Skript zum Grundkurs
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1 2 Grundstudium Biologie Grundkurs V Sommersemester 2004 Teil Mikrobiologie Allgemeines und allgemeine Vorschriften (S. 3) Kursthemen: I. Anreicherungskulturen, Sterilisationsverfahren (S. 4 - 6) II. Anreicherungskulturen (S. 7 - 11) III. Auswertung der Anreicherungskulturen, Reinkulturen, Anaerobentechnik, steriles Arbeiten, mikroskopische Untersuchung von Bakterien (S. 12 - 16) IV. Identifizierung von Bakterien, Morphologie, Cytologie, spezifische Stoffwechselleistungen. (S. 17 - 22) V. Hemmung des Wachstums und Abtötung (S. 23 - 26) VI. Wachstum (S. 27 - 29) Anhang (ab S. 30 ) Allgemeines 3 Ziel dieses Praktikumteils ist es, die Studierenden der Biologie mit ausgewählten Gruppen von Bakterien und ihren Aktivitäten sowie mit einigen Arbeitstechniken der Mikrobiologie vertraut zu machen. Für die erfolgreiche Teilnahme wird der Stoff der einführenden Grundvorlesung in Mikrobiologie empfohlen. Über Beobachtungen, Versuchsablauf und die Ergebnisse soll von den einzelnen Teilnehmern ein Protokoll angefertigt werden. Das Protokollheft muss zu jedem Praktikumstag mitgebracht und gegebenenfalls dem Praktikumsleiter vorgelegt werden. Allgemeine Arbeitsvorschriften Zu Beginn des Praktikums werden Sie über die relevanten Vorschriften der Gefahrenstoffverordnung und Sicherheitsvorschriften belehrt. Aus Gründen der Hygiene und Arbeitssicherheit ist im Praktikumsraum Essen, Trinken und Rauchen strikt untersagt. Aus eigenem Interesse sollte ein Schutzkittel getragen werden. Zum Pipettieren müssen grundsätzlich Pipettierhilfen verwendet werden, denn Pipettieren mit dem Mund ist nicht statthaft. Nach dem Arbeiten sollen die Hände und die Tischflächen mit einer Desinfektionslösung desinfiziert werden. Bakterien werden so gehandhabt, dass sie sich nur in abgeschlossenen Gefäßen befinden. Impfösen, Impfnadeln und Drigalskispatel werden nach Berührung mit Standortmaterial oder Anreicherungskulturen abgeflammt. Gebrauchte Pipetten nicht auf den Tisch, sondern in die Ständer und nach dem Gebrauch in die mit Desinfektionslösung gefüllten Behälter stellen. Verunreinigungen des Arbeitsbereichs müssen sofort mit einem Desinfektionsmittel aufgewischt werden. Desinfizieren Sie bei Kontamination und immer nach dem Arbeiten die Hände bzw. andere kontaminierte Körperteile. Alle verarbeiteten Kulturgefäße und sonstige Ansätze werden von den Teilnehmern mit Versuchsnummer, Datum, Gruppennummer und anderen Kurzbezeichnungen beschriftet. Mikroskope, Wasserbäder und andere Geräte sowie Glasgeräte sorgfältig behandeln! Für Abfälle stehen Behälter zur Verfügung. Gebrauchte Petrischalen mit Kulturen werden in Metalleimern mit Plastiksäcken gesammelt. Gebrauchte Glasgefäße werden in Plastikschüsseln gesammelt. In die auf dem Fußboden stehenden Plastikeimer werden benutzte Zellstofftücher, Abstrichtupfer, Papier und Watte gegeben. Alle Pipettengefäße werden am Ende des Tisches zusammengestellt. Sämtliche Glasabfälle in den dafür vorgesehenen Behälter tun. Am Ende des Praktikums hinterlassen Sie bitte Ihren Arbeitsplatz aufgeräumt und mit Desinfektionsmittel gereinigt. Die Bunsenbrenner werden gelöscht und die Gashähne geschlossen. Die Mikroskope werden ausgeschaltet, Objektträger entfernt und Objektiv und Objekttisch sorgfältig mit einem Linsentuch gereinigt, am Objektivrevolver wird das kleine Objektiv eingerastet. Das Elektrokabel wird aufgerollt und am Okularteil aufgehängt. . I. KURS: ANREICHERUNGSKULTUREN; STERILISATIONSVERFAHREN 4 Wie unter allen Lebewesen, so gibt es auch unter den Mikroorganismen anspruchsvolle und weniger anspruchsvolle Formen, - Spezialisten und Organismen mit weniger ausgeprägten Eigenschaften. Entsprechend lassen sich Mikroorganismen durch die Wahl der Kulturmethoden selektiv anreichern. Anreicherungskulturen dienen zur Gewinnung von Reinkulturen. Das Vorliegen von Reinkulturen aber ist im allgemeinen die grundlegende Voraussetzung für wissenschaftliche Untersuchungen an Mikroorganismen sowie für die medizinische, Lebensmittel-mikrobiologische und ökologische Diagnostik. Da Mikroorganismen definitionsgemäß < 1mm groß sind, lassen sie sich im allgemeinen erst dann feststellen, wenn sie bereits in größeren Mengen vorliegen. Für die Haltung von Reinkulturen ist es deshalb notwendig, dass rechtzeitig der Befall mit Fremdkeimen (Kontaminanten) verhindert wird. Hierzu sind sterile Arbeitstechniken erforderlich, die sowohl die Sterilisation der Nährmedien und der für die Kultur erforderlichen Gerätschaften als auch die Technik der Weiterführung von Reinkulturen (Umfüllen von Nährmedien und deren Beimpfung) umfassen. Der erste Kurstag soll die Studierenden mit grundlegenden Techniken des sterilen Arbeitens vertraut machen. Über geeignete Versuche soll verdeutlicht werden, weshalb bestimmte Sterilisationsbedingungen einzuhalten sind (z. B. Unterschiede zwischen Sterilisation durch trockene oder feuchte Hitze, Wahl genügend hoher Sterilisationstemperaturen). Darüber hinaus sollen erste Anreicherungskulturen auf der Grundlage relativ einfacher Selektionskriterien angesetzt werden. (Am 2. Kurstag werden dann Stoffwechselspezialisten angereichert). 1. Ansetzen des Nährmediums GPH Versuch I. 1 Das Medium “Glucose-Pepton-Hefeextrakt” (GPH, siehe Anhang) ist ein komplexes Nährmedium, das die Nährstoffansprüche einer Vielzahl an Bakterien erfüllt. • Von dem Nährmedium GPH setzt jede Gruppe ein Volumen von 500 ml an • nach dem Einstellen des pH-Wertes werden 100 ml davon (vor der Zugabe von Agar-Agar) in 300 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt (zur späteren Verwendung als Flüssigmedium), • die verbleibenden 400 ml werden in 500 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt und mit der angegebenen Menge an Agar-Agar versetzt ( zur späteren Verwendung als Nähragar ) • anschließend werden die Medien 15 - 20 min im Autoklaven sterilisiert • nach dem Abkühlen auf ca 50 °C werden mit dem GPH-Agar-Medium Platten (in die Unterschale der Petrischale) unter Einhaltung steriler Bedingungen gegossen. • Die Flüssigmedien (100 ml) werden für anschließende Sterilisationsversuche benötigt. 2. Sterilisationsverfahren Die Anwendung der gebräuchlichen Sterilisationsverfahren ist durch die Art des Sterilisiergutes bestimmt. Während temperaturresistente Gerätschaften (z. B. aus Glas oder Metall) bei trockner Hitze im Bereich um 180 °C sterilisierbar sind, können hitzelabile Materialien (Flüssigkeiten, Plastikmaterialien) bei mäßiger Hitze, mit Hilfe von chemischen Agenzien, durch Filtration oder durch kurzwellige Strahlung sterilisiert werden. Flüssigkeiten werden im Labor bevorzugt bei feuchter Hitze (Kochen, Autoklavieren) sterilisiert. Beim Kochen unter Normaldruck können maximal bis 100 °C erreicht werden. Diese Temperatur reicht häufig nicht aus, um hitzeresistente 5 Formen (z. B. Sporen) abzutöten. Deshalb sollte das Sterilisiergut nach 30 minütigem Aufkochen und einer 4 stündigen Standphase bei Raumtemperatur (Sporen keimen dann zu hitzelabilen vegetativen Zellen aus) ein zweites Mal gekocht werden (fraktionierte Sterilisation = Tyndallisation). Gebräuchlicher ist es jedoch, Flüssigkeiten im Dampfdrucktopf (Autoklav) unter gespanntem Dampf bei höheren Temperaturen zu sterilisieren (2 atm = 202,65 kPa ; 121 °C). Versuch I. 2 Zur Überprüfung der Wirksamkeit üblicher Sterilisationsverfahren wird je eine Spatelspitze Sporenerde (reife Komposterde) in fünf Reagenzgläser gegeben. Die Reagenzgläser werden mit Kappen verschlossen und beschriftet (Datum, Versuch, Gruppen-Nr., Röhrchen-Nr. ). Je ein Reagenzglas wird anschließend • bei Raumtemperatur gehalten (Kontrolle, Rö. Nr. 1 ) • 2 Minuten bei 180 °C im Heißluftsterilisator erhitzt ( Rö. Nr. 2 ) • 30 Minuten bei 180 °C im Heißluftsterilisator erhitzt ( Rö. Nr. 3 ) • 30 Minuten im Dampftopf gekocht ( Rö. Nr. 4 ) • 15 Minuten im Autoklaven bei 2 atm gehalten ( Rö. Nr. 5 ). Nach dem Abkühlen werden die Reagenzgläser steril mit je 8 ml des autoklavierten GPHFlüssigmediums versetzt ( von AssistentInnen) und bei 30 °C bebrütet. 3. Luftkeimplatten Die Luft enthält feine Wassertröpfchen oder kleine Partikeln als Schwebestoffe, an die Bakterien oder Pilzsporen angeheftet sein können. Die Zusammensetzung solcher in der Luft enthaltenen Populationen wird durch den Grad der Luftfeuchtigkeit, die Temperatur, Art und Intensität der Strahlung oder auch durch spezifische Keimquellen (z.B. antibiotikaresistente Bakterien in Krankenhäusern) bestimmt. Bei niedrigem Feuchtigkeitsgehalt der Luft und intensiver Sonnenstrahlung bleiben nur wenige Organismen vermehrungsfähig. Viele dieser Bakterien sind pigmentiert, bilden Sporen oder haben einen hohen GC-Gehalt der DNA. Auf Luftplatten findet man häufig Vertreter der Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces und die Hefe Rhodutorula. Versuch I. 3 Material: Für die Anreicherung von Keimen aus der Luft verwenden wir Platten (Petrischalen) mit GPH- und MP-Agar (siehe Anhang). Jede Gruppe gießt oder erhält je eine Platte mit einem der beiden Nährböden. Durchführung: An einem vom Kursleiter angegebenen Standort werden die Petrischalen für 30 min mit abgehobenem Deckels exponiert. Die auf der Unterschale außen beschrifteten Platten (Gruppen-Nr, Datum, Standort) werden bei 30°C bebrütet. 6 4. Isolierung von Bakterien und Pilzen aus Wasserproben Auch im Wasser kommen freilebende Bakterien und Pilze vor. Je nach Reinheitsgrad des Wassers kommen zahlen- und formenmäßig mehr oder weniger viele Mikroorganismen vor. Um einen Eindruck darüber zu gewinnen, werden Wasserproben von verschiedenen Standorten überprüft. Dazu werden die Proben durch Filtration angereichert. Versuch I. 4 Material: Wasserproben (gerade Tisch-Reihen: Trinkwasser ; ungerade Reihen : Teichwasser GPH-Agarplatten, Filtrationsgerät ( je 1 für Trink- und für Teichwasser ), Filter, Pinzette. Durchführung: Die Wasserproben (jeweils 100 ml/Gruppe) werden durch Bakterien-dichte Membranfilter filtriert. Anschließend werden die Membranfilter mit einer sterilen Pinzette mit der Unterseite nach unten auf eine GPH-Agarplatte gelegt. Die Agarplatten werden bei 30°C im Brutraum bebrütet. Isolierung von Sporenbildnern Die Bildung hitzeresistenter Endosporen ist ein charakteristisches Merkmal der Gattungen Bacillus (aerob) und Clostridium (anaerob). Bacillen und Clostridien sind Gram-positive Eubakterien, die verschiedene organische C-Quellen (wie z.B. Zucker) verwerten können. Ihre sonstigen Nährstoffansprüche können durch ein mineralisches Nährmedium gedeckt werden. Im Gegensatz zu vegetativen Zellen überdauern Endosporen das Pasteurisieren (10 min feuchte Hitze bei 80°C). Bacillus subtilis ist zur Hydrolyse von Stärke befähigt. Die Hitzeresistenz der Sporen, die Fähigkeit zur Stärkehydrolyse sowie Wachstum in Gegenwart von 7% NaCl werden als selektive Merkmale zur Anreicherung von B. subtilis ausgenützt. Für die Anreicherung saccharolytischer Clostridien ist die Einstellung anaerober Bedingungen sowie eine Versorgung der Organismen mit Stärke ausreichend. 5. Aerobe Sporenbildner (Bacillus-Arten) Vers. I. 5 Material: Gartenerde, Aqua dest., Reagenzglas, Kappe, Pasteurpipette, Drigalski-Spatel, Petrischale mit Stärkeagar Anreicherungsprinzip : aerob, Stärke, Selektion von Sporenbildnern Durchführung: In einem Reagenzglas wird eine Spatelspitze Gartenerde mit etwa 5 ml Aqua dest. aufgeschwemmt; das Reagenzglas wird mit einer Kappe verschlossen und im Wasserbad 10 min bei 80°C erhitzt. Anschließend wird mit einer Pasteurpipette ein Tropfen der Erdaufschwemmung auf den Stärkeagar gegeben und mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die Agarplatten werden bei 30°C bebrütet (3-4 Tage). 6. Anaerobe Sporenbildner (Clostridien-Arten) Vers. I. 6 Material: Gartenerde, Kartoffel, Schraubdeckelröhrchen mit Verschlusskappe, Korkbohrer Anreicherungsprinzip : anaerob, Stärke Durchführung : Eine Spatelspitze Gartenerde wird in das Röhrchen gegeben; darüber werden Kartoffelstückchen geschichtet, die mit einem Korkbohrer aus einer Kartoffel gebohrt wurden. Anschließend wird das Röhrchen vorsichtig (Vermeidung von Turbulenzen!) mit Leitungswasser nicht ganz voll ( ca. 2 cm bis zum Rand ) aufgefüllt und mit der Kappe zugeschraubt. Bebrütung bei 30 °C im Brutraum. 7 II. KURS: ANREICHERUNGSKULTUREN. 1. Anreicherung von anoxygenen phototrophen Purpurbakterien Nicht nur Pflanzen, sondern auch einige Bakterien, die phototrophen Bakterien, können Lichtenergie in eine chemisch verwertbare Form umwandeln und mit Hilfe dieser Energie ihren Stoffwechsel betreiben (Phototrophie). Die phototrophen Bakterien kommen bevorzugt im Süßwasser vor. Mit Ausnahme der Photosynthese bei aeroben Cyanobacterien findet bakterielle Photosynthese unter Ausschluss von Sauerstoff (anaerobe Lebensweise unter anoxischen Bedingungen) statt, denn der Photosyntheseapparat dieser Organismen wird nur unter Sauerstoffmangel synthetisiert und die Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie (elektrochemisches Protonenpotential, ∆p) läuft im Gegensatz zu Cyanobakterien und Pflanzen ohne Freisetzung von Sauerstoff (anoxygen) ab. Alle Vertreter der phototrophen Bakterien bilden als Komponenten des Photosynthese-Apparates Bacteriochlorophylle, Carotinoide, Cytochrome, Chinone und Nicht-HämEisen-Verbindungen. Die schwefelfreien Purpurbakterien können zwar photolithoautotroph (Licht als Energiequelle, anorganischer Elektronendonor, CO2 als C-Quelle) leben, bevorzugen aber photoorganoheterotrophe (organische C-Quelle) Bedingungen. Selektive Anreicherungsbedingungen bestehen unter Ausschluss von Sauerstoff und gleichzeitiger Beleuchtung (Spektralbereich des Lichtes: ca. 4001000 nm). Allerdings können viele Vertreter der phototrophen Bakterien bei Gegenwart von Sauerstoff auch chemotroph im Dunkeln wachsen. Sie gewinnen dann Energie über die Atmungskette. Weil zahlreiche andere Bakterien zu diesem Stoffwechseltyp befähigt sind, eignen sich chemotrophe Bedingungen weniger gut für eine selektive Anreicherung phototropher Bakterien Vers. II. 1 Material: Teichwasser, eine 50 ml Schraubdeckelflasche, ein Einmal-Röhrchen ( 10 ml ) mit Verschlusskappe, Erlenmeyer-Kolben mit RÄH Nährlösung, Pasteurpipetten. Anreicherungsprinzip : anaerob, Licht, Malat Durchführung: Als Impfmaterial dient Wasser (10 ml), das dicht über dem Schlamm eines nährstoffreichen Gewässers entnommen wurde. Das Impfmaterial wird in die Schraubdeckel-Flaschen pipettiert. Anschließend werden die Flaschen luftblasenfrei mit RÄH-Medium aufgefüllt. Die Flaschen werden sodann mit den Schraubdeckeln verschlossen und zum Verbrauch des gelösten Sauerstoffs zunächst für 2-3 h im Dunkeln bei 30°C bebrütet. Dann werden die Flaschen im Lichtbrutraum mit Glühbirnen bestrahlt. Dieses Licht enthält alle Bereiche, die von Photosynthesepigmenten der Purpurbakterien absorbiert werden. Nach 3-6 Tagen wird in den Flaschen die Entwicklung bräunlich, purpurrot oder grünlich gefärbter Mischpopulationen phototropher Bakterien sichtbar. Anreicherung von Organismen aus dem biologischen Schwefelkreislauf 2. Desulfurizierer Im biologischen Schwefelkreislauf wird H2S sowie elementarer Schwefel über Sulfit zu Sulfat oxidiert. Die im Verlaufe dieser Oxidation frei werdende Energie können Mikroorganismen ( z. B. Thiobacillen ) zur Fixierung von CO2 und somit für eine autotrophe Lebensweise nutzen. Sulfat kann nach Reduktion einerseits in bioorganische Schwefelverbindungen eingebaut werden (assimilatorische Sulfatreduktion). Andererseits können anaerobe Organismen (Desulfurizierer) Sulfat im Zuge einer anaeroben Atmung zu Sulfid reduzieren (dissimilatorische Sulfatreduktion). Sulfid 8 wird auch im Verlaufe des Abbaus von bioorganischen Schwefelverbindungen ( S-haltige Aminosäuren ) durch Desulfuration freigesetzt. Sulfid wird über Sulfit wiederum zu Sulfat oxidiert (s.o.). Desulfurizierer sind anaerobe Organismen. Ihre Anreicherung erfordert deshalb unter Ausschluss von Sauerstoff. Dies geschieht, indem Proben aus anoxischen Zonen von Gewässern ( Schlamm ) in Schraubdeckelflaschen gegeben und nach dem Auffüllen mit Nährmedium (möglichst) luftblasenfrei verschlossen werden. Nachweis der erfolgreichen Anreicherung von Desulfurizierern: H2S-Entwicklung (Geruch !) und damit verbunden: Ausfällung von schwarzem FeS. Vers. II. 2 Material: Faulschlamm aus dem Botanischen Garten ( wird gestellt ); Nährmedium (frisch angesetzt !); je Gr.: 5 u. 10 ml-Pipetten mit Pipettierhilfe, 50 (oder 100) ml Schraubdeckelflasche. Selektionsprinzip: anaerob, Elektronenakzeptor: Sulfat, C- und Elektronen-Quelle: Milchsäure Durchführung : Eine Schraubdeckelflasche mit 1 ml Faulschlamm aus dem Teich des Botanischen Garten beimpfen, dann mit Nährmedium für Sulfatreduzierer ( siehe Anhang ) randvoll auffüllen und verschließen. Bebrütung bei 30°C im Kursbrutraum. Anreicherung von Organismen aus dem biologischen Stickstoffkreislauf Der biologische Stickstoffkreislauf fasst die Aktivitäten verschiedener Mikroorganismen zusammen: Ammonium - vorwiegend aus dem Abbau von Aminosäuren und Protein - wird durch Nitrifizierer unter Energiegewinn über Nitrit zu Nitrat oxidiert. Nitrat und auch Ammonium können von Pflanzen zur Deckung ihres Stickstoffbedarfs aufgenommen werden. Unter anoxischen Bedingungen wird Nitrat als Elektronenakzeptor (Nitratatmung) von einigen Bakterien zu Stickstoff (N2) reduziert (Denitrifikation) und geht damit dem Boden verloren. N2 kann jedoch durch N2bindende Bakterien fixiert und damit wieder der Biosphäre zugeführt werden. 3. Nitrifizierer Die Oxidation von Ammoniak zu Nitrat wird im Boden durch zwei Gruppen chemolithoautotropher Bakterien bewirkt: 1. NH4+ + 1,5 O2- → NO2- + H2O + 2 H+ (Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus u.a.) 2. NO2- + 0,5 O2 → NO3(Nitrobacter, Nitrocystis) NH4+/NH3 entstehen bei der Mineralisierung stickstoffhaltiger Verbindungen. Durch die Oxidation dieser anorganischen Verbindungen über die Atmungsketten der genannten Organismen wird das elektrochemische Protonenpotential (∆p) aufgebaut, das für die ATP-Produktion genutzt werden kann (Chemotrophie). Ein Teil von ∆p wird auch dazu verwendet, über einen rückläufigen Elektronentransport Reduktionsäquivalente (NADH + H+) für die Assimilation von CO2 (Autotrophie) zu bilden. Die bei der Nitrifizierung gebildete Salpetersäure erhöht die Löslichkeit vieler Mineralien im Boden. Nitrat wird aus dem Boden leichter ausgewaschen als AmmoniumIonen. Die Isolierung und Charakterisierung der Nitrifizierer gelang erstmals Winogradsky (1890). Selektiv für eine Anreicherung sind das rein anorganische Nährmedium und Ammoniak als Elektronendonator (Chemolithoautotrophie). 9 Vers. II. 3 Material: Jede Gruppe erhält einen 100 ml-Erlenmeyerkolben mit 30 ml der fertigen Nährlösung für Nitrifizierer (siehe Anhang), Gartenerde. Anreicherungsprinzip : anorganisches Nährmedium, Ammoniak als Elektronendonator Durchführung: Der Kolben wird mit einer Spatelspitze Gartenerde beimpft. Vier unbeimpfte Kolben pro Kurs werden als Kontrollen geführt. 4. Denitrifizierer Eine Reihe von Bakterien kann bei Sauerstoffausschluss (anoxische Bedingungen) die Elektronen über die Atmungskette auf NO3- übertragen und dieses schrittweise reduzieren. Nitrat wird in dieser Reaktionskette nicht assimilatorisch als Stickstoffquelle, sondern dissimilatorisch als Elektronenakzeptor in der Atmungskette benutzt. NO3- + 2e- + 2H+ NO2- + e- + H+ NO + 2e- + 2H+ N2O + 2e- + 2H+ → → → → NO2- + H2O NO + OHN2O + H2O N2 + H2O Go (kJ/Reaktion) - 163 - 73 - 306 Als Stickstoffquelle dient NH4+ oder eine Aminosäure (siehe Anhang). Selektiv für eine Anreicherung sind Anaerobiose und Nitrat als Elektronenakzeptor. Vers. II. 4 Material: Jede Gruppe erhält 1 Schraubverschlussröhrchen mit 15 ml Medium und einem Durham-Röhrchen (siehe S. 20). Jede 5. Gruppe erhält ein zusätzliches Röhrchen für eine Kontrolle. Anreicherungsprinzip: anoxisch, Nitrat als Elektronenakzeptor Durchführung: Die Röhrchen werden mit einer Spatelspitze Erdprobe versetzt. Die Kontrollröhrchen bleiben unbeimpft. Die Gasbildung kann mit Hilfe des Durham-Röhrchens verfolgt werden. Die Bildung von Nitrit und die Abnahme von Nitrat wird mit Teststäbchen gemessen. Das Bakterienwachstum wird als Zunahme der Trübung registriert. Nitrat- und Nitritbestimmungen von der Kontrolle und zur Messung der Stoffwechsel-Leistung in den beimpften Röhrchen werden eine Woche später durchgeführt und protokolliert. 5. Biologische Stickstoffbindung Die Fähigkeit zur biologischen Fixierung von Stickstoff (N2) ist ausschließlich auf Prokaryoten beschränkt, kommt hier aber unabhängig von der taxonomischen Zugehörigkeit bei Vertretern verschiedenster Bakteriengruppen vor. Die Reduktion von N2 wird durch den NitrogenaseEnzymkomplex katalysiert und verläuft über folgende Reaktion: N2 + 8 H+ + 8 e + 16 MgATP → 2 NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 Pi Als Selektionskriterium zur Anreicherung dient die Abwesenheit gebundenen Stickstoffs und (für die Anreicherung von Azotobacter) aerobe Lebensweise plus Mannit als Kohlenstoff-Quelle. 10 Versuch II. 5 Material: Gartenerde, Mannit, K2HPO4 , pro Gruppe ein 100 ml Erlenmeyerkolben Anreicherungsprinzip : Aerob, N-Mangel, gute C-Quelle (Mannit) Durchführung: In den Erlenmeyerkolben wird in flacher Schicht Leitungswasser eingefüllt und dann mit je einer Spatelspitze Gartenerde ( wenig Material !) , Mannit und K2HPO4 versetzt. Die Proben werden bei 30 °C bebrütet. 6. Anreicherung von Hefen und anderen Pilzen Sprosshefen und Hyphenpilze sind weit verbreitete Mikroorganismen mit sehr verschiedenem Organisationsgrad und unterschiedlicher taxonomischer Zugehörigkeit. Die meisten Hefen und Pilze können auf einem schwach sauren (pH 6) Nährboden mit einer zuckerhaltigen Kohlenstoffquelle wachsen. Zur Unterdrückung des Bakterienwachstums wird das Antibiotikum Chloramphenicol zugesetzt, das die eubakterielle Proteinsynthese hemmt. Vers. II. 6 Material: a) eine Aufschwemmung von käuflicher Bäckerhefe in sterilem Leitungswasser b) Aufschwemmung einer Erdprobe aus einer Rebanlage in Leitungswasser Anreicherungsprinzip: Pilzagar mit Malzextrakt, aerob. Durchführung: Jede Gruppe erhält 2 fertige Nährboden-Platten (MP, siehe Anhang). Eine Platte wird mit einem Tropfen aus a), die zweite Platte mit einem Tropfen aus b) beimpft. Der Tropfen wird mit dem Drigalski-Spatel unter gleichzeitigem Drehen der Platte auf der Tischfläche über die AgarOberfläche verteilt. Bebrütung: 30°C im Brutraum. 11 AUSWERTUNG DER ANREICHERUNGSKULTUREN Es sollen die makroskopisch erfassbaren Merkmale der angereicherten Mikroorganismen beschrieben werden. 7. Luftkeimplatten Vers. II. 7 Material: Luftkeimplatten von Vers. I.3, Tropfflasche (braun) mit 10%iger Wasserstoffperoxid-Lösung, Pasteurpipette, Binokular . Auswertung: Protokollieren: Zahl, Aussehen und Farbe der Kolonien. Betrachten der Kolonien mit dem Binokular. Auf eine gelbe Kolonie H2O2 (10%ig) mit der Pasteurpipette auftropfen. Aus H2O2 wird durch Katalase O2 freigesetzt (Blasenbildung). 2H2O2 → O2 + 2H2O Luftkeimplatten zur weiteren mikroskopischen Untersuchung (3. Kurs) bei 4°C aufbewahren. 8. Bakterien und Pilze aus Wasserproben Versuch II. 8 Material: GPH-Agarplatten mit Anreicherungskulturen von Vers. I. 4, Binokular Auswertung: Zum Vergleich der beiden Wasserproben ( Trinkwasser/Teichwasser) werden Aussehen und Farbe der Kolonien protokolliert. Die Kolonien werden mit dem Binokular betrachtet. 9. Aerobe Sporenbildner ( Bacillus-Arten ) Vers. II. 9 Material: Agarplatte von Vers. I.5 mit Anreicherungskultur von Bacillus spec; verdünnte Lugolsche-Lösung ( 1:10, wässerig) , Pasteurpipetten. Auswertung: • Kolonien nach Form, Farbe, Konsistenz (fest, schleimig), Rand der Kolonie (glatt, gewellt), Oberfläche (glänzend, stumpf, runzelig) beschreiben. • Die Hydrolyse von Stärke wird nach Auftragen der Lugolschen-Lösung auf die Agaroberfläche (mit Pasteurpipette) durch eine farblose Zone um die Kolonien herum nachgewiesen. 10. Anaerobe Sporenbildner (Clostridien-Arten) Vers. II. 10 Material: wassergefülltes Schraubröhrchen mit Kartoffelstücken von Vers. I.6 Auswertung : Sicht- und Geruchs-Kontrolle. Bei erfolgreicher Anreicherung: Zersetzung der Kartoffelstücke , penetranter Geruch nach Buttersäure, Gasentwicklung. III. KURS: AUSWERTUNG DER ANREICHERUNGSKULTUREN, REINKULTUREN, ANAEROBENTECHNIK, STERILES ARBEITEN, MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG VON BAKTERIEN 12 Es sollen die makroskopisch und mikroskopisch erfassbaren Merkmale der angereicherten Mikroorganismen beschrieben und Reinkulturen angelegt werden. 1. Luftkeimplatten Vers. III.1 Material: Luftkeimplatten von Vers. I.3, Mikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl, Linsenpapier, Impföse Auswertung: Zunächst erfolgt eine makroskopische Begutachtung der Platten hinsichtlich Form und Farbe der Kolonien. Mikroskopische Untersuchung: Von einer einzelnen Kolonie wird mit der Impföse etwas Material entnommen und in einem Tropfen Wasser auf einem Objektträger verrieben. Bedecken Sie die Probe mit dem Deckgläschen. Objektträger und Deckgläschen nur an den Rändern anfassen! Der Objektträger wird in den Kreuztisch des Mikroskopes so eingespannt, dass sich die Probe im Strahlengang befindet. Am Objektivrevolver wird das 10er Objektiv (10/0,25) eingestellt. Nun wird das Mikroskop für das Phasenkontrastverfahren justiert (siehe Anhang ). Nach Justierung des Mikroskopes erfolgt die Betrachtung der Zellen bei höherer Auflösung im Phasenkontrast mit dem 100er Phasenkontrast-Objektiv (100/1,25 Oil, Ph 3 ). Dazu senken Sie zunächst den Objekttisch durch Drehung (gegen den Uhrzeigersinn!) des Grobtriebes ca. 1 cm nach unten. Jetzt können Sie den unteren, beweglichen Teil des 100er Objektives nach oben in die Schutzstellung schieben und ihn durch eine Drehung gegen den Uhrzeigersinn in dieser Position arretieren. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas unterhalb des Objektives, lösen Sie nun die Arretierung des Objektives, und bewegen Sie den Objekttisch mit dem Grobtrieb langsam (unter Beobachtung von der Seite her ) nach oben bis das Objektiv in das Immersionsöl eintaucht. Bewegen Sie von nun an den Objekttisch unter mikroskopischer Kontrolle mit dem Feintrieb langsam nach oben bis die Zellen im Bild erscheinen. Nach dem Auflegen eines Deckglases wird dieses Präparat mit dem Mikroskop (100er Phasenkontrast-Objektiv 100/Oil Ph 3) betrachtet. Gelbliche Kolonien könnten aus Zellpaketen von Micrococcus luteus bestehen. Micrococcus luteus bildet Tetraden und ist Katalase positiv. 2. Aerobe Sporenbildner ( Bacillus-Arten ) Vers. III.2 Material: Agarplatte von Vers. I.5 mit Anreicherungskultur von Bacillus spec; Mikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl, Linsenpapier Auswertung: Bakterien mikroskopisch untersuchen. Sporen erscheinen als stark lichtbrechende, helle Gebilde in der dunklen Sporenmutterzelle (endständig oder mittelständig, ovoid bis kugelig) oder als dunkle Vorspore in der helleren Mutterzelle. 3. Anoxygene phototrophe Purpurbakterien 13 Vers. III.3a Material: Mikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl, Linsenpapier, Impföse, Anreicherungskultur, Petrischalen mit RÄH-Agar, Anaerobentopf, Gasentwickler, Sauerstoffindikator Auswertung: Protokollieren Sie die Farbe der Anreicherungskultur der anoxygenen, phototrophen Bakterien (braun, grün, purpurfarben, andere Farben). Mikroskopische Untersuchung: Entnehmen Sie mit einer abgeflammten Impföse (siehe unten) einen Tropfen aus der Flaschenkultur, geben diesen auf einen Objektträger und bedecken ihn mit dem Deckgläschen. Fragen: Welche Formen und Bakterien erkennen Sie in Ihrem Präparat? Bewegen sich die Zellen aktiv oder werden sie passiv durch Brown'sche Molekularbewegung oder durch Strömung hinund herbewegt? Isolierung von Klonkulturen anoxygener phototropher Purpurbakterien Mit Hilfe des Verdünnungsausstrich-Verfahrens mit der Impföse werden aus den stark angereicherten Mischkulturen phototropher Bakterien isoliert und Reinkulturen gewonnen. Eine Impföse besteht aus einem ca. 6 cm langen Platin-Iridium-Draht (80% Pt + 20% Ir) mit einem Durchmesser von ca. 0,6 mm. Das eine Ende des Drahtes ist kreisförmig zu einer Öse gebogen. Das andere Ende ist im Spannfutter des Kollehalters fixiert (Abb. 1A). Impfösen werden stets mit dem Halter in einem Ständer stehend aufbewahrt. Die Öse soll nie in Berührung mit anderen Gegenständen oder der Tischplatte kommen. Grundsätzlich werden Impfösen vor und nach jedem Gebrauch durch Ausglühen in der Bunsenbrennerflamme sterilisiert, und zwar im Außenkegel der prasselnden, vollständig entleuchteten Flamme. Größere Mengen an Bakterienmaterial an der Öse neigen vor dem Ausglühen zum Verspritzen. Um dies zu vermeiden, wird die Öse zunächst im Innenkegel der Flamme getrocknet und dann im Außenkegel ausgeglüht (Abb. 1B). 14 Verdünnungsausstrich Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Zellen auf der Agaroberfläche getrennt von anderen Zellen festzulegen. Aus diesen Einzelzellen entwickeln sich Kolonien. Um Klonkulturen zu erhalten, müsste das Verfahren wiederholt werden (im Kurs nicht möglich). Form, Farbe, Rand und Oberfläche der Kolonie sind charakteristische Eigenschaften einer Bakterienkultur. Vers. III.3 b Durchführung: Durch Eintauchen der ausgeglühten und wieder abgekühlten Impföse in die Anreicherungskultur werden der Suspension Bakterien entnommen und auf dem Nähragar RÄH in der Petrischale wie folgt ausgestrichen. Dabei wird der Deckel der Petrischale mit den mittleren Fingern schützend über die Petrischale gehalten, während die beiden äußeren Finger die Petrischale festhalten(Abb. 2). Impfstriche 1 - 3 werden direkt aus der Anreicherungskultur ausgestrichen (Abb. 3). Dann wird die Öse ausgeglüht. Nach dem Abkühlen werden die Impfstriche 4 -6 durch 1 -3 gezogen. Der gleiche Vorgang wird für 7- 9 und 10 - 13 wiederholt. Ein "Pflügen" des Agars ist unerwünscht und wird dadurch vermieden, dass man die Impföse möglichst flach und ohne Druck über die Agaroberfläche gleiten lässt. Es werden je 2 Platten beimpft. 15 Anaerobentopf Vers. III. 3 c Durchführung : Die beimpften Petrischalen werden in einem Plattenkorb übereinander geschichtet. Der Plattenkorb wird dann in den Anaerobentopf gestellt. Wegen der Kondenswasserbildung empfiehlt es sich, zuunterst eine leere Petrischale in den Plattenkorb zu stellen sowie die gefüllten Schalen mit dem Agarboden nach oben einzulegen. Dann wird der Gasentwickler in den Topf gestellt. Nach Zugabe von Aqua dest. zum Gasentwickler wird der Anaerobentopf rasch dicht verschlossen. Nun erfolgt die Entwicklung von H2 + CO2. Mit Hilfe eines Katalysators im Topf wird unter Sauerstoffverbrauch H2 zu H2O oxidiert. Der Anaerobentopf wird zunächst bei 30°C im Dunkeln gehalten. Ein Teststreifen (oxidiert blau, reduziert farblos) zeigt an, wann die Atmosphäre im Topf Sauerstoff frei ist. Nun werden die Anaerobentöpfe in den Lichtbrutraum gestellt. Nach mehreren Tagen Bebrütung (30°C) im Licht werden aus den isolierten Bakterien hervorgegangene Einzelkolonien auf den Agarplatten sichtbar. 4. Desulfurizierer Vers. III.4 Material : Schraubdeckelflasche beimpft mit Faulschlamm von Vers. II.2 Auswertung: Schwarzfärbung durch FeS , Geruchsprobe auf H2S. 5. Nitrifizierer Vers. III.5 Material: Kulturen von Vers. II.3, Nitrit-Nitrat-Teststäbchen, universal pH Messpapier. Auswertung: Wachstum: Zunahme der Trübung der Kultur Chemischer Nachweis: Messung des pH-Wertes, Bestimmung von Nitrit und Nitrat mit Teststäbchen (unverdünnte Proben). 16 6. Denitrifizierer Vers. III.6 Material: Nitrat-Nitrit-Teststäbchen, Röhrchen mit Denitrifikanten (von Vers. II.4), Aqua dest. Messzylinder 100 ml. Auswertung: In der unbeimpften Probe (Kontrolle) sowie in der mit Erde beimpften Probe von Vers. II.4 werden die Bildung von Nitrit und die Abnahme von Nitrat mit den Nitrat-Nitrit-Teststäbchen verfolgt. Die Proben werden unverdünnt verwendet. Der Konzentrationsbereich wird nach der Farbskala auf der Packung bestimmt. Die Gasbildung (N2) kann an den Gasblasen im Durham-Röhrchen verfolgt werden. Ansatz Nitrit Nitrat ===================================================================== Anreicherungskultur: (7. Tag) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------unbeimpfte Kontrolle: (7. Tag) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 7. Stickstoff-Fixierer Vers. III. 7 Auswertung: Aus der Anreicherungskultur ( von Vers. II.5 ) wird mit der abgeflammten Impföse schleimiges Material entnommen und mit dem Phasenkontrast mikroskopiert. 8. Hefen und andere Pilze Vers. III. 8 Auswertung: Die Platten mit Pilzkulturen ( von Vers. II.6 ) werden mit dem Stereomikroskop, Einzelzellen mit dem Lichtmikroskop zunächst ohne und dann mit Phasenkontrast betrachtet. Protokoll: Luftmyzel, Myzel im Nährboden, Farbe, Beschaffenheit der Kolonien, Sporen? Hefen werden in einem Tropfen Wasser suspendiert und im Lichtmikroskop mit Phasenkontrast 40 x betrachtet. Spalthefe oder knospende Hefe, Form der Zellen, Zellstrukturen. IV. KURS: IDENTIFIZIERUNG VON BAKTERIEN. MORPHOLOGIE, CYTOLOGIE UND SPEZIFISCHE STOFFWECHSELLEISTUNGEN 17 Bakterien sind aufgrund charakteristischer Eigenschaften im Rahmen der binären Nomenklatur taxonomisch klassifizierbar. Zu ihrer Beschreibung dienen Eigenschaften wie Biotop, Form der Kolonien auf Agar, Pigmentierung, Größe und Form von Einzelzellen und von Zellaggregaten, cytologische Eigenschaften, Art der Ernährung, Spektrum der Substratverwertung, spezifische Stoffwechselleistungen, Pathogenität oder serologische Spezifität der Zelloberfläche. Im Kurs lernen wir, dass die Merkmale für die Klassifizierung der Bakterien in Abhängigkeit von der Bakteriengruppe unterschiedlich angewendet werden müssen. 1. Morphologie und Pigmentierung Es sollen Zellformen wie z.B. Stäbchen, Kokken, Spirillen sowie Knospungswachstum im Lichtmikroskop betrachtet werden. Dazu soll das Phasenkontrastmikroskop verwendet werden, denn Bakterien sind für die normale Durchlichtmikroskopie zu kontrastarm. Wenn die Zellform charakteristisch ist und/oder die Bakterien zusätzlich pigmentiert sind, kann in einigen Fällen bereits aufgrund dieser Merkmale eine taxonomische Zuordnung erfolgen. Meistens ist man jedoch auf weitere Eigenschaften angewiesen. Dieses verdeutlichen folgende Beispiele. Beispiel 1: In Gegenwart von Sauerstoff (aerob) wachsende, orange (Carotinoide) pigmentierte Kokken. Diese Eigenschaften erlauben eine wahrscheinliche Zuordnung zu der Gattung Micrococcus (häufige Bakterien in der Luft). Beispiel 2: Fakultativ anaerobe, rotbraun pigmentierte phototrophe Spirillen. Die Spirillenform, die Pigmentierung und die phototrophe Lebensweise erlauben eine Zuordnung zu der Gattung Rhodospirillum. Die Identifikation der Art erfordert aufwendigere Methoden, wie die Analyse des Absorptionsspektrums, der Substratverwertung oder der Feinstruktur. Beispiel 3: Fakultativ anaerobe, rotbraun pigmentierte, knospende phototrophe Bakterien. Die Merkmale Knospungswachstum und Photosynthese (rotbraune Pigmente) erlauben direkt die Bestimmung der Art Rhodomicrobium vannielii der schwefelfreien Purpurbakterien. Beispiel 4: Aerobe Stäbchen, die nicht pigmentiert sind. Hier ist man bei der Identifizierung auf weitere Merkmale (siehe unten) angewiesen. Vers. IV.1 Material: • Plattenkulturen von Micrococcus luteus (Beisp. 1) Escherichia coli (Beisp. 4) und Bacillus sp. (Beisp. 4, jeweils aerob im Dunkeln gewachsen), sowie Flaschenkulturen von Rhodospirillum rubrum (Beisp. 2) und Rhodomicrobium vannielii (Beisp. 3, anaerob im Licht gewachsen) • Phasenkontrastmikroskop, Objektträger, Deckgläser, Immersionsöl Impföse, Pasteurpipetten, Pipettenhütchen Vorsicht ! Escherichia coli, Proteus mirabilis und Pseudomonas fluorescens sind in der Regel nicht pathogen. Die Arten können aber mit opportunistischen Infektionen des Menschen in Verbindung gebracht werden. Der Hautkommensale Micrococcus luteus , sowie Bacillus sp. und die phototrophen Bakterien sind ebenfalls nicht pathogen. Dennoch ist beim Umgang mit diesen Organismen in jedem Fall auf mikrobiologisch korrekte Arbeitsweise zu achten. 18 Durchführung: Stellen Sie sich wie folgt die Präparate für die mikroskopische Betrachtung aller vorgegebenen Bakterien her: Geben Sie mit einer Pasteurpipette einen Tropfen Wasser auf den Objektträger. Daneben geben Sie mit der Impföse wenig Bakterienmasse von den Plattenkulturen. Verreiben Sie die Bakterien mit der Impföse homogen auf dem Objektträger. Ziehen Sie dann die Bakteriensuspension homogen in den Wassertropfen hinein. Die Impföse ist nach jedem Gebrauch auszuglühen! Von den Flüssigkeitskulturen geben Sie 2-3 Impfösen direkt auf den Objektträger. Legen Sie dann das Deckglas auf, und mikroskopieren Sie zunächst mit dem 40er und dann mit dem 100er Objektiv (mit Immersionsöl). Skizzieren Sie die jeweiligen Zellformen und notieren Sie die Pigmentierung der Ausgangskolonie. 2. Cytologie Viele Bakterien sind stäbchenförmig und wenig pigmentiert (siehe Beispiel 4). Hier kann man zur Identifizierung zunächst zelluläre Strukturen nachweisen, indem man diese durch Färbung sichtbar macht. Eine für diagnostische und taxonomische Zwecke wichtige Färbe-Methode ist die "Gram-Färbung" (H. C. Gram war ein dänischer Mikrobiologe). Sie erfordert 4 Teilschritte, gefolgt von einer Gegenfärbung: 1) strukturschonende Hitzeabtötung (Fixierung) der Zellen. Färbung der gesamten Zelle in zwei Teilschritten (2 und 3) mit einem Kristallviolett-Jod Komplex als dunkelviolettem Farblack. 4) Differenzierung, d.h. selektive Entfärbung der Zellen mit Ethanol. 5) Gegenfärbung mit Fuchsin. Bei den Gram-positiven Bakterien wird durch den vielschichtigen, dickeren Peptidoglycan-Sacculus der Farblack beim Differenzierungsschritt besser in der Zelle zurückgehalten als bei den Gram-negativen Bakterien mit ihrer dünnen Peptidoglycanschicht. Grampositive Bakterien bleiben bei der Differenzierung daher dunkelviolett. Gram-negative werden entfärbt, sie werden bei einer anschließenden Gegenfärbung mit Fuchsin rot gefärbt. Damit kann man Bakterien mit Hilfe der Gram-Färbung in zwei große Gruppen einteilen, die sich anhand der Zellwandstruktur voneinander unterscheiden. Vers. IV.2 Material: - Platten-Kulturen von Escherichia coli und Bacillus sp.. - Färbelösung nach Gram: Kristallviolett (1:5 mit Aqua dest. verdünnt). - Lugolsche Lösung (Iod-Kaliumiodid-Lösung): 1g Jod + 2g KJ in 300 ml Aq. dest.(unverd. 1%) - Ethanol: 96%ig. - Fuchsinlösung: gesättigte, filtrierte Fuchsinlösung mit Aqua dest. 1:10 verdünnt. - Mikroskop (Hellfeldeinstellung), Objektträger, Immersionsöl, Impföse, Pasteurpipetten, - Pipettenhütchen Durchführung: Führen Sie die Gram-Färbung mit (a) Escherichia coli und (b) Bacillus sp. sowie mit einer Mischung von (a) und (b) wie folgt durch (die Reagenzien sind gebrauchsfertig vorgerichtet): 19 Vorbereitung der Präparate: Entfetten Sie drei Objektträger durch Spülen mit 96%igem Ethanol und Trockenreiben mit Zellstoff. Auf den Objektträger tragen Sie wie schon bei Vers. III.1 angegeben die Bakterien auf. Die Mischung von (a) und (b) stellen Sie durch homogenes Vermischen der beiden Bakterienstämme mit der Impföse auf dem Objektträger her. Für die Herstellung des Ausstrichpräparats ziehen Sie die Bakteriensuspensionen mit einem weiteren Objektträger zu einem dünnen Film (ca. 3/4 der Fläche des Objektträgers) aus (Abb. 4). Fixierung (durch Hitze): Präparat lufttrocknen und mehrmals langsam durch die leuchtende Flamme des Bunsenbrenners ziehen, ohne daß die Bakterien dabei verkohlen. Färbung: Präparat auf einer Färbebank mit Kristallviolettlösung bedecken, nach 4 min den Farbstoff in die Wanne abgießen, mit wenigen Tropfen Lugolsche-Lösung noch haftenden Farbstoff abspülen, erneut Lugolsche-Lösung auftropfen, nach 2 min die Lösung abgießen. Differenzierung: Auf den schräg gehaltenen Objektträger wenige Sekunden lang 96%iges Ethanol einwirken lassen, abtropfen lassen, restliche Farbstoffwolken mit Wasser abspülen, Präparat gut mit Wasser spülen. Vorsicht: Bei zu kurzer Einwirkungsdauer des Ethanols werden Gramnegative Bakterien nicht entfärbt; bei zu langer Einwirkungsdauer werden jedoch auch Grampositive entfärbt. Daher ist manchmal Wiederholung der Färbung notwendig. Gegenfärbung: Fuchsin-Lösung auf Präparat auftropfen, 10-15 sec einwirken lassen, gründlich mit Aqua dest. abspülen, lufttrocknen. Anschließend wird das luftgetrocknete Präparat mikroskopisch betrachtet, dazu ohne Phasenkontrast und ohne Deckglas zunächst die Objektebene mit dem 40er Trockenobjektiv einstellen, dann auf das 100er Ölimmersionsobjektiv umstellen. 3. Atmungskette Manche Bakterien sind weder morphologisch noch durch Färbeverfahren voneinander zu unterscheiden. Zum Beispiel sind viele Arten der medizinisch wichtigen Pseudomonadaceae und der Enterobacteriaceae stäbchenförmig, nicht pigmentiert und Gram-negativ. Um zwischen den beiden Familien zu unterscheiden, nützt man beim sog. "Oxidase-Test" einen Unterschied in der Zusammensetzung der Atmungskette: Pseudomonaden haben Cytochrom c -Oxidase (lösliches Cytochrom c mit Cytochrom c-Oxidase) und sind somit "Oxidase-positiv", Enterobakterien dagegen sind "Oxidase-negativ". Das Vorhandensein der Cytochrom c -Oxidase wird bei atmendenden Zellen mit N,N,N'-N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin, einem künstlichen Elektronendonator für Cytochrom c, nachgewiesen. Bei Oxidase-positiven Bakterien wird N,N,N'-N'-Tetramethyl-pphenylendiamin (farblos im reduzierten Zustand) durch Elektronenabgabe an Cytochrom c oxidiert und dadurch blau, bei den Oxidase-negativen Bakterien bleibt es farblos. 20 Die Gattung Proteus gehört der biologischen Risikogruppe S2 an. Mit diesen Organismen darf nur nach vorheriger Belehrung unter Einhaltung strenger Sicherheitskriterien gearbeitet werden! Vers. IV.3 Material: - Plattenkulturen von Pseudomonas fluorescens, Proteus mirabilis und Escherichia coli - Oxidase-Reagenz (N,N,N'-N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin) - Impföse Durchführung: Tropfen Sie einen Tropfen des gebrauchsfertigen Oxidase-Reagenz direkt auf einzelne Kolonien von P. fluorescens P. mirabilis oder E. coli. Ablesen der Farbreaktion nach 15 sec. 4. Spezifische Stoffwechselleistungen Wenn man einen Enterobakterienstamm (als Oxidase-negativ geprüft) einer bestimmten Art zuordnen will, so ist man im Rahmen der "Differentialdiagnose" auf die Testung stoffwechselphysiologischer Eigenschaften angewiesen. Dabei prüft man zunächst, ob der Stamm - wie alle Enterobakterien (im Gegensatz zu den obligat aeroben Pseudomonaden) - zur fakultativen anaeroben Vergärung von Glucose befähigt ist. Die Vergärung weiterer Zucker unter Säure- oder unter Gasbildung, die Freisetzung von H2S oder Indol, Harnstoffabbau, Gelatineverflüssigung oder die Acetoin-Bildung erlauben dann innerhalb der Enterobakterien die Zuordnung zu einer Art. Man prüft dabei eine größere Anzahl von spezifischen Stoffwechselleistungen, da - nach statistischer Auswertung - nur die Summe mehrerer Eigenschaften eine sichere Grundlage für die Identifizierung einer Art ist. Da bei vielen Testansätzen Farbindikatoren zum Nachweis von Säure- oder Lauge-Bildung verwendet werden, spricht man bei der Auswertung von der "Bunten Reihe" zur Differentialdiagnose der Enterobakterien-Arten. Die Bunte Reihe wird gut deutlich bei den von der Industrie angebotenen "Enterotubes", die mehrere spezifische Stoffwechselreaktionen in einem System hintereinander angeordneter, getrennter Testkammern zusammenfasst. Vers. IV.4 Material: - Plattenkulturen von Escherichia coli und Proteus mirabilis - Impföse - 5 Reagenzgläser mit je einem Durham-Röhrchen und je 10 ml sterilem Grundmedium darin, mit Kapsenbergkappen verschlossen - Sterile Zuckerlösungen (20%ig) von Glucose, Lactose, Galactose, Arabinose, - steriles Aqua dest. - Sterile 1 ml Pipetten - Bromthymolblaulösung - Nährmedium: 10 g Bacto-Trypton und 1 g L-Tryptophan in 1 l Aqua dest. gelöst (pH 7,0) - Teststreifen: Filterstreifen, für den Indolnachweis getränkt mit Ehrlichs-Reagenz (1 g p-Dimethylaminobenzaldehyd in 95 ml 96%igem Ethanol lösen und dann 20 ml konz. 21 HCl zusetzen, leicht feucht bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt, gebrauchsfertig, wenn gelb), oder für den H2S-Nachweis getränkt mit Bleiacetat (10%ig, leicht feucht aufbewahrt) - Enterotubes Durchführung: Geben Sie in je 1 der Reagenzgläser mit 1 ml Pipetten steril je 0,3 ml der folgenden vorsterilisierten Zuckerlösungen (20%ig): (a) Glucose, (b) Lactose, (c) Galactose, (d) Arabinose und zur Kontrolle (e) Aqua dest. hinzu. Beimpfen Sie unter Verwendung der Impföse mit Escherichia coli (ger. Gruppen-Nr.) bzw. Proteus mirabilis (unger. Gruppen-Nr.). Verreiben Sie dazu die Bakterien mit der Impföse gut an der Glasinnenseite und ziehen Sie dann die Bakterien in das Nährmedium hinein (Impföse jeweils gut durchglühen und vor Aufnahme der Bakterien abkühlen lassen). Hängen Sie schließlich mit einer sterilen Pinzette je einen Teststreifen für Indol- (mit Ehrlich's Reagenz getränkt) bzw. H2S-Freisetzung (mit Bleiacetat getränkt) in die beiden Reagenzgläser mit Glucose und der Kontrolle hinein (Abb. 5), so dass keine Benetzung mit dem Nährmedium erfolgt (einige cm Abstand vom oberen Rand des Nährmediums), indem Sie die Streifen beim Verschließen der Reagenzgläser mit den Verschlusskappen befestigen. Die Teststreifen sind gebrauchsfertig vorgerichtet. Abb. 5. Reagenzglas mit Durhamröhrchen zum Nachweis von Säure- und Gasbildung aus Zuckern. Die Teststreifen für den Nachweis der Bildung von Indol und H2S werden mit der Kapsenberg-Kappe befestigt. Es werden zusätzlich einige Enterotubes zur Beimpfung ausgegeben. Diese erfolgt durch Abnahme der beiden Schraubkappen, Beimpfen der Impfspitze unter der weißen Verschlusskappe mit einer Einzelkolonie der Platte, langsames Durchziehen der Impfnadel unter leichtem Drehen durch alle Kammern, danach zurückschieben bis zur Einkerbung der Nadel und Abknicken der Impfnadel an dieser Stelle, danach Durchstoßen der Luftlöcher der letzten 8 Kammern mit dem abgebrochenen Teil der Impfnadel und Wiederaufsetzen der Schraubkappen. Die Bebrütung der Ansätze (Reagenzgläser und Enterotubes) erfolgt 24 h bei 37 °C, die Auswertung am darauffolgenden Tag, bzw. im nächsten Kurs nach Lagerung im Kühlschrank. Zur Auswertung geben Sie in jedes Röhrchen einen Tropfen Bromthymolblaulösung (sauer: gelb; alkalisch: blau; Farbumschlagsbereich: pH 6,0 bis 7,6) als Indikator für die Zuckervergärung unter Säurebildung. 22 Im Verlaufe des Kurses haben wir uns an dem folgenden sehr vereinfachten Weg orientiert: KLON-KULTUR ⇓ ⇓ Zellform/Pigmentierung ⇓ ============================================== ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ Kokken Spirillen knospend Stäbchen orange rotbraun rotbraun farblos ⇓ (Micrococcus (Rhodospirillum (Rhodomicrobium ⇓ sp.) sp). vannielii) ⇓ ⇓ Gram-Färbung ================== ⇓ ⇓ Gram-negativ Gram-positiv (Escherichia (Bacillus coli) sp.) ⇓ ⇓ ⇓ Oxidase-Test ====================== ⇓ ⇓ Oxidase-negativ Oxidase-positiv Dextrose-Vergärung (Pseudomonadaceae) (Enterobacteriaceae) ⇓ ⇓ Spezifische Stoffwechselleistungen ⇓ Lactose-Verwertung Indol-Freisetzung keine H2S-Bildung (Escherichia coli) ⇓ keine Lactose-Verwertung keine Indol-Freisetzung H2S-Bildung (Proteus mirabilis) 23 V. KURS: HEMMUNG DES WACHSTUMS UND ABTÖTUNG Um eine unkontrollierte Ausbreitung von Mikroorganismen zu verhindern, ist es nötig, entweder das Wachstum der unerwünschten Organismen zu hemmen oder sie gar abzutöten. Dies geschieht mit Hilfe von antimikrobiellen Agenzien oder physikalischen Methoden, die geeignet sind, essentielle Zellfunktionen zu schädigen. Bei einem Einsatz solcher Methoden ist aber immer daran zu denken, dass durch Mutation zufällig entstandene resistente Formen unter dem herrschenden Selektionsdruck zur Anreicherung kommen und sich dann ausbreiten können. Im Falle einer Wachstumshemmung spricht man bei Bakterien von einem bakteriostatischen und bei Pilzen von einem fungistatischen Effekt, während Abtötung auf bakteriziden oder fungiziden Effekten beruhen. Vielfach ist der Übergang von der Hemmung des Wachstums zur Abtötung abhängig von der Konzentration des antimikrobiellen Agens. Im typischen Falle wird Abtötung durch folgende Exponential-Funktion beschrieben: N = N0 e-kt wobei N die Zahl an Bakterien zum Zeitpunkt t ist und N0 die Zahl zu Beginn der Behandlung; k [h-1] wird als Absterberate bezeichnet. (Die Ableitung der Funktion entspricht der Ableitung der Wachstumskinetik). Beispiele für die Auslösung antimikrobieller Wirkungen: A) Physikalische Methoden: • Hitzebehandlung • Bestrahlung mit UV- oder Röntgen-Strahlen • Kältebehandlung • Wasserentzug B) Chemische Methoden: • Ansäuern • Detergentien (amphiphile Moleküle, stören Membranfunktionen) • Schwermetall-Ionen (können an aktive Zentren von Enzymen binden) • CN-, CO (hemmen Atmung über Cytochromoxidase) • Antimetabolite (Strukturanaloge zu normalen Substraten, hemmen Enzymfunktionen) • Enzymatischer Angriff (Abbau von Zellwänden und Proteinen) • Antibiotika (Substanzen biologischer Herkunft, die in geringen Mengen das Wachstum von Mikroorganismen hemmen) 1. Wirkung von UV-Licht UV-Strahlung mit Wellenlängen um 260 nm wird in erster Linie von Nukleinsäuren absorbiert und führt damit zu Änderungen im genetischen Material der Zellen. Hierdurch können Mutationen bis zu letalen Effekten ausgelöst werden. 24 Vers. V.1 Material: - 4 Petrischalen mit GPH-Nähragar für Staphylococcus epidermides - Übernachtkultur von Staphylococcus epidermides (flüssig) - sterile Pasteurpipetten, Pipettenhütchen - Drigalski-Spatel (steril) - Schalen mit Alkohol Durchführung: Auf die Agar-Oberfläche jeder Petrischale werden mit einer Pasteurpipette 3 Tropfen der Bakterienkultur aufgetragen und mit dem Drigalski-Spatel gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt. Pipetten und Spatel nach dem Gebrauch nicht auf dem Tisch, sondern gleich in einem Gefäß mit 70% Ethanol ablegen. Platten sofort am Boden beschriften mit: Datum, Gruppen-Nr., Versuchs-Nr., Expositionszeit. Eine der beimpften Platten dient als Kontrolle, die verbleibenden drei Platten werden mit geöffnetem Deckel im UV-Licht (Impfraum) exponiert. Vorsicht ! UV-Strahlung ist gefährlich für Haut und Augen! Deshalb vor dem Betreten des Impfraumes UV-Licht abschalten (Schalter außen) und nach dem Verlassen einschalten ! Nach 1; 5; bzw. 10 min Expositionszeit werden die Platten mit dem Deckel verschlossen und zusammen mit der Kontrolle bebrütet (30 °C, ca. 2 Tage). Auswertung am 6. Kurstag 2. Minimale Hemmstoff-Konzentration von Ampicillin Zur Ermittlung der minimalen Grenzkonzentration eines Hemmstoffes wird eine Reihe von TestRöhrchen angelegt, die Nährlösung enthält und in abgestuften Konzentrationen den zu untersuchenden Hemmstoff. Nach dem Beimpfen mit einer konstanten Menge an Bakterien werden die Röhrchen bebrütet. Bei der anschließenden Auswertung wird diejenige HemmstoffKonzentration, die in der absteigenden Verdünnungsreihe als niedrigste Konzentration im Vergleich zur Kontrolle kein Wachstum (= keine Trübung) aufweist, als minimale bakteriostatische Hemmkonzentration festgelegt. Vorsicht ! Ampicillin gehört (wie die Penicilline) zu den ß-Lactam-Antibiotika, deren Einsatz zum Auftreten von Allergien führen kann. Kursteilnehmer, die solch eine Allergie haben, können die folgenden Versuche nicht durchführen und müssen sich zu Kursbeginn beim Kursleiter melden ! 25 Vers. V.2: Material: - 10 sterile Reagenzgläser im Reagenzglasständer - sterile Nährlösung (LB) - sterile Stammlösung mit Ampicillin (1 mg/3,3 ml) - sterile, physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) - sterile Pipetten (5 ml und 10 ml), Pasteurpipetten, Pipettierhilfen - Impfsuspension (Escherichia coli DH5α) Durchführung: Zunächst werden unter Einhaltung steriler Bedingungen in jedes der zuvor nummerierten Röhrchen 3,0 ml Nährlösung pipettiert. Mit einer sterilen Pipette werden nun in das erste Röhrchen der Reihe 3,0 ml der Ampicillin-Stammlösung gegeben (⇒ 150 µg/ml). Der Inhalt des Röhrchens wird mit der Pipette durch Aufsaugen und Wiederauslaufenlassen gemischt (nicht mit dem Mund, sondern mit Pipettierhilfen pipettieren!). Anschließend werden 3,0 ml aus dem ersten in das zweite Röhrchen überführt, wie oben beschrieben durchmischt und in Portionen zu 3,0 ml weiter übertragen. Auf diese Weise wird mit insgesamt 9 Röhrchen verfahren, so dass eine geometrische Verdünnungsreihe des Antibiotikums entsteht. In dem 10. Röhrchen werden 3,0 ml Nährlösung mit 3,0 ml phys. Kochsalzlösung versetzt und durch Entnahme und Verwerfen von 3,0 ml (nach Mischen) auf das Volumen der anderen Testansätze reduziert. Schließlich werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette in sämtliche Röhrchen 2 Tropfen der Kultursuspension von E. coli gegeben und bei 30 °C bebrütet. Nach ca. 48 h Bebrütung werden die Röhrchen bis zum 6. Kurs kühl gehalten. 3. Natürliche Resistenz gegenüber ß-Lactam-Antibiotika ß-Lactam-Antibiotika (z.B. Penicilline) hemmen wachsende Bakterien auf der Stufe der Zellwandsynthese, und zwar der Biosynthese von Peptidoglycan (= Murein). Peptidoglycan wird von verschiedenen ß-Lactam-sensitiven Enzymen synthetisiert. Unter dem Einfluss von Antibiotika können Organismen, die ursprünglich empfindlich sind, Resistenzen erwerben. Daneben ist aber auch die natürliche Resistenz bekannt, die in erster Linie auf einen verminderten Zutritt der Antibiotika zum Wirkort zurückzuführen ist. Im Falle der ß-Lactam-Antibiotika kann die äußere Membran Gram-negativer Bakterien den Zugang zu den Enzymen der Peptidoglycan-Synthese behindern. Die Organismen sind dann resistent. Bei der anschließenden Auswertung weisen die mit Antibiotikum versetzten Röhrchen im Falle resistenter Bakterien Wachstum (= Trübung) auf, während die Röhrchen mit nicht resistenten Bakterien kein Wachstum ( = keine Trübung ) zeigen und klar bleiben.. Vers. V.3 Material: - sechs Reagenzröhrchen mit je 5 ml GPH-Medium, davon je zwei mit Penicillin G (7.5 E/ml), zwei mit Ampicillin (150 µg/ml ) und zwei als Kontrolle ohne Zusatz eines Antibiotikums. - Übernachtkulturen (flüssig in GPH) von Pseudomonas fluoreszenz, Staphylococcus aureus 26 - sterile Pasteurpipetten mit Saughütchen Durchführung: Je drei Reagenzröhrchen ( eines mit Penicillin, eines mit Ampicillin und eines ohne Zusatz als Kontrolle ) werden mit je einer der zwei Bakterienarten beimpft. Dafür wird jedes der Röhrchen mit je zwei Tropfen der betreffenden Übernachtkultur mit der Pasteurpipette beimpft. Die Röhrchen werden im Dunkeln bei 30°C bebrütet und am 6. Kurstag ausgewertet. 4. Bacterizide Wirkung von Desinfektionsmitteln Der Begriff der Desinfektion stammt aus dem Bereich der medizinischen Bakteriologie und bezeichnet die Abtötung aller pathogenen Mikroorganismen. Um die bakterizide Wirkung eines Hemmstoffs festzustellen, werden Bakterien mit verschiedenen Konzentrationen des Hemmstoffes über einen konstanten Zeitraum inkubiert. Anschließend werden Petrischalen mit Nähragar mit vier Tropfen aus der hemmstoffhaltigen Suspension beimpft und bebrütet. Bakterizide Wirkung liegt vor, wenn die Organismen auf den Agarplatten (d.h. ohne Hemmstoff) kein Wachstum (d.h. keine Kolonienbildung) mehr zeigen. Vers. V.4 Material: - 5 sterile Reagenzgläser - 5 Petri-Schalen mit GPH-Nähragar (siehe Anhang) - sterile Pipette (5,0; 1,0 ml) - Übernachtkultur von Staphylococcus epidermides (Sicherheitsmaßnahmen, siehe oben !) - Pasteurpipette - Desinfektionsmittel (Sterilliumlösung) - phys. Kochsalzlösung (0.9 %) - Drigalskispatel Durchführung: Die Röhrchen werden in einer Reihe aufgestellt und mit je 1,0 ml physiologischer Kochsalzlösung versehen. Dann wird in das erste Röhrchen 1,0 ml Sterilliumlösung gegeben. Nach dem Mischen wird 1,0 ml entnommen und auf das nächste Röhrchen übertragen usw.. Auf diese Weise wird wiederum eine geometrische Verdünnungsreihe hergestellt. Als Kontrolle wird das 5.Röhrchen nicht mit Sterillium versetzt. Sämtliche Röhrchen in der korrekten Reihenfolge beschriften ! Die Verdünnungsreihe wird nun mit 0,1 ml ( genau !) Bakteriensuspension je Röhrchen versetzt und für die Dauer von 15 min inkubiert. In der Zwischenzeit werden die Petrischalen beschriftet ( Versuchs-Nr., Gruppen-Nr., Sterillium-Konzentration ), so dass sie nach Ablauf der Versuchszeit mit 4 Tropfen ( Pasteurpipette ) aus der Sterillium-Reihe beimpft werden können. Mit dem Drigalski-Spatel werden die aufgetropften Bakterien auf der Agaroberfläche gleichmäßig ausgespatelt. Die Petrischalen werden 4 Tage bei 30 °C bebrütet und dann bis zum 6. Kurstag kühl gestellt. 27 VI. KURS: WACHSTUM Werden physiologisch aktive Bakterienzellen mit geeigneten Substraten versorgt, so werden diese Substrate von den Organismen in zelleigene makromolekulare Bausteine umgesetzt: die Biomasse der Zellen - und damit die Biomasse der Kultur - nimmt zu. Zellwachstum erfolgt bis zu einer kritischen Zellgröße; die darüber hinausgehende Zunahme der Biomasse einzelner Zellen ist nun nur nach Zellteilung möglich: die Zellen vermehren sich. Das Wachstum einer Bakterienkultur lässt sich somit anhand der Zunahme der Zellzahl oder der Biomasse beschreiben. Im folgenden wollen wir uns auf die Ermittlung von Parametern beschränken, die eine Quantifizierung des Wachstums auf der Grundlage der Biomasse (X) ermöglichen. Die Geschwindigkeit des Wachstums ist: dX / dt = µ X (1) Die Konstante µ besitzt die Dimension einer reziproken Zeit [h-1] und wird als Wachstumsratenkonstante oder in der gängigen Literatur kurz auch als Wachstumsrate bezeichnet. Zur Bestimmung von µ lösen wir die Gleichung nach Umformung durch Integration: dX / X = µ dt ln (X / X0) = 1 / loge x log (X / X0) = µ t (2) µ = (log Xt - log X0 ) / (loge (t - t0)) = (ln Xt - ln X0 ) / (t - t0) (2a) [loge = 0,43429 ] X = X0 x e µt (3) Anschaulicher als die Wachstumsrate (µ) einer Kultur ist die Verdopplungszeit td. Nach (2a) ist: td = (ln 2 X0 - ln X0) / µ = ln 2 / µ [h-1] (4) Wachstum im geschlossenen Kultursystem Zur Anzucht von Bakterien wird vorwiegend das geschlossene Kultursystem genutzt, in dem ein geeignetes steriles Kulturgefäß (z.B. ein Erlenmeyerkolben) mit Nährlösung versehen und mit Bakterien beimpft wird. Anschließend wird die Kultur bebrütet. Dabei werden die Komponenten der ursprünglich eingebrachten Nährlösung verbraucht und das Bakterienwachstum klingt aus. (Bei einem offenen Kultursystem wird durch laufende Zufuhr frischer Nährlösung die Kultur in der Phase aktiven Wachstums gehalten). 28 Im geschlossenem System durchlaufen die Kulturen aufgrund der sich ständig ändernden Bedingungen verschiedene Phasen. Nach dem Beimpfen können die Organismen im Prinzip gleich mit der maximalen Rate wachsen (exponentielle oder auch logarithmische Phase). Voraussetzung hierfür ist, dass sie in ihrem Stoffwechsel auf eine optimale Verwertung der Nährstoffe eingestellt sind. Sie wachsen mit dieser maximalen Rate solange, bis die Konzentration einer begrenzt vorhandenen Komponente des Mediums (dies wird in erster Linie das Substrat sein) auf limitierende Werte absinkt, so daß das Wachstum der Kultur ausklingt. Verbunden damit wird zunächst die Wachstumsrate geringer (Verzögerungsphase) bis das Wachstum letztlich ganz zum Stillstand kommt (stationäre Phase). Auch die Bildung von Stoffwechsel-Endprodukten kann über eine Hemmung zum Stillstand des Wachstums führen (z. B. Änderung des pH-Wertes bei der Produktion von Säuren). Werden Zellen aus suboptimalen Wachstumsverhältnissen als Impfmaterial in frisches Medium übertragen, so sind sie zunächst nicht gleich auf die günstigeren Bedingungen eingestellt. Die Adaptation an das frische Medium erfolgt dann in einer ersten Phase, die noch kein Wachstum erkennen lässt ("lag"-Phase). Anschließend (Anlaufphase) wird die Wachstumsrate bis zu ihrem maximalen Wert (exponentielle Phase, s.o.) gesteigert. Lag- und Anlaufphase können auch auftreten, wenn die Komposition des Mediums geändert wird. Wachstumsprozesse gehorchen Exponentialfunktionen. Deren graphische Darstellung wird in halblogarithmischem Maßstab überschaubar. Zum einen wird in dieser Auftragung der Übergang zwischen verschiedenen Wachstumsphasen deutlicher und zum anderen lässt sich die maximale Wachstumsrate (µmax) aus der Steigung des Geradenbereichs ablesen. Messung der Biomasse Eine Reihe von Methoden steht dem Experimentator zur Verfügung, um die Biomasse direkt oder indirekt zu quantifizieren. Zu den direkten Methoden gehören die Ermittlung von Trockengewicht, Zellprotein oder des Gesamtstickstoffs der Biomasse einer Kultur. Zur routinemäßigen Bestimmung der Biomasse hat sich als indirekte Methode die Messung optischer Eigenschaften einer Population bewährt. Dabei wird die in der Mikrobiologie übliche optische Dichte (O.D.) der Suspension in einem Wellenlängenbereich des Spektrums gemessen, in dem keine Pigmente der Bakterien absorbieren. Damit ist gewährleistet, dass in erster Linie die Lichtstreuung an den Zellen in die Messung eingeht. Aufgaben: Bestimmen Sie mit den unten aufgeführten Kulturen von Escherichia coli: a) die Wachstumsrate (µ) b) die Verdopplungszeit (td) und c) gegebenenfalls die Zeit vom Animpfen bis zum Erreichen der exponentiellen Phase Vorsicht ! Escherichia coli ist im Prinzip kein pathogener Organismus. Dies bedeutet jedoch nicht, dass mit ihm sorglos umgegangen werden kann; denn ein Auftreten in größeren Mengen kann, z.B. über Hautverletzungen auch zur Infektion führen. Es gilt das grundsätzliche Gebot des sauberen Arbeitens in der Mikrobiologie. 29 Vers. VI.1: Material: - Schüttelwasserbäder: mindestens 2 Stück pro Kurs - Eppendorf oder vergleichbares Photometer: 2 Stück plus Filter - Erlenmeyerkolben (300 ml, 1 Stück pro Gruppe), die in Einsätze für Wasserbäder passen - sterile Pasteurpipetten (lange Spitze) in Pipetten-Dose: (10 Pip. und 1 Dose pro Gruppe) - Einmal-Küvetten, 1,0 cm, halbmikro (1 Stück pro Gruppe) - Gefäß für gebrauchte Pipetten - Desinfektionslösung (Sterillium) - Nährmedien in Kolben (alternativ können den Kursteilnehmern gleich die mit den richtigen Mengen an Nährlösung gefüllten Kulturkolben vorbereitet werden) - 3 Eisbäder, Gummihütchen zum Pipettieren, 5 Reagenzröhrchen, Log-Papier - 2 Stationen zum Animpfen der Kulturen: mit je 1 Übernacht-Kultur und sterilen 10 ml Pipetten - Taschenrechner ( bitte mitbringen !) Durchführung: Jede Gruppe bearbeitet jeweils eine Kultur mit Zellen von Escherichia coli, die in VollMedium als Schüttelkultur (= gute Belüftung) entweder bei 37 °C ( optimale Wachstumstemperatur; gerade Gruppen-Nr.) oder bei 27 °C ( suboptimale Wachstumstemperatur; ungerade Gruppen-Nr.) wachsen. Die Anzucht erfolgt in 300 ml Erlenmeyerkolben, das Kulturvolumen beträgt 100 ml. Um gutes Wachstum zu erhalten, sollten die Kulturen mit einer O.D.623 von 0.05 - 0.1 (Messung in Halbmikro-Küvetten, 1,0 cm Strahlengang) angeimpft werden. Probennahme mit sterilen Pasteurpipetten: ca. 3/4 gefüllt, in Abständen von 20 min (Zeiten genau protokollieren!). Sollte die Messung nicht sofort nach der Probenahme durchführbar sein: Proben im Eisbad rasch abkühlen und dort bis zur Messung aufbewahren. Vor der Messung die Proben kurz aufschütteln, dabei jedoch Schaum- oder Bläschenbildung vermeiden! Ab einem O.D.-Wert von 0,5 muss die Probe vor der O.D.-Bestimmung mit Medium verdünnt werden, damit die Messung weiterhin im linearen Bereich erfolgen kann. Tragen Sie die Messwerte in halblogarithmischem Maßstab gegen die jeweilige Kulturdauer auf und berechnen Sie die gewünschten Werte. 30 Anhang Nährböden für Anreicherungskulturen Glucose-Pepton-Hefeextrakt (GPH)-Medium (Vers. I.1) Glucose 1 g Pepton 5 g Hefeextrakt 2 g Aqua dest. ad pH 7,0 1.000 ml Glucose-Pepton-Hefeextrakt (GPH)-Agar (Vers. I.1) Glucose 1 g Pepton 5 g Hefeextrakt 2 g Agar-Agar 18 g Aqua dest. ad 1.000 ml pH 7,0 Das GPH-Medium ist nicht selektiv,- auf ihm können verschiedene Bakterien wachsen MP - Agar (Vers. I.3 und II.6) Malzextrakt (fest) Caseinpepton Agar Aqua dest. ad. pH 5,9 Stärke-Agar (Vers. I.5) 3,0 0,5 15,0 900 g g g ml Lösliche Stärke NaCl Pepton Agar Aqua dest. ad. pH 7,0 20 70 3 18 1.000 g g g g ml Nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 60 °C (im Wasserbad) wird dem MP-Agar 0,1 g Chloramphenicol zur Unterdrückung des bakteriellen Wachstums zugemischt (in 100 ml Aq. dest. gelöst und sterilfiltriert). Nährlösung für phototrophe Bakterien (RÄH, Vers. II.1) Hefeextrakt Äpfelsäure NH4Cl MgSO4 x 7 H2O CaCl2 x 2 H2O Spurenelemente-Lösung* Aqua dest. ad 1,0 g 3,0 g 1,2 g 0,2 g 0,07 g 2,0 ml 1.000 ml Mit 20%iger NaOH auf pH 6,8 einstellen und nach dem Autoklavieren 10 ml eines sterilen0,5 mol K-Phosphatpuffers (pH 6,8) sowie 1 ml sterilfiltrierter Vitamin-Lsg. zusetzen 31 Nährlösung für Desulfurizierer# ( Vers. II.2 ) Nährlösung für Nitrifizierer (Vers. II.3) Na-Lactat (50%ig) KH2PO4 NH4Cl CaSO4 MgSO4 x 7 H20 Ammoniumeisen(II)sulfat Na2S (10-3 M) Aqua dest. ad pH 7,0 (NH4)2 SO4 700 mg K2HPO4 200 mg MgSO4 7H2O 50 mg CaCO3 50 mg CaCl2x 2 H2O 20 mg Spurenelemente Lösung 1 ml Aqua dest. ad 1.000 ml 4,9 g 0,5 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 0,5 g 10 ml 1.000 ml # Erst am 2. Kurstag ansetzen, da sonst Oxidation des FeII erfolgt ! Nach dem Autoklavieren mit steriler Na2CO3-Lösung (2 g/100 ml H2O) auf pH 7,5-8,0 einstellen Nährlösung für Denitrifizierer (Vers. II.4) Nährlösung LB (Vollmedium für E.coli ) (Vers. V.1, V.2) Pepton 5 g NaCl 5,0 g Hefeextrakt 1 g Hefeextrakt 5,0 g NaCl 8 g Trypton 10,0 g KNO3 10 g Aqua dest. ad 1000 ml Aqua dest. ad 1.000 ml pH 7,1 pH 6,9 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Phosphat wird bei allen Nährlösungen getrennt gelöst und autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wird mit dem Nährboden gemischt und der pH Wert kontrolliert. Auch Zuckerlösungen sollen getrennt gelöst und erst nach dem Autoklavieren mit dem Nährboden vermischt werden. Spurenelement-Lösung :. Der Bedarf an Spurenelementen ist - abhängig vom Bakterium - unterschiedlich. Alle Bakterien benötigen Fe2+. Weitere wichtige Spurenelemente sind: Mn2+, Co2+, Cu2+, Ni2+, Molybdat, Zink und Selen. Die Zusammensetzung der im Kurs verwendeten Spurenelement-Lösung: Stamm-Lösung für Spurenelemente ( nach Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 4. Auflage (1984) EDTA ( Ethylendiamintetraessigsäure ) FeSO4 x 7 H2O MnCl2 x 4 H2O CoCl2 x 6 H2O CuCl2 x 2 H2O NiCl2 x 6 H2O Na2MoO4 x 2 H2O ZnSO4 x 7 H2O H3BO3 500 mg 300 mg 3 mg 5 mg 1 mg 2 mg 3 mg 5 mg 2 mg Die Substanzen werden getrennt in Aqua dest. gelöst, zur EDTA-Lösung gegeben, der pH-Wert auf etwa 4 eingestellt und auf 1000ml mit Aqua dest. aufgefüllt. Zu den verschiedenen Nährlösungen werden 1 – 10 ml/l zugegeben. 32 Vitamin-Stammlösung Biotin Nicotinsäure Nicotinsäureamid Thiaminhydrochlorid (Vitamin B1) Aqua dest. ad 10,6 mg 266,0 mg 266,0 mg 533,0 mg 1000 ml Von dieser Stamm-Lösung wird 1 ml pro 1000 ml Nährmedium zugegeben. Auszug aus den Sicherheitsregeln für das Arbeiten in biologischen Laboratorien Zu Beginn des Kurses erfolgt eine Belehrung über allgemeine Sicherheitsbestimmungen einschließlich der Hinweise auf : - Fluchtwege - Standort von Feuerlöschern und Erstehilfe-Einrichtungen - Pläne für Notruftelephon-Nr. - Verhalten bei Alarm ( siehe hierzu auch die entsprechenden Aushänge im Kursraum und in den Fluren ) Rauchverbot beachten ! Bei vorliegenden Verletzungen an den Händen : mit Schutzhandschuhen arbeiten! Bei Allergien : Kursleiter informieren ! Sämtliche Vorfälle, die die Sicherheit beeinträchtigen könnten, Kursleiter oder Kurs-Assistenz melden! Bei der praktischen Arbeit: - Im Kursraum muss ein Schutzkittel getragen werden. - Schutzbrillen mit Seitenschutz müssen immer getragen werden, wenn mit Gefahrstoffen umgegangen wird, die auf dem Originaletikett ein Gefahrsymbol tragen sowie bei Laborarbeiten , bei denen Apparaturen evakuiert bzw. mit Überdruck betrieben werden. - Grundsätzlich darf nicht mit dem Mund pipettiert werden, Pipettierhilfen benutzen. - Im Kursraum darf weder gegessen noch getrunken werden. Vor Beginn der Arbeiten : Verpflichtung zur Information über Gefahren, die von Chemikalien, Organismen und Geräten ausgehen können, mit denen gearbeitet wird. Chemikalien: Giftigkeit, Stabilität, Brennbarkeit, Entsorgung. Organismen: Im Praktikum wird vorwiegend mit apathogen Bakterien gearbeitet. Dies schließt nicht aus, dass von Anreicherungskulturen mit unbekannter Zusammensetzung oder von massiven Infektionen gesundheitliche Gefahren ausgehen können. Deshalb grundsätzlich mit Mikroorganismen vorsichtig arbeiten! o Arbeiten mit den Organismen auf den definierten Arbeitsplatz beschränken und unkontrollierte Ausbreitung in die Umgebung vermeiden. o Unvermeidbare Verunreinigungen sofort beheben ( zunächst mit Wasser aufwischen und anschließend mit Desinfektionsmittel nachbehandeln). Vor dem Verlassen des Labors die Hände mit den bereitgehaltenen Desinfektionsmit teln reinigen Geräte: sämtliche Geräte nur nach vorheriger Einweisung durch erfahreneMitarbeiter/innen nutzen. Bei Unsicherheit ( auch nach der Einweisung) über genauen Gebrauch informieren. Es sollten ohne vorherige Absprache mit dem Kursleiter keine anderen , als im Programm vorgesehenen Experimente durchgeführt werden. Aus dem Kursraum dürfen ohne Anweisung keine Materialien ( Chemikalien, Organismen und Geräte ) entfernt werden. 33 Nach Beendigung des Tagesprogrammes: Gashähne schließen, Geräte ausschalten, Stecker elektrischer Geräte abziehen, Wasserhähne schließen, Kursmaterialien auf dem dafür vorgesehenen Platz sammeln, nach Abschluss der Experimente: Gefäße von Beschriftungen reinigen, Arbeitsplatz aufräumen und von eventuellen Verschmutzungen reinigen und mit Desinfek tionsmittel einsprühen, Vor dem Verlassen des Labors die Hände mit den bereitgehaltenen Desinfektionsmitteln reinigen. Phasenkontrastmikroskop ( Zeiss, neuer Typ) Zuerst Hellfelddurchlicht-Verfahren einstellen ( „Köhlern“) : - Beleuchtung einschalten (10) . Mittlere Helligkeit (9) einstellen. - Präparat auflegen.10er Objektiv (gelber Kennring) einstellen. Auf „0“-Stellung amTubusrohr (1) - Aperturblende (4) halb geschlossen - Okularstutzenabstand auf Ihren Augenabstand einstellen (helle Kreise, die Okularblenden, zu einem Kreis vereinen Köhlern: - Scharfstellen des Präparates (11): Grob-, dann erst Feintrieb. ( Hilfe: Kante des Objektträgers) - Mäßiges Schließen der Leuchtfeldblende (7), die jetzt im Bild erscheint (A) - Falls Blendenbild unscharf, mit (6) möglichst scharf stellen (B) - Mit den beiden Schrauben (5a, 5b) Blendenbild zentrieren © - Leuchtfeldblende (7) gerade soweit öffnen, bis sie aus Sehfeld verschwindet (D) Bei Objektivwechsel muss die Einstellung der Leuchtfeldblende neu erfolgen ( wegen Änderung des Sehfeldes und der Apertur!) Dann Phasenkontrast-Verfahren einstellen : - Objekt im Hellfeld eingestellt und so gut wie möglich fokussiert (s.o.) - Gewünschtes Phasenkontrast-Objektiv in den Strahlengang (40er oder 100er. Jeweils mit „Ph“) - Aperturblendenhebel (4) auf Linksanschlag (öffnet Aperturblende vollständig) - Zum Objektiv passenden Blendenschieber (12) bis zum Anschlag in Kondensor einschieben ( die Angabe Ph2 bzw. Ph3 auf dem Blendenschieber muss mit der Ph-Angabe auf dem Objektiv identisch sein) 34 - - Lampenhelligkeit (9) nachregulieren Die helle Ringblende im Blendenschieber (13) und der dunkle Phasenring im Objektiv müssen sich genau decken.Die Kontrolle erfolgt durch Abnehmen des Okulars ( und evtl. durch Einsetzen eines Hilfsmikroskopes). Ringblende und Phasenring mittels der beiden InbussSchrauben (14) am Blendenschieber zur Deckung bringen. Das Mikroskop ist nun für den Phasenkontrastbetrieb justiert. Bei Objektivwechsel: bei einigen Mikroskopen Blendenschieber wechseln, bei anderen Mikroskopen nicht nötig. Gegebenenfalls Phasenkontrast nachjustieren ( Ringblende und Phasenring deckungsgleich s.o. ) Nach Beendigung des Mikroskopierens : Bei Verwendung von Immersionsöl : Objektive mit Linsenpapier reinigen ( ggf. mit etwas Alkohol). 100er Objektiv in die Schutzarretierung bringen. Phasenkontrastmikroskop ( Zeiss, älterer Typ) Zeiss Standard Mikroskop : 1 Okulare 12 Oberer Halter für Hilfslinse 2 Tubus 13 Unterer Filterhalter 3 Optovar 14 Knopf zum Ausklappen der 4 Wahlscheibe Optovar-Einstellung Kondensorfrontlinse 5 Scharfstellung Optovar 15 Kondensorjustierung ( li u. re ) 6 Objektivrevolver, 4fach 16 Kondensorhöhenverstellung ( li ) 7 Objektiv 17 Leuchtfeldblende 8 Objekttischverstellung 18 Fuß 9 Objekttisch 19 Stativ 10 Kondensor mit Kondensorwahlscheibe 20 Grob- und Feintrieb 11 Zentrierung für Phaseneinstellung 21 Mikroskopleuchte nicht sichtbar : Kondensorfrontlinse und Kondensorhilfslinse 35 Justierung : ( 1 ) Zuerst Hellfeld-Einstellung, einschließlich „Köhlern“ : - Lampe einschalten.Mittlere Helligkeit ( 5,5 V ) auf Transformator einstellen - Präparat auflegen. 10er Objektiv ( 7 ) wählen - Kondensor in höchste Stellung bringen ( 16 ) - Frontlinse ( direkt unter Objekttisch ( 9 ), Hebel rechts ) in den Strahlengang bringen, alle weiteren Zusatzlinsen (unterhalb des Kondensors ) vollständig aus dem Strahlengang nehmen. - Kondensorblende mit Kondensorwahlscheibe ( 10 ) auf „J“ = Hellfeld auf weißen Markierungsstrich einstellen ( links unter Objekttisch ) - Okulare ( 1 ) auf richtigen Augenabstand einstellen - Mit dem 10er Objektiv das Präparat scharf einstellen : Grob- , dann erst Feintrieb (20 ) ( Hilfe dabei : Kante des Objektträgers, Objekt dabei bewegen) - Leuchtfeldblende ( 17 ) unten im Fuß ( 18 ) des Mikroskopes ganz schließen - Kondensor ( Triebknopf ( 16 ) links ) gerade soweit senken, bis Leuchtfeldblende möglichst scharf erscheint - Bild der Leuchtfeldblende zentrieren ( Triebknöpfe ( 15 ) am Kondensor rechts und links - Leuchtfeldblende( 17 ) unten im Fuß soweit öffnen, bis Sehfeld gerade ganz ausgeleuchtet ist, dabei Kondensor ggfls. nachzentrieren Ab hier , selbst bei Objektivwechsel , weder Verschiebung noch Höhe des Kondensors verändern, sonst wird korrektes Köhlern wieder aufgehoben. ( 2 ) Wechsel vom 10er auf das 40er oder 100er Objektiv : - Im Fall von Objektivwechsel muss die Einstellung der Leuchtfeldblende ( 17 ) ( siehe oben ) neu erfolgen ( wegen Änderung des Sehfeldes und der Apertur ) ( 3 ) Dann Phasenkontrast-Einstellung : - Objekt im Hellfeld einstellen ( s. o. ) - Gewünschtes Phasenkontrast-Objektiv ( 7 ) in den Strahlengang ( 40er oder 100er, jeweils mit „Ph“ ). Bei 100er Objektiv Ölimmersion - Dem gewählten Objektiv entsprechende Phasenkontrastringblende mit Kondensorwahlscheibe (10) auf weißen Markierungsstrich einstellen („2“ entspricht dem 40er, „3“ dem 100er Objektiv ) - Am Optovar (3 ) mit Wahlscheibe ( 4 ) auf „PH“ drehen . („PH“ ist Hilfsmikroskop zur Sichtbarmachung der hellen Ringblende im Kondensor und des dunklen Phasenringes im Objektiv) - Ringblendenbild und Phasenring zur Deckung bringen ( Triebknöpfe ( 11 ) gleich unterhalb des Objekttisches vorne und seitlich am Kondensor ) - Gewünschte Zwischenvergrößerung mit Wahlscheibe ( 4 ) am Optovar einstellen, dabei förderlichen Vergrößerungsbereich beachten ! - Objektebene vorsichtig scharf stellen ( Feintrieb ! ) - Nach Bedarf Bildhelligkeit regulieren Bei Objektivwechsel ( 40er zum 100er, bzw. umgekehrt) muss auch der Phasenkontrast neu eingestellt werden ( wegen neuer Justierung von Ringblende und Phasenring) 36 Platz für Notizen :
