechselwirkung ist die durch Tumorzellen induzierte Angiogenese. Neben ihrer Bedeutung für die Ernährung und Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes werden der Gefäßneubildung zusätzliche, für das Tumorwachstum wesentliche Funktionen zugesprochen. Dementsprechend konnten wir im Transplantationssystem eine DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 79 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation 80 bisher nicht bekannte Interaktion von Angiogenese und Tumorinvasion nachweisen. Durch Blockade der Tumor-induzierten Angiogenese mittels Antikörper-vermittelter Inaktivierung eines Rezeptors (VEGF-R2) des potentesten Angiogenesefaktors VEGF (vascular endothelial growth factor) wurde nicht nur ein Einsprossen der Gefäße in den Tumor (Vaskularisierung), sondern überraschenderweise auch die Invasion der Tumorzellen unterbunden. Dieser bedeutende Befund einer so entscheidenden Wechselwirkung zwischen Gefäßsystem und Tumorinvasion ließ sich inzwischen auch an aggressiven Tumorvarianten, sowohl im Transplantationssystem als auch nach konventioneller subcutaner Injektion, erhärten. Wenn auch die mechanistischen Zusammenhänge noch unklar sind, belegen diese Ergebnisse eindeutig die essentielle Rolle der Gefäßneubildung, d.h. von aktivierten Endothelien, für die Tumorinvasion [18]. In einer Kooperationsstudie mit Prof. Hartschuh (Universitätshautklinik, Heidelberg) konnten wir zeigen, daß eine verstärkte Vaskularisierung von epithelialen Hauttumoren erst in Spätstadien auftritt [19]. Erst bei einem größeren Tumordurchmesser erfolgt die verstärkte Induktion von Angiogenese in diesen Tumoren, nicht jedoch in Frühstadien (aktinische Keratose), wie dies bei anderen Organtumoren berichtet wurde. Interessanterweise korreliert die verstärkte Vaskularisierung von Plattenepithelcarcinomen der Haut mit der ansteigenden Metastasierungshäufigkeit. Ein weiterer bedeutender funktioneller Aspekt der TumorStroma-Interaktion ist die Produktion und Regulation von Matrix-degradierenden Proteinasen, denen eine besondere Rolle bei der Tumorinvasion zukommt. So konnte die Expression verschiedener Proteasen, insbesondere Matrix Metalloproteinasen (MMPs) in unterschiedlichen Transformationsstadien von HaCaT Zellen nachgewiesen und ihre Induktion über verschiedene Signalwege belegt werden [20-23]. Eine funktionelle Korrelation zu dem Transformations-Stadium der Zellen, d.h. zu ihrem invasiven Verhalten, war jedoch nicht zu belegen. Andererseits konnten wir zeigen, daß die Expression von MMPs in benignen und malignen Tumorzellen durch Stromazellen in vitro und in vivo reguliert wird [24]. Außerdem scheinen nur maligne Tumorzellen in der Lage, bestimmte MMPs im benachbarten Stroma zu induzieren, nicht jedoch benigne, wie derzeit laufende Studien zeigen. Weitere Befunde aus einer Kooperation weisen darauf hin, daß nicht die Proteaseproduktion an sich Invasions-fördernd ist, sondern ihre balancierte Expression und Aktivierung. In Fortführung dieser Zusammenarbeit konnte nachgewiesen werden, daß das Fehlen eines natürlichen Inhibitors des Plasmin-Protease-Systems (PAI-1) sowohl Tumorvaskularisierung wie Invasion völlig hemmt [25]. Die in drei verschiedenen Systemen mit unterschiedlichen Komponenten nachgewiesene Rolle der einsprossenden Gefäße für die Tumorinvasion spricht für einen komplexen multifaktoriellen Mechanismus der Wechselwirkung, wobei Wachstumsfaktoren, Proteasen und ECM-Komponenten synergistisch wirken, um Tumorinvasion zu ermöglichen [18, 25, 26]. Abteilung B0600 Differenzierung und Carcinogenese in vitro Alle diese Befunde lassen erkennen, daß nicht nur in normalen, sondern auch in Tumorgeweben wechselseitige Interaktionen zwischen Epithelzellen und Zellen des Bindegewebes stattfinden, die Proliferation, Differenzierung und möglicherweise Migration von normalen und Tumorzellen, aber auch die Synthese und Aktivierung von Proteasen steuern. Die detaillierte Analyse dieser Wechselwirkungen und ihrer Rolle bei der Regulation der Invasion ist Aufgabe laufender Untersuchungen, die sowohl an in vivo (Oberflächentransplantaten) wie an in vitro Modellen (organotypischen Hautkulturen) erfolgen. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Maas-Szabowski, N., *Shimotoyodome, A, Fusenig, N.E.: Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. Journal of Cell Science 12:18431853 (1999) [2] Fusenig, N.E.: Culture of specific cell types: keratinocytes. In: Culture of animal cells (R.A. Freshney, ed.) Wiley, New York, Chichester, pp. 346-349 (2000) [3] Stark, H.-J., *Baur, M., Breitkreutz, D., *Mirancea, N., Fusenig, N.E.: Organotypic keratinocyte cocultures in defined medium with regular epidermal morphogenesis and differentiation. 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Dietrich Keppler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. sc. hum. Yunhai Cui Dr. med. Markus Donner (- 01/01) Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Hagmann Dr. sc. hum. Gabriele Jedlitschky Dr. rer. nat. Jörg König Dr. sc. hum. Inka Leier (U12/00) Dr. rer. nat. Anne Nies 82 Gastwissenschaftler/Stipendiaten Dr. med. H. Kojima (Japan, Humboldt-Stipendium, 08/01 -) Dr. M. Komatsu (Ph.D.) (Japan, Forschungsstipendium der Kagoshima Universität Japan, 10/01 -) Doktoranden/innen Renata Gologan (- 03/00) Verena Keitel Young-Min Lee (07/01 -) Christoph Michalski (04/01 -) Dipl. Pharmazeut. Maria Rius Montraveta (12/00 -) Dipl. Biol. Birgit Stöckel (- 03/00) Technische Assistentinnen Manuela Brom Ulrike Buchholz (halbtags) (- 09/00) Johanna Hummel-Eisenbeiß (halbtags) Marion Pfannschmidt (Gast) Jana Schubert (03/00 -) Bettina Walter (halbtags) (11/00 -) Sekretariat Friederike Kremp Der Transport körpereigener und körperfremder Substanzen über Zellmembranen wird durch Transportproteine kontrolliert. Zahlreiche Gene kodieren für die Proteine, welche die Aufnahme von Substanzen in die Zelle und die Abgabe aus der Zelle vermitteln. ATP-abhängige Membranproteine transportieren körpereigene Substanzen, Toxine, Kanzerogene, Zytostatika und deren Konjugate über die Plasmamembran aus normalen und malignen Zellen in den extrazellulären Raum. Untersuchungen in der Abteilung Tumorbiochemie haben zur Entdeckung der molekularen Identität von ATP-abhängigen Transportern für Konjugate und Komplexe lipophiler Verbindungen mit Glutathion, Glucuronat oder Sulfat geführt. Eine Überexpression dieser Transportproteine der Plasmamembran, zu denen die Mitglieder der Multidrug Resistance-Proteine (MRPProteine) zählen, kann zur Resistenz von Tumoren gegenüber verschiedenen Zytostatika führen. Die Proteine der MRP-Familie (MRP1-9) unterscheiden sich erheblich in ihrer Sequenz und Substrat-Spezifität vom MDR1-P-Glykoprotein, welches ebenfalls eine Zytostatika-Resistenz bewirken kann. Hemmstoffe des Transports von ZytostatikaKonjugaten und -Komplexen durch MRP-Proteine können dazu dienen, diese neuen Formen der Zytostatika-Resistenz zu überwinden. Zu den physiologischen Substraten von Konjugat-Exportpumpen der MRP-Familie zählen unter anderem das Glutathionkonjugat Leukotrien C4, Glucuronide von Bilirubin, Gallensäuren und Steroidhormonen, sowie zyklische Nukleotide (cGMP und cAMP). Die fehlende Lokalisation der MRP2-kodierten Konjugat-Exportpumpe in der apikalen Membran der Hepatozyten ist die Ursache des erblichen Dubin-Johnson-Syndroms des Menschen, das durch eine konjugierte Hyperbilirubinämie charakterisiert ist. Die Klonierung von MRP2, MRP3, MRP5 und MRP6 ermöglichte die Herstellung stabil transfizierter Zellen und spezifischer Antikörper. Durch Immunfluoreszenz- und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde die dynamische intrazelluläre Verteilung von MRP2, die basolaterale Lokalisation von MRP3 und die apikale Lokalisation von MRP2 in verschiedenen Geweben bestimmt. Die MRP2-Expression und –Lokalisation wurde auch im klarzelligen Nierenzellkarzinom und im hepatozellulären Karzinom nachgewiesen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass MRP2 zur lange bekannten Chemoresistenz dieser malignen Tumoren beitragen kann. Zusatzfinanzierung: DFG über SFB 352 und SFB 601; Forschungsschwerpunkt Transplantation; Tumorzentrum Heidelberg-Mannheim; Deutsch-Israelische Zusammenarbeit (DKFZ/ NCRD); Fonds der Chemischen Industrie. Homepage: www.dkfz.de/tumorbiochem/ DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Identifikation und genomische Organisation von hepatozellulären Aufnahmetransportern für organische Anionen J. König, Y. Cui, A. Nies, D. Keppler Auf Grund der Ähnlichkeit mit der Sequenz eines bekannten Aufnahmetransporters für organische Anionen konnten wir die gesamte cDNA eines neuen Aufnahmetransporters, OATP2 (Gensymbol SLC21A6), klonieren. Die OATP2cDNA ist 2073 Basenpaare lang, was einem Translationsprodukt von 691 Aminosäuren entspricht [1]. Ausgehend von dieser DNA-Sequenz konnte eine weitere homologe Sequenz identifiziert werden, welche 85 % Nukleotidsequenz-Identität mit der OATP2-Sequenz aufwies. Das entsprechende Protein wurde als OATP8 (Gensymbol SLC21A8) bezeichnet. Die Identität zwischen OATP2 und OATP8 auf Proteinebene beträgt 80 % [7]. Weitere bekannte Familienmitglieder der SLC21A-Familie (OATP-A; OATP-B; OATP-D; und OATP-E) weisen eine AminosäureIdentität von weniger als 40 % im Vergleich zu OATP2 und OATP8 auf [7]. Mit Hilfe von Antikörpern, welche gegen verschiedene Epitope der Transporter gerichtet waren, konnten sowohl OATP2 als auch OATP8 in der basolateralen Membran humaner Hepatozyten nachgewiesen werden. Diese Lokalisation stimmte überein mit der vorhergesagten Funktion dieser Proteine als Aufnahmetransporter für anionische Substanzen aus dem Blut in die Hepatozyten [1, 7, 12, 19]. In Cholangiozyten, den Epithelzellen der Gallenwege, konnten beide Transporter nicht nachgewiesen werden. Mittels molekularbiologischer Techniken konnte die Messenger-RNA für beide Transporter nur in Hepatozyten nachgewiesen werden. Die genomische Organisation von OATP2 und OATP8 konnte zusammen mit der genomischen Organisation von OATP-A, dem dritten, gut charakterisierten Aufnahmetransporter der SLC21A-Familie mit Hilfe von Sequenz-Datenbanken etabliert werden. Trotz der geringen Aminosäure-Identität zwischen den Transportern (40 % zwischen OATP8 und OATP-A) zeigten sich bei der Analyse der genomischen Organisation erstaunliche Übereinstimmungen [7]. Alle drei Gene wurden auf Chromosom 12 lokalisiert. Ein Vergleich der genomischen Organisationen zeigte, dass alle drei Transportergene aus 14 Exons bestehen und die mittlere Exonlänge 150 Basenpaare beträgt. Zwischen allen drei Genen stimmen 9 Exons in der Länge überein, zwischen OATP2 und OATP8 sind sogar 13 der 14 Exons in der Länge identisch. Werden die Exon-Intron-Grenzen auf die entsprechende Aminosäure-Sequenz übertragen, so zeigt sich, dass sich alle Grenzen an identischen Stellen in dieser Anordnung der drei Sequenzen befinden. Dies deutet auf ein hohes Maß an evolutionärer Verwandtschaft hin. Abteilung B0700 Tumorbiochemie Funktionelle Charakterisierung der Aufnahme-Transporter OATP2 und OATP8 Y. Cui, J. König, D. Keppler Die funktionelle Charakterisierung der Aufnahme-Transporter OATP2 (SLC21A6) und OATP8 (SLC21A8) wurde mit Hilfe von stabil transfizierten Zellen durchgeführt [1, 7, 12]. Beide Transportproteine weisen ein breites Spektrum an Substraten auf. Das humane OATP2 transportiert sowohl endogene Metaboliten, wie z. B. Bilirubin, Mono- und Bis-glucuronosyl-bilirubin, 17β-Glucuronosyl-estradiol, Dehydroepiandrosteronsulfat, Triiodthyronin, Cholyltaurin, Leukotrien C4 und Prostaglandin E2 als auch Arzneimittel wie Pravastatin, einem Inhibitor der Cholesterol-Biosynthese, und Enalapril, einem ACE-Hemmer. Sulfobromophthalein, eine zur Testung der Transport-Funktion der Leber verwendete Substanz, ist ein hoch-affines Substrat für OATP2 mit einer Michaelis-Menten-Konstanten (Km) von 140 nM. Die Substrat-Spezifität des humanen OATP8 ist ähnlich wie die des OATP2, was der nahe verwandten Aminosäuren-Sequenz beider Proteine entspricht. Wir haben jedoch deutliche Unterschiede der Transportkinetik und in der Substrat-Spezifität festgestellt [12]. Von physiologischer Bedeutung ist der Unterschied beim BilirubinTransport: Im Gegensatz zu OATP2, kann OATP8 unkonjugiertes Bilirubin nicht transportieren [12]. Regulation der apikal lokalisierten Exportpumpe MRP2 (ABCC2) und der basolateral lokalisierten Exportpumpe MRP3 (ABCC3) B. Stöckel, J. König, A. Nies, Y. Cui, M. Brom, D. Keppler Einige Mitglieder der MRP-Familie werden zwar in Hepatozyten synthetisiert, sind aber in verschiedenen Membrandomänen lokalisiert: MRP2 (ABCC2) befindet sich in der apikalen Domäne und transportiert Substanzen in die Galle, wogegen MRP3 (ABCC3) in der basolateralen Membran lokalisiert ist und Substanzen aus dem Hepatozyten zurück ins Blut pumpt. Da das Substratspektrum beider Transporter überlappend ist, kommt einer Regulation der Transporterexpression für eine geordnete Funktion große Bedeutung zu. Untersuchungen an den homologen Transportern der Ratte zeigten, dass unter normalen Bedingungen MRP2-mRNA hoch exprimiert ist, MRP3-mRNA aber nur schwach nachweisbar ist. Unter Bedingungen einer gestörten Transportfunktion von MRP2, mit verminderter Expression der MRP2-mRNA, wird die MRP3-Expression induziert. Zur genaueren Untersuchung dieser Regulation klonierten wir die 5´-reglatorischen Bereiche des MRP2-Gens und des MRP3-Gens in ein Reportergenplasmid und untersuchten die Promotoraktivitäten beider Transportergene unter Normalbedingungen und nach Zugabe verschiedener Substanzen [4]. Unter Normalbedingungen ist die basale MRP2-Promotoraktivität hoch, jedoch beträgt die basale Aktivität des MRP3-Promotors unter den gleichen Bedingungen nur 4 % der MRP2-Promotoraktivität. Nach der Behandlung der transfizierten Zellen mit Nocodazol, einem Inhibitor der DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 83 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Bildung der Mikrotubuli, vermindert sich die Aktivität des MRP2-Promotors um 50 %, die Aktivität des MRP3-Promotors hingegen verstärkt sich um mehr als 1000 %. Unsere Ergebnisse zeigen eine geregelte, jedoch inverse Regulation der Aktivität beider Promotoren. Funktionelle Rekonstitution von gereinigtem MRP2 Vektorieller Transport durch doppel-transfizierte polarisierte Zellen Die Reinigung von MRP2 ist eine unabdingbare Voraussetzung zur genauen Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften dieses Transporterproteins. Nach erfolgreicher Klonierung und Reinigung von MRP2 mit Hilfe einer carboxy-terminal eingefügten His6-Sequenz konnten wir zeigen, dass dieses gereinigte Protein nach Rekonstitution in Proteoliposomen funktionell insoweit intakt war, als es Substrat-stimulierbare ATPase-Aktivität aufwies (Hagmann et al., Eur. J. Biochem. 265: 281-289, 1999). Die intakte Rekonstitution von transport-aktivem MRP2 erforderte eine Optimierung der Solubilisations- und Rekonstitutionsbedingungen. Damit konnten wir zeigen, dass MRP2 als Protein allein in der Lage ist, in der geeigneten Lipidvesikelumgebung als Transporter zu funktionieren. Die Transportrate für LTC4 in rekonstituierten MRP2-Proteoliposomen betrug 2.7 pmol x min-1 x mg MRP2-1 [26], die KmWerte für ATP und LTC4 beliefen sich dabei auf 560 µM bzw. 450 nM. Dieser Transport durch gereinigtes MRP2 war durch den Inhibitor MK571 hemmbar (IC50 = 12 µM). Bindungs- und Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass MRP2 mit dem Chaperon Calnexin assoziieren kann. Allerdings konnten wir in Rekonstitutionsversuchen mit gereinigtem Calnexin und MRP2 keinen Einfluss dieses Chaperons auf die Transportfunktion von MRP2 feststellen [26]. Das gereinigte MRP2 wird in weiteren Studien eingesetzt, um mögliche Partner zu finden, die in Wechselwirkung mit MRP2 dessen zelluläre Lokalisation und Funktion als Transporter beeinflussen. Y. Cui, J. König, D. Keppler 84 Abteilung B0700 Tumorbiochemie Rekombinante Transportproteine wurden bisher einzeln untersucht. Der vektorielle Transport durch Epithelzellen erfordert aber sowohl Protein-vermittelte Aufnahme-Prozesse als auch Export-Prozesse. Um diesen vektoriellen Transport besser verstehen zu können, haben wir eine doppel-transfizierte Zell-Linie hergestellt [19]. In polar wachsende MDCK-Zellen wurden die cDNAs von MRP2 und OATP8 stabil transfiziert. Immunfluoreszenz-Untersuchungen zeigten, dass OATP8 in der basolateralen Membran, MRP2 dagegen in der apikalen Membran der transfizierten MDCK-Zellen lokalisiert ist. Der Vergleich von doppel-transfizierten Zellen mit einzel-transfizierten Zellen zeigte, dass ein transzellulärer Transport von Sulfobromophthalein, einem Substrat für OATP8 und MRP2, nur dann mit ausreichender Geschwindigkeit stattfand, wenn der Aufnahme-Transporter OATP8 und die Exportpumpe MRP2 gleichzeitig in den Zellen exprimiert wurden. Auch andere Substrate beider Transportproteine wurden nur durch die doppel-transfizierten MDCK-Zellen vektoriell transportiert. Die doppel-transfizierten MDCK-Zellen stellen ein zelluläres Modellsystem dar, um Arzneimittel und Arzneimittelkandidaten auf deren Wechselwirkung mit dem vektoriellen Transport von organischen Anionen zu untersuchen. Ferner kann dieses Modellsystem die Suche nach Inhibitoren für MRP2, einem Zytostatika-Resistenz-vermittelnden Transporter, erleichtern. W. Hagmann, J. Schubert, J. König, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer und T. Kempf, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Expression und Lokalisation von MRP-Isoformen im Hepatozellulären Karzinom des Menschen A. Nies, J. König, M. Pfannschmidt, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: W. J. Hofmann, Universität Heidelberg und E. Klar, Universität Heidelberg Die ausgeprägte Resistenz des hepatozellulären Karzinoms (HCC) des Menschen gegenüber verschiedensten Zytostatika ist ein wichtiger Grund für das häufige Versagen einer Chemotherapie dieses bösartigen und weltweit sehr häufigen Tumors. Wir konnten durch semi-quantitative RT-PCR zeigen, dass MRP2 und MRP3 mRNA im HCC stark exprimiert werden [18]. Beide MRP-Isoformen können Resistenz gegenüber Zytostatika vermitteln, indem sie diese über die Plasmamembran aus den Zellen heraustransportieren, so dass keine wirksamen Zytostatikakonzentrationen erreicht werden [11, 21]. Durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen mit Isoform-spezifischen Antikörpern lokalisierten wir MRP2 in der apikalen Membran von Tumorzellen; hierbei wurden häufig trabekuläre oder pseudoglanduläre Strukturen beobachtet. MRP3 war hingegen in der basolateralen Plasmamembran lokalisiert [18]. In einigen HCC-Proben wurde auch MRP1 mRNA detektiert, allerdings wurde MRP1-Protein ausschließlich in intrazellulären Membranstrukturen nachgewiesen. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Lokalisation von MRP2 in der apikalen und MRP3 in der basolateralen Membran von Tumorzellen zur Zytostatika-Resistenz des HCC beitragen kann. Expression und Lokalisation von MRP2 und MRP3 wurde auch in HepG2-Zellen nachgewiesen [2]. Zellbiologische Charakterisierung eines MRP2-Proteins mit einer Mutation, die zum Dubin-Johnson Syndrom führt V. Keitel, A. Nies, M. Brom, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: J. Kartenbeck, Zellbiologie, DKFZ (Immun-Elektronenmikroskopie von MRP2); H. Spring, Strukturanalyse, DKFZ (Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie) Mutationen im MRP2-Gen, die zum Verlust des MRP2Proteins in der apikalen Membran führen, sind die molekulare Basis für das Dubin-Johnson Syndrom, welches mit einer konjugierten Hyperbilirubinämie einhergeht [21], da MRP2 die ATP-abhängige Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate in der apikalen Membran von Hepatozyten ist [10, 11, 21, 24]. Eine 6-Nukleotide umfassende Deletion im MRP2-Gen führt zum Verlust von Arg1392 und Met1393 (MRP2DR,M) in der carboxy-proximalen ATP-Bindungsdomäne und zum Fehlen des MRP2-Proteins in der apikalen Membran von Hepatozyten des Menschen (Tsujii et al., Gastroenterology 117: 653-660, 1999). Wir haben diese 6Nukleotide umfassende Deletion in die MRP2-cDNA eingebracht und nach Expression der mRNA die Lokalisation des mutierten MRP2-Proteins in polarisierten HepG2-Zellen untersucht [9]. HepG2-Zellen, die von einem Hepatoblastom des Menschen abgeleitet sind, eignen sich gut für die Untersuchung der domänenspezifischen Sortierung Abteilung B0700 Tumorbiochemie von MRP-Isoformen [2]. Die mRNA wurde in HepG2-Zellen exprimiert und führte zur Synthese eines mutierten MRP2DR,M-Proteins, welches nur unvollständig glykosyliert war. Das mutierte Protein akkumulierte im endoplasmatischen Retikulum und wurde nicht zur apikalen Membran transportiert [9]. Der Abbau des unreifen MRP2-Proteins erfolgte in Proteasomen. Unsere Untersuchungen klärten erstmalig den Pathomechanismus einer MRP2-Mutation auf, die zum Verlust von MRP2 in der apikalen Membran von Hepatozyten des Menschen und zum Dubin-Johnson Syndrom führt. Charakterisierung von MRP5 (ABCC5) als ATP-abhängige Exportpumpe für zyklische Nukleotide G. Jedlitschky, D. Keppler In Zusammenarbeit mit: B. Burchell, University of Dundee, Schottland, UK Der zelluläre Export von zyklischen Nukleotiden (3'-5'cGMP und 3'-5'-cAMP) wurde in einer Vielzahl von Geweben und Zellen beobachtet und kann zur Regulation der intrazellulären Konzentration der zyklischen Nukleotide beitragen. Unsere Untersuchungen haben erstmals die physiologische Funktion von rekombinantem MRP5, das in V79-Zellen exprimiert wurde, identifiziert [8]. Dementsprechend ist MRP5 eine ATP-abhängige Exportpumpe für 3'5'-zyklisches GMP mit einem Km-Wert von 2,1 µM [8]. Der ATP-abhängige Export von 3'-5'-zyklischem AMP erfolgt mit niedrigerer Affinität (Km = 379 µM). Verschiedene Substanzen, die als Hemmstoffe der Zyklonukleotid-Phosphodiesterase bekannt waren, wurden als wirksame Hemmstoffe des MRP5-vermittelten Transports von cGMP identifiziert, wobei die Hemmkonstante Ki für Sildenafil 267 nM und für Trequinsin 250 nM betrug [8]. MRP5 könnte demnach ein neues pharmakologisches Zielmolekül sein, um durch dessen Hemmung die intrazellulären Konzentrationen an zyklischem GMP zu steigern [8]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] König, J.; Cui Y.; Nies, A.T.; Keppler, D.: A novel human organic anion transporting polypeptide localized to the basolateral hepatocyte membrane. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology 278 (2000) G156-G164. [2] Cantz, T.; Nies, A.T.; Brom, M.; *Hofmann, A.F.; Keppler, D.: MRP2, a human conjugate export pump, is present and transports Fluo 3 into apical vacuoles of Hep G2 cells. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology 278 (2000) G522-G531. 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DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Abteilung Signaltransduktion und Wachstumskontrolle (B0800) Leiter: Peter Angel, Ph.D. Wissenschaftliche Mitarbeiter: Dr. Marina Schorpp-Kistner Dr. Hartmut Richter Dr. Bettina Hartenstein (07/99 -) * Dr. Jochen Hess (01/00 -) Dr. Niamh Keon (- 07/00) * Dr. Ute Breitenbach (- 03/01) Dr. Sabine Gack (03/01 -) Doktoranden Christine Munz *(- 08/00) Sven Andrecht * (- 11/01) Axel Szabowski Dirk Schmidt * (- 01) Hanna Bierbaum* Nicola Viebig (04-10/00) Bernd Dittrich (11/00 -)* Regina Müller (11/01 -) Lore Florin (12/01 -) Medizin Studenten Christoffer Gebhardt (- 06/00) Christian Krause (08-12/00) Diplomanden: Jens Eberlein (- 04/00) Technische Angestellte Sibylle Teurich Susanne Adams (- 09/00) Melanie Sator-Schmitt Auszubildende Tanja Raubinger (09/00 -) Daniel Sandmaier (- 08/00) Sven Rüffer (10/00 -) Nicole Echner (10/01 -) Steffen Baumert (10/01 -) Zentral Sabrina Zahner, Sekretärin (halbtags) *) Drittmittel Die Funktion und Regulation von Transkriptionsfaktoren und deren Zielgene in der Regulation von physiologischen und pathologischen Prozessen In der Abteilung „Signaltransduktion und Wachstumskontrolle“ werden die Reaktionen von Organismen und ihren Zellen auf Umwelteinflüsse (Strahlung, chemische Karzinogene) untersucht und mit den Reaktionen auf körpereigene Substanzen verglichen. Ziel dieser Arbeiten ist es, verstehen zu lernen, über welche Mechanismen die Zellen auf diese äußeren Signale mit Veränderungen in der Expression spezifischer Gene reagieren, und welche Funktion die dabei involvierten Genprodukte spielen. Dies beinhaltet auch das Verständnis der molekularen Ereignisse auf der Ebene der Genregulation, die eine „normale“ Zelle in eine Krebszelle umwandelt. Die Arbeiten der Abteilung konzentrieren sich in erster Linie auf die Funktion und Regulation des Transkriptionsfaktors AP-1 und der Identifizierung AP-1-regulierter Zielgene. AP-1 ist der Sammelbegriff für verschiedene homound heterodimere Proteinkomplexe, deren Untereinheiten sich aus den Mitgliedern der Fos, Jun und CREB/ATF Proteinfamilien zusammensetzten. Da sich zum einen die Sequenzspezifität der verschiedenen Dimere leicht unterscheidet, und zum anderen die Transkription der fos und jun Gene als auch die Transaktivierungsfunktion der davon abgeleiteten Proteine Unterschiede aufweist, geht man heute davon aus, daß die verschiedenen Dimer-Kombinationen spezifische Funktionen bei komplexen biologischen Prozessen wie Zellproliferation, Transformation, Differenzierung, Angiogenese, Immunantwort, Apoptose und Protektion gegenüber DNA-schädigenden Substanzen spielen [1,2]. Schwerpunkte der Arbeiten der Abteilung sind das Verständnis der: a) Mechanismen der Aktivitätskontrolle von AP-1 in Abhängigkeit von extrazellulären Signalen b) Aufklärung der Funktion der verschiedenen Jun und Fos Proteine bei physiologischen und pathologischen Prozessen c) Isolierung, Regulation und Funktionsanalyse von AP-1abhängigen Zielgene d) Klonierung und Charakterisierung neuer Tumor-assoziierter Gene Für die beschriebenen Fragestellungen kommen sowohl in vivo Mausmodelle als auch in vitro Zellkultursysteme zum Einsatz, um die spezifischen Funktionen dieser zellulären Regulatoren der Genexpression und deren Zielgene im Gesamtorganismus bei komplexen Prozesse zu definieren und um informative Modelle für menschliche Krankheiten zu entwickeln. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 87 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Zell-autonome Funktionen von c-Jun bei der Regulation von Zellproliferation und Antwort auf genotoxische Substanzen A. Kolbus, A. Szabowski, P. Angel In Kollaboration mit Ingrid Herr, Klaus-Michael Debatin, Sven Baumann, Sören Eichhorst, Sabine Kirchhoff, Peter Krammer, DKFZ Heidelberg; Martin Schreiber und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich; Stefan Scherer, Manfred Schartl, Universität Würzburg; Michael Karin, UC San Diego, La Jolla, USA 88 Die Synthese der Fos und Jun Proteine wird nach Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden Substanzen (Strahlung, chemische Karzinogene, z.B. alkylierende Agenzien) stark erhöht [1,2]. Dies läßt darauf schließen, daß diese Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der zellulären Antwort auf solche Streßfaktoren spielen könnten. Durch Untersuchungen mit Fibroblasten, die aus c-Jun oder c-Fos Knockout-Mäusen etabliert wurden, konnte diese Annahme experimentell bestätigt werden. Während c-Fos-defiziente Zellen eine Hypersensitivität gegenüber UV Strahlung und chemischen Mutagenen (z.B. Alkylantien) aufweisen, verlieren c-Jun-defiziente Zellen die Fähigkeit, nach Behandlung mit UV Strahlung oder chemischen Mutagenen in Apoptose zu gehen [3]. Obwohl c-Jun, in Kooperation mit p53, für die UV-induzierte Expression des DNA Reparaturgens MSH2 benötigt wird [4], können die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutantenzelle nicht durch Unterschiede in der Fähigkeit der Zellen, die entstandenen DNA Schäden zu reparieren, erklärt werden [3]. Vielmehr beruht dies auf dem Verlust der Induktion von Fos/Jun-abhängigen Genen, was am Beispiel der fehlenden transkriptionellen Aktivierung zweier bekannter AP-1 Zielgene, Kollagenase und Stromelysin, exemplarisch sichtbar wurde [3]. Neben diesen bekannten Zielgenen konnten wir das CD95-L Gene als neues c-Jun/AP1 Zielgen definieren. CD95-L bindet an das Zelloberflächenantigen CD95 und es kommt nachfolgend zur Aktivierung einer Serie von Caspasen, an deren Ende die DNA Fragmentierung und Zelltod steht. Die Induktion der CD95-L Expression und die nachfolgende autokrine oder parakrine Aktivierung des CD95 Signalwegs scheint in den untersuchten Zellen für die Induktion der Apoptose durch UV und chemische Mutagene essentiell zu sein, da neutralisierende CD95-L Antikörper mit diesem Prozess interferieren, und in c-Jun-defizienten Zellen durch die Zugabe von rekombinantem CD95-L sehr effizient Apoptose ausgelöst werden kann. Dies bedeutet, daß c-Jun eine essentielle Rolle bei der Synthese von Apoptose-auslösenden Proteinen (z.B. CD95-L) spielt. Die Komponenten des CD95-spezifischen Signalwegs, der zur Auslösung von Apoptose führt, werden jedoch unabhängig von c-Jun exprimiert [3]. Neben der “Stress”-induzierten Apoptose in Fibroblasten spielt AP-1-abhängige Induktion von CD95-L auch bei der (durch Chemotherapeutika) induzierten Apoptose in Hepatokarzinomzellen [5] und in aktivierten TZellen [6] eine wichtige Rolle. Mit Hilfe der c-Jun-defizienten Fibroblasten konnten wir auch die Funktion von c-Jun bei der Regulation der Zellproliferation aufklären. Es zeigt sich, daß der Verlust von Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle c-Jun zu einer erhöhten Rate von p53 und p21 führt, wodurch die Aktivität von Cyclin-assoziierten Protein Kinasen gehemmt wird und die Zellen nur sehr ineffizient durch die G1/S Phase des Zellzyklus gehen. Alle diese Effekte werden durch zusätzliche Deletion des p53 Gens revertiert. Dies bedeutet, daß die Hauptfunktion von c-Jun bei der Regulation der Proliferation in der Repression der p53 Expression liegt [7]. Die Repression der p53 Expression wird dabei über eine AP-1-ähnliche Erkennungssequenz im p53 Promotor vermittelt, an die c-Jun mit einem bisher noch nicht genau definierten Partner bindet und als Inhibitor agiert [7,8]. Funktion von JunB in vivo und in vitro S. Andrecht, D. Schmidt, B. Hartenstein, N. Keon, S. Gack, H. Bierbaum, M. Sator-Schmitt, T. Raubinger, S. Adams, P. Angel, M. Schorpp-Kistner In Kollaboration mit Zhao-Qi Wang, Emanuelle Passegue und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich Die Ergebnisse unserer bisherigen Arbeiten ergaben deutliche Hinweise darauf, daß die verschiedenen Mitglieder der Jun Proteinfamilie (c-Jun, JunB, JunD) spezifische, zum Teil nicht-überlappende Funktionen in AP-1-abhängigen Prozessen spielen. Diese Annahme wurde durch den spezifischen Phänotyp der JunB knockout Mäuse unterstrichen, der sich deutlich von denjenigen unterscheidet, die durch den Verlust anderer AP-1 Untereinheiten (z.B. c-Jun, JunD, Fos Proteine) hervorgerufen werden [2]. Tiere mit einem heterozygoten JunB Genotyp (junB+/-), bei denen in allen Zellen noch eine intakte Kopie des junB Gens vorhanden ist, zeigten beim Vergleich mit Wildtyp Mäusen keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede. Die genotypische Analyse der Nachkommen aus der Rückkreuzung von junB+/- Tieren ergab, daß keine lebensfähigen junB -/- Tiere auftraten. Dies bedeutet, daß das Fehlen des JunB Proteins einen letalen Phänotyp der Embryogenese verursacht [9]. Die junB -/- Embryonen entwickeln sich normal bis zum Tag 7.5 der Embryogenese und sterben dann innerhalb von zwei Tagen. Die histologischen und biochemischen Analysen ergaben, daß es zu Fehlentwicklungen bei der Blutgefäßbildung der extraembryonalen Gewebe (Dottersack, Plazenta) kommt, und dadurch der notwendige Transport von Nährstoffe von der Mutter zum Embryo nicht im ausreichenden Umfang stattfindet. Um die kritischen Zielgene zu identifizieren, deren Expression von JunB reguliert wird, und deren Genprodukte eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung von extraembryonalen Geweben spielen, haben wir vor allem ein in vitro Differenzierungssystem mit JunB-defizienten embryonale Stammzellen (ES) einsetzten, das die in vivo Defekte bei der Ausbildung von Blutgefäßen widerspiegelt. Mit Hilfe dieser in vitro generierten sog. “embryoid bodies”, konnten wir VEGF (ein Hauptregulator der Vaskulogenese und Angiogenese) als JunB-abhängiges Zielgen identifizieren, wobei die exogene Zugabe von VEGF die beobachteten Defekte zum großen Teil kompensieren kann [10]. Vorläufige Daten lassen darauf schließen, daß JunB direkt an den VEGF Promotor bindet, und zusammen mit dem Transkrip- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abb. 1: AP-1 abhängige Regulation der Keratinozytenproliferation und Differenzierung. Links: Histologische und Immunfluoreszenzfärbung von in vitro Hautmodellen mit genetisch veränderten Fibroblasten. Rechts: Schematische Darstellung der c-Jun- und JunBabhängigen Regulation der doppelt parakrine Interaktion zwischen Fibroblasten und Keratinozyten. Details siehe [14]. tionsfaktor HIF1α die VEGF Expression positiv reguliert [10]. HE Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Loricrin Keratinozyt MEF wt MEF c-jun-/- Proliferation & Differenzierung KGF GM-CSF MEF junB-/- Durch Einkreuzen einer junB transgenen Mauslinie kann der embryonal letale Phänotyp wieder revertiert werden, was die Spezifität des Phänotyps aufzeigt. Diese sog. “rescue” Linie weist ein weitgehend ubiquitäres Muster der junB Transgen Expression auf. In Zellen der myeloiden Subklasse von Immunzellen sind in diesen Tieren jedoch nur geringe Menge an JunB Transgen nachweisbar. Dieser Verlust an JunB ist mit der Entwicklung eines myeloproliferativen Defekts verbunden, der einer chronischen myeloiden Leukämie (CML) beim Menschen ähnelt [11]. Der pathologische Phänotyp ist durch eine erhöhte Anzahl von Granulozyten Vorläuferzellen und reifen neutrophilen Granulozyten gekennzeichnet. Diese Daten weisen JunB als kritischer Regulator der Differenzierung von Blutzellen aus und sind ein weiterer Beleg für die postulierte Funktion von JunB als Tumorsupressor [11]. Obwohl junB-/- Embryonen in der frühen Phase der Embryonalentwicklung sterben, ist es uns gelungen daraus primäre Fibroblasten zu isolieren und durch spontane Immortalisierung permanente Linien zu generieren [12-14]. Diese Zellen wurden dann, analog zur Analyse von c-Jundefizienten Fibroblasten [3,7] für die Aufklärung der Rolle von JunB in der Proliferationskontrolle und Antwort auf Strahlung und Oncoproteine untersucht. JunB greift an zwei Stellen im Zellzyklus regulatorisch ein: zum einen führt das Fehlen von JunB zu einem beschleunigten Übergang der Zellen von der G1 in die S-Phase. Dies beruht sehr wahrscheinlich auf einer reduzierten Expression des CDK Inhibitors p16ink und einer spontan erhöhten Expression von c-Jun. Im weiteren Verlauf der Zellzyklusprogression kommt es in junB-defizienten Zellen zu einem verzögerten Übergang von S nach G2/M was mit einer verringerten Expression und Kinaseaktivität von Cyclin A assoziiert ist. Alle Defekte können durch Einbringen eines JunBER Expressionsvektors Hormon-abhängig revertiert werden [12,13]. Durch den Nachweis i) der Bindung von JunB in vitro an eine CRE Sequenz im Cyclin A Promotor, ii) der CRE-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Zyklin A Promotors durch Überexpression von JunB (zusammen mit ATF2) und iii) der verringerten AP-1 Bindungsaktivität il-1 IL-1 gm-csf c-Jun kgf JunB Fibroblast an das CRE Element in JunB-defizienten Zellen konnten wir erstmals Cyclin A als direktes und positiv reguliertes JunB Zielgen identifizieren [12,13]. Trans-regulatorische Funktion der Jun Proteine in Zellproliferation und Differenzierung A. Szabowski, S. Andrecht, A. Kolbus, M. Schorpp-Kistner, P. Angel In Kollaboration mit Nicole Maas-Szabowski und Norbert Fusenig, DKFZ Neben der Aufklärung der Zell-autonomen Funktion der Jun Proteine in der Zellzykluskontrolle und bei positiven oder negativen Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren (z.B. Smad Proteine, 15; Glucocorticoid Rezeptor, 16] konnten wir durch Verwendung der junB-/- Fibroblasten erstmals den Einfluß von c-Jun und JunB bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung in trans identifizieren [8,14,17,18]. Dabei haben wir uns im besonderen mit dem Zytokin-abhängigen regulatorischen Wechselspiel zwischen dem dermalen und epidermalen Kompartiment der Haut beschäftigt. Unter Verwendung eines Co-Kultursystems mit primären menschlichen Keratinozyten und murinen Fibroblasten und eines 3-dimensionalen organotypischen in vitro Hautmodells haben wir die Fibroblastenabhängige Proliferation und Differenzierung von primären Keratinozyten untersucht. Durch Verwendung der genetisch veränderten c-jun-/- und junB-/- Fibroblasten wird die Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten massiv verändert. Dies beruht darauf, daß c-Jun und JunB gegenläufig die Expression von KGF und GM-CSF regulieren (s. Abb. 1). Im Gegensatz zu GM-CSF und KGF war die Zugabe anderer Zytokine (EGF, bFGF) nicht ausreichend, den Phänotyp der verringerten Epithelbildung in Gegenwart von c-Jun-defizienten Fibroblasten zu kompensieren [17]. Andererseits sind Zytokine, die c-Jun-unabhängig exprimiert werden, ebenfalls in diesem Regelkreis involviert [8,14,17]. Den direkten Nachweis der kausalen Rolle dieser AP-1-abhängigen Zytokine konnten wir durch Ver- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 89 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation 90 wendung von neutralisierenden GM-CSF Antikörper erbringen, die die Epithelbildung in Gegenwart von Wildtyp Fibroblasten drastisch reduzierte und den pathologischen Phänotyp der junB-/- Co-Kulturen fast völlig aufhob. In Übereinstimmung mit früheren Vermutungen führt die Verwendung von neutralisierenden Antikörper gegen Il-1 ebenfalls zu einer partiellen Reversion des Phänotyps der junB-/- Fibroblasten organotypischen Kultur und Kulturen, die auf Wildtyp Fibroblasten basieren, zeigen nur noch eine geringe Epithelbildung [8,14,17]. Diese Daten unterstreichen noch einmal das Modell des doppelt-parakrinen Wirkmechanismus z.B. bei der Wundheilung, wo durch Synthese und Ausschüttung von Il-1 durch Keratinozyten die Produktion von Zytokinen in Fibroblasten (darunter KGF und GM-CSF) gesteuert wird, die dann parakrin wieder auf Keratinozyten wirken und Proliferation und Differenzierung regulieren. Wir glauben, daß die weiteren Analysen der Jun-defizienten Fibroblasten (und hier vor allem die junB-/- Fibroblasten) in diesem in vitro Hautmodell neben dem Verständnis der physiologischen Prozesse der Haut (Differenzierung, Wundheilung) auch die Etablierung molekularbiologischer Werkzeuge zur Analyse von pathologischen Veränderungen der Haut (Psoriasis, chronische Entzündungen, verzögerte Wundheilung; Tumorerkrankungen) bringen wird. Regulation und Funktion des AP-1-abhängigen Zielgens Kollagenase: ein Modell zur Analyse regulatorischer Mechanismen der Protein/Protein Wechselwirkung zwischen AP-1, Cbfa1 und dem Glucocorticoid Rezeptor Arbeiten aus unserem Labor und zahlreicher anderer Labors haben Metalloproteinasen (vor allem die interstitielle Kollagenase, Kollagenase-3) als Modellsystem für AP-1abhängige Genexpression in Zellkultur und im Tier etabliert [18-22]. Das Gen der interstitiellen Kollagenase-3 (MMP-13) kodiert für eine Proteinase, die im Zusammenspiel mit anderen Mitglieder der Matrix Metalloproteinase (MMP) Familie und in Abhängigkeit von der Expression von Inhibitoren von MMPs (TIMPs; [23,24] und darin angegebene Referenzen) eine essentielle Rolle bei physiologischen Prozessen (Gewebeumbau bei der Embryogenese, Organogenese) und beim pathologischen Gewebeumbau (chronische Entzündung, Tumor Progression) zugeschrieben wird. Positive Interferenz zwischen AP-1 und Cbfa1 J. Hess, J. Tuckermann, M. Becker, C. Munz, S. Teurich, P. Angel iIn Kollaboration mit Michael Owen, ICRF, London, UK; J. Labrador und Rüdiger Klein, EMBL Heidelberg; Karen Pittois und J. Merregaert, Universität Antwerpen, Belgien; Jörg Schmidt, Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Neuherberg, Oberschleißheim; Agamemnon Grigoriadis Guy´s Hospital, London UK; Gillian Murphy and Rosalind Hembry, Strangeways Research Laboratory, Cambridge, UK. Durch den Nachweis der zelltyp-spezifischen Expression von Kollagenase-3 in osteoblastoiden Zellen während der Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle Embryonalentwicklung der Maus und in adulten Mäusen [19,21,22] konnten wir starke Evidenzen für eine Funktion dieses Proteins bei der Knochenentwicklung und Metabolismus erhalten. In transgenen Mäusen, die das c-fos Gen überexprimieren, korreliert die Lokalisation der verstärkten Kollagenase Expression mit den pathologischen Veränderungen, vor allem der Ausbildung von Knochentumoren (Osteosarkome), die als Konsequenz einer lang anhaltenden Fos Expression auftreten [24]. Da Kollagenase-3 spontan fast ausschließlich im Knochen [21,22,24], die Jun und Fos Proteine jedoch noch in vielen anderen Geweben exprimiert werden, stellt sich die Frage nach dem Mechanismus der Zelltyp-Spezifität. Diese könnte durch Osteoblasten-spezifische Aktivatoren vermittelt werden, die mit AP-1 funktionell kooperieren. Durch Untersuchungen der Aktivierung des Kollagenase Promotors durch Parathormon (PTH, einer der wichtigsten Regulatoren des Knochenmetabolismus) konnten wir zwei ciswirkende Elemente definieren, die zusammen mit AP-1 für die Induktion notwendig sind [19,26]. Diese Elemente dienen als Erkennungssequenz für den Transkriptionsfaktor Cbfa-1. Dieser Faktor wurde kürzlich als essentielle Komponente der Osteoblasten-Differenzierung und der endochondralen Ossifikation beschrieben. Unsere Arbeiten zeigten, dass AP-1 und Cbfa1 direkt miteinander in Wechselwirkung treten, und dass dies über den “Leucine zipper” (Fos, Jun Proteine) bzw. die “Runt”-Domäne (Cbfa1) vermittelt wird [26]. Diese Daten weisen darauf hin, daß neben seiner Funktion bei der Differenzierung von Osteoblasten Cbfa1 im Zusammenspiel mit AP-1 auch eine wichtige Rolle beim Knochenmetabolismus zu spielen scheint. Negative Interferenz zwischen AP-1 und dem Glucocorticoid Rezeptor J. Tuckermann, J. Eberlein, H. Richter In Kollaboration mit Holger Reichardt, Günther Schütz, G. Fürstenberger, DKFZ; Martin Göttlicher, Falk Weih, Peter Herrlich, Institut für Genetik, Forschungszentrum Karlsruhe Neben der positiven Regulation von AP-1 durch übergeordnete Proteinkinasen (JNKs) und der Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen (Smads, Cbfa1; siehe oben) erfährt aber auch die negative Regulation von AP-1 durch Protein/Protein Interaktionen eine zunehmende Beachtung. Bei letzterem gilt unser Interesse vor allem der physiologischen Relevanz der negativen Regulation von AP-1 Aktivität durch aktivierte Glucocorticoid Rezeptoren (GR) im Gesamtorganismus. Anhand einer “knock-in” Maus, die einen mutierten GR exprimiert (GRdim, im Labor von Günther Schütz generiert), konnten wir nachweisen, daß für die Repression von AP-1-abhängiger Kollagenase Expression in primären embryonalen Mausfibroblasten nur die reprimierende, jedoch nicht die aktivierende Funktion des GR (mittels DNA Bindung an “Glucocorticoid-responsive-elements”, GREs) notwendig ist [16,21]. Die Signifikanz dieses Regulationsmechanismus im Gesamtorganismus konnten wir durch die Unterdrückung der TPA-induzierte Expression von Kollagenase-3 in der Maushaut durch gleichzeitige Applikation des synthetischen Gluco- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation corticoids Dexamethason bestätigen. Dabei fanden wir, daß Glucocorticoid Gabe die TPA-vermittelte Induktion von Kollagenase-3 in Wildtyp und GRdim Mäusen mit gleicher Effizienz unterdrückt [20,21]. Wir haben dieses experimentelle System auch benutzt, um die ersten Gene in Haut zu klonieren, deren Expression durch Glucocorticoide induziert werden. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften des mutierten GR in der GRdim Maus wird die Expression beider Gene, Plasmaglutathion Peroxidase-3 (PGX-3) und Heat Shock Protein-27 (HSP-27), nur in der Haut von Wildtyp Mäusen, jedoch nicht GRdim Mäusen durch Dexamethason induziert [20,21]. Durch diese Daten konnte belegt werden, daß die Repression der AP-1 Aktivität durch Glucocorticoide in vivo tatsächlich keine Expression von GRE-gesteuerten Gene benötigt. Parallel zu AP-1 wird die Aktivität des Transkriptionsfaktors NFκB in ähnlicher Weise durch den GR negativ reguliert. Da NFκB eine wichtige regulatorische Rolle bei der Immunantwort zugeschrieben wird, haben wir TPA-induzierten Entzündungsreaktionen in der Haut untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl diese Reaktion, als auch andere Parameter (z.B. Zytokin Expression in T-Zellen und Makrophagen) in Wildtyp und GRdim Mäusen mit gleicher Effizienz durch Glucocorticoide unterdrückt werden [27]. Dies bedeutet, dass Glucocorticoid-vermittelte Immunsuppression vor allem durch die DNA Bindungs-unabhängige Funktion des GR vermittelt wird. Abteilung B0800 Signaltransduktion und Wachstumskontrolle von zum Teil völlig unbekannten Genen haben wir als neue Tumor-assoziierte Gene die noch wenig charakterisierte Serin Protease BSSP [28] und Mitglieder der S100 Proteine [29] identifiziert. Zur Zeit wird das Expressionsmuster dieser Gene und der spezifische Transkript-positive Zelltyp in verschiedenen Stadien der chemisch induzierten Hautkarzinogenese (Papillome, Karzinome) bestimmt, um mögliche Anhaltspunkte über die Funktion dieser Proteine im Verlauf der Tumorgenese zu bekommen. In Kollaboration mit Dr. Peter Steinlein, IMP Wien, und Prof. Peter Lichter (DKFZ Heidelberg) haben wir mittlerweile die isolierte cDNA Kollektion auf DNA-Chips aufgebracht und damit die Methodik des “large-scale gene expression profiling” in der Abteilung etabliert. Ziel ist es, zum einen das Expressionsmuster diese cDNAs in Tumoren aus anderen Geweben zu untersuchen. Zum anderen wollen wir die Expression der bisher isolierten, neuen Tumor-assoziierten Gene der Maus in menschlichen Tumoren bestimmen, um mögliche neue, spezifische Markergene für diese Tumore zu etablieren. Klonierung neuer tumor-assoziierter Gene in der Maus U. Breitenbach, C. Gebhardt, H. Richter, J. Hess, P. Angel In Kollaboration mit Gerhard Fürstenberger, Gunnar Wrobel, Jörg Schlingemann, Peter Lichter, DKFZ; Peter Steinlein, Institut für Molekulare Pathologie, Wien, Österreich; Zena Werb, University of California, San Francisco, USA Sequentielle Behandlung der Maushaut mit TPA führt zur Ausbildung von Papillomen und nachfolgend zum Auftreten von Karzinomen (Mehrstufenmodell der chemisch-induzierten Hautkarzinogenese). In Zellinien, die sich von den verschiedenen Tumorstadien ableiten, wurde eine Korrelation zwischen basaler Expression von Kollagenase3 und zunehmender Malignität der Tumorzellen gefunden. Dies läßt vermuten, daß dieses Enzym auch zur Ausbildung und Ausbreitung von Hauttumoren beitragen könnte. Durch Herstellung von konditionalen (“floxed”) Kollagenase-3 Maus Mutanten, in denen spezifisch die Expression in Keratinozyten ausgeschaltet werden kann, versuchen wir zur Zeit diese Frage zu beantworten. Basierend auf den experimentellen Bedingungen, die zu einer deutlich erhöhten Expression des Kollagenase-3 Gens in TPA-behandelter Maushaut führen, haben wir im Berichtszeitraum die Anwendung der Methode der subtraktiven cDNA Klonierung (SSH) zur Isolierung differentiell exprimierter Gene im Labor etabliert. Wir haben die isolierte Kollektion von etwa 3000 TPA-induzierten cDNAs auf solche Gene untersucht, die eine konstitutiv hohe Expression in den Hauttumoren aufweisen. In dieser Subgruppe DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 91 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Angel, P. (2001) AP-1. In: Encyclopedic Reference of Cancer. M. Schwab (Ed.) pp. 60-67. Springer Verlag, Heidelberg. [2] Schorpp-Kistner, M., *Herrlich, P. and Angel, P. (2002). The AP-1 family of transcription factors: Structure, regulation and functional analysis in mice. N.LeThangue (Ed.) 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[27] Reichardt, H., Tuckermann, J., *Göttlicher, M., Vujic, M., *Weih, F., Angel, P., *Herrlich, P. and Schütz, G. (2001) Immunosuppression in the absence of DNA-binding by the glucocorticoid receptor in vivo. EMBO J., 20, 7168-713 [28] Breitenbach, U., Tuckermann, J., Gebhardt, C., Richter, K.H., Fürstenberger, G., Christofori, G. and Angel, P. (2001) Keratinocyte-specific onset expression in experimental of serine protease BSSP carcinogenesis. J. Inv. Dermatol., 117, 634-640. [29] Gebhardt, C., Breitenbach, U., Tuckermann, J., Richter, K.H. and Angel, P. (2002) Calgranulins S100A8 and S100A9 are negatively regulated by glucocorticoids in a c-Fos-dependent manner and overexpressed throughout skin carcinogenesis, Oncogene, in press. [15] *Verrecchia, F., *Tacheau, C., Schorpp-Kistner, M., Angel, P. und *Mauviel, A. (2001) Induction of the AP-1 members c-Jun and by TGFß/Smad suppresses early Smad-driven gene activation. Oncogene, 20, 2205-11 [16] Reichardt, H. M., Kaestener, K.H., Tuckermann, J., Kretz, O., Wessely, O., Bock, R., Gass, P., Schmid, W., *Herrlich, P., Angel, P. and Schütz, G. (1998). DNA-binding of the glucocorticoid receptor is not essential for survival. Cell 93, 531-541. [17] Maas-Szabowski, N., Szabowski, A., Andrecht, S., Kolbus, A., Schorpp-Kistner, M., Angel, P. und Fusenig, N. (2001) Organotypic Cocultures with genetically modified mouse fibroblasts as a tool to dissect molecular mechanisms regulating keratinocyte growth and differentiation. J. Invest. Dermatol., 116, 816-20 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion AG Hormonwirkung und Signaltransduktion (B0810) Leiterin: PD Dr. rer. nat. Doris Mayer Wissenschaftlicher Mitarbeiter Dr. rer. nat. Bernd Schnarr ( - 09/00) * I. Der Insulin / IGF-I Rezeptor-Signalweg in Brustkrebszellen Doktoranden Barbara De Servi (07/01 - ) * Kathrin Kopplow ( - 12/00) Yongde Liao (10/01 - ) * Senad Medunjanin (01/01 - ) Martina Schmitt (- 2/00) Kathrin Strunz (- 12/00) Expression von IRS-1 und IGF-I Rezeptor in Mamma-Carcinomen D. Mayer, B. Schnarr, K. Strunz, Y. Niu, J. Ohsam, A. Dreuw In Kooperation mit J. Wacker, Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; A. Benner, Zentrale Einheit Biostatistik, DKFZ Zusatzfinanzierung: „Organtumorsystem Mammacarcinom“ des DKFZ Diplomanden Alexandra Dreuw (10/00 - 05/01) Stephanie Geiger (10/01 - ) Gastwissenschaftler Yun Niu (China, 04/00 - 05/01) Technischer Angestellter Jürgen Ohsam (- 04/01) * Sonderfinanzierung Hormone sind körpereigene Substanzen, die bei einer Vielzahl von Wachstums- und Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Synthetisiert in endokrinen Organen erreichen sie ihre Zielorgane auf dem Blutweg. Nach Bindung an spezifische Rezeptoren, die auf der Plasmamembran bzw. im Cytosol oder im Zellkern der Zielzellen lokalisiert sind, wird eine Vielzahl von Signalübertragungsprozessen aktiviert, die u.a. in der Stimulation der Zellproliferation enden. Aufgrund dieser wachstumsfördernden Eigenschaften gelten zahlreiche Hormone als Tumorpromotoren. Dies gilt sowohl für Steroidhormone als auch für Peptidhormone. Die von Steroiden und Peptidhormonen aktivierten Signalkaskaden sind prinzipiell unterschiedlich, Peptidhormone binden an Rezeptoren in der Plasmamembran und setzen dadurch eine Kaskade von Phosphorylierungsreaktionen an Proteinen in Gang. Steroidhormone binden an Rezeptoren, die entweder im Cytoplasma oder im Zellkern lokalisiert sind. Nach Aktivierung und Translokation in den Zellkern werden sie primär als Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Expression von Zielgenen wirksam. Jüngste Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass es vielfältige Interaktionen zwischen Peptidhormon- und Steroidhormon-vermittelten Signalwegen gibt. Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit Mechanismen der Tumorentstehung unter dem Einfluß von Peptid- und Steroidhormonen sowie mit deren Wechselwirkung in epithelialen Mamma- und Leberzellen. Der Insulin / IGF-I Rezeptor-Signalweg wird aktiviert durch die beiden Wachstumsfaktoren IGF-I und IGF-II sowie durch das Hormon Insulin. IGF-I und IGF-II können von verschiedenen Gewebekomponenten menschlicher Brusttumoren, dem Stroma (Bindegewebe) und den epithelialen Carcinomzellen synthetisiert werden. Sie können das Wachstum der Krebszellen parakrin oder autokrin stimulieren. Auch wurden hohe Insulin-Blutspiegel (z.B. bei Typ II-Diabetikerinnen) mit einer erhöhten Brustkrebsinzidenz in Verbindung gebracht. Nach Bindung der Liganden an den Insulinrezeptor bzw. den IGF- I Rezeptor werden diese dimerisiert und durch Autophosphorylierung verschiedener Tyrosinreste durch die intrinsische Rezeptor-Tyrosinkinase aktiviert. Beide Rezeptor-Tyrosinkinasen phosphorylieren das Insulinrezeptor-Substrat-1 (IRS-1), eines der wichtigsten Signalproteine der Zelle. Aus Zellkulturexperimenten ist bekannt [1], dass die Expression des IGF-I Rezeptors und des IRS-1 durch das Steroidhormon Estradiol (E2) induziert werden. Estradiol stimuliert außerdem das Wachstum normaler Brustdrüsenepithelzellen sowie von Brustkrebszellen, sofern diese den Estrogenrezeptor exprimieren. Wir haben uns die Frage gestellt, ob es einen Zusammenhang gibt zwischen dem Differenzierungsgrad von Brusttumoren und der Expression des IGF-I Rezeptors, des Insulinrezeptors und IRS-1 sowie des Estrogenrezeptors. An 69 Brustkrebsproben verschiedenen Differenzierungsgrades und 21 normalen Brustdrüsengeweben wurde immunhistochemisch die Expression von Insulinrezeptor, IGF-I Rezeptor, IRS-1 und Estrogenrezeptor sowie die Zellproliferation (% Ki-67 positive Zellen) bestimmt. IGF-I Rezeptor und IRS-1 wurden in hohen Spiegeln in gut und mäßig differenzierten Carcinomen (Grad I und II) und in geringen Mengen in niedrig differenzierten Tumoren (Grad III) nachgewiesen [Abb.1]. Vorläufige durch in situHybridisierung der entsprechenden mRNA gewonnene Ergebnisse zeigen, dass die Expression der Proteine transkriptional reguliert wird. Die Expression des Insulinrezeptors zeigte keine eindeutige Korrelation mit dem Grad der Tumordifferenzierung. Genaue statistische Analyse zeigte, daß der Verlust an IGF-I Rezeptor und IRS-1 einen genaueren Marker für die Entdifferenzierung der Carcinome darstellt als die bekannte Reduktion der EstrogenrezeptorExpression und die Zunahme der Zellproliferation. Die Befunde zeigen eindeutig, daß die Progression von Brustkrebs von einer Reduktion an IGF-I Rezeptor und IRS-1 begleitet wird, und daß die IGF-I Rezeptor / IRS-1 Expres- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 93 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation H&E IRS-1 IGF-IR Normalgewebe G1 94 G3 Abb. 1.: Expression von IRS-1 und IGF-I Rezeptor in Brustgewebe und in Mamma-Carcinomen unterschiedlichen Differenzierungsgrades A-C: normales Brustdrüsenläppchen. D-F: gut differenziertes intraduktales Carcinom (Pfeile) umgeben von Bindegewebe. G-I: niedrig differenziertes duktales Carcinom. A, D, G: HämatoxilinEosin gefärbte Schnitte. Immunhistochemischer Nachweis von IRS-1 (B, E, H) und IGF-IR (C, F, I) in Serienschnitten von A, D und G. Starke Expression von IRS-1 (B) und etwas geringere Expression von IGF-IR (C) in allen epithelialen Zellen des normalen Drüsenläppchens. D-F: Grad-1 Carcinom (Pfeile) zeigt starke Expression von IRS-1 (E) und mäßige bis starke Expression von IGF-IR (F). G-I: Grad-3 Carcinom mit schwacher Expression von IRS-1 (H) und IGF-IR (I). K. Perinukleäre Lokalisation von IRS-1 in Tumorzellen (Pfeile). L und M sind Kontrollen zur Dokumentation der Spezifität der Antikörper. B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion zellen proliferationssteigernd wirkt und wenn ja, ob diese Wirkung auf die Konversion zu Estrogenen zurückgeführt werden kann. Wir konnten zeigen, daß estrogenabhängige MCF-7 Brustkrebszellen DHEA in physiologisch relevanten Mengen zu Estradiol umwandeln (~200 pM im Medium nach 4-tägiger Inkubation mit 100 nM DHEA). Außerdem wurden Estron und Testosteron identifiziert [3, 4]. Sowohl Estradiol (1 nM) als auch DHEA (100 nM) wirkten proliferationsstimulierend auf MCF-7 Zellen, letzteres mit einer Verzögerung von 2 ½ Tagen, was für eine Notwendigkeit der Konversion des DHEA zu Estrogen spricht. Estrogenunabhängige Brustkrebszellen (MDA-MB-436) wurden nicht stimuliert. Eine von MCF-7 abgeleitete Zellinie, die mit einem Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des Estrogen Responsive Elements und des β-Globulinpromotors (EREluc) stabil transfiziert wurde, wurde eingesetzt, um Effekte von DHEA auf die estrogenabhängige Genexpression zu messen. DHEA zeigte eine deutliche Induktion der Luciferase. Sowohl die Stimulation der Zellproliferation und als auch die Induktion der Luciferase-Expression durch DHEA konnte durch die Anti-Estrogene ICI 182,780 und Tamoxifen gehemmt werden, ebenso durch den Aromatase-Hemmer 4-Hydroxyandrostendion, was die Notwendigkeit der Konversion von DHEA zu Estrogen unterstreicht [4]. Ein androgener Effekt von DHEA auf MCF-7 Zellen konnte durch ein negatives Ergebnis nach Doppeltransfektion von MCF-7 Zellen mit dem Androgenrezeptor und einem ARELuc Reportergen-Konstrukt ausgeschlossen werden. Aus den Ergebnissen wurde geschlossen, daß DHEA auf Brustkrebszellen mitogen wirkt, daß es in erheblichen Mengen zu Estrogenen, insbesondere Estradiol konvertiert wird, und daß die Konversion eine Voraussetzung für den proliferationssteigernden Effekt von DHEA darstellt. III. DHEA-Effekt auf Leberzellen D. Mayer, K. Kopplow sion negativ mit der hohen Proliferationsrate in niedrig differenzierten Mammacarcinomen korreliert ist [2]. Aus diesem Grund wurde vorgeschlagen, IGF-I Rezeptor und IRS-1 als neue Marker für das (oft schwierige) Grading von Tumoren einzusetzen. II. DHEA- Effekt auf Brustkrebszellen D. Mayer, M. Schmitt, B. Schnarr In Kooperation mit R. Morfin, Laboratoire de Biotechnologie, Conservatoire National des Arts et Métiers, Paris, Frankreich ; K. Klinga, Hormonlabor der Universitätsfrauenklinik, Heidelberg; A. Benner, Biostatistik, DKFZ Das Nebennierenrindenhormon Dehydroepiandrosteron (DHEA) stellt in vivo eine Vorstufe in der Biosynthese von Testosteron und Estradiol in peripheren Organen dar. Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß Frauen mit hohem DHEA-Blutspiegel in der Postmenopause ein erhöhtes Brustkrebsrisiko aufweisen. Die Substanz kann in Brustgewebe und Brusttumoren aus dem Blut angereichert werden. Wir haben untersucht, ob DHEA auf Brustkrebs- In Kooperation mit: G. Hobe, Hans-Knöll-Institut, Jena; J. Swierczynski, Dept. Biochemistry, Medical University Gdansk, Polen; P. Bannasch, Cytopathologie, DKFZ; A. Benner, Biostatistik, DKFZ; K. Forstner, FIMT Asperg. Die Untersuchungen zur carcinogenen und tumorpromovierenden Wirkung von DHEA auf die Rattenleber wurden fortgesetzt [5-10]. Dabei stand der Befund im Vordergrund, daß DHEA tumorpromovierend wirkt, obwohl es insgesamt die Proliferation präneoplastischer Läsionen hemmt. Die Identifizierung der Tumorvorstufe, die möglicherweise durch DHEA spezifisch promoviert wird, ist Gegenstand aktueller Untersuchungen. Weiterhin wurde der biochemische und molekulare Mechanismus der proliferationshemmenden Wirkung von DHEA weiteruntersucht. Vorläufige Ergebnisse dokumentieren einen Einfluß von DHEA auf die Cytokin- und Wachstumsfaktor-Produktion in der Rattenleber [11]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation B0810 Hormonwirkung und Signaltransduktion Publikationen (* = externer Koautor) [1] Dreuw, A.: Wirkung von IGF-I und Estradiol auf die TyrosinPhosphorylierung des Insulin-like Growth Factor-I Rezeptors und auf die estragonabhängige Genexpression in Mammakarzinomzellen. Diplomarbeit, Biologische Fakultät, Universität Heidelberg (2001) [2] Schnarr, B., Strunz, K., Ohsam, J., Benner, A., *Wacker, J., Mayer, D.: Downregulation of insulin-like growth factor-1 receptor and insulin receptor substrate-1 in advanced human breast cancer. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 89, 506-513 (2000) [3] Schmitt, M., *Klinga, K., Mayer, D.: Dehydroepiandrosterone (DHEA) stimulates proliferation of of MCF-7 cells after being metabolized to estrogens. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41, 139 (2000) [4] Schmitt, M., *Klinga, K., Schnarr, B., *Morfin, R., Mayer, D.: Dehydroepiandrosterone stimulates proliferation and gene expression in MCF-7 cells after conversion to estradiol. Mol. Cell. Endocrinol. 173, 1-13 (2001) [5] Bannasch, P., Metzger, C., Mayer, D.: Hepatocarcinogenesis by dehydroepiandrosterone. I. Sequential cellular changes during neoplastic develoment. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, 237-249 (2000) [6] *Hobe, G., *Hillesheim, H.-G., *Schön, R., *Undisz, K., *Valentin, U., *Reddersen, G., *Ritter, P., Bannasch, P., Mayer, D.: Studies on the metabolism of DHEA in rats and mice. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, 343-362 (2000) [7] Mayer, D., Metzger, C., Bannasch, P.: Hepatocarcinogenesis by dehydroepiandrosterone. II. Biochemical and molecular changes during neoplastic development. In: Dehydroepiandrosterone (DHEA). Biochemical, physiological and clinical aspects (W. Regelson, M. Kalimi, eds.) Walter de Gruyter, Berlin, 251-260 (2000) [8] Mayer, D., Metzger, C., Nehrbass, D., Bannasch, P.: Characteristics of dehydroepiandrosterone-induced hepatocarcinogenesis in the rat. In: Hormonal Carcinogenesis III (Eds. Li, J.J., J.R. Daling, S.A. Li) Springer-Verlag, New York, pp. 477-483 (2000) [9] *Swierczynski, J., *Slominska, E., *Smolenski, R.T., Mayer, D. : Increase in NAD but not ATP and GTP concentrations in rat liver by dehydroepiandrosterone feeding. Pol. J. Pharmacol. 53, 125130 (2001) [10] Mayer, D.: Hormonal and carcinogenic effects of dehydroepiandrosterone on liver. In: Surgical Pathology, Update 2001, 18th European Congress of Pathology (Eds. S. Hauptmann, M. Dietel, M. Sobrinho-Simões), ABW Wissenschaftsverlag Berlin, pp. 363-367 (2001) [11] Kopplow, K. Untersuchung des Einflusses von Dehydroepiandrosteron auf die Proliferationsaktivität von Hepatozyten und die Expression von Zellzyklusparametern in der Rattenleber. Dissertation, Naturwissenschaftlich-Mathematische Gesamtfakultät, Universität Heidelberg (2002) DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 95 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese Abteilung: Genetik der Hautcarcinogenese (B0900) Leiterin: Priv.-Doz. Dr. Petra Boukamp Wissenschaftler: Dr. Susanne Popp Dr. Sabine Rosenberger (05/00 - ) Dr. Vera Vormwald Dogan (05 - 12/00) Dr. Reynel Figueroa ( - 07/00) Dr. Karin Greulich-Bode (10/00 - ) Dr. Sascha Beneke (09/01 - ) 96 Doktoranden: Ana Cerezo Heike Lindenmaier ( - 04/01) Sharareh Moshir (07/01/ - ) Sibylle Ermler (08/01 - ) 1. Genetische Mechanismen der Hautcarcinogenese P. Boukamp, S. Popp, B. Jelinek, A. Jirschik In Kooperation mit: Prof. W. Hartschuh, Dermatologie Heidelberg; Prof. Irenen Leigh, Dermatologie London, UK; Prof. Ingrid Moll, Dermatologie Hamburg; Dr. A. Bürkle, DKFZ Heidelberg (jetzt Newcastle upon Tyne, UK); Dr. A. Jauch, Humangenetik Heidelberg; Dr. Frank de Gruijl (Utrecht, Niederlande); Prof. Karin Scharffetter-Kochanek Dermatologie Köln, Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Zugewinn von 11q13 wird durch erhöhte Temperatur sowie UV-A Strahlung induziert und ist ein wichtiges genetisches Ereignis in Hautcarcinomen Techniker: Alena Jirschik (05/01-) Hermann Stammer (10/01 - ) 2. Die genetische Analyse über CHG und M-FISH erlaubt die Aufstellung eines genetischen Stammbaums und damit die direkte Ableitung von Metastasen. Hautcarcinome (Basalzell- [BCC] und Plattenepithelcarcinome [SCC]) sind nicht nur bereits heute die häufigsten Tumortypen, die Zahl steigt auch ständig und dies speziell in immunsupprimierten Patienten. Darüber hinaus kehrt sich das Verhältnis von nahezu nie metastasierenden Basalzell Carcinomenen zu den malignen Plattenepithel Carcinomen um, so dass auch die Mortalitätsrate steigt. Obwohl schon seit langer Zeit bekannt ist, dass übermäßige Sonnenbestrahlung (Sonnenbrände) bei der Entstehung von Hautcarcinomen eine wesentliche Rolle spielt, ist noch wenig über die molekularen Mechanismen bekannt. Das Ziel unserer Studien ist es deshalb, die Rolle von Risikofaktoren (UV-A, erhöhte Temperatur) besser verstehen zu lernen, neue genetische Aberrationen zu identifizieren und deren Funktion aufzuklären. Dies soll einerseits dazu beitragen, die Differentialdiagnose unterschiedlicher Hauttumortypen zu verbessern und andererseits sollen dadurch die molekularbiologischen Grundlagen für neue Behandlungsmöglichkeiten geschaffen werden. Mit Hilfe experimenteller Modellsysteme werden in der Abteilung 2 Hauptthemen bearbeitet: 1) Molekularund funktionelle genetische Studien, um relevante Onkogene und Tumorsuppressorgene zu identifizieren und deren Funktion in der Entstehung bzw. Progression von Hautcarcinomen aufzuzeigen. 2) Eine spezifische Aberration, die für nahezu alle Tumore gilt, ist die erhöhte Expression der Telomerase. Ziel unserer Studien ist es, die Rolle und Regulation der Telomerase und ihre Rolle in der Telomerlängenregulation bei der Hautcarcinomentstehung und in der Hautalterung zu definieren. Erhöhte Temperatur und UV-A als potentielle „Carcinogene“ für die Entstehung von Hautcarcinomen Um die Rolle der „Umweltfaktoren“ bei der Entstehung von Hautcarcinomen experimentell untersuchen zu können, verwenden wir das von uns etablierte HaCaT in vitro Hautcarcinogenese Modell. Diese Modell repräsentiert unterschiedliche Stadien (Fusenig, N.E. Boukamp, P. Molecular Carcinogenesis, 23: 144-158 (1998)) und erlaubt es somit, gezielt Fragen zur tumorigenen Transformation oder auch malignen Konversion anzugehen. So war es uns möglich, mit Hilfe der HaCaT Zellen zu zeigen, daß Langzeitkultivierung bei 40°C statt 37°C ausreichte, um die Zellen tumorigen zu transformieren [1] d.h. nach s.c. Injektion der Zellen in Thymus-aplastische Nacktmäuse entstanden Tumore. Wie schon zuvor für HaCaT Zellen demonstriert, die das Harvey-ras Onkogen enthielten, war der Tumorphänotyp abhängig von dem Alter der Ausgangskultur (frühe versus späte Passagen der HaCaT Zellen korreliert mit benignem bzw. malignem Tumorphänotyp). Zudem wiesen die rekultivierten Tumorzellen eine erhöhte Tumorigenitätsrate auf, was für eine weitere Selektion durch die in vivo Passage spricht [2]. Mittels Vergleichender genomischer Hybridisierung (CGH) und Multiplex Fluoreszenz in situ Hybridisierung (M-FISH) der rekultivierten Tumore konnten wir zeigen, dass in allen tumorigenen Varianten eine gemeinsame genetische Aberration vorlag, nämlich eine Amplifikation von 11q13 [1]. Erste Versuche, in denen HaCaT Zellen für mehrere Wochen mit UV-A bestrahlt wurden, haben ebenfalls zur tumorigenen Transformation der Zellen geführt. Interessanterweise weisen auch diese tumorigenen Varianten einen Zugewinn von 11q13 auf. Es ist deshalb unsere jetzige Arbeitshypothese, dass erhöhte Temperatur bzw. UV-A Strahlung in den Epidermiszellen der Haut über DNA Strangbrüche für eine bestimmte Art von genetischen Schäden (Amplifikation, Deletionen, Translokation) verantwortlich sind. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Ein erster Hinweis, daß es sich bei dem Zugewinn von 11q13 um ein für Hautcarcinome häufigeres genetisches Ereignis handelt, kamen durch die genetische Charakterisierung eines neuen in vivo Hautcarcinogenese Modells. Mit dieser, von dem selben Patienten stammenden Tumorsequenz, bestehend aus dem Primärtumor, zwei Rezidiven und einer Lymphknotenmetastase, konnten wir dann zweifelsfrei belegen, dass die Metastase genetisch aus dem Primärtumor hervorgegangen war, während sich die Rezidive parallel dazu und jeweils unabhängig voneinander entwickelt hatten [3]. Dies könnte bedeuten, daß sich die Metastase bereits sehr früh während der Tumorprogression gebildet hatte. Darüber hinaus lag auch hier ein Zugewinn von 11q13 vor und diese Aberration blieb in allen Tumorstadien erhalten, was dafür spricht, daß die Tumorzellen durch sie einen Selektionsvorteil hatten. Derzeit untersuchen wir an einer größeren Zahl von Hautcarcinomen und benignen Hauttumoren i) ob der Zugewinn von 11q13 ein generell relevantes genetisches Ereignis ist, ii) für welches Stadium der Tumorentwicklung er charakteristisch ist und iii) und welche anderen genetischen Aberrationen häufig zu beobachten sind, um damit neue diagnostische und möglicherweise prognostische Marker für die Hautcarcinogenese zu definieren. Der angiogene Switch, eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Konversion: zur Rolle von Thrombospondin (TSP-1) Zusätzlich zur Amplifikation von 11q13, die für das uneingeschränkte Wachstum aller Tumorzellen (benigne und maligne) wesentlich ist, konnten wir den Verlust von Chromosom 15 als wichtiges genetisches Ereignis für die maligne Progression der HaCaT Zellen und der SCL-I Plattenepithelcarcinomlinie der Haut definieren. Wiedereinführung einer Kopie von Chromosom 15 in die SCL-I Zellen führte nach s.c. Injektion der Zellen in Nacktmäusen zu einer signifikanten, wenn auch temporären Tumorsuppression [4]. Als potentielles Tumorsuppressorgen identifizierten wir TSP-1, ein Matrixglycoprotein, das auf 15q15 lokalisiert ist. Überexpression dieses Gens induzierte die gleiche Tumorsuppression wie das gesamte Chromosom 15 und verursachte eine massive Ablagerung von TSP-1 Matrix an der Tumor/Stroma Grenze um den Tumor herum. Diese Matrix verhinderte das Einwachsen von Blutgefäßen und damit das Expandieren der Tumorzellen in das umgebende Stroma. Diese Tumorsuppression war aber nur temporär und nach 8-10 Wochen wurde Tumorwachstum beobachtet. Da das Tumorwachstum mit der Auflösung der TSP-1 Matrix korrelierte, ist es Ziel weiterer Studien, zu ermitteln, welche Proteasen für die Degradation verantwortlich waren und ob dieses kausal für das Tumorwachstum waren. Erste Studien zur Proteaseexpression der Tumorzellen zeigten, daß die malignen Tumorzellen signifikant mehr Proteasen exprimieren als die benignen bzw. nicht-tumorigenen HaCaT Zellen [5, 6]. Ein wesentlicher Anteil der Proteasen wird zusätzlich aber auch von den Tumor-umgebenden Stromazellen synthetisiert. Wir sind deshalb derzeit dabei die Proteaseexpression im Tumorstroma in vivo zu charakterisieren. Darüber hinaus ist aus der Literatur bekannt, Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese daß der Transformierende Wachstrumsfaktor TGF-ß1and die TSP-1 Matrix bindet und dadurch aktiviert wird. Da TGF-β1 bekanntermaßen die Expression von Proteasen in Stromazellen induzieren kann, ist es ein weiteres Ziel unserer Studien, die Rolle der Interaktion von TGF-β1 und TSP-1 für dieses Hautcarcinogenese Modell zu ermitteln. 2. Telomeraseaktivierung eine besondere Form der genetischen Aberration: Telomerase-, und Telomerlängenregulation in normalen and transformierten humanen Keratinozyten P. Boukamp, S. Beneke, A. Cerezo, S. Ermler, K. Greulich-Bode, S. Moshir, S. Rosenberger, H. Stammer In Kooperation mit: Dr. J. R. Bickenbach, University of Iowa, Iowa City, USA; Dr. M. Hergenhahn, DKFZ; Kirsten Vang Nielsen, DAKO Dänemark, Prof. Holger Kalthoff, Universität Kiel, Prof. Sabine Werner, ETH Zürich, Schweiz Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren: 1. Das Mass der Telomerverkürzung während der zellulären Alterung ist abhängig vom Spenderalters, d.h. es muß Faktoren geben, die die Rate der Telomerverkürzung modulieren können. 2. Der Telomer-bindende Faktor TRF-2 spielt eine Rolle in der zellulären Alterung Regulation der Telomeraseaktivität und Telomerlänge Ein Enzymkomplex, der als essentiell für das uneingeschränkte Wachstum von Tumorzellen gilt, ist der Ribonucleoproteinkomplex Telomerase. Normale Zellen verlieren Replikations-bedingt kontinuierlich Sequenzen am Ende der Chromosomen, den Telomeren und man geht davon aus, daß dieser Telomerverlust für die begrenzte Lebensspanne normaler Zellen verantwortlich ist. D.h der Verlust von Telomersequenzen ist der Zählmechanismus, die innere Uhr der „zellulären Alterung“. Würde dies auch für Tumorzellen gelten, so würden diese durch ihre Vielzahl von Teilungen eine so kritische Telomerlänge erreichen, dass dies einem Wachstumsstop und schlussendlichen das Absterben der Zellen zur Folge hätte. Telomerase ist nun in der Lage, de novo Sequenzen an die Telomere zu hängen und so eine Stabilisierung der Telomerlänge zu gewährleisten. Im Gegensatz zur ursprünglichen Annahme konnten wir aber schon sehr früh zeigen, dass Telomerase nicht nur in Tumorzellen exprimiert wird, sondern Aktivität auch in der normalen Epidermis der Haut nachweisbar ist [Härle-Bachor, C, Boukamp, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:6476-6481 (1996)]. Inzwischen ist klar, dass alle regenerativen Gewebe auch im adulten menschlichen Organismus Telomerase-positiv sind [7]. In der Epidermis, wie auch in anderen Geweben, ist die Telomeraseaktivität eng mit der Proliferation verknüpft und wird mit Beginn der Differenzierung abgeschaltet. Erste Studien zur Telomeraseregulation hatten gezeigt, dass Calcium ein wichtiger Inhibitor der Telomeraseaktivität ist (Bickenbach, J.R. et al. J. Invest. Dermatol., 111: 1045-1052 (1998)). DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 97 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Die intrazelluläre Erhöhung des Calciumspiegels führt somit nicht nur zur Induktion der epidermalen Differenzierung, sondern scheint auch vorgeschaltet, die Telomeraseaktivität zu inhibieren. Wir sind derzeit dabei, den Telomerasekomplex im Detail zu charakterisieren, um die Faktoren zu identifizieren, die für die Calcium-bedingte Regulation verantwortlich sind. 98 Im Gegensatz zu den Keratinozyten der Epidermis sind die Fibroblasten der Dermis Telomerase-negativ. Erwartungsgemäß findet man auch bei Langzeitkulturen eine kontinuierliche Abnahme der Telomerlänge. Überraschenderweise beobachteten wir jedoch einen vom Spenderalter abhängigen Grad des Telomerverlusts [8]. So war dieser bei Zellen von Kleinkindern deutlich vermindert und die Zellen hörten trotz relativ langer Telomere auf zu proliferieren (Seneszenz). D.h. der Grad der Telomerverkürzung kann moduliert werden und somit ist die Telomerlänge per se kein striktes Mass für die replikative Historie der Zellen. Darüber hinaus scheint auch die Telomerase der Keratinozyten nicht in der Lage zu sein, den Replikationsbedingten Telomerverlust auszugleichen. Da dies gleichermaßen für das hematopoietische System gilt, bleibt nun zu klären, warum Telomerase speziell in diesen Geweben exprimiert wird [9]. TRF2, ein wichtiger Faktor für die zellulären Alterung Ein Faktor, der bei der Telomerlängenregulation eine wichtige Rolle spielen soll und dessen Anwesenheit Voraussetzung für die Chromosomenintegität ist, ist der Telomerrepeat-bindende Faktor TRF-2. Es wird postuliert, dass TRF2 eines der Proteine ist, die das Telomerende vor Degradation schützt. Wir konnten nun zeigen, dass TRF2 im Laufe der zellulären Alterung signifikant hochreguliert wird. Dieses ist offensichtlich von funktioneller Relevanz, da Verminderung des TRF2 Spiegels in alten Zellen mittels anti-sense Oligonucleotiden zu einer verbesserten Proliferation und einer morphologischen „Verjüngung“ der Kulturen führte [8]. Wir sind deshalb derzeit dabei, die Rolle von TRF2 für die zelluläre Alterung im Detail zu charakterisieren. Abteilung B0900 Genetik der Hautcarcinogenese Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Boukamp, P., Popp, S., Bleuel, K., Tomakidi, E., Bürkle, A., Fusenig, N.E.: Tumorigenic conversion of immortal human skin keratinocytes (HaCaT) by increased temperature. Oncogene, 18: 5638-5645 (1999) [2] 3. Müller MM, Peter W, Mappes M, Huelsen A, Steinbauer H, Boukamp P, Vaccariello M, Garlick J, Fusenig NE.: Tumor progression of skin carcinoma cells in vivo promoted by clonal selection, mutagenesis, and autocrine growth regulation by GCSF and GM-CSF. Am. J. Pathol., 159:1567-1579 (2001) [3] 4. Popp, S., *Waltering, S., *Holtgreve-Grez, H., *Jauch, A., *Proby, C., *Leigh, I.M., Boukamp, P.: Genetic characterization of a human skin carcinoma progression model: from primary tumor to metastasis. J. Invest. Dermatol., 115: 1095-1103 (2000) [4] 5. Bleuel, S., Popp, S., Fusenig, N.E., *Stanbridge, E.J., Boukamp, P.: Tumor suppression in human skin carcinoma cells by chromosome 15 transfer or TSP-1 overexpression through halted tumor vascularization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 2065-2070 (1999) [5] 6. *Bachmeier, B.E., *Nerlich, A.G., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., *Tschesche, H., *Fritz, H., *Fink, E.: Human keratinocyte cell lines differ in the expression of the collagenolytic matrix metalloproteinases-1,-8, and -13 and of TIMP-1. Biol Chem. 381: 509-516 (2000) [6] 7. *Bachmeier, B.E., Boukamp, P., *Lichtinghagen, R., Fusenig, N.E., *Fink, E.: Matrix metalloproteinases-2,-3,-7,-9 and10, but not MMP-11, are differentially expressed in normal, benign tumorigenic and malignant human keratinocyte cell lines. Biol. Chem. 381: 497-507 (2000) [7] 9. Bachor, C., *Bachor, O.A., Boukamp, P.: Telomerase is active in normal gastrointestinal mucosa and not upregulated in precancerous lesions. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 453-460 (1999) [8] 11. Figueroa, R., Lindenmaier, H., Hergenhahn, M., *Vang Nielsen, K., Boukamp, P.: Telomere erosion varies during in vitro aging of normal human fibroblasts from infant and adult donors. Cancer Res. 60: 2770-2774 (2000) [9] 12. Boukamp P.: Ageing mechanisms: the role of telomere loss. Clin Exp Dermatol. 26:562-565 (2001) DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation R0400 Zentrale Spektroskopie Zentrale Spektroskopie (R0400) Leiter: Dr. William E. Hull, Spezialist für Kernspinresonanz (NMR) Wissenschaftliche Mitarbeiter Prof. Dr. Wolf-Dieter Lehmann, Spezialist für Massenspektrometrie (MS) Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth, Spezialist für EDV und Modeling Technisches Personal Gabriele Schwebel-Schilling (04.92 -), CL für NMR-Dienstleistung Gerhard Erben (08.93 -), CTA für Dienstleistung (IR, UV, MS) und Methodenentwicklung (MS, HPLC) Sekretariat Sabrina Zahner (1/2) Im Zeitraum 2000-2002 waren folgende zusätzliche Personen über Haus- oder Drittmittel-Zeitverträge (H oder D) in der ZS an verschiedenen Forschungsprojekten tätig: Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Dieter Albert (D 09/98 - 12/00; H 01/01 - 12/02) Dr. Andreas Bohne-Lang (D 01/01 - 12/02) Dr. Martin Frank (D 06/01 - 05/03) Gastwissenschaftler Jaroslav Tóth, Lehrstuhl für Pharmakognosie und Botanik, Fakultät für Pharmazie, Comenius Universität, Bratislava, Slowakische Republik (DFG-Stipendium für Netzbasierte Forschungskooperationen: 10 - 12/01) Doktoranden Andreas Bohne (D - 12/00) Klaus Lohmann (D 05/01 - ) Alexander Loß (D 01/01 - ) Thomas Lütteke (H 10/01 - ) Mogjiboraliman Salek (H 02/01 - ) Andreas Schlosser (H - 03/02; mit Abt. B0100) Mathias Wind (H 01/00 -) Technisches Personal Gerda Baumann, CTA (D 06/98 - 12/00, 1/2) Neben der vielfältigen analytischen Dienstleistung (Auftragsmessungen zur Bestätigung bzw. Aufklärung von Molekülstrukturen mittels NMR, IR, UV, und MS) wird in der Zentralen Spektroskopie (ZS) an die Einführung bzw. Entwicklung neuer Meß- bzw. Analyse-Verfahren und ihre Anwendung in der Krebsforschung intensiv gearbeitet. Diese Methoden werden bei eigenständigen bzw. kooperativen Forschungsaktivitäten in den Bereichen Biochemie, molekulare Struktur, Dynamik, und Wechselwirkung, sowieTumormetabolismus und Tumortherapie eingesetzt. Die Schwerpunkte der MS-Anwendungen liegen in Protein- und Peptidanalytik mit nano- bis picomol Mengen (präzises Molgewicht, Charakterisierung mittels eines enzymatischen Verdau, Sequenzierung, Bestimmung von Phosphorylierung und anderen post-translationalen Modifikationen) sowie quantitative Bestimmung von zellulären Phospholipidenprofilen. Mit der Hochfeld-MR-Spektroskopie wird die Entwicklung neuartiger Pharmaka und die Identifikation von Naturstoffen mit krebspräventiver Wirkung unterstützt. Mit der 31 P-MR-Spektroskopie werden metabolische Eigenschaften von Tumorzellen in Kultur sowie in vivo (Tiermodell) untersucht (Korrelation des Tumorwachstum mit Phospholipid-Metabolitenprofilen). Die nichtinvasive Hochfeld-MR-Bildgebung wird eingesetzt, um das Wachstum von Tumoren und Metastasen in inneren Organen von tumortragenden Mäusen zu visualisieren und die Wirkung einer Therapie zu untersuchen. Im Internet-Zeitalter ist die Bereitstellung von spektroskopischen Daten und Molekülstrukturen in Form von „benutzerfreundlichen“ Datenbanken und Informationssystemen eine zunehmend wichtige Arbeit. Schwerpunkte in „molecular modeling“ sind die Oligosaccharide (Konformation und Dynamik), Glykoproteine, sowie Protein-Oligosaccharide-Wechselwirkungen (Lektine, Virusinfektion) und die Entwicklung neuer Pharmaka. Die Forschungsaktivitäten der ZS sind in vier Bereichen gegliedert, die im Folgenden näher beschrieben werden. Unsere Internet-Addresse: http://www.dkfz-heidelberg.de/zspek/zshome.htm DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 99 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Entwicklung von WWW-basierten Anwendungen und Datenbanken für strukturbiologische Fragestellungen (Schwerpunkt Glykobiologie) (R0401) C.-W. von der Lieth, A. Bohne-Lang, K. Lohmann, A. Loß 100 In Zusammenarbeit mit: Prof. E. Schwarzer, Universität Hildesheim; Prof. Dr. E. Lang, Fachhochschule Darmstadt; Prof. Dr. R. Geyer, Universität Giessen; PD. Dr. U. Zähringer, Forschungszentrum Borstel. Zusatzfinanzierung: DFG-Projekt (D376); Konzeption und Entwicklung einer Web-basierten Arbeitsumgebung von glykowissenschaftliche Fragestellungen und Bereitstellung von fachbasierten Informationsangeboten; für C.-W. von der Lieth; 1 Postdoc (A. Bohne-Lang), 2 Doktoranden (A. Loß, K. Lohmann) 01.01.01 31.12.02. Die rasche Entwicklung der Möglichkeiten des Internet hat sowohl die Art und Weise, wie Wissenschaftler weltweit miteinander kommunizieren als auch die Möglichkeiten der wissenschaftlichen Informationsbeschaffung entscheidend verändert. Über das WWW sind jetzt auch viele Datenbanken mit strukturellen, biologischen und spektroskopischen Daten mittels standardisierter, graphisch orientierter Benutzerführungen verfügbar. Vorteile sind: der Zugriff auf die aktuellsten Daten, eine für viele Anwendungen sehr ähnliche, graphisch orientierte und intuitiv bedienbare Benutzeroberfläche sowie eine weitgehende Unabhängigkeit von der jeweils vorhandenen Hardware-Konfigurationen, so daß die Anwendungen von praktisch jedem Arbeitsplatzrechner aus durchgeführt werden können. Die inhaltliche Verknüpfung von verteilten, wissenschaftlichen Datenbanken, die im Bereich der biologischen Makromoleküle zumeist über die Sequenzinformation realisiert wird, erlaubt mit hoher Effizienz und aus unterschiedlichen und weltweit verteilten Quellen die rasche Zusammenführung von Informationen, die zu einem Molekül gehören. Aus diesen Gründen sondieren und testen wir kontinuierlich die über das WWW verfügbaren Angebote an spektroskopischen, strukturellen und biologischen Daten und machen sie in Form von Linksammlungen verfügbar [1]. Als Schwerpunkt betreiben wir eigenständige Entwicklungen im Bereich der Glykobiologie, in dem bisher nur wenige Angebote weltweit verfügbar sind [2]. Da Oligosaccharide wesentlich komplexere Strukturen bilden (unterschiedliche Verknüpfungen der Residuen, Verzweigungen) als Oligonukleotide bzw. Proteine, erwies es sich als notwendig, eine einfache, eindeutige lineare Codierung von Kohlenhydratenstrukturen abzuleiten, die der üblichen Sprache der Glykowissenschaftler sehr nahe kommt und die eine einfache Verknüpfung von Einträgen in verschiedenen, verteilten Datenbanken ermöglicht [3] (LINUCS : LInear Notation for Unique description of Carbohydrate Sequences. www.dkfz.de/spec/ linucs/). Exemplarisch wurde die Verwendung der LINUCS-Codierung in der SWEET-DB [4] realisiert (www.dkfz.de/spec/sweetdb) in der momentan Daten aus vier verschiedenen Quellen miteinander über die chemische Struktur miteinander verknüpft werden. R0400 Zentrale Spektroskopie Oligosaccharide sind hochgradig flexible Verbindungen. Während das Programm SWEET-II die Erzeugung einer möglichen Konformation eines Oligosacchariden erlaubt, kann die Anwendung GLYDICT [5,6] (www.dkfz.de/spec/ glydict/) ein komplettes Ensemble von möglichen Konformationen von N-Glykanen berechnen. Dieses Verfahren beruht auf einem wissensbasiertem Ansatz, bei dem zunächst der konformationelle Raum aller Teilstrukturen (Tri-, Tetra- und Pentasaccharide), aus denen sich N-Glykane aufbauen lassen, durch Langzeit-Molekulardynamik Simulationen systematisch abgetastet werden. Die erhaltenen Konformationskarten für jede glykosidische Bindung im Oligomer werden analysiert und für jeden stabilen Konformer die entsprechende Torsionswinkeln und dazugehörenden Energien in der Wissensbasis abgelegt. Die erzeugten 3D-Strukturen können mittels eines automatisch auf dem lokalen Rechner startenden Programms (Plugins) visualisiert und abgespeichert werden. Ein Algorithmus, der die automatische Verknüpfung der generierten N-Glykan Strukturen mit bestimmten Glykosylierungstellen eines Protein vornimmt (siehe Abb. 1), befindet sich in der Entwicklung [7]. Weitere seit längeren verfügbare und weltweit intensiv genutzte Anwendungen sind: SWEET-II: Erzeugung von verläßlichen räumlichen Strukturen für Oligosacchariden auf der Basis der in der Literatur standardisierten Schreibweise für Kohlenhydratketten (www.dkfz.de/spec/sweet2). PDB2MultiGIF: Darstellung von sich bewegenden bzw. drehenden Molekülen in Standard Web-Browsern. (www.dkfz-heidelberg.de/spec/pdb2mgif/) Abb. 1: In silico Glykosylierung eines Proteins. Laut Röntgenstruktur hat die Neuraminidase Hemaglutin (Influenza Virus, PDB-Eintrag 1INY) drei Glykosylierungsstellen, aber die Röntgen-Diffraktionsdaten reichen nicht, um die gesamten Zuckerketten darzustellen. Daher wurden neun repräsentativen N-Glykanstrukturen (Konformationen) mit dem Programm GLYDICT erzeugt und an einem der Glykosylierungsstellen verknüpft. Die relativ starre Proteinteile der Strukturen (Band Darstellung links) wurden genau überlagert, so daß der erreichbare konformationelle Raum der flexiblen N-Glykanstrukturen (Stabmodell rechts) dargestellt wird. GLYPEPS: nutzt die Möglichkeiten mittels MALDI-TOF und ESI MS-Techniken, die Präzisionsmassen von Pep- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation tiden mit hoher Genauigkeit bestimmen zu können, und verwendet die Information zur Auffinden Peptidmodifikationen (z.B. Glykosylierungen).(www.dkfz.de/spec/glypeps) Die aktuelle Nutzungsstatistiken unserer WWW-Datenbanken und Anwendungen können abgerufen werden unter (http://www.dkfz.de/spec/statistik/). In den Jahren 2000/ 2001 hatten wir im Durchschnitt täglich mehr als 500 Aufrufe mit steigender Tendenz zu verzeichnen. Es ist geplant, weitere Anwendungen über WWW-basierte Zugriffe verfügbar zu machen. Dies gilt insbesondere für die den Bereich glykowissenschaftlicher Fragestellungen. Mit unseren WWW-basierten Anwendungen im Bereich der Glykobiologie beteiligen wir uns an dem US amerikanischen Consortium for Functional Glycomics (glycomics.scripps.edu/). Ziel dieses Konsortiums ist, die Funktion von kohlenhydrat-bindenden Proteine bei der inter- und intrazellulären Kommunikation bzw. Signaltransduktion zu entschlüsseln. Aufbauend auf unseren Methoden verschiedene Datenbanken über eine eindeutige Strukturbeschreibung der Kohlenhydrate zu verknüpfen, sind wir intensiv an der konzeptionelle Arbeit für die neu zu schaffenden Datenbanken des Konsortiums beteiligt. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bohne, A.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: Molecular visualization programs on the web. Drugs of the Future 25 (2000) 489500. [2] Bohne, A.; *Wetter, T.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: Glykowissenschaften, ein neuer Einsatzbereich in der Bioinformatik. In: Informatik 2000 - Neue Horizonte im neuen Jahrhundert. K. Mehlhorn, G. Snelting (Eds.), Springer, Berlin, pp. 181-196 (2000). [3] von der Lieth, C.-W.; Expanding Proteomics to Glycobiology, In: Pacific Symposium on Biocomputing, Vol 7. R.B. Altman, A.K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale T.E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp. 283-284. [4] Bohne-Lang, A.; *Lang, E.; *Forster, T.; von der Lieth, C.-W.: LINUCS: Linear Notation for Unique Description of Carbohydrate Sequences. Carbohydrate Res. 336 (2001) 1-11. [5] Loss, A.; *Bunsmann, P.; Bohne, A.; *Loss, A.; *Schwarzer, E.; *Lang, E.; von der Lieth, C.-W.: SWEET-DB: an attempt to create annotated data collections for carbohydrates. Nucleic Acids Res. 30 (2002) 405-408. [6] Bohne, Andreas: Ein wissensbasiertes System zur schnellen Erzeugung von 3D-Strukturen biologisch relevanter N-Glykane sowie ihrer mimikrierenden Glykoclusterstrukturen. Dissertation: Medizinischen Fakultät, Univ. Heidelberg (2001). [7] Bohne A. and von der Lieth, C.-W.: Glycosylation of proteins: a computer-based method for the rapid exploration of the comformational space of N-Glycans. In: Pacific Symposium on Biocomputing, Vol 7. R.B. Altman, A.K. Dunker, L. Hunter, K. Lauderdale T.E. Klein (Eds.), World Scientific Publishing, London (2002) pp. 285-296. Methodenentwicklung und Anwendung der Massenspektrometrie in der Krebsforschung (R0402) W.D. Lehmann, A. Schlosser, M. Wind, A. Salek, G. Erben In Zusammenarbeit mit: D. Bossemeyer, D. Kübler, V. Kinzel, H. Wesch, A. Alonso, G. Füstenberger, F. Marks, D. Keppler, M. Eisenhut, A. Bohne, W. von der Lieth, R. Pipkorn (DKFZ). B. Brügger, J. B. Helms, F. Wieland, Biochemiezentrum, Universi- R0400 Zentrale Spektroskopie tät Heidelberg; E. Mayatepek, Kinderklinik, Universität Heidelberg; N. Jakubowski, Inst. f. Angewandte Spektroskopie (ISAS), Dortmund; M. Linscheid, Humboldt-Universität Berlin; E. Nigg, MPI für Biochemie, Martinsried. Polare Lipide und speziell modifizierte Proteine sind essentielle Bestandteile von zellulären SignalübertragungsProzessen (Kaskaden) und kontrollieren damit zahlreiche zentrale Zellfunktionen. Ihre molekulare Charakterisierung und Quantifizierung ist daher ein essentieller Baustein bei der Erforschung ihrer Funktionen. Aufgrund der technologischen Fortschritte sind in den letzten Jahren viele Signal-aktive Verbindungen der direkten molekularen Analytik mit Massenspektrometrie zugänglich geworden, so daß diese Technik mittlerweile die Methode der Wahl für die Spurenanalytik von polaren Lipiden und modifizierten Peptiden/Proteinen darstellt. Wir haben im Berichtszeitraum dazu die folgenden Ergebnisse erarbeitet. Analytik Polarer Lipide Hochempfindliche Charakterisierung und Quantifizierung von oxidierten Lipiden in Körperflüssigkeiten [1,2], in in vitro Lipoxygenase-Assays [3] sowie von Membranlipiden [4]. Diese Arbeiten wurden mit Electrospray (ESI) Tandem MS-Methoden durchgeführt, die zuvor überwiegend im eigenen Labor entwickelt wurden. Damit gelingt es z.B. in Membranen von isolierten Zellorganellen, das Cholesterin/ Sphingomyelin-Verhältnis zu bestimmen [4], ein analytischer Parameter bei der Charakterisierung z.B. von sogenannten lipid rafts in Zellmembranen. Weiter wurde mit diesen Methoden eine Strukturanalytik von iodierten lipophilen nuklearmedizinischen Markern durchgeführt [5]. Erkennung und Lokalisation von kovalenten Proteinmodifikationen Theoretische und Mechanistische Arbeiten Bestimmte kovalente Proteinmodifikationen wie Glykosylierung oder Lipidierung sind anhand der Präzisionsmasse eines entsprechend modifizierten Peptidfragments erkennbar. Dieses Phänomen wurde beschrieben und eine Internet-Suchmaschine zur Erkennung abweichender PeptidPräzisionsmassen geschaffen [6]. Bei Kollisions-induziertem Zerfall von modifizierten Peptiden in der Tandem Massenspektrometrie (die MS-Methode zur Strukturanalytik) wurde die Bildung von 5-Ring Strukturen als zentrales Element bei vielen Schlüsselfragmentierungen erkannt [7]. Isoaspartat-Bildung und Racemisierung Die Isoaspartat-Bildung ist eine weit verbreitete spontan ablaufende kovalente Proteinmodifikation, die mit zunehmender Proteinalterung zunimmt und in der Regel zu Funktionsbeinträchtigung oder Funktionsverlust des Proteins führt. Bislang sind nur wenige Analysenmethoden zur Analytik von Isoaspartat in Proteinen verfügbar. Wir haben die Tandem Massenspektrometrie als neue Methode für diesen Zweck erfolgreich eingesetzt [8] und in Rinder-Proteinkinase A neben der Isoaspartat-Bildung am N-terminus zusätzlich eine Racemisierung von L-Aspartat zu D-Aspartat nachweisen können [9]. N-terminale Myristoylierung Eine N-terminale Myristoylierung konnte mit Tandem MSMethoden an einem Golgi-Membranprotein (rekombinant und nativ) eindeutig nachgewiesen werden [10]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 101 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation N-terminale Oxalyl-Modifikation Eine Sauerstoff-induzierte Proteinspaltung mit Nachweis einer N-terminalen Oxalyl-Modifikation am abgespaltenen Peptid-Bruckstück wurde mit Tandem MS nachgewiesen [11]. 102 Phosphorylierung Die reversible Phosphorylierung an Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der häufigsten und funktionell wichtigsten kovalenten Proteinmodifikationen. Die Verbesserung der Analytik der Proteinphosphorylierung und deren Anwendung steht seit einigen Jahren Im Mittelpunkt unserer Forschungsaktivitäten. Eine vollständige Erfassung aller Phosphorylierungsstellen der Proteinkinase A wurde durch Kombination von Tandem Massenspektrometrie und proteolytischem Abbau durch Elastase erreicht [12]. Der Neutralverlust-Scan Modus wurde systematisch für den Nachweis von Serin- und Threonin-Phosphorylierung optimiert [12]. Die Element-Massenspektrometrie mit Phosphor-Detektion wurde als neue Methode zum Nachweis von Phosphopeptiden eingeführt und erprobt [13]. Mit gleichzeitiger Bestimmung von Schwefel und Phosphor wurde der Phosphorylierungsgrad von Phosphoproteinen bestimmt [14]. Mittlerweile wurde diese neue Methodik zur Charakterisierung bislang unbekannter Phosphorylierungsstellen eingesetzt. Publikationen (* = externer Koautor) [1] Uemura, M.; Lehmann, W.D.; *Schneider, W.; *Seitz, H.K.; Benner, A.; *Keppler-Hafkemeyer, A.; *Hafkemeyer, P.; *Kojima, H.; *Fujimoto, M.; *Tsujii, T.; *Fukui, H.; Keppler, D.: Enhanced urinary excretion of cysteinyl leukotrienes in patients with acute alcohol intoxication. Gastroenterology 118 (2000) 1140-1148. [2] *Mayatepek, E.; *Zelezny, R.; Lehmann, W.D.; *Hammond, J.W.; *Hoffmann, G.F.: Defects of the synthesis of cysteinyl leukotrienes: a new group of inborn errors of metabolism. J. Inherit. Metab. Dis. 23 (2000) 404-408. [3] Siebert, M.; Krieg, P.; Lehmann, W.D.; Marks, F.; Fürstenberger, G.: Enzymic characterization of epidermis-derived 12lipoxygenase isoemzymes. Biochem J. 355 (2001) 97-104. [4] *Brügger, B.; *Sandhoff, R.; *Wegehingel, S.; *Gorgas, K.; *Malsam, J.; *Helms, J.B.; Lehmann, W.D.; *Nickel, W.; *Wieland, F.T.: Evidence for segregation of sphingomyelin and cholesterol during formation of COPI-coated vesicles. J. Cell Biol. 151 (2000) 507-517. [5] Eisenhut, M.; Hull, W.E.; *Mohammed, A.; *Mier, W.; Lay, D.; *Just, W.; *Gorgas, K.; Lehmann, W.D.; Haberkorn, U.: Radioiodinated N-(2-diethylaminoethyl)benzamide derivatives with high melanoma uptake: structure-affinity relationships, metabolic fate, and intracellular localization. J. Med. Chem. 43 (2000) 3913-3922. [6] Lehmann, W.D.; Bohne, A.; von der Lieth, C.-W.: The information encrypted in the accurate mass of peptides improved protein identification and assistance in glycopeptide identification and characteriization. J. Mass Spectrom. 35 (2000) 1335-1341. [7] Schlosser, A.; Lehmann, W.D.: Five-membered ring formation in unimolecular reactions of peptides: a key structural element controlling low-energy collision-induced dissociation of peptides. J. Mass Spectrom. 35 (2000) 1382-1390. [8] Lehmann, W.D.; Schlosser, A.; Erben, G.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Kinzel, V.: Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Prot. Sci. 9 (2000) 22602268. R0400 Zentrale Spektroskopie [9] Kinzel, V.; König, N.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Lehmann, W.D.: The amino terminus of the PKA catalytic subunit - a site for introduction of postranslational heterogeneities by deamidation: DAsp2 and D-isoAsp2 containing isozymes. Prot. Sci. 9 (2000) 2269-2277. [10] *Eberle, H.B.; *Serrano, R.L.; *Radke, S.; *Füllekrug, J.; Schlosser, A.; Lehmann, W.D.; *Lottspeich, F.; *Kaloyanova, D.; *Wieland, F.T.; *Helms, J.B.: Identification and characterization of a novel human plant-pathogenesis related protein that localizes to lipid-enriched microdomains in the Golgi complex, J. Cell Sci. 115 (2002) 827-838. [11] *Wagner, A.F.V.; *Schultz, S.; *Bomke, J.; *Pils, T.; Lehmann, W.D.; *Knappe, J.: YfiD of E. coli and Y061 of bacteriophage T4 as autonomous glycyl radical cofactors reconstituting the catalytic center of oxygen-fragmented pyruvate formate-lyase. Biochem. Biophys. Res . Commun. 285 (2001) 456-462. [12] Schlosser, A.; Pipkorn, R.; Bossemeyer, D.; Lehmann, W.D.: Analysis of protein phosphorylation by combination of elastase digestion and neutral loss tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) 170-176. [13] Wind, M.; *Edler, M.; *Jakubowski, N.; *Linscheid, M.; Wesch, H.; Lehmann, W.D.: Analysis of protein phosphorylation by capillary liquid chromatography coupled to element mass spectrometry with 31P detection and to electrospray mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) 29-35. [14] Wind, M.; Wesch, H.; Lehmann, W.D.: Protein phosphorylation degree - Determination by capillary liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal. Chem. 73 (2001) 3006-3010. Methodische Entwicklung und Anwendung der Hochfeld-Kernmagnetischen-Resonanz(MR)-Spektroskopie und Bildgebung (R0403) W.E. Hull, D. Albert In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, R. Owen, H. Bartsch, J. Debus, P. Krammer, H. Walczak, R. Pipkorn (DKFZ); M. Eisenhut, Abt. Nuklearmedizin der Universität Heidelberg; S. Lebedkin, Forschungszentrum Karlsruhe; T.K. Lindhorst, Universität Hamburg; H. Kunz, Universität Mainz; I. Walter-Sack, Innere Medizin VI, Klinische Pharmakologie und Pharmakoepidemiologie, Universitätsklinikum Heidelberg. Zusatzfinanzierung: BMBF Glycobiotechnology Program (B256); Synthese und Molekulardynamic neuer Saccharid-basierten Dendrimere als Basis für neue Medikamente; für C.-W. von der Lieth und W.E. Hull in Kooperation mit M.Wießler (DKFZ) and Beiersdorf AG; 1 Postdoc (D. Albert), 1/2 CTA (G. Baumann), 01.01.98 - 31.12.00. In der ZS werden die MR-Forschungsaktivitäten mittels drei Großgeräten durchgeführt: ein 14-Tesla 4-Kanal Spektrometer (600 MHz 1H-Frequenz), hauptsächlich für Strukturforschung im Bereich Proteomics und Glycomics; ein 11,7-Tesla Spektrometer (500 MHz 1H-Frequenz) für die analytische in vitro NMR-Spektroskopie (MRS); ein multifunktionelles 7,0-Tesla System mit 15-cm Magnetbohrung für in vitro Analytik, z.B. an Bioflüssigkeiten, und in vivo MRS und MR-Bildgebung am Tiermodell. Für die routine MR-Analytik steht ein 5.8-Tesla (250 MHz) Gerät zur Verfügung. Die sogenannte in vitro MRS wird für analytische Aufgaben und Molekül-Strukturforschung eingesetzt; sie befaßt sich üblicherweise mit reinen Substanzen in Lösung, Chromatographie-Fraktionen oder Reaktionsgemischen. Es können aber auch biologische Flüssigkeiten wie Urin und DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Plasma (Pharmakokinetik-Studien) oder Suspensionen intakter Zellen bzw. Zellextrakte untersucht werden. Die sogenannte in vivo MRS wird hauptsächlich für nichtinvasive metabolische Untersuchungen an soliden Tumoren im Tiermodell eingesetzt. Mit MR-Bildgebung kann das Wachstum von Tumoren bzw. Metastasen im lebenden Tier visualisiert werden. Einige der aufwendigeren kooperativen Forschungsprojekte, die über die Routine-Analytik hinausgehen, werden im Folgenden beschrieben. Struktur-Analytik mittels MRS In verschiedenen Kooperationen wurden die Methoden der hochauflösenden 1H- und 13C-MRS intensiv für die Strukturbestimmung und Charakterisierung einzelner Moleküle eingesetzt. R0400 Zentrale Spektroskopie Projekt war die Bestimmung der für die immunogene Wirkung wichtigen konformationellen Eigenschaften des 12mer MUC1-Peptides mittels zweidimensionaler 1H-NMR Messungen bei 500 MHz und Molecular Modeling. Dazu wurde ein Sialyl-GalNAc-O-Threonin-Derivat dieses Peptids auch untersucht. Die Ergebnisse der Studie (die noch zu veröffentlichen sind) zeigen, daß der MUC1-Peptid eine offene, relativ flexible Struktur besitzt, ohne Bevorzugung einer bestimmten Konformation. Dagegen zeigt das glykosylierte Peptid eine deutlich eingeschränktere Konformation, insbesondere um die Glykosylierungsstelle, (eine geknickte Struktur mit zwei „half turns“). Diese letzteren Eigenschaften könnten für die immunogene Wirkung des Vakzins von Bedeutung sein (siehe Abb. 2). Fulleren-Chemie. Fullerene sind exotische KohlenstoffMoleküle, die auf mögliche Anwendungen in der Nanotechnologie und Pharmakologie intensiv untersucht werden. Die wichtigsten analytischen Techniken sind Ramanund 13C-NMR-Spektroskopie. Eine dreijährige Kooperation mit dem MPI für Kernphysik, der Universität Heidelberg, und das Forschungszentrum Karlsruhe ging vorläufig zu Ende mit einer Arbeit über den C70-Dimer C140 [1]. Neue Radiodiagnostika. Die Früherkennung von aggressiven, metastasierenden Krebserkrankungen bleibt ein wichtiges Ziel der Diagnostik. Weil Hautkrebs (Melanom) eine steigende Frequenz in der Bevölkerung zeigt, wird intensiv an die Entwicklung neuer melanom-spezifischer Radiodiagnostika für den Nachweis von Tumoren und Metastasen mittels bildgebender Verfahren wie Szintigraphie und SPECT (single-photon emission computed tomography). In der Abt. Nuklearmedizin der Universität Heidelberg wurden eine Reihe neuer radioiodinierter N-(2-Diethylaminoethyl)-Benzamid-Derivate entwickelt und ihre Aufnahme in Melanom-Gewebe untersucht. Für die Charakterisierung und Strukturbestätigung der verschiedenen Substanzen wurden zahlreiche 1H- und 13C-NMR-Spektren analysiert [2]. MGMT Inhibitoren. Eine große Reihe potentieller Inhibitoren des DNA-Repair Proteins O6-Methylguanin-DNAMethyltransferase (MGMT) wurden synthetisiert (Abt. Wiessler, C0300); die Strukturen und ihre Reinheit wurden durch NMR charakterisiert, und ihre in vitro Aktivitäten wurden getestet [3]. Zu dem wurden ausführliche Molekular-Dynamik Studien (siehe R0404 unten) der Protein-Inhibitor-Komplexe unternommen, um die Struktur-Aktivitätsbeziehungen aufzuklären. Die effektivste Substanzen waren ω-[O6-Bromthenyl-Guan-9-yl]-(CH2)n -β-D-Glucoside mit n = 8,10,12. Entwicklung eines synthetischen Antitumorvakzins. In der Arbeitsgruppe von H. Kunz (Uni Mainz) wird ein 12-mer Peptid, GVTSAPDTRPAP, einer Teilsequenz der tumorassoziierten Glykopeptid MUC1 (überexprimiert bei Epithelkarzinomen), über einem Alkyläther-Spacer mit einem T-Zell-Epitop YSYSPFV gekoppelt. Das Konjugat soll eine tumorspezifische T-Zell-Proliferation stimulieren, d.h. als synthetisches Vakzin wirken. Unser Beitrag zu diesem Abb. 2: Energie-minimierte und durch NMR bestätigte Struktur des glykosylierten MUC1-Peptides mit Wasserstoffbrücken in den „half-turns“ T1-A3 und D5-R7; P4-P10 ist das antigene Epitop. Chemoprävention Krebspräventive Substanzen in Olivenöl. Das Ernährungsschema im Mittelmeerraum (hohe Anteile von Früchten, Gemüse, Fisch, und Olivenöl) bietet, laut Statistik, eine breite protektive Wirkung gegen Krebs (insbesondere Kolorektalekarzinom und Mammakarzinom) und HerzKreislauf-Erkrankungen. Es gibt zunehmende Hinweise, daß Olivenöl, insbesondere das kaltgepresste „extravirgin“ Produkt, eine große gesundheitsfördernde Rolle spielen kann [4]. In der Abt. Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200: Abt. Bartsch, Gruppe Owen) wird die chemopräventive Wirkung des Mittelmeerdiäts untersucht, und seit 1998 wird die MR-Analytik intensiv eingesetzt, um eine detaillierte Bestandsaufnahme der Antioxidantien (Phenole und Derivate) in Olivenöl zu erstellen [5,6]. Es könnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß, zusätzlich zu den einfachen Phenolen und Secoiridoiden, auch die Lignane (+)-1Acetoxypinoresinol and (+)-Pinoresinol als Hauptkomponenten in nativem Olivenöl vorhanden sind [7]. Die Lignane wirken protektiv gegen Brust-, Kolon-, und Prostatakrebs, sind aber nicht in raffiniertem Olivenöl oder anderen Kern-Ölen vorhanden. Neben Olivenöl wurde das Olivenfruchtfleisch (brined olive drupes) auch untersucht. Durch die NMR-Analytik konnten mehrere phenolische Antioxidantien identifiziert werden [8]. Grüne Oliven enthalten hauptsächlich Hydroxytyrosol während schwarze Oliven eine Vielzahl von interessanten DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 103 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation Verbindungen aufweisen (Abb. 3): die einfache Phenole tyrosol, dehydrocaffeic acid, dehydro-p-coumaric acid; das Disaccharid Acteosid, sowie die Flavonoide Luteolin und Apigenin. Die Konzentrationen dieser potentiell krebspräventiven Substanzen waren im Fruchtfleisch sogar höher als in den entsprechenden geernteten Ölen. Zimtsäure ist auch ein wichtiger Inhaltstoff in Früchten, Gemusen und chinesischen Medikamenten und zeigt protektive Wirkung gegen reaktiver Sauerstoff in in vitro Assays. Die resultierende hydroxylierten Spezies (Coumarinsäuren) wurden mittels NMR identifiziert. 104 Glykobiotechnologie: Thioharnstoff-ZuckerDerivate Die Entdeckung von Harnstoff-gekoppelten Sacchariden in Breitbandantibiotika hat das Interesse an diesen Substanzen und ihren Schwefel-Analoga (Thioharnstoff-Derivaten) geweckt. Solche Moleküle haben interessante chemische und biologische Eigenschaften und können als Bausteine für multivalente Glykodendrimere dienen. Die Thioharnstoff-Verbindungen R-NH-C(=S)-N’H-R’ besitzen N-C und C-N’ Bindungen mit Doppelbindungscharakter (eingeschränkte Rotation) so daß vier Kombinationen von cis (E) oder trans (Z) Bindungen möglich sind (EE, EZ, ZE, ZZ). Die Populationen der verschiedenen Thioharnstoff-Isomeren (Konformationen) sind abhängig von den Substituenten R und R’ (z.B. Methyl, Phenyl, Glucosyl, Mannosyl, usw.), der Temperatur und dem Lösungsmittel und beeinflussen daher die chemischen Reaktionen dieser Substanzen. R0400 Zentrale Spektroskopie die EE Form auch beobachtet; bei R,R’ = Ethyl oder Phenyl wurde ZZ statt EE als zweite Konformation festgestellt. In einer Kooperation mit T.K. Lindhorst (Uni. Kiel) wurden verschiedene C1-Thioharnstoff-Zucker-Derivate mit der Struktur Pyranose-NH-C(=S)-N’H-R’ mit ein- und zweidimensionaler MRS untersucht (Pyranose = 2,3,4,6-Tetra-Oacetyl Glucose, Mannose, oder Galactose). Bei α-Mannose mit Thioharnstoff in axialer Position wird die EZ Konformation bevorzugt aber EE und ZE wurden auch nachgewiesen. Besonders interessant ist die Tatsache, daß bei ZE die Mannose-Ringkonformation von der gewöhnlichen 4 C1 Sesselform in den selten beobachteten 1C4 Sessel mit equatorialem Thioharnstoff umklappt. Um den stereoelektronischen Effekten hinter diesem Verhalten besser zu verstehen wurden intensiven Molecular Modeling Studien (semi-empirischen sowie ab initio Methoden) durchgeführt - u.a. unter die Nutzung der erweiterten Parallelrechner-Kapazitäten der ZDV. Die Arbeiten an diesem Projekt sind weitgehend abgeschlossen und die Ergebnisse werden im Jahr 2002 veröffentlicht. 19 F-MR-Studien zur Fluorpyrimidin-Chemotherapie Fluorpyrimidin Chemotherapie (z.B. mit 5-Fluoruracil, 5-FU) ist eine der ältesten aber noch weitverbreiteten Behandlungsmethoden, insbesondere für Kolonkarzinom und Lebermetastasen. 19F-MRS bietet die einmalige Möglichkeit die zahlreichen Metaboliten eines Medikamentes wie Fluoruracil z.B. in Blutplasma, Urin, oder Tumorgewebe nachzuweisen und zu quantifizieren. Mehrere Studien dieser Art wurden seit 1986 in der Abteilung erfolgreich durchgeführt. Nach einem Hilferuf aus der Pharmakologie der Universitätsklinikum Heidelberg, haben wir unsere Erfahrung und Meßmethodik zur Verfügung gestellt, um zum ersten Mal eine detaillierte Pharmakokinetik für 5-FU in Blutplasma bei einem Krebspatient mit terminaler Niereninsuffizienz (Hämodialyse-Patient) aufzuzeichnen [9]. Die Behandlung solcher Patienten ist äußerst schwierig weil sie, durch die fehlende Nierenfunktion, keine selbständige Ausscheidung (Clearance) der anfallenden, zum Teil giftigen 5-FU Metaboliten zeigen und daher sehr anfällig für systemische toxische Nebenwirkungen sind. Abb. 3: Wichtige Antioxidantien im Fruchtfleisch von schwarzen Oliven. Eine Reihe Modellsubstanzen mit R,R’ = Methyl, Ethyl, oder Phenyl wurden mittels 1H- und 13C-MRS untersucht. Bei Temperaturen unter -50°C ist die Umwandlung der Isomeren langsam, so daß einzelne Konformationen nachweisbar sind. Bei den symmetrischen Molekülen mit R,R’ = Methyl wird die EZ = ZE Konformation (bevorzugt) aber Die NMR-Daten zeigten, daß nach 5 täglichen Bolus-Infusion von 5-FU, und trotz Hämodialyse jeden zweiten Tag, bedenklich hohe Konzentrationen von dem Hauptkatabolit α-Fluor-β-Alanine (FBAL) in Plasma erreicht wurden. Auch eine Langzeitinfusion führte zu einem sehr hohen FBALSpiegel. Nach weitergehenden NMR-Analysen konnte sogar die FBAL-Metaboliten Fluorhydroxypropionsäure (FHPA) und das Neurotoxin Fluoracetat (FAC) in mikromolare Konzentrationen (Abb. 4) bei den zwei bis jetzt untersuchten Patienten nachgewiesen werden. Beide Patienten zeigten deutliche systemische Nebenwirkungen der Therapie, einer zeigte starke neurologische Störungen. Hier konnte zum ersten Mal die 19F-MRS die Grenzen der 5-FU Therapie bei Dialyse-Patienten deutlich machen. Es DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation wurde damit klar, daß die Anwendung dieser problematischen Therapie eine noch gründlichere, tägliche Dialyse verlangt. R0400 Zentrale Spektroskopie Produktion und der Export von 5-FU wiederum begrenzt wird. Interessanterweise, funktioniert diese CD/5-FC Gentherapie mit Bystander Effect in einigen anderen Zell- bzw. Tiermodellen doch ausgezeichnet. Unsere MRS-Studie zeigt aber klar und deutlich, warum die Therapie für die gewählte Prostatekarzinom-Linie nicht funktionierte und wie wichtig es ist, die metabolischen Bedingungen einer möglichen Gentherapie durch entsprechende Untersuchungen abzuklären. 105 Abb. 4: 282 MHz 19F-MRS of Blutplasma eines Dialyse-Patienten mit Kolonkarzinom, 26 Std. nach Ende einer 5-FU Behandlung (2.9 g Infusion über 21 Std) und vor der Hämodialyse. Durch die fehlende Nierenfunktion wird eine sehr hohe Konzentration von FBAL (311 µM) erreicht; bedenkliche Menge von den FBAL-Metaboliten, die neurotoxische Substanzen FHPA und FAC, werden auch nachgewiesen. Der Patient zeigte starke neurologische Nebenwirkungen. 19 F-MRS Untersuchungen zu einem GentherapieModell In einer Kooperation mit der Abt. Debus (E0500) wurde die 19 F-MRS eingesetzt, um metabolische Fragen zu einem Gentherapie-Modell zu beantworten (Cytosin-Deaminase/ 5-Fluorcytosin Therapie des Dunning Prostatekarzinoms der Ratte). Die Prostatekarzinom Zell-Linie AT-1 wurde mit dem Gen für Cytosindeaminase (CD von E. coli) transfiziert. Diese CD+-Zellen waren empfindlich gegenüber Behandlung mit dem Prodrug 5-Fluorcytosin (5-FC), das intrazellulär durch CD in das hochwirksame Zytostatikum 5Fluoruracil (5-FU) umgewandelt wird. Es wurde aber in Zellkultur und Tierexperimenten festgestellt, daß bei diesem Modell der für eine praktische Therapie so wichtige Bystander Effect (die wirksame Tötung benachbarter, nicht-transfizierter CD--Zellen durch den in den CD+-Zellen produzierten 5-FU) nicht funktionierte. Um den Grund dieser Fehlschlag zu entdecken, wurde 19FMRS Messungen an Suspensionen von intakten CD+-Zellen nach Inkubation mit 5-FC durchgeführt. Die spektroskopische Daten zeigten, daß die Aufnahme des 5-FC in die CD+-Zellen und seine Umwandlung in 5-FU relativ langsam abläuft. Dagegen war die Aktivierung des 5-FU durch Anabolismus zu zytotoxischen Fluor-Nukleotiden (FNuctd) wie FUTP (die die Zelle nicht verlassen) relativ schnell; der Export des produzierten 5-FU in das Medium (notwendig für einen Bystander Effect) war wiederum sehr langsam. Ein hoher negativer Konzentrationsgradient zwischen intra- und extrazellulärem 5-FU blieb erhalten, auch nach 16-Std. Inkubation (Abb. 5). Diese effektives „trapping“ des intrazellulären 5-FU in den CD+-Zellen verhindert einen effiizienten Bystander Effect; durch die Wirkung der in CD+-Zellen produzierten F-Nuctd werden diese Zellen (die 5-FU Fabrik) relativ schnell getötet, so daß die Abb. 5: 19F-MRS (470 MHz, 4°C) von (A) einer Suspension intakter CD+-Zellen, geerntet nach 16-Std. Inkubation with 774 µM 5FC (4-Std. MRS-Meßzeit) und (B) dem Inkubationsmedium zur Zeit der Ernte (1-Std. Meßzeit). In der Zellsuspension werden drei Signale für intrazelluläres 5-FC (314 µM), 5-FU (52 µM) und eine nicht-aufgelöste Mischung von Fluor-Nukleotiden (163 µM) detektiert. In dem Kulturmedium wird, neben 5-FC, nur eine sehr niedrige Konzentration von 5-FU (6.4 µM) nachgewiesen (sehr schwache Bystander Effect). NMR-basiertes Screening von Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor In einer Kooperation mit der Abt. Krammer (G0300) und der Gruppe Walczak (G0310) wird seit dem 3. Quartal 2001 mit Hilfe der außerordentlichen Leistung des neuen 600 MHz NMR-Spektrometer an einem neuen Strukturforschungsprojekt im Bereich Apoptose gearbeitet. Durch die NMR-Spektroskopie können die Wechselwirkungen von Liganden und Rezeptoren (Struktur und Dynamik) detailliert auf der molekularen Ebene untersucht werden. NMR-Screening bietet die Möglichkeit, niedermolekularen, peptidischen oder nicht-peptidischen Liganden, welche z.B. die Einleitung der Apoptose beeinflussen können, zu entdecken bzw. zu optimieren, mit folgenden Vorteilen: - hohe Empfindlichkeit, auch für die Erkennung schwach bindender Liganden; - Bestimmung der 3D-Struktur des Liganden im gebundenen Zustand (im Komplex); - Bestimmung der beteiligten Bindungsstellen am Rezeptor; - gezielte, rationale Optimierung der Ligandstruktur. Bei den typischen NMR-Screening Anwendungen werden etwa 0,1 - 1 µmol eines Proteines oder seiner Rezeptor- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation 106 domäne benötigt. In der Arbeitsgruppe Walczak werden z.Z. entsprechende Mengen eines wasserlöslichen Fusionsproteins, gebildet aus der extrazellulären Domäne von TRAIL-R2 und der Fc-Region des menschlichen IgG, aufbereitet. TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand oder APO-2L), ein neulich identifiziertes Mitglied der TNF-Familie von Liganden kann Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzellen hervorrufen mit minimaler Toxizität gegen normale Zellen. TRAIL induziert Apoptose über zwei Rezeptoren, die eine Todesdomäne enthalten: TRAIL-R1 (DR4) und TRAIL-R2 (DR5). Das Fusionsprotein TRAIL-R2-Fc hemmt spezifisch die TRAIL-induzierte nicht aber die CD95L-induzierte Apoptose. TRAIL-R2-Fc ist daher ein geeignetes Modellsystem, um passende Liganden für den membrangebundenen TRAIL-R2 Rezeptor zu finden. Mit Hilfe der vorliegenden Röntgenstruktur des TRAIL/ TRAIL-R2 Komplexes wurden durch Molecular Modeling kurze Abschnitte (Teilsequenzen) im Ligand gefunden, welche für die Affinität und Spezifizität von TRAIL verantwortlich sein könnten. Die entsprechende Oligopeptide sind bereits synthetisiert (Gruppe Pipkorn) und werden zur Zeit mittels 1H-NMR vollständig charakterisiert. So bald das TRAIL-R2-Fc Fusionprotein bereitgestellt wird, kann das Screening beginnen und die Eigenschaften, die für die Affinität und die Spezifizität der TRAIL/TRAIL-R2 Wechselwirkung verantwortlich sind, näher definiert werden. Zur weiteren Optimierung der Liganden müssen die günstigsten bzw. aktivsten Konformationen der gefundenen Peptide stabilisiert werden, z. B. durch intramolekulare Verknüpfungen. Ein Kandidat-Sequenz ist der 19-mer aus dem Bereich Tyr189 - Val207 der TRAIL-Sequenz - ein Bereich, der wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Spezifizität des Liganden spielt. Im TRAIL-TRAIL-R2 Komplex ist dieser 19-mer in einem konformativ fixierten Loop oder „hairpin“ähnlicher Struktur angeordnet und geht gleichzeitig Wechselwirkungen mit zwei Rezeptormolekülen ein (Abb. 6), wobei die dreidimensionale Ausrichtung der Seitenketten eine entscheidende Rolle spielt. Abb. 6: Wechselwirkung zwischen der Teilsequenz Tyr189 Val207 in TRAIL (mitte) mit zwei Molekülen des TRAIL-R2 R0400 Zentrale Spektroskopie Um die Bindungsaffinität eines Modell-Peptides zu erhöhen, muß der zugängliche Konformationsraum der relativ flexiblen Peptidkette eingeschränkt werden, z.B. durch das Einbringen jeweils einen Cystein-Rest am Anfang und Ende der Teilsequenz und die Zyklisierung durch eine Disulfid-Brücke. Zusätzliche Stabilisierung soll durch Wechselwirkungen zwischen den Aminosäureseitenketten erfolgen. Nach einer in der Literatur aufgestellten These, bildet TRAIL-R2 in Abwesenheit des TRAIL-Liganden einen selbstassoziierten Trimer (mittels sogenannten PLAD-Domäne), der die Apoptose nicht im Gange setzen kann. Die Komplexierung des TRAIL-R2 Trimers mit einem TRAILTrimer führt zu einer Trennung der PLAD-Kontakte und löst schließlich die Apoptose aus. Eine ähnliche Wechselwirkung zwischen dem TRAIL-R2 Trimer und drei Moleküle unseres bivalenten zyklischen Peptides ist evtl. auch möglich. Mit diesem Projekt sollen hochaffine und selektive Liganden für den TRAIL-R2 Rezeptor aufgebaut werden, wobei die Struktur (Konformation) der Liganden (frei und im Komplex mit dem Rezeptor) bezüglich der Bindungsaffinität, -spezifizität und biologischer Wirkung gezielt optimiert werden soll. Dadurch erhoffen wir niedermolekulare Substanzen liefern zu können, die die Apoptose in Krebszellen auslösen und von therapeutischem Interesse sind. Publikationen (* = externer Koautor) [1] *Lebedkin, S.; Hull, W.E.; *Soldatov, A.; *Renker, B.; *Kappes, M.M.: Structure and properties of the fullerene dimer C140 produced by pressure treatment of C70. J. Chem. Phys. 104 (2000) 4101-4110. [2] *Eisenhut; M., Hull, W.E.; *Mohammed, A.; *Mier, W.; *Lay, D.; *Just, W.; *Gorgas, K.; Lehmann, W.D.; Haberkorn, U.: Radioiodinated N-(2-diethylaminoethyl)benzamide derivatives with high melanoma uptake: structure-affinity relationships, metabolic fate, and intracellular localization. J. Med. Chem. 43 (2000) 3913-3922. [3] Reinhard, J.; Hull, W.E.; von der Lieth, C.-W.; *Eichhorn, U.; Kliem, H.-C.; *Kaina, B.; Wiessler, M.: Monosaccharide-linked inhibitors of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling and structure-activity relationships. J. Med. Chem. 44 (2001) 4050-4061. [4] Owen, R.W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Würtele, G.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncology 1 (2000) 107-112. [5] Owen, R.W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Haubner, R.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. Eur. J. Cancer 36 (2000) 1235-1247. [6] Owen, R.W.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Phenolic compounds and squalene in olive oils: the concentration and antioxidant potential of total phenols, simple phenols, secoiridoids, lignans and squalene. Food Chem. Toxicol. 38 (2000) 647-659. [7] Owen, R.W.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: Identification of lignans as major components in the phenolic fraction of olive oil. Clin. Chem. 46 (2000) 976-988. Rezeptorproteins (Oberflächen). [8] Owen, R.W.; Haubner, R.; Mier, W.; *Giacosa, A.; Hull, W.E.; Spiegelhalder, B.; Bartsch, H.: The isolation, structure elucidation and antioxidant potential of the major phenolic and flavonoid compounds in brined olive drupes. Clin. Chem. (2002), submitted. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation R0400 Zentrale Spektroskopie [9] *Rengelshausen, J.; Hull, W.E.; *Schwenger, V.; *Göggelmann, C.; *Walter-Sack, I.; *Bommer, J.: Pharmacokinetics of 5-FU and its Catabolites Determined by 19FMRS for a Patient on Chronic Hemodialysis. Am. J. Kidney Dis. 39 (2002) U30 - U36. wendig, neue Möglichkeiten zur Beschreibung der Aufenthaltswahrscheinlichkeiten von funktionellen Gruppen zu entwickeln. [10] Corban-Wilhelm, H.; Hull, W.E.; Becker, G.; Bauder-Wüst, U.; Greulich, D.; Debus, J.: Cytosine deaminase gene therapy in a Dunning rat prostate tumour model: characterisation of 5-fluorocytosine metabolism and the bystander effect with 19F-NMR spectroscopy. Gene Therapy (2002) submitted. Die Untersuchung biologischer Kommunikations -prozesse stellt einen vielversprechenden Ansatz dar, um Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung in eine rationale Entwicklung von neuen Strategien zur Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen einzubringen. Zunehmend zeigt sich auch die Bedeutung von Kohlenhydraten (Oligosaccharide) heraus. Diese Moleküle werden kovalent an Proteine oder Lipide gebunden, die in der Zellmembran verankert sind. Solche Glykoproteine bzw. Glykolipide stellen wesentliche Komponenten der Zelloberfläche dar und sind somit besonders exponiert, um an Zell-Zell und Zell-Matrix Erkennungs- bzw. Signalprozessen mitzuwirken [4,5]. So wird z.B. der erste Schritt des Anheftens von Leukozyten an die Endothelzellen der Blutgefäße - ein entscheidender Schritt im Entzündungsprozeß - durch Selektine vermittelt, die spezifische Oligosaccharide auf der Zelloberfläche erkennen. Molecular Modeling (R0404) C.-W. von der Lieth, M. Frank, A. Bohne-Lang In Zusammenarbeit mit: M. Wießler, H.-C. Kliem, M. Pawlita, P. Altevogt (DKFZ); J.F.G. Vliegenthart, Bijvoet Center for Biomolecular Research, Universität Utrecht, Niederlande; H.-J. Gabius, H.-C. Siebert, Tierärtzliche Fakultät, LMU München, T.K. Lindhorst, Universität Kiel. Zusatzfinanzierung: BMBF Glycobiotechnology Program (B256); Synthese und Molekulardynamik neuer Saccharid-basierten Dendrimere als Basis für neue Medikamente; für C.-W. von der Lieth und W.E. Hull in Kooperation mit M. Wießler (DKFZ) and Beiersdorf AG; 1 Doktorand (A. Bohne); 1 Workstation; 12.02.98 31.12.00. Zusatzfinanzierung: DFN-Projekt (B919); Dynamische Moleküle: Darstellung und Analyse der Dynamik von biologischen Makromolekülen per Internet; für C.-W. von der Lieth; 1 Postdoc (M. Frank), versch. HiWis; 1 Linux-Cluster (Teilfinanzierung); 01.06.01 - 31.05.03. 3D Struktur in Lösung Die möglichst genaue Kenntnis der dreidimensio-nalen (3D) Struktur von biologisch aktiven Verbind-ungen und deren Flexibilität und Dynamik in Lösung ist oft der entscheidende Schlüssel zu einem tieferen Verständnis ihrer Wirksamkeit. Röntgenstrukturanalyse und Neutronenbeugung liefern verläßliche 3D Strukturen von chemischen Verbindungen im kristallinen Zustand. Mit multidimensionalen NMR-Techniken und effektiven Modellierungsprogrammen ist es möglich, die räumliche Strukturen und Dynamik von Molekülen in Lösung zu untersuchen. Die NMR-Daten liefern geometrische Informationen (Atomabstände, Diederwinkel, Stereochemie), die als Eingangsinformationen und/oder Nebenbedingungen z.B. in einer geometrischen Optimierung oder in einer Kraftfeldberechnung verwendet werden können. Die rasche Entwicklung der Computertechnologien erlaubt es, das dynamische Verhalten von zunehmend größeren molekularen Ensembles unter Berücksichtigung der jeweiligen physiologischen Bedingungen zu simulieren. Zur Auswertung werden effiziente Werkzeuge benötigt, die eine weitgehend automatische Analyse der anfallenden riesigen Datenmengen erlaubt. Das in der Arbeitsgruppe entwickelte Programm CAT (Conformational Analysis Tools) [1] ermöglicht eine detaillierte Analyse dynamischer Vorgänge innerhalb von biologischen Markomolekülen und deren Wechselwirkungen untereinander. Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen Die Bindung von Kohlenhydraten an Modell-Lektinen wurde mittels Transfer-NOE-NMR-Experimenten und verschiedenen Methoden des Molecular Modeling (Homologie-Modelierung, Berechnung der Wechselwirkungsenergien, systematische Konformationssuche, usw.) in verschiedenen Lösungsmitteln untersucht [5,6,7]. Dabei stellte sich heraus, dass aprotische Lösungsmittel, in denen zusätzlich NOE-Kontakte gemessen werden können, einen starken Einfluß auf die Entropie des Komplexes hat und insgesamt zur Verminderung der Bindungsstärke führen [7]. Intensiven Molekular-Dynamik Simulationen für Komplexe der O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase mit einer Familie neuer synthetischen Inhibitoren wurden durchgeführt. Die Inhibitoren waren Guanin-Derivate, die über unterschiedlich lange Alkylketten mit Glucose gekoppelt wurden. Es gelang uns, ein 3D-Modell zu entwickeln, dass auf atomarer Ebene die unterschiedliche Bindeverhalten der verschiedenen Inhibitoren quantitativ beschreiben konnte [8]. Angewandt wurde hierzu eine neue methodische Entwicklung, die es erlaubt, die Interaktionen zwischen Ligand und Rezeptor (Abb. 7) auf der Basis der einzelnen Aminosäurereste in der Bindungstasche und einzelner Teile des Ligands zu analysieren, d.h. die Wechselwirkung in individuellen Bestandteile zu zerlegen. Dazu konnte auch die interne Dynamik sowohl des Proteins als auch des Inhibitors berücksichtigt werden. Die durch Modeling errechneten Bindungsenergien zeigten eine gute Korrelation mit den gemessen Inhibitionskonstanten. Intensive Studien zum Abtasten des konformationellen Raumes von flexiblen Molekülen wurden mittels Molekular-Dynamik Simulationen an Glykodendrimeren und NGlykanen durchgeführt [2,3]. Um aussagekräftige Beschreibungen des dynamischen Verhaltens von sehr beweglichen Molekülen zu erhalten, erwies es sich als not- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 107 Forschungsschwerpunkt B Tumorzellregulation R0400 Zentrale Spektroskopie [5] *Solís, D.; *Jiménez-Barbero, J.; *Kaltner, H.; *Romero, A.; *Siebert, H.-C.; von der Lieth, C.-W.; *Gabius, H.-J.: Towards defining the role of glycans as hardware in information storage and transfer: basic principles, experimental approaches and recent progress. Cells Tissues Organs 168 (2001) 5-23. [6] *Asensio, J.L.; *Siebert, H.-C.; von der Lieth, C.-W.; *Laynez J.; *Bruix, M.; *Soedjanaamadja, U.M.; *Beintema J.J.; *Cañada, F.J.; *Gabius, H.-J.; *Jiménez-Barbero, J.: NMR investigations of protein-carbohydrate interactions: studies on the relevance of Trp/ Tyr variations in lectin binding sites as deduced from titration microcalorimetry and NMR studies on hevein domains. Determination of the NMR structure of the complex between pseudohevein and N,N*,N(-triacetylchitotriose. Proteins: Structure, Function, and Genetics 40 (2000) 218-236. 108 Abb. 7: Das Bild zeigt einen sogenannten Snapshot aus einer Molekular-Dynamik Simulation für den Komplex zwischen MGMT und dem Inhibitor ω-[O6-Bromthenyl-Guan-9-yl]-(CH2)8 -β-D-Glucoside. Die Röntgenstruktur des MGMT (PDB entry: 1QNT) wurde als Templat verwendet. Der Inhibitor (Stabmodell) und die wasserzugängliche Oberfläche des Proteins werden dargestellt (Seitenketten der Aminosäuren sind beschriftet). Die Bromthenyl-Gruppe und Teil des Guanins sind in dem tunnel-ähnlichen Bereich der Bindungstasche zu sehen (vorne, rechts; Arg135, Ser159, Gly160); die Alkylkette und Glucose-Einheit liegen entlang einer hydrophobischen Mulde (nach hinten, links). [7] *Siebert, H.-C.; *André, S.; *Asensio, J.L.; *Cañada, F.J.; *Dong, X.; *Espinosa, J.F.; Frank, M.; *Gilleron, M.; *Kaltner, H.; *Kozár, T.; *Bovin, N.V.; von der Lieth, C.-W.; *Vliegenthart, J.F.G.; *Jiménez-Barbero, J.; *Gabius, H.-J.: A new combined computational and NMR-spectroscopic strategy for the identification of additional conformational constraints of the bound ligand in an aprotic solvent. ChemBioChem 1 (2000) 181-195. [8] Reinhard, J.; Hull, W.E.; von der Lieth, C.-W.; *Eichhorn, U.; Kliem, H.-C.; *Kaina, B.; Wiessler, M.: Monosaccharide-linked inhibitors of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT): synthesis, molecular modeling and structure-activity relationships. Journal of Medicinal Chemistry 44 (2001) 4050-4061. [9] Oleszewski, M.; Gutwein, P.; von der Lieth, W.; *Rauch U.; Altevogt, P.: Characterization of the L1-neurocan-binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 34478-34485. Modellieren Sequenz-homologer Proteine Die Zahl der experimentell gelösten 3D Proteinstrukturen hat in den letzten Jahren stark zugenommen, so dass auch für viele in der Krebsforschung relevante Moleküle verläßliche Strukturen mit einem wissensbasierten Ansatz modelliert werden können. Zudem hat sich auch die Qualität der verwendeten Algorithmen kontinuierlich verbessert. Da zudem praktisch alle notwendigen Daten und ein Großteil der Programme über das Internet abgerufen werden können, entwickelt sich eine ständig steigende Nachfrage, diese Möglichkeiten auch für Fragestellungen aus dem DKFZ zu nutzen. Aus diesem Grunde bieten wir einerseits Fortbildungskurse an, andererseits versuchen wir in Form von Linksammlungen den interessierten Kollegen einen einfachen Zugang zu den Datenbanken und Programmen zu eröffnen. Werden neben den Standardanwendungen zusätzliche, komplexe Modellierungsschritte [9] erforderlich, so führen wir diese in Kooperation durch. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Frank, Martin: Konformationsanalyse von Oligosacchariden im freien und gebundenen Zustand. Dissertation: Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät, Univ. Heidelberg (2000). < http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/605/> [2] von der Lieth, C.-W.; Frank, M.; *Lindhorst, T.K.: Molecular dynamics simulations of glycoclusters and glycodendrimers, Reviews in Molecular Biotechnology 90 (2002) 311-337. [3] Frank, M.; Bohne, A.; *Wetter, T., von der Lieth, C.-W.: Knowledge-Based Approach for the Rapid Generation of a Representative Ensemble of N-Glycan Conformations, In Silico Biology (2002), in press. [4] *Rüdiger, H.; *Siebert, H.-C.; *Solís, D.; *Jiménez-Barbero, J.; *Romero, A.; von der Lieth, C.-W.; *Diaz-Mauriño, T.; *Gabius, H.J.: Medicinal chemistry based on the sugar code: fundamentals of lectinology and experimental strategies with lectins as targets. Current Medicinal Chemistry 7 (2000) 389-416. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Übersicht Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Sprecher: Prof. Dr. Helmut Bartsch Cytopathologie (C0100) Prof. Dr. med. Peter Bannasch 06221 42-3202, FAX 06221 42-3222 e-mail: [email protected] Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200) Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch 06221 42-3300, FAX 06221 42-3359 e-mail: [email protected] Molekulare Toxikologie (C0300) Prof. Dr. rer. nat. Manfred Wießler 06221 42-3311, FAX 06221 42-3375 e-mail: [email protected] Wechselwirkungen von Carcinogenen mit biologischen Makromolekülen (C0400) Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Heinz W. Thielmann 06221 42-4508, FAX 06221 42-4553 e-mail: [email protected] Klinische Epidemiologie (C0500) Prof. Dr. Anthony B. Miller 06221 42-2219, FAX 06221 42-2203 e-mail:[email protected] Umweltepidemiologie (C0600) Prof. Dr. sc. math. Jürgen Wahrendorf 06221 42-2201, FAX 06221 42-2229 e-mail: [email protected] Genetische Veränderungen in der Karzinogenese (C0700) Dr. Monica Hollstein PhD 06221 42-3302, FAX 06221 42-3342 e-mail: [email protected] Die Bedeutung von Krebs als eine der nicht übertragbaren Krankheiten mit der höchsten Sterblichkeitsziffer bei Männern und Frauen in Deutschland wird in den nächsten zwei Jahrzehnten noch weiter dramatisch anwachsen. Die Krebsfälle, die pro Jahr in Deutschland diagnostiziert werden, sollen nach dieser Schätzung statt 330.000 im Jahr 2000 rund 560.000 im Jahr 2040 betragen. Dies trifft für die Mehrzahl der Krebsfälle, vor allen Dingen den Lungenkrebs zu, da bis auf einige relativ seltene Krebsformen nur wenige Fortschritte in der Behandlung von Krebs erzielt worden sind. Dieses Szenario macht es dringend erforderlich, nicht nur die Behandlung von Krebs sondern vor allen Dingen auch die Prävention und Früherkennung voranzutreiben. Nach realistischen Einschätzungen könnten bis zu 30 % der neuen Krebsfälle in einem Zeitrahmen von 20 bis 30 Jahren verhindert werden. Die Anwendbarkeit der Fortschritte, die sowohl für die Behandlung als auch für die Prävention aus dem Human Genom-Projekt resultieren, wird jedoch erst dann möglich sein, wenn diese durch epidemiologische Studien in der Allgemeinbevölkerung bestätigt sind. Unverzichtbare Voraussetzung für präventive Maßnahmen ist die Kenntnis der Hauptursachen und das Verständnis der Mechanismen der Krebsentstehung. Diese Voraussetzung ist jedoch in vielen Fällen noch nicht erfüllt. Im Forschungsschwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention werden Faktoren untersucht, die in der Kanzerogenese eine Rolle spielen und daher die Grundlage für Krebspräventionsprojekte bilden. Hauptforschungsfelder sind (1) die Aufklärung exogener und endogener Krebsrisikofaktoren sowie Risikoabschätzungen durch epidemiologische, pathologische und toxikologische Methoden, (2) Untersuchungen von erblichen genetischen Veränderungen, die eine Krebsdisposition und ein erhöhtes Risiko durch GenUmweltinteraktionen darstellen, (3) Aufklärung von Kanzerogen-induzierten DNA- und Genschäden, (4) Identifizierung und Analyse von präkanzerösen Veränderungen, (5) Mechanismen der Chemoprävention und krebsprotektiver Faktoren, klinische Studien und schließlich (6) Entwicklung von Tumortherapeutika. Die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen tragen zu einer besseren Kenntnis der Ursachen und Mechanismen der Krebsentstehung bei und erlauben das Fortschreiten und Umsetzen von effektiven Präventions-Maßnahmen. Neue Abteilungen im Schwerpunkt Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention werden diese Aufgaben übernehmen: die Abteilungen Molekulargenetische Epidemiologie, Chemoprävention (beide Abteilungen in Planung) und die Klinische Epidemiologie, die bereits im September 1999 gegründet wurde. Die im Januar 2000 gegründete Abteilung Genetische Veränderungen in der Krebsentstehung untersucht Karzinome, frühe neoplastische Veränderungen und menschliche Tumorzell-Linien auf Veränderungen in der DNA-Sequenz und auf Verände- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 109 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention rungen in der Gen-Expression, die mit der Entwicklung von Krebs zusammenhängen. 110 Die Abteilung Klinische Epidemiologie besteht aus drei Projektgruppen: der Gruppe Genetische Epidemiologie, die die Rolle von genetischen Faktoren in der Entstehung von Brust- und Eierstockkrebs untersucht und zusammen mit Klinikern und Epidemiologen ein Konsortium für die Untersuchung der Krebsdisposition durch die Gene BRCA1 und BRCA2 bildet. Auch die Projektgruppe “Krebsprävention” wird mit einer Reihe von klinisch orientierten Forschern kooperieren; ihr Ziel ist die Entwicklung einer Brustkrebstherapie auf Hormonbasis. Die Projektgruppe “Ernährung” betreut eine prospektive Studie über Ernährung und Krebs (EPIC), an der 25.000 Personen in der Heidelberger Studie teilnehmen; die Studie wird von der IARC in Lyon, Frankreich, koordiniert. Die Studien zu genetischen Risikofaktoren beziehen sich auch auf die Untersuchung von Genumweltinteraktionen. Ätiologische Aspekte einschließlich sozialer, ökonomischer und medizinischer Aspekte sind in allen Projekten mit eingeschlossen. Die Suche nach Risikofaktoren und Krebsursachen wird mit Hilfe der deskriptiven Epidemiologie einschließlich kartographischer Präsentation der Krebssterblichkeit und der Evaluation neuer statistischer Methoden hinsichtlich arbeitsplatz-epidemiologischer Studien durchgeführt. Zur Zeit sind Studien in Planung, die sich mit der Evaluation von Screening-Methoden für verschiedene Krebslokalisationen befassen, und es werden Maßnahmen zur Verbesserung der Krebsbehandlung diskutiert. Zu den Aufgaben der Einheit Umweltepidemiologie gehören die Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Umweltfaktoren, zum Beispiel elektromagnetischer Felder, ionisierender Strahlung und Berufsrisiken auf die Entwicklung verschiedener Krebsarten. Der derzeitige Hauptschwerpunkt wird auf die Untersuchung elektromagnetischer Felder gelegt, die bei dem Gebrauch von Handys (mobile phones) auftreten und deren Bedeutung auf die Entwicklung von Hirntumoren. In diesem Zusammenhang werden groß angelegte Untersuchungen durchgeführt, um das Verhältnis zwischen möglichen Risikofaktoren und personenbezogenen Abhängigkeiten mit der Hilfe klassischer epidemiologischer Instrumente sowie mit Hilfe von Fragebögen zu erfassen. Weiterhin werden ausgedehnte Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen vermuteten Risikofaktoren und somatischen Gegebenheiten mit Biomarkern, Wirtsfaktoren, genetischer Prädisposition und Co-Sterblichkeit durchgeführt. Desgleichen wird der Einfluss anderer Umweltfaktoren z. B. der Ernährung und des Rauchens auf die Krebsentstehung analysiert. Für den bevölkerungsspezifischen Aspekt ist der weitere Ausbau von statistischen Methoden in der Epidemiologie von ganz besonderer Bedeutung. Übersicht Die Forschungsaktivitäten in der Abteilung Toxikologie und Krebsrisikofaktoren umfassen die Aufklärung von umweltbezogenen Risikofaktoren und Studien über Wechselwirkungen von kanzerogenen Stoffen mit erworbenen oder geerbten Wirtsfaktoren (genetische Disposition) beim Menschen. Besonderer Wert wird darauf gelegt, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Grundlage von chronischen Infektionen bzw. entzündlichen Prozessen darstellen, die letztendlich zu Krebs führen oder die Krebsentstehung beschleunigen. Dies sollte die Charakterisierung und die Bewertung von DNA-Veränderungen erlauben, die durch andauernden oxidativen Stress und durch Lipidperoxidation in krebsanfälligen Geweben und Zellen des Menschen entstehen und somit neue Einblicke in die Mechanismen und die Veränderungen zulassen, die am Anfang der Umwandlung einer normalen Zelle in eine maligne Zelle stehen. Ein wichtiges Forschungsfeld ist die Entwicklung von hoch sensitiven Methoden für den Nachweis von DNASchäden und von Biomarkern, die Krebsanfälligkeit anzeigen. Diese Methoden sollen in der Krebsepidemiologie und den klinischen Interventionsstudien Anwendung finden. Große Bedeutung haben auch die Pläne zum Aufbau von Studien in der molekularen Epidemiologie, hier speziell zum Auffinden neuer genetischer Polymorphismen und bei der Suche nach weiteren Genen zur Frühdiagnose einer Krebsdisposition. Weiterhin sollen Risikogruppen in der Bevölkerung für Präventionsund Screening-Untersuchungen über Gen-UmweltWechselwirkungen aufgefunden werden, um das Wissen auf diesem Gebiet zu vertiefen. Eine Projektgruppe hat 1996 mit der Suche nach krebschemopräventiven Stoffen und ihren Wirkmechanismen vor dem Hintergrund einer Anwendung in Präventionsstudien beim Menschen begonnen. Durch selektive Synthesen und Testung von Strukturanalogen sollen neue krebspräventive Stoffe erforscht werden. Die Abteilung Genetische Veränderungen in der Krebsentstehung untersucht Tumoren, frühe neoplastische Veränderungen und menschliche Tumorzell-Linien auf Veränderungen in der DNA-Sequenz und auf Veränderungen in der Genexpression, die zur Entwicklung der Tumoren in Verbindung stehen. Das “Molecular Profiling” von Tumoren liefert Erkenntnisse über biologische Abläufe und Vernetzung, welche das Leben und Sterben der Zelle bestimmen und öffnet so neue Wege für moderne diagnostische chemopräventive und therapeutische Strategien. In diesem Zusammenhang werden genetisch veränderte Mausstämme mit genau definierten molekularen Veränderungen erzeugt (zum Beispiel mit einer inaktivierenden Punktmodation im p53-Tumor Suppressorgen), wie sie für Krebszellen typisch sind und zum malignen Wachstum beitragen. Die Mausmodelle sollen die Entwicklung und die in vivo präklinische Evaluation maßgeschneiderter Arzneimittel beschleunigen, welche ganz spezifisch molekulare Veränderungen in menschlichen Tumoren ansteuern können. Verwandte Mäusestämme, welche menschliche DNA-Sequenzen tragen, sollen ebenfalls verwendet werden, um Hypothesen über den Ursprung spezifischer genetischer Defekte DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Übersicht bewerten zu können, welche menschlichen Krankheiten zu Grunde liegen, einschließlich endogener und exogener Krebsrisikofaktoren und Mechanismen, die für die Schäden in der DNA-Sequenz verantwortlich sind. Die Forschungsziele der Abteilung Molekulare Toxikologie konzentrieren sich auf toxikologiesche Fragestellungen und auf die Entwicklung neuer Tumortherapeutika. In der Toxikologie liegt das Schwergewicht auf der Analyse und der Strukturaufklärung von DNA-Addukten, die verwendet werden können, um die Belastung durch Umweltgifte zu erfassen (Biomonitoring). Die derzeit empfindlichste Methode zu diesem Zweck ist die 32PPostlabeling-Analyse, die jedoch den Nachteil hat, dass mit hohen Mengen an Radioaktivität gearbeitet werden muss. Mit einem von uns entwickelten Verfahren können DNA-Addukte jedoch auch mit einem Fluoreszenzmarker versehen und durch Kapillarelektrophorese bestimmt werden. So konnten sogenannte endogene DNA Addukte nachgewiesen werden. In der Abteilung werden neue Arzneimittel entwickelt, welche auf dem Konzept der Kopplung von Tumortherapeutika an Saccharide basieren, um den Transport zum Tumor und die Aufnahme in die Tumorzellen zu erleichtern. Andere neue Strukturen, zum Beispiel Hemmstoffe von DNA-Reparaturenzymen, zeigen ebenfalls vielversprechende Ergebnisse nach Kopplung an Monosaccharide. Die spezifische Aufnahme solcher Glykokonjugate durch Transportsysteme führt zu einer Anreicherung der Substanzen im Zielorgan und reduziert unerwünschte Nebenwirkungen. Komplexe Oligosaccharide sind Liganden für Lektine – wir versuchen, solche tumorassoziierten Lektine mit synthetischen Oligosanchariden anzusprechen und zu isolieren, um sie letztendlich als Transportwerkzeug für Therapeutika zu nutzen. Eine weitere Möglichkeit, Arzneimittel zielgenau an Tumoren zu bringen, ist ihre kovalente Kopplung an humanes Serumalbumin. Tumorzellen nehmen Albuminkonjugate über Endozytose auf, im Lysosom, dem Magen der Zelle, wird das gekoppelte Therapeutikum freigesetzt und tötet die Zelle. Die Leiter der Abteilungen Cytopathologie (Prof. Peter Bannasch) und Wechselwirkungen von Carcinogenen mit biologischen Makromolekülen (Prof. Heinz W. Thielmann) sind in Ruhestand gegangen. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 111 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Abteilung: Toxikologie und Krebsrisikofaktoren (C0200) Leiter: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Bartsch Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Matthias Bartelmann Dr. Walter Beerheide (- 04/ 01) Dr. Barbara Bertram Dr. Heike Dally Dr. Norbert Frank Dr. Clarissa Gerhäuser Dr. Reinhold Klein Dr. Claudia Mayer Dr. Jagadeesan Nair Dr. Urmila Nair Prof. Dr. Hans Osswald Dr. Robert W. Owen Dr. Odilia Popanda Dr. Angela Risch Dr. Margarita Rojas Dr. Hans-Rudolf Scherf Dr. Peter Schmezer Dr. Bertold Spiegelhalder Dr. Gisela Werle-Schneider Gastwissenschaftler Dr. Roger Godschalk Dr. Xin Sun Somkid Sitthimonchai (09/01 - ) 112 Doktoranden Elisabeth Bertl (09/01 -) Reinhard Ebbeler Kai Gassner Chi Tai Phong (10/01 -) ) Inge Schönffeldt Patrick Schweizer Isabel Streck Changping Xie Diplomanden Jörg Hümmerich Andreas Vogt (03-10/01) BeateBreitschopf Amira Gamal Eldeen (- 02/02) Elke Heiß (- 08/01) Torsten Schattenberg (10/01- Assistenz/technisches Personal Ursula Bollow Christel Ditrich Reinhard Gliniorz Roswitha Haubner Michael Huber (- 09/01) Birgit Jäger Claudia Kalla ( - 09/01) Karin Klimo Jutta Knauft Regina Merkel (- 02/02) Ulrike von Seydlitz-Kurzbach Peter Waas Andreas Wölfelschneider Gerd Würtele Otto Zelezny Sekretariat Susanna Fuladdjusch Auszubildende Karin Schüßler (- 02/02) Kai Doberstein Die Hauptziele der Abteilung sind: (a) Identifizierung von exogenen und endogenen Krebsrisikofaktoren und Aufklärung ihrer Wirkmechanismen, (b) Charakterisierung krebsvorbeugender Stoffe und Nachweis ihrer Effizienz in vorklinischen und klinischen Studien, (c) Entwicklung und Validierung neuer Methoden und Biomarker für molekularepidemiologische Studien zur Krebsätiologie und -prävention auf der Basis der gewonnenen mechanistischen Erkenntnisse, (d) Initiierung und Beteiligung an solchen Studien durch Beiträge zur Methodik und Planung. Damit sollen die Voraussetzungen für eine effiziente Prävention von Krebserkrankungen durch Eliminierung der Risikofaktoren oder Unterbrechung der Krankheitsentwicklung (Chemoprävention) geschaffen werden. Viele der Forschungsaktivitäten in der Abteilung fallen unter „Biomarkerentwicklung und deren Anwendung in Humanstudien (Abb. 1). Viele dieser Untersuchungen befinden sich erst in der Anfangsphase neben einigen bereits laufenden, groß angelegten molekularepidemiologischen Studien [4]. Epidemiologische Beobachtungen zu Risiko- und protektiven Faktoren bei Krebserkrankungen ⇓ Mechanistische Studien in experimentellen Systemen zur Bestimmung von Biomarkern/intermediären Endpunkten ans Teil der Kausalkette ⇓ Entwicklung von (nichtinvasiven) Methoden zur Bestimmung von Expositions-/ Risikomarkern ⇓ Validierung in tierexperimentellen/humanen Pilotstudien ⇓ Untersuchung von Markern in groß angelegten epidemiologischen Studien ⇓ Feedback: Ätiologie, Prävention, Diagnose, Prognose Abb. 1 Entwicklung und Validierung von Biomarkern in der Humankarzinogenese zur Anwendung in molekularepidemiologischen oder klinischen Studien [2] Die Hauptziele auf dem Gebiet der Biomarkerentwicklung und -anwendung beim Menschen bestehen darin, (a) neue Quellen der Karzinogenexposition zu identifizieren [7], insbesondere solche, die durch endogene (entzündliche) Prozesse entstehen [10,18], (b) die Exposition der Bevölkerung mit Hilfe von Markern der Schadstoffexposition und genetischen Disposition abzuschätzen, um damit Hochrisikogruppen zu identifizieren [9,14-17,19] und schließlich (c) die Wirksamkeit präventiver Maßnahmen z.B. durch Intervention mit chemopräventiven Substanzen zu verifizieren [1,4,20]. Mitte 1996 wurden die Aktivitäten zur sekundären Krebsprävention in der Abteilung intensiviert. Da chemopräventive Substanzen strukturell heterogen sind und unterschiedliche Wirkmechanismen aufweisen, werden neue vielversprechende Naturstoffe und synthetische Analoga identifiziert und bewertet [5,6,11-13]. Letztendlich soll der Nachweis ihrer präventiven Wirksamkeit beim Menschen, zuerst z.B. bei Patienten mit Dysplasien und später in der Allgemeinbevölkerung erbracht werden. Eine klinische Interventionsstudie [20] mit Sulindac (ein nicht steroidales Antiphlogistikum) und Biomarkeruntersuchungen [18] bei Patienten mit familiärer adenomatöser Polyposis (FAP) erbrachte den Beweis einer krebspräventiven Aktivität bisher nur bei DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention kolektomierten FAP-Patienten. Des weiteren wurde eine partielle Rückbildung oraler Dysplasien durch Gabe einer Antioxidantienkombination an Patienten mit Leukoplakien bzw. nach chirurgischer Entfernung des Primärkarzinoms in der Mundhöhle erreicht [1]. Eine europäische Interventionsstudie mit Kalzium-Ballaststoffgabe bei Patienten mit sporadischen kolorektalen Adenomen und Placebokontrollen wurde zu Ende geführt [4]. Fernziele sind die Charakterisierung und Erprobung neuer, wirksamer chemopräventiver Substanzen mit geringer Langzeittoxizität und verstärkte interdisziplinäre Forschungsaktivitäten: 1. Durchführung klinischer Versuche an zugänglichen Dysplasien mit wiederholter, direkter Kontrolle nach Behandlung mit bekannten und neuen antidysplastischen Arzneimitteln, 2. Entwicklung und Validierung krebsprädiktiver Biomarker für schwer zugängliche Dysplasien, 3. Entwicklung neuer antidysplastischer Substanzen von hoher präventiver Wirksamkeit bei einer Vielzahl unterschiedlicher Dysplasien. Die Etablierung von zwei neuen Abteilungen für ‘Molekulargenetische Epidemiologie’ (2002) und ‘Klinische Epidemiologie’ (seit 1999) sollte die Aktivitäten dieses Forschungsschwerpunkts verstärken. Zur Intensivierung der Zusammenarbeit zwischen Grundlagenforschern, Klinikern und Epidemiologen auf dem Gebiet der Krebsursachen- und Krebspräventionsforschung wurden 1999-2000 folgende multidisziplinären Veranstaltungen abgehalten: • Third Taiwanese-German Workshop on Cancer Causes and Prevention: Mechanisms, Preclinical and Clinical Studies, Heidelberg, Juli 2000. • International Workshop on Biomarkers in Cancer Chemoprevention, Heidelberg, Februar 2000 (organisiert zusammen mit A.B. Miller, DKFZ und der IARC, Lyon, Frankreich [8]. • Training Course in Environmental Toxicology, Hanoi, November 2001. Sponsoren: UN Environmental Program, Chulabhorn Research Institute, Bangkok, Thailand. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] *Barth, T.J., *Zöller, J., *Kuebler, A., *Born, I.A., Osswald, H.: Redifferentiation of oral dysplastic mucosa by the application of the antioxidants beta-carotene, alpha-tocopherol and vitamin C. International Journal for Vitamin and Nutrition Research 67 (1997) 368-376. [2] Bartsch, H.: Studies on biomarkers in cancer etiology and prevention: a summary and challenge of interdisciplinary research. Mutation Research 462 (2000) 255-279. [3] Bartsch, H., Nair, J.: New DNA-based biomarkers for oxidative stress and cancer chemoprevention studies. European Journal of Cancer 36 (2000) 1229-1234. [4] *Bonithon-Kopp, C., Kronborg, O., *Giacosa, A., Räth, U., *Faivre, J. [Experts: *Milan, C., *Fenger, C., *Piard, F., *Belghiti C., Owen, R. W., *Pignatelli, M.].: Calcium and fibre supplementation in the prevention of colorectal adenoma recurrence: a placebocontrolled intervention trial from the European Cancer Prevention Organisation (ECP). Lancet 356 (2000) 1300-1306. [5] Gerhäuser, C., Alt, A., Klimo, K., Heiss, E., Neumann, I., GamalEldeen, A., Knauft, J., Scherf, H., Frank, N., Bartsch, H., Becker, H.: Xanthohumol from hop (Humulus lupus) as a novel potential cancer chemopreventive agent. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 42 (2001) 18. Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren [6] *Ha, T., Gerhäuser, C., *Zhang, W., *Ho-Chong-Line, N., *Fourasté, I.: New Lanostanoids from Ganoderma lucidum (Polyporaceae) that induce NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cultured Hepa1c1c7 murine hepatoma cells. Planta Medica 66 (2000) 681-684. [7] Klein, R.G., Schmezer, P., Amelung, F., *Schroeder, H.-G., *Woeste, W., *Wolf, J.: Carcinogenicity assays of wood dust and wood additives in rats exposed by long-term inhalation. International Archives of Occupational and Environmental Health 74 (2001) 109-118. [8] Miller, A.B., Bartsch, H., *Bofetta, P., *Dragsted, L.O., *Vainio, H.: Biomarker in Cancer Chemoprevention. IARC Sci. Publ. No. 154 (2001) IARC, Lyon, Frankreich pp 1-294. [9] Nair, U., Bartsch, H.: Metabolic polymorphisms as susceptibility markers for lung and oral cavity cancer. In: Biomarkers in Cancer Chemoprevention. Miller, A.B. et al. (eds.), IARC Scientific Publications N° 154 (IARC, Lyon, Frankreich) (2001) 271-290. [10] Nair, J., *Barbin, A., *Velic, I., Bartsch, H.: Etheno DNA-base adducts from endogenous reactive species. Mutation Research 424 (1999) 59-69. [11] Owen, R.W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. European Journal of Cancer 36 (2000) 1235-1247. [12] Owen, R.W., *Mier, W., Hull, W.E., *Giacosa, A., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: (2000). Identification of lignans as major components in the phenolic fraction of olive oil. Clinical Chemistry 46, 976-988. [13] Owen, R.W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Würtele, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncology 1 (2000) 107-112: [14] *Rajaee-Behbahani, N., Schmezer, P., Risch, A., Rittgen, W., *Kayser, K.W., *Dienemann, H., *Schulz, V., *Drings, P., *Thiel, S., Bartsch, H.: Altered DNA repair capacity and bleomycin sensitivity as risk markers for non-small cell lung cancer. International Journal of Cancer 95 (2001) 86-91. [15] Rojas, M., *Cascorbi, I., *Alexandrov, K., *Kriek, E., *Auburtin, G., *Mayer, L., Kopp-Schneider, A., *Roots, I., Bartsch, H.: Modulation of benzo[a]pyrene diolepoxide-DNA adduct levels in human white blood cells by CYP1A1, GSTM1 and GSTT1 polymorphism. Carcinogenesis 21 (2000) 35-41. [16] Schmezer, P., *Rajaee-Behbahani, N., Risch, A., *Thiel, S., Rittgen, W., *Drings, P., *Dienemann, H., *Kayser, K.W., *Schulz, V., Bartsch, H.: Rapid screening assay for mutagen sensitivity and DNA repair capacity in human peripheral blood lymphocytes. Mutagenesis 16 (2001) 25-30. [17] Schmezer, P., *Rupprecht, T., *Tisch, M., *Maier, H., Bartsch, H.: Laryngeal mucosa of head and neck cancer patients shows increased DNA damage as detected by single cell microgel electrophoresis. Toxicology 144 (2000) 149-154. [18] Schmid, K., Nair, J., *Winde, G., *Velic, I., Bartsch, H.: Increased levels of promutagenic etheno-DNA adducts in colonic polyps of FAP patients. International Journal of Cancer 87 (2000) 1-4. [19] Wikman, H., Risch, A., Klimek, F., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., *Dienemann, H., *Kayser, K., *Schulz, V., *Drings, P., Bartsch, H.: hOGG1 polymorphism and loss of heterozygosity (LOH): significance for lung cancer susceptibility in a caucasian population. International Journal of Cancer 88 (2000) 932-937. [20] *Winde, G., *Schmid, K.W., *Brandt, B., *Mueller, O., Osswald, H.: Clinical and genomic influence of sulindac on rectal mucosa in familial adenomatous polyposis. Diseases of the Colon and Rectum 40 (1997) 1156-1168. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 113 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Transkriptionsanalyse und ihre Anwendung in der prädiktiven Toxikologie (C0201) G. Werle-Schneider, K. Schüßler, K. Doberstein, A. Wölfelschneider, M. Bartelmann In Zusammenarbeit mit M.C.v. Brevern, J. Scheel, C. Behrens, T. Storck und A. Bach, Axaron Bioscience AG, Heidelberg; J. Hengstler, M.Ringel, Institut für Toxikologie, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz; D. Müller, R. Glöckner, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Friedrich-Schiller-Universität, Jena Drittmittel: Bioregio Projekt BMBF 114 Tumorpromotoren oder nicht-genotoxische Karzinogene verursachen keine DNA-Schäden, verändern aber bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Karzinogenese die Genexpression. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, neue Testsysteme zu entwickeln, die eine schnelle Evaluierung des karzinogenen Potentials von Tumorpromotoren erlauben. Basierend auf der Hypothese, daß nicht-genotoxische Karzinogene anhand ihrer spezifischen Genexpressionsprofile klassifiziert werden können, wurden verschiedene Tumorpromotoren aus 3 unterschiedlichen toxikologisch relevanten Klassen mit Hilfe der cDNA microarray Technologie untersucht. Dabei wurden neben den Enzyminduktoren Phenobarbital, αHexachlorozyklohexan und Cyproteronacetat, die Peroxisomenproliferatoren WY14643 und Ciprofibrat oder Nafenopin, das Hormon Ethinylestradiol sowie Dehydroepiandrosteron, das neben hormonaler vor allem eine peroxisomenproliferierende Wirkung besitzt, verwendet. Durch die Erstellung der für jede Substanz spezifischen Transkriptionsprofile, können sogenannte Markergene identifiziert werden, die für die Wirkung von Tumorpromotoren charakteristisch sind und als prädiktiv eingeschätzt werden können. Untersuchungen in einem in vivo Modell (Rattenleber) und ein hierarchisches Clustering der resultierenden Transkriptionsprofile für ausgewählte Markergene zeigten, daß Substanzen entsprechend ihrer Wirkmechanismen klassifiziert werden können. Für ein high-throughput screening sogenannter Lead-Substanzen in der Frühphase der Wirkstoffentwicklung (z.B. in Pharma und Pflanzenschutz) ist jedoch die Entwicklung eines geeigneten in vitro Testsystems erforderlich. Entwicklung eines in vitro Testsystems zur Analyse von Genexpressionsmustern, die für die Wirkung nichtgenotoxischer Karzinogene charakteristisch sind Zur Entwicklung eines in vitro Testsystems zur Erkennung von karzinogenen Substanzen wurden verschiedene von der Rattenleber abgeleitete Testsysteme untersucht: Eine aus der Rattenleber etablierte Zellinie (C2I [Mayer und Schäfer, Exp Cell Res 138 (1982)1-14]), Leberschnitte und primäre kultivierte Hepatozyten. Als Modellsubstanz wurde zunächst das Barbiturat Phenobarbital eingesetzt. Phenobarbital verändert die Expression einer Vielzahl von Enzymen, die unter anderem bei der Metabolisierung von Fremdstoffen eine Rolle spielen. (I) Zellinien Etablierte Zellinien wären aufgrund ihrer einfachen Handhabung für Routinetests besonders geeignet. Aufgrund Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren der Dedifferenzierung von Zelllinien fehlten jedoch die für Phenobarbital spezifischen Veränderungen der Genexpression. Testsysteme mit etablierten Zellinien erwiesen sich daher als ungeeignet. (II) Primäre kultivierte Hepatozyten In primären kultivierten Hepatozyten können durch bestimmte Kultivierungsbedingungen, z.B. durch die Verwendung von Matrigel (extrazelluläre Matrix) oder des Hormons Dexamethason, für Phenobarbital spezifische Veränderungen der Genexpression ähnlich in vivo erhalten werden [Henstler et al. Drug Metab Rev 32 (2000) 81118]. Es wurden zunächst verschiedene Kulturivierungssysteme und -medien für primäre Hepatozyten der Ratte untersucht: (a) 2-dimensionale Kulturen als Monokultur mit einer Beschichtung der Zellkulturschalen mit Kollagen, Matrigel oder einem Kollagengelsandwitch; als Kokultur mit Rattenleberepithelzellen, sowie eine 3dimensionale Kultur unter Verwendung von CalciumAlginat-Beads; (b) Medien mit fötalem Kälberserum (FCS), mit und ohne Dexamethason als auch chemisch definierte Medien ohne FCS. Die Transkriptionsanalyse der mit Phenobarbital behandelten primären Hepatozyten zeigten im Vergleich zu den in vivo erhaltenen Transkriptionsprofilen je nach Kultivierungsbedingungen unterschiedliche Übereinstimmung. (1) Eine Kultivierung der primären Hepatozyten in Monound Kokultur auf Kollagen- oder Kollagengel-beschichteten Zellkulturschalen führte zu einer Übereinstimmung von 57 bis 70 %, während mit einer Kultivierung auf Matrigel nur eine Übereinstimmung von 40 % erzielt wurde. (2) Dexamethason allein verändert die Expression von knapp 20 % der untersuchten Gene. Ein Vergleich der Transkriptionsprofile mit und ohne Dexamethason mit den in vivo erhaltenen Profilen zeigt jedoch, daß mit Dexamethason etwa 55 % Übereinstimmung erzielt wird, während ohne Dexamethason nur 20 % der untersuchten Gene übereinstimmen. (3) Eine Induktion von für Phenobarbital spezifischen Markergenen wie den Cytochromen P450, UDP-Glucuronosyltransferasen und Glutathionstransferasen konnte in den verschiedenen in vitro Testsystemen beobachtet werden. Die stärkste Induktion wurde für Cytochrom P450 2B1 erhalten, das auch in vivo in der Rattenleber induziert wird. Abhängig vom jeweiligen Testsystem können unterschiedliche Mitglieder einer Enzymfamilie in ihrer Expression verändert sein. Während Cyp 3A1 in der Rattenleber, in primären Hepatozyten und Leberschnitten ähnlich stark induziert wurde, war eine erhöhte Expression von CYP3A2 nur in vivo zu beobachten. (4) Unabhängige Untersuchungen mit unterschiedlichen Tieren zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit der mit cDNA microarrays erhaltenen Ergebnisse (98 % bzw. 95 % bei mehr als 3 bzw. 2 fachen Veränderungen der Genexpression). (5) Mit Rattenleberepithelzellen wurden keine für Phenobarbital spezifischen Veränderungen der Genexpression beobachtet. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Zur Zeit werden mit einem chemisch definierten Medium und primären Hepatozyten in Monokultur auf Kollagen Untersuchungen mit weiteren Tumorpromotoren aus verschiedenen Klassen durchgeführt. (III) Leberschnitte Als drittes in vitro Testsystem, das in toxikologischen Untersuchungen zunehmend Anwendung findet, wurden Leberschnitte eingesetzt [Kuhn et al. Exp Toxicol Pathol 50 (1998) 4961-496]. Im Unterschied zu primären Hepatozyten bleibt bei Leberschnitten der Gewebeverband erhalten. Nach Behandlung mit Phenobarbital wurde eine ausgeprägte Übereinstimmung (70 %) zwischen den in vitro und den in vivo in der Rattenleber induzierten Transkriptionsprofilen beobachtet. Kryokonservierte Leberschnitte zeigten hingegen nur eine geringe Übereinstimmung (14 %). Clusteranalysen der Transkriptionsprofile ausgewählter Markergene für die Substanzen Phenobarbital, αHexachlorozyklohexan, Ethinylestradiol und Dehydroepiandrosteron zeigen, daß ähnlich den in vivo Studien auch in vitro eine Klassifizierung entsprechend den Wirkmechanismen möglich zu sein scheint. So rufen die Enzyminduktoren Phenobarbital und α-Hexachlorozyklohexan ähnliche Transkriptionsänderungen hervor. Auch weisen die durch Dehydroepiandrosteron erhaltenen Transkriptionsprofile Ähnlichkeiten zu den in vivo untersuchten Peroxisomenproliferatoren auf. Dies deutet darauf hin, daß mit Hilfe eines in vitro Testsystems und der Erstellung von Transkriptionsmustern ein prädiktives Testsytem erhalten werden könnte, mit dem auch bisher unbekannte Substanzen durch eine Analyse auf Zugehörigkeit zu einer dieser Wirkgruppen getestet werden könnten. Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren 1. Identifizierung und Entwicklung neuer chemopräventiver Verbindungen: Programmüberblick Die Krebsentstehung, die grob in eine Initiations-, Promotions-, und Progressionsphase unterteilt wird, kann als kontinuierliche Anhäufung von genetischen oder biochemischen Zellschäden angesehen werden. Wie in Abb. 1 angedeutet bietet diese meist über viele Jahre andauernde Entwicklung eine Vielzahl von Ansatzmöglichkeiten für die Krebs-Chemoprävention, d.h. der Einsatz von chemischen Verbindungen, Naturstoffen oder Nahrungsbestandteilen mit dem Ziel, die Carcinogenese zur verlangsamen, zu hemmen oder rückgängig zu machen. Zur Identifizierung und Beurteilung neuer krebs-chemopräventiver Naturstoffe und synthetischer Verbindungen wurden anhand der oben beschriebenen Mechanismen verschiedene Testmodelle als Markersysteme für chemopräventive Aktivität im Labor etabliert. Diese Modelle, die meist im 96-Lochplatten-Format mit Enzympräparationen oder in Zellkultur mit photometrischer, fluorimetrischer oder radioaktiver Endpunktbestimmung durchgeführt werden, ermöglichen die Untersuchung einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit (1-3 Tage), ohne daß wie im Die mit den bekannten Tumorpromotoren erstellten Transkriptionsmuster werden in eine Datenbank eingegeben. In dem am besten geeigneten in vitro Testsystem werden weitere neue Testsubstanzen untersucht. Über die charakteristischen Veränderungen des erstellten Transkriptionsmusters zu bereits vorhandenen Transkriptionsprofilen soll eine Risikoabschätzung der neuen Testsubstanzen erfolgen. Publikation (* = externe Koautoren) [1] Werle-Schneider, G., Kalla, C., Hollstein, M., Bollow, U., *Behrens, C.K., *v. Brevern, M.C., *Storck, T., *Müller, D., *Steinmetzer, P., *Bach, A., Beerheide, W.: Comparison of gene expression in rat liver slices and primary hepatocytes after treatment with phenobarbital. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 127 (2001) 30. Chemoprävention (C0202) C. Gerhäuser, N. Frank, H.-R. Scherf, E. Heiss, A. Gamal Eldeen, C. Xie, E. Bertl, S. Sittimonchai, R. Merkel, K. Klimo, J. Knauft, A. Vogt Drittmittel: Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauwirtschaft e.V. 1.11.1999 - 21.12.2001 DM 280.500,- Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken); 1.1.02 - 1.4.03 Euro 129.011,- Dr. C. Gerhäuser/Prof. H. Becker (Uni Saarbrücken) Abb. 1: Schematische Gegenüberstellung der stufenweisen Krebsentstehung (links) und möglicher chemopräventiver Mechanismen (rechts) High-Throughput-Screening die Kontrolle über substanzspezifische Charakteristika (z.B. Löslichkeit, toxische Effekte) verlorengeht. Vorteile sind ein geringer Substanzbedarf, einfache Durchführung, vergleichbar geringe Kosten, und die Generation von Daten in computerisierter Form, die eine schnelle, halbautomatische Auswertung der Ergebnisse ermöglichen. In den Schwerpunktbereichen Metabolismus, Antioxidanzien, Hemmung der Tumor-Promotion, der Zellproliferation und von Entzündungsprozessen wurden folgende Systeme etabliert: 1.1 Modulation des Fremdstoffmetabolismus DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 115 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 116 a) Fluorimetrischer Nachweis einer Hemmung von Cyp1A (Phase 1 Enzym) in β-Naphthoflavon induzierten Rattenhepatomzellen (H4IIE) b) Induktion von NAD(P)H: Chinone Oxidoreduktase in Maushepatomzellen (Hepa1c1c7) (Phase 2 Enzym) c) Fluorimetrische Messung von Glutathion und intrazellulären Thiolen nach Derivatisierung und HPLC-Trennung 1.2 Nachweis von Radikalfängern und Antioxidanzien a) Reaktion mit stabilen Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) Radikalen b) Reaktion mit Superoxid Anion Radikalen im Phenazinmethosulfat (PMS)-Nitroblue Tetrazolium (NBT) System (nicht-enzymatisch) oder im Xanthin/ Xanthinoxidase System (XO/NBT) (enzymatisch) c) Hemmung der Superoxid Anion Radikal-Freisetzung in differenzierten HL-60 Zellen 1.3 Entzündungshemmung a) Cyclooxygenase (Cox)-1 und -2 Hemmung b) Hemmung der Induktion der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) in Raw 264.7 Makrophagen 1.4 Tumorpromotionshemmung a) Hemmung der Phorbolester-vermittelten Induktion der Ornithindecarboxylase in 308 Maus Keratinozyten 1.5 Proliferationshemmung a) Induktion der terminalen Zelldifferenzierung in humanen und murinen Leukemiezellen (HL-60, MEL) b) Nachweis östrogener bzw. antiöstrogene Effekte in der Ishikawa humanen Endometriumkrebs Zellinie. Die Behandlung der Zellen mit E2 oder anderen Östrogenen führt zu einer verstärkten Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) als Markerenzym, während die gleichzeitige Behandlung mit einer Testsubstanz und E2 die Untersuchung einer anti-östrogenen Wirkung erlaubt. 1.6 Mouse Mammary Gland Organ Culture (MMOC) Ein Nachteil von Kurzzeit in vitro Testsysteme zur Identifizierung von chemopräventiven Stoffen ist die Gefahr, falsch positive Leitsubstanzen zu identifizieren, d.h. Substanzen, die zwar in vitro aktiv sind, in vivo jedoch keine chemopräventive Aktivität zeigen. Deshalb wurde ein Organkultur Modell mit Brustdrüsen der Maus etabliert, welches die Vorteile eines in vitro Tests (einfache Durchführung, geringer Substanzbedarf, kurze Dauer) mit denen eines in vivo Versuchs (komplexe zelluläre und metabolische Prozesse in einem intakten Organ) vereinigt. Dabei werden Brustdrüsen von Mäusen für 24 Tage in Kultur gehalten. In einer ersten Proliferationsphase (10 Tage) werden die Drüsen mit mammotrophen Hormonen stimuliert, bei Entzug der Hormone folgt eine Regressionsphase (14 Tage). Am Tag drei wird mit 7,12Dimethylbenz(a)anthracen die Entstehung prä-neoplastischer knötchenartiger Läsionen induziert. Nach Behandlung mit Testsubstanzen während der Proliferationsphase (Tag 0-10) kann am Ausbleiben der Läsionen nach Beendigung des Experiments eine chemopräventive Wirkung abgelesen werden. Das Modell eignet sich in Kombination mit immunhistochemischen Nachweis in der Expression von Markerproteinen Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren auch zur Aufklärung von Wirkmechanismen aktiver Verbindungen. Insgesamt wurden seit 1996 über 2000 Naturstoffe, synthetische Analoge, Extrakte von Nahrungsbestandteilen, Heilpflanzen, Algen, Schwämmen, Pilzen, Moosen und Subfraktionen der Extrakte von nationalen und internationalen Kooperationspartner zur Verfügung gestellt und in den oben beschriebenen Testsystemen untersucht. Die Testergebnisse werden in einer umfangreichen Datenbank verwaltet und dienen der Auswahl von Leitstrukturen für den weiteren Nachweis chemopräventiver Wirksamkeit im Tiermodell und für mechanistische Untersuchungen. 2. Beschreibung ausgewählter Projekte 2.1. Identifizierung neuer Leitstrukturen 2.1.1. Antioxidatives Potential von Bier-Polyphenolen in Zusammenarbeit mit A. Alt und H. Becker, Universität des Saarlandes, Saarbrücken Bier ist eines der weltweit am meisten konsumierten Getränke. Es ist reich an Nährstoffen und Nahrungszusatzstoffen wie Vitamine und Polyphenole, die wegen ihrer antioxidativen Aktivität mit gesundheitsfördernden Aspekten in Zusammenhang gebracht werden. 1996 wurde erstmalig eine anti-mutagene Aktivität von Bier beschrieben. Später konnte dies auf eine Hemmung der Entstehung von Carcinogen-Addukten mit der DNA zurückgeführt werden. Im vorliegenden Projekt (gefördert von der Wissenschaftsförderung der Deutschen Brauwirtschaft e.V.) wurden Inhaltsstoffe aus Bier sowie von Polyphenol-Rückständen, die bei der Bier-Stabilisierung anfallen, auf Radikalfänger- und antioxidative Aktivität in den unter 1.2. beschriebenen Testsystemen und im ORAC (Oxygen Radikal Absorbance Capacity) Test getestet. Wir untersuchten ca. 40 verschiedene Polyphenole aus fünf strukturellen Klassen: Benzoe- und Zimtsäure-Derivate, Acetophenone (nur im Rückstand), Catechine und Flavonoide. Benzoesäure Derivate Zimtsäure Derivate Acetophenone H Flavonoide (R = H, OH, OCH3) Catechine (R1= H, OH; R2=H, Gallussäure) Catechine und Flavonoide zeigten die beste Radikalfängerwirkung gegenüber DPPH-Radikalen. Darüber hinaus waren alle Zimtsäurederivate mit einer 4-OH- und einer zusätzlichen 3-OH- oder 3-OCH3-Substitution potente DPPH Radikalfänder. Protocatechu-, Gallus- und Syringasäure waren aktive Benzoesäurederivate. Basierend auf DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention diesen ersten Ergebnissen wurden die Verbindungen unter Verwendung physiologisch relevanter ROS weiter untersucht. Nur Flavonoide und Catechine waren in der Lage, chemisch generierte Superoxide Anion Radikale in einem Konzentrationsbereich unter 100µM zu inaktivieren. Die Aktivität im zellulären System war für alle Substanzen generell niedriger. Antioxidative Kapazität gegenüber Hydroxyl- und PeroxylRadikalen wurde im ORAC Test analysiert. In diesem Modell werden Radikalfängereigenschaften gegenüber Hydroxyl- und Peroxyl-Radikalen und Übergangsmetallen über den radikalvermittelten Fluorezensabfall von β-Phycoerythrin in Relation zu dem Standardantioxidanz Trolox (wasserlösliches Vit. E Analog) berechnet. Dieser Test wurde zur Erhöhung des Probenumsatzes für die Verwendung von 96-Lochplatten modifiziert. Die Abnahme der Fluoreszenz wird über eine Zeit von ca. 100 min bis zum vollständigen Abfall mit Hilfe eines MikrotiterplattenFluorimeters kontinuierlich aufgezeichnet; zur Erhöhung der Aussagekraft werden Proben in 5 Konzentrationen analysiert und die Fläche unter der Dosis-Wirkungskurve als Maß für die Radikalfängerkapazität berechnet. Interessanterweise zeigten fast alle Verbindungen im ORAC Test eine hohe Reaktivität gegenüber Hydroxyl-Radikalen, während die Kapazität, Peroxylradikale abzufangen, durchschnittlich niedriger ausfiel [2] . Diese Ergebnisse könnten einerseits in der Krebs-Chemoprävention Anwendung finden, andererseits könnten sie als Grundlage zur Entwicklung eines polyphenolreicheren Bieres dienen. 2.1.2. Krebs-chemopräventiven Wirkung von Xanthohumol, ein prenyliertes Chalcon aus Hopfen (Humulus lupulus L.) In Zusammenarbeit mit A. Alt und H. Becker, Universität des Saarlandes, Saarbrücken. Hopfen ist eine reiche Quelle an phenolischen Verbindungen im Bier. Der Anteil an Polyphenolen im Hopfenharz, bestehend aus Phenolcarbonsäuren, prenylierten Chalconen und Flavonoiden, Catechinen und Proanthocyanidinen, liegt bei 4-14%. In früheren Untersuchungen konnte bereits gezeigt werden, daß prenylierte Flavonoide aus Hopfen den Fremdstoffmetabolismus in vitro beeinflussen. Sie hemmen verschiedene Cytochrom P450 Enzyme und induzieren die NAD(P)H:Quinon Reductase (QR) in Maus Hepatomzellen, was auf eine chemopräventive Aktivität hindeutet. Daneben wurden antioxidative, anti-proliferative und cytotoxische Effekte beschrieben. Hopfen wurde immer wieder mit einer phytoöstrogenen Wirkung in Verbindung gebracht; in dieser Hinsicht konnte 8-Prenylnaringenin als aktives Prinzip identifiziert werden. Basierend auf diesen Informationen wurde im Rahmen eines von der Wissenschaftsförderung der Dt. Brauwirtschaft e.V. unterstützten Projektes ein Hopfenextrakt in den oben beschriebenen Testsystemen analysiert. Eine Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren anschließende Aktivitäts-geleitete Fraktionierung führte zur Identifizierung von Xanthohumol, ein prenyliertes Chalcon, und einer Reihe von strukturverwandten Verbindungen. Xanthohumol Wir konnten zeigen, daß Xanthohumol in der Initiations-, Promotions-, und Progressionsphase in die Krebsentstehung eingreifen kann. Zunächst wurde Xanthohumol als Radikalfänger untersucht und konnte Hydroxyl-, Peroxyl- und Superoxidanion-Radikale besser als Trolox inaktivieren. Eine Hemmung der Tumor-Initiation durch Modulation der Aktivität von Enzymen des Phase 1 und 2 Fremdstoffmetabolismus konnte bestätigt werden. Erstmalig konnte eine entzündungshemmende Wirkung von Xanthohumol nachgewiesen werden. Xanthohumol hemmte die Aktivität der konstitutiv exprimierten Cox 1, aber auch der induzierbaren Cox 2, und verhinderte in LPS-stimulierten Raw Makrophagen die Induktion der iNOS und Produktion von NO. Zellwachstumshemmende Wirkung konnte anti-östrogenen Eigenschaften, der Hemmung der DNA Polymerase α und einer Induktion von Apoptose und Zelldifferenzierung zugeschrieben werden. Als ersten Nachweis einer chemopräventive Wirksamkeit wurde Xanthohumol im MMOC Modell untersucht und verhinderte das Auftreten DMBA-induzierte Läsionen im nanomolaren Bereich [3, 12]. Weiterführende Untersuchungen des Metabolismus, der Bioverfügbakeit und einer Aktivität im Tiermodell sind bereits angelaufen. Diese Ergebnisse könnten einen neuen Markt für Xanthohumol oder Hopfenprodukte öffnen, wenn die Wirksamkeit auch am Menschen nachgewiesen sein wird. 2.1.3. Induktion von Zelldifferenzierung durch Sesquiterpenlactone in Kooperation mit C.A. Klaas1, I. Merfort1, V. Castro2, 1Institute of Pharmaceutical Biology, Albert-Ludwigs-University, Freiburg; 2 Escuela de Quimica, Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica. Ein möglicher Mechanismus der Chemoprävention wird darin gesehen, Krebszellen zur Differenzierung in einen normalen, nicht krebsartigen Zustand anzuregen. Natürlich vorkommende Sesquiterpen Lactone (SLs) besitzen anti-inflammatorische und cytotoxische Wirkung. Die entzündungshemmenden Eigenschaften werden einer Inaktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB durch Alkylierung seiner p65 Untereinheit zugeschrieben. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Hemmung von NF-κB und der Induktion von Zell-Differenzierung zu untersuchen, verwendeten wir die humane promyelozytische Leukämiezelllinie HL-60. Zell-Differenzierung zu morphologisch und funktionell reifen Granulozyten oder Monozyten/Makrophagen wurde durch spezifische zelluläre Eigenschaften nachgewiesen, d..h. die Reduktion des Tetrazoliumsalzes NBT zu einem gefärbten Formazan nach Behandlung mit dem Tumor-Promoter TPA, Nachweis der nicht-spezifischen (NSE) und spezifischen (SE) Säure-Esterase und einem Rückgang der Zellproliferation. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 117 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Parthenolid 118 Dihydrohelenalin acetate Bei Sesquiterpenlactonen mit einer reaktiven α-Methylenγ-lakton Gruppe, z.B. Parthenolid, beobachteten wir einen gute Korrelation zwischen der Hemmung der NF-κB DNA-Bindung und der Zellproliferation (r2=0.96), aber keinen direkten Zusammenhang mit der Induktion der ZellDifferenzierung. Andererseits konnten wir schwache NFκB Inhibitoren, einschließlich α-Methylen-butyrolakton als Referenzverbindung, und SLs ohne die α-Methylen-γlakton Gruppe, z.B. Dihydrohelenalin Acetat, als potente Induktoren von Zell-Differenzierungsprozessen identifizieren. Die Expression der nichtspezifischen Säure-Esterase zeigte eine Differenzierung in Richtung MonozytenMakrophagen. Insgesamt konnte die Induktion der ZellDifferenzierung durch SLs als unabhängig von der NF-κB Hemmung angesehen werden [4]. Weiterführende Untersuchungen mit Dihydrohelenalin Acetat unter Verwendung von DNA Makroarrays sollen nun alternative Targets identifizieren. 2.2. Untersuchung molekularer Mechanismen chemopräventiver Aktivität 2.2.1. Aktivierung anti-oxidativer zellulärer Prozesse durch Ellagsäure Unsere Ernährung spielt eine wichtige Rolle bei der Auslösung, aber auch in der Prävention verschiedenen Tumorarten. Chemopräventive Stoffe lassen sich in allen Nahrungskategorien finden, jedoch stellen Obst und Gemüse die Hauptquellen dar. Die Ellagsäure (EA) ist ein Polyphenol, das vor allem in Himbeeren, Erdbeeren und Walnüssen vorkommt. EA besitzt sowohl anti-mutagene als auch anti-carcinogene Eigenschaften. Eine krebspräventive Wirksamkeit konnte in verschiedenen Nager-Karzinogenesemodellen gezeigt werden. EA hemmt Phase 1 Cytochrom P450 Enzyme und verhindert so die Aktivierung von Karzinogenen; ferner werden Phase 2 Enzymen (Glutathion S-Transferasen und QR) induziert, die zu einer verstärkten Entgiftung von Karzinogenen beitragen. Ellagsäure (EA) Ziel des vorliegenden Projekts war es zu untersuchen, inwieweit auch antioxidative Mechanismen zur chemopräventiven Wirkung der EA beitragen. Dazu wurde die hepatozelluläre Karzinomzelllinie HUH-7 eingesetzt. EA, aber auch mit EA-behandelte Zellextrakte zeigten im ORAC Test hohe anti-oxidative Kapazität. Dies war zum einen auf die Induktion von Glutathion als einem der wichtigsten niedermolekularen intrazellulären Antioxidantien zurückzuführen, zum anderen wurden aber auch verschiedene antioxidative Proteine durch EA induziert. Wir Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren konnten z.B. einen Dosis- und Zeit-abhängigen Anstieg der Aktivität der Catalase and Thioredoxin Reduktase nachweisen. Mittels kompetitiver RT-PCR Analysen konnten wir zeigen, daß EA die mRNA Expression von Metallothionein I, einem thiol-reichen antioxidativen und Metall-bindenden Protein, signifikant stimuliert und auch die Proteinexpression erhöht. Aus der Induktion des antioxidativen intrazellulären Potentials resultierte insgesamt ein Schutz vor chemisch-induzierter Lipidperoxidation, bestimmt über die Spiegel des Fettsäureabbauproduktes Malondialdehyd mittels HPLC Analytik [1]. κB als molekulares Target der anti2.2.2. NF-κ inflammatorischen Wirkung von Sulforaphan, ein Isothiocyanat aus Broccoli. Erhöhte NO-Werte, die z.B. bei chronischen Entzündungen und Infektionen durch die Aktivität der induzierbaren NO Synthase (iNOS) gebildet werden, können Ursache für Mutationen und letztendlich für Krebs sein. Sulforaphan, ein aliphatisches Isothiocyanat aus Cruciferen, hemmt die Bildung von NO in Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Raw Makrophagen mit einem IC50 von 0.7µM. Sulforaphan interferiert dabei nicht mit der enzymatischen Aktivität der iNOS, sondern hemmt vielmehr die Induktion des Enzyms auf transkriptioneller Ebene, wie durch Western Blot und RT-PCR-Analysen gezeigt werden konnte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für die induzierbare Cyclooxygenase (Cox-2) erhalten. Zudem verhindert Sulforaphan die Bindung von aktiviertem NFκB, einem für die iNOS und Cox-2 Expression entscheidenden Transkriptionsfaktor, an dessen Konsensussequenz in der Promoterregion. Allerdings beeinträchtigt Sulforaphan weder den durch LPS initiierten Abbau des Inhibitors IκB noch die Translokation von NF-κB in den Zellkern. Wir konnten in weiterführenden Untersuchungen zeigen, daß Sulforaphan zu einer transienten Depletion von GSH und damit zu einer Veränderung des Redoxpotentials (GSH/GSSG System) führt und evtl. die NF-κB-Aktivität so beeinträchtigt, daß NF-κB zwar in den Kern gelangt, aber nicht an die DNA bindet und die Expression κB-abhängiger Gene aktiviert [13]. Ferner konnten wir nachweisen, daß Sulforaphan transient die Aktivität der Thioredoxin-Reduktase hemmt. Thioredoxin stellt einen Redox-Modulator dar, der im Zellkern essentiellen Cystein-Gruppen an Redox-sensitiven Transkriptionsfaktoren in einem reduzierten Zustand erhält und damit die Bindung an die DNA ermöglicht. Eine Hemmung der Thioredoxin Reduktase könnte über eine Veränderung des intranukleären Redox-Potentials zu einer Hemmung der NF-κB DNA-Bindung führen. 2.2.3. Induktion von Zell-Differenzierungsprozessen durch Histon Deacetylase Hemmstoffe In Zusammenarbeit mit M. Jung, Universität Münster Die Entstehung von Darmkrebs kann als kontinuierliche Anhäufung von genetischen (sowohl erbliche als auch erworbene) oder biochemischen Zellschäden angesehen werden. Diese Veränderungen resultieren in DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention hyperproliferativem Wachstum von Darmepithelzellen, das durch ein komplexes Zusammenspiel von Faktoren mit Einfluß auf die Zellzyklusprogression, die Induktion zellulärer Enddifferenzierungsprozesse und Apoptose reguliert wird. Der Acetylierung und Deacetylierung von Histonen wird eine fundamentale Funktion in der Regulation von Transkription und Zell-Proliferation zugeschrieben. Verschiedene Hemmstoffe von Histon-Deacetylasen (HDAC) sind in der Literatur als Differenzierungs-Induktoren in in vitro Zellkultursystemen beschrieben. In unseren Studien wurde v.a. zwei HDAC Inhibitoren untersucht: Natrium Butyrat (SB) und Trichostatin A (TSA). SB ist besonders von Interesse, da es einen Metaboliten von Ballaststoffen aus der Nahrung darstellt, der durch anaerobe Mikroorganismen im Darm produziert wird. Die Differenzierung verschiedener Darmkrebs-Zellinien wurde über die Induktion des Glykoproteins Alkalische Phosphatase (ALP) gemessen. Histon Acetylierung konnte über die AUT Gel-Elektrophorese analysiert werden. Darüber hinaus wurde die Expression eines Inhibitors Cyclin-abhängiger Kinasen, p21, und des Retinoblasomaproteins pRB mittels Western Blotting gemessen. SB induzierte die ALP Aktivität in den DarmkrebsZelllinien LIM1215 und HCT 116 mehr als 10-fach. Eine Hyperacetylierung von Histon H4 konnte bereits nach 6h detektiert werden. Dies war ein Hinweis auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der Hemmung der HDAC und der Induktion von Zelldifferenzierung. Andererseits führte die Behandlung mit dem potenten HDAC Inhibitor TSA zwar zu einer Hyperacetylierung von H4, aber nicht zur Induktion der ALP Aktivität als Marker für Zelldifferenzierungsprozesse. Sowohl SB als auch TSA bewirkten in LIM1215 und HCT 116 Zellen nach einer 6bis 24-stündigen Behandlung eine signifikante Induktion von p21. Diese Induktion war unabhängig von p53, da wir ähnliche Effekte (Induktion der ALP Aktivität und der p21 Expression) nach SB-Behandlung auch in einer p53 (-/-) Variante von HCT 116 messen konnten. Interessanterweise konnte in einer p21 (-/-) Variante durch SB keine Differenzierung mehr induziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß für die Induktion von Zelldifferenzierungsprozesse durch HDAC Inhibitoren p21 notwendig ist, daß jedoch die Hyperacetylierung von Histonen und die p21 Induktion nicht ausreichend sind, um Zell-Differenzierung zu induzieren. Bei der Untersuchung des Phosphorylierungsgrades von pRB zeigten sich Unterscheide zwischen SB und TSA: Nach TSA Behandlung war pRb in HCT 116 Zellen in Übereinstimmung mit der verstärkten Expression von p21 hypo-phosphoryliert, in der p21 (-/-) Variante lag pRB jedoch hauptsächlich in der hyper-phosphorylierten Form vor. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit TSA konnten wir in den p21 (-/-) Zellen nach SB Behandlung Wachstumshemmung und pRB Hypo-Phosphorylierung detektieren. Diese Resultate deuten auf einen Einfluß von SB auf zusätzliche Cyclin-abhängige Kinasen bzw. Kinase- Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Inhibitoren hin und werden unter Verwendung von DNAMakroarrays weiter untersucht [18]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Gamal-Eldeen, A., Gerhäuser, C., Frank, N., Bartsch, H.: Ellagic acid induces antioxidant mechanisms in cultured human hepatocellular carcinoma cells HUH-7. Journal of Cancer Research and Clinical Oncologyy 127 Suppl. (2001). [2] Gerhäuser, C., *Alt, A., Gamal-Eldeen, A., Neumann, I., Frank, N., Chmiel, H., Bartsch, H., and *Becker, H.: Antioxidant and Radical-scavenging Potential of Phenolic Constituents of Beer. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 42 (2001a) 103. [3] Gerhäuser, C., *Alt, A., Klimo, K., Heiss, E., Neumann, I., Gamal-Eldeen, A., Knauft, J., Scherf, H., Frank, N., Bartsch, H., *Becker, H.: Xanthohumol from Hop (Humulus lupulus) as a Novel Potential Cancer Chemopreventive Agent. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 42 (2001b) 94. [4] Gerhäuser, C., Scherf, H.R., *Klaas, C.R., *Castro, V., *Merfort, I.: Induction of HL-60 Cell Differentiation by Sesquiterpene Lactones. Journal of Cancer Research and Clinical Oncologyy 127 Suppl. (2001c). [5] Gerhäuser, C., *Alt, A., Heiss, E., Gamal-Eldeen, A., Klimo, K., Knauft, J., Neumann, I., Scherf, H.-R., Frank, N., Bartsch, H., *Becker, H.: Cancer chemopreventive activity of Xanthohumol, a natural product from hop.Molecular Cancer Therapeutics (2002) [6] Gerhäuser, C.: Flavonoide und andere pflanzliche Wirkstoffe. Was hat praktische Relevanz? Sollen wir unser Essverhalten ändern? Akt. Ernähr. Med. 26 (2001) 1-7. [7] Gerhäuser, C.: Mechanismen der Krebsentstehung - Ansatzpunkte für die Krebs-Chemoprävention. Ernährungs-Umschau 48 (2001) S48 - S51. [8] Gerhäuser, C., Heiss, E., Klimo, K., Neumann, I., *Becker, H., *Eicher, Th., Bartsch, H.: Bibenzyl derivatives as novel lead compounds in chemoprevention. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41 (2000) 412. [9] Gerhäuser, C.: Chemoprävention von Krebs durch Naturstoffe. Pharmazeutische Zeitschrift, (Sonderheft Meran) (2000) 4-8. [10] Gerhäuser, C., Heiss, E., Herhaus, C., Klimo, K.: Potential Chemopreventive Mechanisms of Chalcones. Chapter 4.4 in: Dietary Anticarcinogens and Antimutagens. Chemical and Biological Aspects. Ian Johnson and Roger Fenwick: RCS, Cambridge, UK (2000), pp. 189-192. [11] *Ha, T., Gerhäuser, C., *Zhang, W., *Ho-Chong-Line, N., *Fourasté, I.: New Lanostanoids from Ganoderma lucidum (Polyporaceae) that induce NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cultured Hepa1c1c7 murine hepatoma cells. Planta Medica 66 (2000) 681-684. [12] Heiss, E., Klimo, K., Neumann, I., Gerhäuser, C.: AntiProliferative Mechanisms of Xanthohumol from Hop (Humulus Lupulus) in in vitro Breast Cancer Chemoprevention Models. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 127 Suppl. (2001a). [13] Heiss, E., Herhaus, C., Klimo, K., Bartsch, H., Gerhäuser, C.: Nuclear factor-κB is a molecular target for sulforaphanemediated anti-inflammatory mechanisms. Journal of Biological Chemistry 276 (2001b) 32008-32016. [14] *Jung M., *Wittich, S., Xie, C., Scherf, H., Gerhauser, C.: Structure-activity data on inhibitors of histone deacetylase - In vitro enzyme inhibition, induction of differentiation and inhibition of proliferation in leukemic cells. Clinical Cancer Research 6 Suppl. (2000) 336. [15] Spaeth, M., Gerhäuser, C., Schiffter, H., Frank, N., *Nasheuer, N.P., Bartsch, H.: Inhibition of human DNA polymerase α by chemopreventive agents. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41 (2000) 846. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 119 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [16] *Wittich, S., Scherf, H.R., Xie, C., *Brosch, G., *Loidl, P., Gerhäuser, C., *Jung, M.: Structure-activity relationships on phenylalanine containing inhibitors of histone deacetylase - Invitro enzyme inhibition, induction of differentiation and inhibition of proliferation in erythroleukemic cells. J. Med. Chem. (2002) [17] *Wollenweber, E., *Stevens, J.F., Klimo, K., Knauft, J., Frank, F. and Gerhäuser, C.: Cancer Chemopreventive in vitro Activities of Isoflavones Isolated from Iris germanica. [18] Xie, C.P., Scherf, H.R., Neumann, I., Gerhäuser, C.: Potential Mechanisms of Induction of Cell Differentiation by Histone Deacetylase Inhibitors. Journal of Cancer Research and Clinical Oncologyy 127 Suppl. (2001). Patente Nr. 100 15 525.1. Synthetische Derivate von Lunularsäure, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen, Verfahren zur Herstellung der Lunularsäurederivate sowie deren Verwendung. Erf. Gerhäuser, *Eicher, *Pick. Patentanmeldung eingereicht beim Deutschen Patentamt am 30.3.2000. Internationale Anmeldung 31.1.2001. 120 Genetische Toxikologie und DNA Reparatur (C0203) P. Schmezer Die meisten beim Menschen und viele im Tierversuch krebserzeugende Stoffe besitzen in vitro eine DNA schädigende (gentoxische) Wirkung. Häufig ist jedoch eine (Gewebe)-spezifische Verstoffwechslung notwendig, um die ultimalen, DNA-reaktiven Metabolite zu bilden. Wir setzen deshalb aus verschiedenen Geweben des Menschen oder von Versuchstieren frisch isolierte, metabolisch kompetente Zellen ein, um die gentoxische Wirkung von Stoffen zu untersuchen [1]. Dieses Ziel kann jedoch nur dann effektiv erreicht werden, wenn experimentelle Methoden zur Verfügung stehen, die den Nachweis einer gentoxischen Wirkung an wenigen Zellen erlauben. Mit einer derartigen Methode können auch Zellen untersucht werden, die aus kleinen durch Biopsie beim Menschen gewonnenen Gewebestücken isoliert werden. Hierfür ist die Methode der Einzelzell-Mikrogel-Elektrophorese (alkalischer Comet Assay) besonders geeignet. Wir haben diese Methode optimiert und zur allgemeinen Untersuchung von Gentoxizität sowie zur Analyse spezifischer (z.B. oxidativer) DNA Schäden eingesetzt [2,3]. Zusätzlich verwenden wir die Mikrogel-Elektrophorese zur Untersuchung von DNA Reparaturprozessen. Unsere Forschungsarbeiten beinhalten Untersuchungen von gentoxischen und cancerogenen luftgetragenen Schadstoffen, vorwiegend im Respirationstrakt [4]. Zur Identifizierung möglicher DNA schädigender und krebserzeugender Noxen wurden auch in vivo Mutationsanalysen bei transgenen Nagetieren (BigBlue, MutaMouse) [5,6] sowie mittels ‚hprt T-cell cloning’ beim Menschen durchgeführt [7]. In den letzten Jahren haben wir einen Schwerpunkt unserer Arbeiten darauf ausgerichtet, in populationsbasierten Studien Personen mit hohem individuellem Risiko gegenüber gentoxischen Noxen zu identifizieren: In Zusammenarbeit mit Epidemiologie und Klinik setzen wir eine optimierte Version des Comet Assay ein, um sowohl die zelluläre Mutagensensitivität als auch die DNA Reparaturkapazität in peripheren Blutlymphozyten zu ermitteln [11, 14]. Zusätzlich werden PCR-gestützte Verfah- Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren ren zur Bestimmung von Polymorphismen bei DNA Reparatur- [20] und Fremdstoffmetabolismus-Genen [13,19] angewandt. Schließlich führen wir Untersuchungen zur Expression dieser Gene durch, wobei sowohl selbst entwickelte cDNA Arrays als auch quantitative RT-PCR (realtime) zum Einsatz kommen [6]. Die Identifizierung von sogenannten Hochrisikopersonen, die eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber gentoxischen Stoffen oder Strahlung, eine reduzierte DNA Reparaturkapazität oder spezifische Defekte bei DNA Reparaturenzymen aufweisen, kann einen wichtigen Beitrag zur Krebsprävention leisten: Diese Personen können einem engmaschigen Screening zur Krebsfrüherkennung zugeführt werden, und sie stellen geeignete Kandidaten für chemopräventive Interventionsstudien dar. Schließlich besteht eine neue Aktivität der Arbeitsgruppe in der Suche und Bewertung von Stoffen, die in der Lage sind, das zelluläre DNA Reparaturvermögen zu verbessern. 1. DNA-Reparaturkapazität und Mutagensensitivität als Risikofaktoren für das nicht-kleinzellige Bronchialcarcinom P. Schmezer, C. Mayer, O. Popanda, N. Rajaee-Behbahani, A. Risch, R. Gliniorz, O. Zelezny, P. Waas In Zusammenarbeit mit: W. Rittgen, Biostatistik, DKFZ; P. Drings, H. Dienemann, K.W. Kayser, V. Schulz, Thoraxklinik HeidelbergRohrbach Die Fähigkeit zur DNA-Reparatur ist eine wesentliche Voraussetzung für die Erhaltung der Erbinformation und für den korrekten Ablauf zellulärer Funktionen. Störungen in der DNA-Reparatur können das individuelle Krebsrisiko erhöhen. Daher ist es wichtig, Methoden für den Einsatz in molekular-epidemiologischen Studien zu entwickeln, mit denen es verlässlich möglich ist, solche Risikoindividuen zu identifizieren, die spezifische genetische Veränderungen tragen (Polymorphismen in DNAReparaturgenen), oder die eine verminderte Reparaturfunktion (DNA-Reparaturkapazität) aufweisen. Für letzteres haben wir eine Mikrogel-Elektrophorese-Technik entwickelt, mit der die individuelle DNA-Reparaturkapazität an peripheren Blutlymphozyten bestimmt werden kann [14]. Diese Methode wurde in einer Fall-Kontroll-Studie mit Patienten validiert, die am nichtkleinzelligen Bronchialcarcinom erkrankt waren [11]. Hierzu wurden periphere Blutlymphozyten von 160 Krebspatienten und 180 Kontrollpersonen gewonnen. Letztere waren zum Zeitpunkt der Blutentnahme nicht an Krebs erkrankt, befanden sich jedoch zur Behandlung anderer Lungenerkrankungen im selben Krankenhaus. Die Zellen wurden bei -80° C gelagert. Nach dem Auftauen wurden sie mit PHA stimuliert und anschließend mit Bleomycin behandelt (20µg/ml über 30 min). Danach wurden sowohl die Bleomycin-(Mutagen-)sensitivität als auch die DNA-Reparaturkapazität der Zellen bestimmt: Patienten mit Bronchialkarzinom zeigten im Durchschnitt eine deutlich erhöhte Mutagensensitivität gegenüber den Kontrollpatienten (p<0001). Die DNA-Reparaturkapazität, gemessen in den ersten 15 min nach Mutagenbehandlung, war in den Lymphozyten der Patienten mit nicht-kleinzelligem DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Bronchialcarcinom signifikant niedriger als in den Zellen der Kontrollen (67% versus 79.3%; p<0004). Weder bei den Fällen noch bei den Kontrollen konnten wir einen Einfluss des Alters oder Geschlechts der Patienten auf die gemessenen Parameter feststellen. Die Medianwerte für Mutagensensitivität und DNA-Reparaturkapazität bei den Kontrollen wurden als ‚cut-off’ Grenzwerte herangezogen, um das relative Risiko (odds ratio, OR) zu berechnen: Nach Adjustierung für Alter, Geschlecht und Rauchverhalten ergab sich ein OR=2.1 (95%CI 1.1-4) für die reduzierte DNA-Reparaturkapazität sowie ein OR=4 (95% CI 2.2-7.4) für die erhöhte Mutagensensitivität bei den Tumorpatienten gegenüber den Kontrollpatienten. Beide Parameter erwiesen sich als unabhängige Risikofaktoren für das Tabakrauch-assoziierte Bronchialcarcinom. Wiederholte Analysen von Lymphozyten desselben Spenders ergaben eine gute Reproduzierbarkeit der Methode. Die Lagerung der Zellen bei -80°C über einen Zeitraum von bis zu mehr als einem Jahr hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Messergebnisse. Diese Resultate belegen, dass die von uns optimierte MikrogelElektrophorese-Technik geeignet ist, um individuelle Mutagen-sensitivität und DNA-Reparaturkapazität zu bestimmen: Sie ist sensitiv, schneller durchzuführen als zytogenetische Methoden und sie kann sowohl bei tiefgefroren gelagerten als auch bei nativen Lymphozyten eingesetzt werden. Zur weiteren Validierung der Methode wäre ihr Einsatz in großen prospektiven Studien zur Identifizierung von Hochrisikopatienten wünschenswert. 2. Untersuchungen zur Expression von DNA Reparaturgenen P. Schmezer, C. Mayer, O. Zelezny, P. Waas, O. Popanda, In Zusammenarbeit mit: W. Rittgen, Biostatistik, DKFZ; A. Bach, M.C. von Brevern, Axaron Bioscience AG, Heidelberg In weiterführenden Experimenten wollen wir solche DNAReparaturgene identifizieren und charakterisieren, die für die o.g. Störungen der DNA-Reparatur verantwortlich sein könnten. Dazu wird die Expression verschiedener menschlicher Reparaturgene auf der mRNA-Ebene untersucht. Hierzu entwickelten wir cDNA-Arrays, mit deren Hilfe die Expression von ca. 70 Genen, die bei der Reparatur von DNA-Schäden eine Rolle spielen, gleichzeitig gemessen werden kann. Aus IMAGE cDNA-Klonen isolierten wir für jedes dieser Gene repräsentative PCR-Fragmente. Nach Verifizierung der Identität der PCR-Fragmente durch Sequenzanalyse wurden diese Fragmente auf Arrays gespottet und fixiert. Mit Hilfe dieser Arrays wurde zunächst untersucht, ob sich das Expressionsmuster von DNA Reparaturgenen in ruhenden peripheren menschlichen Blutlymphozyten von dem in Mitogen-stimulierten (mit PHA behandelten) Zellen unterscheidet [6]. Es gibt Hinweise, dass die Fähigkeit der Zellen, DNA Schäden zu reparieren, mit ihrer Proliferationsaktivität zusammenhängen könnte. Es ist deshalb eine wichtige Frage für molekular-epidemiologische Studien, ob stimulierte oder ruhende Lymphozyten zur Messung der DNA Reparaturkapazität eingesetzt werden sollen. Es wurden Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Hybridisierungsexperimente sowohl mit ruhenden als auch mit PHA stimulierten Lymphozyten nach 0, 24, 48 und 72 Stunden durchgeführt. Die Signalintensitäten von 46 DNA Reparaturgenen war für eine quantitative Analyse ausreichend. Wir haben 12 Gene identifiziert, die 72 Stunden nach PHA Behandlung mit einem mehr als zweifachen Anstieg der Transkriptmenge reagierten, wobei der maximale Anstieg mehr als das Achtzehnfache betrug. Für die meisten der hochregulierten Reparaturgene ist bekannt, dass sie außer bei der DNA Reparatur auch eine Rolle bei der DNA Replikation spielen. Im Gegensatz hierzu beobachteten wir bei 34 von 46 Reparaturgenen (74%) keinen Anstieg des Expressionsniveaus, d.h. die Messwerte lagen innerhalb eines Bereichs, der das Zweifache des Vergleichswertes bei Zellen ohne PHA Behandlung nicht überschritt. Die Expressionswerte wurden unabhängig von den cDNA-Arrays verifiziert, und zwar unter Verwendung eines LightCyclers mittels quantitativer PCR im Echtzeit-Verfahren nach Reverser Transkription (real time RT-PCR). Bisher wurden die Expressionswerte von 8 Genen überprüft: 5 Gene die nach PHA Behandlung anstiegen und 3 Gene die nach Mitogenstimulierung konstant blieben. Für 6 dieser 8 Genen wurde eine qualitative und/oder quantitative Übereinstimmung beobachtet. Aus unseren Ergebnissen können wir schließen, dass es in humanen peripheren Blutlymphozyten nach PHA Stimulierung nicht zu einem generellen Anstieg der Genexpression von DNA Reparaturgenen kommt. Dieses Resultat steht im Einklang mit eigenen Comet Assay Untersuchungen an ruhenden und PHA-stimulierten Lymphozyten [6]: Die Reparaturkapazität PHA-behandelter und nicht behandelter Zellen wurde nach γ-Bestrahlung gemessen. Wir konnten keine Unterschiede feststellen, weder in der Menge der durch die Bestrahlung induzierten DNA-Schäden noch in der DNAReparaturkapazität. Allerdings war der Basalwert (Menge an DNA Schäden ohne γ-Bestrahlung) in den PHA-stimulierten Lymphozyten höher als in den ruhenden Zellen. Im weiteren Verlauf unserer Untersuchungen werden die Arrays verwendet, um Transkriptionsprofile von Lungenkrebspatienten mit normaler oder reduzierter DNA Reparaturkapazität zu erstellen. Erste Resultate zeigen eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, die experimentelle Variation in einer wiederholten Analyse der RNA desselben Patienten war kleiner als zweifach. Dagegen zeigten mehrere Gene größere Expressionsunterschiede zwischen verschiedenen Patienten. Ob diese Unterschiede mit der DNA-Reparaturkapazität korrelieren, soll in einer Pilotstudie mit 30 Patienten geklärt werden. Zusätzlich soll durch die Analyse von Polymorphismen in DNAReparaturgenen geklärt werden, inwieweit eine reduzierte DNA-Reparaturleistung in Lungenkrebspatienten genetisch bedingt sein kann. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 121 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 3. Quantitative Erfassung der Poly(ADP-ribosyl)ierung P. Schmezer, N. Rajaee-Behbahani, C. Mayer, O. Zelezny, R. Gliniorz, P. Waas, U. Bollow, B. Bertram In Zusammenarbeit mit: A. Bürkle, Abteilung Gerontologie, Universität Newcastle, UK; H. Becher, Abteilung Tropenhygiene und öffentl. Gesundheitswesen, Universität Heidelberg; H. Ramroth, Abteilung Klinische Epidemiologie, DKFZ; A. Dietz, Abteilung Otolaryngologie, Kopf-Hals-Chirurgie, Universität Heidelberg. 122 Die Poly(ADP-Ribose)polymerase (PARP) ist ein nukleäres Enzym das durch bestimmte DNA Schäden (Strangbrüche) aktiviert wird. Sie katalysiert unter Verwendung von NAD+ die kovalente Modifikation von Proteinen durch ADP-Ribose-Polymere. Wir haben nach Induktion von DNA Schäden die Polymerbildung mittels eines Immunfluoreszenz-Verfahrens in intakten peripheren Blutlymphozyten des Menschen analysiert. Hierbei wurde die Reaktion der Lymphozyten auf Bleomycin untersucht, eine Verbindung, die bekanntermaßen DNA Einzel- und Doppelstrangbrüche induziert. Für diesen Zweck wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe die Immunfärbung durch PC-gestützte Bildverarbeitung quantitativ erfasst werden konnte [12]. Als erste Anwendung dieser neuen Methode haben wir die Polymerbildung nach Bleomycin-Schädigung vergleichend in ruhenden und in Mitogen-stimulierten peripheren Blutlymphozyten untersucht. Ruhende menschliche Lymphozyten zeigten ähnliche Basalwerte für die Immunfärbung wie Phytohämagglutinin(PHA)-stimulierte Zellen (1.3±0.8 versus 2.2±0.9, p<0.3). Nach Bleomycin-Behandlung der Zellen konnte ein deutlicher Anstieg der Polymerbildung beobachtet werden, der in PHA-stimulierten Zellen signifikant höher war als in nicht-stimulierten Lymphozyten (9.2±1.4 versus 4.2±1.0, p<0.005). Erwartungsgemäß wurde die Immunfärbung des Polymers durch den Einsatz des ADP-Ribosylierungs-Inhibitors 3-Aminobenzamid unterdrückt und die Intensitätswerte der Immunfärbung sanken sowohl in ruhenden als auch in PHA-stimulierten Lymphozyten (1.2±0.7 versus 1.5±0.9). Unsere Beobachtungen zeigen, dass (i) Mitogen-stimulierte gegenüber ruhenden Lymphozyten eine verstärkte Polymerbildung nach Behandlung mit Bleomycin aufweisen und (ii) unsere neu entwickelte quantitative Immunfluoreszenz-Methode empfindlich und zuverlässig ist, um Veränderungen der Polymerbildungsrate in intakten Zellen reproduzierbar nachzuweisen. Diese neu entwickelte Methode wurde in einer klinischen Fall-Kontroll-Studie eingesetzt [10]. Da bekannt ist, dass Defekte in der DNA Reparatur mit einem erhöhten Tumorrisiko beim Menschen einhergehen können, haben wir untersucht, ob erworbene oder vererbte Änderungen in der PARP-Aktivität einen Einfluss auf das Risiko haben, an Larynxkrebs zu erkranken. Im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie zu genetischen sowie berufsund Lebensstil-bedingten Risikofaktoren für Larynxkrebs wurde mittels quantitativer Immunfluoreszenz-Analyse die PARP-Aktivität durch Messung der Poly(ADP-Ribose)Bildung in peripheren Blutlymphozyten erfasst. Die Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Polymerbildung wurde nach Behandlung der Lymphozyten von 69 Larynxkrebspatienten und 125 gesunden populationsbasierten Kontrollpersonen mit Bleomycin bestimmt. Das Ausmaß der Bleomycin-induzierten Polymerbildung, gemessen als durchschnittliche PixelIntensität, war in Larynxkrebspatienten (74.6; SE=3.7) signifikant niedriger als in Kontrollpersonen (94.5; SE=3.5) und wurde durch Faktoren wie Alter, Geschlecht oder Rauchverhalten nicht beeinflusst. Es war jedoch kein Unterschied bei den Basalwerten der Polymerbildung (ohne Bleomycin-Behandlung) zu beobachten (Fälle: 59.1; SE=5.2 / Kontrollen: 50.5; SE=3.7). Wenn man das höchste Tertil der Polymerbildung als Referenzwert heranzieht, ist das Risiko (odds ratio) für das niedrigste Tertil um den Faktor 3.79 (95% CI 1.37-10.47, p=0.01) erhöht. Dies bedeutet, dass periphere Blutlymphozyten von Patienten mit Larynxkrebs eine signifikant niedrigere Bleomycin-induzierte Poly(ADP-Ribose)-Bildung aufweisen als Zellen von gesunden Kontrollpersonen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine verminderte Fähigkeit zur zellulären Poly(ADP-Ribose)-Bildung mit einem erhöhten Risiko für Larynxkrebs einhergehen könnte. Der diesem Befund zugrundeliegende Wirkmechanismus muss noch aufgeklärt werden. Zur Suche und Bewertung von Naturstoffen, die in der Lage sind, das zelluläre DNA Reparaturvermögen zu verbessern, haben wir eine Reihe von Experimenten mit (-)Epigallocatechingallat (EGCG) begonnnen, einem wichtigen Inhaltsstoff des grünen Tee. Beim Tee sind bisher keine Hinweise auf ein mutagenes oder krebserzeugendes Potential bekannt [3]. Es wird jedoch berichtet, dass er bemerkenswerte präventive Wirkung bei der Entstehung von Krebs- sowie kardiovaskulären Erkrankungen besitzt [2]. In unseren Untersuchungen erwies sich EGCG als wirkungsvoller Induktor der Bildung von Poly(ADP-Ribose) in einer Leukämie-Zellinie (Nalm6) sowie in menschlichen peripheren Blutlymphozyten. Bereits 10 min nach Behandlung der Zellen mit EGCG war in beiden Zelltypen ein deutlicher Anstieg von Poly(ADPRibose) festzustellen, der in den Nalm6 Zellen über 60 min, in Lymphozyten länger als 4 Stunden anhielt. Die parallele Bestimmung von DNA Schäden mittels Mikrogel-Elektrophorese weist jedoch auch auf eine mögliche gentoxische Wirkung von EGCG hin. Dieser Befund wird derzeit in unserem Labor weiter abgeklärt. 4. Mutationsanalyse bei Replikationsenzymen aus Tumorzellen O. Popanda, P. Waas In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. E. Hagmüller, Kreiskrankenhaus Bad Friedrichshall; im DKFZ: H.W. Thielmann, T. Flohr, J. Dai Das Genom maligner Tumoren ist von Mutationen und chromosomalen Modifikationen gekennzeichnet, die sich im Laufe der Tumorentstehung anhäufen. Nach der „Mutatorhypothese“ von L. A. Loeb können Veränderungen in Enzymen des Replikationsapparates und der DNA-Reparatur eine Ursache dieser genomischen Instabilität sein. Es war zu vermuteten, daß hierfür insbesondere Veränderungen von DNA-Polymerasen in Betracht DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention kommen, da deren Kopiergenauigkeit wesentlich zur akkuraten Replikation des Genoms beiträgt. Ist ihre Kopiergenauigkeit in malignen Zellen gestört, nehmen diese Enzyme am Entartungsprozeß teil, indem sie vermehrt Mutationen in den DNA-Tochterstrang einführen. Ziel dieser Forschungsaktivität war zu klären, ob in Tumorzellen die an der Replikation beteiligten DNAPolymerasen so verändert sind, daß sie Mutatoreigenschaften annehmen und zur Progression maligner Tumoren beitragen können. Für diese Untersuchungen wurden zwei Modellsysteme verwendet: (i) hoch maligne Novikoff-Hepatomzellen eines Lebertumors der Ratte, und normale, sich regenerierende Rattenleber [8] sowie (ii) sporadische Kolontumoren des Menschen [9]: (i) Im Rahmen dieser Aktivität wurden die cDNA-Sequenzen der DNA-Polymerase alpha und ihrer Untereinheiten in Novikoff-Hepatomzellen und normaler Rattenleber bestimmt. Durch Vergleich beider Sequenzen wurde eine Mutation in der regulativen Untereinheit B des DNA-Polymerase α-Primasekomplexes der Novikoff-Hepatomzellen identifiziert, die zu einem Aminosäureaustausch führte. Der streng parallel geführte Vergleich molekularer und biochemischer Eigenschaften der gereinigten DNAPolymerase-α Aktivitäten von normaler Rattenleber und Novikoff-Hepatomzellen ergab für das Enzym der malignen Zellen mehrere statistisch signifikante Unterschiede. Besonders erwähnt sei, daß die DNA-Polymerase α der Novikoffzellen signifikant empfindlicher gegenüber einigen Hemmstoffen der Zellproliferation (z. B.: Doxorubicin, Netropsin, Topotecan) reagierte. Die Sedimentationsanalyse zeigte, daß die in der Untereinheit B des DNA-Polymerase α-Primasekomplexes nachgewiesene Mutation eine Änderung der Konformation der Untereinheit B selbst sowie des gesamten Komplexes bewirkt. Aufgrund früherer Ergebnisse und durch Hinweise aus der Literatur können die abweichenden katalytischen Eigenschaften des DNA-Polymerase-α-Primasekomplexes durch die Konformationsänderung und ein dadurch möglicherweise verändertes Phosphorylierungsmuster erklärt werden. Vor allem im Hinblick auf eine therapeutische Nutzung ist die Beobachtung von Interesse, daß auch die Sensitivität gegenüber Hemmstoffen der Zellproliferation erhöht ist. (ii) Mehrere für Replikationsenzyme kodierende Gene wurden unter Verwendung molekularbiologischer Techniken auf Mutationen in Gewebeproben von menschlichen Kolontumoren und gesunder Mukosa geprüft (klinischer Kooperationspartner: Prof. Dr. E. Hagmüller). Es standen Tumor- und Normalgewebe von 19 Patienten sowie sechs Kolonkarzinomzellinien zur Verfügung; drei der Zellinien wiesen einen Defekt in der Basenfehlpaarungsreparatur auf. Die mittels Reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten cDNAs der katalytischen Untereinheit der DNA-Polymerase α sowie jeweils eine Untereinheit der Replikationsfaktoren A und C wurden mit einer Methode zur Bestimmung des Einzelstrangkonformations-Polymorphismus (SSCPAnalyse) und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Pro Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Gen wurden mindestens 10 Tumoren und 6 Zellinien untersucht. Eine Mutation, die ausschließlich in Tumoren auftritt und somit während der Tumorentwicklung entstanden ist, wurde nur in der cDNA der DNA-Polymerase α gefunden. Diese Mutation verursachte allerdings keine Änderung der Aminosäuresequenz und blieb damit ohne Wirkung auf die Proteineigenschaften oder das Zellwachstum. Weitere Mutationen wurden bei der DNA-Polymerase α nicht entdeckt. Beim Replikationsfaktor A wurde bei zwei Patienten eine abweichende Aminosäuresequenz im Normal- und Tumorgewebe identifiziert. Diese Mutationen liegen in der Nähe aktiver Zentren der jeweiligen Proteine, so daß deren Eigenschaften durch die Sequenzvarianten verändert sein könnten. Schlußfolgerungen: Die Analyse der biochemischen Eigenschaften von DNA-Polymerasen aus malignen Novikoff-Hepatomzellen zeigte, daß in Tumorzellen Veränderungen der DNA-Polymerasen vorkommen, die die Kopiergenauigkeit der Enzyme verändern und Mutatoreigenschaften in den Zellen auslösen können. Allerdings konnten beim Menschen keine tumorspezifischen Mutationen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Grund für die überhaupt sehr geringe Zahl beobachteter Mutationen mögen die strengen Selektionsbedingungen im wachsenden Tumorgewebe sein, die alle Zellvarianten eliminieren, die nicht mit der Teilungsgeschwindigkeit der am schnellsten proliferierenden Zellen Schritt halten. So wurden in vivo nur wenige Sequenzvarianten der DNA-Polymerase δ und des Replikationsfaktors A geduldet. Ob es sich bei diesen Varianten, die auch im Normalgewebe beobachtet wurden, um Polymorphismen handelt, die mit einem erhöhten Krebsrisiko einhergehen, wird die Analyse eines größeren Patientenkollektives und entsprechender Kontrollen zeigen. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] *Becker, R., *Ritter, A., *Eichhorn, U., *Lips, J., Bertram, B., Wiessler, M., *Zdzienicka, M.Z., *Kaina, B.: Induction of DNA breaks and apoptosis in crosslink-hypersensitive V79 cells by the cytostatic drug beta-D-glucosyl-ifosfamide mustard. British Journal of Cancer 86 (2002) 130-135. [2] Bertram, B., Bartsch, H.: Krebsprävention durch grünen Tee: Wirklichkeit und Wunschdenken. Wiener Medizinische Wochenschrift 5/6 (2002) 153-158. [3] Bertram, B., *Hemm, I., *Tang, W.: Mutagenic and carcinogenic constituents of medicinal herbs used in Europe and in the USA. Die Pharmazie 56 (2001) 99-120. [4] Frei, E., *Kuchenmeister, F., Gliniorz, R., Breuer, A., Schmezer, P.: N-nitrososdimethylamine is activated in microsomes from hepatocytes to reactive metabolites which damage DNA of nonparenchymal cells in rat liver. Toxicol Letters 123 (2001)227-234. 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Seit langem wird LPO eine Rolle bei der Tumorpromotion und -progression zugeschrieben, doch erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass Etheno(ε)-DNA-Addukte aus LPO-Produkten gebildet werden. Die Entwicklung und Validierung von Analysemethoden für DNA-Addukte soll deshalb zum Verständnis der Bildung von exogenen und endogenen DNA-reaktiven Metaboliten beitragen. Weiterhin werden diese Adduktmarker bereits in Biomonitoring- und Chemopräventionsstudien angewandt. Die Bildung von DNA-Addukten ist eine der frühesten Stufen von messba- [15] Schmezer, P., *Rupprecht, T., *Tisch, M., *Maier, H., Bartsch, H.: Laryngeal mucosa of head and neck cancer patients shows increased DNA damage as detected by single cell microgel electrophoresis. Toxicology 144 (2000) 149-154. Abb. 1 Bildung von exozyklischen (Etheno)-DNA-Addukten aus Lipidperoxidationsprodukten (z.B. 4-Hydroxynonenal, HNE und Malonaldehyd, MDA), die durch oxidativen Stress in der Säugetierzelle aus Linolsäure und Arachidonsäure gebildet werden und auch beim Menschen nachgewiesen wurden. Anhäufung solcher promutagenen DNA-Läsionen (z.B. im Darmepithel) führt zu genetischer Instabilität, die den Übergang von gutartigen in bösartige Zellen vorantreibt (Bartsch und Nair, 2000). DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ren genetischen Schäden der Zelle. Werden diese nicht repariert, so führen diese nach Zellteilung zu Mutationen, die sich anhäufen und zu genomischer Instabilität und Krebswachstum führen können (Abb. 1). Bisherige Untersuchungen bestätigten die Nachweisempfindlichkeit und Spezifität unserer entwickelten Methoden zur Messung von Etheno-DNA-Addukten, die durch oxidativen Stress und LPO entstehen. In früheren Untersuchungen konnte eine verstärkte DNA-Schädigung durch chronisch entzündliche Prozesse und Aufnahme von ω-6 PUFA-reicher Nahrung mit einer erhöhten Etheno-Addukt-Bildung assoziiert werden. Die bisher meist benutzte Messmethode für oxidative DNA-Schäden ist die Bestimmung der oxidierten DNA-Base 8-OxoDesoxyguanosin. Jedoch bestehen wegen der Artefaktbildung Unsicherheiten über die Verlässichkeit dieses Biomarkers. Die Messung stabilerer, sekundärer Marker für DNA-Schäden, wie den Etheno-DNA-Addukten, erwies sich als besserer Indikator, um durch erhöhten oxidativen Stress und Lipidperoxidation bedingte DNA-Schäden zu erfassen, was durch die nachfolgenden Untersuchungen bestätigt wurde: 1.1 Etheno-DNA-Addukte im Darmepithel von Patienten mit Morbus Crohn (CD), Colitis Ulcerosa (UC) und familiärer adenomatöser Polyposis (FAP) 1,N6-Ethenodesoxyadenosin (εdA) und N3,4-Ethenodesoxycytidin (εdC) wurden im Darmgewebe dieser Patienten mit hohem Darmkrebsrisiko zum ersten Mal nachgewiesen. Beide Etheno-Addukte waren in FAP- und CDPatienten erhöht, während bei UC-Patienten nur εdC im Vergleich zur normalen Kolon-DNA angereichert war. Die Bildung von Etheno-DNA-Addukten in FAP-Patienten ist einem erhöhten Arachidonsäure-Metabolismus zuzuschreiben, dies in Folge einer Überexprimierung der Phospholipase A2 - und Cyclooxygenase 2 im Darmepithel (s. Abb. 1). Im Falle der entzündlichen Darmerkrankungen CD und UC wird die Adduktbildung auf erhöhten oxidativen Stress und Lipidperoxidation zurückgeführt, die als Folge chronisch entzündlicher Prozesse und einer Überproduktion von NO in den Zielzellen einhergehen. 1.2 Nachweis von Etheno-Addukten in Patienten mit chronischer Pankreatitis Hier wurden stark erhöhte Etheno-Addukt-Spiegel im Pankreasgewebe dieser Patienten im Vergleich zu normaler Pankreas-DNA gemessen. 1.3 Nachweis von 1,N6-Ethenodesoxyadenosin (εεdA) im Urin durch eine Immunaffinitäts-HPLC-FluoreszenzMethode In Zusammenarbeit mit Dr. T. Hanaoka, National Cancer Research Institute, Chiba, Tokio, Japan. Wie bereits früher gezeigt, werden die Etheno-AdduktSpiegel beim Menschen durch Nahrungsfaktoren, Hormonmetabolismus und entzündliche Prozesse beeinflusst. Zu ihrem leichteren Nachweis und zur Untersuchung über die Persistenz dieser DNA-Läsionen beim Menschen wurde eine nicht-invasive, empfindliche Analyse-Nachweismethode für im Urin ausgeschiedenes εdA Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren entwickelt, die auf Immunaffinitätsreinigungs-HPLC-Fluoreszenz-Bestimmungen beruht. Mit Hilfe dieser Methode kann das Ausmaß von DNA-Schäden, die durch oxidativen Stress und Lipidperoxidation ausgelöst werden, im Menschen nicht-invasiv untersucht werden. Damit können ätiologische Faktoren, wie hohe Fettaufnahme, niedrige Antioxidantien-Spiegel sowie chronisch entzündliche Prozesse, die bei der Krebsauslösung eine Rolle spielen, in Urinproben untersucht werden (Nair 1999). In einer Interventionsstudie in Japan wurde die Ausscheidung von εdA im Urin in nichtrauchenden postmenopausalen Frauen in Nordjapan untersucht. Dabei wurde der Erfolg einer diätetischen Beratung, die Salzeinnahme zu reduzieren und höhere Vitamin C- und Karotin-Mengen zu sich zu nehmen durch Fragebögen und biochemischen Analysen bestimmt. Aus einer großen Kohorte wurden 30 postmenopausale Frauen (60 - 69 Jahre alt) in der Interventionsgruppe und 30 gematchte Frauen in der Kontrollgruppe untersucht. Vor der Intervention war der εdA-Spiegel im Harn positiv mit der ausgeschiedenen Kochsalz-Konzentration korreliert (R = 0,33; P = 0,01); ebenso korrelierte εdA mit der Einnahme von ω-6 vielfach ungesättigten Fettsäuren (R = 0,28, P = 0,03). Die Ergebnisse dieser Pilotstudie stützen die Annahme, dass das ausgeschiedene εdA im Harn von DNA-Schäden herstammt, die durch Kochsalz über chronisch entzündliche Prozesse im Magen ausgelöst werden. Ein bereits nachgewiesener Zusammenhang zwischen der Aufnahme von ω-6 PUFA-reicher Nahrung und erhöhter Etheno-Addukt-Bildung in Lymphozyten weiblicher Probanden wurde in dieser Studie weiter bestätigt. Die biologische Relevanz von εdA als Biomarker in Biomonitoring- und klinischen Studien wird weiter untersucht [9]. 1.4 Immunhistochemische Methoden zum Nachweis von Etheno-Addukten in Gewebeschnitten Eine von uns entwickelte semiquantitative, immunhistochemische Nachweismethode für εdA konnte in der Leber-DNA von Ratten, die Vinylchlorid inhaliert hatten oder eine erhöhte Dosis von FeII erhielten, zellspezifisch erhöhte DNA-Spiegel dieser Addukte nachweisen [15]. 1.5 Die Rolle von COX-2 und Lipoxygenase (LOX) bei der Entstehung von Etheno-DNA- Addukten In Zusammenarbeit mit Dr. G. Fürstenberger, DKFZ. Bei Untersuchungen zur Entstehung des Mäusehautkarzinoms (DMBA als Initiator, TPA als Promotor) wurden Gewebespiegel von 8- und 12- HETE sowie Etheno-Addukte in Papillomen und Tumoren der Maushaut gemessen. Dabei wurde eine enge Korrelation von HETE-Konzentration und Etheno-Addukt-Spiegel beobachtet, wobei die höchste DNA-Schädigung bereits in gutartigen Krebsvorstufen auftrat. Damit wurde bewiesen, dass in Vorstufen des Mäusehautkarzinoms eine gestörte Regulation des Lipoxygenase/Arachidonsäure-Stoffwechsels auftritt, wobei eine Akkumulation dieser ArachidonsäureMetaboliten (HETEs) mit einer Zunahme von genetischen Defekten einhergeht [12]. Erhöhte Etheno-DNA-AdduktSpiegel wurden auch in den Darmpolypen von FAP-Pati- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 125 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention enten nachgewiesen [14]. Der relative Beitrag von COX-2 und LOX wird anhand von Zelllinien mit Überexprimierung dieser Enzyme gemessen. 2. Nachweismethode für O4-Ethyl-Thymidin (O4-etT) 1.6 Aufnahme von Fettsäuren in der Nahrung und Bildung von Etheno-Addukten bei premenopausalen Frauen In Zusammenarbeit mit Dr. M. Wiessler und Dr. C. Kliem, Abteilung Molekulare Toxikologie, DKFZ In Zusammenarbeit mit Dr. N. Becker, DKFZ 126 Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren In dieser Studie wurde das Vorkommen von Etheno-Addukten in Lymphozyten von Frauen nach niedriger und hoher Fettsäureaufnahme in der Nahrung geprüft [8]. Verbliebene Serum- und Lymphozytenproben aus der Heidelberger EPIC-Studie wurden nach den Angaben im Fragebogen in zwei Gruppen unterteilt: > 15 g (A) und < 5 g (B) Linolsäure-Aufnahme pro Tag. Das Verhältnis von Linolsäure- zu Ölsäurekonzentration im Serum wurde gemessen und die Etheno-Addukt-Spiegel in Lymphozyten bestimmt. Als Gruppenwert waren die Linolsäurekonzentrationen signifikant höher in der A- als in der B-Gruppe, was auch für die Ölsäurekonzentration zutraf. Das Verhältnis der Konzentrationen beider Fettsäuren war jedoch in beiden Gruppen gleich. Etheno-Addukt-Spiegel waren nicht signifikant verschieden in der A- und B-Gruppe, jedoch zeigte ein Drittel der Probanden mehr als das Doppelte der medianen Adduktwerte aller Teilnehmer. Durch Fragebögen wurde die eingenommene Menge von Antioxidantien in der Nahrung abgeschätzt und mit den Etheno-Addukt-Spiegeln in Lymphozyten korreliert. Unter den analysierten Parametern bewirkte die Einnahme von Gemüse und Vitamin E eine signifikante Reduzierung der εdA-Spiegel im Blut. Diese Ergebnisse bestätigen den protektiven Effekt von Vitamin E und Gemüseeinnahme gegen oxidativen Stress und durch Lipidperoxidation ausgelöste DNA-Schäden. 1.7 Erhöhte Etheno-DNA-Addukt-Spiegel und Mutationsrate in transgenen Mäusen mit verminderter G6PD-Enzymaktivität. In Zusammenarbeit mit Dr. K. Felix und Dr. S. Janz, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA. Das von G6PD-generierte NADPH spielt eine wichtige Rolle beim Schutz der Zelle gegenüber oxidativem Stress. Ein möglicher Zusammenhang mit der Auslösung von somatischen Mutationen und einer G6PDDefizienz wurde in einem transgenen Mäusestamm untersucht, der ein ‘low efficiency’ Allel der G6PD und einen Shuttle-Vektor pUR288 zum Nachweis von Mutationen trägt. Das Hirn männlicher Tiere zeigte wegen der auf 13 % erniedrigten G6PD-Aktivität deutliche Störungen des Redox-Gleichgewichtes, d.h. eine dreifache Verminderung des Verhältnisses von reduzierten zu oxidierten Glutathion. Eine Anhäufung promutagener EthenoAddukte (13-fach für εdA und 5-fach für εdC) wurde nachgewiesen, die mit einer dreifach erhöhten somatischen Mutationsrate einherging. Die Ergebnisse belegen die wichtige Schutzfunktion der G6PD in der Säugetierzelle [5]. J. Nair, R. Godschalk Neben dem Nachweis von Etheno-DNA-Addukten wurde auch eine verbesserte Methode zur quantitativen Bestimmung von O4-etT entwickelt. Unter den Dutzend verschiedener Alkylierungsprodukte in der DNA, die z.B. durch karzinogene N-Nitrosoverbindungen gebildet werden, zählt O4-etT zu den wichtigen promutagenen DNA-Läsionen, die hauptsächlich AT→GC Punktmutationen hervorrufen. Obwohl O4-etT anfänglich in relativ niedriger Ausbeute gebildet wird, reichert es sich wegen der unvollständigen DNA-Reparatur in der Zelle an und spielt deshalb in der Karzinogenese eine wichtige Rolle. Eine erhöhte Ausscheidung von ethylierten DNA-Basen wurde im Harn von Zigarettenraucher nachgewiesen. Um die Ethylierung der DNA in Zielorganen von Rauchern nachzuweisen, wurde eine 32P-PostlabellingImmunanreicherungs-Methode für O4-etT entwickelt. O4etT-3'-Monophosphat wurde synthetisiert, aufgereinigt und durch LC-MS, ESI-MS und NMR charakterisiert. Zur Validierung der Methode wurden O4-etT-Spiegel in DNA bestimmt, die zuvor mit N-Ethyl-N-Nitroso-Harnstoff in vitro behandelt wurde. Dabei wurde eine konzentrationsabhängige Bildung von O4-etT nachgewiesen. Weiterhin wurde O4-etT in der DNA von alveolaren Makrophagen bestimmt, die aus dem Sputum von Rauchern isoliert wurden. Das Addukt wurde in zwei der vier Raucher nachgewiesen, nicht aber in Nichtrauchern gefunden. Da O4-etT in der DNA schlecht repariert wird, ist diese Verbindung geeignet, um durch Biomonitoring Tabakrauch-assoziierte DNA-Schäden nachzuweisen. Wie gezeigt, besitzt unsere neu entwickelte Methode eine genügend hohe Nachweisempfindlichkeit und Spezifität, um O4-etT in Surrogatzellen von Zigarettenrauchern nachzuweisen. Lungengewebe von Rauchern (Operationsmaterial) wird derzeitig auf den Gehalt von O4-etT in der DNA untersucht [7]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bartsch, H., Nair, J.: New DNA-based biomarkers for oxidative stress and cancer chemoprevention studies. European Journal of Cancer 36 (2000) 1229-1234. [2] Bartsch, H., *Phillips, D.H., Nair, J., *Hewer, A., *MeybergSolomeyer, G., *Grischke, E.M.: Lack of evidence for tamoxifenand toremifene-DNA adducts in lymphocytes of treated patients. Carcinogenesis 21 (2000) 845-847. [3] Bartsch, H., Nair, J.: Ultrasensitive and specific detection methods for exocylic DNA adducts: markers for lipid peroxidation and oxidative stress. Toxicology 153 (2000) 105-114. [4] Bartsch, H., Nair, J., Owen, R.W.: Dietary polyunsaturated fatty acids and cancers of the breast and colorectum: emerging evidence for their role as risk modifiers. Carcinogenesis 20 (1999) 2209-2218. [5] *Felix, K., *Rockwood, L.D., *Pretsch, W., Nair, J., Bartsch, H., *Bornkamm, G.-W., *Janz, S.: Moderate g6pd deficiency increases mutation rates in the brain of mice. Free Radical Biology & Medicine 32 (2002) 663-673. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [6] *Freese, R., *Basu, S., *Hietanen, E., Nair, J., *Nakachi, K., Bartsch, H., Mutanen, M.: Green tea extract decreases plasma malondialdehyde concentration but does not affect other indicators of oxidative stress, nitric oxide production, or hemostatic factors during a high-linoleic acid diet in healthy females. European Journal of Nutrition 38 (1999) 149-157. [7] Godschalk, R.W.L., Nair, J., Kliem, C., Wiessler, M., *Bouvier, G., Bartsch, H.: Modified immuno-enriched 32P-HPLC assay for the detection of O4-ethylthymidine in human biomonitoring studies. Chemical Research in Toxicology 15 (2002) 433-437. [8] Hagenlocher, T., Nair, J., Becker, N., Korfmann. A., Bartsch, H.: Influence of Dietary Fatty Acid, Vegetable, and Vitamin Intake on Etheno-DNA Adducts in White Blood Cells of Healthy Female Volunteers: A Pilot Study. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 10 (2001) 1187-1191. [9] *Hanaoka, T., Nair, J., *Takahashi, Y., *Sasaki, S., Bartsch, H., *Tsugane, S.: Urinary excretion of 1, N6-ethenodeoxyadenosine, a marker of oxidative DNA damage in postmenopousal Japanese women participating in a dietary intervention trial in Northern Japan. International Journal of Cancer (2002) in press. [10] *Marrogi, A.J., *Khan, M.A., *van Gijssel, H.E., *Welsh, J.A., *Rahim, H., *Demetris, A.J., *Kowdley, K.V., *Hussain, S.P., Nair, J., Bartsch, H., *Okby, N., *Poirier, M.C., *Ishak, K.G., *Harris, C.C.: Oxidative Stress and p53 Mutations in the Carcinogenesis of Iron Overload-Associated Hepatocellular Carcinoma. Journal of the National Cancer Institute 93 (2001) 1652-1655. [11] Nair, J.: Lipid peroxidation-induced etheno-DNA adducts in humans. In: Exocyclic DNA adducts in Mutagenesis and Carcinogenesis, B. Singer & H.Bartsch (Eds) IARC Sci Publ. 1999; (150):55-61.IARC, Lyon, France. [12] Nair, J., Fürstenberger, G., *Burger, F., Marks, F., Bartsch, H.: Promutagenic etheno-DNA adducts in multistage mouse skin carcinogenesis: correlation with lipoxygenase-catalyzed arachidonic acid metabolism. Chemical Research in Toxicology 13 (2000) 703-709. [13] *Navasumrit, P., *Ward, T.H., *O’Connor, P.J., Nair, J., Frank, N., Bartsch, H.: Ethanol enhances the formation of endogenously and exogenously derived adducts in rat hepatic DNA. Mutatation Research 479 (2001) 81-94. [14] Schmid, K., Nair, J., *Winde, G., *Velic, I., Bartsch, H.: Increased levels of promutagenic etheno-DNA adducts in colonic polyps of FAP patients. International Journal of Cancer 87 (2000) 1-4. [15] Yang, Y., Nair, J., *Barbin, A., Bartsch, H.: Immunohistochemical detection of 1,N6-ethenodeoxyadenosine, a promutagenic DNA adduct, in liver of rats exposed to vinyl chloride or an iron overload. Carcinogenesis 21 (2000) 777-781. Klinische Interventionsstudien (C0207) B. Spiegelhalder, R.W. Owen 1. Interventionsstudien zur Ernährung und Kolorektalkrebs R.W. Owen, G. Würtele, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit Jürgen Wahrendorf (Umweltepidemiologie, DKFZ) Björn Hofstad, Morten Vatn (Rikshospitalet, The National Hospital, Medical Department A, Oslo, Norwegen), Claire Bonithon-Kopp, Jean Faivre (ECP Colon Cancer Working Group, Registre des Tumeurs Digestives de la Cote-d´Or, Faculté de Medicine, Dijon, Frankreich. Einem hohen Gehalt an Kalzium (Owen 1998 In: Recent Results in Cancer Research Vol 146 195-213) und/oder Ballaststoffen (Hill et al. 1997 European Journal of Cancer Prevention 6 512-514) in der Nahrung wird eine Schutzwirkung gegen Kolorektalkrebs zugeschrieben. Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Die Art Wirkmechanismen werden die Chelatbildung (Kalzium) und Verdünnung (Ballaststoffe) von potentiell cokarzinogenen Lipiden im Darm angesehen. Um diese Hypothese zu testen, wurden eine Reihe von Interventionsstudien bei Adenompatienten initiiert. In einer Pilotstudie zu Plazebo-Kalzium kontrollierten Intervention (35 Patienten) wurde keine Reduzierung der Darmzellproliferation gefunden (Weisgerber et al. 1996 Gut 38 396402.). In einer weiteren etwas größeren Studie zur Intervention mit Kalzium und Antioxidantien wurde ein geringer nicht signifikanter Hemmeffekt des Adenomwachstums in-situ registriert, wohl aber war die Neubildung von Adenomen signifikant inhibiert (Hofstad et al. 1998 Digestion 59 148-156.). Weiter wurde in Zusammenarbeit mit der ECP (European Agency for Cancer Prevention) eine gesamteuropäische (10 Länder) Langzeit (3 Jahre) kontrollierte Kalzium-Ballaststoff (Fybogel) Intervention mit Placebokontrolle bei insgesamt 665 Patienten mit sporadischen Adenomen durchgeführt und abgeschlossen. Am DKFZ wurden (1997 - 1998) Stuhlproben von 1003 Patienten (jeweils vor und nach der Intervention) auf Lipid- und Mineralstoffgehalt untersucht. Das Verhältnis zwischen Ernährung, Zellproliferation, Adenomrezidivierung, Lipid- und Mineralstoffspiegel im Darm, Antioxidantienstatus und der Wirkung der Intervention auf diese Werte wurden ausgewertet und veröffentlicht. Die klinischen Ergebnisse [1] zeigten, dass die Kalziumintervention einen geringen jedoch nicht signifikanten präventiven Effekt auf die Adenomrezidivierung ausübte. Der Effekt war jedoch statistisch signifikant in Patienten, deren tägliche Einnahme von Kalzium niedrig lag. Überraschenderweise hatte die Intervention mit Ballaststoffen zur Folge, dass die Adenomrezidivierung signifikant erhöht wurde. Dies war besonders in männlichen Teilnehmern aus Skandinavien sichtbar. Außerdem zeigte die Ballaststoff-Intervention eine deutlich dosisabhängige interaktive Wechselwirkung mit der Kalziumaufnahme in der Nahrung. Die Hypothese, dass Gallensäuren in der Adenom-Karzinom-Sequenz eine Rolle spielen, wurde durch keine dieser Studien unterstützt. Jedoch werden die Gesamtdaten der ECP-Studie derzeitig noch einmal sorgfältig statistisch analysiert. 2. Phenol- und Lipidkomponenten und ihre Vorstufen in Speiseölen als mögliche protektive Faktoren gegen Kolorektal- und Brustkrebs R.W. Owen, R. Haubner, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit William E. Hull (Abteilung Zentrale Spektroskopie, DKFZ), Attilio Giacosa (Istituto Nazionale per la ricerca sul cancro, Istituto scientifico per lo studio e la cura del tumori, 16132 Genova, Italien), Petcharin Srivatanakul (National Cancer Institute, Bangkok, Thailand). 2.1 Oliven und Olivenöl Die mediterrane Ernährung wird mit einer geringen Inzidenzrate bei verschiedenen Erkrankungen, vor allem Kolorektal- und Brustkrebs, assoziiert. Als Hauptursache dafür wird der Verzehr von Olivenöl angesehen, das zu mehr als 70 % aus Ölsäure (n9), einer einfach gesättigten, langkettigen Fettsäure besteht und eine Reihe von Phenolen erhält. Da die vermehrte Aufnahme von DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 127 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 128 mehrfach ungesättigten, langkettigen Fettsäuren (n6) mit einem Brustkrebsrisiko in Verbindung gebracht wird [2], (Nair et al. 1997 Biomarkers and Prevention 6 597-601) und um zu verstehen, warum Olivenöl gegenüber anderen Ölen eine bessere Schutzwirkung hat, wurden unterschiedliche italienische Oliven- und Speiseöle (n = 30) auf ihren Gehalt an phenolischen Antioxidantien und Lipiden untersucht. Extraktions-, GLC- und HPLC-Protokolle wurden für den Nachweis und die Auftrennung der Lipid- und Phenolkomponenten optimiert. Mittels MS und NMRS wurde eine Reihe wichtiger Antioxidantien identifiziert: Squalen, einfache Phenole, Secoiride, Lignane und Flavonoide [3-6]. Der Nachweis und die strukturelle Charakterisierung von Lignanen und Flavonoide im Olivenöl gelang zum ersten Mal. Die Untersuchungen wurden auf den Antioxidantiengehalt von Oliven ausgeweitet. Schwarze und grüne Oliven enthalten sehr hohe Konzentration (10 - 20 fach höher als extra-virgin Olivenöl) an diesen Substanzen, womit sie bei Verzehr zur gesundheitsfördernden Wirkung der mediterranen Ernährung beitragen könnten. Die einzelnen aus Olivenöl extrahierten und isolierten Phenole weisen starke antioxidative Wirkung auf, vergleichbar mit dem klassischen Antioxidant Vitamin E. Diese Ergebnisse sollten nicht nur bei chemopräventiven Maßnahmen sondern auch in zukünftigen epidemiologischen Studien Berücksichtigung finden, wobei nicht nur die Art und Zusammensetzung der Öle von Bedeutung sind, sondern auch die Häufigkeit des Verzehrs von Oliven. Unsere Untersuchungen werden derzeitig auf Olivenöle/Oliven aus weiteren Mittelmeerländern ausgedehnt. 2.2 Palm-, Sesam- und Sojabohnenöl aus Thailand im Vergleich zu anderen Speiseölen Neben der mediterranen Ernährung in Europa dürfte auch die Ernährungsweise in fernöstlichen Ländern zur Aufnahme von Antioxidantien führen, die nicht in typischen westlichen Nahrungsmitteln enthalten sind. Als Beispiel hierfür ist Thailand, welches eine extrem niedrige Inzidenz an Kolorektal- und Brustkrebs aufweist. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Zusammenarbeit zwischen dem DKFZ und dem National Cancer Institute, Bangkok etabliert. Unterschiedliche (n = 20) Speiseöle uns Thailand wurden untersucht und dabei die gleichen Analysemethode wie für Olivenöl angewandt. Nicht raffiniertes Palmöl enthielt erhebliche Mengen an antioxidativen Phenolsäuren, z.B. 3,4Dihydroxybenzoessäure, Vanillinsäure und pCoumarinsäure. Im Gegensatz enthielten die raffinierten Palmöle (n = 6) keine dieser phenolischen Säuren sondern erhebliche Mengen an wahrscheinlich synthetischen Antioxidantien. Durch GC/MS- und NMRS-Analysen wurde die Substanz als Butyldihydroxyanisol (BDHA) identifiziert. Untersuchungen sind im Gange, um die Frage zu klären, ob diese Substanz zugesetzt wurde oder während der Ölraffinierung entsteht. Unter den anderen untersuchten Speiseölen war Sesamöl besonders reich an nicht polaren antioxidativ wirkenden Phenolen, z.B. Sesamin und Sesamolin, die in Konzentrationen von 2 g pro kg nachgewiesen wurden. Vorstufen, die in Sesamsamen vorkommen, sind eine komplexe Mischung von Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Glykosiden, Sesaminol und Pinoresinol sowie weiteren polyphenolischen Substanzen. Diese Substanzklassen von Antioxidantien wurden jedoch nicht in Ölen aus Sojabohnen, Sonnenblumen, Mais und Erdnüssen gefunden. Derzeitig werden genügend Substanzmengen auf die neu identifizierten Antioxidantien isoliert, die dann in Screening-Tests auf ihr krebsvorbeugendes Potential untersucht werden (in Zusammenarbeit mit C. Gerhäuser und P. Schmezer). 2.3 Leinsamen und Leinöl bezüglich des Vorkommens von Lignanen im Säugetier-Organismus Lignane werden im Säugetier-Organismus im Darm durch bakterielle Verstoffwechslung von Vorstufen aus der Nahrung gebildet. Ihnen wird eine Schutzwirkung gegen Brustkrebs zugeschrieben, da sie eine ähnliche Struktur wie das Tamoxifen aufweisen. Diese so im Körper bebildeten Lignane wurden als Enterodiol (ENND) und Enterolacton (ENNL) identifiziert und ihre hauptsächlichen Vorstufen sind Secoisolariciresinol-Diglucosid (SDG), das als Hauptkomponente in einem komplexen, phenolischen, polymeren Gemisch (CPP) in Leinsamen vorkommt. Leinöl im Gegensatz zu Oliven- und Sesamöl enthält dagegen sehr niedrige SDG-Spiegel, da die polymere CPP-Fraktion in Öl unlöslich ist. Wir haben die polymere CPP-Fraktion jetzt untersucht und eine Anzahl von Phenolsäuren sowie weitere Substanzen, die darin enthalten sind, charakterisiert. Nach Isolierung genügender Mengen werden in in vitro Testsystemen die Substanzen auf ihr chemopräventives Potential untersucht. 3. Phenole in humanen Stuhlproben Viele der Substanzen, die aus verschiedenen Speiseölen und ihren Vorstufen isoliert wurden, sind Glykoside. Da käuflichen Enzyme nur sehr schlecht die phenolischen Glykoside spalten, haben wir eine neue Methode entwikkelt, wobei die im Stuhl vorkommenden Glykosylasen eingesetzt werden, um z.B. das Monoglykosid des Secoisolariciresinols innerhalb von drei Stunden abzuspalten. Diese neue Methode wurde auf Stuhlproben aus der ECP-Kalzium-/Ballaststoffinterventionsstudie angewandt und erlaubte die phenolischen Antioxidantien quantitativ zu bestimmen, wobei 30 verschiedene Substanzen dieser Klasse mit Hilfe von GC/MS und ESI-LC/MS identifiziert wurden. Die neue Methode wird jetzt auf Proben, die aus drei Ländern der ECP-Studie - Dänemark, Deutschland, Italien - stammen, die einen Nord-Süd-Gradienten bei der Krebshäufigkeit darstellen, angewandt. Bereits in einer Pilotstudie wurde ein bemerkenswerter Zusammenhang zwischen dem Vorkommen dieser phenolischen Antioxidantien in Stuhlproben und der Inzidenz von Brust- und Kolorektalkrebs gefunden. Eine größere Studie ist in Planung. 4. Fermentationsstudien R.W. Owen, B. Spiegelhalder Die Bildung von Lignanen im Säugetierorganismus aus Leinsamen wurde 1980 vorgeschlagen, aber die genauen Bildungsmechanismen waren nicht bekannt. Nach der Isolierung mehrerer Gramm SDG wurden anaerobe Fermentationsexperimente von uns durchgeführt. Nach DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention anaerober Inkubation bei 37° für 72 Stunden in Gegenwart von 1 % Fäkalmatrix, Aufarbeitung der verschiedenen Fraktionen, konnten in der Tat mehrere Metaboliten durch GC/MS und ESI-LC/MS charakterisiert werden [7]. Die Strukturen konnten durch NMR bestätigt werden und somit Umwandlung von SDG durch die fäkale Mikroflora in Säugetier-Lignanen vollständig aufgeklärt werden. Da nun genügende Mengen dieser Substanzen aufbereitet werden können, werden sie auf ihr krebsvorbeugendes Potential untersucht. Weiterhin wurde der Metabolismus von Lignanen aus Olivenöl, Sesamöl und Sesamsamen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese ölspezifischen Lignane ebenfalls durch die fäkale Mikroflora in die Säugetier-Lignane ENND und ENNL verstoffwechselt werden [8]. Diese neuen Befunde erklären, warum immer höhere Ausbeuten an SäugetierLignanen im Darm gefunden wurden, als die durch die Einnahme von SDG erwartete Menge. Bei diesen Untersuchungen wurden auch neue Lignan-Vorstufen entdeckt, deren Strukturaufklärung im Gange ist. 5. Antioxidantien-Gehalt von Rotwein R.W. Owen, G. Würtele, B. Spiegelhalder Das Vorkommen verschiedener Klassen von Antioxidantien in Rotwein ist gut untersucht und verschiedene Klassen dieser Stoffe wurden bisher identifiziert. Es wurde beobachtet, dass Probanden, die kein Olivenöl konsumierten, dennoch nachweisbare Mengen an Tyrosol und Hydroxytyrosol im Stuhl ausschieden. Wegen der Annahme, dass diese Substanzen aus Getränken stammen, wurde eine ausführliche Analyse phenolischer Antioxidantien in grünem und schwarzem Tee und Rotwein durchgeführt. Das Spektrum der Antioxidantien in Tee war mit dem bereits publizierten identisch, jedoch enthielt Rotwein erhebliche Mengen an Hydroxytyrosol sowie weitere Komponenten, die bisher nicht im Rotwein beschrieben wurden. Die Antioxidantien wurden durch chromatografische Verfahren getrennt und massenspektrometrisch identifiziert. Mit Hilfe einer Reihe von neu etablierten LC/MSD-Progammen können wir das Antioxidantienprofil von Weinproben durch eine direkte Injektion von etwa 20 µl Wein erhalten. Bis heute wurden über 50 antioxidative Substanzen in Rotwein nachgewiesen und identifiziert. Unsere neue Analysenmethode erlaubt einen schnellen Vergleich der Antioxidantienkapazität von Wein, z.B. in Chemopräventionsstudien. 6. Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) in der Krebsentstehung R.W. Owen, G. Würtele, B. Spiegelhalder Für die zuverlässige Bestimmung von Phytat (phytic acid = PA) und ROS in human Stuhlproben wurden HPLC-Methoden entwickelt (Owen et al. 1996 Gut 38 591-597; Owen et al. 1996 European Journal of Cancer Prevention 5 233-240; Owen et al. 1997 Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 12 (Supplement 1) 2; Owen et al. 1998 European Journal of Cancer Prevention 7 (suppl 2) S41-S54). Mit einer verbesserten HPLC-Methode konnte Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren gezeigt werden, dass die ROS-Bildung in Stuhlproben nicht mit der vorhandenen Darmflora korreliert [9]. Die ROS-Bildung wird viel mehr durch eine lösliche Komponente im Stuhl ausgelöst. In laufenden Studien soll deren Struktur identifiziert werden. In einem optimierten Testsystem werden erneut die bisherigen sowie neue ECPProben untersucht, um zu sehen, ob PA, Eisen und ROS alleine oder in Kombination eine Rolle bei der Kolonkarzinogenese spielen. Diese Daten werden gerade ausgewertet. 7. Reaktive Sauerstoffradikale und Magenkrebs R.W. Owen, G. Würtele, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit Heinrich Bauer (Abteilung Molekulare Toxikologie, DKFZ), Jochen Rudi (Abteilung für Gastroenterologie, Krehl Klinik, Heidelberg). Infektion durch Helicobacter pylori ist einer der Risikofaktoren für die Auslösung der Magenkarzinogenese, wobei die molekularen Mechanismen noch unbekannt sind. Deshalb wurde in einer Pilotstudie die mögliche Rolle von ROS bei der Magenkarzinogenese untersucht und zwar mit der möglichen Bildung von ROS im Magensaft bei Patienten mit Magendysplasien mit und ohne Helicobacter pylori Infektion. Magensaftproben von 31 Patienten mit oder ohne Gastritis wurden untersucht. ROS-Bildung wurde durch die radikale Hydroxylierung von Salizylsäure gemessen und das Reaktionsprodukt, die Dihydroxybenzoesäure, durch HPLC bestimmt. Magensaftproben von 20 (64,5 %) Patienten mit chronischer H. pylori Gastritis zeigten deutlich erhöhte ROSKonzentrationen, wenn sie mit den 8 Gastritis-Patienten (21,6 %) ohne H. pylori Infektion verglichen wurden. Damit wurde weiter bestätigt, dass Infektion mit H. pylori mit einer höheren Rate von ROS-Bildung einhergeht, wobei dieser oxidative Stress zur Tumorbildung im Magen beiträgt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Inkubation von H. pylori mit einer Magenkarzinom-Zelllinie AGS den Methylierungsstatus des p53-Gens erhöht, wobei methylierte CpG-Sequenzen in verschiedenen Introns und Exons nachgewiesen wurden[10]. 8. Einfluss von Lignanen auf oxidativen Stress Eine Interventionsstudie in premenopausalen Frauen mit erhöhtem familiären Brustkrebsrisiko R.W. Owen, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit Ulrike Knust, Karl H. Adzerson, F Beldmann, G Bastert (Frauenklinik der Universität Heidelberg, Abteilung für Allgemeine Frauenheilkunde und Geburtshilfe). Das Ziel dieser Interventionsstudie sind Untersuchungen, wie Leinsamen- und Gemüseverzehr die Spiegel von Lignanen im Serum und Harn beeinflussen und dadurch Lipidperoxidation und oxidativen Stress abhängige Biomarker in vivo verändern können. Jeder Arm dieser Interventionsstudie umfasst je 20 Teilnehmer mit einem hohen bzw. niedrigen Leinsamen- und Gemüsekonsum. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 129 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Die pre- und postmenopausalen Probanden (25 - 55 Jahre) kommen aus Familien, wo bei der Mutter oder Schwester Brustkrebs diagnostiziert wurde. Bestimmt werden im Serum oder Plasma die Enterolignan-Spiegel (direkt durch ESI-LC/MS), Vitamin E und C, Folsäure und Karotinoide (mit einem cross-over design). Die biochemischen Ergebnisse werden dann mit den Daten aus Food Frequency Fragebögen verglichen. Die Studie wird Ende 2002 abgeschlossen sein. 9. Phenolische Antioxidantien in thailändischen Früchten R.W. Owen, R. Haubner, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit William E. Hull (Abteilung Zentrale Spektroskopie, DKFZ), Attilio Giacosa (Istituto Nazionale per la ricerca sul cancro, Istituto scientifico per lo studio e la cura del tumori, Genova, Italien), Yuttana Sudjoereen, Supranee Chambumrung (Mahidol University , Bangkok, Thailand). 130 Die von uns entwickelten analytischen Methoden (s. 2.1) wurden benutzt, um den Gehalt an phenolischen Antioxidantien in Früchten aus Thailand (in nicht verwertbaren Abfallprodukten) zu untersuchen. Erste Ergebnisse zeigen eine Fülle von verschiedenen phenolischen Substanzen in einigen der untersuchten Früchte, während andere keine dieser Stoffe enthielten. Die Strukturaufklärung der neu entdeckten Antioxidantien ist im Gange. 10. Antioxidantien und Lipidkomponenten im Arganöl aus Marokko R.W. Owen, R. Haubner, G. Würtele, B. Spiegelhalder In Zusammenarbeit mit F. Khallouki, C. Younos, T. Oster (Laboratoire D´Ingénierie Moléculaire et de Biochimie Pharmalogique, Université de Metz, Frankreich), Z. Charrouf (Département de Chimie, Faculté des Sciences, Université Mohammed V, Rabat, Marokko). Drei Sorten von Arganöl wurden auf den Gehalt von Fettsäuren, Tocopherolen, Squalenen, Sterolen und phenolischen Antioxidantien untersucht und die Ergebnisse mit den Werten in ‘extra-virgin’ Olivenöl und Sonnenblumenöl verglichen. Das Profil der Fettsäuren in den Arganölen war ähnlich mit Vorkommen an Ölsäure (43 %) und Linolsäure (36 %). Als hauptsächliches Vitamin wurde γTocopherol (483 mg pro kg) identifiziert, im Gegensatz zu α-Tocopherol, dass hauptsächlich im Olivenöl (190 mg pro kg) und Sonnenblumenöl (532 mg pro kg) vorkommt. Der Squalen-Gehalt von Arganölen war gleich und betrug etwa 313 mg pro 100 g, der niedriger liegt, als bei Olivenöl (499 mg pro 100 g), aber signifikant höher als in Sonnenblumenöl (6 mg pro 100 g). Während β-Sitosterol hauptsächlich in Oliven- und Sonnenblumenöl vorkommt, wurde in den Arganölen Schottenol (147 mg pro kg) und Spinasterol (122 mg pro kg) gefunden. Im Vergleich zu ‘extra-virgin’ Olivenölen (793 mg pro kg) war die Konzentration an gesamtphenolischen Verbindungen in Arganöl extrem niedrig (weniger als 5 mg pro kg). Trotzdem ist anzunehmen, dass Arganöl mit seinem hohen Gehalt an γ-Tocopherol, Squalen und Ölsäure eine protektive Funktion in der marokkanischen Ernährung spielt. Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren 11. Einfluss von Übungsprogrammen mäßiger und geringer Intensität auf oxidativen Stress, DNA-Schäden und Reparaturmechanismen bei Patienten mit kolorektalen Tumoren R.W. Owen, J. Nair, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit H. Allgayer, Abteilung Onkologie, Rehabilitation Klinik Ob der Tauber der LVA Württemberg, Bad Mergentheim). Das Ziel dieser Studie ist es, mit einem randomisierten, kontrollierten und prospektiven Design, den Effekt eines 3 - 4 wöchigen Übungsprogramms mit mäßiger Intensität mit einer geringeren Intensität bei Patienten mit Kolon-/Rektumtumoren nach Operationen, Strahlenbehandlung und Chemotherapie zu vergleichen. Dies im Hinblick auf mögliche Veränderungen von Biomarkern, die oxidative DNA-Veränderungen und individuelles Stressniveau aufzeigen. Dabei wird die Hypothese verfolgt, dass mäßig intensive körperliche Aktivität im Vergleich zu weniger intensiven mit einer signifikanten Erniedrigung dieser oxidativen Stress-Biomarker einhergeht. Sollte die Annahme zutreffen, soll die Pilotstudie zu einer anschließend prospektiven multizentrischen Langzeitstudie ausgeweitet werden, die den Einfluss mäßiger und wenig intensiver Übungsprogamme im Hinblick auf klinische Verlaufsparameter (Lebensqualität, Auftreten von Rezidiven, Metastasen, Tumoren) verglichen werden. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] *Bonithon-Kopp, C., *Kronborg, O., *Giacosa, A., *Räth, U., *Faivre, J. [Experts:- *Milan, C., *Fenger, C., *Piard, F., *Belghiti C., Owen, R. W., *Pignatelli, M.].: Calcium and fibre supplementation in the prevention of colorectal adenoma recurrence: a placebocontrolled intervention trial from the European Cancer Prevention Organisation (ECP). Lancet 356 (2000) 1300-1306. [2] Bartsch, H., Nair, J., Owen, R.W.: Dietary polyunsaturated fatty acids and cancers of the breast and colorectum: emerging evidence for their role as risk modifiers. Carcinogenesis 20 (1999) 2209-2218. [3] Owen, R.W., *Mier, W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: (2000a). Phenoilic compounds and squalene in oilive oils: the concentration and antioxidant potential of total phenols, simple phenols, secoiridoids, lignans and squalene. Food and Chemical Toxicology 38, 647-659. [4] Owen, R.W., *Mier, W., Hull, W.E., *Giacosa, A., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: (2000b). Identification of lignans as major components in the phenolic fraction of olive oil. Clinical Chemistry 46, 976-988. [5] Owen, R.W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. European Journal of Cancer 36 (2000c) 1235-1247. [6] Owen, R.W., *Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Würtele, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Olive oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncology 1 (2000d) 107-112. [7] Owen, R.W., Haubner, R., Hull, W.E., *Thompson, L.U., Spiegelhalder, B.,Bartsch, H.: Complete pathway of mammalian lignan formation from secoisolariciresinol diglucoside. Whole Grain and Human Health, VTT Symposium 213 (2001) 81-84. [8] Owen, R.W., Würtele, G., Haubner, R., Hull, W.E., *Giacosa, A., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Formation of the mammalian lignans enterodiol and enterolactone from (+)-pinoresinol, a major lignan present in olive oil. Whole Grain and Human Health, VTT Symposium 213 (2001) 85-88. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention [9] Owen, R.W., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Generation of reactive oxygen species by the faecal matrix. Gut 46 (2000) 225-232. [10] *Rudi, J., *Bruchhausen B., *Kuck D., *Stremmel, W., *von Herbay, A., Bauer, H., Berger, M., Owen, R.W.: Reactive oxygen species analysis in human gastritis patients and p53 methylation analysis in gastric tumor cell line ags infected by Helicobacter pylori. Adv Exp Med Biol 500 (2001) 199-202. [13] Owen R.W.: The role of nutritional factors: colon cancer. In: Carcinogenic and anticarcinogenic factors in food (G. Eisenbrand, A.D. Dayan, P.S. Elias, W. Grunow, J. Schlatter Eds), DFG, Wiley-VCH (2000) 43-75. [3] *Fadden, K., *Hill, M.J., *Latymer, E., *Low, G., Owen, R.W.: Steroid metabolism along the gastrointestinal tract of the pig. European Journal of Cancer Prevention 8 (1999) 35-40. [4] *Haines, A., *Hill, M.J., *Thompson, M.H., Owen, R.W., *Williams, R.E.O., *Meade, T.W., *Wilkes, H.: A prospective study of faecal bile acids and colorectal cancer. European Journal of Cancer Prevention 9 (2000) 317-323. [7] Owen, R.W.: Biomarkers in colorectal cancer. In: Biomarkers in cancer chemoprevention (A.B. Miller, H. Bartsch, L. Dragsted, H. Vainio). IARC Scientific Publications No 154 (2001) 101-112. Genetische Suszeptibilitätsmarker bei der Entstehung von Lungenkrebs A. Risch, H. Wikman, H. Dally, S. Thiel, K. Gassner, P. Schmezer, N. Rajaee-Behbahani, B. Spiegelhalder, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. P. Drings, Prof. Dr. H. Dienemann, Prof. Dr. Dr. K. Kayser, Prof. Dr. V. Schulz, PD Dr. J.R. Fischer Thoraxklinik, Heidelberg, Dr. L. Edler, DKFZ- Biostatistik, Dr. F. Klimek, DKFZ-Abtl. Tumorvirus-Charakterisierung. Zusatzfinanzierung: Stipendien: Marie-Curie Programm der EU; Projekt- und Personalmittel: Deutsche Krebshilfe, Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.V.) Genetische Enzympolymorphismen, aus denen sich ein veränderter Phänotyp ergibt, können ein erhöhtes Risiko für bestimmte schadstoffbedingte Krebsarten zur Folge haben [1]. Die Bedeutung genetischer Polymorphismen in Phase I- und Phase II-Enzymen bei der Entstehung von Lungenkrebs wird im Rahmen einer FallKontrollstudie untersucht. Blutproben und Angaben zur Schadstoffexposition von über 1200 Personen (Patienten mit primärem Bronchialkarzinom bzw. Krankenhauskontrollen ohne Malignom) konnten bisher archiviert werden. Gewebeproben, zur späteren Korrelation der Ergebnisse mit weiteren Biomarkern wie z.B. Adduktspiegel [7] wurden ebenfalls archiviert. Analysen der Genotypdaten für über 700 Probanden zeigten, dass für sowohl für Glutathiontransferasen (GSTM1, GSTM3, GSTT1, GSTP1) [8] als auch für N-Acetyltransferasen 1 und 2 (NAT1, NAT2) [6] im Zusammenhang mit einer Beeinflussung der Empfindlichkeit gegenüber Tabakkarzinogenen die verschiedenen histologischen Typen des Bronchialkarzinoms getrennt betrachtet werden müssen, da sie sich in ihrer Ätiologie unterscheiden. Genotypisierungsdaten für weitere schadstoffmetabolisierende Enzyme, die im Zusammenhang mit Zigarettenrauch-induziertem Lungenkrebs von Interesse sind, werden derzeit ausgewertet (u.a. CYP1B1, Myeloperoxidase) und verschiedene genetische Polymorphismen werden noch untersucht. Genotypisierung für das reparaturrelevante hOGG1 Gen Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren zeigte kein erhöhtes Lungenkrebsrisiko für Träger varianter hOGG1 Allele bei Kaukasiern. In weiteren Untersuchungen an mikrodissektierten Lungengewebeproben konnte gezeigt werden, dass dieses auf 3p21 lokalisierte Gen häufig ‚loss of heterozygosity’ (LOH) aufwies, bevorzugter Verlust eines bestimmten Allels wurde jedoch nicht beobachtet [3]. Die Analyse der DNA-Reparaturkapazität in Lymphozyten von Fall- und Kontrollpatienten weist auf eine eingeschränkte DNA Reparaturkapazität bei Lungenkrebspatienten im Vergleich zu Krankenhauskontrollen hin [4,5]. Ein Projektziel ist die Erstellung eines Markerprofils, welches die Identifikation von Individuen mit erhöhtem Lungenkrebsrisiko erlaubt. Ferner werden zur Bestimmung der möglichen Relevanz genetischer Polymorphismen bei der Chemotherapiesensitivität und für die Prognose von Bronchialkarzinompatienten derzeit weiterhin Probanden rekrutiert und klinische Daten erfasst. Die Entwicklung neuer Genotypisierungsmethoden und Identifikation neuer Allele A. Risch, H. Dally, B. Spiegelhalder, H. Bartsch Zusatzfinanzierung: Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.V.) Zur Durchführung großer Fall-Kontrollstudien sind neue Genotypisierungsmethoden notwendig, die einen höheren Probendurchsatz als herkömmliche PCR/RFLP-basierte Methoden erlauben. Genotypisierungsmethoden auf der Basis von Fluoreszenz-basierter Schmelzkurvenanalyse wurde für verschiedene bekannte Polymorphismen wie z.B. in N-Acetyltransferasen [3], Glutathiontransferasen und Myeloperoxidase entwickelt. Weiterhin werden Methoden zur Identifizierung bisher nicht bekannter genetischer Polymorphismen etabliert. Zigarettenrauch und genetische Polymorphismen als Risikomarker für Brustkrebs A. Risch, B. Spiegelhalder, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit PD Dr. J. Chang-Claude, S. Kropp, DKFZ, Abtl. Klin. Epidemiologie Zusatzfinanzierung: Deutsche Krebshilfe, Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.V.) Der langsame NAT2-Acetyliererstatus ist bei Raucherinnen als ein Risikofaktor für die Brustkrebsentstehung identifiziert worden [Ambrosone et al, JAMA 276 (1996): 1494]. Allerdings ist Rauchen als ätiologischer Faktor bei der Brustkrebsentstehung umstritten. Aus Blasenkrebsstudien ergibt sich, dass der Genotyp bei niedriger Schadstoffdosis besonders wichtig für das individuelle Risiko sein kann. Im Rahmen dieser Kooperation wird diese Hypothese für Brustkrebspatientinnen getestet. Beim separaten Vergleich von Aktiv- und Passivraucherinnen mit nicht Tabakrauch-exponierten Frauen waren die Brustkrebsrisiken unterschiedlich bezüglich NAT2 Status. Ein signifikant erhöhtes Risiko ergab sich bei langsamen Acetylierenden für das Rauchen von mehr als 10 Packyears, OR 1.8 (1-3.2), jedoch nicht für schnell Acetylierende. Andererseits war der Zusammenhang zwischen Passivrauchen und erhöhtem Brustkrebsrisiko DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 131 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention stärker bei schnell als bei langsam Acetylierenden (OR 1.9 (0.9-3.9) bzw. OR 1.2 (0.7-2.1)). Es wird deutlich, dass bei Studien zu Gen-Umweltinteraktion zwischen Aktiv-, Passiv- und Nichtrauchern unterschieden werden muss. Neben der unterschiedlichen Gesamtschadstoffdosis beim Aktiv- und Passivrauchen könnten auch Unterschiede in der Zusammensetzung des ‚mainstream’ und ‚side-stream’ Tabakrauchs das Gen-Umweltinteraktionsbedingte Krebsrisiko beinflussen. Die Relevanz von Enzympolymorphismen bei der Entstehung von Larynxkarzinomen A. Risch, V. Raedts, P. Schmezer, N. Rajaee-Behbahani, H. Bartsch 132 In Zusammenarbeit mit Dr. H. Ramroth, DKFZ-Abtl. Klin. Epidemiologie, Prof. Dr. H. Becher, Institut für Tropen-Hygiene, Univ. Heidelberg, OA Dr. med. habil. A. Dietz, Kopfklinik Heidelberg. Zusatzfinanzierung: Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft, Forschung und Technologie; Verein zur Förderung der Krebsforschung in Deutschland (e.V.) Im Rahmen einer populationsbasierten Fall-Kontroll-Studie zur Ätiologie von Larynxkarzinomen werden mögliche Gen-Umweltinteraktionen untersucht. Beim Vergleich von je rund 250 Fällen und gematchten Kontrollen wurden Alkohol- und Tabakkonsum als signifikante Risikofaktoren identifiziert. Statistische Auswertung der Genotypanalysen für Alkoholdehydrogenasen ADH 2 und 3 und Glutathiontransferasen GSTM1 und GSTT1 ergaben jedoch keine Hinweise auf eine signifikante Beeinflussung dieses Risikos durch die untersuchten ADH oder GST Genotypen. Untersuchung der möglichen Rolle von GSTM1-, GSTT1- und GSTP1- Polymorphismen als Modulatoren antioxidativer Kapazität, bei der Modifikation von Telomerenlänge und als mögliche Risikofaktoren für vaskuläre Demenz A. Risch, H. Bartsch In Zusammenarbeit mit Prof. T. von Zglinicki, Dept. of Gerontology, Institute for Health of the Elderly, Univ. of Newcastle, UK Progressive cerebrovaskuläre Atherosklerose und darauf folgender Infarkt gehören zu den am weitesten verbreiteten Ursachen für Demenz. Spezifische Risikofaktoren für vaskuläre Demenz sind allerdings bisher nicht bekannt. Die Länge humaner Telomeren nimmt in vitro mit jeder Zellteilung und in vivo mit dem Alter ab, allerdings nimmt in humanen Fibroblasten in vitro die Telomerenverkürzungsrate mit zunehmender antioxidativer Kapazität ab. In 186 älteren Personen waren Leukozytentelomere bei Patienten mit Demenz signifikant kürzer als in 3 Kontrollgruppen. Um den Einfluß möglicher genetischer Risikofaktoren zu untersuchen wurde eine zufällige Untergruppe von 75 Patienten genotypisiert. Weder Telomerenlänge noch Diagnose korrelierten mit genetischen Polymorphismen in Apolipoprotein E oder Glutathiontransferasen M1, T1 oder P1 [2]. Alle Projekte sollen zu einem besseren Verständnis der Ätiologie der verschiedenen Krankheiten beitragen und Abteilung C0200 Toxikologie und Krebsrisikofaktoren Hinweise auf einen möglichen Mechanismus der Aktivierung von pro-Karzinogenen durch den menschlichen Stoffwechsel geben. Anonymisierte Genotypisierungsdaten werden zur Beantwortung von Fragestellungen für die sehr viel größere Fallzahlen notwendig sind zusätzlich in internationaler Zusammenarbeit ausgewertet [9,10]. Die Identifikation von Hochrisikogruppen ist von Bedeutung für verschiedene präventive Ansätze z.B. im Rahmen der Grenzwertfestsetzung, gesundheitlicher Aufklärungskampagnen oder der Chemoprävention. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Bartsch, H., Nair, U., Risch, A., Rojas, M., Wikman, H., *Alexandrov, K.: Genetic Polymorphims of CYP Genes, Alone or in Combination, as a Risk Modifier of Tobacco-related Cancers. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 9 (2000) 3-28. [2] *Garte, S., *Gaspari, L., *Alexandrie, A.-K., *Ambrosone, C., *Autrup, H., *Autrup, J.L., *Baranova, H., *Bathum, L., *Benhamou, S., *Boffetta, P., *Bouchardy, C., *Breskvar, K., *Brockmöller, J., *Cascorbi, I., *Clapper, M.L., *Coutelle, C., *Daly, A., *Dell’Omo, M., *Dolzan, V., *Dresler, C.M., *Fryer, A., *Haugen, A., *Hein, D.W., *Hildesheim, A., *Hirvonen, A., *Hsieh, L.-L., *Ingelman-Sundberg, M., *Kalina, I., *Kang, D., *Kihara, M., *Kiyohara, C., *Kremers, P., *Lazarus, P., *Le Marchand, L., *Lechner, M.C., *van Lieshout, E.M.M., *London, S., *Manni, J.J., *Maugard, C.M., *Morita, S., *Nazar-Stewart, V., *Noda, K., *Oda, Y., *Parl, F.F., *Pastorelli, R., *Persson, I., *Peters, W.H.M., *Rannug, A., *Rebbeck, T., Risch, A., *Roelandt, L., *Romkes, M., *Ryberg, D., *Schoket, B., *Seidegard, J., *Shields, P., *Sim, E., *Sinnet, D., *Strange, R.C., *Stucker, I., *Sugimura, H., *ToFigueras, J., *Vineis, P., *Yu, M.C., *Taioli, E.: Metabolic Gene Polymorphism Frequencies in Control Populations. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 10 (2001) 1239-1248. [3] Godschalk, R.W.L., *Dallinga, J.W., Wikman, H., Risch, A., *Kleinjans, J.C.S., Bartsch, H., *Van Schooten, F.-J.: Modulation of DNA and protein adducts in smokers by genetic polymorphisms in GSTM1, GSTT1, NAT1 and NAT2. Pharmacogenetics 11 (2001) 389-398. [4] *Rajaee-Behbahani, N., Schmezer, P., Risch, A., *Rittgen, W., *Kayser, K., *Dienemann, H., *Schulz, V., *Drings, P., *Thiel, S., Bartsch, H.: Altered DNA repair capacity and bleomycin sensitivity as risk markers for non-small cell lung cancer. International Journal of Cancer (Pred. Oncol.) 95 (2001) 86-91. [5] Risch, A., Wikman, H., *Thiel, S., Schmezer, P., Edler, L., *Drings, P., *Dienemann, H., *Kayser, K., *Schulz, V., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.: Glutathione-S-Transferase M1, M3, T1, P1 Polymorphisms and Susceptibility to Non-Small Cell Lung Cancer Subtypes and Hamartomas. Pharmacogenetics 11 (2001) 757-764. [6] Schmezer, P., Rajaee-Behbehani, N., Risch, A., *Thiel, S., Rittgen, W., *Drings, P., *Dienemann, H., *Kayser, K., *Schulz, V., Bartsch, H.: Rapid screening assay for mutagen sensitivity and DNA repair capacity in human peripheral blood lymphocytes. Mutagenesis 16 (2001) 25-30. [7] *Vineis, P., *Marinelli, D., *Autrup, H., *Brockmöller, J., *Cascorbi, I., *Daly, A.K., *Golka, H., *Okkels, K., Risch, A., *Rothman, N., *Sim, E., *Taioli, E.: Current Smoking, Occupation, N-acetyltransferase-2 and Bladder Cancer: a pooled Analysis of Genotype based studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 10 (2001) 1249-1252. [8] *von Zglinicki, T., *Serra, V., *Lorenz, M., *Saretzki, G., *Lenzen-Großimlighaus, R., *Geßner R., Risch, A., *SteinhagenThiessen, E.: Short telomeres in patients with vascular dementia: an indicator of low antioxidative capacity and a possible risk factor? Laboratory Invest. 80 (2000) 1739-1747. [9] Wikman, H., Risch, A., Klimek, F., Schmezer, P., Spiegelhalder, B., *Dienemann, H., *Kayser K., *Schulz, V., *Drings, P., Bartsch, H.: hOGG1 Polymorphism and Loss of Heterozygosity (LOH): Significance for Lung Cancer Susceptibility in a Caucasian Population. International Journal of Cancer 88 (2000) 932-937. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0300 Molekulare Toxikologie Abteilung Molekulare Toxikologie (C0300) Leiter: Prof. Dr. Manfred Wießler Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Heinrich Bauer (- 12/00, ½) Dr. Barbara Bertram (- 05/00) Dr. Christian Bieler ( - 06/00) Dr. Eva Frei Dr. Holger Hoffmann (10-12/00) Dr. Irina Kiprianová (10/00 - 12/01) Dr. Hans Christian Kliem ( - 12/02) Dr. Roland Müller (02 - 09/00) Dr. Bernd Sauerbrei ( - 07/00) Dr. Birgit Schmauser ( - 04/00) PD. Dr. Heinz Schmeiser Dr. Oliver Schmitz ( - 12/00) Dr. Martina Weigand ( - 09/00) Gastwissenschaftler Dr. Marie Stiborova (Prag, Tschechien) 08 - 09 jährlich Dr. Amitava Chatterjee (Kalkutta, Indien) 04/00 - 06/00 Dr. Hassan Mamdouh Ali (Elmenofia, Ägypten) 07/00 - 03/01 Doktoranden Volker Arlt ( - 01/01) Thomas Fritsche (04/00 - ) Regine Garcia-Boy (03/01 - ) Evelyn Kim ( - 09/02) Erwin P. Mark ( - 04/02) Bettina Meister (10/00 - ) Jost Reinhard ( - 12/00) Bernd Sorg ( - 04/01) Dirk Stach (03/00 - ) Christoph Tacheci (02/01 - ) Christian Wörth ( - 07/00) Sonja Wolf (10/00 - ) Techniker Ursula Bollow ( - 05/00 (½)) Horst Braun ( - 02/00 Andrea Breuer Karl Albert Klokow ( - 04/02 Peter Lorenz Eduard Müller Diplomanden Michael Wolf (10/00 - 03/01) Jitka Huclova (10/00 - 02/ 01) Farina Neuwirth (10/01 - 03/02) Sekretärin Hélène Boittin (08/01 -, ½) Christina Grosch (- 08/01, ½) Auszubildende Dorina Rauch ( - 03/00) Nicole DiGallo Die Forschungsschwerpunkte der Abteilung Molekulare Toxikologie sind Biomonitoring von Umweltgiften und die Entwicklung von Arzneistoffen. Biomonitoring ist ein Verfahren zur Bestimmung der Exposition eines Individuums oder einer Population gegenüber Fremdstoffen. Besonders erstrebenswert ist die Ermittlung der biologisch wirksamen Dosis des Fremdstoffes oder Umweltschadstoffes, da somit individuelle oder speziesbedingte Unterschiede in der Pharmakokinetik berücksichtigt werden. Für genotoxische Substanzen kann die biologisch wirksame Dosis als Veränderung der DNA oder von Proteinen, den DNA- bzw. Proteinaddukten bestimmt werden. Ein Schwerpunkt unserer Abteilung liegt in der Analyse von DNA-Addukten, da diese Addukte mutagen sind und eine direkte Risikobewertung durch den Vergleich mit Daten aus Tierversuchen möglich ist. Als Beispiel für ein erfolgreiches, wenngleich unerfreuliches Biomonitoring sei hier die “Chinese Herbs Nephropathy” (CHN) genannt, eine Erkrankung, die bei Patientinnen auftrat, die im Rahmen einer Schlankheitskur Produkte eingenommen hatten, welche versehentlich Aristolochiasäuren enthielten. Das DNA-Adduktmuster im Nierengewebe dieser Patientinnen entsprach demjenigen, das in Tieren gefunden wurde, die nach Aristolochiasäure-Behandlung Tumoren entwickelt hatten und war selbst zehn Jahre nach Absetzen der Behandlung im Gewebe der Patientinnen noch nachweisbar. Die ³²P-postlabeling Methode, die für diese Analysen angewandt wird, ist zur Zeit die empfindlichste Methode zur Detektion von DNA-Addukten bekannten und unbekannten Ursprungs. Sie hat jedoch den Nachteil, dass mit hohen Radioaktivitätsmengen umgegangen werden muss, und dass die Analysebedingungen für empfindliche Addukte zu drastisch sind. Durch Fluoreszenzmarkierung von Nukleotiden, die nach enzymatischem Verdau der DNA entstehen, konnte mittels Kapillarelektrophorese gekoppelt mit laserinduzierter Fluoreszenzdetektion das endogene DNA-Addukt 5‘-Methylcytosin von den normalen DNA-Bausteinen getrennt und quantifiziert werden. Diese Methode wurde für die Analyse von durch Umweltschadstoffe hervorgerufene DNA-Addukte entwickelt. Die Entwicklung von Arzneistoffen, die an Saccharide oder humanes Serumalbumin gekoppelt sind, zur zielgerichteten Therapie (drug targeting) von Tumoren, ist der zweite Schwerpunkt unserer Abteilung. Die Substanz Glufosfamid, ein Konjugat aus Glucose und Ifosfamid Mustard, ist ein in der Abteilung entwickeltes Krebstherapeutikum, welches sich in klinischer Phase II Prüfung befindet. Die Substanz wird an Patienten, die an Pankreas-, Lungen-, Hirn oder Mammatumoren leiden, DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 133 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 134 getestet. In der Phase I Studie wurde an 10% der Patienten ein Rückgang des Tumorwachstums beobachtet. DNA-Reparatur, speziell die durch 06-Methylguanin-DNAmethyltransferase (MGMT) vermittelte Reparatur, spielt eine wesentliche Rolle in der Entstehung von Resistenzen gegenüber alkylierenden Zytostatika. Konjugate neuer MGMT Inhibitoren mit Monosacchariden zeigten eine gute Aufnahme in die Zelle und hemmten, wie gewünscht, die MGMT, wenn der Abstand zwischen Monosaccharid und Effektormolekül gross genug war. Diese Arbeit wird mit Substanzen fortgesetzt, die die 5‘Methylcytosin-Transferasen, welche in der Tumorentstehung eine Rolle spielen, beeinflussen. Das drug targeting von Tumoren kann auch über die Bindung von Oligosaccharid-Konjugaten an Lektine erfolgen, falls Tumoren charakteristische Lektine exprimieren. Um tumorassoziierte Lektine anzureichern und zu charakterisieren, wurden verzweigte Oligosaccharidmimetika synthetisiert und als Liganden in der Affinitätschromatographie von Plasmamembranen aus Tumoren eingesetzt. Bibliotheken komplexer Oligosaccharide können mit Hilfe der kombinatorischen Chemie generiert werden. Aus diesen Bibliotheken werden Strukturen ermittelt, die die Adhäsion von Tumorzellen an die extrazelluläre Matrix und/oder deren Migration durch diese Matrix hemmen. Die Zellen eines Tumors haben einen hohen Bedarf an Energie und Aminosäuren, den sie auch über die Aufnahme von Plasmaproteinen wie Albumin decken. Diese Eigenschaft wird ausgenutzt, um über Albumin als Träger Tumortherapeutika in die entartete Zelle zu schleusen. Das erste Medikament dieser Gruppe, Methotrexat-Albumin, ist zur Zeit in klinischer Phase II Prüfung. Die Bindung an Albumin führt gegenüber freiem Methotrexat zu einer drastisch verlängerten Plasmahalbwertszeit. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt über Endozytose und nach lysosomalem Abbau wird Methotrexat freigesetzt. Durch Albuminkopplung können toxische Substanzen gezielt zum Tumor dirigiert und Resistenzen gegen die niedermolekularen Substanzen überwunden werden. Abteilung C0300 Molekulare Toxikologie Der Pflanzeninhaltsstoff Aristolochiasäure löst Harnleiter-Krebs beim Menschen aus H.H. Schmeiser, C.A. Bieler, V.M. Arlt, M. Stiborova, E. Frei, M. Wießler In Zusammenarbeit mit: Dr. Joelle L. Nortier und Prof. Jean-Louis Vanherweghem, Nephrology Department, Hopital Erasme, Université Libre de Bruxelles, Belgien ; Dr. Jean-Pierre Cosyns und Prof. Charles van Ypersele de Strihou, University of Louvain, Medical School, Brüssel, Belgien ; Dr. Graham M. Lord und Prof. Charles D. Pusey, Division of Renal Medicine and Transplantation, Hammersmith Hospitals, London, England, UK; Annie Leszkowicz, Ecole Nationale Agronomique de Toulouse, Auzeville Tolosane, Frankreich Aristolochiasäure (AA) das Hauptalkaloid der Aristolochia-Arten ist mutagen und carcinogen im Tierversuch. Neue Befunde deuten darauf hin, daß AA auch beim Menschen carcinogen wirkt, denn AA wird als der auslösende Faktor für die Krebserkrankungen in einer belgischen Patientengruppe mit terminalem Nierenversagen (Chinesische Heilkräuter Nephropathie Patienten, CHN-Patienten) betrachtet [1]. Diese CHN-Patienten haben alle an einer Schlankheitskur teilgenommen, die chinesische Heilkräuter, darunter auch Aristolochia fangchi, enthielt, und erkranken mit hoher Häufigkeit an Harnleiter-Krebs. Allerdings besteht auch die Möglichkeit, daß andere Bestandteile der Schlankheitskur sowie das Schimmelpilzgift Ochratoxin A, das häufig pflanzliche Nahrungsmittel kontaminiert und auch carcinogen wirkt, wesentlich die Entstehung der Harnleiter-Carcinome beeinflußen. Durch unsere Untersuchungen konnten wir nun die Beteiligung anderer Risikofaktoren außer AA an der Krebsentstehung in CHN-Patienten ausschließen [2,3,4]. Die carcinogene Wirkung von AA im Tier ist verknüpft mit der Bildung von Aristolochiasäure-spezifischen DNA-Addukten, die nach metabolischer Aktivierung von AA in den Zielorganen der Carcinogenese mit der ³²Ppostlabeling Methode nachgewiesen werden können. Insbesondere das von AA hauptsächlich gebildete DNAAddukt, ein Desoxyadenosin-Addukt (dA-AAI), wurde in den Nieren und Harnleiter aller belgischen CHN-Patienten detektiert, selbst wenn die Exposition mit AA durch die Schlankheitskur 10 Jahre zurück lag. Im Gegensatz dazu konnten wir nur in 25% der CHN-Patienten Ochratoxin Avermittelte DNA-Addukte und zudem in deutlich geringeren Mengen als die AA-DNA-Addukte nachweisen [4]. Desweiteren zeigten ³²P-postlabeling Analysen von zwei CHN-Fällen, die nicht aus der belgischen Gruppe stammen, eindeutig das charakteristische dA-AAI-Addukt in der DNA aus Nieren und Harnleiter einer englischen Patientin [2] und in der DNA aus einer Nierenbiopsie von einer chinesischen Patientin [3]. In beiden Fällen war die Einnahme von AA-enthaltenden Pflanzenbestandteilen durch analytische Untersuchungen belegt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Krebserkrankungen in CHN-Patienten ursächlich mit einer Exposition mit AA verbunden sind und verdeutlichen das carcinogene Potential des Pflanzeninhaltsstoffes AA beim Menschen. Untersuchungen zum Metabolismus der beiden Hauptkomponenten des Pflanzenextraktes AA, Aristolochiasäure I (AAI) und Aristolochiasäure II (AAII), er- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0300 Molekulare Toxikologie Schema 1: Elektropherogramme zur Bestimmung von: A) 1,N2-Propano-2'-desoxyguanidin (Hex-dGMP) in KalbsthymusDNA B) Etheno-Adenosin (Etheno-dAMP) in einem modifizierten Oligonukleotid C) 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosin (8-HO-dGMP) in einem modifizierten Oligonukleotid für mögliche spätere Krebserkrankungen, zum Anderen aber auch die Einflussnahme von Substanzen und Umweltfaktoren auf die DNA-Adduktbildung zu beurteilen, was zur Prävention genutzt werden kann. gaben, daß beide nach reduktiver Aktivierung prämutagene DNA-Addukte bilden [5,6]. Als Säuger-Enzyme, die in der Lage sind diese Aktivierung zu katalysieren wurden die Prostaglandin H Synthase und die Cytochrome P450 1A1 und 1A2 identifiziert. Studien mit spezifischen Enzym-Inhibitoren und Induktoren an humanen Leber-Mikrosomen und an Mikrosomen aus Zellen, die einzelne humane Cytochrome exprimieren, erlaubten es uns den humanen Cytochromen P450 1A1, 1A2 und der NADPH:P450 Reduktase eine Beteiligung an der Aktivierung von AA zu zuschreiben. Diese Studien bilden die Grundlage dafür am Menschen die Fähigkeit AA zu metabolisieren zur bestimmen und erlauben eine Abschätzung der Empfindlichkeit des Einzelnen gegenüber der krebsauslösenden Wirkung bei AA-Expositionen. Einsatz einer kapillarelektrophoretischen Analysenmethode zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von DNAAddukten D. Stach, O.J. Schmitz, M. Wießler Die Gruppe der genotoxischen Kanzerogene umfasst DNA-reaktive Substanzen, die mit der Erbsubstanz DNAAddukte bilden und dadurch mutagen wirken. Die DNAAdduktbildung stellt einen sehr frühen und grundlegenden Schritt im Mehrstufenprozess der Kanzerogenese dar. Eine Bestimmung derartiger DNA-Modifikationen eröffnet zum Einen die Möglichkeit zur Risikoabschätzung Dieses Biomonitoring ist mit Hilfe der von uns entwickelten Methode der kapillarelektrophoretischen Analyse von DNA mit anschließender laserinduzierter Fluoreszenzdetektion der einzelnen Nukleotide möglich [7]. Die hohe Selektivität sowie die hervorragende Reproduzierbarkeit (Standardabweichung kleiner 5%) macht eine automatisierte Anwendung mit hohem Probendurchsatz denkbar. Nukleotid korr. Migrationszeit (dAMP/Nukleotid) Desoxyadenosin (dAMP) 1.00 Desoxyguanosin (dGMP) 0.96 Desoxythymidin (dTMP) 0.93 Desoxycytosin (dCMP) 0.80 5-Me-dCMP 0.77 Etheno-dAMP 1.38 8-HO-dGMP 0.83 B[a]P-dGMP, 1. Isomer 1.28 B[a]P-dGMP, 2. Isomer 1.17 Hex-dGMP 0.74 AA-dNMP (3 Signale) 1.19 dA-AAI dA-AAII, 1.17 dG-AAI 1.11 7,12-DMBA-dNMP (4 Signale) 1.25 1.22 1.18 1.12 Apurinische Stellen 1.01 Tabelle 1: Bisher nachgewiesene Nukleotide und DNA-Addukte mit korrigierter Migrationszeit (Erklärungen im Text). Die in Tabelle 1 aufgeführten bislang nachgewiesenen DNA-Addukte zeigen das breite Anwendungsspektrum der Methode. Zum Vergleich sind die unmodifizierten Nukleotidmonophosphate (dAMP, dGMP, dTMP, dCMP) DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 135 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ebenfalls aufgeführt. Daneben konnten die GuanosinAddukte des Benzo[a]pyrens (B[a]P-dGMP, 2 Isomere), drei Addukte der Aristolochiasäure (AA-dNMP), 4 Addukte des 7,12-Dimethylbenzanthrazens (7,12-DMBA), Apurinische Stellen infolge von Spaltung der Nglykosidischen Bindung zwischen Zucker und Base, 5Methyl-Cytosin (5-Me-dCMP) als wichtige genregulatorisch wirkende modifizierte Base [Baylin, S.B. et al. Trends in Genetics 16 (2000) 168] sowie die drei ernährungsbedingt auftretenden Addukte EthenoAdenosin (Etheno-dAMP), 8-Hydroxy-Guanosin (8-HOdGMP) und das aus 2-Hexenal gebildete GuanosinAddukt (Hex-dGMP) bestimmt werden [8]. 136 Besonderes Augenmerk gilt dabei neben der „fünften Base“ 5-Me-dCMP den drei letztgenannten endogen gebildeten Addukten. So lassen epidemiologische Studien den Schluss zu, dass die Ernährung mit etwa 35 % zum Krebsrisiko beiträgt [Doll, R. et al. JNCI 66 (1981) 1197]. Das aus 2-Hexenal gebildete DNA-Addukt 1,N2-Propano2'-desoxyguanidin (Hex-dGMP), gehört zur Gruppe der α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen, die in verschiedenen Versuchen ein mutagenes, ein genotoxisches oder auch ein kanzerogenes Potential zeigten. Als Hauptaufnahmequelle von 2-Hexenal gelten Früchte (Bananen), Gemüse (Bohnen), Fruchtsäfte und Tee (25 ppm). Ein weiteres ernährungsbedingtes DNAAddukt ist das Etheno-Adenosin (Etheno-dAMP). Dieses durch Lipidperoxidation im Körper entstehende DNAAddukt wurde bereits 1983 von Ames [Ames, B.N. Science 221 (1983) 1256] zusammen mit anderen durch oxidativen Stress hervorgerufene DNA-Schäden mit der Tumorbildung beim Menschen in Verbindung gebracht. Oxidative DNA-Schädigungen spielen in der Kanzerogenese ohnehin eine bedeutende Rolle [Marnett, L.J. Carcinogenesis 21 (2000) 361]. Der am häufigsten untersuchte Biomarker für oxidativen Stress ist 8-Oxo-7,8dihydro-2'-desoxyguanosin (8-HO-dGMP). Wie Schema 1 zeigt, ist es nun zum ersten Mal möglich, diese drei ernährungsbedingten Marker in einer einzigen Analyse auf einfache Weise simultan zu bestimmen [8]. Albumin-Konjugate mit Therapeutika als neues Konzept in der Tumortherapie E. Frei, M. Weigand, C. Bieler, A. Breuer, I. Kiprianová, T. Fritzsche, M. Wolf, N. Eschen, F. Neuwirth In Zusammenarbeit mit: Dr. H. Sinn, H.H. Schrenk FS Radiologische Diagnostik und Therapie, DKFZ; Dr. G. Hartung Onkologisches Zentrum im Klinikum Mannheim; Dr. P. Kremer Kopfklinik Heidelberg. Das Plasmaprotein Serumalbumin akkumuliert in Tumoren und ist deren wichtigste Quelle für Energie und Aminosäuren. Albumin wird über Endozytose aufgenommen und in den Lysosomen abgebaut. Diese Eigenschaften machen Albumin zu einem natürlichen Transporter für zytotoxische Substanzen in der zielgerichteten Tumortherapie, dem “drug targeting”. Abteilung C0300 Molekulare Toxikologie Methotrexat (MTX) ist ein Folsäure-Antagonist und ein sehr potentes Tumortherapeutikum, welches effektiv in der Behandlung von Leukämien und des Chorioncarcimos eingesetzt wird. Vor allem in soliden Tumoren und in Rezidiven werden aber Resistenzen beobachtet, die oft auf einer verminderten Aufnahme von MTX beruhen. Wir haben MTX im molaren Verhältnis 1:1,4 kovalent an Albumin gekoppelt (MTX-HSA) und gezeigt, dass es sich in Tumoren anreichert. MTX-HSA ist mittlerweile in klinischer Phase II. In der ersten Phase I Studie zeigten 3 von 17 terminal kranken Patienten Ansprechen. Ein Patient mit einem Pleuramesotheliom und einer mit einer NierencarcinomMetastase sind seit 7 Jahren in Remission [Hartung et al. Clin Cancer Res 5 (1999) 753]. MTX-HSA hat im Gegensatz zu MTX eine sehr lange Plasmahalbwertszeit von 16-19 Tagen, ähnlich dem nativen Albumin und sehr moderate Nebenwirkungen [9]. Die zelluläre Aufnahme und der zelluläre Metabolismus von MTX-HSA wurde an CCRF-CEM Zellen, einer menschlichen T-Zellleukämielinie und an Nalm6 einer Pre-B-Leukämie untersucht. Wir konnten zeigen, dass MTX von beiden Zelllinien aus MTX-HSA freigesetzt wird. In CCRF-CEM Zellen wurden nur Polyglutamate mit einer zusätzlichen Glutaminsäure beobachtet, während in Nalm6 Zellen auch längerkettige Polyglutamate zu analysieren waren. Diese könnten aber auch aus dem als Verunreinigung in der MTX-HSA Präparation noch vorhandene niedermolekularen MTX stammen [10]. Im Medium von CCRF-CEM wurden beträchtliche Mengen freies MTX nachgewiesen, welches in den Zellen von HSA abgespalten und, weil es die Bindungskapazität von Dihydrofolatreduktase überstieg und nicht polyglutamyliert wurde, exportiert wurde. In einem soliden Tumor mit geringem Austausch von Nährstoffen, könnte freigesetztes MTX von anderen Zellen mit intaktem Transporter für reduzierte Folate aufgenommen und polyglutamyliert werden und die Zellteilung hemmen. Die MTX Transportresistenz eines Klons von CCRF-CEM konnte durch MTX-HSA überwunden werden, da die Aufnahme über Endozytose erfolgt. Die Aufnahme von MTXHSA über Endozytose wurde in Experimenten bewiesen, in denen die lysosomalen Proteasen durch Methylamin gehemmt wurden. Hier konnten nach Immunpräzipitation und Western Blot Analysen intaktes MTX-HSA in den Zellen nachgewiesen werden, während in unbehandelten Zellen nur schwache Signale von MTX-HSA zu sehen waren. Hier wurde das aufgenommene Albumin schnell abgebaut [11]. In Untersuchungen mit isolierten Lysosomen konnten wir allerdings zeigen, dass die Abspaltung von MTX aus dem Albumin kein frühes Ereignis im lysosomalen Abbau ist, sondern, dass erst Albuminfragmente entstehen, die noch MTX enthalten. Diese Befunde erklären die vor allem in Zellen beobachtete langsame Wirksamkeit von MTX-HSA. Wir untersuchen nun, ob die Aufnahme über Endozytose rezeptorvermittelt ab- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0300 Molekulare Toxikologie läuft und wenn ja, welche Albumin-bindenden Proteine zuständig sind. In der Klinik wird MTX-HSA, genau wie MTX, meist in Kombinationen eingesetzt werden. Wir haben daher untersucht wie eine Kombination von Cisplatin mit MTX-HSA sich auf die Zytotoxizität beider Substanzen auswirkt. Die Versuche wurden über Isobologramme ausgewertet und verschiedene Inkubationsschemata gewählt, nämlich 24h Vorinkubation mit jeweils einer Substanz, gefolgt von gleichzeitiger Inkubation mit beiden Substanzen und gleichzeitige Zugabe beider Substanzen. Ganz unerwartet war in allen Kombinationen nie eine Addition der Wirkungen zu sehen, sondern immer ein Antagonismus oder sogar eine Schutzwirkung der einen Substanz auf die andere. Die Ursache dieses starken Antagonismus ist noch nicht klar. Gründe könnten in veränderten Aufnahmekinetiken beider Substanzen und einem verlangsamten Abbau des MTX-HSA liegen. Da die Bindung von Effektoren an Albumin mit der daraus resultierenden langen Plasmahalbwertszeit und der zellulären Aufnahme über Endozytose ein allgemeingültiges Prinzip zu sein scheint, haben wir weitere Substanzen gekoppelt und untersuchen sie auf ihre Wirksamkeit. So zeigte das als niedermolekulare Substanz zwar wirksame aber toxische Aminopterin als Albuminkonjugat im Tierversuch eine noch bessere Wirksamkeit als MTXHSA [P. Kremer et al. Anti-Cancer Drugs accepted 2002]. Der Unterschied zu MTX-HSA konnte auch in Zellkultur gezeigt werden, aber nicht so deutlich wie in vivo. Generell ist es schwierig die im Tier beobachtete gute Wirksamkeit von Albuminkonjugaten in Zellkultur zu zeigen. Die Inkubationsbedingungen von Zellen sind trotz unserer Umstellung auf geringe Aminosäurengehalte immer noch viel besser als in einem Tumor, so dass die Zellen nicht von Albumin leben müssen. Dieses Beispiel und weitere Entwicklungen mit Fluoreszenzfarbstoffen zeigen aber, dass die Albuminkopplung tatsächlich ein “drug targeting” darstellt und, dass toxische Substanzen nach Bindung an Albumin, wegen der geringeren systemischen Toxizität ein breites therapeutisches Fenster erhalten. Inhibitoren der DNA-Reparatur J. Reinhard, H.-C. Kliem, M. Wießler In Zusammenarbeit mit: C-W. von der Lieth, W. E. Hull Zentrale Spektroskopie, DKFZ; Uta Eichorn, Prof. Dr. Bernd Kaina, Angewandte Toxikologie, Universität Mainz Das menschliche Genom ist zahlreichen, unerwünschten Schädigungen ausgesetzt, durch die die Unversehrtheit der Zelle gefährdet ist. Jeder Organismus hat daher Strategien entwickelt, diese Schäden zu reparieren, um so seinen Fortbestand zu sichern. Neben anderen ist hier die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT), Abbildung 1: Darstellung des Komplexes aus MGMT und Inhibitor. Man erkennt die Glukose (oben links) die aus dem aktiven Zentrum der MGMT herausragt, während das 4-BTG direkt im aktiven Zentrum liegt (recht vorne). Ein Spacer aus 8 C-Atomen verbindet beide Moleküle. zu nennen. Sie ist in der Lage, Alkylierungen an den DNABausteinen Guanin (an Position O6) und Thymin (an Position O4) zu entfernen. Bei der Therapie von Tumoren ist jedoch gerade die Schädigung von Zellen (oder Geweben) erwünscht. Hier soll durch Behandlung mit alkylierenden Therapeutika gezielt die Tumorzelle getroffen werden. Der Therapieerfolg wird jedoch durch die Anwesenheit der MGMT in Frage gestellt, repariert sie doch auch die Schäden an der DNA, die zur gezielten Vernichtung der Tumorzellen gesetzt wurden. Diese Erkenntnisse könnten zu Kombinationstherapien führen, bei denen zunächst die MGMT-Aktivität durch spezifische Therapeutika inhibiert wird. Hierdurch sensibilisiertes Tumorgewebe kann dann ebenfalls spezifisch mit Alkylantien behandelt und so die Tumorzellen in den Zelltod getrieben werden Der “Goldstandard” für MGMT-Inhibitoren ist das O6-Benzylguanin (O6-BG). Diese Verbindung befindet sich in der klinischen Prüfung. O6-Benzylguanin zeichnet sich jedoch durch schlechte Wasserlöslichkeit aus und zeigt keine Präferenz gegenüber Tumoren. Im Rahmen unseres Targeting-Konzeptes, der Konjugation von Therapeutika mit Sacchariden, wurden neue Verbindungen synthetisiert und auf ihre Wirkung in einem MGMT-Assay [Preuss, I et al. Cancer Detect. Prev. 20 (1996) 130] mit Zellproteinextrakten aus HeLaS3-Zellen untersucht. Es wurde u.a gefunden, daß die Wirkung der Saccharidkonjugate von O6-(4-Bromothienyl)guanin (4-BTG) entscheidend von der Spacerlänge, d.h. dem Abstand zwischen Saccharid und 4-BTG, abhängt[12, 13]. Dabei inhibierten die 4-BTG-Glukoside mit Spacern aus 2, 4 oder 6 C-Atomen moderat die MGMT Aktivität bei einem IC50-Wert von ca 0,5 µM, während die unglukosidierten Verbindungen O6-BG und 4-BTG IC50- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 137 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0300 Molekulare Toxikologie Werre von 0,62 µM bzw. 0,009 µM aufweisen. Die 4-BTG Glukoside mit Spacern aus 8, 10 oder 12 C-Atomen inhibierten die MGMT-Aktivität hingegen deutlich stärker; ihre IC50-Werte lagen bei ca. 0,03 µM. [10] Weigand, M. Frei, E. Graf*, N. Wiessler, M. Comparative analysis of methotrexate polyglutamates in lymphoblast prepapretions from bone marrow and blood, and the contribution of residual red blood cells. J. Cancer res Clin Oncol 126 (2000) 407-411. Um zu verstehen, warum der Abstand zwischen Glukose und 4-BTG diesen Einfluß auf die Wirkung hat, wurden die Untersuchungen durch Moleküldynamiksimulationen von MGMT:Inhibitor-Komplexen begleitet. Auf diese Weise konnten Sturktur-Wirkungsbeziehungen gefunden werden. [11] Weigand, M. Hartung, G. Roboz*, J. Sieger, S. Wolf, M. Sinn, H. Schrenk, H.H. Wiessler, M. Frei, E. Mode of action of methotrexate-albumin in a human T-cell leukemia line and activity against an MTX-resistant clone. Anti Cancer Drug Design in press 2002. Verbindungen mit Spacerlängen aus 2, 4 oder 6 C-Atomen ließen sich nur schlecht in die Bindungstasche der MGMT einpassen. Erst ab einer Länge von mindestens 8-C Atomen ist die Passgenauigkeit vom Inhibitor in die MGMT-Bindungstasche optimal. Die molekulardynamischen Berechnungen bestätigten in beeindrukkender Weise die experimentellen Befunde der Wirksamkeitsuntersuchungen. [12] J. Reinhard, W. E. Hull, C.-W. von der Lieth, U. Eichhorn*, H.C. Kliem, B. Kaina*, M. Wiessler (2001) Monosaccharide-Linked Inhibitors of O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase (MGMT): Synthesis, Molecular Modeling, and Structure-Activity Relationships. J. Med. Chem. 44 (24): 4050-4061. [13] J. Reinhard, U. Eichhorn*, M. Wiessler , B. Kaina*, (2001) Inactivation of O6-methylguanine-DNA methyltransferase by glucose-conjugated inhibitors. Int J Cancer 93 (3):373-379. 138 Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Nortier, J.L.*; Muniz, M.-C.;* Schmeiser, H.H.; Arlt, V.M.; Bieler, C.A.; . Petein, M.*; Depierreux, M.F.*; DePauw, L.*; Abramowicz, D.*; Vereerstraeten, P.*; Vanherweghem J.-L.*: Urothelial carcinoma associated with the use of Chinese herbs (Aristolochia species). New England Journal of Medicine 342 (2000) 1686-1692. [2] Lord, G.M.*; Cook, T. *; Arlt, V.M.; Schmeiser, H.H.; Williams, G. *; Pusey, C.D. *: Urothelial malignant disease and Chinese herbal nephropathy. Lancet 358 (2001) 1515-1516. [3] Gillerot, G. *; Jadoul, M. *; Arlt, V.M.; van Ypersele de Strihou, C.*; Schmeiser, H.H.; But, P.P. *; Bieler, C.A.; Cosyns, J.-P.*: Aristolochic acid nephropathy in a Chinese patient: time to abandon the term “Chinese herbs nephropathy”? Am. J. Kid. Dis. 38 (2001) U16-U20. [4] Arlt, V.M.; Pfohl-Leszkowicz, A. *; Cosyns, J.-P.*; Schmeiser, H.H.: Analyses of DNA adducts formed by ochratoxin A and aristolochic acid in patients with Chinese herbs nephropathy. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 494 (2001) 143-150. [5] Stiborová, M.; Frei, E.; Wiessler M.; Schmeiser, H.H.: Human enzymes involved in the metabolic activation of carcinogenic aristolochic acids: evidence for reductive activation by cytochromes P450 1A1 and 1A2. Chem. Res. Toxicol. 14 (2001) 1128-1137. [6] Stiborová, M.; Frei, E.; Breuer, A.; Wiessler M.; Schmeiser, H.H.: Evidence for reductive activation of carcinogenic aristolochic acids by prostaglandin H synthase-32P-postlabelling analysis of DNA adduct formation. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 493 (2001) 149-160. [7] Wörth, C.C.T.; Schmitz, O.J.; Kliem, H.-C.; Wießler, M.: Synthesis of fluorescently labeled alkylated DNA adduct standards and separation by capillary electrophoresis. Electrophoresis 21 (2000) 2086-2091. [8] Schmitz, O.J.; Wörth, C.C.T.; Stach, D.; Wießler, M.: Capillary electrophoresis analysis of DNA adducts as biomarkers for carcinogenesis. Angewandte Chemie International Edition 41, No.3 (2002) 445-448 [9] Hartung, G. Heeger, S. Bertsch*, T. Frei, E., Wunder, A. Kränzle*, M. Stehle*, G. Weigand, M. Schrenk, H.H. Sinn, H. Queißer*, W. Adaptation and clinical evaluation of a homogenous enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT) for drug monitoring of a methotrexate-albumin conjugate (MTX-HSA) in humans. Onkologie 23 (2000) 352-357. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie Abteilung Klinische Epidemiologie (C0500) Leiter: Prof. Dr. Anthony B. Miller (kommisarisch) Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Hans-Peter Altenburg PD Dr. Nikolaus Becker Heike Behmann ( - 05/00) PD Dr. Jenny Chang-Claude Irmgard Helmbold Dr. Silke Hermann (07/00 - ) Jutta Kneisel (0,5) Dr. Jakob Linseisen ( -12/ 01) Dr. Gerhard Lotze ( - 09/01) Christine Martinsohn (-12/ 01) Dr. Alexandra Nieters Dr. Irene Reinisch Dr. Hans Wiebelt Dorothee Zoller Doktoranden Lars Beckmann Ulrike Bussas ( - 03/01) Klaus-Georg Deck ( - 09/01) Gaël Hammer ( - 06/00) Silke Kropp Annika Leopold (10/00 - ) Heribert Ramroth ( - 07/01) Maren Rohrbacher (11/01 - ) Sabine Rohrmann (01/99 - ) Dorothee Twardella ( - 12/ 01) Technische Mitarbeiter Elke Bauer (0,5) ( - 03/00) Karin Becker (08/01 - ) Elvira Calabek ( - 10/00) Evelin Deeg Ursula Eilber Erika Fisch Petra Galmbacher Ulla Gromer (0,75) Volker Herrmann (0,5) ( - 12/01) Martina Keith (0,5) (04/01 - ) Ina Kögel Waltraud Kröner (0,75) Ilona Krüger-Friedemann (0,5) (05/01 - ) Yvonne Küster (0,5) Martha Menz ( - 09/00) Dorothea Niehoff (beurlaubt bis 31.12.01) Karin Pfleger (09/01 - ) Jutta Schmitt Kati Smit Margot Villhauer-Lehr Sonstige Mitarbeiter Züleha Aytis (02/01 - ) Severin ElAlamy Markus Obreiter (08/01 - ) Julia Schliwka (06/01 - ) Stefanie Brems (06/00-03/01) Hendrik Hoyer (8/00-5/01; Zivi) Jochen Rudolph (08/01-; Zivi) Zorica Stupar (11/00 - ) Sekretariat Petra Rössler Heike Weis (0,75) Gegenstand der Abteilung Klinische Epidemiologie sind die Identifizierung von Faktoren, die zur Entstehung von Krebs führen, und gegebenenfalls die Quantifizierung der mit einer Exposition verbundenen Risiken. Ein weiterer Schwerpunkt der Forschung sind die Untersuchung von Möglichkeiten zur Vorbeugung und Früherkennung von Krebserkrankungen sowie die Evaluation der Effektivität bereits implementierter Maßnahmen. Neu in das Forschungsprogramm aufgenommen ist der Bereich der Prüfung der Effektivität neuer Diagnose- und Behandlungsverfahren. Schließlich gehört zu den Aufgaben der Abteilung auch die Verbreitung von Informationen über wirksame Maßnahmen zur Krebsprävention. Krebsprävention (C0501) N. Becker; Z. Aytis; S. Brems; E. Deeg, H. Hoyer, I. Krüger-Friedemann; A. Nieters, J. Rudolph; H. Wiebelt Kooperationen: BIPS, Bremen (Dr. Wolfgang Ahrens, Dr. Klaus Giersiepen, Prof. Dr. Eberhard Greiser); IARC Lyon, Frankreich (Dr. Paolo Boffetta, Dr. Paul Brennan, Dr. Elio Riboli, Dr. Rengsawami Sankaranarayanan); Süddeutsche Metall BG Mainz; Universität Heidelberg (Prof. Dr. med. Stefan Meuer); Universität München, München (Dr. Leonhard Knorr-Held, Prof. Dr. Ludwig Fahrmeier); Universität Bielefeld (Prof. Dr. Maria Blettner); Universität Würzburg (Prof. H.K. Müller-Hermelink); Zentralinstitut für die Kassenärztliche Versorgung in der BRD; Krankenhäuser in den Studienregionen Modellprojekt Mammograpie Screening Wiesbaden Epidemiologische Studien belegen, daß Mammographie-Screening bei 50 - 70jährigen Frauen die Brustkrebsmortalität um bis zu 30% senken kann. Voraussetzung ist die Einhaltung bestimmter, auf der Grundlage dieser Studien quantifizierbarer hoher Qualitätsstandards. Ziel des Vorhabens ist es, die erforderlichen Erfahrungen und Erkenntnisse für die Durchführung eines bevölkerungsbezogenen, qualitätsgesicherten Mammographie Screenings zu sammeln und wissenschaftlich zu evaluieren im Hinblick auf eine flächendeckende Einführung in ganz Deutschland. Das von dieser Arbeitsgruppe mit initiierte Modellprojekt wird in der Region Wiesbaden/ Rheingau-Taunus-Kreis in Zusammenarbeit mit den örtlichen niedergelassenen Ärzten und der Planungsstelle Mammographie-Screening durchgeführt. [2, 49, 62] Lungenkrebs-Screening Von den etwa 40 000 - 45 000 in jedem Jahr neu diagnostizierten Erkrankungsfällen an Lungenkrebs sterben 85 - 90% an der Krankheit. Mit 35 000 - 40 000 Todesfällen in jedem Jahr ist Lungenkrebs damit nach wie vor die häufigste Krebstodesursache in Deutschland. Theoretisch könnte eine frühzeitige Erkennung der Tumoren die Überlebenschancen nachhaltig verbessern, doch verliefen in der Vergangenheit Prüfungen von eventuellen Früherkennungsverfahren stets enttäuschend. Neueste Ergebnisse deuten nun allerdings darauf hin, daß spezielle Verfahren der Computertomographie möglicherweise frühe Stadien der Lungenkrebsentwicklung entdecken und zur Senkung der Sterblichkeit beitragen können. In Zusammenarbeit mit Radiologen des DKFZ und der Universität Münster wird derzeit eine randomisierte Studie zur Überprüfung dieses neuen Verfahrens vorbereitet. Das Vorhaben wird eingebettet sein in eine breite internationale Zusammenarbeit unter Einschluß europäischer und nordamerikanischer Gruppen. Kolorektales Screening Mit etwa 30 000 Todesfällen im Jahr ist Darmkrebs die zweithäufigste Krebstodesursache und etwa 50 000 Neuerkrankungsfällen im Jahr der häufigste inzidente Krebs in Deutschland. In den letzten Jahren veröffentlich- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 139 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention te Ergebnisse randomisierter Studien haben gezeigt, daß mit einer bevölkerungsweiten Anwendung des Test auf okkultes Blut im Stuhl (FOBT) eine etwa 20%ige Senkung der Sterblichkeit erreicht werden kann. Eine bevölkerungsweite Einführung dieses Tests wird daher empfohlen. Eine weitaus stärkere Senkung der Krebssterblichkeit wäre allerdings von einer breiten Anwendung der vollständigen Koloskopie zu erwarten. Derzeit wird ein Studienprotokoll für eine randomisierte prospektive Studie ausgearbeitet, das die Realisierbarkeit der theoretisch zu erwartenden Sterblichkeitssenkung von 50 - 80% in der Praxis überprüfen soll. Gebärmutterhalskrebs-Screening 140 Gebärmutterhalskrebs ist weltweit eine der häufigsten Krebsarten (etwa 400 000 Neuerkrankungsfälle jährlich, 10 % aller Krebsfälle bei Frauen). Aufgrund einer wirksamen Früherkennung ist in Deutschland diese Krebsart mit etwa 7000 Neuerkrankungsfällen jährlich (4 %) weitaus seltener. Gleichwohl besteht nach wie vor Unsicherheit hinsichtlich der Screeninghäufigkeit und geeigneter Kriterien für eventuell erforderliche chirurgische Eingriffe. Viele der bei der Früherkennung entdeckten Läsionen hängen mit Infektionen mit Papillomviren (HPV) zusammen, die vorübergehend sind, so daß sich die Veränderungen von selbst wieder zurückbilden. Allerdings entwickelt sich ein kleiner Teil dieser Veränderungen zu Gebärmutterhalskrebs weiter. Da die HPV-Infektion notwendige Voraussetzung für die Entstehung dieser Krebsart ist, versucht man neuerdings, durch einen spezifischen Test auf Papillomviren die Bekämpfung des Gebärmutterhalskrebses effizienter zu machen. Allerdings kann dieser Test nicht zwischen vorübergehenden und persistenten Infektionen unterscheiden. Nur letztere entwickeln sich zu Krebs. Das Risiko unnötiger chirurgischer Eingriffe nimmt durch diesen Test daher eher noch zu. Ein im DKFZ entwickelter neuartiger Test (CINtecTM) ist in der Lage, spezifisch persistente, d.h. mit hohem Risiko zu Gebärmutterhalskrebs führende Veränderungen zu identifizieren. Gegenwärtig wird eine randomisierte epidemiologische Studie vorbereitet, mit der dessen Eignung für einen Einsatz beim Screening überprüft wird. Fall-Kontrollstudie zur Ätiologie von Lymphomen Lymphome gehören zu den wenigen Krebsarten, für die Inzidenz und Sterblichkeit in Deutschland weiterhin ansteigen. Im internationalen Schrifttum veröffentlichte Studien deuten daraufhin, daß das Antwortverhalten des Immunsystems sowie infektiöse Erreger an der Ätiologie von Lymphomen beteiligt sind. Diese beiden Bereiche sollen Schwerpunkte einer Fall-Kontrollstudie sein, die im Jahr 1999 begonnen wurde. Weitere zu berücksichtigende Faktoren werden die Exposition gegenüber Pestiziden sowie berufliche Expositionen, beispielsweise gegenüber chemischen Agentien oder Asbest sein. Ein weiterer Hintergrund der Studie ist die Tatsache, daß in den letzten Jahren eine moderne molekularbiologisch begründete Diagnostik und Klassifikation entwickelt wurde, die sich nun auch international durchgesetzt hat. Auf dieser Grundlage durchgeführte epidemiologische Un- Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie tersuchungen lassen erwarten, daß Zusammenhänge zwischen spezifischen Expositionen und spezifischen Entitäten von Lymphomen eher gefunden werden können. Die Studie wird in sechs Regionen Deutschlands durchgeführt (Heidelberg/Rhein-Neckar-Kreis, Ludwigshafen/Vorderpfalz, Würzburg, Bielefeld, Hamburg und München). Die Kontrollgruppe wird im Verhältnis 1 : 1 alters- und geschlechtsgleich aus der Allgemeinbevölkerung gezogen. Im Hinblick auf die Durchführung von Virusnachweisen und Untersuchungen zu genetischen Polymorphismen werden von Fällen und Kontrollen jeweils Blutproben genommen und eingefroren. Von den Krebsfällen ist weiterhin angestrebt, jeweils Lymphknotenmaterial zu asservieren, um im genetischen Material der entarteten Zellen nach viralem Material zu suchen. Die Studie ist an dem deutschen Kompetenznetz Maligne Lymphome, dem europäischen kooperativen Projekt EPILYMPH sowie dem internationalen Kooperationsvorhaben INTERLYMPH beteiligt. Immunogenetische Determinanten von Allergien Bestimmte Faktoren, die an der Entstehung von Allergien beteiligt sind, spielen möglicherweise auch bei der Entstehung bestimmter Krebsarten, darunter auch Lymphome und Leukämien, eine Rolle. Darauf deuten epidemiologische Studien hin, die teilweise ein verändertes Krebsrisiko unter Allergikern festgestellt haben. Da sowohl Allergien als auch Lymphome einen immunologischen Hintergrund haben, kann die Untersuchung gemeinsamer immunologischer Faktoren auch mit der Charakterisierung immunogenetischer Voraussetzungen für die Entwicklung von Allergien begonnen werden. In einer ersten kleineren Untersuchung wurden die entsprechenden Testverfahren entwickelt. Diese werden nun weiter entwickelt und im Rahmen von Kooperationsprojekten in umfangreicheren Studien eingesetzt und künftig auch zur Auswertung des Lymphomprojektes herangezogen. Publikationen: [58] Immunogenetische Determinanten von Gebärmutterhalskrebs Infektion mit Human-Papillomviren (HPV) im Genitalbereich sind häufig und in aller Regel vorübergehend und harmlos. Nur in einem sehr kleinen Teil der Fälle wird das Virus durch die Immunabwehr nicht eliminiert und führt zu einer persistenten Infektion. Eine persistente Infektion ist jedoch Voraussetzung für die Entstehung von Gebärmutterhalskrebs. Mit dem vorliegenden Projekt sollen immunogenetische Determinanten identifiziert werden, die das Risiko für eine persistente Infektion erhöhen. Diese können dann eventuell bei der Früherkennung von Gebärmutterhalskrebs behilflich sein. Analyse historischer Follow-up-Studien mit fehlenden Todesursachen In Brustkrebsstudien gelingt es häufiger, Expositionsdaten bis weit in die Vergangenheit zurück (z.T. 50er und 60er Jahre) zu erheben. Dadurch steht umfangreiches Datenmaterial im Hinblick auf (a) eine grö- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention ßere statistische Stabilität und (b) zur Untersuchung historischer Veränderungen zur Verfügung. Allerdings bereitet es in Deutschland zunehmend Schwierigkeiten, für die weit zurückliegenden Dekaden die Todesbescheinigungen der verstorbenen Studienteilnehmer vollständig zu erhalten. Die teilweise fehlenden Todesbescheinigungen sind wiederum die für solche Studien üblichen Auswertungsverfahren unbrauchbar. Im Rahmen einer methodischen Arbeit wurde daher ein statistisches Modell entwickelt, anhand diesem die Standardverfahren auf Situationen mit unvollständiger Information über verstorbene Studienteilnehmer erweitert werden konnten. [22] Krebsatlas für Deutschland In Fortschreibung des im Jahr 1997 erschienen Atlas der Krebsmortalität in Deutschland wurden die Daten und Grafiken zur säkularen Entwicklung der Sterblichkeit an Krebs insgesamt und den im Atlas aufgeführten Einzellokalisationen sowie erläuternde Texte auf das Internet übertragen. Die Daten und Graphiken werden seitdem fortlaufend aktualisiert und ermöglichen einen raschen Zugriff auf die jeweils aktuellsten Daten zur Krebssterblichkeit in Deutschland. Internetadresse: www.dkfz.de, ‚Krebsatlas‘. Prädiktion der Entwicklung der Krebssterblichkeit in Deutschland Eine der Kernaussagen des Krebsatlas war, daß seit Beginn der 90er Jahre für beide Geschlechter ein Rückgang der altersstandardisierten Krebssterblichkeit zu beobachten ist. Auf der anderen Seite hat in der letzten Zeit, z.B. im Rahmen der Diskussion über die zukünftige Entwicklung des Alterssicherungssystems, die Alterung der deutschen Bevölkerung die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Unter dem Gesichtspunkt der zu erwartenden Anforderungen an das Gesundheitssystem haben wir vorläufige Abschätzungen der bis zum Jahr 2040 zu erwartenden Zahlen an Neuerkrankungsfällen bzw. Sterbefällen an Krebs vorgenommen. [62] Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie Diese Schätzungen beruhten jedoch durchweg auf amerikanischen oder britischen Mortalitätsdaten. Auf der Grundlage der im Krebsatlas veröffentlichten Sterblichkeitszahlen wurden solche Berechnungen nun auch für Deutschland durchgeführt und untersucht, in welchem Umfang sich die Situation hierzulande von den genannten amerikanischen Schätzungen unterscheidet. Die Ergebnisse wurden im Jahr 2001 veröffentlicht . [39]. Ernährungsepidemiologie (C0503) A.B. Miller, J. Wahrendorf, N. Becker, H.-P. Altenburg, H. Behmann, U. Bussas, J. Kneisel, A. Leopold, J. Linseisen, G. Lotze, C. Martinsohn, A. Nieters, S. Rohrmann Kooperationen: Prof. Dr. Helmut Bartsch, DKFZ; Dr. Heiner Boeing, DIfE, Potsdam-Rehbrücke; Dr. Elio Riboli, International Agency for Research on Cancer, Lyon, Frankreich; Prof. Dr. A. Trichopoulu, Athens School of Public Health, Athen, Griechenland; Dr. Domenico Palli CSPO, Florenz, Italien; Dr. Anne Tjønneland Danish Cancer Society, Kopenhagen, Dänemark; Dr. Paolo Vineis, Department of Cancer Epidemiology, Turin, Italien; Dr. Francoise Clavel, INSERM U. 287, IGR, Villejuif, Frankreich; Dr. Franco Berrino Instituto Nazionale dei Tumori, Mailand, Italien; Dr. Carlos Gonzáles ICO, Barcelona, Spanien; Dr. Gunnar Berglund Malmö Diet & Cancer Study, Schweden; Dr. Nick Day MRC Biostatistics Unit, Cambridge, UK; Dr. Rosario Tumino Registro dei Tumori, Ragusa, Italien RIVM; Dr. Bas Bueno de Mesquita, Bilthoven, Niederlande; Dr. Kim Overvad University of Aahrus, Dänemark; Dr. Timothy J. Key University of Oxford, UK; Dr. Göran Hallmans University of Umea, Dept. of Epidemiology, Schweden; Dr. Petra Peeters University of Utrecht, Niederlande; Dr. Rashmi Sinha National Cancer Institute, Bethesda, USA; Dr. Gunnar Steineck, Karolinska Institute, Stockholm, Schweden, Dr. Eiliv Lund, University of Tromsø, Norwegen Förderung: Deutsche Krebshilfe (seit Mai 2000); Europäische Kommission (seit 1994) Schätzung der vermeidbaren Krebstodesfälle in Deutschland Die Vermutung, dass die Ernährung ein wichtiger Faktor für die Entstehung von Krebs darstellt, existiert seit langem. Doll and Peto (1981) rechneten etwa 35% der Todesfälle an Krebs einer ungünstigen Ernährung zu. Die grundsätzliche Bedeutung der Ernährung bei der Entstehung von Krebs gilt als unbestritten, wobei der Einfluss einzelner Lebensmittelgruppen, Nährstoffe und anderer Inhaltsstoffe für die Krebsentstehung nur für wenige Zusammenhänge so überzeugend bewiesen ist, dass daraus öffentliche Ernährungsempfehlungen abgeleitet werden können. Vom World Cancer Research Fund (WCRF) und dem American Institute for Cancer Research (AICR) wurden die Ergebnisse biomedizinischer und epidemiologischer Studien zur Erforschung des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Krebs in einem 1997 herausgegebenen Bericht zusammengefasst. Die vorhandenen biomedizinischen und epidemiologischen Forschungsergebnisse wurden zusammengestellt und hinsichtlich der Zusammenhänge zwischen Ernährung und Krebsrisiko als überzeugend, wahrscheinlich oder möglich bewertet. Seit Ende der 70er Jahre wurden wiederholt Berechnungen vorgelegt, die anhand der bestimmten Risikofaktoren zuzuordnenden Krebstodesfälle das hohe Potential für Krebspräventionsmaßnahmen nachgewiesen haben. Als überzeugend wissenschaftlich bewiesen gelten demnach vor allem die protektive Wirkung von Gemüse und Obst für verschiedene Krebsarten (Mundhöhle, Rachen, Speiseröhre, Lunge, Magen). Auf der Seite der krebsför- Anwendung Bayesianischer Modellierung auf kartographische Darstellungen der Krebsmortalität Die kartographischen Darstellungen des Krebsatlas zeigten bei einigen Krebsarten deutliche regionale Unterschiede in der Sterblichkeit, während bei anderen Krebsarten wenige oder gar keine Unterschiede feststellbar waren. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Statistik der Universität München wurde auf der Grundlage von in der letzten Zeit entwickelten Modellen zur räumlichen Statistik Untersuchungen zur statistischen Sicherung solcher Befunde durchgeführt. [12] DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 141 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention dernden Faktoren hat Alkohol eine übergreifende Bedeutung. Dabei wirkt Alkohol in Bezug auf die Karzinome des oberen Verdauungstraktes synergetisch mit dem Tabakrauchen, d.h. die Anwesenheit beider Faktoren verstärkt deren Einzelwirkungen. Das Ziel der Arbeitsgruppe ist es, zu einer weiteren Klärung des Zusammenhanges von Ernährung und Krebs sowie anderen chronischen Erkrankungen beizutragen, um genauere Empfehlungen für eine gesundheitsfördernde Ernährung zu ermöglichen. Kohortenstudie „Gesundheit, Ernährung, Krebs“ als Teilstudie von EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) 142 Die Studie „Gesundheit, Ernährung, Krebs“ wird seit 1994 von der Abteilung Epidemiologie des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) in Heidelberg als Teil der europäischen Langzeitstudie EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) durchgeführt. Mittlerweile sind 10 europäische Länder mit insgesamt annähernd 500.000 Studienteilnehmern und -teilnehmerinnen beteiligt. In Deutschland befindet sich neben Heidelberg auch noch ein EPIC-Zentrum am Deutschen Institut für Ernährungsforschung (DIFE) in Potsdam. EPIC zielt auf eine weitere Klärung des Zusammenhangs von Ernährung und Krebs. Die Durchführung einer prospektiven Kohortenstudie in mehreren europäischen Ländern mit unterschiedlichen Ernährungsweisen und deutlichen Unterschieden der Neuerkrankungsraten für verschiedene Krebsarten erhöht zusammen mit der Anlage einer in ihrer Größe einzigartigen biologischen Datenbank das Auswertungspotential erheblich. Das Projekt wird von der Abteilung Ernährung und Krebs der International Agency for Research on Cancer (IARC) in Lyon koordiniert. Mit EPIC wird versucht die Beschränkungen früherer epidemiologischer Studien hinsichtlich der Präzision und Validität traditioneller Ernährungsfragebögen sowie der Anwendung biologischer Marker zu überwinden. In Rahmen der Befragung wurden biologische Proben gewonnen, welche auf Grund der Größe eine einzigartige biologische Datenbank bilden. Molekularbiologische Untersuchungen sind Bestandteil des wissenschaftlichen Programms. Stand der Datenerhebung EPIC Heidelberg Rekrutierung Die Erstbefragung der Studienteilnehmer/-innen wurde in Heidelberg im Oktober 1998 abgeschlossen. Außer einer umfangreichen Erhebung der Ernährungsgewohnheiten wurden die Teilnehmer auch zu Rauchgewohnheiten, körperlicher Aktivität, subjektivem Befinden, Krankheitsgeschichte und Medikamenteneinnahme befragt. Begleitet wurde die Befragung von Blutentnahmen, Blutdruckund Körpermessungen. Insgesamt haben 25.544 Personen aus Heidelberg und Umlandgemeinden an der Ersterhebung teilgenommen. Davon sind 53% Frauen und 47% Männer; 57% der Teilnehmer kommen aus dem Stadtbereich und 43% aus Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie den Umlandgemeinden Heidelbergs. Von 24.466 Teilnehmern (95,7%) konnten Blutproben gewonnen werden, die in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Nachbeobachtung Die Auswertung der EPIC-Studie beruht vor allem auf der möglichst lückenlosen Erfassung der Krebsneuerkrankungen und der Sterbefälle mit den jeweiligen Todesursachen. Deshalb kommt der Nachbeobachtung der gesamten Studienbevölkerung eine entscheidende Bedeutung zu. Die erste Nachbefragungsrunde hat in Heidelberg Anfang 1998 begonnen und wurde Anfang 2000 abgeschlossen. Es konnte eine Teilnahmerate von 93,5% erreicht werden. Die zweite Nachbefragungsrunde, bei der auch wieder die Ernährungsgewohnheiten erfragt werden, wurde Anfang 2001 begonnen und wird voraussichtlich 2003 abgeschlossen sein. Außer zu ihrer Ernährung werden die Studienteilnehmer zu Krankheitsgeschichte, Teilnahme an Krebsvorsorgeuntersuchungen, Rauchverhalten, körperlicher Aktivität, Einnahme von Medikamenten, Hormonpräparaten und Nahrungsergänzungsstoffen befragt. Verifizierung Alle Selbstangaben der Studienteilnehmer/-innen zu Krebsneuerkrankungen werden durch den Vergleich mit pathologischen Befunden oder Arztberichten überprüft und gemäß des von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) vorgegebenen internationalen Schlüssels zur Klassifikation der Krankheiten (ICD-O2) kodiert. Um in fernerer Zukunft auch Informationen zu Krebsneuerkrankungen über das im Aufbau befindliche Krebsregister Baden-Württemberg zu bekommen, wurde ein Verfahren entwickelt, das in anonymisierter Form einen routinemäßigen Abgleich der EPIC-Daten mit den Daten des Krebsregisters erlaubt. Gleichzeitig melden wir alle von uns innerhalb der Heidelberger Studienbevölkerung erfassten Krebsfälle an das Krebsregister und leisten auf diese Weise einen Beitrag zur Vervollständigung der Datenbasis des Krebsregisters. Dieser Datenaustausch wird kontinuierlich durchgeführt. Auswertung Abschätzungen des Krebsrisikos für verschiedene Expositionsfaktoren werden dann möglich sein, wenn eine ausreichende Zahl von Neuerkrankungen für die entsprechende Krebslokalisation erfaßt wurde. Dies wird in Zusammenarbeit mit dem DIFE (Deutsches Institut für Ernährungsforschung) in Potsdam für Deutschland etwa im Jahr 2004 möglich sein. Hingegen haben Auswertungen auf europäischer Ebene für die zusammengefaßten Daten der an EPIC beteiligten Länder für die häufigen Krebserkrankungen (Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Prostatakrebs) bereits begonnen. EPIC Heidelberg hat die Leitung der EPIC-Arbeitsgruppe Lungenkarzinom zur Quantifizierung der Erkrankungsrisiken für Ernährungs- und andere Lebensstilfaktoren. Für einige Tumorentitäten (Magenkrebs, Lungenkrebs) wur- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention den in Kooperationen auf europäischer Ebene weitere vertiefende Projekte initiiert. Des weiteren wurden die Verzehrsmengen einzelner Lebensmittelgruppen sowie deren Zubereitungsmethoden zwischen den teilnehmenden Studienregionen verglichen. Wissenschaftler der Heidelberger EPIC-Gruppe haben bei der Auswertung folgender Ernährungsmuster auf europäischer Ebene mitgewirkt: „Zufuhr von Ölen und Fetten“, „Fleischzufuhr“, „ Zufuhr von Fleisch und Fleischprodukten klassifiziert nach ätiologischen Hypothesen der Krebsentstehung“, „Zubereitungsmethoden von Fisch und Fleisch“. Deskriptive Analysen der deutschen EPIC-Kohorte hinsichtlich der Rekrutierung wurden zusammen mit EPICPotsdam publiziert. Diese vergleichenden Untersuchungen beziehen sich auf Lebensmittelgruppen, Nährstoffe und Rauchgewohnheiten. [64] Als Teilprojekt von EPIC Heidelberg wurden Untersuchungen zur Bedeutung von Zubereitungsmethoden, wie Braten und Grillen, für die Krebsentstehung durchgeführt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Ernährungsfragebogen der zweiten Nachbefragung um einen Fragekomplex bezüglich der Nahrungsmittelzubereitung ergänzt. Das Ziel ist es, die alimentäre Aufnahme der durch die Zubereitung entstehenden heterozyklischen aromatischen Amine (HAA) bestimmen zu können. [71] Die Bestimmung von Biomarkern der Nahrungsmittelaufnahme in den Blutproben stellt eine Auswertungsebene dar. Die fraktionierten Blutproben umfassen auch DNAMaterial, um molekulargenetische Untersuchungen durchzuführen. Gen-Umwelt-Interaktionen werden zur Beschreibung von Risikogruppen untersucht. Zur Exploration des Zusammenhangs zwischen Ernährung und Krebs wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: „Bedeutung von Cholesterol und Cholesteroloxidationprodukten für die Entstehung von Lungenkrebsrisiko“, „Lipidoxidation und Brustkrebsrisiko“. Des weiteren wurden Untersuchungen zur„Risikoabschätzung genetischer Varianz in Kombination mit Ernährungsfaktoren für das Auftreten von Adipositas“ und ,,Assoziationen zwischen Genpolymorphismen der Immunreaktion und Heuschnupfen“ durchgeführt. [46,47] Im Zusammenarbeit mit dem koordinierenden Zentrum des IARC in Lyon wird an der Entwicklung einer standardisierten europäischen Lebensmitteltabelle gearbeitet. Genetische Epidemiologie (C0505) J. Chang-Claude, L. Beckmann, R. Birr, K.-G. Deck, U. Eilber, P. Galmbacher, U. Gromer, I. Helmbold, S. Hermann, M. Keith, I. Kögel, S. Kropp, I. Reinisch, K. Smit, D. Twardella Kooperationen: Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg (Prof. Dr. H. Bartsch, Dr. A. Risch, Dr. P Schmezer, Prof. Dr. H. Thielmann); Institut für Tropenmedizin, Heidelberg (Prof. Dr. H. Becher); Universitäts-Frauenklinik Heidelberg (Prof. Dr. G. Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie Bastert, Prof. Dr. D. von Fournier); Pathologisches Institut, Heidelberg (Prof. Dr. H.F. Otto); Universitäts-Frauenklinik Kiel (PD Dr. M. Kiechle); Universitäts-Frauenklinik Ulm (Prof. Dr. R. Kreienberg); Institut für Humangenetik. Düsseldorf (Prof. Dr. Bartram, Dipl.math. C. Fischer); Imperial Cancer Research Fund, Leeds, England (Professor T. Bishop); Medical Research Council, Cambridge, England (Professor B. Ponder); Institute of Cancer Research, Sutton, England (Professor M. Stratton); Intituto Nazionale per lo Studio e la Cura die Tumori Ort, Italien (Professor F. Berrino); Sämtliche Kliniken der Studienregionen “Rhein-NeckarOdenwald” und “Freiburg”; Breast Cancer Linkage Consortium; Philipps-Universität, Marburg (Dr. A. Ziegler); BIPS, Bremen (Prof. Dr. R. Frentzel-Beyme); IARC, Lyon, Frankreich (Dr. P. Bofetta) Genetisch-epidemiologische Studien zur Ätiologie des prämenopausalen Brustkrebses Das Projekt hat zum Ziel Suszeptibilitätsgene für Brustkrebs und Ovarialkrebs zu lokalisieren, die Bedeutung und Heterogenität der disponierenden Gene zu klären und die Gen-Umwelt Interaktion zu untersuchen. Die Studien werden von der Deutschen Krebshilfe gefördert. In einer Familienstudie zu Brustkrebs und Eierstockkrebs wurden Familien mit mindestens drei Brustkrebs- oder Ovarialkrebspatientinnen innerhalb von zwei oder drei Generationen erfaßt. Der Nachweis von Keimbahnmutationen des BRCA1-Gens in 33% der Familien mit Brustkrebs sowie Ovarialkrebs und 17% der Brustkrebsfamilien mit mindestens 3 Fällen bestätigten eine höhere a priori Wahrscheinlichkeit für das BRCA1-Gens in BrustOvarialkrebs-Familien. Unterschiede in pathologischen Merkmalen von BRCA1- und BRCA2-bedingten und anderen Brusttumoren werden ermittelt. Neu erkrankte Brustkrebspatientinnen (£ 50 Jahre) aus zwei Studienregionen, “Rhein-Neckar-Odenwald” (von 1992 bis 1995) und “Freiburg-Breisgau-Emmendingen-Ortenau” (von 1993 bis 1995), wurden erfaßt. Zwei Gruppen von Kontrollpersonen (Schwester Kontrolle, Bevölkerungskontrollen aus der gleichen Studienregion) wurden einbezogen. Angaben zu exogenen Faktoren wurden erhoben und biologische Proben (Blutprobe, Paraffinblöcke von Tumorgewebe) für molekulargenetische Untersuchungen gesammelt. Die Fall-Kontroll-Analyse der Fragenbogendaten ergab eine signifikante Risikoreduzierung mit der Dauer des Stillens, die unabhängig vom Schutzeffekt in Verbindung mit Anzahl der Geburten war. Ein hoher täglicher Alkoholkonsum ging mit einem erhöhtem Brustkrebsrisiko einher. Assoziationsstudien wurden durchgeführt, um risikomodifizierende Gene (z.B. im Stoffwechsel von Hormonen wie Progesteron-Rezeptor-Gen und DNA Reparatur wie BRCA2) beim Brustkrebs zu identifizieren. [5,6,13,19,20,31,48,51,67] Förderung: Deutsche Krebshilfe e.V. (1993-1997) Genetisch-epidemiologische Studien zur Ätiologie des Ovarialkrebses Neu erkrankte Ovarialkrebspatientinnen (≤ 75 Jahre) aus zwei Studienregionen, “Rhein-Neckar-Odenwald” und “Freiburg-Breisgau-Emmendingen-Ortenau” (von 1993 bis 1995), wurden erfaßt. Bevölkerungskontrollen aus der gleichen Studienregion wurden einbezogen. Angaben zu exogenen Faktoren wurden erhoben und biologische Proben (Blutprobe, Paraffinblöcke von Tumorgewebe) für molekulargenetische Untersuchungen gesammelt. Die DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 143 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Fall-Kontroll-Analyse der Fragenbogendaten ergab eine eindeutige protektive Wirkung der Einnahme von oralen Kontrazeptiva. Der Schutzeffekt war auch für niedrig dosierte Präparate vorhanden. BRCA1 und BRCA2 wird bei Patientinnen unter 45 Jahren untersucht. [63] Förderung: BMBF „Klinisch-Biomedizinische Forschung“ Programm (1994-1997) Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie der von der Abteilung “Wechselwirkungen von Carcinogenen mit biologischen Makromolekülen” entwickelt wird, sich zur Vorbestimmung der klinischen Strahlenempfindlichkeit der Brustkrebspatientinnen eignet. Eine weitere Validierungsstudie bei Patienten der Thorotrast-Studie der Abteilung “Onkologische Diagnostik und Therapie” ist geplant. Förderung: Bundesamt für Strahlenschutz (1997-2000) Datenmanagement und genetisch-epidemiologische Forschung im Förderungsprogramm der Deutschen Krebshilfe e.V. zum familiären Brustkrebs 144 Ziel dieses Projekt ist es, eine zentrale Arbeitsgruppe für Datenmanagement und genetische Epidemiologie zur Schaffung eines Datenbanksystems für 11 Zentren “Familiärer Brustkrebs” einzurichten. Das Projekt wird durch die Deutsche Krebshilfe gefördert. Diese Datenbank soll alle Datensätze, die von den Arbeitsgruppen Klinik, Molekulargenetik und Psychologie der 11 Zentren geliefert werden, zusammenfassen und dient neuen Erkenntnissen für die Information, Diagnostik, Beratung und Betreuung Betroffener und ihrer Angehörigen aus Hochrisiko-Familien und der Umsetzung der Erkenntnisse aus der Forschung. [8] Förderung: Deutsche Krebshilfe e.V. (1998-2000) Genetische Disposition als Risikomarker für Brustkrebs bei Schadstoffbelastung durch Aktivund Passivrauchen Für verschiedene Genotypen können Umweltfaktoren verschiedene Auswirkungen haben. Die Wechselwirkung der genetischen Polymorphismen in 4 möglichen relevanten Fremdstoffwechselenzymen, N-Acetyltransferase 1 und 2 (NAT1, NAT2), Glutathiontransferase T1 (GSTT1) und Cytochrom-P450-Monooxygenerase 2A6 (CYP2A6) auf das Brustkrebsrisiko in Bezug auf das Aktiv- und Passivrauchen werden untersucht. Von Teilnehmerinnen der vorangegangenen Fall-Kontroll-Studie zum Brustkrebs werden zusätzlich detailliertere Angaben zur Schadstoffbelastung durch Aktiv- und Passivrauchen erhoben. Die molekulargenetischen Untersuchungen werden in Zusammenarbeit mit der Abteilung “Toxikologie und Krebsrisikofaktoren” durchgeführt. Verglichen mit weder aktiv noch passiv exponierten Frauen, ergab sich ein um 31% erhöhtes Brustkrebsrisiko für Aktivrauchende. Bei den Nichtraucherinnen war das Passivrauchen mit einer eindeutigen Risikoerhöhung um 50% verbunden. Förderung: Deutsche Krebshilfe e.V. (1998-2001) Die Bedeutung der individuellen Strahlenempfindlichkeit für die Abschätzung des individuellen Strahlenrisikos beruflich strahlenexponierter Personen unter gegebenen Expositionsumständen Ziel dieser Studie ist, die Prävalenz von Strahlenempfindlichkeit abzuschätzen und Risikofaktoren für Strahlenempfindlichkeit zu identifizieren. Für die klinische Definition von Strahlenempfindlichkeit werden die durch die Strahlentherapie hervorgerufenen akuten Nebenwirkungen bei Brustkrebspatientinnen in der Abteilung Radiologie der Universitäts-Frauenklinik Heidelberg herangezogen. Es wird überprüft, ob ein neu zu etablierender in vitro Assay, Genetik von komplexen Krankheiten: Genetische Kartierung von Brustkrebsgenen und DarmkrebsSuszeptiblilitätsgenen durch „haplotype sharing analysis“ in Isolatpopulationen Die bisher identifizierten Krankheitsgene (BRCA-Gene, HNPCC-Gene), die zu einem stark erhöhten Risiko für das Mammakarzinom und das kolorektale Karzinom disponieren, können das gehäufte Auftreten nur in 30% bis 60% der entsprechenden Familien erklären. Zur Genkartierung weiterer zum Brustkrebs und Kolonkrebs disponierender Gene nehmen wir die „haplotype-sharing“ Methode in einer Isolatpopulation als eine aussichtsreiche Alternative zu den traditionellen Ansätzen. Als geeignete Isolatpopulation wurde die sorbische Population der Oberlausitz ausgewählt, die ethnisch, konfessionell, geographisch, demographisch und historisch einzigartig dokumentiert ist. In Rahmen des von dem HGF-Strategie Fonds geförderten Projektes sollen jeweils ca. 150 “trios” von Brustkrebspatientinnen und Darmkrebspatienten aus der Bevölkerung der Oberlausitz rekrutiert und für ein Genom-Scan einbezogen werden. Förderung: HGF Strategie Fonds (1999-2002) Genetik komplexer Krankheiten: Statistische Methoden der “haplotype sharing analysis” Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung und Anwendung einer effizienten „haplotype sharing“ Methode HSA, einer neuen Methode zur statistischen Auswertung einer genomweiten Analyse in der Untersuchung einer komplexen Krankheit. Die nichtparametrische HSA Methode beruht auf dem Prinzip des „Identity by descent“. In einer geeigneten Isolatpopulation erwarten wir, daß ein Teil der Patienten von einem oder wenigen mutationstragenden Vorfahren ( foundern ) abstammen. Die Patienten haben die Mutation von einem founder und teilen sich ein Chromosomensegment um die Mutation. An dieser Stelle sind sie also „identical by descent“. Während übliche kopplungsanalytische Verfahren die Beziehungen zwischen einzelnen Markern und einem Mutationslocus betrachten, benutzt HSA die Informationen ganzer Chromosomensegmente. Vorteile von HSA ist einmal die geringere Anzahl an Patienten sowie die geringere Anzahl an benötigten Markern. Es sollen die theoretischen Eigenschaften der HSA anhand genetischer und populationsdynamischer Grundlagen für verschiedene genetische Modelle erarbeitet werden. Weitere Arbeitsfelder sind die Entwicklung von Tools DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung C0500 Klinische Epidemiologie für Simulationen, Haplotypisierungen und die Berücksichti-gung von fehlenden Daten. Anhand von empirischen Daten aus verschiedenen Studien werden die Eigenschaften der HSA untersucht und validiert. Die Methode wird zur Identifizierung von Brustkrebs- und Darmkrebs-Suszeptilitätsgenen in der sorbischen Population in der Oberlausitz benutzt. [44] das Lungenkrebsrisiko in Bezug auf die berufliche Exposition gegenüber KMF unter Berücksichtigung von Störfaktoren wie Rauchen, Alkoholkonsum und andere berufliche Expositionen, zu ermitteln. Expositionsbewertungen erfolgen basierend auf Angaben eines Expertpanels von Betriebsleitern und Vorarbeitern sowie auf Angaben von Hinterbliebenen. [52] Förderung: HGF Strategie Fonds (1999-2002) Förderung: International Agency for Research on Cancer (19961998) The International BRCA1/2 Carrier Cohort Study Angesichts der vermuteten Natur der BRCA1- und BRCA2-Gene (Tumorsuppressorgene) können exogene Risikofaktoren die Wahrscheinlichkeit einer somatischen Mutation des verbliebenen ‘normalen’ Allels und damit den Zeitpunkt, wann die Krankheit ausbricht, auch Penetranz genannt, beeinflussen. Tatsächlich werden in Familien mit BRCA-Mutationen auch Frauen beschrieben, die erst im hohen Alter Brustkrebs entwickelten oder bis zum hohen Alter gesund bleiben. Es wird Gegenstand der Untersuchung bei Mutationsträgerinnen aus zahlreichen europäischen Ländern und aus Kanada sein, den Einfluss exogener Risikofaktoren weiter zu charakterisieren und die Bedeutung prophylaktischer Chirurgie für das Erkrankungsrisiko prospektiv zu ermitteln. Kohortenstudie bei Vegetariern (20 Jahre-Mortalitäts-Follow-up) Förderung: EU/ Europe Against Cancer (2000-2002). Lebensstilfaktoren von 1904 deutschen Vegetariern werden in Bezug auf ihre Mortalität seit 1978 untersucht. Regelmäßige körperliche Aktivität, die Dauer des Vegetarismus und der Vegetarier-Status (streng oder moderat) wurden als Determinanten der Gesamt-Mortalität, der Krebsmortalität und/oder der Mortalität an kardiovaskulären Erkrankungen gefunden. Eine gemeinsame Analyse von amerikanischen und europäischen prospektiven Kohortenstudien ergab eine erniedrigte Mortalität von Vegetariern verglichen mit Nicht-Vegetariern vorwiegend für ischämische Herzkrankheiten. Der Follow-up dieser Kohorte wurde bis Ende 1999 weitergeführt für weitere Analysen. Europäische multizentrische Studie: Assoziationen zwischen Ernährungs- und Lebensstilfaktoren und genetischer Prädisposition im Auftreten von Brustkrebs bei jungen Frauen [1] Aronson K.J.*, Miller A.B., Woolcott C.G.* et al. Breast adipose tissue concentrations of polychlorinated biphenyls and other organochlorines and breast cancer risk. Cancer Epid Biom Prev (2000) 9: 55-63. Diese multizentrische Studie in 7 Ländern untersucht die Frage, ob sich bekannte Lebensstil- und Umweltfaktoren, die als Risikofaktoren für Brustkrebs gelten, gleichermassen auf Patientinnen mit und ohne genetische Disposition auswirken. Brustkrebspatientinnen in der RheinNeckar- und Ortenau-Region sowie im gesamten Bundesland Rheinland-Pfalz, die bei der Diagnose (zwischen 1998 und 2002) jünger als 40 Jahre alt waren, sollen für eine Teilnahme an der Studie gewonnen werden. Daten über Ernährungsfaktoren, verschiedene Lebensstilfaktoren, Reproduktivitätsfaktoren, und hormonelle Faktoren werden mit selbstauszufüllenden Fragebogen gewonnen. Das Risiko einer genetischen Disposition wird zunächst anhand der familiären Krebserkrankungen geschätzt. Das gewählte „Case-Only“ Studiendesign ermöglicht Gen-Umwelt-Interaktionen mit größerer statistischer Power festzustellen, erlaubt jedoch keine Aussage über die Effekte der einzelnen Risikofaktoren. Förderung: Europäische Union Fifth Framework Programme(2001-2003). Verlängertes Follow-up und eingebettete FallKontrollstudie in der Kohortenstudie zur Exposition gegenüber künstlichen Mineralfasern Im Rahmen der internationalen Kohortenstudie unter Beschäftigten in der Herstellung künstlicher Mineralfasern (KMF) wurde eine eingebettete Fall-Kontrollstudie mit den Lungenkrebsfällen und geeigneten Kontrollpersonen innerhalb der Kohorte durchgeführt, um Publikationen (* = externe Koautoren) [2] Becker N. Brustkrebs-Screening (Letter). Radiologe (2000) 40: 835. [3] Boyd N.F.*, Jensen H.M.*, Cooke G.*, Lee Han H.*, Lockwood G.A.*, Miller A.B. Mammographic densities and the prevalence and incidence of histological types of benign breast disease. Eur J Cancer Prevention (2000) 9: 15-24. 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Deseyve) Dr. Karen Steindorf (0,5) Awi Wiesel (09/00 - 04/01) ohne Vergütung Doktoranden/Diplomanden Karsten Geletneky Gael Hammer ( -06/00) Gastwissenschaftler Prof. Dr. Wieslaw Jedrychowski, Warschau, Polen (03-04/00) 148 Technische Mitarbeiter Evelyn Kludt (0,5) - 09/01 Wissenschaftliche Hilfskraft: Martin Ritschel (06/01-05/02) Zivildienstleistende Martin Ritschel (08/00-05/01) Frank Seyfried (05/01-04/02) Sekretariat Erika Stolte (0,5)( - 11/01) Angelika Lampe (0,25) (12/01 - ) Die Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie hat es sich zur Aufgabe gemacht, die Bedeutung verschiedener Umweltfaktoren, wie z. B. elektromagnetische Felder, körperliche Aktivitäten und berufsbedingte Noxen, in Zusammenhang mit der Entstehung unterschiedlicher Krebserkrankungen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Forschungsaufgaben sollen neben den klassischen Verfahren der Epidemiologie (Fall-Kontroll-Studien, Kohortenstudien usw.), in denen weitgehend mit den Methoden der Befragung durch Interviews gearbeitet wird, auch weitergehende Untersuchungen bezüglich des Zusammenhanges zwischen diesen vermuteten Risikofaktoren und körperspezifischen Bedingungen, wie z.B. Biomarkern, “host factors”, genetischen Prädispositionen und Co-Morbidität durchgeführt werden. Ebenso werden der Einfluss von anderen Umweltfaktoren wie z.B. Ernährungsbedingungen körperliche Aktivität und Rauchen analysiert [1,2,3,4,5]. Zur Bearbeitung dieser Fragen wurden verschiedene Forschungsprojekte etabliert: Im Mittelpunkt der inhaltlichen Forschungstätigkeiten stehen zur Zeit Untersuchungen über den Einfluss von elektromagnetischen Feldimmissionen, die u.a. durch die Nutzung von mobilen Kommunikationseinrichtungen (wie z.B. „Handys“) auftreten, auf die Entstehung von Hirntumoren. Zusätzlich soll die kontrovers diskutierte Rolle beruflicher Risikofaktoren auf die Hirntumorentstehung geklärt werden. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe liegt auf der Untersuchung des Einflußfaktors körperliche Aktivität, der für verschiedene Krebsarten als protektiver Faktor in der Tumorätiologie diskutiert wird. Hierbei stehen derzeit Studien zu Brustkrebs und zu Kolorektalkarzinomen im Vordergrund. In einer virologisch-epidemiologischen Studie wird in Zusammenarbeit mit der Abt. Angewandte Tumorvirologie des DKFZ die Bedeutung einer Infektion mit adeno-assoziierten Viren auf den Schwangerschaftsverlauf und die Entwicklung des Embryos untersucht, da diese Viren u.a. als Vektoren im Rahmen der Tumortherapie diskutiert werden. In Kooperation mit der Universität Mainz werden Daten des Mainzer Kindergeburten-Registers im Hinblick auf angeborene Fehlbildungen und mögliche ätiologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus soll die Prävalenz onkologischer Erkrankungen bei Kindern mit Fehlbildungen ermittelt werden. Der methodische Forschungsschwerpunkt liegt auf Quantitativen Risikoabschätzungen. Deren Ziel ist es, aus den Ergebnissen von epidemiologischen Studien konkrete Aussagen zu dem Gefährdungspotential verschiedener Risikofaktoren in einer bestimmten Bevölkerung abzuleiten. Derartige Untersuchungen stellen ein wichtige Basis für Entscheidungen im Öffentlichen Gesundheitswesen dar. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Hochfrequente elektromagnetische Felder B. Schlehofer, K. Schlaefer, I. Hettinger, E. Kludt, J. Wahrendorf In Zusammenarbeit mit: Interphone Study Group: Prof. Dr. Maria Blettner, Dr. Gabriele Berg, Universität Bielefeld, Dr. Joachim Schüz, Prof. Dr. Jörg Michaelis, Universität Mainz; Dr. Elisabeth Cardis, IARC, Lyon, Frankreich; Prof. Dr. Bruce Armstrong, NSW Cancer Council, Kings Cross, Australien; Dr. Martine Hours, Université Claude Bernard Lyon, Frankreich; Dr. Anssi Auvinen, University of Tampere, Finnland; Dr. Liz Findlay, NHS Scotland, Edinburgh, UK; Dr. Christoffer Johansen, Danish Cancer Society, Kopenhagen, Dänemark; Dr. Simon Mann, National Radiological Protection Board, Chilton, UK; Prof. Dr. Baruch Modan, The Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer, Israel (verstorben); Prof. Dr. Daniel Krewski, University of Ottawa, Ottawa, Kanada; Dr. Stefan Lönn, Karolinska Institute, Stockholm, Schweden; Dr. Toru Takebayashi, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan; Dr. Paolo Vecchia, Istituto Superiore di Sanità, Rom, Italien; Dr. Tore Tynes, Norwegian Radiation Protection Authority, Østerås, Norwegen, Dr. Alistair Woodward, University of Otago, Wellington, Neuseeland. Gesundheitsschädigende Wirkungen hochfrequenter elektromagnetischer Felder, wie sie z. B. durch die Nutzung des Mobilfunks auftreten, wurden in den letzten Jahren, nicht zuletzt aufgrund der uneinheitlichen Ergebnisse vielseitiger Forschungsaktivitäten, äußerst kontrovers diskutiert. Expositionen mit hochfrequenten elektromagnetischen Feldern sind neben dem Gebrauch durch eine Vielzahl mobiler Kommunikationseinrichtungen (z. B. Handys, Funk- oder schnurlose Telefone) auch durch spezifische berufliche Tätigkeiten gegeben. Ein Handlungsbedarf für die Erforschung dieses Feldes mit verbesserter Methodik und auf den Ergebnissen vorangegangener Untersuchungen aufbauender Fragestellungen ergibt sich, neben der öffentlichen Besorgnis, auch aus der starken Zunahme der Exposition. So benutzten nach Angaben der Telekom Ende 2001 bereits 56 Millionen Bundesbürger ein Handy (ca. 65% der bundesdeutschen Bevölkerung). Studien zur validen Quantifizierung gesundheitlicher Risiken durch Hochfrequenzstrahlung sind somit gerade zum heutigen Zeitpunkt zwingend geboten. Auf dieser Basis führt die International Agency for Research on Cancer (IARC), gefördert durch das V. Rahmenprogramm der EU, seit dem Jahr 2000 eine internationale, multizentrische, populationsbezogene FallKontroll-Studie zu Tumoren des Kopf- und Halsbereiches (Gliome, Meningeome, Akustikusneurinome und Parotistumoren) durch, an der Australien, Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Israel, Italien, Japan, Kanada, Neuseeland, und die skandinavischen Länder beteiligt sind. Dabei soll die Möglichkeit geprüft werden, in wie weit gesundheitliche Risiken durch die Mobilfunknutzung und durch sonstige Expositionen gegenüber hochfrequenten elektromagnetischen Feldern im privaten und beruflichen Bereich bestehen. Die Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie des DKFZ Heidelberg (Prof. Dr. Jürgen Wahrendorf) beteiligt sich zusammen mit der Arbeitsgruppe Epidemiologie und Medizinische Statistik der Universität Bielefeld (Prof. Dr. Maria Blettner) und dem Institut für Medizinische Statistik und Arbeitsgruppe C0600 Umweltepidemiologie Dokumentation der Universität Mainz (Prof. Dr. Jörg Michaelis) als gemeinsame deutsche Studiengruppe an diesem Projekt (Kurztitel in Heidelberg: Studie zu Umwelt und Gesundheit 2000/2001). Eine Auswertung der gepoolten Studiendaten sowohl für Deutschland als auch im Rahmen eines internationalen multizentrischen Studiendesigns ist nötig, da aufgrund der Seltenheit der zu untersuchenden Tumoren und der noch nicht sehr lange bestehenden Nutzung mobiler Telefone, insbesondere in der deutschen Bevölkerung, nur bei großer Fallzahl mit aussagekräftigen Ergebnissen zu rechnen ist [6,7]. Ziel ist es, für den deutschen Anteil der Fall-Kontroll-Studie in den drei Studienregionen Heidelberg, Bielefeld und Mainz in einer 3-jährigen Erhebungsphase (bis Ende 2003) ca. 700 Patienten, die im Alter von 30 bis 69 Jahren an primären Hirntumoren (Gliomen, Meningeomen, Akustikusneurinomen) inzident erkrankt sind, aus den jeweiligen regionalen Neurochirurgischen Kliniken zu rekrutieren. Parallel dazu wird eine doppelt so große Anzahl von Kontrollpersonen (gematcht nach Alter und Geschlecht zu den Fällen) aus der Bevölkerung der Studienregionen (Gesamteinwohnerzahl ca. 5.5 Millionen) befragt. Das Studiendesign und das Befragungsinstrument, ein Computer unterstütztes Interview (CAPI), ist für alle Studienzentren der internationalen Studie einheitlich. Schwerpunkt der Befragung ist es, durch ein direktes Interview die Telefoniergewohnheiten der Studienteilnehmer detailliert zu erfassen. Die Vorarbeiten zu dieser Studie wurden bereits 1999 durchgeführt. Mit der Rekrutierung von Fällen und Kontrollen konnte im Oktober 2000, nach Fertigstellung der Erhebungsinstrumente und aller Begleitunterlagen begonnen werden. Bis Ende 2001 wurden für den deutschen Studienanteil 263 Hirntumorpatienten als relevant für die Studie identifiziert, 87% (n=228) konnten interviewt werden, 106 davon kamen aus den neurochirurgischen Kliniken Heidelberg und Mannheim. Von den in den deutschen Studienregionen insgesamt 729 angeschriebenen Kontrollpersonen mussten 65 aus unterschiedlichen Gründen (z.B. Sprachproblemen, Wohnortswechsel) ausgeschlossen werden. Von den verbliebenen 664 „relevanten“ Kontrollen wurden 341 interviewt, 23 war zu krank, 165 Personen verweigerten die Teilnahme und 135 Personen waren noch in Bearbeitung. Im Heidelberger Studienzentrum konnte von 266 relevanten Kontrollen 116 interviewt werden, 58 Personen verweigerten und 91 Kontrollen waren in Bearbeitung. Die Erhebungsphase der Studie wird Ende 2003 abgeschlossen werden. Mit ersten Ergebnissen ist frühestens Anfang 2004 zu rechnen. Parallel zur Datenerhebung wurden im Rahmen einer Validierungsuntersuchung die Angaben zum Telefonierverhalten für die deutschen Studienzentren gemeinsam in Bielefeld durchgeführt und 2002 abgeschlossen. Für die Validierung der histologischen Diagnose wird anhand einer Stichprobe der Studienteilnehmer eine Referenzpathologie in Lyon durchgeführt; die Lokalisation der Tumoren wird mit Hilfe der Dokumentation aus bildgebenden Verfahren (MRT, CT) detailliert ermittelt. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 149 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Dieses Vorgehen soll 2002 nach Vorgaben aus Lyon durchgeführt werden. Berufliche Risikofaktoren für Hirntumoren I. Hettinger, B. Schlehofer, J. Wahrendorf In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Anders Ahlbom, Institute for Environmental Medicine, Stockholm, Schweden; Prof. Dr. Annie Arslan, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, Frankreich; Prof. Dr. Maria Blettner, Universität Bielefeld; Prof. Dr. Won N. Choi, Manitoba Cancer Treatment & Research Foundation, Winnipeg, Kanada (verstorben); Prof. Dr. Graham G. Giles, Anti Cancer Council of Victoria, Victoria, Australien; Prof. Dr. Geoffrey Howe, Columbia University School of Public Health, New York, USA; Prof. Dr. Julian Little, University of Aberdeen Medical School, Aberdeen, UK; Dr. Francois Menegoz, Registre du Cancer du Department de l’Isère, Frankreich; Prof. Dr. Susan Preston-Martin, University of Southern California School of Medicine, Los Angeles, USA; Dr. Philip Ryan, University of Adelaide, Adelaide, Australien. 150 Im Rahmen einer Internationalen populationsbezogenen Studie zur Ätiologie von Hirntumoren im Erwachsenenalter wurden Daten zu verschiedenen potentiellen Risikofaktoren, aus den Bereichen Ernährung, Lebensstil (z.B. Rauchen und Alkohol), berufliche Tätigkeit und zur medizinischen Vorgeschichte erhoben. Die Studie wurde Ende der 80er Jahre nach gleichem Protokoll in acht Studienzentren in Australien, Kanada, Europa (Frankreich, Deutschland, Schweden) und den USA durchgeführt. Insgesamt konnten 331 Meningiom- und 1178 Gliomfälle, sowie 1123 Meningiom- und 1987 Gliomkontrollen (gematcht nach Alter, Geschlecht und Region) rekrutiert werden. Die Abteilung Epidemiologie des DKFZ hat sich bereits mehrfach an der Auswertung des Datenmaterials beteiligt. Aktuell stehen die Informationen zu beruflichen Risikofaktoren im Mittelpunkt unserer Untersuchungen. Risikofaktoren für Hirntumoren werden für verschiedene berufliche Tätigkeiten und Expositionen kontrovers diskutiert. Die Analyse des gepoolten Datensatzes der Internationalen Fall-Kontroll-Studie soll zur Klärung der Rolle der beruflichen Tätigkeit und damit verbundener Substanzexpositionen im Hinblick auf die Entstehung von primären Hirntumoren (Gliomen und Meningiomen) beitragen. Von allen Studienteilnehmern wurden Daten zu beruflichen Tätigkeiten über das gesamte Berufsleben erhoben und in 16 Berufsgruppen kategorisiert. Zusätzlich wurden anhand einer Liste Informationen zu spezifischen Substanzexpositionen erhalten. Aufgrund von Informationen aus der Literatur standen à priori sechs Berufsgruppen im Mittelpunkt der Analysen: „Chemie“, „Metall“, „Elektro“, „Bau“, „Transport“ und „Landwirtschaft“ [8]. Als Hauptresultate liegen vor: Für Gliome konnten keine beruflichen Risikofaktoren identifiziert werden. Für Meningiome zeigten sich signifikant nahezu 2fach erhöhte Risiken in den Kategorien „Bau“ und „Transport“. Bezüglich Substanzexpositionen weisen die beruflichen Expositionen mit Isoliermaterial, Metall- und Metallverbindungen und mit Ölprodukten ein deutlich erhöhtes Risiko nur für Meningiome auf. Für die Exposition mit kosmetischen Produkten ergab sich ein signifikant dreifach erhöhtes Arbeitsgruppe C0600 Umweltepidemiologie Risiko für Meningiome. Geschlechtspezifische Unterschiede konnten herausgearbeitet werden; so basierte das Ergebnis für Isoliermaterial hauptsächlich auf exponierten Männern, und das Ergebnis für kosmetische Produkte überwiegend auf exponierten Frauen. Da ätiologische Faktoren von Hirntumoren noch immer nicht hinreichend geklärt sind und bisher nicht alle Daten der Internationalen Hirntumorstudie ausgewertet werden konnten, hat sich die Arbeitsgruppe Umwelt-Epidemiologie und die AG Epidemiologie und medizinische Statistik der Universität Bielefeld entschlossen, weitere Bereiche der Studie zu untersuchen. So wurde in einer Zusammenarbeit mit dem französischen Studienzentrum [9] das Risiko von Tierkontakten auf Hirntumoren untersucht. Körperliche Aktivität und Krebs K. Steindorf, M. Schmidt In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Wieslaw Jedrychowski, Universität Krakau, Polen; PD Dr. Jenny Chang-Claude, Silke Kropp, Abteilung Klinische Epidemiologie, DKFZ Ein Zusammenhang zwischen körperlicher Aktivität und der Entstehung von Tumoren wird für verschiedene Krebsarten diskutiert, so z.B. für Darm- und Brustkrebs, aber auch für Gebärmutter- und Prostatakrebs. Körperliche Aktivität stellt einen Faktor dar, der auf Individual- und auf Bevölkerungsebene in seiner Häufigkeit und Intensität veränderbar ist. Daher besitzt er ein hohes Potential für die Gesundheitserziehung und die primäre Prävention von Tumoren. Aus wissenschaftlicher Sicht handelt es sich bei der Größe „körperliche Aktivität“ um eine komplexe Variable. So müssen z.B. Arbeits- und Freizeitverhalten, Verhaltensweisen in verschiedenen Lebensaltersstufen, jahreszeitliche Einflüße und Wechselwirkungen zu anderen Lebensstilfaktoren wie z.B. der Ernährung und Beruf berücksichtigt werden. In der Literatur finden sich verschiedene Ansätze zur Erhebung und Auswertung von körperlicher Aktivität, von sehr einfachen Abfragen bis hin zu sehr detaillierten und aufwendigen Befragungen. Ein Ziel des laufenden Projektes ist daher die Fortentwicklung und Validierung von standardisierten Erhebungs- und Auswertungsmethoden für verschiedene Arten von körperlicher Aktivität. Es wurden verschiedene Kooperationen initiiert, um unsere Forschungsergebnisse in Studien zu verschiedenen Krebsformen einzubringen. Neben diesem eher methodischen Schwerpunkt besteht ein weiteres wichtiges Ziel dieses Projektes darin, die Erkenntnislage für verschiedene Tumoren zu verbessern und somit die Erstellung von konkreten Empfehlungen für das Gesundheitsverhalten zu unterstützen. Im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie der Universität Krakau (Polen) zur Entstehung von Kolorektalkarzinomen wurden 180 neu an einem derartigen Tumor erkrankte Patienten und 180 Krankenhauskontrollen untersucht. Der Schwerpunkt der Kooperation lag sowohl auf der gemeinsamen Betrachtung von körperlicher Aktivität im Beruf und in der Freizeit, als auch auf der ausführlichen Analyse möglicher Wechselwirkungen zu anderen Lebensstilfaktoren DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention wie z.B. der Ernährung [10,11,12,13]. Im Rahmen einer Fall-Kontroll-Studie mit 468 Brustkrebsfällen und 1093 Kontrollen wurde in den Jahren 1999 bis 2000 eine ausführliche Erhebung der körperlichen Aktivität der Studienteilnehmerinnen vorgenommen. Aus den noch laufenden Auswertungen werden weitere Erkenntnisse zu dem Einfluß von körperlicher Aktivität und Brustkrebs hervorgehen. Quantitative Risikoabschätzungen und statistische Methoden in der Epidemiologie K. Steindorf In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Maria Blettner, Universität Bielefeld; Prof. Dr. Heiko Becher, Universität Heidelberg Das Ziel von Quantitativen Risikoabschätzungen ist es, die gesundheitlichen Auswirkungen einer Substanz oder einer Lebensbedingung in einer Bevölkerung auf der Basis epidemiologischer und toxikologischer Erkenntnisse quantitativ zu beschreiben. Derartige Bewertungen stellen eine wichtige Grundlage für Entscheidungen im Öffentlichen Gesundheitswesen dar. So war die Arbeitsgruppe an der Erarbeitung von Empfehlungen für die deutsche Strahlenschutzkommission beteiligt. Dabei wurden verschiedene Konzepte für die Sanierung von Innenräumen, die mit dem radioaktiven Edelgas Radon belastet sind, bezüglich ihres gesundheitlichen Nutzens bewertet. Neben der Durchführung von Quantitativen Risikoabschätzungen anhand von etablierten Verfahren spielt die Erweiterung des Methodenspektrums eine wichtige Rolle. Schwerpunkte liegen dabei derzeit auf der gemeinsamen Untersuchung von Quantitativen Risikoabschätzungen und Meta-Analysen, deren Ziel es ist, die Informationen verschiedener Quellen gemeinsam zu bewerten und auf den speziellen Problemen, die sich bei der Betrachtung von kleinen Risiken ergeben. Auch die Berücksichtigung von individuellen Suszeptibilitäten und Hoch-Risikogruppen gerät zunehmend in den Vordergrund von Quantitativen Risikoabschätzungen [14]. Es ist zu erwarten, dass das Teilgebiet der Quantitativen Risikoabschätzungen mit der politischen Neuorganisation des Verbraucherschutzes zusätzlich an Bedeutung gewinnt. Eine stetige Fortentwicklung der generellen statistischen und epidemiologischen Methoden ist für die Epidemiologie unerläßlich, nicht zuletzt durch die rasanten Entwicklungen in den der Epidemiologie assoziierten Fächern wie der Genetik und der Molekularbiologie. Wichtige Aspekte stellen dabei die Entwicklung geeigneter Studiendesigns und Erhebungsmethoden, die Datenerfassung und die Auswertung mit adäquaten statistischen Methoden dar. Im Berichtszeitraum wurden von der Arbeitsgruppe zwei wissenschaftliche Workshops zu aktuellen Themen (Epidemiologische Methoden für die Krebsfrüherkennung, Verfahren der räumlichen Statistik) veranstaltet. Arbeitsgruppe C0600 Umweltepidemiologie Angeborene morphologische Defekte K. Schlaefer, J. Wahrendorf, A. Wiesel In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Annette Queisser-Luft, Kinderklinik der Universität Mainz In der Bundesrepublik Deutschland sind angeborene Fehlbildungen die häufigste Ursache der Kindersterblichkeit (ca. ein Viertel aller kindlichen Todesfälle). Die Prävention angeborener Fehlbildungen ist daher eine wesentliche Aufgabe der Pädiatrie. Eine systematische Registrierung von angeborenen Fehlbildungen stellt die Grundlage zur Bearbeitung wissenschaftlicher Fragestellungen und damit auch zur Ursachenforschung dar. Epidemiologische Daten und Analysen können Ansatzpunkte zur Prävention von Fehlbildungen liefern und sind daher wesentliche Grundlagen für gesundheitspolitische Maßnahmen. Die intrauterine Entwicklung des Kindes kann durch äußere Störfaktoren (z.B. chemische und physikalische Noxen, Medikamenteneinnahme in der Schwangerschaft, Fehlernährung, ökosoziale Faktoren, berufliche Expositionen) beeinflusst und sehr empfindlich gestört werden. Fehlbildungen können dann die Folge solcher schädigenden Einflüsse sein. Aber noch immer sind in ca. 60% der Fälle die Ursachen angeborener Fehlbildungen nicht bekannt. Seit 1990 besteht das Mainzer Geburtenregister zur Erfassung angeborener Fehlbildungen bei Neugeborenen. Ziele dieses Registers sind die Erfassung von bevölkerungsbezogenen Fehlbildungshäufigkeiten, zeitlichen und regionalen Trends sowie die Ermittlung von Ansatzpunkten zur Ursachenforschung angeborener Fehlbildungen [15,16]. Dazu werden alle in Mainz geborenen Kinder (Lebendgeborene, Totgeborene, spontane und induzierte Aborte) nach einem standardisierten Schema klinisch und sonographisch (Hüften und Nieren; bei spezieller Indikation Schädel und Herz) untersucht. Die Zusammenarbeit mit der AG Umwelt-Epidemiologie des DKFZ besteht bezüglich der Auswertung der epidemiologischen Fragestellungen. Seit 1990 wurden mehr als 38.000 Neugeborene (94,8% aller in der Region Rheinhessen geborenen Kinder) in die anonymisierte Auswertung einbezogen. Bisherige spezielle Auswertungen widmeten sich u.a. den Themenbereichen: „Pränatale Diagnose von Fehlbildungen: Sensitivität pränataler Ultraschalluntersuchungen“, „Mütterliche Medikamenteneinnahme und Fehlbildungen beim Feten“ und „Mütterliche Adipositas als Risikofaktor für kindliche Fehlbildungen“. Derzeitige Schwerpunkte bei den Auswertungen liegen in der Ermittlung möglicher Risikofaktoren (z.B. reproduktionsmedizinische Methoden) für die Entstehung angeborener Fehlbildungen, in der Überprüfung der mütterlichen perikonzeptionellen Folsäureeinahme zur Prävention von Neuralrohrdefekten, in der Erstellung der deskriptiven 10Jahres-Auswertung und in der Prävalenz- Ermittlung onkologischer Erkrankungen bei den Kindern mit Fehlbildungen der Mainzer Geburtenkohorte [17]. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 151 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung S0109 Mechanismen der Tumorigenese Publikationen (*= externe Autoren) Studie zum Einfluß von Adeno-assoziierten Viren auf die Schwangerschaft (AAVIS). B. Schlehofer, E. Kludt, J. Wahrendorf In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Jörg Schlehofer, Angewandte Tumorvirologie, DKFZ; Dr. Gernot K. Beisler, Ärztehaus, BadWildbad 152 Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind helferabhängigen Parvoviren (kleine, einzelsträngige, DNA-Viren), mit denen sich die meisten Menschen schon in der Kindheit infizieren. Sie gelten nicht als humanpathogen, sind tumorprotektiv und werden, aufgrund ihrer Eigenschaft sich unter bestimmten Bedingungen ins zelluläre Genom integrieren zu können, als mögliche Vektoren in der Gentherapie diskutiert. In Tierexperimenten und einigen virologischen Studien zeigte sich jedoch ein Zusammenhang zwischen AAV und perinatalen Komplikationen. Im Rahmen einer prospektiven Studie wird untersucht, wie sich die Antikörperprävalenz der Viren während der Schwangerschaft und beim Neugeborenen entwickelt, ob virale DNA im Fruchtwasser nachweisbar ist und ob Infektionen mit AAV und/oder seinen Helfern (Papillom- und Herpes-Viren) den Verlauf der Schwangerschaft, die Entwicklung des Kindes oder den Geburtsvorgang beeinflussen. Im Rahmen einer virologisch-epidemiologischen Kohorten-Studie wurden alle 405 schwangere Frauen, die zwischen Februar 1999 und April 2000 in einer Schwerpunktspraxis für Amniozentese im Raum Pforzheim behandelt wurden zum Zeitpunkt der Amniozentese (T1) in die Studie aufgenommen. Bei ihnen (n=391) wurde sowohl zu (T1) als auch direkt nach der Geburt (T2) bei Mutter (n=270) und Kind (n=261) Serum entnommen und auf IgG und IgM Antikörper (AK) gegen AAV mittels ELISA getestet; zusätzlich wurde bei 396 Frauen das Fruchtwasser auf AAV-DNA mittels PCR untersucht. Für 246 Studienteilnehmerinnen (61%) sind alle 3 Serumproben (zwei mütterliche und ein kindliches) und die Fruchtwasserprobe vorhanden. Die Ergebnisse der Testung der Seren auf AAV-AK und der Fruchtwasseruntersuchungen auf virale DNA werden z.Zt. abgeschlossen. Parallel dazu wurden sowohl zu T1 wie auch zu T2 verschiedene, die Schwangerschaft möglicherweise beeinflussende medizinische und lebensstilbedingte Risikofaktoren per Fragebogen erhoben, ebenso relevante Daten bezüglich früherer und des aktuellen Schwangerschaftverlaufes, der Entbindung und des Kindes. 91% der Fragebogen (n=369) wurden sowohl von den jeweils betreuenden Gynäkologen als auch von den Geburtsstationen der Entbindungskliniken ausgefüllt. Der Einfluss von AAV auf den Schwangerschaftsverlauf und die Entwicklung des Neugeborenen wird mittels multivariater logistischer Regression anhand der Serumbzw. Fruchtwasserergebnisse und der Fragebogenangaben ermittelt. [1] *Brennan, P., *Bogillot, O., *Cordier, S., *Greiser, E., *Schill, W., *Vineis, P., *Lopez-Abente, G., *Tzonou, A., Chang-Claude, J., *Bolm-Audorf, U., *Jöckel, K.H., *Donato, F., *Serra, C., Wahrendorf, J, *Hours, M., *T’Mannetje, A., *Kogevinas, M., *Boffeta, P. (2000) Cigarette Smoking and bladder cancer in men: a pooled analysis of 11 case-control studies. International Journal of Cancer 86: 289-294. [2] *Sala. M., *Cordier, S., Chang-Claude J, *Donato, F., *EscolarPujolar, A., *Fernandez, F., *Conzález, C.A., *Greiser, E., *Jöckel, K.H., *Lynge, E., *T’Mannetje, A., *Pohlabeln, H., *Porru, S., *Serra, C., *Tzonou, A., *Vineis, P., Wahrendorf J, *Boffetta, P., *Kogevinas, M. (2000) Coffee consumption and bladder cancer in nonsmokers: a pooled analysis of case-control studies in European countries. Cancer Causes and Control 11: 925-931. [3] *Brennan P, *Bogillot, S, *Greiser E, Chang-Claude J, Wahrendorf, J, *Cordier, S., *Jöckel KH, *Lopez-Abente G, *Tzonou, A, *Vineis P, *Donato, F, *Hours, M, *Serra, C, *Bolm-Audorff, U, *Schill W, A, *Kogevinas, M, *Boffeta, P (2001) The contribution of cigarette smoking to bladder cancer in women (pooled European data). Cancer Causes and Control 12: 411-417. [4] *Pitard A, *Brennan P, *Clavel H, *Greiser E, *Lopez-Abente G, Chang-Claude J, Wahrendorf J, *Serra C, *Kogevinas M, *Boffetta P (2001) Cigar, pipe and cigarette smoking and bladder cancer risk in European men. Cancer Causes and Control 12: 551-556. [5] *Kynast-Wolf, G., Becker, N., *Kroke, A., *Brandstetter, B., Wahrendorf, J., *Boeing, H. (2001) Linear regression calibration theoretical framework and empirical results in EPIC Germany. Annals of Nutrition and Metabolism, 45: 255-261. [6] *Blettner M, *Michaelis J, Wahrendorf J (2000) Workshop on research into the health effects of cellular telephones. Epidemiology 11: 609-611. [7] Blettner M, *Berg G, Wahrendorf J, Schlehofer B, Schlaefer K, *Michaelis J, *Schüz J (2000) Internationale Fall-Kontrollstudie zur Untersuchung des Risikos für die Entstehung von Hirntumoren durch den Gebrauch von Handys. Forschungsgemeinschaft Funk NEWS letter 1: 8-12. [8] Schlehofer, B., Hettinger, I., *Ryan, P., *Little, J., *Preston-Martin, S., *Ahlbom, A., *Menegoz, F., *Howe, G.R., *Giles, G.G., *Blettner, M. (2001) Occupational risk factors for brain tumours in adults. Results from the international brain tumour case-control study. European Journal of Cancer 37 (Suppl. 6): S23-S24. [9] *Menegoz, R.F., *Little, J., *Colonna, M., *Arslan, A., *PrestonMartin, S., Schlehofer, B., *Blettner, M., *Howe, G.R., *Ryan, P., *Giles, G.G.; *Rodvall, Y., *Choi, N.W. (2002) Contacts with animals and humans as risk factors of brain tumor in adult. An international case-control study. European Journal of Cancer, im Druck. [10] Steindorf, K., *Tobiasz-Adamczyk, B., *Popiela, T., *Jedrychowski, W., *Penar, A., *Matyja, A., Wahrendorf, J. (2000): Combined risk assessment of physical activity and dietary habits on the development of colorectal cancer. A hospital-based case-control study in Poland. European Journal of Cancer Prevention, 9, 309-316. [11] *Jedrychowski, W., Steindorf, K., *Popiela, T., Wahrendorf J., *Tobiasz-Adamczyk, B., *Kulig, J., *Penar, A. (2001): Risk of colorectal cancer from alcohol consumption at lower vitamin intakes. A hospital-based case-control study in Poland. Reviews on Environmental Health, 16, 213-222. [12] *Jedrychowski, W., *Popiela, T., Steindorf, K., *TobiaszAdamczyk, B., *Kulig, J., *Penar, A., Wahrendorf, J. (2001): Nutrient intake patterns in gastric and colorectal cancers. International Journal of Occupational Medicine and Environmental Health, 14, 391-395. [13] Steindorf, K., *Jedrychowski, W. (2001): Der Einfluss von Alkohol und der Aufnahme von Vitaminen auf das Darmkrebsrisiko. Informatik, Biometrie und Epidemiologie in Medizin und Biologie, 2/3, 309-310. [14] *Becher H., *Grau A., Steindorf K., *Buggle F., *Hacke W. (2000): Previous infection and other risk factors for acute Attributable risks and the DKFZ 2002: Wissenschaftlichercerebrovascular Ergebnisberichtischemia: 2000/2001 characterisation of high risk groups. Journal of Epidemiology and Biostatistics, 5, 277-283. Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung S0109 Mechanismen der Tumorigenese Abteilung Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese (C0700) Leiterin: Dr. Monica Hollstein Wissenschaftler: Dr. Walter Beerheide (05/00-12/00) Dr. Manfred Hergenhahn Dr. Jun-Li Luo Dr. Gisela Werle-Schneider (50 %) ( - 12/00) 1. Analyse der Genexpression in Tumoren, Zelllinien, und primären Säugerzellen: Implikationen für die Krebsdiagnose und chemoprevention. M. Hergenhahn, M. Hollstein Doktoranden: Firouzeh Biramijamal ( - 10/00) Boris Zielinski ( - 3/01) Zhipei Liu (ab 10/01) Sebastian Günkel (10/01 - ) In Zusammenarbeit mit H-J Gröne, DKFZ; M.Kenzelmann (Abt.Schütz) DKFZ; H. Scherübl, Freie Universitat, Berlin Technische Angestellte: C. Kalla ( - 12/00) Karl-Rudolf Mühlbauer Ute Schmitt (50 %) ( - 5/01) Annette Weninger Die Abteilung C0700 ist erst zu Beginn des Jahres 2000 eingerichtet worden; eines der Hauptziele von C0700 ist es, die für bestimmte Krebsarten während des Prozesses der Carcinogenese entscheidenden Veränderungen aufzuspüren und molekularbiologisch zu charakterisieren. Auf der Grundlage solcher Kenntnisse können dann Massnahmen zur Frühdiagnose, zur Behandlung und Prognose, und zur primären Prävention verbessert werden. Solche Untersuchungen zu quantitativen Beziehungen im Netzwerk der Genexpression, und zu posttranskriptionellen und -translationalen Kontrollmechanismen werden unser Verständnis grundlegender Prinzipien von Gewebshomöostase und Zellwachstum und damit von Mechanismen der Carcinogenese wesentlich erweitern. Präzise Kenntnisse über dysregulierte Signaltransduktionswege und Kontrollmechanismen in Tumoren sind auch Voraussetzungen für die Entwicklung neuer therapeutischer Targets und entsprechende Pharmazeutika. Ein weiteres Ziel von C0700 sind Beiträge zur Frage, ob und in in welchem Umfang die erwähnten genetischen Veränderungen durch Exposition gegenüber exogenen Carcinogenen, oder eher durch endogene Mechanismen, z.B. in Fällen ererbter genetischer Tumorsuszeptibilität, induziert werden. Zu diesem Problem arbeiten wir neue Ansätze und Verfahren aus. Das langfristige Ziel dieser Aktivität ist die Beschreibung von Genexpressionsprofilen und der dazugehörigen Veränderungen auf der Proteinebene während der Entstehungsphase bestimmter Krebsarten des Menschen. Um eine solche Analyse für eine häufig vorkommende Krebsart durchzuführen, haben wir das Transkriptom von 10 phänotypisch noch normalen Prostatageweben und 18 nicht-metastasierenden Prostatatumoren verglichen; diese Analyse wurde auf dem Affymetrix-System der Abteilung C0700 mit Affymetrix-Chips (ca. 12.600 Sequenzen) durchgeführt, die neben der x-fachen Veränderung der Genexpression jedes Gens auch seine absolute Genexpressionshöhe liefern. Die so gewonnenen Werte sind eine entscheidende Voraussetzung zur Etablierung quantitativer Beziehungen im genetischen Netzwerk der Prostata. Erstmals haben wir weiterhin Expressionsprofile von Tumorepithel- und -stromazellen in Prostatatumoren mit Hilfe einer effizienten, von M.Kenzelmann verbesserten Amplifikationsmethode von Nanogramm-Mengen von RNA dargestellt. Unsere Daten [1] bestätigen die Daten anderer und erweitern sie wesentlich um die Daten aus den Mikrodissektionen. In experimentellen Studien mit primären Zellen und Zelllinien können wir jetzt untersuchen, wie Genexpressionsmuster durch Pharmazeutika, Tumorpromotoren wie TPA oder bestimmte Hormone, oder durch chemopräventive Substanzen verändert werden. Als ersten Ansatz dazu haben wir die Hemmung der Induktion von Epstein-Barr Virus durch den Tumorpromotor TPA in transgenen B-lymphoiden Zellen (Raji DR-LUC-Zellen, in Zusammenarbeit mit Dr. A. Polack, GSF Neuherberg, hergestellt und validiert) untersucht. Die Induktion des EBV in B-Gedächtniszellen könnte eine Rolle bei der Entstehung von EBV-assoziierten Epithel und B-Zelltumoren spielen; eine wenig toxische Substanz, die bei Menschen mit hohem EBV-Risiko (z.B. Patienten nach Organtranplantation, AIDS-Kranken) diese Induktion verhindert, könnte daher von hohem präventivem Wert sein. Wie von uns kürzlich beschrieben [2], ist das chemopräventive Curcumin (die gelbe Substanz im Curry) ein geeigneter Kandidat für diese Aufgabe, da sie über die Hemmung der Transkription von EBVGenen und zellulären Genen und weitere Funktione die Virusinduktion verhindert. Wir untersuchen z.Zt. die Genexpression in Raji-DR-LUC auf Affymetrix-Chips mit dem Ziel, erstmals zelluläre Gene, die an der EBV-Induktion beteiligt sind, zu identifizieren. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 153 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 2. Mutationsanalyse von Tumorsuppressor Genen in Tumoren des Menschen. F. Biramijamal, M. Hollstein In Zusammenarbeit mit: A. Allameh, Teheran, Iran; A. Mandard, Caen, Frankreich; H-J Gröne, DKFZ. Obwohl über die Hälfte aller Tumoren von Patienten Mutationen im p53-Gen aufweisen, die die Funktion des p53-Proteins entscheidend verändert, gibt es eine grosse Bandbreite bei der Prävalenz dieser Tumoren, und beim p53-Mutationsspektrum in verschiedenen Tumorklassen [3]. 154 Die Fluktationen der Häufigkeit, des frühesten Auftretens der Mutation und der Art der Basenveränderungen hängen von zahlreichen Faktoren ab, zu denen die jeweilige Histopathologie eines Tumors und die verschiedenen Risikofaktoren, denen die Patienten ausgesetzt waren, gehören [4]. So sind spezifische ‘Signatur’-Mutationen mit verschiedenen krebserzeugenden Faktoren assoziiert worden; umgekehrt könnte man bei Tumoren unbekannter Ätiologie aus spezifischen Mutationsmustern einen Rückschluss auf die verursachenden Faktoren ziehen. Es ist z.B. gut etabliert, dass Tabakgenuss und Alkoholkonsum die Hauptursachen des Plattenepithelcarcinoms (SCC) des Ösophagus in den U.S.A. und Europa sind [5]. Keiner dieser beiden Faktoren scheint jedoch eine wichtige Rolle bei den entsprechenden SCCs im Iran zu spielen, der die weltweit höchste Inzidenz an diesem Tumor aufweist. In einer kürzlich veröffentlichten Studie zeigten wir, dass die Prävalenz von p53-Mutationen in Ösophagus-SCCs über 60 % liegt, dass das Mutationsmuster sich deutlich von dem in anderen Teilen der Welt unterscheidet, und dass es auf eine besondere inflammatorische Ätiologie hinweist [6]. 3. Entwicklung von Mausmodellen, die Gene des Menschen tragen, für molekularepidemiologische Studien, wie für die präklinische Testung von neuartigen Pharmazeutika, die auf Oncoproteine and mutierte Tumorsuppressor Proteine wirken. J.L. Luo, M. Hergenhahn, M. Hollstein In Zusammenarbeit mit G. P. Pfeifer, Beckman Research Institute, Duarte, California, USA; ZQ Wang, International Agency for Research on Cancer, Lyon, Frankreich; C.C. Harris und P. Hussain, National Cancer Institute, Bethesda, USA. Obwohl das p53-Gen hoch konserviert durch die Evolution gegangen ist, gibt es Unterschiede in der Nukleinsäuresequenz und daher auch in der Aminosäurenkette der DNA-Bindungsdomäne (DBD) des p53-Proteins bei Mensch und Maus. Diese beeinflussen einerseits das Mutationsspektrum, und andererseits die Raumstruktur der Komplexe des p53-Proteins mit sich selbst (Tetramer) und anderen Transkriptionsfaktoren. Wir haben daher eine Maus geplant und hergestellt, bei der mit ‘Knock-in’-Technik die für die DBD-kodierende Maus- Abteilung C0700 Genetische Veränderungen bei der Carcinogenese DNA-Sequenz in beiden Maus-Allelen durch die DBDs des humanen p53-Gens ersetzt wurde [7]. Mit einer Reihe von biochemischen Untersuchungen konnten wir zeigen, dass das chimäre Maus-Mensch-Gen in völlig normaler Weise transkribiert und translatiert wird, und dass verschiedene Funktionen des Wiltyp-Proteins in der Hupki-Maus (human p53 knock-in, patentiert) erhalten sind [7]. Chronische UVB-Exposition und Untersuchung der Maushaut auf p53-Mutationen längst bevor Tumoren entstanden, erlaubte mit hochempfindlichen Methoden den Nachweis einer Anhäufung von Mutationen im p53Gen, die denen in Hauttumoren von sonnenexponierten Patienten entsprachen [8]. Wir können mit diesem bisher einzigartigen Mausstamm oder seinen Derivaten wichtige Untersuchungen zur Genese menschlicher Tumoren durchführen. So können z.B. Substanzen präklinisch untersucht werden, die 1) die Anhäufung solcher Mutationen verhindern (Prävention), 2) das p53-Protein vorübergehend ausschalten (um unerwünschte Nebeneffekte von Chemo- und Radiotherapie auf gesunde Zellen eines Patienten zu verhindern), 3) mutiertes Protein wieder ‘zurechtbiegen’ (Konformationsänderung von der mutierten zur WT-Konformation) und damit Tumorzellen in die Apoptose treiben sollen. Publikationen: (* = externer Koautor) [1] Ernst, T., Hergenhahn, M., Kenzelmann, M., *Cohen, C., Bonrouhi, M., Weninger, A., Klären, R., Gröne, E.F., *Wiesel, M., *Güdemann, C., *Keuster, J., *Schott, W, *Stähler, G., *Kretzler, M., Hollstein, M., and Gröne, H-J.: Decrease and gain of gene expression are equally discriminatory markers for prostate carcinoma. A gene expression analysis on total and microdissected prostate tissue. Am. J. Pathology. In press [2] Hergenhahn, M., Soto, U., Weninger, A., *Polack, A., *Hsu, C.H., *Cheng, A.-L. and Rösl, F.: The chemopreventive compound curcumin is an effective inhibitor of BZLF1 mRNA induction in Raji-DR-LUC cells. Molecular Carcinogenesis (2002) 33:137-145. [3] *Hainaut, P.; Hollstein, M.: p53 and human cancer: The first ten thousand mutations. Adv. Cancer Res. vol. 76 (2000) 8 -137. [4] Yang, Q., Wesch, H., *Mueller, K-M., Bartsch, H., *Wegener, K., Hollstein, M.: Analysis of radon-associated squamous cell carcinomas of the lung for a p53 gene hotspot mutation. Br. J. Cancer 82 (2000) 763-766. [5] *Mandard, A.M., *Hainaut, P., Hollstein, M.: Genetic steps in the development of squamous cell carcinoma of the esophagus. Mutation Res. 462 (2000) 335-342. [6] Biramijamal, F., *Allameh, A., *Mirbod, P., Gröne, H-J., Koomägi, R., and Hollstein, M.: Unusual profile and high prevalence of p53 mutations in esophageal squamous cell carcinomas from Northern Iran. Cancer Res. (2001) 61: 3119-3123. [7] Luo, J-L., Yang, Q., *Tong, W.M., Hergenhahn, M., *Wang, ZQ., and Hollstein, M.: Knock-in mice with a chimeric human/ murine p53 gene develop normally and show wild-type p53 responses to DNA damaging agents: a new biomedical research tool. Oncogene (2001) 20:320-328. [8] Luo, J-L., *Tong, W-M., *Yoon, J-H., Hergenhahn, M., Koomägi, R., Yang, Q., *Galendo, D., *Pfeifer, G.P., *Wang, Z-Q., and Hollstein, M.: UV-induced DNA damage and mutations n Hupki (human-p53 knock-in) mice recapitulate p53 patterns in sun-exposed human skin. Cancer Res. (2001) 61: 8158-8163. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Stabsstelle S0103 Krebsprävention Stabsstelle Krebsprävention (S0103) Leiterin: Dr. med. Martina Pötschke-Langer 06221 42-3007; FAX 06221 42-3020; e-mail: [email protected] Wissenschaftliche Mitarbeiter Dipl.-Psych. Dr. Annette Bornhäuser Dipl.-Psych. Peter Lindinger Projektkoordination: Susanne Schunk Technische Mitarbeiter mit Werkvertrag Christa Leiber Dr. Erna Motsch Dagmar Metz Roswita Petersen Elke Treml (09/99-10/00) Freie Mitarbeiter des Rauchertelefones vom Gesundheitsamt Mannheim, der AOK Rhein-Neckar und des Gesundheitsamtes Kreis Bergstrasse Heppenheim Praktikanten Nina Grunze (02/01-05/01) Marcella Munoz (06-07/01) Markus Notheis (08-10/01) Carmen Schletterer (10/0106/02) Auszubildende Kauffrauen für Bürokommunikation Nicole Helker (12/99-03/00) Nina Edelmann (04-06/00) Madeleine Marquetant (07-09/00) Sonja Herrmann (09-12/00) Stephanie Kretz (09-12/00) Simone Burkhard (01-03/01) Dagmar Jarek (04/0106/01) Sarah Koch (07/01-08/01) Kooperationen (ausgewählt): International: Dr. Derek Yach und Prof. Dr. Pekka Puska, World Health Organization, Genf, Schweiz; Dr. Haik Nikogosian, World Health Organization, Kopenhagen, Dänemark; Dr. Scott Leischow, National Cancer Institute, USA; Mike Pertschuk, Advocacy Institute, Washington, USA; Sibylle Fleitmann European Network for Smoking Prevention, Brüssel, Belgien; Dr. Liisa Elovainio, Cancer Society of Finland, Helsinki, Finland; Margaretha Haglund, International Women Against Tobacco, Stockholm, Schweden; Patti White, Health Development Agency, London, UK; Steve Crone, Quit, London, UK; Clive Bates, Action Smoking or Health (ASH), London, UK; Andrew Hayes, UICC, Brüssel - Belgien National: PD Dr. Anil Batra, Universtitätsklinik für Psychiatrie und Psychotherapie Tübingen; Dr. Pal Laszlo Bölcskei, Medizinische Klinik des Klinikum Nürnberg Nord, Nürnberg; Dr. Christoph Kröger, IFT, München; Dr. Reiner Hanewinkel, IFT Nord, Kiel; Dr. Frank Lehmann und Dr. Justina Engelbrecht, Bundesärztekammer Köln; Prof. Dr. Karl Mann, Lehrstuhl für Suchtforschung der Ruprecht-Karls Universität Heidelberg und Klinik für Abhängigkeitsverhalten, Zentralinstitut für seelische Gesundheit, Mannheim; Prof. Dr. Peter Drings, Thorax Klinik, Heidelberg; Volker Beck, Deutsche Krebsgesellschaft, Frankfurt; Prof. Dr. Friedrich Wiebel, Ärztlicher Arbeitskreis Rauchen und Gesundheit, Eching; Dr. Uwe Prümel-Philippsen, Bundesvereinigung für Gesundheit, Bonn; Rolf Hüllinghorst und Dr. Raphael Gassmann, Deutsche Hauptstelle gegen die Suchtgefahren, Hamm; Dr. Eva Kalbheim, Deutsche Krebshilfe, Bonn; Prof. Dr. Gerhardt Simon, Deutsche Lungenstiftung, Donaustauf; Martin Vestweber, Deutsche Herzstiftung, Frankfurt; Gisela Marsen-Storz und Peter Lang, Bundeszentrale für gesundheitliche Aufklärung, Köln Die Stabsstelle Krebsprävention hat 2000/2001 den Arbeitsschwerpunkt Tabakprävention und Tabakkontrolle weiter ausgebaut. Dabei wurden folgende Projekte durchgeführt: 1. Rauchertelefon als zentrale Hotline zur Raucherentwöhnung Die Bereitstellung evidenzbasierter Entwöhnungsangebote für eine große Zahl von Rauchern bei möglichst geringen Kosten erfüllt nur die telefonische Raucherberatung. In Deutschland bestehen unterschiedliche Arten der Informationsvermittlung und Beratung an Telefonen. Ein strukturiertes Beratungsprotokoll sowie Daten zur in Anspruchnahme und Effektivität liegen lediglich beim Rauchertelefon des DKFZ vor [1]. Das Rauchertelefon hat sich nicht nur für ratsuchende Raucherinnen und Raucher sowie deren Angehörigen, sondern auch für Journalisten zu einem bundesweiten Informationsdienst entwickelt. 2. Massenmediale Nichtraucherkampagne im 2-Jahres-Rhythmus nach den internationalen Quit and Win Konzepten Die Stabsstelle Krebsprävention führte im Jahr 2000 die erste Nichtraucherkampagne „Rauchfrei bis Mai - Quit and Win 2000“ in Deutschland durch. Trotz einer kurzen Vorbereitungsphase von nur 2 Monaten war es möglich, 25.000 Raucherinnen und Raucher zu bewegen, an der Kampagne teilzunehmen und diese zu motivieren, dass sie wenigstens einen Monat lang, vom 1. Mai 2000 an, versuchen nicht zu rauchen. Der langfristige Erfolg der Kampagne liegt in der dauerhaften Beibehaltung des Nichtrauchens. Eine Nachbefragung 12 Monate später ergab, dass 30% dauerhaft abstinent geworden sind und weitere 6% sich als abstinent bezeichnen, jedoch angaben, während der vergangenen Monate zwischenzeitlich rückfällig geworden zu sein. [2] Die Stabsstelle Krebsprävention koordiniert auch die zweite Nichtraucherkampagne „Rauchfrei 2002“. Massenkampagnen dieser Art haben noch einen weiteren Effekt: Durch die Nutzung sämtlicher Medien wie Rundfunk, Fernsehen, Internet und Print-Medien wird die Motivation von Raucherinnen und Rauchern zum Rauchstopp gesteigert und gleichzeitig die Akzeptanz des Nichtrauchens erhöht. Dieser Medieneffekt trägt dazu bei, dass auch stabile Raucher zunehmend erwägen, den Rauchstopp vorzunehmen. Deshalb sind Kampagnen, die sich an Raucher richten, von besonderer Bedeutung. Die Praktikabilität dieser Kampagnen auch in Deutschland wurde durch die Stabsstelle demonstriert. 3. Curriculum für Gesundheitsberufe zur Tabakabhängigkeit und Raucherentwöhnung In Deutschland bestand bis zum Jahr 2000 das Problem unzureichender Ausbildungs- und Fortbildungsmöglichkeiten für Gesundheitsberufe, welche auf evidenzbasierten Methoden Raucherentwöhnung durchführen wollten. Die Stabsstelle Krebsprävention entwickelte deshalb gemeinsam mit führenden deutschen Raucherentwöhnungsexperten ein Handbuch [3] für ein 4-stündiges Curriculum zur Tabakabhängigkeit und Raucherentwöhnung, welches von der Bezirksärztekammer Nordbaden als Baustein für die Suchtmedizin anerkannt wurde. Das Curriculum wird im DKFZ, aber auch im Rahmen von Fortbildungsveranstaltungen DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 155 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention für Ärzte, Suchttherapeuten und anderen Gesundheitsberufe durchgeführt. 156 4. Die Rauchersprechstunde - Beratungskonzept für Gesundheitsberufe In Zusammenarbeit mit führenden deutschen Suchtmedizinern und Therapeuten entwickelte die Stabsstelle Krebsprävention ein Beratungskonzept, das als Einzelberatung konzipiert wurde und eine vorhandene Lücke schließen soll zwischen Kurzberatung und intensiven Gruppenprogrammen. Das Konzept Rauchersprechstunde ist modular aufgebaut, um den unterschiedlichen Ansprüchen und organisatorischen Rahmenbedingungen in Kliniken, Praxen, Beratungsstellen, Gesundheitsämtern und anderen Einrichtungen gerecht zu werden. Die Rauchersprechstunde kann von Ärzten, Apothekern, Psychologen, Sozialarbeitern, Sozialpädagogen, Krankenschwestern und Krankenpflegern sowie examinierten Mitarbeitern anderer Gesundheitsberufe durchgeführt werden. Das Konzept wurde auch als Ergänzung zum Stufenprogramm in der Arztpraxis „Frei von Tabak“ der Bundesärztekammer und der Kassenärztlichen Vereinigung entwickelt. Die Rauchersprechstunde bildet die Grundlage einer Rahmenvereinbarung des BKK Bundesverbandes mit dem Verband Deutscher Betriebs- und Werksärzte vom 10. September 2001. Dort wird festgestellt, dass das Konzept Rauchersprechstunde für die werksärztliche Praxis geeignet ist. Werksärzte können eine separate Kostenpauschale erhalten, wenn sie eine Fortbildung zur Umsetzung der Rauchersprechstunde absolviert haben und eine darauf basierende Beratungsleistung erbringen. Das Beratungskonzept erschien als erster Band einer neuen Reihe des DKFZ, der „Roten Reihe - Tabakprävention und Tabakkontrolle“. Diese Publikationsreihe ergänzt bestehende Publikationen der BZgA und der Deutschen Hauptstelle gegen die Suchtgefahren, Einrichtungen, mit denen die Stabsstelle Krebsprävention eng zusammenarbeitet. [4] 5. Entwurf eines nationalen Tabakkontrollprogrammes Verhältnisorientierte Tabakkontrollmaßnahmen stellen die Basis für eine erfolgreiche Absenkung des Rauchverhaltens in allen Bevölkerungsgruppen, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen dar. Hierzu gehören unter anderem drastische Tabaksteuererhöhungen, Bekämpfung des Zigarettenschmuggels, ein umfassendes Tabakwerbeverbot, Abbau der Zigarettenautomaten, Durchsetzung des Nichtraucherschutzes und Schaffung rauchfreier Zonen sowie Produktregulation von Tabakwaren, umfassende Verbraucherinformation und große Warnhinweise auf Zigarettenpackungen. Da keine dieser Maßnahmen bisher realisiert wurde, kann Deutschland als in der Tabakkontrolle rückständiges Land bezeichnet werden [5]. Zu diesem Ergebnis kommt auch der Sachverständigenrat für die Konzertierte Aktion im Gesundheitswesen zum August 2001. Der Rat empfiehlt einen grundsätzlichen Neuanfang in der Tabakkontrollpolitik und mahnt die Umsetzung dieser Maßnahmen durch die Politik an. Die Stabsstelle Krebsprävention hat deshalb einen Entwurf für ein nationales Tabakkontrollprogramm auf der Basis wissenschaftlich überprüfter Maßnahmen in Zusammenarbeit mit über 30 Stabsstelle S0103 Krebsprävention deutschen Wissenschaftlern entwickelt. Dieses Strategiepapier für wirkungsvolle Tabakkontrollmaßnahmen wird im Jahr 2002 mit wichtigen Institutionen des deutschen Gesundheitswesens abgestimmt und in die gesundheitspolitische Diskussion eingebracht. Aus aktuellem Anlass wurde bereits im September 2001ein Fact Sheet zum Tabakwerbeverbot herausgegeben. [6] Dieses Fact Sheet wurde als Argumentationshilfe für gesundheitspolitische Entscheidungsträger und Journalisten geschrieben und enthält die wissenschaftlichen Begründungen für ein umfassendes Tabakwerbeverbot. 6. WHO Partnerschaftsprojekt Tabakabhängigkeit Die Stabsstelle Krebsprävention war maßgeblich an der Projektentwicklung des WHO Partnerschaftsprojektes Tabakabhängigkeit, eines Vier-Länder-Projektes der WHO Kopenhagen, beteiligt. Die Stabsstelle hat dabei die Leitung der deutschen Arbeitsgruppe Raucherentwöhnung übernommen und gemeinsam mit anderen Einrichtungen Empfehlungen für die Behandlung der Tabakabhängigkeit entwickelt [7] 7. WHO Projekt „Don’t Be Duped“ Im Rahmen der Tobacco Free Initiative der WHO Genf wurde 1999 eine internationale Arbeitsgruppe der „Change Agents“ gegründet, welche in über 20 Ländern die Kampagne der WHO „Don’t Be Duped“ unterstützt. Ziel ist es dabei, die Rolle der Tabakindustrie in politischen Entscheidungsprozessen transparent zu machen und den Industrieeinfluss zu begrenzen.[8] Die Stabsstelle Krebsprävention ist in dieser internationalen Arbeitsgruppe aktiv beteiligt und vermittelt die Ergebnisse an die Mitgliedsorganisationen der deutschen Koalition gegen das Rauchen, welche, neben dem Deutschen Krebsforschungszentrum, auch die Deutsche Krebshilfe, Krebsgesellschaft, Lungenstiftung, Herzstiftung, Bundesvereinigung für Gesundheit, Bundesärztekammer, Ärztlicher Arbeitskreis Rauchen und Gesundheit sowie die Deutsche Hauptstelle gegen die Suchtgefahren umfassen. 8. Framework Convention on Tobacco Control Da die Tabakepidemie ein weltweites Problem ist, haben sich die Mitgliedsstaaten der WHO darauf geeinigt, eine weltweit gültige Rahmenkonvention zur Tabakkontrolle (Framework Convention on Tobacco Control) zu erarbeiten. Die Verhandlungen um die Texte und die Protokolle des Rahmenabkommens werden seit 2000 geführt. Die Stabsstelle Krebsprävention hat in enger Zusammenarbeit mit der Internationalen Framework Convention Alliance und insbesondere mit der Action on Smoking or Health (ASH) London Kommentare zu den Verhandlungstexten erarbeitet und auf einem Hearing im Bundesministerium für Gesundheit vorgetragen. Die Kommentare zum Rahmenabkommen werden regelmäßig erneuert und den Gegebenheiten angepasst. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Pötschke-Langer M, Lindinger P: Das Rauchertelefon des Deutschen Krebsforschungszentrums - eine nationale Hotline als niederschwelliges Angebot zur Raucherentwöhnung. Haustein K.-O. (Hrsg.) Vorträge der 2. Deutschen Nikotinkonferenz, 99103, 1999 [2] Pötschke-Langer M: Rauchfrei 2002. DAZ 142, 66-69, 2002 [3] Deutsches Krebsforschungszentrum, Bundesvereinigung für Gesundheit, Barmer (Hrsg) Tabakabhängigkeit und Raucherentwöhnung. Heidelberg, Bonn, Wuppertal 2001 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention S0108 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe (S0108) Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Heinz Walter Thielmann Tätigkeit in der Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Florian Gotzes (- 09/99) Dr. Odilia Popanda (jetzt C0200) Doktorand (Medizin) Jin Joo Park H.W. Thielmann Prof. Thielmann ging 1999 in Ruhestand. Die Arbeiten seiner früheren Abteilung Wechselwirkungen von Karzinogenen mit biologischen Makromolekülen werden z. T. in der Abteilung C0200 weitergeführt (s. auch den dortigen Bericht). Prof. Thielmann ist zur Zeit bis 2004 in die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft berufen. Seit 1996 ist H. W. Thielmann Mitglied der Senatskommission der DFG zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe. Laut Mandat erarbeitet die Kommission die wissenschaftlichen Grundlagen des Schutzes der Gesundheit vor toxischen Stoffen am Arbeitsplatz. Ergebnisse der Kommissionsarbeit sind wissenschaftliche Empfehlungen zur Aufstellungen von MAK-Werten (“Maximale Arbeitsplatzkonzentration”), zur Einstufung krebserzeugender Arbeitsstoffe, zur Bewertung fruchtschädigender und erbgutschädigender sowie weiterer Wirkungen. Darüber hinaus greift die Kommission weitere aktuelle Probleme der Gesundheitsgefährdung durch Arbeitsstoffe auf und schlägt Lösungsmöglichkeiten vor. Die Arbeitsergebnisse der Senatskommission werden in Form ausführlicher wissenschaftlicher Begründungen durch die DFG veröffentlicht. Keine der Publikationen trägt die Namen der beteiligten Autoren, damit nicht seitens wirtschaftlicher, politischer oder sonstiger Interessengruppen angegriffen werden können. Die Publikationen werden als Empfehlungen dem Bundesminister für Arbeit und Sozialordnung übergeben. Dieser kann den Empfehlungen - unverändert oder geändert - in geeigneter Form Rechtsverbindlichkeit als Grundlage des Arbeitschutzes verleihen. Die Kommission arbeitet in wissenschaftlicher Freiheit und Unabhängigkeit. Sie ist in der Auswahl und in der Prioritätensetzung der Prüfung von Arbeitsstoffen und weiterer zu untersuchender Probleme an Weisungen nicht gebunden. Ziel der Kommissionsarbeit ist allein der nach dem jeweiligen Stand der Wissenschaft mögliche und gebotene Schutz der Gesundheit der Beschäftigten und deren Nachkommen. Es versteht sich von selbst, dass die Kommissionsarbeit ein Ganzes darstellt. Folglich lässt sich der von einem einzelnen Mitglied geleistete Anteil nicht herauslösen und gesondert beschreiben. In ca. 30 Sitzungen der Kommission bzw. ihrer Ad-hoc-Arbeitsgruppen wurden Bewertungskonzeptionen entwikkelt, Stoffe beurteilt und die Ergebnisse in den Kommissionsmitteilungen “MAK- und BAT-Werte-Liste” der Jahre 2000 und 2001 - jeweils in deutschen als auch englischen Fassungen - veröffentlicht [1,2]. In den Broschüren sind ca. 160 Änderungen und Neuaufnahmen pro Arbeitsjahr dokumentiert. Für jede Neuaufnahme und Änderung wurden detaillierte wissenschaftliche Begründungen erarbeitet. Deren Veröffentlichung erfolgte in der Monographiensammlung “Gesundheitsschädliche Arbeitsstoffe - Toxikologisch-arbeitsmedizinische Begründungen von MAK-Werten” (Herausgeber: H. Greim) der DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 157 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Jahre 2000 und 2001 (30. bis 33. Lieferung) mit jeweils 400-500 Druckseiten pro Lieferung [3]. In der “MAK- und BAT-Werte-Liste 2001” wurden nunmehr die Grundsätze dargelegt, wie die Kommission bei ihren Bewertungen, insbesondere der Ableitung von MAK-Werten vorgeht. In den einschlägigen Kapiteln sind die Kriterien für die Einstufung von Stoffen in folgende Wirkkategorien festgeschrieben: Kanzerogenität, Keimzellmutagenität, Fruchtschädigung, Sensibilisierung, Hautresorption, zulässige Kurzzeit-Überschreitung. 158 Bei der Überprüfung zahlreicher Arbeitsstoffe auf krebserzeugende Wirkung wurden folgende Stoffe als Kanzerogene erkannt und aufgrund ihres Wirkmodus und ihrer Wirkungsstärke in eine der fünf Kanzerogen-Kategorien eingestuft [1-5]: Bitumen (Kategorie 2, d. h. krebserzeugend beim Versuchstier); Nickelmetall und dessen Verbindungen (Kategorie 1, d. h. krebserzeugend beim Menschen); Cobaltmetall und dessen Verbindungen, 1,4-Dichlorbenzol, Naphthalin, Glycidol (Kategorie 2); Formaldehyd (Kategorie 4; diese Kategorie wurde geschaffen, um Kanzerogene zu charakterisieren, deren primärer Angriffspunkt nicht die DNA des Erbguts ist; MAKWert für Formaldehyd, bei dessen Einhaltung kein nennenswerter Beitrag zum Krebsrisiko für den Menschen zu erwarten ist: 0.3 ml/m3); Tri-n-butylphosphat (Kategorie 4; MAK-Wert: 1 ml/m3); Tetrachlormethan (Kategorie 4 mit dem MAK-Wert von 0.5 ml/m3); Ethylbenzol, Dichlormethan, Diethanolamin, Laurinsäure, Terpentinöl, Kresol, 4-Nitroanilin, Toluylendiisocyanat sowie Xylidin-Isomere (Kategorie 3 A; diese Kategorie ist Substanzen vorbehalten, deren Wirkmodus zwar bekannt ist, für die jedoch mangels Daten kein MAK-Wert festgelegt werden kann). In die Verdachtskategorie 3 B wurden eingeordnet: Biphenyl, Blei, Benzochinon, Methyl-tert-butylether, Molybdäntrioxid, Nitromethan, 2,4,6-Trinitrophenol u. a. Keimzellmutagene Wirkung wurde für folgende Stoffen herausgearbeitet und begründet: Benzo[a]pyren, Cobalt und dessen Verbindungen, 1,4-Dichlorbenzol, 1,4-Dichlorbuten, Naphthalin, Trichlorethen u. a. MAK-Werte Für 21 Stoffe änderten sich die MAK-Werte bzw. wurden erstmals ermittelt [1-3]. In 10 Fällen wurde nach eingehender Prüfung der bestehende Wert bestätigt. Für 31 Stoffe konnten aufgrund fehlender Daten keine MAK-Werte festgelegt werden. Auf besondere Gefährdung in der Schwangerschaft wurden 26 Stoffe überprüft und entsprechend klassifiziert. S0108 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Bedeutung der individuellen Strahlenempfindlichkeit für die Abschätzung des individuellen Strahlenrisikos beruflich strahlenexponierter Personen Teilaktivität: Entwicklung eines In-vitro-Testsystems zur Erfassung der Strahlenempfindlichkeit H.W. Thielmann, F. Gotzes, J.J. Park, L. Edler* *Biostatistik (R0700) DKFZ In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. B.-S. Kim (Yonsei-Universität Seoul, Süd-Korea), Prof. Dr. D. von Fournier (Radiologische Klinik der Universität Heidelberg), Dr. W. Haase (Klinik für Radiotherapie und radiologische Onkologie der St.-Vincentius-Krankenhäuser, Karlsruhe), Prof. Dr. M.-L. Sautter-Bihl (Klinik für Radiotherapie des Städt. Klinikums Karlsruhe), Prof. Dr. E. Hagmüller (Klinikum Heilbronn). Zusatzfinanzierung: Forschungsvorhaben StSch 4116 des Bundesamtes für Strahlenschutz, Neuherberg Zur Abschätzung der individuellen Strahlenempfindlichkeit wurden Lymphozyten von Brustkrebspatientinnen herangezogen und zwei zellphysiologische Parameter bestimmt: 1) die Anzahl der Basenfehlpaarungsstellen, die - nach Bestrahlung der Zellen mit 137Cs (γ-Quelle) in vitro - im Zuge der replikativen DNA-Synthese auftreten; 2) die Anzahl von strahleninduzierten DNA-Brüchen sowie deren Beseitigung durch Reparatur. Zu 1). Testprinzip. Nach γ-Bestrahlung enthält die DNAMatrize der Lymphozyten veränderte (d. h. teilzerstörte) Basen, u. a. 8-Oxoguanin, das bei der stimulierten DNAReplikation mit dem falschen Nukleotid Adenin anstelle des korrekten Cytosins paart und folglich Cytosin in den Tochterstrang dirigiert. Die Reparatur dieser Fehlpaarung erfolgt durch selektive enzymatische Abspaltung des Adenins aus dem 8-Oxoguanin : Adenin-Paar. Die Abspaltung wird durch eine spezifische Glykosylase-Endonuklease der Lymphozyten katalysiert, kann jedoch, nach Zell-Lyse, auch von einem zugesetzten Enzym z. B. aus E. coli ausgeführt werden. Der durch das Enzym bewirkte - unvermeidliche - DNA-Einzelstrangbruch wird anschließend mit der Methode der alkalischen Elektrophorese ermittelt [7]. Die Häufigkeit der DNA-Strangbrüche ist somit ein Maß für die Anzahl an Basenfehlpaarungen, und diese Basenfehlpaarungen können zu Mutationen werden, falls die Zelle sie nicht rechtzeitig eliminiert. Die Hypothese (die zu verifizieren oder zu widerlegen ist) unterstellt, dass Basenfehlpaarungen und deren Reparatur bestimmende Variable der Strahlenempfindlichkeit sind [7]. Zu 2). Bei 25 Patientinnen wurde die Einzelzell-Gelelektrophorese zur Abschätzung der Strahlenempfindlichkeit benutzt. Im einzelnen wurden die Lymphozyten jeder Patientin in vitro mit γ-Strahlen einer 137Cs-Quelle bestrahlt, Dosis-Wirkungskurven erstellt sowie die zeitabhängige Eliminierung von DNA-Schäden (DNA-Strangbrüchen) für mehrere Bestrahlungsdosen bestimmt. Das Abklingen der Strahlenschäden gibt Auskunft über das DNA-Reparaturvermögen der Zelle. Vereint man die Dosis-Wirkungs- und Dosis-Zeit-Kurven, die für die Lymphozyten jeder Patientin gewonnen wurden, so erhält man eine Dosis-Zeit-Wirkungsfläche. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Für den geplanten Vergleich dieser Schädigungs- und Reparaturcharakteristik mit den klinischen Zeichen der Strahlenempfindlichkeit stellte sich das Problem, wie die in der Dosis-Zeit-Wirkungsfläche steckenden Informationen zu einer einzigen quantifizierenden Messgröße vereinigt werden konnten. Derzeit existiert für die Datenfülle der Einzelzell-Gelelektrophorese kein validiertes und bindendes Auswertungsverfahren. Das ist einer der Gründe, weshalb die regulatorische Toxikologie diese Elektrophorese bislang nicht als verlässlichen Test anerkennt. Die OECD urteilt ebenfalls zurückhaltend. Um das Defizit zu kompensieren, entwickelten wir folgende Auswertungsmethode und stellten sie in das Internet [8,9] (www.interscience.wiley.com/em): Die Dosis-Zeit-Wirkungsfläche - gebildet jeweils für DNAWanderungsverzögerung im elektrischen Feld (“Olive tail moment”) sowie weiteren Messparametern (“tail DNA”, “tail inertia”) - wird mittels der doppelten Ableitung dieser Wirkungsfläche nach Zeit und Dosis zu einer einzigen Größe (genannt: 2D) komprimiert [7-9]. Die rechnerische Darstellung lautet: d2F/dt,dx [F bedeutet die von Dosis und Zeit bestimmte Wirkungsfläche; (F = f(t,x)]. S0108 Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe [7] Thielmann et al., Die Bedeutung der individuellen Strahlenempfindlichkeit für die Abschätzung des individuellen Strahlenrisikos. In: Bundesamt für Strahlenschutz, Fachbereich Strahlenhygiene, Programmreport 2000. Herausgeber: W. Donhäri, R. Gödde, A. Schmitt-Hannig, M. Williams. Wirtschaftsverlag NW/ Verlag für neue Wissenschaft GmbH. [8] B. S. Kim*, J. Park, L. Edler, D. von Fournier*, H. W. Thielmann (2000) A measure of DNA damage/repair in the single-cell gel electrophoresis (SCGE/comet) assay. International Biometric Society, The XXth International Biometric Conference, Berkeley, Band 1, S. 152, ISSN-1606-8653. [9] B. S. Kim*, J. J. Park, L. Edler, D. von Fournier*, W. Haase*, M.L. Sautter-Bihl*, F. Gotzes, H. W. Thielmann (2002) New measure of DNA repair in the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. Environ. Molec. Mutagen. 40, 50-56. Aus diesem Rechenverfahren resultierten für jede Patientin mindestens zwei quantitative integrale Messgrößen, die, jede für sich genommen, die weit über tausend Einzeldaten eines Dosis-Zeit-Wirkungsexperiments wiederspiegeln und den klinischen Zeichen der Strahlenempfindlichkeit gegenübergestellt werden können [7,8]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] MAK- und BAT-Werte-Liste 2000 (Deutsche und englische Versionen) Senatskommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Mitteilung 36 (2000), VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim. [2] MAK- und BAT-Werte-Liste 2001 (Deutsche und englische Versionen) Senatskommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe Mitteilung 37 (2001), VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim. [3] Autoren der MAK-Kommission, u. a. H. W. Thielmann: “Acetonitril”, “Bitumen”, “Formaldehyd”, “1,4-Dichlorbenzol”, “Biphenyl”, “Ölsäure”, “Naphthalin” und weitere Stoffe. In Greim, H. (Hrsg.): Gesundheitsschädliche Arbeitsstoffe. Toxikologischarbeitsmedizinische Begründungen von MAK-Werten (Maximale Arbeitsplatzkonzentrationen). 30., 31., 32. u. 33. Lieferung, Wiley-VCH-Verlag, Weinheim, 2000 und 2001. [4] Occupational Toxicants, Critical Data Evaluation for MAK Values and Classification of Carcinogens. Vol. 14; Autoren der MAK-Kommission, u. a. Thielmann, H. W.; Herausgeber: H. Greim, Commission for the Investigation of Health Hazard of Chemical Compounds in the Work Area.. Wiley-VCH, Weinheim, 2000. [5] Occupational Toxicants, Critical Data Evaluation for MAK Values and Classification of Carcinogens. Vol. 16; Autoren der MAK-Kommission, u. a. Thielmann, H. W.; Herausgeber: H. Greim, Commission for the Investigation of Health Hazard of Chemical Compounds in the Work Area.. Wiley-VCH, Weinheim, 2001. [6] *Greim, H., *Reuter, U., and Thielmann et al. (contributors). Classification of carcinogenic chemicals in the work area by the German MAK Commission: current examples for the new categories. Toxicology 166, 11-23 (2001). DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 159 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Abteilung S0109 Mechanismen der Tumorigenese Abteilung Mechanismen der Tumorigenese (S0109) Leiter: Prof. em. Dr.rer.nat. Erich Hecker*) Telephon: 06221-424500; Fax: 06221-424498; e-mail: [email protected] Wissenschaftler Dr. Richard Gminski Sekretärin Elfriede Mang _______________ *) Anmerkung: Der Gründungsdirektor und frühere Leiter der Abteilung Mechanismen der Tumorgeneses wurde als Emeritus vom Stiftungsvorstand mit nachstehenden Aufgaben - ohne Budget des DKFZ - betraut: Koordination der Israelkooperation des DKFZ; Vorsitz der Vergabekommission des Dr. Emil-Salzer-Preises für Krebsforschung; Beratung externer Forschungsprojekte oder -institutionen bezügl. Problemen präventiver und/oder regulatorischer Toxikologie, z.B. Ägypten-Projekt, EC-Projekte, pharmazeutische Firmen; Herausgabe verschiedener wissenschaftlicher Zeitschriften und Publikation eigener, wissenschaftlicher Aktivitäten. 160 In den Berichtszeitraum fiel die Beratung des Deutschen Museums, bei der Planung, Entwicklung und Einrichtung einer grundlegend neuen, ständigen Ausstellung, die an historisch bedeutenden und museumspädagogisch geeigneten Beispielen die Entwicklung von Pharmazie und Biomedizin im 19. und 20. Jahrhundert darstellen soll. Darunter fallen u.a. auch Aspekte der Krebsverhütung, vorbeugung und -erkennung sowie der Therapie von Krebskrankheiten. Um den unterschiedlichen Zielgruppen der Besucher die umfangreichen Informationen attraktiv zu vermitteln, z.B. unter dem Motto “Du selbst bist Chemie”, werden moderne Multimedia-Techniken intensiv genutzt. Die am 5. Mai 2001 eröffnete ständige Ausstellung soll bei den Feierlichkeiten zum 100. Jahrestag der Gründung des weltbekannten Museums im Jahr 2003 einen Höhepunkt bilden [1]. - Das aktive Interesse des Berichterstatters an der Geschichte der Krebsforschung - Wissenschaftsgeschichte und deren nationale Umsetzung [siehe Research Report 2001 (1999/2000)] fand einen weiteren Niederschlag in einem historischen Kurzessay zum Internationalen Symposium “100 Years of Organized Cancer Research” [2]. Publikationen [1] Fachbeirat Pharmazie des Deutschen Museums, in: Deutsches Museum München, Museumsführer Pharmazie, 2. Auflage, Redaktion A. Klubertanz, Selbstverlag Deutsches Museum (ISBN 3-924183-56-2), München 2001, S. 118. [2] Hecker, E. Historical essay on the general scientific and of an organized national approach to the fight against cancer, In: 100 Years of Organized Cancer Research - 100 Jahre organisierte Krebsforschung, eds. Wolfgang U. Eckart, A.W. Bauer, Georg Thieme Verlag Stuttgart 2000, pp. 5-10. In der Publikation wissenschaftlicher Ergebnisse liegt der Schwerpunkt im Berichtsabschnitt auf den Arbeitsgebieten “Biochemische Wirkungsmechanismen von Tumorpromotoren (S0109-1/2)” und “Umweltrelevanz von Tumorpromotoren als Krebsrisikofaktoren für den Menschen (S0109-3)”. Im Arbeitsgebiet S0109-1/2 wurde eine früher postulierte Hypothese zum Wirkungsmechanismus der Diterpenester(DTE)-Promotoren über Rezeptoren vom Typ der Proteinkinasen der PKC-Multienzymfamilie in initiierten Zielzellen weiter geprüft [vgl. Research Report 2001 (1999/2000)]. Im Arbeitsgebiet S0109-3 wurden erstmals - basierend auf der 1998 vorgeschlagenen allgemeinen Strategie zur Prüfung verdächtiger, umweltrelevanter Materialien auf ein mögliches Krebsrisiko durch konditionalkanzerogene (tumorpromovierende) Wirkung - zur Risikoprüfung spezielle quantitative Testpläne geschaffen. Dabei waren die zu verwendenden in vitro Teste unter mechanistischen Gesichtspunkten und so auszuwählen, daß sie die Risikoermittlung und -bewertung von Umweltmaterialien schnell und kostengünstig ermöglicht. Langjährige Bemühungen haben gezeigt, daß das Krebsrisiko durch Tumorpromotoren am besten in reproduzierbaren sogenannten “Toxprognosen” für das Versuchstier ausgedrückt wird. Diese sind zur Extrapolation auf das Krebsrisiko des Menschen in analoger Weise geeignet, wie für den Fall der klassischen Solitärkanzerogene in langjähriger Praxis erprobt. Die Bestimmung des Krebsrisikos wird modelhaft für die Einwirkung von Tumorpromotoren des DTE-Typs auf Menschen vorgenommen. Die erzielten Toxprognosen können in der prädiktiven bzw. regulatorischen Toxikologie jeweils bis hin zur Begründung legislatorischer Maßnahmen Anwendung finden. Im Berichtszeitraum wurden auf diesem Wege erstmals Toxprognosen für zahlreiche homöopathische Urtinkturen oder Arzneimittel bestimmt (vgl. unten sowie vorausgehende Research Reports bzw. Ergebnisberichte). DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention Biochemische Wirkungsmechanismen von Tumorpromotoren (S0109-1,2) E. Hecker, K. Schlatterer, G. Krauter In Zusammenarbeit mit: U. Zillmann, Zentrales Tierlabor DKFZ, L. Edler, Biostatistik, DKFZ; P. Chandra, Gustav-Embden-Zentrum der biologischen Chemie, Universität Frankfurt. Es wurde gezeigt, daß eine in vivo Behandlung adulter muriner Epidermis mit dem Hyperplasiogen und Tumorpromotor des Diterpenester (DTE)-Typs TPA zu Ergebnissen führt, die bezüglich der Expression des Proteins p10 mit denen unbehandelter neonataler muriner Epidermis vergleichbar sind [1]. Protein p10 findet sich somit nicht nur in adulter muriner Epidermis [Research Report 2001 (1999/2000)], die mit nicht-promovierenden Hyperplasiogenen oder mit promovierenden DTE behandelt worden war, sondern auch in neonataler muriner Epidermis. Es wird daher angenommen, daß das Protein eher mit zellulären Proliferations- bzw. Differenzierungsprozessen im Zusammenhang steht als mit spezielleren tumor-promovierenden Prozessen. Die Tatsache, daß p10 auch in Papillomen und Karzinomen zu finden ist, widerspricht dieser Hypothese nicht, da diese Tumoren proliferative Tendenz zeigen. Versuche zur Sequenzierung des Proteins p10 resultierten in zwei neuen Partialsequenzen, deren Primärstruktur keine grundsätzlichen Ähnlichkeiten mit schon bekannten Proteinen zeigten. - In unabhängigen Untersuchungen der molekularen Wirkung von Tumorpromotoren des Okadasäure-Typs (Hemmer von Proteinphosphatase), wurde von Japanischen Autoren berichtet, daß sie eine Expression des bekannten Zytokins Tumornekrose-Faktor α (TNFα) auslösen [2]. Sie führen erste Versuche an, die wahrscheinlich machen, daß auch TPA die Expression von TNFα auslösen kann. Die Autoren vermuten, daß z.B. membranständige Formen von TNFα an interkriner Wachstumskontrolle beteiligt sein können. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Schlatterer, K.; Schlatterer, B.; Krauter, G.; Hecker, E.; *Chandra, P.: A novel polypeptide P10 expressed in tumorpromoter-treated murine epidermis and in untreated neonatal murine epidermis. Anticancer Research 20 (2000) 289-292. [2] *Fujiki H. and *Suganuma M.: Unique features of the okadaic acid activity class of tumor promoters, J Cancer Res and Clin Oncol 125, 150-55 (1999). Umweltrelevante Tumorpromotoren als Krebsrisikofaktoren für den Menschen (S0109-3) E. Hecker, R. Gminski, P. Zahn In Zusammenarbeit mit: L. Edler, Biostatistik DKFZ; M. Nawito, S.M.A.D. Zayed, National Research Center, Kairo, Ägpten; H. Metelmann, Fa. Heel Biologische Heilmittel GmbH, Baden-Baden. Modellfall “berufsbedingte Einwirkung” von Tumorpromotoren des DTE-Typs. Der Wildtyp von Euphorbia lagascae ist eine Spezies der großen botanischen Gattung Euphorbia (ca. 1600 Spezies), die zu einer der größten Pflanzenfamilien, den Euphorbiaceaen (Wolfsmilchgewächsen), zählt. Alle Pflan- Abteilung S0109 Mechanismen der Tumorigenese zen der Gattung Euphorbia enthalten einen hautreizenden Milchsaft (Latex), ihr Samen meist mehr oder weniger große Mengen an Pflanzenfetten. In ariden Gegenden Spaniens ist E. lagascae als ein weit verbreitetes Unkraut bekannt (z.B. Region und Stadt Murcia). Das Samenöl enthält hohe Anteile von Vernolsäure (13expoxy-9-octadecen-Säure), die als nachwachsender Rohstoff für die Oleochemie von Interesse ist. Mit dem Ziel, die Nutzung von E. lagascae im Sinne des “sustainable development” als einer neuen nachwachsenden Quelle für Samenöl zu erforschen, wurden der landwirtschaftliche Anbau der Pflanze und ihre Toxikologie im experimentellen Maßstab in einer anteiligen EC Concerted Action untersucht. Im Rahmen des vorausgegangenen VOSFA-Projekts [Vegetable Oils with Specific Fatty Acids (Air-CT93-1817)] wurde von uns bereits gefunden, daß das Samenöl stark hautreizend ist. Außer dem Samenöl erwiesen sich auch alle anderen Pflanzenteile von E. lagascae als hautreizend. Als irritierende Prinzipien treten hauptsächlich Ester des 12-Desoxyphorbols auf. Im Zweistufenmodell an der Mäusehaut [standardisiertes Initiations/Promotions(I/P)-Protokoll 16] zeigte sich das Samenöl als mittelstarker Tumorpromotor [siehe Ergebnisbericht 1999 (1998/99)]. In der dem VOSFA-Projekt nachfolgenden EC geförderten “Concerted Action” (PL 98/4460) wurden von uns chemische Analysen und toxikologische Bestimmungsweisen für DTE-Promotoren in Samenöl der Pflanze erarbeitet [13]. Darüberhinaus wurden Schutzmaßnamen aufgezeigt, die eine sichere - krebsrisikofreie - Handhabung und Verarbeitung der zu erntenden Pflanzen sowie des Samenöls und der Abfallprodukte (Preßkuchen, Stroh) gewährleisten können. Als Ergebnis der Concerted Action wurde empfohlen, in Zukunft zu versuchen, durch klassische Züchtung und Selektion bzw. durch Anwendung geeigneter gentechnologischer Ansätze, jeweils unter toxikologischer Begleitung, Sorten von E. lagascae anzustreben, die sich durch geringen oder gar keinen DTE-Toxingehalt - bei Erhalt hoher Ausbeuten an gewünschtem Produkt (Vernolsäure) - auszeichnen. - Erste Versuche zielgerichteter, toxikologisch begleiteter Pflanzenzucht, in Analogie zu der für E. lagascae vorgeschlagenen, waren für den als nachwachsende Quelle für Ölsäure von uns früher untersuchten Wildtyp von Euphorbia lathyris erfolgreich (vgl. vorausgehende Ergebnisberichte). Beide Pflanzen könnten danach in der Zukunft eine bedeutende Rolle als ökonomisch innovative und ökologisch sinnvolle nachwachsende Rohstoffquellen spielen [3]. Modellfall “ernährungsbedingte Einwirkung” von Tumorpromotoren des DTE-Typs. Milch von Ziegen, deren Futter Beimischungen von hautreizenden Wolfsmilchgewächsen enthält, waren Gegenstand der Untersuchungen im DKFZ-Projekt P513, einer Kooperation mit dem National Research Center in Kairo, Ägypten. Dabei ist gezeigt worden, daß in Ägypten im grünen Futter von Ziegen die hautreizend und hyperplasiogen wirkenden Euphorbia-Arten E. peplus, E. helioscopia und E. nubica als Verunreinigungen häufig vorkommen. Daß, wie zu vermuten, tatsächlich aktive DTE-Promotoren, die in E. peplus vorkommen, aus dem DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 161 Forschungsschwerpunkt C Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention 162 damit verunreinigten Futter in die Milch von Mutterziegen übergehen können, wurde bereits berichtet [vgl. Research Report 2001 (1998/99)]. Im vorliegenden Berichtszeitrum erhielten Mutterziegen grünes Futter, das mit E. helioscopia bzw. E. nubica verunreinigt war [4]. Das Futter, das über einen Zeitraum von vier Wochen (30g/Tag/Ziege) verabreicht wurde, führte zur Vergiftung der Mutterziegen, deren Erscheinungsbild dem bei der Futterverunreinigung mit E. peplus analog war. Die säugenden Jungtiere wurden durch die Muttermilch ebenfalls vergiftet, wobei es zu einzelnen Todesfällen kam. Durch mikrochemische Techniken (HPLC) wurde nachgewiesen, daß das im obigen Fütterungsprotokoll verabreichte Pflanzenmaterial hautreizende Promotoren des Ingenan-Typs (E. helioscopia) bzw. hautreizende Promotoren des Tigliantyps (E. nubica) enthält [5]. Schließlich wurde nachgewiesen, daß die Milch der Muttertiere Diterpenester desjenigen Strukturtyps enthält, der in den verunreinigenden Pflanzen vorkommt. Damit bietet es sich an, für die Milch, entsprechend der von uns 1998 vorgeschlagenen Prüfstrategie, Prüfpläne zu entwickeln, die das mit dem Genuß der Milch durch den Menschen verbundene Krebsrisiko als Toxprognosen z.B. für Oesophaguskarzinom, abschätzen lassen (siehe oben). Abteilung S0109 Mechanismen der Tumorigenese [4] *Nawito, M., *Ahmed, Y.F., *Shalaby, S.I., *Nada, A., *Zayed, S.M.A.D. and Hecker, E. IV. Toxicologic and pathophysiologic observations in lactating goats and their suckling kids fed on the irritant herbs Euphorbia nubica and Euphorbia helioscopia: an etiologic model for investigations on the putative risk of cancer by consumption of food polluted with tumor promoters, J Cancer Res and Clin Oncol, 127, 34-39 (2001). [5] *Zayed, S.M.A.D., *Farghaly, M., *Soliman, S.M., *Gotta, H., Sorg, B. and Hecker, E. V. Skin irritant and tumor promoting diterpene ester toxins of the tigliane and ingenane type in the herbs Euphorbia nubica and Euphorbia helioscopia contaminating fodder of livestock, J Cancer Res and Clin Oncol, 127, 40-47 (2001). [6] Treiber, H-J.: Über die medikamentöse Behandlung von Krebserkrankungen in der traditionellen indischen Heilkunde. Dissertation Fakultät für Sozial- und Verhaltenswissenschaften, Fach Ethnologie, Univ. Heidelberg, 1999. [7] Gminski, R., Über ein mögliches kanzerogenes (iatrogenes) Krebsrisko durch ausgewählte homöopathische Urtinkturen Standardisierte Prüfpläne und resultierende Toxprognosen für 33 Urtinkturen, Workshop des Projekts DKFZ/HEEL 1992-97 am 24.11.00 im DKFZ, Heidelberg. Modellfall “arzneiliche Einwirkung” von Tumorpromotoren des DTE-Typs. Phytomedizinische Präparate aus Wolfsmilch- und Seidelbastgewächsen werden in der Ethnomedizin zahlreicher Völker häufig angewandt, z.B. in Indien [6]. Für das Beispiel homöopathischer Urtinkturen obiger Provenienz, die in westlichen Ländern handelsüblich sind, wurden im Berichtszeitraum - in Fortführung unserer allgemeinen Teststrategie von 1998 [vgl. Ergebnisbericht 1999 (1998/99)] - spezielle Prüfpläne entwickelt mit dem Ziel, für jede Urtinktur das mit der phytomedizinischen Anwendung verbundene iatrogene Krebsrisiko durch tumorpromovierende oder/und solitärkanzerogene Wirkungen zu bestimmen [7]. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Hecker, E. and Gminski, R. Bioassays and microchemical methods to analyse skin-irritant and tumor promoting diterepenes ester toxins in Euphorbia species, in The development of Euphorbia lagascae as a new oil crop within the European community (FAIR CT 98/4460): EC-Concerted Action (PL 98/ 4460): Proceedings Workshop II, Cambridge, UK, eds. S.K. Cook, M.A. Froment and D. Turley, published by ADAS, Boxworth, Boxworth, Cambridge 2000, S. 6-22. [2] Hecker, E. Overall summary of safety issues, in The development of Euphorbia lagascae as a new oil crop within the European community (FAIR CT 98/4460), EC-Concerted Action (PL 98/4460): Proceedings Workshop II, Cambridge, UK, eds. S.K. Cook, M.A. Froment and D. Turley, published by ADAS, Boxworth, Boxworth, Cambridge 2000, S. 44. [3] Hecker E. and Gminski R. Toxicology and Occupational Safety, in: Development of Euphorbia lagascae as a new industrial oil crop (FAIR CT 98/4460), EC-Concerted Action (PL98/4460): Handbook, eds. D. Turley, M. Froment and S. Cook, ISBN 189923608x, ADAS Consulting Ltd., Wolverhampton UK 2000, S. 25-26. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Übersicht Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Sprecherin: Prof. Dr. med. Margot Zöller (kommissarisch) Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100) Prof. Dr. med. Hermann-Josef Gröne 06221 42-3243, FAX 06221 42-3262 e-mail: [email protected] Pharmakologie und Tumortherapie (D0200) Prof. Dr. med. Jens W. Zeller 06221 42-3312, FAX 06221 42-3346 e-mail: [email protected] Experimentelle Therapie (D0300) N.N. 06221 42-3350 Rekombinante Antikörper (D0500) Prof. Dr. Melvyn Little 06221 42-3450, FAX 06221 42-3462 e-mail: [email protected] Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600) Prof. Dr. med. Margot Zöller 06221 42-2454, FAX 06221 42-4760 e-mail: [email protected] Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700) Prof. Dr. med. Radek Skoda (02/00-12/01) 06221 42-3351, FAX 06221 42-3352 Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800) Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin 06221 42-3363, FAX 06221 42-3362 0731 502-7700, FAX 0731 502-6681 (Ulm) e-mail: [email protected] Klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie (D0900) Prof. Dr. med. Dirk Schadendorf 0621 383-2127, FAX 0621 383-2163 e-mail: [email protected] Der Forschungsschwerpunkt stellt sich die Aufgabe, in der Zusammenführung von grundlagen- und klinisch orientierten Arbeitsgruppen Voraussetzungen für die Entwicklung neuer therapeutischer und diagnostischer Verfahren zu schaffen. Dies soll über eine intensive Kooperation zwischen den grundlagenorientierten Abteilungen des Forschungsschwerpunktes und den klinischen Kooperationseinheiten erzielt werden. Da ein einzelner Forschungsschwerpunkt nicht das gesamte Spektrum der Tumordiagnostik und experimentellen Therapie abdecken kann, ist darüber hinaus in Absprache zwischen den Grundlagenorientierten und den klinischen Kooperationseinheiten eine Zentrierung auf bestimmte Fragestellungen erforderlich, wobei z. Zt. die Erarbeitung immuntherapeutischer Konzepte als eine der zentralen Fragestellungen aufgegriffen wurde. Aufgrund der Fluktuation im Bereich der klinischen Kooperationseinheiten ist darüber hinaus in diesem Schwerpunkt ein hohes Maß an Flexibilität erforderlich. Es sei abschließend vermerkt, dass eine der zentralen Einheiten des FS leider im Berichtszeitraum nicht wiederbesetzt werden konnte. Die Arbeiten der Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100) befassen sich mit Mechanismen der Abstoßung von Tumorgewebe und allogen-transplantierter Organe. Eine Arbeitsgruppe der Abteilung beschäftigt sich mit der detaillierten histomorphologischen Analyse von transgenen Tieren mit modernen morphologischen Verfahren. Eine weitere Arbeitsgruppe der Abteilung betreibt eine spezielle Diagnostik an humanen Gewebsproben. In die Abteilung integriert ist die zentrale Tumorbank des DKFZ. Im Zentrum der Aktivitäten der Arbeitsgruppe Pharmakologie und Tumortherapie (D0200) stehen Untersuchungen zum retroviralen Transfer des Multidrug-Resistenzgens in hämatopoetische Stammzellen. Daneben werden Verfahren zur Verbesserung des Adenovirus-assoziierten Transfers in hämatopoetische Stammzellen untersucht. Die Arbeitsgruppe Rekombinante Antikörper (D0500) befasst sich zum einen mit Fragen der Methodik zur Verbesserung der Herstellung rekombinanter Antikörper. Daneben wird die Möglichkeit eines therapeutischen Einsatzes z. B. über zytolytische Konjugate erprobt. Im Focus der Forschung der Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600) steht die Suche nach Molekülen, die für die Tumorprogression verantwortlich sind, sowie die Klärung der dem Phänomen der Metastasierung zugrunde liegenden Mechanismen. Eine therapeutische Nutzung der erzielten Ergebnisse wird vornehmlich über die Etablierung neuer Vakzinierungsverfahren angestrebt. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 163 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Übersicht Die klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie / Onkologie (D0700) hat sich zum einen auf immuntherapeutische Ansätze im Kontext allogener Stammzelltransplantation konzentriert. Im Zentrum der Arbeiten stehen vor allem Genomanalysen bei malignen hämatologischen Erkrankungen sowie Untersuchungen zur Stammzellbiologie. Der Leiter Prof. Skoda hat einen Ruf nach Basel angenommen. Die klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800) wurde im Berichtszeitraum nach Berufung des Abteilungsleiters an die Universitätskinderklinik Ulm von diesem weiterhin kommissarisch geleitet. Die Abteilung befasst sich mit der Regulation des physiologischen Zelltodes (Apoptose) bei hämatologischen Erkrankungen und dem Transfer der erzielten Ergebnisse in die Leukämietherapie bei Kindern. Die klinische Kooperationseinheit Dermato-Onkologie (D0900) untersucht schwerpunktmäßig Fragen der Chemoresistenz und erarbeitet neue Vakzinierungsstrategien beim malignen Melanom. Daneben werden Möglichkeiten eines in vivo Gentransfers untersucht. 164 Die Abteilung Experimentelle Therapie (D0300) ist vakant und im Berichtszeitraum leider nicht wiederbesetzt worden. Die am DKFZ verbliebene Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie befasst sich vornehmlich mit den Wirkmechanismen von Zytostatika. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Abteilung D0100 Zelluläre und Molekulare Pathologie Abteilung Zelluläre und Molekulare Pathologie (D0100) Leiter: Prof. Dr. med. Hermann-Josef Gröne Wissenschaftliche Mitarbeiter: Richard Jennemann Dr. sc. hum. Yanhua Li Dr. rer. nat. Roger Sandhoff Dr. rer. nat. Qiang Sun Dr. med. David Trick Doktoranden: Zhen Li Shijun Wang Ärzte im Praktikum: Jeannette Bachmann Thomas Büch Gastwissenschaftler: Prof. Dr. rer. nat. Herbert. Wiegandt, Universität Marburg, (01/00 - ) Technisches Personal: Mahnaz Bonrouhi Sylvia Kaden Ursula Naab Claudia Schmidt Martina Volz Sekretariat: Anita Meeske-Ferrai Rebekka Hauck Iris Moll Ulrike Rothermel Benita von Tümpling-Radosta Christine Zesch Tumorbank (D0101) Dr. med. dent. Elisabeth F. Gröne Technisches Personal: Mariana Enulescu Sebastian Ronellenfitsch Histopathologische Spezialdiagnostik Prof. Dr. med. H.-J. Gröne Technisches Personal: Elisabeth Röbel Gabriele Schmidt Die Abteilung fungiert als Bindeglied zwischen Grundlagen-orientierter Forschung im DKFZ und der klinischen Diagnostik und Therapie. Die Abteilung versucht dieser Aufgabe Rechnung zu tragen, indem sie 1. kliniknahe wissenschaftliche Fragestellungen bearbeitet, 2. in der histopathologischen Analyse von Tierexperimenten, insbesondere transgenen Tieren mit Arbeitsgruppen des DKFZ kooperiert, 3. selbst eine spezielle humane histopathologische Diagnostik durchführt und 4. humanes Material Abteilungen des DKFZ zur genomischen und proteomischen Aufarbeitung zur Verfügung stellt (Tumorbank). Der wissenschaftliche Schwerpunkt der Abteilung ist die Aufklärung der Mechanismen der Abstoßung von Tumorgewebe und allogentransplantierten Organen. Hierbei wird die Rejektion allogen-transplantierter Organe als Modellsystem für die Rejektion eines malignen Tumors angesehen. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen steht die Analyse der Interaktion von Monozyten/ Makrophagen mit Endothelzellen und Tumorzellen. Rolle immunkompetenter Zellen insbesondere von Monozyten/Makrophagen bei der Rejektion von Gewebe Ein Ziel unserer Arbeiten ist die Aufklärung von zellulären und molekularen Mechanismen, die zur Abstoßung von Geweben führen. Experimentelle allogene Transplantationen solider Organe werden hierbei als relevante Modellsysteme angesehen, da der Beginn einer Rejektion,die Qualität und die Schwere des Abstoßungsvorgangs bei experimentellen allogenen Transplantationen genau definiert werden können. Im Vordergrund unseres Interesses steht hierbei die Interaktion von Monozyten mit Endothelzellen und Tumorzellen. Monozyten sind immunkompetente Zellen, die zur Synthese zahlreicher Substanzen befähigt sind, die die Abstoßung eines Gewebes bewirken. Monozyten werden deshalb von uns als die wesentlichen Effektorzellen einer Rejektion angesehen. Endothelzellen sind in soliden transplantierten Organen die primär vom Rejektionsprozess betroffenen Zielzellen. Sie sind als erste Zellen des abgestoßenen Organs einer humoralen und zellulären Abstoßungsantwort ausgesetzt. Wir erhoffen uns von der Analyse der Interaktion von Monozyten und Endothel in allogen-transplantierten Organen Erkenntnisse, die zu diagnostischen und therapeutischen Anwendungen führen könnten. Chemokine als wesentliche Modulatoren der Frühphase einer allogenen Rejektion H.-J. Gröne, Z. Li, Q. Sun, S. Wang In Kooperation mit: Peter Nelson Ph.D., Medizinische Poliklinik, Arbeitsgruppe Klinische Biochemie der LMU München und Amanda Proudfoot, Ph.D, Serono Genf, Schweiz Die Transplantation allogener solider Organe in der Ratte ist ein geeignetes System um die Mechanismen, die für die Generation und die Aufrechterhaltung einer Rejektion oder Toleranz gegenüber einem immunologischen Prozess notwendig sind, zu erarbeiten. Die bekannten Unterschiede der MHC-Loci von Spender und Empfänger ermöglichen es, die Schwere der Allograft-Rejektion festzulegen; der Beginn und der Verlauf der Transplantat-Rejektion wie auch ihre morphologischen Phänomene sind gut definiert. Eine Toleranzinduktion bei allogener Organtransplantation oder eine Rejektionsinduktion bei malignem Tumorwachstum wären von großem klinischen Nutzen. Tierexperimente und klinische Daten weisen darauf hin, daß eine kurzfristige, frühe Inhibition der vaskulären Alloreaktivität wesentlich zur langfristigen Allograftakzeptanz beitragen könnte. Durch die Inhibition der Arretierung von T-Zellen und Monozyten an das Endothel mit Hilfe der Blockade von Chemokinrezeptoren im Transplantat konnten Chemokine von unserer Arbeitsgruppe als wichtige pathogenetische Faktoren bei der Transplantatrejektion erkannt werden. Chemokine sind chemotaktische Peptide mit einem Molekulargewicht zwischen 6 und 15 k/Da, die wie ihre zugehörigen Rezeptoren von zahlreichen Zellen, unter anderem von Endothelzellen, Leukozyten und Fibroblasten syn- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 165 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie 166 thetisiert werden. Das ß-Chemokin-RANTES ist ein potentes Chemokin für die Chemotaxie von Monozyten, dendritischen Zellen und T-Zellen. Aufgrund des Nachweises einer Expression des ß-Chemokin-RANTES in tubulären Epithelien abstoßender Nierentransplantate und atherosklerotischen Plaques von Coronararterien transplantierter Herzen wurde begonnen, die Rolle des Chemokin: RANTES bei der akuten Abstoßung allogener Transplantate funktionell zu untersuchen. Die intravenöse Gabe des antagonistischen Chemokin-Analogs Met-RANTES bewirkte eine Reduktion der akuten Entzündung und eine Abnahme der Abstoßung im allogenen Nierentransplantat. Durch Met-RANTES konnte in allogen transplantiertem Dünndarm die Mikrozirkulation weitgehend normalisiert werden. Ein nicht peptiderger Antagonist für einen Rezeptor von RANTES: CCR1 bewirkte mit niedrig dosiertem Cyclosporin eine erhebliche Verlängerung der Überlebenszeit eines allogenen Herztransplantates in der Ratte. In vitro Untersuchungen zum möglichen Mechanismus dieser CCR1-Antagonismus-Wirkung ergaben, daß unter physiologischen Flußbedingungen die Arretierung von Monozyten an aktiviertes mikrovaskuläres Endothel durch eine Blockade RANTES-zugehöriger Chemokinrezeptoren unterdrückt wurde. Diese Untersuchungen demonstrierten die funktionelle Bedeutung von Chemokinen für die Rejektion eines allogenen transplantierten Organs. Neue Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben sich mit der Expression und Wirkung von Chemokinen in nicht hämatopoetischen Zellen beschäftigt. Da die Expression von Proteinen in embryonalem Gewebe, in entzündeten und tumorösem Gewebe wieder auftreten kann, wurde die Expression von Chemokinen bei der Entwicklung der menschlichen Niere analysiert. Chemokine, die proliferative und angiogenetische Effekte besitzen und ihre Rezeptoren wurden zellspezifisch bei der Ontogenese der Niere nachgewiesen. Für das Chemokin SLC und den zugehörigen Rezeptor CCR7 konnte eine antiapoptotische Wirkung dokumentiert werden. Die Transkription mehrerer Chemokine kann durch den Transkriptionsfaktor NFκB gesteigert werden. NFκB reguliert zusätzlich die Expression von Adhäsionsmolekülen. Durch die Perfusion einer Niere vor allogener Transplantation mit einem NFκB-Decoy Oligodeoxynucleotid in kationischen Liposomen, die bevorzugt von hypoxischem peritubulärem Endothel aufgenommen wurden, wurde die frühe postischämische Endothelialitis eines Transplantates signifikant gemindert. Es wurde insbesondere die Adhäsion von Monozyten an das mikrovaskuläre Endothel und die monozytäre Infiltration in der Niere gehemmt, sowie die interstitielle Rejektion reduziert. Diese Experimente unterstützen insgesamt die Annahme, daß Chemokine die Interaktion von Endothel und immunkompetenten Zellen in einer Alloreaktivitätsreaktion wesentlich beeinflussen. Weitere Analysen zur Rolle von Chemokinen in der Frühphase der Abstoßung eines allogenen Transplantates sind geplant 1. in Chemokinrezeptor knock-out Mäusen und 2. in Experimenten, die weitere, teils von Viren spezifisch synthetisierte, teils synthetisch gewonnene Chemokinrezeptoranaloga einsetzen. Abteilung D0100 Zelluläre und Molekulare Pathologie Analyse der Rolle von Sauerstoff-reaktiven Spezies und endothelialen Wachstumsfaktoren bei der Gewebsrejektion K. Sun, Y. Li, H.-J. Gröne In Kooperation mit: Dr. med. Tomislav Stojanovic, Chirurgische Klinik der Universität Göttingen, Prof. Dr. rer. nat. Ernst Malle, Klinische Biochemie der Universität Graz, Österreich, Dr. med. Ton J. Rabelink, Innere Medizin Universität Utrecht, Niederlande In der Interaktion von Endothel und Monozyten und T-Zellen bei der akuten vaskulären Rejektion kommt dem Aktivierungszustand der Endothelzellen eine wesentliche Rolle zu. Ein wichtiger Modulator der endothelialen Funktion ist das Radikal NO. Das durch die endotheliale NO-Synthase konstitutiv synthetisierte NO besitzt mehrere Endothel-zytoprotektive Eigenschaften (Hemmung der Thrombozytenadhäsion/aggregation, Verminderung der Endothelpermeabilität, Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen und Vasodilatation). In einem allogenen Rattennieren-Transplantationsmodell konnten wir belegen, daß die Inhibition der konstitutiven endothelialen NO-Synthese zu einer deutlichen Verschlechterung der Transplantatfunktion und zu einer ausgeprägten vaskulären Abstoßung des Organs führt. Es gelang somit einen nicht-immunologischen Einfluß auf die Alloreaktivität des Nierentransplantates zu nehmen. Dieser tierexperimentelle Befund könnte durchaus klinische Bedeutung besitzen, da Inhibitoren der NOSynthase (L-ADMA, L-NMMA) beim akuten Nierenversagen, das direkt nach Transplantation bei einem nicht geringen Prozentsatz allogen Transplantierter vorliegt, akkumulieren können und über eine Inhibition der endothelialen NO-Synthase frühe Rejektionsphänomene verstärken könnten. In Erweiterung dieser Untersuchungen konnten wir durch die selektive Hemmung der induzierbaren NOSynthase, die bei Rejektion überwiegend von immunkompetenten Zellen (z.B. Monozyten/Makrophagen) exprimiert wird und wegen hoher generierter NO-und O2-Mengen zytotoxische Effekte auslöst, eine Reduktion interstitieller Rejektionsphänomene erreichen. Supplementierung von L-Arginin und Tetrahydrobiopterin als Vorstufen und Cofaktoren der NO-Synthese reduzierten die Superoxidanion Generation und erhöhten die NO-Synthese durch die endotheliale NO-Synthase. Es wurde eine wesentliche funktionelle und strukturelle Verbesserung im allogenen Nierentransplantat erreicht. NO spielt somit eine konzentrations- und zeitabhängige, bimodale Rolle bei der Rejektion von Geweben. Wir haben durch weitere Untersuchungen die Relevanz der O2- Synthese im allogenen Nierentransplantat analysiert. Durch eine Inhibition der O2--produzierenden Xanthinoxidoreduktase und eine Überexpression dieses Enzyms konnten wir bereits die Bedeutung dieses oxidativen Enzyms bei der akuten Rejektion von allogenen Geweben belegen. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Rolle von Glycosphingolipiden (GSL) in Tumoren und bei immunlogischen Prozessen R. Sandhoff, R. Jennemann, B. von TümplingRadosta, H. Wiegandt, H.-J. Gröne Unter den Glykokonjungaten, Glykoproteine und Glykolipide, die auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen exprimiert werden, sind Glykolipide strukturell gut charakterisiert. Glykosphingolipide (GSL) lokalisieren mit Cholesterin in „Rafts“, Membrandomänen, die zur Signalübertragung wichtig sind. GSL stellen essentielle Bindungspartner für virale und bakterielle Strukturen dar. Wir haben zeigen können, dass GSL ihr Expressionsprofil in Tumoren (Nierenzellkarzinom) ändern und zur Charakterisierung von Tumoren dienen können. In Experimenten an für spezifische GSL mutierten Mäusen wurde der Degradationsmechanismus für komplexe sulfatierte GSL (Sulfatide) aufgeklärt. Da wir belegten, dass Sulfatide bei der Differenzierung von Monozyten differentiell exprimiert werden, werden weitere Untersuchungen zur Funktion von GSL in immunkompetenten Zellen an knockout Mäusen durchgeführt. Histopathologische Analyse transgener Tiere I. Berger, F. Amelung., H.-J. Gröne Die Abteilung hat eine Arbeitsgruppe, die sich speziell mit der konsultativen histopathologischen Diagnostik transgener Tiere beschäftigt. Die umfassende morphologische Analyse transgener und knock-out Tiere ist für die Interpretation der Bedeutung eines überexprimierten oder nicht-exprimierten Gens entscheidend. In der morphologischen Analyse werden neben einer konventionell-morphologischen Aufarbeitung moderne Verfahren der Pathomorphologie eingesetzt: Immunhistologie, In situ Hybridisierung, ultrastrukturelle Untersuchung am Transmissionselektronenmikroskop. Histopathologische Spezialdiagnostik H.-J. Gröne Es wurde eine Arbeitsgruppe für histopathologische Spezialdiagnostik eingerichtet, die in ausgewählten Gebieten der Pathologie eine wissenschaftlich orientierte Diagnostik durchführt. Es wird so erreicht, dass (1) die in der Abteilung tätigen Pathologen die für die Beratung anderer Abteilungen des DKFZ und für ihre eigene wissenschaftliche Arbeit notwendige humanpathologische Expertise behalten, (2) humanes Material verschiedenen Abteilungen des DKFZ zur Verfügung gestellt werden kann (3) die Abteilung selbst, das humane Material in korrelativen Untersuchungen zu experimentellen Befunden einsetzen kann und (4) das Deutsche Krebsforschungszentrum seit Gründung der Abteilung, eine von der Deutschen Ärztekammer anerkannte Ausbildungsstätte für Pathologie ist. Im Bestreben, objektivierbare supplementäre Techniken in die humane histopathologische Diagnostik einzuführen, haben wir am Beispiel des Prostatakarzinoms, des häufigsten malignen Tumors des Mannes, Gen-Expressionsanalysen Abteilung D0100 Zelluläre und Molekulare Pathologie mit cDNA Chips durchgeführt. Es wurde eine hohe spezifische Detektionsrate von malignen Prostatatumoren mit dieser Methode gefunden. Unsere zukünftigen Bemühungen werden auf die Etablierung von Genexpressionsanalysen an präcancerösen Läsionen im Biopsiematerial gerichtet sein. Tumorbank E. Gröne, M. Enulescu, S. Ronellenfitsch In Kooperation mit: Klinikum Aschaffenburg, Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe (Prof. Dr. Teichmann), Klinikum Göppingen, Institut für Pathologie (Frau Prof. Dr. Sorger), Universitätskliniken Heidelberg: Urologische Klinik Prof. Dr. Stähler Die Tumorbank der Abteilung ist eine Serviceeinrichtung für das DKFZ um primäre immortalisierte Zellkulturen und seit Anfang 1999 nicht fixiertes, gefrorenes, nicht tumoröses und tumoröses humanes Material zur Verfügung zu stellen. Die Arbeitsgruppe bemüht sich, durch engen Kontakt mit den koopierierenden Kliniken Gewebe fachgerecht diagnostiziert zu sammeln und zu katalogisieren, um der Abteilung selbst und anderen Abteilungen des DKFZ genomische und proteomische Untersuchungen an diesem Material zu ermöglichen. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Anders H.J.* Vielhauer V.* Cohen C.D.* Kretzler M.* Segerer S.* Luckow B.* Weller L.* Gröne H.-J., Schlöndorff D.* Chemokine and chemokine receptor expression during initiation and resolution of immune complex glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 12: 919-31, 2000. [2] Barton M.*, Vos. I., Shaw S.*, Boer P.*, D’Uscio LV*, Gröne H.J., Rabelink T.-J.*, Lattmann T.*, Moreau P.*, Luscher T.F.*: Dysfunctional renal nitric oxide synthase as a determinant of saltsensitive hypertension: mechanisms of renal artery endothelial dysfunction and renal endothelin for vascular hypertrophy and glomeruloscerosis. J. Am. Soc. Neprohl. 11: 835-845, 2000. [3] Becker R.* Rohlfs J.* Jennemann R., Wiegandt H., Mennel H.D.* Bauer B.L.*: Glycosphingolipid component profiles or human gliomas - correlation to survival time and histopathological malignancy grading. Clinical Neuropathology 19: 119-125, 2000. [4] Brugger B.* Sandhoff R., Wegehingel S.* Gorgas K.* Malsam J.* Helms J.B.* LehEmann W.D.* Evidence for segregation of shingomyelin and cholesterol during formation of COPI-coated vesicles. J. Cell Biol. 151: 507-518, 2000 [5] Coimbra T.M.,* Janssen U.*, Gröne H.-J., Ostendorf T.*, Kunter U.*, Schmidt H.*, Brabant G.*, Floege J.*: Early events leading to renal injury in obese Zucker (fatty) rats with type I diabetes. Kidney Int. 57: 167-82, 2000. [6] Dombrowski F.*, Klotz L.*, Hacker H.-J.*, Li Y., Klingmüller D.*, Brix K.*, Herzog V.*, Bannasch P.: Hyperproliferative hepatocellular alterations after intraportal transplantation of thyroid follicles. Am.J.Pathol. 156: 99 -113, 2000. [7] Friederichs J. Zeller Y. Hafezi-Moghadam A.* Gröne H.-J., Ley K.* Altevogt P.: The CD24/P selectin binding pathway initiates lung arrest of human A125 adenocarcinoma cells. Cancer Res. 60: 6714-6722, 2000. [8] Gwinner W.* Gröne H.-J.: Role of reactive oxygen species in glomerulonephritis. Nephrol. Dial. Transplant. 15: 1127-1132, 2000. [9] Heuser M.*, Pfaar O.*, Gralla O.*, Gröne H.-J., Nustede R.*, Post S.*: Impact of gastrin-releasing peptide on intestinal microcirculation after ischema-reperfusion in rats. Digestion. 61: 172-180, 2000. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 167 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie [10] Heuser M.*, Gralla O.*, Pfaar O.*, Nustede R.*, Gröne H.-J., Post S.*: Differential effects of neurotensin and cholecystokinin on intestinal microcirculation after ischemia-reperfusion. Langenbecks Arch Surg. 385: 357-362, 2000. [25] Biramijamal F.*, Allameh A.*, Mirbod P.*, Gröne H.-J., Koomagi R.*, Hollstein M.: Unusual profile and high prevalence of p53 mutations in esophageal squamous cell carcinomas from northern Iran. Cancer Res. 61: 3119-3123, 2001. [11] Kömhoff M.*, Jeck N.D.*, Seyberth H.W.*, Gröne H.-J., Nusing R.M.*, Breyer M.D.*: Cyclooxygenase-2 expression is associated with the renal macula densa of patients with bartterlike syndrome. Kidney Int. 58: 2420-2424, 2000. [26] Boldicke T.*, Tesar M.*, Griesel C.*, Rohde M.*, Gröne H.-J., Waltenberger J.*, Kollet O.*, Lapidot T.*, Yayon A.*, Weich H.*: Anti-VEGFR-2 scFvs for cell isolation. Single-chain antibodies recognizing the human vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2/flk-1) on the surface of primary endothelial cells and preselected CD34+ cells from cord blood. Stem Cells 19: 24-36, 2001. [12] Malle E.*, Waeg G.*, Schreiber R.*, Gröne E.F., Sattler W.*, Gröne H.-J.: Immunohistochemical evidence for the myeloperoxidase/H2O2/halide system human atherosclerotic lesions colocalization of myeloperoxidase and hypochloritemodified proteins. Eur.J.Biochem. 267: 4495-4503, 2000. [13] Menzel K.*, Sperschneider H.*, Gröne H.-J.: Konversion auf Cell Cept oder Prograf bei chronischem Transplantatversagen in der Spätphase nach Nierentransplantation Tx Med 12: 78-87, 2000. [14] Mollenhauer A.. Herbertz S., Holmskov U.*, Tolnay M.*, Krebs I., Merlo A.*, Schroder H.D.*, Maier D.*, Breitling F., Wiemann S., Gröne H.-J. Poustka A.: DMBT1 encodes a protein involved in the immune defense and in epithelial differentiation and is highly unstable in cancer. Cancer Research 60: 1704 - 1710, 2000. [15.Ostendorf T.*, Kunter U.*, Gröne H.-J., Bahlman F.*, Kawachi H.*, Shimizu F.*, Koch K.*, Nebojsa J.*, Floege J.*: Specific antagonism of PDGF prevents renal scarring in experimental glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 12: 909-18, 2000. 168 Abteilung D0100 Zelluläre und Molekulare Pathologie [16] Radaeva S.*. Li Y., Hacker H.J., Burger V.*, Kopp-Schneider A., Bannasch P.: Hepadnaciral hepatocarcinogenesis: In situ visualization of viral antigens, cytoplasmic compartmentation, enzymic patterns and cellular proliferation in preneoplastic hepatocellar lineages in woodchucks. J. Hepatology 33: 580-600, 2000. [17.Schäfer L.*, Gröne H.-J., Raslik I.*, Robenek H.*, Ugorcakova J.*, Budny S.*, Schäfer R.M.*, Kresse H.*: Small proteoglycans of normal adult human kidney: Distinct expression patterns of decorin, biglycan, fibromodulin and lumican. Kidney International 58: 1557-1568, 2000. [18] Scheuer H., Gwinner W.*, Hohbach J.*, Gröne E.F., Brandes R.P.*, Malle E.*, Olbricht C.J.*, Walli A.K.*, Gröne H.-J.: Oxidant stress in hyperlidemia-induced renal damage. Am.J.Physiol. 278: F63-F64, 2000. [19] Steiß J.O.*, Piske-Keyser K.*, Gröne H.-J., Gortner L.*: Therapie der membranösen Glomerulonephritis mit alpha-Interferon bei einem 7-jährigen Jungen mit chronisch persistierender Hepatitis B. Klin. Pädiatr. 212: 283-286, 2000. [20] Stojanovic T., Schlemminger R.*, Bedke J.*, Gröne H.-J., Heuser M.*, Leister I.*, Hecker M.*, Becker H.*, Markus P.M.*: In vivo Changes in Acute Rejection of Rat Small Bowel Allografts Transplantation Proceedings 32; 1247-1248, 2000. [21] Verhagen A.M., Hohbach J.*, Joles J.A.*, Braam B.*, Boer P.*, Koomans H.A.*, Gröne H.J.: Unchanged cardiac angiotensin II levels accompany losartin-sensitive can injury due to nitric oxide synthase inhibition. Eur. J. Pharmacol. 400: 239-247, 2000. [22] Vos I.. Joles J.A.*, Schurink M.*, Stojanovic T.*, Tsikas D.*, Rabelink TJ.*, Gröne H.-J.: INOS inhibition decreases tubulointerstitial injury to renal allograft rejection. Eur.J.Pharmacol. 391: 31 - 39, 2000. [23] Vos I., Govers R.*, Gröne H.-J., Kley L.*, Schurink M.*, de Weger R.*, Goldschmeding R.*, Rabelink TJ.*: NFκB decoy oligodeoxynucleotids reduce monocyte infiltration in renal allograft. FASEB J. 14: 815 - 822, 2000. [24] Attia D.M.*, Verhagen A.M.*, Stroes E.S.*, van Faassen E.E.*, Gröne H.-J., De Kimpe S.J.*, Koomans H.A.*, Braam B.*, Joles J.A.*: Vitamin E alleviates renal injury, but not hypertension, during chronic nitric oxide synthase inhibition in rats. J. Am. Soc. Nephrol. 12: 2280-2287, 2001. [27] Constien R*., Forde A., Liliensiek B., Gröne H.-J., Nawroth P., Hammerling G., Arnold B.: Characterization of a novel EGFP reporter mouse to monitor Cre recombination as demonstrated by a Tie2 Cre mouse line. Genesis 30: 36-44, 2001. [28] Gaigg B.*, Neergaard T.B.*, Schneiter R.*, Hansen J.K.*, Faergeman N.J.*, Jensen N.A.*, Andersen J.R.*, Friis J.*, Sandhoff R., Schroder H.D.*, Knudsen J.*: Depletion of acylcoenzyme A-binding protein affects shingolipid synthesis and causes vesicle accumulation and membrane defects in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 12: 1147-1160, 2001. [29] Grisk O.*, Gröne H.-J., Rose H.J.*, Rettig R.*: Sympathetic reinnervation of rat kidney grafts. 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[33] Jennemann R., Sandhoff R., Gröne H.-J., Wiegandt H.: Human heterophile antibodies recognizing distinct carbohydrate epitopes on basidiolipids from different mushrooms. Immunol Invest. 30: 115-29, 2001. [34] Malle E.*, Wäg G.*, Thiery J.*, Sattler W.*, Gröne H.-J.: Immunohistochemical evidence for hypochlorite-modified proteins in rabbit lesions generated by the myeloperoxidase-H2O2-halide system in response to dietary cholesterol. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289: 894-900, 2001 [35] Mollenhauer J., Herbertz S.*, Helmke B.*, Kollender G.*, Krebs I.*, Madsen J.*, Homlskov U.*, Sorger K.*, Schmitt L.*, Wiemann S., Otto H.F.*, Gröne H.-J., Poustka A.: DMBT1 is a Versatile Mucin-like Molecule Likely to Play a Differential Role in Digestive Tract Cancer. Cancer Res. 61: 8880-8886, 2001. [36] Ostendorf T.*, Kunter U.*, Gröne H.-J., Bahlmann F.*, Kawachi H.*, Shimizu F.*, Koch K.M.*, Janjic N.*, Floege J.*: Specific antagonism of PDGF prevents renal scarring in experimental glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 12: 909-918, 2001. [37] Otto C., Kovalchuk Y.*, Wolfer D.P.*, Gass P.*, Martin M.*, Zuschratter W.*, Gröne H.-J., Kellendonk C.*, Tronche F.*, Maldonado R.*, Lipp H.P.*, Konnerty A.*, Schütz G.: Impairment of mossy fiber long-term potentiation and associative learning in pituitary adenylate cyclase activating polypeptide type I receptordeficient mice. J. Neurosci. 21: 5520-5527, 2001. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Abteilung D0100 Zelluläre und Molekulare Pathologie [38] Phillips A.O.*, Baboolal K.*, Riley S.*, Gröne H.-J., Janssen U.*, Steadman R.*, Williams J.*, Floege J.*: Association of prolonged hyperglycemia with glomerular hypertrophy and renal basement membrane thickening in the Goto Kakizaki model of non-insulin-dependent diabetes mellitus. Am. J. Kidney 37: 400410, 2001. [52] Anders H.J.*, Vielhauer V.*, Frink M.*, Linde Y.*, Cohen C.D.*, Blattner S.M.*, Kretzler M.*, Strutz F.*, Mack M.*, Gröne H.J., Onuffer J.*, Horuk R.*, Nelson P.J., Schlöndorff D.*: A chemokine receptor-1-specific non-peptide antagonist reduces progressive fibrosis of the kidney. J. Clin. Invest. 109: 251-259, 2002. [39] QuaschningT.*, D’Uscio L.V.*, Shaw W.*, Gröne H.-J., Ruschitzka F.*, Luscher T.E.*: Vasopeptidase inhibition restores renovascular endothelial dysfunction in salt-induced hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 12: 2280-2287, 2001. [53] Blaschke S.*, Grupp C.*, Haase J.*, Kleinoeder T.*, Hallermann C.*, Troche I.*, Gröne H.-J., Muller G.A.*: A case of lateonset primary hyperoxaluria type 1. Am. J. Kidney Dis. 39: E11, 2002. [40] Reichardt H.M.*, Horsch K.*, Gröne H.-J., Kolbus A.*, Beug H.*, Hynes N.*, Schütz G.: Mammary gland development and lactation are controlled by different glucocorticoid receptor activities. Eur. J. Endocrinol. 145: 519-527, 2001. [54] Cohen C.D.*, Gröne H.-J., Gröne E.F., Nelson P.J., Schlöndorff D.*, Kretzler M.*: Laser microdissection and gene expression analysis on formaldehyde-fixed archival tissue: IP-10 and RANTES in renal allograft rejection. Kidney Int. 61: 125-132, 2002. [41.Reinalter S.C.*, Gröne H.-J., Konrad M.*, Seyberth H.W.*, Klaus G.*: Evaluation of long-term treatment with indomethacin in hereditary hypokalemic salt-losing tubulopathies. J. Pediatr. 139: 398-406, 2001. [42] Schäfer L.*, Raslik I.*, Gröne H.-J., Schonherr F.*, Macakova K.*, Ugorcakova J.*, Budny S.*, Schäfer R.M.*, Kresse H.*: Small proteoglycans in human diabetic nephropathy: discrepancy between glomerular expression and protein accumulation of decorin, biglycan, lumican and fibromodulin. FASEB J. 15: 559561, 2001. [43] Schaier M.*, Lehrke I.*, Schade K.*, Morath C.*, Shimizu F.*, Kawachi H.*, Gröne H.-J., Ritz E.*, Wagner J.*: Isotretinoin alleviates renal damage in rat chronic glomerulonephritis. Kidney Int. 60: 2222-2234, 2001. [44] Shipkova M.*, Strassburg C.P.*, Braun F.*, Streit F.*, Gröne H.-J., Armstrong V.W.*, Tukey R.H.*, Oellerich M.* & Wieland E.*: Glucoronide and glucoside conjugation of mycophenolic acid by human liver, kidney and intestinal microsomes. Br. J. 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[58] Schäfer L.*, Macakova K.*, Raslik I.*, Micegova M.*, Gröne H.-J., Schönherr E.*, Robenek H.*, Echtermeyer F.G.*, Grässel S.*, Bruckner P.*, Schaefer R.M.*, Iozzo R.V.*, Kresse H.*: Animal Model - Absence of decorin adversely influences tubulointerstitial fibrosis of the obstructed kidney by enhanced apoptosis and increased inflammatory reaction. Am. J. of Pathology 160: 11811191, 2002. [59] Stojanovic T.*, Bedke J.*, Gröne H.-J., Proudfoot A.E.I.*, Becker H.*, Markus P.*, Hecker M.*: Met-RANTES inhibition of mucosal perfusion failure in acute intestinal transplant rejection role of endothelial cell- leucocyte interaction. J. Vasc. Res. 39: 5158, 2002. [60] Banas B.*, Wörnle M.*, Berger T.*, Nelson P.J.*, Cohen C.D.*, Kretzler M.*, Pfirstinger J.*, Mack M.*, Banas B.*, Lipp M.*, Gröne H.-J., Schlöndorff D.*: Roles of SLC/CCL21 and CCR7 in human kidney for mesangial proliferation, migration, apoptosis and tissue homeostasis J. of Immunol. 2002, in press. [61] Eitner F.*, Ostendorf T.*, Van Roeyen C.*, Li X.*, Aase K.*, Gröne H.-J., Eriksson U.*, FloegeJ.*: Expression of a novel PDGF Isoform, PDGF-C, in normal and diseased rat kidney. J. Am. Soc. Nephrol. [62] Ernst T., Hergenhahn M., Kenzelmann M., Cohen C.D.*, Bonrouhi M., Weninger A., Klären R., Gröne E.F., Wiesel M.*, Güdemann C.*, Küster J.*, Schott W.*, Staehler G.*, Kretzler M.*, Hollstein M., Gröne H.-J.: Decrease and Gain of Gene Expression are Equally Discriminatory Markers for Prostate Carcinoma. A gene expression analysis on total and microdissected prostate tissue. J. Am. Sco. Nephrol. 2002, in press [63] Gröne H.-J., Cohen C.D.*, Schmidt C., Kretzler M.*, Gröne E., Schlöndorff D.*, Nelson P.*: Spatial and Temporally Restricted Expression of Chemokines and Chemokine Receptors in the Developing Human Kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 2002, in press. [64] Mizukami H., Mi Y., Wada R., Kono M., Yamshita T., Liu Y., Werth N., Sandhoff R., Sandhoff K., Proia R.L.: Systemic inflammation in glucocerebrosidase-deficient mice with minimal glucosylcermaide storage. J. Clin. Invest. 2002, in press. [65] Sandhoff R., Hepbildikler S.T., Jennemann R., Geyer R., Gieselmann V., Proia R.L., Wiegandt H., Gröne H.-J.: Kidney sulfatides in mouse models of inherited glycosphingolipid disorders - determination by Nano-electrospray Ionization tandem mass spectrometry. J. Biol. Chem. 2002, in press. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 169 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie D0200 Pharmakologie der Krebsbehandlung Arbeitseinheit Pharmakologie der Krebsbehandlung (D0200) Leiter: Prof. Dr. med. W. Jens Zeller Wissenschaftler Dr. Rüdiger Port Dr. Renate Port Dr. Stephanie Laufs Ioulian Topaly * Chemoprotektion von humanen mobilisierten peripheren Blutvorläuferzellen nach retroviralem Transfer des humanen Multidrug-Resistenzgens (MDR1) und Transplantation in NOD/SCID-Mäuse Studenten/Doktoranden cand.med. Simone Berlinghoff cand.med. Thomas Büch cand.med. Eike Buß cand.med. Bernhard Gentner cand.med. Moritz Schad Zsuzsanna Nagy (med.biol.) Marlon Romano Veldwijk (med.biol.) Technische Assistenten Bernhard Berkus Hans-Jürgen Engel Sigrid Heil (1/2) Sekretärin Brigitte Pétillon (1/3, 01/02 -) 170 * Finanzierung extern Die Arbeitseinheit „Pharmakologie der Krebsbehandlung“ besteht aus den Arbeitsgruppen von W. Jens Zeller und Rüdiger Port. Die Forschungsarbeit von W.J. Zeller konzentriert sich vor allem auf sensibilisierende und protektive Ansätze in der Krebschemotherapie. R. Port’s Forschungsarbeit befaßt sich mit pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Modellen. Die Gruppe von W.J. Zeller kooperiert mit PD Dr. S. Fruehauf und Prof. Dr. A.D. Ho, Abt. Innere Medizin V der Universität Heidelberg; Ziel dieser Kooperation ist die Optimierung der Hochdosis-Chemotherapie mit Blutstammzellsupport unter Einsatz präklinischer Modelle (Stammzellexpansion, Zytostatikaresistenz-Gentransfer), die experimentelle Therapie der chronischen myeloischen Leukämie sowie die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung von Sarkomen. S. Laufs, B. Gentner, K.Z. Nagy, B. Schiedlmeier*, A.J. Schilz**, K. Kühlcke**, C. Baum***, H.G. Eckert**, S. Fruehauf****, W.J. Zeller *Heinrich-Pette-Institut, Hamburg; **EUFETS GmbH, Idar-Oberstein; ***Medizinische Hochschule, Hannover; ****Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg Humane periphere Blutvorläuferzellen wurden mit dem neuen retroviralen SF91m3-Vektor, der das humane MDR1-Gen enthält, transduziert und anschließend in NOD/SCID-Mäuse transplantiert. Mit diesem Versuchsansatz konnten wir zeigen, daß der retrovirale Transfer des MDR1-Gens in humane mobilisierte periphere Blutvorläuferzellen diesen Zellen einen Schutz gegenüber MDR1abhängiger Chemotherapie in vivo vermittelt. Weiterhin konnte eine Expansion der MDR1-transduzierten, im NOD/ SCID-Modell angegangenen Zellen mit hoher P-Glykoprotein-Expression nach Chemotherapie gezeigt werden. Der durchschnittliche Anteil humaner Leukozyten im chimären NOD/SCID-Mausknochenmark lag zwischen 56%78%. Das Angehen der humanen Zellen in Mäusen, die mit MDR1-transduzierten Zellen transplantiert wurden, war genauso hoch wie bei den Mäusen, die mit Mock-transduzierten Zellen transplantiert wurden. Dies zeigt, daß mit dem verwendeten Transduktionsprotokoll und dem verbesserten SF91m3-Vektor während des 6-7 wöchigen Beobachtungszeitraums die Hämatopoese regelrecht verläuft. Mit Hilfe von MDR1-provirusspezifischer quantitativer PCR konnte eine durchschnittliche Gentransferrate der im NOD/ SCID-Mausmodell repopulierenden humanen Zellen von 9.4%-12.3% festgestellt werden. Ein Anteil von 59% (33%-92%) SF91m3-transduzierter repopulierender Zellen zeigte einen Rh-123 dull Phänotyp. Diese Daten legen nahe, daß eine Vektorintegration pro MDR1-transduzierter Zelle mit dem hier verwendeten Trasnduktionsprotokoll stattgefunden hat, was das Risiko der Insertionsmutagenese soweit als möglich minimiert. Das gute „Angehen“ der Zellen in den Mäusen, die hohe Gentransferrate, sowie die starke Genexpression ermöglichten nun die Untersuchung einer Chemoprotektion in vivo. Den chimären Mäusen wurde eine subletale Dosis an Paclitaxel verabreicht. Anschließend konnte festgestellt werden, daß die Zahl humaner Zellen in Mäusen, die mit MDR1-transduzierten Zellen transplantiert wurden, signifikant weniger abfiel, als in Mäusen, die mit Mock-transduzierten Zellen transplantiert wurden (p<0.05), woraus der Schluß der Chemoprotektion MDR1-transduzierter Zellen gezogen werden kann. Ein Vergleich mit transduzierten, unbehandelten Mäusen zeigt eine signifikante 1.4-1.8-fa- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie che Erhöhung in der Zahl der genmarkierten (p<0.05-0.01) oder P-Glykoprotein-exprimierenden (p<0.01) humanen Zellen in transduzierten, Paclitaxel-behandelten Mäusen. Eine immer wieder auftauchende Frage im Zusammenhang mit der Transplantation retroviral transduzierter hämatopoetischer Stammzellen ist, ob und wieviele solche(r) Stammzellen erfolgreich transduziert wurden. Durch klonale Analyse dieser Zellen mittels ligationsmediierter PCR (LM-PCR) konnte eine hohe Zahl gleichzeitig aktiver humaner Stammzellklone acht Wochen nach Transplantation analysiert werden. Es ist nun von Interesse, ob durch die Chemotherapie bestimmte Klone selektiert werden und es zu einer oligoklonalen Hämatopoese kommt, oder ob die Myeloprotektion polyklonal getragen wird. Publikationen (* = externe Koautoren) Schiedlmeier B.*, Schilz A.J.*, Kuehlcke K.*, Laufs S., Baum C.*, Zeller W.J., Eckert H.G.*, Fruehauf S.*: Multidrug resistance 1 gene transfer can confer chemoprotection to human peripheral blood progenitor cells engrafted in immunodeficient mice. Hum Gene Ther. 13(2): 233-42, 2002. Buss E.C., Schiedlmeier B.*, Ho A.D.*, Zeller W.J., Fruehauf S.*: The FBMD-1 stroma cell line secretes a unique moiety which can increase retroviral transduction of lineage-committed and primitive human peripheral blood progenitor cells. Cancer Gene Ther.8(6): 440-9, 2001. Schiedlmeier B.*, Kühlcke K.*, Eckert H.G.*, Baum C.*, Zeller W. J., Fruehauf S.*: Quantitative Assessment of Retroviral Transfer of the Human Multidrug Resistance-1 Gene to Human Mobilized Peripheral Blood Progenitor Cells Engrafting in NOD/SCID Mice. Blood 95: 1237-1248, 2000. Schilz A.J.*, Schiedlmeier B.*, Kühlcke K.*, Fruehauf S.*, Lindemann C.*, Zeller W.J., Grez M.*, Fauser A.A.*, Baum C.*, Eckert H.G.*: MDR1 gene expression in NOD/SCID repopulating cells after retroviral gene transfer under clinically relevant conditions.Mol. Ther. 2(6): 609-618, 2000. Schiedlmeier B.*, Buss E.C., Veldwijk M.R., Zeller W.J., Fruehauf S.*: Soluble bone marrow stroma factors improve the efficiency of retroviral transfer of the human multidrug-resistance 1 gene to human mobilized peripheral blood progenitor cells. Hum. Gene Ther. 10: 1443-1452, 1999. Fruehauf S.*, Wermann K., Buss E.C., Hundsdoerfer P., Veldwijk M.R., Haas R.*, Zeller W.J.: Protection of hematopoietic stem cells from chemotherapy-induced toxicity by multidrug-resistance 1 gene transfer. Rec. Results Cancer Res. 144: 93-115, 1998. Neue Strategien für die Behandlung von Sarkomen mittels Gen-Transfer von Suizidgen-enthaltenden „Rekombinante Adeno-Assoziiertes-Virus-2-Vektoren“ M.R. Veldwijk, S. Berlinghoff, J. Topaly*, S. Laufs, S. Fruehauf* and W.J. Zeller *Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg. Rekombinante Adeno-assoziiertes-Virus-2 (rAAV-2)-Vektoren werden sowohl für die klinische Gentherapie bei Erbkrankheiten als auch präklinisch zur Behandlung von Krebs eingesetzt. In diesem Projekt konnten wir mit einem rAAV-2-Vektor, welcher das “green fluorescent protein“ (GFP) enthält, eine hohe Infektionsrate von verschiedenen soliden Tumoren gegenüber erreichen. Aus einer Reihe von 8 soliden Tumorzelllinien und primären peripheren Blutstammzellen (PBSZ), die mit rAAV-2-Überständen infi- D0200 Pharmakologie der Krebsbehandlung ziert worden sind (funktionaler Titer: 200 IU/Zelle), erhielten wir die höchste Infektionsraten bei einer Weichteilsarkom-Zelllinie (HS1; Mittelwert: 96% GFP+ Zellen) und bei Brustkrebszellen (T47D; Mittelwert: 83%, MCF-7; Mittelwert: 85%); bei 5 weiteren Zelllinien (1 Ovarialtumor, 1 Keimzelltumor, 1 Osteosarkom und 2 kleinzellige Bronchialkarzinome) wurden niedrigere Infektionsraten erreicht (3%-12%); die niedrigste Infektionsrate zeigte sich bei PBSZ (max. 4%). Diese Resultate zeigen, daß Sarkome und Brustkrebszellen die geeignetsten Zielzellen für rAAV2-vermittelte Suizid-Gentherapie sind. Die erste Anforderung, um diese Vektoren in Zell-kill-Experimenten zu verwenden, ist die Klonierung von neuen rAAV-2-Vektoren, welche ein geeignetes Suizidgen enthalten. Deshalb wurde das Thymidinkinase (TK)-Gen in Kombination mit dem Prodrug Ganciclovir gewählt. Drei neue TK-rAAV-2-Vektoren wurden kloniert. Da einige dieser neuen Vektoren kein Markergen (GFP) enthielten und deshalb auch nicht mit dem Fluoreszenz-abhängigen funktionalen Titrierungsverfahren titriert werden konnten, wurde ein optimiertes Titrierungsverfahren entwickelt, welches auf einer „real-time quantitative“ Polymerase-Ketten-Reaktion (RQ-PCR), die Markergen-unabhängig ist, basiert. Vier Sarkomzelllinien wurden ausgewählt (HS-1, HT1080, RDES und SK-N-MC) und eine komplette Abtötung aller Tumorzellen nach Infektion mit einem rAAV-TK/eGFP-Vektor und Behandlung dieser Zellen mit Ganciclovir (2,5 µg/ml) konnte nachgewiesen werden, wobei in der Kontrollgruppe über 95% der Zellen überlebten. Für diese Zelllinien sind weiterhin Xenotransplantationsmodelle etabliert worden. In „proof of principle“-Experimenten sind Mäuse mit rAAV-TK/eGFPtransduzierten und Ganciclovir behandelten Tumorzellen transplantiert worden. Diese Tiere überlebten das Experiment (>5 Monate), während die Tiere, die nicht-transduzierte Zellen bekamen, innerhalb eines Monats verstarben. Diese Daten zeigen das vielversprechende Potential von rAAV-2-bassierten Suizidvektoren für die zukünftige klinische Anwendung. Publikationen (* = externe Koautoren) Veldwijk MR, Topaly J*, Laufs S, Zeller WJ and Fruehauf S* (2002). Rapid determination of adeno-associated virus 2 vector titers using an optimized real-time quantitative polymerase chain reaction-based titration assay that meets clinical laboratory standards. Mol Ther, Accepted for publication. Fruehauf S*, Veldwijk MR, Berlinghoff S, Basara N, Baum C*, Flasshove M, Hegewisch-Becker S, Kröger N, Licht T, Moritz T, Zeller WJ and Laufs S (2002). Gene therapy for sarcoma. Cells Tissues Organs, Accepted for publication. Veldwijk MR, Fruehauf S*, Schiedlmeier B, Kleinschmidt JA and Zeller WJ (2000). Differential expression of a recombinant adenoassociated virus 2 vector in human CD34+ cells and breast cancer cells. Cancer Gene Ther 7: 597-604. Veldwijk MR, Schiedlmeier B, Kleinschmidt JA, Zeller WJ and Fruehauf S* (1999). Superior gene transfer into solid tumour cells than into human mobilised peripheral blood progenitor cells using helpervirus-free adeno-associated viral vector stocks. Eur J Cancer 35: 1136-1142. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 171 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Experimentelle Kombinationstherapie der chronischen myeloischen Leukämie unter Einschluß des Tyrosinkinaseinhibitors STI571. Publikationen (* = externe Koautoren) J. Topaly*, M. Schad, S. Fruehauf*, W.J. Zeller Topaly J.*, Zeller W.J., Fruehauf S.* : Synergistic activity of the new ABL-specific tyrosine kinase inhibitor STI571 and chemotherapeutic drugs on BCR-ABL-positive chronic myelogenous leukemia cells.Leukemia 15: 342-347, 2001. *Med. Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg Die chronische myeloische Leukämie (CML) wird durch die reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 verursacht, bei der das BCR-ABL-Fusionsgen entsteht, das eine erhöhte Tyrosinkinase (TK)-Aktivität aufweist. Durch die Entwicklung des TK-Inhibitors STI571 (Novartis Pharma) ist es zu einem Durchbruch in der Therapie dieser Erkrankung gekommen. Je nach Erkrankungsstadium sprechen bis zu 90% der CML-Patienten mit einer Normalisierung des Blutbildes und ca. 50% der Patienten mit weitgehenden zytogenetischen Remissionen auf eine Behandlung mit STI571 an. Nichtsdestotrotz kommt es bei einem Teil der Patienten unter STI571-Therapie zu einem Rezidiv der Erkrankung. 172 D0200 Pharmakologie der Krebsbehandlung Topaly J.*, Fruehauf S.*, Ho A.D.*, Zeller W.J.: Rationale for combination therapy of chronic myelogenous leukemia with imatinib and irradiation or alkylating agents: implications for pretransplant conditioning. Br J Cancer 86: 1487-1493, 2002. Eine weitere Verbesserung der Behandlung ist durch eine Kombinationstherapie zu erwarten. In dieser Arbeit wurde systematisch untersucht, welche Substanzen in Kombination mit STI571 CML-Zellen synergistisch abtöten. Für die quantitative Auswertung der Kombinationseffekte wurde die Median-Effect-Methode von Chou und Talalay angewendet. Nach dieser Methode wird ein Kombinationsindex (CI) berechnet, der bei Werten <1 auf Synergismus, >1 auf Antagonismus und =1 auf Additivität hindeutet. Es hat sich gezeigt, dass CI-Werte meistens mit steigender Wachstumshemmung abnehmen, was einem verstärkten Synergismus entspricht. Die Auswertung der CI-Werte bei IC75 (75% Wachstumshemmung) ergab einen signifikanten Synergismus in der CML-Zelllinie BV173 für die STI571Kombinationen mit Cytarabin, Etoposid, Mitoxantron, Treosulfan, Mafosfamid, Idarubicin, Carboplatin, Thiotepa, Dexamethason und γ-Bestrahlung. Ein Teil dieser Kombinationen wurde auch in anderen CML-Zelllinien getestet und führte zu ähnlichen Ergebnissen. CI-Werte der Kombinationen mit Gemcitabin, Busulfan, Hydroxyurea, Docetaxel, Fludarabin, Methotrexat, Cladribin, Nimustin und Topotecan unterschieden sich nicht signifikant von 1 (rein additiver Effekt). Ergebnisse aus dem Colony-FormingAssay mit primärem CML-Material entsprachen tendenziell den Beobachtungen im MTT-Assay. Untersuchungen mit BCR-ABL-negativen Zelllinien und primären Zellen zeigten keine Verstärkung der zytostatischen Wirkung chemotherapeutischer Substanzen oder der γ-Bestrahlung durch STI571. Demzufolge führt STI571 zu einer Erweiterung des therapeutischen Index zytostatischer Substanzen und der γ-Bestrahlung. Aufgrund unserer Daten ist eine klinische Studie entstanden, welche die Effektivität und Verträglichkeit einer STI571-basierten Kombinationstherapie in der myeloischen Blastenkrise der CML testen soll. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Es wurden pharmakokinetische Modelle für Signal-ZeitDaten entwickelt, die gleichzeitig im Tumor und im Kreislauf erhoben wurden, und es wurde gezeigt, dass wegen der Variabilität der Kinetik im Kreislauf gleichzeitige Messungen im Tumor und im Kreislauf erforderlich sind, wenn man quantitative Aussagen über die Kinetik des Kontrastmittels im individuellen Tumor machen will [1]. Pharmakokinetische und pharmakodynamische Daten aus der Klinik und der Arzneimittelentwicklung werden mit Populationsmodellen ausgewertet [Sheiner et al., J. Pharmacokin. Biopharm. 19 (1991), 11S - 24S]. Schwerpunkt war die Untersuchung der Dosis- und Zeit-Wirkungs-Beziehung von Erythropoetin bei Kindern mit renaler Anämie. Die Dosierung ist in diesem Fall schwierig, da die Wirkung sehr variabel ist und über mehrere Monate anhält. Bei geringer Überdosierung treten ernste Nebenwirkungen auf. Ziel der Untersuchung ist, die Grundlage für ein Computer-gestütztes Verfahren zur individuellen Dosisoptimierung zu schaffen. 6 relative Signalintensitaet 2 3 4 5 Eines der Hauptprobleme bei der Behandlung solider maligner Tumoren mit Arzneistoffen ist die Erzielung ausreichend hoher Wirkstoffkonzentrationen im Tumor für ausreichend lange Zeit. Über die Arzneistoffkonzentrationen, die tatsächlich in menschlichen Tumoren zustandekommen, ist wenig bekannt. Die dynamische KernresonanzTomographie (“dynamic magnetic resonance imaging”, dMRI) erlaubt es, Konzentrationsverläufe von Kontrastmitteln nichtinvasiv im Gewebe zu verfolgen. Mögliche Anwendungen liegen in der Differentialdiagnose maligner und benigner Tumoren und in einer frühen Erfassung von therapeutischen Effekten. Bei den meisten Tumoruntersuchungen wird nicht der gleichzeitige Verlauf der Konzentration des Kontrastmittels im Kreislauf berücksichtigt. 173 1 Kooperationen mit: M.V. Knopp, Onkologische Diagnostik und Therapie, DKFZ; W.E. Hull, AG Zentrale Spektroskopie, DKFZ; O. Mehls, Universitäts-Kinderklinik Heidelberg; R.W. Jelliffe, School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, USA. Zusatzfinanzierung: DFG (Pharmakodynamik von Erythropoetin) 0 5 10 6 R.E. Port Abb.: Dynamische NMR-Tomographie, Signal-Zeit-Verlauf in der Aorta nach Kurzinfusion des Kontrastmittels Gadopentetat (0,1 mmol/kg) bei zwei verschiedenen Patientinnen. Senkrechte gestrichelte Geraden: Beginn und Ende der Infusion. Durchgezogene Kurven: Modellvorhersage auf Grund der mittleren Populationsparameter, des Körpergewichts und des ersten Messwerts. Gestrichelte Kurven: Modellvorhersage auf Grund individueller Bayes-Parameter. Bei der ersten Patientin entsprechen die Messwerte etwa dem, was auf Grund der mittleren Populationsparameter, des Körpergewichts und des ersten Messwerts zu erwarten ist. Damit sind die individuellen Bayes-Parameter ähnlich den mittleren Populationsparametern und beide Modellkurven sind nahezu gleich (obere Abbildung). Bei der zweiten Patientin weichen die Messwerte erheblich von der Erwartung ab. Dies wird überwiegend als Folge zufälliger interindividueller Variation gedeutet. Das Ergebnis sind stark abweichende individuelle Bayes-Parameter und damit ein Auseinanderklaffen der beiden Modellkurven (untere Abbildung). relative Signalintensitaet 2 3 4 5 Pharmakokinetik/Pharmakodynamik (D0201) D0200 Pharmakologie der Krebsbehandlung 1 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie 0 Publikationen (* = externer Koautor): [1] Port RE, Knopp MV, Brix G*: Dynamic contrast-enhanced MRI using Gd-DTPA: Interindividual variability of the arterial input function and consequences for the assessment of kinetics in tumors. Magn Reson Med 45, 1030 - 1038, 2001 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 5 Zeit (min) 10 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie D0301 Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie (D0301) Leiter: Prof. Dr. med. Martin R. Berger 06221 42-3310, FAX: 06221 42-3313, E-mail: [email protected] Gastwissenschaftler Dr. Spiro M. Konstantinov (09 - 11/00, 05 - 08/01, Sofia, Bulgarien) Dr. Milka Georgieva (03 - 06/00, 10 - 12/00, 03 - 05/01, Sofia, Bulgarien) Prof. Dr. Iana Tsoneva (10 - 11/01, Sofia, Bulgarien) Doktoranden Cristina Voß ( - 12/01) Hassan Adwan (10/99 - ) Michael Conzelmann ( - 09/01) Christoph Dieterle ( - 09/01) Maike Leible (10/00 - ) Jan Sänger (10/00 - ) Tobias Bäuerle (09/01 - ) Technisches Personal Aysen Danisman-Marsch ( - 03/01) Helmut Opitz ( - 09/00) Birgit Kaiser (1/2 Stelle, 10/00 - ) Gerd Braun (02/01 - ) Nachweis von disseminierten Kolonkarzinomzellen (D0301-1) M.R. Berger, C. Dieterle, M. Conzelmann In Zusammenarbeit mit Dr. U. Linnemann, Städtisches Klinikum Nord, Nürnberg Kolonkarzinome weisen in der Hälfte aller Fälle Mutationen des K-ras Gens auf. Der sensitive Nachweis dieser Mutation mittels PCR-RFLP wurde ausgenutzt, um geringe Mengen derartig mutierter Kolonkarzinomzellen am Resektatrand und in der Leber von Patienten nachzuweisen, die wegen eines Kolonkarzinoms operiert wurden. Die Sensitivität des K-ras Nachweises ist durch molekularbiologische Methoden gegenüber der Histologie deutlich verbessert. Eine Ausweitung der Diagnostik auf weitere Gewebe wie Lymphknoten und Knochenmark ist geplant. Das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen in der Leber erlaubt eine genauere Klassifizierung der Patienten [13]. Alkylphosphocholine (D0301-2) 174 Ziele und Aufgaben der Arbeitsgruppe sind eng an den verbesserten Nachweis geringer Mengen von Tumorzellen und an die Entwicklung und toxikologische Beurteilung von Substanzen gekoppelt, die Krebswachstum hemmen. Der Nachweis von wenigen Tumorzellen ist durch molekularbiologische Techniken prinzipiell möglich geworden, muss für jede Tumorart in der Praxis aber erst etabliert werden. Diese Arbeit ist sinnvoll, weil geringe Mengen an Tumorzellen therapeutisch leichter positiv beeinflussbar sind. In diesem Zusammenhang ist die Detektion von Tumorzellen zu sehen, die mit Hilfe von Mutationen des Kras Gens oder mittels epithelialer Marker (Cytokeratin 20, Guanylylcyclase C) nachgewiesen wurden. Neue, mehr selektiv antineoplastisch wirksame Verbindungen beeinflussen häufig die Signaltransduktion der Zelle. Alkylphosphocholine, eine neue Gruppe membranwirksamer Verbindungen, hemmen das Krebswachstum konzentrationsabhängig (sowohl zytotoxisch als auch Apoptose- auslösend und differenzierend). Die Identifizierung der molekularen Wirkungen ist ein weiteres mittelfristiges Forschungsziel. Die Wirkung auf Metastasen im Knochen und in der Leber wird an spezifischen Modellen untersucht, die pathophysiologisch den klinischen Vorbildern möglichst nahe kommen. M.R. Berger, S.M. Konstantinov In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H. Eibl, Max Planck Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen; Prof. Dr. C. Unger, Klinik für Tumorbiologie, Freiburg Alkylphosphocholine sind Verbindungen, die sich - wegen ihrer hohen Ähnlichkeit mit natürlichen Membranbestandteilen - in Zellmembranen anreichern und dort Wirkungen auslösen, die als antineoplastisch, antiviral und antileishmanial charakterisiert werden können. Der Mechanismus der antineoplastischen Wirkung beruht - zumindest teilweise - auf der Auslösung von Apoptose in den exponierten Krebszellen. Untersuchungen zu Struktur-Wirkungsbeziehungen haben gezeigt, daß Alkylphosphocholine mit einer Kettenlänge von 22 Kohlenstoff-Atomen sowie einer Doppelbindung in der Alkoholkette intravenös applizierbar werden und deshalb als eigene Untergruppe gewertet werden können. Insgesamt ist diese Gruppe von antineoplastischen Verbindungen arm an schädlichen Nebenwirkungen und weist Eigenwirkungen auf, wie die Stimulation von hämatopoetischen Zellen, die diese Gruppe als Bestandteil einer Kombinationschemotherapie besonders geeignet erscheinen lassen [4-6]. Tiermodelle zur Metastasierung (D0301-3) M.R. Berger, H. Adwan, M. Leible, J. Sänger In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. G. Golomb, Hebrew University of Jerusalem, Israel; Dr. M. Seelig, Abteilung für Chirurgie, Städtisches Klinikum, Ludwigshafen Da der Primärtumor meist therapeutisch beherrscht werden kann, ist das Auftreten von Metastasen oft die finale Etappe einer Krebserkrankung. Tiermodelle, die diese Krankheitsstufe modellieren sollen, sind technisch aufwendiger und können nur jeweils besondere Aspekte der Metastasierung darstellen. Ein Rattenmodell zur Metastasierung von kolorektalen Tumoren in die Leber wurde DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie D0301 Arbeitsgruppe Toxikologie und Chemotherapie dazu so modifiziert, daß ein Markergen die Quantifizierung der Tumorzellen nach intraportaler Injektion in die Leber auch bei diffuser Metastasierung ermöglicht [7]. Ein weiteres Rattenmodell stellt die Metastasierung in den Knochen nach. Dazu werden ebenfalls mit einem Markergen versehene Mammakarzinomzellen in einen Seitenast der A. femoralis injiziert und bilden danach im Bereich des distalen Ober- und proximalen Unterschenkels lytische Metastasen (Abb. 1). Derzeit laufende Therapiestudien mit diesen Modellen werden dazu beitragen, verbesserte Therapiemöglichkeiten zu entwickeln. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Schimanski, C.C.; *Sutter, C.; *Linnemann, U., Berger, M.R.: Sampling technique influences the detection of K-ras mutations in normal appearing mucosa of colorectal cancer patients. Int. J. Oncol. 15, 391-398 (1999) [2] Schimanski, C.C.; *Linnemann, U., Berger, M.R.: Sensitive detection of K-ras mutations augments diagnosis of colorectal cancer metastases in the liver. Cancer Res. 59, 5169-5175 (1999) Abb. 1: Darstellung einer osteolytischen Metastase von MDA-MB231 Zellen in der Tibia einer Ratte. [3] Schimanski, C.C., *Linnemann, U., *Arbogast, R., Berger, M.R.: Extended staging results from the detection of isolated tumor cells in the liver of colorectal cancer patients Oncol. Rep 8: 185-188 (2001) [4] Berger, M.R., Sobottka, S., Konstantinov, S.M., *Eibl, H.: Erucylphosphocholine is the prototype of i.v. injectable alkylphosphocholines. Drugs of Today, 34 (Suppl. F), 73-81 (1998) [5] Konstantinov, S.M., *Eibl, H., Berger M.R.: BCR-ABL influences the antileukaemic efficacy of alkylphosphocholines. Br. J. Haematol., 107 365-374 (1999) [6] Konstantinov, S.M., Berger M.R.: Human urinary bladder carcinoma cell lines respond to treatment with alkylphosphocholines. Cancer Lett. 144, 153-160 (1999) [7] Wittmer, A., *Khazaie, K., Berger, M.R.: Quantitative detection of lac-Z-transfected CC531 colon carcinoma cells in an orthotopic rat liver metastasis model. Clin. Exp. Metastas. 17, 369-376 (1999) DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 175 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie D0302 Kooperation mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg Kooperation des DKFZ mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg (D0302) Leiter: Prof. Dr. med. Magnus von Knebel-Doeberitz : 06221 562876, Fax -5981, E-mail: [email protected] Differentielle Genexpression in soliden Tumoren (insb. Kolonkarzinom) Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Robert Kösters Dr. Johannes Gebert Dr. med. Matthias Kloor Dr. med. Nicolas Wentzensen Dr. Svetlana Vinokourova Dr. Michael Linnebacher Dr. Jeannine Lacroix Dr. Susanne Dihlmann Dr. med. Stefan Wörner Dr. med. Peter Findeisen Im Projektbereich 1 werden mit Hilfe differentieller Analyseverfahren der Genexpression Gene identifiziert, die in Tumorzellen exprimiert werden, in normalen, nicht transformierten Geweben jedoch nicht. Wir nutzen hierbei einen „evidence basierten“ Ansatz. Diese Gene dienen als Ansätze für die Entwicklung neuer Verfahren für die Krebsfrüherkennung, den Nachweis disseminierter Tumorzellen in verschiedenen klinischen Proben, wie beispielsweise Lymphknoten, Knochenmark, peripherem Blut etc. Ferner werden diese differentiell exprimierten Gene auch für die Entwicklung neuer Tumorvakzine verwendet (siehe Projektbereich 6). Es konnten etwa 30 neue Gene identifiziert und validiert werden. U.a. konnten gänzliche neue, bisher nicht bekannte Sequenzen mit hoher differentieller Expression vor allem in koloektalen Karzinomen isoliert und charakterisiert werden, die sich sowohl als Diagnostikum wie auch als Angriff für eine gezielte Immuntherapie eignen. Gastwissenschaftler Carmen Gurrola Diaz Doktoranden Anja Germann Christine Fallsehr Corina Ziegert Eva Geiger 176 Technische Assistenten Özlem Mutluer Irina Voehringer Simone Klein* Gabriele Russell Beate Kuchenbuch Heike Sartor Kooperationen: Prof.Dr. M. Büchler, Chir. Univ. Klinik, Heidelberg; Prof.Dr. M. Wiesel, Urolog. Univ.-Klinik, Heidelberg; Prof.Dr. P. Drings, Thoraxklinik, Heidelberg; Dr.F. Bosch, Univ.-HNO-Klinik, Heidelberg; Prof.Dr. W. Dippolt, St. Vincenz- u. Elisabeth-Hospital, Mainz; Dr. J. Hoheisel, Prof.Dr. M. Little, DKFZ; Prof.Dr. W. Ansorge, Dr. P. Bork, EMBL, Heidelberg; Dr. J. Coy, MTMLaboratories AG, Heidelberg Drittmittel: BMBF-Fortsetzungsantrag 2002: 1 BAT IIa, 1 BAT Vc, Sachmittel Euro 160.000; Forschungsförderung der Univ.: 1 BAT Vb, Sachmittel DM 19.996 * DKFZ finanziert Die Abteilung für „Molekulare Pathologie“ ist im Oktober 2001 neu eingerichtet worden. Sie ging aus der ehemaligen Sektion für Molekulare Diagnostik und Therapie der Chirurgischen Universitätsklinik Heidelberg hervor und stellt eine Kooperationseinheit zwischen dem DKFZ und dem Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg dar. Hauptfokus der Abteilung ist die Entwicklung neuer Verfahren für die Krebsfrüherkennung, die Krebsdiagnostik und Prävention solider Tumoren. Die Arbeiten werden vom DKFZ durch die Bereitstellung von Laborkapazität und anderen Unterstützungen gefördert. Die wissenschaftliche Arbeitsschwerpunkte der Abteilung gliedern sich in 7 Hauptprojekte: • Projekt 1: Differentielle Genexpression in soliden Tumoren (insb. Kolonkarzinom) • Projekt 2: Molekulare Pathogenese mikrosatelliten instabiler Tumore • Projekt 3: Neue Diagnostika für die Krebsfrüherkennung und den Nachweis disseminierter Tumorzellen • Projekt 4: Karzinogenese durch humane Papillomviren, Aspekte für Diagnostik und Früherkennung • Projekt 5: konditionelle (transgene) Tiermodelle der Krebsentstehung • Projekt 6: Tumorimmunologie und Vakzineentwicklung • Projekt 7: Tumorzellsensitivierung und Krebsprävention Publikationen Dihlmann et al., Cancer Res. 59: 1857-1860, 1999 Klaes et al., Eur. J. Cancer 35: 733-737, 1999 Koesters et al., Genomics 61: 210-218, 1999 Gebert et al., Int.J.Oncol. 16:169-179, 2000 Dihlmann et al., Oncogene 20: 645-653, 2001 Molekulare Pathogenese mikrosatelliten instabiler Tumore Im Projektbereich 2 werden vor allem Gene identifiziert, die in mikrosatelliten instabilen Tumoren (MSI+) spezifische Mutationen aufweisen (sog. frame shift-Mutationen) (Wörner et al., 2001). Diese Frameshiftmutationen führen zu neuen Peptidsequenzen in den Tumorzellen, die sich sowohl für die Diagnostik als auch die immunologische Prävention und Therapie dieser Tumoren sehr gut nutzen lassen. Im Rahmen dieses Projektes arbeiten wir insbesondere intensiv an der Entwicklung eines präventiven Impfstoffes für das hereditäre nicht-kolorektale Karzinom (Linnebacher et al., 2001). Im Projektbereich 2 wurde ferner ein interdisziplinäres Zentrum für den erblichen Dickdarmkrebs (HNPCC) durch Unterstützung der Deutschen Krebshilfe aufgebaut, in dessen Rahmen ein sehr umfangreiches Diagnostik und Beratungsprogramm für Patienten mit erblichen Formen des kolorekalen Karzinoms unterhalten wird (siehe hierzu auch die Homepage des Programms www.hnpcc.de). DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Kooperationspartner: Dr. P. Bork, EMBL, Heidelberg; Prof.Dr. CM Becker, Inst. für Biochemie der Univ. Erlangen; Prof. Dr. J. Rüschoff, Inst. für Pathologie, Städt. Kliniken, Kassel; Prof.Dr. H. Vogelsang Techn. Universität, München; Dr. R. Ridder, MTMLaboratories, Heidelberg Drittmittel : Krebshilfe HNPCC (1999-2002): 1 BAT IIa, 1 BAT Vc, Verbrauch Euro 1.35 Mio für 6 Jahre, Tumorzentrum HD/MA (1997-2001): 1 BAT IIa/4, Sachmittel p.a. DM 10.000 Publikationen: Sutter et al., Molecular and Cellular Probes 13: 157-165, 1999 Wörner et al., Int. J. Cancer 93, 1: 12-19, 2000 Wüllenweber et al., Dis. Colon and Rectum 44: 1281-1289, 2000 Grips et al., Nervenarzt 73: 177-182, 2002 Neue Diagnostika für die Krebsfrüherkennung und den Nachweis disseminierter Tumorzellen Im Projektbereich 3 wurden neue Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen in verschiedenen Organsystemen, wie beispielsweise Lymphknoten, peripherem Blut, Knochenmark und anderen mehr entwickelt und im Rahmen breitangelegter klinische Studien evaluiert. Dem Nachweis disseminierter Tumorzellen in den verschiedenen Organsystemen konnte eine erhebliche prognostische Bedeutung zugemessen werden. Kooperationspartner: Prof. Dr. K. Pantel, Univ.-Krankenhaus Eppendorf, Hamburg; Dr. J. Weitz, Sloane-Kettering-MemorialHospital, New York, USA; Dr. P. Kienle, Dr. M. Koch, Chir. Univ. Klinik Heidelberg; MTM-Laboratories, Heidelberg Drittmittel: Tumorzentrum HD/MA (1997-2001): 1 BAT IIa/2 1 BAT Vc, Sachmittel p. a. DM 15.000; Tumorzentrum HD/MA (20022006): 1 BAT IIa/2 1 BAT Vib, Sachmittel p.a. DM 20.000 D0302 Kooperation mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg ser Marker derzeit evaluiert. Die bisherigen Daten weisen daraufhin, dass durch diesen neuen Marker das bisherige Verfahren des Pap-Abstrichs sehr sinnvoll ergänzt und wesentlich genauer durchgeführt werden kann. Ferner konnte im Rahmen dieses Projektbereichs durch den Nachweis der Integration von humanen Papillomviren ein neues Verfahren für den Nachweis der Progression von Vorstufen des Zervixkarzinoms zum invasiven Karzinom entwickelt und validiert werden. Beide Verfahren wurden umfangreich durch Patentanmeldungen geschützt und an ein mit dem DKFZ neugegründetes Unternehmen, die MTMlaboratories AG in Heidelberg auslizensiert. Kooperationspartner: Dr. H. Hoffmann, MTM-Laboratories, Heidelberg; Prof.Dr. U. Petry, Univ.-Frauenklinik, Hannover; Prof.Dr. P. Melsheimer, Univ.-Frauenklinik, Heidelberg; Prof.Dr. A. Schneider, Univ.-Frauenklinik, Jena; Prof.Dr. V. Schneider, Inst. für Pathologie, Freiburg; Dr. V. Heilmann, Univ.-Frauenklinik, Ulm; Prof.Dr. K. Shah, Johns-Hopkins-Medical-School, Dept. of Molecular Microbiology and Immunology, Baltimore, USA; Prof.Dr. R. Kurman, Johns Hopkins Medical School, Dept. of Pathology, Baltimore, USA; Prof.Dr. D. Jenkins, Queen’s Medical Center, Dept. of Pathology, Nottingham, UK; Prof.Dr. T. Rajkumar, Institute of Pathology, Madras, Indien Drittmittel : Krebshilfe (Folgeantrag) (1999-2002): 1 BAT IIa/2 1 BAT Vc/2, Sachmittel p.a. DM 20.000; Krebshilfe 2000-2001 : 1 BAT IIa/2, Sachmittel p.a. DM 25.000; Tumorzentrum HD/MA (2002-2006): 1 BAT IIa/2 1 BAT VIb 177 Publikationen : Nindl. et al., Int. J. Cancer 81: 666-668, 1999 Snijders et al., J. Clin. Pathol. 52: 498-503, 1999 Klaes et al., Cancer Research 59 (24): 6132-6136, 1999 Klaes et al., Int. J. Cancer 92 (2): 276-284, 2000 Publikationen Luft et al., Int. J. Cancer 92 (1): 9-17, 2000 Weitz et al., Clin. Cancer Research 5: 1830-1836, 1999 v. Knebel Doeberitz, Zentralbl. Gynaekol. 123: 186-191, 2001 Weber et al., British Journal of Cancer 82 (1): 157-60, 2000 v. Knebel Doeberitz, Disease Markers 17: 123-128, 2001 Weitz et al., Annals of Surgery 232 (1): 66-72, 2000 Wentzensen et al., Oncogene 21: 419-426, 2002 v. Knebel Doeberitz et al., Zentralbl. Chir. 125 Suppl. 1:16-20, 2000 Preise: 2000 Christoph-Wilhelm-Hufeland-Preis Güdemann et al., Journal of Urology 164: 532-536, 2000 Koch et al., Arch Surg. 136: 85-89, 2001 Lacroix et al., Int. J. Cancer 92 (1): 1-8 Weitz et al., Langenbecks Arch Chir. Forumsband 29: 149-152, 2000 Weitz et al., Dtsch. Ges. f. Chir., Chir. Forum 30: 109-111, 2001 Lacroix et al., Semin. Surg. Oncol. 20: 252-264, 2001 Weber et al., World. J. Surg. 26: 148-152, 2002 Karzinogenese durch humane Papillomviren, Aspekte für Diagnostik und Früherkennung Im Projektbereich 4 entwickeln wir vor allem Verfahren, durch die dysplastische Zellveränderungen an der Zervix uteri spezifischer und mit höherer Genauigkeit nachgewiesen werden können. Durch die detaillierte Analyse der Transformationsmechanismen, durch die humane Papillomviren zur Karzinogenese der Anogenitalkarzinome (insbesondere Zervixkarzinom) beitragen, konnten wir Marker ableiten, die sowohl als spezifische Früherkennungsmarker als auch als Progressionsmarker klinisch von Bedeutung sind. So konnten wir zeigen, dass das p16ink4a-Protein ein hochspezifischer Marker für auftretende Dysplasien der Zervix uteri ist. In interanionalen Studien wird die- Konditionelle (transgene) Tiermodelle der Krebsentstehung Im Projektbereich 5 entwickeln wir transgene und nicht transgene Tiemodelle der Krebsentstehung, durch die Tumoren konditionell in Nagern hervorgerufen werden können. In diesen Modellen konnten ebenfalls differentiell exprimierte Gene nachgewiesen werden, gegen die spezifische Vakzinierungsverfahren entwickelt werden. Ziel dieses Projektbereiches ist es vor allem zu prüfen, ob durch präventive Vakzinierungsverfahren gegenüber differentiell exprimierten Tumorantigenen ein präventiver Impfschutz und Immunität gegenüber in vivo induzierbaren Tumoren hervorgerufen werden kann. Kooperationspartner: Prof.Dr. Bujard, ZMBH, Heidelberg; Prof.Dr. Groene, DKFZ Drittmittel: Tumorzentrum HD/MA (1997-2001): 1 BAT IIa/2 1 BAT Vc, Sachmittel p. a. DM 15.000 Publikationen: Kösters et al., Cancer Research 59 (16): 3880-3882, 1999 Kösters et al., Carcinogenesis 22 (11): 1885-1890, 2001 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie D0302 Kooperation mit der Abteilung für Molekulare Pathologie des Universitätsklinikums Heidelberg Tumorimmunologie und Vakzineentwicklung Tumorzellsensitivierung und Krebsprävention Im Projektbereich 6 werden mögliche induzierbare Immunmechansimen gegenüber differentiell exprimierten Antigenen (siehe Projekt 1,2,4) überprüft Ziel dieses Projektes ist es, optimierte Vakzinierungsverfahren zu entwikkeln, die vor allem für die immunbasierte Krebsprävention Verwendung finden sollen. Ferner werden im Rahmen diese Verfahren Immunmechanismen bei Tumorpatienten überprüft, die sich gegen die differentiell exprimierten Antigene richten. Im Projektbereich 7 werden Mechanismen untersucht, die zum einen Tumorzellen gegenüber genotoxischen Agentien resistenter machen, bzw. den gegenteiligen Effekt hervorrufen, in dem sie die Wirksamkeit der antineoplastischen Therapie verstärken. So konnte insbesondere in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Jörg Schlehofer (ATV / DKFZ) nachgewiesen werden, dass die Infektion von Tumoren durch Adeno-assoziierte Viren zu einer erheblichen Steigerung des Effektes einer Chemooder Strahlentherapie führt. Beobachtungen im Tierexperiment zeigten ferner, dass die Nebenwirkungen der Chemotherapie durch eine begleitende Infektion durch AAV erheblich reduziert werden kann. Molekulare Mechanismen, durch die diese Effekte auftreten werden gegenwertig umfangreich charakterisiert. Kooperationspartner: Prof.Dr. G. Gaudernack, Radium-Hospital, Oslo, Norwegen; Prof.Dr. H.G. Rammensee, Interfakultäres Inst. für Zellbiologie der Univ., Abt. Immunologie, Tübingen; Prof.Dr. M. Büchler, Chir. Univ. Klinik, Heidelberg Drittmittel : Verein zur Förderung der Krebsforschung: 1 BAT IIa;1 BAT IIa/2,1 BAT Vb, Sachmittel DM 360.000; Forschungsförderung der Univ.: 1 BAT Vb ¾, Sachmittel DM 35.000 Publikationen: Haack et al., Cancer Gene Therapy 7 (10): 1357-1364, 2000 Linnebacher et al., Int. J. Cancer 93 (1): 6-11, 2001 Kooperationspartner: Prof.Dr. J. Schlehofer, ATV, DKFZ Drittmittel: 1 BAT IIa, 1 BAT IIa 1/2, 1 BAT Vc Verbrauchsmittel; Forschungsförderung der Univ.: 1 BAT Vb Publikationen: Hillgenberg et al., Eur. J. Cancer 35 (1): 106-110, 1999 Eisold et al., Int. J. Cancer, in press Schwarzbach et al., International Journal of Oncology, in press 178 Patente Titel Land Anmeldungs Nr Patent Nr Method for Early diagnosis of carcinomas DE DE 198 29 473.5-52 DE 19829473C2 Method for Early diagnosis of carcinomas PCT PCT/DE99/02094 WO0001845A2 Method for Early diagnosis of carcinomas US Method for Early diagnosis of carcinomas AU 58487/99 Method for Early diagnosis of carcinomas BR Method for Early diagnosis of carcinomas BY a20010082 Method for Early diagnosis of carcinomas CA 2336153 Method for Early diagnosis of carcinomas CN 99807911.1 Method for Early diagnosis of carcinomas CZ PV 2000-4922 Method for Early diagnosis of carcinomas EP 99 945 931.6 EP1092155 Method for Early diagnosis of carcinomas HU Method for Early diagnosis of carcinomas IL 140338 Method for Early diagnosis of carcinomas IN Method for Early diagnosis of carcinomas JP 2000-558235 Method for Early diagnosis of carcinomas KR 10-2001-700026 Method for Early diagnosis of carcinomas MX 012852 Method for Early diagnosis of carcinomas NO 2000 6681 Method for Early diagnosis of carcinomas PL Method for Early diagnosis of carcinomas RU 2001 102 598 Method for Early diagnosis of carcinomas SK Method for Early diagnosis of carcinomas SG 200007667-9 Method for Early diagnosis of carcinomas TR Method for Early diagnosis of carcinomas ‘HK’ Für mikrosattelliteninstabile (MSI+)-Tumore DE 10032608.0 relevante Gene und ihre Genprodukte Für mikrosattelliteninstabile (MSI+)-Tumore PCT PCT/DE01/02510 relevante Gene und ihre Genprodukte Verfahren zur Früherkennung von HPV-as- DE 19506561 DE19506561 soziierten Karzinomen bzw. von hochgradigen durch HPV verursachten Dysplasien Method of early detection of HPV-associated US US6027891 carcinomas and extreme dysplasias caused by HPV Early recognition process of HPV-asEP 96 904 706.7 EP0811079 sociated carcinomas or High-grade HPV-caused dysplasias Early recognition process of HPV-assoc..... PCT WO9626293A2 Early recognition process of HPV-assoc..... JP 8-525305 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Status granted pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending pending Erfinder von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. von Knebel-Doeberitz, M. pending von Knebel-Doeberitz, M. granted von Knebel-Doeberitz, M. granted von Knebel-Doeberitz, M. granted von Knebel-Doeberitz, M. pending von Knebel-Doeberitz, M. pending von Knebel-Doeberitz, M. Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie D0500 Rekombinante Antikörper Rekombinante Antikörper (D0500) Leiter: Prof. Dr. Melvyn Little Postdocs Dr. Sergey Kipriyanov (- 30.4.00) Dr. Michael Hoffmann (- 31.3.00) Dr. Monika Zewe-Welschof (- 31.3.01) Dr. Peter Röttgen (- 31.12.00) Dr. Fabrice Le Gall (- 30.8.00) Dr. Timo Kürschner (1.2.00-31.3.00) Dr. Jürgen Recktenwald (1.9.01-) Dr. Björn Cochlovius Doktoranden Petra Rohrbach (- 31.3.00) Timo Kürschner (- 31.1.00) Wolfgang Schmitt (-31.10.01) Ingrid Choi (- 31.7.01). Die Arbeitsgruppe Rekombinante Antikörper untersucht die Erstellung hochkomplexer Immunglobulin-Genbanken, wobei mittels spezieller Expressionsvektoren eine klonale Selektion spezifisch bindender Antikörper im Prokaryotensystem vorgenommen werden kann. Ziel ist es, humane monoklonale Antikörper in vitro zu generieren, um Fragmente dieser Antikörper klinisch einzusetzen. Hierzu werden Konjugate von Fv-Fragmenten der Antikörper mit Effektormolekülen oder Toxinen hergestellt. Über die Herstellung multivalenter und multispezifischer Antikörper kann die Avidität erhöht werden und es bieten sich weitere Konjugationsmöglichkeiten. Bei der Kopplung der Antikörperfragmente an Effektormoleküle stehen menschliche RNAsen im Vordergrund. Die Überprüfung der Wirksamkeit im Tiermodell ist bereits erfolgt. In der Therapie von humanen Lymphomen sollen speziell rekombinante bispezifische Antkörper (Diabodies und Tandem-Diabodies) mit Spezifität für CD16 x CD30 und CD3 x CD19 eingesetzt werden. Präklinische Studien konnten bereits erfolgreich abgeschlossen werden. In weiteren präklinischen Studien sollen Kombinationstherapien aus aktiver Vakzinierung, z.B. mittels Antigen-beladener dendritischer Zellen und dem Einsatz von Diabodies /Tandem-Diabodies erprobt werden. Im Mai 2000 wurde die Firma Affimed Therapeutics AG als Spin-off der AG Rekombinante Antikörper von Prof. Melvyn Little gegründet. Ziel ist die Entwicklung von neuen therapeutischen Reagenzien auf der Basis von rekombinanten Antikörpern. Hierfür wurden umfangreiche synthetische und native Antikörperbibliotheken etabliert, um humane Antikörper mit geringen Nebenwirkungen zu isolieren. Experimentelle Therapie mit rekombinanten Antikörpern 1) Herstellung und Screening von Antikörperbibliotheken P. Rohrbach, T. Kürschner, P. Röttgen, M. Little Wir haben Methoden und Vektoren entwickelt, die es ermöglichen, die grundlegenden Prinzipien der humanen Antikörper-Immunantwort in Bakterien zu imitieren. Unsere aus menschlichem Blut hergestellten hochkomplexen Immunglobulin-Genbanken oder „synthetische“ humane Immunglobulin-Genbanken mit Zufallssequenzen an der Antigenbindungsstelle dienen als Repertoir für die Isolation klinisch relevanter Antikörper. Spezifische Antikörper werden mit der Phage-Display-Technologie aus der Bibliothek selektioniert. Wir haben damit die Möglichkeit, humane monoklonale Antikörper in vitro, d.h. ohne die Notwendigkeit zur Immunisierung, herzustellen. 2) Diabodies für die Lyse von Tumorzellen S. Kipriyanov, B. Cochlovius, F. Le Gall, M. Little In Zusammenarbeit mit: Dr. Gerd Moldenhauer, Dr. Gudrun Strauss, Dr. Jochen Schumacher, Dr. Claus-Wilhelm von der Lieth, Dr. E. Ronald Matys, DKFZ. Wir haben mehrere bispezifische Antikörper in einer sogenannten “Diabody”-Form konstruiert, die nur aus den variablen Domänen von vorhandenen Mausantikörpern bestehen. Diese sehr kompakten und rigiden Moleküle sind weniger immunogen als die viel größeren parentalen Antikörper und erlauben eine bessere Penetration des Tumorgewebes. In vitro Assays mit Zellkulturen zeigten, daß die Diabodies eine effiziente Lyse von malignen B-Zellen ermöglichen. 3) Mulitivalente rekombinante Antikörper F. Le Gall, S. Kipriyanov, B. Cochlovius, M. Little In Zusammenarbeit mit: Dr. Gerd Moldenhauer, DKFZ Um eine höhere Avidität und eine längere in vivo Retentionszeit zu erreichen, haben wir einen tetravalenten bispezifischen „Tandem Diabody“ konstruiert. In vivo Versuche mit dieser innovativen Form eines rekombinanten Antikörpers zeigten klarer Vorteile gegenüber den kleineren herkömmlichen Diabodys. Wir konnten z.B. eine komplette Heilung eines menschlichen Burkitt Lymphoms in einem SCID Mausmodell erreichen. 4) Targeting von Thrombosen mit rekombinanten Antikörpern M. Zewe-Welschof, S. Kipriyanov, M. Little In Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Christof Bode, Dr. Karl-Heinz Peter und Justin Gräber (Ludolf Krehl Klinik, Univ. Heidelberg) In einer Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Bode wurden rekombinante Antikörper gegen Fibrin und gegen aktivierte Blutplättchen hergestellt. Der Antikörper gegen Fibrin wurden aus vorhanden Hybridomzellen iso- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 179 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie liert.. Der Fibrin-Antikörper wurde mit Hirudin fusioniert. Eine Faktor Xa Spaltstelle zwischen dem Antikörper und Hirudin ermöglicht, dass das Hirudinmolekül an einer Thrombose abgespalten wird. Nur das freigesetzte Hirudin und nicht das Fusionsprotein kann Thrombin inhibieren. Ein künstlich erzeugter Blutpfropfen konnte mit diesem Fusionsprotein aufgelöst werden. [11] Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Schäfer, H., Moldenhauer, G., Bähre, A., LeGall, F., Knackmuss, S. and Little, M.: Therapy of Burkitt’s lymphoma in SCID mice by human PBL in combination with bispecific CD19xCD3 and CD19xCD16 diabodies. J. Immunol. In press. 5) Herstellung von menschlichen Immuntoxinen [13] Kipriyanov, S.M., Cochlovius, B., Moldenhauer, G., Little, M.: Der bispezifische CD3xCD19 Diabody für die Therapie von B-ZellLymphomen und -Leukämien. In: Kneba, Dreger, Pantel (eds) Antikörpertherapie in der Hämatologie und Onkologie, Springer Verlag, Heidelberg (2001). M. Zewe-Welschof, B. Cochlovius, W. Schmitt, M. Little Um nicht-immunogene Immuntoxinen herzustellen, wurde das Gen für eine humane pankreatische RNase isoliert. Ein Fusionsprotein des Genprodukts mit einem rekombinanten Antikörper gegen ein internalisierendes Antigen konnte maligne B-Zellen bei relativ niedrigen Konzentrationen effizient lysieren. Zusatzfinanzierung: BMBF (1 Wissenschaftler), Mildred Scheel Stiftung (1 Wissenschaftler), EU (1 Wissenschaftler), Sander Stiftung (1 Wissenschaftler). Publikationen (* = externe Koautoren) 180 D0500 Rekombinante Antikörper [1] Schmidt, S., Arndt, M., Braunagel, M., Moldenhauer, G. and Little, M.: Construction and purification of a single-chain Fv antibody binding to the T-cell differentiation antigen CD28. J. Int. Soc. Tumor Targeting 1, 82-89 (2000). [2] *Peter, K., *Graeber, J., Kipriyanov, S., Zewe-Welschof, M., *Runge, M.S., *Kübler, W., Little, M. and *Bode, C.: Construction and functional evaluation of a single chain antibody fusion protein with fibrin-targeting and thrombin inhibition after activation by factor Xa. Circulation 101, 1158-1164 (2000). [12] Kipriyanov, S.M., Cochlovius, B., LeGall, F., Little, M.: Recombinant antibody technology for developing diagnostic and therapeutic products. In: Kieber-Emmons et al (eds) Therapeutic antibody technology, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (2000). [14] Zewe-Welschof, M., Kipriyanov, S.M., Moldenhauer, G., Zhang, H., Little, M. and Cochlovius, B.: A recombinant anti-CD5/ human pancreatic ribonuclease immunotoxin for the therapy of Bcell chronic lymphocytic leukemia: evaluation in a preclinical model. [15] Stassar, M.J.J.G., Schmitt, W.E., Schlenzka, J., Kipriyanov, S.M. and Cochlovius, B.: Combined treatment of Burkitt’s lymphoma with doxorubicin and a CD3xCD19 diabody. [16] Moehler, T.M., Schlenzka, J., Kipriyanov, S.M., Benner, A., Bähre, A., Stassar, M.J.J.G., Schäfer, H.J., Little, M., Ho, A.D., Goldschmidt, H. and Cochlovius B.: Synergistic effect of a recombinant CD3xCD19 diabody and the angiogenesis inhibitor thalidomide in a preclinical model of B-cell lymphoma. [17] Schmitt, W.E., Little, M. and Cochlovius, B.: Membraneanchored recombinant anti-phOx single-chain antibodies for customized cellular tumor vaccines. [18] Stassar, M.J.J.G., Belharazem, D., Schlenzka, J., Schmitt, W.E., Beckmann, I., Bähre, A. and Cochlovius, B.: CD40 Ligandactivated BDCA-2+/BDCA-4+ plasmacytoid dendritic cells display cytotoxic activity against tumor cells involving Granzyme B. [3] Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Stassar, M.J.J.G., Christ, O., Schuhmacher, J., Strauß, G., Moldenhauer, G. und Little, M.: Cure of Burkitt´s lymphoma in SCID mice by T cells, tetravalent CD3 x CD19 tandem diabody and CD28 costimulation. J. Immunology 165, 888-895 (2000) [4] Little, M., Kipriyanov, S.M., F. Le Gall and G. Moldenhauer: Of mice and men: hybridoma and recombinant antibodies. Immunology Today 21, 364-370 (2000). [5] Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Stassar, M.J.J.G., Schuhmacher, J., Benner, A., Moldenhauer, G. and Little, M.: Cure of Burkitt´s Lymphoma in severe combined immunodeficiency mice by T cells, tetravalent CD3 x CD19 tandem diabody, and CD28 costimulation. Cancer Research 60, 4336-4341 (2000) [6] De Ines, C., Cochlovius, B., Schmidt, S. and Little, M.: A cell surface-displayed anti c-myc single chain antibody: new perspectives for the genetic improvement of cellular tumor vaccines. Cancer Gene Therapy, 1257-1262 (2000). [7] Schmitt, W.E., Stassar, M.J.J.G., Schmitt, W., Little, M., Cochlovius, B.: In vitro induction of a bladder cancer-specific Tcell response by mRNA-transfected dendritic cells. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127, 203-206 (2001). [8] Choi, I., de Ines, C., Kürschner, T., Cochlovius, B., Sörensen, V., Olafsen, T., Sandlie, I and Little, M.: Recombinant chimeric OKT3 scFv IgM antibodies mediate immune suppression while reducing T cell activation in vitro. Eur. J. Immunology 31, 94-106 (2001). [9] Cochlovius, B., Stassar, M.J.J.G., Schreurs, M.W., Benner, A., Little, M., and Adema, G.J.: Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity. Immunol Letters 80: 89-96 (2002). [10] Cochlovius, B., Stassar, M.J.J.G., Schreurs, M.W., Benner, A., Little, M., and Adema, G.J.: Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity. Immunol Letters 80: 89-96 (2002). DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr Abteilung Tumorprogression und Tumorabwehr (D0600) Leiterin: Prof. Dr. med. Margot Zöller Metastasierung Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Eberhard Amtmann Dr. Margot Brosius (05/00 - 03/01) Dr. Andreas Claas (05/01 - 12/01) Dr. Christoph Claas (02/01 - ) Dr. Wolfgang Friebolin (11/01 - ) Dr. Rachid Marhaba I. Metastasierung-assoziierte Oberflächenmoleküle auf einem Pankreaskarzinom der Ratte M. Herlevsen, M. Zöller Doktoranden Mehdi Bourouba (09/00 - ) Peter Engel ( - 09/01) Mikael Herlevsen ( - 02/01) Dirk-Steffen Schmidt Nicole Stroh (02/01 - ) Robert Weth ( - 04/00) Gerard Devitt (07/00 - ) Frank Fries (09/01 - ) Thibaud Jegou (10/00 - ) Marike Stassar ( - 10/00) Joachim Wahl (07/01 - ) Daniela Wilms (01/01 - 12/01 Technische Assistenten Waltraud Baader Susanne Hummel Elke Grünewald Mario Vitacolonna Sekretariat Angelika Manz Das Programm der Abteilung zentriert sich um die Frage der Tumorprogression. Wir gehen davon aus, dass Metastasierung vornehmlich durch die Aufnahme physiologischer Programme durch maligne transformierte Zellen in Gang gesetzt wird. Basierend auf dieser Arbeitshypothese konzentrieren wir uns auf die Identifizierung neuer Metastasierung-assoziierter Moleküle, ihre physiologische Funktion, ihre Involvierung in Programmabläufe und insbesondere ihre Konnektivität und wechselseitige Einflussnahme. Funktionelle Studien orientieren sich vornehmlich an Programmen der Lymphozytenreifung und -aktivierung. Wir erwarten, dass die Klärung physiologischer Funktionen Metastasierung-assoziierter Moleküle neue therapeutische Möglichkeiten in der Tumortherapie, aber auch bei Knochenmarktransplantation und Autoimmunerkrankungen eröffnet. Neben diesem Grundlagen-orientierten Programm befassen wir uns mit zwei Therapieoptionen, dem therapeutischen Einsatz Tumor-assoziierter Antigene und der Optimierung einer neuen Platinverbindung. Die immuntherapeutischen Studien, hauptsächlich am Nierenzellkarzinom, konzentrieren sich auf die Identifikation neuer Nierenzellkarzinom-assoziierter Antigene, auf eine Optimierung von Vakzinierungsstrategien und auf geeignete Targetierungsprinzipien, die den Aufbau bzw. die Aufrechterhaltung einer effizienten Immunabwehr unterstützen. Um gegebenenfalls einen raschen Transfer in die Klinik zu erleichtern, werden die Untersuchungen nicht nur in syngenen Tiermodellen sondern auch in der “humanisierten” SCID-Maus durchgeführt. Darüber hinaus haben wir eine neue Thioplatinverbindung entwickelt, die sich durch eine signifikant gesteigerte Effizienz bei gleichzeitiger Reduktion der Nebenwirkungen auszeichnet. In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Prof. Dr. M. Schwab, Abteilung für Zytogenetik, DKFZ Zusatzfinanzierung: Tumorzentrum HD/MA Ausgehend von der Beobachtung, dass ein metastasierendes Pankreaskarzinom der Ratte eine Reihe von Oberflächenmolekülen exprimiert, die zwar auf weiteren metastasierenden Tumoren, nicht aber auf nicht-metastasierenden Tumoren beobachtet werden, haben wir über monoklonale Antikörper neben den bereits bekannten varianten CD44 Molekülen (CD44v), dem Tetraspanin D6.1A (Homolog von CO-029), einem Urokinase-Rezeptor verwandten Molekül (C4.4A) und D5.7A, dem Rattenhomolog von EpCAM, inzwischen ein weiteres, auf metastasierenden Tumoren stark überexprimiertes Molekül, B5.5A, kloniert [1]. B5.5A wurde aus Membranpräparationen über Immunadsorption gereinigt und massenspektrometrisch als α6β4 Integrin identifiziert. Wenngleich eine Korrelation zwischen Überexpression von α6β4 und Metastasierung wiederholt beschrieben wurde, konnte wir eine solche in unserem Rattenmodell nicht feststellen. Allerdings beobachteten wir bei intraperitonealem Tumorwachstum eine massive Metastasierung in die Leber, sofern die Tumoren neben α6β4 das Tetraspanin D6.1A überexprimierten. Die Co-Expression von D6.1A und B5.5A war darüber hinaus von signifikanten Veränderungen des Phänotyps der Zellen begleitet und von einer gesteigerten Fähigkeit zur Migration [1]. II. Funktionelle Charakterisierung Metastasierung-assoziierter Moleküle Variante CD44 Isoformen: Expression und Funktion M. Bourouba, P. Engel, R. Marhaba, M. Zöller In Kooperation mit Prof. P. Herrlich, Institut für Genetik, Universität Karlsruhe, PD Dr. U. Günthert, Basel Institut für Immunologie, Basel, Schweiz Zusatzfinanzierung: DFG, Sander-Stiftung, Tumorzentrum HD/MA In den letzten Jahren haben wir uns mit Untersuchungen zur physiologischen Funktionen von CD44v3, -v6, -v7 und -v10 im Kontext von Lymphozytenreifung, -aktivierung und -migration befasst, da diese Isoformen offensichtlich unterschiedliche Funktionen erfüllen. CD44v3 Im Kontext mit der Tumorprogression konnte eine Korrelation zwischen der Metastasierungstendenz maligner Melanome und der Expression von CD44v3 beobachtet werden [2]. Auf hämatopoetischen Zellen wird CD44v3 auf einem Subset CD4+ T-Zellen, auf Monozyten, B-Zellen und dendritischen Zellen (DC), aber auch auf aktivierten DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 181 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Endothelzellen exprimiert. Wir haben Evidenzen, dass CD44v3 auf Monozyten als kostimulatorisches Molekül agieren kann [3]. Daneben ist CD44v3 hautsächlich in die Leukozytenwanderung, vornehmlich in die Haut, involviert [4]. Dem entspricht eine hohe Expressionsdichte von CD44v3 auf allergisch- und autoimmun-bedingten Leukozyteninfiltraten sowie der Befund, dass bei einer experimentel-induzierten allergischen Reaktion vom verzögerten Typ (DTH) die Extravasation von Leukozyten durch einen CD44v3-spezifischen Antikörper nahezu vollständig unterbunden werden konnte [5]. CD44v3 ist die einzige CD44 Isoform mit einer Heparinseitenkette und es wurde beschrieben, dass CD44v3 als membranständiges Proteoglykan als Fängermolekül für eine Reihe von Zytokinen und Chemokinen agiert. Da sich die Bedeutung von CD44v3 für die Extravasation von Leukozyten sehr wohl über eine lokale, CD44v3-vermittelte Konzentrierung von Chemokinen erklären liesse, untersuchen wir z.Zt. mittels eines CD44v3-Rezeptorglobulins mögliche CD44v3 Liganden zu identifizieren (P.Engel et al., in Vorb.). 182 CD44v10 CD44v10 ist eine weitere CD44 Isoform die vornehmlich auf Makrophagen und DC exprimiert wird. Es gibt Hinweise für eine Involvierung von CD44v10 in den Prozess der B-Zellreifung und -Aktivierung [6,7]. Daneben und hauptsächlich ist CD44v10 für die Anreicherung von Makrophagen in DTH Reaktionen von Bedeutung. Entsprechend können diese pathologischen Reaktionen durch anti-CD44v10 Antikörper effizient unterbunden werden. Dies gilt auch für die Induktion einer Alopecia areata, die als eine dermatologische Autoimmunerkrankung eingestuft wird [8,9]. Eine mögliche Erklärung für diese Befunde bietet die Bindung von CD44v10 an Osteopontin. Osteopontin wurde bereits vor einigen Jahren als Ligand von CD44 beschrieben. Wir konnten nun nachweisen, dass Osteopontin ausschliesslich an CD44v10 bindet Daneben haben wir Hinweise, dass CD44v10 auch einen membranständigen Liganden erkennt, der auf Monozyten und Stromazellen im Knochenmark exprimiert wird. Die Identifizierung dieses membranständigen Liganden ist z. Zt. in Bearbeitung (P.Engel et al., in Vorb.). CD44v6 and CD44v7 Wie bereits erwähnt beruht unser Interesse an varianten CD44 Isoformen auf der Beobachtung, dass durch die Transfektion von CD44v cDNA Metastasierung induziert und Metastasierung durch CD44v6-spezifische Antikörper blockiert werden kann. Die Tatsache, dass CD44v6 und CD44v7 auch transient während der Hämatopoese und während der Lymphozytenaktivierung exprimiert werden, bot uns ein physiologisches Modell um das Wirkrpinzip dieser CD44 Isoformen zu untersuchen. Neben der Etablierung von Antikörpern und Rezeptorglobulinen, hat die Bereitstellung von transgenen Mäusen, die Ratten CD44v4-v7 ausschliesslich auf Thymozyten und reifen TZellen exprimieren (P. Herrlich, Institut für Genetik, Universität Karlsruhe) und von Mäusen mit einer targetierten Deletion von CD44v7 bzw. von CD44v6 und CD44v7 (U. Günthert, Basel Institut für Immunologie) unsere Arbeiten wesentlich erleichtert. Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr CD44v6 wird auf frühen hämatopoetischen Progenitorzellen, wobei wir noch nicht sicher wissen, ob dies die eigentliche Stammzelle einschliesst, und auf frühen Thymozyten exprimiert [10]. Untersuchungen zum Homing von Stammzellen haben gezeigt, dass CD44v6, im Gegensatz zur Standardform von CD44, an diesem Prozess nicht beteiligt ist [11]. Hingegen ist CD44v6 an der Thymozytenreifung beteiligt. Dies konnte durch Antikörperblockade und den Einsatz CD44v4-v7 transgener bzw. CD44v6/v7 defizienter Mäuse gezeigt werden. CD44v6 unterstützt und beschleunigt den Prozess der Thymozytenreifung und damit den Prozess der Induktion von Toleranz. Die funktionelle Relevanz dieser Beobachtung liess sich insbesondere bei einer allogenen Knochenmarkrekonstitution im nichtmyeloablativ konditionierten Wirt belegen [11]. Um die supportive Funktion von CD44v6 bei der T-Zellreifung weiter abzuklären untersuchen wir z. Zt. welche Signaltransduzierenden Moleküle über CD44v6 aktiviert werden und worauf die unterschiedliche Aktivierung Signal-transduzierender Moleküle über CD44s und CD44v6 beruht, obgleich sich die intrazytoplasmatischen Anteile dieser beiden CD44 Isoformen nicht unterscheiden (R.Marhaba et al., in Vorb.). CD44v7 wird auf Subpopulationen von Knochemarkzellen, die wir noch nicht genau definieren konnten, und auf Stromazellen des Knochenmark exprimiert [10]. Unsere Untersuchungen ergaben jedoch keinen Hinweis für eine aktive Beteiligung von CD44v7 an der Reifung hämatopoetischer Zellen. Hingegen ist CD44v7 massgeblich an der Adhäsion von Progenitorzellen am Knochenmarkstroma und am Homing von Stammzellen ins Knochenmark beteiligt. Dies konnte mittels Antikörperblockade und Mäusen mit einer targetierten Deletion von CD44v7 nachgewiesen werden [10]. Hinzukommt, dass sich CD44v7-spezifische Antikörper aufgrund dieser Funktion von CD44v7 in ganz besonderer Weise zur Mobilisation von Stammzellen eignen und bei einer Mobilisation über anti-CD44v7 keiner der Nachteile beobachtet wird, die beim Transfer von G-CSF mobilisierten Stammzellen beschrieben wurden, z.B. ist die Wiedererlangung von Immunkompetenz nach dem Transfer über anti-CD44v7 mobilisierter Stammzellen deutlich kürzer als nach dem Transfer G-CSF mobilisierter Stammzellen [12]. Auf reifen Lymphozyten stellen CD44v6 und CD44v7 Aktivierungsmarker einer Subpopulation von CD8+ (CD44v6) und CD4+ (CD44v7) T-Zellen dar [13]. Wenngleich die Expression von CD44v6 und CD44v7 auf aktivierten Lymphozyten schwach erscheint, konnte die funktionelle Bedeutung dieser Expression überzeugend demonstriert werden. So konnten über CD44v6-spezifische Antikörper vom T-Helferzell-Typ-1 (TH1)-mediierte DTH Reaktionen mitigiert werden [13] und der Abstossungsprozess bei einer allogenen Hauttransplantation wurde durch anti-CD44v6 zusammen mit einer niedrigen Dosis an Cyclosporin unterbunden. Wir haben keinen Hinweis, dass über dieses Protokoll Toleranz induziert wurde, da nach Beendigung der Medikation das Transplantat abgestossen wurde. Unsere Daten weisen vielmehr darauf hin, dass über anti-CD44v6 die Phosphorylierung von DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie ZAP70 blockiert wurde und damit die Aktivierung Alloantigen-spezifischer T-Zellen zwar nicht unterbunden aber signifikant reduziert werden konnte. Auch anti-CD44v7 interferiert mit dem Aufbau TH1-mediierter DTH Reaktionen. Im Unterschied zu CD44v6 ist CD44v7 allerdings auch in die Induktion von TH2-mediierten DTH Reaktionen involviert [13]. Am nachhaltigsten konnte die funktionelle Bedeutung von CD44v7 bei der Lymphozytenaktivierung jedoch im Modell einer TNBS-induzierten Colitis belegt werden. Die Induktion der in über 90% der Tiere tödlich verlaufenden Erkrankung konnte durch anti-CD44v7 blockiert werden und eine florierende Colitis konnte durch anti-CD44v7 geheilt weren. Untersuchungen mit CD44v7 ko Tieren belegten, dass diese Tiere sich gegenüber der Induktion einer Colitis resistent verhalten und dass Tiere mit einer targetierten Deletion von IL10, die spontan eine Colitis entwickeln, nicht erkrankten, sofern neben IL-10 auch CD44v7 deletiert war [12]. Aufgrund dieser Befunde bietet sich das Modell der induzierten Colitis an, um das Funktionsprinzip von CD44v7 aufzuklären. Unsere bisherigen Untersuchungen weisen darauf hin, dass CD44v7 auf Monozyten und auf T-Zellen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Quervernetzung von CD44v7 auf Monozyten initiiert die Sekretion von Zytokinen, hauptsächlich von IL-10. Wenn über anti-CD44v7 eine Interaktion zwischen CD44v7 (auf T-Zellen) und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) unterbunden wird, geht dies mit einer Blockade der Aktivierung regulatorischer TZellen einher. Diese Beobachtungen konnten in CD44v7 ko Mäusen bestätigt werden, wobei die Untersuchungen an den ko Tieren noch einen weiteren Hinweis auf das Funktionsprinzip von CD44v7 lieferten. In Entzündungsherden von CD44v7 ko Tieren fand sich eine signifiakant höhere Anzahl apoptotischer Zellen als in Entzündungsherden CD44v7 kompetenter Tiere [14]. Wir interpretieren diesen Befund in dem Sinne, dass CD44v7 entweder die Aktivierung apoptotischer Signale inhibiert oder anti-apoptotische Moleküle aktiviert. Inzwischen konnten wir auch die klinische Relevanz dieses Befundes durch eine Studie an peripheren Blutlymphozyten (PBL) von Patienten mit Autoimmunerkrankungen belegen. PBL von Patienten mit Autoimmunerkrankungen, speziell Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, zeigen eine signifikante Erhöhung der CD44v7 Expression und reagieren bei in vitro Aktivierung entsprechend den im Mausmodell geschilderten Befunden [3]. CD44-mediierte Signaltransduktion Aufbauend auf den geschilderten Befunden haben wir mit der Analyse CD44-mediierter Signaltransduktion begonnen, wobei wir bei unseren einleitenden Studien mit Antikörpern gearbeitet haben, die alle CD44 Isoformen erkennen. Sobald wir potentielle Liganden für CD44v6 und CD44v7 identifiziert haben, werden sich Untersuchungen anschliessen, die es uns erlauben Isoformen-spezifische Funktionen aufzudecken. Die Aktivierung von T-Zellen erfordert zwei Signale, wobei das erste Signal über die Interaktion des T-Zellrezeptor (TCR) mit dem MHC-Peptidkomplex initiiert wird. Zur Bereitstellung des zweiten Signals bedarf es der Interaktion Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr ko-stimulatorischer Moleküle auf APC (z.B. CD40) mit ihren Liganden auf T-Zellen (z.B. CD40L). In jüngster Zekt wurde die durch experimentelle Befunde gestützte Hypothese formuliert, dass über die Interaktion der kostimulatorischen Moleküle CD80 / CD86 mit ihrem Liganden, CD28, keine selektive Signaltransduktionskette aktiviert wird, vielmehr durch Apposition von Phosphotyrosinkinasen die Aktivierungskaskade, die über die Bindung des TCR initiiert wird, nachhaltig unterstütz wird und damit der Schwellenwert an Signalen, der zur Aktivierung benötigt wird, deutlich sinkt. Wir konnten diesen Befund für CD44 bestätigen und gleichzeitig nachweisen, dass CD44 auf TZellen als Ligand eines kostimulatorischen Moleküls agiert. CD44 ist konstitutiv mit den Phosphotyrosinkinasen lck und fyn assoziiert. Während der T-Zellaktivierung wird es in den Bereich der immunologischen Synapse rekrutiert, so dass bereits bei einer Besetzung nur weniger TCR Moleküle ZAP70 rekrutiert wird und in der Folge die bekannte Signaltransduktionskaskade in Gang gesetzt wird, die Proliferation und Sekretion von Zytokinen einleitet [15]. Wir konnten auch zeigen, dass dieses Wirkprinzip nicht nur bei der Aktivierung von T-Zellen zum Tragen kommt, vielmehr über einen entsprechenden Mechanismus Aktivierung-induzierter Zelltod eingeleitet werden kann [15]. Wie bereits erwähnt, erfordert dieses Funktionsprinzip von CD44, dass eine Umverteilung von CD44 in der Zellmembran stattfindet, die zu einer selektiven Anreicherung im Bereich von Glykolipid-reichen Mikrodomänen, den sog. “rafts” führt. Wir konnten dies experimentell bestätigen und zeigen, dass die Anreicherung von CD44 in “rafts” von einer Polymerisierung des Aktinzytoskeletts begleitet wird, wobei Rac als Linkerprotein benötigt wird [16]. Wie bereits erwähnt, untersuchen wir nun, welche dieser Prozesse für alle CD44 Isoformen Gültigkeit haben bzw. CD44 Isoformen-spezifisch sind. Wir haben erste Hinweise, dass sich das Phosphorylisierungsmuster nach Quervernetzung von CD44v6 von dem nach Quervernetzung von CD44s unterscheidet. Wir haben auch Hinweise, dass dies möglicherweise über eine Assoziation mit unterschiedlichen Linkerproteinen erklärt werden kann (R.Marhaba et al., in Vorb.). Zwei Aspekte haben in jüngster Zeit wesentlich zum Verständnis der Lymphozytenaktivierung beigetragen, die Klärung des Funktionsprinzips von kostimulatorischen Molekülen und die Definition und Charakterisierung von Membranmikrodomänen. Mit den aufgezeigten Experiment konnten wir zum einen die akzessorische Funktion von CD44 bei der T-Zellaktivierung nachweisen, zum anderen ist es gelungen zumindest einen Pathway aufzuzeigen, der einen Konnex zwischen der Reorganisation des Zytoskeletts und der Rekrutierung akzessorischer Moleküle im Bereich der immunologischen Synapse herstellt. Letztlich haben wir erste Hinweise wie die Selektivität CD44 Isoformen-spezifischer Signaltransduktion zustande kommen kann. Inwieweit aus diesen Untersuchungen Hinweise für eine therapeutische Interferenz mit Autoimmunerkrankungen bzw. mit der Metastasierung von Tumoren durch die Blockade selektiver CD44 Isoformen oder der durch diese Isoformen aktivierten Signal-transduzierenden Moleküle abgeleitet werden können, bleibt in weiterführenden Experimenten zu beantworten. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 183 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie α6β β4 Integrin),C4.4A, D5.7A (EpCAM), B5.5A (α D6.1A (CO 029) A. Claas, F. Fries, T. Jegou, J. Wahl, M. Zöller In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, Prof. M. Schwab, Abteilung für Zytogenetik, DKFZ, Prof. Dr. M. von Knebel-Döberitz, Sektion Experimentelle Chriurgie, Universität Heidelberg, Prof. Dr. W. Tilgen. Dermatologische Klinik der Universität des Saarland, Prof. U. Weidle, Roche Diagnostics, Penzberg, Prof. Dr. K. Dano und Prof. Dr. M. Ploug, Finsen Laboratorien, Kopenhagen, Dänemark Zusatzfinanzierung: DFG, Krebshilfe, Roche Diagnostics, TZ H/M Unsere Untersuchungen zum Funktionsprinzip dieser vier Metastasierung-assoziierten Moleküle wurden erst im letzten Jahr begonnen. Das bedeutet, wir sind z. Zt. vornehmlich mit der Etablierung der benötigten Reagenzien befasst. 184 Das α6β4 Integrin, eine Komponente der Hemidesmosomen, ist als Laminin-Rezeptor bekannt. Man weiss auch, dass Spleißvarianten der intrazellulären Domänen zur Phosphorylierung von Signal-transduzierenden Molekülen beitragen, die Rezeptorlokalisation beeinflussen und Zellproliferation und Migration regulieren. In unserem Modell erscheint es von besonderer Bedeutung, dass α6β4 mit Tetraspaninen assoziieren kann [1]. Wir haben Hinweise, dass diese Komplexe internalisiert werden können und wesentlich zur Migration der metastasierenden Tumorzellen beitragen (M.Herlevsen, C.Claas et al., in Vorb.). Inziwschen haben wir das humane Homolog des “neuen” Metastasierung-assoziierten C4.4A Moleküls kloniert [17]. Das Expressionsprofil im Menschen entspricht dem für die Ratte beschriebenen. Von den bisher getesteten humane Tumorlinien haben etwa 50% C4.4A exprimiert. Wichtig erscheint uns auch die Beobachtung, dass Tumorprogression von einer verstärkten Expression von C4.4A begleitet wird [18]. Da C4.4A auf gesundem Gewebe kaum exprimiert wird, könnte dieses Molekül sowohl diagnostisch als auch therapeutisch von Interesse sein. Um die Funktionen des C4.4A Moleküls zu erfassen werden z. Zt. entsprechende Rezeptorglobuline erstellt, die zur Identifikation des/der Liganden benötigt werden. Da C4.4A auch während der Implantation des Morula hoch exprimiert wird, erwarten wir von einer targetierten Deletion des Moleküls weiter Information zum Funktionsprinzip. Die entsprechenden Vorarbeiten sind im Gange. Dies gilt auch für Untersuchungen zur Regulation der Expression von C4.4A. Wenngleich EpCAM bereits in den 80iger Jahren beschrieben wurde, ist die Funktion des Moleküls bisher weitgehend ungeklärt. Unser Interesse basiert vor allem auf der Beobachtung, dass EpCAM / D5.7A mit weiteren Metastasierung-assoziierten Molekülen assoziiert (siehe folgenden Abschnitt). Um diese Assoziation genauer zu definieren, werden z. Zt. Deletionsmutanten der einzelnen Domänen dieses Moleküls erstellt. Neben varianten CD44 Isoformen ist für den Metastasierungsprozess mit hoher Wahrscheinlichkeit vor allem das Tetraspanin D6.1A von essentieller Bedeutung. Tetraspanine sind wichtig für Adhäsion, Migration, Proliferation, Aktivierung, Differenzierung und Metastasierung. Man geht Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr davon aus, dass diese vielfältigen Funktionen auf der Fähigkeit der Tetraspanine beruht, Molekül-Cluster zu bilden, die neben weiteren Tetraspaninen vor allem Integrine einschließen. Für D6.1A konnten wir bisher neben einer Assoziation mit dem Tetraspanin CD9, eine Assoziation mit α6β1, α3, und möglicherweise mit α6β4 Integrinen, sowie eine schwache Assoziation mit D5.7A und CD44 beobachten. Die Identifikation weiterer assoziierender Moleküle erfolgt in Kooperation mit der zentralen Einheit für Proteinanalytik (J.Wahl et al., in Vorb.). Von besonderem Interesse für die Funktion von Tetraspaninkomplexen ist ihre Lokalisation in bestimmten Membransubdomänen, den sog. “Lubrol rafts”. Die Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase ist eine Komponente von Tetraspaninkomplexen. Wenngleich Tetraspaninkomplexe auch ausserhalb von “Lubrol rafts” gefunden werden, wird die enzymatische Aktivität Tetraspaninkomplex-assoziierter Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase essentiell vom Membranmikroenvironment bestimmt [19]. Da die Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase die Produktion von Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat katalysiert, das seinerseits ein Substrat einer Reihe von Signal-transduzierenden Molekülen darstellt, erfordert dieser Befund unsere weitere Beachtung. III. Konnektivität Metastasierung-assoziierter Moleküle C. Claas, D-S. Schmidt, M. Zöller Zusatzfinanzierung: DFG Die Überexpression der 5 beschriebenen Metastasierungassoziierten Moleküle wurde auf einer Reihe metastasierender Tumoren unterschiedlichen Ursprungs beobachtet. Es gibt zumindest zwei Möglichkeiten diese konzertierte Expression zu erklären: i. Die Expression dieser Moleküle wird über ein Gen reguliert; ii. Die Koexpression dieser Moleküle ist erforderlich, damit eine Tumorzelle alle Schritte der Metastasierungskaskade durchlaufen kann. Unabhängig davon, ob die konzertierte Expression dieser Moleküle auf die Aktivierung eines „Master-Gens“ zurückzuführen ist oder auf einem Selektionsprozess beruht, besteht die Möglichkgit einer wechselseitigen Einflussnahme der funktionellen Aktivitäten dieser 5 Moleküle in dem Sinne, daß die Funktion der einzelnen Moleküle durch die Assoziation mit den weiteren Molekülen verändert wird. Wir haben eine Reihe von Evidenzen, die diese Arbeitshypothese unterstützen. Das Tetraspanin D6.1A assoziiert mit dem Tetraspanin CD9, den Integrinen α6β1 und α3β1, mit D5.7A (EpCAM), CD44 und weiteren noch zu identifizierenden Membranmolekülen; C4.4A kann mit Integrinen assoziieren; variante CD44 Isoformen assoziieren mit den Tetraspaninen CD9 und D6.1A sowie mit D5.7A (D-S. Schmidt et al., in Vorb.); Nur in Assoziation mit Tetraspaninen nimmt α6β4 Einfluss auf die Zellmigration; Eine Assoziation dieser Moleküle wird vornehmlich in „Lubrol rafts“ beobachtet (C. Claas et al., in Vorb.), die als Plattform für die Signaltransduktion angesehen werden; Im Hinblick auf die Metastasierung unterscheiden sich die funktionellen Aktivitäten von C4.4A, D6.1A und insbesondere von α6β4 sofern diese Moleküle im Kontext mit bzw. unabhängig von DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr weiteren Metastasierung-assoziierten Molekülen exprimiert werden. II. Immuntherapie Nierenzellkarzinom-assoziierte Antigene Wir haben 5 Membranmoleküle definiert, die in den Prozess der lymphatischen Metastasierung involviert sind: Ein Zell-Zell-Adhäsionsmolekül (D5.7A), zwei Zell-MatrixAdhäsionsmoleküle (CD44v und α6β4), C4.4A, das möglicherweise in die Gruppe der Matrix-degradierenden Enzymsysteme einzureihen ist, und ein Tetraspanin. Von allen diesen Molekülfamilien ist bekannt, dass sie am Prozess der Metastasierung beteiligt sein können. Wir gehen davon aus, dass es nicht die einzelnen Moleküle sind, die dabei einen wesentlichen Beitrag leisten, sondern vielmehr ihre konzertierte Aktion und wechselseitige Einflussnahme. Wir prüfen daher, inwieweit diese Moleküle miteinander interagieren und inwieweit durch eine solche Interaktion das Funktionsprinzip der einzelnen Moleküle moduliert wird. Wir erwarten, dass die Aufschlüsselung konzertierter Aktivitäten dieser Moleküle massgeblich zum Verständnis der Mechanismen der Tumorprogression beitragen wird. G. Dewitt, M. Zöller Tumor Diagnostik und Tumortherapie I. Eine neue Thioplatinverbindung E. Amtmann, W. Fribolin In Kooperation mit G. Schilling, Chemisches Institut, Universität Heidelberg Zusatzfinanzierung: Antisoma Wenngleich seit Jahrzehnten in der Klinik etabliert, konnte das molekularen Wirkprinzip von Zytostatika häufig noch nicht voll aufgeklärt werden. Unsere Erfindung einer neuen Platinverbindung basiert auf unseren Arbeiten zur Funktion von Phospholipase C sowie einer neutralen Sphinomyelinase, deren Blockade sich in der Therapie des septischen Schocks als hoch effizient erwies [20]. Bei einer Klasse der eingesetzten Inhibitoren, Dithiokarbonsäuren, beobachteten wir eine explizite Abhängigkeit funktioneller Aktivität von einem sauren Milieu. Basierend auf diesen Befunden haben wir eine antitumoral wirksame Platinverbindung mit Schwefelkomplexbindung hergestellt (Thioplatin) [21]. Diese Verbindungen werden pH abhängig aktiviert. Da solide Tumoren ein leicht saures Milieu aufweisen, ist Thioplatin im Tumor 5-10 mal wirksamer als im Normalgewebe. Dies hat zur Folge, dass Thioplatin nur sehr geringe Nebenwirkungen aufweist, insbesondere wird die bei Cisplatin gefürchtete Knochenmarkdepression nicht beobachtet. Das DKFZ hat inzwischen mit Antisoma, London, einen Kooperationsvertrag zur klinischen Weiterentwicklung von Thioplatinverbindungen abgeschlossen. Mit den klinischen Studien soll im Sommer 2002 begonnen werden. Unser Ziel ist die molekulare Definition der pH-Abhängigkeit von Thioplatinverbindungen. Darüber hinaus werden wir die selektiven DNA-Bindungsstellen von Thioplatin charakterisieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden eine gezielte Optimierung von Thioplatinverbindungen erlauben. In Kooperation mit Prof. Dr. Richard Hautmann, Urologische Klinik, Universität Ulm Zusatzfinanzierung: Krebshilfe Nierenzellkarzinome (RCC) verhalten sich in aller Regel resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie. Da sie in frühen Stadien weitgehend symptomlos sind, werden sie häufig erst in fortgeschrittenem Zustand detektiert. Dem entspricht eine 5 Jahresüberlebensrate von unter 5%. Immuntherapeutische Ansätze würden eine Alternative darstellen, zumal man davon ausgehen kann, dass es sich beim RCC um einen immunogenen Tumor handelt, bei dem auch - wenngleich selten - Spontanremissionen beobachtet werden. Bisher sind jedoch nur sehr wenige RCC-assoziierte Antigene bekannt. Wir haben daher in den letzten Jahren versucht, über suppressive subtraktive Hybridisierung (SSH) und serologisch nach rekombinanter Expressionsklonierung (SEREX) weitere immunogene RCC-assoziierte Antigene zu identifizieren. Für die SSH wurde normales Nierengewebe und Nierenzellkarzinomgewebe vom gleichen Patienten bzw. einer Gruppe von Patienten eingesetzt. In einem ersten Screening konnte die differentielle Expression von 9 Genen im Northernblot verifiziert werden, 7 Gene, u.a. MAGE-9 waren bekannt. Mit einer weiteren Probe von Tumor- / Normalgewebe konnte die Überexpression von weiteren 17 Genen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die Untersuchung von 35 Paaren an Normal- und Tumorgewebe, um die Frequenz einer de novo Expression bzw einer signifikanten Erhöhung der Expression dieser RCC-assoziierten Gene nachzuweisen, ergab, dass 14 Gene in einem nennenswerten Prozentsatz bzw. in bis zu über 90% von RCC überexprimiert werden. Das Screening eines Filterarrays mit bekannten Tumor-assoziierten Genen bestätigte die Überexpression von 3 Genen und ergab darüberhinaus eine Überexpression von 3 weiteren Genen. Die Expression einiger Gene korreliert mit dem histologischen Typ. Eine Korrelation zum Differenzierungsgrad konnte nicht beobachtet werden [22,23]. Insgesamt lässt sich jedoch feststellen, dass mit Ausnahme von MAGE-9 und möglicherweise von Semaphorin G die Expression dieser Gene eher in Bezug zur Tumorprogression als zur Immunogenität des Tumors steht. Wir haben daher begonnen die Seren von Patienten mit RCC mittels der SEREX Methode auf die Präsenz hoch-avider Antikörper mit Spezifität für RCC-assoziierte Antigene zu analysieren. Das Antikörper-Screening einer Phagenexpressionsbibliothek ergab bisher 5 Klone, von denen einer Homologien zu EBV aufweist. Zwei weitere Klone zeigen Homologien zum DNA J-Domänenprotein, das zu den molekularen Chaperonen zählt, bzw. zu einem Aktin-assoziierten Filamentprotein. Bei einem dritten Klon haben wir Hinweise für eine Translokation zwischen Chromosom 3 und 12, die bei RCC bereits wiederholt beschrieben wurde. Wir erwarten, dass insbesondere dieser Klon für ein immunogenes RCC-assoziiertes Antigen kodiert. Ein zweites SEREX DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 185 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Screening einer Expressionsbibliothek eines weiteren RCC ist in Bearbeitung [24, G.Dewitt et al., in Vorb.]. Parallel mit diesen Untersuchungen laufen die Arbeiten zur Klonierung der beschriebenen neu definierten Gene sowie erste Untersuchungen zum Nachweis der Immunogenität dieser RCC-assoziierten Moleküle (siehe nachfolgendes Kapitel). Optimierung von Vakzinierungsstrategien in der Therapie solider Tumoren (Nierenzellkarzinom) N. Stroh, D. Wilms, M. Zöller In Kooperation mit Dr. M. Görner und Dr. T. Luft, Medizinische Klinik V, Universität Heidelberg, Prof. R. Haas, Klinik für Hämatologie und Onkologie, Universität Düsseldorf, Prof. S. Matzku, Merck AG, Darmstadt, Dr. S. Stevanovic, Institut für Zellbiologie, Universität Tübingen, Dr. J. Hammer, La Roche Inc, Nutley, NJ, USA Zusatzfinanzierung: Krebshilfe, Israel-Kooperation, TZ H/M Modelle zur aktiven Vakzinierung 186 Die Induktion einer Tumor-spezifischen Immunantwort erfordert die Präsentation von Peptiden eines Tumorantigens im Kontext mit MHC Klasse I oder II Molekülen und ein zweites Signal, das in der Regel über kostimulatorische Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen initiiert wird. Die Verfügbarkeit weiterer Mediatoren, z.B. von Zytokinen erleichert und verstärkt den Prozess der T-Zellaktivierung und deren Effektorfunktionen. Die Summe dieser Voraussetzungen wird in aller Regel von Tumoren und vom Tumor-tragenden Wirt nicht erfüllt. Deshalb sind supportive Massnahmen, um eine effiziente Anti-Tumor-Immunantwort zu induzieren, unumgänglich. Dies erfolgt entweder über die Modulation der Tumorzelle, um sie mit Eigenschaften einer Antigen-präsentierenden Zelle auszustatten, den passiven Transfer aktivierter Effektorzellen oder mittels aktiver Vakzinierung. Zur Vakzinierung können RNS, DNS, Protein oder Peptide eingesetzt werden, die in “nativer” Form oder “verpackt” appliziert werden. Als Trägersysteme eigenen sich insbesondere dendritische Zellen (DC) oder - beim Einsatz von DNS - transformierte und attenuierte Bakterien, z.B. Salmonellen. Da die klinischen Erfolge bisher weit hinter den Erwartungen zurückbleiben, ist es keine Frage, dass weitere experimentelle Studien notwendig sind, um Vakzinierungsprotokolle in der Tumortherapie zu verbessern [25,26]. Wir haben uns auf Modelle der aktiven Vakzinierung mittels DC und attenuierter Salmonellen (SL) konzentriert und dabei insbesondere die Vor- und Nachteile einer Helfer-T-Zell (TH)-orientierten Vakzinierung untersucht. Als Adjuvantien wurden Antikörper-Zytokin-Fusionsproteine eingesetzt. In jüngster Zeit widmen wir uns insbesondere der Verbesserung von Verfahren der allogenen Knochenmarktransplantation nach nicht-myeloablativer Konditionierung, da wir davon ausgehen, dass die allogene Rekonstitution eine optimale Plattform für aktive Vakzinierung bei Tumorpatienten darstellt. In ersten Vakzinierungsstudien haben wir uns mit der Vakzinierung mit transformierten Tumorzellen, die entweder Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr ein Surrogat-Tumorantigen [27] oder MHC Klasse II Moleküle und B7 als kostimulatorisches Molekül [28] exprimierten befaßt. Bei den letztgenannten Untersuchungen wurde die murine Nierenzellkarzinomlinie RENCA eingesetzt. Wenngleich wir in eingeschränkter Form eine Protektion durch die Vakzinierung erzielen konnten, war die Effizienz dieser Vakzinierungsstrategie durch Tumor-mediierte Suppression deutlich eingeschränkt. Wir konnten zeigen, dass RENCA Zellen nicht direkt suppressiv sind, aber die Aktivierung einer Population von NK1.1+/CD3+ Lymphozyten in Gang setzen, die die Induktion einer Immunantwort, vornehmlich über die Depletion von TH Zellen, unterdrückt [28]. Die Aktivierung dieser immunsuppressiven T-Zellen konnte verhindert werden, wenn das Immunsystem zuerst mit RENCA Zellen konfrontiert wurde, die MHC Klasse II und B7 exprimierten. Eine Vakzinierung mit diesen transformierten Tumorzellen nach Applikation nativer RENCA Zellen, der Situation wie sie in der Kliik angetroffen wird, war ineffektiv. Es sei an dieser Stelle, auch für die im folgenden skizzierten Studien, vermerkt, dass wir neben diesem Prozess einer aktiven Immunsuppression häufig die Aktivierung von Tumoreskapemechanismen, wie z.B. den Verlust von Tumorantigenen oder von MHC Molekülen, beobachteten. Tumoreskape stellt eines der Probleme dar, von denen bei Tumor-immuntherapeutischen Ansätzen häufig berichtet wird. Hingegen haben wir, auch wenn Selbstantigene wie das Melanom-assoziierte Antigen gp100 eingesetzt wurden, keine schweren Formen von Autoimmunität beobachtet. Wie bereits erwähnt, befaßte sich die Mehrzahl unsere Vakzinierungsstudien mit dem Transfer Protein- oder Peptid-beladener DC und der oralen Vakzinierung mit transformierten SL. Die therapeutische Effizienz einer Vakzinierung mit DC umfaßte Untersuchungen bei denen die DC mit Protein oder Peptiden beladen wurden, wobei letztere entweder an MHC Klasse I oder II Moleküle binden. Da Algorithmen, die Aussagen über die Bindung von Peptiden in MHC Klasse II Molekülen erlauben, erst in jüngster Zeit zu Verfügung stehen, sind bisher kaum experimentelle Daten verfügbar. Der Einschluß dieses Aspektes war jedoch wichtig, da in aller Regel die Aktivierung von TH-Zellen erforderlich ist, um alle Elemente des Immunsystems zu aktivieren. Da die Effizienz der Induktion einer CTL Antwort bei einer Vakzinierung mit dem Melanom-assoziierten Antigen gp100 gut charakterisiert ist, bot sich gp100 für unsere weiterführenden Studien an. Mit dem gp100 Protein beladene DC induzieren in vitro und in vivo vor allem eine TH-1 Antwort [29]. In der Folge wurden gp100 Peptide untersucht, die mit Wahrscheinlichkeit an MHC II Moleküle binden. Aus einem Panel von 7 Peptiden wurde in der Regel 1-3 Peptide selektioniert, die zur Aktivierung von TH-Zellen geeignet erschienen. Dies galt sowohl für PBL von gesunden Spendern als auch für PBL von Melanompatienten, so dass wir davon ausgehen können, dass der Tumor keine Toleranz induziert hat. Da zudem die Reaktivität von PBL individueller Probanden mit einem bestimmten Peptid sich als konstanter Faktor erwies und die Selektivität der Bindung definierter Peptide durch in vivo Studien DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Peritonealzellen Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr phagozytierende Zellen in der Darmwand mesenteriale Lymphknotenzellen Abb. 1: Expression eines grünen Fluoreszenzproteins auf phagozytierenden Zellen nach oraler Vakzinierung mit transformierten Salmonellen in der SCID Maus bestätigt werden konnte, bietet sich ein in vitro Screening an, das relativ rasch durchgeführt werden kann, um die Peptide für eine Vakzinierung zu selektionieren, die optimal für die Induktion einer TH-Antwort des individuellen Patienten geeignet erscheinen [30]. Die mit gp100 erhobenen Befunde konnten mit RAGE-1, einem Nierenzellkarzinom-spezifischen Antigen bestätigt werden, wenngleich TH-Zellen mit einer niedrigeren Frequenz auf RAGE-1 im Vergleich zu gp100 Peptiden reagieren [31]. In den bisher beschriebenen in vivo Studien wurden humane PBL und humane Tumoren im SCIDMaus-Modell getestet, das sich in besonderer Weise für Screeninguntersuchungen eignet. Aufgrund nicht zu vermeidender graft vs host (GvH) Reaktionen bei Langzeitvakzinierungsstudien in der humanisierten SCID Maus, haben wir in weiterführenden Experimenten zur Optimierung von Vakzinierungsprotokollen auf syngene Maustumormodelle zurückgegriffen. Die Form des Antigens, das als DNA, RNA oder Protein / Peptid angeboten werden kann, stellt einen wesentlichen Faktor der Vakzinierung dar. Alle 3 Formen haben Vorund Nachteile. So bietet sich eine DNA Vazinierung aufgrund der leichten Verfügbarkeit an, ist aber mit dem Nachteil einer häufig ineffizienten Transkriptionsrate versehen. Das Problem kann durch die Verpackung in geeignete „Trägersysteme vermieden werden, wobei sich u.a. attenuierte Bakterien anbieten. Es ist bekannt, dass Salmonellen die Darmwand durchwandern und im Peritoneum von Makrophagen phagozytiert werden. Attenuierte Salmonellen werden auf diese Weise in kürzester Zeit komplett eliminiert. Wenn diese Bakterien mit einem eukaryotischen Expressionsvektor transformiert wurden, der z.B. die DNA eines Tumorantigens enthält, wird die DNA ausschließlich in eukaryotischen Wirtzellen transkribiert [Darji et al, Cell 91 (1997) 765] (Abb. 1). Wir haben in diesem Kontext 3 Fragen gestellt: i. Stellt die Verpackung von DNA in attenuierten Salmonellen einen Vorteil bei der Vakzinierung im Vergleich zu nackter DNA dar? ii. Ist eine DNA oder eine Protein Vakzinierung effizienter? iii. Ist auch bei einer DNA Vakzinierung eine Präsentation durch MHC II Moleküle effizienter und wie kann bei einer DNA Vakzinierung das translatierte Protein in den MHC II Präsentationsweg eingeschleust werden? Der Vergleich einer Vakzinierung mit nackter DNA und DNA, die in Form transformierter Salmonellen angeboten wurde, ergab, dass beide Vakzinierungsschemata geeignet erschienen, um das Tumorwachstum zu verzögern. Allerdings zeichnete sich die Vakzinierung mit transformierten Salmonellen durch eine signifikant gesteigerte Effizienz aus, die durch eine überwiegende Aktivierung von CTL charakterisiert war. Die Vakzinierung mit nackter DNA war hauptsächlich von einer unspezifischen Aktivierung, vermutlich aufgrund von DNA Sequenzen mit bekanntem adjuvantem Effekt, begleitet. Die Effizienz einer Vakzinierung mit Protein-beladenen DC übertraf jedoch die Effizienz der Vakzinierung mit transformierten Salmonellen [32]. Ex vivo Untersuchungen wiesen darauf hin, dass der Vorteil der Proteinvakzinierung auf die präferentielle Aktivierung von TH-Zellen zurückzuführen war. Deshalb wurden in einer weiteren Studie Salmonellen mit einem eukaryotischen Expressionsvektor transformiert, in den die DNA des Tumorantigens mit der DNA eines Fragmentes der invarianten Kette als Fusionsprodukt integriert war. Die invariante Kette ist wesentlich an der Einschleusung von Proteinen in den MHC II Präsentationsweg beteiligt. Wir konnten in der Tat zeigen, dass eine Vakzinierung mit diesen Zahl der überlebenden Tiere 12 Kontrolle SL Vakzinierung SL-gp100 Vakzinierung SL-gp100/Ii Vakzinierung 10 8 6 4 2 0 20 40 60 80 100 120 140 Tage nach subkutaner Tumorzellapplikation DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Abb. 2: Protektion und Verlängerung der Überlebenszeit durch Vakzinierung mit transformierten Samonellen SL: SL transformiert mit leerem Vektor, SL-gp100: SL transformiert mit der cDNS des Melanomantigens gp100, SL-gp100/Ii: SL transformiert mit chimärer DNS aus gp100 und einem Bruchstück der invarianten Kette 187 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Salmonellen zur Aktivierung von TH-Zellen geeignet ist. Im Hinblick auf Überlebenszeit und Abstossungsrate lieferte dieses Vakzinierungsprotokoll die bisher überzeugendsten Ergebnisse [33] (Abb. 2). Wir konnten die Effizienz dieses Vakzinierungsverfahrens in einer Reihe von Tumormodellen wiederholen, wobei allerdings vermerkt werden sollte, dass wir in einem Leukämiemodell mit der Induktion von Toleranz konfrontiert wurden. Inwieweit dieser Befund Modell-bezogen oder generell bei Leukämien zu beobachten ist, bleibt zu untersuchen [32-34]. Davon unabhängig erscheint uns im Augenblick eine Tumorvakzinierung mit transformierten Salmonellen als äußerst vielversprechend. Adjuvante Tumortherapie 188 Aufgrund der speziellen Eigenschaften der Mehrzahl von Tumoren sowie des Immunstatus im Tumorpatienten ist es nicht nur notwendig, über eine Vakzinierung die Induktion einer Immunantwort in Gang zu setzen, vielmehr ist es häufig erforderlich durch ein geeignetes Adjuvant den Aktivierungsstatus von Immuneffektorzellen aufrecht zu erhalten. Die Targetierung von Effektorzellen in den Tumor stellt einen weiteren Problemkreis dar, der selektiv unterstützt werden sollte. Antikörper, Antikörper-Zytokin-Fusionsproteine und Antikörper-Chemokin-Fusionsproteine werden häufig eingesetzt, um diese Probleme in der Tumortherapie zu beheben. Wir haben uns in der Berichtsperiode vornehmlich mit dem Einsatz von Antikörper-Zytokin-Fusionsproteinen befaßt, wobei zwei Zytokine, IL-2 und TNF, zum Einsatz kamen, die beide als Fusionsprodukt mit einem anti-EGFR-Antikörper vorlagen. Als Modell diente wiederum die humanisierte SCID Maus, der ein humanes Melanom implantiert wurde. Wir konnten zeigen, dass mittels der Zytokin-Antikörper-Fusionsproteine eine äußerst effiziente Targetierung der humanen Effektorzellen erzielt werden kann. Darüberhinaus gelang es mittels des IL-2 Fusionsproteins eine Aktivierung von TH-Zellen in Gang zu setzen, die ausreichte um sowohl zytotoxische T-Zellen als auch Elemente der natürlichen Immunabwehr zu rekrutieren. Das TNF-Antikörper-Fusionsprotein war speziell bei intratumoraler Applikation therapeutisch effektiv. Dies ließ sich durch den Wirkmechanismus, d.h. eine in loco Aktivierung zytotoxischer T-Zellen erklären [35,36]. Diese Ergebnisse sind vielversprechend und wir werden diesen adjuvanten Therapieansatz im Kontext einer aktiven Vakzinierung weiter verfolgen. Allogene Stammzelltransplantation in der Therapie solider Tumoren Die allogene Stammzelltransplantation wird als ein potentiell kuratives Verfahren nach Ausschöpfung aller konventionellen Therapiestrategien erachtet. Aufgrund der hohen Toxizität der myeloablativen Konditionierung konnte dieses Verfahren über lange Zeit nur sehr begrenzt eingesetzt werden. Erst seit wenigen Jahren ist bekannt, dass eine allogene Knochenmarktransplantation auch nach nicht myeloablativer Konditionierung vorgenommen werden kann. Dies erweitert in ganz erheblichem Maße das mögliche Patientenkollektiv. Das Problem der „graft vs host“ Reaktionen (GvHD) bleibt allerdings bestehen. Weiterhin muss die Frage geklärt werden, wie eine „graft vs tumor“ (GvT) Reaktion bei einer Reduktion von GvHD aufrechterhalten werden kann. Letztlich ist bei einer nicht-myelo- Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr ablativen Vorbehandlung auch mit „host vs graft“ Reaktionen (HvGD) zu rechnen. Es ist bekannt, dass sowohl zytotoxische T-Zellen (CTL) als auch NK-Zellen an GvHD und HvGD beteiligt sind. Unsere früheren Studien zur allogenen Knochenmarktransplantation haben sich vornehmlich mit der Modulation von CTL Reaktionen über die Blockade kostimulatorischer Moleküle, u.a. CD44v6, befaßt. Über diese Untersuchungen wurde bereits im Kontext der Metastasierung-assoziierten Moleküle berichtet. An dieser Stelle sei nur auf zur Zeit laufende Untersuchungen verwiesen, in denen wir die Möglichkeit einer aktiven Vakzinierung nach allogener Stammzelltransplantation des nicht-myeloablativ konditionierten Wirts untersuchen. Bislang konnten wir zeigen, dass durch eine NK-Zell-Depletion des Wirts die Angehrate eines T-Zell-depletierten Transplantates signifikant verbessert werden kann. Wenngleich dieses Vorgehen mit einer verlängerten Phase der Immuninkompetenz belastet ist, konnte so GvHD deutlich abgeschwächt werden. Wesentlich ist vor allem, dass bei diesem Protokoll DonorT-Zellen im Wirt reifen und damit tolerant gegen den Wirt sind. Unsere Befunde weisen darauf hin, dass - ungeachtet der Induktion von Toleranz gegenüber dem Wirt - diese T-Zellen den Tumor als fremd erkennen. Die Weiterführung dieser Studien ist z.Zt. eines unserer zentralen Anliegen. Wenn wir bestätigen können, dass allogene T-Zellen nach Etablierung von Chimerismus Tumor-assoziierte Antigene als fremd erkennen, bietet eine allogene Stammzelltransplantation unter den genannten Konditionierungsbedingungen die optimale Plattform für aktive Vakzinierung in der Tumortherapie [37,38]. Ich möchte die Folgerungen aus unseren bisherigen Vakzinierungsstudien kurz zusammenfassen: i. Es erscheint wesentlich, dass das Antigen in einer Form angeboten wird, die zur Präsentation im Kontext mit MHC II geeignet ist; ii. Eine Vakzinierung mit attenuierten Salmonellen führt zu einer sehr effizienten Präsentation des Tumorantigens durch Makrophagen und DC und ist zudem vergleichsweise leicht zu handhaben und kostengünstig; iii. Antikörper-Zytokin-Fusionsproteine erweisen sich sowohl für die Targetierung von Effektorzellen als auch zur Aufrechterhaltung des Aktivitätszustandes als geeignet; iv. Eine allogene Stammzelltransplantation nach nicht-myeloablativer Konditionierung stellt möglicherweise die optimale Voraussetzung für eine aktive Tumorvakzinierung dar, da die im Wirt gereiften und somit gegenüber dem Wirt toleranten TZellen Tumorantigene weiterhin als fremd erkennen; v. Leider wurden wir bei allen Vakzinierungsprotokollen entweder mit Tumoreskapemechanismen oder Gegenattacken durch den Tumor konfrontiert. Wenngleich wir einige Möglichkeiten sehen, den Tumoreskape zu umgehen, haben wir bisher noch keine Anhaltspunkte, wie Gegenattacken des Tumors zu vermeiden sind. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Publikationen (* = externer Koautor) [1] Herlevsen M, Zöller M.: Co-expression of α6β4, the Tetraspanin D6.1A supports metastasis formation. [2] *Döme B, *Somlai B, *Ladányi A, *Fazekas K, Zöller M, *Tímár J.: Expression of CD44v3 splice variant is associated with the visceral metastatic phenotype of human melanoma. Virchow Archiv, 439: 628-635, 2001. [3] Wittig B, *Seiter S, Schmidt DS, *Zuber M, *Neurath M, Zöller M.: Selective upregulation of CD44 variant isoforms on peripheral blood leukocytes of patients with chronic inflammatory bowel disease. 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Resistance to alopecia areata in C3H/HeJ mice is associated with increased expression of regulatory cytokines and a failure to recruit CD4+ and CD8+ cells. J Invest Dermatol, [10] Christ O, *Günthert U, *Haas R, Zöller M.: Importance of CD44v7 isoforms for homing and seeding of hematopoietic progenitor cells. J Leukoc Biol, 69: 343-352, 2001. Abteilung D0600 Tumorprogression und Tumorabwehr [21] Amtmann E, Zöller M., Wesch H, *Schilling, G.: Antitumoral activity of sulphur-containing platinum complexes with an acidic pH optimum. Cancer Chemother Pharmacol 47: 461-466, 2001. [22] Pitzer C, Stassar MJJG., Zöller M.: Identification of renal cell carcinoma related cDNA clones by suppression subtractive hybridization. J Cancer Res Clin Oncol, 125: 487-492, 1999. [23] Stassar MJJG., Devitt G, Brosius M, *Rinnab L, *Prang J, *Schradin T, *Simon J, *Petersen S, Kopp-Schneider A, Zöller M.: Identification of human renal cell carcinoma associated genes by suppression subtractive hybridization. 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Radek Skoda (02/00 - 12/01) Das Ziel der Klinischen Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie/Onkologie ist eine Verbesserung der Diagnostik und Therapie maligner Erkrankungen durch einen schnellen Transfer von Ergebnissen aus der Grundlagenforschung in die klinische Anwendung. Ein Schwerpunkt der Abteilung beschäftigte sich unter Prof. Haas mit der Hemmung fehlgesteuerter zellulärer Genexpression bei hämatologischen und onkologischen Erkrankungen durch Antisense-Nukleinsäuren und Ribozyme. Antisense-Oligonukleotide werden nun in einer klinischen Pilotstudie zur Behandlung von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie eingesetzt. Um inhibitorische Gene in hämatopoetische Vorläuferzellen einschleusen zu können, wird das Adeno-assoziierte Virus-Vektorsystem (AAV-2) verwendet. Ein weiterer Schwerpunkt besteht in der Gewinnung, Anreicherung und immunologischen sowie molekularbiologischen Charakterisierung blutbildender Vorläuferzellen. Außerdem sind experimentelle Therapieansätze für die Behandlung maligner B-Zellerkrankungen mit bispezifischen Antikörpern in der Entwicklung. 190 Der Nachfolger von Prof. Haas (1999 Ruf an die Universität Düsseldorf) Prof. Skoda hat einen Ruf an die Universität Basel angenommen. Die Kooperationseinheit wird seit März 2002 kommissarisch durch Oberarzt Dr. Martin Görner (Abt. Hämatologische Onkologie und Rheumatologie der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Heidelberg) geleitet. Publikationen (2000) (* = externe Koautoren) *Lichterfeld, M.; *Martin, S.; *Burkly, L.; Haas, R.; Kronenwett, R.: Mobilization of CD34(+) hematopoietic stem-cells is associated with a functional inactivation of the integrin very late antigen-4. British Journal of Haematology 110 (2000) 71-81. *Neben, K.; Hohaus, S.; *Goldschmidt, H.; *Egerer, G.; Voso, M.T.; *Ho, A.D.; Haas, R.: High-dose therapy with peripheralblood stem-cell transplantation for patients with relapsed or refractory Hodgkins disease - Long-term outcome and prognostic factors. Annals of Hematology 79 (2000) 547-555. Steidl, U.; Haas, R.; Kronenwett, R.: Intercellular adhesion molecule 1 on monocytes mediates adhesion as well as transendothelial migration and can be down-regulated using antisense oligonucleotides. Annals of Hematology 79 (2000) 414-423. Voso, M.T.; Martin, S.; Hohaus, S.; *Abdallah, A.; *Schlenk, R.F.; *Ho, A.D.; Haas, R.: Prognostic factors for the clinical outcome of patients with follicular lymphoma following high-dose therapy and peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT). Bone Marrow Transplantation 25 (2000) 957-964. 309. Voso, M.T.; *Pantel, G.; Weis, M.; Schmidt, P.; Martin, S.; *Moos, M.; *Ho, A.D.; Haas, R.; Hohaus, S.: In-vivo depletion of B-cells using a combination of high-dose cytosine arabinoside/ mitoxantrone and rituximab for autografting in patients with nonHodgkins-lymphoma. British Journal of Haematology 109 (2000) 729-735. *Wenzel, V.; Padosch, S.A.; *Voelckel, W.G.; *Idris, A.H.; *Krismer, A.C.; *Bettschartwolfensberger, R.; *Lindner, K.H.: Survey of effects of anesthesia protocols on hemodynamic variables in porcine cardiopulmonary-resuscitation laboratory models before induction of cardiac arrest. Comparative Medicine Vol 50, Iss 6 (2000) 644-648. *Wiestner, A.; Padosch, S.A.; *Ghilardi, N.; *Cesar, J.M.; *Odriozola, J.; *Shapiro, A.; Skoda, R.C.: Hereditary thrombocythaemia is a genetically heterogenous disorder: exclusion of TPO and MPL in two families with hereditary thrombocythaemia. British Journal of Haematology 110 (2000) 104-109. Patente Haas, R.; Kronenwett, R.; *Lichterfeld, M.: AntisenseOligonukleotid zur Hemmung der Expression des Adhäsionsmoleküls very late antigen 4 (VLA-4) in menschlichen Zellen. DE 198 60 642.7; PCT/EP 99/10387; 2000 Haas, R.; Kronenwett, R.; Patzel, V.; *Steidl, U.; Sczakiel, G.: Antisens-Nukleinsäuren für die Hemmung der Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1. DE 198 44 111.8; PCT/EP 99/ 06972; DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Klinische Kooperationseinheit D0800 Pädiatrische Onkologie Klinische Kooperationseinheit Pädiatrische Onkologie (D0800) Leiter: Prof. Dr. med. Klaus-Michael Debatin Wissenschaftliche Mitarbeiter Dr. Ingrid Herr1 Dr. Simone Fulda2 Dr. Christian Beltinger2 Dr. Silke Henrich3 Dr. Thomas Böhler2 (- 2000) Dr. Karsten Stahnke2 Dr. Claudia Friesen3 Dr. Christian Scheuerpflug3 Doktoranden (Medizin und Biologie) Markus Dechant Eva Pauly Eric Meyer3 Anke Schroth3 Stella Okonoyo3 Till Wenger3 Carsten Posovszky2 (- 2000) MTA Melanie Motsch1 Tanja Dravits3 Helgard Knauß3 1 = DKFZ 2 = Universitätskinderklinik Ulm 3 = Drittmittel Die Klinische Kooperationseinheit Molekulare Onkologie/ Pädiatrie hat seit ihrer Etablierung erfolgreich an der Umsetzung molekularer Konzepte der Apoptoseregulation klinischer Orientierung in der pädiatrischen Onkologie und Hämatologie gearbeitet. Die Forschungsschwerpunkte befassen sich mit Störung von Apoptosesignalwegen bei lymphoproliferativen Erkrankungen und HIV-Infektion, sowie vor allem mit der Rolle von Apoptosesignalwegen bei der Chemo- bzw. Radiotherapie-induzierten Apoptose. Diese Untersuchungen werden jetzt erstmalig in klinische Studien (Kompetenznetz Pädiatrische Onkologie des BMBF) zur Analyse von Chemoresistenzmechanismen eingeführt. Das Forschungsprogramm der Klinischen Kooperationseinheit konzentriert sich auf die klinischen Implikationen grundlegender Erkenntnisse zur Regulation von Zelltod durch Rezeptor-abhängige Signalwege und/oder mitochondriale Faktoren. Die Entwicklung des Forschungsprogramms in den vergangenen Jahren hat gezeigt, dass Erkenntnisse der Apoptoseforschung in Zellsystemen bei der Diagnose und Behandlung von Tumorerkrankungen von Bedeutung sind. Ähnlich wie bei der zellzerstörenden Wirkung von Zytostatika und Strahlentherapie, sind auch bei der Ischämie-bedingten Gewebsschädigung Apoptosesignalwege entscheidend für den Zelltod verantwortlich. Gestörte Apoptosesensitivität oder Apoptoseresistenz spielt weiterhin eine Rolle bei lymphoproliferativen Erkrankungen, bei der HIV-Infektion, bei Autoimmunerkrankungen und schweren immunologischen Komplikationen im Rahmen allogener Knochenmarktransplantation. Kooperationspartner Intern: Dr. P. Angel, Prof. Dr. P. Krammer, Prof. Dr. M. von Knebel-Doeberitz, Prof. Dr. Peter Lichter, Dr. J. Mattern, Dr. G. Moldenhauer, Dr. M. Peter, Dr. R. Ridder, Prof. Dr. M. Schwab, Dr. H. Walczak, Prof. Dr. M. Wießler. Extern national: Dr. B. Baumann, Ulm; Prof. Dr. Berthold, Köln; Prof. Dr. H. Döhner, Ulm; Prof. Dr. V. Ewerbeck, Heidelberg; Dr. J. Fellenberg, Heidelberg; Prof. Dr. W. Friedrich, Ulm; Prof. Dr. T. Gress, Ulm; Prof. Dr. T. Herdegen, Kiel; Prof. Dr. G. JankaSchaub, Hamburg; Dr. I. Jeremias, München, Dr. C. Kupatt, München; Prof. Dr. W-D Ludwig, Berlin; Dr. A. Martin-Villalba, Heidelberg; Dr. S. Müller, Ulm; Dr. J. Schenkel, Heidelberg; Dr. A. Schulz, Ulm; Prof. Dr. M. Weller, Tübingen; Prof. Dr. T. Wirth, Ulm. Extern international: Prof. Dr. G. Brodeur, Philadelphia, USA; Prof. Dr. A. Fischer, Paris, Frannkreich; Dr. M. L. Gougeon, Paris, Frannkreich; Prof. Dr. J. Hickman, Paris, Frannkreich; Dr. G. Kroemer, Villejuif, Frannkreich, Prof. Dr. G. Melino, Rom, Italien; Dr. L. Di Marzio, L´Aquila, Italien; Dr. G. Nunez, Ann Arbor, USA; Prof. Dr. M. Piacentini, Rom, Italien; Prof. Dr. X. Wang, Texas, USA. Charakterisierung der Rolle von Apoptosesignalwegen für Sensitivität oder Resistenz in der Tumortherapie I. Herr, C. Friesen, E. Meyer, S. Fulda, C. Beltinger, C. Posovszky, E. Ucur, K. Stahnke Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe in den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Aktivierung von Apoptosesignal- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 191 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie 192 wegen entscheidend an der Sensitivität oder Resistenz von Tumorzellen für Chemotherapie oder Radiotherapie beteiligt ist. Durch zytotoxische Therapie kann Mitochondrien-abhängige Apoptose oder Zelltod durch Todesrezeptor-Signalwege induziert werden. Wir haben verschiedene Aspekte der Aktivierung solcher Zelltodessignalwege bei Zytostatika-induzierter Apoptose untersucht. Dabei konnten zelltypspezifische Einflüsse des mitochondrialen und/ oder des Todesrezeptor-Signalwegs identifiziert werden. Zytotoxische Therapie aktiviert zunächst „zelluläre Stressprogramme“, die, vermittelt z. B. über Jun-Kinasen, zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und zur Genexpression führen. Die gesteigerte Expression Apoptose-induzierender Gene ist ein wichtiger Faktor für Apoptosesensitivität. Durch zellulären „Stress“ induzierte Todesliganden können an ihre Rezeptoren binden und pro-apoptotische Moleküle können die Freisetzung apoptogener Faktoren aus Mitochondrien induzieren. In den meisten Fällen Zytostatika-induzierter Apoptose findet sich eine parallele Aktivierung von Todesrezeptor und mitochondrialen Signalwegen. In ähnlicher Weise wie zytotoxische Therapie durch Zytostatika führt auch die Suizidgentherapie zur Apoptose. Defizienzen in Apoptosesignalwegen reduzieren den Effekt eines Suizidgentransfersystems wie Herpes simplex Thymidinkinase/Gancyclovir. Dies könnte eine Erklärung für das gegenwärtige generelle Versagen der Suizidgentherapie z. B. in der Behandlung von Hirntumoren sein. Eine detaillierte Analyse des Zusammenspiels von mitochondrialen und Zelltodesrezeptor-Signalwegen zeigte darüber hinaus, dass beide Signalwege sich gegenseitig beeinflussen können. So führt Stimulation von Todesrezeptoren wie CD95 zu einem „auto amplification loop“, der durch Aktivierung des Stresssignalwegs die verstärkte Produktion von CD95 Ligand und anderen pro-apoptotischen Faktoren induziert. Sensitivierung für Zytostatika-induzierte Apoptose durch mitochondriotrope Zytostatika (Betulinsäure) und Gentransfer S. Fulda, C. Friesen, E. Meyer, I. Herr, E. Ucur, S. Okonoyo Veränderungen mitochondrialer Funktionen sind entscheidend für die Apoptose-Auslösung. Wir haben in Tumorzellen, in denen Zelltodessignalwege inhibiert sind, neue Substanzen identifiziert, die über den mitochondrialen Signalweg Zytotoxizität vermitteln können. Betulinsäure und ihre Derivate sind in der Lage, auch Zellen mit mutiertem p53 in vitro zu eliminieren. Die Untersuchungen zur Betulinsäure-vermittelten Apoptose-Induktion wurden zwischenzeitlich an Primärmaterial von Patienten mit Hirntumor durchgeführt und zeigen eine gute in vitro Aktivität gegen ein breites Spektrum von neuroektodermalen Tumoren. Vorläufige in vivo Experimente in Xenotransplantatmodellen zeigen darüber hinaus eine in vivo Wirksamkeit bei tolerabler Toxizität. Die Untersuchungen zur Überwindung von Apoptoseresistenz konzentrieren sich insbesondere auf neuroektodermale Tumoren, bei denen ein grosser Anteil eine primäre Klinische Kooperationseinheit D0800 Pädiatrische Onkologie Apoptoseresistenz, z. B. für Apoptoseinduktion über den Todesliganden TRAIL zeigt. Dabei zeigte sich, dass ein Teil der resistenten Tumoren eine deutlich reduzierte Caspase-8 Expression durch Hypermethylierung des Caspase-8 Promoters aufweist. Gentransferstrategien mit retroviralen Caspase-8 Konstrukten oder Demethylierung der regulatorischen Sequenzen des Caspase-8 Gens durch Azacytidin konnte die Apoptoseresistenz dieser Zellen überwinden. Die Untersuchungen wurden primär an Zelllinien von Patienten mit neuroektodermalen Tumoren durchgeführt, dann jedoch auch an Tumorproben überprüft, die von Patienten mit neuroektodermalen Tumoren stammen, die im Rahmen multizentrischer Studien behandelt werden. Auch dabei zeigte sich ein hoher Prozentsatz an reduzierter Caspase-8 Expression durch Hypermethylierung regulatorischer Promotersequenzen. Weiterhin konnten Defekte in Apoptosesignalwegen durch gesteigerte Expression von inhibitorischen Molekülen, wie c-FLIP identifiziert werden. Da in vielen der resistenten Tumoren die Expression apoptosefördernder Moleküle, wie Todesliganden oder Caspasen, inhibiert ist, haben wir Strategien entwickelt, um die defiziente Expression pro-apoptotischer Moleküle in Tumoren in Modellsystemen zu überkommen. Hierzu wurden verschiedene Vektorkonstrukte, z. T. konditionell reguliert (Tetracyclinsystem), entwickelt, die in Tumorzellen eingebracht werden können. Mit Hilfe dieser Konstrukte konnte die Zytostatikaresistenz Caspase-8 defizienter Tumorzellen überwunden werden. Die Restauration des defizienten Stresssignalwegs in Tumorzellen konnte ebenfalls durch Transfer Apoptose-induzierender Gene ausgeglichen werden. Durch konditionelle Expression von TRAIL konnten Effektorzellen hergestellt werden, die u. U. spezifisch Tumorzellen erkennen und durch Tetracyclin-induzierte Expression von TRAIL diese dann in vivo abtöten können. Mit dieser Strategie kann das Problem umgangen werden, dass der Gentransfer von Todesliganden in vivo wahrscheinlich nicht in einem ausreichenden Prozentsatz von Tumorzellen gelingen wird. CD95 Mutationen bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL) und autoimmunlymphoproliferativem Syndrom (ALPS) C. Scheuerpflug, C. Beltinger, T. Böhler, C. Posovszky, M. Dechant, E. Pauly In Vorarbeiten haben wir Mutationen im CD95 Rezeptor bei T lineage ALL und B lineage ALL bei pädiatrischen Patienten untersucht. Die Frequenz dieser Mutationen war, verglichen mit publizierten Frequenzen z. B. bei nonHodgkin-Lymphomen des Erwachsenen, relativ gering. Zum Mutationsscreening wurde eine SSCP Methode entwickelt, die jedoch nur 90% der Mutationen entdecken konnte. Mit direkter Sequenzierung des CD95 Gens über genomische DNA wurden auch Mutationen bei Patienten mit ALPS identifiziert. Bei diesen Patienten mit autoimmunlymphoproliferativem Syndrom kommt es zur Akkumulation doppelt negativer (CD4-/CD8-) T-Zellen und zur Bildung von Autoantikörpern. Im Gegensatz zu den ALL Pati- DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie enten, bei denen die Mutationen über das gesamte Gen zu finden sind, finden sich bei Patienten mit ALPS prädominant Mutationen in exon 9, das den intrazellulären Anteil des Moleküls kodiert. Patienten mit exon 9 Mutationen zeigen jedoch eine variable Ausprägung von Apoptosesensitivität und eine heterogene Funktion des CD95 Rezeptors, z. B. bei der Bildung des CD95 death inducing signaling complex, die nicht alleine aus der Lokalisation der Mutation erklärt werden kann. Wir haben weiterhin Mutationen für andere Apoptose-induzierende und Apoptose-modulierende Moleküle, wie CD95 Ligand, FADD, Caspase-8 und TRADD untersucht. Dabei fanden sich neue Mutationen im Adapterprotein TRADD bei Patienten mit Leukämien und ALPS. CD95 vermittelte Apoptose bei der HIV-Infektion T. Böhler, I. Herr Die HIV-1-Infektion ist durch eine im Krankheitsverlauf zunehmende Depletion von T Helfer Zellen charakterisiert, die durch verstärkte Apoptose verursacht zu sein scheint. In früheren Arbeiten fanden wir eine verstärkte Expression von CD95 und CD95 Ligand in frisch isolierten Lymphozyten von Patienten mit HIV-Infektion im Rahmen einer multizentrischen Studie zur pädiatrischen HIV-Infektion. In Längsschnittuntersuchungen konnten wir nun zeigen, daß die initial verstärkte Expression von CD95 Ligand nach effektiver antiretroviraler Therapie deutlich zurückgeht. Diese Veränderung ist unabhängig von aktueller Viruslast, korreliert allerdings direkt mit dem Wiederauftauchen naiver CD4+ T Zellen, die CD95 genuin nur schwach exprimieren. Die Analyse der Aktivität des CD95 Systems kann bei der HIV-Infektion von prognostischer Bedeutung sein und wird gegenwärtig als Surrogatmarker für Krankheitsprogression und Therapieansprechen evaluiert. Apoptosesignalwege bei Ischämie induzierter Apoptose I. Herr, I. Jeremias, S. Henrich, K.-M. Debatin Gewebsischämie führt nicht nur zum nekrotischen Zelltod sondern in weiten Bereichen des hypoxischen Gewebes zur Apoptose. In tierexperimentellen Untersuchungen fanden wir in hypoxischen Gewebsarealen bei zerebraler Ischämie eine verstärkte Expression des Transkriptionsfaktors c-jun sowie CD95L und TRAIL. Inhibition der Expression von CD95L und TRAIL durch FK 506 führte zur Reduktion des Infarktareals bei der zerebralen Ischämie. In Mäusen, bei denen durch Rezeptormutationen der CD95 Signalweg blockiert ist (lpr-Mäuse), waren die Infarktareale in Herz und Gehirn deutlich reduziert. In vitro führen hypoxische Kulturbedingungen zur Sensibilisierung für Liganden vermittelte Apoptose. Die zellulären Signalwege, die zur Aktivierung der Apoptosesysteme führen sowie deren mögliche pharmakologische Beeinflussung werden gegenwärtig in in vitro Zellsystemen untersucht. Hypoxiebedingungen sind auch an der Regulation von Apoptosesensitivität und -resistenz in Tumoren beteiligt. Wir ha- Klinische Kooperationseinheit D0800 Pädiatrische Onkologie ben in vitro Kulturbedingungen etabliert, die Zellen kontrolliert Hypoxie, Glukosedepletion und „Reperfusion“ aussetzen. Dabei kommt es zur Aktivierung von zellulären Signalwegen die über den hypoxiesensiblen Transkriptionsfaktor HIF 1α gesteuert werden. HIF 1α scheint dabei allerdings, ähnlich wie NFκB, sowohl Zelltod als auch Protektion vermitteln zu können. Publikationen (* = externe Koautoren) [1] Fulda S, *Strauss G, *Meyer E, Debatin K-M, 2000. Functional CD95 ligand and CD95 DISC in activation-induced cell death and doxorubicin-induced apoptosis in leukemic T cells. 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Betulinic acid induces apoptosis through a direct effect on mitochondria in neuroectodermal tumors. Medical and Pediatric Oncology, 35: 616-618 DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 193 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie Klinische Kooperationseinheit D0800 Pädiatrische Onkologie [16] Wang I, Hofmann TG, Runkel L, Haaf T, Schaller H, Debatin K-M, Hug H, 2001. Isolation and characterization of cDNAs for the protein kinase HIPK2. Biochimica et Biophysica Acta 1518: 168172 [17] Fulda S, Meyer E, Debatin K-M, 2001. Cell type specific involvement of death receptor and mitochondrial pathways in drug-induced apoptosis. Oncogene 20: 1063-1075 [18] Beltinger C, Uckert W, Debatin K-M, 2001. Suicide gene therapy for pediatric tumors. Journal of Molecular Medicine 78: 598-612 [19] Böhler T, Wintergerst U, Linde R, Belohradsky BH, Debatin KM, 2001. 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Stefan Eichmüller Dr. rer. nat. Jan Müller-Berghaus (05/02 - ) Dr. rer. nat. Wolfram Osen (03/02 - ) Dr. rer. nat. Annette Paschen Dr. med. Wolfram Fink, AiP Dr. med. Heike Röckmann (geb. Helmbach) Dr. med. Mingxia Song Dr. med. Selma Ugurel (03/02 - ) Dr. med. Udo Hofmann (- 10/01) Dr. med. Daniela Lang ( - 12/00) Dr. med. Angelika Stein ( - 01/02) Dr. med. Yuansheng Sun ( - 05/01) Dr. med. Christine Zimpfer-Rechner (06/00 - 06/02) Dipl. Biol. Friederike Fellenburg Dipl. Chem. Ebil-Lun Gelen Dipl. Biol. Tanja Hartmann Dipl. Biol. Annette Reitz (04/02 -) Dipl. Biol. Daniela Thomas Dipl. Biol. Dirk Usener Dipl. Biol. Evelyn Rossmann ( - 02/02) Dipl. Biol. Heike Rothfels ( - 04/02) Dipl. Biol. Birgit Wasser (08/00 - 09/01) Stipendiaten: Weiqing Jing (Shandong, China) (04/01 - ) Studienassistenten im Prüfzentrum: Sr. Annette Novak Technische Mitarbeiter: Antje Sucker (MTA) Judith Bartels (MTA) Willi Eickelbaum (MTLA) Brigitte Gschwendt (CTA) ( - 08/02) Ricarda Heber (BTA) Anita Jochim (MTA) Magdalena Pföhler (CTA) (04/02 - ) Claudia Sterzik (MTA) Sandra Christmann (MTA) (02/00 - 01/02) Konstanze Kolmsee (MTA) (04/01 - 04/02) Christine Schleicher (BTA) (09/00 - 01/01) Yvonne Nowak (Laborassistentin) Sekretariat: Margaret Vazansky Die Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie ist eine Abteilung des Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) an der Hautklinik des Klinikum Mannheim. Dermato-Onkologie befaßt sich mit der Prävention, Diagnose und Therapie von Tumoren der Haut. Dazu zählen Plattenepithelkarzinome der Haut und Hautanhangsorgane, Lymphome der Haut sowie das maligne Melanom, das für ¾ der hautkrebsbedingten Todesfälle verantwortlich ist. Die optimale Betreuung von Tumorpatienten ist eine interdisziplinäre Aufgabe, die guten Kontakt und Kooperation zu anderen Abteilungen wie Chirurgie, Pathologie, Radiologie, Hämatologie/Onkologie benötigt. Für die klinische Betreuung dieser Patienten im Haus sind spezielle Nachsorgesprechstunden eingerichtet. Die Klinische Kooperationseinheit für Dermatoonkologie besteht seit April 1997 und umfaßt Labore im DKFZ und in Mannheim. Dazu zählen ein großzügiger Laborbereich und eine spezielle dermatoonkologische Ambulanz in Mannheim mit der Möglichkeit auch ambulante Chemotherapien und Lymphknoten-Ultraschalluntersuchungen durchzuführen. Darüber hinaus stehen durch den Kooperationsvertrag zwischen dem DKFZ, der Universität Heidelberg und dem Klinikum Mannheim 4 Betten zur stationären Versorgung von Hautkrebspatienten zur Verfügung. Das Ziel der Klinischen Kooperationseinheit ist die enge Verzahnung von Klinik mit aktuellen, experimentellen Fortschritten im Labor. Im Zentrum der Bemühungen stehen Patienten mit malignen Melanomen in allen Stadien, jedoch auch fortgeschrittene Plattenepithelkarzinome und Lymphome der Haut werden umfassend stationär und ambulant versorgt. Es besteht die Möglichkeit Patienten bei den regelmäßig stattfindenden Dermatoonkologischen Konferenzen (mittwochs nachmittags, Anmeldung erbeten) vorzustellen. Homepage: http://www.dkfz-heidelberg.de/melanom Hintergrund Das maligne Melanom ist ein bösartiger Tumor, der seinen Ausgang von den pigmentproduzierenden Melanozyten nimmt. Es ist der bedeutendste Tumor der dermatologischen Onkologie, nicht wegen seiner Häufigkeit, sondern aufgrund seines aggressiven biologischen Wachstumsverhaltens und seiner ausgeprägten Therapieresistenz bei eingetretener Metastasierung. Die Häufigkeit des malignen Melanoms unterliegt starken geographischen Schwankungen. Die weltweit höchste Inzidenz findet sich in Australien und in den Südstaaten der Vereinigten Staaten, mit bis zu 40 Neuerkrankungen je 100.000 Einwohner pro Jahr. In Mitteleuropa und der Bundesrepublik beträgt die Inzidenzrate zwischen 6 bis 10 Fälle je 100.000 Einwohner pro Jahr in Abhängigkeit des Geschlechtes. Die Metastasierung des malignen Melanoms erfolgt entweder lymphogen oder hämatogen. Mit eingetretener Disseminierung der malignen Erkrankung sinkt die Überlebenserwartung dramatisch. Das Maligne Melanom ist im fortgeschrittenen Krankheitsstadium durch seine ausgeprägte Therapieresistenz gekennzeichnet. Konventionelle DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 195 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie 196 Behandlungsstrategien einschließlich der Chirurgie, Radiatio oder der Chemotherapie hatten bislang keinen wesentlichen Einfluß auf die Heilungserfolge bei betroffenen Patienten. Fortschritte in der Tumorimmunologie im allgemeinen und beim Melanom im besonderen haben dazu geführt, daß jetzt eine Reihe von Melanom-assoziierten Tumorantigenen, die durch spezifische T-Lymphozyten erkannt werden, identifiziert wurden. Darüber hinaus sind die immunologischen Mechanismen der spezifischen Tumorzell-Erkennung und -Vernichtung gut untersucht. Aus diesen neuen Erkenntnissen entwickeln sich jetzt eine Reihe interessanter, experimenteller Therapieansätze für das Melanom, die z.T. bereits in der klinischen Erprobung sind. Die Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie (DKFZ) am Klinikum Mannheim hat sich weiterhin zum Ziel gesetzt, die der hohen Chemoresistenz beim Melanom zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, um durch ein verbessertes Verständnis die Therapie verbessern zu können. Durch Identifikation derartiger Mechanismen und Moleküle verspricht man sich Angriffspunkte für eine gezielte pharmakologische oder auch zellbiologisch/ gentherapeutische Beeinflussung zu identifizieren, um letztendlich die klinische Therapieresistenz zu modulieren bzw. zu überwinden. Klinische Kooperationseinheit D0900 Dermato-Onkologie Chemoresistenz: H. (Helmbach) Röckmann, B. Gschwendt, S. Englisch In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Hermann Lage, Prof. Manfred Dietel (Charité, Pathologie Berlin) und Prof. Dr. Pranav Sinha (Charité, Klinische Chemie, Berlin), Prof. Dr. Annemarie Poustka (DKFZ, Abt. H0600), Prof. Peter Krammer (DKFZ, Abt. G0300), Prof. Dr. Peter Lichter (DKFZ, Abt. H 0700). Im fortgeschrittenen Stadium hat das Melanom eine schlechte Prognose, hauptsächlich aufgrund der Ineffektivität von Chemotherapie. Aus bisher ungeklärten Gründen sind Melanomzellen weitgehend resistent gegen systemische Behandlung mit antineoplastischen Substanzen. Verschiedene Mechanismen, die für die beobachtete Chemoresistenz verantwortlich sein könnten, sind in Bezug auf der spezifischen Wirkungsweise bestimmter Zytostatika und auf die Vorgänge, die zum Zelltod führen, untersucht worden (Übersicht in Helmbach et al., 2001). Einige Studien haben gezeigt, daß die Mechanismen, die zur Chemoresistenz von hämatologischen Tumoren führen, bei soliden Tumoren wie dem Melanom nicht wirksam sind. Aus diesem Grund müssen die Mechanismen, die mit Chemoresistenz bei Melanomerkrankungen in Zusammenhang stehen könnten, durch breitgefächerte Studienansätze analysiert werden. Die Auslösung von Apoptosis wird als einer der wichtigsten Mechanismen angesehen, durch die zytostatische Substanzen Tumorzellen töten. Infolgedessen könnten Defekte oder Veränderungen in der Apoptosiskaskade bei Melanomzellen die Wirksamkeit von Chemotherapeutika einschränken und zur Chemoresistenz führen. Die spezifischen Wirkmechanismen und molekularen Pfade der zellulären Apoptosis werden schon länger intensiv erforscht während Untersuchungen zu dem Zusammenhang zwischen Störungen in den apoptotischen Abläufen und Chemoresistenz von Tumorzellen jetzt erst in Gang kommen. Es ist anzunehmen, daß es noch andere unbekannte Mechanismen auf der molekularen Ebene gibt, die zu Chemoresistenz führen, die jetzt mittels molekularbiologischen Untersuchungen gesucht werden [6, 9]. Da experimentelle Beobachtungen zu Chemoresistenz in der Regel nicht direkt an Patienten vorgenommen werden können, haben wir ein in-vitro Modellsystem entwickelt, um sehr spezifische und reproduzierbare Analysen chemoresistenter Mechanismen ausführen zu können (Kern et al., 1997, Anticancer Res (1997) 17: 4359-4370.): I.Cisplatin: DNS-Schädigung, induziert DNS-Kreuzvernetzung II. Etoposid: Inhibiert DNS-Topoisomerase II, induziert Brüche in dem DNS-Strang III. Fotemustin: DNS-alkylisierende Substanz, induziert Brüche in dem DNS-Strang IV. Vindesin: Mitosis-Inhibitor, inhibiert Polymerisierung der Mikrotubuli. Bei der Analyse der Varianten hat es sich herausgestellt, daß eine breite Kreuz-Resistenz vorlag, die nicht durch die bekannten Transporterproteine erklärlich war. Dies führt zu der Annahme, daß es bestimmte, bis jetzt unbekannte, allgemeine Resistenzmechanismen gibt, die für Chemoresistenz beim Malignen Melanom verantwortlich sind. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie A. Apoptosis-Defizienz Apoptosis (programmierter Zelltod) wurde als wichtigster Mechanismus erkannt, durch den Zytostatika anfällige (sensitive) Tumorzellen töten. Verschiedene Studien lassen vermuten, daß Resistenz gegen antineoplastische Substanzen durch Inhibition oder Dysregulation der Apoptosis verursacht wird. Untersuchungen an anderen Tumorsystemen haben ergeben, daß die Induktion von Apoptosis durch einige Zytostatika entweder durch TodesrezeptorLigand-Interaktionen, wie z. B. beim CD95-System, oder durch mitochondriale Prozesse vermittelt wird. Für das humane Melanom ist wenig über die Induktion von Apoptosis durch Chemotherapeutika oder über Störungen der apoptotischen Kaskaden, die Chemoresistenz bewirken, bekannt. Wir haben den apoptotischen Pfad analysiert, über den Cisplatin und Etoposid den Zelltod in chemo-sensitiven MeWo Zellen herbeiführen, und ihn mit den zum Zelltod führenden Pfaden bei chemoresistenten MeWo Zellen verglichen (Kern et al., 1997, Anticancer Res (1997) 17: 4359-4370.). Der durch Etoposid und Cisplatin induzierte apoptotische Zelltod wird durch mitochondriale Prozesse vermittelt. Eine analog durchgeführte Analyse an Etoposid-resistenten Zellen zeigte ein anderes Muster. Defizient ablaufende apoptotische Prozesse wurden durch eine reduzierte Freisetzung von Cytochrom c durch die Mitochondrien sowie eine verminderte stromabwärts laufende Signaltransduktion charakterisiert. Der Zelltod in Cisplatin-resistenten Zellen kommt auch über veränderte Pfade (im Vergleich zu den Pfaden bei sensitiven Zellen) zustande, wenngleich andere Mechanismen tangiert werden [9]. B. Wirkungspezifische Mechanismen: DNS-Reparatur und Topoisomerase Durch Zytostatika verursachte DNS-Schädigungen werden durch entsprechende kompensierende Veränderungen in den DNS-Reparaturmechanismen teilweise behoben. In den letzten Jahren haben Untersuchungen gezeigt, daß DNS - Mismatch Repair (MMR)-Defizienz sowie vermehrte DNS-Reparatur zur Chemoresistenz führen. Ein weiterer Mechanismus, der der zellschädigenden Wirkung von Zytostatika entgegenwirkt, ist die Regulierung der Zielmoleküle. Topoisomerase II ist ein nukleares Enzym, das für die Transkription und Rekombination der DNS sowie die Segregation der Chromatide während Mitose unentbehrlich ist. Topoisomerase II stellt eine primäre intrazelluläre Zielscheibe für viele antineoplastische Substanzen dar. Nur wenige Studien haben sich mit der Rolle von Topoisomerase II in Chemoresistenz beim malignen Melanom befasst. Wir konnten zeigen, daß in Zellen, die gegen Cisplatin, Etoposid und Vindesin resistent sind, die Menge einiger im Zellkern enthaltenen DNA-MMR-Proteine (hMLHI, hMSH2 und hMSH6) reduziert war. In Melanomzellen, die Resistenz gegen Fotemustin aufzeigten, war die Menge der nuklearen MMR-Proteine fast unverändert, während die Aktivität von O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) beträchtlich erhöht war [1]. In einer Kooperationsarbeit mit der Gruppe von Prof. Wießler im DKFZ wurden Klinische Kooperationseinheit D0900 Dermato-Onkologie MGMT-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, Chemoresistenz in Fotemustin-resistenten MeWo-Zellen teilweise zu überwinden [8]. Topoisomerase IIα- and IIβ-Expression war in allen Etoposid-resistenten Zellen auf der mRNS- sowie auf der Proteinebene reduziert. Bei Cisplatin-resistenten und Fotemustin-resistenten Zellen war die Expression von Topoisomerase IIα nur auf der mRNS-Ebene erniedrigt. Verminderte Expression in Etoposid-resistenten Zellen wurde von einer Abnahme in Topoisomerase-Aktivität begleitet und führte zu einer entsprechend höheren Grad der Resistenz [3]. C. Identifikation differentiell exprimierter Moleküle Es ist davon auszugehen, daß es noch weitere bisher unentdeckte Resistenz-vermittelnde Mechanismen gibt. Um hier zu einem tieferen Verständnis zu gelangen, haben wir mittels differential display reverse transcription-polymerase (DDRT-PCR) sowie complex cDNA hybridisation (CCH) MeWo-Zellvarianten charakterisiert. Dieser Ansatz wurde durch eine Analyse der globalen Proteinexpression (Proteomanalyse) unter Verwendung einer zweidimensionalen Gelelektrophorese ergänzt, um weiteren noch unbekannten Mechanismen der Chemoresistenz beim humanen Melanom auf die Spur zu kommen [5]. Mittels DDRT-PCR und Northern Blot Analysen konnten 11 cDNS Klone als differentiell exprimierte Gene identifiziert werden. Diese cDNS Klone DSM-1-DSM-11 (DrugResistance- associated Sequence in Melanoma) beinhalten 4 Gene (DSM-1, DSM-3, DSM-5, DSM-7), deren Funktion bekannt ist, 3 Gene (DSM-2, DSM-4, DSM-6), die schon sequenziert wurden, ohne daß die Funktion charakterisiert wurde, und 4 neue Gene (DSM-8 - DSM-11) ohne Übereinstimmung mit einem Gen in der Genbank (Grottke et al., 2000). Funktionelle Analysen haben gezeigt, daß DSM-2 (ICERE) eine Rolle in der Resistenz gegen Etoposid spielt [7]. Mittels complex cDNA-hybridisation konnten weitere 120 differentiell exprimierte Gene identifiziert werden [11]. Durch 2-D-Gel Analyse konnten wir mehr als 70 differentiell exprimierte Proteine (pH 2,8-pH 10) identifizieren und in sensitiven und resistenten MeWo Melanomzelllinien vergleichen [5, 10]. Ausblick • Da ein in vitro Modell schon zur Verfügung steht und erste Protein-biochemische und molekularbiologische Untersuchungen bereits laufen, sollte es möglich sein in Zusammenarbeit mit anderen Forschungsgruppen im DKFZ, die über Expertise in diesem Gebiet verfügen, DNS- und Proteinchips mit Resistenz-assoziierten Genen/Proteinen zu entwickeln, um mit diesem Werkzeug mehr über diese Moleküle zu erfahren. • Zusammen mit den Mitgliedern unserer Einheit, die an experimentellen Therapien arbeiten, werden wir eine umfassende Sammlung von verschiedenen chemoresistenten Zelllinien sowie frischem Tumorgewebe von zahlreichen Patienten, für die ausführliche Daten und Dokumentation vorliegt, zusammentragen. DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 197 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie • Die auf diese Weise gesammelten Daten werden verwendet, um einen „Resistenzprofil“ für individuelle Melanompatienten zu erstellen, mit dem die potentielle Reaktion auf neoplastische Substanzen vorhergesagt und ein entsprechend optimiertes Therapieschema ausgewählt werden kann. Sobald genauer bekannt ist, durch welche Moleküle Chemoresistenz bewerkstelligt wird, können diese gezielt manipuliert werden, um die erwünschte Wirkung von pharmazeutischen Substanzen zu erreichen. Die entsprechenden Veränderungen könnten möglicherweise durch molekularbiologische oder gentherapeutische Strategien (z. B. Ribozyme, Antisense) sowie chemotherapeutische Ansätze herbeigeführt werden. Immuntherapie und Vakzinentwicklung A. Paschen, W. Osen, W. Jing, D. Thomas, E. Gelen, A. Reitz, A. Sucker, C. Sterzik, R. Heber, J. Müller-Berghaus 198 In Zusammenarbeit mit: Prof. Pierre Coulie (Ludwig Institut, Brüssel, Belgien); Prof. Georgio Parmiani (National Cancer Institute, Mailand, Italien), Prof. Dr. Marcus Maeurer (Mikrobiologie, Mainz), Prof. Dr. G. Rammensee (Tübingen), Prof. Dr. Reinhard Dummer, PD Dr. Carmen Scheibenbogen (FU Berlin), Prof. Frederico Garrido (Granada, Spanien), PD Dr. Gerd Sutter & Dr. Ingo Drexler (Virologie, GSF München), Prof. Lutz Gissmann (DKFZ, Abt. F0200), Prof. Dr. Harald Klüter & Dr. X D. Nguyen (Transfusionsmedizin, Mannheim), Dr. Siegfried Weiss (GBF Braunschweig) Prof. T. Chakraborty & PD Dr. E. Domann (Mikrobiologie, Gießen), PD Dr. Harald Kropshofer und PD Dr. Anne Vogt (Roche Institut für Molecular Genetics, Basel, Schweiz). Die zunehmende Anzahl der experimentellen Belege dafür, daß tumorassoziierte Antigene (tumor-associated antigens = TAA) durch das Immunsystem spezifisch erkannt werden, ließen das Konzept der Tumorvakzinierung aussichtsreich erscheinen und führte zu der Entwicklung verschiedener Tumor-spezifischer Vakzinierungsstrategien (Sun et al., 1999). Die Anwendung solcher Behandlungsstrategien in klinischen Phase I/II Studien führte jedoch zu therapeutischem Erfolg in nur einer kleinen Anzahl von Krebspatienten (Möller et al. 2000). Dieses Ergebnis ist zum Teil darauf zurückzuführen, daß die Patienten in diesen Studien schon in fortgeschrittenen Krankheitsstadien waren, aber möglicherweise auch darauf, daß die meisten Vazinierungsstrategien ausschließlich auf die Induktion einer tumorspezifischen CD8+-T-Zell (CTL) Immunreaktion ausgerichtet waren. Obwohl CTL die Fähigkeit besitzen, Tumorzellen unmittelbar zu töten, hängen die Induktion und Erhaltung ihrer Effektorfunktion sehr stark von der Teilnahme antigenspezifischer CD4+ T-Helferzellen an der Immunreaktion ab. Aus diesem Grund muß eine Immuntherapie für Krebserkrankungen auf die Mobilisierung von sowohl CD8+ wie auch CD4+ T-Zellen hinsteuern. Um dieses Ziel zu erreichen, müssen zuerst die von den Tumorzellen präsentierten immunogenen TAA-spezifischen TZellepitopen identifiziert werden. Die Arbeitsgruppe “Immuntherapie und Vakzinentwicklung” verfolgt daher zwei Hauptzielen: (I) die Identifizierung antigenspezifischer T-Zellepitopen als eine Voraussetzung Klinische Kooperationseinheit D0900 Dermato-Onkologie für (II) die Entwicklung wirksamer antigenspezifischer, auf T-Zellen gerichteter Immuntherapien. Bisher haben die von unserer Gruppe durchgeführten Untersuchungen sich hauptsächlich mit der Charakterisierung immunogener HLA-Klasse I restriktivierter Peptiden, die aus Melanom-assoziierten Antigenen (melanoma associated antigens = MAA) stammen, befaßt. Das experimentelle Verfahren für die Identifizierung dieser Peptide basierte auf einer immunologischen “Umkehrstrategie”, d. h. die in vitro Stimulierung von T-Lymphozyten durch CTLEpitopen, für die eine bestimmte Wirkung vorausgesagt wurde. Auf diese Weise konnten wir die immunogenen Peptidepitopen identifizieren, die für die qualitativ unterschiedliche Prozessierung der Antigenen in Tumorzellen verantwortlich sind [13, 16]. Neben diesem Umkehrverfahren werden wir jetzt direkte Strategien zur Identifizierung von Epitopen unter Anwendung globaler Tumorantigenen in vitro und in vivo einsetzen. Dendritische Zellen (DC) werden mit Antigen-kodierender RNS oder rekombiniertem Protein geladen und HLA-transgene Mäuse werden mittels rekombinanter DNS, Protein oder rekombinanter mikrobiellen Vektorvakzinen immunisiert. Wir setzen direkte und Umkehrstrategien nebeneinander ein, um der Tatsache Rechnung zu tragen, daß Tumorzellen und antigenpräsentierende Zellen (antigen-presenting cells = APC) Unterschiede hinsichtlich des Spektrums der immunogener Peptide, die von einem gegebenen Tumorantigen generiert werden, aufzeigen könnten. Kenntnisse über beide Gruppen von Peptiden ist für die Entwicklung von Krebsvakzinen potentiell von Bedeutung. Im Bewußtsein der entscheidenden Rolle, die CD4+ T-Helferzellen in der Induktion und Erhaltung CTL-vermittelter Immunität spielen, haben wir unseren Ansatz mit einer Analyse der immunogenen TAA-derivierten Peptide, die von HLA-Klasse II Molekülen präsentiert werden, erweitert. Analog zu dem Verfahren beim HLA-Klasse I-System werden beide experimentelle Strategien (Umkehr- und direkt, in vitro/in vivo) angewendet. Die Versuche zur Identifikation von Epitopen werden auch die neuen TAA-spezifischen Antigene einschließen, die von der Arbeitsgruppe “Identifikation und Charakterisierung neuer Tumorantigene” in Laborversuchen identifiziert wurden. Die Charakterisierung der oben beschriebenen TAA bildet das Fundament für die zweite wichtige Zielsetzung der Arbeitsgruppe, die Entwicklung wirksamer, T-Zell aktivierender Krebsvakzine. Um dieses Ziel zu erreichen, schlagen wir zwei Wege ein: (I) Optimierung der schon entwickelten Vakzine und (II) Entwicklung neuer alternativer Vakzine. Wir glauben, daß auf dendritischen Zellen basierende Impfstoffe ein immunologisches Werkzeug mit beträchtlichem Potential für die Prophylaxe und Therapie darstellen, und die beeindruckende therapeutische Wirkung, die mit der Behandlung von Melanompatienten mit Peptid-beladenen autologen dendritischen Zellen schon erzielt werden konnte, bestätigt dieses Urteil (Nestle et al., 1998, . Nature Medicine 4: 328-332). Dieses Vakzin wollen wir noch weiter verbessern, in dem dendritische Zellen mit den antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellepitopen DKFZ 2002: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2000/2001 Forschungsschwerpunkt D Diagnostik und Experimentelle Therapie geladen werden, die in den oben beschrieben experimentellen Arbeiten identifiziert wurden. Da aber die Herstellung autologer DC-Vakzine sehr kostspielig ist, suchen wir nach alternativen Vakzin-Vektorensystemen, die solche Antigene in vivo direkt in die dendritischen Zellen bringen können. Zu diesem Zweck benutzen wir das fakultative intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes um die TAA zu transportieren. Von uns durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß dieses Bakterium in der Lage ist, humane dendritische Zellen effektiv zu infizieren und dadurch phänotypische DC-Maturation und die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine auszulösen [15]. Neben diesem bakteriellen System werden wir den modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA) als virales Vektorensystem einsetzen. Für beide Vektorensysteme sind rekombinante Variante verfügbar, die Melanomantigene (melanoma differentiation antigens = MDA) transportieren können. Da MDA als Zielstrukturen für zelluläre Immunreaktionen in Melanompatienten schon bekannt und ausführlich in Tiermodellen untersucht worden sind, haben wir sie für die Evaluierung unserer Vakzinierungsstrategien gewählt. Die Effizienz dieser neuen Vakzinvektoren wird dementsprechend in humanen Zellkultursystemen und in Tierexperimenten, basierend auf dem B16 MelanomMausmodell und HLA-transgenen Mäusen, getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sollen dann in die Entwicklung von neuen experimentellen klinischen Therapien durch unsere Einheit einfließen. Identifikation und Charakterisierung neuer Tumorantigene S. Eichmüller, J. Zeng, D. Usener, F. Fellenberg, T. Hartmann, A. Jochim, J. Bartels In Zusammenarbeit mit: PD Dr. Michael Pawlita (DKFZ, Abt. F0200), Prof. Reinhard Dummer (Dermatologie, Zürich, Schweiz), PD Dr. Edgar Dippel (Dermatologie, Mannheim), PD Dr. Stefan Dübel (Universität Heidelberg). Mittelpunkt der Arbeit dieser Gruppe ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA) und die Einschätzung ihrer möglichen Anwendbarkeit für Diagnostik und Therapie. Die verschiedenen Projekte beziehen sich auf drei Hauptthemen: (1) die Suche nach Tumorantigenen mittels Screening, (2) Evaluierung der neu entdeckten TAA, cTAGE-1 und GBP-TA, und (3) die Entwicklung diagnostischer Werkzeuge. Wir verwenden verschiedene Screening-Verfahren wie das SEREX-Verfahren, eine serologische Screeningmethode von Phagenbanken, um neue tumorassoziierte Antigene oder Homologe von schon vorher entdeckten TAA zu identifizieren. Die Screeningversuche haben sich initial hauptsächlich auf das Kutane T-Zell Lymphom (CTCL) bezogen, eine lymphoproliferative Erkrankung der Haut, für die nur eine begrenzte Anzahl tumorspezifischer Antigene bekannt sind [19], und konzentrieren sich jetzt auch auf des Melanom. Zusätzlich zu der Suche nach neuen Antigenen wurde die Expression bekannter tumorassoziierter Antigene, Klinische Kooperationseinheit D0900 Dermato-Onkologie insbesondere derjenigen, die der “cancer-germline-antigen” Gruppe angehören, in verschiedenen Geweben und Zelllinien (CTCL, Melanom) untersucht. Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit war, daß in diesen CTCL-Proben das Antigen LAGE-1 und die Antigengruppe GAGE reichlich exprimiert wurden und deswegen vielversprechende Ansatzpunkte für therapeutische und diagnostische Maßnahmen darbieten könnten [20]. In der letzten Zeit haben wir angefangen nach Testis-Antigenen, die in malignen Melanomen exprimiert werden, zu suchen [21]. In einer Reihe von Versuchen neue CTCL-Antigene zu detektieren, konnten wir einige tumorassoziierte Antigene identifizieren, die ein interessantes serologisches Reaktionsmuster zeigten. Darüber hinaus konnten wir demonstrieren, daß eines der tumorassoziierten Antigene, die schon bekannt waren (SCP-1) und zwei neu entdeckte TAA (cTAGE-1 und GBP-TA) ein differentielles Expressionsmuster aufzeigen, das sie als wichtige potentielle Ziele für Immuntherapie erscheinen läßt [18, 19, 22]. Solche tumorspezifische Antigene könnten für Zell-basierten Immuntherapien oder - wenn sie auf der Zelloberfläche exprimiert werden - für Behandlungen, die auf Antikörpern basieren, verwendet werden. Aus diesem Grund bilden die Bemühungen um eine vollständige Analyse der neu identifizierten Tumorantigene mittels Expressionsanalyse (RNS und Protein) und Immunhistologie sowie die Überprüfung der Antikörperreaktivität in Patientenseren wichtige Schwerpunkte der Forschung unserer Gruppe. Was cTAGE-1, das erste beim CTCL detektierte TAA, betrifft, konnten wir inzwischen zeigen, daß dieses Antigen Mitglied einer größeren Familie ist, zu der sogar ein zweites tumorspezifisches Mitglied gehört (cTAGE-5A) [22]. Sämtliche neue tumorassoziierte Antigene, die im Verlauf der beschriebenen Screeningverfahren sich zumindest in ihrer serologischen Reaktivität als tumorspezifisch darstellten, werden jetzt weiteren Untersuchungen auf der Proteinebene unterzogen. Das Ziel dieses Unternehmens ist es, neue diagnostische Werkzeuge durch das Generieren antigenspezifischer Antikörper und die Entwicklung eines ELISA-Systems bereitzustellen, um Patientenseren auf die Anwesenheit tumorspezifischer Antikörper überprüfen zu können. Experimentelle Therapie S. Ugurel, C. Zimpfer-Rechner, W. Fink, A. Novak, A. Zimpfer, W. Eickelbaum, M. Pföhler In Zusammenarbeit mit: Prof. Alexander Enk (Mainz), Prof. Gerold Schuler (Erlangen), Dr. Eckehard Kämpgen (Würzburg), Prof. Stefan Grabbe (Münster), PD Dr. Frank Nestle (Zürich, Schweiz),
