Funktion klassischer Cadherine an glutamatergen Synapsen

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ZUSAMMENFASSUNG
5 Zusammenfassung
Die in dieser Arbeit verwendete Methode der in vitro Differenzierung von ES-Zellen und die
nachfolgende Aufreinigung der aus ES-Zellen hervorgegangenen Neurone stellt ein wichtiges
Werkzeug zur Analyse von früh embryonal lethalen Deletionsmutationen dar, die ansonsten
keine Möglichkeit zur Untersuchung neuronaler Strukturen bieten. Es konnte in Vorarbeiten
gezeigt werden, dass die aus der in vitro Differenzierung hervorgegangenen Neurone
typische, exzitatorische Synapsen ausbilden und gut mit primärkultivierten cortikalen
Neuronen der Maus vergleichbar sind (Jüngling et al., 2003). Mittels dieser Methode konnten
in dieser Arbeit erstmals die homozygoten N- und E-Cadherindeletionsmutanten bezüglich
Synaptogeneseprozessen und synaptischer Transmission untersucht werden.
Die Analyse von N-Cadherin -/- Neuronen in homotypen Kulturen zeigte, dass die
Synapsenbildung an sich auch in Abwesenheit des synaptischen Adhäsionsmoleküls NCadherin abläuft. Mit zwei unterschiedlichen Methoden (Immuncytochemischer Nachweis
von Synapsin I und FM4-64 Färbungen) konnte deutlich gemacht werden, dass die
Synapsendichte auf den Dendriten der N-Cadherin -/- Neurone nicht verändert ist. Dies läßt
den Schluß zu, dass die initiale Synaptogenese auch über N-Cadherin-unabhängige
Mechanismen, die sowohl andere klassische Cadherine als auch andere Adhäsionsmoleküle
oder diffusible Faktoren beinhalten können, gesteuert werden kann.
Analysen der funktionellen Transmitterfreisetzungseigenschaften mittels aktivitätsabhängiger
Aufnahme des Farbstoffs FM4-64 und mittels elektrophysiologischer Ableitungen zeigten
Veränderungen der FM4-64 Freisetzungskinetiken und eine deutliche „paired-pulse“
Depression, sowie eine ausgeprägte synaptische Depression während hochfrequenter
Stimulationen. Dies deutet darauf hin, dass in Abwesenheit von N-Cadherin eine deutliche
Störung
der
Kurzzeitplastizität
an
exzitatorischen
Synapsen
vorliegt.
Da
die
Kurzzeitplastizität eine Art Gedächtnis des Aktivitätslevels einer Synapse darstellt, hat eine
Veränderung dieser Aktivitätsintegration Folgen für die Informationsweiterleitung an
nachgeschaltete Neurone. Durch die massive „paired-pulse“ Depression und die vorzeitige
Depletion des RRPs an N-Cadherin -/- Synapsen sinkt die Wahrscheinlichkeit
Aktionspotential-kodierte Informationen innerhalb eines Netzwerkes an nachgeschaltete Ziele
weiterzugeben.
Desweiteren
zeigten
N-Cadherin
defiziente
Neurone
in
langen
Aktivitätsphasen einen Verlust der synchronen Transmitterfreisetzung an exzitatorischen
Synapsen. Eine derart drastische Änderung der Freisetzungskinetik spricht für eine
dramatische Veränderung der präsynaptischen Struktur. Insgesamt deuten beide Befunde
darauf hin, dass an N-Cadherin -/- Synapsen die Bereitstellung fusionskompetenter Vesikel in
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ZUSAMMENFASSUNG
Phasen erhöhter Aktivität deutlich reduziert ist. N-Cadherin scheint also die Struktur junger
glutamaterger Synapsen zu stabilisieren und eine koordinierte Transmission zu gewährleisten.
Analysen der synaptischen Transmission an glutamatergen Synapsen in chimären Kulturen
zwischen N-Cadherin -/- Neuronen und EGFP-coWT Neuronen zeigten, dass zur effektiven
Stabilisierung der präsynaptischen Struktur eine homophile, transsynaptische Interaktion von
prä-
und
postsynaptisch
exprimierten
N-Cadherinmolekülen
notwendig
ist.
Der
postsynaptische Verlust von N-Cadherin induziert in N-Cadherin exprimierenden
Präsynapsen vergleichbare Veränderungen der Transmissionseigenschaften, wie sie in
homotypen N-Cadherin -/- Kulturen beobachtet werden konnten.
Die Analyse der synaptischen Transmission an glutamatergen Synapsen in E-Cadherin -/Neuronen in homotypen Kulturen zeigte, dass E-Cadherin ebenfalls eine, wenn auch weniger
stark ausgeprägte, stabilisierende Funktion bei der Transmitterfreisetzung zukommt. Obwohl
in der Literatur an hippocampalen Neuronen ein unterschiedliches Expressionsmuster von Nund E-Cadherin an Synapsen gezeigt wird und auf Grund dieser Daten eine Funktion von ECadherin an glutamatergen Synapsen eher unwahrscheinlich erschien, konnte in dieser Arbeit
jedoch gezeigt werden, dass deutliche Unterschiede zwischen E-Cadherin defizienten und
entsprechenden Kontrollen bezüglich der Transmissionseigenschaften an glutamatergen
Synapsen vorliegen.
Die zusätzliche Analyse chimärer Kulturen unterschiedlicher Genotypen ergab Hinweise auf
einen
auf
der
N-Cadherinexpression
basierenden
Mechanismus
zur
selektiven
Synapsenbildung zwischen Neuronen mit unterschiedlicher Cadherinausstattung. In zwei
unabhängigen Experimentreihen kam es zwischen präsynaptischen N-Cadherin -/- Neuronen
und postsynaptischen N-Cadherin +/+ Neuronen (EGFP-coWT Neuronen bzw. E-Cadherin -/Neuronen) zu einer funktionell sehr ineffektiven Innervation der Zielneuronen, während es in
allen anderen Kombinationen zu einer wesentlich effektiveren Innervation kam. Aus diesen
Ergebnissen ergibt sich die Hypothese, dass die Innervation einer Zielzelle oder eines ganzen
„Zielareals“ eher durch die Proteinausstattung des Zielareals als durch die Proteinausstattung
des einwachsenden Axons determiniert wird. Abhängig von der Cadherinexpression läßt das
Zielneuron demnach eine Synapsenbildung zu und wird nicht durch das Axon auserwählt.
Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass Cadherine eine wichtige Rolle bei der selektiven
Verschaltung innerhalb kleinerer Netzwerke übernehmen. Es ist wahrscheinlich, dass sich
diese Erkenntnisse auch auf größere Strukturen des ZNS übertragen lassen. Desweiteren
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werden junge glutamaterge Synapsen durch N-Cadherin stabilisiert, was eine effektive,
koordinierte Informationsweitergabe innerhalb von neuronalen Netzwerken gewährleistet.
Neben vielen Erkenntnissen zur N-Cadherinfunktion hat diese Arbeit auch eine Reihe neuer
Fragen aufgeworfen, die weitergehende Detailanalysen erfordern. In an diese Arbeit
angeschlossene
Experimente
sollten
die
Auswirkungen
der
unterschiedlichen
Cadherinexpression in chimären Kulturen bezüglich spezifischer Verschaltungsmuster
analysiert werden. Die Auswirkungen der N-Cadherin Defizienz in einem Teil der Neurone
auf Phänomene wie „feedback-inhibition“ oder rekurrente Erregung und die damit
einhergehende Änderung von Aktivitätsmustern bedürfen einer eingehenden Untersuchung.
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