Optische Pinzetten

Optische Pinzetten: die Kräfte des Lichts
Prof. Dr. Holger Kress
Experimentalphysik I – Biologische Physik
40. Fortbildungsveranstaltung für Physiklehrer/innen
1. Oktober 2015
Was sind optische Pinzetten
und wie funktionieren Sie?
Grundlagen und Funktionsweise
optischer Pinzetten
Photonenimpuls
Photon besitzt einen Impuls
Impuls eines sichtbaren Photons
Spiegel
Photon
Zum Vergleich:
Impuls eines PKW auf Autobahn
= 1032 mal mehr als Photon!
Impuls p
Impuls nach
Reflexion p‘
Impulsübertrag
auf Spiegel Δp
Optische Kraft durch Impulsübertrag
Kraft auf Leinwand: Impulsänderung pro Zeit
Laserpointer mit 1 mW Leistung  Kraft auf Leinwand
Optische Kräfte in fokussiertem Licht
1986: Entwicklung der ersten optischen Pinzette durch Arthur Ashkin und Steven Chu
Frei diffundierende Partikel
Partikel mit 1µm und 350 nm Durchmesser
Partikel in optischer Pinzette
Charakterisierung und Kalibrierung
optischer Pinzetten
Kalibrierung einer optischen Pinzette mit Videomikroskopie
Kalibrierung einer optischen Pinzette mit Interferometrie
Datenaufnahmerate mit Photodioden (QPD)
> 1 MHz möglich
Problem:
Relation zwischen QPD-Signal (in Volt) und
Partikelposition im Allgemeinen unbekannt.
Lösung:
Anwendung von statistischer Physik
Kalibrierung mit Interferometrie und Langevin-Methode
Positionsignal-Histogram
Positionssignal
Harmonisches
Potential:
Fluktuationsbreite
Kalibrationsfaktor
Autokorrelation
Fluktuationsbreite
Harmonisches
Potential:
Korrelationszeit
Kraftkonstante
Äquipartitionstheorem
Vergleich zwischen Theorie und Experiment
Kräfte in optischen Pinzetten: Theorie und Experiment
Theorie
Experiment & Theorie
Fourieroptik
→ Hochfokussierte polarisierte Felder
Mie-Theorie
→ Lichtstreuung in fokussierten Feldern
→ Optische Kräfte für Partikel mit d ≈ λ
Rohrbach, PRL (2005)
Gradientenkraft
Streukraft
Interferometrische Partikeldetektion: Theorie und Experiment
Fourieroptik
→ Hochfokussierte polarisierte Felder
Mie-Theorie
→ Lichtstreuung in fokussierten Feldern
→ Detektionsbereich für Partikel mit d ≈ λ
Experiment & Theorie
Axial detection range (μm)
Theorie
Kress et al. Phys. Rev. E (2005)
Experiment
Calculation
Wozu kann man optische
Pinzetten verwenden?
Aufbau einer Zelle
Alberts et. Al, Essential Cell Biology (2010)
Elementare Zellbestandteile: Proteine
• Ein wichtiger Bestandteil unserer Nahrung
• Moleküle, die u. a. biochemische
Reaktionen katalysieren (Enzyme)
• Molekulare Maschinen
Harvard University/XVIVO
Anwendung in
Einzelmoleküluntersuchungen an Proteinen
Molekulare Motoren sorgen für Transport in Zellen
Kinesin Motor und Mikrotubulus
Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)
Transportvorgänge in Nervenzellen
Modifiziert von Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)
Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen:
Geschwindigkeit
Gemessene Geschwindigkeiten
molekularer Motoren:
Kinesin: 1-2 µm/s
Myosin V: 0.2-0.4 µm/s
Alberts et al., Essential Cell Biology, 2010
Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen:
Schrittweiten
Schemazeichnung eines Aufbaus zur Messung
der Schrittweiten eines molekularen Motors
Svoboda et. al, Nature (1993)
Experimenteller Aufbau für
interferometrisches
„Particle Tracking“
Rohrbach et. al, Rev. Sci. Instrum. (2003)
Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen:
Schrittweiten
Direkte Schrittmessung
Funktion der „Paarweisen Distanzverteilung“
Svoboda et. al, Nature (1993)
Ergebnis: Kinesin hat Schrittweite von 8 nm!
Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen:
Schrittweiten
Schrittweite
8 nm
Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)
Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen:
Kraft
Messung der Kraft eines einzelnen Kinesin-Motors
mit einer optischen Pinzette
Joshua Shaevitz, Stanford University
Steve Block Labor, Stanford University
→ Maximalkraft von Kinesin-Motoren:
5-8 pN
(also 5-8∙10-12 N)
RNA-Polymerase:
Ein molekulare Motor für die Transkription von DNA
← Abstand zweier Basenpaare: 3.4 Å
Schrittweite
8 nm
Abbodanzieri et. al, Nature (2005)
RNA-Polymerase:
Ein molekulare Motor mit einer Schrittweite von 3.7 ± 0.6 Å
Schrittweite
8 nm
Abbodanzieri et. al, Nature (2005)
Untersuchungen an einzelnen Zellen:
Mechanik von Filopodien
Filopodien agieren als Fangarme in Fresszellen
Retraktion von Filopodien
Kress et al., PNAS (2007)
Diskrete Schritte in linearer Retraktion
Schrittweitenhistogram
Aktinfilamente sind notwendig für
Retraktion
→ Aktinfilament-basierter Kraftgenerator mit
Schrittweite von 36 nm
Kress et al., PNAS (2007)
Kraft-Geschwindigkeits-Relation der Retraktion
Verfügbare freie Energie pro Motorschritt:
Maximale Kraft eines einzelnen Motors:
fit parameter:
d = 4.6 ± 0.4 nm
Kress et al., PNAS (2007)
Thermodynamisches Modell für mehrere molekulare Motoren:
• Kraft-abhängige Einzelmotor-Kinetik wird durch erweitertes Einzustandsmodell beschrieben
• Mehrere Motoren teilen sich die Zugkraft gleichmäßig auf
Einschub zu
holographischen optischen Pinzetten
Von Einzelstrahlpinzetten zu Mehrstrahlpinzetten
1µm Silicapartikel
Mehrere Fallen
1µm Silicapartikel
Objektiv
Phasenmaske
Chapin et al. (2006)
Hologramm
Laser
Dufresne, et al (1998, 2001)
1998: Entwickliung der ersten holographischen optischen Pinzetten durch David Grier und Eric Dufresne
Holographische optische Pinzetten
Aktueller Aufbau an der Uni Bayreuth
(Konrad Berghoff, Steve Keller, Adal Sabri,
Wolfgang Groß und Lisa Gebhardt)
Untersuchung einzelner Zellen:
Raum-zeitlich flexible chemische Stimulierung
Kontrolle über die chemische Mikroumgebung
von einzelnen Zellen
Immunzelle (Neutrophile) und Bakterium
Hypothese:
Kurzreichweitiger positiver und
langreichweitiger negativer Rückkopplungskreis
By David Rogers (Vanderbilt University) 1950s, 16 mm camera
Weiner, Curr. Opin. Cell. Biol. 2002
Welches sind die charakteristischen Längen- und Zeitskalen?
→ Flexible raum-zeitliche Zellstimulierung nötig!
Flexible Zellstimulierung
mit optisch gefangenene Mikroquellen
Mikroquellen: Struktur und Wirkstoff-Abgabeverhalten
Material: PLGA (Polymer)
Kontrollierte Wirkstoffabgabe eingeschlossener Chemikalien
(Lockstoff fMLP)
bead concentration: 1 mg/ml
Konzentrationsprofil um einzelnes Mikropartikel
Kress et al., Nature Methods (2009)
→ Gradient auf der Längenskala einer Zelle:
Zellreaktionen auf flexible partikel-basierte Stimulierung
Ein anziehendes Partikel
(welches den Lockstoff fMLP absondert)
Kress et al., Nature Methods (2009)
Zwei repulsive Partikel
(welche den Aktin-Inhibitor Cytochalasin absondern)
Untersuchung einzelner Zellen:
Zelluläre Entscheidungsfindung
Zelluläre Entscheidungsfindung
Aktuelles M.Sc. Projekt
von Adal Sabri mit Unterstützung
durch Konrad Berghoff, Steve Keller
und Kathrin Weidner-Hertrampf
Phagozytose: Einverleibung von Partikeln
Monica Hagedorn, 2005
Mayer-Scholl et al., PLoS Pathogens 2005
Aufnahme von zwei Partikeln: Getrennt oder gemeinsam?
Getrennte Internalisierung
zweier Partikel
Gemeinsame Internalisierung
zweier Partikel
Getrennte Aufnahme von zwei Partikeln
Gemeinsame Aufnahme von zwei Partikeln
Entscheidungsverhalten der Zelle hängt vom Partikelabstand ab
Partikel
⌀ = 2 µm
… was kann man noch so alles mit optischen Pinzetten machen?
Vrije Universiteit Amsterdam
Danksagung
Doktoranden
Konrad Berghoff
Wolfgang Groß
Steve Keller
Herbst 2014
Master StudentInnen
Tim Klaußner
Silvie Krizova
Adal Sabri
Christina Zahn
Bachelor Studenten
Stefan Conrad
Christopher Greve
Veit Mengling
TechnikerInnen
Pamela Anger
Andrea Hanold
Ralf Pihan
Kathrin WeidnerHertrampf
Konrad
Steve
Adal
Lisa
Wolfgang Philipp
Christina
Andrea
Kathrin
Tim
Margot
Holger
Alumni
Philipp Dorscht
Manuel Eisentraut
Lisa Gebhardt
Michael Schukalski
Literatur:
Erste Beschreibung einer optischen Pinzette
Literatur:
Erste Beschreibung einer holographischen optischen Pinzette
Literatur:
Übersichtsartikel (Reviews) zu optischen Pinzetten
Literatur:
Praktische Anleitungen zu optischen Pinzetten
Zusammenfassung
• Grundlagen und Funktionsweise optischer Pinzetten
• Charakterisierung und Kalibrierung optischer Pinzetten
• Vergleich zwischen Theorie und Experiment
• Einzelmoleküluntersuchungen an Proteinen
– Kinesin-Motor
– RNA-Polymerase
• Untersuchungen an einzelnen Zellen
– Mechanik von Filopodien
– Einschub zu holographischen optischen Pinzetten
– Raum-zeitlich flexible chemische Stimulierung von Zellen
– Zelluläre Entscheidungsfindung
• Literaturempfehlungen