Regulatorische Mechanismen in der Signaltransduktion kleiner

ZUSAMMENFASSUNG
6
Zusammenfassung
In vielen Signaltransduktionsprozessen spielen die kleinen GTPasen der Rho-Familie eine
entscheidende Rolle und fungieren hierbei als Organisatoren des Aktinzytoskeletts oder
können als Regulatoren der Genexpression und der Kontrolle des Zellzyklus wirken.
Diese Funktionen üben sie als molekulare Schalter aus, indem sie durch spezifische
zelluläre Lokalisation eine ortsgebundene und zeitlich begrenzte Aktivierung eines oder
mehrerer Signalwege bewirken. Die Schalterfunktion wird durch die Rho regulatorischen
Proteine
der
Klassen
der
Guaninnukleotidaustauschfaktoren
(GEFs),
GTPase
aktivierenden Proteine (GAPs) und Guaninnukleotiddissoziationsinhibitoren (GDIs) in
ihrem Aktivitätsstatus moduliert. Sie bilden ein Regulationsnetzwerk aus, das eingehende
externe Signale integriert, die dann zu einer Gleichgewichtsverschiebung innerhalb des
Netzwerks führen und sukzessiv die Aktivierung bzw. Abschaltung eines oder mehrerer
durch Rho GTPasen kontrollierten Signalwege bewirken. Die Aktivierungsmechanismen
der Rho regulatorischen Proteine sind ein bislang wenig beachtetes wissenschaftliches
Feld, das allerdings im Bezug auf Krankheiten, die mit diesen oder den Rho-Proteinen
assoziiert sind ein großes therapeutisches Potential besitzt.
Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation einiger GEF- und GAP-Proteine detailliert zu
untersuchen, wobei die hierfür notwendigen Methoden teilweise noch etabliert werden
mussten.
Die GEF-Proteine der Pix-Unterfamilie sind in dem Sinne besonders, dass ihre
katalytische Domäne keine Nukleotidaustauschaktivität in vitro und in vivo zeigt. Aus
diesem Grund konnte auch keine Spezifität der GEF-Funktion für eine der zahlreichen
untersuchten Rho-Mitglieder beobachtet werden. Stattdessen wurde eine Regulation der
katalytischen Funktion durch Modifikationen wie Phosphorylierung oder die Bindung
weiterer Proteine in Betracht gezogen. Eine direkte Modifikation in der DH-Domäne,
wenn
sie
denn
stattfindet,
führt
jedoch
nicht
zu
einer
Stimulation
der
Nukleotidaustauschreaktion. Ebenso ist die direkte Bindung des Effektors PAK1 an Pix
und eine hypothetische Phosphorylierung durch dessen Kinase-Domäne nicht in der Lage
eine Aktivierung der GEF-Funktion herbeizuführen. Ergebnisse anderer Arbeitsgruppe
deuten inzwischen auf einen sehr komplexen Regulationsmechanismus hin, der die
Dimerisierung sowie die Bindung weiterer Helferproteine involviert, und je nachdem
welcher Zustand (Monomer oder Dimer) gerade erreicht ist, findet eine Aktivierung von
Cdc42 oder Rac1 statt. Zudem hat aktives Cdc42 oder aktives Rac1 einen
stimulatorischen bzw. inhibitorischen Effekt auf die Austauschaktivität von α-Pix, was
125
ZUSAMMENFASSUNG
andeutet, dass dieses Protein nicht wie ein klassisches GEF als Aktivator multipler
GTPase-Moleküle fungiert. Infolgedessen und aufgrund der Existenz weiterer
Bindungspartner ist eine Rolle der Pix-Proteine als Gerüstprotein ebenfalls nicht
auszuschließen.
Zur fluoreszenzspektroskopischen Bestimmung von Rho GTPase-RhoGAP-Interaktionen,
wurde in dieser Arbeit das fluoreszenzmarkierte Nukleotid tamraGTP synthetisiert, das
die besondere Eigenschaft besitzt als Sensor des nukleotidgebundenen Zustands zu
dienen. In der GTP-gebundenen Konformation ist das Fluoreszenzsignal höher als im
GDP-gebundenen Zustand. Hierdurch ist es möglich sowohl die intrinsische, als auch die
GAP stimulierte GTP-Hydrolysereaktion in Echtzeit qualitativ und quantitativ zu
analysieren. Dies trifft neben Rho- auch auf Ras-Proteine zu, nicht jedoch auf andere
Guaninnukleotid-bindende Proteine wie Ran, Ypt1, Gα,i, Ef-Tu und EF-G. Zudem kann
mit Hilfe dieses Nukleotids die Bildung des Übergangszustands der GTPHydrolysereaktion spektroskopisch verfolgt werden. Die Affinität des tamra modifizierten
Nukleotids für Rac1 ist vergleichbar mit der für mant-Nukleotide und stellt eine
hochaffine Bindung im picomolaren Bereich dar. Alle Untersuchungen deuten darauf hin,
dass die relativ sperrige Tetramethylrhodamingruppe keinen Einfluss auf die intrinsischen
wie auch die enzymatisch stimulierten Prozesse der Nukleotiddissoziation und GTPHydrolyse ausübt. Somit ist tamraGTP ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung
GTP/GDP-bindender Proteine. Modelling Studien geben außerdem eine gute Erklärung
für die beobachteten Prozesse, wobei die Fluorophorgruppe mit Aminosäuren der switch I
Region im aktiven Zustand interagiert und diese Wechselwirkungen bei GTP-Hydrolyse
aufgehoben werden. Im Fall des GTPase•GAP-Komplexes scheint das Ribose-gekoppelte
Fluorophor hingegen in einer Furche zwischen beiden Molekülen positioniert zu sein, und
die beobachtete Fluoreszenzänderung kommt vermutlich durch die Assoziation bzw.
Dissoziation des GAP-Proteins nach Abspaltung des γ-Phosphats zustande.
Für die Rho GTPase aktivierenden Proteine der Oligophrenine konnte in dieser Arbeit ein
autoregulatorischer Mechanismus zur Kontrolle ihrer GAP-Funktion entschlüsselt
werden. Bei diesen Proteinen findet eine Inhibition der GAP-Aktivität durch die Nterminale Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) Domäne statt. Diese Autoinhibition konnte durch
mehrere Methoden bestätigt werden, z.B. durch vergleichende in vitro und in vivo
Aktivitätsmessungen von Proteinkonstrukten unterschiedlicher Domänenzusammensetzung, durch proteolytischen Verdau inhibierter Konstrukte und anschließende
Aktivitätsmessung, sowie durch Rekonstruktion der Autoinhibition in trans mittels der
isolierten interagierenden Domänen. Die Affinität zwischen GAP-Domäne und der
126
ZUSAMMENFASSUNG
inhibitorischen BAR-PH-Domäne liegt im mittleren mikromolaren Bereich (21µM), ist
im Wildtyp Protein durch die lokale Nähe beider Motive aber vermutlich deutlich höher.
Die Interaktion zwischen GAP- und BAR-Domäne ist dabei sehr spezifisch, denn sie
findet, mit Ausnahme der inhibitorischen Wirkung von OPHN1 BAR-PH auf Graf1 GAP,
nur zwischen den beiden Domänen eines Proteins statt. Ebenso sind BAR-Domänen
offensichtlich keine universellen Inhibitoren GTPase aktivierender Proteine, denn sie
können die katalytischen Domänen anderer GAP-Proteine nur unwesentlich in ihrer
Aktivität modulieren. Das Signal oder der aktivierende Faktor, der zur Unterbrechung der
Autoinhibition und somit zur Aktivierung der GAP-Funktion der Oligophrenine in der
Zell führt, konnte bislang nicht identifiziert werden, obwohl viele potentielle
Möglichkeiten
wie
die
Bindung
aktiver
GTPasen,
die
Rekrutierung
an
Liposomenmembranen, die Bindung des Adapterproteins Homer oder die Anwesenheit
von filamentösem Aktin untersucht wurden. Die inhibitorische N-terminale Domäne der
Oligophrenine ist aufgrund ihrer biologischen Tubulationsaktivität als BAR-Domäne
klassifiziert worden, und diese Fähigkeit ist im cis- und trans-inhibierten Zustand nicht
beeinträchtigt. Aufgrund dessen kann davon ausgegangen werden, dass die Bindung der
GAP-Domäne an die BAR-Domäne nicht auf der konkaven Membranbindungsseite
stattfindet, sondern auf der abgewandeten konvexen Seite. Abschließend konnte aus den
Ergebnissen ein Modell der autoinhibitorischen Regulation der Oligophrenin ähnlichen
Proteine erstellt werden.
127