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Jahrbuch 2008/2009 | Mandelkow , Eckhard | Zytoskelett: Architektur und Bew egung der Zelle
Zytoskelett: Architektur und Bewegung der Zelle
Cytoskeleton: Architecture and movement of cells
Mandelkow , Eckhard
Max-Planck-Arbeitsgruppen für strukturelle Molekularbiologie am DESY, Hamburg
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Die Abteilung „Zytoskelett“ der Max-Planck-Arbeitsgruppen in Hamburg befasst sich mit den Proteinfasern der
Zelle, speziell den Mikrotubuli und Motorproteinen, die für die Zellbew egung, Zellteilung und Differenzierung
w ichtig sind. Von besonderer Bedeutung ist das Tau-Protein, das bei der Alzheimerkrankheit in den
Nervenzellen die pathologischen „Neurofibrillen-Bündel“ bildet. Neuere transgene Zell- und Mausmodelle der
Tau-Pathologie zeigen, dass das Absterben der Synapsen und Neuronen in der Alzheimerkrankheit eng mit der
Aggregation des Tau-Proteins zusammenhängt und reversibel ist.
Summary
The "Cytoskeleton" group of the Max Planck Unit for Structural Molecular Biology in Hamburg focuses on the
structure and dynamics of protein fibers in cells, in particular on microtubules and their associated proteins
w hich are responsible for cell movement, cell division, or intracellular transport. One of these proteins, tau,
forms pathological aggregates in nerve cells affected by Alzheimer's disease. Recent transgenic cell and mouse
models of the tau pathology reveal that the pathological degeneration of synapses and neurons is closely
related to aggregation, and that it is reversible.
Das Zytoskelett – ein plastisches Korsett für die Zelle
Das Zytoskelett ist für die Form der Zellen, für die Bew egung, für Materialtransport, für Zellteilung und
Zelldifferenzierung
verantw ortlich.
Es
besteht
aus
drei
Fasersystemen,
den
Aktinfilamenten,
den
Intermediärfilamenten und den Mikrotubuli. Diese Fasern können sich aus Protein-Untereinheiten selbständig
auf-
und
w ieder
abbauen,
das
heißt.
sie
sind
dynamisch,
und
sie
haben
die
Fähigkeit
der
"„Selbstorganisation“. Hinzu kommen zahlreiche Proteine, die an die Fasern andocken, Fasern miteinander
verbinden oder Verbindungen mit anderen Zellkomponenten, z. B. der äußeren Zellmembran oder der
Kernmembran, herstellen können. Eine w ichtige Klasse dieser assoziierten Proteine sind die „Motorproteine“.
Sie können chemische Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) in mechanische Energie umw andeln und
dadurch Lasten transportieren. Die Mikrotubuli w erden durch verschiedene „Mikrotubuli-Assoziierte Proteine“
(MAP) stabilisiert. Ein bekanntes Beispiel für das Zusammenspiel verschiedener Zytoskelett-Proteine ist die
Zellteilung; dabei bilden
Mikrotubuli einen
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Spindelapparat
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aus, der die
Chromosomen
mithilfe
von
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Motorproteinen auseinanderziehen kann. Bei den Nervenzellen stellen Mikrotubuli die „Gleise“ für den
Transport in den Zellfortsätzen (Axone, Dendriten) dar, w o Lasten über w eite Entfernungen zu den
Nervenendigungen (Synapsen) geliefert w erden müssen.
Der Schw erpunkt der Arbeiten der Abteilung „Zytoskelett“ liegt auf der Untersuchung der Selbstorganisation
der Mikrotubuli, der Struktur Mikrotubuli-abhängiger Motorproteine, dem Mikrotubuli-assoziierten Tau-Protein
und seiner Rolle in der Alzheimerkrankheit. Dabei w urden biochemische, molekularbiologische, zellbiologische
und biophysikalische Methoden kombiniert. Die Intensität der Synchrotronstrahlung erlaubt es, Wachstum und
Zerfall von Mikrotubuli in Echtzeit durch Beugung des Röntgenlichts zu verfolgen, Röntgenbilder von sehr
kleinen Proben von Alzheimer-Fasern aufzunehmen oder die Struktur von kristallisierten Proteinen mit hoher
Auflösung zu bestimmen. Durch Ankoppeln von fluoreszierenden Molekülen und Einschleusen in Nervenzellen
kann die Verteilung von Tau-Protein in lebenden Nervenzellen dargestellt w erden und so seine mögliche
Fehlfunktion in der Alzheimerkrankheit untersucht w erden. Transgene Zell- und Mausmodelle bestätigen die
pathologische
W irkung
der
Tau-Proteins
und
zeigen,
w elche
Eigenschaften
seiner
Struktur
dafür
verantw ortlich sind. Es folgen einige Beispiele aus der Arbeit des vergangenen Jahres.
MARK – Struktur und Regulation einer Familie von Proteinkinasen
Proteinkinasen sind Enzyme, die Phosphatgruppen auf Proteine übertragen und damit die Funktion der
Zielproteine verändern (z. B. Aktivierung oder Hemmung). Dieser Mechanismus w ird in Zellen häufig für die
Übertragung von Signalen verw endet. Im Fall des Tau-Proteins führt die Phosphorylierung an bestimmten
Stellen zur Ablösung von den Mikrotubuli. Die Konsequenzen sind, dass Mikrotubuli destabilisiert w erden und
somit als Gleise für den intrazellulären Transport ausfallen, und dass das abgelöste Tau-Protein in den
neuronalen Zellen anomal aggregieren kann und die „Neurofibrillenbündel“ der Alzheimerkrankheit bildet. Die
Suche
nach der verantw ortlichen Proteinkinase
führte
zur Entdeckung
von MARK („MAP-Mikrotubuli-
affinitätsregulierende Kinase“). Es handelt sich um eine Familie von vier Isoformen (MARK1-4), die zur Gruppe
der AMP-Kinasen gehört. Die Hamburger W issenschaftler haben mithilfe der Proteinkristallographie die
Strukturen von mehreren Isoformen und Varianten der Kinase aufgeklärt (Abb. 1). Die katalytische Domäne ist
ähnlich aufgebaut w ie bei anderen Kinasen, aber eine Besonderheit ist die Ubiquitin-assoziierte Domäne
(UBA), die vermutlich einen Ubiquitin-abhängigen Regulationsmechanismus ermöglicht. Die katalytische
Domäne kann durch verschiedene Kinasen phosphoryliert w erden, w as entw eder zur Aktivierung (MARKK,
LKB1) oder Inaktivierung (GSK3β) führt [1]. Weiterhin kann MARK oder seine Aktivatoren durch direkte Bindung
an andere Proteinkinasen reguliert w erden, z. B. TESK1, PAK5, w as zu einer w echselseitigen Kontrolle der
zw ei w esentlichen Zytoskelett-Netzw erke führt (Aktinfilamente und Mikrotubuli) [2].
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Da rste llung de r k a ta lytische n Dom ä ne de r P rote ink ina se
MAR K2. Bla u und viole tt = k le ine und große Dom ä ne de r
Kina se , da zwische n die a k tive Ta sche m it de r re gula torische n
Schla ufe (ge lb). Bra un = Dock ingdom ä ne (C D), rot =
Ubiquitin-a ssoziie rte Dom ä ne (UBA).
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Die physiologische W irkung der Kinase lässt sich durch Transfektion von primären neuronalen Zellen oder von
Maus-Embryonen nachw eisen. So kann z. B. der axonale Transport in Neuronen durch das Wechselspiel
zw ischen Tau-Protein und seiner Kinase MARK verändert w erden; die Wanderung von Neuronen bei der
Ausformung des Gehirns w ird von MARK gesteuert (Zusammenarbeit mit der Gruppe von Orly Reiner,
Weizmann Institut, Israel, [3]). Bei der krankhaften „Hyperphosphorylierung“ des Tau-Proteins in MausModellen der Alzheimerkrankheit findet man MARK zusammen mit dem Tau-Protein angereichert vor (Abb. 2).
Ve rte ilung de r P rote ink ina se MAR K im Hippok a m pus e ine r
Ma us, in de r da s Ta u-P rote in übe re x prim ie rt wird, so da ss sich
Ne urofibrille nbünde l bilde n, die a us hoch phosphorylie rte m
Ta u-P rote in be ste he n (re chts).
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Tau-Protein – ein nativ entfaltetes Protein mit pathologischer Wirkung
Tau-Protein stabilisiert normalerw eise die Mikrotubuli in Nervenzellen, kann sich aber bei der AlzheimerDemenz krankhaft verändern. Dasselbe geschieht in anderen sog. „Tauopathien“, z. B. bei frontotemporalen
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Demenzen oder Morbus Pick. Die Folge ist, dass das Zytoskelett zusammenbricht, sodass das Tau-Protein zu
unlöslichen Fasern verklumpt. Es bilden sich die „paarigen helikalen Filamente“ der Alzheimerkrankheit, die die
Nervenzellen verstopfen und sie absterben lassen (Übersicht: [4]). Eine Besonderheit des Tau-Proteins ist es,
dass es keine kompakt gefaltete Struktur besitzt, in der Zelle w eitgehend entfaltet und flexibel ist und
trotzdem seine physiologische Funktion erfüllt (Stabilisierung von Mikrotubuli in neuronalen Axonen). Die
Struktur des Proteins lässt sich deshalb nicht mit Proteinkristallographie lösen, sondern man muss auf
spektroskopische und andere biophysikalische Methoden zurückgreifen. Die globale Faltung w urde untersucht,
indem verschiedene Paare von Aminosäuren jew eils markiert w urden mit Fluoreszenz-Donor- und -AkzeptorGruppen, so dass ihr Abstand mithilfe des sog. FRET-Effekts bestimmt w erden konnte. Es zeigte sich, dass das
Tau-Protein in Lösung ähnlich w ie eine Büroklammer gefaltet ist, sodass der N- und C-Terminus sich auf die
Mitte des Proteins zurückfalten. Wenn Tau-Protein in einen phosphorylierten Zustand versetzt w ird, w ird die
Struktur kompakter – es entsteht eine „pathologische Konformation“, w ie sie auch durch bestimmte Antikörper
gegen Tau-Protein in der Alzheimerkrankheit typisch ist. Auf diese Weise lässt sich die Konformationsänderung
des
Proteins
im
Frühstadium
der
Krankheit in vitro nachstellen
und
untersuchen
[5]. Ein
zw eiter
Untersuchungsansatz w ar die Röntgenbeugung in Lösung (SAXS; Zusammenarbeit mit der Gruppe Dmitri
Svergun, EMBL, [6]). Hier zeigt es sich, dass das Tau-Protein w esentlich mehr Raum einnimmt (ca. 20fach), als
es einem kompakt gefalteten Protein gleicher Länge entsprechen w ürde (Streumassenradius 6.5 nm statt 2.4
n m , Abb. 3). Es scheint, dass das Protein sich w ie ein bew eglicher „Puffer“ über die Oberfläche eines
Mikrotubulus verteilt.
Ve rgle ich de r Größe e ine s k om pa k t ge fa lte te n P rote ins
(Am yla se ) und e ine s na tiv e ntfa lte te n P rote ins (Ta u) von e twa
gle iche r Größe (ca . 440 Am inosä ure n). Die gra ue Kuge l
e ntspricht de m m ittle re n Auße nra dius de s ge fa lte te n P rote ins.
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Neben der Strukturaufklärung mit Röntgenstrahlung hat in den letzten Jahren die Kernresonanzmethode
(NMR) eine zunehmende Bedeutung erlangt. In Zusammenarbeit mit dem MPI für biophysikalische Chemie
Göttingen (Christian Griesinger, Marc Baldus, Marcus Zw eckstetter u.a.) w urden verschiedene Domänen des
Tau-Proteins separat und in Kombination mit Lösungs- und Festkörper-NMR untersucht (z. B. [7]). Die
Ergebnisse zeigen, dass Tau zw ar insgesamt den Charakter eines entfalteten Proteins besitzt, trotzdem gibt
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es eine Reihe von begrenzten Elementen der Sekundärstruktur (α-Helix, Poly-Prolin-Helix, β-Struktur). Die βStruktur ist von besonderer Bedeutung, w eil hierauf die pathologische Aggregation des Proteins beruht. Die
NMR-Ergebnisse zeigen außerdem, an w elchen Stellen des Tau-Proteins die Wechselw irkung mit anderen
Partnerproteinen oder Liganden stattfindet (z. B. Mikrotubuli, Kupferionen oder Aggregationsinhibitoren).
Transgene Mausmodelle der Tau-Pathologie in der Alzheimerkrankheit
Die auslösenden Faktoren der Alzheimerkrankheit und der pathologischen Proteinablagerungen im Gehirn sind
bis heute nur in Ansätzen bekannt. Desw egen spielen transgene Tiermodelle eine w esentliche Rolle bei der
Ursachenforschung. Die Gruppe von Eckhard Mandelkow hat transgene Mausmodelle entw ickelt, in denen
mehrere Elemente neu kombiniert w urden [8]: (1) Die Mäuse exprimieren das humane Tau in einer
regulierbaren Weise, das heißt das Protein kann zu bestimmten Zeitpunkten an- und w ieder abgeschaltet
w erden. Auf diese Weise kann man den Einfluss des Alterns auf die Pathologie des Tau-Proteins sow ie die
Regenerationsfähigkeit des Gehirns beobachten. (2) Das Protein w ird nur in den Gehirnregionen exprimiert, in
denen auch die Neurofibrillen der Alzheimerkrankheit erscheinen. (3) Es w erden verschiedene Varianten des
Tau-Proteins
exprimiert,
die
sich
systematisch
voneinander
unterscheiden,
vor
allem
in
ihrem
Aggregationsverhalten („W ildtyp“, „Pro-Aggregations-Mutante“, und „Anti-Aggregations-Mutante“). Dadurch
w ird es möglich, den Effekt der Tau-Expression von dem Effekt der Aggregation zu unterscheiden.
P a thologische Aggre ga tion von Ta u im Ge hirn von tra nsge ne n
Mä use n. Link s: Die Ex pre ssion de r P ro-„Aggre ga tionsMuta nte “ Ta uR DΔK280 führt na ch 3 Mona te n zu de utliche n
Abla ge runge n (schwa rz ge fä rbt), wä hre nd die „AntiAggre ga tions-Muta nte “ a uch na ch 22 Mona te n k e ine
Abla ge runge n ze igt.
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Neurofibrillen-Pathologie eindeutig von der Aggregationsfähigkeit abhängt,
nicht von der Expression von Tau an sich. Diese Aggregationsfähigkeit w ird w iederum von kurzen Elementen in
der Tau-Sequenz bestimmt, die fähig sind, eine β-Struktur auszubilden. So zeigen beispielsw eise ProAggregations-Mutanten schon nach 3 Monaten ausgeprägte Neurofibrillen, w ährend Anti-AggregationsMutanten auch nach 2 Jahren noch völlig frei davon sind (Abb. 4). Dass die Aggregation des Tau-Proteins
tatsächlich toxisch ist, zeigt sich am Verlust von Synapsen und am Absterben von Neuronen genau in den
Regionen, die auch in der Alzheimerkrankheit des Menschen betroffen sind, z. B. im Hippokampus, der für die
Speicherung des Gedächtnisses verantw ortlich ist (Abb. 5). Überraschend w aren die Befunde, dass die
Aggregate im Gehirn reversibel sind (d.h. sich nach Abschalten der Expression von Tau w ieder zurückbilden
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können), und dass das exogene humane Tau-Protein auch das endogene Maus-Tau zur Aggregation bringen
kann, so als ob ein „toxisches“ Tau-Molekül ein gesundes „infizieren“ kann.
Auswirk ung de r Aggre ga tion de s Ta u-P rote ins a uf die
Ne urone n im Be re ich de s Hippok a m pus von tra nsge ne n
Mä use n. Die Ne urone n sind m it e ine m bra une n Fa rbstoff
(Ne uN) da rge ste llt. Im Fa ll de r „P ro-Aggre ga tions-Muta nte “
de s Ta u-P rote ins (m ittle re R e ihe ) tritt schon na ch 5 Mona te n
de utliche r Ve rlust von Ne urone n a uf, na ch 24 Mona te n sind sie
we itge he nd a bge storbe n. Da ge ge n ble ibe n be i de r nichttra nsfizie rte n Kontrollm a us (obe re R e ihe ) ode r be i de r „AntiAggre ga tions-Muta nte “ (unte re R e ihe ) die Ne urone n e rha lte n.
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Therapeutischer Ansatz: Suche nach Wirkstoffen gegen die Tau-Aggregation
Aufgrund der genannten Befunde liegt es nahe, die Degeneration der Neuronen durch Hemmstoffe der
Aggregation zu verlangsamen oder rückgängig zu machen. Eine Suche nach geeigneten W irkstoffen w urde
bereits
eingeleitet,
mehrere
Klassen
von
möglichen
Hemmstoffen
w urden
identifiziert
und
durch
kombinatorische Chemie w eiterentw ickelt (Zusammenarbeit mit den Gruppen Herbert Waldmann, MPI
Dortmund und Boris Schmidt, TU Darmstadt, vgl. [9]). Es konnte gezeigt w erden, dass diese Substanzen die
Aggregation und Toxizität des Tau-Proteins in neuronalen Zellen verhindern und einmal gebildete Aggregate
w ieder auflösen können. Ziel der w eiteren Arbeit ist es, die W irksamkeit der Substanzen an Mäusen
nachzuw eisen und sie zum Einsatz in der Klinik w eiterzuführen.
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Struk tur e ine s Hits a us de r Kla sse de r R hoda nine , die a uf de r
Suche na ch Ta u-Aggre ga tions-Inhibitore n ge funde n wurde n,
sowie Ansa tzpunk te zur Modifik a tion und O ptim ie rung de r
Substa nz.
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