Teil 3

Pharmazeutische Technologie und Medizinprodukte;
Nanopharmazie_3
Nanopartikel zur Therapie und Diagnose
nawroth @uni-mainz.de
langguth @uni-mainz.de
1.
Prinzip, Typen von Nanopartikeln, Liposomen Teil 1
2.
Herstellung, Charakterisierung, Liposomen & Lipoid-Partikel Teil 2
3.
Magnetische Nanopartikel, Ferrofluide; Anwendungen
Polymere, Aerosole
Bio-Ferrofluide, Poly-Ferrofluide : magnetisch
Nanopartikel Charakterisierung
8
Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS
µs
Specles
•
•
NP‘s
Bewegung
•
LaserLichtstrahl
•
•
•
•
Partikel im Laser-Lichtstrahl erzeugen
Interferenzmuster (Specles, 2D)
Lichtstreu-Messung bei der nicht die
Winkelabhängigkeit, sondern die zeitliche
Schwankung ermittelt wird
Das Streulicht schwankt im Maße der
Brown‘schen Molekularbewegung, d.h. der
Diffusion (Temperatur-abhängig).
Bei Nanopartikeln erfolgt die Variation im µsBereich –> schneller Detektor.
Analyse durch Autokorrelationsfunktion
(Häufigkeits-Analyse).
Die Interpretation mit allgemeinen
Streugesetzen (I ~r6, M ~r3 etc.) liefert die
Massenzusammensetzung der Probe aus
Partikelpopulationen verschiedener Größe
Bei konzentrierten Proben (Pharma-NP‘s)
muß in Rückstreuung gemessen werden
(170°)
Nanopartikel Charakterisierung
9
Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS
Schritte einer DLS-Untersuchung :
Messung:
• Bestimmung der zeitlichen
Schwankung des Streulichts für
ca. 30s -5 Minuten : I(t)
• Automatische Ermittlung der AutoKorrelationsfunktion C(τ)
•
•
DLS-Untersuchung von Liposomen (Dissertation T. Peters)
•
Auswertung (PC):
Komponentenanalyse der AutoKorrelationsfunktion: regularized Fit
- ergibt die Streubeiträge (τ)
- Software: z.B. von ALV (Langen)
Umrechnung in die unskalierte
Partikelgrößenverteilung P(r)
= Beiträge zum Streulicht
Umrechnung in die massen-skalierte
Partikelgrößenverteilung M(r)
= Massenanteile an der Probe
(Gewichts-%, relativ)
Struktur von therapeutischen Nanopartikeln :
die medizinische Sicherheit hängt von den Eigenschaften ab
(Charakterisierung
embolic
risk limit
- 8)
Nanoparticles for therapy can carry drugs of
radiation therapy targets (lanthanides).
A size of 100 nm is optimal in load and avoids
embolic, which appears, if >500 nm
The nanoparticles are characterized by:
DLS of a disk-shaped
Poly-Ferrofluid (160x10nm)
for medical applications
•
•
•
•
•
TEM of a liposome (SUV)
bearing Gd-DTP-DMPE
•
Chemical and spectroscopy analysis of target
entrapping and release, and of components
Average particle size estimation by
dynamic light scattering DLS (PCS)
Structure of individual particles by
electron microscopy (TEM)
Structure and dynamics investigation by
neutron small angle scattering
SANS and TR-SANS (time-resolved)
at ILL-D22
Structure and target localization by
anomalous X-ray scattering ASAXS and
EXAFS at L-edges: at ESRF-ID1
Target absorption at therapeutically used
K-edges : at ESRF-ID17
SANS of a liposomes
yields size & volume
@ ILL-D22.
Lanthanide Nano-target
biocompatible Gd-citrate
formulation @ ESRF-ID1
Nanopartikel Charakterisierung
Zusammenfassung
Zusammenfassung Analytik:
Analytik im Apothekenbereich und Klinik-Qualitätssicherung (QS) :
Kostenlimit (20 – 50 000 € / Gerät)
- Sterilitätstest / Mikrobiol. Untersuchung,
- Photometrie,
- Mikroskopie zur Partikeluntersuchung / Überprüfung
- DLS (spezifische Identitätsprüfung)
Erweiterte Analytik im F&E - Bereich
- Streumethoden (Röntgen-, Neutronen-Streuung
- Elektronenmikroskopie, DLS, magnetische Untersuchung
- Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenz-Spektroskopie, Lumineszenz
- Dissolutionstest / Freisetzungsstudie
- Biokompatibilität / Toxiditätsanalyse
- Wirksamkeit : Zellkultur-Tests
- Wirksamkeit : Tierversuche
- Wirksamkeit : Klinische Tests (I, II, III)
4 Typen von Pharma- Nanopartikeln :
Liposomen, Lipoid-partikel, Polymere, Ferrofluide
kombinierte Partikel:
Liposome (30 – 500 nm) Lipoid-Particle
Polymer
Microsphere
-------Aerosol particle---------
•
•
•
•
•
Ferrofluid / magn-NP
Poly-Ferrofluid
magnetic liposome
multicomponent NP
Der in Liposomen verkapselte Wirkstoff (Target) kann jeder Wasser-lösliche Stoff sein,
z.B. Metallverbindungen für die Strahlentherapie, Wirkstoffe für Chemotherapie: MDT.
Der in Lipoid-Partikel oder Aerosol-Partikel gelöste Wirkstoff kann jede lipophile
Verbindung sein, z.B. Wirkstoffe für die Chemotherapie, Diagnose: MDT , Bildgebung.
Polymere, Membranproteine und Oberflächengebundene Peptide
Magnetische Liposomen können Metall in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid
Liposomen b) Liposomen mit verkapselten Maghemite Nanopartikeln, c) Metaloxide-Lipid
Doppelschalen-Liposomen. Der gebundene Wirkstoff (Target (T)) ,z.B. GdDTPA, drugs
kann selektiv und zeitlich definiert freigesetzt werden (Lokalisation und Zeitsteuerung).
Binäre Schalen- und Poly-Ferrofluide (d) enhalten z.B. ~ 10 - 100 magnetische Core-Partikel
von 10-20 nm Größe. Durch gezielte Struktur-Synthese können 5% Wirkstoff gebunden werden.
Wirkstoff-Zielsteuerung zu Zellen : Targeting
Chemotherapie, Nano-RT, -PDT, Imaging
Nanopartikel können die Therapie und Diagnose durch Lokalisierung verbessern :
•
Verstärkte
(Enhanced)
mit
Bio-Nanopartikeln
ist
möglich
mit:
(a) hohlen Target-Liposomen, Lipoid-Partikeln, Polymeren oder (b) binären Poly-Ferrofluiden, die ~ 1,000,000
Wirkstoffmoleküle in kolloidalen Partikeln von 100 nm Größe konzentrieren.
(50-500 nm is ok.)
•
Regioselektivität kann erzielt werden durch: Diffusions-Restriktion, (c) magnetische Target-nanopartikel
•
Kompatible Methoden sind mit Nanopartikeln parallel möglich: MDT, RT, PAT, PDT, NCT, imaging: PET, MRI
Radiotherapie
in eine, magnetischen Feld-Gradienten, (d) Rezeptor-Ligand Interaction und/ oder Immuno-Nanopartikel, die
specifische Antikörper, Antigene tragen.
magnetic drug targeting MDT: C. Alexiou, R. Schmid, R. Jurgons, M. Kremer, M. Wanner, C. Bergemann, E. Huenges, T. Nawroth, W.
Arnold, F. Parak (2006) Eur. Biophys. J. 35, 446-450
Zielsteuerung : Magnetic Drug Targeting MDT
magnetische Partikel – externe Manipulation
•
Magnetische Partikel:
- Kraftwirkung im magnetischen
Feld-Gradienten
- sekundäre Strukturbildung im
magnetischen Feld
•
Ferrofluide:
Technisches Ferrofluid (in Öl) im magnetischen Feld
– Superparamgnetische Partikel
(keine magnetische Remanenz)
– Zwei Strukturebenen möglich:
•
Magnetische Kernpartikel (Cores)
– typische Partikelgröße 10 nm
– Bio-Ferrofluide mit hydrophiler Hülle
– Technische Ferrofluide in Öl !!
•
Poly-Ferrofluide
– Typische Partikelgröße 100 nm
– großes magnetisches Moment
– im Blutstrom lokalisierbar
Ferrofluide : Magnetic Drug Targeting MDT -2
magnetische Partikel – externe Manipulation
Ferrofluide:
– Superparamgnetische Partikel
(keine magnetische Remanenz)
– Zwei Strukturebenen möglich:
•
Magnetische Kernpartikel (Cores)
– typische Partikelgröße 10 nm
– Bio-Ferrofluide mit hydrophiler Hülle
– Technische Ferrofluide in Öl !!
•
Poly-Ferrofluide
– Typische Partikelgröße 100 nm
– großes magnetisches Moment
– im Blutstrom lokalisierbar
•
Gebundene Pharmaka:
– Polymerhülle ums Ferrofluid
– als Gegenion an einem Hüllpolymer
– In Poren eines Hüllpolymers
Bio-Ferrofluide : Magnetic Drug Targeting MDT -3
magnetische Partikel – Wirkstoffbindung und Freisetzung
Beladenes Ferrofluid
Applikation Patient / Tier
... lokale Infusion ( 30 min )
Im Magnetfeld (Feldgradient)
Immobilisiertes Ferrofluid
im Zielorgan / Tumor
+ NaCl (Blut .... 130 mM Na+)
Elution des Pharmakums ( 1h )
Strukturprinzip von pharmazeutischen
Hüll-Ferrofluiden:
Die geladene Polymerhülle bindet den
Wirkstoff als Gegenion
(magnetische Ionenaustauscher)
Pharmakum-Bindung und
Beispiel: Phosphodextram + Mitoxantron
Tage -Wochen
Wirkung im Tumor
Magnetic Drug Targeting MDT -4
Chemotherapie – Anwendung (Krebstherapie)
•
Chemotherapie mit magnetischem DrugTargeting MDT im Tierversuch
•
Poly-Ferrofluid mit gebundenem
Mitoxantron
Intra-Arterielle Gabe (Arterie führt zum
Tumor am Bein)
Konzentration der NP‘s im magnetischen
Gradienten (1,7 T)
Freisetzung durch das Na+ im Blut (in 1 h)
•
VX-2 squamous cell Carcinom: Kaninchen
TEM des Therapiematerials (non-stained)
•
•
Lit.: Alexiou, Schmid, Jurgons, Kremer, Wanner, Bergemann ,
Huenges, Nawroth, Arnold, Parak (2006) Eur. Biophys. J 35, 446-450
EM-Analytik:
Histologie (links),
EDX-Raster-EM (rechts)
Struktur Prinzipien von Target-Nanopartikeln :
Magnetische Target-Liposomen
•
Magnetische Liposomen können Metalle in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid
liposomen b) Liposomes mit eingeschlossenen Maghemite NanoPartikeln (cores), c) Metalloxide-Lipid Doppel-Schalen Liposomen. das wasserlösliche Strahlen-Target (T,
enhancer) ist im Lumen eingeschlossen: GdDTPA, Borat, Chemotherapeutica
•
Das liposomal verkapselte Target kann jede wasserlösliche Verbindung sein, z.B.
Lanthanid-DTPA‘s (Gd - Lu), Hf, Boron-Diol-Ester oder Wirkstoffe für die Chemotherapie: MDT.
•
Hyperthermie : Magnetische Nanopartikel können durch Mikrowellen-Absorption zur
Wärmetherapie genutzt werden. Dazu genügt eine Temperatur von 42-43°C.
Elektronenmikroskopie von Metallo-Liposomen :
Magnetische Target-Liposomen, Poly-Ferrofluid
• Non-stained electron micrographs of the three types of metallo-target-liposomes:
a) membrane metal liposomes (Gd outside), b) core entrapped vesicles (10nm cores),
and c) shell layer metal liposomes. The images depict the burried metal directly.
•
The membrane metal liposomes (a) contained 5% Gd- loaded chelate-head lipid DTPADMPE in DMPC, as in ESRF-experiments with ASAXS at ID01.
•
The entrapped core vesicles (b) contained sub-nanoparticles (10-15 nm cores,
chromatographically purified γ-Fe2O3) and loaded with Gd-DTPA, Eu-DTPA, as at ESRF
•
The shell layer liposomes (c) had a double layer of lipid and γ-Fe2O3, and were
investigated by time resolved neutron scattering TR-SANS at ILL-D22
Tris2Gd-DTPA, Polyferrofluid PF100C (FerroMed), MRI-analog: Magnevist
(S h i )
Nawroth, Rusp, May (2004) Physica B350, e635-638
Struktur Prinzipien von Target-Nanopartikeln :
Protein-haltige Liposomen zur Zielsteuerung
Gerichtete Protein-Rekonstitution in Liposomen (Tutus
et al., Makromolecular Bioscience 8, 1034 (2008)
•
•
Nanopartikel können durch Oberflächen-Modfikation zielgesteuert werden
Geeignete Wechselwirkungen / Strukturen:
- Ligand – Rezeptor-Protein: Ligand am NP , z.B. zur Endocytose
- Ligand – Enzym-Protein: Ligand am NP
- Ligand – Enzym-Protein: Protein am NP
- Antigen – Antikörper : Antigen am NP
…. Tumor-spezifische …
- Antigen – Antikörper : Antikörper am NP
Membran-Proteine und Lipid-gebundene Liganden können mit Verfahren aus der
Membranbiochemie gerichtet in Liposomen und NP‘s rekonstituiert werden
Indirekte Strahlentherapie IRT :
sekundäre Strahlungsprodukte inaktivieren Krebs-Zellen
1) Secondary radiation or products of short range (30 µm) evolve from a
local target by specific absorption of
a) X-ray photons (medium energy, 60 keV) of a synchrotron :
PAT, photon activation therapy (= PXT, photodynamic X-ray therapy),
b) IR-light photons (water filtered) absorbed at organic target: PDT, photodynamic therapy
c) Neutrons from a reactor (thermal or cold neutrons):
NCT, neutron capture therapy (with Boron or Gadolinium),
d) High energy photons produce DNA-lesions and free electrons :
Photon therapy PT, (clinics standard: 6-15 MeV)
…. four sources with a common principle
2) Chemotherapy drugs convert temporal radiation demages (single strain breaks) to letal radiation demages,
which cannot be repaired by the cells. Example: cis-Platinum.
Indirekte Strahlentherapie IRT - 2 :
Erzeugung der sekundäre Strahlungsprodukte
Secondary radiation or products of short range (30 µm) evolve from a
local target by specific absorption of
a) X-ray photons (medium energy, 60 keV) of a synchrotron :
PAT, photon activation therapy (= PXT, photodynamic X-ray therapy),
b) IR-light photons (water filtered) absorbed at organic target: PDT, photodynamic therapy
c) Neutrons from a reactor (thermal or cold neutrons):
NCT, neutron capture therapy (with Boron or Gadolinium),
d) High energy photons produce DNA-lesions and free electrons :
Photon therapy PT, (clinics standard: 6-15 MeV)
…. four sources with a common principle
PAT Entwicklung bei ESRF : Tier-Imaging, Tests (Ratte)
Therapie und Imaging von Ratten unter Anaestesie
• Animals are prepared for imaging and
therapy in the biomedical facility BMF:
aseptic animal house, ethically correct
• Transfer and treatment under anestesia
• Beam from a wiggler (30-300 keV) is a
line (max. 1 x 200 mm)
• Monochromatic beam (double crystal):
below / above K-edge (on-off)
• Client is rotated and elevated (hight) in
the beam – stereotactic irradiation:
high dose at tumor only
• Image reconstruction from sinograms:
tumor localization before treatment
PAT Entwicklung bei ESRF : Tiervesuche (Ratte,
F98-Zellline)
Therapie Versuche mit Tumorratten, Imaging und
PAT-IRT
Iopamidol contrast:
• Tumor rats were induced with
F98 cancer cells (104, 5 µl).
• The animals showed tumors of
~ 2-4 mm size after 14 days
tumor
• Imaging (350 µm) at iodine K-edge for
localization of tumors (33 keV,
Iopamidole 2 ml i.V.)
• Subsequent intracranial application of
target-liposomes (15 µl, 40 mg/ml)
Synchrotron-tomography sCT of a rat bearing a
brain tumor from F98 cells by K-edge contrast
imaging with Iopamidole @ 33 keV (iodine-K).
The images were obtained with a Ge-detector.
• Irradiation at Lutetium K-edge (15 Gy
at tumor, 64 keV, tomographic method)
• 3D-alignment of sCT, target injection,
and radiation treatment (tomographic)
PAT Entwicklung bei ESRF : erfolgreiche
Tierversuche (Ratte)
Therapieversuche mit Tumor-Ratten und LanthanidNanopartikeln
•
•
•
PAT
Survival curves of tumor rats in animal tests of indirect
radiation therapy with Lanthanide targets and Nanoparticles.
•
tumor
The tumor were induced at day 0, the IRT treatment was done
at day 14. Additionally the tumors were detected by imaging.
Tris2Lu-DTPA, Tris2Gd-DTPA (FerroMed), MRI-analog: Magnevist (Schering)
Tumor rats were
induced with F98
cancer cells (104).
The animals showed
tumors of ~ 4 mm
size after 14 days.
After intracranical
injection of 10µl
target-drug an
indirect radiation
therapy test (10 Gy,
at K-edge) was done
with 1 h delay by the
tomographic
technique (rotating)
Prolonged survival
of animals, which got
Gd-DTPA and LuDTPA in liposomes,
indicated a successful
IRT treatment.
Anwendungen von pharmazeutischen Nanopartikeln :
Liposomen – Produkte, parenteral
•AmBisome, Albelcet ;
Membran-intercaliertes Amphotericin B
SUV, gefriergetrocknet,
Lipid: H-SPC (hydriertes Soya-PC), Cholesterin, DSPG
•DaunoXome
Encapsuliertes Daunorubicin : Krebstherapie
SUV, wässrige Suspension : im Blut stabil
Lipid: DSPC, Cholesterol
•Doxil (und Myocet)
F. Martin / www.fda.gov
Encapsuliertes Doxorubicin : Krebstherapie
LUV, wässrige Suspension : im Blut 4 Tage stabil
Lipid: MPEG-DSPE, H-SPC, Cholesterin
Ammonium-Gradient hält den Wirkstoff in den LUV
•Visudyne
Membran-intercaliertes Benzoporphyrin
SUV, gefriergetrocknet : in Blut instabil, schnelle Freis.
Lipid: Ei-PG + DMPC + Antioxidatien
•Junovan
Membran-intercaliertes MTP-PE : Krebstherapie
MLV , in-situ präpariert : im Blut instabil, Phase-III
Lipid: POPC / OOPS : negativ geladen -> Makrophagen