Porcine Parvovirus (PPV
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Porcine Parvovirus (PPV-Ab) SVANOVIR® ELISA test for the detection of PPV antibodies in porcine serum samples General information Parvoviruses form the family of small (Latin ’parvus’) DNA viruses. Porcine Parvovirus (PPV) is a major cause of reproductive failure in swine. PPV is transmitted horizontally by contact with both respiratory and excretory secretions. Dams are susceptible to reproductive failure if infected during the first half of gestation. Consequences of maternal infection include: embryonic and foetal death followed by resorption and mummification, abortion, stillbirths, neonatal death and reduced neonatal vitality. Clinical signs of infection are usually absent. Exposure of sows in the second half of gestation also results in transplacental infection but foetuses usually survive. Nursing piglets absorb sufficient quantities of PPV antibodies from colostrum to maintain high titres for up to 6 months. Such passively acquired immunity interferes with normal autogenous immune development1. Gilts should be monitored for the presence of virus both prior to vaccination and before breeding to prevent economical losses. Principle The PPV-Ab ELISA Kit is designed to detect Porcine Parvovirus specific antibodies in serum samples. The kit procedure is based on a Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Competitive ELISA). In this procedure This manual covers the following PPV-Ab ELISA kit: Article number 10-7400-02 samples are exposed to noninfectious PPV antigen coated wells on microtitre strips. Serum samples, controls, and the antibody conjugate are added simultaneously. PPV antibodies (if present in the test sample) compete with the enzyme-conjugated antibodies for the antigen binding sites in the wells. In the absence of PPV antibodies the enzyme-conjugated antibodies are bound, giving rise to a colour change when a substrate solution is added subsequently. Therefore, absence of a colour change indicates a positive result. The colour is read by a microplate photometer, where the optical density (OD) is measured at 450 nm.extended washing procedures than usual, and furthermore provide a stable antigen surface with low variations in the binding. Contents 2 Microtitre strips coated with noninfectious PPV antigen (sealed and stored dry) 2 Lyophilized HRP Conjugate (horseradish peroxidase conjugated mouse anti-PPV monoclonal antibodies) 1 PBS-Tween Solution 20 x concentrate (125ml) 1 Substrate Solution (20ml) (tetramethylbenzidine in substrate buffer containing H2O2) – STORE IN THE DARK! 1 Stop Solution (10ml)– Contains sulphuric acid – CORROSIVE! 1 Positive Control Serum A (250µl) – 0.05% merthiolate 1 Negative Control Serum B (250µl) – 0.05% merthiolate 1. 2. 3. 4. 5. 6. Material needed but not provided Precision pipets (range from 5 to 200 µl) Disposable pipet tips Distilled water Wash bottle 1 container: 1 to 2 litres for PBS-Tween Microplate photometer, 450 nm filter Specimen information 10 µl undiluted blood serum or plasma is required for each sample well. Fresh, refrigerated, or previously frozen serum or plasma may be tested. Preparation of reagents PBS-Tween Buffer: Dilute the PBS-Tween Solution 20 x concentrate 1/20 in distilled water. Prepare 500 ml per plate by adding 25 ml PBST solution to 475 ml distilled water and mix thoroughly. N.B. Please check that there is no crystal precipitation in the bottle. If crystals are seen, please warm and shake well. Anti-PPV-Conjugate: Reconstitute the lyophilized HRP Conjugate with 11.5 ml PBS-Tween Buffer. Add the buffer carefully to the bottle. Leave the solution one minute and mix thoroughly. Prepare immediately before use. The remaining reconstituted conjugate can be stored at -20°C for 2 weeks and thawed and refrozen up to 3 times. Precautions 1. Carefully read and follow all instructions. 2. Store the kit and all reagents at +2 to +8°C (35 to 45°F). 3. All reagents should equilibrate to room temperature +18 to +25°C (64 to 77°F) before use. 4. Handle all materials according to the Good Laboratory Practice. 5. Do not mix components or instruction booklets from different test kit batches. 6. Care should be taken to prevent contamination of kit components. 7. Do not use test kit beyond date of expire. 8. Do not eat, drink, or smoke where specimens or kit reagents are handled. 9. Use a separate pipet tip for each sample. 10. Do not pipet by mouth. 11. Include positive and negative serum and/ or milk controls on each plate or test strip series. 12. Use only distilled water for preparation of reagents. 13. The Stop Solution contains sulphuric acid, which is corrosive. 14. All unused biological materials should be disposed according to the local, regional and national regulations. Recommendation! The volume of the reagents is sufficient for at least 10 separate test occasions. Strips with broken seal can be stored at +2 to +8°C for up to 4 weeks. Reconstituted conjugate may not be stored in refrigerator. Procedure Calculations 1. All reagents should equilibrate to room temperature 18 to 25°C (64 to 77°F) before use. Label each strip with a number. 1. Calculate the mean OD-values for each of the controls and samples. 2. Rinse the strips 3 times with PBS-Tween Buffer: at each rinse cycle fill up the wells, empty the plate and tap hard to remove all remains of fluid. 3. Add 90 µl of PBS-Tween Buffer to each well that will be used for samples and controls. 4. Add 10 µl of Positive Control Serum (Reagent A) and 10 µl of Negative Control Serum (Reagent B) respectively, to selected wells coated with PPV antigen. For confirmation purposes it is recommended to run the control sera in duplicates. 5. Add 10 µl of serum sample to a selected well coated with PPV antigen. For confirmation purposes it is recommended to run the samples in duplicates. 2. Calculate the percent inhibition (PI) values for controls as well as samples, using the following formula: PI= 100 - Mean ODsamples/ctrl Mean ODneg ctrl X100 Interpretation of the results Criteria for test validity To ensure validity the Negative Control should have an optical density (OD) value greater than 0.6. Positive Control should have an optical density (OD) value less than 0.3. For invalid tests, technique may be suspect and the assay should be repeated. Interpretation PI < 50 negative 6. Add 100 µl of HRP Conjugate to each well and mix thoroughly. PI 50–80 positive (+) PI > 80 strong positive (++) 7. Incubate for 30 minutes at room temperature 18 to 25°C (64 to 77°F). The following interpretation of results is used on herdtesting basis. 8. Repeat step #2. 9. Add 100 µl Substrate Solution to each well. Incubate for 10 minutes at room temperature (18 to 25°C). Begin timing when the first well is filled. 10. Stop the reaction by adding 50 µl of Stop Solution to each well and mix thoroughly. Add the Stop Solution in the same order as the Substrate Solution in step #9. 11. Measure the optical density (OD) of the controls and samples at 450 nm in a microplate photometer (use air as blank). Measure the OD within 15 minutes after the addition of Stop Solution to prevent fluctuation in OD values. All the s amp le s are (+) o r s tro ng p o s itiv e (++) He rd ad e q uate ly p ro te c te d So me s amp le s are ne g ativ e and s o me p o s itiv e (+) o r s tro ng p o s itiv e (++) He rd ad e q uate ly p ro te c te d All s amp le s are ne g ativ e He rd no t p ro te c te d Infection status If individual samples from one herd are scoring both negative as well as positive (+) or (++), there is, taking into consideration the corresponding clinical signs, an indication for infection in the herd. Mengeling, W.L. (1986) Porcine Parvovirus infection. In Diseases of Swine 6th Edition. Edited by A.D. Leman, B. Straw, R.D. Glock, W.C. Mengeling, R.H. Penny, and E. Scholl. Iowa State Uni. Press, pp. 411-424. Manufacturer Svanova Biotech AB Uppsala Science Park SE-751 83 Uppsala, Sweden Phone +46 18 65 49 00 Fax +46 18 65 49 99 [email protected] www.svanova.com Juntti, N. et. al. (1986) Use of monoclonal antibody against hemagglutinin in ELISA for the diagnostics of porcine parvovirus. Proceedings of the International Pig Veterinary Society, Barcelona. Customer Service Phone +46 18 65 49 15 Fax +46 18 65 49 99 [email protected] References Porcine Parvovirus (PPV-Ak) SVANOVIR® In vitro-Diagnostikum zum Nachweis von Antikörpern gegen das porcine Parvovirus (PPV) in Blutserum und/oder Blutplasma bei Schweinen. Die deutsche Gebrauchsinformation ist nach §17c TierSG zugelassen; Zul. -FLI-B428 Allgemeine Information Parvoviren bilden die Familie der kleinen (lat. parvus) DNA-Viren. Das porcine Parvovirus (PPV, Schweineparvovirus) ist eine der Hauptursachen für Reproduktionsstörungen bei Schweinen. PPV wird sowohl über respiratorische als auch exkretorische Ausscheidungen horizontal übertragen. Muttertiere sind in der ersten Hälfte der Trächtigkeitsperiode für reproduktive Störungen anfällig. Zu den Folgen einer Infektion des Muttertiers zählen: embryonaler und fetaler Tod, gefolgt von Resorption und Mumifikation, Abort, Totgeburten, neonatalem Tod und einer reduzierten neonatalen Vitalität. Klinische Zeichen einer Infektion liegen normalerweise nicht vor. Sind die Sauen in der zweiten Hälfte der Trächtigkeitsperiode diesen Erregern ausgesetzt, führt dies ebenfalls zu einer transplazentaren Infektion, bei der die Föten in der Regel überleben. Saugferkel absorbieren eine ausreichende Menge von PPV-Antikörpern mit dem Kolostrum, um die hohen Titer bis zu 6 Monate zu halten. Solch eine passiv erworbene Immunität interferiert mit einer normalen autogenen Immunentwicklung1 . Jungsauen sollten vor der Impfung und vor der Fortpflanzung auf dieses Virus hin überwacht werden, um wirtschaftlichen Verlusten vorzubeugen. Diagnostisches Verfahren Das SVANOVIR® PPV-Antikörper -Test ist ein ”kompetitiver-ELISA”. In den Reaktionsvertiefungen sind nichtinfektiöse PPVAntigenet fixiert. Proben, Kontrollen und das Konjugat werden nacheinander in die entsprechenden Reaktionsvertiefungen gegeben. Sind im zu testenden Serum Antikörper gegen PPV vorhanden, so binden diese an das PPVAntigen. Die im Konjugat vorhandenen an das Indikatorenzym Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierten PPV-Antikörper können nicht an das Antigen binden und werden durch einen Waschvorgang weggespült. Ein danach zugefügtes Substrat kann nicht gespalten werden. Es kommt zu keiner Farbreaktion, die Tests sind positiv. Sind im zu testenden Serum keine Antikörper gegen PPV vorhanden, so kann das Konjugat an das Antigen binden, wird nicht ausgewaschen und reagiert mit dem Substrat. Es kommt zu einer Farbreaktion, die Tests sind negativ. Zusammensetzung 2 2 1 1 1 1 1 Mikrotiterplatten, je geteilt in 12 Streifen mit je 8 Reaktionsvertiefungen, beschichtet mit inaktiviertem PPV-Antigen Flaschen Anti-PPV-HRP-Konjugat, l yophilisiert, (11,5 ml nach Auflösen) Flaschen PBS-Tween-Lösung, 20-fach konzentriert ( 125 ml) Flasche Substrat-Lösung, Tetramethylbenzidin und H2O2 gelöst in Substratpuffer (20 ml) Flasche Stoplösung, 2 M Schwefelsäure (10 ml)- Vorsicht ätzend! Flasche Reagenz A, positives PPV Kontrollserum, konserviert mit 0,05% Merthiolat (250µl) Flasche Reagenz B, negatives PPV Kontrollserum, konserviert mit 0,05% Merthiolat (250µl) Anwendungsgebiet Art der Anwendung In-vitro-Diagnostikum zum Nachweis von Antikörpern gegen das porcine Parvovirus bei Schweinen im Blutserum oder/-plasma. 1. Verwendung der Einzelstreifen: 24 Einzelstreifen mit je 8 Reaktionvertiefungen im Kunststoffrahmen (entsprechen 2 Mikrotiterplatten), damit können maximal 184 Proben untersucht werden. Nach Öffnung der Umhüllung können die Streifen 4 Wochen bei +4-8°C aufbewahrt werden. 2. Zubereitung der Testreagenzien: 2.1 Wasch-/Konjugatverdünnungslösung Für die Bearbeitung einer Mikrotiterplatte verdünnen Sie 25 ml des 20-fach-Konzentrates mit 475 ml destilliertem Wasser. Mischen Sie sorgfältig! Der Puffer kann, bei -20°C eingefroren, 3 Monate aufbewahrt werden. 2.2 Konjugatlösung: Lösen Sie das lyophilisierte Anti-PPV-HRPKonjugat unmittelbar vor Gebrauch in 11,5ml der Wasch-/Konjugatverdünnungslösung auf. Geben Sie die Lösung vorsichtig in die Konjugatflasche. Überschüssiges Konjugat kann bei -20°C bis zu 3 Monaten aufbewahrt werden. 3. Probenvorbereitung: Es kann frisches, kühl aufbewahrtes oder gefrorenes und aufgetautes Blutserum oder Blutplasma benutzt werden. Für eine Untersuchung werden 10µl Plasma oder Serum benötigt. Zusätzlich notwendiges Material 1. 2. 3. 4. 5. Präzisionspipetten (im Bereich von 5-200µl) Einmalpipettenspitzen Destilliertes Wasser Ein Behälter für Waschlösung (1bis 2 Liter) Photometer für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter 6. Einrichtung zum Aufbringen und Absaugen der Waschlösung. Besondere Hinweise 1. Alle Hinweise vor der Testdurchfürung sorgfältig lesen und befolgen. 2. Das Test-Kit und alle Reagenzien bei +2 bis +8°C lagern. 3. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (+18 bis +25°C) bringen. 4. Alle Materialen als potentiell infektiös behandeln und entsorgen. 5. Nicht die Reagenzien und/oder Anweisungen verschiedener Tests untereinander vertauschen. 6. Kontamination der Testreagenzien verhindern. 7. Test nach Ablauf der Haltbarkeit nicht mehr verwenden. 8. Während der Testdurchführung nicht essen, trinken oder rauchen. 9. Für jede Probe eine separate Pipettenspitze benutzen. 10. Nicht mit dem Mund pipettieren. 11. Bei jeder Testdurchführung muß eine positive und negative Kontrolle mitgeführt werden. 12. Ausschließlich destilliertes Wasser zur Herstellung der Testreagentien verwenden. 13. Die Stoplösung enthält Schwefelsäure, eine starke Säure, die schwere Verletzungen verursachen kann. Erhöhte Vorsicht ! 14. Alles biologische Material vor Entsorgung unschädlich machen (z. B. durch Autoklavieren). Durchfürung des Tests 1. Alle Reagenzien sollen Raumtemperatur (+18 bis +25°C) haben. 2. Entnehmen Sie die benötigte Anzahl an Auswertung der Ergebnisse 1. Folgende Richtwerte dienen zur Überprüfung der korrekten Testdurchfürung Mikrotiterplatten der Umhüllung. 3. Spülen Sie die Mikrotiterplatte/ den Streifen dreimal mit PBS-Tween Puffer (mind 300 µl xOD-Wert negatives Kontrollserum: > 0,6 xOD-Wert positives Kontrollserum: < 0,3 pro Vertiefung), entfernen Sie dann die Flüssigkeit gründlich. 4 Geben Sie in jede der für die Kontrollseren (Doppelansatz) und Proben vorgesehenen Reaktionsvertiefungen 90 µl der Wasch-/ konjugatverdünnungslösung. 5. Geben Sie in jede der für die Kontrollseren vorgesehenen Reaktionsvertiefungen 10 µl des positiven Kontrollserums (Reagenz A) bzw.10 µl des negativen Kontrollserums (Reagenz B). 6. Geben Sie in jede der für die Proben vorgesehenen Reaktionsvertiefungen 10 µl der unverdünnten Serumprobe 7. Geben Sie in jede Reaktionsvertiefung 100 µl der Konjugatlösung und mischen Sie gründlich. 8. Verkleben Sie den Einzelstreifen. Inkubieren sie anschlieβend 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-25 °C). 9. Entleeren Sie danach die Reaktionsvertiefungen und spülen Sie diese dreimal mit der Wasch-/ Konjugatverdünnungslösung (mind. 300 µl pro Vertiefung), entfernen Sie dann die Flüssigkeit gründlich. 10. Setzen Sie jeder Reaktionsvertiefung 100 µl Substratlösung zu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur (18-25°C). Beginnen Sie mit der Zeitmessung nach Füllen der ersten Reaktionsvertiefung. 11. Geben Sie 50 µl Stoplösung in jede Reaktionsvertiefung, und zwar in der gleichen Reihenfolge, in der Sie die Substratlösung zugegeben hatten. 12. Schütteln Sie gründlich. Messen Sie sofort die Extinktionswerte (OD) der Proben und der Kontrollseren innerhalb von 15 Minuten nach Zugabe der Stoplösung mit einem Photometer bei 450 nm . 2. Berechnung: 2.1 Berechnen Sie die Mittelwerte der optischen Dichte (xOD) der Proben. 2.2 Berechnen Sie den Prozentsatz der Inhibition (PI) der Proben nach der folgenden Formel: Die Interpretation der Ergebnisse finden Sie weiter unten. PI = 100 - x OD der Proben x der negativen Kontrolle 3. Cut Off PI <50 PI 50-80 PI >80 X 100 negativ positiv (+) stark positv (++) 4. Bewertung: Die folgende Bewertungen gelten nur, wenn mehrere Tiere einer Tiergruppe untersucht wurden. 4.1 Immunstatus: Alle Pro b e n s ind p o s itiv (+) / s tark p o s itiv (++) Aus re ic he nd e Be s tand s immunität Nic ht alle Pro b e n s ind p o s itiv (+) / s tark p o s itiv (++) Ke ine Aus re ic he nd e Be atnd s immunität Alle Pro b e n s ind ne g ativ Ke ine Be s tand s immunität Infektionsstatus Werden bei einer Bestandsuntersuchung negative, positive (+) und stark positive (++) Ergebnissen erzielt, so spricht der Befund bei entsprechender Klinik für ein akutes PPV-Infektionsgeschehen. Referenzen Mengeling, W.L. (1986) Porcine Parvovirus infection. In Diseases of Swine 6th Edition. Edited by A.D. Leman, B. Straw, R.D. Glock, W.C. Mengeling, R.H. Penny, and E. Scholl. Iowa State Uni. Press, pp. 411-424. Juntti, N. et. al. (1986) Use of monoclonal antibody against hemagglutinin in ELISA for the diagnostics of porcine parvovirus. Proceedings of the International Pig Veterinary Society, Barcelona. Diese Gebrauchsinformation umfasst die Testkits mit den Produktnummern: 10-7400- 02 Hersteller/Vertreib Svanova Biotech AB Uppsala Science Park SE-751 83 Uppsala, Schweden Rufnummer: +46 18 65 49 00 Faxnummer: +46 18 65 49 99 [email protected] www.svanova.com Kundenservice Rufnummer: +46 18 65 49 15 Faxnummer: +46 18 65 49 99 [email protected] Manualnumber: 19-7400-02-22/03 Handelsform Packung mit 2 Mikrotiterplatten, je gesteilt in 12 Striefen mit je 8 Reaktionsvertiefungen im Kunststoffrahment und den entsprechenden Reagenzien.
