Kernmodul 3 Zellfraktionierung / Mitochondrien Übersicht
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AG Prof. R. Lill, Institut für Zytobiologie Kernmodul 3 Zellfraktionierung / Mitochondrien Übersicht Aufgabe dieses Versuchs ist es mittels ✦Zellfraktionierung den Ort der ✦Fermentation, des ✦Zitratzyklus und der ✦zellulären Respiration in der Bäckerhefe S. cerevisiae zu lokalisieren. Parallel soll die Fähigkeit der isolierten Mitochondrien zur ✦oxidativen Phosphorylierung untersucht werden. Am ersten Versuchstag werden die Hefezellen mittels Glaskugeln mechanisch aufgeschlossen, und aus dem gewonnenen Zell-Lysat durch ✦differenzielle Zentrifugation eine mitochondriale und eine cytosolische Fraktion (PMS, post-mitochondrialer Überstand) isoliert. Der Proteingehalt wird ermittelt und die Fraktionen werden eingefroren. Zweiter Versuchstag: Aufgabe 1: Zwei Gruppen werden die Fraktionen jeweils auf die ✦spezifische Aktivität charakteristischer Enzyme der Fermentation (Alkohol-Dehydrogenase); des Zitratzyklus (CitratSynthase, Malat-Dehydrogenase) und der Respiration (Cytochrom Oxidase) hin untersuchen. Frage: In welchen Fraktionen reichern sich die Enzyme an? Aufgabe 2: Die anderen Gruppen werden die mitochondriale Fraktion auf ihre Fähigkeit zur ATPProduktion in Gegenwart unterschiedlicher Reduktionsmittel (NADH oder Succinat) untersuchen. Weiterhin soll der Effekt der Inhibitoren KCN und Malonat untersucht werden. Frage: Wie verhält sich die ATP Produktion der Mitochondrien in Gegenwart dieser Substanzen? Warum? In einem parallelen Versuch (1. Versuchstag) soll der Einfluß der Respiration und des Zitratzyklus auf den Stoffwechsel von S. cerevisiae direkt untersucht werden. Hierzu wird das Wachstumsverhalten des Wildtyps mit dem zweier ✦„petite“ Mutanten, aco1∆ und cyt2∆, in Gegenwart von unterschiedlichen Kohlenstoffquellen (Glucose bzw. Glycerin) und auf definiertem Minimalmedium verglichen. Im Stamm aco1∆ ist das Gen der Aconitase, ein Enzym des Zitratzyklus deletiert. cyt2∆ kann keinen aktiven respiratorischen Komplex III synthetisieren. Frage: Wie verhalten sich die Stämme auf den unterschiedlichen Wachstumsmedien? Warum? ✦: Die Bedeutung dieser Begriffe sollte am Ende des Versuchs klar sein. 2 Die Ergebnisse der einzelnen Versuchsteile sollen am Dienstag der Woche, die auf den Versuch folgt, im begleitenden Seminar gemeinsam vorgestellt und diskutiert werden. Werten Sie ihre Daten bis zu diesem Zeitpunkt aus. Erstellen Sie anschließend ein Gruppenprotokoll, das die von Ihnen durchgeführten Versuche dokumentiert und diskutiert. Legen sie hierbei ihren Schwerpunkt auf Auswertung der Daten und die Beantwortung der Fragestellung des jeweiligen Versuchsteils und verzichten sie auf die Beschreibung der im Skript aufgeführten Versuchsdurchführungen. Praktischer Teil 1. Zellfraktionierung Ablauf: Die Hefezellen werden zunächst in einem ✦isotonischen Puffer suspendiert und mittels Glaskugeln mechanisch aufgeschlossen. Die rasche Durchführung der nachfolgenden Schritte, niedrige Temperaturen (4°C) und der Zusatz von Protease-Inhibitoren (hier PMSF, Phenylmethylsulfonylfluorid) reduzieren die Proteindegradation. Die Zellkerne und Zelltrümmer werden durch Zentrifugation bei niedriger Umdrehungszahl sedimentiert (2500 rpm, 5 min, 4°C). Anschließend werden die leichteren Mitochondrien durch Zentrifugation bei höherer Umdrehungszahl (9000 rpm, 12 min, 4°C) aus dem Zellextrakt sedimentiert. Der übrigbleibende "postmitochondriale" Überstand (PMS) enthält kleine Membranvesikel des ER und des Golgi-Apparats sowie cytosolische Proteine. Die so erhaltene Mitochondrien-Fraktion ist relativ unsauber, kann jedoch z.B. für Expressionsanalysen oder für die Lokalisierung von Proteinen eingesetzt werden. Durchführung Jede Gruppe verarbeitet Zellen aus zwei Kulturen. 1. Übernacht-Kulturen (jew. 150 ml YPGal, OD600=1-2) sind bei 3000 rpm, 20°C, für 5 min. abzentrifugiert worden. 2. Die sedimentierten Zellen werden in 10 ml Waschpuffer resuspendiert, in ein 15 ml FalconTube überführt und erneut bei 3000 rpm, 20°C, für 5 min. abzentrifugiert. 3. Das Sediment wird mit 2 ml Waschpuffer versetzt und vollständig resuspendiert (Vortex). Es werden 20 µl des Proteaseinhibitors Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), ca. 1 ml Glaskugeln zugegeben (mit Hilfe eines Eppendorfgefäß abmessen) und für ca. 5 min auf Eis auf dem Kopf inkubiert. 3 Hinweis: Alle Schritte von hier ab werden auf Eis durchgeführt. Zentrifugationen bei 4°C. 4. Die Zellen werden durch dreimaliges Vortexen für 1 min. (über Kopf!) bei maximaler Geschwindigkeit aufgeschlossen. Zwischendurch werden die Proben für jeweils ca. 1 min. auf Eis abgekühlt. 5. Die Mischung wird bei 2500 rpm und 4°C für 5 min. abzentrifugiert und die Überstände der drei Proben in ein frisches 15 ml Falcon-Tube vereinigt. Vorsichtig abnehmen! Es sollten möglichst keine Membranreste überführt werden. 6. Die Probe wird in den 15 ml Falcon-Tube erneut bei 2500 rpm und 4°C für 5 min. zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues 15 ml Falcon Tube überführt. (Aufgabe 1: 0.5 ml Probe abnehmen! 20 µl für die Proteinbestimmung bei Seite stellen (Lysat)) 7. Der Überstand wird bei 8500 rpm und 4°C für 12 min zentrifugiert. (Aufgabe 1: Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt. 20 µl für die Proteinbestimmung bei Seite stellen (PMS)) 8. Das Pellet wird in 1 ml Waschpuffer aufgenommen (Nicht vortexen!), in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und erneut bei 2500 rpm und 4°C für 5 min abzentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei 9500 rpm und 4 °C für 12 min zentrifugiert (Mitochondrien). 9. Die Mitochondrien werden in 200 µl Waschpuffer vorsichtig resuspendiert. Nicht vortexen! 10. Bestimmen Sie den Proteingehalt ihrer Proben (siehe unten). 11. Die jeweiligen Fraktionen werden anschließend in zwei Portionen aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20 °C gelagert. (Handschuhe; Schutzbrille!) Materialien Waschpuffer: (20 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, 0.6 M Sorbitol.) 0,1 M PMSF in Ethanol.; Glaskugeln, Eis 4 Proteinbestimmung nach Bradford 1. Von jeder Probe werden je 1 µl und 2 µl in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß mit dest. Wasser auf 100 µl verdünnt, mit 1 ml Bradford-Reagenz versetzt und 2-5 min. bei RT inkubiert. Anschließend wird die Absorption der Proben bei 595 nm gegen eine Blindprobe (100 µl Waschpuffer plus 1 ml Bradford Reagenz) vermessen. Der Proteingehalt kann anhand einer Eichkurve abgelesen werden. 2. Sollten einige Absorptionswerte zu gering, zu hoch, zu variabel oder zweifelhaft ausfallen, sollte die Proteinbestimmung wiederholt werden. (o.K. der Assistenten einholen). Eine Gruppe erstellt eine Eichkurve für den Kurs. 2. Untersuchung des Wachstumsverhalten von Defektmutanten Im Versuch soll das Wachstumsverhalten folgender Stämme auf unterschiedlichen Wachstumsmedien verglichen werden: Hefestamm Info W303A Wildtyp cyt2∆ W303A; Deletion des Gens der Cytochrom c1 Hämlyase, eines Assemblierungsfaktors des respiratorischen Komplex III. aco1∆ W303A; Deletion des Gens der Aconitase des Zitratzyklus. Die Zellen sind auf einer Petrischale angezogen worden. Mit Hilfe einer sterilen Impföse werden die drei Stämme jeweils auf ein Drittel der folgenden Agarplatten transferiert: (1.) Vollmedium mit Glyzerin (YPGly) (2.) Vollmedium mit Glucose (YPD) (3.) Minimalmedium mit Glucose (SD) (Beschriftung nicht vergessen!) Die Platten werden bei 30°C inkubiert. Nach drei bis fünf Tagen wird das Wachstum der Zellen verglichen. Frage: Wie erklärt sich das unterschiedliche Wachstum der einzelnen Zellen? 5 3: Lokalisation der Fermentation, des Zitratzyklus und der Respiration: Enzymassays (1) Alkohol Dehydrogenase (Fermentation): Der Assay basiert auf der Absorptionsänderung von NADH bei 340 nm. (ε340 nm =6200 Mol-1 l cm-1) Reagenzien: ADH-Puffer (50 mM Tris, pH 8.0, 50 mM NaCl.); 50 mM NAD+; 100% Ethanol; Assay: Pipettieren Sie in eine Quarzküvette: ADH-Puffer: Ethanol: 50 mM NAD+: 930 µL 30 µL 30 µL Gut mischen (Rührspatel); Grundabsorption des Photometer bei 340 nm auf null setzen. 25 µg Mitoprep. bzw. 5 µg Lysat/PMS zufügen zufügen; Mischen und die Absorptionszunahme über 60 s aufzeichen. (2) Citrat-Synthase (Citratzyklus): Der Assay basiert auf der Absorptionsänderung von (DTNB) bei 412 nm. (ε412 nm = 13300 Mol-1 l cm-1) Reagenzien: CIT-Puffer (ADH-Puffer mit 0,1% Triton X100 und 0.5 mM DTNB (Stock in DMSO) Frisch zugeben!. 15 mg/ml Oxalacetat; 10 mg/ml Acetyl-CoA; Assay: Pipettieren Sie in eine Plastikküvette: CIT-Puffer: Acetyl-CoA: Oxalacetat: 970 µL 10 µL 10 µL Gut mischen (Rührspatel); Grundabsorption des Photometer bei 412 nm auf null setzen. 20 µg Mitoprep. bzw. 50 µg Lysat/PMS zufügen; mischen und die Absorptionszunahme über 90 s aufzeichen. 6 (3) Cytochrom oxidase (Respiration) Der Assay basiert auf der Absorptionsänderung von Cytochrom C bei 550 nm. (ε550 nm = 20000 Mol-1 l cm-1) Reagenzien: COX-Puffer (50 mM Mes,pH 6.5; 50 mM NaCl); 100 mM KCN (frisch ansetzen) 20 mg/ml reduziertes Cytochrom C. [Präparation: Zu 2,5 ml einer 20 mg/ml Cytochrom C Lösung in COX-Puffer werden 25 µl frisches 1 M Na-Dithionit zugefügt und für 2 min. auf Eis inkubiert. Überschüssiges Dithionit wird anschließend durch Gelfiltration mittels einer PD10 Säule, die mit COX-Puffer equilibriert wurde, entfernt. Ergibt 3,5 ml; Aliquotieren, in Stickstoff einfrieren und bei -20 0C lagern.] Assay: Pipettieren Sie in eine Plastikküvette: COX-Puffer: Cytochrom C: 950 µl 50 µl Gut mischen (Rührspatel); Grundabsorption des Photometers bei 550 nm auf null setzen. 10 µg Mitoprep. bzw. 50 µg Lysat/PMS zufügen. Mischen und die Absorptionsabnahme über 60 s aufzeichen. 10 µl 100 mM KCN zufügen und erneut 60 s messen. 4. Malat-Dehydrogenase (Citratzyklus): Der Assay basiert auf der Absorptionsänderung von NADH bei 340 nm. (ε340 nm =6200 Mol-1 l cm-1) Reagenzien: MDH-Puffer (ADH-Puffer + 0,1% Triton X100.); 10 mg/ml NADH; 5 mg/ml Oxalacetate; Assay: Pipettieren Sie in eine Quarzküvette: MDH-Puffer: Oxalacetat: NADH: 970 µL 10 µL 10 µL Gut mischen (Rührspatel); Grundabsorption des Photometers bei 340 nm auf null setzen. 25 µg Mitoprep. bzw. 25 µg Lysat/PMS zufügen. Mischen und die Absorptionsabnahme über 60 s aufzeichen. 7 Auswertung: Berechnen Sie die spezifische Aktivität (U/mg) des jeweiligen Enzyms in ihren Fraktionen und stellen Sie diese tabellarisch dar. In welchen Fraktionen reichert sich das jeweilige Enzym an? Kann eine eindeutige Zuordnung zu Mitochondrien bzw. Cytosol/PMS vorgenommen werden? Entspricht diese Ihren Erwartungen? 4: Oxidative Phosphorylierung Einführung Die bekannteste Funktion von Mitochondrien ist die Synthese von ATP durch die oxidative Phosphorylierung. In diesem komplexen Prozess wird die Energie der Oxidation von Nährstoffen und Metaboliten durch die Synthese von ATP gespeichert. Der Prozess kann in zwei funktionelle Bereiche aufgegliedert werden. 1. Die Elektronentransportkette dient zum Aufbau eines Membranpotentials an der inneren Mitochondrienmembran. Dabei werden Elektronen von reduzierten Substraten wie NADH über verschiedene Stufen auf molekularen Sauerstoff übertragen. Die hierbei gewonnene Energie wird zum Ausschleusen von Protonen in den Intermembranraum verwendet. 2. Die F1Fo-ATP Synthase nutzt den Rückfluß von Protonen aus dem Intermembranraum in die Matrix zur von ATP aus ADP und Phosphat. In diesem Versuchsteil soll die ATP-Syntheseleistung ihrer Mitochondrien in Abhängigkeit zweier unterschiedlichen Reduktionsmitteln, NADH und Succinat, untersucht werden. Darüber hinaus wird den Ansätzen zwei Inhibitoren, KCN, bzw. Malonat, zugegeben. Ihre Aufgabe ist es herauszufinden, an welcher Stelle diese beiden Inhibitoren in die oxidative Phosphorylierung eingreifen. Die Quantifizierung des gebildeten ATP erfolgt anschließend über das Enzym Luciferase entsprechend folgender Reaktion: Luciferin + ATP + O2 Oxoluciferin + AMP + Pyrrophosphat + CO2 + Licht Das emittierte Licht ist dem in der Probe vorhandenen ATP proportional und wird in einem Luminometer detektiert. 8 Reagenzien Puffer P: (40 mM MOPS pH 7.2; 500 mM Saccharose, 2 mM KH2PO4; 10 mM MgCl2; 2 mg/ml BSA.) 100 mM NADH; 10 mM ADP (ATP-frei); 50 mM Succinat; 50 mM Malonat; 200 mM KCN. ATP Nachweisreagenz (Luciferin, Luciferase; DTT). Pipettierschema: (50 µL Ansatz mit 40 µg Mitochondrien) Nummerieren sie 6 Reaktionsgefäße 1 - 6. Pipettieren sie an den Rand der Gefäße jeweils 25 µL Puffer P; 10 µL 10 mM ADP, und 11 (minus Volumen der Mitochondrien) µl Wasser. Pipettieren sie nun nach folgendem Schema: Gefäß: 1 2 3 Zugabe: 2 µL NADH 2 µL Wasser 2 µL NADH 2 µL KCN 2 µL NADH 2 µL Malonat Gefäß: 4 5 6 Zugabe: 2 µL Succinat 2 µL Wasser 2 µL Succinat 2 µL KCN 2 µL Succinat 2 µL Malonat Geben Sie anschließend 40 µg Mitochondrien in jedes Reaktionsgefäß und zentrifugieren sie kurz ab (< 5 s bei 7.000 rpm). Die Ansätze werden durch vorsichtiges Schnippen der Reaktionsgefäße resupendiert und gleichzeitig für 20 min. bei 30 0C inkubiert. Die Ansätze werden für 2 min bei 95 0C inaktiviert und anschließend auf Eis gestellt. Pipettieren Sie während der Inkubationspause in 2 Reaktionsgefäße: Probe 7: 25 µL Puffer P, 25 (minus Volumen der Mitochondrien) µl Wasser; Mitochondrien wie in 1-6. Probe 8: 25 µL Puffer P, 10 µL 10 mM ADP 20 µl Wasser; Die Ansätze werden für 2 min bei 95 0C inaktiviert und anschließend auf Eis gestellt. 9 ATP-Nachweis: Pipettieren Sie je 10 µl Wasser und 10 µl jedes Reaktionsansatzes in die Vertiefungen 1- 8 einer Mikrotiterplatte. Geben Sie 20 µl ATP Nachweisreagenz hinzu. (zügig arbeiten). Die Lumineszenz der Proben wird in einem Mikrotiterplatten-Leser über einen Zeitraum von 5 aufgezeichnet. Entnehmen Sie den ATP-Gehalt ihrer Proben einer am Kurstag zu erstellenden Eichkurve. (Bereich der Eichung: 10 µl einer 0.00001 – 0.01 mM ATP-Lösung; Tragen Sie die Eichkurve im Bereich ihrer Messergebnisse in der Form Lumineszenz / Stoffmenge ATP auf. Diese Eichkurve ist nicht linear.) Auswertung: Stellen Sie ihre Messergebnisse graphisch dar und berechnen Sie die spezifische ATP-Syntheserate (mU/mg Protein) ihrer mitochondrialen Fraktion. (Die Summe der Ansätze 7 und 8 spiegelt den Hintergrund der Messung wider und wird abgezogen.) Mit welchem Reduktionsmittel wird die höchste ATP Syntheserate erzielt? Wie ist das Verhalten der Inhibitoren zu erklären? An welcher Stelle greifen diese in die oxidative Phosphorylierung ein? Woher stammt die Energie zur ATP-Synthese in den KCN-behandelten Ansätzen? Literatur: 1. Keith Wilson and John Walker (2005): Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 6th Edition, Cambridge University Press. 2. Harvey Lodish et al. (2006): Molecular Cell Biology. 6th Edition, W.H. Freeman and Company; pp. 92ff, 391ff & 479ff. 10 Bestimmung der Cytochrome C Reduktionsrate 1. Pipettieren Sie in ein Reaktionsgefäß: Puffer 20 mg/ml Cytochrom c 20 % Succinat 230 µl 10 µl 3 µl 2. 10 µg Mitochondrien zufügen, mischen und sofort in die Vertiefung einer Mirkotiterplatte geben. 3. Die Absorptionsänderung wird in einem Plattenleser für zwei Minuten bei einer Wellenlänge von 550 nm aufzeichnen. Ermitteln Sie aus der Absorptionsänderung bei 550 nm die spezifische Aktivität ihrer Proben für die Succinat-Dehydrogenase (d.h. Cytochrom c Reduktion pro Minute und mg Protein. Einheit: [U/mg]). Der differentielle Extinktionskoeffizient (ε red - ε ox) von Cytochrom c beträgt bei 550 nm 20000 M-1 cm-1 (Lambert-Beer'sches Gesetz). Die Fläche der Vertiefung der Mikrotiterplatte beträgt 0,36 cm3. Lösungen: Puffer: 50 mM TRIS, pH 8.0; 50 mM NaCl, 1 mM KCN (frisch zugeben). 20 % Natrium-Succinat, pH 7.5; 20 mg/ml Cytochrom c (Pferdeherz)
