Mutagenese des nuo-Operons von Escherichia coli

Mutagenese des nuo-Operons von
Escherichia coli
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung der Doktorwürde der
Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der
Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Mareike Uhlmann
Freiburg im Breisgau, April 2005
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. Georg E. Schulz
Referent:
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Korreferent:
Prof. Dr. Peter Gräber
Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses:
07.Juli 2005
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden in folgendem Artikel veröffentlicht:
Mareike Uhlmann und Thorsten Friedrich (2005) The EPR signals assigned to Fe/S cluster
N1c of the Escherichia coli NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) derive from
cluster N1a. Biochemistry 44: 1653-1658
Das Schönste, was wir entdecken können, ist das Geheimnisvolle.
Albert Einstein
Inhaltsverzeichnis
T
1
Zusammenfassung
4
2
Einleitung
6
2.1
Das aerobe Elektronentransportsystem von Escherichia coli
6
2.2
Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
7
2.3
Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus E. coli
9
2.3.1
Das nuo-Operon
9
2.3.2 Der isolierte Komplex I
11
2.4
Mutagenese im nuo-Operon
15
2.4.1
Die extrachromosomale Klonierung
15
2.4.2
λ-Red vermittelte Rekombination in E. coli
17
2.4.3
Selektion auf Rekombination
19
2.5
Thema der Arbeit
21
3
Material und Methoden
22
3.1
Medien und Lösungen
22
3.2
Mikroorganismen, Vektoren und Oligonukleotide
25
3.3
Mikrobiologische Methoden
28
3.3.1
Anzucht von E. coli
28
3.3.2 Herstellung von Dauerkulturen
29
3.3.3
Herstellung kompetenter Zellen
29
3.4
Molekularbiologische Methoden
30
3.4.1
Analytische Plasmidisolierung mittels „Boiling lysis“
30
3.4.2
Analytische Plasmidisolierung mittels alkalischer Lyse
30
3.4.3
Präparative Plasmidisolierung
31
3.4.4
Präparation genomischer DNA
31
3.4.5
Restriktion und Modifikation von DNA
31
3.4.6 Agarosegelelektrophorese
32
-1-
3.4.7
Isolation und Aufreinigung von DNA-Fragmenten
32
3.4.8
Polymerase-Kettenreaktion
33
3.4.9
Einführung von Punktmutationen mittels ortsgerichteter Mutagenese
34
3.4.10 Weitere molekularbiologische Methoden
34
3.5
Proteinchemische Methoden
34
3.5.1
Isolierung der Plasmamembranen
34
3.5.2
Isolierung des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo
35
3.5.3
Isolierung des Komplex I über Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin
36
3.5.4 Aufreinigung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes über eine AffinitätsChromatographie an StrepTactin
37
3.5.5
Verschiedene analytische Methoden
37
4
Ergebnisse
42
4.1
Klonierung des extrachromosomalen Expressionssystems pBADnuo
42
4.2
Produktion von Komplex I vom Plasmid pBADnuo
47
4.2.1
Wachstumskurven von nuo/ndh-Doppeldeletionsstämmen mit pBADnuo
47
4.2.2
Atmungsaktivität des E. coli Stammes ANN0221/pBADnuo
51
4.2.3
Assemblierung des Komplex I in ANN0221/pBADnuo
53
4.2.4
Isolierung des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo
54
4.3
Das Subklonsystem des Plasmids pBADnuo
56
4.3.1
Vektor für die Subklonierung des Plasmids pBADnuo
58
4.3.2 Klonierung der pBADnuo-Subklone und der kleinen Subklone
61
4.4
Einführung einer StrepTag II-Sequenz in pBADnuo
63
4.4.1
Modifizierung von NuoB
63
4.4.2
Modifizierung von NuoF
68
4.4.3
Modifizierung von NuoCD
71
4.5
λ-Red vermittelte Rekombination zur Mutagenese im nuo-Operon
80
4.5.1
Deletionsmutanten in pBADnuo
80
4.5.2 Punktmutationen in nuoM
92
4.6
Mutagenese an einem Fe/S-Bindemotiv auf NuoG
102
4.6.1
ESR-spektroskopische Charakterisierung des NADH-Dehydrogenase
Fragmentes im Cytoplasma
105
Isolierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus den NuoG-Mutanten
109
4.6.2
-2-
4.6.3
ESR-spektroskopische Charakterisierung des aufgereinigten NADHDehydrogenase Fragmentes
111
4.6.4
ESR-spektroskopische Charakterisierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes in
aerob und anaerob gezogenen Zellen
113
5
Diskussion
115
5.1
Das extrachromosomale Expressionssystem pBADnuo
115
5.2
Nutzung des Plasmids pBADnuo zur Mutagenese
117
5.3
Vergleich der λ-Red vermittelten Rekombination mit der Klonierung
118
5.4
Kombination von Klonierung und Rekombination
121
5.5
Isolierung des Komplex I über eine Affinitäts-Chromatographie
122
5.6
Das zusätzliche Fe/S-Bindemotiv auf NuoG
123
6
Literatur
127
-3-
Zusammenfassung
1. Zusammenfassung
Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, die auch als respiratorischer
Komplex I bezeichnet wird, koppelt den Transfer von zwei Elektronen von NADH auf ein
Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran. Der Elektronenweg in
dem Enzymkomplex verläuft über ein Flavin Mononukleotid und bis zu neun Eisen-Schwefel
(Fe/S)-Zentren. Da die Struktur des Komplexes auf molekularer Ebene bislang nicht bekannt
ist, ist die Elektronenübertragung und ihre Kopplung mit der Protonentranslokation noch nicht
verstanden. Der Komplex I setzt sich modular aus einem NADH-Dehydrogenase Fragment,
einem verbindenden Fragment und einem Membranfragment zusammen. Der Komplex I aus
dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten, NuoA bis
NuoN, die von den Genen des 15 kbp großen nuo-Operons (von NADH:Ubichinon
Oxidoreduktase) kodiert werden. Die Gene nuoC und nuoD sind in E. coli zu einem Gen
fusioniert.
In dieser Arbeit sollte ein System entwickelt werden, mit dem beliebige Manipulationen am
nuo-Operon vorgenommen werden können. In einem ersten Schritt sollte das Operon in einen
Expressionvektor kloniert werden, um später große Mengen des mutierten Komplexes zu
erhalten. Dann sollten Subklone des Operons erstellt werden, die in einer PCR-basierten
Mutagenese eingesetzt werden sollten. Die Subklone sollten das gesamte nuo-Operon
abdecken und nach Mutation in den Expressionsvektor rückkloniert werden können. Dieses
System sollte eingesetzt werden, um den Komplex mit Affinitätspeptiden für eine schnelle
Aufreinigung zu modifizieren, um die Assemblierung des Komplexes durch Deletion
einzelner Gene zu untersuchen und um Bindestellen für Kofaktoren durch stellengerichtete
Mutagenese zu charakterisieren.
Die Gene nuoA und nuoB wurden aus dem Chromosom mit PCR-Methoden amplifiziert und
in ein Plasmid ligiert, so dass vor nuoA eine neue Restriktionsschnittstelle für einen Promotor
geschaffen wurde. Das nuo-Operon wurde aus dem Chromosom geschnitten und in ein
Cosmid ligiert. Aus dem Cosmid wurden die Gene nuoCD bis nuoG herausgeschnitten und in
das Plasmid hinter nuoB eingefügt. Aus dem Expressionsvektor pBAD33 wurde der
Arabinose-Promotor ausgeschnitten und in die neu geschaffene Schnittstelle vor nuoA
kloniert. Die restlichen Gene des nuo-Operons wurden sukzessiv aus dem Cosmid eingefügt.
Dieser
Expressionsvektor
wurde
pBADnuo
-4-
genannt.
Von
pBADnuo
wurde
ein
Zusammenfassung
vollassemblierter und enzymatisch aktiver Komplex I produziert. Der Gehalt in der Membran
war etwa drei- bis vierfach höher als in dem Ausgangsstamm. Dies ist das erste Beispiel für
eine extrachromosomale Produktion von Komplex I.
Um die nuo-Gene des Plasmids pBADnuo einer Mutagenese zugänglich zu machen, wurden
Subklone der Gene nuoA bis nuoL sowie für einen Teil von nuoM (nuoM´) erhalten. Eine
direkte Rückklonierung in pBADnuo war aber nur für die Gene nuoA bis nuoE´ möglich, da
die benötigten Zwischenvektoren nicht hergestellt werden konnten. Durch Etablierung der
λ−Red vermittelten Rekombination war es jedoch möglich, auch Mutationen aus nuoE bis
nuoM´ in pBADnuo einzufügen. Mit diesem System wurden die Untereinheiten NuoB, NuoC
und NuoF jeweils C-terminal mit einem StrepTag II-Peptid modifiziert. Die Modifizierung an
NuoF verhinderte die Assemblierung des Komplex I. Die Modifizierung an NuoB führte zu
einem fragmentierten Komplex I, dem die Untereinheiten NuoA, NuoJ und NuoK sowie die
Fe/S-Zentren N2 und N4 fehlten. Die StrepTag II-Sequenz wurde so in das Gen nuoCD
eingeführt, dass ein Stoppkodon für nuoC sowie ein neues Startkodon für nuoD entstand. Der
so modifizierte Komplex wurde über eine Affinitäts-Chromatographie mit äußerst geringen
Ausbeuten präpariert.
Durch die Deletion der Gene nuoCD, nuoM, nuoG und nuoE bis F von dem Plasmid
pBADnuo wurde Komplex I nicht mehr assembliert. Allerdings war im Cytosol des Stammes
BL21(DE3)/pBADnuo/∆nuoCD
das
assemblierte
NADH-Dehydrogenase
Fragment
nachzuweisen. Die übrigen Mutanten wurden bislang nicht auf das Vorhandensein dieses
NADH-Dehydrogenase Fragmentes untersucht.
Die Untereinheit NuoG trägt ein zusätzliches Bindemotiv für ein Fe/S-Zentrum. Da in der
Präparation des Komplexes ein neues ESR-Signal gefunden wurde, wurde dieses dem Motiv
auf NuoG zugeordnet und als „N1c“ bezeichnet. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurden
die Cysteine des Bindemotivs gegen Alanine ausgetauscht. Die ESR-spektroskopische
Charakterisierung der mutierten Proteine zeigte, dass das ESR-Signal von dem zweikernigen
Zentrum N1a auf NuoE stammt. Da die Mutationen die Assemblierung störten, bindet das
zusätzliche Bindemotiv wahrscheinlich ein bislang nicht nachgewiesenes Fe/S-Zentrum, das
als N7 bezeichnet wird.
-5-
Einleitung
2. Einleitung
2.1 Das aerobe Elektronentransportsystem von Escherichia coli
Das Gram-negative, fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli, das im Darm von
Säugetieren
lebt,
deckt
Elektronentransportsysteme.
seinen
Diese
Energiebedarf
bestehen
aus
über
aerobe
und
anaerobe
membrangebundenen
primären
Dehydrogenasen und terminalen Reduktasen bzw. Oxidasen, die bei aerobem Wachstum
durch Ubichinon und bei anaeroben Wachstumsbedingungen durch Menachinon oder im Fall
der Nitrat-Atmung durch Dimethylmenachinon miteinander verbunden sind (Unden, 1988;
Wissenbach et al., 1990). Die von diesen Komplexen katalysierten Redoxreaktionen sind mit
der Bildung eines elektrochemischen Protonengradienten gekoppelt, der für die ATPSynthese und andere energieverbrauchende Prozesse genutzt wird (Mitchell, 1961; Ingledew
und Poole, 1984; Neijssel und Teixeira de Mattos, 1994; Rich, 2003).
Das aerobe Elektronentransportsystem von E. coli umfasst im Wesentlichen drei
energiewandelnde
Enzymkomplexe,
die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NADH-
Dehydrogenase Typ I; NDH-I) und zwei terminale Cytochrom-Oxidasen bo und bd, sowie
eine alternative, nicht-energiewandelnde NADH-Dehydrogenase (NADH-Dehydrogenase
Typ II; NDH-II) (Yagi et al., 1998; Abb. 2-1). Die Cytochrom bd-Oxidase besteht aus zwei
Polypeptidketten und besitzt zwei Hämgruppen vom b-Typ und eine vom d-Typ. Sie
transloziert pro Elektron ein Proton über die Membran (Puustinen und Wikström, 1999). Die
aus vier Polypeptidketten bestehende Cytochrom bo3-Oxidase enthält je eine Hämgruppe vom
b-Typ und vom o-Typ, sowie zwei Kupferionen. Dieser Komplex transloziert zwei Protonen
pro übertragenem Elektron über die Membran, so dass die Energiekonservierung doppelt so
hoch wie bei der Cytochrom bd-Oxidase ist (Anraku und Gennis, 1987; Puustinen et al.,
1991). Die Cytochrom bo3-Oxidase wird unter aeroben Bedingungen, die Cytochrom bdOxidase unter mikroaeroben Bedingungen exprimiert (Cotter et al., 1990; Iuchi et al., 1990).
-6-
Einleitung
Abb. 2-1: Schematische Darstellung des aeroben Elektonentransportsystems in E. coli Die
energiewandelnden Enzymkomplexe mit ihrer Energiebilanz sind grau dargestellt. NDH-I
bezeichnet die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, NDH-II die alternative NADHDehydrogenase, bo3-Komplex die Cytochrom bo3-Oxidase und bd-Komplex die Cytochrom
bd-Oxidase. Die Pfeile zeigen die Richtung des Elektronenflusses, Q steht für den
Elektronenüberträger Ubichinon.
Beide NADH-Dehydrogenasen übertragen Elektronen von NADH auf Ubichinon. Im
Gegensatz zu der NDH-I ist die Reaktion der NDH-II nicht mit einer Protonentranslokation
gekoppelt. Die NDH-II weist eine zehnfach geringere Affinität zum natürlichen Substrat
NADH und eine etwa tausendfach geringere Affinität zum künstlichen Substrat
Desamino (d)-NADH auf. Dies wird zur Unterscheidung der beiden Dehydrogenasen in
enzymatischen Tests genutzt (Matsushita et al., 1987). So stammt die NADH-Oxidaseaktivität
von beiden Enzymen, während die d-NADH-Oxidaseaktivität nahezu vollständig von der
NDH-I stammt. Der Besitz verschiedener NADH-Dehydrogenasen und terminaler Oxidasen
ermöglicht E. coli, sich an verschiedene Wachstumsbedingungen anzupassen.
2.2 Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, die auch als respiratorischer
Komplex I oder NDH-I bezeichnet wird, koppelt den Transfer von zwei Elektronen des
NADH auf ein Chinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran nach
-7-
Einleitung
folgender Reaktionsgleichung (Walker, 1992; Friedrich, 2001; Magnitsky et al., 2002; Brandt
et al., 2003; Yagi et al., 2003):
NADH + Q + 5H+n NAD+ + QH2 + 4H+p
P
PB
B
P
P
B
B
P
PB
B
Hierbei steht Q für Ubichinon und H+n und H+p für Protonen auf der negativen inneren bzw.
P
PB
B
P
PB
B
positiven äußeren Seite der Membran.
Durch diese Protonentranslokation trägt die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase zum Aufbau
der protonenmotorischen Kraft bei, die essentiell für energieverbrauchende Prozesse ist.
Homologe Formen des Komplexes kommen in der Cytoplasmamembran vieler Bakterien und
in der inneren Mitochondrienmembran der meisten Eukaryonten vor.
Während der mitochondriale Komplex I von Eukaryonten aus bis zu 46 Untereinheiten
aufgebaut ist (Carroll et al., 2002), besteht der bakterielle Komplex I im Allgemeinen aus 14
verschiedenen Untereinheiten, die homolog zu Untereinheiten des mitochondrialen
Komplexes sind. Sieben dieser 14 Untereinheiten sind periphere Proteine, darunter alle
Untereinheiten, die die bislang nachgewiesenen Redoxgruppen des Komplexes, ein Flavin
Mononukleotid (FMN) und bis zu neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren beinhalten. Bei den
restlichen sieben Untereinheiten handelt es sich um hydrophobe Proteine, die laut
Sekundärstrukturvorhersage mit 54 α-Helices in der Membran verankert und in bislang
unbekannter Weise an der Protonentranslokation beteiligt sind (Weiss et al., 1991; Walker,
1992; Friedrich et al., 1995; Brandt, 1997). UV/vis-spektroskopische Untersuchungen des
Komplexes ergaben Hinweise auf die Existenz eines weiteren Kofaktors in den
membranständigen Untereinheiten, dessen chemische Struktur noch unbekannt ist (Friedrich,
1998; Schulte et al., 1998 und 1999; Friedrich et al., 2000).
Der mitochondriale Komplex I besitzt eine molekulare Masse von nahezu 1 MDa, während
die des bakteriellen Komplexes etwa 550 kDa beträgt. Von allen Atmungskettenkomplexen
ist der Komplex I aufgrund seiner Größe und komplizierten Zusammensetzung der Einzige,
dessen
Struktur
noch
nicht
auf
molekularer
Ebene
gelöst
wurde.
Bisherige
Strukturuntersuchungen konzentrierten sich auf elektronenmikroskopische Aufnahmen von
Komplex I-Einzelpartikeln und zweidimensionalen Membran-Kristallen des Komplexes aus
Rinderherz (Sazanov und Walker, 2000; Grigorieff 1998), dem filamentösen Pilz Neurospora
-8-
Einleitung
crassa (Leonard et al., 1987; Hofhaus et al., 1991; Guenebaut et al., 1997 und 1998a), der
aeroben Hefe Yarrowia lipolytica (Djafarzadeh et al., 2000) und den Bakterien E. coli
(Guenebaut et al., 1998b) und Aquifex aeolicus (Peng et al., 2003). Die Untersuchungen an
dem Komplex aus verschiedenen Organismen zeigten eine L-förmige Struktur mit einem
Membranarm und einem peripheren Arm, der in die mitochondriale Matrix bzw. das
bakterielle Cytoplasma ragt. Der isolierte E. coli Komplex I kann je nach Ionenstärke des
Mediums zwei unterschiedliche Konformationen annehmen: In Puffern hoher Ionenstärke
bildet er die oben beschriebene L-förmige Struktur, während in Puffern niedriger Ionenstärke
eine so genannte Hufeisen-Form vorliegt (Böttcher et al., 2002; Abb. 2-2). Wie mittels
analytischer Ultrazentrifugation gezeigt wurde, gehen beide Formen reversibel ineinander
über. In der Hufeisen-Form, von der man auf Grund ihrer enzymatischen Aktivität annimmt,
dass sie den nativen Zustand des Komplexes darstellt, sind peripherer Arm und Membranarm
parallel zueinander angeordnet, in der L-Form senkrecht zueinander.
Abb. 2-2: Schematische Darstellung der Konformationen des Komplex I aus E. coli. (a) zeigt
die L-Form, die bei hohen Ionenstärken vorliegt und (b) die Hufeisenform, die bei niedrigen
Ionenstärken vorliegt. Die Modelle wurden aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen an
Einzelpartikeln berechnet (Böttcher et al., 2002).
2.3 Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus E. coli
2.3.1 Das nuo-Operon
Der Komplex I aus E. coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten. Die für diese
Untereinheiten kodierenden Gene sind im sogenannten nuo-Operon organisiert (von
-9-
Einleitung
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase) und werden mit nuoA-N bezeichnet (Weidner et al., 1993;
Abb. 2-3). Das Operon hat eine Größe von 15 kbp und befindet sich auf min 51 des E. coli
Chromosoms (Weidner et al., 1993). In E. coli liegen die Gene nuoC und nuoD fusioniert vor
(Braun et al., 1998; Friedrich, 1998). Diese Fusion findet sich ebenfalls in Buchnera
aphidicola, Yersinia pestis, Pseudomonas aeruginosa und Salmonella typhimurium (Clarke et
al., 1997; http://www.scripps.edu/mem/biochem/CI/images/operons.gif). Die Homologen von
nuoC und D sind in der Formiat-Hydrogenlyase von E. coli ebenfalls zu einem Gen hycE
fusioniert, welches für die große Untereinheit der Hydrogenase kodiert (Sauter et al., 1992;
Videira und Azevedo, 1994; Friedrich und Weiss, 1997). Die Anordnung der Gene im nuoOperon ist konserviert und findet sich ebenfalls in den homologen Gen-Loci von Paracoccus
denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Thermus thermophilus und Synechocystis spec.
(Friedrich et al., 1995; Friedrich und Weiss, 1997). Die Promotorregion des nuo-Operons
besteht aus einer 560 bp langen stromaufwärts gelegenen Region. Die Expression des
Operons wird durch O2 und Nitrat über die Regulatoren ArcA, NarL, FNR und andere
Faktoren, welche C4-Dicarboyxlate beeinhalten, reguliert (Bongaerts et al., 1995). Bei einem
anaeroben Wachstum reprimiert ArcA die Expression der nuo-Gene, durch Nitrat wird sie
über NarL stimuliert. FNR reprimiert die Expression der alternativen NADH-Dehydrogenase
(Bongaerts et al., 1995).
Abb. 2-3: Modell des nuo-Operons. Die Gene, die für die peripheren Proteine kodieren, sind
blau dargestellt, die die für die membranständigen Gene kodieren gelb. Das nuo-Operon ist
schematisch mit den aus der Primärstruktur vorhergesagten Bindemotiven für Redoxgruppen
und Substrate gezeigt.
Der E. coli Komplex I wird aus der Cytoplasmamembran durch Detergenzextraktion und zwei
Ionenaustausch-Chromatographien sowie einer Größenausschluss-Chromatographie bei pH 6
isoliert (Leif, 1995; Spehr et al., 1999; Stolpe, 2003). Je mehr Verunreinigungen die
- 10 -
Einleitung
Präparation enthält, desto mehr dieser Schritte sind nötig, wobei sich bei jeder weiteren
Aufreinigung die Ausbeute verringert. Die Ausbeute der bisherigen Präparation beträgt 2-5 %
(Spehr et al., 1999; Stolpe, 2003). Um eine möglichst hohe Ausbeute und große Reinheit der
Präparation zu erreichen, ist die Affinitäts-Chromatographie durch kleine Peptide (Tags) die
Methode der Wahl (Bailon et al., 2000). Die beiden gebräuchlichsten Systeme sind der HisTag und der StrepTag. Im Fall des StrepTags wird gewöhnlich das StrepTag II-System
verwendet (Voss und Skerra, 1997), das die natürliche Bindung zwischen Avidin und Biotin
nachahmt, die eine der höchsten Bindungskonstanten in der Natur aufweist. Avidin ist neben
Lysozym und Conalbumin ein Bestandteil des antibakteriellen Systems des Hühnereis, wobei
die antibakterielle Wirkung darin besteht, der Umgebung Biotin zu entziehen, wobei bis zu
vier Moleküle Biotin an das aus vier Untereinheiten bestehende Glykoprotein gebunden
werden. Das StrepTag II-System nutzt das dem Avidin homologe bakterielle Streptavidin in
Form des trägergebundenen Liganden StrepTactin. An das aufzureinigende Protein wird mit
Hilfe molekularbiologischer Methoden der so genannte StrepTag angebracht, eine kurze
Peptidsequenz von acht Aminosäuren, die die Eigenschaften des Biotins imitiert. Im Fall des
His-Tags wird eine Sequenz von vier bis zehn Histidinen eingeführt, über die das Protein an
eine Nickel-beladene Matrix gebunden wird. Gewöhnlich wird vor dem Tag eine kurze
Sequenz von meist zwei weiteren Aminosäuren eingebracht, die als Bindeglied (Linker)
bezeichnet wird und als Abstandshalter zwischen Tag und Protein dient, um eine Exposition
des Tags sicherzustellen. Es wird berichtet, dass der Komplex I aus Y. lipolytica und aus
T. thermophilus über einen His-Tag C-terminal zu NuoC effizient über eine AffinitätsChromatographie aufgereinigt wurde (Kashani-Poor et al., 2001; T. Ohnishi, persönliche
Mitteilung). Aufgrund der Homologie der NADH:Ubichinon Oxidoreduktasen ist zu
vermuten, dass auch der E. coli Komplex I nach einer Tag-Modifizierung dieser Untereinheit
durch eine Affinitäts-Chromatographie aufzureinigen wäre. Allerdings liegt NuoC im E. coli
Komplex I nicht als einzelne Untereinheit sondern fusioniert mit NuoD vor.
2.3.2 Der isolierte Komplex I
Bei Anheben des pH-Wertes auf 7.5 und Detergenzwechsel zu Triton X-100 zerfällt der
isolierte Komplex in drei Fragmente, das NADH-Dehydrogenase Fragment, das verbindende
Fragment und das Membranfragment (Leif et al., 1995; Abb. 2-4).
- 11 -
Einleitung
Abb. 2-4: Schematische Darstellung von Komplex I aus E. coli und seiner Fragmente, in die
der Komplex I bei Anheben des pH-Wertes und Detergenzwechsel zu Triton X-100 zerfällt.
Gelb dargestellt ist das NADH-Dehydrogenase Fragment, orange das verbindende Fragment
und blau das Membranfragment. Die Elektronen fliessen vermutlich von NADH über das
FMN und die Fe/S-Zentren N1a, N1b, N3, N4 und N5 des NADH-Dehydrogenase
Fragmentes zu den Fe/S-Zentren N6a, N6b und N2 des verbindenden Fragmentes, wo die
Reduktion des Ubichinons (Q) zu Ubichinol (QH2) stattfindet. Die vermutlich an diesen
Prozess gekoppelten Protonentranslokationen sind mit gepunkteten Pfeilen dargestellt.
Das lösliche NADH-Dehydrogenase Fragment ist der Elektroneneingang des Komplexes und
besteht aus den Untereinheiten NuoE, F und G (Braun et al., 1998; Leif et al., 1995; Friedrich
und Scheide, 2000). Es enthält die NADH-Bindestelle, das FMN und die ESRspektroskopisch nachweisbaren Fe/S-Zentren N1b, N1c, N3 und N4 (Sled et al., 1993; Leif et
al., 1995; Braun et al., 1998; Friedrich, 1998; Bungert et al., 1999; Tab. 2-1) und weist eine
Masse von 160 kDa auf. Ein weiteres konserviertes Motiv für ein zweikerniges Fe/S-Zentrum
befindet sich auf NuoE (Yano et al., 1994; Braun et al., 1998). Dieses wurde dem Zentrum
N1a zugeordnet. Das Zentrum N1a zeigt ein pH-abhängiges Mittenpotential im Bereich von
-410 bis -370 mV (Ohnishi, 1998; Zu et al., 2002). Es wurde angenommen, dass das
Mittenpotential des Zentrums N1a in E. coli so negativ ist, dass es in der NADH-reduzierten
Probe oxidiert vorlag und somit nicht nachgewiesen wurde (Sled et al., 1993).
- 12 -
Einleitung
Tab. 2-1: Lokalisation der in der Präparation von E. coli nachgewiesenen Fe/S-Zentren
Fe/S-Zentrum
N1a**
N1b
N1c**
N2
N3
N4
N5*
N6a/N6b
N7***
Typ
Untereinheit
2Fe/2S
2Fe/2S
2 Fe/2S
4Fe/4S
4Fe/4S
4Fe/4S
4Fe/4S
2x 4Fe/4S
4Fe/4S
NuoE
NuoG
NuoG
NuoB
NuoF
NuoG
NuoG
NuoI
NuoG
Fragment des Komplexes
NADH-Dehydrogenase Fragment
NADH-Dehydrogenase Fragment
nicht existent
Verbindendes Fragment
NADH-Dehydrogenase Fragment
NADH-Dehydrogenase Fragment
NADH-Dehydrogenase Fragment
Verbindendes Fragment
NADH-Dehydrogenase Fragment
* Wurde bislang in dem E. coli Komplex I nicht nachgewiesen.
** Siehe diese Arbeit.
*** Bislang noch nicht nachgewiesen, vermutlich von einem zusätzlichen Bindemotiv auf
NuoG ligiertes Fe/S-Zentrum, siehe diese Arbeit.
Ein weiteres Bindemotiv für ein Fe/S-Zentrum befindet sich auf der Untereinheit NuoG
(Abb. 2-5) Dieses zusätzliche Motiv wurde bislang außer bei E. coli nur bei Salmonella
thyphimurium, T. thermophilus, A. aeolicus und wenigen anderen Bakterien gefunden (Finel,
1998; Scheide et al., 2002).
E.
A.
T.
P.
R.
N.
H.
coli
aeolicus
thermophilus
denitrificans
capsulatus
crassa
sapiens
221
* *
*
* 270
WDMQFAPSICQQCSIGCNISPGERYGELRRIENRY-NGTVNHYFLCDRGRF
WLLEKGRTVCNLCPVGCEIQIEYGVGDWRSKRKVYRTKPTDELNICAKGFF
WEMEETPTTCALCPVGCGITADTRSGELLRIRARE-VPEVNEIWICDAGRF
WELTKTESIDVMDALGSSIRIDTKGREVMRILPRN-HDGVNEEWISDKTRF
WELVKTESIDVMDALGSNIRIDAKGREVKRIVPRN-HDGVNEEWLSDKGRF
WELKKTESIDVLDGLGSNIRVDTRGLEVMRILPRL-NDEVNEEWINDKTRF
WETRKTESIDVMDAVGSNIVVSTRTGEVMRILPRM-HEDINEEWISDKTRF
Abb. 2-5: Sequenzvergleich der NuoG-Homologen von E. coli, A. aeolicus, T. thermophilus,
P. denitrificans, R. capsulatus, N. crassa und H. sapiens. Die Nummerierung bezieht sich auf
die E. coli Sequenz. Die Cysteine des zusätzlichen Fe/S-Zentrum Bindemotivs sind rot
gedruckt und ihre Position mit einem Stern markiert.
- 13 -
Einleitung
ESR-Spektren der Präparation des E. coli Komplex I zeigen ein ESR-Signal eines
zweikernigen
Fe/S-Zentrums
mit
gx,y,z = 1.92,
1.94
und
2.00.
Aufgrund
seines
Mittenpotentials von –240 mV, das keine pH-Abhängigkeit zeigt, wurde dieses Signal nicht
dem Zentrum N1a, sondern einem neuartigen Zentrum, N1c, zugeordnet (Sled et al., 1993;
Leif et al., 1995). Es wurde sowohl in den cytoplasmatischen Membranen von E. coli, dem
isolierten Komplex I und dem isolierten NADH-Dehydrogenase Fragment nachgewiesen. Das
Signal war in den Spektren der cytoplasmatischen Membran eines E. coli Komplex I
Überproduzenten deutlich verstärkt (Spehr et al, 1999). Dieses Signal wurde daher dem
zusätzlichen Bindemotiv auf NuoG zugeordnet (Sled et al., 1993; Leif et al., 1995; Braun et
al., 1998; Bungert et al., 1999). In anderen Enzymen wie der E. coli Formiat
Dehydrogenase H (Boyington et al., 1997), der periplasmatischen Nitrat Reduktase von
Desulfovibrio desulfuricans (Dias et al., 1999) oder im Fall der Ferredoxin-Oxidoreduktasen
von Pyrococcus furiosus (Hu et al., 1999; Chan et al., 1995) ligiert ein Bindemotiv mit
ähnlichen Cystein-Abständen allerdings ein vierkerniges Fe/S-Zentrum. Es wurde diskutiert,
ob das als N1c bezeichnete Fe/S-Zentrum möglicherweise zwischen einem zweikernigen und
einem vierkernigen Zustand wechselt, je nachdem ob Sauerstoff vorhanden ist oder ein
reduzierter Zustand des Zentrums vorliegt (Nakamaru-Ogiso et al., 2002). Eine solche
Umwandlung eines [4Fe-4S]-Zentrums wurde z.B. für den Transkriptionsfaktor FNR und der
Biotinsynthase gezeigt (Lazazzera et al., 1996; Bates et al., 2000, Khoroshilova et al., 1997;
Kiley und Beinert, 1998; Duin et al., 1997; Ugulava et al., 2000; Ollagnier-De Choudens et
al., 2000).
Zusätzlich zu dem dem Fe/S-Zentrum N1c zugeordneten Bindemotiv befindet sich auf NuoG
ein weiteres Bindemotiv für ein vierkerniges Fe/S-Zentrum. Bislang war umstritten, ob dieses
als N5 bezeichnetes Zentrum einen tatsächlichen Kofaktor des Komplex I darstellt, da seine
Konzentration in Präparationen des Komplexes sehr gering ist (Ohnishi, 1979 und 1998;
Beinert und Albracht, 1982). N5 wurde in dem überproduzierten Homolog von NuoG aus
P. denitrificans nachgeweisen (Yano et al., 1995; Ohnishi, 1998). Vermutlich ist es in
stöchiometrischen Mengen in Komplex I enthalten, aber ein Großteil des N5 Spins könnte im
S = 3/2 Grundzustand vorliegen, was zu einer Unterschätzung seiner Konzentration gemessen
an den Spins in der g = 2 Region führen würde (Yano et al., 1995; Ohnishi, 1998).
Das amphipathische, verbindende Fragment ist nur in detergenzhaltigen Puffern löslich und
besteht aus den Untereinheiten NuoB, CD und I und hat eine molekulare Masse von 124 kDa
- 14 -
Einleitung
(Leif et al., 1995; Rasmussen et al., 2001). Es verbindet das NADH-Dehydrogenase Fragment
mit dem Membranfragment und enthält die Fe/S-Zentren N2, N6a und N6b (Rasmussen et al.,
2001; Tab. 2-1). Das Membranfragment besteht aus den sieben hydrophoben Untereinheiten
NuoA, NuoH und NuoJ-N mit einer molekularen Masse von 241 kDa. Es enthält weder ein
konserviertes Motiv zur Bindung eines Kofaktors, noch wurde ein Kofaktor in dieser
Untereinheit nachgewiesen. Es ist möglicherweise an der Chinonbindung und der
Protonentranslokation beteiligt (Weiss et al., 1991; Walker, 1992; Friedrich et al., 1995;
Brandt, 1997). Die Ubichinon-Bindestelle wurde bislang aufgrund der Hydrophobiezität des
Substrates
in
dem
Membranfragment
vermutet.
NuoH
wurde
durch
Photoaffinitätsmarkierungen und durch Mutagenesestudien von menschlicher mitochondrialer
DNA als Ubichinon- und Rotenon-bindendes Protein vorgeschlagen (Earley und Ragan, 1984;
Earley et al., 1987; Degli Esposti et al., 1994; Majander et al., 1996; Lunardi et al., 1998).
Kürzlich wurde postuliert, dass sich die Ubichinon-Bindestelle an der Kontaktfläche zwischen
peripherem Arm und Membranarm befindet und die Untereinheiten NuoH und NuoD an der
Bindung beteiligt sind (Darrouzet et al., 1998; Dupuis et al., 2001). Weiterhin wurde zur
Lokalisierung der Ubichinonbindestelle ein photoaktivierbares Azido-Ubichinon-Derivat,
3-Azido-2-methyl-5-methoxy[3H]-6-decyl-1,4-benzochinon,
verwendet,
das
nach
Bestrahlung mit UV-Licht kovalent an NuoM gebunden war (Gong et al., 2003).
2.4 Mutagenese im nuo-Operon
2.4.1 Die extrachromosomale Klonierung
Eine gängige Technik zur Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen von Enzymen ist
eine Mutagenesestudie. Solche Mutationen in das nuo-Operon im Genom von E. coli
einzubringen, ist allerdings sehr aufwendig (Spehr et al., 1999). Einfacher ist es, die
entsprechenden
Gene
extrachromosomal
auf
einem
Plasmid
zu
mutagenisieren.
Voraussetzung hierfür ist, dass entweder das gesamte Operon oder ein Teil davon in einen
Vektor kloniert wurde. Ein Expressionsvektor, der das gesamte nuo-Operon enthält,
ermöglicht direkt die Expression mutierter Gene. Erfolgt die Expression in einem Stamm, in
dem das nuo-Operon aus dem Genom deletiert wurde, so produzieren die Zellen nur den
gezielt veränderten Komplex I. Eine Alternative stellt die Komplementation dar, d.h. es wird
nur ein Teil des Operons im Genom deletiert und dieser Teil wird auf einem Plasmid in die
- 15 -
Einleitung
Zellen eingebracht. Nach Expression der auf dem Plasmid mutierten Gene erfolgt in der Regel
der Einbau der Untereinheiten zu dem Gesamtkomplex. Allerdings ist eine solche
Komplementation nicht in jedem Fall möglich, da die Assemblierung des Komplexes bei
getrennter Expression der Gene von dem Chromosom und von einem Plasmid nicht unbedingt
stattfinden muss. Außerdem können unterschiedliche Transkriptstabilitäten die Menge des
produzierten Proteins beeinflussen. Daher ist es von Vorteil, das gesamte Operon auf einem
extrachromosomalen Expressionssystem zur Verfügung zu haben.
Die Klonierung des nuo-Operons ist aufgrund seiner Größe von 15 kbp nicht trivial. Zwar
wurde auch das atp-Operon der ATP-Synthase kloniert, die mit 535 kDa eine mit dem
Komplex I vergleichbare Masse besitzt, jedoch besteht die ATPase aus 8 Untereinheiten, die
in einer Stöchiometrie von a1:b2:c10-14:α3:β3:γ1:δ1:ε1 vorkommen (Noji und Yoshida, 2001).
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Dadurch hat das aus den Genen atpIBEFHAGDC bestehende Operon eine Größe von nur
7 kbp (Gunsalus et al., 1982; Kasimoglu et al. 1996). Klonierungsvektoren besitzen im
Allgemeinen eine Klonierungskapazität von etwa fünf bis zehn kbp. Es gibt nur vereinzelte
Berichte, dass größere DNA-Fragmente in Expressionsvektoren kloniert wurden. Die hohe
Ringspannung destabilisiert das Plasmid und erschwert eine Expression der klonierten Gene
und eine Replikation des Plasmids. In der Literatur werden die höchsten Kapazitäten mit bis
zu 12 kbp für den ZAP Express® Vektor, Fa. Stratagene, angegeben. Mit so genannten
P
P
Lambda-Austauschvektoren können neun bis 23 kbp kloniert werden, bei der Verwendung
von Cosmiden bis zu 42 kbp, jedoch ist eine Expression der Gene von diesen Systemen nicht
möglich (Sambrook und Russel, 2001). Um bei der Klonierung des nuo-Operons das Problem
der hohen Ringspannung zu vermeiden, müsste das Operon in mehreren kleinen Schritten
kloniert werden. Als Vektor würde sich der pBAD33 eignen, der durch einen ArabinosePromotor sehr gut regulierbar ist. Er enthält den PBAD-Promotor des araBAD-Operons und das
B
B
araC-Gen, das für den negativen und positiven Regulator dieses Promotors kodiert (Guzman
et al., 1995). Die wichtigsten Eigenschaften dieses Plasmids sind eine sehr geringe
Hintergrundexpression im nicht-induzierten Zustand, eine schnelle und hohe Expression in
Gegenwart von L(+)-Arabinose sowie die Möglichkeit zur Modulation der Expression über
die Konzentration des Induktors Arabinose.
- 16 -
Einleitung
2.4.2 λ-Red vermittelte Rekombination in E. coli
Mit dem Zusammenspiel von Restriktionsenzymen und einer Ligase entsteht eine Vielzahl
von Möglichkeiten zur Modifikation von DNA, die unter dem Begriff der Klonierung
zusammengefasst werden. Mittels Klonierung können z.B. einzelne Gene in einen Vektor
integriert werden, Deletionen oder Insertionen eingeführt oder einzelne DNA-Bereiche
ausgetauscht werden. Voraussetzung ist allerdings, dass geeignete Erkennungssequenzen für
Restriktionsenzyme vorhanden sind. Oftmals müssen diese palindromischen Bereiche erst
durch eine Mutagenese eingeführt werden, während in anderen Fällen das zu häufige
Vorkommen einer Erkennungssequenz zu einer unerwünschten Fragmentierung der DNA
führt. Dadurch sind vor allem der Modifikation des Chromosoms Grenzen gesetzt. Zur
Modifikation von DNA wird bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae häufig anstelle der
Klonierung die Rekombination genutzt. Bringt man durch Transformation lineare DNAFragmente in die Zellen ein, so werden diese in das Genom eingebaut, wenn sie zu der
chromosomalen Sequenz homologe Bereiche aufweisen. Dies geschieht mit dem sehr
effizienten Rekombinasesystem von S. cerevisiae über einen Doppelstrangbruch im Genom
und anschließende Ligation mit dem homologen Einzelstrang (Oliver et al., 1998). Auf diese
Art und Weise können synthetische Oligonukleotide genutzt werden, um über die
Rekombination jedes gewünschte DNA-Fragment in das Genom von S. cerevisiae
einzuführen.
Die Nutzung der Rekombination zur Einführung von linearen DNA-Fragmenten in das
Genom von E. coli ist durch das Rekombinasesystem von E. coli begrenzt (Abb. 2-6), das
einen Homologiebereich von mehreren tausend Basen zwischen Fragment und Zielsequenz
benötigt, dabei wenig effizient ist und vor allen Dingen nicht geeignet zur Rekombination
linearer DNA ist, da diese durch die intrazelluläre RecBCD-Exonuklease abgebaut wird
(Lorenz und Wackernagel, 1994). Bei einer Deletion von recBCD wird lineare DNA zwar
nicht abgebaut, jedoch findet keine Rekombination mehr statt, Plasmide werden nur noch in
geringem Maß repliziert und das Zellwachstum ist gestört (Cosloy und Oishi, 1973).
Ermöglicht wird die Rekombination linearer DNA, wenn statt des E. coli eigenen
Rekombinasesystems das λ-Red System des Phagen λ genutzt wird (Murphy, 1998). Dieses
besteht aus den drei Rekombinase-Untereinheiten Gam, Exo und Beta. λ-Gam inhibiert die
Nukleaseaktivität von RecBCD, so dass lineare DNA in E. coli transformiert werden kann,
ohne dass sie abgebaut wird. λ-Exo führt einen Doppelstrangbruch in die DNA ein und
- 17 -
Einleitung
erzeugt 3´-Überhänge, die als Substrat für die Rekombination benötigt werden. λ-Beta ist ein
Einzelstrang-bindendes Protein, das die Renaturierung von komplementären DNAEinzelsträngen fördert und so einen Strangaustausch vermitteln kann (Ellis et al., 2001). Die
λ-Red vermittelte Rekombination ist im Vergleich zu dem RecBCD-System nicht nur
wesentlich effizienter, es wird außerdem ein wesentlich kleinerer homologer Bereich für den
Austausch benötigt. Schon ab einer Länge von 20 bp findet eine Rekombination statt, eine
genügend hohe Effizienz ist ab 36 bp oder mehr gegeben (Datsenko und Wanner, 2000).
Abb. 2-6: Das Rekombinasesystem von E. coli. RecBCD bindet an ein freies Ende der
doppelsträngigen DNA und entwindet unter ATP-Verbrauch die Helix. Es entstehen zwei
einzelsträngige Schleifen, in denen RecBCD vier bis sechs Nukleotide vor dem 3´-Ende einer
sogenannten Chi-Sequenz schneidet. So entsteht ein offener Einzelstrang, an den RecA zur
Stabilisierung bindet und an dem die homologe Rekombination stattfindet (nach:
http://gsbs.gs.uth.tmc.edu/courses/experimental_genetics/fig_9.jpg).
Durch die λ-Red Rekombinase sind alle Möglichkeiten der Modifikation von DNA in E. coli
gegeben, die auch durch Klonierung erreicht werden können, allerdings vollkommen
sequenzunabhängig. Oftmals kann daher das „Rekombineering“ die Methode der Wahl z.B.
- 18 -
Einleitung
zur Deletion eines Gens oder für das Einführen von Mutationen sein, wobei vor allem die
genomische Manipulation im Vergleich zur Klonierung wesentlich einfacher ist.
2.4.3 Selektion auf Rekombination
Erfolgt eine Rekombination ohne Selektion über eine Antibiotikaresistenz, so trägt sowohl
das Ausgangsplasmid als auch das rekombinierte Plasmid die gleiche Resistenz und eine
Unterscheidung der Zellen ist nicht möglich. In diesem Fall müssen entweder sehr viele
Kolonien mittels Plasmidpräparation und anschließender Restriktionsanalyse oder über eine
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchsucht werden. Alternativ bieten sogenannte
Suizidsysteme die Möglichkeit, rekombinierte von nicht-rekombinierten Plasmiden zu
unterscheiden. Ein Beispiel für ein solches System ist das nptI-sacR-sacB-System (Ried und
Collmer, 1987). Das sacB-Gen aus Bacillus subtilis kodiert für die Levansucrase, ein Enzym,
das Saccharose in Levan umbaut. Levan akkumuliert in den Zellen und führt zu einer Lyse
(Gay et al., 1985). Gram-negative Bakterien, die dieses Gen zusammen mit seinem Regulator
sacR enthalten, können nicht auf Saccharose-haltigen Medien wachsen. In diesem Fall spricht
man von einem negativen Selektionsmarker. Bei Verwendung der nptI-sacR-sacB-Kassette
benutzt man zusätzlich als positiven Selektionsmarker das nptI-Gen, das für eine
Neophosphotransferase kodiert und eine Kanamycin-Resistenz vermittelt. Wird diese Kassette
in ein E. coli Plasmid eingeführt, können Zellen auf Kanamycin-enthaltendem Medium auf
die Insertion der Kassette überprüft werden. Das Medium darf dabei keine Saccharose
enthalten, da die Zellen ansonsten lysiert werden. Die Kassette kann über Rekombination in
den Bereich insertiert werden, in den eine Mutation eingeführt werden soll. Die Mutation wird
wiederum über Rekombination derart in das Plasmid eingeführt, dass die nptI-sacR-sacBKassette vollständig von dem Bereich ersetzt wird, in dem die Mutation liegt. Bei Anzucht
auf Medium mit Saccharose können nur Zellen überleben, die die Kassette nicht mehr
enthalten und bei denen die Rekombination erfolgreich war.
Soll statt der Klonierung die Rekombination genutzt werden, um ein DNA-Fragment in einen
Vektor einzuführen, so steht die Möglichkeit der Antibiotika-Selektion ebenfalls nicht zur
Verfügung. Bei der Klonierung wird der Vektor mit Restriktionsenzymen linearisiert und
wird
bei
nicht
erfolgter
Ligation
als
lineare
DNA
in
E.
coli
vom
RecBCD-Rekombinasesystem abgebaut (Lorenz und Wackernagel, 1994). Nur geschlossene
- 19 -
Einleitung
Plasmide werden in E. coli propagiert und produzieren das die Resistenz vermittelnde Protein.
Zellen, die kein erfolgreich ligiertes Plasmid enthalten, können auf Antibiotika-haltigen
Medien nicht wachsen. Im Fall der Rekombination wird der Ursprungsvektor in seiner
superspiralisierten Form in die Zellen transformiert. Es erfolgt kein Abbau des Plasmids und
die Zellen besitzen die Plasmid-kodierte Antibiotika-Resistenz, egal ob ein Gen durch
Rekombination in das Plasmid eingeführt wurde oder nicht. Hier kann zwischen
rekombinanten
und
nicht-rekombinanten
Zellen
mittels
einer
Blau-Weiß-Selektion
unterschieden werden. Hierzu wird ein Plasmid benötigt, das in seiner multiplen
Klonierungsstelle
(multiple
cloning
site,
MCS),
einem
DNA-Bereich
mit
vielen
Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme, das Gen für das N-terminale α-Fragment der
β-Galaktosidase, bezeichnet mit lacZ´, enthält. β-Galaktosidase setzt normalerweise
Galaktose zu Fructose und Glucose um. Andere Substrate wie 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl[beta]-D-galaktopyranosid (X-Gal), das farblos ist, werden zu einem farbigen Produkt
umgesetzt. Produziert der Bakterienstamm das chromosomal kodierte C-terminale ωFragment der β-Galaktosidase, das nur zusammen mit dem α-Fragment katalytische Aktivität
hat, so erfolgt die sogenannte α-Komplementation. Wird in die MCS des verwendeten
Vektors ein DNA-Fragment insertiert, so wird die für das α-Fragment kodierende Sequenz
unterbrochen und es wird keine funktionelle β-Galaktosidase mehr produziert. X-Gal wird
nicht mehr zu einem farbigen Produkt umgesetzt und solche Plasmide enthaltende
Bakterienkolonien bleiben farblos. Kolonien, die Plasmide ohne Insert enthalten, sind
weiterhin zur Produktion von β-Galaktosidase fähig und setzen X-Gal um, wodurch sie eine
blaue Färbung annehmen. Blaue Kolonien scheiden als Rekombinanten aus, wodurch die
Anzahl zu untersuchender Kolonien wesentlich verringert wird.
Plasmide, die in ihrer MCS für lacZ´ kodieren und somit für eine Blau-Weiß-Selektion
geeignet sind, werden im Normalfall nur zur Klonierung und nicht zur Expression genutzt.
Der Vektor pETBlue-1 (Invitrogen) ermöglicht nicht nur die Blau-Weiß-Selektion, sondern
auch eine auf den T7 lac-Promotor basierende Expression. Selektion und Expression
verlaufen getrennt voneinander, da die Expression des insertierten Gens und von lacZ´ über
zwei Promotoren in verschiedene Richtungen verläuft (s. Anhang).
- 20 -
Einleitung
2.5 Thema der Arbeit
Bislang existiert kein extrachromosomales Expressionssystem für das nuo-Operon. Um
Mutagenesestudien zu erleichtern, sollte das gesamte nuo-Operon in den Expressionsvektor
pBAD33 kloniert werden. Zur Verringerung der Ringspannung war eine Klonierung in
mehreren Klonierungsschritten geplant. Um die einzelnen nuo-Gene einer Mutagenese
zugänglich zu machen, sollte ein Subklonsystem erstellt werden, in dem Fragmente des
Operons in Klonierungsvektoren zur Verfügung stehen, die bei einer maximalen Größe von 6
kbp für eine PCR-basierte Mutagenese geeignet sind. In die Subklone sollten verschiedene
Mutationen in nuo-Gene eingeführt und diese anschließend zur Expression der mutierten
Gene in das Expressionsplasmid rückkloniert werden. Es sollten Deletionen einzelner Gene
bzw. Gengruppen, verschiedene Tag-Sequenzen und der Austausch einzelner Aminosäuren in
das nuo-Operon eingeführt werden. Da die genetische Manipulation über Mutagenese und
Klonierung nicht immer zugänglich ist, sollte die sequenzunabhängige Methode der λ-Red
vermittelten Rekombination als Ergänzung zum Subklonsystem etabliert werden.
.
- 21 -
Material und Methoden
3. Material und Methoden
3.1 Medien und Lösungen
LB-Medium
Pepton (Invitrogen)
1 % (w/v)
NaCl (Roth)
1 % (w/v)
Hefeextrakt (AppliChem)
0.5 % (w/v)
Für feste Nährböden: Agar (AppliChem)
2 % (w/v)
LBAmp
LB-Medium + Ampicillin (AppliChem)
100 mg/l
LBKan
LB-Medium + Kanamycin (Merck)
LBCam
LB-Medium + Chloramphenicol (Fluka)
30-60 mg/l
feste Medien
20 mg/l
flüssige Medien 170 mg/l
LBTet
LB-Medium + Tetracyclin (AppliChem)
SOC-Medium
Pepton (Invitrogen)
2 % (w/v)
Hefeextrakt (AppliChem)
TB-Medium
50 mg/l
0.5% (w/v)
NaCl (Roth)
10 mM
KCl (Merck)
2.5 mM
MgSO4.7H2O (Fluka)
10 mM
MgCl2.6H2O (Riedel-de Haën)
10 mM
Glucose (Serva)
20 mM
Pepton (Invitrogen)
1.2 % (w/v)
Hefeextrakt (AppliChem)
2.4 % (w/v)
Glycerin (aus Institutsbeständen)
0.2 % (v/v)
KH2PO4 (Merck)
17 mM
K2HPO4 (Aldrich)
72 mM
- 22 -
Material und Methoden
M9-Medium
Na2HPO4 (Merck)
0.6 % (w/v)
KH2PO4 (Merck)
0.3 % (w/v)
NaCl (Roth)
0.05 % (w/v)
NH4Cl (Riedel-de Haën)
CaCl2 (Fluka)
0.1 mM
MgSO4 (Fluka)
10 mM
Casein (Merck)
0.1 % (w/v)
Tryptophan (Merck)
M46-Medium
0.01 % (w/v)
Mannitol (Serva)
30 mM
Mannitol (Serva)
30 mM
Natriumacetat (Riedel-de Haën)
Casein (Difco)
L-Methionin (Sigma)
0.2 mM
Uracil (Fluka)
0.2 mM
L-Prolin (Sigma)
0.15 mM
1 mM
L-Histidin-HCl (Merck)
0.15 mM
L-Isoleucin (Fluka)
0.3 mM
L-Valin (Merck)
0.3 mM
L-Tryptophan (Aldrich)
0.2 mM
Thiamin (Sigma)
1 µM
Pepton (Invitrogen)
1 % (w/v)
NaCl (Roth)
1 % (w/v)
Hefeextrakt (AppliChem)
DMSO (Roth)
STET-Puffer
4 mM
0.1 % (w/v)
Adenin-HCl (Aldrich)
TSS
0.1 % (w/v)
0.5 % (w/v)
5 % (w/v)
MgSO4 (Fluka)
20 mM
Tris-HCl, pH 8.0 (Merck)
50 mM
EDTA (Roth)
50 mM
Saccharose (Merck)
8 % (w/v)
Triton X-100 (Serva)
5 % (w/v)
- 23 -
Material und Methoden
Puffer P1 (Qiagen)
Tris-HCl, pH 8.0 (Merck)
50 mM
EDTA (Roth)
10 mM
100 µg/ml
RNAse (Qiagen)
Puffer P2 (Qiagen)
NaOH (Roth)
0.2 M
SDS (Serva)
Puffer P3 (Qiagen)
1 % (w/v)
Kaliumacetat, pH 5.5 (Merck)
Tris-Borat, pH 8.3 (Merck)
Biuret-Reagenz
1 mM
NaOH (Roth)
0.2 M
Na-K-Tartrat (Merck)
5 g/l
Cu2SO4 (Merck)
3 g/l
KI (Fluka)
5 g/l
B
B
B
SDS (USB)
8 % (w/v)
Glycerin (aus Institutsbeständen)
Tris-Acetat, pH 6.8 (Merck)
EDTA (Roth)
Blot-Puffer
1M
Bromphenolblau (Merck)
0.3 % (w/v)
Tris-HCl, pH 7.5 (Merck)
25 mM
192 mM
SDS (USB)
0.05 % (w/v)
Methanol (aus Institutsbeständen)
20 % (v/v)
NaCl (Roth)
0.8 % (w/v)
KCl (Merck)
0.02 % (w/v)
Na2HPO4 (Merck)
0.144 % (w/v)
KH2PO4 (Merck)
0.024 % (w/v)
B
B
B
PBST
20 % (w/v)
2.5 mM
Glycin (Roth)
PBS
89 mM
EDTA (Roth)
B
SDS-Probenpuffer
3M
B
B
B
B
B
PBS + Tween 20 (Acros)
- 24 -
0.01 % (w/v)
Material und Methoden
TBE
Tris-Borat, pH 8.3 (Merck)
89 mM
EDTA (Roth)
1 mM
SDS-Kammerpuffer Glycin (Roth)
14 % (w/v)
Tris-Acetat, pH 8.3 (Merck)
3 % (w/v)
SDS (Serva)
0.5 % (w/v)
3.2 Mikroorganismen, Vektoren und Oligonukleotide
Tab. 3-1: Verwendete E. coli Stämme
Stamm
Genotyp
Quelle
DH5α
supE 44 ∆lacU169 (Φ80lacZ∆M15) hsdR17
(Hanahan et al., 1983)
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 re1A1
BL21(DE3)
BF- ompT hsdS (rB- mB-) gal dcm
P
P
B
PB
P
B
(Studier et al., 1986)
P
PB
RosettaBlue(DE3) endA1 hsdR17 (rK12-mK12+) supE44 thi-1
T
P
P
Novagen
P
P
recA1 gyrA96 relA1 lacF' [proA+B+
P
P
P
P
lacIqZ∆M15::Tn10(tetR)] (DE3)pRARE (CmR)
P
P
RR1∆M15
P
P
Fhsd 320 (rB- mB-) recA+ ara-14 pro A2 lac
B
PB
P
B
PB
P
P
P
T
(Bolivar et al., 1977)
1qZ, ∆M15 gal K2 rspL20strR xyl-5 mtl-1 supE
P
P
P
P
44 LambdaP
P
AN387
(Wallace und Young,
1977)
ANN023
AN387, ∆nuoB
Spehr et al., 1996
ANN0221
AN387, ndh::tet; nuoB::nptI
(Böck, 1996)
ANN0222
AN387, ndh::tet; nuoB::nptI-sacB-sacR
(Böck, 1996)
ANN0921
AN387, ndh::tet; nuoI::nptI
(Böck, 1996)
ANN0922
AN387, ndh::tet; nuoI::nptI-sacB-sacR
(Böck, 1996)
ANN003
AN387, 5´nuo::lacI-aadA+-T7-Promotor
(Spehr et al., 1999)
P
P
- 25 -
Material und Methoden
Tab. 3-2: Verwendete Vektoren
Vektor
Quelle
pET11-a
AGS, Heidelberg
pET24-a
Novagen, Darmstadt
pUC18
Biolab, Schwalbach
pBAD33
Guzman et al., 1995
pETBlue-1
Novagen, Darmstadt
pKD46
Datsenko und Wanner, 2000
pCP20
Datsenko und Wanner, 2000
pKD3
Datsenko und Wanner, 2000
pAR1219
Davanloo et al., 1984
pBAD33-nuoB
Flemming, 2003
pASK-IBA3
IBA, Göttingen
Die Vektorkarten von pET11-a/nuoB-G/NuoFC, pBADnuo, pBAD33, pET24-a, pET11-a und
pKD46 sind im Anhang gezeigt.
Tab. 3-3: Verwendete Oligonukleotide. Die Oligonukleotide wurden entweder von MWG
Biotech (Ebersberg) oder von der Hermann GbR (Freiburg) synthetisiert.
Oligonukleotid
Sequenz
N1c-1Pvuf
5´-CAGTTTGCGCCGTCGATCGCCCAGCAATGTTCCATCGGC-3´
N1c-1Pvur
5´-GCCGATGGAACATTGCTGGGCGATCGACGGCGCAAACTG-3´
N1c2
5´-GCATCTGCCAGCAAGCTTCCATCGGCTGTAAC-3´
N1c2r
5´-GTTACAGCCGATGGAAGCTTGCTGGCAGATGC-3´
N1c3
5´-CAATGTTCCATCGGCGCCAACATCAGCC-3´
N1c3r
5´-GGCTGATGTTGGCGCCGATGGAACATTG-3´
N1c4
5´-CACTACTTCCTCGCGGACCGTGGTCGTTTCG-3´
N1c4r
5´-CGAAACGACCACGGTCCGCGAGGAAGTAGTG-3´
pET11M-NdeI
5´-AAGATCCATATGTTACTACCCTGGC-3´
pET11M-NheI
5´-GTCATGCTAGCTTACGGCCTTGTAGTAG-3´
pET11CD-NdeI
5´-CCATTTCATATGGTGAACAATATGACCG-3´
- 26 -
Material und Methoden
Tab. 3-3; Fortsetzung
LambdaCD1-rev
5´-TCTTCGCTTATTCCTAAATCTATTTCGCGAAGCTTACTGCGT
GTAGGCTGGAGCTGCTTC-3´
LambdaCD1-for
5´-AGATAAACAATCAGGTCAGACACCAGGCTGCCGCGGATCG
CATATGAATATCCTCCTTAG-3´
IBA-M-for
5´-GAATAAGGTCTCCAATGTTACTACCCTGGCTAATATTAATT
C-3´
IBA-M-rev
5´-TATTGTGGTCTCGGCGCTCGGCCTTGTTAGTAGTAACGGAA
TTAAC-3´
Lambda-M-L
5´-GCCTTCGCGGTGCATCCGACACTACCCCCAGTCCGAAGAGG
TGTAGGCTGGAGCTGCTTC -3´
Lambda-M-N
5´-CCACTGCTGGATATTGCCAATCGCGGAGTGCGAGGTATCCC
ATATGAATATCCTCCTTAG-3´
StrepC-for
5´-CTCGCCGTTTGAGCTGACCAAAGCCAAACAGGATCTGGAGG
CTAGCTGGAGCCACCCGCAGTTCGAG-3´
StrepC-rev
5´-TCATCCCCCACTCTTCCGGTTTGAAGGTCAGGGCTTCCATTT
ACTTCTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGC-3´
6TagCSD-for
5´-CTCGCCGTTTGAGCTGACCAAAGCCAAACAGGATCTGGAGG
CTGCAGCTGCTGCTGCTAG-3´
6TagCSD-rev
5´-GGCTTCCATTTACTTCTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGCTAGC
AGCAGCAGCTGCAGC-3´
SeqB-Cterm
5´-GCGCGAACGCAAGCGGTG-3´
SeqC-Cterm
5´-CGGCGATCCGCGGCAGC-3´
pUC25-for
5´-CCCAATACGCAAACCGCTCGAGCCTCTCCCCGCGCGTTGG
-3´
pUC25-rev
5´-CCAACGCGCGGGGAGAGGCTCGAGCGGTTTGCGTATTGGG
-3´
24Mred-for
5´-AAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGT
TACTACCCTGGCTAATATTAATTCCC-3´
24Mred-rev
5´-CGGATCCGCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCTT
ACGGCCTTGTAGTAGTAACGG-3´
Leu244Ile-for
5’-CCGCTGCATGGCTGGATCCCGGATGCGCACTC-3’
Leu244Ile-rev
5’-GAGTGCGCATCCGGGATCCAGCCATGCAGCGG-3’
- 27 -
Material und Methoden
Tab. 3-3; Fortsetzung
Asp246Asn-for
5’-GTGGTTCCGCTCCATGGCTGGCTGCCGAATGCGCACTCCCA
G-3’
Asp246Asn-rev
5’-CTGGGAGTGCGCATTCGGCAGCCAGCCATGGAGCGGAACC
AC-3’
-EFG-CD
5´-GGGCAGTATCGATTTTGTTATGTCAGATGTGGACCGCTAAG
TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3´
-EFG-H
5´-AGTTCCGGTGATATCCAACTCATTGTTGTGCCTCCTTGAGCA
TATGAATATCCTCCTTAG-3´
-G-for
5´-TAACCGAATTTCGATTAACGCTCAGTCTCTGACTGAGAAAG
TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3´
-EF-rev
5´-GCCATTAGCATGCTTCCAGTTTTCTCAGTCAGAGACTGAGC
ATATGAATATCCTCCTTAG-3´
3.3 Mikrobiologische Methoden
3.3.1 Anzucht von E. coli
Einzelne Kolonien einer Platte wurden mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers in 4 ml bzw.
50 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überführt und für 16 Std. bei 37°C
bzw. im Fall temperatursensitiver Plasmide bei 30°C geschüttelt. Diese Übernachtkulturen
wurden zur Anzucht von E. coli in größerem Maßstab oder zur Plasmidpräparation
verwendet.
E. coli Zellen wurden je nach benötigter Zellmenge im Litermaßstab oder in 10 l LB-Medium
im Glasfermenter angezogen. Als Zusätze wurden dem Medium 0.01 g/l Eisen-AmmoniumCitrat, 0.05 g/l Riboflavin und 0.02 g/l Natriumsulfid zugegeben. Die Zellen wurden aerob bei
37°C angezogen. Bei Bedarf wurde die Expression bei einer optischen Dichte bei 600 nm
(OD600) von 0.8 in einer 1 l-Kultur bzw. bei einer OD600 von 1.2 bei einer Zucht im 10 l
Fermenter induziert. Die Zellen wurden etwa zwei weitere Stunden bis zum Erreichen der
stationären Phase angezogen, abzentrifugiert (9´000 Upm, Rotor GS-3, 30 min, 4°C, RC-5
- 28 -
Material und Methoden
Centrifuge, Sorvall), mit 50 mM 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES)/50 mM NaCl,
pH 6.0 gewaschen und das Zellsediment bis zur Verwendung bei -80°C aufbewahrt.
3.3.2 Herstellung von Dauerkulturen
Zu 500 µl sterilem 80 % Glycerin wurde 300 µl Bakterienkultur gegeben, gemischt und sofort
in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Dauerkulturen wurden bei -80°C aufbewahrt.
3.3.3 Herstellung kompetenter Zellen
Herstellung elektrokompetenter Zellen:
LB-Medium wurde im Verhältnis 1:100 (v/v) mit einer E. coli Übernachtkultur angeimpft.
Bei einer OD600 von 0.5 bis 0.6 wurden die Zellen im Anzuchtkolben 15 min auf Eis gekühlt
und anschließend für 10 min bei 5´000 Upm abzentrifugiert (4°C, Zentrifuge 5804R,
Eppendorf). Das Sediment wurde in dem Ausgangsvolumen eiskaltem sterilem H2O
resuspendiert und anschließend erneut abzentrifugiert. Dieser Schritt wurde zweimal
wiederholt. Das Sediment der letzten Zentrifugation wurde in dem 1.5 fachen Volumen
eiskaltem 15 % (v/v) Glycerin resuspendiert und anschließend bis zur Verwendung bei -80°C
gelagert. Wurden die Zellen sofort zur Transformation eingesetzt wurden sie in H2O statt
Glycerin resuspendiert.
Transformation durch Elektroporation:
0.1 bis 2.5 µl Plasmid-DNA wurden mit 90 µl elektrokompetenten Zellen vermischt, in eine
Elektroporationsküvette (Eppendorf) mit einem Elektrodenabstand von 1 mm gegeben und im
Elektroporator (Eppendorf, Electroporator 2510) für 5 ms einem Puls von 1´700 V ausgesetzt.
Anschließend wurde sofort 1 ml SOC-Medium zugegeben und die Bakteriensuspension für
1 Std. bei 650 Upm und 30°C bzw. 37°C zur Ausbildung der Antibiotika-Resistenzen
geschüttelt. Die Zellen wurden für 4 min bei 4´000 Upm abzentrifugiert (Eppendorf,
Zentrifuge 5415 D), in 100 µl SOC-Medium resuspendiert und auf LB-Agarplatten mit dem
entsprechenden Antibiotikum ausplattiert.
- 29 -
Material und Methoden
Transformation nach der TSS-Methode:
U
E. coli Zellen wurden aus einer frischen Übernachtkultur angeimpft und bis zu einer OD600
B
B
von 0.3 bis 0.4 bei 37°C angezogen. 1 ml der Zellsuspension wurde bei 3´000 Upm für
10 min zentrifugiert (Zentrifuge 5804R, Eppendorf) und das Sediment in einem Zehntel des
Ausgangsvolumen eiskaltem TSS-Puffer resuspendiert. 1-10 µl DNA wurden mit der
Zellsuspension gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Die Suspension wurde für 45 sec bei
42°C inkubiert und anschließend für 2 min auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 900 µl SOCoder LB-Medium mit 20 mM Glucose wurde für 1 Std. bei 37°C und 650 Upm geschüttelt.
Die Zellen wurden 4 min bei 4´000 Upm abzentrifugiert (Zentrifuge 5804R, Eppendorf) und
das resuspendierte Sediment auf Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert.
3.4 Molekularbiologische Methoden
3.4.1 Analytische Plasmidisolierung mittels „Boiling lysis“
Zur analytischen Plasmidisolierung nach der „Boiling lysis“-Methode (Holmes und Quigley,
1980) wurden 1.5 ml einer E. coli Übernachtkultur für 4 min bei 4´000 Upm abzentrifugiert
(Zentrifuge 5804R, Eppendorf). Das Sediment wurde in 500 µl eiskaltem STET-Puffer
resuspendiert und nach Zugabe von 20 µl Lysozym (50 mg/ml, Fluka) wurden die Proben
zuerst 15 min auf Eis inkubiert und anschließend für 2.5 min in einem kochenden Wasserbad
erhitzt. Die Probe wurde 5 min auf Eis abgekühlt, die denaturierte genomische DNA 10 min
bei 14´000 Upm (Zentrifuge 5804R, Eppendorf) abzentrifugiert und mit einem sterilen
Zahnstocher aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Die verbleibende Plasmid-DNA wurde durch
Zugabe von 500 µl Isopropanol, eine 20 minütige Inkubation bei -20°C und anschließende
Zentrifugation bei 14´000 Upm (15 min, 4°C, Zentrifuge 5804R, Eppendorf) ausgefällt. Das
DNA-Sediment wurde an der Luft getrocknet und anschließend in 40 µl H2O durch Schütteln
B
B
bei 50°C und 1´150 Upm gelöst.
3.4.2 Analytische Plasmidisolierung mittels alkalischer Lyse
2 ml einer E. coli Übernachtkultur wurden 4 min bei 4´000 Upm abzentrifugiert (Zentrifuge
5804R, Eppendorf). Das Sediment wurde in 250 µl P1-Puffer resuspendiert und zur Lyse der
- 30 -
Material und Methoden
Zellen 250 µl P2-Puffer zugegeben. Nach 4 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die
alkalische Suspension mit 250 µl P3-Puffer neutralisiert und 15 bis 30 min bei 4°C inkubiert.
Danach wurde 10 min bei 14´000 Upm (Zentrifuge 5804R, Eppendorf) zentrifugiert und der
Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 750 µl Isopropanol und
20 min Inkubation bei -20°C wurde die Plasmid-DNA 15 min bei 14´000 Upm (Zentrifuge
5804R, Eppendorf) abzentrifugiert, an Luft getrocknet und durch Schütteln bei 50°C und
1´150 Upm in 40 µl H20 resuspendiert.
B
B
3.4.3 Präparative Plasmidisolierung
Plasmide wurden aus E. coli im präparativen Maßstab mit dem QIAGEN Midi Kit (Qiagen,
Hilden) nach Herstellervorschrift isoliert. Hierfür wurden für high copy Plasmide (über 200
Plasmide pro Zelle) 50 ml, für low copy Plasmide (weniger als 50 Plasmide pro Zelle) 100 bis
200 ml einer Übernachtkultur eingesetzt. Bei Plasmiden, die für die Sequenzierung bestimmt
waren, wurde die Suspension nach der Isopropanolfällung für nur 5 min auf Eis inkubiert.
3.4.4 Präparation genomischer DNA
3 ml einer E. coli Übernachtkultur wurden 3 min bei 3´000 Upm abzentrifugiert (Zentrifuge
5804R, Eppendorf) und das Sediment in 200 µl Lysis-Puffer resuspendiert. Nach 10 min
Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Suspension mit 66 µl 5 M NaCl gemischt. Das
Gemisch wurde 10 min bei 17´000 *g bei 4°C zentrifugiert (Zentrifuge 5804R, Eppendorf),
der Überstand mit 266 µl Chloroform versetzt und durch fünfzigmaliges vorsichtiges
Umdrehen des Reaktionsgefäßes gemischt. Nach 3 min Zentrifugation bei 17´000 *g
(Zentrifuge 5804R, Eppendorf) wurde die wässrige Phase mit 266 µl Isopropanol gemischt,
für 10 min bei -20°C inkubiert und die ausgefällte genomische DNA 15 min bei 25´000 *g
abzentrifugiert (Zentrifuge 5804R, Eppendorf). Das Sediment wurde zweimal mit 70 % (v/v)
Ethanol gewaschen, getrocknet und in 30 µl H2O gelöst (Chen und Kuo, 1993).
B
B
3.4.5 Restriktion und Modifikation von DNA
Analytische Restriktionsansätze wurden in 20 µl durchgeführt. Für je 1 µg DNA wurde 1 bis
10 U Restriktionsenzym (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) in dem jeweiligen Restriktionspuffer
- 31 -
Material und Methoden
eingesetzt und nach Herstellervorschriften verdaut. Das Volumen eines präparativen
Restriktionsansatzes betrug 20 bis 60 µl.
DNA-Überhänge wurden mit alkalischer Phosphatase (CIAP, MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
nach Herstellervorschriften dephosphoryliert und mit T4 Polynukleotid Kinase (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot) phosphoryliert. Für Ligationen wurde T4 Ligase eingesetzt (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot). In einem 20 µl Ligationsansatz wurden 50 ng Vektor im molaren
Verhältnis von 1:3 bis 1:5 mit dem zu ligierenden DNA-Fragment gemischt und mit 5 U
Ligase im entsprechenden Puffer über Nacht bei 4°C bzw. für 4 Std. bei Raumtemperatur
inkubiert.
3.4.6 Agarosegelelektrophorese
Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten in einem Größenbereich von 0.6 bis 8 kbp wurden
0.8 % (w/v) Agarosegele in 0.5x TBE mit 500 µg/l Ethidiumbromid verwendet. Die
Fragmente wurden bei einer Spannung von 2 bis 8 V/cm in 0.5x TBE voneinander getrennt
und durch die UV-Fluoreszenz des DNA-Ethidiumbromid-Komplexes bei 254 nm
nachgewiesen. Die Größen der DNA-Fragmente konnten durch gleichzeitige Auftrennung
von DNA-Fragmenten bekannter Größe abgeschätzt werden.
3.4.7 Isolation und Aufreinigung von DNA-Fragmenten
Zur Aufreinigung einzelner DNA-Fragmente wurde die DNA auf einem Agarosegel
aufgetrennt, das aufzureinigende Fragment mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten
und mit dem Novagen SpinPrep Gel DNA Kit (Novagen, Schwalbach) nach
Herstellervorschriften aufgereinigt. PCR-Ansätze wurden mittels des Novagen PCR Clean-up
Kit (Novagen, Schwalbach) nach Herstellervorschrift aufgereinigt. Kleine DNA-Fragmente
bzw. Plasmide wurden durch Zugabe des 0.7-fachen Volumens Isopropanol und eines Zehntel
Volumens 3 M Natriumacetat, pH 5.2 für 20 min bei -20°C ausgefällt und 15 min bei
14´000 Upm (Zentrifuge 5804R, Eppendorf) abzentrifugiert. Nach Trocknen des Sediments
an Luft wurde die DNA durch Schütteln bei 1´400 Upm und 50°C in H2O gelöst. Große
B
B
DNA-Fragmente bzw. Plasmide wurden analog mit dem 2.5 fachen Volumen Ethanol statt
Isopropanol ausgefällt.
- 32 -
Material und Methoden
3.4.8 Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde in 50 µl Ansätzen in dünnwandigen
Reaktionsgefäßen (Biozyme) in einem GeneAmp PCR-System 2400 (Perkin Elmer) oder in
einem Mastercycler (Eppendorf Thermocycler) durchgeführt. In einem PCR-Ansatz wurden
25 bis 150 ng Vorlage-DNA, je 10 bis 100 pmol der beiden Oligonukleotide (Primer), 1 µl
10 mM dNTPs, 5 µl 10x PCR-Puffer (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) und 2.5 U Long PCR
Enzyme
Mix
(MBI
Fermentas,
St.
Leon-Rot)
eingesetzt.
Nach
einem
ersten
Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 bis 5 min wurden 25 bis 30 Zyklen mit den drei Phasen
Denaturierung, Anlagerung der Primer (Annealing) und Elongation durchlaufen. Die DNAStränge wurden bei 94°C für 20 bis 30 sec denaturiert und bei einer Temperatur von 5°C
unterhalb der Schmelztemperatur der Primer für 30 sec zusammengelagert. Die Elongation
erfolgte bei 68°C, wobei pro kb PCR-Produkt eine Elongationszeit von 60 sec gewählt wurde.
Mit dem letzten Elongationsschritt von 7 bis 10 min sollten nicht komplett synthetisierte
DNA-Stränge verlängert werden. Abschließend wurden die Ansätze bis zur weiteren
Benutzung auf 4°C gekühlt. Gegebenenfalls wurde die Vorlage-DNA mit dem
Restriktionsenzym DpnI, das das nicht-methylierte PCR-Produkt nicht abbaut, für 1 Std. bei
37°C verdaut.
Sollten DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 7 kbp amplifiziert werden, wurden
zunächst zehn Zyklen mit den drei oben beschriebenen Phasen durchlaufen, gefolgt von 17
weiteren Zyklen, in denen die Elongation jeweils um 10 bis 20 sec verlängert wurde. Bei nicht
erfolgreicher Amplifikation wurde die Reaktion erneut mit einem Zusatz von 4 % (v/v)
DMSO in dem Ansatz durchgeführt. Gegebenenfalls wurde die MgCl2-Konzentration im
Ansatz von 12.5 bis 30 mM variiert.
Eine analytische PCR wurde sowohl an ganzen Zellen als auch an aufgereinigten Plasmiden
durchgeführt. Es wurde 2.5 U Taq-Polymerase (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) zur
Amplifikation eingesetzt. Bei der Ganzzell-PCR wurde die DNA im ersten Schritt bei 94°C
für 10 min denaturiert, alle darauf folgenden Schritten wurden analog zum allgemeinen PCRProtokoll durchgeführt.
- 33 -
Material und Methoden
3.4.9 Einführung von Punktmutationen mittels ortsgerichteter Mutagenese
Zur Einführung von Punktmutationen wurde das QuikChange® II Site-Directed Mutagenesis
Kit (Stratagene) nach Herstellerangaben verwendet. Alternativ wurde eine Mutagenese-PCR
mit dem Expand Long Template PCR System (Roche) durchgeführt, die Template-DNA mit
dem Restriktionsenzym DpnI verdaut und das PCR-Produkt nach Aufreinigung mittels
Elektroporation in elektrokompetente E. coli Zellen transformiert. Um die mutierten Plasmide
von den Wildtyp-Plasmiden zu unterscheiden, wurden die Mutagenese-Primer so gewählt,
dass durch die Mutagenese eine Restriktionsschnittstelle eingefügt oder entfernt wurde.
3.4.10 Weitere molekularbiologische Methoden
Plasmid-DNA wurde von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) sequenziert. Zur
Klonierung in ein Cosmid und zur Transformation in E. coli wurden große Fragmente mit
dem Expand cloning Kit (Roche) nach Herstellerangaben in Phagen verpackt.
3.5 Proteinchemische Methoden
3.5.1 Isolierung der Plasmamembranen
Zur Isolation von Plasmamembranen wurden E. coli Zellen im 2.5fachen Volumen
50 mM MES/NaOH, pH 6.0, 50 mM NaCl unter Zusatz von 200 µl 0.1 M
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma), einer Spatelspitze DNase (Boehringer) und
einer Spatelspitze Lysozym (Fluka) in einem Teflon-in-Glas-Homogenisator homogenisiert.
Dabei entstandener Schaum wurde durch Zugabe von möglichst wenig Antischaum-Emulsion
(Antifoam 204, Sigma) entfernt. Alle weiteren Schritte erfolgten bei 4°C. Die Zellen wurden
in einem Durchgang in der „French Press“ (SML Aminco) bei 110 MPa aufgeschlossen.
Zelltrümmer und nicht aufgeschlossene Zellen wurden durch eine 20minütige Zentrifugation
bei 36´000 *g (16´000 Upm, Rotor 8.24, RC-5 Superspeed Refrigerated Centrifuge, Sorvall)
abgetrennt. Durch eine weitere Zentrifugation für 1 Std. bei 250´000 *g (50´000 Upm, Rotor
60Ti, L8-70M Ultrazentrifuge, Beckman) wurden die Membranen sedimentiert. Das
Membransediment wurde in 1 ml/g 50 mM MES/NaOH, pH 6.0 resuspendiert und
gegebenenfalls bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert.
- 34 -
Material und Methoden
3.5.2 Isolierung des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo
Der E. coli Doppeldeletionsstamm ANN0221 enthält weder Komplex I noch die alternative
NADH Dehydrogenase, da das ndh-Gen durch Insertion einer Tetracyclin-Resistenzkassette
und das nuoB-Gen durch eine Kanamycin-Resistenzkassette zerstört wurden (Böck, 1996). In
diesem Stamm wurden die nuo-Gene auf dem Plasmid pBADnuo eingebracht und von dem
Plasmid exprimiert. Dieser Stamm wurde in einem 10 l- Fermenter angezogen und die Zellen
bis zu ihrer Verwendung bei -80°C gelagert.
Für eine Präparation des Komplex I aus diesem Stamm wurden 60 bis 70 g Zellen
(Feuchtgewicht) in 250 ml 50 mM MES/NaOH, pH 6.0 unter Zusatz von 200 µl PMSF
(0.1 M in Isopropanol, Sigma), 0.5 g Lysozym
(Fluka) und einer Spatelspitze DNase
(Boehringer) resuspendiert und wie oben beschrieben die Plasmamembranen hergestellt. Die
Membranen wurden in einen Teflon-in-Glas-Homogenisator überführt und ihr Gewicht
bestimmt. Zur Extraktion von Komplex I aus den Membranen wurde je g Zellen 1 ml 50 mM
MES/NaOH, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 6.0 (A*-Puffer), 4 µl 0.1 M PMSF und soviel
B
B
einer 20 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-maltopyranosidlösung (DDM, Glycon) zugegeben, wie zur
Einstellung einer Endkonzentration von 3 % Detergenz nötig war. Die Suspension wurde
vorsichtig homogenisiert und für 10 min inkubiert. Nach Zentrifugation bei 250´000 *g
(50´000 Upm, Rotor 60Ti, L8-70M Ultrazentrifuge, Beckman) für 20 min wurde der
Überstand mit 7 ml/min auf eine 80 ml Anionentauscher-Chromatographie Source15 Q (26
mm x 400 mm; Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl,
0.1 % (w/v) DDM, pH 6.0 (ADM-Puffer) äquilibriert worden war. Gebundene Proteine wurden
B
B
mit einem linearen 700 ml Gradienten von 50 mM NaCl bis 350 mM NaCl in 50 mM
MES/NaOH, 0.1 % (w/v) DDM, pH 6.0 bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 ml/min eluiert.
Die Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität, einer artefiziellen Aktivität des
peripheren Arms des Komplexes, wurden vereinigt. Die Proteine wurden durch Zugabe einer
50 % (w/v) Polyethylenglycol 4´000-Lösung in ADM-Puffer (PEG, Boehringer) bei einer
B
B
PEG-Endkonzentration von 9 % unter 10 min rühren auf Eis ausgefällt. Das ausgefällte
Protein wurde für 5 min bei 12´000 *g (10´000 Upm, Rotor 8.24, RC-5 Superspeed
Refrigerated Centrifuge, Sorvall) abzentrifugiert, das Sediment zweimal mit H2O gewaschen
B
B
und in 1 ml A*DM-Puffer unter Rühren resuspendiert. Die so aufkonzentrierte Proteinlösung
B
B
wurde auf eine 450 ml Größenausschluss-Chromatographiesäule (26 mm x 850 mm Sephacryl
S300, Amersham Biosciences) aufgetragen, die mit A*DM-Puffer äquilibriert worden war. Die
B
- 35 -
B
Material und Methoden
Proteine wurden in A*DM-Puffer mit einer Flussgeschwindigkeit von 20 ml/Std. bei einer
Fraktionsgröße von 1.75 ml eluiert. Die Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität
wurden vereinigt und bei -80°C gelagert.
3.5.3 Isolierung des Komplex I über Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin
Die DNA-Sequenz, die für das StrepTag II kodiert, wurde in pBADnuo jeweils an die Gene
nuoB, nuoC und nuoF angefügt, so dass die entsprechenden Proteine C-terminal mit dem
Affinitätspeptid
versehen
waren.
Das
so
modifizierte
Plasmid
wurde
in
den
Doppeldeletionsstamm ANN0221 transformiert und die nuo-Gene von pBADnuo exprimiert.
Die Zellen wurden in 1 l-Kolben bzw. im 10 l-Fermenter angezogen
und bis zu ihrer
Verwendung bei -80°C gelagert.
Aus 30 g Zellen wurden wie oben beschrieben Plasmamembranen hergestellt. Die
Membranen wurden in 1 ml 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, pH 6.0 pro g Membran mit
50 µl PMSF (0.1 M in Isopropanol) resuspendiert. Pro ml Lösung wurde zur Extraktion der
Membranproteine 0.175 ml 20 % (w/v) DDM zugesetzt. Nach 10 min Inkubation wurde
20 min bei 250´000*g (50´000 Upm, Rotor 60Ti, L8-70M Ultrazentrifuge, Beckman)
zentrifugiert und der Überstand mit 6 ml/min auf eine 20 ml Source15 Q (50 mm x 75 mm;
Pharmacia Biotech) aufgetragen, die mit ADM-Puffer äquilibriert worden war. Die Proteine
wurden mit einem linearen 160 ml Gradienten von 150 mM NaCl bis 350 mM NaCl in
50 mM MES/NaOH, 0.1 % (w/v) DDM, pH 6.0 eluiert. Fraktionen mit NADH/Ferricyanid
Reduktaseaktivität wurden vereinigt und auf eine 20 ml StrepTactin-Sepharosesäule (50 mm x
75 mm; Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Säule wurde mit ADM-Puffer gespült, bis die
Absorbanz bei 280 nm auf das Grundniveau zurückgegangen war. Die gebundenen Proteine
wurden mit 2.5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) in ADM-Puffer eluiert. Fraktionen mit
NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität wurden vereinigt und bis zur Verwendung bei -80°C
gelagert. Das Säulenmaterial wurde mit 1 mM 4-Hydroxylbenzen-2-carboxylsäure (HABA,
IBA) in ADM-Puffer regeneriert.
- 36 -
Material und Methoden
3.5.4 Aufreinigung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes über eine AffinitätsChromatographie an StrepTactin
20 g Zellen des E. coli Stammes BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFC wurden in 60 ml
B
B
50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, pH 6.0, 20 µg Avidin, 10 µg/ml DNaseI (Boehringer), mit
einer Tablette Proteaseinhibitor (Complete, Boehringer) in einem Teflon-in-GlasHomogenisator resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem einmaligen Durchgang in der
„French Press“ (SLM Aminco) bei 110 MPa aufgeschlossen und das Cytoplasma durch
Ultrazentrifugation für 1 Std. bei 250´000*g (50´000 Upm, Rotor 60Ti, L8-70M
Ultrazentrifuge, Beckman) erhalten. Das Cytoplasma wurde auf eine 50 ml DEAESepharosesäule (28 x 100 mm, Pharmacia) aufgetragen, die mit 50 mM MES/NaOH, 50 mM
NaCl, pH 6.0 äquilibriert worden war. Die gebundenen Proteine wurden in einem linearen
400 ml Gradienten von 50 mM NaCl bis 400 mM NaCl in 50 mM MES/NaOH, pH 6.0
eluiert. Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität wurden vereinigt und der pH
entweder mit 0.1 N oder 1 N NaOH unter Rühren auf Eis auf 7.0 eingestellt. Die Probe wurde
auf eine 5 ml StrepTactin-Sepharose-Säule (7 x 65 mm, IBA) aufgetragen, die mit 100 mM
Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0 äquilibriert worden war. Das NADH-Dehydrogenase
Fragment wurde mit 2.5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) in 100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA,
pH 7.0 eluiert. Die Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität wurden vereinigt,
durch Ultrafiltration (Centricon 100, Amicon) aufkonzentriert und bei -80°C gelagert. Das
Säulenmaterial wurde mit 1 mM HABA regeneriert.
3.5.5 Verschiedene analytische Methoden
Proteinbestimmungen:
U
Die Proteinkonzentration wurde nach der Biuret-Methode (Beisenherz et al., 1953) bestimmt.
Hierzu wurde 10 µl bis 50 µl Probe mit 1 ml 6% Trichloressigsäure versetzt und die
denaturierten Proteine für 1 min bei 13´200 Upm
(Zentrifuge 5415D, Eppendorf)
abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment in 1 ml Biuret-Reagenz
unter Schütteln und bei 1´400 Upm bei Raumtemperatur für 30 min resuspendiert. Die
Absorption der Proben bei 546 nm wurde gemessen. Nach Entfärbung der Proben durch
Zugabe von einigen Körnchen KCN wurde die Absorption bei 546 nm erneut vermessen und
als Hintergrund, bedingt durch die Trübung durch Lipide, abgezogen. Aus der so bestimmten
- 37 -
Material und Methoden
Absorbanz wurde die Proteinmenge anhand einer zuvor aufgenommenen Eichgerade mit
verschiedenen Mengen Rinderserumalbumin (Sigma) als Standard abgelesen.
Die Konzentration des isolierten Komplex I wurde durch Messung der Absorbanz der Probe
bei 278 nm (Ultrospec 1000; Pharmacia Biotech) bestimmt. Der Extinktionskoeffizient von
Komplex I bei 278 nm (ε = 760 mM-1cm-1) wurde aus der von der DNA abgeleiteten
P
P
P
P
Aminosäuresequenz mit Inkrementen für Tyrosin, Tryptophan und Cystin berechnet (Gill und
von Hippel, 1989). Die Proteinkonzentration wurde aus der gemessenen Absorbanz nach dem
Lambert-Beer´schen Gesetz berechnet.
Zuckergradientenzentrifugation:
U
Die Assemblierung des Komplex I in den einzelnen E. coli Stämmen wurde mittels
Zuckerdichtegradienten-Zentrifugation untersucht. Dazu wurden die Membranproteine der
isolierten Cytoplasmamembranen mit DDM in einer Endkonzentration von 3 % (w/v)
solubilisiert
und
nicht
lösliche
Bestandteile
durch
Zentrifugation
bei
20´000*g
(Kühlzentrifuge Sorvall Instruments RC-5, Rotor A 8.24, 16´000 Upm, 4°C) abgetrennt. Die
Suspension wurde auf einen Zuckergradienten von 5-25 % (w/v) Saccharose in ADM-Puffer
B
B
aufgetragen und 16 Std. bei 180´000 *g zentrifugiert (Ultrazentrifuge Beckman L8-70M,
Rotor Ti 70, 36´000 Upm, 4°C). Die Gradienten wurden in 600 µl Portionen fraktioniert und
deren NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität bestimmt. Da nur Komplex I in einem
Molekulargewichtsbereich über 200 kDa diese Aktivität aufweist, weist ein Aktivitätsgipfel
im letzten Drittel des Gradienten auf einen vollständig assemblierten Komplex I hin.
Bestimmung der NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität:
U
Zu 1 ml 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, 1 mM K3[Fe(CN)6], pH 6.0 wurden 0.2 mM
B
B
B
B
NADH gegeben. Nach Zugabe von 5 bis 20 µl Probe wurde die zeitliche Änderung der
Absorbanz bei 410 nm bei Raumtemperatur gemessen (Ultrospec 1000; Pharmacia Biotech).
Der molare Extinktionskoeffizient von K3[Fe(CN)6] beträgt ε = 1 mM-1cm-1 (Friedrich et al.,
B
B
B
B
P
P
P
P
1989).
Bestimmung der Atmungsaktivität:
U
Die (d-)NADH-Oxidase Aktivität der E. coli Plasmamembranen wurde durch Messung des
Sauerstoffverbrauchs mit einer Clark-Sauerstoffelektrode bestimmt. Als Probenpuffer wurde
50 mM MES/NaOH, pH 6.0 verwendet, das Gesamtvolumen in der Probenkammer betrug
- 38 -
Material und Methoden
1 ml. Die Aktivität wurde bei 30°C gemessen. Zur Eichung der Elektrode wurde der
Stromfluss in O2-gesättigtem Puffer und nach Reduktion des O2 durch Zugabe eines
Überschusses Natriumdithionit gemessen. Die gemessene Differenz entspricht nach der
Löslichkeit von O2 in H2O bei 30°C 237 µM O2. Es wurden 5 bis 20 µl Membransuspension
eingesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl einer 0.1 M NADH (Gerbu) bzw.
d-NADH (Sigma) Lösung gestartet und der Verlauf der Sauerstoffabnahme mit einem
Schreiber registriert.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE):
Es wurden diskontinuierliche Laemmli-Gele mit 3 %igem Sammel- und 16 %igem Trenngel
verwendet (Laemmli, 1970). Je nach Proteinmenge wurden 5 bis 30 µl Probe mit 5 bis 10 µl
Probenpuffer versetzt und 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Proteine wurden bei
einer Stromstärke von 30 mA aufgetrennt und die Proteinbanden durch Färbung in
Coomassie-Blau-Lösung und anschließende Entfärbung in 30 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v)
Essigsäure sichtbar gemacht.
Silberfärbung von SDS-Gelen:
SDS-Gele wurden zur Silberfärbung für mindestens 1 Std. in 10 % Essigsäure und 30 %
Ethanol fixiert. Die Gele wurden dreimal mit 30 % Ethanol für 15 min gewaschen, bevor sie
in 200 mg/l Na2S2O3.6 H2O für 1 min sensibilisiert wurden. Nach Waschen mit destilliertem
H2O für zweimal 30 sec wurden die Gele mit 2 g/l AgNO3, 0.0125 % (v/v) Formaldehyd für
25 min imprägniert. Anschließend wurde zweimal für 20 sec mit destilliertem H2O gewaschen
und mit 60 g/l Na2CO3, 200 mg/l Na2S2O3.6 H2O, 0.05 % (v/v) Formaldehyd bis zur
deutlichen Färbung der Proteinbanden entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe
konzentrierter Essigsäure gestoppt.
Western Blot-Analyse:
Nach ihrer gelelektrophoretischen Auftrennung wurden einzelne Proteine über eine Western
Blot-Analyse nachgewiesen. Dazu wurden die Proteine in einer Tank-Blot-Apparatur in BlotPuffer bei 4°C und 400 mA je nach Größe des Proteins für 1 bis 2 Std. aus dem
Polyacrylamid-Gel auf Cellulosenitrat-Membranen (Schleicher & Schüll) transferiert (Towbin
et al., 1979). Alle weiteren Inkubationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur auf einem
Kippschüttler. Die Membranen wurden für 1 Std. in PBS mit 3 % (w/v) Magermilchpulver
(Glücksklee) geschüttelt, um freie Bindeplätze der Membran abzudecken und anschließend
- 39 -
Material und Methoden
5 min mit PBST gewaschen. Die Membran wurde mit Antikörpern einer Verdünnung von
1:500 in PBST für 2 Std. inkubiert. Anschließend wurde zweimal für 5 min mit PBST
gewaschen, um überschüssige Antikörper zu entfernen und für 1 Std. in PBST mit 1:5´000
verdünnter Protein A-gekoppelter Meerrettich-Peroxidase (Bio-Rad) inkubiert. Daraufhin
wurden die Membranen je zweimal für 5 min erst mit PBS, anschließend mit 25 mM NaPhosphat, pH 7.2 gewaschen. Die gebundenen Zweit-Antikörper wurden durch Inkubation mit
25 mM Na-Phosphat, pH 7.2, 0,05 % (w/v) 3.3´-Diaminobenzidin (Sigma), 0.03 % (w/v)
NiSO4, 0.03 % (w/v) CoCl2 und 0.1 % H202 sichtbar gemacht (De Blas und Cerwinski, 1983).
B
B
B
B
B
B
B
B
ESR-Spektroskopie:
U
ESR-Spektren wurden in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Thorsten Friedrich aufgenommen.
Proben wurden zur Messung auf 300 µl aufkonzentriert. Das aufgereinigte NADHDehydrogenase Fragment wurde in Gegenwart von Redoxmediatoren mit Dithionit reduziert.
Cytoplasma-Proben wurden mit 20 mM NADH (Endkonzentration) reduziert. Zum Vergleich
wurde ein Aliquot des Cytoplasmas mit dem gleichen Volumen Puffer verdünnt. Für die
Differenzspektroskopie wurde das ESR-Spektrum dieser Probe von dem der reduzierten
Probe
abgezogen.
Die
Proben
wurden
zunächst
in
einer
1:5
(v/v)
Isopentan/Methylcyclohexan-Kältemischung bei 150 K und anschließend in flüssigem
Stickstoff gefroren und bis zur Messung bei -80°C gelagert. Tieftemperatur-ESR-Messungen
wurden mit einem Bruker EMX 1/6 Spektrometer durchgeführt. Die Probentemperatur wurde
mit einem ESR-9 Helium-Kryostaten (Oxford Instruments) kontrolliert. Das Magnetfeld
wurde mit einem Bruker Standard geeicht. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.461 GHz, die
Modulationsamplitude 6 G, die Zeitkonstante 164 ms und die Aufnahmegeschwindigkeit
17.9 mT/min.
Permeabilisierung ganzer Zellen:
U
4 g Zellen wurden mit 100 ml 50 mM MES, 50 mM KCl, pH 6.0 gewaschen und das
Sediment in 50 ml 50 mM MES, 50 mM KCl, pH 6.0 resuspendiert. Die Suspension wurde
18 Std. bei Raumtemperatur leicht gerührt. Nach 10 min Zentrifugation bei 10´000 Upm
(Zentrifuge 5804R, Eppendorf) wurde das Sediment in 10 ml 50 mM MES, 50 mM KCl,
pH 6.0 resuspendiert, mit 300 µl Toluol versetzt und 30 min bei 4°C gerührt. Nach erneuter
Zentrifugation für 10 min bei 10´000 Upm (Zentrifuge 5804R, Eppendorf) wurde das
Sediment wiederum in 10 ml 50 mM MES, 50 mM KCl, pH 6.0 resuspendiert, 300 µl Toluol
zugegeben und 30 min bei 4°C gerührt. Daraufhin wurden die Zellen dreimal mit je 50 ml
- 40 -
Material und Methoden
50 mM MES, 50 mM KCl, pH 6.0 wie oben beschrieben gewaschen, anschließend in 5 ml
50 mM MES, 50 mM KCl, pH 6.0 resuspendiert und bei -80°C gelagert.
- 41 -
Ergebnisse
4. Ergebnisse
4.1 Klonierung des extrachromosomalen Expressionssystems pBADnuo
Die chromosomale DNA des Komplex I Überproduktionsstammes ANN003/pAR1219 (Spehr
et al., 1999) wurde isoliert und daraus das nuo-Operon mit dem Restriktionsenzym ScaI
herausgeschnitten. Die DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel aufgetrennt und ein
27´866 bp großes Fragment, welches das nuo-Operon enthält, durch Gelelution aufgereinigt.
Es wurde in das Cosmid III (Roche) ligiert und mittels einer Phagenverpackung (Expand
cloning kit, Roche) in E. coli eingeführt. Das Konstrukt wird im Folgenden als ScaCos
bezeichnet und enthält das nuo-Operon, zwei T7-Promotoren sowie eine Ampicillin- und
Spectinomycin-Resistenz. Es ist aber aufgrund der falschen Lage der Promotoren nicht zur
Expression des nuo-Operons geeignet. Daher sollte das nuo-Operon von dem Cosmid ScaCos
in das Plasmid pBAD33, das einen Arabinose-Promotor enthält, umkloniert werden. Zunächst
wurde ein Konstrukt kloniert, in dem beide T7-Promotoren gegen einen Arabinose-Promotor
aus dem Plasmid pBAD33 ausgetauscht wurden. Um den Beginn des nuo-Operons optimal
zum Promotor auszurichten, wurde er mittels PCR amplifiziert und dabei stromaufwärts vor
nuoA eine NsiI-Schnittstelle eingefügt (Abb. 4-1). Das PCR-Produkt, das die Gene nuoA und
nuoB enthält, wurde mit den Restriktionsenzymen NsiI und SmaI geschnitten und in den mit
SmaI verdauten Vektor pUC18 kloniert. Dieses Konstrukt wurde mit pUCPCR-AB
bezeichnet. Aus dem Cosmid ScaCos wurden weitere nuo-Gene (nuoC-F und der Beginn von
nuoG, bezeichnet als nuoG´) mit SmaI herausgeschnitten und in pUCPCR-AB eingefügt. In
das resultierende Konstrukt pABS1 wurde der Arabinose-Promotor aus pBAD33 unter
Verwendung der Restriktionsenzyme NsiI und PstI eingefügt. Das entstandene Konstrukt
wurde mit pPromABS bezeichnet und enthält den Arabinose-Promotor und den Beginn des
nuo-Operons bis zum Gen nuoG´ (Abb. 4-1).
- 42 -
Ergebnisse
Abb. 4-1: Klonierung des Plasmids pPromABS, das den Arabinose-Promotor des Plasmids
pBAD33 und den Beginn des nuo-Operons mit den Genen nuoA-nuoG´ enthält.
Ausgangspunkt ist das Konstrukt ScaCos, das das mit ScaI einklonierte nuo-Operon enthält.
Die folgenden Klonierungsschritte dienten zur korrekten Positionierung des ArabinosePromotors stromaufwärts zum nuo-Operon.
Die restlichen Gene des nuo-Operons wurden in weiteren Klonierungsschritten eingefügt. Der
Arabinose-Regulator und -Promotor und der im Leseraster gelegene Beginn des nuo-Operons
wurden aus pPromABS mit den Restriktionsenzymen NsiI und BglII herausgeschnitten und in
das mit NsiI und BamHI geschnittene Plasmid pBAD33 umkloniert, so dass der
Promotorbereich von pBAD33 gegen den Promotor mit dem Beginn des nuo-Operons
- 43 -
Ergebnisse
ausgetauscht wurde (Abb. 4-2). Dieses Konstrukt wurde als pBADProm bezeichnet Die
fehlenden nuo-Gene wurden aus dem Cosmid ScaCos eingefügt. Hierfür wurde pBADProm
mit PstI geschnitten, die überhängenden Enden enzymatisch durch das Klenow-Fragment
geglättet und anschließend mit SgfI geschnitten. Das Konstrukt ScaCos wurde mit EcoO109I
geschnitten, mit dem Klenow-Fragment geglättet und anschließend mit SgfI verdaut. Das
resultierende 12´706 bp große Fragment wurde mit dem 8´572 bp großen DNA-Fragment aus
pBADProm ligiert (Abb. 4-2).
Abb. 4-2: Klonierung des Plasmids pBADnuo, ausgehend von den Plasmiden pBAD33 und
pPromABS, das den Arabinose-Promotor im Leseraster des Starts des nuo-Operons enthält.
Nach Austausch des Promotorbereichs aus pBAD33 gegen den aus pPromABS wurden die
restlichen nuo-Gene von dem Cosmid ScaCos in das Plasmid pBADProm eingefügt.
Der
Ligationsansatz
der
DNA-Fragmente
pBADProm/PstI(blunt)+SgfI
und
ScaCos/EcoO109I(blunt)+SgfI wurde in die E. coli Stämme RR1∆M15 und BL21(DE3)
transformiert. Aus den Transformanden wurde mit einer Mini-Präparation die Plasmid-DNA
aufgereinigt und mit einer Restriktionsanalyse untersucht. Es zeigte sich, dass die PlasmidDNA von fast allen Restriktionsenzymen auch bei geringen Enzymkonzentrationen zersetzt
wurde. Bei der Auftrennung der Restriktionsansätze auf einem Agarosegel wurde bei
verschiedenen Ansätzen nur ein Gemisch von DNA-Fragmenten aller Größen detektiert. Nur
- 44 -
Ergebnisse
bei dem Restriktionsenzym KpnI wurde in mehreren Plasmid-Präparationen das erwartete
Restriktionsmuster des Plasmids pBADnuo festgestellt (Abb. 4-3).
Abb. 4-3: Restriktionsanalyse mit KpnI nach Ligation der DNA-Fragmente
pBADProm/PstI(blunt)+SgfI und ScaCos/EcoO109I(blunt)+SgfI zur Klonierung des Plasmids
pBADnuo. Im Fall der gelungenen Klonierung wurden Fragmentgrößen von 12´342 bp und
8´936 bp erwartet (Spur 1, mit Pfeilen gekennzeichnet). Als Standard wurde pUC-Mix 4
(MBI Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet (pUC4).
Da nur bei der Restriktionsanalyse mit dem Enzym KpnI die erwarteten Fragmente erhalten
wurden, bei Verwendung anderer Restriktionsenzyme die Plasmid-DNA abgebaut wurde, ist
zu vermuten, dass dies aus der hohen Ringspannung des 21´278 bp großen Plasmids resultiert
oder aber Verunreinigungen der Präparation sich störend bei einer Restriktion der Plasmide
auswirken. Die Plasmide, die bei dem Schnitt mit KpnI das erwartete Restriktionsmuster
zeigten, wurden nach verschiedenen Methoden im Mini- und auch im Midi-Maßstab
präpariert, um möglicherweise störende Einflüsse von Verunreinigungen der Mini-Präparation
auszuschliessen. Die Plasmid-DNA dieser Präparationen wurden durch alle verwendeten
Restriktionsenzyme außer KpnI abgebaut. Hieraus wurde geschlossen, dass die Ringspannung
der Plasmid-DNA der Grund für den unspezifischen Abbau ist.
Das Plasmid pBADnuo wurde in E. coli DH5α transformiert, aus den Transformanden die
Plasmide präpariert und mittels Restriktionsanalyse untersucht. Es wurde eine Kolonie
erhalten, deren Plasmide mit verschiedenen Restriktionsenzymen das jeweils erwartete
Restriktionsmuster des Plasmids pBADnuo zeigten (Tab. 4-1, Abb. 4-4). Gegenüber den
- 45 -
Ergebnisse
vorher genutzten B-Stämmen BL21(DE3) und RR1∆M15 zeigt sich der K12-Stamm DH5α
zur Vermeidung hoher Ringspannungen geeignet.
Tab. 4-1: Erwartete Fragmentgrößen des Plasmids pBADnuo nach Restriktionsanalyse mit
verschiedenen Restriktionsenzymen.
Restriktionsenzym
Fragmentgrößen
[bp]
NcoI
14´036
5´903
1´339
HindIII
10´938
6´549
2´710
1´081
EcoRV
7´331
5´643
5´320
1´573
1´411
PstI
17´229
4´049
KpnI
12´342
8´936
NheI
18´993
2´285
- 46 -
Ergebnisse
Abb. 4-4: Restriktionsanalyse der Transformanden des Plasmids pBADnuo in E. coli DH5α.
Das jeweils verwendete Restriktionsenzym ist angegeben. Die erwarteten Fragmentgrößen
finden sich in Tab. 4-1. Als Standard wurde pUC-Mix 4 (pUC4; MBI Fermentas, St. LeonRot) aufgetragen.
4.2 Produktion von Komplex I vom Plasmid pBADnuo
Das Plasmid pBADnuo soll hauptsächlich zu Mutagenesestudien des E. coli Komplex I
eingesetzt werden. Zu diesem Zweck muss die Expression der Gene des nuo-Operons, die
korrekte und vollständige Assemblierung des Komplexes und eine möglichst große
Proteinproduktion gewährleistet sein. Weiterhin sollte der Stamm, in dem das Plasmid
exprimiert wird, keine chromosomale Kopie des nuo-Operons enthalten. Um dies zu
überprüfen, wurden von den jeweiligen Transformanden Wachstumskurven in Mangelmedien
aufgenommen, die Atmungsaktivität der Plasmamembranen gemessen und die Stabilität des
Komplexes nach Detergenzextraktion in einem Saccharosegradienten überprüft.
4.2.1 Wachstumskurven von nuo/ndh-Doppeldeletionsstämmen mit pBADnuo
Um bei der Expression des nuo-Operons vom Plasmid pBADnuo eine Hintergrundaktivität
der chromosomalen nuo-Kopie auszuschließen, sollten E. coli Stämme verwendet werden, die
keinen Komplex I produzieren. Es wurden Stämme aus Arbeitsgruppenbeständen benutzt, bei
denen in nuoB (ANN0221, ANN0222) bzw. nuoI (ANN0921, ANN0922) eine KanamycinResistenzkassette insertiert worden war. Durch diese Insertion wird die Transkription
stromabwärts gelegener Gene verhindert und der Komplex I assembliert nicht (Böck, 1996).
- 47 -
Ergebnisse
Alle vier Stämme tragen außerdem eine Tetracyclin-Resistenzkassette in dem Gen ndh, das
für die alternative NADH-Dehydrogenase kodiert und ebenfalls nicht transkribiert wird
(Böck, 1996). Das Plasmid pBADnuo wurde in diese vier Doppeldeletionsstämme
transformiert und von den Transformanden Wachstumskurven in Mangelmedium
aufgenommen. Es wurde erwartet, dass die Doppeldeletionsstämme ohne membranständige
NADH-Dehydrogenasen
in
Mangelmedium
kaum
Wachstum
zeigen,
während
Deletionsstämme mit dem Plasmid pBADnuo bei korrekter Produktion des Komplexes auch
in Mangelmedium wie der Wildtyp AN387 wachsen sollten (Abb. 4-5).
Abb. 4-5: Anzucht von zehn Kolonien des E. coli Stammes AN387 auf LB-Medium (links)
und M46/Mannitol-Medium (rechts).
Die Doppeldeletionsstämme ANN0221, ANN0222, ANN0921 und ANN0922, die aus acht
Jahre alten Stammkulturen angeimpft wurden, wurden zunächst daraufhin überprüft, ob sie
auf M46-Mangelmedium mit 20 mM Mannitol tatsächlich ein verlangsamtes Wachstum
zeigten. Die Stämme wurden auf LB-Medium vereinzelt und jeweils 10 Kolonien auf
M46/Mannitol-Medium überimpft. Von diesen Kolonien wurde je eine augewählt, die auf
Mangelmedium schlechtes und auf LB-Medium gutes Wachstum zeigte (Abb. 4-6). Als
Vergleich wurde der Wildtyp-E. coli-Stamm AN387 (Abb. 4-5) sowie der Komplex IÜberproduktionsstamm ANN003/pAR1219 (Abb. 4-7) ebenfalls auf Mangelmedium und LBMedium gezogen. Im Fall des Überproduktionsstammes wurde dem Medium IPTG zur
Induktion der Komplex I-Produktion zugesetzt (Abb. 4-7). Auf den Platten mit Kolonien der
Stämme AN387 und ANN003/pAR1219 war deutlich zu sehen, dass sich das Wachstum der
Zellen auf Mangelmedium nur wenig von dem auf LB-Medium unterscheidet (Abb. 4-5, 4-7).
- 48 -
Ergebnisse
Abb. 4-6: Anzucht einzelner Kolonien der E. coli Stämme ANN0221 (links oben), ANN0222
(rechts oben), ANN0921 (links unten) und ANN0922 (rechts unten) auf (a) LB-Medium und
(b) M46/Mannitol-Mangelmedium.
Abb. 4-7: Wachstum von zehn Kolonien des E. coli-Stammes ANN003/pAR1219 auf LBMedium mit 0.1 % (w/v) IPTG (links) und M46/Mannitol-Mangelmedium (rechts).
Alle Kolonien der Doppeldeletionsstämme ANN0221, ANN0222 und ANN0922 zeigten auf
Mangelmedium auch nach 60 Std. Inkubation bei 37°C nahezu kein Wachstum, während sie
auf LB-Medium normal wuchsen. Allerdings zeigten nur vier Kolonien des Stammes
ANN0921 ein verlangsamtes Wachstum, während die übrigen Kolonien vergleichbar schnell
wie auf LB-Medium wuchsen (Abb. 4-6). Von den Kolonien, die auf M46/MannitolMangelmedium ein geringes und auf LB-Medium ein gutes Wachstum zeigten, wurde jeweils
eine Übernachtkultur angesetzt. Diese Kulturen wurden zur Herstellung von Dauerkulturen
- 49 -
Ergebnisse
sowie elektrokompetenter Zellen verwendet. Das Plasmid pBADnuo wurde durch
Elektroporation
in
diese
Zellen
transformiert.
Die
resultierenden
Stämme
ANN0221/pBADnuo, ANN0222/pBADnuo, ANN0921/pBADnuo, ANN0922/pBADnuo
wurden 1:100 in M9-Mangelmedium mit 20 mM Mannitol angeimpft. Die Expression der
nuo-Gene wurde mit 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose induziert und Wachstumskurven der
einzelnen Stämme aufgenommen (Abb. 4-8). Zum Vergleich wurden Wachstumskurven der
nicht transformierten Doppeldeletionsstämme aufgenommen (Abb.4-8).
Abb. 4-8: Wachstumskurven der E. coli-Stämme (a) ANN0221 ( ), ANN0222 ( ),
ANN0921( ), ANN0922 ( ) sowie (b) ANN0221/pBADnuo( ), ANN0222/pBADnuo
( ), ANN0921/pBADnuo( ) und ANN0922/pBADnuo ( ) in M9-Medium mit 0.2 %
(w/v) L(+)-Arabinose.
- 50 -
Ergebnisse
Nur der Doppeldeletionsstamm ANN0221 wuchs unterschiedlich schnell, je nachdem, ob er
das Plasmid pBADnuo enthielt oder nicht (Abb. 4-8). Die übrigen Stämme zeigten ohne die
Expression der nuo-Gene ein gutes Wachstum in Mangelmedium (Abb. 4-8). Es ist
anzunehmen, dass diese Deletionsmutanten im Lauf ihrer achtjährigen Lagerung mit WildtypZellen verunreinigt wurden. Daher wurde der Stamm ANN0221/pBADnuo für weitere
Arbeiten ausgewählt.
4.2.2 Atmungsaktivität des E. coli Stammes ANN0221/pBADnuo
Der E. coli-Stamm ANN0221/pBADnuo wurde in 1 l LB-Medium angezogen und die
Expression der nuo-Gene durch Zugabe von 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose induziert. Aus 2.5 g
Zellen wurden die Membranen präpariert und in 200 µl 50 mM MES, 50 mM NaCl, pH 6.0
resuspendiert. Analog dazu wurden die Membranen des Stammes ANN0221 präpariert und
von beiden Membranen die d-NADH-Oxidase Aktivität mit einer Sauerstoffelektrode
gemessen. Die Membranen des Stammes ANN0221 zeigten -wie erwartet- nach Zugabe von
NADH keinen Sauerstoffverbrauch (Abb. 4-9). Wurde in die gleiche Messung Membranen
des E. coli Wildtyp-Stammes AN387 zugegeben, wurde eine starke Abnahme der
Sauerstoffkonzentration beobachtet (Abb. 4-9).
Abb. 4-9: Sauerstoffverbrauch von Cytoplasma-Membranen des E. coli Stammes ANN0221
nach Zugabe von NADH und Sauerstoffverbrauch von Membranen des E. coli Wildtyps
AN387 in der gleichen Messung. Die Sauerstoffkonzentration wurde mit einer ClarkeElektrode bei 37°C bestimmt. Die Messung enthielt 10 µg Membranprotein des Stamms
ANN0221 und 43 µg Membranprotein des Wildtyp-Stammes.
- 51 -
Ergebnisse
Die Membranen des Stammes ANN0221/pBADnuo zeigten sowohl mit NADH als auch mit
d-NADH als Substrat eine deutliche und vergleichbare Atmungsaktivität (Abb. 4-10). Die
Aktivität
betrug
mit
NADH
als
Substrat
0.23 µmol O2/min.mg,
B
B
P
P
mit
d-NADH
0.25 µmol O2/min.mg (Tab. 4-2). Diese Ergebnisse zeigen, dass beide Dehydrogenase
B
B
P
P
Aktivitäten von dem auf pBADnuo kodierten Komplex I stammen und nicht von genomisch
kodiertem Komplex I oder der alternativen NADH-Dehydrogenase aus E. coli. Die im
Vergleich zum Wildtyp etwas 3.5fach erhöhte d-NADH-Oxidase Aktivität (Tab. 4-2) zeigt,
dass der Komplex I in dem Stamm ANN0221/pBADnuo etwa 3- bis 4-fach überproduziert
wird. Die NADH-Oxidase Aktivität der Membranen des Stammes ANN0221/pBADnuo ist
mit der des Wildtyps AN387 vergleichbar. Im Stamm ANN0221/pBADnuo stammt diese
Aktivität aber vollständig von Komplex I, während sie im Wildtyp AN387 zum größten Teil
von der alternativen NADH-Dehydrogenase stammt. Dies ist an der wesentlich geringeren
d-NADH-Oxidase Aktivität des Wildtyp-Stammes ersichtlich, die ausschließlich von
Komplex I hervorgerufen wird.
Abb.
4-10:
Sauerstoffverbrauch
der
Cytoplasma-Membranen
des
Stammes
ANN0221/pBADnuo gemessen mit einer Clark-Sauerstoffelektrode bei Zugabe von d-NADH
(a) und NADH (b). Die Sauerstoffkonzentration wurde bei 37°C bestimmt. Beide Messungen
enthielten 10 µg Membranprotein.
- 52 -
Ergebnisse
Tab. 4-2: (d-)NADH-Oxidase Aktivitäten der Cytoplasmamembranen der E. coli Stämme
ANN387 und ANN0221/pBADnuo. Die Werte für den Stamm AN387 stammen von Friedrich
et al. (1994).
E. coli Stamm
NADH-Oxidase Aktivität
d-NADH-Oxidase Aktivität
[µmol O2/min.mg]
B
B
P
P
AN387 (Wildtyp)
0.26
0.07
ANN0221/pBADnuo
0.23
0.25
4.2.3 Assemblierung des Komplex I in ANN0221/pBADnuo
Um die Assemblierung und Stabilität des in dem Stamm ANN0221/pBADnuo gebildeten
Komplex I zu untersuchen, wurden die Membranproteine der Cytoplasmamembran mit 3 %
DDM (w/v) solubilisiert. Der Extrakt wurde auf Zuckerdichtegradienten von 5 bis 20 % (w/v)
Saccharose aufgetragen und 16 Std. bei 180´000 g zentrifugiert. Die Gradienten wurden
fraktioniert und die NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität der einzelnen Fraktionen
vermessen. Als Vergleich diente ein Extrakt der Cytoplasmamembranen des Stammes
ANN0221 (Abb. 4-11). Der Extrakt der Membranen des Stammes ANN0221/pBADnuo
zeigte einen deutlichen Gipfel der NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität im zweiten Drittel
des Gradienten. Dies entspricht der Position des Komplex I aus Wildtyp (Leif et al., 1994).
Dieser Gipfel ist im Extrakt des Stammes ANN0221 nicht nachzuweisen. Der Aktivitätsgipfel
im vorderen Teil des Gradienten rührt von der alternativen NADH Dehydrogenase her.
- 53 -
Ergebnisse
Abb. 4-11: Zuckergradienten-Zentrifugation der Detergenzextrakte der CytoplasmaMembranen der Stämme ANN0221 ( ) und ANN0221/pADnuo ( ). Gezeigt ist die
NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität der einzelnen Fraktionen. Die Gradienten wurden mit
je 5 mg Protein beladen.
4.2.4 Isolierung des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo
67 g Zellen ANN0221/pBADnuo wurden in der „French-press“ aufgeschlossen und 10 g
Cytoplasmamembranen durch differentielle Zentrifugation erhalten. Die Membranproteine
wurden mit 3 % DDM solubilisiert, nicht gelöste Bestandteile abzentrifugiert und der Extrakt
auf eine Anionenaustausch-Chromatographie an Source 15Q aufgetragen. Fraktionen mit
NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität wurden vereinigt, mit PEG 4´000 ausgefällt, in einem
geringen Volumen ADM-Puffer gelöst und durch Größenausschluss-Chromatographie auf
Sephacryl S300 weiter aufgereinigt. Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität
wurden vereinigt und die Reinheit der Präparation über eine SDS-PAGE überprüft. Nach der
Größenausschlusschromatographie waren nur wenige Verunreinigungen in der Präparation
vorhanden (Abb. 4-12), so dass für den Nachweis, dass der vollständige Komplex aufgereinigt
wurde, kein weiterer chromatographischer Schritt notwendig war.
- 54 -
Ergebnisse
Abb. 4-12: Isolierung des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo über eine
Anionenaustausch-Chromatographie an Source 15Q (a) und GrößenausschlussChromatographie auf Sephacryl S300 (b). Die durchgezogene Kurve zeigt die Absorbanz bei
280 nm, die Punkt-Strich Linie den Verlauf der NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität und
die gestrichelte Linie die Lage des NaCl-Gradienten. In (c) ist die SDS-PAGE zur
Auftrennung der Proben der einzelnen Reinigungsschritte gezeigt. M: Membranen (5 µl
Auftrag; 52 mg/ml); E: Detergenz-Extrakt (5 µl Auftrag; 27 mg/ml); SQ: Gipfelfraktion nach
Anionenaustausch-Chromatographie (40 µl Auftrag; 2.6 mg/ml); KI: aufgereinigter
Komplex I aus dem Stamm ANN003/pAR1219 nach der Standard-Präparation (15 µl Auftrag;
1 mg/ml); Sep: Gipfelfraktionen nach Größenausschluss-Chromatographie (je 40 µl Auftrag;
vereinigte Fraktionen 0.7 mg/ml).
- 55 -
Ergebnisse
Tab. 4-3: Isolierung von Komplex I aus E. coli ANN0221/pBADnuo. Es wurden 67 g Zellen
(Feuchtgewicht) eingesetzt.
Präparationsschritt
Volumen Proteinmenge
[ml]
[mg]
NADH/Ferricyanid
Ausbeute
Reduktaseaktivität
[%]
gesamt
spezifisch
[µmol/min] [µmol/(min•mg)]
Membranen
64
3328
3962
1.2
100
Detergenzextrakt
58
1566
3550
2.3
90
AnionenaustauschChromatographie
22
57
461
8.1
12
GrössenausschlussChromatographie
14
10
347
34.7
9
Bei einer typischen Präparation des Komplex I aus dem Überproduzenten ANN003/pAR1219
wurden aus 55 g Zellen mit den gleichen Reinigungsschritten 25 mg Protein einer
spezifischen NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität von 48 µmol/(min•mg) isoliert (Stolpe
und Friedrich, 2004). Dies zeigt, dass die hier erhaltene Präparation nicht so sauber ist, wie
die aus dem Stamm ANN003/pAR1219. Bezieht man die Präparationen auf die gleiche
Ausgangsmenge Zellen, wurde etwa ein Drittel des Proteins im Vergleich zu der Präparation
aus ANN003/pAR1219 gewonnen.
4.3 Das Subklonsystem des Plasmids pBADnuo
Das Plasmid pBADnuo sollte für Mutagenese-Studien eingesetzt werden, wobei seine Größe
von gut 21 kbp ein Problem für die Mutagenese mittels PCR und nachfolgende
Sequenzierungen darstellt. Um zu verhindern, dass die Polymerase Fehler einbaut und dass
die Elongation verfrüht abgebrochen wird, sollte eine Mutagenese-PCR an kleineren
Plasmiden
durchgeführt
werden.
Hierzu
wurde
das
Operon
durch
singuläre
Restriktionsschnittstellen in drei Subklone aufgeteilt: pBAD-A, pBAD-B und pBAD-C (Abb.
4-13). Da die Subklone immer noch zwischen 5.9 kbp und 10.3 kbp groß sind, sollten sie in
zwei bis drei noch kleinere Subklone aufgeteilt werden. Hierbei wurden Schnittstellen
verwendet, die zwar nicht in pBADnuo, aber in den Subklonen pBAD-A, -B und -C singulär
- 56 -
Ergebnisse
vorkommen (Abb. 4-13). So sollten die nuo-Gene in den kleinen Subklonen modifiziert
werden können und diese anschließend über den größeren Subklon in das Plasmid pBADnuo
zurückkloniert werden, von dem aus dann die Expression der mutierten Gene stattfindet (Abb.
4-13).
Abb. 4-13: Schema des Subklonsystems des nuo-Operons. Ausgehend vom Plasmid
pBADnuo sollten drei Subklone pBAD-A, pBAD-B und pBAD-C erstellt werden, von denen
jeweils zwei oder drei kleinere Subklone kloniert werden sollten. Die in den Plasmiden
enthaltenen nuo-Gene und die benötigten, jeweils singulären Schnittstellen sind angegeben.
- 57 -
Ergebnisse
4.3.1 Vektor für die Subklonierung des Plasmids pBADnuo
Für die Subklone mussten Vektoren verwendet werden, in denen die singulären
Erkennungssequenzen in pBADnuo ebenfalls singulär nur in der MCS vorkommen. Für die
Subklone pBAD-A, pBAD-B und pBAD-C musste ein Vektor mit Sequenzen für die
Restriktionsenzyme SacI, XhoI, ApaI und NdeI zur Verfügung stehen. Für die kleineren
Subklone wurden weiterhin Erkennungssequenzen für die Enzyme EcoRI, BglII, KpnI und
EcoRV benötigt. Aus dem Klonierungsvektor pUC18 wurde zunächst mittels PCR ein Vektor
hergestellt, in den 34 zusätzliche Basenpaare eingeführt wurden (Abb. 4-14). Das
resultierende Konstrukt wird im Folgenden als pUC20 bezeichnet.
DpnI PruI
ApaI
↓ ↓
↓
5´-AAC AAT TTG CTC AGC GAT CGC GTA CGG GCC CTA AGG ACC G-3´
↑
MboI
↑
SgfI
↑
Eco0109I
Abb. 4-14: In pUC18 eingefügte Sequenz zur Herstellung des Vektors pUC20. Pfeile
kennzeichnen die Positionen von Erkennungssequenzen verschiedener Restriktionsenzyme.
Um weitere Restriktionsschnittstellen in den Vektor pUC20 einzufügen, wurde pUC20 mittels
PCR weiter mutagenisiert. Die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme SmaI,
EcoRV, RsrII und NruI (Abb. 4-15) wurden mittels überhängenden Primern (pUC25-for und
pUC25-rev) zwischen der MCS und der NdeI-Schnittstelle von pUC20 eingeführt. Das
resultierende Plasmid wird im Folgenden als pUC24 bezeichnet.
RsrII
EcoRV
SmaI
NruI
↓
↓
↓
↓
5´-CGG TCC GAT ATC CCC GGG GGA CTT TCG CGA-3´
Abb. 4-15: Zur Herstellung des Vektors pUC24 in den Vektor pUC20 eingeführte Sequenz.
Die Pfeile geben die Positionen der Erkennungssequenzen verschiedener Restriktionsenzyme
an.
- 58 -
Ergebnisse
Nach der Mutagenese-PCR wurde der Ursprungsvektor mit DpnI verdaut. Das unmethylierte
PCR-Produkt, das nicht fragmentiert wurde, wurde in E. coli RR1∆M15 transformiert. Aus
einzelnen Kolonien wurden die Plasmide präpariert und mittels Restriktionsanalyse
charakterisiert (Abb. 4-16).
Abb. 4-16: Restriktionsanalyse des Vektors pUC24 mit EcoRV+ScaI (Spur 1) bzw.
RsrII+ScaI (Spur 2). Die erwarteten Fragmentgrößen betrugen 1´969 bp und 784 bp
(EcoRV+ScaI) bzw. 1´962 bp und 791 bp (RsrII+ScaI). Als Standard wurde in Spur 3 pUCMix 4 (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
In den Vektor pUC24 wurde eine weitere Restriktionsschnittstelle für XhoI mittels einer
Mutagenese-PCR mit den Primern pUC25/2-rev und pUC25/2-for eingefügt, die hinter der
NruI-Schnittstelle für die Sequenz 5´-CTC GAG-3´ kodiert. Das so hergestellte Plasmid
pUC25 wurde mittels Restriktionsanalyse verifiziert (Tab. 4-4, Abb. 4-17).
- 59 -
Ergebnisse
Tab. 4-4: Erwartete Fragmentgrößen nach Restriktionsverdau des Plasmids pUC25 mit
verschiedenen Enzymen.
Restriktionsenzyme
Fragmentgrößen
[bp]
RsrII + ScaI
1´968
791
EcoRV + ScaI
1´975
784
SmaI + ScaI
1´981
778
NruI + ScaI
1´991
768
XhoI + ScaI
1´515
1´244
Abb. 4-17: Restriktionsanalyse des Plasmids pUC25 mit RsrII und ScaI (Spur 2), EcoRV und
ScaI (Spur 3), SmaI und ScaI (Spur 4), NruI und ScaI (Spur 5) und XhoI und ScaI (Spur 6).
Als Standard wurde pUC-Mix 4 eingesetzt (Spur 1 und 7; MBI Fermentas, St. Leon-Rot).
- 60 -
Ergebnisse
4.3.2 Klonierung der pBADnuo-Subklone und der kleinen Subklone
Um Subklone des Plasmids pBADnuo herzustellen, wurde es mit den in Tab. 4-5 aufgeführten
Restriktionsenzymen verdaut und die entstandenen DNA-Fragmente mittels Gelelution
aufgereinigt. Der Vektor pUC25 wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten.
Die Fragmente von pBADnuo wurden mit dem entsprechend geschnittenen und
aufgereinigten Vektor ligiert und in E. coli RR1∆M15 transformiert. Die zur Herstellung der
Fragmente benutzten Restriktionsenzyme wurden ebenfalls zur Analyse der Klone verwendet.
Tab. 4-5: Subklone des Plasmids pBADnuo. Aufgeführt sind die verwendeten
Restriktionsenzyme, die in den entsprechenden Fragmenten enthaltenen nuo-Gene, die Größe
der Fragmente und die Gesamtgröße des resultierenden Subklons.
Subklon
Restriktionsenzyme
Enthaltene nuo-
Fragmentgröße
Größe des Plasmids
Gene
[bp]
[bp]
pBAD-A
SacI + XhoI
nuoA-nuoE´
3´401
5´942
pBAD-B
XhoI + ApaI
nuoE´-nuoL´
7´417
9´928
pBAD-C
ApaI + NdeI
nuoL´-nuoN
5´091
7´547
pBAD-A1
SacI + EcoRI
nuoA-nuoCD´
1´806
4´563
pBAD-A2
EcoRI + XhoI
nuoCD´-nuoE´
1´595
4´138
pBAD-B1
XhoI + EcoRI
nuoE´-nuoF´
1´100
3´643
pBAD-B2
EcoRI + KpnI
nuoF´-nuoI´
4´441
7´184
pBAD-B3
KpnI + ApaI
nuoI´-nuoL´
1´876
4´619
pBAD-B4
XhoI + KpnI
nuoE´-nuoI´
5´541
8´068
pBAD-C1
ApaI + EcoRV
nuoL´-nuoM´
2´199
4´746
pBAD-C2
EcoRV + NdeI
nuoM´-nuoN
2´892
5´560
Von den geplanten Subklonen wurden in dieser Arbeit die Plasmide pBAD-A, pBAD-A1,
pBAD-A2, pBAD-B2, pBAD-B3, pBAD-B4 und pBAD-C1 hergestellt (Abb. 4-18). Nicht
kloniert wurden die Plasmide pBAD-B, pBAD-B1, pBAD-C und pBAD-C2. Auch Versuche,
die Inserts, d.h., die in den Vektor zu inserierenden DNA-Fragmente, in einen anderen Vektor
- 61 -
Ergebnisse
und unter Verwendung anderer Restriktionsenzyme mit gleicher Erkennungssequenz zu
klonieren, waren nicht erfolgreich.
Abb. 4-18: Restriktionsanalyse der Plasmide pBAD-A (Spur 1), pBAD-A1 (Spur 2),
pBAD-A2 (Spur 3), pBAD-B2 (Spur 5), pBAD-B3 (Spur 6), pBAD-B4 (Spur 7) und
pBAD-C1 (Spur 9). Die Plasmide wurden jeweils mit den Enzymen verdaut, mit denen sie
hergestellt wurden (Tab. 4-5). Als Standard wurde pUC-Mix 4 (Spur 4 und 10) bzw.
λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 8; beide MBI Fermentas, St. Leon-Rot) eingesetzt.
Mit dem in dieser Arbeit etablierten Subklonsystem sind die Bereiche nuoA-nuoM´ des nuoOperons abgedeckt und stehen für Mutagenesen zur Verfügung. Eine direkte Rückklonierung
mutierter Gene ist nur mit den kleinen Subklonen pBAD-A1 und pBAD-A2 über das Plasmid
pBAD-A möglich. Für die Rückklonierung von Mutationen in den kleinen Subklonen pBADB2, pBAD-B3, pBAD-B4 und pBAD-C1 in pBADnuo fehlen bislang die benötigten Subklone
pBAD-B und pBAD-C. Da die Schnittstellen der nuo-Fragmente in den kleinen Subklonen
der Plasmide pBAD-B und pBAD-C in pBADnuo nicht singulär vorliegen, können diese
Fragmente nicht direkt in pBADnuo rückkloniert werden. Die kleinen Subklone von pBAD-B
und pBAD-C sind zur Mutagenese geeignet, die Mutationen müssen aber auf anderem Weg in
pBADnuo transferiert werden. Eine Alternative zur Klonierung ist die λ-Red vermittelte
Rekombination (Datsenko und Wanner, 2000), bei der Mutationen mit beliebigen
Restriktionsenzymen aus den kleinen Subklonen herausgeschnitten und in pBADnuo gegen
den Wildtyp-Bereich ausgetauscht werden können. Das Subklonsystem ist für die Mutagenese
dieser Bereiche nicht geeignet.
Die λ-Red vermittelte Rekombination zur Einführung von Punktmutationen, Deletionen oder
Insertionen in pBADnuo kann in E. coli Zellen durchgeführt werden, die außer dem
Zielplasmid pBADnuo das Plasmid pKD46 enthalten (s. Anhang). pKD46 kodiert für die
- 62 -
Ergebnisse
λ-Red Rekombinase, deren Expression über einen Arabinosepromotor durch die Induktion
mit L-Arabinose erfolgt. pBADnuo und pKD46 werden durch Kotransformation in E. coli
eingeführt und bei 30°C in LB-Medium mit den Antibiotika Chloramphenicol und Ampicillin
gemeinsam propagiert. pBADnuo kodiert dabei für eine Acetyltransferase, die die
Chloramphenicolresistenz vermittelt, pKD46 für β-Lactamase, die Ampicillinresistenz
vermittelt. Das zu rekombinierende DNA-Fragment, das neben dem auszutauschenden
Bereich flankierende homologe Enden mit einer Länge von mindestens 36 bp aufweist, wird
durch Elektroporation in die E. coli Zellen mit den beiden Plasmiden transformiert. Das
Plasmid pKD46 enthält einen temperatursensitiven Replikationsursprung, so dass bei 37°C
keine weitere Replikation des Plasmids stattfindet. Werden die Zellen nach der
Rekombination bei 37°C ohne Ampicillin angezogen, wird nur pBADnuo weiterhin repliziert.
4.4 Einführung einer StrepTag II-Sequenz in pBADnuo
4.4.1 Modifizierung von NuoB
Bei den in diesem Kapitel beschriebenen Arbeiten wurde Frau Julia Hinderberger im Rahmen
ihrer Diplomarbeit (2004) angeleitet. In den Subklon pBAD-A wurde am 5´-Ende von nuoB
die StrepTag II-Sequenz eingefügt. Dazu wurde zunächst über eine PCR nuoB und nuoC
amplifiziert, wobei der Primer am 3´-Ende von nuoB und am 5´-Ende von nuoCD jeweils für
das Affinitätspeptid kodierte. Die PCR-Produkte wurden in einer weiteren PCR eingesetzt,
um aus beiden Fragmenten ein DNA-Fragment, das die StrepTag II-Sequenz (Abb. 4-19)
enthält, zu bilden (Abb. 4-20).
StrepTag II-Sequenz mit Linker:
5´-gct agc tgg agc cac ccg cag ttc gaa aaa-3´
Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
Abb. 4-19: Nukleotid- und Aminosäuresequenz des StrepTag II mit zwei vorangefügten
Aminosäuren als sogenannter „Linker“ (Alanin und Serin), die für einen Abstand zwischen
Tag und Protein sorgen sollen.
- 63 -
Ergebnisse
P1
a)
P3
3´
5´
3´
5´
nuoB
nuoCD
P2
P4
PCR
5´
3´
3´
5´
b)
5´
5´
3´
3´
P1
P4
PCR
5´
3´
nuoB
Tag-Sequenz
nuoCD
Abb. 4-20: PCR zur Einführung eines StrepTag II in NuoB, der Abschnitt des nuo-Operons ist
schwarz, die Tagsequenz rot dargestellt. Die verwendeten Primer sind mit P1-4 bezeichnet. a)
Es wurden je ein Außen- (P1 und P4) und ein Innenprimer (P2 und P3) zur Amplifizierung
der Fragmente nuoA-B bzw. nuoCD-E´ eingesetzt. Die Außenprimer sind in den Bereichen
nuoA (P1) und nuoE´ (P4) komplementär zum nuo-Operon und enthalten
Restriktionsschnittstellen für die Enzyme SacI (P1) und XhoI (P4). Die Innenprimer enthalten
neben komplementären nuo-Sequenzen die vollständige Tagsequenz. b) Durch Annealing der
Produkte des ersten Schrittes in der überlappenden Tagsequenz wurde die Vorlage für den
zweiten PCR-Schritt gebildet. Nach Restriktion mit SacI und XhoI wurde das Fragment gegen
das entsprechende native Fragment im Vektor pBADnuo ausgetauscht.
- 64 -
Ergebnisse
Das in pBAD-A enthaltene Fragment des nuo-Operons aus nuoA-nuoE´ mit der StrepTag IISequenz am 3´-Ende von nuoB wurde in das Plasmid pBADnuo kloniert. Das resultierende
Plasmid, das im Folgenden als pBADnuo/NuoBc bezeichnet wird, wurde in den Komplex IDeletionsstamm ANN023 transformiert. Der Stamm wurde angezogen und die Expression der
nuo-Gene durch Zugabe von 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose induziert. Frau Hinderberger hat in
ihrer Arbeit gezeigt, dass der Komplex I in diesem Stamm assembliert wird und mit dem
Detergenz Dodecylmaltosid extrahiert werden kann (Hinderberger, 2004). Aus den Zellen
wurden die Plasmamembranen präpariert und der Komplex I über eine AntionenaustauschChromatographie an DEAE-Sepharose und eine Affinitäts-Chromatographie an StrepTactinSepharose aufgereinigt. Es zeigte sich, dass der Komplex I zwar an das AffinitätsChromatographie-Material gebunden und eluiert wurde, jedoch enthielt die Präparation nicht
alle Untereinheiten (Abb. 4-21, 4-22). Die Banden des Elutionsgipfels wurden anhand ihrer
scheinbaren molekularen Massen den Untereinheiten NuoB, CD, E, F, G, H, I, L, M und N
zugeordnet. Die hydrophoben Untereinheiten NuoA, NuoJ und NuoK konnten nicht
nachgewiesen werden. Auffällig ist, dass die Intensitätsverhältnisse der Banden der einzelnen
Untereinheiten nicht übereinstimmen. So ist z.B. die Intensität der NuoG zugeordneten Bande
wesentlich geringer als die der Bande von NuoI (Abb. 4-22). Dies deutet darauf hin, dass die
Untereinheiten dieser Präparation nicht in einem stöchiometrischen Verhältnis vorliegen.
Abb. 4-21: Elutionsprofil der Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin. (-) kennzeichnet die
Absorbanz bei 280 nm in willkürlichen Einheiten, (+) die NADH/Ferricyanid
Reduktaseaktivität der Fraktionen ist mit einem „+“ gekennzeichnet. Der Pfeil markiert den
Beginn der Elution mit 2.5 mM Desthiobiotin.
- 65 -
Ergebnisse
A
B
C D
E
F
G
H I
J
100
70
50
a)
25
20
10
b)
4
7
1
2
3
5
6
8
9
Abb. 4-22: SDS-PAGE der mit Affinitäts-Chromatographie gereinigten Komplex I
Präparation, (a) Färbung mit Coomassie Brilliant Blue und (b) Silberfärbung. Es wurden
jeweils 40 µl Probe aufgetragen. (A) 0-5 ml des Waschschritts, (B) 5-20 ml des
Waschschritts, (C) Fraktion 8 des Eluats (31.4 ml), (D) Fraktion 10 des Eluats (33 ml), (E)
Frei, (F) Fraktion 14 des Eluats (36.2 ml), (G) Fraktion 16 des Eluats (37.8 ml), (H) Fraktion
18 des Eluats (39.4 ml), (I) Fraktion 20 des Eluats (41 ml) und (J) Standard. Die molekulare
Masse einzelner Banden in a) ist in kDa angegeben. Die Banden in den Spuren D und F bis I
wurden aufgrund ihrer scheinbaren molekularen Massen den Untereinheiten NuoG (1),
NuoCD (2), NuoN und M (3), NuoF (4), NuoL (5), NuoH (6), NuoB (7), NuoI (8) und NuoE
(9) zugeordnet.
Die vierkernigen Fe/S-Zentren N2 (gz = 2.054 und gx,y = 1.922) und N4 (gz = 2.100, gx =
1.862) wurden in ESR-Spektren der Präparation nicht nachgewiesen (Abb. 4-23). Wie aus der
Präparationstabelle ersichtlich (Tab. 4-6), wurde weniger als 10 % der von der DEAE-Säule
eluierten Aktivität nach Affinitäts-Chromatographie wiedergewonnen. Somit ist die
Modifizierung des C-terminalen Endes von NuoB mit dem StrepTag II-Affinitätspeptid nicht
geeignet, um den Komplex I aufzureinigen.
- 66 -
Ergebnisse
Abb. 4-23: ESR-Spektren von Komplex I-Präparationen aus dem Stamm ANN003/pAR1219
nach konventioneller Chromatographie (a) und dem Stamm ANN0221/pBADnuo/NuoBC
nach Affinitäts-Chromatographie (b). Die Spektren wurden bei 13 K und 10 mW
Mikrowellenleistung aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.44 GHz, die
Modulationsamplitude 6 mT, die Zeitkonstante 0.064 s und die Aufnahmegeschwindigkeit
17.9 mT/min. Die bei 40 K und 2 mW Mikrowellenleistung aufgenommenen Spektren sahen
vergleichbar aus (Daten nicht gezeigt).
B
B
Tab. 4-6: Isolierung von Komplex I aus E. coli ANN0221/pBADnuo/BC. Es wurden 28 g
Zellen (Feuchtgewicht) eingesetzt.
B
Präparationsschritt
B
Volumen
Proteinmenge
NADH/Ferricyanid
Ausbeute
[ml]
[mg]
Reduktaseaktivität
[%]
gesamt
spezifisch
[µmol/min] [µmol/(min•mg]
Membranen
18
1500
2250
1.5
100
Detergenzextrakt
58
692
1800
2.6
80
Anionenaustauschchromatographie
54
104
1080
10.4
48
0.27
3.8
89
24
4
AffinitätsChromatographie
- 67 -
Ergebnisse
4.4.2 Modifizierung von NuoF
Aus vorangegangenen Arbeiten war im Arbeitskreis ein Plasmid vorhanden, in dem die Gene
nuoB-nuoG in das Plasmid pET11-a eingefügt und am 3´-Ende von nuoF die StrepTag IISequenz insertiert worden war. Von diesem als pET11-a/nuoB-G/NuoFC bezeichneten
B
B
Plasmid wurden im Stamm BL21(DE3) die nuo-Gene exprimiert. Es wurde gezeigt, dass das
NADH-Dehydrogenase Fragment aus den Untereinheiten NuoE, F und G aus diesem Stamm
an StrepTactin-Sepharose bindet und dass die Modifizierung von NuoF weder die
Assemblierung noch die enzymatische Aktivität des Fragmentes stört (Bungert et al., 1999).
Der Bereich mit der StrepTag II-Sequenz an nuoF wurde aus dem Plasmid
pET11-a/nuoB-G/NuoFC mit DraIII herausgeschnitten. Das 2´692 bp große Fragment wurde
B
B
durch Gelelution aufgereinigt und in den Stamm DH5α/pBADnuo+pKD46 durch
Elektroporation transformiert. Die Zellen waren zuvor bei 30°C mit 0.2 % (w/v) L(+)Arabinose angezogen worden, um die Expression der λ-Red Rekombinase zu induzieren.
Nach der Transformation wurden die Zellen in 4 ml LB-Medium für 16 Std. bei 37°C
angezogen und anschließend die Plasmide mittels Mini-Präparation isoliert. Die
Restriktionsanalyse mit NheI, das eine Sequenz in dem Bereich, der die StrepTag II-Sequenz
mit nuoF verbindet, erkennt, zeigt ein Gemisch der Plasmide pBADnuo und dem nach
Rekombination resultierenden Plasmid pBADnuo/NuoFC (Tab. 4-7, Abb. 4-24).
B
B
Tab. 4-7: Erwartete Fragmentgrößen der Plasmide pBADnuo und pBADnuo/NuoFC nach
Restriktionsanalyse mit NheI.
B
Restriktionsenzym
NheI
pBADnuo
pBADnuo/NuoFC
[bp]
[bp]
18´993
14´098
2´285
4´925
B
2´285
- 68 -
B
Ergebnisse
Abb. 4-24: Restriktionsanalyse des Rekombinationsansatzes der StrepTag II-Sequenz in
pBADnuo mit NheI (Spur 1). Als Standard wurde λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 2; MBI
Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Um die Plasmide pBADnuo und pBADnuo/NuoFC zu trennen, wurde die Präparation 1:100
B
B
mit destilliertem Wasser verdünnt und in E. coli DH5α transformiert. Ein Fünftel des
Transformationsansatzes wurde auf LB-Medium mit Chloramphenicol ausplattiert. Einzelne
Kolonien wurden für 16 Std. bei 17°C angezogen, die Plasmide präpariert und mit NheI und
ScaI geschnitten. Zwei Klone zeigten das erwartete Fragmentmuster mit Größen von 13´103,
4´925, 2´285 und 995 bp (Abb. 4-25).
Abb. 4-25: Restriktionsanalyse des Rekombinationsansatzes des DraIII-Fragmentes des
Plasmids pET11-a/nuoB-G/NuoFC in pBADnuo (Spur 1). Es wurde mit dem Enzym NheI
B
B
geschnitten. Spur 2 zeigt den Standard λ-DNA/EcoRI+HindIII (MBI Fermentas, St. LeonRot) aufgetragen.
- 69 -
Ergebnisse
Eine Sequenzierung der Klone mit dem erwarteten Restriktionsmuster zeigte die korrekte
Rekombination der StrepTag II-Sequenz in pBADnuo. Das Plasmid pBADnuo/NuoFC wurde
in den Doppeldeletionsstamm ANN0221 transformiert und unter Induktion mit 0.2 % (w/v)
L(+)-Arabinose angezogen. Kurz vor der stationären Phase wurden die Zellen geerntet. Aus
4.3 g Zellen wurden 550 mg Membranen präpariert, die mit 500 µl 50 mM MES, pH 6.0
resuspendiert und in der Sauerstoffelektrode vermessen wurden. Mit d-NADH als Substrat
wurde kein Sauerstoffverbrauch nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die Membranen wurden
mit DDM solubilisiert, auf einen Zuckergradienten von 5 % - 20 % Saccharose aufgetragen
und für 16 Std. bei 180´000 *g zentrifugiert. Die Gradienten wurden in 2 ml Portionen
fraktioniert und die NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität der einzelnen Fraktionen bestimmt
(Abb. 4-26).
Abb.
4-26:
Zuckergradienten-Dichtezentrifugation
des
Detergenzextraktes
der
cytoplasmatischen Membranen des Stammes ANN0221/pBADnuo/NuoFC. Gezeigt ist die
NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität der Fraktionen des Gradienten. Der Gradient wurde
mit 5 mg Protein beladen.
Der Gradient zeigte zwei Aktivitätsgipfel. Ein Gipfel entsprach der Position der alternativen
NADH-Dehydrogenase in den Fraktionen 3 und 4. Der zweite Aktivitätsgipfel entspricht der
Position des NADH-Dehydrogenase Fragmentes. In den Fraktionen 10 bis 12, in denen der
Komplex I normalerweise sedimentiert, wurde keine Aktivität gemessen. Dies zeigt, dass in
dem Stamm ANN0221/pBADnuo/NuoFC der Komplex I nicht assembliert wird, was
vermutlich durch das Affinitätspeptid an NuoF verhindert wird.
- 70 -
Ergebnisse
4.4.3 Modifizierung von NuoCD
Aus Arbeiten mit Y. lipolytica und T. thermophilus war bekannt, dass eine Modifizierung des
Komplex I mit einem Affinitätspeptid C-terminal an NuoC zu einer intakten Präparation des
Komplexes über eine Affinitäts-Chromatographie führt (Kashani-Poor et al., 2001;
T. Ohnishi, persönliche Mitteilung). Es ist jedoch nicht ohne weiteres möglich, die StrepTag
II-Sequenz an dieser Position in den E. coli Komplex I einzuführen, da in E. coli die Gene
nuoC und D zu einem Gen nuoCD fusioniert sind. Zuerst müssen die Gene voneinander
getrennt werden. Mittels Sequenzvergleichen mit Organismen, in denen nuoC und nuoD als
getrennte Gene vorliegen, wurde ein potentielles Startkodon für nuoD in E. coli identifiziert.
Vor dieses Startkodon sollte über eine PCR die für den StrepTag II kodierende Sequenz mit
einem stromaufwärts dazu gelegenen Stoppkodon für nuoC eingeführt werden (Abb. 4-27).
Eine Ribosomenbindestelle für nuoD sollte an dem 3´-Ende der StrepTag II-Sequenz
eingeführt werden. Um die Sequenz einer „klassischen“ Ribosomenbindestelle ähnlicher zu
machen, wurde die ursprüngliche Sequenz GAA AAA in GAG AAG umgewandelt, ohne dass
die Aminosäuresequenz beeinflusst wurde (Abb. 4-19, 4-27). Die Primer StrepC-for und
StrepC-rev für die Amplifikation der StrepTag II-Sequenz wurden so synthetisiert, dass sie
jeweils für 34 bp bzw. 33 bp der StrepTag II-Sequenz kodieren, wobei sie 30 zueinander
komplementäre bp aufweisen, so dass in diesem Bereich eine Anlagerung der Primer
aneinander stattfindet (Abb. 4-27). Außerdem kodierten die Primer jeweils für 40 bp der am
3´-Ende von nuoC bzw. am 5´-Ende von nuoD gelegenen Sequenz, an denen über
Rekombination die Tag-Sequenz in das Konstrukt pBADnuo eingeführt werden sollte.
5´-GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAG AAG-3´
Ala
Ser
Linker
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
StrepTag II-Sequenz
Abb. 4-27: Nukleotid- und Aminosäuresequenz des StrepTag II. Zur Amplifikation der
Sequenz mit flankierenden Enden, die homolog zum 3´-Ende von nuoC bzw. 5´-Ende von
nuoD sind, sollten Primer verwendet werden, die sich ohne Matrizen-DNA aneinander
anlagern (in der Nukleotid-Sequenz unterstrichen markiert). In der Aminosäuresequenz ist
jeweils die Linkersequenz und die StrepTag II-Sequenz unterstrichen dargestellt.
Um den StrepTag II in den entsprechenden Bereich innerhalb von nuoCD in das Konstrukt
pBADnuo einzubringen, wurde ein 113 bp langes DNA-Fragment eingesetzt, das jeweils 40
- 71 -
Ergebnisse
bp von nuoC bzw. nuoD enthält, welche die StrepTag II-Sequenz flankieren. Hinter der TagSequenz befindet sich ein Stoppkodon für nuoC sowie ein Startkodon für nuoD. Dieses
Fragment sollte mittels PCR hergestellt werden. Es wurden Primer genutzt, die sich jeweils in
einem Bereich von 23 bp überlappen. Durch diese Überlappung lagern sich die Primern
aneinander an und eine Elongation erfolgt jeweils komplementär zum Gegenprimer. In
diesem Fall wurde keine Matrizen-DNA für die PCR benötigt, sie wurde als so genannte
„Template-lose PCR“ durchgeführt (Abb. 4-28). Das PCR-Produkt sollte anschließend über
eine Rekombination in pBADnuo eingebracht werden, das resultierende Konstrukt in einen
Komplex I-defizienten Stamm transformiert und aus diesem nach Anzucht Komplex I
präpariert werden.
Abb. 4-28: Schema zur Herstellung eines DNA-Fragmentes zur Rekombination eines
StrepTag II zwischen nuoC und nuoD im Konstrukt pBADnuo. Das Fragment sollte mittels
einer Templat-losen PCR mit Primern hergestellt werden, die jeweils 40 bp von nuoC bzw.
nuoD sowie einen Teil der StrepTag II-Sequenz beinhalten und aneinander annealen, so dass
keine Matrizen-DNA benötigt wird. TAA bezeichnet das neu einzufügende Stoppkodon von
nuoC.
In einer PCR mit den Primern StrepC-for (69 bp) und StrepC-rev (67 bp) wurde ein 113 bp
großes Fragment amplifiziert, das das 3´-Ende von nuoC, eine 6 bp lange verbindende
Sequenz, die StrepTag II-Sequenz, ein Stoppkodon und das 5´-Ende von nuoD enthält. Dieses
PCR-Produkt (Abb. 4-29) wird im Folgenden als nuoC-StrepTag II-nuoD bezeichnet. Neben
dem 113 bp großen PCR-Produkt wurde eine weitere, schwach angefärbte Bande in dem
Agarosegel nachgewiesen, die aufgrund ihrer Größe vermutlich von einem Dimer des PCRProduktes gebildet wird (Abb. 4-29).
- 72 -
Ergebnisse
Abb. 4-29: Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte zur Amplifizierung von
nuoC-StrepTag II-nuoD in einem 2 %igen Agarosegel (Spur 1). Als Standard wurde pUCMix 8 (pUC8; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen. Der Pfeil kennzeichnet das
(Haupt)-PCR-Produkt.
Das Fragment nuoC-StrepTag II-nuoD wurde in den E. coli Stamm DH5α mit den Plasmiden
pBADnuo und pKD46 transformiert und bei 37°C 1 Std. unter Schütteln inkubiert. Der
Ansatz wurde in 4 ml LB-Medium für 16 Std. bei 37°C gezogen. Die Plasmide wurden
mittels Mini-Präparation aus der Kultur isoliert. Nach einer 1:100-Verdünnung wurden sie zur
Vereinzelung erneut in E. coli DH5α transformiert. Nach Ausplattieren der Zellen auf LBMedium mit Chloramphenicol wurden die Zellen bei 37°C über Nacht inkubiert. Von den so
erhaltenen Kolonien wurden 12 in je 4 ml LB-Medium über Nacht angezogen, die Plasmide
mittels Mini-Präparation aufgereinigt, und mit NheI geschnitten (Abb. 4-30). Das Plasmid
pBADnuo ergibt zwei Fragmente von 18´993 und 2´285 bp. Das nach Rekombination
erwartete Plasmid pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD sollte durch das Enzym NheI in drei
Fragmente von 17´159, 2´285 und 1´867 bp gespalten werden. Der korrekte Einbau der
StrepTag II-Sequenz und der optimierten Ribosomenbindestelle wurde durch eine
Sequenzierung bestätigt (s. Anhang).
Abb. 4-30: Restriktionsanalyse des Rekombinationsansatzes des PCR-Produktes nuoCStrepTag II-nuoD in pBADnuo. Es wurde mit dem Restriktionsenzym NheI geschnitten
(Spur 1). Als Standard wurde pUC-Mix 4 (Spur 2; MBI Fermentas, St. Leon-Rot)
aufgetragen.
- 73 -
Ergebnisse
Um den Komplex I, der von dem Plasmid pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD exprimiert wird,
zu isolieren, wurde das Plasmid in E. coli ANN0221 transformiert. Der Stamm
ANN0221/pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD wurde wie beschrieben in einem 10 l-Maßstab
angezogen. Aus 26.3 g Zellen wurden 7.3 g Cytoplasmamembranen erhaltenen. Die
Membranproteine wurden durch Zugabe von DDM extrahiert und mittels einer
Anionenaustausch-Chromatographie auf einer 40 ml DEAE-Säule von dem Überschuß
Detergenz befreit. Durch eine Stoßelution mit 50 mM MES/NaOH, 320 mM NaCl, 0.1 %
(w/v) DDM, pH 6.0 wurden die Proteine von der Säule gewaschen und mit PEG 4.000 gefällt,
abzentrifugiert und in 1 ml 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, 0.1 % (w/v) DDM, pH 7.0
resuspendiert. Die resuspendierte Lösung wurde auf eine 8 ml StrepTactin-Sepharosesäule
aufgetragen, die Säule mit 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, 0.1 % (w/v) DDM, pH 7.0
gespült, bis die Absorbanz bei 280 nm auf die Grundlinie zurückgegangen war. Gebundene
Proteine wurden mit 2.5 mM Desthiobiothin im gleichen Puffer eluiert. Es wurde nur ein sehr
kleiner Elutionsgipfel detektiert (Abb. 4-31). Die Fraktionen dieses Gipfels wurden auf ein
SDS-Gel aufgetragen, die einzelnen Proteine gelelektrophoretisch voneinander getrennt und
durch Silberfärbung sichtbar gemacht (Abb. 4-31).
- 74 -
Ergebnisse
Abb.
4-31:
Reinigung
des
Komplex
I
aus
dem
Stamm
ANN0221/pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD.
Elutionsprofil
der
IonenaustauschChromatographie an DEAE-Sepharose (a), der Affinitäts-Chromatographie an StrepTactinSepharose (b) und Proteinzusammensetzung der Gipfelfraktionen der Absorbanz bei 280 nm
nach SDS-PAGE (c). Die SDS-PAGE zeigt weiterhin die Proteinzusammensetzung der
vereinigten Fraktionen der Ionenaustausch-Chromatographie (IEC) und des Durchflusses der
StrepTactin-Säule (D). Die Pfeile markieren den Beginn der Stoßelution mit 320 mM NaCl in
(a) und 2.5 mM D-Desthiobiotin in (b).
- 75 -
Ergebnisse
Aus dem E. coli Stamm ANN0221/pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD kann der Komplex I
über Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin-Sepharose aufgereinigt werden. Die
Präparation enthält Banden, die anhand ihrer scheinbaren molekularen Massen Untereinheiten
des Komplexes entsprechen. Die Ausbeute der Präparation ist allerdings so gering, dass die
Proteinkonzentration und die NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität nicht bestimmt werden
konnte.
Im
Vergleich
zu
der
Standardpräparation
des
Komplex
I
aus
dem
Stamm
ANN0221/pBADnuo waren sowohl die Ausbeuten als auch die NADH/Ferricyanid
Reduktaseaktivität der einzelnen Schritte bis zur Affinitäts-Chromatographie miteinander
vergleichbar (Tab. 4-3, Tab. 4-8). Die geringe Ausbeute nach Affinitäts-Chromatographie
liegt somit nicht an einer größeren Instabilität des Komplexes durch die Modifizierung mit
dem StrepTag II, sondern daran, dass das Affinitätspeptid keine ausreichende Bindung zu
dem Chromatographie-Material ausbildet.
Tab. 4-8: Isolierung von Komplex I aus 26.3 g (Feuchtgewicht) E. coli ANN0221/pBADnuo
nuoC-StrepTag II-nuoD. Aufgrund der geringen Ausbeute der Affinität-Chromatographie war
es nicht möglich, die Proteinmenge und die NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität dieses
Schrittes zu bestimmen.
Präparationsschritt
Volumen
Proteinmenge
NADH/Ferricyanid
Ausbeute
[ml]
[mg]
Reduktaseaktivität
[%]
gesamt
spezifisch
[µmol/min] [µmol/(min•mg]
Membranen
64
506
1280
2.5
100
Detergenzextrakt
62
242
1240
5.1
97
AnionenaustauschChromatographie
AffinitätsChromatographie
35
32
420
13
33
3
-
-
-
-
Da der Komplex I aus dem E. coli Stamm ANN0221/pBADnuo nuoC-StrepTag II-nuoD
assembliert und prinzipiell über eine Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt werden
kann, wurde versucht, die Wechselwirkung des Affinitätspeptids C-terminal an NuoC mit
dem StrepTactin-Material zu verbessern, indem der verbindende Bereich zwischen NuoC und
- 76 -
Ergebnisse
dem Affinitätspeptid von einem Alanin und einem Serin auf sechs Alanine und ein Serin
verlängert wurde.
Zur Einfügung weiterer Nukleotide in den verbindenden Bereich des Plasmids
pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD wurde es als Matrize für eine weitere PCR mit den
Primern 6TagCSD-for und –rev verwendet. Die Primer kodierten jeweils für eine Hälfte der
StrepTag II-Sequenz und enthielten die Kodons für fünf zusätzliche Alanine in dem
verbindenden Bereich. Die PCR wurde wie oben für das Fragment nuoC-StrepTag II-nuoD
beschrieben durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt (Abb. 4-32) wird im Folgenden als
nuoC-6 StrepTagII-nuoD bezeichnet.
Abb. 4-32: Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte zur Amplifizierung von
nuoC/6 StrepTag II/nuoD (Spur 1). Als Standard wurde pUC-Mix 8 (Spur 2; MBI Fermentas,
St. Leon-Rot) aufgetragen. Das (Haupt)-PCR-Produkt ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Das
PCR-Produkt
nuoC/6 StrepTag II/nuoD
wurde
in
elektrokompetente
DH5α/pBADnuo+pKD46 transformiert. Die Rekombinase wurde durch Induktion mit
0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose exprimiert. Nach der Transformation wurden die Zellen bei 37°C
für 16 Std. angezogen, die Plasmide durch eine Mini-Präparation isoliert und mit einer
Restriktionsanalyse charakterisiert. Durch den verlängerten verbindenden Bereich wurde eine
Erkennungssequenz für das Restriktionenzym PstI eingefügt. In Tab. 4-9 sind die erwarteten
Fragmentgrößen der verschiedenen Restriktionen aufgeführt. Das Restriktionsmuster ist in
Abb. 4-33 gezeigt.
- 77 -
Ergebnisse
Tab. 4-9: Erwartete Fragmentgrößen der Plasmide pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD und
pBADnuo/nuoC-6 StrepTag II-nuoD nach Restriktion mit verschiedenen Enzymen.
Restriktions-
pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD
pBADnuo/nuoC-6 StrepTag II-
enzym
[bp]
nuoD
[bp]
PstI
17´229
9´700
4´049
7´600
4´049
PstI + XbaI
11´492
9´701
5´700
5´700
4´100
4´100
1´839
KpnI
12´342
12´342
8´984
8´936
Abb. 4-33: Restriktionsanalyse des Rekombinationsansatzes des PCR-Produktes
nuoC-6 StrepTag II-nuoD in pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD mit den Enzymen PstI (Spur
1), PstI+XbaI (Spur 2) und KpnI (Spur 3). Als Standard wurde λ–DNA/EcoRI+HindIII
(Spur 4; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet.
Wie
die
Restriktionsanalyse
zeigte,
pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD
und
wurde
ein
Gemisch
der
beiden
pBADnuo/nuoC-6 StrepTag II-nuoD
Plasmide
präpariert
(Abb. 4-33). Zur Trennung der Plasmide wurde die Probe 1:100 verdünnt und in E. coli
DH5α transformiert. Von den auf LB-Medium mit Chloramphenicol gewachsenen Kolonien
- 78 -
Ergebnisse
wurden 24 Übernachtkulturen angesetzt, daraus mit einer Mini-Präparation die Plasmide
isoliert und diese mit einer Restriktionsanalyse charakterisiert (Abb. 4-34). Das erwartete
Fragmentmuster zeigt Tabelle 4-9.
Abb. 4-34: Restriktionsanalyse der Transformation des Plasmidgemisches pBADnuo/nuoCStrepTag II-nuoD und pBADnuo/nuoC-6 StrepTag II-nuoD in E. coli DH5α. Die Plasmide
wurden mit dem Enzym PstI (Spur 1 und 2) bzw. mit PstI und XbaI (Spur 3 und 4)
geschnitten. In den Spuren 1 und 3 ist das Fragmentmuster des Plasmids pBADnuo/nuoCStrepTag II-nuoD, in den Spuren 2 und 4 das des Plasmids pBADnuo/nuoC-6 StrepTag IInuoD zu finden. Als Standard wurde λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 5; MBI Fermentas, St.
Leon-Rot) aufgetragen.
Zwei Klone zeigten das erwartete Fragmentmuster der Plasmide. Die Sequenz wurde mit
einer DNA-Sequenzierung bestätigt (s. Anhang). Aus E. coli DH5α/pBADnuo/nuoC6 StrepTag II-nuoD wurde, wie oben für den Stamm ANN0221/pBADnuo/nuoC-StrepTag IInuoD beschrieben, der Komplex I über die Präparation der Cytoplasmamembranen, eine
Detergenzextraktion, eine Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Sepharose und eine
Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin Komplex I isoliert. Die Ausbeuten der einzelnen
Schritte und die enzymatischen Aktivitäten unterschieden sich nur unwesentlich von der
Präparation aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD (Tab. 4-8, Daten
nicht gezeigt). Das Elutionsprofil der Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin unterschied
sich nicht von dem Profil der Aufreinigung von Komplex I mit dem um vier Alanine kürzeren
verbindenden Bereich (Abb. 4-35). Somit scheint die Wechselwirkung des Affinitätspeptids
mit dem Säulenmaterial nicht Grund für die fehlende Bindung des Enzyms an das Material zu
sein.
- 79 -
Ergebnisse
Abb. 4-35: Reinigung des Komplex I aus dem Stamm DH5α/pBADnuo/nuoC-6 StrepTag IInuoD. Elutionsprofil der Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin-Sepharose. Aufgetragen
wurde das Eluat einer Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-Sepharose, das
Elutionsprofil der Anionenaustausch-Chromatographie entsprach dem der Aufreinigung von
Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo/nuoC-6 StrepTag II-nuoD. Der Pfeil
kennzeichnet den Beginn der Elution mit D-Desthiobiotin.
4.5 λ-Red vermittelte Rekombination zur Mutagenese im nuo-Operon
4.5.1 Deletionsmutationen in pBADnuo
Um Deletionen in pBADnuo mittels λ-Red vermittelter Rekombination einzuführen, wurde
der zu deletierende Bereich zunächst durch ein Resistenzgen ersetzt. An dieses Resistenzgen
wurde über eine PCR jeweils am 3´- und 5´-Ende ein Bereich von 40 bp eingefügt, der
homolog zu der Sequenz war, in die das Resistenzgen insertiert werden sollte (entsprechend
4-36; Datsenko und Wanner, 2000). Nach der Selektion positiver Klone mittels
Antibiotikaresistenz wurde das Resistenzgen durch die FLP-Rekombinase über flankierende
Sequenzen, die als FRT-Sequenzen (FLP recognition target) bezeichnet werden, entfernt. Die
U
U
U
U
U
U
Eliminierung der Antibiotikaresistenz hinterlässt eine 82 bis 85 bp lange Sequenz, die
sogenannte „Narbe“, in dem deletierten Bereich. Diese Sequenz enthält in allen sechs
Leserastern Stoppkodons, eine idealisierte Ribosomenbindestelle und Startkodons, damit die
Expression stromabwärts gelegener Gene nicht gestört wird (Datsenko und Wanner, 2000).
- 80 -
Ergebnisse
.
Abb. 4-36: Deletion eines Gens durch die λ-Red vermittelte Rekombination nach Datsenko
und Wanner (2000). H1 und H2 bezeichnen homologe Bereiche zur Zielsequenz, P1 und P2
die Sequenzen der Primer, die sich an das Resistenzgen anlagern. FRT bedeutet „FLP
recognition target“ und bezeichnet eine Sequenz, die von der FLP-Rekombinase erkannt
wird.
U
U
U
U
U
U
Deletion von nuoCD:
U
Es ist bekannt, dass zur Überproduktion des NADH-Dehydrogenase Fragmentes auch die
Gene nuoB und nuoCD, deren Produkte nicht Teil des Fragmentes sind, überexprimiert
werden müssen (Braun et al., 1998). Um zu überprüfen, welches Protein für die
Assemblierung des Fragmentes benötigt wird, sollte nuoCD im Plasmid pBADnuo deletiert
werden. Das Gen nuoCD wurde durch einen Austausch gegen eine KanamycinResistenzkassette deletiert. Die Kanamycin-Resistenzkassette wurde durch eine PCR am
Plasmid pKD4 mit den Primern LambdaCD1-rev und LambdaCD1-for, die flankierend
homologe Enden zu nuoCD enthielten, amplifiziert. Die Template-DNA wurde nach der PCR
mit KpnI geschnitten und das 1´547 bp große PCR-Produkt aufgereinigt. Das die λ-Red
Rekombinase kodierende Plasmid pKD46 wurde in E. coli DH5α mit dem Zielplasmid der
Rekombination, pBADnuo, transformiert. Nach der Transformation wurden die Zellen auf
LB-Medium mit Ampicillin und Chloramphenicol angezogen, um die Propagation sowohl
von pBADnuo als auch von pKD46 zu gewährleisten. Die Transformanden wurden bei 30°C
mit 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose angezogen, um die Expression der Rekombinase zu
induzieren. Die Zellen wurden elektrokompetent gemacht und mit 250 ng des PCR-Produktes
- 81 -
Ergebnisse
transformiert. Diese Transformanden wurden auf LB-Medium mit Chloramphenicol und
Kanamycin ausplattiert, um auf Klone zu selektionieren, bei denen die KanamycinResistenzkassette in das die Chloramphenicol-Resistenz tragende Plasmid pBADnuo insertiert
worden war. Die Plasmid-DNA von neun Kolonien wurde über das SpinPrep PCR
purification Kit (Novagen) aufgereinigt. Die E. coli Stämme BL21(DE3), DH5α und
RR1∆M15 wurden mit diesem Plasmid transformiert. Von dem Stamm BL21(DE3) wurde ein
Klon isoliert, der nach Restriktionsanalyse das erwartete Fragmentmuster für das Plasmid
pBADnuo/nuoCD::nptI aufwies (Abb. 4-37). Die nach Restriktionsanalyse mit den Enzymen
XbaI, NdeI, PstI, BglII und SalI erwarteten Fragmentmuster der Plasmide pBADnuo und
pBADnuo/nuoCD::nptI sind in Tab. 4-10 aufgeführt.
Tab. 4-10: Erwartete Fragmentgrößen der Plasmide pBADnuo und pBADnuo/nuoCD::nptI
nach Restriktionsverdau mit verschiedenen Enzymen.
Restriktionsenzym
XbaI
pBADnuo
pBADnuo/nuoCD::nptI
[bp]
[bp]
21´278
18´309
1´393
1´263
NdeI
21´278
12´879
8´086
PstI
17´229
9´342
4´049
7´574
4´049
BglII
9´939
9´939
9´181
7´509
2´158
2´158
1´359
SalI
19´303
- 82 -
20´965
Ergebnisse
Abb. 4-37: Restriktionsanalyse des Plasmids pBADnuo/nuoCD::nptI. Als Enzym eingesetzt
wurde XbaI (Spur 1), NdeI (Spur 2), PstI (Spur 3), BglII (Spur 5) und SalI (Spur 6). In Spur 4
wurde als Standard pUC-Mix 4 (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Der Stamm E. coli BL21(DE3)/pBADnuo/nuoCD::nptI wurde in 50 ml LB-Medium
angezogen und seine Plasmide mittels einer Midi-Präparation isoliert. Die KanamycinResistenzkassette wurde aus diesen Plasmiden mit der FLP-Rekombinase entfernt.
Flankierend zu der Kanamycin-Resistenzkassette liegen die Erkennungssequenzen der
Rekombinase, an denen die Kassette ausgeschnitten wird. Die FLP-Rekombinase ist auf dem
Plasmid pCP20 kodiert. In den Stamm BL21(DE3)/pBADnuo/nuoCD::nptI wurde das
Plasmid pCP20 über eine Elektroporation transformiert. Nach der Transformation wurden die
Zellen bei 30°C auf LB-Agar mit Chloramphenicol und Ampicillin angezogen. Einzelne
Kolonien wurden zunächst für 16 Std. bei 37°C in Medium mit Chloramphenicol und
Kanamycin und dann für 10 Std. bei 43°C zur Expression der FLP-Rekombinase in LBMedium mit Chloramphenicol angezogen. Aus Einzelkolonien wurden Plasmide präpariert
und durch Restriktionsanalysen mit RsrII und NcoI charakterisiert (Abb. 4-38). Nach
Entfernung der Kanamycin-Resistenzkassette aus pBADnuo sollte der Schnitt mit RsrII zu
einer Linearisierung eines 19´572 bp großen DNA-Fragmentes führen (Abb. 4-38, Spur 2).
Bei nicht erfolgter Rekombination sollten zwei Fragmente mit Größen von 14´496 und
6´469 bp entstehen. Die Restriktion des Plasmids pBADnuo/∆nuoCD mit NcoI sollte drei
Fragmente mit den Größen 12´330, 5´903 und 1´339 bp ergeben (Abb. 4-38, Spur 3). Aus
dem nicht rekombinierten Plasmid pBADnuo würden bei Restriktion mit NcoI vier Fragmente
mit 8´306, 5´903, 5´417 und 1´339 bp entstehen.
- 83 -
Ergebnisse
Abb. 4-38: Restriktionsanalyse von pBADnuo/∆nuoCD. In Spur 1 ist der Restriktionsverdau
der Probe mit NcoI, in Spur 2 der Restriktionsverdau mit RsrII und in Spur 3 der DNAStandard λ-DNA/EcoRI+HindIII (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Das Plasmid mit dem erwarteten Fragmentmuster nach RsrII- und NcoI-Verdau wurde mit
einer Midi-Präparation isoliert und sequenziert. Die Sequenzierung zeigte, dass nuoCD aus
dem Plasmid pBADnuo deletiert wurde und dass durch die Rekombination eine „Narbe“ von
85 bp zurückblieb, die eine idealisierte Ribosomenbindestelle, sowie Startkodons in allen drei
Leserastern enthält (Datsenko und Wanner, 2000).
Die Deletionsmutante pBADnuo/∆nuoCD wurde weiterhin von Frau Saskia Kissel verwendet,
um den Effekt der Deletion von nuoCD auf die Assemblierung von Komplex I bei Expression
von pBADnuo/∆nuoCD zu untersuchen (Kissel, 2003). Das Plasmid pBADnuo/∆nuoCD
wurde durch Elektroporation in E. coli BL21(DE3) transformiert, die Zellen angezogen und
nach Induktion mit 0.2% (w/v) L-(+)-Arabinose nach 3 Std. Wachstum bei einer OD600 von
B
B
0.8 geerntet. Die Bakterien wurden durch einen einmaligen Durchgang in einer „French
Press“ aufgeschlossen. Das Cytosol wurde als Überstand einer Ultrazentrifugation erhalten
und durch Ultrafiltration etwa 10-fach aufkonzentriert. Es wurde eine NADH-reduzierte und
eine Luftsauerstoff-oxidierte Probe angesetzt. Die Differenz dieser Spektren ist in Abb. 4-39
gezeigt. Es sind deutlich die Signale der Fe/S-Zentren des NADH-Dehydrogenase Fragments
zu erkennen. Dies zeigt, dass NuoCD nicht essentiell für die Assemblierung dieses
Fragmentes ist.
- 84 -
Ergebnisse
Abb. 4-39: ESR (reduziert-minus-oxidiert) Differenz Spektrum des Cytosols des Stammes
BL21(DE3)/pBADnuo/∆nuoCD. Das Spektrum wurde bei 40 K und 50 mW
Mikrowellenleistung aufgenommen. Im Bereich zwischen 310 und 330 mT sind noch Reste
des Mn2+-Signals zu erkennen, was auf eine gering unterschiedliche Proteinkonzentration der
beiden Proben zurückzuführen ist. Die Proteinkonzentration betrug etwa 50 mg/ml.
P
P
Deletion von nuoM:
U
Mit Hilfe eines radioaktiv-markierten und photoaktivierbaren Ubichinon-Analog wurde
NuoM selektiv markiert (Gong et al., 2004). Um die Rolle von NuoM bei der UbichinonBindung zu untersuchen, sollte das Gen nuoM im Plasmid pBADnuo mutiert werden. Für die
Komplementation mit dem mutierten Gen sollte nuoM zunächst aus pBADnuo deletiert
werden. Außerdem sollte die Assemblierung des Komplexes in der Deletionsmutante
pBADnuo/∆nuoM untersucht werden.
Zunächst wurde in pBADnuo nuoM durch eine Kanamycin-Resistenzkassette ersetzt. Hierfür
wurde die Resistenzkassette auf dem Plasmid pKD4 mit den Primern Lambda-M-L und
Lambda-M-N amplifiziert, die flankierend für je 40 Basen kodierten, die homolog zu den
stromauf- und stromabwärts zu nuoM gelegenen Bereichen sind. Das PCR-Produkt mit einer
Größe von 1´547 bp wurde mit einer Ethanolfällung gereinigt und durch Elektroporation in
Zellen transformiert, die das Zielplasmid pBADnuo sowie das die λ-Red Rekombinase
kodierende Plasmid pKD46 enthielten. Diese Zellen waren mit 0.2 % L(+)-Arabinose bei
30°C angezogen worden. Die Transformanden wurden auf LB-Medium mit Chloramphenicol
- 85 -
Ergebnisse
und Kanamycin ausplattiert, um Zellen zu selektionieren, bei denen die KanamycinResistenzkassette in das die Chloramphenicol-Resistenz tragende Plasmid pBADnuo insertiert
worden war. Kolonien wurden für 16 Std. in LB-Medium angezogen, ihre Plasmide mit einer
Mini-Präparation isoliert und durch Restriktion mit NdeI analysiert. Das Plasmid
pBADnuo/nuoM::nptI sollte zwei Fragmente der Größen 18´860 und 2´369 bp ergeben,
während bei nicht erfolgter Rekombination nur ein Fragment von 21´278 bp entstehen sollte.
Alle untersuchten Klone zeigten das Restriktionsmuster von
pBADnuo/nuoM::nptI
(Abb. 4-40).
Abb. 4-40: Restriktionsanalyse von vier verschiedenen Präparationen des Plasmids
pBADnuo/nuoM::nptI mit dem Enzym NdeI (Spur 1 bis 4). Als Standard aufgetragen wurde
pUC-Mix 4 (Spur 5; MBI Fermentas, St- Leon-Rot).
Zellen mit dem Plasmid pBADnuo/nuoM::nptI wurden elektrokompetent gemacht und mit
dem Plasmid pCP20, das für die FLP-Rekombinase kodiert, transformiert. Die Zellen wurden
bei 30°C auf LB-Medium mit Ampicillin und Chloramphenicol angezogen, um die
Propagation beider Plasmide zu gewährleisten. Anschließend wurde zur Induktion der
Expression der FLP-Rekombinase für 16 Std. bei 37°C inkubiert. Aus den Kulturen wurden
die Plasmide isoliert und mit einer Restriktionsanalyse untersucht. Tab. 4-11 zeigt die zur
Analyse verwendeten Restriktionsenzyme und die erwarteten Fragmentgrößen.
- 86 -
Ergebnisse
Tab. 4-11: Erwartete Fragmentgrößen der Plasmide pBADnuo/∆nuoM
pBADnuo/nuoM::nptI nach Restriktionsverdau mit verschiedenen Enzymen.
Restriktionsenzym
PstI
pBADnuo/∆nuoM
pBADnuo/nuoM::nptI
[bp]
[bp]
17´229
17´229
2´607
2´881
und
1´119
XbaI
12´037
12´037
7´799
7´799
1´393
BglII
9´181
9´181
8´487
6´944
2´158
2´946
2´158
Die Zellen einer Kolonie, die das erwartete Fragmentmuster zeigte (Abb. 4-41), wurden
angezogen und deren Plasmide mit einer Midi-Präparation isoliert. Durch eine Sequenzierung
wurde die Deletion von nuoM in pBADnuo bestätigt.
Abb. 4-41: Restriktionsanalyse des Plasmids pBADnuo/∆nuoM. Als Standard wurde pUCMix 4 verwendet (Spur 4; MBI Fermentas, St. Leon-Rot). Als Restriktionsenzym wurde PstI
(Spur 1), XbaI (Spur 2) und BglII (Spur 3) eingesetzt.
- 87 -
Ergebnisse
Deletion von nuoE bis nuoG:
U
Das NADH-Dehydrogenase Fragment ist homolog zu der Familie der NAD-abhängigen
[NiFe]-Hydrogenasen (Friedrich und Scheide, 2000). Um zu überprüfen, ob eine dieser
Hydrogenasen in der Lage ist, das NADH-Dehydrogenase Fragment im Komplex I
funktionell zu ersetzen, sollte die Gengruppe nuoE bis G aus dem Plasmid pBADnuo deletiert
werden. Das Plasmid pBADnuo/∆nuoEFG sollte zusammen mit einem Plasmid in einem
Komplex I Deletionsstamm exprimiert werden, dass die zu nuoE, F und G homologen
Hydrogenasegene enthält (Schmitz et al., 2002).
Die Gengruppe nuoE-G sollte durch eine Kanamycinresistenzkassette ersetzt werden, die am
Plasmid pKD4 amplifiziert wurde. Dafür wurden die Primer –EFG-CD und –EFG-H
verwendet, die sich jeweils an das 5´- bzw. 3´-Ende der Kanamycinkassette anlagern sollen
und außerdem homolog zu je 40 bp der Gene nuoCD und nuoH waren. Die Gengruppe nuoEG konnte jedoch in mehreren Versuchen mit veränderten Bedingungen nicht durch die
Kanamycin-Resistenzkassette ersetzt werden. Vermutlich ist der zu ersetzende Bereich mit
4´613 bp zu groß, um die Rekombination zu ermöglichen. Da das große Plasmid pBADnuo
wahrscheinlich stark verdrillt vorliegt, können sich die homologen Enden der 1´467 bp großen
Kanamycinkassette nicht an die stromauf- und abwärts von nuoE-G gelegenen Bereiche
anlagern. Daher wurde versucht, die Gene nuoE und F sowie nuoG einzeln mittels der λ-Red
vermittelten Rekombination zu deletieren und in einem dieser Konstrukte den jeweils anderen
Bereich zu entfernen. Im Fall von nuoE-F würden 1´334 bp deletiert werden, bei nuoG 2´732
bp.
Die Kanamycin-Resistenzkassette wurde mit jeweils homologen Enden zu den stromaufwärts
und stromabwärts zu nuoEF bzw. nuoG gelegenen Bereichen amplifiziert. Zur Deletion von
nuoEF wurden dabei die Primer –EFG-CD und –EF-rev verwendet, zur Deletion von nuoG
die Primer –G-for und –EFG-H. Die PCR-Produkte wurden aufgereinigt und anschließend in
elektrokompetente DH5α/pBADnuo+pKD46 transformiert, die zuvor bei 30°C mit 0.2 %
(w/v) L(+)-Arabinose angezogen worden waren. Die Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit
Chloramphenicol und Kanamycin ausgestrichen. Auf diesem Medium sollten nur Zellen
wachsen, die das Chloramphenicol-resistente Plasmid pBADnuo mit der insertierten
Kanamycin-Resistenzkassette enthalten. Kolonien wurden in jeweils 4 ml LB-Medium für
16 Std. bei 37°C angezogen. Nach Mini-Präparation wurden die Plasmide durch
Restriktionsverdau mit XbaI analysiert. Das Plasmid pBADnuo sollte in ein lineares Fragment
- 88 -
Ergebnisse
von 21´278 bp geschnitten werden, während das Plasmid pBADnuo/nuoEF::nptI in drei
Fragmente von 16´415, 3´093 und 1´393 bp gespalten werden sollte. Nahezu alle Klone
zeigten das erwartete Fragmentmuster (Abb. 4-42).
Abb. 4-42: Restriktionsanalyse des Plasmids pBADnuo/nuoEF::nptI mit dem Enzym XbaI
(Spur 1 und 2). Als Standard wurde λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 3; MBI Fermentas,
St. Leon-Rot) aufgetragen.
Die Insertion der Kanamycin-Resistenzkassette in das Plasmid pBADnuo anstelle der Gene
nuoE und F wurde durch eine Sequenzierung bestätigt (s. Anhang). Die Resistenzkassette
wurde entfernt, indem das Plasmid pBADnuo/nuoEF::nptI mit dem Plasmid pCP20 in E. coli
DH5α kotransformiert wurde. Die Expression der FLP-Rekombinase wurde durch Anzucht
der Zellen bei 42°C induziert. Die Plasmide wurden aus den Zellen mit einer MiniPräparation isoliert und mit dem Restriktionsenzym XbaI analysiert (Tab. 4-12, Abb. 4-43).
Tab. 4-12: Fragmentgrößen der Plasmide pBADnuo, pBADnuo/nuoEF::nptI
pBADnuo/∆nuoEF nach Verdau mit dem Restriktionsenzym XbaI.
pBADnuo
pBADnuo/nuoEF::nptI
pBADnuo/∆nuoEF
[bp]
[bp]
[bp]
21´641
16´415
16´415
3´093
3´093
1´393
- 89 -
und
Ergebnisse
Abb. 4-43: Restriktionsanalyse der Plasmide pBADnuo (Spur 1), pBADnuo/nuoEF::nptI
(Spur 2) und pBADnuo/∆nuoEF (Spur 3) mit dem Enzym XbaI. Als Standard wurde
λ-DNA/EcoRI+HindIII verwendet (Spur 4; MBI Fermentas, St. Leon-Rot).
Die Insertion der Kanamycin-Resistenzkassette in nuoG wurde über einen Restriktionsverdau
mit HindIII, PstI und NcoI analysiert (Abb. 4-44). Die erwarteten Fragmentgrößen zeigt Tab.
4-13.
Tab. 4-13: Erwartete Fragmentgrößen der Plasmide pBADnuo und pBADnuo/nuoG::nptI bei
Restriktionsanalyse mit verschiedenen Enzymen.
Restriktionsenzym
HindIII
pBADnuo
pBADnuo/nuoG::nptI
[bp]
[bp]
10´938
10´775
6´549
6´549
2´710
2´710
1´081
PstI
17´229
11´278
4´049
4´707
4´049
NcoI
14´036
9´121
5´903
5´903
1´339
3´671
1´339
- 90 -
Ergebnisse
Abb. 4-44: Restriktionsanalyse des Plasmids pBADnuo/nuoG::nptI mit den
Restriktionsenzymen HindIII (Spur 1), PstI (Spur 2) und NcoI (Spur 3). Als Standard wurde
λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 4; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet.
Nach Transformation des Plasmids in elektrokompetente DH5α/pBADnuo/nuoG::nptI und
anschließende Hitzeinduktion der Expression der FLP-Rekombinase bei 42°C wurden die
Plasmide aus einzelnen Kolonien durch Mini-Präparation isoliert und mit XhoI analysiert
(Tab. 4-14; Abb. 4-45).
Tab. 4-14: Erwartete Fragmentgrößen bei Restriktionsanalyse der Plasmide pBADnuo,
pBADnuo/∆nuoG und pBADnuo/nuoG::nptI mit dem Enzym XbaI.
pBADnuo
pBADnuo/∆nuoG
pBADnuo/nuoG::nptI
[bp]
[bp]
[bp]
21´278
13´674
13´674
4´967
4´967
1´393
- 91 -
Ergebnisse
Abb. 4-45: Restriktionsanalyse der Plasmide pBADnuo/nuoG::nptI (Spur 1),
pBADnuo/∆nuoG (Spur 2) und pBADnuo (Spur 3) mit XbaI. Als Standard wurde λDNA/EcoRI+HindIII (Spur 4; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Die korrekte Sequenz von pBADnuo/∆nuoG wurde durch eine Sequenzierung bestätigt (s.
Anhang). Es wurde noch nicht versucht, in diesem Plasmid eine Deletion der Gene
nuoE und F bzw. eine Deletion von nuoG im Plasmid pBADnuo/∆nuoEF durchzuführen.
4.5.2 Punktmutationen in nuoM
Die Untereinheit NuoM wurde mit einem radioaktiv markierten, photoaktivierbaren AzidoUbichinon-Derivat
(3-Azido-2-methyl-5-methoxy[3H]-6-decyl-1,4-benzochinon)
markiert
und der Bereich des Proteins, an den das Derivat gebunden hatte, durch Sequenzierung
tryptischer Fragmente identifiziert (Gong et al., 2003). Anhand von elektrochemischinduzierten FT-IR Differenzspektren in Gegenwart und Abwesenheit von Ubichinon wurde
außerdem vermutet, dass Lysin(e) und Aspartat(e) oder Glutamat(e) an der Chinon-Bindung
beteiligt sind (P. Hellwig, mündliche Mitteilung). Ein Sequenzvergleich ergab, dass in dem
mit dem Chinon-Derivat markierten Bereich von NuoM ein Leucin und ein Aspartat an den
Positionen 244 bzw. 246 konserviert sind (Abb. 4-46). Das Leucin sollte zu Isoleucin und das
Aspartat zu einem Asparagin in dem Plasmid pBADnuo mutiert werden. Der Komplex sollte
in den Mutanten produziert und charakterisiert werden.
- 92 -
Ergebnisse
E.
S.
S.
Y.
R.
R.
S.
M.
221
* *
255
YLLMLGFFIAFAVKMPVVPLHGWLPDAHSQAPTAG
YLLMLGFFIAFAVKMPVVPLHGWLPDAHSQAPTAG
YLLMLGFFIAFAVKMPVVPLHGWLPDAHSQAPTAG
YLLMLGFFIAFAVKMPVVPLHGWLPDAHSQAPTAG
TLLFLAFFASFAVKMPMWPVHTWLPDAHVQAPTAG
QILWWAIFIAFAVKIPIIPFHTWLPDAHVQAPTSG
SWLFFAFLVAFAVKVPMVPVHTWLPDAHVQAPTAG
KALFLGFMFAFAIKAPLWPFHRWLPDAAVESTPAT
coli
flexneria
typhimurium
pestis
capsulatus
conorii
meliloti
tuberculosis
Abb. 4-46: Sequenzvergleich der NuoM-Homologen von E. coli, S. flexneria (Shigella
flexneria), S. typhimurium (Salmonella typhimurium), Y. pestis (Yersinia pestis), R. capsulatus
(Rhodobacter capsulatus), R. conorii (Rickettsia conorii), S. meliloti (Sinorhizobium meliloti)
und M. tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis). Die Nummerierung bezieht sich auf die E.
coli-Sequenz. Das konservierte Leucin an Position 244 und Aspartat an Position 246, die an
der Ubichinonbindung beteiligt sein könnten, sind rot gedruckt und mit einem Stern markiert.
Die Punktmutationen Leu244Ile und Asp246Asn wurden über eine Mutagenese-PCR im
P
P
P
P
Subklon pBAD-C1 in nuoM eingeführt. Für die Mutation Leu244Ile wurde das Kodon CTG
P
P
gegen das Kodon ATC ausgetauscht, so dass eine Schnittstelle für das Enzym BamHI
entstand. Für die Mutation Asp246Asn wurde das Kodon GAT gegen das Kodon AAT
P
P
ausgetauscht, allerdings musste eine weitere Base im Primer ausgetauscht werden, so dass
eine Erkennungssequenz für das Enzym NcoI entstand.
Der Subklon pBAD-C1 wurde jeweils als Template-DNA zur Mutagenese-PCR eingesetzt.
Für das Plasmid pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile) wurden die Primer Leu244Ile-for und -rev, für
P
P
das Plasmid pBAD-C1/nuoM(Asp246Asn) die Primer Asp246Asn-for und -rev eingesetzt. Die
P
P
PCR-Produkte wurden aufgereinigt und in E. coli DH5α transformiert. Einzelne Kolonien
wurden über Nacht angezogen, die Plasmide über eine Mini-Präparation isoliert und durch
Restriktionsanalyse auf den Basenaustausch überprüft. Bei der Restriktionsanalyse der
Mutation pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile) mit BamHI sollten Fragmente der Größe 4´230, 363 und
P
P
153 bp entstehen, während im Fall des Plasmids pBAD-C1 zwei Fragmente von 4´593 und
153 bp entstehen sollten. Bei drei Klonen wurde das Fragmentmuster des Plasmids pBADC1/nuoM(Leu244Ile) nachgewiesen (Abb. 4-47). Das 153 bp große Fragment ist aufgrund
P
P
seiner geringen Länge nicht zu sehen.
- 93 -
Ergebnisse
Abb.
4-47:
Restriktionsanalyse
der
Plasmide
pBAD-C1
(Spur
1)
und
pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile) (Spur 3) nach Behandlung mit BamHI. Als Standard wurde in
Spur 2 λ-DNA/EcoRI+HindIII (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
P
P
Für die Mutation pBAD-C1/nuoM(Asp246Asn) wurde nach Restriktion mit NcoI ein
P
P
Fragmentmuster aus drei Fragmenten der Größen 2´791, 1´339 und 616 bp erwartet. Das
Plasmid pBAD-C1 sollte entsprechend zwei Fragmente von 3´407 und 1´339 bp ergeben. Es
wurden drei Klone identifiziert, die das erwartete Restriktionsmuster des Plasmids
pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile) zeigten (Abb. 4-48).
P
P
Abb. 4-48: Restriktionsanalyse des Plasmids pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile) (Spur 1) und
pBAD-C1 (Spur 3) nach Behandlung mit NcoI. Als Standard wurde λ-DNA/EcoRI+HindIII
(Spur 2; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
P
P
Die jeweiligen Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt (s. Anhang). Aus den
gewünschten Plasmiden wurde ein HincII-Fragment mit der jeweiligen Mutation erzeugt, das
- 94 -
Ergebnisse
in das Plasmid pBADnuo rekombiniert werden sollte (Abb. 4-49). Um die Punktmutationen
über die λ-Red Rekombinase in pBADnuo einzuführen, wurden lineare DNA-Fragmente mit
den entsprechenden Mutationen in E. coli Zellen transformiert, die die Ziel-DNA sowie ein
λ-Red Rekombinase exprimierendes Plasmid trugen (Abb. 4-49). Es wurde nicht auf eine
Antibiotika-Resistenz selektioniert, weil die auf dem Plasmid kodierte Resistenz durch
Einführen der Mutation nicht verändert wurde.
Abb. 4-49: Allgemeines Schema zur Einführung einer Mutation in das Genom oder in ein
Plasmid mittels λ-Red Rekombinase. Zellen, die die Ziel-DNA, in die die Mutation eingeführt
werden soll, und das Plasmid pKD46 enthalten, das für die Rekombinase kodiert, werden bei
30°C angezogen. Nach Transformation mit einem linearen DNA-Fragment (grün dargestellt),
das die betreffende Mutation enthält und flankierend dazu einen mindestens 36 bp großen
homologen Bereich aufweist, in den die Mutation eingeführt werden soll, wird durch
L(+)-Arabinose die Produktion der λ-Red Rekombinase induziert, die die Rekombination
katalysiert. Durch Anzucht bei 37°C geht das Plasmid pKD46 aufgrund seines
temperatursensitiven Replikationsursprungs verloren.
- 95 -
Ergebnisse
Tab. 4-15: Erwartete Fragmentgrößen bei Restriktion der Plasmide pBADnuo und
pBADnuo/nuoM(Mutation) mit verschiedenen Enzymen.
Restriktionsenzym pBADnuo
Mutation
pBADnuo/nuoM(Mutation)
[bp]
BamHI
[bp]
Leu244Ile
7´893
7´893
P
P
7´231
7´231
4´395
4´395
1´518
1´155
153
363
88
153
88
NcoI
14´036
Asp
246
P
Asn
14´036
P
5´903
5´287
1´339
1´339
616
Die Restriktionsanalyse des Plasmids pBADnuo/nuoM zeigte, dass keiner der Klone das
erwartete Fragmentierungsmuster (Tab. 4-15) der Mutation nuoM(Leu244Ile) trug (Abb. 4-50).
P
P
Anscheinend war die Rekombination nicht effizient genug. Trotz Variation verschiedener
Parameter der Rekombinationsansätze, wobei vor allem verschiedene Konzentrationen des
mutierten Fragmentes eingesetzt wurden, gelang es nicht, die Mutation, die zu dem Austausch
Leu244Ile in NuoM führt, in pBADnuo einzuführen. In dem Rekombinationsansatz, der zu der
P
P
Mutation nuoM(Asp246Asn) führen sollte, wurde jeweils ein Gemisch der Plasmide pBADnuo
P
P
und pBADnuo/nuoM(Asp246Asn) isoliert (Abb. 4-50). Auch nach mehrfacher Verdünnung der
P
Plasmide
und
P
Retransformation
in
E.
coli
pBADnuo/nuoM(Asp246Asn) nicht vereinzelt werden.
P
P
- 96 -
DH5α
konnte
die
Mutante
Ergebnisse
Abb. 4-50: Restriktionsanalyse der Rekombinationsansätze zur Erzeugung der Mutationen
Leu244Ile (Spur 1) und Asp245Asn (Spur 3) auf NuoM. Die isolierten Plasmide wurden mit
BamHI (Spur 1) und NcoI (Spur 3 und 4) geschnitten. Spur 1 zeigt das Fragmentmuster von
pBADnuo und Spur 3 ein Gemisch der Plasmide pBADnuo/nuoM(Asp245Asn) und pBADnuo.
Spur 4 zeigt das Fragmentmuster des Plasmids pBADnuo. Als Standard wurde
λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 2) und pUC-Mix 4 (Spur 5; beide MBI Fermentas, St. LeonRot) aufgetragen.
P
P
P
P
P
P
Daraufhin wurde versucht, die Mutationen mittels λ-Red vermittelter Rekombination in ein
Plasmid einzubringen, in dem nuoL und nuoM durch eine nptI-sacR-sacB-Kassette ersetzt
worden war (pBADnuo/nuoLM::nptI-sacB, von Thomas Pohl aus dem Arbeitskreis zur
Verfügung gestellt). Zellen mit diesem Plasmid können nur auf Medium ohne Saccharose
wachsen und können über ihre Kanamycin-Resistenz selektioniert werden. Die Gene nuoL
und
nuoM
wurden
an
den
Plasmiden
pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile)
P
P
und
pBAD-C1/nuoM(Asp246Asn) amplifiziert und mit pBADnuo/nuoLM::nptI-sacB rekombiniert,
P
P
indem die aufgereinigten PCR-Produkte in DH5α/pBADnuo/nuoLM::nptI-sacB+pKD46
transformiert wurden, die zuvor in Medium mit 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose angezogen und
anschließend elektrokompetent gemacht wurden. Die Zellen wurden auf LB-Medium mit
Saccharose und Chloramphenicol angezogen, um auf den Verlust der nptI-sacR-sacBKassette zu selektionieren. Zwar wuchsen einige Kolonien auf diesem Medium; eine MiniPräparation zeigte allerdings, dass sie keine Plasmide enthielten. Da diese Zellen resistent
gegenüber Chloramphenicol waren, wurde angenommen, dass die ChloramphenicolResistenzkassette in das Genom an einer unbekannten Stelle integriert wurde.
Da es nicht gelang, die gewünschten Mutationen in NuoM in das Plasmid pBADnuo zu
rekombinieren, wurde in einem nächsten Schritt versucht, nuoM in einen Expressionsvektor
einzubringen und damit die Expression aller nuo-Gene von dem Plasmid pBADnuo/∆nuoM
zu komplementieren. Diese Methode hätte den Vorteil, dass alle gewünschten Mutationen in
nuoM direkt in dieses Konstrukt eingebracht werden könnten.
- 97 -
Ergebnisse
Zunächst wurde nuoM in den Vektor pET11-a kloniert. Hierzu wurde das Gen in einer PCR
mit den Primern pET11M-NdeI und pET11M-NheI so amplifiziert, dass es von den
Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme NdeI und NheI flankiert wurde. Das PCRProdukt und der Vektor pET11-a wurden mit diesen Enzymen geschnitten und ligiert. Nach
Transformation des Ligationsansatzes in E. coli wurden auf Ampicillin-haltigen LBAgarplatten allerdings keine Kolonien gefunden. Mehrere Versuche mit Variationen bei der
PCR-Amplifizierung, der Aufreinigung der Restriktionsansätze und des Ligationsansatzes
führten nicht zu der Klonierung von nuoM in pET11-a. Der Versuch, das Gen nach
Behandlung mit NheI und NdeI in den Vektor pET24-a zu klonieren, scheiterte ebenfalls.
pET24-a unterscheidet sich von pET11-a durch die komplementäre Lage der MCS, in diesem
Konstrukt würde das Gen in der falschen Orientierung vorliegen und nicht exprimiert werden.
So kann ausgeschlossen werden, dass eine mögliche basale Produktion von NuoM, das nach
Sekundärstrukturvorhersagen zehn transmembrane Helices besitzt (Fearnley und Walker,
1992; Weidner et al., 1993), letal für die Zellen ist. In Kontrollexperimenten wurde die
Aktivität der Restriktionsenzyme nachgewiesen. Warum die Klonierung erfolglos blieb, ist
unklar.
In einem weiteren Versuch sollte nuoM mit der λ-Red vermittelten Rekombination in das
Plasmid pET24-a eingebracht werden, das eine Kanamycin-Resistenz besitzt. Da das Plasmid
pKD46 eine Ampicillin-Resistenz vermittelt, wird durch Verwendung beider Antibiotika die
gleichzeitige Propagation beider Plasmide sichergestellt. Das Gen nuoM wurde über eine PCR
mit den Primern 24Mred-for und 24Mred-rev amplifiziert, die jeweils homolog zu 20 Basen
des 3´- und 5´-Endes von nuoM sind und flankierend jeweils 30 Basen der MCS des Vektors
enthielten. Als Matrize wurde das Plasmid pBADnuo verwendet. Das PCR-Produkt mit einer
Größe von 1´376 bp wurde durch Gelelektrophorese nachgewiesen (Abb. 4-51).
- 98 -
Ergebnisse
Abb. 4-51: Gelelektrophoretische Auftrennung des PCR-Ansatzes zur Amplifizierung von
nuoM (Spur 1). Es wurde eine Größe von 1´376 bp erwartet. Als Standard wurde
λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 2; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) verwendet.
Die Plasmide pKD46 und pET-24a wurden durch Elektroporation in E. coli DH5α
kotransformiert. Die Zellen wurden bei 30 °C 1 Std. geschüttelt und eine Übernachtkultur in
50 ml LB-Medium mit Ampicillin und Kanamycin bei 30 °C angesetzt. Die Expression der
Rekombinase wurde mit 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose induziert, die Zellen elektrokompetent
gemacht und auf Eis gelagert. Danach wurde das amplifizierte PCR-Produkt durch
Elektroporation in die elektrokompetenten Zellen transformiert und der Ansatz 1 Std. bei
30°C geschüttelt. Die Zellen wurden auf LB-Medium mit Kanamycin ausplattiert und über
Nacht bei 37 °C inkubiert, um die weitere Replikation von pKD46 zu unterbinden. Eine
Restriktionsanalyse der isolierten Plasmide einer Übernachtkultur zeigte, dass nur der leere
Vektor isoliert worden war. Es wurde angenommen, dass die erfolgreiche Rekombination zu
selten stattfand und somit die Anzahl positiver Klone zu gering war. Um zwischen Zellen, die
das Plasmid ohne Insert und das rekombinierte Plasmid mit nuoM beinhalten, zu
unterscheiden, sollte daher der Vektor pETBlue-1 (s. Anhang) mit einer Blau-Weiß-Selektion
verwendet werden.
Das Gen nuoM wurde mit den Primern pETBlueM2-for und pETBlueM2-rev amplifiziert, die
jeweils für 40 Nukleotide kodierten, die homolog zur MCS von pETBlue-1 waren und den
Start- bzw. den Stopp-Bereich von nuoM enthielten. Als Matrize diente das Plasmid
pBADnuo. Das PCR-Produkt mit einer Größe von 1´584 bp, das im Folgenden als BlueM
bezeichnet wird, wurde durch Gelelektrophorese nachgewiesen (Abb. 4-52).
- 99 -
Ergebnisse
Abb. 4-52: Gelelektrophoretische Auftrennung des PCR-Ansatzes zur Amplifizierung von
nuoM mit zum Vektor pETBlue-1 homologen Enden (Spur 1). Es wurde eine Größe von
1´584 bp erwartet. Als Standard verwendet wurde λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 2; MBI
Fermentas, St. Leon-Rot).
Das Plasmid pKD46 wurde durch Elektroporation in E. coli DH5α transformiert. Die Zellen
wurden bei 30°C für 1 Std. geschüttelt, in 50 ml LB-Medium mit Ampicillin übergeimpft und
für 16 Std. angezogen. Die Zellen wurden elektrokompetent gemacht und die Expression der
Rekombinase mit 0.2 % (w/v) L(+)-Arabinose induziert. In diese Zellen wurde das Plasmid
pETBlue-1 und das aufgereinigte PCR-Produkt BlueM transformiert. Der Ansatz wurde nach
Schütteln für 1 Std. bei 37 °C abzentrifugiert, die Zellen in 100 µl SOC-Medium
resuspendiert und nach Zugabe von 10 µl 0.1 M IPTG auf LB-Medium mit Ampicillin und XGal ausplattiert. Die Zellen wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert und anschließend bei 4°C
gelagert, um die Farbreaktion zu fördern. Da sowohl der leere Vektor als auch das
rekombinante Plasmid für eine Ampicillin-Resistenz kodieren, wurde die Zellsuspension vor
dem Ausplattieren 1:20 mit LB-Medium verdünnt, um Einzelkolonien auf den Platten zu
erhalten. Auf der Schale wuchsen neben einigen blauen auch eine große Anzahl weißer
Kolonien, die das rekombinierte Plasmid enthalten sollten (Abb. 4-53).
- 100 -
Ergebnisse
Abb. 4-53: LB-Ampicillin-Schale mit X-Gal nach Ausstrich der Transformation des PCRProduktes BlueM in E. coli DH5α/pETBlue-1+pKD46.
Von 12 weißen Kolonien wurden Übernachtkulturen mit Ampicillin angesetzt, die Plasmide
präpariert und mit Eco31I und XbaI+ScaI geschnitten (Abb. 4-54). Die erwarteten Fragmente
sind in Tab. 4-16 aufgeführt.
Tab. 4-16: Erwartete Fragmentgrößen bei Restriktion der Plasmide pETBlue-1 und
pETBlue-1/nuoM mit verschiedenen Enzymen.
Restriktionsenzym
Eco31I
XbaI + ScaI
pETBlue-1
pETBlue-1/nuoM
[bp]
[bp]
2´385
3´911
1´091
1´095
1´995
3´525
1´481
1´421
- 101 -
Ergebnisse
Abb. 4-54: Restriktionsanalyse mit den Enzymen Eco31I (Spur 1) und XbaI + ScaI (Spur 3)
der Rekombinationsansätze des PCR-Produktes BlueM in das Plasmid pETBlue-1. Als
Standard wurde λ-DNA/EcoRI+HindIII (Spur 2; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Aus allen Kulturen wurde das Plasmid pETBlue-1 isoliert, obwohl die ausgesuchten Kolonien
weiß gewesen waren. Diese Kolonien besaßen einen Durchmesser von über 1 mm, so dass
eine fehlende Anfärbung trotz einer aktiven β-Galaktosidase nicht auf einer zu geringen
Größe der Kolonien beruht. Trotz mehrfacher Versuche mit abgeänderten Bedingungen
konnten nur noch blaue Kolonien gefunden werden. Die Methode der Blau-weiß-Selektion
war aus nicht bekannten Gründen für die Selektion von rekombinanten Zellen nicht geeignet.
4.6 Mutagenese an einem Fe/S-Bindemotiv auf NuoG
Die vier konservierten Cysteine auf NuoG, die ein zusätzliches Bindemotiv für ein Fe/SZentrum ausbilden, wurden mittels einer PCR-basierenden Mutagenese zu Alaninen
mutagenisiert. Hierbei wurden Primer eingesetzt, in denen jeweils ein oder mehrere Basen
gegenüber der Template-Sequenz ausgetauscht waren, wodurch die beabsichtigte Mutation
eingeführt wurde. In einer PCR wurden die Primer mit den veränderten Basen verlängert. Die
Template-DNA wurde durch das Restriktionsenzym DpnI abgebaut, das nur methylierte DNA
spaltet und nicht das unmethylierte PCR-Produkt (Abb. 4-55). Das zirkuläre, aber nicht
ligierte PCR-Produkt wurde in E. coli Zellen transformiert, die das Plasmid ligierten und
replizierten.
- 102 -
Ergebnisse
Abb. 4-55: Schematische Darstellung einer ortsgerichteten Punktmutation mittels PCR auf
einem Plasmid. Die Primer mit der gewünschten Mutation (durch ein x dargestellt) lagern
sich an das Template an (1) und werden verlängert, ohne ligiert zu werden (2). Das Plasmid
mit der Mutation liegt aber zirkulär vor. Nach Abbau des Ausgangsplasmids (4) wird das
PCR-Produkt in E. coli-Zellen transformiert, wo es ligiert und propagiert wird (3) (nach dem
Manual des QuikChange® II Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene).
Als Template wurde der Subklon pBAD-B2 eingesetzt, der die Gengruppe nuoF´-nuoI´enthält
und 7´184 bp groß ist. Das Plasmid pET11-a/nuoB-G/NuoFC, in das letztendlich die
B
B
Mutationen eingeführt werden sollten, war mit 13´059 bp zu groß für eine Mutagenese-PCR.
Als Primer wurden für die Mutante pBAD-B2/NuoG(Cys230Ala) die Oligonukleotide N1cP
P
Pvuf und N1c-Pvur eingesetzt, für die Mutante pBAD-B2/NuoG(Cys233Ala) die
P
P
Oligonukleotide N1c2 und N1c2r, für die Mutante pBAD-B2/NuoG(Cys237Ala) die
P
P
Oligonukleotide N1c3 und N1c3r und für die Mutante pBAD-B2/NuoG(Cys265Ala) die
P
P
Oligonukleotide N1c4 und N1c4r. Nach der PCR wurde das Plasmid pBAD-B2 durch DpnI
fragmentiert und die amplifizierten Plasmide in E. coli transformiert. Nach der
Transformation wurde der Ansatz auf LB-Medium mit Ampicillin ausgestrichen. Jeweils
sechs der Kolonien wurden für 16 Std. bei 37°C in LB-Medium mit Ampicillin angezogen,
aus diesen Übernachtkulturen die Plasmide isoliert und die erwünschten Klone durch
Restriktionsanalyse identifiziert. Aus diesen Klonen wurde jeweils ein DraIII-Fragment mit
der betreffenden Mutation herausgeschnitten. Aus dem Plasmid pET11-a/nuoB-G/NuoFC
B
B
wurde ebenfalls das 10´367 bp große DraIII-Fragment isoliert und aufgereinigt. Dieses
Fragment wurde jeweils mit dem 2´692 bp großen DraIII-Fragment der mutierten Plasmide
ligiert und in E. coli RR1∆15 transformiert und ausplattiert. Die Transformanden wurden für
- 103 -
Ergebnisse
16 Std. bei 37°C angezogen, aus diesen Übernachtkulturen die Plasmide isoliert und durch
Restriktionsanalyse charakterisiert (Abb. 4-56). Die Primer der Mutagenese-PCR enthielten
im Bereich der Mutation eine singuläre Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym.
Tab. 4-17 zeigt die erwarteten Fragmentgrößen des Plasmids pET11-a/nuoB-G/NuoFC mit
und ohne Mutation.
Tab. 4-17: Erwartete Fragmentgrößen des Plasmids pET11-a/nuoB-G/NuoFC und der
Plasmide mit den entsprechenden Mutationen auf NuoG nach Restriktionsanalyse mit
verschiedenen Enzymen.
Mutation
Cys230Ala
Restriktions-
pET11-a/nuoB-G/
pET11-a/nuoB-G/
enzym
NuoFC
NuoFC(Mutation)
[bp]
[bp]
5´764
5´764
5´635
3´211
844
2´424
708
844
108
708
PvuI
108
Cys233Ala
HindIII
6´069
6´069
3´169
2´710
2´710
2´540
1´111
1´111
629
Cys237Ala
EheI
6´894
5´392
4´153
4´153
1´182
1´565
695
1´182
114
695
21
114
21
Cys
265
Ala
RsrII
13´059
9´209
3´850
- 104 -
Ergebnisse
Abb. 4-56: Restriktionsanalyse der Plasmide pET11-a/nuoB-G/NuoFC(Cys230Ala) (Spur 5)
mit PvuI, pET11-a/nuoB-G/NuoFC(Cys233Ala) (Spur 2) mit dem Restriktionsenzym HindIII,
von
pET11-a/nuoB-G/NuoFC(Cys237Ala)
(Spur
3)
mit
EheI
und
265
pET11-a/nuoB-G/NuoFC(Cys Ala) (Spur 4) mit RsrII. Als Standard wurde pUC-Mix 4
(Spur 1 und 6; MBI Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen.
Sämtliche Mutationen wurden durch Sequenzierung bestätigt und die mutierten Plasmide in
den Stamm BL21(DE3) transformiert. In diesem Stamm wurden die nuo-Gene durch IPTGZugabe exprimiert.
4.6.1 ESR-spektroskopische Charakterisierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes
im Cytoplasma
Durch die Überexpression von nuoB-G wird das NADH-Dehydrogenase Fragment mit dem
StrepTag II C-terminal an NuoF vollständig im Cytoplasma assembliert (Bungert et al.,
1999). Für die korrekte Assemblierung werden die Untereinheiten NuoB und NuoCD
benötigt, diese sind aber in der Präparation des Fragmentes nicht nachweisbar (Braun et al.,
1998).
In
einer
Western-Blot-Analyse
des
Cytosols
des
Stammes
BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFC mit spezifischen Antikörpern gegen NuoB und NuoCD
wurden beide Untereinheiten nachgewiesen (Abb. 4-57). Beide Proteine wurden in der
Kontrolle, dem Überproduktionsstamm ANN003/pAR1219, einer Komplex I-Präparation,
ebenfalls eindeutig nachgewiesen. Im Cytosol des Überproduzenten ANN003/pAR1219
wurde ebenfalls eine geringe Menge der Untereinheit NuoB detektiert (Abb. 4-57 a). Dies
könnte von einem Abbau des Komplex I oder einem Assemblierungsintermediat stammen.
NuoCD wurde nicht erkannt (Abb. 4-57 b).
- 105 -
Ergebnisse
Abb.
4-57:
Western-Blot-Analyse
des
Cytosols
der
Stämme
BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFC (Spur 1 und 4) und ANN003/pAR1219 (Spur 2 und 6)
sowie von aufgereinigtem Komplex I (Spur 3 und 5) mit Antikörpern gegen NuoB (a) und
NuoCD (b). Die Positionen der Untereinheiten sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.
B
Das
Cytoplasma
des
B
Stammes
BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFC
B
B
wurde
nach
Ultrazentrifugation der aufgebrochenen Zellen gewonnen und aliquotiert. Ein 300 µl Aliquot
wurde mit 5 µl 1 M NADH versetzt, ein anderes mit dem gleichen Volumen Puffer. Beide
Proben wurden 5 min auf Eis inkubiert, in ESR-Röhrchen überführt und tiefgefroren. Von
beiden Proben wurden ESR-Spektren bei 40 K und 10 mW Mikrowellenleistung
aufgenommen. Das Spektrum der Probe, die mit Puffer verdünnt worden war, wurde von dem
Spektrum der mit NADH-reduzierten Probe abgezogen. Das Differenz-Spektrum zeigt die
Signale der paramagnetischen Spezies des Cytoplasmas, die mit NADH reduzierbar sind
(Abb. 4-58). Das Differenz-Spektrum zeigt alle Signale der zweikernigen Fe/S-Zentren des
NADH-Dehydrogenase Fragmentes, die auch in der Präparation beschrieben wurden (Braun
et al., 1998). Die Signale des Zentrums N1b bei g2,⊥ = 2.03, 1.94 und die Signale bei
B
B
gx, y, z = 1.92, 1.94, 2.00, die dem Zentrum N1c zugeordnet wurden, sind zu erkennen (Abb.
B
B
4-58). Das Spektrum bei 13 K zeigt außerdem die vierkernigen Fe/S-Zentren N2 und N4, die
jedoch so stark von Signalen anderer Fe/S-Zentren überlagert sind, dass sie nicht ausgewertet
werden können (Daten nicht gezeigt).
- 106 -
Ergebnisse
Abb. 4-58: ESR (NADH-reduziert minus Luft-oxidiert) Differenz-Spektrum des Cytoplasmas
aus BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc. Die Einzelspektren wurden bei 40 K und 10 mW
Mikrowellenleistung
aufgenommen.
Die
übrigen
Messparameter
waren:
Mikrowellenfrequenz, 9.44 GHz; Modulationsamplitude, 6 mT; Zeitkonstante, 0.064 s und
Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min. Die Signale sind einzelnen Fe/S-Zentren
zugeordnet.
Die Spektren des Cytoplasmas der Mutantenstämme wurden in gleicher Weise erhalten. Die
Differenzspektren des Cytoplasmas aus den Mutanten Cys233Ala und Cys237Ala zeigten nur
die Signale des Zentrums N1c (Abb. 4-59 c, d). Die Signale des Zentrums N1b waren nicht
nachweisbar. Die Differenzspektren des Cytoplasmas der Mutanten Cys230Ala und Cys265Ala
zeigten ein sehr kleines Signal des Zentrums N1c, deren Amplituden weniger als 5 % der des
Signals im Wildtyp Cytoplasma betrugen (Abb. 4-59 d, e). Die Signale des Fe/S-Zentrums
N1b war in keiner Mutante nachweisbar (Abb. 4-59 d, e).
- 107 -
Ergebnisse
Abb. 4-59: ESR-(NADH-reduziert minus Luft-oxidiert)-Differenzspektren des Cytoplasmas
des Stammes BL21(DE3)/pET11a/nuoB-G/NuoFc (a) und der NuoG-Mutantenstämme
Cys230Ala (b), Cys233Ala (c), Cys237Ala (d) und Cys265Ala (e). Die Einzelspektren wurden bei
40 K und 10 mW Mikrowellenleistung aufgenommen. Die übrigen Messparameter betrugen:
Mikrowellenfrequenz von 9.44 GHz, Modulationsamplitude von 6 mT, Zeitkonstante von
0.064 s und Aufnahmegeschwindigkeit von 17.9 mT/min. Die Signale sind einzelnen Fe/SZentren zugeordnet.
- 108 -
Ergebnisse
4.6.2 Isolierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus den NuoG-Mutanten
Um sicherzustellen, dass die ESR-Differenzspektren des Cytoplasmas der Mutanten die
Signale der Fe/S-Zentren des NADH-Dehydrogenase Fragmentes widerspiegeln, wurde das
Fragment aus dem Cytosol mittels Anionenaustausch-Chromatographie und AffinitätsChromatographie
aufgereinigt.
Das
Enzym
eluierte
von
der
Anionenaustausch-
Chromatographie bei 160 mM NaCl. Bei der Affinitäts-Chromatographie eluierte das Protein
in einem einzigen Peak. In Abb. 4-60 sind die Elutionsprofile der Präparation aus der Mutante
Cys233Ala gezeigt. Die Präparationen des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus den
Mutanten Cys237Ala und Cys265Ala zeigten ähnliche Elutionsprofile.
Abb. 4-60: Isolierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus dem Stamm
BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc/NuoG(Cys233Ala) über eine Chromatographie an
DEAE-Sepharose (a) und Chromatographie an StrepTactin-Sepharose (b). Die durchgezogene
Kurve zeigt die Absorbanz bei 280 nm, die Punkt-Strich Linie den Verlauf der
NADH/Ferricyanid Reduktaseaktivität und die gestrichelte Linie die Lage des NaClGradienten. In (c) ist die Polypetidzusammensetzung der gekennzeichneten Fraktionen der
Affinitäts-Chromatographie nach SDS-PAGE gezeigt. Der Pfeil markiert den Beginn der
Elution mit D-Desthiobiotin-Puffer.
- 109 -
Ergebnisse
Aus 10 g Zellen (Feuchtgewicht) des Stammes BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc wurden
5 mg NADH-Dehydrogenase Fragment erhalten. Aus 50 g Zellen der NuoG-Mutanten
wurden nur 0.5 bis 1.5 mg erhalten. Die Präparationen aus den NuoG-Mutanten Cys233Ala,
Cys237Ala und Cys265Ala bestand aus den Untereinheiten NuoE, F und G des Fragmentes
(Fig. 4-58 a, b, c). Jedoch tendierten Präparationen aus der NuoG-Mutante Cys237Ala zu
einem Verlust von NuoG, wenn der pH-Wert vor dem Auftrag der Probe auf die AffinitätsChromatographiesäule mit 1 M statt mit 0.1 M NaOH auf pH 7.0 eingestellt wurde (siehe
Material und Methoden). Abhängig von der Einstellung des pH-Werts enthielt die Präparation
aus dieser Mutante entweder das komplett assemblierte NADH-Dehydrogenase Fragment
oder einen aus den Untereinheit NuoE und NuoF bestehenden Subkomplex (Abb. 4-61 d).
Das NADH-Dehydrogenase Fragment konnte aus der NuoG-Mutante Cys230Ala nicht isoliert
werden, da es vermutlich nicht assembliert wurde. Dies steht in Einklang damit, dass im ESRDifferenz-Spektrum des Cytosols dieser Mutante kein Fe/S-Zentrum des Fragmentes
detektiert wurde (Abb. 4-61 b). Aus dieser Mutante wurde nur die Untereinheit NuoF, die mit
dem StrepTag modifiziert ist, aufgereinigt (Abb. 4-61 e).
Abb. 4-61: SDS-PAGE der Präparationen des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus den
Stämmen BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc (a) und den NuoG-Mutanten Cys265Ala (b),
Cys237Ala (c, d) und Cys230Ala (e). Das NADH-Dehydrogenase Fragment der Mutante
Cys237Ala wurde entweder unter milden Bedingungen isoliert (c) oder vor der AffinitätsChromatographie mit 1 M NaOH titriert (d). Die Positionen der Untereinheiten NuoE, NuoF
und NuoG sind angezeigt. Die zusätzliche Bande mit einer apparenten molekularen Masse
von 18 kDa in (c) stammt von einem proteolytischen Fragment von NuoG (Bungert et al.,
1999).
- 110 -
Ergebnisse
4.6.3
ESR-spektroskopische
Charakterisierung
des
aufgereinigten
NADH-
Dehydrogenase Fragmentes
Die
Präparationen
wurden
mit
einem
Überschuß
Dithionit
in
Gegenwart
von
Redoxmediatoren reduziert und bei 40 K und 2 mW Mikrowellenleistung vermessen. Die
ESR-Spektren des isolierten NADH-Dehydrogenase Fragmentes unterschieden sich nicht
signifikant von den Differenzspektren des Cytosols der Mutanten (Abb. 4-59 und 4-62). Die
ESR-Spektren des Fragmentes der NuoG-Mutanten Cys233Ala, Cys237Ala und Cys265Ala
zeigten die Signale, die dem Zentrum N1c zugeschrieben wurden (Abb. 4-62). Signale des
Zentrums N1b äußerst geringer Intensität waren ebenfalls nachzuweisen (Abb. 4-62). Die
Signale der Fe/S-Zentren N3 und N4 wurden in den Präparationen nicht detektiert (Daten
nicht gezeigt).
Abb. 4-62: ESR-Spektren der Präparationen des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus den
Stämmen BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc (a) und aus den NuoG-Mutanten Cys233Ala
(b), Cys237Ala (c) und Cys265Ala (d). Die Spektren wurden bei 40 K und 2 mW
aufgenommen. Die Proben wurden mit einem Überschuss an Dithionit in der Gegenwart von
Redoxmediatoren reduziert. Das mit einem Stern markierte Radikal-Signal stammt von den
Redoxmediatoren. Die Signale sind einzelnen Fe/S-Zentren zugeordnet. Die übrigen
Messparameter waren: 9.44 GHz Mikrowellenfrequenz, 6 mT Modulationsamplitude, 0.064 s
Zeitkonstante, Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min.
- 111 -
Ergebnisse
Mutationen in dem zusätzlichen Bindemotiv auf NuoG hatten einen Einfluss auf die ESRSpektren aller Fe/S-Zentren, bis auf die Signale des Zentrums N1c. Das ESR-Spektrum des
Subkomplexes aus den Untereinheiten NuoE und NuoF aus der Mutante zeigte ebenfalls die
ESR-Signale des Zentrums N1c (Abb. 4-63). Daher kann das Signal nicht von einem auf der
Untereinheit NuoG liegenden Fe/S-Zentrum stammen. Die Zuordnung des Signals „N1c“ zu
dem zusätzlichen Bindemotiv auf NuoG ist somit falsch. Wie aus der Präparation vor allem
der Mutanten Cys237Ala und Cys230Ala ersichtlich ist, scheint die Mutagenese dieses
Bindemotives die Assemblierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes zu stören. Es ist
somit wahrscheinlich, dass dieses Bindemotiv die Liganden für ein Fe/S-Zentrum zur
Verfügung stellt, welches bislang nicht ESR-spektroskopisch nachgewiesen wurde.
Abb. 4-63: ESR-Spektren der Präparationen des NADH-Dehydrogenase Fragmentes aus den
Stämmen BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc (a) und dem NuoEF-Subkomplex aus der
NuoG-Mutante Cys237Ala (b). Die Spektren wurden bei 40 K und 2 mW aufgenommen. Die
Proben wurden mit einem Überschuss an Dithionit in der Gegenwart von Redoxmediatoren
reduziert. Das mit einem Stern markierte Signal wird von den Redoxmediatoren verursacht.
Die Signale sind einzelnen Fe/S-Zentren zugeordnet. Die übrigen Messbedingungen waren:
9.44 GHz Mikrowellenfrequenz, 6 mT Modulationsamplitude, 0.064 s Zeitkonstante,
Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min.
- 112 -
Ergebnisse
4.6.4 ESR-spektroskopische Charakterisierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes
in aerob und anaerob gezogenen Zellen
Es war vorgeschlagen worden, dass das zusätzliche Motiv auf NuoG ein Fe/S-Zentrum bindet,
das als „molekularer Schalter“ für die Anpassung an aerobes und anaerobes Wachstum dient,
indem es von einem zweikernigen in einem vierkernigen Zustand wechselt (Nakamuru-Ogiso
et
al.,
2000).
Um
diese
Annahme
zu
überprüfen,
wurde
der
Stamm
BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFC einmal aerob unter starker Luftzufuhr und einmal
anaerob unter Stickstoffbegasung angezogen. Die unterschiedlichen Anzuchtbedingungen
spiegelten sich in der Färbung der Zellen wider (Abb. 4-64)
Abb. 4-64: Suspensionen der Zucht von E. coli BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFC unter
aeroben (O2) und anaeroben (N2) Bedingungen.
Die Zellen wurden mit Toluol permeabilisiert und aliquotiert. Ein Aliquot wurde mit NADH
reduziert, das andere mit dem gleichen Volumen Puffer verdünnt. Von den vier Proben
wurden ESR-Spektren bei 40 K und 10 mW aufgenommen. Abb. 4-65 zeigt die (NADHreduziert minus wie-isoliert) Differenzspektren der aeroben und anaeroben Zucht. Es konnten
keine signifikanten Unterschiede zwischen den Spektren nachgewiesen werden, so dass keine
Aussage zu der Theorie des „molekularen Schalters“ gemacht werden kann. Die zusätzlichen
Signale in den Differenz-Spektrum der aerob gezogenen Probe stammen von Mangan, was
damit zu erklären ist, dass anscheinend die oxidierte Probe zu stark verdünnt wurde.
- 113 -
Ergebnisse
Abb. 4-65: ESR (NADH-reduziert minus wie-isoliert)-Differenz-Spektrum permeabilisierter
ganzer Zellen von E. coli BL21(DE3)/pET11-a/nuoB-G/NuoFc einer aeroben (a) und einer
anaeroben (b) Zucht. Die Einzelspektren wurden bei 40 K und 10 mW Mikrowellenleistung
aufgenommen. Die übrigen Messbedingungen waren: 9.44 GHz Mikrowellenfrequenz, 6 mT
Modulationsamplitude, 0.064 s Zeitkonstante und 17.9 mT/min Aufnahmegeschwindigkeit.
- 114 -
Diskussion
5. Diskussion
5.1 Das extrachromosomale Expressionssystem pBADnuo
Das Plasmid pBADnuo ist das erste extrachromosomale Expressionsystem sämtlicher
Komplex I-Gene. Ein solches System wurde in der Literatur bislang nicht beschrieben. Es ist
zur homologen Überproduktion des Komplexes in E. coli geeignet. Es wurde gezeigt, dass
eine Produktion der 13 Untereinheiten NuoA-N bei Expression der zugehörigen nuo-Gene
vom Plasmid pBADnuo stattfindet (Abb. 4-12) und dass ein enzymatisch aktiver Komplex I
aus allen Untereinheiten NuoA-N assembliert wird. Dies wurde durch ZuckergradientenZentrifugation
(Abb.
4-11),
Messung
der
Atmungsaktivität
(Abb.
4-10)
und
Wachstumskurven (Abb. 4-8) belegt. Der einzige Bericht in der Literatur über eine
extrachromosomale Expression und Produktion von mehreren Komplex I-Genen beschreibt
die Überproduktion des NADH-Dehydrogenase Fragmentes durch Expression der Gengruppe
nuoB-G in E. coli (Braun et al., 1998; Bungert et al., 1999). Einzelne Untereinheiten des
Komplex I aus Paracoccus denitrificans wurden heterolog in E. coli exprimiert und die
einzelnen Untereinheiten spektroskopisch charakterisiert (Yano et al., 1994 a und b; Yano et
al., 1995; Yano et al., 1996; Yano et al., 1996; Yagi et al., 1998; Yagi und Matsuno-Yagi,
2003). Allerdings wichen die spektroskopischen Eigenschaften der Kofaktoren in den
überproduzierten
einzelnen
Untereinheiten
stark
von
denen
der
Kofaktoren
im
Gesamtkomplex ab. Mit dieser Methode wurden die Liganden einzelner Kofaktoren
identifiziert, die Rolle dieser Kofaktoren für den Mechanismus des Komplexes blieb aber
unklar.
Bislang wurde Komplex I durch verstärkte Expression der chromosomalen Gene nuoA-N
überproduziert. Dies gelang durch den Austausch des nuo-Promotors gegen den induzierbaren
T4-Phagen Promotor (Spehr et al., 1999). Die Ausbeuten der Präparationen des Komplexes
aus ANN0221/pBADnuo waren etwa ein Drittel der Ausbeuten des chromosomalen
Überproduzenten ANN003/pAR1219. Das pBADnuo-System stellt somit eine Alternative zur
Überproduktion von Komplex I im Stamm ANN003/pAR1219 dar. Die Induktion der
Expression mit L(+)-Arabinose ist wesentlich preisgünstiger als die mit IPTG, die beim
Überproduzenten ANN003/pAR1219 benötigt wird. Gemessen an der NADH-Oxidase
Aktivität wird der Komplex in beiden Stämmen etwa vier- bis fünffach überproduziert
(Tab. 4-2; Spehr et al., 1999). Dies ist eine geringe Überproduktionsrate, z.B. im Vergleich zu
- 115 -
Diskussion
der 20-fachen Überproduktion der ATP-Synthase in E. coli (von Meyenburg et al., 1984)).
Die vergleichbare Produktion des Komplexes bei chromosomaler und Plasmid-gerichteter
Überproduktion zeigt, dass die geringe Überproduktion keine Folge von noch unbekannten
Regulationsfaktoren auf dem Chromosom ist. Eine mögliche Ursache könnte die fehlerhafte
bzw. unzureichende Assemblierung des Komplexes sein. Durch die gleichzeitige Expression
von Chaperonen könnte die Proteinproduktion gesteigert werden. Dieser Ansatz wird derzeit
in unserem Arbeitskreis verfolgt. Weiterhin sollte untersucht werden, inwiefern sich die
Anzucht der Zellen in Mangelmedium auf die Proteinproduktion auswirkt. Es wurde gezeigt,
dass der Arabinosepromotor in reichhaltigem Medium eine drei- bis vierfach geringere
Expression als in Mangelmedium aufweist (Guzman et al., 1995). Dies könnte aus einer
geringeren Kopienzahl in reichhaltigem Medium oder aus der Gegenwart von KatabolitRepressoren oder Inhibitoren resultieren. Dieser Effekt wurde auch bei anderen Promotoren,
wie z.B. dem tac-Promotor, beobachtet (Guzman et al., 1995).
Als Expressionsvektor wurde das Plasmid pBAD33 ausgewählt (Guzman et al., 1995). Die
Expression über den Arabinose-Promotor wird durch die Konzentration von L(+)-Arabinose
sehr gut reguliert. Der Vektor zeigt im Vergleich zu den auf dem T7-Promotor basierten
Plasmiden kaum Hintergrundexpression, da die Expression durch Glucose vollständig
reprimiert wird (Guzman et al., 1995). Dadurch ist es möglich, die Expression des nuoOperons durch Zugabe von Arabinose bzw. Glucose zu dem Medium gezielt an- und
auszuschalten. Die Regulation der Expression über die Arabinosekonzentration verhindert
auch eine zu starke Expression des nuo-Operons, was für die Zelle unter Umständen letal sein
könnte. Der Promotor sollte außerdem nicht zu stark sein, da eine Protein-Überproduktion
von mehr als 30 % des Gesamtproteins der Zelle zu einer Zerstörung der mRNA und der
Ribosomen sowie zu einer Akkumulation von Hitzeschockproteinen führen kann (Dong et al.,
1995).
Bei der Konstruktion des 21 kbp großen Plasmids pBADnuo ergaben sich mehrere Probleme.
Zum einen gingen sehr große DNA-Fragmente bis 12 kbp bei der Aufreinigung durch
Gelelution oder über eine PCR-Aufreinigungsmethode meist vollständig verloren, da sie so
stark an die Silica-Säulen banden, dass sie nicht eluierten. Daher wurde auf eine präparative
Trennung der Fragmente eines Restriktionsansatzes verzichtet und die Fragmente nur über
eine Ethanolfällung aufgereinigt. Dadurch kam es zwar mitunter zu einer Ligation falscher
Fragmente mit dem Vektor, die Ausbeute an gewünschtem Produkt war aber dennoch höher
- 116 -
Diskussion
als bei einer Ligation mit einem aufgereinigten Fragment geringer Konzentration. Die großen
Konstrukte konnten nur über eine Elektroporation in E. coli transformiert werden, da bei einer
chemischen Transformation die Konstrukte vermehrt fragmentieren. Ein weiterer wichtiger
Faktor ist die Verwendung des E. coli Stammes DH5α zur Propagation sehr großer Plasmide.
Die E. coli Stämme BL21(DE3) und RR1∆M15 waren dazu nicht geeignet, was sich in einer
Fragmentierung der Plasmid-Konstrukte zeigte. DH5α scheint als E. coli K12-Derivat
gegenüber den B-Typ Derivaten BL21(DE3) und RR1∆M15 für eine stabile Propagation
großer Konstrukte besser geeignet zu sein. Nach der Vermehrung des Plasmids pBADnuo in
DH5α war es stabil genug, um auch in anderen Stämmen erfolgreich repliziert zu werden.
5.2 Nutzung des Plasmids pBADnuo zur Mutagenese
Eine weitere Anwendung des pBADnuo-Expressionssystemes stellt die Mutagenese der nuoGene dar. Eine Mutagenese des chromosomalen nuo-Operons ist sehr umständlich und
aufwendig, da Mutationen stets unmarkiert eingeführt werden müssen, um die Expression der
stromabwärts gelegenen nuo-Gene nicht zu beeinflussen. Als Kompromiss stellte sich ein
Ansatz heraus, mit dem auf der Untereinheit NuoB eine Reihe von Mutationen eingeführt
wurden (Flemming et al., 2003). Das Gen nuoB wurde in das Plasmid pBAD33 kloniert und
dort mutagenisiert. Dieses Plasmid wurde in einen Stamm transformiert, in dem nuoB
chromosomal deletiert worden war. In diesem Ansatz wurde NuoB von dem Plasmid
produziert, die restlichen Komplex I-Untereinheiten von dem Chromosom. Diese in transKomplementation ermöglichte die Produktion des vollständig assemblierten Komplexes, der
die auf dem Plasmid kodierten Mutationen in NuoB trug (Flemming et al., 2003). Um
prinzipiell Mutationen einzelner Untereinheiten auf einem Plasmid einzuführen, wird für die
in trans-Komplementation ein E. coli Stamm mit der entsprechenden genomischen Deletion
benötigt. Außerdem muss das Gen der betreffenden Untereinheit in ein Expressionsplasmid
kloniert werden. Es ist aber nicht bekannt, ob eine in trans-Komplementation mit jedem Gen
des nuo-Operons möglich ist, da die Deletion die Expression stromabwärts gelegener
Bereiche des Operons stören könnte oder die Stabilität der mRNA beeinträchtigen könnte.
Eine sinnvolle Alternative ist deshalb die Expression des gesamten nuo-Operons von einem
Plasmid, in dem Mutationen eingeführt werden können. Mit einer Größe von über 21 kbp ist
das Plasmid pBADnuo allerdings viel zu groß für eine direkte Mutagenese. PCR-basierte
Mutagenesemethoden beschränken sich auf Plasmide mit einer Größe bis etwa 6 kbp, da
- 117 -
Diskussion
oberhalb dieser Größe die Syntheseleistung der Polymerase zu gering ist und außerdem die
Fehlerrate stark ansteigt, so dass das PCR-Produkt weitere unerkannte Mutationen tragen
könnte. Solche Mutationen können im besten Fall zum Austausch einer Aminosäure führen,
schlimmstenfalls kann es zur Einführung eines Stoppkodons oder zur Verschiebung des
Leserasters kommen. Deshalb sollten kleinere Plasmide mutagenisiert werden, die nur Teile
des nuo-Operons enthalten. Um nicht für jede Mutagenese ein neues Konstrukt zu klonieren,
wurde ein sogenanntes Subklon-System des nuo-Operons aufgestellt. Dieses sollte aus drei
Subklonen pBAD-A, pBAD-B und pBAD-C bestehen, die wiederum in noch kleinere
Subklone aufgeteilt werden sollten. Diese kleinen Subklone sollten durch PCR-Methoden
mutagenisiert werden und anschließend in einen großen Subklon und dann in das Plasmid
pBADnuo zurückkloniert werden. Mit dieser Methode wurde z.B. eine StrepTag II-Sequenz
am 3´-Ende von nuoB eingeführt (Kap. 4.4.1).
In dieser Arbeit wurde der Grundstein des Subklonsystems gelegt, da nur die über den
Subklon pBAD-A abgedeckten Gene nuoA-nuoE´ zugänglich sind. Die Subklone pBAD-B
und pBAD-C konnten bislang nicht hergestellt werden. Die Größe der zu klonierenden
nuo-Bereiche erschwert die Herstellung dieser Subklone. Eine Möglichkeit, diese Subklone
herzustellen, wäre, neue singuläre Restriktionssequenzen in pBADnuo einzufügen. Aufgrund
der Größe des Plasmids ist eine PCR an pBADnuo allerdings nicht möglich. Solche
Sequenzen könnten über die λ-Red vermittelte Rekombination in pBADnuo eingeführt
werden.
5.3 Vergleich der λ -Red vermittelten Rekombination mit der Klonierung
Da die Subklone pBAD-B und pBAD-C bislang nicht zur Verfügung stehen, wurde nach
Alternativen gesucht, Mutationen von den kleinen Subklonen in pBADnuo einzubringen.
Klonierungsmethoden sind dabei nicht möglich, da keine weiteren singulären Schnittstellen
vorhanden sind, die für die Rückklonierung genutzt werden können. Eine Möglichkeit stellt
die Rekombination dar, die bislang in E. coli nur wenig genutzt wird, da das
Rekombinasesystem von E. coli für eine genetische Manipulation nicht geeignet ist. Zum
einen wird zur Rekombination ein homologer Bereich von mehreren tausend bp benötigt, zum
anderen ist die Rekombination linearer DNA nicht möglich, da die RecBCD-Nuklease lineare
DNA abbaut. Wird aber in E. coli die λ-Red Rekombinase aus dem Phagen λ exprimiert, so
- 118 -
Diskussion
verhindert diese den Abbau linearer DNA durch Inhibition der RecBCD-Nuklease. Die
Rekombination mit der λ-Red Rekombinase benötigt einen homologen Bereich von nur etwa
36 bp. Mit der λ-Red Rekombinationsmethode können lineare DNA-Fragmente in
genomische oder Plasmid-DNA eingebaut werden, wenn sie flankierende Bereiche von
mindestens 36 bp besitzen, die der genomischen oder der Plasmidsequenz entsprechen. Mit
der Methode der λ-Red vermittelten Rekombination wurde versucht, Deletionen, Insertionen
und Punktmutationen in Plasmide einzuführen.
Punktmutationen auf nuoM wurden in den kleinen Subklon pBAD-C1 eingeführt (Abb. 4-47,
4-48), konnten aber nicht in pBADnuo zurückkloniert werden, da der große Subklon pBAD-B
nicht vorhanden war (Kap. 4.3.2). Es wurde deshalb versucht, ein Fragment von pBAD-C1,
das die gewünschte Mutation trug, in pBADnuo zu rekombinieren (Kap. 4.5.2). Dieser
Versuch scheiterte zum einen daran, dass stets nur ein Gemisch beider Plasmide erzeugt
wurde, zum anderen an der fehlenden Selektion auf das rekombinante Plasmid. Eine Selektion
über das sacR-sacB-Suizidsystem lieferte nur die Rekombination des Fragmentes in das
Genom. Diese Methode müsste an die gewünschte Anwendung angepasst werden. Ohne eine
Selektionsmöglichkeit müssen nach der Rekombination eine große Anzahl Klone analysiert
werden. Dies muss bei Punktmutationen durch Restriktionsanalyse erfolgen, eine PCRbasierte Analyse wie im Fall von Insertionen oder Deletionen ist nicht möglich. Dies zeigt,
dass die λ-Red vermittelte Rekombination nicht unbedingt für die Einführung von
Punktmutationen geeignet ist. Es wäre wahrscheinlich sinnvoller, das mutierte Gen in ein
Expressionsplasmid
Deletionsstamm
zu
einzubringen
und
exprimieren.
die
Untereinheit
Allerdings
ist
es
in
einem
entsprechenden
nicht
trivial,
chromosomale
Deletionsmutanten von E. coli mit den gebräuchlichen Methoden herzustellen. Hier ist das
λ-Red Rekombinationssystem eine effektive Methode zur Deletion einzelner Gene und
Gengruppen. Die Deletionen können dabei sowohl auf dem Chromosom als auch auf dem
Plasmid pBADnuo eingeführt werden.
Mittels der λ-Red vermittelten Rekombination wurden verschiedene Deletionen in das
Plasmid pBADnuo eingefügt: pBADnuo/∆nuoB (Kissel, 2003), pBADnuo/∆nuoCD (Abb.
4-38), pBADnuo/∆nuoEF (Abb. 4-43), pBADnuo/∆nuoG (Abb. 4-45) und pBADnuo/∆nuoM
(Abb. 4-41). Die deletierten Bereiche waren zwischen 662 bp (nuoB) und 2´732 bp (nuoG)
groß. Die Deletion des 4´613 bp großen Genbereiches nuoE-nuoG gelang nicht. Nach der
Rekombination wurden zwar resistente Kolonien gefunden, die aber keine Plasmide
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Diskussion
enthielten. Es ist möglich, dass die Resistenzkassette in das Chromosom statt in das Plasmid
pBADnuo rekombiniert wurde. Es wurde berichtet, dass mit dieser Methode Deletionen von
bis zu 5´178 bp möglich sind (Datsenko und Wanner, 2000). Diese Deletionen wurden
allerdings ausschließlich ins Genom eingeführt. Vermutlich ist die starke Ringspannung des
über 21 kbp großen Plasmids pBADnuo für die Rekombination eines großen Bereiches
hinderlich. Der 4.6 kbp große Bereich nuoEFG sollte durch die 1.6 kbp große
Kanamycinresistenzkassette ersetzt werden. Zur Anlagerung der Resistenzkassette an die
homologen Bereiche müsste das Plasmid stark verdrillt werden, daher ist es vermutlich
einfacher, die Resistenz in das Genom einzubauen. Um diesen Bereich dennoch zu deletieren,
könnte in die Plasmide pBADnuo/∆nuoEF eine Deletion von nuoG bzw. in pBADnuo/∆nuoG
eine Deletion von nuoE und nuoF eingeführt werden.
Durch die λ-Red Rekombinase wurde die StrepTag II-Sequenz mit einem verbindenden
Bereich, der für zwei bzw. sieben Aminosäuren kodiert, in das Plasmid pBADnuo
eingebracht. Hierbei wurde sowohl eine schon innerhalb einer Gengruppe des nuo-Operons
vorhandene Tag-Sequenz genutzt als auch eine Tag-Sequenz neu eingeführt. Im ersten Fall
wurde ein Fragment aus dem Expressionsplasmid pET11-a/nuoB-G/NuoFC, in dem die
B
B
StrepTag II-Sequenz am 3´-Ende von nuoF angefügt wurde (Bungert et al., 1999), in
pBADnuo rekombiniert. Da es keine positive Selektion gab, wurden sehr viele Klone
analysiert. Etwa 3 % der Klone enthielten ein Plasmidgemisch, aus dem das gewünschte
Konstrukt durch Retransformation nach Verdünnung des Plasmidgemisches vereinzelt werden
konnte. Auch die Neusynthese der StrepTag II-Sequenz an nuoC in pBADnuo über die
Rekombination eines PCR-Produktes war sehr effizient. Dabei wurde eine so genannte
„Template-lose“ PCR eingesetzt (Abb. 4-28), in der die Oligonukleotide aneinander
angelagert und verlängert werden, anstatt an einer Matrizen-DNA verlängert zu werden. Diese
PCR war gut geeignet, das Fragment für die Rekombination zu synthetisieren. Allerdings ist
die Größe des PCR-Produktes durch die Länge der Primer eingeschränkt, da eine Synthese
längerer Oligonukleotide unsicher ist und zur Ausbildung von Fehlbasen führen kann, die
Rekombination behindern können. Die Insertion von 30 bp war problemlos möglich (Abb.
4-30).
Das Gen nuoM konnte weder mit einer Klonierung noch einer Rekombination in ein Plasmid
eingeführt werden. Die Rekombination scheiterte vor allem an einer geeigneten
Selektionsmöglichkeit. Eine klassische Blau-Weiß-Selektion führte ebenfalls nicht zum
- 120 -
Diskussion
gewünschten Ergebnis. Die Selektion wurde auch dadurch erschwert, dass das Plasmid
pKD46 die gleiche Resistenz wie das Zielplasmid besitzt. Möglicherweise wurde pKD46 in
den weißen Kolonien bei 37°C weiterhin repliziert. Es hatte sich gezeigt, dass zum
vollständigen Verlust der Propagation dieses Plasmids eine Temperatur von 42°C über einen
längeren Zeitraum nötig war, wenn Zellen auf die auf diesem Plasmid kodierte
Ampicillinresistenz angewiesen waren. Es wäre sinnvoll ein Rekombinase-kodierendes
Plasmid mit einer anderen Resistenz zu konstruieren. Dieses Plasmid sollte auch einen
anderen Replikationsursprung haben, da einige Plasmide aufgrund der nicht-kompatiblen
Replikationsursprünge nicht mit Hilfe von pKD46 rekombiniert werden können.
Allgemein zeigte sich bei der Insertion von DNA in pBADnuo, dass eine Rekombination
erleichtert wird, wenn das Zielplasmid und das zu rekombinierende DNA-Fragment in E. coliZellen mit dem Plasmid pKD46 kotransformiert werden. Wird das zu rekombinierende DNAFragment in Zellen transformiert, die die Plasmide pKD46 und pBADnuo enthalten, so erfolgt
gleichzeitig mit der Induktion der Expression der Rekombinase auch eine Expression der nuoGene, da beide unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors stehen. Rekombinations-Ansätze
in Zellen, in denen vor der Transformation des DNA-Fragmentes eine gemeinsame
Propagation von pBADnuo und pKD46 stattfand, führten zu keinem Erfolg. Dabei war es
unerheblich, ob beide Plasmide kotransformiert wurden oder ob ein Plasmid in Zellen
transformiert wurde, die schon das andere Plasmid enthielten.
5.4 Kombination von Klonierung und Rekombination
Das in dieser Arbeit erstellte Subklonsystem ist sehr gut geeignet, um Mutationen in
Komplex I einzuführen. Allerdings ist nur der Genbereich nuoA-nuoE´ zugänglich, da zwei
der drei großen Subklone nicht erhalten wurden. Alle weiteren Gene sind auf den kleinen
Subklonen zugänglich und können mit der λ-Red vermittelten Rekombination in pBADnuo
eingebracht werden. Diese Methode hat sich bei Insertionen bewährt, während
Punktmutationen deutlich schwerer zu rekombinieren und selektionieren sind. Diese
Mutanten können besser über eine in trans-Komplementation erzeugt werden. Die hierfür
benötigten E. coli-Stämme, in denen die nuo-Gene auf dem Chromosom deletiert wurden,
können durch Rekombination hergestellt werden. Allerdings enthielten diese Zellen nur wenig
Protein, was die spätere Protein-chemische Charakterisierung des Komplexes erschweren
- 121 -
Diskussion
würde. Deshalb sollte getestet werden, ob statt der chromosomalen Deletion nicht auch eine
Deletion in dem Plasmid pBADnuo verwendet werden kann. Beide Plasmide pBADnuo/∆nuoX und z.B. pET11-a/nuoX - müssten in einem Komplex I-defizienten Stamm
exprimiert werden. Es ist klar, dass Klonierung und Rekombination zwei Methoden sind, die
sich nicht ausschließen, sondern gegenseitig ergänzen. Ihre Kombination kann zur
Herstellung rekombinierender DNA-Fragmente auch ohne singuläre Restriktionsschnittstellen
genutzt werden.
5.5 Isolierung des Komplex I über eine Affinitäts-Chromatographie
Es ist bislang nicht möglich, den E. coli Komplex I so mit einem Affinitätspeptid zu versehen,
dass er über eine Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt werden kann. Nur das NADHDehydrogenase Fragment wird mit Hilfe eines StrepTag II aufgereinigt. Es zeigte sich, dass
nur eine C-terminale Modifizierung einer Untereinheit mit dem Affinitätspeptid sinnvoll ist,
da das Fragment sonst nicht assembliert (Bungert et al., 1999).
Zur Aufreinigung des Komplex I wurden die Untereinheiten NuoB, NuoC und NuoF
C-terminal mit dem StrepTag II modifiziert, allerdings ohne Erfolg. Da das NADHDehydrogenase Fragment mit dem Affinitätspeptid an NuoF assembliert und in einer
enzymatisch aktiven Form über eine Affinitäts-Chromatographie isoliert werden kann
(Bungert et al., 1999), scheint diese Stelle im Komplex I von anderen Untereinheiten
abgeschirmt zu sein. Dies wird dadurch bestätigt, dass das Affinitätspeptid die Assemblierung
des Komplexes stört, wie durch Zuckergradientenzentrifugation gezeigt wurde (Abb. 4-26).
Die Untereinheit NuoB wurde mit der StrepTag II-Sequenz modifiziert, da sie hydrophil ist.
Hydrophobe Untereinheiten sind zur Modifizierung ungeeignet, da sie bei der Präparation
durch Detergenzmoleküle abgeschirmt werden würden. Auch diese Modifizierung störte die
Assemblierung des Komplex I. Die Untereinheiten NuoA, J und K des Komplexes konnten in
der Präparation nicht nachgewiesen werden (Abb. 4-22), ebenso die Fe/S-Zentren N2 und N4
(Abb. 4-23). Es ist jedoch nicht auszuschliessen, dass der Komplex in der Membran
vollständig assembliert vorlag, aber durch das Affinitätspeptid destabilisiert wurde, so dass er
bei der Detergenzextraktion desintegrierte. Die C-terminale Modifizierung von NuoC führte
zwar zu einem funktionellen Komplex I (Abb. 4-31), jedoch wurde der Komplex nur sehr
schwach von dem StrepTactin-Material gebunden (Abb. 4-31). Die Bindung konnte auch
- 122 -
Diskussion
nicht durch eine Verlängerung des verbindenden Bereiches, die das Affinitätspeptid
exponieren sollte, verbessert werden. Da nur geringste Mengen des Komplexes über diese
Methode aufgereinigt wurden, stellt sie keine Alternative zur Standardaufreinigung von
Komplex I dar. Es wurde gezeigt, dass der Komplex I aus Y. lipolytica über eine
Modifizierung mit einem His-Tag C-terminal an dem Homolog von NuoC möglich ist
(Kashani-Poor et al., 2001). Warum eine entsprechende Modifizierung mit dem homologen
Enzym aus E. coli offensichtlich nicht zu dem gewünschten Erfolg führt, ist nicht verstanden.
Es ist aber nicht auszuschliessen, dass die schwache Bindung eine Folge des pH-Wertes des
Puffers ist. Die Affinitäts-Chromatographie erfolgte bei pH 6.0, da der Komplex bei diesem
pH-Wert sein Stabilitätsoptimum hat (Leif et al., 1995). Bei diesem pH-Wert zeigt das
StrepTactin aber nur eine geringe Affinität zu dem StrepTag II (Voss und Skerra, 1997). In
weiterführenden Arbeiten sollte versucht werden, den Komplex kurz vor der AffinitätsChromatographie auf pH 7.5 zu titrieren, schnell auf die Säule in pH 7.5-Puffer aufzutragen
und mit dem üblichen pH 6.0-Puffer von der Säule zu eluieren. Die Versuche zur
Modifizierung von NuoC zeigen, dass die Trennung der Untereinheit NuoCD nicht zu einer
Änderung der Eigenschaften des Komplexes führt (Abb. 4-31). Dies zeigt auch, dass der am
3´-Ende der StrepTag II-Sequenz gelegene Bereich tatsächlich als Ribosomenbindestelle für
nuoD dient. Stromabwärts vom Gen nuoCD wurde in dem Subklon pBAD-A die Sequenz für
den His- und den StrepTag II eingeführt (Hinderberger, 2004). Nach Rekombination bzw.
Rückklonierung in pBADnuo kann überprüft werden, ob das Affinitätspeptid an dieser
Position an das entsprechende Affinitätsmaterial bindet.
5.6 Das zusätzliche Fe/S-Bindemotiv auf NuoG
Die ESR-Signale bei gx, y, z = 1.92, 1.94 und 2.00, die in den cytoplasmatischen Membranen
von E. coli und in Präparationen des E. coli Komplex I gemessen wurden, wurden einem
neuartigen zweikernigen Fe/S-Zentrum zugeordnet, das mit N1c bezeichnet wurde (Sled et
al., 1993; Leif et al., 1995; Braun et al., 1998). Zwar erinnern die spektralen Eigenschaften
dieses Zentrums an die des zweikernigen Fe/S-Zentrums N1a aus anderen Organismen
(Ohnishi, 1998), doch zeigten sie nicht die Eigenschaften dieses Zentrums, nämlich sein sehr
niedriges und pH-abhängiges Mittenpotential (Sled et al., 1993; Leif et al., 1995). Somit
wurden diese ESR-Signale einem neuartigen Zentrum N1c zugeordnet, welches auf NuoG
lokalisiert sein sollte, da diese Untereinheit ein zusätzliches Bindemotiv für ein Fe/S-Zentrum
- 123 -
Diskussion
enthält. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese ESR-Signale von dem Zentrum N1a
stammen und dass es kein Zentrum N1c gibt. Die Mutagenese der vier Cysteine des
zusätzlichen Bindemotivs auf NuoG führten zu einem nahezu vollständigen Verlust aller
Fe/S-Zentren dieser Untereinheit, während die Signale, die N1c zugeordnet wurden,
nachweisbar waren (Abb. 4-59, 4-62). Diese Signale wurden auch in dem NuoEFSubkomplex aus der Mutante Cys237Ala detektiert (Abb. 4-63). Dies zeigt, dass diese Signale
nicht von einem Fe/S-Zentrum auf der Untereinheit NuoG stammen können. Das einzige
Bindemotiv für ein zweikerniges Fe/S-Zentrum in dem Subkomplex NuoEF befindet sich auf
NuoE und bindet das Zentrum N1a (Yano et al., 1994). Dies bedeutet, dass die dem Zentrum
N1c zugeordneten ESR-Signale von dem Zentrum N1a der Untereinheit NuoE stammen.
Die überproduzierte und aufgereinigte Untereinheit NuoE von E. coli enthält ein zweikerniges
Fe/S-Zentrum mit g-Werten und einem Mittenpotential, die identisch zu denen des als N1c
bezeichneten Zentrum sind (Zu et al., 2002). Es war allerdings nicht klar, ob das Zentrum N1a
auf der einzelnen Untereinheit NuoE die gleichen spektralen und thermodynamischen
Eigenschaften wie im NADH-Dehydrogenase Fragment oder im Komplex I zeigen würde. Es
ist bekannt, dass ESR-Spektren von Fe/S-Zentren in isolierten Untereinheiten sich erheblich
von denen des gleichen Zentrums im assemblierten Komplex unterscheiden können (Yano et
al., 1996). Zusätzlich wurde gezeigt, dass das Mittenpotential des Zentrums N1a aus E. coli
etwa 100 mV positiver ist als das des Zentrums in anderen Organismen und dass seine pHAbhängigkeit stark von der Ionenstärke des Puffers beeinflusst wird (Zu et al., 2002). Bei
Salzkonzentrationen größer als 100 mM zeigt das Mittenpotential von N1a keine pHAbhängigkeit, während es in einem Puffer mit 10 mM NaCl, im pH-Bereich von 3.5 bis 9.5
zwischen -348 mV und -246 mV variiert (Zu et al., 2002). Das Fe/S-Zentrum N1a in
Komplex I von E. coli zeigte im pH-Bereich von 6.0 bis 8.2 keine pH-Abhängigkeit, da der
Komplex in einem Puffer mit 300 mM NaCl vermessen wurde. Dies führte zu seiner falschen
Zuordnung als N1c (Sled et al., 1993; Leif et al., 1995).
Die Mutagenese des zusätzlichen Bindemotivs auf der Untereinheit NuoG lässt vermuten,
dass die betreffenden Cysteine tatsächlich an der Bindung eines Fe/S-Zentrums beteiligt sind,
da sie einen Einfluss auf die Assemblierung des NADH-Dehydrogenase Fragmentes hat. Vor
allem in den Mutanten Cys230Ala und Cys265Ala wurde durch ESR-Differenzspektroskopie
ein deutlich verringerter Anteil des NADH-Dehydrogenase Fragments gezeigt (Abb. 4-62).
Das NADH-Dehydrogenase Fragment der Mutante Cys237Ala zeigte eine verringerte
- 124 -
Diskussion
Stabilität, da es zu einem Subkomplex aus den Untereinheiten NuoE und F zerfällt (Abb.
4-63). Ein ähnlicher Subkomplex wurde durch Überexpression von NuoE und F in P.
denitrificans erhalten (Yano et al., 1997). Das Fe/S-Zentrum, das an das zusätzliche Motiv auf
NuoG gebunden ist, muss weitergehend charakterisiert werden. Es wurde diskutiert, ob dieses
Zentrum ein molekularer Schalter zwischen aeroben und anaerobem Wachstum sein könnte
(Nakamuro-Ogiso et al., 2002). In dieser Arbeit wurden keine Hinweise für diese Funktion
gefunden (Abb. 4-65). Weiterhin wird diskutiert, dass dieses Zentrum mit der Fähigkeit des
Komplexes zur Reaktion mit Menachinon besteht (Finel, 1998). Beide Vorschläge
beschreiben verwandte Phänomene (Unden und Bongaerts, 1997).
Es wurde vorgeschlagen, dass das zusätzliche Bindemotiv ein vierkerniges Fe/S-Zentrum
ligiert. Ähnliche Bindemotive wurden in anderen Enzymen wie z.B. der E. coli Formiat
Dehydrogenase gefunden, wo sie immer ein vierkerniges Fe/S-Zentrum binden (NakamuruOgiso et al., 2002). Die Überexpression eines kurzen Fragmentes von NuoG, das das
betreffende Motiv enthält, führte zur Produktion eines Peptids, das ein vierkerniges Zentrum
enthält (Nakamuru-Ogiso et al., 2002). Dies zeigt, dass das Motiv auf NuoG in E. coli
Komplex I ebenfalls ein vierkerniges Zentrum binden könnte. Es ist möglich, dass dieses
Zentrum bislang noch nicht ESR-spektroskopisch nachgewiesen wurde, weil es entweder ein
sehr niedriges Mittenpotential besitzt oder einen Spin-Grundzustand höher als s=½. Ein
wichtiges Folgeexperiment ist deshalb die ESR-spektroskopische Untersuchung eines
elektrochemisch reduzierten Komplex I. Da die Namensgebung „N1c“ auf der Annahme
beruhte, dass es sich hierbei um ein zweikerniges Fe/S-Zentrum handelt, sollte der Name des
Zentrums auf der Untereinheit NuoG geändert werden. Zweikernige Fe/S-Zentren werden mit
N1 und einem Buchstaben in der Reihenfolge der Entdeckung (N1a, N1b, darauffolgend N1c)
bezeichnet. Vierkernige Fe/S-Zentren werden von N2 aufsteigend nach ihrer chronologischen
Entdeckung nummeriert. Das neue Zentrum auf NuoG wird folglich nun als N7 benannt
werden.
Als nächster Schritt wäre zu untersuchen, ob sich die Mutagenese der betreffenden Cysteine
im Gesamtkomplex ebenfalls auf die Assemblierung auswirkt. Sollte der Komplex in diesen
Mutanten assemblieren, könnte er ESR-spektroskopisch untersucht werden. Zur Herstellung
der Mutanten gibt es sowohl die Möglichkeit der Klonierung als auch der Rekombination. Da
die Cysteine über eine Mutagenese-PCR im Subklon pBAD-B2 gegen Alanine ausgetauscht
wurden, könnten die Mutationen in pBADnuo umkloniert werden. Das dafür benötigte
- 125 -
Diskussion
Plasmid pBAD-B steht aber dafür nicht zur Verfügung. Da die zur Herstellung von pBAD-B2
verwendeten Restriktionsschnittstellen im Konstrukt pBADnuo nicht singulär vorliegen, kann
keine direkte Rückklonierung erfolgen. Deshalb wäre es sinnvoll, die Mutationen des
Bindemotivs auf NuoG über eine Rekombination in pBADnuo einzuführen. Hierfür können
die Mutationen mit DraIII aus dem ursprünglichen Klon herausgeschnitten und dieses
Fragment
zur
Rekombination
in
pBADnuo
eingesetzt
werden.
Da
keine
Selektionsmöglichkeit über eine unterschiedliche Antibiotikaresistenz besteht, wäre es
empfehlenswert, zuerst den betreffenden Bereich in pBADnuo gegen eine nptI-sacR-sacBKassette auszutauschen, um nach der Rekombination dieser Kassette gegen das die
Mutationen tragende Fragment auf Saccharose-haltigem Medium zu selektieren.
- 126 -
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Anhang
Anhang
Anhang 1: Vektorkarte des Plasmids pETBlue-1. Ap bezeichnet dasAmpicillin-Resistenz.
Gezeigt sind die Replikationsursprünge (f1 origin, pUC or), der tet-Promotor, T7-Promotor,
T7-Terminator, rrnB-Terminator, die Ribosomenbindestelle (T7 RBS) sowie das lacZ-Gen
Anhang 2: Vektorkarte des Plasmids pBAD33. Die Lage des araC-Regulators und araC–
Promotors ist eingezeichnet, außerdem die Position der singulären Schnittstellen der
Restriktionsenzyme NdeI, SacI, ApaI und XhoI. Cam bezeichnet das ChloramphenicolResistenzgen.
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Anhang
Anhang 3: Vektorkarte des Plasmids pET11-a/nuoB-G/NuoFc. nuo bezeichnet die Position der
einzelnen Komplex I-Untereinheiten und die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung an. Amp
bezeichnet die Lage des Ampicillin-Resistenzgens. Außerdem ist die Modifizierung der
Untereinheit NuoF durch den Strep-Tag II gezeigt.
Anhang 3: Vektorkarte des Plasmidkonstruktes pBADnuo. nuo bezeichnet die Lage der
einzelnen Komplex I-Untereinheiten nuoA-N, die Pfeile geben die Transkriptionsrichtung an.
Cam steht für das Chloramphenicol-Resistenzgen. Die Lage des araC-Regulators und araC–
Promotors ist eingezeichnet, außerdem die Position der singulären Schnittstellen der
Restriktionsenzyme NdeI, SacI, ApaI und XhoI.
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Anhang
Anhang 4: Vektorkarte des Plasmids pET24-a.Gezeigt sind die Replikationsursprünge (ori, f1
origin), das Kanamycin-Resistenzgen (Kann), der T7-Promotor und das lacI-Gen (LacI). Die
in der multiple cloning site (MCS) liegenden Restriktionsschnittstellen NheI und NdeI sind
markiert. Im Plasmid pET11-a liegt die MCS in umgekehrter Orientierung, der Rest des
Plasmids ist identisch.
Anhang 5: Vektorkarte des Plasmids pKD46. Amp bezeichnet das Ampicillin-Resistenzgen
und araC den Arabinosepromotor. Gezeigt sind die Gene gamma, beta und exo, die für die λRed Rekombinase kodieren.
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Anhang
Anhang 6: Ergebnis der Sequenzierung von pBADnuo/nuoC-StrepTag II-nuoD
pBADcgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnaCAAGccaACAGGATCTGGAGGCTAGCTGGAGCCAC
CCGCAGTTCGAGAAGtaaAATGGAAGCCCTGACCTTCAAACCGGAAGAGTGGGGG
ATGAAGCGCGGCACCGAAAACGAGGACTTCATGTTCCTCAACCTCGGTCCGAACC
ACCCGTCGGCGCACGGGGCTTTCCGTATCGTTTTGCAACTCGATGGCGAAGAGAT
TGTCGACTGCGTACCAGACATCGGTTACCACCACCGTGGTGCGGAGAAAATGGGC
GAACGCCAGTCCTGGCACAGCTACATTCCGTATACTGACCGTATCGAATACCTCG
GCGGCTGCGTTAACGAAATGCCTTACGTGCTGGCGGTAGAGAAACTGGCCGGGA
TCACCGTGCCGGATCGCGTTAACGTCATTCGCGTTATGCTCTCCGAACTGTTCCGC
ATCAACAGTCACCTGCTGTATATCTCGACCTTTATTCAGGACGTCGGCGCAATGA
CGCCAGTGTTCTTCGCCTTTACCGATCGTCAGAAAATTTACGATCTGGTGGAAGC
AATCACTGGTTTCCGTATGCACCCGGCGTGGTTCCGTATTGGCGGCGTAGCGCAC
GACCTGCCGCGCGGCTGGGATCGCCTGCTGCGTGAGTTCCTCGACTGGATGCCGA
AACGTCTGGCGTCTTACGAGAAAGCGGCGCTGCAAAACACCAttCTGaannnnnAGG
GCGTTGCCGCCTATGGCGCGaa
Anhang 7: Ergebnis der Sequenzierung von pBADnuo/nuoC-6 StrepTag II-nuoD
ACGagaAAGCGGCGCTGCAAAACgactgacAAGccaACAGGATCTGGAGGCTGCAGCT
GCTGCTGCTAGCTGGAGCCACCCGCAGTTCGAGAAGTAAAATGGAAGCCCTGAC
CTTCAAACCGGAAGAGTGGGGGATGAAGCGCGGCACCGAAAACGAGGACTTCAT
GTTCCTCAACCTCGGTCCGAACCACCCGTCGGCGCACGGGGCTTTCCGTATCGTTT
TGCAACTCGATGGCGAAGAGATTGTCGACTGCGTACCAGACATCGGTTACCACCA
CCGTGGTGCGGAGAAAATGGGCGAACGCCAGTCCTGGCACAGCTACATTCCGTAT
ACTGACCGTATCGAATACCTCGGCGGCTGCGTTAACGAAATGCCTTACGTGCTGG
CGGTAGAGAAACTGGCCGGGATCACCGTGCCGGATCGCGTTAACGTCATTCGCGT
TATGCTCTCCGAACTGTTCCGCATCAACAGTCACCTGCTGTATATCTCGACCTTTA
TTCAGGACGTCGGCGCAATGACGCCAGTGTTCTTCGCCTTTACCGATCGTCAGAA
AATTTACGATCTGGTGGAAGCAATCACTGGTTTCCGTATGCACCCGGCGTGGTTC
CGTATTGGCGGCGTAGCGCACGACCTGCCGCGCGGCTGggATCGCCTGCTGCGTG
AGTTCCTCGACTGGATGCCGAAACGTCTGGCGTCTTACCATTCTgaaaggTCGtTCc
Anhang 8: Ergebnis der Sequenzierung von pBADnuo/∆nuoEF
CGATTTTGTTATGTCAGATGTGGACCGCTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAG
TTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTC
ATATGCTCAGTCTCTGACTGAGAAAACTGGAAGCATGCTAATGGCTACAATTCAT
GTAGACGGCAAAGAATACGAGGTCAACGGAGCGGACAACCTGCTGGAAGCTTGT
CTGTCTCTGGGCCTTGATATTCCTTACTTTTGCTGGCATCCGGCGCTGGGAAGTGT
CGGTGCTTGCCGCCAGTGTGCGGTGAAGCAATACCAAAACGCGGAAGACACGCG
TGGTCGCCTGGTGATGTCCTGTATGACACCGGCTTCCGATGGCACCTTTATTTCCA
TTGACGACGAAGAAGCGAAACAGTTCCGTGAAAGCGTGGTCGAGTGGTTGATGA
CCAACCACCCGCACGACTGTCCGGTATGTGAAGAGGGCGGTAACTGCCATCTTCat
gATATGACTGTGATGACCGGACACAGCTTCCGTCGCTACCGTTTCACCAAACGTA
CCCACCGTAATCAGGATTTGGGGCCATTCATCTCTCACGAAATGAACCGCTGCAT
CGCCTGCTACCGCTGTGTGCGTTACTACAAAGATTACGCTGACGGTACAGATCTG
GGCGTTTAcGGTGCGCACGACaACGTCTACTtCGGTCGCCCGGAagacgGCACGCTgg
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Anhang
Anhang 9: Ergebnis der Sequenzierung von pBADnuo/∆nuoG
aCTCAttgtTGTGCCTCCTTGAGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCCGAAGTT
CCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACACTTTCTCA
GTCAGAGACTGAGCGTTAATCGAAATTCGGTTACCAGCGCTCTTTCAGCAGGTTC
GGCTGAATCCCATTAATCAAATGGGTATTGCTGAACGGCTGTTTGATTCCCGCCTC
AAATTCTTCGCGGAAATATTTGATGGCGCTCTGTAACGGCTCCACTGCACCAGGT
GCGTGGGCACAGAAAGTTTTACCCGGGCCTAAGAATCGACACAGTTGCTCAAGTG
TTTCGATATCGCCCGGCTGACCTTCACCACGCTCCAGCGCACGCAGAATTTTCAC
GCTCCACGGCAGACCGTCGCGGCACGGCGTACACCAGCCGCAGGACTCACGGGC
GAAAAACTCTTCCAGGTTACGCACCAGCGACACCATGTTGATCTCATGGTCAACC
GCCATCGCCAGCGCCGTACCCAGACGGCTGCCCGCTTTACCGATACTTTCGAATT
CCATCGGCAGATCAAGGTGCGCTTCGGTCAGGAAGTCAGTCCCCGCGCCGCCTGG
CTGCCAGGCTTTAAATTTCagnnnATCACGCATACCACCGGCGTAATCTTCGaggAtcT
CGCGTGcg
Anhang 10: Ergebnis der Sequenzierung von pBAD-C1/nuoM(Leu244Ile)
P
P
gacttacctataAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGAC
GGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAG
CGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGT
GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCA
TATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCG
CCATTCGCCATTCAGGCTGCTCGCGAGTCCCCCGGGATATCGGTCTGGGCGAAGG
CCATCCACGCACCGTAGAAGATGCCGATAACACCCAGCCACATAGCAATTGGCG
CGAACTCTGCCGACGCGTTCGGGAACAGCGGCAGGGAGAAACGCAGCAAACCGT
AAGCGGCAGTTTTCAGCAAGATCCCCGCGAGGTCAACGGAACCGGCGGTCGGAG
CCTGGGAGTGCGCATCCGGGATCCAGCCATGCAGCGGAACCACCGGCATTTTGAC
TGCGAAGGCGATGAAGAAGCCCAGCATTAACAGGTATTCCACACCACTGGACAT
TGGCGTATTCAGCAGCTCTTCATAGTTGAAGGTCCAGACGCCGGTCGCATTGTAG
TGAACAAAAACCAGCGCCAGGATGGCAATCAACATCACCAGGCCACTCGCCTGG
GTGTAAATGAAGAACTTGGTTGCCGCCGTGATACGCGTTTTACCGTCAGaggCTTT
ATGCCCCCACAGTGCGATCAGGAAGTACATCGGCACCAGCATCATTTCCCAGAAG
aaGaaGAACAGGAACATGTCGaTGGCAAGgaacAcgccga
Anhang 11: Ergebnis der Sequenzierung von pBAD-C1/ nuoM(Asp246Asn)
P
P
AGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACC
TCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGG
GAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTG
GCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGT
GAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCA
TTCAGGCTGCTCGCGAGTCCCCCGGGATATCGGTCTGGGCGAAGGCCATCCACGC
ACCGTAGAAGATGCCGATAACACCCAGCCACATAGCAATTGGCGCGAACTCTGC
CGACGCGTTCGGGAACAGCGGCAGGGAGAAACGCAGCAAACCGTAAGCGGCAGT
TTTCAGCAAGATCCCCGCGAGGTCAACGGAACCGGCGGTCGGAGCCTGGGAGTG
CGCATTCGGCAGCCAGCCATGGAGCGGAACCACCGGCATTTTGACTGCGAAGGC
GATGAAGAAGCCCAGCATTAACAGGTATTCCACACCACTGGACATTGGCGTATTC
AGCAGCTCTTCATAGTTGAAGGTCCAGACGCCGGTCGCATTGTAGTGAACAAAAA
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Anhang
CCAGCGCCAGGATGGCAATCAACATCACCAGGCCACTCGCCTGGGTGTAAATGA
AGAACTTGGTTGCCGCCGTGATACGCGTTTTACCGTCAGAggCTTTATGCCCCCAC
AGTGCGATCAGGAAGTACATCGGCACCAGCATCATTTCCCAGaagaaGAagaacaggaA
CATGTCGATggcanngaacAC
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Danksagung
Ich danke Prof. Dr. Thorsten Friedrich für die Bereitstellung des interessanten Themas und
seine unermüdliche Hilfestellung bei allen Fragen. Er hat es immer geschafft, mich
aufzumuntern, zu ermutigen und mit seinem Enthusiasmus zu motivieren.
Mit den Mitgliedern des Arbeitskreises habe ich nicht nur viele schöne Stunden im Institut
verbracht, sondern auch außerhalb des Labors. Es hat mir mit den „Friedrichs“ viel Spaß
gemacht, und ich werde diese Zeit sehr vermissen. Ich hoffe, einige dieser Freundschaften mit
in meine Zukunft zu nehmen. Für die Erledigung so vieler Kleinigkeiten gilt mein Dank Franz
Butz, Helga Lay und Edith Fitzke. Ich danke außerdem meinen Diplomanden und
Mitarbeiterpraktikanten, von denen viele mir die Arbeit erleichtert haben.
Ich danke den Leuten, die mir (auch in schlechten Zeiten) gezeigt haben, wie schön es ist,
gute Freunde zu haben. Mein besonderer Dank gilt dabei Christiane Schäfer und Stefan
Tacke, Saskia Kissel, Stefan Stolpe, Markus Kohlstädt, Annette, Thom und Marlon Bunk,
Kathrin
Lauckner
und
Andreas
Kranzusch,
außerdem
meinen
Freunden
aus
Mönchengladbach, Christian Bönsch, Andrea Peper und Stephy Foltin. Alle anderen seien
sich sicher, dass ich sie nicht vergessen habe (und nur der Platz nicht ausreicht). Dirk
Flemming möchte ich trotz allem danken, dass ich einige schöne Stunden mit ihm erlebt habe.
Michael Ochsenkühn danke ich dafür, ein Stück des Weges neben mir zu laufen.
Den Pferden Farina, Chamba und Ohio und einer Horde von „Pferdeleuten“ verdanke ich
etliche Stunden der Zerstreuung vom Laboralltag…
Meine Familie hat mir nicht nur das Studium ermöglicht, ich verdanke ihr wesentlich mehr;
meiner Mutter, dass sie den Ehrgeiz in mir gefördert hat, meinem Vater, dass er mir früh die
Augen für die wunderbaren kleinen Dinge dieser Welt geöffnet hat, meinem Bruder danke ich
dafür, dass er der beste Mensch der Welt ist und meinen Omas dafür, dass sie für mich da
waren.
…und letztendlich danke ich dem Tuniberg, auf dem ich im Sonnenschein diese Zeilen
schrieb… Das Leben ist schön!
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