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Erregerdifferenzierung mittels LoopTag-PCR Werner Lehmann Attomol GmbH, Bronkow Workshop Infektionsdiagnostik Rüdersdorf, 25. Januar 2012 Strategien der Erregerdiagnostik Direkter Nachweis: • Erregerkultur in vitro • Mikroskopie • Molekularer Nachweis • Antigennachweis Indirekter Nachweis: • Antikörpernachweis • Lymphozytentransformationstest Anti-Borrelia-IgG-μLINA Erregerkultur in vitro Vorteile: • Nachweis lebender Erreger • Testung von Antibiotikaresistenzen • preiswert Nachteile: • dauert lange Mycobacterium tuberculosis • Infektionsgefahr • Multiplexnachweis schwierig Borrelia burgdorferi Molekularer Erregernachweis Post-PCR-Nachweis Reverse Hybridisierung Vorteile: • sehr sensitiv • genaue Typisierung von Erregern Nachteile: attomol® Mycobacterium tuberculosis DNA-LINA • arbeitsaufwendig Sequenzierung • Kontaminationsgefahr durch Amplifikat • teurere Reagenzien • qualitativ Molekularer Erregernachweis Realtime-PCR-Nachweis TaqMan-Sondensystem F Vorteile: • sehr sensitiv und spezifisch Q • semiquantitativ/quantitativ • Schmelzkurvenanalytik Hyprobe-Sondensystem A • geringer Arbeitsaufwand, schnell D • Kontaminationsrisiko ist gering LoopTag-Sondensystem Nachteile: PrimerVerlängerung A FRET A D • teure Geräte • Differenzierung von nur 3-4 Amplikons SondenHybridisierung LoopTag-Realtime-PCR-Sondensystem FRET FITC A C G C C TAGCCTAGGTAAAGGGCCTT Cy5 T G C G G CCAACGTTAACCCGGCCACGG-5‘ A C C TGTTAAGGCCG[N]1-100AATTGGCCGGTTGGAATTGGGCCGGTGCCGTTTAAGTCCGGT-3‘ Vorwärtsprimer FITC-5‘-ACGCCTTCCGGGAAATGGATGGCAT-3‘ Sonde 5‘-CCGTGGCCGGGTTAACGCAACC GGCGT -3‘-ATTO590 Patented! Sensitivität der LoopTag-PCR Vorteile: • großer linearer Meßbereich • Nachweis < 10 Kopien pro Ansatz • IS481-Repetition < 1 Genom/Ansatz Nachteile: • Kontaminationsgefahr Erreger Template [fg in 5 μl] interner Standard B. pertussis (BP283) B. pertussis (IS481) B. parapertussis Mycobacterium tub. Borrelia burg. Mycoplasma hom. Ureaplasma ureal. 30 <10 <10 <10 1 1 1 Template [Kopien in 5 μl] 1 7 <1 1 1 1 1 1 Schmelzkurve +++ +++ +++ + +++ +++ • Nachweis subklinischer Erregermengen Erregerdifferenzierung mittels LoopTag LoopTag Vorteile: • 2-3 Schmelzkurvenpeaks pro Meßkanal • toleriert Mutationen im Sondenbereich Nachteile: attomol® Bordetella-Realtime • Kompetition limitiert Sensitivität • keine komplexen Differenzierungen attomol® Mycoplasmen-Realtime Sensitivität/Spezifität der LoopTag-PCR attomol®Bordetella Realtime Interne Studie Nr. Probe 1 PK, Bp, Bpp 2 3 B. pertussis/B. parapertussis B. pertussis/B. parapertussis IS481 IS1001 Bp283 IS1001 + + + + NK - - - - PP1, Bp + - + - 4 PP2, Bp + - -- - 5 PP3, Bpp - + - + 6 PP4, B. holmesii + - - - PK NK PP Bp Bp Positivkontrolle Negativkontrolle Patientenprobe Bordetella pertussis Bordetella parapertussis Sensitivität: Mutationen im Primerbindungsbereich können zu klinisch falschnegativen Bestimmungen führen. Spezifität: Sondensequenzen können zu klinisch falsch-positiven Bestimmungen führen. Zusammenfassung Real-time PCR Technologie: • hochsensitiv und spezifisch • begrenzt multiplextauglich Klinische Aussagekraft: • Nachweis der Nukleinsäure und nicht des lebenden Erregers • falsch-positive und falsch-negative Bestimmungen möglich Konsequenzen: • Einbeziehung des klinischen Bildes • Einsatz weiterer Verfahren
