Nanopartikel zur Therapie und Diagnose

Pharmazeutische Technologie und Medizinprodukte;
Nanopharmazie_1
Nanopartikel zur Therapie und Diagnose
1.
Prinzip, Typen von Nanopartikeln, Liposomen Teil 1
2.
Herstellung, Charakterisierung, Liposomen & Lipoid-Partikel Teil 2
3.
Magnetische Partikel, Ferrofluide; Anwendungen
nawroth @uni-mainz.de
langguth @uni-mainz.de
Mainzer Nanotherapie-Netzwerk / Gruppe
Landes-Schwerpunkt: SAMT
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1. Gutenberg-Universität & Uni-Klinik Mainz :
a) IPM, Institut für Pharmazie, AK Langguth
b) BCh, Institut für Biochemie
c) OCh, Institut für Organische Chemie
d) Molekulare Biophysik Institut, FB Biologie
e) Institut für Anatomie & Zellbiologie / Medizin
f) Klinik für Radioonkologie & Radiotherapie
g) Klinik für Nuklearmedizin
h) Institut für Kernchemie / TRIGA Reaktor
PD Thomas Nawroth1a, formerly 1b & TUM
Tanja Peters1a,
P. Buch1a,
K. Buch1a,
E. Hühn1a,
Gamal Shazly1a,
Natalie Glube1a,
AK Prof. Peter Langguth1a,
1c,
Extern:
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PD Christoph Alexiou2, HNO Klinik Erlangen
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Monika Rusp3a, TU München (TUM)
Günter Gorigk3b, formerly DESY-HASYLAB FRM-2
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Stéphanie Corde5, CHRU Klinik Grenoble
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AK Prof. Frey
AK Prof. Zentel1c,
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AK Prof. Manel Sabés6 , UAB Barcelona
Meritxell Costa-Torres6
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AK Prof. Heinz Decker1d,
Bruno Pairet1d,
Christian Meesters1dc
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Roland Gähler7b ,
Michael Jentschel7b ,
Bernhard Lauss(7b),8,
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PD Debra Bickes-Kelleher1e
Prof. Peter Vaupel1f
AK Prof. Moritz Konerding1e
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Phil Callow7a,
Roland P. May7a,
Isabelle Grillo7a
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AK Prof. Heinz Schmidberger1f
Dr. Arnulf Mayer1f
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AK Prof. Mathias Schreckenberger1g
Dipl.Ing. Stephan Maus1g
Dr. Gabriele Hampel1h
AK Prof. Frank Rösch1h
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Peter Boesecke4a,
Alberto Bravin4b,
Christian Nemoz4b,
Pierick Regnard4c,
Géraldine Le Duc4c
www.ill.eu
www.esrf.eu
Wozu dienen Nanopharmazeutika ?
(Nanopartikel-Formulierungen)
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Konzentration von Wirkstoffen : ~ 1000 000 Moleküle/ Partikel
Zielsteuerung von Wirkstoffen
Zeitsteuerung der Freisetzung von Wirkstoffen
Erhöhung der Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen
• Diagose : Gewinnung analytischer Signale
• Bildgebung (Diagnose, Imaging)
• Behandlung von Krankheiten mit kritischem Verlauf, z.B. Krebs
Krebs : schnell wachsende Zellen, Kontroll-Verlust
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Hirn Tumor , Krebs :
(Beispiel)
20 000 Fälle / Jahr in der EU, (nur primäre Hirn Tumoren)
Sterblichkeit (10 y) ~ 98% …. Extrem ungünstige Prognose
Therapie-Entwicklung & Tests: Zellkulturen und Tierversuche
Zell-Kultur Experiment mit Ratten - Glioblastom 9L Zellen : 2 Tage
- Verwendung als Tumor Modell
- in Kombination mit Tier-Versuchen
Krebs : Situation und Therapie-Methoden
Situation in der EU :
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Eine von drei Personen bekommt in der Lebensspanne Krebs
Eine von fünf stribt, d.h. ~ 1 500 000 Krebsfälle in der Europäischen Union jährlich
zweithäufigste Todesursache in der EU (nach Herz-Kreislauf Versagen)
Krebs ist ein Versagen eines komplexen Multikomponenten-Systems, das in 98% der Fälle
keine gemeinsame Ursache hat: jeder Fall is unterschiedlich
(Ausnahmen , je ~2% : genetisch bedingt (z.B. BRCA1&2 Gene), Virus-induzierter Krebs)
Krebs Therapie Strategien : 3 Ebenen / Level
Chirurgie – Strahlentherapie – Chemotherapie
Heilerfolg :
40-50% : 20% : 5-10%
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„Stahl – Strahl – Chemie“
In der Sequenz der Behandlungs-Strategien sinkt der Effekt 1:3 je Level
die unerwünschten Nebeneffekte steigen in der umgekehrten Reihenfolge
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Selbst die Strategie-Kombination versagt in ~ 20 % der Krebsfälle
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Vollständige Heilungschance (10-Jahre) für diverse Krebstypen : 90 % … 2% (Hirn)
Deutschland: Informations-Server : www.krebsinformation.de (KID, Heidelberg)
France :
Medizinisches Netzwerk : www.inserm.fr (INSERM)
Therapie und Diagnose mit Nanopartikeln :
Wirkstoff Konzentration und lokale Anreicherung
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In der konventionellen Therapie (A) verteilt sich die aktive Substanz (Wirkstoff, Target) im gesamten
Körper, was zu einer Verdünnung am Krankheits-Herd (Tumor), und Nebenwirkungen fernab führt.
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Nanotherapy (B) steigert die Heilwirkung des Wirkstoffs doppelt: ~ 1 000 000 Moleküle werden in
Nanopartikeln konzentriert eingebracht, die zusätzlich lokal angereichert werden können (Targeting).
Was sind Bio-Nanopartikel ?
a) Substrat-Moleküle
0,3-2 nm (3 Å)
b) Bio-Polymere
3 - 20 nm
c) Bio-Nanopartikel
10 –5000 nm
d) Zellen
0,3 – 30 µm
Größenvergleich von a) Substraten, c) Bio-Polymeren, c) Bio-Nanopartikeln und d) Zellen
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Größe zwischen organischen Molekülen (< 20 nm) und Zellen (~10 µm)
Formale Größe: Durchmesser von 1 – 999 nm
Pharmazeutisch sinnvolle Größe: 10 nm – 5 µm
Pharmazeutisch nutzbare Bio-Nanopartikel haben etwa die Größe der
zellulären Kompartimente
• Bei Parenteralia : Größenbeschränkung wegen Embolie-Risiko (500 nm < 1 µm )
• Aufbau aus biokompatiblen Materialien, z. B. Lipide, Biopolymere
• Abbauweg und / oder Ausscheidungsweg erforderlich
Wie : 4 Typen von Pharma- Nanopartikeln :
Liposomen, Lipoid-partikel, Polymere, Ferrofluide
kombinierte Partikel:
Liposome (30 – 500 nm) Lipoid-Particle
Polymer
Microsphere
-------Aerosol particle---------
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Ferrofluid / magn-NP
Poly-Ferrofluid
magnetic liposome
multicomponent NP
Der in Liposomen verkapselte Wirkstoff (Target) kann jeder Wasser-lösliche Stoff sein,
z.B. Metallverbindungen für die Strahlentherapie, Wirkstoffe für Chemotherapie: MDT.
Der in Lipoid-Partikel oder Aerosol-Partikel gelöste Wirkstoff kann jede lipophile
Verbindung sein, z.B. Wirkstoffe für die Chemotherapie, Diagnose: MDT , Bildgebung.
Polymere, Membranproteine und Oberflächengebundene Peptide
Magnetische Liposomen können Metall in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid
Liposomen b) Liposomen mit verkapselten Maghemite Nanopartikeln, c) Metaloxide-Lipid
Doppelschalen-Liposomen. Der gebundene Wirkstoff (Target (T)) ,z.B. GdDTPA, drugs
kann selektiv und zeitlich definiert freigesetzt werden (Lokalisation und Zeitsteuerung).
Binäre Schalen- und Poly-Ferrofluide (d) enhalten z.B. ~ 10 - 100 magnetische Core-Partikel
von 10-20 nm Größe. Durch gezielte Struktur-Synthese können 5% Wirkstoff gebunden werden.
Wo wirken Pharma-Nanopartikel ?
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Pharmazeutische Bio-Nanopartikel sind analog zu natürlichen Nanopartikeln
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Zwei Wirkstoff-Freisetzungs Prinzipien und Orte:
a) Wirkstoff-Freisetzung außerhalb der Zellen (im Gewebe)
b) Wirkstoff-Freisetzung in den Zellen (intrazellulär), oder bei Zellkontakt
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Zwei Aufnahme-Wege in Zellen:
c) durch Endocytose: komplette Nanopartikel mit Wirkstoff
d) durch Carrier (aktiv) oder Diffusion (passiv): nur Wirkstoff
Carrier
Endycytose
100x Zoom
Nano-skalierte Partikel in a) Zellen : Kompartimente (nativ); und b) Synthetische Bio-Nanopartikel
zur Therapie und Diagnose, Bio-Analytik. Beide Partikeltypen konzentrieren Materialien lokal.
Wirkstoff-Zielsteuerung zu Zellen : Targeting
Chemotherapie, Nano-RT, -PDT, Imaging
Nanopartikel können die Therapie und Diagnose durch Lokalisierung verbessern :
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Verstärkte
(Enhanced)
mit
Bio-Nanopartikeln
ist
möglich
mit:
(a) hohlen Target-Liposomen, Lipoid-Partikeln, Polymeren oder (b) binären Poly-Ferrofluiden, die ~ 1,000,000
Wirkstoffmoleküle in kolloidalen Partikeln von 100 nm Größe konzentrieren.
(50-500 nm is ok.)
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Regioselektivität kann erzielt werden durch: Diffusions-Restriktion, (c) magnetische Target-nanopartikel
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Kompatible Methoden sind mit Nanopartikeln parallel möglich: MDT, RT, PAT, PDT, NCT, imaging: PET, MRI
Radiotherapie
in eine, magnetischen Feld-Gradienten, (d) Rezeptor-Ligand Interaction und/ oder Immuno-Nanopartikel, die
specifische Antikörper, Antigene tragen.
magnetic drug targeting MDT: C. Alexiou, R. Schmid, R. Jurgons, M. Kremer, M. Wanner, C. Bergemann, E. Huenges, T. Nawroth, W.
Arnold, F. Parak (2006) Eur. Biophys. J. 35, 446-450
Liposomen : Aufbau und Typen - 1
Prinzip, Wirkstoffbindung
Hydrophile
Wirkstoffe
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Lipophile
Wirkstoffe
Liposomen sind Hohlkugeln aus Lipiden, z.B.
Lecithin (Phosphatidylcholin)
Der wässrige Innenraum (Lumen) wird von einer
Membranstruktur aus einer oder mehreren LipidDoppelschichten umschlossen (wie bei Zellen)
Wirkstoffbindung: Strukturabhängig, 3 Typen:
Hydrophile Wirkstoffe können im Lumen als
Lösung eingeschlossen werden (bis 20%)
Lipophile Wirkstoffe können in der Membran
strukturell integriert werden (< 5%)
Amphiphile Wirkstoffe können begrenzt an der
Grenzfläche von Membran und Lumen / Medium
eingelagert werden (<5%, Lyse-begrenzt)
Amphiphile
Wirkstoffe
Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek
Liposomen : Aufbau und Typen - 2
Beispiel, Wirkstoffbindung
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Integration eines hydrophoben
Wirkstoffs in Liposomen aus DOPC
(Di-Oleyl-Lecithin, 10 g/l) und
Analyse durch SucroseDichtegradienten-Ultrazentrifugation
(150 000g, 15h):
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Links: Liposomen ohne Wirkstoff
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Rechts: mit 0,5 % Wirkstoff in der
Membran: farbig, Dabsyl-Stearylamin)
Liposomen : Aufbau und Lipide - 3
Membranlipide - Phospholipide
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Membranlipide sind Amphiphile
(hydrophobe und hydrophile Domäne)
Wichtigste Gruppe: Phospholipide aus
Glycerin-Phosphat, 2 Fettsäuren FS,
oft eine weitere Gruppe am Phosphat
Fettsäuren: Palmitinsäure, Stearinsäure,
Ölsäure (18:1), Linolsäure, Linolen„Schmelzpunkt“ der Lipidschich: Tc:
- nativ >20° unter Körpertemperatur
- Pharmaprodukte: Tc kann so gewählt
werden, das Wirkstoff-Freisetzung
erfolgt; bei DPPC: Tc = 42°C
- Messung: DSC = Diff.-Kalorimetrie
Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek
Liposomen : Aufbau und Lipide - 4
Membranlipide - Cholesterin
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Säugetiermembranen enthalten Cholesterin, ein Amphiphil mit Steran-Gerüst
Cholesterin macht die Membranen fluide, aber zäh (im Gegensatz zu ungesättigten FS
Cholesterin steht senkrecht in der Membran, die es halb durchspannt
Für Cholesterin gibt es Rezeptoren, welche die zelluläre Aufnahme von Lipid-Partikeln
mit Cholesteringehalt induzieren können
Membranen mit hohem Cholesteringehalt bilden Cholesterin-haltige
Entmischungsinseln, die als „Rafts“ bezeichnet werden
Cholesterin ist die Vorstufe von wichtigen Hormonen (Cortisol, Östrogen etc.)
Liposomen : Aufbau und Lipide - 5
Membranlipide bestimmen die Membranstruktur
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Den Lipiden können nach dem
Querschnitt der hydrophilen und
hydrophoben Domäne molekulare
Formen zugeordnet werden: Zylinder,
Pyramide, Konus (Konzept nach Cullis)
Aus der Lipidform ergibt sichtdie Art
der aufgebauten Amphiphil-Aggregate:
Membranen, Mizellen (beiDetergentien)
und H-II-Phase / inverse Mizellen (mit
speziellen Detergentien)
In biologischen Systemen sind die
Lipidformen für die Ausbildung von
Strukturen wichtig (Krümmung, Poren,
Myelin-Struktur etc)
Liposomen : Aufbau und Typen - 6
SUV, LUV, MLV
20 - 30
nm
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SUV
100 500
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Einschalige Liposomen (..UV) : 1 Bilayer (5 nm):
SUV: kleine einschalige Liposomen: kleines Lumen
LUV: große einschalige Liposomen: großes Lumen,
aber geringer Lipidanteil
(GUV Riesenliposomen) … nicht für Pharma-Produkte
nm
LUV
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MLV
Vielschalige Liposomen: mehrere Bilayer mit wässrigem
Zwischenraum (3-4 nm)
MLV: Multilamellare Lipid-Vesikel
… verzögerte Wirkstofffreisetzung
… hoher Lipidanteil (für hydrophobe, amphiphile W.)
Liposomen, mit Ausnahme der GUV und großer MLV,
sind zu klein, um im Mikroskop sichtbar gemacht zu
werden. Bei Fluoreszenz erfolgt falsch zu große
Abbildung (s = λ)
Vertiefende Vorlesung „Methoden der Membranbiochemie“ (PD. Dr. T. Nawroth): Montags 9h30-11h, Inst. f. Biochemie, Bibliothek
Liposomen : Aufbau und Typen - 7
Beispiel: Große Multilamellare Liposomen MLV
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Große multilamellare Liposomen MLV
können durch sukzessive Rotationsmischung
(Vortexing) und Gefrier-Tau Zyklen
hergestellt werden
Große amphiphile Liposomen zeigen
verzögerte Wirkstofffreisetzung
Große amphiphile Liposomenim µm-Bereich
sind im Lichtmikroskop sichtbar
(Phasenkontrast-Mikroskopie)
Große amphiphile Liposomen im eignen sich
wegen des hohen Lipidanteils als Träger für
hydrophobe und amphiphile Wirkstoffe, z.B.
für orale und dermatologische Anwendungen
drug release from multilamellar liposomes: Shazly, Nawroth, Langguth (2008) Dissolution technologies 15, 7-10
Liposomen Wirkstoffbeladung -1
Beispiel: unilamellare Liposomen SUV
Beispiel:
Liposomen
mit lipophilem
Wirkstoff /
Label
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Die Herstellung einschaliger Liposomen (SUV, LUV) erfolgt vierstufig:
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Zunächst wird ein Lipidfilm aus einer Lösung in organischem Lösungsmittel hergestellt; dabei kann
lipophiler Wirkstoff zugefügt werden.
Nach Zugabe der wässrigen Phase mit dem hydrophilen oder amphiphilen Wirkstoff und
folgende Ratotionsmischung (Vortexting) werden vielschalige Liposomen (MLV) als
Zwischenstufe hergestellt.
Die finale Dispersion erfolgt durch Membran-Druckfiltration (Extruder) oder mit Ultraschall;
dabei bestimmen Porengröße und Beschalldauer die Liposomengröße
Der Wirkstoff im Medium wird abgetrennt (Gelpermeations-Chromatographie, Zentrifuge, Dialyse)
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Liposomen Wirkstoffbeladung -2
Abtrennung des Wirkstoffs im Medium durch GPC
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Der überschüssige Wirkstoff im Medium
(außen) wird für die meisten Anwendungen
abgetrennt (keine Zielsteuerung). Dazu
eignen sich:
- Gelpermeations-Chromatographie (Säule)
- Schnelle Gelpermeations-Chromatographie
(Zentrifuge, Penefsky-Säulen, ~98% Effekt)
- Zentrifugation und Re-Suspension
- Dialyse
Abtrennung von überschüssigem Wirkstoff
im Medium durch GPC (z.B. Sephadex G25)
Liposomen Wirkstoffbeladung - 3
Ananlytik des Produkts: Wirkstoffgehalt und Partikelgröße
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Prinzip der Wirkstoffbestimmung an intakten
Liposomen durch Photometrie
Das Nanopartikel-Produkt ist
mindestens in vierfacher Hinsicht zu
analysieren:
- Wirkstoffgehalt (Photometrie,
HPLC-Analytik, GC-MS)
- Partikelgröße (dynamische
Lichtstreuung DLS; eventuell auch
mit Streulichtmessung/ Photometrie)
- Wirkstoff-Freisetzung
(Dissolution)
- Sterilität (Qualitätskontrolle)
Partikelgrößenverteilung, nach DLS (5 min. Messzeit)
Drug release from liposomes: Shazly, Nawroth, Langguth (2008) Dissolution technologies 15, 7-10