Einfluss einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten
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Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten und die Spermaqualität von Warmbluthengsten INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Holger Tesche aus Braunschweig Hannover 2013 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. H. Sieme Klinik für Pferde Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken 1. Gutachter: Prof. Dr. H. Sieme 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Bollwein Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2013 Ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen Meiner Familie Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung................................................................................ 11 2 Literaturübersicht................................................................... 13 2.1 Magnetfeldtherapie unter medizinischen Gesichtspunkten................13 2.1.1 Historische Entwicklung........................................................................ 13 2.1.2 Physikalische Grundlagen..................................................................... 15 2.1.3 Anwendungsgebiete und mögliche Wirkmechanismen......................... 16 2.2 Methodik und Verfahren der Spermauntersuchung und Qualitätsbeurteilung................................................................................ 17 2.2.1 Samenuntersuchung............................................................................. 17 2.2.2 Makroskopische Untersuchungen......................................................... 18 2.2.3 Mikroskopische Untersuchungen.......................................................... 19 2.2.3.1 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA).................................... 20 2.2.4 Durchflusszytometrie............................................................................. 21 2.2.4.1 Sperm-Chromatin-Structure-Assay (SCSA)……………….................... 22 2.3 Variabilität der Qualitätsmerkmale von Hengstsperma und der Sexualparameter......................................................................................22 2.3.1 Deckverhalten....................................................................................... 22 2.3.2 Einfluss des Alters................................................................................. 23 2.3.3 Einfluss der Jahreszeit.......................................................................... 24 3 Material und Methoden.......................................................... 29 3.1 Versuchshengste..................................................................................... 29 3.2 Medithera Vet-System M-1000…………………………............................ 29 3.3 Versuchsaufbau....................................................................................... 30 3.4 Samengewinnung und Untersuchung des Deckverhaltens................ 30 3.4.1 Untersuchung des Deckverhaltens....................................................... 30 3.4.2 Samengewinnung..................................................................................31 3.5 Dichtemessung und Bestimmung der Viabilität mittels NucleoCounter®...................................................................................... 32 3.6 Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate....................................................... 32 3.7 Flowzytometrische Bestimmung der Chromatinintegrität (SCSA)..... 33 3.7.1 Geräte und Geräteeinstellungen........................................................... 33 3.7.2 Messprinzip und Durchführung der Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA)..........................................33 3.8 Durchführung der computerassistierten Spermienmotilitätsanalyse (CASA)....................................................... 34 3.9 Statistische Auswertungen.................................................................... 35 4 Ergebnisse.............................................................................. 41 4.1 Bestimmung des Einflusses einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten durch Zeitmessung bei der Samenentnahme...................................................................................... 41 4.2 Untersuchungen zum Einfluss gepulster Magnetfelder auf die Spermaqualität......................................................................................... 49 4.2.1 Ergebnisse zum Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die Gesamtspermienzahl, den Anteil Plasmamembranintakter Spermien und den Anteil progressiv motiler Spermien unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität................................. 49 4.2.2 Ergebnisse zum Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die Spermienmorphologie und die Chromatinintegrität unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität................................. 61 5 Diskussion.............................................................................. 69 5.1 Darstellung der Versuchsziele............................................................... 69 5.2 Effekte der gepulsten Magnetfeldtherapie, des Alters und des Behandlungsabschnitts auf das Deckverhalten von Hengsten.......... 69 5.3 Effekte der gepulsten Magnetfeldtherapie auf die untersuchten spermatologischen Parameter............................................................... 71 5.4 Effekte des Alters und des Behandlungsabschnitts auf die untersuchten spermatologischen Parameter....................................... 72 6 Zusammenfassung................................................................. 74 7 Summary................................................................................. 76 8 Literaturverzeichnis............................................................... 78 9 Anhang.................................................................................... 91 9.1 Abbildungsverzeichnis........................................................................... 91 9.2 Tabellenverzeichnis................................................................................ 96 10 Danksagung............................................................................ 97 Abkürzungsverzeichnis ® eingetragenes Warenzeichen ™ registered Trademark °C Temperatur in Grad Celsius % Prozent Abb. Abbildung ALH Amplitude of lateral Head Displacement (Amplitude seitlicher Kopfauslenkung) B magnetische Flussdichte BCF Beat-Cross-Frequency (Frequenz des seitlichen Kopfausschlages) ca. circa CASA Computer assisted sperm analysis bzw. beziehungsweise d.h. das heißt DAP Distance Average Path (Mittlere Strecke auf der geglätteten Bahn) DCL Distance Curve Line (Kurvolineare Strecke) DFI DNA-Fragmentationsindex DNA Desoxyribonukleinsäure DSL Distance Straight Line (Strecke der direkten Verbindung vom Anfangszum Endpunkt) EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat EMF elektromagnetische Felder et al. et alii Fa. Firma FDA Food and Drug Administration Fig. Figur FITC Fluoreszeinisothiocyanat FN Fédération Equestre Nationale (Deutsche Reiterliche Vereinigung) FSH Follikel-stimulierendes Hormon G Gauß (physikalische Einheit) g Gramm ggr. geringgradig GnRH Gonadotropin-Releasing Hormon h Stunde H Vektor der magnetischen Feldstärke Hz Hertz Ie elektrische Stromstärke i.d.R. in der Regel Jh.v.Chr. Jahrhundert vor Christus KB künstliche Besamung kg Kilogramm I Liter L Länge LH Luteinisierendes Hormon LIN Linearity (VSL/VCL) M Molar MfT Magnetfeldtherapie Min. Minute ml Milliliter mM Millimolar mOsm Milliosmol mW Milliwatt µI Mikroliter µT Mikrotesla µ0 magnetische Induktionskonstante n Probandenzahl N Anzahl der Spulenwindungen nM Nanometer NSAID nonsteroidal antiinflammatory drugs (nichtsteroidale Antiphlogistika) PBS Phosphate buffered saline PEMF pulsierende elektromagnetische Felder PI Propidiumiodid PNA Peanut-Agglutinin s. siehe SCSA Sperm-Chromatin-Structure-Assay (Spermachromatinstrukturanalyse) sec. Sekunde SI Système international d‘ unités (Internationales Einheitensystem) STR Straightness (VSL/VAP) T Tesla Tab. Tabelle VAP Velocity Average Path (Mittlere Geschwindigkeit auf der geglätteten Bahn) VCL Velocity Curve Line (Kurvolineare Geschwindigkeit) VSL Velocity Straight Line (Geschwindigkeit auf direkter Strecke vom Anfangs- zum Endpunkt) z.B. zum Beispiel Einleitung 1. Einleitung In den vergangenen Jahren ist in der deutschen Pferdezucht (Warmblut) ein nicht unerheblicher, stetiger Abfall der Bedeckungszahlen von durchschnittlich ca. 45.000 Bedeckungen in den Jahren 2000 bis 2009 auf noch 35.642 Bedeckungen im Jahr 2011 (Jahresbericht FN 2011) zu verzeichnen. Dabei liegt der Besamungsanteil (Frischsamen und Tiefgefriersamen) bei über 80%. In der Warmblutzucht besteht daher weiterhin großes Interesse daran Hengste zur Verfügung zu stellen, die sich durch eine gute Spermaqualität auszeichnen, da oft nur wenige vielversprechende Hengste genutzt werden, die sich bereits züchterisch bewährt oder sich durch sportliche Erfolge ausgezeichnet haben. Weiterhin ist es wichtig Hengstsperma innerhalb kürzester Zeit, zum Teil über große Entfernungen, zur Verfügung zu stellen. Dies wird einerseits durch die Herstellung von Tiefgefriersperma möglich, andererseits durch den Versand flüssigkonservierten Spermas (+5°C, KB 24-36 h nach Samengewinnung), dessen Verwendung sowohl höhere Erfolgsaussichten bietet als auch den Versand in das Ausland ermöglicht und daher das aktuell überwiegend eingesetzte Verfahren ist. Die Existenz des Magnetismus war den Griechen bereits im 5. Jh. v. Chr. bekannt. In China nutzte man magnetische Mineralien bereits im 11. Jh. v. Chr. zur allgemeinen Behandlung von körperlichen Gebrechen und Krankheiten jeglicher Art (HOHLOCH 2009). Im letzten Jahrhundert führte dann die Entdeckung der piezoelektrischen Eigenschaften von Knochen, d.h. dass messbare elektrische Potentiale bei mechanischer Belastung in Knochengewebe entstehen, durch FUKADA und YASUDA (1957) zu einem Neubeginn der Arbeit mit Magnetfeldern in der Humanmedizin. Betrachtet wurden dabei zunächst die Behandlungsmöglichkeiten von Frakturen, Arthrosen (besonders Knie- und Hüftgelenksarthrosen) und die Behandlung von Wundheilungsstörungen. In der Veterinärmedizin ist der Einsatz gepulster, d. h. frequenzmodulierter Magnetfelder aktuell eher von untergeordneter Bedeutung. Firmen die Magnetfeldsysteme ursprünglich für die Anwendung im humanmedizinischen Bereich hergestellt haben, stellen ähnliche Systeme jedoch 11 Einleitung zunehmend für den Einsatz in der Veterinärmedizin her. Bisher sind viele Untersuchungen in der Humanmedizin durchgeführt wurden, die in einigen Bereichen (z. B. Schmerzreduktion, schnellere Frakturheilung) einen positiven Einfluss dieser Therapieform zeigen. In Bezug zu den Wirkmechanismen auf zellulärer oder molekularer Ebene sind die Aussagen vieler Autoren wissenschaftlicher Studien jedoch oft widersprüchlich. Häufig wird die mangelhafte wissenschaftliche Erforschung und Dokumentation kritisiert (SCHUFRIED et al. 2005, PIEBER et al. 2007, HUG und RÖÖSLI 2012), bzw. werden Wirkmechanismen als nicht bekannt beschrieben (CHENG 1985, FARNDALE et al. 1987, BLANK und GOODMANN 1997, SMITH et al. 2004). Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum einen festzustellen, ob eine bei Hengsten angewandte Magnetfeldtherapie eine positive Beeinflussung der Tiere in Bezug auf ihre Deckfähigkeit bewirkt. Diese wurde durch Zeitmessung im Sprungraum und durch zusätzliche Beurteilung der Anzahl der Aufsprünge, die bis zur Ejakulation benötigt wurden, bestimmt. Zum anderen sollte eine Aussage über den Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die Spermaqualität anhand ausgewählter spermatologischer Parameter getätigt werden. Da bekannt ist, dass Reproduktionsparameter wie z.B. das Sexualverhalten oder die Spermaqualität und -quantität durch das Alter der Tiere und die Jahreszeit beeinflusst werden (PICKETT et al. 1976, JOHNSON und NEAVES 1981, JOHNSON und THOMSON 1983, JANETT et al. 2003, BLANCHARD et al. 2012), wurde auch untersucht, ob diesbezüglich Effekte in dieser Arbeit festgestellt werden können. 12 Literaturübersicht 2. Literaturübersicht 2.1 Magnetfeldtherapie unter medizinischen Gesichtspunkten 2.1.1 Historische Entwicklung Bezüglich der Verwendung von Magnetfeldern zu therapeutischen Zwecken kann bereits auf eine lange geschichtliche Entwicklung zurückgeblickt werden. Schon in der Antike, vornehmlich in China und Griechenland, kamen magnetische Mineralien zum Einsatz, denen allgemein wohltuende Wirkungen zugesagt wurden (SALOMONOWITZ et al. 2011, MARKOV 2007b). Im 18. Jahrhundert geriet das Verfahren jedoch durch die zu dieser Zeit wissenschaftlich umstrittenen Anwendungsmethoden des deutschen Arztes und Theologen Franz Anton Mesmer in Verruf und wurde von der damaligen Schulmedizin als unwirksam angesehen (AMMER 2004). Ende der fünfziger Jahre des letzten Jahrhunderts wurde durch FUKADA UND YASUDA (1957) der piezoelektrische Effekt in Knochengewebe nachgewiesen. Diese zeigten, dass es unter mechanischer Belastung zu Ladungsverschiebungen innerhalb der kollagenen Knochenmatrix kommt und somit elektrische Potentiale gemessen werden können (BASSET et al. 1974, CRUESS et al. 1983). Die Bedeutung dieser Ladungsverschiebungen ist nicht abschließend geklärt. Dennoch wird ihnen eine gewisse Rolle bei der Heilung von Frakturen zugesprochen, da auch beim natürlichen Heilungsprozess von Frakturen elektrische Ströme messbar sind (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000). Seit den 1970er Jahren wuchs vermehrt das Interesse daran, elektromagnetische Felder (EMF) zu therapeutischen Zwecken einzusetzen (MARKOV 2007b). Die frühen Arbeiten befassten sich hauptsächlich mit der beschleunigten Heilung von Frakturen durch elektromagnetische Felder im Gegensatz zu einer Behandlung mittels konservativer Therapie, beispielsweise durch Ruhigstellung mit Hilfe von Gips- oder CastVerbänden (BASSETT et al. 1974). Die FDA (Food and Drug Administration), die in Amerika für die Zulassung neuer Verfahren im Gesundheitswesen zuständig ist, lies 1979 erstmals die Anwendung von pulsierenden elektromagnetischen Feldern 13 Literaturübersicht (PEMF) als medizinische Therapieform für die Heilung von Frakturen zu (BASSETT 1982, 1993, JAHNS et al. 2007, MARKOV 2007b). Wesentliche Schwerpunkte der Forschung bezüglich der klinischen Nutzung von pulsierenden Magnetfeldern lagen in den letzten zwanzig Jahren sowohl in der Behandlung von Frakturen, Knochennekrosen und Pseudarthrosen, als auch in der Behandlung von Wundheilungsstörungen und Erkrankungen des Bewegungsapparates (MARKOV 2007a, HUG und RÖÖSLI 2012). Seit den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden auch vereinzelt Studien im Bereich der Veterinärmedizin durchgeführt. Dabei erschien unter anderem eine Studie von WATKINS et al. (1985), die den Einfluss von PEMF bezüglich des Heilungsverlaufs bei Verletzungen der oberflächlichen Beugesehne bei Pferden überprüften. Dabei konnten sie keine positive Beeinflussung durch die PEMFBehandlung bezüglich des generellen Heilungsverlaufs und der Reorganisation des geschädigten Sehnengewebes feststellen. Die Vaskularisation im behandelten Gewebe stellte sich geringgradig verbessert dar. KOLD et al. (1987) begutachteten bei Ponys wie sich die Wiedereingliederung von Knochentransplantaten unter dem Einfluss von PEMF entwickelte. Hierbei trat keine signifikante Verbesserung der Heilungsrate in der mit PEMF behandelten Versuchstiergruppe auf. SANDERSSHAMIS et al. (1989) untersuchten den Heilungsverlauf chirurgisch induzierter Osteotomien des Metakarpus bzw. des Metatarsus bei Pferden unter PEMF Einfluss. Auch in dieser Studie konnte keine positive Beeinflussung der Heilungsrate der behandelten Tiere gegenüber den Tieren der unbehandelten Kontrollgruppe gefunden werden. SHAFFORD et al. (2002) untersuchten, ob die Anwendung von PEMF bei Hunden nach einer Ovariohysterektomie zu einer Schmerzreduktion führt. Dies konnte unter den Bedingungen der Studie nicht nachgewiesen werden. PINNA et al. (2012) überprüften die Beeinflussbarkeit der funktionellen Beweglichkeit und des Schmerzempfindens bei Hunden mit Osteoarthritis. Dabei führte sowohl die Behandlung mit PEMF als auch die Behandlung der Kontrollgruppe mit einem nichtsteroidalen Antipholgistikum Bewegungsfähigkeit der Tiere und (NSAID) somit 14 zu auch einer zu einer Besserung Reduktion der des Literaturübersicht Schmerzempfindens. Zudem stellte sich ein verbesserter Langzeiteffekt der PEMFTherapie gegenüber der Behandlung mit einem NSAID heraus. 2.1.2 Physikalische Grundlagen Um die Wirkungsweise niederfrequenter pulsierender („gepulster“) Magnetfelder bezüglich ihrer physikalischen Eigenschaften zu charakterisieren, gilt es einige physikalische Parameter (s. Tab. 2.1) zu betrachten (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000). Die Erzeugung eines Magnetfeldes wird erreicht, indem Drahtspulen von elektrischem Strom durchflossen werden. Die Feldlinien die dabei die Magnetspule umgeben werden durch den Vektor der magnetischen Feldstärke H beschrieben, der in Henry (in Ampere/Meter) gemessen wird (QUITTAN 2004). Die Feldstärke H erzeugt einen magnetischen Fluss. Die magnetische Flussdichte B (in Tesla) wird auch als magnetische Induktion bezeichnet. Sie lässt sich unter Einbeziehung der magnetischen Induktionskonstante µo (4 10-7 Newton/Ampere2) aus der Stromstärke Ie (in Ampere), der Länge des Spulendrahtes L (in Metern) und der Anzahl der Spulenwindungen N berechnen: B = N x Ie x µo/L (FISCHER et al. 2002). Die frühere Einheit der magnetischen Flussdichte war das Gauß (G), die heutige SI-Einheit wird in Tesla (T) angegeben. Dabei entspricht 1 Tesla 10.000 Gauß bzw. 1 Gauß 0,1 Millitesla. Die magnetische Flussdichte B nimmt mit dem Quadrat des Abstandes vom Entstehungsort ab (PIEBER et al. 2007, QUITTTAN 2004). Die magnetische Flussdichte des Erdmagnetfeldes liegt in etwa bei 30-60 µT. Handelsübliche Geräte verwenden i.d.R. Magnetfeldstärken die ebenfalls im Mikroteslabereich liegen, wenige gehen darüber hinaus bis in den Milliteslabereich (FISCHER et al. 2002, QUITTAN 2004, HUUG und RÖÖSLI 2012). Für die Wirksamkeit der Magnetfeldtherapie (MFT) ist der einzelne magnetische Impuls auschlaggebend. Er ist gekennzeichnet durch die Impulsamplitude und die Impulsdauer. In Kombination mit einer entsprechenden Impulsfrequenz, die die Anzahl der Impulse pro Zeiteinheit angibt und in Hertz (Hz) gemessen wird, können verschiedene Impulsformen entstehen. Abb. 2.2 zeigt unterschiedliche Impulsformen, die in bisherigen Studien verwendet wurden (WATKINS et al. 1985, MARKOV 2007b). Die Höhe der am häufigsten verwendeten Frequenzen liegt nach HUUG und RÖÖSLI (2012) bei ca. 5-300 Hz und nach FISCHER et al. (2002) bei 1-100 Hz. Bei der MFT handelt es sich 15 Literaturübersicht um ein nicht thermisches Verfahren (BASSETT 1987), d.h. das induzierte Gewebe wird keiner Erwärmung ausgesetzt. Zur Induktion von Hitze kommt es nur bei der Anwendung hochfrequenter, nicht-ionisierender Wellen (109-1011 Hz) (BLANK 1995). Als wesentlicher Faktor bezüglich einer tatsächlichen biologischen Beeinflussbarkeit des behandelten Gewebes wird die Anstiegs- bzw. Abfallszeit der einzelnen Impulse benannt, da es nur in diesem Zeitraum zu Ladungsverschiebungen innerhalb des Gewebes kommen kann. Dabei fällt die im Gewebe induzierte Feldstärke umso höher aus, je steiler der Flankenanstieg oder –abfall ist (SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000, MARKOV 2007b). BASSETT (1987), CHENG (1985) und MARKOV (2007b) erwähnen in diesem Zusammenhang den Begriff der „biologischen Fenster“. Hiermit sind der Frequenzbereich, die Frequenzform, die Amplitude und die Magnetfeldstärke gemeint, in denen ein nachweislicher Effekt tatsächlich erzielt wird. 2.1.3 Anwendungsgebiete und mögliche Wirkmechanismen Seit ca. fünfzig Jahren ist die Magnetfeldtherapie in ihren verschiedenen Formen als Heilmethode bekannt. Sie gilt als alternative Behandlungstechnik gegenüber der Schulmedizin und verspricht als sichere, nicht invasive und einfach anzuwendende Methode Besserung bei einer Vielzahl von Erkrankungen (BASSETT 1993, MARKOV 2007b, SALOMONOWITZ et al. 2011). Ein konkreter wissenschaftlich abgesicherter Nachweis zur Wirksamkeit der Magnetfeldtherapie auf zellulärer bzw. molekularer Ebene wurde bisher noch nicht erbracht (BLANK und GOODMAN 1997, CHENG 1985, FARNDALE et al. 1987, GOODMANN und HENDERSON 1988, AMMER 2004, SMITH et al. 2004). Die am häufigsten erforschten Wirkmechanismen und Anwendungsgebiete gepulster magnetischer Felder sind: (1) der Einfluss auf die Osteogenese und die damit in Zusammenhang stehende Anwendung bei der Behandlung von Frakturen (BASSETT et al. 1974, BASSETT 1987, HANNAY et al. 2005), (2) der Einfluss bezüglich einer Schmerzreduktion mit einhergehender Bewegungseinschränkung und (3) der Einfluss bezüglich einer möglichen verbesserten Wundheilung (SCHUHFRIED et al. 2005). Die wohl am häufigsten auf zellulärer und molekularer Ebene erforschten Gebiete der Wirkmechanismen der Magnetfeldtherapie sind: (1) die Beeinflussung von Membraneigenschaften, hauptsächlich der Na+/K+-ATPase (FARNDALE et al. 16 Literaturübersicht 1987, MARKOV 2007b), die für die Aufrechterhaltung des Membranpotentials verantwortlich ist; (2) die direkte Einwirkung auf die DNA (BLANK und GOODMAN 1997, CHENG 1985); und (3) die Beeinflussung der Proteinbiosynthese (BLANK und GOODMAN 2004, GOODMAN und HENDERSON 1988). 2.2 Methodik und Verfahren der Spermauntersuchung und Qualitätsbeurteilung 2.2.1 Samenuntersuchung Die Untersuchung des Spermas stellt ein wichtiges Kriterium bei der Beurteilung der Zuchttauglichkeit dar. Anhand qualitativer und quantitativer spermatologischer Parameter soll eine Prognose bezüglich der Befruchtungsfähigkeit des Samens abgegeben werden (WABERSKI et al. 1999) Dabei sind an das Ejakulat eines Hengstes gewisse Mindestanforderungen zu stellen (MERKT und KLUG 1989). Routinemäßig werden daher Parameter untersucht, die bereits seit einigen Jahrzehnten zur konventionellen Beurteilung von Ejakulaten eingesetzt werden. Dazu gehören die Bestimmung von Konzentration und Volumen des Ejakulates, sowie die mikroskopische Bestimmung von Motilität und Morphologie (VARNER 2008). Die so bestimmten Parameter lassen jedoch nur bedingt eine Aussage über die Befruchtungsfähigkeit eines Ejakulates zu. Daher werden vermehrt moderne Verfahren wie beispielweise Motilitätsbestimmung oder die die computerassistierte flowzytometrische Spermienanalyse zur Spermauntersuchung zur Bestimmung der Plasmamembranintegrität, des akrosomalen Status oder der Chromatinintegrität eingesetzt (PETRUNKINA et al. 2008). Das Alter der Hengste und die Jahreszeit haben zudem einen Einfluss auf das Sexualverhalten und die Spermaqualität (PICKETT et al. 1976, JOHNSON und NEAVES 1981, JOHNSON und THOMPSON 1983). Das Ejakulat von Deckhengsten sollte daher routinemäßig überprüft werden: einmal im Jahr vor der Decksaison, bei Verdacht auf beeinträchtigte Zuchttauglichkeit, bei abnormalem sexuellem Verhalten und beim Verkauf eines Hengstes (ENGLAND 1996). 17 Literaturübersicht 2.2.2 Makroskopische Untersuchungen Die makroskopische Beurteilung des Ejakulats sollte nach Filtration durch einen Gazefilter durchgeführt werden, damit der Schleimanteil der Samenblasendrüsen vom Ejakulat separiert wird. Die Farbe des normalen Hengstejakulates ist weiß bis gräulich-weiß, bei einer molke- bis milchähnlichen Konsistenz. Aus der Betrachtung von Farbe und Konsistenz des Ejakulates kann bereits eine grobe Schätzung der Spermienkonzentration im Ejakulat erfolgen. Eine rötliche Farbabweichung deutet auf Beimengungen durch Blut hin, eine gelbliche Verfärbung auf Urin. Flockige Bestandteile geben einen Hinweis auf Eiter (HOOGEWIJS 2010). Das Volumen eines Hengstejakulats beträgt zwischen 30 und 300 ml (ENGLAND 1996). Der Geruch sollte neutral sein. Der pH-Wert des Hengstejakulats liegt in der Regel zwischen 6,7 und 7,5. Zur Bestimmung der Spermienkonzentration kann generell ein Haemozytometer verwendet werden. Dieses Verfahren wird auf Grund seiner Spezifität als Standardmethode angegeben. Nachteilig jedoch ist die geringe Anzahl an Spermien die hierdurch erfasst wird (LOVE 2012). Verschiedene Zählkammern können bei dieser Methode eingesetzt werden. Zur Bestimmung der Samenzellkonzentration bei Pferden hat sich besonders die Neubauer-Zählkammer bewährt. Da der Aufwand diese Methode anzuwenden jedoch relativ hoch ist, hat sich das Verfahren in der Tiermedizin als relativ ungeeignet erwiesen, da hier meist eine hohe Anzahl an Proben zu untersuchen ist. In der Routinediagnostik werden meist Photometer benutzt (HOOGEWIJS 2010). Diese erzielen innerhalb eines gewissen Messbereichs (100-300 x 106 Zellen/ml) relativ schnell gute Messergebnisse (BRINSKO et al. 2011). Die Spermienkonzentrationsbestimmung durch die Nutzung computerassistierter Spermienanalysesysteme wird aufgrund ihrer Ungenauigkeit nicht empfohlen (VANTMANN et al. 1988, BRITO 2010). Alternativ kann zur Bestimmung der Spermienkonzentration die Untersuchung fluoreszenzfarbstoffmarkierter Spermien mittels Durchflusszytometrie (EVENSON 1993b, HANSEN et al. 2002, CHRISTENSEN et al. 2004) oder mit Hilfe eines NucleoCounter® (BRITO 2010, ANZAR et al. 2009, HANSEN et al. 2006) durchgeführt werden. Der Vorteil bei der Benutzung dieses Gerätes liegt darin, dass eventuelle Verunreinigungen durch Zelldebris nicht zu einer Verfälschung der 18 Literaturübersicht Messergebnisse führen (BRINSKO et al. 2011). Gleichzeitig kann mit diesem Gerät der Anteil plasmamembrangeschädigter Zellen bestimmt werden. 2.2.3 Mikroskopische Untersuchungen Durch die mikroskopische Betrachtung der Samenprobe werden die Motilität und die Morphologie der Spermien beurteilt (WABERSKI et al. 1999), wobei standardisierte Bedingungen und Methoden einzuhalten sind. Nativsamen sollte auf Grund seiner Agglutinationsneigung nicht verwendet werden. Eine Samenprobe mit einer Konzentration von 25 bis 50 Millionen Samenzellen pro Milliliter sollte durch Verdünnung hergestellt Untersuchung wird und ein verwendet werden. Phasenkontrastmikroskop Für bei die 150 mikroskopische bis 200-facher Vergrößerung mit einem beheizbaren Objekträgertisch (37°C) verwendet. Es sollten dabei 4 bis 5 Gesichtsfelder in der Mitte eines Deckgläschens untersucht werden. Pro Ejakulat sollten mindestens zwei unterschiedliche Proben betrachtet werden (SIEME et al. 2001). Die mikroskopische Beurteilung der Spermienmorphologie wird anhand von EosinNigrosin gefärbter Ausstrichpräparate durchgeführt (DOTT und FOSTER 1972). Genauso dient die Eosin-Nigrosin Färbung der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Spermien (BLOM 1950). Nach neueren Erkenntnissen gilt die Beurteilung der Spermienmorphologie mit Hilfe von Nasspräparaten („wet-mount preperation“) jedoch als exaktere Methode, wobei die Herstellung der Präparate zudem einfacher und schneller zu handhaben ist. Die zur Beurteilung benötigten Phasenkontrastmikroskope gehören zudem mittlerweile zur Standardausrüstung in den entsprechenden Untersuchungeinrichtungen (BRITO et al. 2011). Die Betrachtung unter einem Phasenkontrastmikroskop sollte mindestens mit einer 1000fachen Vergrößerung vorgenommen werden (BRITO 2007, BRITO et al. 2011). Ursprünglich sollten 200 Samenzellen begutachtet werden (DOWSETT et al. 1984, CROSS und MEIZEL 1989, JASKO et al. 1990, KAVAK et al. 2004, CARD 2005), neuere Studien geben eine Mindestanzahl von 100 Samenzellen an (BRITO 2007, BRITO et al. 2011). Im Durchschnitt sollte das Ejakulat eines Hengstes mindestens 50% morphologisch normale Spermien aufweisen (BRITO 2007). Spermienanomalien werden in primäre, sekundäre und tertiäre Veränderungen 19 Literaturübersicht gegliedert (BLOM 1977): primäre Veränderungen (z.B. Kopfveränderungen) entstehen durch Störungen während der Spermatogenese, sekundäre Anomalien (z.B. abgelöster Kopf, proximaler oder distaler Plasmatropfen) entstehen während der Nebenhodenpassage und tertiäre Missbildungen entstehen während der Samengewinnung und Samenuntersuchung (STOLLA 1984). Unter einem kompensatorischen Defekt wird eine Spermienanomalie verstanden, die zwar zu keiner Befruchtung durch das veränderte Spermium führt, aber durch eine ausreichende Anzahl intakter Spermien kompensiert werden kann. Nichtkompensatorische Defekte führen zunächst zu einer Befruchtung der Eizelle, werden dann jedoch durch Störungen in der Embryonalentwicklung gefolgt. Spermiendefekte mit einem starken Einfluss auf die Fruchtbarkeit werden als „Major Defects“ bezeichnet, Defekte mit einem weniger starken Einfluss als „Minor Defects“ (PARLEVLIET und COLENBRANDNER 1999). Auch in neueren Studien werden vermehrt bestimmte Qualitätsparameter, wie beispielsweise die Motilität und die Morphologie der Spermien untersucht, um deren Einfluss auf die Fertilität zu bestimmen. LOVE (2011) bestimmte dafür Motilitätsparameter mittels computerassistierter Spermienanalyse (CASA) und die Spermienmorphologie mit Hilfe der Differentialinterferenzkontastmikroskopie (DIC). Dabei fanden sich die höchsten Korrelationen zwischen der Gesamtmotilität der Spermien und zwischen dem prozentualen Anteil morphologisch intakter Spermien in Bezug zu den ermittelten Fertilitätsparametern. 2.2.3.1 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA) Von DOTT und FOSTER wurde 1979 die computerassistierte Spermienanalyse (CASA) eingeführt. Daraufhin wurden mehrere dieser Systeme entwickelt (z.B.: IVOS, v. 12.2, Hamilton Thorne Research, Berverly, MA, USA; CellSoft-System, CRYO-Resources Ltd., NY, USA; SpermVision™, Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland). Die so durchgeführte Form der Spermienmotilitätsanalyse soll als objektive Beurteilungsmöglichkeit im Gegensatz zur subjektiven mikroskopischen Schätzung eine höhere Präzision und Reproduzierbarkeit bieten (BRITO 2010), was auch bereits bei Bullen- (GSCHWEND 1986, LEIDL et al. 1987, 1989) und Hengstspermien (ZIEGLER 1991) nachgewiesen werden konnte. Trotzdem wurde 20 Literaturübersicht bisher keine standardisierte Methode zur Durchführung der Motilitätsbestimmung evaluiert und die Konzentrationsbestimmung ist, wie bereits beschrieben, relativ ungenau. Neben der Möglichkeit unterschiedliche technische Einstellungen zu verwenden, führt insbesondere der Einfluss der verwendeten Messkammern zu variierenden Ergebnissen. In wissenschaftlichen Arbeiten ist es daher unerlässlich eine genau Auskunft über das verwendete CASA-System, die technischen Einstellungen und die eingesetzten Messkammern zu geben (HOOGEWIJS et al. 2012). Mittlerweile setzen nicht nur Forschungseinrichtungen sondern auch zunehmend Besamungsstationen dieses Verfahren ein (VERSTEGEN 2002). Über eine am Mikroskop angebrachte Kamera werden Bildsequenzen aufgenommen, die mit Hilfe einer speziellen Software auf einem Computer analysiert werden. Von jedem Bild werden die Spermienköpfe detektiert und die Strecken zwischen den Spermienkopfmittelpunkten auf den verschiedenen Bildern gemessen (JASKO et al. 1988, BLACH et al. 1989). So können neben der Spermiengeschwindigkeit weitere kinetische Parameter bestimmt werden (WABERSKI et al. 1999, BALTISSEN 2007). In den meisten Fällen ist es nötig das zu untersuchende Ejakulat, möglichst mit Magermilchverdünner, auf eine vom Hersteller des Systems vorgegebene Konzentration einzustellen. Bei Verwendung von eidotterhaltigem Verdünner oder Vollmilchverdünner könnten Partikel als immotile Spermienköpfe erkannt werden und das Messergebniss verfälschen (JASKO et al. 1988). Zur Ermittlung präziser Messergebnisse empfehlen VOSS et al. (1981) pro Messduchgang mindestens eine Anzahl von 500 Spermien, JASKO et al. (1988) mindestens 400 Spermien zu untersuchen. 2.2.4 Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie, wurde in den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts in der spermatologischen Diagnostik eingeführt. Durch die zu Grunde liegende Technik ist es möglich mit Hilfe der verschiedenen Fluoreszenzfärbemethoden tausende Zellen innerhalb von Sekunden zu analysieren (STOLLA 1984, MORELL 1991, SPANO und EVENSON 1993, ANZAR et al. 2009). Dies ist ein wesentlicher Vorteil des Testverfahrens gegenüber der fluoreszenzmikroskopischen Beurteilung, bei der deutlich weniger Spermien analysiert werden (MAGISTRINI et al. 1997). Abhängig 21 Literaturübersicht von den zu untersuchenden Parametern müssen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden. Die Plasmamembranintegrität und der akrosomale Status werden i.d.R. durch eine kombinierte Färbung mit Propidiumiodid (PI) und Peanut-Agglutinin, konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC-PNA), beurteilt (RATHI et al. 2001). 2.2.4.1 Sperm-Chromatin-Structure-Assay (SCSA) Den Sperm-Chromatin-Structure-Assay (SCSA) entwickelten EVENSON et al. (1980), um die Chromatinintegrität von Spermien zu untersuchen. Mit Hilfe des Sperm-Chromatin-Structure-Assay wird die Empfindlichkeit von Spermienchromatin gegenüber einer induzierten Denaturierung bestimmt (DIGRASSIE 2000). Die Denaturierung wird durch Zugabe von Säure erreicht und führt zu einer Aufspaltung der Doppelstränge fragmentierter DNA in Einzelstränge. Intakte DNA-Doppelstränge werden nicht aufgespalten. Anschließend erfolgt eine Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Akridinorange, der bei Anlagerung an einen DNA-Einzelstrang rotes Licht und bei Anlagerung an einen DNA-Doppelstrang grünes Licht emittiert (EVENSON et al. 1991). Im Anschluss daran wird der DNA-Fragmentationsindex als Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rote und grüne Fluoreszenz) berechnet. Das Fertilitätspotential der Samenproben von Hengsten definiert LOVE (2005) folgendermaßen: (1) DFI-Werte von 0-12% = hohes Fertilitätspotential, (2) DFI-Werte von 12-17% = gutes Fertilitätspotential, (3) DFI-Werte von 17-25% = mäßiges Fertilitätspotential. 2.3 Variabilität der Qualitätsmerkmale von Hengstsperma und der Sexualparameter 2.3.1 Deckverhalten Das Deckverhalten von Hengsten wird geprägt durch die Geschlechtslust (Libido sexualis) und äußert sich in bestimmten Verhaltensweisen und physiologischen Reaktionsabläufen. Sowohl Art und Weise als auch Intensität basieren auf einem Zusammenwirken von angeborenem Instinktverhalten und einer zentralen hormonellen Steuerung (Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse). Dabei erfolgt die Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) pulsatil aus dem 22 Literaturübersicht Hypothalamus. Dies wiederum initiiert die Freisetzung von Gonadotropinen aus der Hypophyse. LH (Luteinisierendes Hormon) führt zur Ausschüttung von Testosteron und Östrogenen aus den Hoden. FSH ist an der Steuerung der Spermatogenese beteiligt. Auch ein komplexes parakrin-autokrin wirkendes System (Abb. 2.1) ist an der Regulation der testikulären Funktionen beteiligt (ROSER 2008). Die Reaktionszeit als Maß für die Geschlechtslust beschreibt die Zeit, die ein Hengst von der ersten Wahrnehmung des Sprungpartners bis zum Aufsprung benötigt (SIEME et al. 2004). Sie sollte 10 Minuten bei Anwesenheit einer rossigen Stute nicht überschreiten. Sensorische Signale (optisch, akustisch, olfaktorisch) induzieren dabei Verhaltensweisen, die zur Durchführung des Deckaktes führen. Sie initiieren den Erektionsvorgang indem sie im zentralen Nervensystem (Erektionszentrum im Lumbal- und Sakralmark) verarbeitet werden und von dort über efferente Nervenbahnen zu den Genitalorganen führen (KLUG et al. 1999). Der Vorgang kann in drei Abschnitte gegliedert werden (MERKT und KLUG 1989): (1) die präkoitale Phase des Hengstes (Vorspielphase), die sich durch Flehmen, Wiehern, Hindrängen des Hengstes zur Stute und Genitalkontrolle dieser und im weiteren Verlauf durch Ausschachten und Erektion des Penis kennzeichnet; (2) die koitale Phase, die sich in den Aufsprung auf die Stute bzw. das Phantom, Umklammerung, Suchphase, Einführen des Penis und die sich anschließenden Friktionsbewegungen (6-8 Beckenschübe) und die Ejakulation gliedert; und (3) die postkoitale Phase, die aus dem Absprung, der Erschlaffung des Penis und dem Nachspiel besteht. Das Deckverhalten und die Spermaqualität eines Hengstes unterliegen dabei sowohl individuellen Einflüssen, wie dem Alter und dem damit in Verbindung stehenden Entwicklungsstand der Hoden und dem Spermienbildungsvermögen, als auch der exogenen Beeinflussung durch Haltung, Fütterung und Jahreszeit (Aurich et al. 1998, KLUG et al. 1999). 2.3.2 Einfluss des Alters Die Spermaqualität eines Hengstes wird unter anderem durch das Alter beeinflusst. Die Hodendimension und die Samenzellproduktion unterliegen genauso einer Altersabhängigkeit, wie die Höhe des Sexualhormonspiegels. Die Hodengröße nimmt nach KLUG (1982) bis zum 7. Lebensjahr kontinuierlich zu, bleibt zwischen dem 8. 23 Literaturübersicht und 18. Lebensjahr weitgehend konstant und fällt mit fortschreitendem Alter deutlich ab. Bezüglich der Gesamtspermienzahl im Ejakulat befinden sich die Hengste noch bis zum 8. und 9. Lebensjahr in einem Heranreifungsstadium. Nach AURICH et al. (1998) findet die Größenzunahme der Hoden bis zu einem Alter von 4 bis 5 Jahren statt und beinhaltet eine Zunahme der Anzahl an Sertoli- und Leydigzellen, sowie eine Zunahme der Spermatogenesekapazität. Nachdem die sexuelle Reife mit 5 Jahren vollständig erreicht ist, treten ab dem 15. Lebensjahr bereits altersbedingte Rückbildungen auf. AMANN et al. (1979) geben an, dass die höchste Samenzellproduktion und die damit verbundene beste Samenqualität im Alter von 5 bis 15 Jahren vorliegt. Bezüglich der Motilität der Samenzellen im Ejakulat ist nach KLUG (1982) keine Beeinflussung durch das Alter erkennbar. In einer Studie von JOHNSON und THOMPSON (1983) finden sich bei älteren Hengsten (6 bis 20 jährig) höhere Konzentrationen von FSH, LH und Testosteron im Blutserum als bei jüngeren Tieren (4 und 5 jährig). Dabei sind die LH- und Testosteronwerte bereits bei 6 jährigen Tieren erhöht, die FSH-Werte jedoch erst ab einem Alter von 13 Jahren. BLANCHARD et al. (2012) beschreiben einen Ablauf von Prozessen, der bei alten Hengsten (>20 Jahre) zu einer Beeinflussung ihrer testikulärer Funktionen und somit ihrer Fertilität führt. Dabei kommt es zunächst zu einer Verringerung des Ejakulatvolumens mit einhergehender Reduktion der Gesamtspermienzahl. Die Hodengröße verändert sich noch nicht. Im weiteren Verlauf wird ein Abfall des prozentualen Anteils morphologisch intakter und progressiv motiler Spermien beschrieben. Die ersten hormonellen Veränderungen gehen mit einem Rückgang der Trächtigkeitsraten einher. Dabei ist eine Reduktion der Östrogenkonzentration ebenso festellbar wie eine Reduktion der Testosteronkonzentration. In fortgeschrittenem Stadium, in dem bereits ein Rückgang der Hodengröße um bis zu 50 % festgestellt werden kann, steigt auch der prozentuale Anteil an Spermien mit erhöhten DFI-Werten. 2.3.3 Einfluss der Jahreszeit Auch bei Hengsten unterliegt das Fortpflanzungsgeschehen einem saisonalen Einfluss. Dies wird durch die Tageslichtlänge hervorgerufen, aber auch Faktoren wie z.B. das Klima oder die Haltungsform bzw. das Nahrungsangebot können indirekt die 24 Literaturübersicht Regulation der Fortpflanzung beeinflussen (AURICH et al. 1998). Bei zunehmenden Tageslichtlängen wird die Hodenfunktion und damit auch die Konzentration testikulärer Hormone im Blut gesteigert (IRVINE und ALEXANDER 1982, CLAY und CLAY 1992), was zu einer Steigerung der Geschlechtslust und der Spermatogenese, sowie zur Stimulation der akzessorischen Geschlechtsdrüsen führen kann (HARRIS et al. 1983). Nach AURICH et al. (1999) besteht jedoch keine Korrelation zwischen der Testosteronkonzentration und der Libido sexualis. Dem Hypothalamus kommt dabei durch die Ausschüttung des Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) eine zentrale Rolle zu. So sehen etliche Autoren die Serumkonzentrationen der Gonadotropine LH (THOMPSON et al. 1977, JOHNSON und THOMPSON 1983, BURNS et al. 1984, LOPES GUSMAO 1988, VON BREDOW 1995) und FSH (HARRIS et al. 1983) in den Frühjahrs- und Sommermonaten erhöht. JOHNSON und THOMPSON (1983) konnten jedoch keinen signifikanten Unterschied bezüglich der FSH-Konzentration im Blut zwischen den Sommer- und Wintermonaten feststellen. Das Steroidhormon Testosteron, das im Hoden gebildet wird, erreicht nach BERNDTSON et al. (1974) im Monat Mai seine höchste Konzentration im Blut, die niedrigsten Werte dagegen in den Monaten Oktober, Dezember und Januar. Eine Zunahme von Größe und Gewicht der Hoden über die Decksaison sahen sowohl JOHNSON und THOMPSON (1983) als auch BURNS et al. (1984). Auch die Beschaffenheit des Ejakulates unterliegt saisonalen Schwankungen. PICKETT et al. (1980) sehen ein Absinken der Spermiengesamtzahl im Winter. JANETT et al. (2003) untersuchten spermatologische Parameter von 10 Warmbluthengsten über einen Zeitraum von einem Jahr um saisonale Unterschiede hierin zu verdeutlichen und um den geeignetsten bestimmen. Dabei Zeitpunkt zur Kryokonservierung fanden sie heraus, dass das von Hengstsperma Ejakulatvolumen, zu die Gesamtspermienzahl und die Motilität in den Sommermonaten (Juni – August) signifikant höher waren als in den Wintermonaten (Dezember – Februar). Dagegen waren die Spermienkonzentration und der Anteil morphologisch intakter Spermien in den Sommermonaten signifikant niedriger, verglichen mit den Frühjahrs-, Herbstund Wintermonaten. Aus den Ergebnissen schlussfolgerten sie, dass der beste Zeitpunkt zur Kryokonservierung von Hengstsperma im Herbst ist. Zu einem 25 Literaturübersicht diesbezüglich abweichenden Ergebnis kamen WRENCH et al. (2010), die den optimalen Zeitpunkt zur Kryokonservierung in den Frühjahrs- und Sommermonaten sehen (März – Juni). Ihre Untersuchungen ergaben in diesem Zeitraum die geringsten Differenzen zwischen Frischsamen und tiefgefrorenem Samen hinsichtlich der untersuchten spermatologischen Parameter. Auch zeigten sich in dieser Studie keine signifikanten Effekte hinsichtlich des Einflusses der Saison auf das Ejakulatvolumen, auf die Spermienkonzentration, auf die Gesamtspermienzahl, auf die Gesamtmotilität und auf die progressive Motilität. Bezüglich der Spermienmorphologie zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen allen vier Versuchsabschnitten (Frühjahr/Sommer/Herbst/Winter), mit den prozentualen Anteilen morphologisch intakter Spermien im Frühjahr (März). 26 höchsten Literaturübersicht Tab.2.1: Parameter zur Charakterisierung der magnetischen Feldexposition (modifiziert nach SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000) Abb.2.1: 1. maximale Flussdichte (B) in Tesla (T) bzw. Gauss 2. Frequenz in Herz (Hz) 3. Anstiegszeit (ta ) eines Impulses in Mikrosekunden (µs) 4. Abfallszeit (tb ) eines Impulses in Mikrosekunden (µs) 5. Dauer der Einzelimpulse in Millisekunden (ms) 7. Länge der Spulen in Meter (m) autokrin-parakrine Regulation der Hodenfunktion (modifiziert nach ROSER 2008) Viele lokal wirkende Mechanismen gelten beim Pferd als unbekannt. Die Abbildung zeigt Mechanismen, die bei anderen Spezies beobachtet wurden: (GnRH) Gonadotropinfreisetzendes Hormon, (IGF-1) Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1, (INSL3) Insulinähnliches Peptid 3, (INH) Inhibin, (ACT) Activin, (ß-EP) beta-Endorphin, (Trans) Transferrin, (bFGF) basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, (TGF) transformierender Wachstumsfaktor, (TGF-ß) transformierender Wachstumsfaktor beta, (TGF-α) transformierender Wachstumsfaktor alpha, (IL-1) Interleukin-1, (SGP) sulfatiertes Glykoprotein, (NGF) Nervenwachstumsfaktor, (PmodS) peritubulär modifizierende Substanz, (OT) Oxytocin, (VP) Vasopressin, (T) Testosteron, (E2) Estradiol. Die hellgrau hinterlegten Substanzen wurden bisher beim Pferd identifiziert. 27 Literaturübersicht a) Sinusförmige Impulsform mit gleichbleibender Amplitude und Frequenz b) trapezoide Impulsform. Diese zeichnet sich durch längere Anstiegsund Abfallszeiten aus rise time = Anstiegszeit ; fall time = Abfallszeit pulse width = Impulsdauer bei maximaler Amplitude c) sinusförmige Impulsform, die zusätzlich in der Amplitude moduliert wird d) sägezahnförmige Impulsform. Ein Intervall besteht in dieser Darstelllung aus mehreren aufeinanderfolgenden Einzelimpulsen Abb.2.1 Ausgewählte Impulsformen, die bisher in Untersuchungen mit gepulsten magnetischen Feldern eingesetzt wurden (modifiziert nach MARKOV 2007b (a-c) und WATKINS et al. 1985 (d)) 28 Material und Methoden 3. Material und Methoden 3.1 Versuchshengste Die Untersuchungen erstreckten sich über einen Zeitraum von insgesamt 24 Wochen. Sie fanden während der routinemäßigen Herstellung von Tiefgefriersperma im Jahr 2010 (Oktober 2010 – Dezember 2010) und zu Beginn der regulären Decksaison 2011 (Januar 2011 – April 2011) statt. Für die Untersuchungen standen insgesamt 11 Warmbluthengste und ein Vollbluthengst des Niedersächsischen Landgestüts in Celle zur Verfügung. Die Hengste waren zwischen 4 und 23 Jahren alt. Alle Tiere waren in der Hengstprüfungsanstalt Adelheidsdorf aufgestallt. Vor Beginn der Untersuchungen erfolgte dreimal in einem Abstand von jeweils 48 Stunden eine Samenentnahme, wobei die Ejakulate verworfen wurden. Die Tiere zeigten ein arttypisches Deckverhalten, sie waren im Allgemeinbefinden ungestört, erb- und geschlechtsgesund. Ihre tägliche Futterration bestand aus Heu, Hafer und einem pelletierten Zusatzfutter. Wasser stand jederzeit über Selbsttränken zur Verfügung. Die Hengste (n=12) wurden entsprechend ihres Alters in drei Gruppen unterteilt. Junge Hengste (4–6 jährig, n=4), mittelalte Hengste (7–11 jährig, n=4) und alte Hengste (12–23 jährig, n=4). Sechs Hengste bildeten eine Untersuchungsgruppe (G1 und G2), die aus je zwei Hengsten einer Altersgruppe bestand. 3.2 Medithera VET-System M-1000 Die Hengste wurden einer gepulsten Magnetfeldtherapie unterzogen. Zum Einsatz kam dabei eine Magnetfelddecke („VET-System M1000“, Fa. Medithera AG, Höhn/Ww.). Diese Einheit bestand aus einem Rückenapplikator in Form einer handelsüblichen Pferdedecke, einem Steuergerät und einem Akku-Netzteil, die beide seitlich an der Decke befestigt wurden. Die Magnetfelddecke wurde täglich (Montag bis Samstag) für 20 Minuten im Programm „Aktiv“ mit der Intensitätsstufe „7“ angewendet. Die Technischen Daten sind in Tabelle 3.1 aufgeführt. Die dieser Programmeinstellung zu Grunde liegende Stärke des Magnetfeldes beträgt 22,5 µT (=0,22 Gauß) bei einer dominanten Frequenz von 10 Hz und Trägerfrequenzen von 29 Material und Methoden 250 Hz und 500 Hz. Die induzierten Impulse haben die Form eines Rechtecks, Anstiegs- und Abfallszeiten ähneln in ihrem Aussehen einer e-Funktion. Die Einstellungen blieben über den gesamten Versuchszeitraum konstant. 3.3 Versuchsaufbau Der Gesamtuntersuchungszeitraum erstreckte sich über 24 Wochen und war untergliedert in Abschnitte von je sechs Wochen. Wie in Abbildung 3.2 dargestellt, wurden die Gruppen G1 und G2, mit jeweils sechs Hengsten, in sechs- wöchigem Rhythmus alternierend der Magnetfeldtherapie unterzogen. Während des täglichen Behandlungszeitraumes von 20 Minuten wurden die Hengste in ihren Boxen angebunden. Die Samenentnahme aller Hengste erfolgte dreimal pro Woche (Montag/Mittwoch/Freitag), wobei nur zweimal pro Woche eine Untersuchung der Ejakulate jedes Hengstes erfolgte. Die Untersuchungen gliederten sich in zwei Bereiche. Zunächst wurde morgens während der Samenentnahme im Sprungraum das Deckverhalten mittels Zeitmessungen an zuvor festgelegten Abschnitten des Deckaktes beurteilt (s. 3.4.1). Danach erfolgte Untersuchung des im angrenzenden Ejakulates und Labor die die standardspermatologische Anfertigung der Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate (s. 3.6). Die computervideographischen Untersuchungen zur Bestimmung von Motilitätsparametern (s. 3.8) fanden am selben Tag statt, die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Bestimmung der Chromatinintegrität (s. 3.7) zu einem späteren Zeitpunkt. 3.4 Samengewinnung und Untersuchung des Deckverhaltens 3.4.1 Untersuchung des Deckverhaltens Insgesamt wurden drei Zeitintervalle während des Deckaktes gemessen. Dafür war sowohl der Hengstführer als auch der Samennehmer mit einer Stoppuhr ausgestattet. Gemessen wurden: (1) die Zeit vom Betreten der Deckhalle bis zum Beginn des Ausschachtens, (2) die Zeit vom Ausschachten bis zum Aufsprung, (3) die Zeit vom Aufsprung bis zur Ejakulation. Desweiteren wurde die Anzahl der Aufsprünge bis zur Ejakulation dokumentiert. Um stets dieselben Voraussetzungen 30 Material und Methoden zu gewährleisten, wurden sowohl der Sprungraum als auch die künstliche Scheide jeweils komplett vorbereitet, bevor der Hengstführer den nächsten Hengst zum Decken geholt hat. 3.4.2 Samengewinnung Für die Samenentnahme wurde eine künstliche Scheide verwendet (Modell „Hannover“, KLUG 1993), welche für jeden Deckakt mit einer Einmalschlauchfolie (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen wurde. Der Sprungraum war mit einem Phantom (Modell „Celle“, KLUG 1993) ausgestattet. Eine Stute, die sich fixiert an der Kopfseite des Phantoms in einem Untersuchungsstand befand, war immer anwesend. Zum Auffangen des Ejakulates diente eine sterile, graduierte Glasflasche. Um Verunreinigungen und die Gelfraktion von der spermienreichen Fraktion des Ejakulates zu trennen, wurde ein Gazefilter (Fa. Minitüb, Tiefenbach) in die Glasflasche eingezogen. Als Schutz und um Temperaturschwankungen zu verhindern wurde die Glasflasche mit einem gepolsterten Kunstoffüberzug (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen. Unmittelbar nach dem Deckakt wurden das Volumen (ml), sowie die Farbe (grau/weiß/gelb) und die Konsistenz (wässrig/molkig/milchig/rahmig) des Ejakulates beurteilt. Aus dem Nativsamen wurden Eosin-Nigrosin-Ausstrichpräparate zur Beurteilung der Spermienmorphologie angefertigt. Im Anschluss wurden für die spätere Bestimmung der Chromatinintegrität 2 ml Nativsperma in ein verschraubbares Kryoröhrchen (Fa. Greiner, Frickenhausen) gefüllt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. In diesem blieben sie bis zur weiteren Untersuchung bei -196°C gelagert. Für die Motilitätsanalyse wurde ein Teil des restlichen Nativsamens mit dem Magermilchverdünner INRA-82 (25 g/I Glukose-Monohydrat, 1,5 g/I LaktoseMonohydrat, 1,5 g/I Raffinose, 0,4 g/I Kalium-Citrat-Monohydrat, 0,3 g/I Tri-NatriumCitrat-Dihydrat, 4,76 g/I HEPES, 0,5 g/I Penicillin, 0,5 g/I Gentamicin, 0,15% Magermilch pH 7.0 (0,5 l auf 0,5 I Verdünneransatz), 300-320 mOsm/kg) auf eine Konzentration von 90 x 106 Samenzellen/ml verdünnt. 31 Material und Methoden 3.5 Dichtemessung und Bestimmung der Viabilität mittels NucleoCounter® Die Dichte der Ejakulate und die gleichzeitige Bestimmung der Viabilität erfolgte mit Hilfe des NucleoCounter® SP-100™ (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark). Dieser besteht aus einem Fluoreszenzmikroskop und einer CCD-Kamera (Chargecoupeld-Device). Zur Bestimmung der Dichte des Ejakulates wurden 50µl Nativsamen zusammen mit 5ml Aufschlusslösung Reagent S-100 (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark) in ein verschraubbares Kunststoffröhrchen gegeben und durch kurzes Schwenken miteinander vermischt. Durch die Aufschlusslösung wurden die Plasmamembranen der Spermien zerstört. Zur Messung wurden dann 50µl dieser Lösung in die sogenannte SP1-Cassette™ (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark) aufgesogen. In der Cassette befand sich in immobilisiertem Zustand der Farbstoff Propidiumiodid (PI), welcher durch die aufgesogene Lösung freigesetzt wurde und so die DNA der Spermien angefärbt hat. Die Cassette wurde nun unmittelbar in die Messkammer des NucleCounter® eingesetzt und der Messvorgang gestartet. Die Messung dauerte insgesamt 30 Sekunden, danach erhielt man auf dem Display das Ergebnis in der Einheit 1 x106 Spermien/ml. Zur Bestimmung des Anteils plasmamembrandefekter Spermien wurde derselbe Messvorgang wiederholt, jedoch wurde anstatt der Aufschlusslösung Reagent S-100 (Fa. ChemoMetec A/S, Allerød/Dänemark) PBS als Verdünnungslösung verwendet. Dieses zerstörte die Plasmamembranen nicht, wodurch sich der Farbstoff PI in der SP1-Cassette™ nicht mit der in den Zellkernen befindlichen DNA plasmamembranintakter Spermien verbinden konnte. Somit konnte nur die DNA der Spermien angefärbt werden, deren Plasmamembranen bereits geschädigt war. Aus den Ergebnissen beider plasmamembrandefekter Messungen Spermien ließ bestimmen sich und der somit prozentuale auch der Anteil Anteil plasmamembranintakter Spermien errechnen. 3.6 Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate Der Anteil morphologisch abweichender Samenzellen wurde nach den Vorgaben von BRITO (2007) bestimmt. Zu jeweils 100 µl Nativsperma wurden 300 µl EosinNigrosin Lösung gegeben (10% Nigrosin, 0,7% Eosin, 3,75 mM Na 2HPO4, 1,88 mM 32 Material und Methoden KH2PO4, 5,78 mM NaK Tartrat, 3,75 mM Glukose). Nach 30-sekündiger Inkubation und Durchmischung wurden von diesem Gemisch zwei Ausstrichpräparate angefertigt. Bei 1000-facher Vergrößerung mit Ölimmersion unter einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX40, Fa. Olympus, Hamburg) fand die Beurteilung der Spermienmorphologie statt (s. Tab. 3.2). Pro Ausstrich wurden 200 Spermien beurteilt. 3.7 Flowzytometrische Bestimmung der Spermienchromatinintegrität (SCSA) 3.7.1 Geräte und Geräteeinstellungen Für die durchflusszytometrischen Untersuchungen zur Chromatinintegrität wurde das Durchflusszytometer FACScan™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) verwendet. Das Gerät ist mit einem Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm und einer Leistung von 15 mW ausgestattet. Um die emittierten Fluoreszenzsignale messen zu können, standen drei verschiedene Filter zur Auswahl: FL-1 (BP 530/30 nm) für die grüne Fluoreszenz, FL-2 (BP 585/42) für die orange Fluoreszenz und FL-3 (LP 650 nm) für die rote Fluoreszenz. Zur Steuerung des Durchflusszytometers war das Gerät an einen Computer, auf dem das Softwareprogramm Cellquest™ (Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) installiert war, angeschlossen. 3.7.2 Messprinzip und Durchführung der Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA) Die Spermienchromatinintegrität wurde nach der von EVENSON und JOST (2000) beschriebenen Methode SCSA™ (sperm chromatin structure assay) bestimmt. Da fragmentiertes Chromatin Säuredenaturierung besitzt, eine wird erhöhte Empfindlichkeit hierdurch bei der gegenüber einer Spermienchromatin- strukturanalyse eine teilweise Trennung der eigentlich doppelsträngig vorliegenden DNA bewirkt. Nach der sich anschließenden Färbung mit Akridinorange emittiert doppelsträngige DNA Licht im grünen Bereich, wohingegen einzelsträngige DNA eine rote Fluoreszenz zeigt. Bei jedem einzelnen Spermium einer Probe wird somit durchflusszytometrisch die Intensität der grünen und der roten Fluoreszenz bestimmt. Der DNA-Fragmentationsindex (DFI), welcher ein Maß für die Integrität der 33 Material und Methoden Chromatinstruktur der einzelnen Spermien darstellt (EVENSON et al. 2002) wird dann aus dem Anteil Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz bestimmt. Die Darstellung der einzelnen Fluoreszenzen erfolgte computergestützt in einem Punktwolkendiagramm. Verteilungshistogramm Anschließend entsprechend wurden ihrer die DFI-Werte vorkommenden in Häufigkeit einem nach dargestellt. Um die Messungen durchzuführen, wurden zunächst die zu untersuchenden, schockgefrorenen Nativspermaproben im Wasserbad bei 38°C für 2 Min. aufgetaut. Die anschließenden Vorgänge wurden in einem Eiswasserbad (4°C) durchgeführt, bzw. wurden die eingesetzten Substanzen permanent darin gekühlt. Die Nativprobe wurde mit TNE-Puffer (0,15 M NaCl, 0,01 M Tris HCL, 1 mM EDTA, pH 7,4) auf eine Konzentration von ca. 2 x 106 Spermien/ml eingestellt. Danach wurden zu 200 µl dieser Spermiensuspension 0,4 ml Säuredetergenz-Lösung (0,08 M HCL, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton-X-100, pH 1,2) gegeben, diese für ca. 30 Sekunden auf einem Vortexer vermischt und anschließend mit 1,2 ml Akridinorangelösung (0,15 M NaCl, 0,037 M Citric acid, 0,126 M Na2HPO4, 0,0011 M EDTA, pH 6,0, beinhaltet 6 µg mL -1 Akridinorange) versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation in einem Eiswasserbad erfolgte dann die flowzytometrische Messung. Die Bearbeitung und Auswertung der Daten wurde mit dem Softwareprogramm DAS Version 4.40 (BEISKER 1994) vorgenommen. 3.8 Durchführung der computerassistierten Spermienmotilitätsanalyse Die Motilitätsanalyse erfolgte mit dem computerassistierten Spermienanalysesystem (CASA) SpermVision™ (Fa. Minitüb, Tiefenbach). Zur Verfügung stand dazu ein Phasenkontrastmikroskop (Olympus BX40, Fa. Olympus, Hamburg) mit aufgebautem optischen System (60 Bilder/Sekunde), welches an einen separaten Computer angeschlossen war, auf dem sich die benötigte Software befand. Für die Analyse wurden ausschließlich standardisierte Messkammern (20 Mikron, SSC 20-01-04-B, Fa. Leja, Nieuw-Vennep, die Niederlande) mit einer Einfülltiefe von 20 µm verwendet. Bei dem zur Verfügung stehenden Gerät wurde der Objektträgertisch manuell 34 Material und Methoden bedient. Die Einstellungen der Software orientierten sich ebenso an den Vorgaben des Herstellers wie die Durchführung der Messungen. Die Motilitätsanalysen wurden an dem zuvor bereits verdünnten Sperma (90 x 106 Spermien/ml in INRA 82) durchgeführt. Die zur Durchführung der Messungen benötigten Gegenstände (Leja-Kammern, Heizblock für Eppendorfgefäße, Pipettenspitzen) wurden zuvor auf 38°C angewärmt. Aus der Spermiensuspension wurde 1 ml in ein 1,5 ml fassendes Eppendorfgefäß pippetiert und für 5 Minuten bei 38°C inkubiert. Nach kurzem Schwenken der Probe wurde umgehend eine Leja-Kammer mit 2,5 µl dieser Spermiensuspension befüllt. Das Befüllen erfolgte nach den Vorgaben der Firma Minitüb. Darauf folgte die Motilitätsanalyse. Hierbei wurden insgesamt acht Felder durch manuelle Betätigung des Objektträgertisches ausgewählt. Die Messung erfolgte auf der Längsachse der Kammer Richtung Kammeröffnung. Mindestens 800 Spermien pro Messung wurden hierdurch erfasst. Die dabei ermittelten Motilitätsparameter sind in Tabelle 3.3 zusammengefasst. 3.9 Statistische Auswertungen Die Beratung und die Durchführung der statistischen Auswertung erfolgte am Institut für Biometrie und Epidemiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Zur statistischen Auswertung der Versuchsergebnisse wurde das Programm SAS ®Software (“Statistical Analysis System“, SAS Institute, Iowa, Cary, NC/USA) Version 9.3 verwendet. Zunächst erfolgte eine Überprüfung der Ergebnisse auf Normalverteilung mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests und der visuellen Beurteilung von q-q-Plots. Daraus ergab sich eine leichte Rechtsverschiebung der Ergebnisse, die durch Logarithmieren der Werte für die weitere Berechnung behoben wurde. Überprüft wurde daraufhin der Einfluss der gepulsten Magnetfeldtherapie, der Einfluss des Alters und der Einfluss des jeweiligen zeitlichen Therapieabschnitts auf die Parameter, die zur Bestimmung des Deckverhaltens gemessen wurden (Gesamtdeckzeit / Anzahl der Aufsprünge) und auf die spermatologischen Parameter Gesamtspermienzahl, Plasmamembranintegrität, Morphologie, progressive Motilität 35 Material und Methoden und Chromatinintegrität. Die Kalkulation wurde mit Hilfe einer drei-faktoriellen Varianzanalyse (SAS-Funktion “Mixed“) durchgeführt. Als Signifikanzgrenze wurde bei allen Tests eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0.05 herangezogen. Aufgrund der geringen Anzahl an Individuen in den einzelnen Altersklassen konnten die Ergebnisse zwischen den Altersklassen (jung/mittel/alt) innerhalb und zwischen den Untersuchungsgruppen G1 und G2 nur deskriptiv anhand von Mittelwerten betrachtet werden. 36 Material und Methoden Tab.3.1: Technische Daten VET-System M-1000 (Fa. Medithera, Höhn/Ww.) Versorgungsspannung 9V DC Netzspannung 110/230 V Netzfrequenz 60/50 Hz Leistungsaufnahme 10 W max. Applikatoranschluss 2x3 pol.-6,3 Klinkenbuchse Intensitätseinstellung,Stufen Tasten 1-10 u. Sensitiveinstellung Anwendungsdauer 1-59 Min. einstellbar Anwendungsstrom ca.1600 mA bei Stufe 10 ca.75 µT ca. 160 mA bei Stufe 1 ca. 7,5 µT Tab.3.2: Beurteilungsschema Spermienmorphologie (modifiziert nach WEITZE 2001) Abweichung: Differenzierung: Kopfkappenveränderung deformiert, in Ablösung / abgelöst Kopfveränderungen deformierte Köpfe Halsveränderungen Plasmatropfen, paraxialer / retroaxialer Ansatz, Halsbruch Verbindungsstückveränderungen Plasmatropfen, deformiert, gebrochen fibrillär Haupt- und Endstückveränderungen aufgerollt, Plasmatropfen, Schleifenform um den Kopf gerollt, rudimentär Doppel- und Mehrfachmissbildungen Mehrfachschwänze, Doppelköpfe Unveränderte Spermien 37 Material und Methoden Tab.3.3: DAP= CASA-Parameter (modifiziert nach KLEWITZ 2009) Distance average path (µm): Die errechnete zurückgelegte Strecke der gemittelten Bahn zwischen Anfangs- und Endpunkt der Messung DCL= Distance curve line (µm): Die tatsächlich zurückgelegte Strecke des Spermiums zwischen Anfangs- und Endpunkt der Messung (Kurvolineare Strecke) DSL= Distance straight line (µm): Die errechnete Strecke zwischen Anfangsund Endpunkt der Messung VAP= Velocity average path (µm/s): Die Durchschnittsgeschwindigkeit des Spermienkopfes entlang der gemittelten Bahn VCL= Velocity curve line (µm/s): Die Geschwindigkeit des Spermiums auf der tatsächlichen, kurvolinearen Bahn VSL= Velocity straiht line (µm/s): Die errechnete Durchschnittsgeschwindigkeit des Spermiums entlang der geraden Linie zwischen dem ersten und letzten Punkt der erkannten Bahn STR= Straightness (VSL/VAP): Die Linearität der gemittelten Bahn LIN= Linearity (VSL/VCL): Die Linearität der tatsächlichen Bahn WOB= Wobble (VAP/VCL): Die Abweichung der tatsächlichen Bahn von der gemittelten Bahn ALH= Amplitude of lateral head displacement (µm): Die Größe des seitlichen Spermienkopfausschlages von der gemittelten Bahn BCF= Beat cross frequenzy (Schläge/s oder Hz): Die Kopfschlagfrequenz, berechnet aus der durchschnittlichen Anzahl der Kreuzpunkte der tatsächlichen Bahn mit der gemittelten Bahn MOT= Gesamtmotilität (%) PMS= Progressive Motilität (%) 38 Material und Methoden Magnetfeldtherapie t = 20 Minuten 6d / Woche Samengewinnung Beurteilung des n = 12 Hengste Deckverhaltens Dichtemessung und Bestimmung der Viabilität mittels Standardspermatologie Volumen Farbe Konsistenz Gesamtspermienzahl NucleoCounter™ Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate Morphologie schockgefrorene Nativprobe Verdünnung mit INRA82 (90 x 106 Spermien/ml) Lagerung bei -196°C Computervideomikrographische Durchflusszytometrische Untersuchung Untersuchung Motilität (SpermVision™) Abb.3.1: Schema des Versuchsaufbaus 39 Chromatinintegrität SCSA™-Test Material und Methoden Gesamtuntersuchungszeitraum Magnetfeldtherapie: 24 Wochen Oktober 2010 April 2011 Gruppe G1, n = 6 Hengste ( zwei Hengste jeder Altersgruppe) 6 Wochen Therapie 6 Wochen 6 Wochen keine Therapie Therapie 6 Wochen keine Therapie Gruppe G2, n = 6 Hengste ( zwei Hengste jeder Altersgruppe) - 6 Wochen 6 Wochen keine Therapie Therapie 6 Wochen 6 Wochen keine Therapie Therapie Therapie: Behandlung mit der Magnetfelddecke für 20 Minuten (Montag bis Samstag) Altersgruppe: junge Hengste (4-6 jährig), mittelalte Hengste (7-11 jährig) alte Hengste (12-23 jährig) Wöchentlicher Untersuchungsablauf Montag Mittwoch Samenentnahme und Untersuchung - Samenentnahme Freitag Samenentnahme und Untersuchung Samenentnahme: die Samenentnahme fand bei allen 12 Hengsten dreimal pro Woche statt Untersuchung: die Untersuchungen fanden Montag/Mittwoch/Freitag statt (hier nur beispielhaft dargestellt). Die Ejakulate jedes Hengstes wurden zweimal pro Woche untersucht Abb.3.2 Zeitschema des Versuchsaufbaus 40 Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1 Bestimmung des Einflusses einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität Im ersten Teil der Versuche wurde anhand von Zeitmessungen bei der Samenentnahme untersucht, inwieweit sich gepulste Magnetwellen auf das Sexualverhalten (Libido sexualis) von Hengsten auswirken. Die dabei gemessenen Zeitabschnitte sind Kapitel 3.4.1 zu entnehmen. Aus diesen einzelnen Zeitabschnitten wurde die Gesamtdauer des Deckaktes (Gesamtdeckzeit) bestimmt. Die Anzahl der Aufsprünge bis zur Ejakulation wurde als weiterer Parameter dokumentiert. Effekte bezüglich der Magnetfeldtherapie (Abb. 4.1/A) und des Alters der Hengste (Abb. 4.3/A) wurden nicht beobachtet (p ≥ 0,05). Wie in Abb. 4.2/A dargestellt, ergab die Varianzanalyse Unterschiede zwischen Abschnitt 1 und 2 (p = 0,0173), zwischen Abschnitt 1 und 3 (p = 0,0073) und zwischen Abschnitt 1 und 4 (p = 0,003). Bei der Betrachtung der Mittelwerte konnten in beiden Gruppen (G1/G2) ggr. längere Gesamtdeckzeiten für die Zeiträume mit Magnetfelddecke gesehen werden (Abb. 4.1/A). Bei der Betrachtung der einzelnen Versuchszeiträume zeigte sich in Gruppe 2 ein stetiger Anstieg der Werte der Gesamtdeckzeiten (in sec.) von Abschnitt 1 (60,13 ± 40,38) bis Abschnitt 4 (107,37 ± 44,51). In Gruppe G1 zeigte sich dieser Anstieg von Abschnitt 1 (104,20 ± 64,47) bis Abschnitt 3 (131,36 ± 71,54). In Abschnitt 4 kam es zu einem deutlichen Abfall der Gesamtdeckzeit (102,57 ± 41,51), der in Gruppe G2 nicht beobachtet werden konnte (Abb. 4.2./A). In Gruppe G1 zeigte die Mittelwertdarstellung (Abb. 4.3/A) die kürzeste Gesamtdeckzeit (in sec.) für die Hengste der Klasse „jung“ (104,53 ± 30,48) und die längste Gesamtdeckzeit für die Hengste der Klasse „alt“ (138,51 ± 102,57). In Gruppe G2 zeigten die Hengste der Klasse „mittel“ die längste Gesamtdeckzeit (98,36 ± 45,56) und die Hengste der Klasse „alt“ die kürzeste (54,14 ± 14,44). 41 Ergebnisse Abb.4.1: Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 42 Ergebnisse Abb.4.2: Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Zeitabschnitten (p ≤ 0,05) 43 Ergebnisse Abb.4.3: Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. 44 Ergebnisse Hinsichtlich der Anzahl der benötigten Aufsprünge bis zur Ejakulation ergab die Varianzanalyse keine signifikante Beeinflussung durch die Magnetfeldtherapie (Abb. 4.4/A). Auch die Faktoren „Zeit“ (Abb. 4.5/A) und „Alter“ (Abb. 4.6/A) führten zu keiner signifikanten Beeinflussung. Die Mittelwertdarstellung zeigte nahezu identische Werte bezüglich der Zeiträume mit und ohne Magnetfeldtherapie für die Gruppe G1. In der Gruppe G2 war der Wert für die Zeiträume mit Magnetfelddecke geringgradig höher als der Wert für die Zeiträume ohne Magnetfelddecke (Abb. 4.4/A). In der Gruppe G1 zeigten die Mittelwerte für die benötigten Aufsprünge einen nahezu einheitlichen Verlauf über die vier 6-Wochen Abschnitte. Dagegen zeigte sich in Gruppe G2 ein stetiger Anstieg der Werte von Abschnitt 1 bis Abschnitt 4 (Abb. 4.5/A) Abb. 4.6/A zeigt, dass die Klasse „jung“ der Gruppe G1 im Vergleich der Mittelwerte den geringsten Wert bezüglich der Anzahl der benötigten Aufsprünge aufwies (1,24 ± 0,46). Ein höherer Wert fand sich in der Klasse „mittel“ (1,39 ± 0,51) und ein wiederum höherer Wert war für die Klasse „alt“ zu verzeichnen (1,83 ± 0,66). Entgegengesetzt stellten sich die Werte der Gruppe G2 dar. Der niedrigste Wert ergab sich in der Klasse „alt“ (1,40 ± 0,49), gefolgt von der Klasse „mittel“ (1,60 ± 0,55) und der Klasse „jung“ (1,91 ± 0,57). 45 Ergebnisse Abb.4.4: Darstellung der benötigten Anzahl an Aufsprüngen bis zur Ejakulation für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen von zwei Versuchstagen pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 46 Ergebnisse Abb.4.5: Darstellung der benötigten Anzahl an Aufsprüngen bis zur Ejakulation über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen von zwei Versuchstagen pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 47 Ergebnisse Abb.4.6: Darstellung der benötigten Anzahl an Aufsprüngen bis zur Ejakulation in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen von zwei Versuchstagen pro Hengst und Woche ermittelt. 48 Ergebnisse 4.2 Untersuchungen zum Einfluss gepulster Magnetfelder auf die auf die Spermaqualität 4.2.1 Ergebnisse zum Einfluss der Magnetfeldtherapie Gesamtspermienzahl, den Anteil plasmamembranintakter Spermien und den Anteil progressiv motiler Spermien unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität In dem zweiten Teil der Versuche lag der Schwerpunkt der Untersuchungen auf der Überprüfung und Beurteilung spermatologischer Parameter, um eine potentielle Beeinflussung der Samenqualität durch gepulste Magnetfelder nachzuweisen. Bezüglich der Gesamtspermienzahl ergab die Varianzanalyse dabei weder eine signifikante Beeinflussung durch die Magnetfeldtherapie noch durch das Alter der Hengste (p ≥ 0,05). Wie in Abb. 4.8/A dargestellt, ergaben sich Unterschiede zwischen den Abschnitten 1 und 3 (p = 0,0012), 1 und 4 (p < 0,001), 2 und 4 (p < 0,001), 3 und 4 (p = 0,0059) und 2 und 3 (p = 0,0002). Die Mittelwerte (in %) zeigten nahezu identische Werte in Gruppe G2 (Abb. 4.7/A) bezüglich der Zeiträume mit (7,13 ± 3,27) und ohne (7,07 ± 2,97) Magnetfelddecke. In Gruppe G1 ergab sich ein ggr. höherer Wert für die Zeiträume mit Magnetfelddecke (10,57 ± 4,49) gegenüber den Zeiträumen ohne Magnetfelddecke (10,06 ± 4,65). Die Mittelwerte hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs über den Versuchszeitraum von 24 Wochen (Abb. 4.8/A) ergaben in Gruppe G1 einen stetigen Abfall von Abschnitt 1 (11,23 ± 4,59) bis Abschnitt 4 (8,96 ± 4,28). In Gruppe G2 ergaben sich höhere Mittelwerte in den Abschnitten 2 (8,0 ± 3,06) und 4 (8,4 ± 3,93) gegenüber den Abschnitten 1 (7,5 ± 3,32) und 3 (6,79 ± 3,21). Wie in Abb. 4.9/A dargestellt, wies die Klasse „alt“ die niedrigsten Mittelwerte (Mrd./Ejakulat) der Gruppe G1 auf (5,77 ± 2,11). Deutlich höher, dabei aber auf nahezu demselben Niveau lagen die Werte der Klasse „jung“ (12,57 ± 3,60) und „mittel“ (12,68 ± 3,72). In Gruppe G2 wies die Klasse „jung“ den niedrigsten Mittelwert auf (4,85 ± 2,74). Höhere Werte konnten in der Klasse „alt“ (7,17 ± 2,11) und der Klasse „mittel“ (9,29 ± 2,74) festgestellt werden. 49 Ergebnisse Abb.4.7: Darstellung der Gesamtspermienzahl (Mrd./Ejakulat) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 50 Ergebnisse Abb.4.8: Darstellung der Gesamtspermienzahl (Mrd./Ejakulat) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke a, b, c = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Zeitabschnitten (p ≤ 0,05) 51 Ergebnisse Abb.4.9: Darstellung der Gesamtspermienzahl (Mrd./Ejakulat) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. 52 Ergebnisse Als weiterer Parameter zur Beurteilung der Spermaqualität wurde der prozentuale Anteil plasmamembranintakter Spermien mit einem NucleoCounter® bestimmt (s. Kapitel 3.5). Die 3-faktorielle Varianzanalyse ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Zeiträumen mit und ohne Magnetfeldtherapie (Abb. 4.10/A). Auch das Alter der Hengste (Abb. 4.12/A) beeinflusste den prozentualen Anteil plasmamembranintakter Spermien nicht (p ≥ 0,05). Zwischen Abschnitt 1 und den Abschnitten 2, 3 und 4 ergab die Varianzanalyse jeweils einen Unterschied (p ≤ 0,001) (Abb.4.11/A). Die Darstellung der Mittelwerte (Abb. 4.10/A) zeigte in der Gruppe G1 einen 5,75 % höheren Wert für die Zeiträume mit Magnetfelddecke, in Gruppe G2 einen 5,59 % höheren Wert für die Zeiträume ohne Magnetfelddecke. Hinsichtlich der vier Versuchsabschnitte (Abb. 4.11/A) zeigten die Mittelwerte (in %) der Gruppe G2 von Abschnitt 1 (76,59 ± 9,9) bis Abschnitt 4 (59,67 ± 14,19) einen stetigen Abfall des prozentualen Anteils plasmamembranintakter Spermien. Der deutlichste Abfall lag dabei mit 11,72 % zwischen Abschnitt 3 und 4. In Gruppe G1 stellte sich über die ersten drei Abschnitte zunächst ein relativ konstanter Verlauf ein, ein deutlicher Abfall des Wertes um 14,55 % zeigte sich zwischen Abschnitt 3 und Abschnitt 4. Einen deutlich niedrigeren Mittelwert (in %) zeigte die Klasse „alt“ der Gruppe G1 (47,27 ± 16,38) im Gegensatz zu den Klassen „jung“ (74,46 ± 13,71) und „mittel“ (74,68 ± 13,24). In Gruppe G2 unterschieden sich die Klassen „jung“ (72,28 ± 15,34), „mittel“ (67,96 ± 14,45) und „alt“ (72,86 ± 11,06) nur geringgradig (Abb. 4.12/A). 53 Ergebnisse Abb.4.10: Darstellung des Anteils plasmamembranintakter Spermien (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 54 Ergebnisse Abb.4.11: Darstellung des Anteils plasmamembranintakter Spermien (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Zeitabschnitten (p ≤ 0,05) 55 Ergebnisse Abb.4.12: Darstellung des Anteils plasmamembranintakter Spermien (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. 56 Ergebnisse Des Weiteren wurde der prozentuale Anteil progressiv motiler Spermien mit Hilfe eines computerassistierten Spermienanalysesystems (CASA) zur Beurteilung der Spermaqualität bestimmt. Die Vorgehensweise ist in Kapitel 3.8 beschrieben. Die Varianzanalyse ergab keine signifikante Beeinflussung des prozentualen Anteils progressiv motiler Spermien durch die Magnetfeldtherapie (Abb. 4.13/A). Auch das Alter der Hengste (Abb. 4.15/A) führte zu keiner Beeinflussung des prozentualen Anteils progressiv motiler Spermien (p ≥ 0,05). Wie aus Abb. 4.14/A ersichtlich ist, ergaben sich folgende Unterschiede zwischen den vier 6-Wochen Abschnitten. Zwischen Abschnitt 1 und 2 (p ≤ 0,001), zwischen Abschnitt 1 und 3 (p = 0,0002), zwischen Abschnitt 2 und 3 (p = 0,0499), zwischen Abschnitt 2 und 4 (p ≤ 0,0001) und zwischen Abschnitt 3 und 4 (p = 0,0068). Die in Abb. 4.13/A dargestellten Mittelwerte bezüglich des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) zeigten für die Gruppe G1 ggr. niedrigere Werte für die Zeiträume mit Magnetfelddecke (57,70 ± 24,49) im Gegensatz zu den Zeiträumen ohne Magnetfelddecke (61,70 ± 26,69). In Gruppe G2 zeigten sich ggr. niedrigere Werte für die Zeiträume ohne Magnetfelddecke (53,65 ± 16,71) im Gegensatz zu den Zeiträumen mit Magnetfelddecke (60,25 ± 16,30). Der Verlauf der Mittelwerte über die vier Versuchsabschnitte stellte sich in den beiden Untersuchungsgruppen G1 und G2 identisch dar (Abb. 4.14/A). Dabei zeigte sich ein stetiger Abfall der Werte von Abschnitt 2 bis Abschnitt 4. Abschnitt 1 wies sowohl in Gruppe 1 (53,41 ± 23,27), als auch in Gruppe 2 (49,85 ± 17,21) die niedrigsten Werte auf. Die Klasse „alt“ zeigte in Gruppe G1 (33,64 ± 27,23) ebenso wie in Gruppe G2 (45,63 ± 17,83) die niedrigsten Mittelwerte hinsichtlich des prozentualen Anteils progressiv motiler Spermien. Die höchsten Werte fanden sich sowohl in der Gruppe G1 (75,20 ± 9,54), als auch in der Gruppe G2 (62,41 ± 15,77) in der Klasse „jung“. 57 Ergebnisse Abb.4.13: Darstellung des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 58 Ergebnisse Abb.4.14: Darstellung des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke a, b, c = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Zeitabschnitten (p ≤ 0,05) 59 Ergebnisse Abb.4.15: Darstellung des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. 60 Ergebnisse 4.2.2 Ergebnisse zum Einfluss der Magnetfeldtherapie auf die Spermienmorphologie und die Chromatinintegrität unter zusätzlicher Berücksichtigung des Alters und der Saisonalität Die Spermienmorphologie wurde anhand von Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparaten beurteilt. Die Vorgehensweise für diesen Versuchsabschnitt wird in Kapitel 3.6 erläutert. Wie aus Abb. 4.16/A hervorgeht ergab die Varianzanalyse bezüglich dieses Parameters keine Beeinflussung durch die Magnetfeldtherapie (p ≥ 0,05). Hinsichtlich des Alters der Hengste (Abb. 4.18/A) zeigte sich ein Unterschied zwischen der Klasse „jung“ und der Klasse „alt“ (p = 0,0185). Ein Unterschied bestand weiterhin zwischen Versuchsabschnitt 1 und Versuchsabschnitt 4 (p = 0,0027). Aus der Darstellung der Mittelwerte (Abb. 4.16/A) geht hervor, dass in Gruppe G1 die Zeiträume mit Magnetfelddecke (18,67 ± 11,46) im Gegensatz zu den Zeiträumen ohne Magnetfelddecke (18,10 ± 10,43) und in Gruppe G2 die Zeiträume ohne Magnetfelddecke (16,27 ± 5,47) im Gegensatz zu den Zeiträumen mit Magnetfelddecke (15,07 ± 4,76) ggr. höhere Anteile morphologisch abweichender Spermien (in %) aufwiesen. Bezüglich der Mittelwerte der vier 6-Wochen Abschnitte (Abb. 4.17/A) zeigte sich in Gruppe G1 ein nahezu konstanter Verlauf mit nur ggr. Abweichungen zwischen den einzelnen Abschnitten. Die höchsten Werte (in %) ergaben sich dabei für Abschnitt 1 (19,12 ± 11,86) und die niedrigsten Werte für Abschnitt 2 (17,83 ± 10,72). In Gruppe G2 konnte ein stetiger Abfall der Werte von Abschnitt 1 (17,28 ± 6,20) bis Abschnitt 4 (14,41 ± 4,87) verzeichnet werden. Aus Abb. 4.18/A geht hervor, dass sich in Gruppe G1 die höchsten Werte morphologisch abweichender Spermien (in %) für die Klasse „alt“ (29,24 ± 11,38) und die niedrigsten für die Klasse „jung“ (10,69 ± 5,0) ergaben. Auch in Gruppe G2 zeigte die Klasse „alt“ die höchsten Werte (18,84 ± 5,31) und die Klasse „jung“ die niedrigsten (14,25 ± 4,61). 61 Ergebnisse Abb.4.16: Darstellung des Anteils morphologisch abweichender Spermien (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 62 Ergebnisse Abb.4.17: Darstellung des Anteils morphologisch abweichender Spermien (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Zeitabschnitten (p ≤ 0,05) 63 Ergebnisse Abb.4.18: Darstellung des Anteils morphologisch abweichender Spermien (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Gruppen (p ≤ 0,05) 64 Ergebnisse Der DNA-Fragmentationsindex (DFI) wurde als weiterer Parameter zur Beurteilung der Spermaqualität herangezogen und mit Hilfe eines Durchflusszytometers bestimmt (s. Kapitel 3.7.2). Hinsichtlich dieses Parameters (Abb. 4.19/A) ergab die Varianzanalyse keine Beeinflussung durch die Magnetfeldtherapie (p ≥ 0,05). Ein Unterschied bedingt durch das Alter der Hengste (Abb. 4.21/A) bestand zwischen der Klasse „jung“ und der Klasse „alt“ (p = 0,0065), und zwischen der Klasse „mittel“ und der Klasse „alt“ (p = 0,047) Weiterhin bestanden Unterschiede zwischen den Abschnitten 2 und 4 (p = 0,0206) und den Abschnitten 3 und 4 (p = 0,0282) (Abb. 4.20/A). Der Mittelwertvergleich (Abb. 4.19/A) ergab in Gruppe 1 nahezu identische Werte (in %) zwischen den Zeiträumen mit Magnetfelddecke (17,39 ± 10,06) und den Zeiträumen ohne Magnetfelddecke (17,62 ± 9,61). In Gruppe G2 zeigten sich ggr. höhere Werte für die Zeiträume ohne Magnetfelddecke (12,35 ± 5,89) im Gegensatz zu den Zeiträumen mit Magnetfelddecke (11,67 ± 5,21). Die Mittelwerte (in %) bezüglich des Verlaufes über die vier 6-Wochen Abschnitte (Abb. 4.20/A) zeigten nur ggr. Unterschiede zwischen den einzelnen Abschnitten in den Gruppen G1 und G2. Lediglich zwischen Abschnitt 3 (12,63 ± 5,45) und Abschnitt 4 (10,94 ± 5,36) der Gruppe G2 konnte ein deutlicherer Abfall des Wertes festgestellt werden. In der Gruppe G1 zeigte sich zwischen der Klasse „jung“ (11,41 ± 4,65) und der Klasse „mittel“ (11,15 ± 1,98) nur ein ggr. Unterschied (in %). Die Klasse „alt“ dagegen zeigte einen deutlich höheren Wert (29,63 ± 6,10). In Gruppe G2 fand sich der niedrigste Wert in der Klasse „jung“ (7,51 ± 1,52) und der höchste in der Klasse „alt“ (15,47 ± 3,56). 65 Ergebnisse Abb.4.19: Darstellung des DNA-Fragmentationsindex (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke 66 Ergebnisse Abb.4.20: Darstellung des DNA-Fragmentationsindex (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. jung / mittel / alt = Altersgruppeneinteilung (4-6 Jahre / 7-11 Jahre / 12-23 Jahre) + / - = Zeitraum mit Magnetfelddecke / ohne Magnetfelddecke a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Zeitabschnitten (p ≤ 0,05) 67 Ergebnisse Abb.4.21: Darstellung des DNA-Fragmentationsindex (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt. a, b = Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant zwischen den Gruppen (p ≤ 0,05) 68 Diskussion 5. Diskussion 5.1 Darstellung der Versuchsziele Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob bei Hengsten durch die Behandlung mit gepulsten Magnetfeldern eine positive Beeinflussung ihres Deckverhaltens hervorgerufen werden kann. Um dafür die Geschlechtslust der Hengste beurteilen zu können, wurden Zeitintervalle während der routinemäßigen Samenentnahme im Sprungraum gemessen. Zudem wurde die Anzahl der Aufsprünge bis zur Ejakulation standardspermatologischer, dokumentiert. Des Weiteren durchflusszytometrischer und sollte mittels computervideo- mikrographischer Verfahren eine Beurteilung der Spermienquantität und –qualität erfolgen. Dazu wurden sowohl die Gesamtspermienzahl, die Plasmamembranintegrität und die Morphologie als auch die progressive Motilität und die Chromatinintegrität der Samenzellen bestimmt. Im Rahmen der Versuche wurde auch der Einfluss des Alters der Hengste und der Jahreszeit auf das Deckverhalten und die untersuchten spermatologischen Parameter beurteilt. 5.2 Effekte der gepulsten Magnetfeldtherapie, des Alters und des Behandlungsabschnitts auf das Deckverhalten von Hengsten Das Deckverhalten wurde durch die Gesamtdeckzeit und die Anzahl der Aufsprünge bestimmt. Die Gesamtdeckzeit teilten PICKETT et al. (1970) in einen Zeitraum auf, der vom Betreten des Deckraumes bis zum Aufsprung („reaction time“) und vom Aufsprung bis zur Ejakulation („copulation time“) gemessen wurde. PICKETT et al. (1976) beschränkten sich auf den Zeitraum vom Betreten des Deckraumes bis zum Aufsprung auf das Phantom bzw. die Stute („reaction time“). HARRIS et al. (1983) beschrieben den als „reaction time“ bezeichneten Abschnitt als Zeitraum vom ersten Aufsprung bis zur Ejakulation. Die Dauer eines Therapiezeitraumes in den hier durchgeführten Versuchen belief sich auf sechs Wochen. Daran schloss sich jeweils ein sechswöchiger therapiefreier Zeitraum an. Zwei Untersuchungsgruppen durchliefen diese Zeiträume alternierend zweimal hintereinander. Auf diese Weise 69 Diskussion war im gleichen zeitlichen Abschnitt ein direkter Vergleich zwischen einem Therapiezeitraum und einem therapiefreien Zeitraum möglich. Dies jedoch anhand unterschiedlicher Individuen. Die Ergebnisse zeigen, dass unter den Bedingungen dieser Versuchsreihe die gepulste Magnetfeldtherapie zu keiner Beeinflussung des Deckverhaltens geführt hat. Dies beinhaltet sowohl die Gesamtdeckzeit als auch die Anzahl der Aufsprünge, die die Hengste bis zur Ejakulation benötigten. Hersteller von Magnetfeldsystemen geben eine ganze Reihe an Wirkungen an, die durch den Einsatz gepulster Magnetfelder hervorgerufen werden sollen. Beispielhaft seien genannt: Aktivierung des Zellstoffwechsels, Verbesserung der Durchblutung und der Sauerstoffversorgung Schmerzzustände, Steigerung der Zellen, Aktivierung der körperlichen Linderung des akuter Hormonsystems, Leistungsfähigkeit und chronischer Stressreduzierung (FISCHER et al. und 2002). Dementsprechend ergeben sich viele Möglichkeiten der Anwendung. Die unter diesem Aspekt aufgestellte Hypothese, dass die Anwendung einer gepulsten Magnetfeldtherapie das allgemeine körperliche Wohlbefinden und die Leistungsfähigkeit steigert, was zu einer Verbesserung der Deckfähigkeit führt, konnte unter den Bedingungen dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. PICKETT et al. (1970 und 1976) zeigen in ihren Arbeiten, dass prinzipiell längere Deckzeiten in den Herbst- und Wintermonaten (September – März) im Gegensatz zu den Frühjahrs- und Sommermonaten (April - August) vorliegen. Als Ursache für die verkürzten Deckzeiten vermuten PICKETT et al. (1976) und BERNDTSON et al. (1974) erhöhte Testosteronkonzentrationen in diesen Monaten; signifikante Zusammenhänge konnten jedoch nicht nachgewiesen werden. AURICH et al. (1998) sehen keinen Zusammenhang zwischen der Ausprägung der Libido sexualis und der Testosteronkonzentration. In der vorliegenden Arbeit ist zu berücksichtigen, dass die Versuche hauptsächlich in den Herbst- und Wintermonaten durchgeführt wurden, so dass eine mögliche Verkürzung der Deckzeit, wie beschrieben, nicht deutlich ersichtlich wird. Gesamtdeckzeiten Lediglich (Abb. Abschnitt 4.2/A). Da eins die zeigte signifikant geringere Testosteronkonzentration nach mehrwöchiger Deckruhe bereits innerhalb weniger Tage signifikant absinkt (AURICH et al. 1999), kann man vermuten, das sich die geringere Gesamtdeckzeit, anstatt 70 Diskussion durch eine erhöhte Testosteronkonzentration, durch die fehlende Samenentnahme erklären lässt, die durch die zweimonatige Deckruhe vor Versuchsbeginn bedingt war. PICKETT et al. (1976) geben zudem an, dass bei Hengsten sowohl eine individuelle als auch eine exogene Beeinflussung des Deckverhaltens existiert. PICKETT et al. (1970) beschreiben, dass ältere, erfahrenere Hengste eine verkürzte Deckzeit zeigen und vermuten die Ursache in häufigerem und daher routinierterem Deckeinsatz. Bezüglich der Anzahl der benötigten Aufsprünge bis zur Ejakulation war in der vorliegenden Arbeit ein leichter Anstieg der Werte über den Versuchszeitraum zu erkennen. Auch diesbezüglich sehen PICKET et al. (1970 und 1976) deutlich niedrigere Werte in den Frühjahrs- und Sommermonaten. KLUG et al. (1999) weisen auf die erhöhte Sensitivität junger und unerfahrener Hengste hin, so dass dadurch eine erhöhte Anzahl an Aufsprüngen zu erklären ist, so wie sie in der Klasse „jung“ der Gruppe G1 in den ersten beiden Versuchsabschnitten zu beobachten war. 5.3 Effekte der gepulsten Magnetfeldtherapie auf die untersuchten spermatologischen Parameter Der Spermatogenesezyklus eines Hengstes hat eine Gesamtdauer von 57 Tagen. Nach Bildung der Spermien in den Hodentubuli erfolgt im Nebenhodenkopf und im Nebenhodenkörper ihre Reifung, wodurch die Spermien ihre Befruchtungs- und Bewegungsfähigkeit erhalten. Die Lagerung der befruchtungsfähigen Spermien erfolgt im Nebenhodenschwanz. Eine eventuell stattfindende exogene Beeinflussung durch die gepulste Magnetfeldtherapie muss somit in dem Zeitraum eines Spermatogenesezyklus oder während der Reifungsphase im Nebenhoden erfolgen. Die gepulste Magnetfeldtherapie führte unter den Bedingungen dieser Arbeit jedoch zu keiner signifikanten Beeinflussung der spermatologischen Parameter, wodurch die Beeinflussung der Gonadenaktivität durch die gepulste Magnetfeldtherapie als fraglich angesehen werden muss. Angaben in der Literatur bezüglich des Einflusses gepulster Magnetfelder auf die Gonadenaktivität fanden sich zudem nicht. 71 Diskussion 5.4 Effekte des Alters und des Behandlungsabschnitts auf die untersuchten spermatologischen Parameter Das Alter der Hengste wirkte sich in dieser Arbeit nicht signifikant auf die Gesamtspermienzahl, die progressive Motilität und den Anteil plasmamembranintakter Spemien aus. Die Gesamtspermienzahl und den Anteil progressiv motiler Spermien sehen BLANCHARD et al. (2012) bei Hengsten ab einem Alter von 20 Jahren signifikant reduziert. AMANN et al. (1979) und DOWSETT und KNOTT (1996) beschreiben niedrigere Gesamtspermienzahlen bei Junghengsten bis zu einem Alter von vier Jahren und bei älteren Hengsten bereits ab einem Alter von 14-16 Jahren. Die Ergebnisse zeigen signifikant erhöhte Werte bezüglich des prozentualen Anteils morphologisch abweichender Spermien und des prozentualen Anteils chromatingeschädigter Spermien in der Altersklasse „alt“. Deutliche individuelle Einflüsse einzelner Hengste sind dabei zu verzeichnen. DOWSETT und KNOTT (1996) und KLEWITZ (2009) beschreiben einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem Alter der Hengste und dem Anteil morphologisch abweichender Spermien. Danach ist sowohl bei Junghengsten (< 3 Jahre) als auch bei älteren Hengsten (> 14 Jahre) mit höheren Anteilen morphologisch abweichender Spermien zu rechnen. BLOTTNER et al. (2001) sehen die Chromatinintegrität in ihrer Arbeit kaum durch das Alter der Hengste oder durch die Jahreszeit beeinflusst. KLEWITZ (2009) konnte einen Zusammenhang zwischen erhöhten DFI-Werten und dem Alter der Hengste nachweisen. Auch BLANCHARD et al. (2012) stellten bei über 20 Jahre alten Hengsten sowohl erhöhte Werte morphologisch abweichender Spermien als auch erhöhte DFI-Werte der Spermien fest. Über den Versuchszeitraum war ein Abfall der Werte bezüglich der Gesamtspermienzahl zu beobachten. Auch PICKETT et al. (1970 und 1976), HARRIS et al. (1983), JOHNSON und THOMPSON (1983), CLAY und CLAY (1992), und JANETT et al. (2003), sehen niedrigere Gesamtspermienzahlen in den Herbstund Wintermonaten. Deutlich höhere Werte finden sich erst in den Monaten Mai bis Juli. Der Anteil progressiv motiler Spermien war bereits im ersten Versuchsabschnitt signifikant reduziert. Dies lag wahrscheinlich in der fehlenden regelmäßigen 72 Diskussion Samenentnahme im Vorfeld der Versuche begründet, wodurch sich die Spermaqualität im Allgemeinen verschlechterte. Nur durch eine regelmäßige Samenentnahme kann sich das Niveau der Spermaqualität erhöhen (AURICH et al. 1998). Von Abschnitt 2 an, der sich bereits durch signifikant höhere Werte auszeichnete, zeigte sich ein stetiger Abfall der Werte. JANETT et al. (2003) und JASKO et al. (1991) beobachteten in den Sommer- und Herbstmonaten eine erhöhte progressive Motilität der Spermien. Dagegen stellten BLOTTNER et al. (2001) im Dezember eine höhere Motilität als im Mai fest. Letztgenannte Autoren untersuchten allerdings die Gesamtmotilität und beschränkten sich dabei lediglich auf die beiden genannten Monate. Keinen saisonalen Einfluss bezüglich der Motilität fanden PICKETT et al. (1976) und WRENCH et al. (2010). Der Verlauf der Werte des prozentualen Anteils plasmamembranintakter Spermien war dem der progressiven Motilität ähnlich. Signifikant niedrigere Werte fanden sich nur im vierten Versuchsabschnitt. JANETT et al. (2003) fanden in kryokonservierten Ejakulaten signifikant geringere Anteile plasmamembranintakter Spermien im Sommer. Die Werte hinsichtlich des Anteils morphologisch abweichender Spermien stellten sich in dieser Arbeit als relativ homogen verlaufend über den Gesamtversuchszeitraum dar. Die signifikant höchsten Werte waren dabei im ersten Versuchsabschnitt festzustellen. JANETT et al. (2003) und BLOTTNER et al. (2001) beschreiben höhere Anteile morphologisch abweichender Spermien während der Sommermonate (Mai bis August). WRENCH et al. (2010) fanden die höchsten Anteile morphologisch intakter Spermien im Frühjahr. Die Werte bezüglich der Chromatinintegrität zeichnen sich in der vorliegenden Arbeit ebenfalls durch einen relativ homogenen Verlauf über den Gesamtversuchszeitraum aus. 73 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Holger Tesche (2013) Einfluss einer gepulsten Magnetfeldtherapie auf das Deckverhalten und die Spermaqualität von Warmbluthengsten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu überprüfen, ob durch eine gepulste Magnetfeldtherapie das Deckverhalten und die Spermaqualität von Hengsten beeinflusst werden kann. Das Deckverhalten wurde durch Zeitmessungen während der Samenentnahme bestimmt. Die dadurch ermittelte Gesamtdeckzeit erstreckte sich vom Betreten der Deckhalle bis zur Ejakulation. Zusätzlich wurde die Anzahl der Aufsprünge dokumentiert. Zur Bestimmung der Spermaqualität wurden spermatologische Parameter ermittelt. Dabei wurden die Gesamtspermienzahl und der prozentuale Anteil plasmamembranintakter Spermien mit Hilfe eines Nucleocounters bestimmt. Der prozentuale Anteil progressiv motiler Spermien wurde mittels computerassistierter Spermienanalyse bestimmt. Eosin-Nigrosin Ausstrichpräparate wurden zur Beurteilung der Spermienmorphologie angefertigt und die Chromatinintegrität der Spermien mit Hilfe des Sperm-Chromatin-StructureAssays (SCSA) ermittelt. Für die Untersuchungen standen insgesamt 12 Hengste des Niedersächsischen Landgestüts Celle zur Verfügung. Die Versuche erstreckten sich von Oktober 2010 bis Anfang April 2011 über insgesamt 24 Wochen. Dieser Gesamtversuchszeitraum war in Abschnitte von jeweils sechs Wochen untergliedert. An einen Therapiezeitraum schloss sich ein therapiefreier Zeitraum an. Diese Prozedur wurde zwischen den Untersuchungsgruppen G1 (n = 6) und G2 (n = 6) zweimal alternierend durchgeführt. Auch der Einfluss des Alters wurde in den Untersuchungen berücksichtigt. Dafür waren die Untersuchungsgruppen G1 und G2 in drei Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils 2 Hengsten/Klasse unterteilt. Die gepulste Magnetfeldtherapie führte dabei zu keinen signifikanten Unterschieden zwischen den Therapieabschnitten mit und ohne Magnetfelddecke in Bezug zum Deckverhalten und den untersuchten spermatologischen Parametern. Auch das Alter der Hengste führte in dieser Arbeit zu keiner signifikanten Beeinflussung des Deckverhaltens. Die Gesamtspermienzahl, der prozentuale Anteil progressiv motiler 74 Zusammenfassung Spermien und der prozentuale Anteil plasmamembranintakter Spermien waren ebenfalls nicht abhängig vom Alter. Dagegen waren die prozentualen Anteile morphologisch abweichender und chromatingeschädigter Spermien bei den Hengsten der Klasse „alt“ signifikant erhöht. Bezüglich der Gesamtdeckzeit zeigten sich signifikant niedrigere Werte im ersten Versuchsabschnitt im Gegensatz zu den folgenden drei Versuchsabschnitten. Die Anzahl der Aufsprünge wurde nicht signifikant beeinflusst. Der Parameter Gesamtspermienzahl wies in den letzten beiden Versuchsabschnitten signifikant niedrigere Werte gegenüber den beiden ersten Abschnitten auf. Der prozentuale Anteil plasmamembranintakter Spermien zeigte signifikant niedrigere Werte im vierten Versuchsabschnitt. Signifikant höhere Werte bezüglich des prozentualen Anteils progressiv motiler Spermien zeigten sich in Abschnitt 2 und 3. Hinsichtlich des prozentualen Anteils morphologisch abweichender Spermien fanden sich signifikant höhere Werte im ersten gegenüber dem letzten Versuchsabschnitt. Der prozentuale Anteil chromatingeschädigter Versuchsabschnitt signifikant niedrigere Werte. 75 Spermien zeigte im letzten Summary 7. Summary Holger Tesche (2013) The Effect of Pulsed Magnetic Field Therapy on sexual behaviour and sperm quality of warmblood stallions. The aim of this study was to determine if sexual behavior and sperm quality were affected by pulsed magnetic field therapy. Sexual behavior patterns were determined by time recordings during the semen collection process, and ejaculation latency was determined as the time period from entering the collection room until ejaculation. In addition, the number of mounts was recorded. To determine sperm quality, several spermatological parameters were evaluated including percentages of motile and morphologically normal sperm and plasmamembrane and chromatin integrity. A nucleocounter was used to determine the total number of sperm and percentage of plasma membrane intact sperm. The percentage of progressively motile sperm was determined using computer assisted sperm analysis microscopically. Eosin-nigrosinstained sperm smears were prepared to evaluate sperm morphology. Chromatin integrity of spermatozoa was determined using the sperm-chromatin-structure-assay (SCSA). In total 12 stallions were used for the studies described in this thesis, belonging to the National Stud of Lower Saxony in Celle, Germany. The studies were performed during 24 weeks, from October 2010 to April 2011. This period was divided into 4 six week periods in which magnetic field therapy was applied followed by a period without therapy resulting in 2 six week periods of magnetic field therapy. There were two groups of 6 stallions each (G1 and G2) that were treated alternating this way. The groups of stallions included 2 stallions classificated young, mature and old. In the current study it was found that pulsed magnetic field therapy did not show significant differences with regards to sexual behavior and spermatological parameters as compared to periods without treatment. Also, the age of the stallions did not significantly affect sexual behavior. The total number of sperm in an ejaculate as well as the percentages of progressively motile and plasma membrane intact sperm were not significantly affected by the age of the stallions. In contrast, 76 Summary percentages of sperm with abnormal morphology and less chromatin integrity were significantly elevated for stallions classified as “old”. With regard to the ejaculation latency, significantly lower durations were found for the first six week period compared to the following periods. The number of mounts on the phantom was not significantly affected. The total number of sperm in an ejaculate was significantly lower in the last two six week periods compared to the first two six week periods. The percentage of plasma membrane intact sperm was significantly lower in the last six week period. Significant higher values of the percentage of progressively motile sperm were shown in the second and third six week periods. The percentage of morphologically abnormal sperm was significantly lower in the first six week period compared to last six week period. The percentage of chromatin damaged sperm was significantly lower in the last six week period. 77 Literaturverzeichnis 8. Literaturverzeichnis Jahresbericht FN (2011) Deutsche Reiterliche Vereinigung AMANN, R. P., D. L. THOMPSON, JR., E. L. SQUIRES und B. W. PICKETT (1979): Effects of age and frequency of ejaculation on sperm production and extragonadal sperm reserves in stallions. J. Reprod. Fertil .Suppl. 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Anhang 9.1 Abbildungsverzeichnis Abb. 2.1 autokrin-parakrine Regulation der Hodenfunktion (modifiziert nach ROSER 2008).................................................................................. 27 Abb. 2.2 Ausgewählte Impulsformen, die bisher in Untersuchungen mit gepulsten magnetischen Feldern eingesetzt wurden (modifiziert nach MARKOV 2007 (a-c) und WATKINS et al. 1985 (d))........................ 28 Abb. 3.1 Schema des Versuchsaufbaus................................................................. 39 Abb. 3.2 Zeitschema des Versuchsaufbaus............................................................ 40 Abb. 4.1 Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 42 Abb. 4.2 Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt.............................................. 43 Abb. 4.3 Darstellung der Gesamtdeckzeit (in sec.) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung 91 Anhang mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt............................... 44 Abb. 4.4 Darstellung der benötigten Anzahl an Aufsprüngen für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 46 Abb. 4.5 Darstellung der benötigten Anzahl an Aufsprüngen über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt.................................................................................. 47 Abb. 4.6 Darstellung der benötigten Anzahl an Aufsprüngen in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt............................... 48 Abb. 4.7 Darstellung der Gesamtspermienzahl (Mrd./Ejakulat) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit 92 Anhang jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 50 Abb. 4.8 Darstellung der Gesamtspermienzahl (Mrd./Ejakulat) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 51 Abb. 4.9 Darstellung der Gesamtspermienzahl (Mrd./Ejakulat) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt............................... 52 Abb. 4.10 Darstellung des Anteils plasmamembranintakter Spermien (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 54 Abb. 4.11 Darstellung des Anteils plasmamembranintakter Spermien (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) 93 Anhang mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 55 Abb. 4.12 Darstellung des Anteils plasmamembranintakter Spermien (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt............................... 56 Abb. 4.13 Darstellung des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 58 Abb. 4.14 Darstellung des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 59 Abb. 4.15 Darstellung des Anteils progressiv motiler Spermien (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert 94 Anhang in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 60 Abb. 4.16 Darstellung des Anteils morphologisch abweichender Spermien (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt.............................................. 62 Abb. 4.17 Darstellung des Anteils morphologisch abweichender Spermien (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt.............................................. 63 Abb. 4.18 Darstellung des Anteils morphologisch abweichender Spermien (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt............................... 64 Abb. 4.19 Darstellung des DNA-Fragmentationsindex (in %) für die Zeiträume mit und ohne Magnetfelddecke (jeweils 12 Wochen) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. 95 Anhang Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 66 Abb. 4.20 Darstellung des DNA-Fragmentationsindex (in %) über den Versuchszeitraum von 24 Wochen. Eine Säule entspricht einem Abschnitt von 6 Wochen. Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit 12 Hengsten, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 6 Hengsten. Fig.B: Gruppe 1 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Fig.C: Gruppe 2 unterteilt in die Altersklassen (jung/mittel/alt) mit jeweils zwei Hengsten/Klasse. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt......................................................................................... 67 Abb. 4.21 Darstellung des DNA-Fragmentationsindex (in %) in Bezug zum Alter der Hengste. Eine Säule entspricht einer Altersklasse (jung/mittel/alt). Fig.A: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, sowie Einzelgruppendarstellung mit jeweils 2 Hengsten/Klasse. Fig.B: Gesamtgruppendarstellung mit jeweils 4 Hengsten/Klasse, untergliedert in vier 6-Wochen Abschnitte. Es wurden Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei Ejakulaten pro Hengst und Woche ermittelt............................... 68 9.1 Tabellenverzeichniss Tab. 2.1 Parameter zur Charakterisierung der magnetischen Feldexposition (modifiziert nach SCHMIDT-ROHLFING et al. 2000)................................ 27 Tab. 3.1 Technische Daten VET-System M-1000................................................... 37 Tab. 3.2 Beurteilungsschema Spermienmorphologie............................................. 37 Tab. 3.3 CASA-Parameter...................................................................................... 38 96 10. Danksagung Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Harald Sieme, danke ich für die Überlassung des Dissertationsthemas und seiner Hilfe bei der wissenschaftlichen Ausarbeitung. Ganz besonders möchte ich mich bei Frau Harriëtte Oldenhof, PhD, aus der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken bedanken, die mir ohne zu zögern Ihre Hilfe angeboten hat und die mir stets mit Rat und Tat bei der Ausarbeitung dieser Arbeit zur Seite gestanden hat. Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Landstallmeister Dr. Axel Brockmann und seiner Familie, nicht nur für die Bereitstellung der Hengste des Niedersächsischen Landgestüts Celle, sondern auch für viele lustige und unterhaltsame Momente während meiner Zeit in Celle. Dieser Dank gilt natürlich auch ganz besonders Frau Dr. Gunilla Martinsson, die mir nicht nur alle Freiheiten bei der Durchführung meiner Versuche gelassen hat, sonder von der ich viele Dinge lernen konnte, die mir für mein weiteres berufliches Leben sicher nützlich sein werden. Besonders dankbar bin ich meinen Mitstreitern der KB Celle/Adelheidsdorf, Hanno und Britta mit Cleo, Stefan, Mareike, Marina, Swantje und Fanziska, für die zwar manchmal anstrengende aber trotzdem schöne gemeinsame Zeit, genauso wie den Mitarbeitern der Stationen Celle und Adelheidsdorf, Ulli, Susi, Otto, Albert und natürlich Locke (Rene), der uns durch seine witzige Art jeden frühen Morgen in der Deckhalle gut überstehen lies. Ebenso danke ich Frau Dr. Sabine Plass für ihre unermüdliche Hilfe, sowohl bei meinen Versuchen, als auch bei der täglichen Arbeit im Labor während der Decksaison und ihre dabei stets freundliche und ruhige Art. Bei meinen Eltern Werner und Marianne Tesche möchte ich mich besonders bedanken, da ohne sie meine gesamte Ausbildung nicht möglich gewesen wäre. Den „Huberten“ und allen anderen Freunden aus Hannover danke ich für eine unvergessene Studentenzeit. Mein größter Dank aber gilt meiner Freundin Jessica Schaper, die mir bereits seit vielen Jahren, während meiner Ausbildungszeit, dem Studium und der folgenden Doktorandenzeit, immer zur Seite gestanden hat. 97
