Untersuchungen zur innaten und adaptiven Immunantwort von
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Untersuchungen zur innaten und adaptiven Immunantwort von Labormäusen gegen Litomosoides sigmodontis (Nematoda, Filarioidea). Vergleich der Genexpression in humanen Makrophagen nach Stimulationen mit Filarien und anderen infektiösen Pathogenen. Der Fakultät für Biologie der Eberhard Karls Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften von Anna Schmidt-Oehm aus Stuttgart - Bad Cannstatt vorgelegte Dissertation 2006 Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2006 Dekan: Prof. Dr. F. Schöffl 1. Berichterstatter: Prof. Dr. H. Schulz-Key 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Dr. h.c. N. Blin Danksagung Hiermit möchte ich folgenden Personen danken: Herrn Prof. Dr. Hartwig Schulz-Key für die Vergabe des Themas und das Erstellen des Erstgutachtens. Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Nikolaus Blin für die Erstellung des Zweitgutachtens. Herrn Dipl. Biol. Wolfgang Hoffmann für die Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit und für die engagierte Betreuung in tierexperimentellen und immunologischen Techniken. Herrn Dipl. Biol. Stefan Schumacher für die allzeit gute Zusammenarbeit und für die Ratschläge in Theorie und Praxis. Herrn Dr. Michael Bonin vom Institut für Humangenetik, Abteilung Medizinische Genetik, Tübingen, für die Durchführung der Genexpressionsanalysen in der Microarray Facility Tübingen Frau Dr. Gudrun Szalay, Frau Dr. Alexandra Kraus, Herrn Dr. Jürgen Löffler und Herrn PD Dr. Christian Sinzger für die Unterstützung bei der Durchführung der Genexpressionsanalysen der humanen Makrophagen und die Bereitstellung der Pathogene. Frau Dipl. Biol. Daniela Lang von der Firma Elchrom für die Durchführung der Genotypisierungen mittels polymorpher Mikrosatellitenmarker. Allen übrigen Mitarbeitern der AG Feldforschung für die gute Atmosphäre und Zusammenarbeit. _____________________________________________________________Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung.……………………………………………………………………......1 1.1 Filariosen...……………………………………………………………………1 1.2 Filarieninfektionen im Tiermodell……………………………………………2 1.3 Entwicklungszyklus von Litomosoides sigmodontis………………………….2 1.4 Immunologische Vorgänge bei Infektionen…...……………………………...4 1.5 Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit…...…………………………………9 1.5.1 Hintergrund der Arbeit…………...…………………………………………...9 1.5.1.1 Genetische Grundlagen der Resistenz von Mäusen gegen Pathogene………..9 1.5.1.2 Expressionsmuster einer Infektion…………………………………………..11 1.5.2 Zielsetzung der Arbeit……………………………………………………….12 2 Material und Methoden……………………………………………………..15 2.1 Die Versuchstiere……………………………………………………………15 2.2 Die Endwirte………………………………………………………………...17 2.3 Der Vektor.......………………………………………………………………17 2.4 Parasitologische Methoden………………………………………………….18 2.4.1 Narkotisieren und Töten der Tiere…………………………………………..18 2.4.2 Blutabnahme………………………………………………………………...18 2.4.3 Mikrofilariengewinnung…………………………………………………….19 2.4.4 Injektion von Mikrofilarien………………………………………………….20 2.4.5 Gewinnung und Implantation von Adultwürmern..…………………………20 2.5 Genotypisierung……………………………..……………………………....21 2.5.1 DNA-Isolierung aus Mausohrgewebe ............................................................21 2.5.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) für D12Nds2….……………………....21 2.5.2.1 Agarose-Gelelektrophorese für D12Nds2…………...……………………....23 2.5.3 PCR für Stat4-k.o……………………….…………...……………………....23 2.5.3.1 Agarose-Gelelektrophorese für Stat4-k.o.…………...……………………...25 2.5.4 PCR an DNAs von Mäusen der N7 (C57BL/6 x BALB/c) mit 77 polymorphen Mikrosatelliten-Markern.……….....……………………....25 2.6 Immunologische Methoden...………………..……………………………....26 2.6.1 L. sigmodontis-Antigenlösung..……………..……………………………....26 I Inhaltsverzeichnis_____________________________________________________________ 2.6.2 Plasmagewinnung……….....………………..……………………………....26 2.6.3 Parasitenspezifischer Antikörper-ELISA..…..……………………………....26 2.7 Genexpressionsanalysen...…………………..……………………………....27 2.7.1 Lungenentnahme.………….………...............................................................27 2.7.2 Microarray-System (Affymetrix)………………...….……………………....27 2.7.3 Genexpressionsanalysen nach Mikrofilarieninjektion....…………………....28 2.7.3.1 Die Versuchstiere........................………………...….……………………....28 2.7.3.2 Auswertung der Microarrays.….………………...….……………………....29 2.7.4 Genexpressionsanalysen nach Implantation adulter Weibchen..…………....29 2.7.4.1 Die Versuchstiere........................………………...….……………………....29 2.7.4.2 Auswertung der Microarrays.….………………...….……………………....30 2.7.5 Genexpressionsanalysen humaner Makrophagen nach Stimulation mit unterschiedlichen Pathogenen……………………………..…………....30 2.7.5.1 Makrophagenisolierung..............………………...….……………………....31 2.7.5.2 Inkubation mit verschiedenen Pathogenen.……...….……………………....31 2.7.5.3 RNA-Isolierung mit dem RNeasy Kit.…………...….……………………....32 2.7.5.4 Auswertung der Microarrays………..…………...….……………………....32 2.8 Statistische Auswertung………………....…..……………………………....34 3 Ergebnisse…………………..…………………………………………………..37 3.1 Kreuzungen verschiedener Inzuchtmausstämme………………….………..37 3.2 Überblick über die Genotypisierung verschiedener Mäusestämme.………..38 3.3 Kreuzung von BALB/c (H2d) mit BALB/b (H2b) ………………….……..39 3..3.1 Parasitologie………………….…………………………………………......39 3.4 Kreuzung von C57BL/6 (H2b) mit BALB/c (H2d) ………………….…….41 3.4.1 Parasitologie………………….……………………………………………..41 3.4.2 Genotypisierung………………….…………………………………………45 3.4.3 PCR an DNAs von Mäusen der N7 mit 77 polymorphen Mikrosatelliten-Markern………………….………………………………...46 3.5 Kreuzung von B10.D2 (H2d) mit BALB/c (H2d) ………………….……...50 3.5.1 Parasitologie………………….……………………………………………..50 3.5.2 Genotypisierung………………….…………………………………………54 3.6 Kreuzung von C57BL/6 (H2b) mit BALB/b (H2b) ………………….…….56 3.6.1 Parasitologie………………….……………………………………………..56 II _____________________________________________________________Inhaltsverzeichnis 3.6.2 Genotypisierung………………….…………………………………………59 3.7 Kreuzung von B10.D2 (H2d) mit BALB/b (H2b) ………………….……...60 3.7.1 Parasitologie………………….……………………………………………..60 3.7.2 Genotypisierung………………….…………………………………………63 3.8 Kreuzungen von Stat4-k.o. mit homozygot resistenten N14 (DBA/1 x BALB/c)…………………………….………………….………..65 3.8.1 Parasitologie………………….……………………………………………..65 3.8.2 Genotypisierung………………….…………………………………………67 3.9 Experimente zur wiederholten Mikrofilariengabe………………….………68 3.9.1 Parasitologie………………….……………………………………………..68 3.9.1.1 Mehrfache Injektionen von Mikrofilarien in verschiedene immunkompetente Labormausstämme………………….………………….68 3.9.1.2 Mehrfache Injektionen von Mikrofilarien in Igα-k.o. ………………….….68 3.9.2 Immunologie………………….…………………………………………….69 3.9.2.1 Humorale Immunantwort………………….………………………………..69 3.10 Genexpressionsanalysen………………….………………………………...71 3.10.1 Genexpressionsanalysen von Mauslungen nach Infektionen mit verschiedenen Stadien von L. sigmodontis………………….………….71 3.10.1.1 Genexpressionsanalysen von Mauslungen nach Infektionen mit Mikrofilarien………………….………………………………………...71 3.10.1.1.1 Genexpression bei naiven BALB/c…………………………………………71 3.10.1.1.2 Genexpression bei infizierten BALB/c……………………………………..73 3.10.1.2 Genexpressionsanalysen von Mauslungen nach Weibchenimplantation…...76 3.10.1.2.1 BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion…………76 3.10.1.2.2 BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion…….………..78 3.10.1.2.3 BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion ………………….……………………..……………80 3.10.1.2.4 Schnittmengen der differentiell regulierten Gene aller Vergleiche………...81 3.10.2 Genexpressionsanalysen humaner Makrophagen nach Stimulation mit unterschiedlichen Pathogenen …………………….……….82 3.10.2.1 Änderung der Genexpression nach drei Zeitpunkten……………….………82 3.10.2.3 Differentielle Genexpression nach 2 Stunden………………….…………...85 3.10.2.4 Differentielle Genexpression nach 8 Stunden………………….…………...88 3.10.2.5 Differentielle Genexpression nach 18 Stunden………………….………….91 III Inhaltsverzeichnis_____________________________________________________________ 4 Diskussion......…………………………………………………………………...95 4.1 Parasitologische Experimente und Genotypisierungen……………………..95 4.2 Genexpressionanalysen..………………..…...……………………………...99 4.3 Ausblick…………………………………………………………………...104 5 Zusammenfassung..………………………………………………………….106 6 Literaturverzeichnis…..…………………………………………………….108 IV _________________________________________________________Liste der Abkürzungen A Absent Abb. Abbildung a. M. Arithmetisches Mittel Aqua dest. Destilliertes Wasser bp Basenpaare BSA Bovines Serumalbumin CD Cluster of Differentiation (Oberflächenmoleküle) cm Centimorgan CVB Coxsackievirus B D Decrease ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent-Assay F Inzuchtgenerationen FCS Fötales Kälberserum G Kanülengröße (engl.: gauge) g Erdbeschleunigung HCMV Humanes Cytomegalovirus HSP Hitzeschockprotein I Increase IFN-γ Interferon-gamma Ig Immunglobulin IL Interleukin IVC Individual Ventilated Cages L3 Drittes Larvenstadium LPS Lipopolysaccharid M molar M Marginal MBL Mannose Binding Lectin Mf Mikrofilarien mfr Mikrofilarämieresistenzlocus MHC Major Histocompatibility Complex MOI Multiplicity of Infection n Stichprobenumfang N Rückkreuzungsgenerationen NC No change V Liste der Abkürzungen_________________________________________________________ NK-Zellen natürliche Killerzellen OD optische Dichte p Probability (hier: Irrtumswahrscheinlichkeit) P Present PAMP Pathogen-Associated Molecular Pattern PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerasekettenreaktion PRR Pattern-Recognition Receptor RPMI Roswell Park Memorial Institute (Zellkulturmedium) SD Standardabweichung SNP Single Nucleotide Polymorphism Stat Signal Transducer and Activators of Transcription Tab. Tabelle Th T-Helfer-Zellen Th1 / Th2 Subpopulation von T-Helferzellen TLR Toll-Like-Rezeptor TNF Tumor-Nekrose-Faktor WHO Weltgesundheitsorganisation VI ___________________________________________________________________Einleitung 1 Einleitung 1.1 Filariosen Unter Filariosen versteht man chronische, parasitäre Infektionen, die durch Filarien (Überfamilie Filarioidea, Unterstamm Nematoda) verursacht werden. Filariosen gehören laut Weltgesundheitsorganisation (WHO) zu den sechs wichtigsten Tropenkrankheiten. Weltweit sind mehr als 150 Mio. Menschen mit Filarien infiziert. Die Letalität von Filariosen ist verglichen mit anderen Tropenkrankheiten praktisch ohne Bedeutung, jedoch werden die Filariosen von der WHO im Jahr 2002 hinsichtlich ihrer klinischen und wirtschaftlichen Bedeutung an dritter Stelle nach Malaria und Tuberkulose geführt, da sie zu einer starken Beeinträchtigung der Lebensqualität führen und der Verlust an Arbeitskraft große sozioökonomische Belastungen mit sich bringt. Die Gruppe der Filarien bilden fadenförmige, meist ovovivpare, getrenntgeschlechtliche, gewebe- und körperhöhlenbewohnende Helminthen mit indirekter Entwicklung. Sie sind in ihrer Entwicklung auf blutsaugende Arthropoden als Zwischenwirte angewiesen. In diesen entwickelt sich das erste Larvenstadium, die Mikrofilarie, bis zum dritten Larvenstadium weiter. Dieses Stadium ist für Wirbeltiere infektiös und wird auf den Endwirt übertragen, in welchem es sich über ein viertes Larvenstadium zum Adultwurm entwickelt, der wiederum Mikrofilarien freisetzt, welche vom Zwischenwirt aufgenommen werden müssen. Insgesamt existieren 8 humanpathogene Filarienarten, von denen lediglich 4 für die medizinische Bedeutung der Filariosen verantwortlich sind. Der Erreger der Onchozerkose oder Flussblindheit ist Onchocerca volvulus, mit dem laut WHO 1995 18 Mio. Menschen infiziert waren. Durch Einwanderung der Mikrofilarien in die vordere Augenkammer und die aus ihrem Absterben resultierenden toxisch-allergischen Reaktionen des Wirts kann es zur Erblindung des Erkrankten kommen. So ist die Onchozerkose eine der wichtigsten Ursache für Erblindung in den Tropen. Die drei weiteren Filariosen mit medizinischer Bedeutung sind die lymphatischen Filariosen, wovon über 119 Mio. Menschen betroffen sind (Michael et al. 1996). Für 90% der Infektionen ist die zirkumtropisch vorkommende Filarie Wuchereria bancrofti verantwortlich. Die restlichen 10% entfallen auf Brugia malayi und Brugia timori und sind auf Teile Asiens beschränkt. Die Adultwürmer sitzen in den Lymphgefäßen und den Lymphknoten, während die Mikrofilarien frei im Blut zirkulieren. Klinische Symptome sind Lymphadenitis, Lymphödeme und Lymphangitis, welche häufig zu Störungen des 1 Einleitung __________________________________________________________________ Lymphgefäßsystems, des renalen Systems und zu Sekundärinfektionen führen (Maizels et al. 1995). Selten kann es nach langjähriger Persistenz von W. bancrofti zur Elephantiasis kommen. 1.2 Filarieninfektionen im Tiermodell Um einen Infektionsverlauf eindeutig charakterisieren zu können, ist es nötig, Experimente zu standardisieren. Der Vorteil eines Tiermodells ist, dass in vivo experimentiert werden kann. Da die wesentlichen Komponenten des Immunsystems von Mäusen denen des Menschen ähneln, sind Schlussfolgerungen aus Beobachtungen im Maussystem für den Menschen grundsätzlich zulässig (Lawrence 1996). Humanpathogene Filarien können aufgrund ihrer hohen Wirtsspezifität nur schwer in Labortieren gehalten werden. Deshalb greift man auf Filarien zurück, die natürlicherweise in Kleinsäugern parasitieren. Litomosoides sigmodontis (Chandler, 1931) ist eine Filarie, die in Baumwollratten parasitiert und sich auch in Labormäusen vom Stamm BALB/c vollständig entwickelt (Petit et al. 1992). Dadurch, dass BALB/c-Mäuse mit L. sigmodontis infiziert werden können, ist es möglich, mehrere parasitologische Parameter, wie z. B. die Parasitendichte und die Wurmlast, zu beliebiger Zeit zu bestimmen. Außerdem können Inzucht-Stämme mit identischem genetischem Hintergrund gezüchtet werden. So ist es möglich, immunologische Fragen auf molekularem Niveau und unter standardisierten Bedingungen zu untersuchen. Des Weiteren ist es möglich, Knockout-Mäuse herzustellen. In Mäusestämmen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund werden beispielsweise gezielt Gene ausgeschaltet, die entweder für Komponenten des Immunsystems kodieren oder in Verdacht stehen, für Resistenzfaktoren verantwortlich zu sein. Mit solchen Tieren kann die Bedeutung des ausgeschalteten Genprodukts untersucht werden. 1.3 Entwicklungszyklus von Litomosoides sigmodontis Die adulten Würmer von L. sigmodontis leben in der Pleurahöhle von Baumwollratten (Sigmodon hispidus). Die adulten Männchen werden circa 3 cm lang, die Weibchen bis circa 12 cm. Die Tiere sind ovovivipar und scheiden bescheidete, bewegliche Mikrofilarien von 75 bis 85 µm Länge aus. Die Mikrofilarienscheide wird von der Eihülle gebildet und umgibt das 2 ___________________________________________________________________Einleitung erste Larvenstadium vollständig. Die Mikrofilarien wandern in die Blutbahn ein und können dort vom Zwischenwirt, der tropischen Rattenmilbe Ornithonyssus bacoti (Macronyssidae, Mesostigmata), mit dem Biss aufgenommen werden. Jetzt wandern die Mikrofilarien aktiv in das Darmepithel ein und entwickeln sich im Laufe von 10 Tagen bis zum dritten Larvenstadium (L3, circa 0,8 mm), welches bei einem weiteren Saugakt von O. bacoti auf eine Baumwollratte übertragen wird. Die L3 wandern innerhalb von 2 bis 4 Tagen via Lymph- und Blutgefäße in die Lunge ein, durchbohren diese und gelangen in die Pleurahöhle (Wenk 1967). Nach vier Wochen und zwei Häutungen erreichen sie das geschlechtsreife Stadium des Adultwurms. Abb. 1.1: Laborzyklus von Litomosoides sigmodontis, verändert nach Hoffmann 2001 und Schumacher 2006. 3 Einleitung __________________________________________________________________ 1.4 Immunologische Vorgänge bei Infektionen Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Typen der Immunantwort: eine unspezifische, angeborene, innate und eine erworbene, adaptive Immunantwort, die spezifisch gegen ein Pathogen gerichtet ist. Die innate Immunantwort ist der erste Weg zur schnellen Eliminierung invasiver Pathogene (Fearon & Locksley 1996, Robertson 1998, Hoffmann et al. 1999). Für die rasche Vernichtung von Bakterien, Pilzen und protozoischen Parasiten sind in erster Linie Phagozyten, eosinophile Granulozyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zuständig, welche Zytokine, v. a. Interferon-(IFN-γ), freisetzen (Morisette et al. 1999, Trinichieri 1995, Weller 1997, Rainbird et al. 1998). Zytokine sind kleine Proteine oder Glykoproteine mit einer Länge von 100-200 Aminosäuren (Schooltink & Rose-John 2002). Nahezu alle kernhaltigen Körperzellen setzen nach ihrer Aktivierung Zytokine frei. Als lösliche, extrazelluläre Botenstoffe übertragen Zytokine ihre Informationen über membranständige Rezeptoren in das Innere ihrer Zielzellen. Für die Zell-Zell-Kommunikation haben Zytokine eine zentrale Bedeutung. Zur Superfamilie der Zytokine gehören Interleukine (IL), Wachstumsfaktoren, Interferone und Chemokine (Nicola 1994). Zytokine spielen eine wichtige Rolle bei Wachstums- und Differenzierungsvorgängen, bei der Apoptose, bei Inflammationsprozessen und bei der Kontrolle des Immunsystems (Arai et al. 1990). Außerdem können Zytokine Parasitosen beeinflussen, beispielsweise via IL-10, welches die Lymphozyten-Reaktivität im Verlauf der humanen der Schistosomiasis moduliert (King et al. 1996). Interleukine und verschiedene Wachstumsfaktoren kontrollieren die Differenzierung und Vermehrung der hämatopoetischen Stammzellen (Moore et al. 2001). Eine weitere zentrale Rolle spielen die Interleukine bei der Koordination und Kontrolle des angeborenen und erworbenen Immunsystems. Ob es zur Abtötung virusbefallener Zellen durch zytotoxische T-Zellen, zur Freisetzung von Histamin durch Mastzellen oder zur Antikörperproduktion von B-Plasmazellen kommt, wird durch verschiedene Zytokine festgelegt (Brian 1988). TNF-α bildet eine eigene Strukturfamilie und gehört mit IL1 zu den wichtigsten Mediatoren von Inflammationssreaktionen (Beutler & Cerami 1989). Eine weitere Funktion, die via TNF-α in die Zielzellen übertragen wird, ist die Auslösung der Apoptose (Grell et al. 1999). Die Wirkung von Zytokinen erfolgt über spezielle membranständige Rezeptoren auf den Zielzellen, deren zelluläre Expression die Spezifität der Wirkung bestimmt. Interferone spielen bei immunmodulatorischen und antiviralen Prozessen eine zentrale Rolle und haben antiproliferatorische Eigenschaften. 4 ___________________________________________________________________Einleitung Makrophagen und neutrophile Granulozyten können toxische Substanzen, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid (H2O2), Superoxidradikale (O2) und Stickstoffmonoxid (NO) produzieren, welche dazu beitragen, aufgenommenen Mikroorganismen zu zerstören. (James 1995). Außerdem hat Stickstoffmonoxid einen inhibierenden Effekt auf z. B. CysteinProteinasen und andere Enzyme, welche für das Überleben von Parasiten unerlässlich sind (Siman-Tov & Ankri 2002). Der Parasit hingegen schützt sich indem er das Enzym Superoxid-Dismutase bildet, welches zu einer Detoxifikation von Superoxidradikalen führt (Ghosh et al. 2003). Das Binden von Pathogenen durch dendritische Zellen und aktivierte Makrophagen führt nicht nur zur Phagozytose der Pathogene, sondern auch zum Anstoß der induzierten Immunantwort. Es wird vermutet, dass bei der Unterscheidung pathogener und kommensalischer Bakterien antiinflammatorische Zytokine und die Kompartimentierung der Immunantwort eine wichtige Rolle spielen (Medzhitov 2001). Chemokine sind eine spezialisierte Gruppe kleiner Polypeptide, die Zellmigrationen von Immun- und Inflammationszellen induzieren (Kim 2004). Chemokine und ihre Rezeptoren sind in 2 Familien unterteilt, die sich anhand der unterschiedlichen Anordnung ihrer beiden N-terminalen-Cystein-Reste unterscheiden. So gibt es CXC-Motive wie z. B. IL8, die eine Aminosäure zwischen diesen Resten tragen und CC-Motive wie z. B. RANTES, welche aus angrenzenden Cysteinmotiven bestehen. Alle diese Chemokine haben korrespondierenden Rezeptoren, die ebenfalls CXC- oder CC-Motive tragen (Rossi & Zlotnik 2000, Bisset et al. 2005). Fremdorganismen werden anhand ihrer molekularen Muster bei Eindringen in den Wirtsorganismus als fremd erkannt. Diese molekularen Muster nennt man Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs), und sie können selbst bei unterschiedlichen Organismen sehr ähnlich sein. Deshalb gibt es nur eine geringe Anzahl von Rezeptoren, so genannter Pattern Recognition Receptors (PRRs), wobei hier der Toll-like-Rezeptor (TLR) -4 eine Schlüsselrolle zu haben scheint. TLR4 und TLR2 sind an der durch endosymbiontische Wolbachia vermittelten Immunantwort gegen O. volvulus beteiligt (Brattig et al. 2004). Der TLR-4 reagiert auf die Anwesenheit von bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS), indem er mit CD14, dem Rezeptor der Makrophagen für LPS, assoziiert. Dadurch kommt es zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB (Rice & Bernard 2005). Dieser wiederum aktiviert Gene, die für die Produktion von Zytokinen und Chemokinen verantwortlich sind, welche als Entzündungsmediatoren fungieren und natürliche Killerzellen aktivieren können (Borish & Steinke 2003). 5 Einleitung __________________________________________________________________ Ein weiterer PRR ist das Mannose Binding Lectin (MBL). Es erkennt bestimmte Zuckerseitenketten auf der Oberfläche von Organismen. Solche Kohlenhydratstrukturen wurden auch bei L. sigmodontis nachgewiesen (Rao et al. 1989). Ein weiteres weit verbreitetes Oberflächenmolekül ist das Phosphorylcholin. Es konnte bei vielen verschiedenen Mikroorganismen wie z. B. bei Streptococcus pneumoniae (Lina et al. 2001) sowie im Homogenat von L. sigmodontis nachgewiesen werden (Araujo et al. 1993). Alle an der innaten Immunantwort beteiligten schnellen unspezifischen Mechanismen überbrücken die Zeit, welche der Organismus benötigt, um die langsamere spezifische, adaptive Immunantwort zu mobilisieren (Tosi 2005). Bei der zweiten Komponente des Immunsystems handelt es sich um eine spezifische, adaptive Immunantwort, die dem Organismus hilft, gezielt auf Pathogene reagieren zu können. Bei der Induktion dieser adaptiven Immunantwort werden essentielle, so genannte kostimulierende Moleküle in dendritischen Zellen und Makrophagen induziert. Diese phagozytotischen Zellen zeichnen sich durch Oberflächenrezeptoren aus, die allgemein vorkommende Bausteine von bakteriellen Oberflächen, zum Beispiel LPS, erkennen und an diese binden. Ist dies geschehen, umfließt der Phagozyt den Erreger und nimmt ihn schließlich auf. Im Inneren der Zelle wird das Pathogen dann enzymatisch abgebaut und schließlich weitere sehr variable Prozesse der adaptiven Immunantwort angeworfen. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Immunantwort spielen die T-Helferzellen. Diese Zellen sind T-Lymphozyten mit T-Zell-Rezeptoren, die Proteinantigene erkennen. Anhand von Oberflächenmolekülen lassen sich zwei Gruppen von T-Lymphozyten unterscheiden: CD8+- und CD4+-Zellen. Die CD4+-Zellen werden auch T-Helferzellen genannt und sezernieren Zytokine, die Botenstoffe der Immunzellen. Im Maussystem wurden zwei unterschiedliche Linien dieser Helferzellen gefunden. Für sie wurden die Bezeichnungen Th1 und Th2 geprägt (Mosmann et al. 1986). Jede dieser Zelllinien leitet eine bestimmte Immunantwort ein, die durch ein charakteristisches Muster der Expression von teilweise antagonistisch wirkenden Chemokinen und Zytokinen gekennzeichnet ist (Maizels et al. 2001). Bei einer Th1-Antwort beobachtet man die Sekretion von IFN-γ, Interleukin 2 (IL-2) und IL-12. Th2-Zellen sezernieren hingegen IL-4, IL-5 sowie IL-13 und aktivieren über IL-5 eosinophile Granulozyten (Yazdanbakhsh et al. 2001). Th1-Antworten sind phagozytenabhängig und werden im Allgemeinen mit intrazellulären Erregern in Verbindung gebracht, wohingegen Th2-Antworten mit der Eliminierung von mehrzelligen Organismen in Verbindung stehen und phagozytenunabhängig sind. Verschiedene Versuche haben jedoch 6 ___________________________________________________________________Einleitung gezeigt, dass diese Zuordnung nicht universell gilt. Adultwürmer von B. malayi rufen eine IL-4 assoziierte Th2-Antwort hervor, wohingegen Mikrofilarien Th1 induzieren. Im Experiment mit IL-4-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung der IL4-Sekretion des Wirtes einen Switch von Th2 zu Th1 induziert (Lawrence et al. 1995). Implantierte, adulte Weibchen von B. pahangi rufen ebenfalls eine mit IL-4 assoziierte Th2Antwort hervor, wohingegen zusätzlich injizierte Mikrofilarien eine Th1-Antwort induzieren (Chirgwin et al. 2002). Ein weiteres Beispiel ist Trichuris muris, dessen Infektionsverlauf in der Labormaus Th2-dominiert ist (Else & Grencis 1991), wohingegen bei den extraintestinalen Filarien die Bedeutung einer Th2-Antwort noch unklar ist. Zwar herrscht bei chronisch an Filariosen Erkrankten eine Th2-Antwort vor (Tawill et al. 2004), jedoch ist nicht gänzlich geklärt, ob diese den Parasiten kontrolliert, oder ob sie protektiv vom Parasiten selbst induziert wird (Maizels et al. 2004). In Versuchen mit O. volvulus wurden Patienten medikamentös von Mikrofilarien befreit, woraufhin sich die Immunantwort von Th2 in Richtung Th1 verschob (Soboslay et al. 1992, 1997). Immunologen diskutieren weltweit, ob das Paradigma einer Th1-/Th2-Antwort nicht überdacht werden sollte (Allen & Maizels 1997). Es gibt auch Beispiele dafür, dass Parasiten bestimmte Komponenten des Immunsystems induzieren, um sich vor einer überschießenden Immunantwort zu schützen. Parasiten stimulieren beispielsweise regulatorische T-Zellen, dabei handelt es sich um eine supprimierende T-Zell-Population (Belkaid et al. 2002). Regulatorische T-Zellen produzieren die Zytokine IL-10 und TGF-β, die die Inflammation und die Immunantwort unterdrücken und scheinen somit zum Überleben des Parasiten beizutragen (Maizels et al. 2004). Dies geschieht über die Kontrolle von CD4+- und CD25+-T-Zellen (Shevach 2002). Ein Beispiel dafür, dass Parasiten eine überschießende Immunantwort des Wirts verhindern, ist, dass in mit S. mansoni infizierten Mäusen, welche CD25+-T-Zellen als Hauptlieferanten von IL-10 haben, dieses essentiell ist, um die Tiere vor einer meist letalen Immunantwort gegen die Eier von S. mansoni in der Leber zu schützen (Hesse et al. 2004). Ein weiterer Teil der adaptiven Immunantwort basiert auf den antigenpräsentierenden Zellen (APC), welche Antigene T-Zellen präsentieren. Die Antigene müssen hierfür zunächst in kleine Peptidfragmente gespalten werden. Dieser Vorgang wird als „Antigenprozessierung“ bezeichnet. Danach werden die Fragmente mit Hilfe verschiedener Kofaktoren an MHC-Moleküle gebunden und zusammen mit diesen an die Zelloberfläche transportiert, um dort T-Zellen präsentiert zu werden. Durch Transplantationsversuche wurde bereits 1914 von Little et al. festgestellt, dass bei genetisch differenten Tieren Transplantate abgestoßen werden. Die Gene, die für diese 7 Einleitung __________________________________________________________________ Abstoßung verantwortlich zeichnen, wurden als Haupthistokompatibilitätsantigene (MHC) bezeichnet. Nach der Entdeckung des H2-Systems der Maus im Jahre 1936 wurden in den 50er Jahren die homologen Strukturen im Mensch entdeckt und als HLA-Komplex (Human Leucocyte Antigen) bezeichnet. Während diese verschiedenen genomischen Loci, die zusammen als System funktionieren, beim Menschen auf Chromosom 6 liegen, findet man sie in der Maus auf dem Chromosom 17. Sowohl das menschliche, als auch das murine MHCSystem zeichnen sich durch einen extremen Polymorphismus aus. Die Funktion der MHCMoleküle besteht prinzipiell darin, eigene und fremde Peptide aus extrazellulären oder aus zytosolischen Proteinen zu binden und für die Erkennung durch T-Lymphozyten auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Man unterscheidet grundsätzlich drei Klassen von MHCMolekülen sowohl nach ihrer Funktion als auch nach ihrer Struktur. Die MHC-Klasse-I-Moleküle findet man auf nahezu allen kernhaltigen Zellen. Sie bestehen aus einer MHC-kodierten, membrangebundenen α-Kette von 45 kDa (schwere Kette), die aus drei extrazellulären Immunglobulindomänen (α1-3), einer Transmembrandomäne und einer kurzen zytosolischen Domäne aufgebaut ist. MHC-Klasse-IMoleküle assoziieren in der Regel über den endogenen Weg der Antigenprozessierung mit zellinternen Antigenen, die zu Peptiden gespalten wurden, und präsentieren diese auf der Oberfläche der Zelle. Die MHC-Klasse-II-Moleküle antigenpräsentierenden Zellen (APCs) werden vor wie B. z. allem von spezialisierten B-Lymphozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen und Thymusepithelzellen exprimiert. Ihre Struktur besteht aus zwei schweren Ketten, einer α-Kette (34 kDa) und einer β-Kette (29 kDa). Die schweren Ketten besitzen jeweils eine Transmembranregion, eine kurze zytosolische Domäne und 2 extrazelluläre Immunglobulindomänen (α1-2; β1-2), über die beide Ketten nichtkovalent miteinander assoziiert sind. Die Funktion der MHC-Klasse-II-Moleküle besteht darin, exogen aufgenommene Antigene, die in Phagolysosomen zu Peptiden verarbeitet wurden, auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Die MHC-III-Moleküle kodieren für Komplementfaktoren, Interleukine wie TNF, das Hitzeschockprotein 70 und für andere Produkte, die bei der Peptidpräsentation wichtig sind. Grundlage für die große Variabilität der MHC-Moleküle und somit für ihre Peptidpräsentationsvielfalt innerhalb eines Organismus und innerhalb einer Spezies ist zum einen ihre Polygenie, d. h. dass es mehrere MHC-Klasse-I und -II-Gene gibt. Zum anderen zeichnen sich die MHC-Gene durch einen außergewöhnlich starken Polymorphismus aus, d. h. es gibt für jedes Gen multiple Allele. Entscheidend für die Funktion der MHC-Moleküle, 8 ___________________________________________________________________Einleitung nämlich die Präsentation von Peptiden an der Zelloberfläche, ist ihre so genannte Peptidbindungstasche. Auch hier unterscheiden sich die MHC-Klassen I und II. In der Nomenklatur stehen Buchstaben für die MHC-Klassen, wobei A und E die MHC-Klasse-II bezeichnen und K und D für MHC-Klasse-I stehen. Abbildung 1.2 gibt einen vereinfachten Überblick über die genomische Organisation des MHC der Maus. Abb. 1.2: Vereinfachte genomische Organisation des MHC in der Maus MHC (nach Schiemann 2005). BALB/c (H2d) hat beispielsweise den Haplotyp d und demzufolge die MHC-Moleküle H-2Dd, H-2Ld, H-2Kd, I-Ad und I-Ed. C57BL/6 (H2b) hat den Haplotyp b und demzufolge die MHC-Moleküle H-2Db, H-2Kb und I-Ab. H-2Lb und I-Eb kommen auf Grund eines Defekts der α-Kette dieser beiden MHC-Moleküle in der C57BL/6-Maus nicht vor. 1.5 Hintergrund und Zielsetzung der Arbeit 1.5.1 Hintergrund der Arbeit 1.5.1.1 Genetische Grundlagen der Resistenz von Mäusen gegen Pathogene Verschiedene Mäusestämme reagieren unterschiedlich auf injizierte Mikrofilarien von L. sigmodontis (Hoffmann et al. 2000). So können DBA/1-Mäuse Mikrofilarien innerhalb von einem Tagen komplett aus dem Blut eliminieren, während diese bei BALB/c-Mäusen über einen Monat lang zirkulieren können. Die Mäusestämme C57BL/6 und B10.D2 tolerieren injizierte Mikrofilarien über einen Zeitraum von bis zu 7 Tagen. So werden Mäusestämme, die innerhalb von 7 Tagen post infectionem im Blut frei von Mikrofilarien sind, in dieser 9 Einleitung __________________________________________________________________ Arbeit per definitionem als resistent, solche mit längerer Mikrofilarämie als suszeptibel bezeichnet. Auch bei Helminthosen ist bekannt, dass verschiedene Nagetierstämme sehr unterschiedlich in ihrer Suszeptibilität auf Infektionen reagieren, so z. B. bei Schistosoma mansoni (Deelder et al. 1978) und Strongyloides ratti (Dawkins et al. 1980). Ebenso wurden bei Infektionsversuchen mit den Filarien Brugia pahangi und Acanthocheilonema viteae stammesabhängige Unterschiede in der Empfänglichkeit der Versuchstiere festgestellt (Fox & Schacher 1976, Haque et al. 1980). Fanning & Kazura untersuchten bereits 1983 die genetischen Grundlagen der Resistenz verschiedener Mäusestämme gegenüber B. malayi. Inzuchtstämme wie CBA/CaJ, C3H/HeJ und DBA/1J entwickelten niedrigere und wesentlich kürzer andauernde Mikrofilarämien als C57BL/6J, BALB/cJ u. a. Die Nachkommen der Kreuzung empfänglicher Stämme mit resistenten waren in der ersten Filialgeneration alle resistent. Wurde die F1 mit dem parentalen suszeptiblen Stamm rückgekreuzt, traten in der N2 sowohl resistente als auch empfängliche Tiere auf. Dies spricht in diesem Fall für eine dominante Vererbung der Resistenz gegenüber der Empfänglichkeit und für nur ein einzelnes oder wenige Gene, die dafür verantwortlich sind. Erste Ergebnisse von Kreuzungsversuchen mit DBA/1 und BALB/c wiesen auch in unserer Arbeitsgruppe darauf hin, dass die Resistenz gegenüber injizierten Mikrofilarien von L. sigmodontis von einem Gen oder einer eng benachbarten Gengruppe kodiert und dominant vererbt wird (Bereth 2000). Durch anschließende serielle Rückkreuzungen resistenter Nachkommen mit dem empfänglichen BALB/c-Elter wurde ein kongener Mäusestamm gezüchtet, der zu mehr als 99% den genetischen Hintergrund von BALB/c-Mäusen aufweist, sich aber in der Suszeptibilität gegenüber intravenös injizierten Mikrofilarien eindeutig von diesen unterscheidet (Schumacher 2002). Um diese Ein-Gen-Hypothese zu bestätigen, wurde mittels Mikrosatellitenanalyse in der Arbeit von Schumacher 2006 gezeigt, dass der postulierte Mikrofilarämieresistenzlocus (mfr) in einer Kandidatenregion von 56-61 cM auf Chromosom 12 liegt. Mikrosatelliten (auch Short Tandem Repeats) sind nicht kodierende DNASequenzen, die über das gesamte Genom verstreut sind. Sie bestehen aus tandemartig wiederholten Motiven von bis zu 6 Basenpaaren (Tautz & Schlötterer 1994, Weber & Wong, 1993). Durch Mutationen entsteht eine Vielzahl von Längenpolymorphismen zwischen verschiedenen Individuen (Dib et al. 1996). Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) lassen sich diese Längenunterschiede einfach nachweisen. Die Tatsache, dass verschiedene resistente Inzuchtstämme existieren, die unterschiedliche Dynamiken des Mikrofilarienabbaus aufweisen, legt die Hypothese nahe, dass der mfr mehrere Allele trägt. Um dies näher zu untersuchen, sollten in dieser Arbeit 10 ___________________________________________________________________Einleitung mehrere Kreuzungen mit den resistenten Stämmen C57BL/6 und B10.D2 angesetzt werden, die im Vergleich zu DBA/1 eine länger andauernde Mikrofilarämie zeigen. Wenn es möglich wäre, mehrere Allele des postulierten mfr in verschiedenen Mäusestämmen zu finden, würde dies unser Infektionsmodell näher an eine tatsächliche humane Population rücken, in der häufig auch mehrere Allele für unterschiedliche Grade von Pathologien gefunden werden, die auf Single Nucleotide Polymorphism (SNP) zurück zu führen sind. Außerdem werden bereits jetzt in unsere Arbeitsgruppe Untersuchungen zu Co-Infektionen gemacht, um zudem festzustellen, ob der postulierte mfr ausschließlich für eine Resistenz gegenüber L. sigmodontis kodiert. In Versuchen mit B. malayi konnte von Hoffmann (persönliche Mitteilung) bereits gezeigt werden, dass auch hier resistente Mäuse die Mikrofilarien schneller abbauen als die suszeptiblen. Die Bedeutung des hier vorgestellten Resistenzmodells mit L. sigmodontis in der Labormaus könnte enorm steigen, sollte sich heraus stellen, dass der mfr-Locus eine Resistenz gegenüber mehreren Pathogenen vermittelt. Ähnliche Beispiele hierfür gibt es bereits. Die Resistenz von Labormäusen gegen Mycobacterium bovis, Salmonella typhimurium und Leishmania donovani wird z. B. von einem einzigen, dominant autosomal vererbten Gen Slc11a1 (solute carrier family 11a member 1) vermittelt. Das Gen wurde als Nramp1 (natural resistance associated macrophage protein), Lsh, Bcg oder Ity beschrieben (Gros et al. 1981, Blackwell 2001). 1.5.1.2 Dringen Expressionsmuster einer Infektion Pathogene in einen Wirtsorganismus ein, werden bestimmte Expressionsmuster induziert (Knodler et al. 2001). Die Mechanismen, welche von innaten Immunzellen als Antwort auf Pathogene induziert werden, beschreiben einerseits die Vorgänge der Wirtsantwort und andererseits die von Pathogenen verwendeten Taktiken, dies zu umgehen (Nau et al. 2002). Makrophagen spielen bei der Erkennung und dem Abtöten von Pathogenen eine entscheidende Rolle (Gordon 1998). Die Untersuchung einzelner immunologischer Parameter konnte bis jetzt die Komplexität des Immunsystems nicht genügend erklären, deshalb werden immer häufiger Genexpressionsanalysen hinzugezogen, um die Zusammenhänge zu klären (Ricciardi-Castagnoli & Granucci 2002, Chaudhuri 2005). 11 Einleitung __________________________________________________________________ 1.5.2 Zielsetzung der Arbeit Es sollten Kreuzungen verschiedener Mäusestämme angesetzt werden, um die Ein- Gen-Hypothese weiter zu untermauern und die unterschiedlichen Allele des postulierten mfrLocus näher zu untersuchen. Ferner sollte die Auswirkung des MHC-Haplotyps der Mäusestämme auf die adaptive Phase der Immunantwort untersucht werden. So wurde die Kombination der Parentalstämme nach zwei Kriterien ausgewählt. Einerseits sollte stets ein gegenüber injizierten Mikrofilarien von L. sigmodontis empfänglicher mit einem resistenten Stamm gekreuzt werden. Die für diese Arbeit relevanten Stämme sind hier die resistenten C57BL/6 und B10.D2 und die suszeptiblen BALB/c und BALB/b. Andererseits wurden mehrere Kombinationen von MHC-Haplotypen ausgewählt, um den Einfluss der MHCHaplotypen auf die Dauer des Abbaus von Mikrofilarien zu untersuchen. Der Stamm B10.D2 leitet sich von C57BL/10-Mäusen ab, die mit DBA/2-Mäusen gekreuzt und auf den genetischen Hintergrund des BLACK-Stammes rückgekreuzt wurden, wobei auf den MHCHaplotyp H2d selektiert wurden. Dieser MHC-Haplotyp entspricht auch dem des BALB/cStammes. Somit sind B10.D2 und BALB/c in Bezug auf den MHC kongen. BALB/c und B10.D2 tragen den MHC-Haplotyp H2d und BALB/b und C57BL/6 den MHC-Haplotyp H2b. Die Parentalstämme, die daraus hervorgegangene F1 und alle nachfolgenden Generationen (Nx) sollten mit Mikrofilarien infiziert werden und ihre Mikrofilarämie bis zur vollständigen Eliminierung bestimmt werden (N steht für die Zahl durchgeführter (Rück)-Kreuzungen, während F für die Zahl durchgeführter Inzuchten steht). Die resistenten Nachkommen der N2 sollten nach der Strategie der seriellen Rückkreuzung weiter mit dem empfänglichen Stamm verpaart werden. Außerdem wurden die suszeptiblen BALB/c (H2d) und BALB/b (H2d) gekreuzt, um zu klären, wie die unterschiedlichen MHC-Haplotypen vererbt werden, wenn sie nicht von einem Resistenzeffekt überlagert werden. Zusätzlich sollten Genotypisierungen mit Hilfe des Mikrosatellitenmarkers D12Nds2 durchgeführt werden, der in der Kandidatenregion für den Resistenzlocus liegt. Resistente und suszeptible Tiere der Kreuzung DBA/1 x BALB/c weisen an dieser Stelle Längenpolymorphismen auf. Handelt es sich bei der Ursache für die genetisch vermittelte Resistenz tatsächlich um nur ein Gen, sollte D12Nds2 auch bei den durchgeführten Kreuzungen Längenunterschiede aufzeigen. Außerdem sollten genomweite Mikrosatellitenanalysen mit der N7 der Kreuzung C57BL/6 x BALB/c gemacht werden, um festzustellen, wie hoch der Grad an Homozygotie nach 7 Rückkreuzungsgenerationen ist, und 12 ___________________________________________________________________Einleitung um den postulierten mfr-Locus auf Chromosom 12 zu bestätigen. Hierzu sollten Marker verwendet werden, für die die beiden Stämme C57BL/6 und BALB/c Längenpolymorphismen aufweisen. Durch im Tierversuch intraperitoneal injizierte Mikrofilarien wird zunächst eine TH1typische Immunantwort mit hoher INF-γ-Produktion induziert (Chirgwin et al. 2002). In dieser Arbeit sollten parasitologische Experimente mit Stat4-k.o.-Mäusen gemacht werden, welche Th1-defizient sind (Murphy et al. 1999), um festzustellen, ob Stat4 am Abbau von Mikrofilarien beteiligt ist. Hierzu sollten Genotypisierungen mit einem Stat4-Marker und mit D12Nds2 durchgeführt werden. Zudem sollten sowohl parasitologische als auch immunologische Experimente mit Tieren durchgeführt werden, die nicht in der Lage sind, Antikörper aufzubauen, um zu klären, ob Antikörper in der adaptiven Phase der Immunantwort beim Abbau von Mikrofilarien eine Rolle spielen. Zur Beschreibung der bei einer Infektion mit verschiedenen Stadien von L. sigmodontis ablaufenden Vorgänge sollten Genexpressionsanalysen an RNA aus Lungengewebe mit cDNA-Oligonukleotid-Microarrays von Affymetrix (Brown & Botstein 1999, Lucchini et al. 2001) durchgeführt werden, welche einen Vergleich der Expression von zahlreichen Mausgenen erlauben (Bolstad et al. 2003). Durch die Analyse der durch L. sigmodontis exprimierten Gene im murinen Modell konnten bereits Kandidatengene für Vakzinemodelle gefunden werden (Allen et al. 2000). Die Lunge gilt als Mikrofilarienreservoir und wird als Hauptabbauort für Mikrofilarien vermutet. In dieser Arbeit sollten die Genexpressionsmuster von BALB/c nach Mikrofilarieninjektion sowie nach kombinierter Adultwurmimplantation und Mikrofilarieninjektion untersucht werden. Implantiert man resistenten Mäusen adulte Weibchen von L. sigmodontis und injiziert nach einer Woche zusätzlich Mikrofilarien, so zirkulieren diese so lange wie in suszeptiblen Mäusen nach alleiniger Mikrofilarieninjektion. In bisherigen Versuchen mit suszeptiblen Mäusen konnten durch eine Implantation adulter Weibchen bisher phänotypisch keine Veränderungen an der Toleranz gegenüber injizierten Mikrofilarien von L. sigmodontis nachgewiesen werden (Hoffmann et al. 2001). Hierzu sollten nun Genexpressionsanalysen mit suszeptiblen BALB/c durchgeführt werden, um Genexpressionsmuster zu finden, die mit einer Weibchenimplantation assoziiert sind. Die korrespondierenden Genexpressionsanalysen mit resistenten Tieren finden sich in der Arbeit von Schumacher 2006. 13 Einleitung __________________________________________________________________ Außerdem sollten weitere Genexpressionsanalysen an humanen Makrophagen nach Stimulation mit mehreren phylogenetisch weit voneinander entfernten Pathogenen durchgeführt werden, um globale Genexpressionsmuster zu finden, die mit der schnellen, unspezifischen Immunantwort gegen Pathogene assoziiert sind. Hierzu sollten die Makrophagen für 2, 8 bzw. 18 Stunden mit jeweils einem der Pathogene Coxsackievirus B, Humanes Cytomegalovirus, Aspergillus fumigatus, Staphylococcus aureus und Mikrofilarien von L. sigmodontis inkubiert und anschließend ihre Genexpression gemessen werden. 14 __________________________________________________________Material & Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Die Versuchstiere Für die Versuche wurden Labormäuse der Inzuchtstämme BALB/cOlaHsd (BALB/c), BALB/bOlaHsd (BALB/b), C57BL/6JOlaHsd (C57BL/6), B10.D2/nOlaHsd (B10.D2) und die Knockoutstämme C.12952-Stat4tm1Gru (Stat4-k.o.) und BALB/c-mb-1-/- (Igα-k.o.). verwendet. Es wurden mehrere Kreuzungen der oben genannten Stämme angesetzt. Dabei wurde die Kombination der Parentalstämme nach zwei Kriterien ausgewählt. Einerseits wurde stets ein gegenüber injizierten Mikrofilarien von L. sigmodontis empfänglicher mit einem resistenten Stamm gekreuzt, andererseits wurden mehrere Kombinationen von MHCHaplotypen ausgesucht, um den Einfluss der MHC-Haplotypen auf die Dauer des Abbaus von Mikrofilarien zu untersuchen. Die BALB-Unterstämme (Abb. 2.1a) BALB/c und BALB/b zeichnen sich durch eine natürliche Empfänglichkeit aus, wohingegen die C57BLUnterstämme (Abb. 2.1b) C57BL/6 und B10.D2 natürlicherweise resistent gegenüber Mikrofilarien sind. BALB/c und B10.D2 tragen den MHC-Haplotyp H-2d und BALB/b und C57BL/6 den MHC-Haplotyp H-2 b. a) b) Abb. 2.1a: BALB Abb. 2.1b: C57BL Übersicht über die Kreuzungen: BALB/c (H-2 d) x C57BL/6 (H-2 b) BALB/b (H-2 b) x C57BL/6 (H-2 b) BALB/c (H-2 d) x B10.D2 (H-2 d) BALB/b (H-2 b) x B10.D2 (H-2 d) 15 Material & Methoden _________________________________________________________ Die jeweils uniform resistente F1 wurde ebenso wie die resistenten Nachkommen nachfolgender Generationen mit dem empfänglichen Parentalstamm rückgekreuzt. Die Generationen nach der F1 werden im Folgenden mit einem N bezeichnet, wobei die angefügte Zahl Auskunft über die Anzahl der Rückkreuzungen gibt, so steht N2 z. B. für die Nachkommen der F1, N3 steht für die Nachkommen der N2 usw. Die Kreuzungen der Stämme werden in Klammern hinter die Generation gesetzt, wobei stets der empfängliche Stamm, mit dem rückgekreuzt wurde, als letztes genannt ist. Diese Rückkreuzungsstrategie wurde bei den Kreuzungen C57BL/6 x BALB/c und B10.D2 x BALB/c bis zur N7 weiterverfolgt. Bei den Kreuzungen C57BL/6 x BALB/b und B10.D2 x BALB/b wurde bis zur N6 rückgekreuzt. Außerdem wurden Tiere aus einer Kreuzung von BALB/c mit DBA/1OlaHsd (DBA/1) verwendet. Der DBA/1-Stamm zeichnet sich durch eine natürliche Resistenz gegenüber injizierten Mikrofilarien von L. sigmodontis aus und ist in der Lage, diese innerhalb eines Tages zu eliminieren. Durch Kreuzung des suszeptiblen BALB/cStammes mit dem resistenten DBA/1-Stamm war es möglich, eine uniform resistente F1 zu erzeugen. Die Rückkreuzung der F1 und aller späteren resistenten Nachkommen mit BALB/c wurde bis zur N19 fortgeführt. Ziel war die Zucht eines homozygot resistenten Mäusestammes (Schumacher 2006). Die verwendeten Tiere dieser Kreuzung stammen aus der N14 (DBA/1 x BALB/c) und wurden mit Stat4-k.o. gekreuzt. Bei Stat4-k.o. sind einzelne Vertreter der Familie der Stat-Gene ausgeschaltet. Die Stat-Proteine (Signal Transducers and Activators of Transcription) sind beim Genregulationsprozess der Proteinkinasen-Aktivierung unerlässlich. Proteinkinasen dienen der vermehrten Expression von Zytokinrezeptoren und damit der Signaltransduktion von Zytokinen. Ein Komplex aus mehreren Stat-Proteinen wird in den Zellkern transferiert, bindet dort als Transkriptionsfaktor an die Promotoren induzierbarer Gene und steuert so deren Transkription (Janeway et al. 2001). Stat4-k.o.Mäuse wurden auf dem genetischen Background von BALB/c generiert und sind somit suszeptibel gegenüber Mikrofilarien. Die uniform resistente F1 aus der Kreuzung Stat4-k.o. x N14 wurde einmal mit Stat4 rückgekreuzt, um eine N2 zu erzeugen, die homozygot den Stat4-Knockout und heterozygot ein Resistenzallel trägt Zusätzlich wurden BALB/c-mb-1-/--Mäuse (Igα-k.o.) verwendet. Dabei handelt es sich um einen Stamm, der einen mb-1-Knockout trägt. Mb-1 kodiert für das Immunglobulin Igα (CD79a), ein transmembranes Glykoprotein, das Expression und Funktion verschiedener BZell-Rezeptorkomplexe sowohl auf Progenitor- wie auf maturen B-Zellen vermittelt. In Mäusen, die auf Grund eines mb-1-Knockouts kein Igα aufweisen, entwickeln sich B-Zellen nicht über das Progenitorstadium hinaus, somit sind die Tiere nicht in der Lage Antikörper zu 16 __________________________________________________________Material & Methoden bilden (Pelanda et al. 2002). Diese Tiere dienten zur Untersuchung der adaptiven Phase während des Abbaus von Mikrofilarien. BALB/c, BALB/b, C57BL/6 und B10.D2 stammten von der Harlan Winkelmann GmbH (Borchen) und wurden am Institut für Tropenmedizin (Tübingen) weitergezüchtet. Die Igα-k.o.-Mäuse stammten von der GBF (Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Braunschweig) und wurden am MPI für Immunbiologie in Freiburg hergestellt. Stat4-k.o. stammten von Jackson Laboratory (Bar Harbor, USA). Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen der Größen II und III gehalten. Die Käfige standen in klimatisierten Räumen und waren einem zwölfstündigen Tag-Nacht-Rhythmus ausgesetzt. Zu einem Teil wurden sie in geschlossenen Käfigen unter der Zufuhr von gefilterter Luft (IVC-System der Firma Tecniplast, IVC = Individually Ventilated Cages) gehalten. Ein anderer Teil wurde unter konventionellen Bedingungen gehalten, d.h. in Käfigen ohne Filterdeckel. Allen Tieren wurde Futter und Wasser ad libitum verabreicht. 2.2 Die Endwirte Der Zyklushaltung von L. sigmodontis dienten 2 Vertreter der Familie der Muridae (Mäuseverwandte), die zur Unterfamilie der Sigmodontinae (Neuweltmäuse) gehörende mittelamerikanische Baumwollratte (Sigmodon hispidus) sowie die der Unterfamilie Gerbillinae (Rennmäuse) angehörende mongolische Rennmaus (Meriones unguiculatus). Baumwollratten sind die natürlichen Endwirte von L. sigmodontis, Rennmäuse eignen sich gut als Ersatzwirte. Tiere beider Arten wurden der hauseigenen Zucht entnommen. Die Haltung erfolgte in Makrolon-Käfigen der Größen III und IV und unter ansonsten gleichen Bedingungen wie die der Labormäuse. 2.3 Der Vektor Ornithonyssus bacoti, der natürliche Überträger von L. sigmodontis, wurde in Glasbecken mit Holzeinstreu und bei Dauerlicht gehalten. Die Raumtemperatur lag bei 2830°C und die Luftfeuchtigkeit bei 80% relativer Luftfeuchte. Um zu verhindern, dass die Milben entweichen konnten, wurde die Außenseite mit einer Filzmanschette, die mit einem Insektenrepellent (Dimethylphtalat) befeuchtet war, versehen. Zusätzlich standen die Becken 17 Material & Methoden _________________________________________________________ in Wannen, die mit Glyzerin gefüllt waren. Zur Fütterung der Milben wurden narkotisierte (Nembutal, Ceva, Paris) mongolische Rennmäuse, die in Drahtkäfigen auf die Einstreu gesetzt wurden, verwendet. Um sicherzustellen, dass die vollgesogenen Milben von den Tieren abfielen und keine weiteren auf sie klettern konnten, wurden die Drahtkäfige nach einiger Zeit über Nacht an den Deckel des Milbenbehälters gehängt. 2.4 Parasitologische Methoden 2.4.1 Narkotisieren, Markieren und Töten der Tiere Um den Tieren Blut abzunehmen, musste man sie in eine Kurzzeit-Narkose versetzen. Hierzu wurden die Tiere in einen Exsiccator gesetzt, in den über eine Wasserstrahlpumpe ein Luft-Diethylether-Gemisch gesaugt wurde. Nachdem sie mindestens zehn Sekunden bewusstlos waren, wurden sie herausgenommen. Für Operationen wurden die Tiere länger betäubt. Hierzu diente ein Gemisch aus dem Analgetikum Esketaminhydrochlorid (KetanestS, Parke-Davis, Berlin; Dosierung: 100 mg/kg Körpergewicht) und dem Muskelrelaxans Xylazinhydrochlorid (Rompun®2% von Bayer Vital, Leverkusen; Dosierung: 15 mg/kg Körpergewicht). Nach der Etherbetäubung bekamen die Tiere eine intramuskuläre Injektion mit einer 26GKanüle in ein Hinterbein. Die Dauer dieser Narkose betrug etwa eine Stunde. Um die Versuchstiere eines Käfigs voneinander unterscheiden zu können, erhielten sie mit einer Skin-Snip-Zange Ohrlochmarkierungen. Zur Organgewinnung, Adultwurmgewinnung sowie zur Obduktion mussten die Tiere mit CO2 getötet werden. Zu diesem Zweck setzte man die Mäuse in einen kleinen Kunststoffbehälter und leitete das Gas über einen Schlauch ein. 2.4.2 Blutabnahme Unter Ethernarkose wurde Mäusen eine 10 µl Hämatokritkapillare (Minicaps, heparinisiert, Multimed, Kirchheim/ Teck) und Baumwollratten eine 60 µl Hämatokritkapillare (Minicaps, heparinisiert, Multimed, Kirchheim/ Teck) unter leichtem Drehen neben dem Augapfel in den retroorbitalen Venenplexus eingeführt und das 18 __________________________________________________________Material & Methoden heraustretende Blut gesammelt. Das Blut, das zur Gewinnung von Mikrofilarien entnommen wurde, wurde mit einem Tropfen Heparin versetzt und in 12 ml-Polystyrolröhrchen aufbewahrt. 2.4.3 Mikrofilariengewinnung Baumwollratten oder Rennmäusen wurden etwa 2 ml Blut entnommen und mit dem gleichen Volumen Zellkulturmedium (RPMI 1640 mit 25 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin, GIBCO BRL, Eggenstein) versetzt. Um Mikrofilarien aus den Spendertieren in größerer Menge frei von Blutzellen zu gewinnen, wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt (Chandrashekar et al. 1984). Dazu wurden zwei Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte angesetzt. Zunächst stellte man eine Verdünnung aus einer 2,5M-Saccharoselösung in Percoll® (Pharmacia, Uppsala, Schweden) im Verhältnis 1:10 her und erhielt so eine 90%ige isoosmotische Stammlösung. Nun wurde diese mit einer 0,25M-Saccharoselösung auf eine 25%ige und eine 30%ige Percolllösung weiterverdünnt. In einem 12ml-Polystyrolröhrchen wurden 2 ml der 30%igen Lösung vorgelegt und darüber vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette 2 ml der 25%igen Lösung geschichtet. Darüber wurden wiederum ohne die Schichtung zu zerstören die 4 ml verdünnten Blutes mit einer Pasteur-Pipette aufgetragen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 400 g und 25°C für 35 Minuten. Die Mikrofilarien bildeten dadurch eine deutlich erkennbare Interphase in Form einer milchigen Bande. Diese wurde mit einer Pasteur-Pipette abgenommen und in ein weiteres 12ml-Polystyrolröhrchen überführt, welches mit RPMI auf 10 ml aufgefüllt und für 10 Minuten einer Zentrifugation unter gleichen Bedingungen unterworfen wurde. Daraufhin waren die Mikrofilarien als Pellet am Boden des Röhrchens zu sehen. Das RPMI wurde bis auf einen Rest von etwa 0,5 ml mit einer Pasteur-Pipette abgesaugt und das Pellet je nach Größe in circa 4 ml RPMI resuspendiert. Um die Anzahl der Mikrofilarien zu bestimmen, wurde eine Probe der Lösung in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer ausgezählt. Etwa 10 µl der Suspension wurden 1:100 mit RPMI verdünnt und davon wurden wiederum 10 µl auf die Zählkammer aufgetragen. Die Anzahl der gezählten Mikrofilarien in einem Großquadrat multipliziert mit dem Faktor der Zählkammer und dem Verdünnungsfaktor ergab die Mikrofilarienanzahl pro Mikroliter. 19 Material & Methoden _________________________________________________________ 2.4.4 Injektion von Mikrofilarien Den narkotisierten Mäusen wurde mit einem elektrischen Haarschneider das Hals- bzw. Brustfell rasiert. Der rasierte Bereich wurde dann mit einem hautverträglichen Desinfektionsspray, SoftaSept (Braun, Melsungen), behandelt. Die Tiere wurden auf dem Rücken liegend mit Klebestreifen auf einer Platte fixiert und im Bereich der Vena jugularis wurde die Haut etwa einen Zentimeter eingeschnitten. Mit einer 30G-Kanüle wurde unter einem Binokular eine ca. 50 000 Mikrofilarien enthaltende Menge RPMI in die Vena jugularis injiziert. Nach der Injektion wurde die durch Zusammendrücken der Wundränder verschlossen. Nach der Operation kamen die Tiere in mit Zellstoff ausgelegte Käfige. 2 Stunden nach der Operation wurde den Tieren erstmals Blut abgenommen, um die Mikrofilariendichte zu bestimmen. Hierzu wurden 30 µl Blut in ein EppendorfReaktionsgefäß mit 1 ml 10%-FACSTM-Lysing-Solution (Becton Dickinson, San Jose) gegeben, 5 Minuten stehen gelassen und dann für weitere 5 Minuten bei 400 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die Probe wurde bis auf etwa 10 µl abgesaugt und diese auf einen Objektträger aufgetragen und unter einem Mikroskop ausgezählt. In der Regel wurde die Mikrofilarämie der Versuchstiere in ein bis sieben Tagesabständen, bis zum Tag der vollkommenen Elimination der Mikrofilarien, bestimmt. 2.4.5 Gewinnung und Implantation von Adultwürmern Zur Gewinnung von Adultwürmern wurden die infizierten Baumwollratten getötet, die Bauchseite geöffnet und die Würmer aus der Pleurahöhle gespült. Diese wurden in mit RPMI gefüllten Petrischalen einige Zeit bei 37°C stehen gelassen, um die stark miteinander verschlungenen Adultwürmer voneinander zu lösen. Männchen und Weibchen wurden anhand von Länge und Dicke unterschieden und getrennt. Im Folgenden wurden ausschließlich Versuche mit adulten Weibchen von L. sigmodontis durchgeführt. Den Versuchstieren wurde die rechte Bauchseite enthaart, desinfiziert und die Tiere auf einer Platte fixiert. Ein etwa 1 cm langer Schnitt öffnete zuerst die Bauchhaut, ein weiterer dann das Peritoneum. Durch diese Öffnung wurden je fünf adulte, lebende Weibchen zusammen mit 1,5 ml RPMI über eine Kunststoffpasteurpipette in das Peritoneum gespült. Anschließend wurde der Peritonealschnitt einfach (Vicryl 5/0, geflochten, Ethicon, Edinburgh), der Hautschnitt mit Rückstich doppelt vernäht (Ethilon 5/0, monofil, Ethicon, Edinburgh, 20 __________________________________________________________Material & Methoden Schottland). In anderen Versuchen wurden nur 1,5 ml RPMI ohne Würmer injiziert (Scheininfektionen). 2.5 Genotypisierung 2.5.1 DNA-Isolierung aus Mausohrgewebe Diese Versuche wurden mit dem Direct PCR Lysis-Kit (Viagen, Los Angeles) durchgeführt. Hierzu wurde den Versuchstieren eine etwa 2 mm2 große Ohrgewebeprobe entnommen und zusammen mit 75µl PCR Lysis Reagent und 1µl Proteinase K (20µg/µl) in ein 0,5 ml-Eppendorfreaktionsgefäß gegeben. Dann wurden die Proben im Hybridisierungsofen bei 55°C über Nacht und anschließend im Wasserbad bei 85°C für 45 min inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 15000 g für 10 s. Der die DNA enthaltende Überstand wurde abgenommen und die isolierte DNA entweder weiterverwendet oder bei 20°C gelagert. 2.5.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) für D12Nds2 In vorangegangenen Versuchen mit Rückkreuzungen von DBA/1 mit BALB/c konnte mittels Mikrosatelliten-Markern gezeigt werden, dass sich der Resistenz vermittelnde Locus auf Chromosom 12 in einer Region von 56-61 cM befindet (Schumacher 2006). Um anhand von Längenpolymorphismen suszeptible von resistenten Tieren unterscheiden zu können, wurde der Marker D12Nds2 verwendet, bei dem für DBA/1 das PCR-Fragment 162 bp und bei BALB/c 165 bp lang ist. Die Banden von C57BL/6 und B10.D2 sind identisch und liegen bei ca. 170 bp. Es wurden dieselben Primer, wie in der Arbeit von Schumacher 2006 verwendet. Die Primer wurden hier nach Angaben des CIDR (Center for Inherited Disease Research, http://www.cidr.jhmi.edu/) ausgewählt und sind dort nachzulesen. Abbildung zeigt das Schema einer Auftrennung der PCR-Fragmente von BALB/c, BALB/b, C57BL/6, B10.D2 und DBA/1 und des 100 bp-Markers. 21 Material & Methoden _________________________________________________________ Marker DBA/1 B10.D2 C57BL/6 BALB.b BALB/c 500 bp 200 bp 165 bp 162 bp 100 bp Abb. 2.2: Schema der Gelelektrophorese des 100 bp-Markers und von BALB/c, BALB/b, C57BL/6, B10.D2 und DBA/1 Die PCR setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen: Konzentration Endkonzentration Volumen 10 x Puffer 10 x 1x 5 µl dNTP 10 mM 200 µM 1 µl D12Nds2-F 20 µM 0,4 µM 1 µl D12Nds2-R 20 µM 0,4 µM 1 µl Taq-DNA-Polymerase (Qiagen) 5 U / µl 1,25 U 0,25 µl DNA (ca. 20 ng) 1,5 µl H2O 40,25 µl 50 µl PCR-Programm: 94°C 10 min 1x 94°C 1 min 52°C 1 min 40 x 72°C 1´30 min 72°C 10 min 1x 22 __________________________________________________________Material & Methoden 2.5.2.1 Agarose-Gelelektrophorese für D12Nds2 Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in 2%igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Herstellung des Agarosegels wurden 3 g MetaPhor®-Agarose (Cambrex, Rockland) mit 150 ml 1x TBE, bestehend aus 10,78 g Trizma-Base (Sigma-Aldrich, St. Louis), 5,50 g Borsäure (Merck), und 0,75 g EDTA (Merck) für 10 min bei 150°C und dann in der Mikrowelle bei maximaler Leistung (1000 W) bis zum vollständigen Lösen der Agarose erhitzt. Nachdem die viskose Lösung auf ca. 60°C abgekühlt war, wurden 8 µl Ethidiumbromid zugegeben. Der Ansatz wurde in eine horizontale Gelkammer mit eingesetzten Kämmen gegossen und für ca. 20 Minuten bei 8°C im Dunkeln auspolymerisiert. Für den Gellauf wurde der Kamm aus dem Gel gezogen und die Elektrophoresekammer bis ca. 0,5 cm oberhalb des Gels mit 1x TBE gefüllt. 10 µl PCR-Produkt wurde mit 5 µl Ladepuffer (Peqlab, Erlangen) vermischt und aufgetragen. Um eine Größenabschätzung der Produkte vornehmen zu können, wurden in die erste Tasche jeder Gelreihe 2 µl eines 100 bp Markers (100 bp DNA-Leiter, äquimolar, Roth, Karlsruhe) aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei 120 W für ca. 3 Stunden. Die aufgetrennten Banden konnten unter UV-Licht (312 nm) dargestellt, mit einer Kamera photographiert und im Computer gespeichert werden. 2.5.3 PCR mit Stat4-k.o. Als Nachweis für einen Knockout von Stat4 wurde folgende PCR etabliert. Das PCR- Fragment hat eine Länge von 84 bp (Abb. 2.3). Primersequenzen: 5'- CCA ACT CAG ACA GCA ACT G -3' 5'- GCT CTT TGA GCA GGG ATG G -3' 23 Material & Methoden _________________________________________________________ Abb. 2.3: Gelelektrophorese von Stat4-k.o.-Tieren. Die erste Geltasche ist mit einem 100 bp-Marker, die zweite mit einem PCR-Produkt einer Maus ohne Stat4-Knockout und die dritte mit einem Produkt einer Stat4-k.o.-Maus gefüllt. Die PCR setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen: Konzentration Endkonzentration Volumen 10 x Puffer 10 x 1x 2,5 µl dNTP 10 mM 200 µM 0,5 µl Stat4.1 20 µM 0,4 µM 0,3 µl Stat4.2 20 µM 0,4 µM 0,3 µl Taq-DNA-Polymerase 5 U / µl 1,25 U 0,125 µl DNA (16 ng) 1 µl H2O 19,675 µl 25 µl PCR-Programm: 95°C 15 min 1x 95°C 35 s 64°C 45 s 12 x 72°C 45 s 94°C 35 s 58°C 30 s 25 x 72°C 45 s 72°C 10 min 1x 24 __________________________________________________________Material & Methoden 2.5.3.1 Agarose-Gelelektrophorese für Stat4-k.o. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden in 2%igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Herstellung des Agarosegels wurden 2 g Agarose (Biozym, Oldendorf) mit 100 ml 1x TBE in der Mikrowelle bei maximaler Leistung (1000 W) bis zum vollständigen Lösen der Agarose erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden 8 µl Ethidiumbromid zugegeben. Der Ansatz wurde in eine horizontale Gelkammer mit eingesetzten Kämmen gegossen und für ca. 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln auspolymerisiert. Für den Gellauf wurde der Kamm aus dem Gel gezogen und die Elektrophoresekammer bis ca. 0,5 cm oberhalb des Gels mit 1x TBE gefüllt. 10 µl PCR-Produkt wurde mit 5 µl Ladepuffer vermischt und aufgetragen. Um eine Größenabschätzung der Produkte vornehmen zu können, wurden in die erste Tasche jeder Gelreihe 2 µl eines 100 bp Markers aufgetragen. Der Gellauf erfolgte bei 120 W für ca. 90 Minuten. Die aufgetrennten Banden konnten unter UV-Licht (312 nm) dargestellt, mit einer Kamera photographiert und im Computer gespeichert werden. 2.5.4 PCR an DNAs von Mäusen der N7 (C57BL/6 x BALB/c) mit 77 polymorphen Mikrosatelliten-Markern Jeweils zwei suszeptiblen und zwei resistenten Tieren der N7 aus der Kreuzung C57BL/6 x BALB/c, einer BALB/c- und einer C57BL/6-Maus wurden SchwanzspitzenBiopsien entnommen. Alle anschließenden Arbeitsschritte wurden bei der Firma Elchrom in Cham (www.elchrom.com, Schweiz) unter standardisierten Bedingungen durchgeführt. Auch das Design der Primerpaare wurde von Elchrom übernommen. Zunächst wurde die DNA isoliert, um dann mittels PCR 77 polymorphe Mikrosatelliten-Marker zu testen. Pro autosomalem Chromosom wurden jeweils 5 Marker eingesetzt. Im hochauflösenden Hydrogel wurden die PCR-Produkte dann analysiert. 25 Material & Methoden _________________________________________________________ 2.6 Immunologische Methoden 2.6.1 L. sigmodontis-Antigenlösung Hergestellt worden war das Antigen, indem Adultwürmer in PBS aufgenommen, mit einem Homogenisator auf Eis manuell zerkleinert und danach 3 mal 3 Minuten einer Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier 250, Stufe 4, 30% Beschallung) unterworfen worden waren. Nach 30 minütiger Zentrifugation bei 10 000 g und 4°C wurde der lösliche Überstand abgenommen, durch ein 0,22 µm-Filter steril filtriert und der Proteingehalt mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteintest nach Keller & Neville (1986) bestimmt (Pfaff 2001). 2.6.2 Plasmagewinnung 200 µl Vollblut wurden in BD Microtainer PST LH- Reaktionsgefäßen (Becton Dickinson, San Jose) gesammelt und sofort 10 x invertiert. Nach einer Zentrifugation bei 15000 g für 2 min konnte das Plasma als Überstand abgenommen werden. 2.6.3 Parasitenspezifischer Antikörper-ELISA 96-Well-ELISA-Platten wurden über Nacht mit 50 µl L. sigmodontis-Antigen in Beschichtungspuffer (7 µg/ml, 0,2 M Natriumcarbonat [1,6 g Na2CO3 + 2,94 g NaHCO3 ad 1 l H2O], pH 9,6) bei 4°C beschichtet. Dann wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und zum Blockieren mit 75 µl Blockierungspuffer (86 ml PBS mit 10 ml hitzeinaktiviertem FCS und 0,4 ml Tween-20) pro Well 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Drei weiteren Waschschritten folgte eine 90 minütige Inkubation bei 37°C mit 50 µl der 1:100 mit Verdünnungspuffer verdünnten Versuchstierseren pro Well. Für die Leerwertbestimmung wurde nur Verdünnungspuffer (= Blockierungspuffer) zugegeben. Darauf folgte wieder dreimaliges Waschen, dann wurden 50 µl einer Lösung aus Verdünnungspuffer und detektierendem Antikörper (IgM 1:2000) in die Wells pipettiert und die Platten 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde viermal gewaschen und in jedes Well 50 µl einer paraNitrophenylphosphat(pNPP)-Lösung (1 Tablette in 20 ml Substratpuffer [0,5 mM 26 __________________________________________________________Material & Methoden MgCl.5H20] mit 97 ml Diethanolamin in 1 Liter Aqua dest. gelöst, mit HCl auf pH 9,6 eingestellt) zugegeben. Möglichst schnell wurden nach kurzem Schütteln im Photometer die optischen Dichten bestimmt. Hier wurde eine Kinetikmessung mit Einzelmessungen alle 30 Sekunden bei einer Wellenlänge von 405 nm durchgeführt. Aus dem Verlauf der Messwerte im Verlauf einiger Minuten wurden mit dem Programm Microwin® (Fa. Mikrotek, Overath) die maximalen Steigungen der Geschwindigkeit der Farbreaktion berechnet. 2.7 Genexpressionsanalysen Zur Beschreibung der bei einer Infektion mit verschiedenen Stadien von L. sigmodontis ablaufenden Vorgänge wurden Genexpressionsanalysen an RNA aus Lungengewebe mit cDNA-Oligonukleotid-Microarrays von Affymetrix durchgeführt. Die Lunge gilt als Mikrofilarienreservoir und wird als Hauptabbauort für Mikrofilarien vermutet. Es wurden die Genexpressionsmuster von BALB/c nach Mikrofilarieninjektion sowie nach kombinierter Adultwurmimplantation und Mikrofilarieninjektion untersucht. 2.7.1 Lungenentnahme Die Tiere wurden 2 Stunden nach Mikrofilarieninjektion mit CO2 getötet und in 70% Ethanol getaucht. Alle weiteren Schritte erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die Haut wurde von der Körpermitte zum Kopf hin aufgeschnitten und zur Seite festgesteckt. Nun wurde die Bauchhaut geöffnet und der Brustkorb freigelegt. Das Sternum wurde durchtrennt und nach oben gebogen, um die Lungenflügel freizulegen. Die Lungenflügel wurden herausgeschnittenen und in ein mit 4 ml Trizol (Invitrogen, Karlsruhe) gefülltes 12mlPolystyrolröhrchen auf Eis oder Trockeneis gegeben. Durch das Trizol wurde die RNA fixiert und konnte nicht sofort durch Nucleasen zerstört werden. 27 Material & Methoden _________________________________________________________ 2.7.2 Microarray-System (Affymetrix) Die Genexpressionanalysen wurden von der Microarray Facility Tübingen durchgeführt. Hergestellt werden Microarrays mittels Photolitographie (Southern et al. 1999). Unter Verwendung einer photolitographischen Maske werden auf das Trägermaterial (Glasplatte) mit einem Laser Oligonucleotide aufgetragen. Durch wiederholtes Hybridisieren der Oligos ist es so möglich, mehrere tausend Oligonucleotide auf einem Chip zu synthetisieren. Hierbei steht jedes Oligonucleotid repräsentativ für ein Gen (Duggan et al. 1999, Lipshutz et al. 1999). Für die Genexpressionsanalysen der Mikrofilarieninjektion wurde der Maus-Chip U74AV2 verwendet, auf dem circa 6000 in Funktion und Lokalisation bekannte Gene und circa 6000 Expressed Sequence Tags (EST) repräsentiert sind. Zur Analyse der Implantationsversuche wurden MG 430 V2 Oligonukleotid-Microarrays von Affymetrix eingesetzt die mit ca. 45 000 repräsentierten Probe Sets annähernd das gesamte Mausgenom vertreten. Zunächst wurde aus den entnommenen Lungenflügeln die RNA isoliert. Nun wurde die gewonnene RNA mittels der Polymerase Reverse Transkriptase in komplementäre, doppelsträngige DNA (cDNA) umgeschrieben, durch in vitro-Transkription in cRNA umgewandelt und mit biotinmarkierten Nucleotiden markiert. Um die Qualität und die Quantität der RNA zu testen, wurden die Proben mittels eines 2100 Bioanalyzers (Agilent Technologies) photometrisch analysiert. Nun wurde der Microarray mit den Targetsequenzen hybridisiert und die Signalstärke für jeden Punkt des Arrays bestimmt. Anhand der Intensitätsunterschiede konnte man die verschiedenen Expressionsmuster einzelner Gruppen von Spendertieren vergleichen. 2.7.3 Genexpressionsanalysen nach Mikrofilarieninjektion 2.7.3.1 Die Versuchstiere Es wurden männliche BALB/c-Mäuse im Alter von ca. 6 bis 8 Wochen verwendet. Die Versuchsgruppen setzten sich aus naiven BALB/c, die völlig unbehandelt in den Versuch aufgenommen wurden, scheininfizierten BALB/c und mit Mikrofilarien infizierten BALB/c zusammen. Scheininfiziert bedeutete, dass die Tiere RPMI injiziert bekamen. 28 __________________________________________________________Material & Methoden Übersicht der prozessierten Arrays: Scheininfizierte BALB/c n=3 Naive BALB/c n=4 Infizierte BALB/c n=3 2.7.3.2 Auswertung der Microarrays Um die gemeinsame Regulierung der Expression funktionell verbundener Gene zu untersuchen, wurden Auswertungen mit Ingenuity Pathway Analysis 3.1 (IPS, www.ingenuity.com) durchgeführt (Schoch et al. 2004). Hierzu erfolgte eine Verarbeitung der Rohdaten der Microarrays zunächst mittels der Software ArrayAssist von Affymetrix. IPS berechnet eine Anzahl verschiedener funktioneller Gennetzwerke, in dieser Arbeit wird für jeden Vergleich immer die Netzwerke mit der höchsten Anzahl differenziell regulierter Gene wiedergegeben. Die Kriterien für eine differenzielle Genexpression sind hier eine Signal Log Ratios (SLR) von > 1 bzw. < -1, sowie ein p < 0,05. SLR sind logarithmierte Verhältnisse der Signale zweier Chips zueinander. Folgende Vergleiche wurden berechnet, wobei die zweite Versuchsgruppe jeweils die Baseline darstellt: Naive BALB/c versus scheininfizierte BALB/c Infizierte BALB/c versus scheininfizierte BALB/c 2.7.4 Genexpressionsanalysen nach Implantation adulter Weibchen 2.7.4. Die Versuchstiere In diesem Experiment wurden männliche BALB/c im Alter von ca. 6 bis 8 Wochen mit den folgenden 3 Behandlungen: Mikrofilarieninjektion, Mikrofilarieninjektion nach Scheinbehandlung, Mikrofilarieninjektion nach Weibchenimplantation verwendet. 29 Material & Methoden _________________________________________________________ Übersicht der prozessierten Arrays: BALB/c mit Mikrofilarieninjektion n=5 BALB/c mit Mikrofilarieninjektion nach Scheinbehandlung n=4 BALB/c mit Mikrofilarieninjektion nach Weibchenimplantation n=5 2.7.4.2 Auswertung der Microarrays Die Bildverarbeitung sowie Berechnung der Signalstärken und weiterer Parameter sowie die Berechung von Signal Log Ratios erfolgte mit ArrayAssist. Auch hier wurden Gennetzwerke wie oben beschrieben erstellt. Folgende Vergleiche wurden berechnet: BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion. BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion. BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion. 2.7.5 Genexpressionsanalysen humaner Makrophagen nach Stimulation mit unterschiedlichen Pathogenen Genexpressionsanalysen wurden an Makrophagen, die aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) generiert worden waren, durchgeführt. Als Kontrollen dienten unbehandelte Makrophagen. Inkubiert wurden die Makrophagen mit systematisch weit voneinander entfernten Pathogenen, um Genexpressionsmuster zu finden, die mit der unspezifischen Immunantwort gegen Pathogene und mit pathogenspezifischen Antworten in Verbindung stehen 30 __________________________________________________________Material & Methoden 2.7.5.1 Makrophagenisolierung Die Makrophagen wurden zunächst als Monozyten aus Vollblut isoliert, um sie dann zu Makrophagen heranreifen zu lassen. Hierzu wurden 350 ml humanes, heparinisiertes Vollblut im Verhältnis 1:1 mit vorgewärmten PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Sigma) gemischt und über 15 ml Lymphozytentrennmedium (Histopaque-1077, Sigma) geschichtet, um einen Dichtegradienten zu erstellen. Anschließend wurde die Probe bei 400 g und 37°C für 30 min zentrifugiert. Die gebildete Interphase aus peripheren mononukleären Zellen wurde abgenommen und wiederum im Verhältnis 1:1 mit PBS gemischt. Es folgte eine Zentrifugation bei 37°C und 400 g für 10 min. Die Zellen lagen nun als Pellet vor und wurden erneut zweimal unter gleichen Bedingungen zentrifugiert, um sie dann in RPMI, das mit 10% FCS versetzt war, aufzunehmen. Die Zellen wurden ausgezählt und in einer Konzentration von 1,04 x 106 Zellen/cm2 auf einer Petrischale ausgesät, was einer ungefähren Dichte von 1 x 107 Zellen pro Petrischale entsprach. Um zu gewährleisten, dass die Zellen am Kunststoff der Petrischalen adhärierten, wurden sie für 2-3 Stunden bei 37°C inkubiert. Es folgte die Zugabe von 0,7 µl/ml GM-CSF (Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor). An jedem zweiten Tag wurde 1/3 des Mediums durch 2,1 µl/ml GM-CSF enthaltendes RPMI (10% FCS) ausgetauscht. Nach sieben Tagen wurde das RPMI (10% FCS) durch Makrophagenmedium (60% AIM-V-Medium (GIBCO), 30% Iscove-Medium (GIBCO), 10% Antibiotika: l-Glutamine, Penicillin und Streptomycin) ausgetauscht, welches wiederum alle zwei Tage zur Hälfte durch neues ersetzt wurde. Nach 2-3 Wochen waren die Makrophagen ausdifferenziert und wurden für zehn Minuten bei 37°C und 400 g zentrifugiert. Durch Zugabe von 700 µl Accutase (PAA, Pasching, Österreich) wurden die Zellen auf das Ablösen vorbereitet, anschließend für 30 min bei 37°C inkubiert und durch mehrmaliges Spülen mit kaltem PBS komplett vom Kunststoff abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden auf Eis weiter behandelt, um ein erneutes Adhärieren zu verhindern. Die Makrophagen wurden in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen pro Well auf einer 6-Well-Platte in Makrophagenmedium ausgesät. 31 Material & Methoden _________________________________________________________ 2.7.5.2 Inkubation mit verschiedenen Pathogenen Die Makrophagen wurden für 2, 8 bzw. 18 Stunden mit jeweils einem der Pathogene Coxsackievirus B (CVB, Picornaviridae, Virus), Humanes Cytomegalovirus (HCMV, Herpesviridae, Virus), Aspergillus fumigatus (A. fumigatus, Moniliaceae, Fungi), Staphylococcus aureus (S. aureus, Micrococcaceae, Bacteria), und Mikrofilarien von L. sigmodontis bei 37°C mit der folgenden Multiplicity of Infection (MOI) inkubiert: CVB 10:1 CMV 1:1 A. fumigatus 2:1 S. aureus 35:1 L. sigmodontis 0,1:1 2.7.5.3 RNA-Isolierung Nach den entsprechenden Inkubationszeiten konnte die RNA mit dem RNeasy-Kit (Qiagen, Hilden) isoliert werden. Zunächst wurde hierzu das Makrophagenmedium entfernt und 350 µl RLT-Puffer, welcher aus 10 µl 2-Mercaptoethanol pro ml Lysispuffer bestand, auf jeweils 1 x 107 Zellen gegeben. Dies diente der Lyse der Zellen, welche direkt auf eine QIAshredder-Säule pipettiert und anschließend bei Raumtemperatur für 2 min und 4500 g zentrifugiert wurden. Es wurden 350 µl 70% Ethanol pro Lysat zugegeben und gemischt, dann das komplette Lysat auf eine RNeasy-Säule pipettiert und für 15 s bei 4000 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die isolierte RNA wurde noch dreimal mit jeweils 700 µl frischem RLT-Puffer und abschließend einmal mit 50 µl RNA-freiem Wasser unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Nun konnte mittels eines Photometers der RNA-Gehalt gemessen werden. 32 __________________________________________________________Material & Methoden 2.7.5.4 Auswertung der Microarrays Die Bildverarbeitung sowie Berechnung der Signalstärken und weiterer Parameter erfolgten hier zunächst mit der Affymetrix Microarray Suite Version 5.0.0.032 (MAS). Eingestellt wurde zur einheitlichen Skalierung der verschiedenen Arrays ein Target Signal von 150. Signalstärken und Detection wurden direkt in Microsoft Excel übertragen. Für die Detection werden „A“ (absent), „P“ (present) oder „M“ (marginal) angegeben, die aussagen, ob ein Messwert tatsächlich zu berücksichtigen oder als Rauschen zu bewerten ist. „A“ wurde durch „0“, „P“ durch „1“, „M“ durch „0,5“ ersetzt. Um Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen Versuchsgruppen zu ermitteln, wurden in der MAS Batchanalysen durchgeführt, d. h. paarweise Vergleiche jedes Chips der einen mit jedem Chip der anderen Versuchsgruppe. Aus den Batchanalysen wurden Signal Log Ratio sowie Signal Log Ratio High, Signal Log Ratio Low sowie der Change in Excel übertragen. „NC“ (no change) wurde durch „0“, „I“ (increase) durch „1“, „MI“ (medium increase) durch „0,5“, „D“ (decrease) durch „- 1“ und „MD“ (medium decrease) durch „- 0,5“ ersetzt. Folgende Kriterien mussten erfüllt werden, um Gene als in einem Vergleich sicher differenziell exprimiert zu betrachten. Für heraufregulierte Gene: Für herunterregulierten Gene: - Signalstärke des Experiment-Arrays ≥ 50 - Signalstärke des Baseline-Arrays ≥ 50 - Detection des Experiment-Arrays ≥ 0,66 - Detection des Baseline-Arrays ≥ 0,66 - Signal Log Ratio ≥ 1 - Signal Log Ratio ≤ - 1 - Signal Log Ratio Low ≥ 0,5 - Signal Log Ratio High ≤ - 0,5 - Change ≥ 0,66 - Change ≤ - 0,66 Maßgebend für eine differentielle Regulierung heraufregulierter Gene war, dass das Gen auf den Experiment-Arrays eine Signalstärke über 50 aufwies und bei mindestens 2/3 der Experiment-Arrays als „present“ detektiert wurde. Darüber hinaus durfte für das Gen bei den Batchanalysen nicht in weniger als 2/3 der Vergleiche ein „increase“ angegeben werden und die SLR Low als eine Art Streuungsmaß nicht unter 0,5 liegen. Als ausschlaggebend für 33 Material & Methoden _________________________________________________________ herunterregulierte Gene galt, dass das Gen auf den Baseline-Arrays eine Signalstärke über 50 aufwies und bei mindestens 2/3 der Baseline-Arrays als „present“ detektiert wurde. Darüber hinaus durfte das Gen nicht in weniger als 2/3 der Vergleiche ein „increase“ aufweisen, und die SLR Low als eine Art Streuungsmaß nicht unter 0,5 liegen. Zur grafischen Darstellung der auf ähnliche Weise regulierten Gene wurden die Versuchsgruppenmittelwerte der Signalstärken aller differentiell regulierten Gene mit der Software Genesis (Institute for Genomics and Bioinformatics - Graz University of Technology, http://genome.tugraz.at/Software/; Sturn, Quackenbush & Trajanoski 2002) auf einen Bereich von -2 bis +2 normalisiert und in Heatmaps dargestellt. Werte zwischen -2, 0 und +2 wurden grün, schwarz und rot dargestellt. 2.8 Statistische Auswertung Zur Bildung von Mittelwerten wurde das arithmetische Mittel berechnet. Als Streuungsmaß wurde die Standardabweichung verwendet. Die Überprüfung auf signifikante Unterschiede zwischen den Versuchstiergruppen erfolgte mittels des Mann-Whitney(U)Testes. Als signifikant wurden Unterschiede zwischen Gruppen betrachtet, wenn die zweiseitige Irrtumswahrscheinlichkeit p kleiner als 0,05 war. Hierzu wurden die Programme Microsoft Excel XP und WinSTAT 3.0 verwendet. Die Übereinstimmung der bei den Kreuzungsversuchen ermittelten Zahlenverhältnisse von empfänglichen und resistenten Tieren mit den nach den Mendelschen Regeln zu erwartenden, wurde mit einem Binomialtest überprüft. 34 __________________________________________________________________Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Kreuzungen verschiedener Inzuchtmausstämme Die Inzuchtmausstämme und die verschiedenen Kreuzungen dieser Stämme wurden jeweils mit 50000 Mikrofilarien von L. sigmodontis infiziert und hinsichtlich parasitologischer Parameter untersucht. Versuche zur Mikrofilarämie und Dauer des Abbaus von Mikrofilarien, zeigten die Verteilung resistenter und suszeptibler Tiere in den verschiedenen Kreuzungsgenerationen. Die Parentalstämme der Kreuzungen zeichneten sich durch unterschiedliche Mikrofilarämien aus (Abb. 3.1). Parentalstämme Mf/30µl Blut 1000 BALB/b (n=10) C57BL/6 (n=6) 100 B10.D2 (n=15) BALB/c (n=14) 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.1: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der Stämme B10.D2, BALB/c, BALB/b und C57BL/6 nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die Stämme C57BL/6 (H2b) und B10.D2 (H2d) waren bis zum Tag 4 bzw. 6 mikrofilarienpositiv und damit resistent. Im Folgenden werden Tiere per Definition als resistent bezeichnet, wenn sie bis zum Tag 7 alle injizierten Mikrofilarien abbauen. Bei BALB/b waren die Mikrofilarien im Blut nie länger als 15 Tage nachzuweisen. Im Blut von BALB/c fanden sich 21 Tage lang Mikrofilarien. BALB/b (H2b) und BALB/c (H2d) erfüllen somit die Kriterien für Suszeptibilität, da sie länger als per Definition Resistente mikrofilarienpositiv sind. In späteren Rückkreuzungsgenerationen mit BALB/c gab es auch Tiere, die länger als 21 Tage mikrofilarienpositiv waren. 35 Ergebnisse__________________________________________________________________ Bei allen Kreuzungen wurde ein resistenter Stamm mit einem empfänglichen gekreuzt. Die jeweils uniform resistente F1 wurde ebenso wie die resistenten Nachkommen nachfolgender Generationen immer mit dem empfänglichen Stamm rückgekreuzt. 3.2 Überblick über die Genotypisierung verschiedener Mäusestämme Mithilfe des Mikrosatelliten-Markers D12Nds2 ist es möglich, mit sehr großer Wahrscheinlichkeit resistente und suszeptible Tiere bis zur N14 aus der Kreuzung von DBA/1 mit BALB/c zu unterscheiden (Schumacher 2006). Ziel des aktuellen Versuchs war es festzustellen, ob diese Genotypisierung auch bei Kreuzungen anderer Stämme möglich ist, und ob die Resistenz der C57BL/6 und B10.D2 wie bei DBA/1 auch auf dem Mikrofilarämieresistenzlocus mfr basiert. Hierzu wurde von verschiedenen Generationen DNA isoliert und Genotypisierungen mithilfe des D12Nds2-Markers durchgeführt. Bei der Genotypisierung zeigte sich, dass sich die Banden der suszeptiblen BALB/c und BALB/b in ihren Längen nicht unterschieden. Sie lagen bei 165 bp. Die Banden der resistenten B10.D2 und C57BL/6 glichen sich ebenfalls, allerdings unterschieden sie sich hier gegenüber der von DBA/1, die bei 162 bp lag. Die Bande von C57BL/6 und B10.D2 lag bei ca. 170 bp (Abb. 3.2). 36 __________________________________________________________________Ergebnisse e 200 bp 165 bp 162 bp R e B10.D2 x BALB/c (n=6) C57BL/6 x BALB/c (n=6) DBA/1 B10.D2 C57BL/6 BALB/b BALB/c 500 bp B10.D2 x BALB/b (n=6) Marker C57BL/6 x BALB/b (n=6) Marker R e R e 500 bp R 100 bp 200 bp 100 bp Abb. 3.2: Schema der Genotypisierung von BALB/c, BALB/b, C57BL/6, B10.D2, DBA/1 und Kreuzungen dieser Stämme. Zur Orientierung sind links und rechts die Banden eines 100 bp-Markers dargestellt. 3.3 Kreuzung von BALB/c (H2d) mit BALB/b (H2b) 3..3.1 Parasitologie BALB/b (H2b)-Tiere wurden mit BALB/c (H2d)-Tieren verpaart und ihren Nachkommen Mikrofilarien injiziert. Ziel war es, den Einfluss des MHC-Haplotyps auf die adaptive Phase der Immunantwort suszeptibler Tiere zu untersuchen. Die Nachkommen der F1 aus der Kreuzung BALB/c x BALB/b waren bis zum Tag 15 mikrofilarienpositiv. Sie verhalten sich somit wie homozygote BALB/b (H2b), folglich verhält sich der MHC von BALB/b (H2b) dominant gegenüber dem von BALB/c (H2d) (Abb. 3.3). 37 Ergebnisse__________________________________________________________________ N1 (BALB/c x BALB/b) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 10 n = 21 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.3: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der F1 (BALB/c x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. 38 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.4 Kreuzung von C57BL/6 (H2b) mit BALB/c (H2d) 3.4.1 Parasitologie C57BL/6 (H2b) wurden mit BALB/c (H2d) verpaart, um zu untersuchen, ob der dominante BALB/b-Haplotyp bei den suszeptiblen Tieren der N2 zum Tragen kommt. Die Nachkommen der F1 aus der Kreuzung C57BL/6 (H2b) mit BALB/c (H2d) waren bis zum Tag 4 Mf-positiv (Abb.3.4). F1 (C57BL6 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n = 23 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.4: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der F1 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die F1 wurde mit suszeptiblen BALB/c (H2d) verpaart und die Nachkommen der N2 einer Mikrofilarieninjektion unterzogen. Die N2 spaltete im Verhältnis 1:1 in resistente und suszeptible Tiere auf, wobei 50% der Nachkommen innerhalb der ersten 5 Tage in der Lage waren, die injizierten Mikrofilarien abzubauen, und 50% länger mikrofilarienpositiv waren. Bei den empfänglichen Tieren konnten zwei klar voneinander getrennte Gruppen ermittelt werden. 25% der gesamten Tiere waren binnen der ersten 15 Tage mikrofilarienfrei und die restlichen 25% waren bis Tag 25 mikrofilarienpositiv. Bereits an Tag 8 war der Unterschied der beiden suszeptiblen Gruppen signifikant. Somit konnte bestätigt werden, dass sich der H2b-Haplotyp von BALB/b dominant gegenüber dem H2d-Haplotyp von BALB/c verhält. Bereits an Tag 2 war der Unterschied von suszeptiblen und resistenten Tieren signifikant (Abb. 3.5). 39 Ergebnisse__________________________________________________________________ N2 (C57BL/6 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 * n = 21 10 n = 10 * n = 14 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.5: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N2 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. Die resistenten Tiere der N2 wurden weiter mit BALB/c (H2d) verpaart. Auch hier zeigte sich eine Aufspaltung in 50% resistente und 50% suszeptible Tiere, wobei sich die suszeptiblen Tiere wiederum in zwei Gruppen aufspalteten, wobei eine bis zum Tag 15 mikrofilarienfrei war und die andere bis zum Tag 23. Auch diese beiden Gruppen spalteten im Verhältnis 1:1 auf. Auch hier war der Unterschied von suszeptiblen und resistenten Tieren bereits an Tag 3 signifikant (Abb. 3.6). N3 (C57BL/6 x BALB/c) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n = 20 n = 12 10 n = 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.6: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N3 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 40 __________________________________________________________________Ergebnisse Die resistenten Nachkommen wurden mit BALB/c (H2d) verpaart. Die N4 spaltete in Resistente und Suszeptible näherungsweise im Verhältnis 1:1 auf. Es ließen sich keine suszeptiblen Untergruppen diskriminieren (Abb. 3.7). N4 (C57BL/6 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n=6 10 n=4 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.7: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N4 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die Ergebnisse der parasitologischen Untersuchungen für die N5, N6 und N7 zeigten ein Spaltungsverhältnis in Resistente und Suszeptible von näherungsweise 1:1. Die resistenten Tiere eliminierten die Mikrofilarien spätestens bis zum Tag 7, die suszeptiblen waren mindestens bis zum Tag 21 und maximal bis zum Tag 29 mikrofilarienpositiv. Bei der N5 und N6 war der Unterschied von suszeptiblen und resistenten Tieren bereits am zweiten Tag nach der Injektion signifikant (Abb. 3.8, 3.9 und 3.10). 41 Ergebnisse__________________________________________________________________ N5 (C57BL/6 x BALB/c) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n=6 10 n=8 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infetionem Abb. 3.8: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N5 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. N6 (C57BL/6 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 * n = 10 10 n=5 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.9: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N6 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 42 __________________________________________________________________Ergebnisse N7 (C57BL/6 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n=7 10 n = 11 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.10: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N7 (C57BL/6 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. 3.4.2 Genotypisierung Aus der Kreuzung C57BL/6 x BALB/c wurden 7 Tiere der N6 genotypisiert (Abb. 3.11) und anschließend parasitologisch eingestuft. Die Ergebnisse stimmten mit denen der Mikrofilarieninjektion überein (Ohne Abbildung). Als Kontrollen wurden BALB/c und C57BL/6 verwendet. Unter den 7 getesteten Tieren der N6 waren 2 resistente und 5 suszeptible. Es wurden in jeder Generation Tiere genotypisiert (ohne Abbildung). 1 2 3 4 5 6 7 DBA/1 C57BL/6 BALB/c N4 (C57 BL/6 x BALB/c) Abb. 3.11: Genotypisierung der N6 der Kreuzung C57BL/6 x BALB/c. Als Kontrollen wurden BALB/c, C57BL/6 und DBA/1 aufgetragen. Die resistenten Tiere 1 und 6 zeigen heterozygote Banden. Die suszeptiblen Tiere 2-5 und 7 zeigen homozygote BALB/c-Banden. 43 Ergebnisse__________________________________________________________________ 3.4.3 PCR an DNAs von Mäusen der N7 mit 77 polymorphen Mikrosatelliten-Markern In diesem Versuch wurde die DNA von jeweils zwei phänotypisch suszeptiblen bzw. resistenten N7-Tieren aus der Kreuzung C57BL/6 x BALB/c mittels PCR für 77 polymorphe Mikrosatelliten-Marker untersucht, bei denen zwischen BALB/c und C57BL/6 Längenpolymorphismen bestehen. Damit sollte einerseits festgestellt werden, wie groß der tatsächliche Grad der Homozygotie nach sieben Generationen war und andererseits sollten Abschnitte im Genom entdeckt werden, an denen sich die suszeptiblen von den resistenten unterscheiden. Als Kontrollen wurden BALB/c und C57BL/6 verwendet. Die N7-Mäuse wiesen für 73 der polymorphen Mikrosatelliten-Marker homozygot BALB/c-Allele auf (Abb. 3.12 und 3.13). Die Proben wurden stets in der gleichen Reihenfolge von links nach rechts auf das Gel aufgetragen: BALB/c, C57BL/6, N7 (suszeptibel), N7 (suszeptibel), N7 (resistent) und N7 (resistent). Die erste Zahl, die auf den Gelelektrophoresebildern dargestellt ist, steht für das Chromosom und die zweite für den verwendeten Marker, wobei hier eine niedrige Zahl für das proximale Ende und eine hohe für das distale Ende steht 44 __________________________________________________________________Ergebnisse Abb. 3.12: Polymorphe Mikrosatelliten-Marker für BALB/c und C57BL/6, bei denen suszeptible und resistente N7-Tiere BALB/c-Banden aufweisen. Die erste Zahl steht für das Chromosom und die zweite für den Marker. Bande 1: BALB/c, Bande 2: C57BL/6, Bande 3 und 4: suszeptible Tiere der N7, Bande 5 und 6: resistente Tiere der N7. 45 Ergebnisse__________________________________________________________________ Abb. 3.13: Polymorphe Mikrosatelliten-Marker für BALB/c und C57BL/6, bei denen suszeptible und resistente N7-Tiere BALB/c-Banden aufweisen. Die erste Zahl steht für das Chromosom und die zweite für den Marker. Bande 1: BALB/c, Bande 2: C57BL/6, Bande 3 und 4: suszeptible Tiere der N7, Bande 5 und 6: resistente Tiere der N7. Wie aus den Abbildungen 3.14 und 3.15 hervorgeht, ist jeweils eines der suszeptiblen N7Tiere heterozygot für den Marker 2.5 und 7.4, somit können diese Loci nicht für die Resistenz verantwortlich sein. 46 __________________________________________________________________Ergebnisse Abb. 3.14: Polymorpher Mikrosatelliten-Marker 5 auf Chromosom 2 für BALB/c und C57BL/6, bei dem eines der suszeptiblen N7-Tiere heterozygot ist. Bande 1: BALB/c, Bande 2: C57BL/6, Bande 3 und 4: suszeptible Tiere der N7, Bande 5 und 6: resistente Tiere der N7. Abb. 3.15: Polymorpher Mikrosatelliten-Marker 4 auf Chromosom 7 für BALB/c und C57BL/6, bei dem eines der suszeptiblen N7-Tiere heterozygot ist. Bande 1: BALB/c, Bande 2: C57BL/6, Bande 3 und 4: suszeptible Tiere der N7, Bande 5 und 6: resistente Tiere der N7. Für den Mikrosatelliten-Marker 5 auf Chromosom 12, wiesen die zwei resistenten Tiere heterozygote Banden auf. Dieser kommt somit also für den Resistenz vermittelnden Bereich in Frage. Bei den beiden suszeptiblen Tieren treten hier BALB/c-Banden auf (Abb. 3.16). Abb. 3.16: Polymorpher Mikrosatelliten-Marker 5 auf Chromosom 12 für BALB/c und C57BL/6, bei dem suszeptible N7-Tiere BALB/c-Banden aufweisen und resistente heterozygot für C57BL/6 sind. Bande 1: BALB/c, Bande 2: C57BL/6, Bande 3 und 4: suszeptible N7, Bande 5 und 6: resistente N7. 47 Ergebnisse__________________________________________________________________ 3.5 Kreuzung von B10.D2 (H2d) mit BALB/c (H2d) 3.5.1 Parasitologie Der Stamm B10.D2 (H2d) wurde mit dem Stamm BALB/c (H2d) gekreuzt. Den daraus hervorgehenden F1-Tieren wurden 50000 Mikrofilarien injiziert und es wurde die Dauer ihrer Mikrofilarämie bestimmt. Die F1 war uniform resistent und bis zum Tag 5 mikrofilarienpositiv (Abb. 3.17). F1 (B10.D2 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 10 n = 20 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.17: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der F1 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die F1 wurde mit den suszeptiblen BALB/c (H2d) rückgekreuzt. Der daraus hervorgehenden N2 sowie allen folgenden Generationen wurden 50000 Mikrofilarien intravenös injiziert und die Dauer der Mikrofilarämie bestimmt. Wie zu erwarten, spaltete die N2 in Resistente und Suszeptible näherungsweise im Verhältnis 1:1 auf (Abb. 3.18). 48 __________________________________________________________________Ergebnisse (B10.D2 x BALB/c) x BALB/c 1000 Mf / 30µl Blut 100 n = 25 10 n = 26 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.18: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N2 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Im Folgenden wurde die Strategie der seriellen Rückkreuzung weiter verfolgt. Es wurden aus jeder Generation die resistenten Nachkommen mit BALB/c-Tieren verpaart. Die Dauer der Mikrofilarämie wurde für alle Nachkommen bestimmt. In der N3 traten näherungsweise 50% resistente und 50% suszeptible Tiere auf. Am Tag 2 nach der Injektion war der Unterschied von Resistenten und Suszeptiblen signifikant (Abb. 3.19). N3 (B10.D2 x BALB/c) 1000 * Mf/30µl Blut 100 n = 10 10 n = 11 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.19: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N3 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. * = p < 0,05 49 Ergebnisse__________________________________________________________________ In der N4 traten 7 suszeptible und 3 resistente Tiere auf. Dies liegt nach dem Binomialtest immer noch im ermittelten Referenzbereich für eine erwartete Aufspaltung von 1:1 (Abb. 3.20). N4 (B10.D2 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n=7 10 n=3 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.20: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N4 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die N5 spaltete erwartungsgemäß näherungsweise im Verhältnis 1:1 in Resistente und Suszeptible auf. Die resistenten Tiere eliminierten die Mikrofilarien bis zum Tag 6, jedoch war bereits an Tag 5 der Unterschied von resistenten und suszeptiblen Tieren signifikant (Abb. 3.21). N5 (B10.D2 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 * n=5 10 n=4 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.21: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N5 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 50 __________________________________________________________________Ergebnisse In der N6 konnten bei 6 Tieren die Mikrofilarien im Blut 6 Tage lang nachgewiesen werden und bei 5 Tieren bis zum Tag 21. Dies entspricht einer näherungsweisen Aufspaltung von 1:1. Der Unterschied beider Gruppen war bereits an Tag 4 signifikant (Abb. 3.22). N6 (B10.D2 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 * n=6 10 n=5 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.22: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N6 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. Die resistenten Nachkommen wurden wiederum mit BALB/c verpaart, um eine N7 zu generieren. Bei 4 Tieren konnten nur bis zum Tag 4 Mikrofilarien nachgewiesen werden, somit wurden sie als resistent eingestuft. Die anderen 4 Versuchstiere waren bis zum Tag 25 mikrofilarienpositiv (Abb. 3.23). 51 Ergebnisse__________________________________________________________________ N7 (B10.D2 x BALB/c) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n=4 10 n=4 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.23: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N7 (B10.D2 x BALB/c) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. 3.5.2 Genotypisierung 6 Tiere der N4 der Kreuzung B10.D2 x BALB/c wurden genotypisiert und anschließend parasitologisch als resistent oder suszeptibel eingestuft. Die Gelelektrophorese der PCR zeigt, dass die resistenten Tiere 1 und 4 heterozygote Banden für sowohl BALB/c als auch B10.D2 tragen (Abb. 3.24). Die Tiere 2, 3, 5 und 6 tragen homozygote BALB/c-Banden und erwiesen sich auch im parasitologischen Experiment als suszeptibel (ohne Abbildung). Als Kontrollen wurden BALB/c, B10.D2 und DBA/1 verwendet. Es wurden in jeder Generation Tiere genotypisiert (ohne Abbildung). 1 DBA/1 B10.D2 BALB/c Abb. 3.24: 2 3 4 5 6 N4 (B10.D2 x BALB/c) Genotypisierung der N4 der Kreuzung B10.D2 x BALB/c. Als Kontrollen wurden BALB/c, B10.D2 und DBA/1 verwendet, außerdem sind zwei resistente (1 und 4) und vier empfängliche Tiere (2, 3, 5 und 6) der N4 dargestellt. 52 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.6 Kreuzung von C57BL/6 (H2b) mit BALB/b (H2b) 3.6.1 Parasitologie Der resistente Stamm C57BL/6 (H2b) wurde mit dem suszeptiblen Stamm BALB/b (H2b) gekreuzt. Den Tieren der daraus hervorgehenden F1 wurden jeweils 50000 Mikrofilarien injiziert und die Dauer ihrer Mikrofilarämie bestimmt. Die F1 war uniform resistent und bis zum Tag 4 mikrofilarienpositiv (Abb. 3.25). F1 (C57BL/6 x BALB/b) 1000 Mf / 30µl Blut 100 n = 23 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.25: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der F1 (C57BL/6 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die F1 wurde mit den suszeptiblen BALB/b (H2b) rückgekreuzt. Der daraus hervorgehenden N2 sowie allen folgenden Generationen wurden 50000 Mikrofilarien intravenös injiziert. Anschließend wurde die Dauer der Mikrofilarämie bestimmt. Wie zu erwarten, spaltete die N2 in Resistente und Suszeptible näherungsweise im Verhältnis 1:1 auf. Der Unterschied von resistenten und suszeptiblen Tieren war bereits an Tag 4 signifikant (Abb. 3.26). 53 Ergebnisse__________________________________________________________________ N2 (C57BL/6 x BALB/b) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n = 30 10 n = 32 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.26: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N2 (C57BL/6 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. Im Folgenden wurde die Strategie der seriellen Rückkreuzung weiter verfolgt. Die resistenten Nachkommen wurden mit den suszeptiblen BALB/b verpaart. Die Dauer der Mikrofilarämie wurde für alle Nachkommen bestimmt. In der N3 spalteten die Nachkommen näherungsweise im Verhältnis 1:1 in resistente und suszeptible Tiere auf. Bereits an Tag 3 war der Unterschied von suszeptiblen und resistenten Tiere signifikant (Abb. 3.27). N3 (C57BL/6 x BALB/b) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n=6 10 n=7 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.27: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N3 (C57BL/6 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 54 __________________________________________________________________Ergebnisse Die Nachkommen der N4, N5 und N6 spalteten erwartungsgemäß in 50% resistente Tiere und 50% suszeptible Tiere auf. Die resistenten Tiere waren in der Lage, die injizierten Mikrofilarien innerhalb der ersten 6 Tage zu eliminieren, wohingegen die suszeptiblen bis zum Tag 15 mikrofilarienpositiv waren. Der Unterschied von resistenten und suszeptiblen Tieren der N4 war bereits an Tag 5 signifikant. Bei der N5 war dieser Unterschied schon an Tag 2 und bei der N6 an Tag 4 signifikant (Abb. 3.28, 3.29 und 3.30). N4 (C57BL/6 x BALB/b) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n=4 10 n=3 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.28: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N4 (C57BL/6 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. N5 (C57BL/6 x BALB/b) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n=5 10 n=6 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.29: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N5 (C57BL/6 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 55 Ergebnisse__________________________________________________________________ N6 (C57BL/6 x BALB/b) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n=7 10 n=6 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.30: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N6 (C57BL/6 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 3.6.2 Genotypisierung Je 3 resistente und 3 suszeptible N4-Tiere aus der Kreuzung C57BL/6 x BALB/b wurden genotypisiert. Als Kontrollen wurden BALB/b und C57BL/6 verwendet (Abb. 3.31). Die parasitologische Einordnung war bereits prospektiv vorgenommen worden (ohne Abbildung). Die Genotypisierung entsprach deren Ergebnissen. In jeder Generation wurden Tiere genotypisiert (ohne Abbildung). 1 C57BL/6 BALB/b Abb. 3.31: 2 3 4 5 6 N4 (C57BL/6 x BALB/b) Genotypisierung von 3 resistenten (1-3) und 3 suszeptiblen (4-6) Tieren der N4 der Kreuzung C57BL/6 x BALB/b. Als Kontrollen wurden BALB/b und C57BL/6 aufgetragen. 56 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.7 Kreuzung von B10.D2 (H2d) mit BALB/b (H2b) 3.7.1 Parasitologie Der resistente Stamm B10.D2 (H2d) wurde mit dem suszeptiblen Stamm BALB/b (H2b) gekreuzt. Den daraus hervorgehenden F1-Tieren wurden 50000 Mikrofilarien injiziert und die Dauer ihrer Mikrofilarämie bestimmt. Die F1 war uniform resistent und bis zum Tag 5 mikrofilarienpositiv (Abb. 3.32). F1 (B10.D2 x BALB/b) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 10 n = 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.32: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der F1 (B10.D2 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die N2 spaltete in Resistente und Suszeptible näherungsweise im Verhältnis 1:1 auf. Bereits an Tag 5 war ein signifikanter Unterschied der Mikrofilarämie Resistenter gegenüber Suszeptibler festzustellen (Abb. 3.33). 57 Ergebnisse__________________________________________________________________ N2 (B10.D2 x BALB/b) 100 Mf / 30 µl Blut * 10 n=6 n=5 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.33: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N2 (B10.D2 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. Auch hier wurde seriell rückgekreuzt. Es wurden aus jeder Generation die resistenten Nachkommen mit BALB/b-Tieren verpaart. In der N3 traten näherungsweise 50% resistente und 50% suszeptible Tiere auf. Der Unterschied von suszeptiblen und resistenten Tieren war an Tag 6 signifikant (Abb. 3.34). N3 (B10.D2 x BALB/b) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 * n=9 10 n = 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.34: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N3 (B10.D2 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 58 __________________________________________________________________Ergebnisse Bei den Nachkommen der N4 konnten die Mikrofilarien bei 3 Tieren 6 Tage lang nachgewiesen werden und bei 5 Tieren bis zum Tag 15. Dies entspricht einer näherungsweisen Aufspaltung von 1:1 (Abb. 3.35). N4 (B10.D2 x BALB/b) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n=4 10 n=3 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.35: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N4 (B10.D2 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. Die Nachkommen der N6 und N6 spalteten erwartungsgemäß näherungsweise in 50% resistente und 50% suszeptible Tiere auf. In Resistenten waren die Mikrofilarien bis maximal zum Tag 5 nachweisbar und in Suszeptiblen nie länger als bis zum Tag 15. Der Unterschied von Resistenten gegenüber Suszeptiblen war in der N6 bereits an Tag 4 signifikant (Abb. 3.36 und 3.37). 59 Ergebnisse__________________________________________________________________ N5 (B10.D2 x BALB/b) 1000 Mf / 30 µl Blut 100 n=4 10 n=5 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.36: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N5 (B10.D2 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. N6 (B10.D2 x BALB/b) 1000 * Mf / 30 µl Blut 100 n=6 10 n=5 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.37: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N6 (B10.D2 x BALB/b) nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. *: p < 0,05. 3.7.2 Genotypisierung 3 resistente und 3 suszeptible Tiere der N6 der Kreuzung B10.D2 x BALB/b wurden genotypisiert Die Gelelektrophorese der PCR zeigte, dass die resistenten Tiere 4 bis 6 heterozygote Banden für sowohl BALB/b als auch für B10.D2 tragen. Die suszeptiblen Tiere 1 bis 3 sind homozygot für BALB/b. Als Kontrollen wurden BALB/b, B10.D2 und DBA/1 60 __________________________________________________________________Ergebnisse aufgetragen (Abb. 3.38). Die Genotypisierung wurde in jeder Generation durchgeführt (ohne Abbildung). 1 B10.D2 DBA/1 BALB/b Abb. 3.38: 2 3 4 5 6 N4 (B10.D2 x BALB/b) Genotypisierung von 3 resistenten (4-6) und 3 suszeptiblen (1-3) Tieren der N4 der Kreuzung B10.D2 x BALB/b. Als Kontrollen wurden BALB/b, B10.D2 und DBA/1 verwendet. 61 Ergebnisse__________________________________________________________________ 3.8 Kreuzungen von Stat4-k.o. mit homozygot resistenten N14 (DBA/1 x BALB/c) 3.8.1 Parasitologie Ziel war es festzustellen, ob der Knockout von Stat4 einen Einfluss auf die genetisch bedingte Resistenz hat. Stat4-k.o.- und homozygot resistente Tiere der N14 aus der Kreuzung (DBA/1 x BALB/c) wurden miteinander verpaart. Die daraus resultierende F1 wurde mit Stat4-k.o. rückgekreuzt, um eine N2 zu generieren, bei der theoretisch 25% der Tiere sowohl homozygot einen Knockout von Stat4 als auch heterozygot ein Resistenzallel tragen. Die Parentalstämme, die F1 und die N2 bekamen eine Mikrofilarieninjektion und es wurde die Dauer ihrer Mikrofilarämie bestimmt. Stat4-k.o.-Mäuse eliminieren intravenös injizierte Mikrofilarien binnen 26 Tagen und sind damit suszeptibel. Die homozygot resistenten Tiere der N14 (DBA/1 x BALB/c) waren innerhalb von 3 Tagen mikrofilarienfrei (Abb. 3.39). Stat4-k.o. und N14 (DBA/1 x BALB/c, RR) Mf / 30 µl Blut 1000 100 n=4 10 n = 14 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.39: Mikrofilarämie (a. M. und SD) von Stat4-k.o.-Tieren und homozygot resistenten Tieren der N14 nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. 62 __________________________________________________________________Ergebnisse Wie zu erwarten, war die F1 binnen 4 Tagen mikrofilarienfrei (Abb. 3.40). F1 (Stat4-k.o. x N14) 1000 Mf / 30µl Blut 100 n = 20 10 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.40: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der F1 aus der Kreuzung Stat4-k.o. nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. In der N2-Generation spalteten die Nachkommen in suszeptible und resistente Tiere im Verhältnis 1:1 auf. Bei der einen Hälfte der Tiere waren die Mikrofilarien bis zum Tag 33 nachweisbar und bei der anderen Hälfte bis zum Tag 3 (Abb. 3.41). N2 [(N14 x Stat4-k.o.) x Stat4-k.o.] Mf / 30 µl Blut 1000 100 n = 19 10 n = 19 1 0 0 10 20 30 40 Tage post infectionem Abb. 3.41: Mikrofilarämie (a. M. und SD) der N2 [(N14 x Stat4-k.o.) x Stat4-k.o.] nach Injektion von 50000 Mikrofilarien. 63 Ergebnisse__________________________________________________________________ 3.8.2 Genotypisierung Die Tiere der N2 wurden genotypisiert, um zu klären, ob die Resistenz tatsächlich unabhängig vom Stat4-Knockout weitervererbt wird. Rein rechnerisch sollte ein Viertel aller Nachkommen sowohl einen Stat4-Knockout tragen als auch heterozygot resistent sein. Es wurde zunächst eine PCR mit Stat4-k.o.-Primern und anschließend eine PCR mit dem Primer D12Nds2 an 14 Tieren durchgeführt. Die Tiere 1 bis 5 tragen einen homozygoten Knockout für Stat4, die Tiere 6-14 tragen keinen solchen Knockout. Die Tiere 1, 4 und 14 zeigten heterozygote Banden in der PCR mit D12Nds2, waren somit als genotypisch resistent einzustufen, wohingegen die Tiere 2, 3 und 5 bis 13 homozygote Banden trugen und damit genotypisch suszeptibel waren. Diese Ergebnisse stimmten mit den in parasitologischen Versuchen zu beobachteten Phänotypen überein. Alle heterozygote Banden tragenden Tiere waren resistent, alle homozygote Banden tragenden waren empfänglich (Abb. 3.42). 1 2 Abb. 3.42: 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Gelelektrophorese der PCR von 14 Tieren der N2 aus der Kreuzung Stat4-k.o. x N14 (DBA/1 x BALB/c, RR). Der obere Abschnitt zeigt das Ergebnis für die Stat4-Primer, der untere für die D12Nds2- Primer. Die Genotypisierung zeigte, dass 8 von den 38 Nachkommen der N2 homozygot einen Stat4Knockout trugen und genotypisch heterozygot resistent waren, dies entspricht ca. 21%. Die parasitologischen Versuche mit diesen Tieren zeigten, dass der Knockout von Stat4 keinen Einfluss hatte, sie waren alle auch phänotypisch als resistent einzustufen. Die Genotypisierung zeigte außerdem, dass auch bei suszeptiblen Tieren ein Knockout von Stat4 zu keiner veränderten Antwort auf injizierte Mikrofilarien führt. 64 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.9 Experimente zur wiederholten Mikrofilariengabe 3.9.1 Parasitologie 3.9.1.1 Mehrfache Injektionen von Mikrofilarien in verschiedene immunkompetente Labormausstämme 4 resistenten und 4 suszeptiblen Mäusen aus der N5 der Kreuzung C57BL/6 x BALB/c und BALB/b-Mäusen wurden 14 Tage nach einer ersten Mikrofilarieninjektion weitere 50000 Mikrofilarien intravenös injiziert. Alle getesteten Tiere waren bis zum Tag 5 mikrofilarienpositiv (Abb. 3.43). 2. Injektion von Mikrofilarien 1000 Mf / 30 µl Blut 100 BALB/b n = 9 10 Suszeptible (n = 4) Resistente (n = 4) 1 0 0 5 10 15 20 25 30 Tage post infectionem Abb. 3.43: Mikrofilarämie (a. M. und SD) nach einer 2. Injektion von 50000 Mikrofilarien in BALB/b-Mäuse und in suszeptible bzw. resistente N5-Tiere aus der Kreuzung von C57BL/6 mit BALB/c. 3.9.1.2 Mehrfache Injektionen von Mikrofilarien in Igα-k.o. Zur Klärung der möglichen Rolle von Immunglobulinen beim Abbau von Mikrofilarien wurden Igα-k.o.-Mäusen Mikrofilarien intravenös injiziert und die Dauer ihrer Mikrofilarämie bestimmt. Die Tiere waren erst am Tag 60 mikrofilarienfrei. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Tiere einer weiteren Injektion unterzogen, um zu klären, ob die erste 65 Ergebnisse__________________________________________________________________ einen Einfluss auf die Dauer der Mikrofilarämie der zweiten Injektion hatte. Die Igα-k.o.Mäuse eliminierten diese Mikrofilarien innerhalb von 72 Tagen vollständig (Abb. 3.44). Igα -k.o. 1000 1. Injektion (n = 9) Mf / 30 µl Blut 100 2. Injektion (n = 5) 10 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Tage post infectionem Abb. 3.44: Mikrofilarämie (a. M. und SD) von Igα-k.o. nach zwei aufeinander folgenden Injektion von jeweils 50000 Mikrofilarien. 3.9.2 Immunologie 3.9.2.1 Humorale Immunantwort Die Antikörpertiter von BALB/c, die injizierte Mikrofilarien bereits abgebaut hatten und von Igα-k.o.-Mäusen wurden mittels ELISA gemessen, um zu klären, ob eine Antikörper Rolle beim Abbau von Mikrofilarien spielen. Es wurde IgM und IgG1 gemessen und bei beiden Immunglobulinen waren keine Antikörper für die Igα-k.o.-Mäuse nachzuweisen, sie lagen nur knapp über dem Nullwert. Die BALB/c-Tiere zeigten signifikant höhere Antikörpertiter beider Immunglobuline (Abb. 3.45). 66 __________________________________________________________________Ergebnisse OD Parasitenspezifische Immunglobuline 0.600 0.550 0.500 0.450 0.400 0.350 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 * Iga-k.o. * BALB/c IgG1 Ig alpha IgG1 IgM Abb. 3.45: BALB/c 1 IgG1 Antikörpernachweis im Plasma von infizierten BALB/c und Igα-k.o. Gemessen wurden IgM und IgG1. *: p < 0,03. 67 Ergebnisse__________________________________________________________________ 3.10 Genexpressionsanalysen 3.10.1 Genexpressionsanalysen von Mauslungen nach Infektionen mit verschiedenen Stadien von L. sigmodontis Genexpressionanalysen wurden durchgeführt, um die Vorgänge einer Infektion mit verschiedenen Stadien von L. sigmodontis näher zu charakterisieren. BALB/c-Mäuse eliminieren Mikrofilarien innerhalb von 30 Tagen. Implantiert man resistenten Mäusen adulte Weibchen und injiziert nach einer Woche zusätzlich Mikrofilarien, persistieren diese genau so lange wie in BALB/c, d. h. die Resistenz wird umgekehrt (Hoffmann et al. 2001). Bei suszeptiblen Mäusen kann durch Implantation adulter Weibchen keine Veränderung in der Geschwindigkeit der Mikrofilarämie beobachtet werden. Es galt zu klären, ob diese parasitologischen Beobachtungen auch auf Expressionsebene zu finden sind. 3.10.1.1 Genexpressionsanalysen von Mauslungen nach Infektionen mit Mikrofilarien Genexpressionsanalysen wurden an naiven BALB/c-, an mit Mikrofilarien infizierten und an mit Medium injizierten (scheininfiziert) Mäusen durchgeführt. Die unterschiedlichen Expressionsmuster wurden dann miteinander verglichen. Zudem wurden Netzwerke von Genen erstellt, die in einem funktionellen Zusammenhang stehen. 3.10.1.1.1 Genexpression bei naiven BALB/c Es wurde naive mit scheininfizierten BALB/c verglichen. Insgesamt waren in den Genexpressionsanalysen 312 Gene differentiell reguliert. Davon waren 210 Gene herauf- und 111 herunterreguliert. Unter den heraufregulierten waren vor allem Gene, die in der Proteinbiosynthese aktiv sind, viele Transkriptionsfaktoren, Ionentransporter, Gene, die mit dem Metabolismus der Zelle und mit dem Zellzyklus assoziiert sind und außerdem ApoptoseGene. Unter den herunterregulierten Genen waren vor allem Gene, die mit der Immunantwort und der Signaltransduktion assoziiert sind, außerdem Anti-Apoptose-induzierende Gene. Bei 68 __________________________________________________________________Ergebnisse der Analyse funktionell zusammenhängender Gruppen von Genen, stach ein aufgeführtes funktionelles Netzwerk besonders hervor, da alle der insgesamt 35, in diesem Netzwerk vorkommenden Gene, differentiell reguliert waren. Außerdem war dieses Netzwerk aufgrund der darin enthaltenen Gene, wie z.B. TP53 (Synonym: P53), Hspa8 (Heat-Shock-Protein), Hspa1 oder der Cyclin-abhängigen Kinase Cdkn1a interessant, da sie alle eine Rolle bei der Apoptose und dem Zellzyklus spielen (Abb. 3.46). Abb. 3.46: Funktionelles Gennetzwerk differentiell exprimierter Gene im Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten. Rot: heraufregulierte Gene, grün: herunterregulierte Gene. Obere Zahl: SLR, untere Zahl: Irrtumswahrscheinlichkeit. Die 312 Gene, die im Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten als differentiell reguliert auftraten, wurden zu Gruppen funktionell assoziierter Gene zusammengefasst (Abb. 47). 69 Ergebnisse__________________________________________________________________ Blutdruck Epidermis Angiogenese Chemotaxis Splicing Apoptose 34 33 DNA Zelladhäsion 30 Immunantwort Metabolismus 66 16 12 11 11 9 7 7 5 4 211 Ionentransport Signaltransduktion Zellzyklus Transkription Sonstiges Protein Abb. 3.47: Funktionelle Gruppen differentiell exprimierter Gene im Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten. 3.10.1.1.2 Genexpression von infizierten BALB/c Es wurde infizierte mit scheininfizierten BALB/c verglichen. Insgesamt waren 258 Gene in diesem Vergleich differentiell reguliert. Davon waren 225 Gene herauf- und 33 Gene herunterreguliert. Unter den heraufregulierten waren vor allem Gene, die mit dem Zellzyklus, der Signaltransduktion, Gene, die beim Transport und der enzymatischen Aktivität von Proteinen aktiv sind, Transkriptionsfaktoren und Ionentransporter. Außerdem waren Gene, die die Immunantwort und die Apoptose induzieren heraufreguliert. Unter den herunterregulierten waren vor allem Anti-Apoptose-Gene. Bei der Analyse funktionell zusammenhängender Gruppen von Genen, stach ein funktionelles Netzwerk besonders hervor, da alle darin vorkommenden Gene differentiell reguliert waren. Auch hier kamen P53, einige Heat-ShockProteine und Cdkn1 vor. Außerdem beinhaltete das Netzwerk noch Pten (phosphatase and tensin homolog), der Transkriptionsfaktor Junb und ein Rezeptor für die Phosphatidylinositol3-Kinase Pik3r1. Alle diese Gene sind mit Apoptose, Zellzyklus und Proliferation assoziiert. (Abb. 3.48). 70 __________________________________________________________________Ergebnisse Abb. 3.48: Funktionelles Gennetzwerk differentiell exprimierter Gene im Vergleich von infizierten BALB/c versus scheininfizierten. Rot: heraufregulierte Gene, grün: herunterregulierte Gene. Obere Zahl: SLR, untere Zahl: Irrtumswahrscheinlichkeit. Die 258 Gene, die im Vergleich von infizierten BALB/c versus scheininfizierten als differentiell reguliert auftraten wurden zu Gruppen funktionell assoziierter Gene zusammengefasst (Abb. 3.49). 71 Ergebnisse__________________________________________________________________ Blutdruck Epidermis Angiogenese Chemotaxis 17 Splicing 26 Apoptose 31 DNA Zelladhäsion Immunantwort Metabolismus 40 18 Ionentransport Signaltransduktion 12 9 8 8 2 9 1 4 211 Zellzyklus Transkription Sonstiges Protein Abb. 3.49: Funktionelle Gruppen differentiell exprimierter Gene im Vergleich von infizierten BALB/c versus scheininfizierten. Zusammenfassend ergibt sich für den Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten und für den Vergleich von infizierten BALB/c versus scheininfizierten folgendes Bild. Insgesamt waren in diesen Genexpressionsanalysen 439 Gene differentiell reguliert. Davon traten 140 Gene in beiden Vergleichen als gemeinsam herauf- oder herunterreguliert auf. Bei 9 Genen trat eine gegenteilige Regulierung auf. Davon sind 7 der insgesamt 9 Gene durch eine Infektion heraufreguliert, wobei nur zwei Gene bei naiven heraufreguliert sind, die bei infizierten BALB/c herunterreguliert sind (Tab. 3.1). heat shock protein 1B heat shock protein 105 BTB (POZ) domain containing 3 colony stimulating factor 3 receptor (granulocyte) UDP-glucose ceramide glucosyltransferase cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (P27) protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22 growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma protein kinase, lysine deficient 1 Tab. 3.1: Hspa1b Hsp105 Btbd3 Csf3r Ugcg Cdkn1b Ptpn22 Gadd45g Prkwnk1 SLR (Naiv vs. Schein) 4.60 1.25 -1.21 -1.24 -1.30 -1.44 -1.57 -1.69 -2.12 SLR (Inf. vs. Schein) -1.15 -1.12 1.66 1.14 1.05 2.06 1.18 1.31 1.53 Übersicht der gegenteilig regulierten Gene in den Vergleichen von naiven und infizierten BALB/c. SLR = Signal Log Ratio. 72 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.10.1.2 Genexpressionsanalysen von Mauslungen nach Weibchenimplantation Genexpressionsanalysen wurden an BALB/c-Mäusen durchgeführt, die eine Weibchenimplantation und eine Mikrofilarieninjektion oder eine Scheinbehandlung und eine Mikrofilarieninjektion oder nur eine Mikrofilarieninjektion erhalten hatten. Die unterschiedlichen Expressionsmuster wurden dann miteinander verglichen. Zudem wurden Netzwerke von Genen erstellt, die in einem funktionellen Zusammenhang stehen. 3.10.1.2.1 BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarien- injektion Insgesamt waren 233 Gene im Vergleich von BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion differentiell reguliert. Davon waren 57 Gene herauf- und 176 Gene herunterreguliert. Die differentiell exprimierten Gene kamen aus den funktionellen Bereichen Antiproliferation, Apoptose, Chemotaxis, Immunantwort, Inflammation, Proteintransport und- Lyse, Signaltransduktion, Transkription, Zelladhäsion, -proliferation und –zyklus. Bei der Analyse funktionell zusammenhängender Gruppen von Genen, trat ein Gennetzwerk sowohl im Vergleich von BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion als auch im Vergleich von BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion auf. Hierbei handelt es sich um das T-Zell-AntigenRezeptor-Netzwerk. Die darin enthaltenen Gene werden folglich unabhängig vom Implantat (Medium oder Weibchen von L. sigmodontis) konstitutiv differentiell exprimiert. Heraufreguliert ist CD3, der T-Zell-Rezeptor Alpha (TCRα) und die IL2-induzierte T-ZellKinase Itk. Herunterreguliert ist IκNα (Synonym: Nfκbia), welches Nfκb inhibiert (Abb. 3.50). 73 Ergebnisse__________________________________________________________________ Abb. 3.50: T-Zell-Antigen-Rezeptor-Signalweg. Funktioneller Signalweg differentiell exprimierter Gene im Vergleich BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion. Rot: heraufregulierte Gene, grün: herunterregulierte Gene. 74 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.10.1.2.2 BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion Insgesamt waren 244 Gene im Vergleich von BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion differentiell reguliert. Davon waren 84 Gene herauf- und 160 Gene herunterreguliert. Sie kamen aus den funktionellen Bereichen Antiproliferation, Apoptose, Chemotaxis, Immunantwort, Inflammation, Proteintransport und- Lyse, Signaltransduktion, Transkription, Zelladhäsion, proliferation und –zyklus und glichen somit den funktionellen Gruppen, aus den Versuchen mit BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion. Abbildung 3.51 zeigt das gleiche Gennetzwerk wie Abbildung 3.50, jedoch sind hier die Gene hervor gehoben, die im Vergleich BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion differentiell exprimiert waren. Hier sind dieselben Gene differentiell exprimiert, zudem noch Lck und CD8 heraufreguliert. 75 Ergebnisse__________________________________________________________________ Abb. 3.51: T-Zell-Antigen-Rezeptor-Signalweg. Funktioneller Signalweg differentiell exprimierter Gene im Vergleich BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Mikrofilarieninjektion. Rot: heraufregulierte Gene, grün: herunterregulierte Gene. 76 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.10.1.2.3 BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarien- injektion Der Vergleich BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion wurde durchgeführt, um Gene zu detektieren, die mit der Implantation von adulten L. sigmodontis-Weibchen assoziiert sind. Insgesamt waren nur 6 Gene in diesem Vergleich differentiell reguliert. Davon waren das mit Apoptose assoziierte Angptl4 (Angiopoietin-like 4) und der Transkriptionsfaktor Arntl (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like) heraufreguliert. Die herunterregulierten Gene waren das mit Apoptose assoziierte Hells (helicase, lymphoid specific), die Transkriptionsfaktoren Per2 (period homolog 2 (Drosophila)) und Per3 (period homolog 3 (Drosophila)) und das bei der DNA-Replikation involvierte Rrm2 (ribonucleotide reductase M2) (Abb. 3.52). 77 Ergebnisse__________________________________________________________________ Abb. 3.52: Funktionelles Gennetzwerk differentiell exprimierter Gene im Vergleich BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c nach Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion. Rot: heraufregulierte Gene, grün: herunterregulierte Gene. Obere Zahl: SLR, untere Zahl: Irrtumswahrscheinlichkeit. 78 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.10.1.2.4 Schnittmengen der differentiell regulierten Gene aller Vergleiche Es wurde ein Schnittmengendiagramm der differentiell regulierten Gene nach den verschiedenen Behandlungen erstellt. Hieraus lässt sich ablesen, wie viele Gene durch welchen Stimulus gemeinsam exprimiert wurden. Im Vergleich von BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c nur mit Mikrofilarieninjektion waren 125 Gene exprimiert, die auch im Vergleich von BALB/c mit Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c nur mit Mikrofilarieninjektion als differentiell exprimiert auftraten. Diese Gene stehen folglich mit einer Implantation an sich in Verbindung und sind nicht spezifisch für eine Implantation von adulten Weibchen. Vergleicht man die differentiell exprimierten Gene von BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion mit BALB/c mit Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion erhält man nur 6 gemeinsame Gene (Abb. 3.53). BALB/c (♀-Implantation und Mikrofilarieninjektion) versus BALB/c (Mikrofilarieninjektion). BALB/c (Scheinimplantation und Mikrofilarieninjektion) versus BALB/c (Mikrofilarieninjektion). BALB/c (♀-Implantation und Mikrofilarieninjektion) versus BALB/c (Scheinimplantation und Mikrofilarieninjektion). Abb. 3.53: Schnittmengen aller Vergleiche von BALB/c mit Mikrofilarieninjektion und BALB/c mit Scheinbehandlung. 79 Weibchenimplantation und Ergebnisse__________________________________________________________________ 3.10.2 Genexpressionsanalysen humaner Makrophagen nach Stimulation mit unterschiedlichen Pathogenen 3.10.2.1 Änderung der Genexpression nach drei Zeitpunkten Es wurden Genexpressionsanalysen an humanen Makrophagen durchgeführt. Hierzu wurden die Makrophagen für 2, 8 und 18 Stunden mit jeweils einem der fünf Pathogene HCMV, A. fumigatus, CVB, L. sigmodontis und S. aureus inkubiert. Die Tabelle 3.2 gibt einen Überblick über die Anzahl der differentiell regulierten Gene und die Art ihrer Regulierung zu jedem Zeitpunkt. Zeit 2h 8h 18 h HCMV gesamt 80 1061 1515 Tab. 3.2: I D 61 19 358 703 1001 514 A. fumigatus gesamt 188 382 536 I D 36 152 238 144 342 212 CVB gesamt 81 278 145 I D 39 42 741 204 37 108 L. sigmodontis gesamt I 63 14 111 86 165 102 D 49 25 63 S. aureus gesamt n.d. 971 1128 I D 480 491 714 414 Überblick über die differentiell regulierten Gene zu drei Zeitpunkten. I = Increase und D = Decrease zeigen die Verteilung in herauf- und herunterregulierte Gene. Die Anzahl der jeweils differentiell regulierten Gene zu den drei Zeitpunkten wurde miteinander verglichen. Nach einer Inkubation mit L. sigmodontis, A. fumigatus, S. aureus und HCMV nahm die Anzahl der Gene im Verlauf zu, wobei bei S. aureus der 2 h-Array aus technischen Gründen nicht ausgewertet werden konnte. Bei CVB waren nach 8 Stunden die höchste Anzahl differentiell regulierter Gene zu finden. Der stärkste Anstieg von exprimierten Genen zeigte sich bei HCMV und der geringste bei L. Sigmodontis (Abb. 3.54). 80 __________________________________________________________________Ergebnisse differentiell regulierte Gene Genexpression 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 HCMV A. fumigatus CVB L. sigmodontis S. aureus 2h 8h 18 h Zeitpunkte Abb. 3.54: Anzahl der differentiell regulierten Gene zu allen drei Zeitpunkten. Betrachtete man nur die differentiell heraufregulierten Gene, so nahm auch hier die Anzahl exprimierter Gene über die Zeit zu, wobei HCMV den stärksten Anstieg an exprimierten Genen zeigte und L. sigmodontis den schwächsten. Auch hier war bei CVB nach 8 Stunden die höchste Anzahl an differentiell exprimierten Genen zu finden (Abb. 3.55). differentiell regulierte Gene Increase 1200 1000 HCMV 800 A. fumigatus 600 CVB 400 L. sigmodontis S. aureus 200 0 2h 8h 18 h Zeitpunkte Abb. 3.55: Anzahl der heraufregulierten Gene zu allen drei Zeitpunkten. Untersuchte man nur die differentiell herunterregulierten Gene, so zeigte sich bei CVB und HCMV, dass die Anzahl der differentiell exprimierten Gene von 2 auf 8 Stunden zu und nach 18 wieder abnahm. Sie lag jedoch nach 18 Stunden höher als nach 2. Bei einer Inkubation mit 81 Ergebnisse__________________________________________________________________ L. sigmodontis und A. fumigatus waren nach 8 Stunden die wenigsten Gene exprimiert und nach 18 Stunden die meisten. Bei einer Inkubation mit S. aureus waren nach 8 Stunden mehr Gene herunterreguliert als nach 18 Stunden (Abb. 3.56). differentiell regulierte Gene Decrease 1200 1000 HCMV 800 A. fumigatus 600 CVB 400 L. sigmodontis S. aureus 200 0 2h 8h 18 h Zeitpunkte Abb. 3.56: 3.10.2.3 Anzahl der herunterregulierten Gene zu allen drei Zeitpunkten. Differentielle Genexpression nach 2 Stunden Insgesamt waren nach 2 Stunden 362 Gene differentiell reguliert. 39 Gene davon waren bei mindestens zwei Stimulationsansätzen gleichzeitig differentiell exprimiert. Diese Gene wurden ihrer Funktion nach zu Gruppen zugeordnet (Abb. 3.57). Die Noch nicht annotierten Gene, wie z. B. RIKEN-DNAs oder EST (Expressed Sequence Tags), werden im Folgenden mit „ohne Funktion“ bezeichnet. Unter die Bezeichnung „Sonstige“ fallen Gene, die nicht in einen für diese Arbeit relevanten Kontext gebracht werden konnten. 82 __________________________________________________________________Ergebnisse ohne Funktion Zellzyklus, -wachstum Inflammation und Immunantwort 89 97 Protein-Metabolismus Transkription Apoptose Ionentransport Zelladhäsion 8 12 30 Metabolismus 12 16 16 20 23 4 35 Signalkaskade DNA-Replikation Sonstige Abb. 3.57: Funktionelle Gruppen differentiell exprimierter Gene nach 2h. Im unten dargestellten Heatmap ist eine Auswahl der nach 2 Stunden differentiell exprimierten Gene abgebildet (Abb. 3.58). Hierfür wurden normalisierte Signals verwendet. Ein Kriterium für eine Auswahl war, dass das Gen in mindestens zwei Stimulationsansätzen als differentiell exprimiert auftrat. Als Kontrollen wurden nicht behandelte, ansonsten unter gleichen Bedingungen kultivierte Makrophagen verwendet. Bei einer Inkubation mit A. fumigatus und CVB wurden Gene, die bei den Kontrollen noch schwach exprimiert waren, stärker exprimiert, wohingegen die meisten dieser Gene bei einer Inkubation mit L. sigmodontis eine schwache Expression beibehielten. Ein solches Expressionsmuster zeigte sich z. B. bei IL-8, bei den Chemokinliganden CCL3, CCL4, CXCL2, CXCL3, CXCL5 und CXCL6, bei TGFB1 (Transforming growth factor, beta-induced), bei BCL3 (B-cell CLL / Lymphoma 3) und bei CDH6 (Cadherin 6). HCMV bewirkte bei den Genen, die bei den Kontrollen schwach exprimiert waren, kein klares Expressionsmuster. Gene, die bei den Kontrollmakrophagen stark exprimiert waren, unterlagen bei einer Inkubation mit A. fumigatus, L. sigmodontis und CVB einer schwächeren Expression, wohingegen diese Gene durch HCMV stärker exprimiert wurden. Beispiele hierfür sind das mit Apoptose assoziierte BAX (BCL2-associated X-Protein), ARPC4 (Actin related protein 2/3 complex, Subunit 4) und das Endocytose auslösende AP1S1 (Adaptor-related-protein). 83 Ergebnisse__________________________________________________________________ Abb. 3.58: Heatmap einer Auswahl differentiell exprimierter Gene nach 2h. Es wurde ein Schnittmengendiagramm der differentiell regulierten Gene nach 2 h erstellt, aus dem sich ablesen lässt, wie viele Gene durch welchen Stimulationsansatz exprimiert werden. IL-8 war das einzige Gen, dessen Expression durch alle Pathogene induziert wurde. Die pathogen-spezifischen Gene sind in den äußersten Ellipsen dargestellt (Abb. 3.59). 84 __________________________________________________________________Ergebnisse CVB CVB HCMV A. fumigatus L. sigmodontis Abb. 3.59: 3.10.2.4 Schnittmengen der differentiell regulierten Gene zum Zeitpunkt 2h. Differentielle Genexpression nach 8 Stunden 2244 Gene waren nach 8 Stunden differentiell reguliert. 451 Gene davon waren bei mindestens zwei Stimulationsansätzen gleichzeitig differentiell exprimiert. Die nach 8 Stunden differentiell regulierten Gene konnten 11 funktionellen Gruppen zugeordnet werden (Abb. 3.60). 85 Ergebnisse__________________________________________________________________ ohne bekannte Funktion Zellzyklus, -wachstum Inflammation und Immunantwort 820 Protein 175 Transkription Apoptose Ionentransport Zelladhäsion 150 434 33 71 Abb. 3.60: 144 79 52 15 92 179 Metabolismus Signalkaskade DNA-Replikation Sonstige Funktionelle Gruppen differentiell exprimierter Gene nach 8h. Einzelne wichtige Gene sind als Heatmaps dargestellt (Abb. 3.61). Bei einer Inkubation mit A. fumigatus und S. aureus wurden Gene, die bei den Kontrollen noch schwach exprimiert waren, stärker exprimiert, wohingegen die meisten dieser Gene bei einer Inkubation mit L. sigmodontis und CVB eine schwache Expression beibehielten. Ein solches Expressionsmuster zeigte sich z. B. bei IL-8, bei den Chemokinliganden CCL3, CCL4, bei den Tumor-NekroseFaktoren TNFSF15 und TNF, bei NFkBIA (Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha) und auch bei PTX3 (Pentaxin-related gene), welches von Il-1-beta induziert wird. HCMV bewirkte bei den Genen, die bei den Kontrollen schwach exprimiert waren, kein klares Expressionsmuster. Gene, die bei den Kontrollmakrophagen stark exprimiert waren, unterlagen bei einer Inkubation mit A. fumigatus, S. aureus, HCMV und CVB einer schwächeren Expression, wohingegen diese Gene bei einer Inkubation mit L. sigmodontis unverändert stark exprimiert wurden. Beispiele hierfür sind ARPC4 (Actin related protein, Subunit 4), das Zellwachstum fördernde SRC (Sarcoma viral oncogene), und das mit Apoptose assoziierte APP (Amyloid beta precursor protein). 86 __________________________________________________________________Ergebnisse Abb. 3.61: Heatmap einer Auswahl differentiell exprimierter Gene nach 8h. 2244 Gene waren nach 8 Stunden differentiell reguliert. IL 8 war bei allen Pathogenen etwa doppelt so stark exprimiert wie nach 2 Stunden. Darüber hinaus war nur noch der CCL4 übereinstimmend exprimiert. 87 Ergebnisse__________________________________________________________________ Farbcode: Differentielle Expression exklusiv bei einem Pathogen A. fumigatus bei zwei Pathogenen bei drei Pathogenen bei vier Pathogenen bei allen Pathogenen S. aureus HCMV CVB L. sigmodontis Abb. 3.62: Schnittmengen der differentiell regulierten Gene zum Zeitpunkt 8h. 88 __________________________________________________________________Ergebnisse 3.10.2.5 Differentielle Genexpression nach 18 Stunden Nach 18 Stunden waren insgesamt 2862 Gene differentiell exprimiert 501 Gene davon waren bei mindestens zwei Stimulationsansätzen gleichzeitig differentiell exprimiert. Anschließend wurden diese Gene zu funktionellen Gruppen zusammengefasst (Abb. 3.63). ohne bekannte Funktion Zellzyklus, -wachstum Inflammation und Immunantwort Protein Transkription 1348 Apoptose 293 Ionentransport Zelladhäsion 181 217 83 101 2950 105 170 228 Metabolismus Signalkaskade DNA-Replikation Sonstige 58 Abb. 3.63: Funktionelle Gruppen differentiell exprimierter Gene nach 18h. Im unten dargestellten Heatmap ist eine Auswahl der nach 18 Stunden differentiell exprimierten Gene abgebildet (Abb. 3.64). Bei einer Inkubation mit A. fumigatus HCMV und S. aureus wurden Gene, die bei den Kontrollen noch schwach exprimiert waren, stärker exprimiert, wohingegen die meisten dieser Gene bei einer Inkubation mit L. sigmodontis und CVB ihre schwache Expression beibehielten. Ein solches Expressionsmuster zeigte sich z. B. bei IL-8, bei den Chemokinliganden CCL3 und CXCL2, beim Tumor-Nekrose-Faktor TNFAIP6, bei VEGF (Vascular endothelial growth factor) und auch bei GBP1 (Guanylate binding protein 1). Gene, die bei den Kontrollmakrophagen stark exprimiert waren, unterlagen bei einer Inkubation mit A. fumigatus, S. aureus, HCMV und CVB einer schwächeren Expression, wohingegen eine Inkubation mit L. sigmodontis keine Änderung der Genexpression bewirkte. Beispiele hierfür sind IL1R1, BIRC1 (Baculoviral IAP repeatcontaining 1), CXCL5, und TGFBI. 89 Ergebnisse__________________________________________________________________ Abb. 3.64: Heatmap von einer Auswahl differentiell exprimierter Gene nach 18h. 90 __________________________________________________________________Ergebnisse Von den 2862 Genen wurde 6 durch alle Pathogene differentiell reguliert. TGFBI und MT1K (Metallothionein 1K) waren bei allen Stimulationsansätzen herunter-, CXCL2, DDIT4 (DNAdamage-inducible transcript 4), GBP1 und VEGF heraufreguliert. Die Anzahl, der zum Zeitpunkt 18 h differentiell regulierten Gene wurden in ein Schnittmengendiagramm übertragen (Abb. 3.65). Farbcode: Differentielle Expression exklusiv bei einem Pathogen bei zwei Pathogenen A. fumigatus bei drei Pathogenen bei vier Pathogenen bei allen Pathogenen S. aureus HCMV CVB L. sigmodontis Abb. 3.65: Schnittmengen der differentiell regulierten Gene zum Zeitpunkt 18h. 91 Diskussion__________________________________________________________________ 4 Diskussion 4.1 Parasitologische Experimente und Genotypisierungen Der Mikrofilarämieresistenzlocus mfr Verschiedene Mäusestämme reagieren unterschiedlich auf injizierte Mikrofilarien von L. sigmodontis (Hoffmann et al. 2000). So können DBA/1-Mäuse Mikrofilarien innerhalb von zwei Tagen komplett aus dem Blut eliminieren, während diese bei BALB/c-Mäusen über einen Monat lang zirkulieren können. Mäusestämme, die innerhalb von sieben Tagen post infectionem im Blut frei von Mikrofilarien sind, werden von uns per definitionem als resistent, solche mit längerer Mikrofilarämie als suszeptibel bezeichnet. Erste Ergebnisse von Kreuzungsversuchen von DBA/1- und BALB/c-Mäusen wiesen darauf hin, dass die Resistenz gegenüber injizierten Mikrofilarien von einem Gen kodiert und dominant vererbt wird (Hoffmann et al. 2001). In weiteren Experimenten von Schumacher 2006 wurde ein solcher Locus als Mikrofilarämieresistenzlocus (mfr) postuliert. Außerdem war es möglich nach 20 Rückkreuzungsgenerationen mfr-kongene Mäuse herzustellen. Die Tatsache, dass es Stämme mit unterschiedlich langen Mikrofilarämien gibt, legt die Hypothese nahe, dass mehrere Allele des mfr an der Eliminierung von Mikrofilarien beteiligt sind. Um zu überprüfen, ob das gleiche Resistenzgen mit unterschiedlichen Allelen für die beobachtete Mikrofilarämieresistenz verantwortlich ist, wurden umfangreiche Kreuzungsexperimente und Genotypisierungen mit verschiedenen resistenten und suszeptiblen Stämmen vorgenommen. C57BL/6 und B10.D2 dienten als resistente Donorstämme und BALB/c und BALB/b als suszeptible Stämme. Die Inzuchtmausstämme und die verschiedenen Kreuzungen dieser Stämme wurden mit Mikrofilarien von L. sigmodontis infiziert und hinsichtlich parasitologischer Parameter untersucht. Kreuzt man zwei Inzuchtstämme und verfolgt eine serielle Rückkreuzungsstrategie, bei der auf ein Merkmal des Donorstammes selektiert wird, können Mäuse erzielt werden, die genetisch bis auf die Zielregion mit dem Rezipientenstammes übereinstimmen (Markel et al. 1997). Es muss jedoch stets beachtet werden, dass bei der Einkreuzung eines gewünschten Merkmals immer eine größere Region als nur ein Zielgen übertragen wird (Silver 1995). Bei der Vererbung der Resistenz gegenüber injizierter Mikrofilarien von L. sigmodontis handelt es sich um einen monogenen autosomal-dominanten Erbgang. Es kann 92 __________________________________________________________________Diskussion ausgeschlossen werden, dass die Resistenz auf den geschlechtsdeterminierenden Chromosomen kodiert ist, da in keiner Generation oder Kreuzung die Verteilung von Resistenz und Suszeptibilität mit dem Geschlecht der Versuchstiere korrelierte. Es wurde bei der Auswahl der Zuchttiere für die Rückkreuzungen außerdem darauf geachtet, sowohl Männchen als auch Weibchen als Donor des Resistenzallels zu verwenden. F1-Nachkommen aus allen Kreuzungsexperimenten verhielten sich uniform resistent. Auch in späteren Generationen fanden sich Spaltungsverhältnisse nach Mendel für monogene Erbgänge wieder. Für das Rückkreuzen der heterozygot Resistenten mit den homozygot Empfänglichen ergab sich eine Aufspaltung in Resistente und Suszeptible im Verhältnis 1:1. Dieses Spaltungsverhältnis wurde bei allen Kreuzungen in den Generationen N2 bis N6 bzw. N7 wieder gefunden. C57BL/6 und B10.D2 eliminieren Mikrofilarien in bis zu 7 Tagen, wohingegen DBA/1 nur einen Tag für die vollständige Eliminierung benötigen, dies belegt die Hypothese, dass es sich um unterschiedliche Allele des Resistenzgens handelt. Die Genotypisierungen wurden mit Hilfe des Mikrosatellitenmarkers D12Nds2 durchgeführt, welcher in der Kandidatenregion für den Resistenzlocus liegt. Es handelte sich hierbei um den Marker, der auch schon in den Kreuzungsversuchen mit DBA/1 und BALB/c verwendet wurde. Die Ergebnisse der Genotypisierung belegen diese Hypothese, da die Genotypisierung von suszeptiblen und resistenten Tieren der unterschiedlichen Kreuzungen mit dem in der Kandidatenregion liegenden D12Nds2-Marker grundsätzlich möglich ist, die Banden von C57BL/6 und B10.D2 aber ca. 170 bp lang sind, wohingegen die DBA/1-Bande bei 163 bp liegt. Dies spricht dafür, dass es den mfr mit mehreren Allelen gibt. Vererbung der adaptiven Immunantwort gegen Mikrofilarien. Einfluss des MHCKomplexes Die Kreuzungen mit Stämmen, die unterschiedliche MHC-Haplotypen tragen, sollten die Auswirkung des MHC-Haplotyps auf die adaptive Phase der Immunantwort beschreiben. Es wurden vier Stämme eingesetzt, die sich sowohl in ihrem MHC-Haplotypen als auch in ihrem Abbauverhalten gegenüber injizierten Mikrofilarien unterscheiden. Der Stamm B10.D2 leitet sich von C57BL/10-Mäusen ab, die mit DBA/2-Mäusen gekreuzt und auf den genetischen Hintergrund des BLACK-Stammes rückgekreuzt wurden, wobei auf den MHC93 Diskussion__________________________________________________________________ Haplotyp H2d selektiert wurden. Dieser MHC-Haplotyp entspricht auch dem des BALB/cStammes. Somit sind B10.D2 und BALB/c in Bezug auf den MHC kongen. Die Stämme BALB/b und C57BL/6 tragen den MHC-Haplotypen H2b. Die suszeptiblen BALB/c (H2d) und BALB/b (H2d) wurden gekreuzt, um zu klären, wie die unterschiedlichen MHC-Haplotypen vererbt werden, wenn sie nicht von einem Resistenzeffekt überlagert werden. Durch Kreuzung der beiden suszeptiblen Stämme BALB/b und BALB/c wurde eine F1 generiert. Alle F1-Nachkommen waren bis zum Tag 15 mikrofilarienfrei. Der MHC-Haplotyp H2b von BALB/b scheint sich daher dominant gegenüber dem Haplotyp H2d von BALB/c zu verhalten. Die F1 der Kreuzung von C57BL/6 (H2b) mit BALB/c (H2d) ist heterozygot resistent und trägt heterozygot die beiden MHC-Haplotypen H2b und H2d. Durch Rückkreuzung der F1 mit BALB/c, der homozygot H2d trägt, ergeben sich unter der Einbeziehung des postulierten mfr-Locus, vier mögliche Genotypen. Die beiden Genotypen mfrrs / mhcH2dd und mfrrs / mhcH2bd tragen jeweils ein Resistenzallel und sind somit phänotypisch resistent. Hier können keine Unterschiede in der adaptiven Phase der Immunantwort diskriminiert werden. Einer der zwei suszeptiblen Genotypen trägt die Allele mfrss / mhcH2dd und ist homozygot für den MHCHaplotypen von BALB/c, somit verhält sich dieser Genotyp phänotypisch auch wie BALB/c. Der Genotyp mfrss / mhcH2bd trägt das, von einem F1-Elter vererbte, H2b und das H2d des anderen BALB/c-Elters. Da nun also ein H2b-BALB/b-Allel heterozygot vorliegt, welches sich dominant verhält, erklärt dies die Gruppe von suszeptiblen Tieren, die bis zum Tag 15 mikrofilarienpositiv sind. Der rechnerische Anteil dieser Tiere beträgt 25%. In der N2 und N3 waren diese suszeptiblen Gruppen zu finden und ihr Anteil entsprach dem erwarteten Viertel und betrug 21,05%. In späteren Kreuzungen konnten die beiden suszeptiblen Gruppen nicht mehr gefunden werden, was einerseits auf die geringe Anzahl Versuchstiere zurückgeführt werden kann. Eine Diskriminierung von Gruppen ist bei geringer Stichprobengröße nicht möglich. Andererseits ist es auch möglich, dass das von C57BL/6 stammende, heterozygot vorliegende H2b-Allel in höheren Generationen nicht weitervererbt wurde, da bei der Auswahl der Zuchttiere ausschließlich das Vorliegen der Resistenz beurteilt wurde. Somit wurden die späteren Generationen vermutlich mit dem Genotyp mfrrs / mhcH2dd gezüchtet. Die Stämme B10.D2 und BALB/c tragen den MHC-Haplotyp H2d. Die Stämme C57BL/6 und BALB/b tragen der MHC-Haplotyp H2b. Bei den Kreuzungen B10.D2 x 94 __________________________________________________________________Diskussion BALB/c und C57BL/6 x BALB/b liegen also keine Unterschiede in den MHC-Haplotypen vor. Es sind daher keine suszeptiblen Untergruppen in der adaptiven Phase zu erwarten und wurden auch nicht gefunden. In der Kreuzung B10.D2 x BALB/b wurden die unterschiedlichen MHC-Haplotypen gekreuzt. B10.D2 vererbt den MHC-Haplotypen H2d und BALB/b H2b, welcher dominant vererbt wird. Es sind hier folglich keine Unterschiede bei suszeptiblen Nachkommen zu erwarten, selbst wenn der MHC-Haplotyp H2d von BALB/c rechnerisch ebenfalls zu einem Viertel heterozygot in der N2 vorliegt. Die Ergebnisse bestätigen dies, da keine suszeptiblen Untergruppen gefunden werden konnten. Die Genotypisierung mithilfe polymorpher Mikrosatellitenmarker der N7 (C57BL/6 x BALB/c) sollte zeigen, ob das erwartete hohe Maß an Homozygotie nach sieben Generationen bereits erreicht war und ob Abschnitte im Genom detektiert werden konnten, an denen sich die Suszeptiblen von den Resistenten unterscheiden. Insgesamt wurden 77 Marker getestet, in denen sich BALB/c von C57BL/6 unterscheiden. Die N7 zeigte für 73 Marker, die über alle autosomalen Chromosomen verteilt waren, eine Übereinstimmung mit BALB/c. Durch siebenfaches Rückkreuzen wurde also ein hoher Anteil homozygot vorliegender BALB/c-Allele erreicht. Bei zwei getesteten Markern trug jeweils ein suszeptibles Tier eine heterozygote Bande von C57BL/6. Diese Marker können also nicht im Bereich, der für die Resistenz kodiert, liegen. Die resistenten Tiere waren für den distalen Marker 5 auf Chromosom 12 heterozygot. In diesem Bereich liegt der postulierte Resistenzlocus. Diese Indizien unterstützen die Ein-Gen-Hypothese und untermauern die Mikrosatellitenanalyse von Schumacher 2006, welche auf einen Bereich von 56 – 61 cM auf Chromosom 12 als Locus für das Resistenzgen schließen lässt. Rolle von Stat4 beim Abbau von injizierten Mikrofilarien Der Abbau von Mikrofilarien findet in einem Th1-Milieu statt (Chirgwin et al. 2002). Stat4-k.o.-Mäuse sind Th1-defizient (Murphy et al. 1999). Mithilfe von Rückkreuzungsexperimenten mit resistenten Mäusen sollte festgestellt werden, ob Stat4 am Abbau von Mikrofilarien beteiligt ist. In den parasitologischen Versuchen konnten keine Veränderungen im Spaltungsverhältnis der N2 gefunden werden. Es traten genau so viele 95 Diskussion__________________________________________________________________ resistente wie suszeptible Tiere auf, somit scheint Stat4 nicht am Abbau von Mikrofilarien beteiligt zu sein. Die Genotypisierung der Kreuzung von Stat4-k.o. mit homozygot resistenten Tieren bestätigten die parasitologischen Befunde und zeigte, dass es phänotypisch resistente Tiere gibt, die sowohl heterozygote resistent sind als auch homozygot einen Stat4-Knockout tragen, d.h., dass der Knockout von Stat4 keinen Einfluss auf die Resistenz gegenüber Mikrofilarien hat. Somit scheint eine TH1-Immunantwort nicht direkt ursächlich für die Eliminierung der Mikrofilarien zu sein. Tiere, die bereits einmal infiziert waren, besitzen Antikörper gegen Mikrofilarien und können die injizierten Mikrofilarien bei einer Reinfektion schneller abbauen (Lawrence 1994). BALB/b und die N5 (C57BL/6 x BALB/c) sind immunkompetent. Unabhängig von ihrer genetischen Disposition gegenüber Mikrofilarien haben die Versuchstiere Antikörper gegen die zuerst injizierten Mikrofilarien aufgebaut und waren so in der Lage, die neu injizierten innerhalb von 4 bis 6 Tagen abzubauen. Der Stamm BALB/c-mb-1-/- (Igα-k.o.) ist nicht in der Lage, Antikörper aufzubauen (Pelanda et al. 2002). Die Ergebnisse der Reinfektionsversuche mit diesem Stamm bestätigen dies. Die Mikrofilarien zirkulierten nach der ersten Injektion über 60 Tage im Blut der Tiere. Auch nach einer zweiten Injektion von Mikrofilarien, nach Abklingen der ersten Infektion, zirkulierten die Mikrofilarien bis zum Tag 72. Zudem bestätigte der Antikörper-ELISA die parasitologischen Untersuchungen. Bei infizierten BALB/c finden sich nach vollständiger Eliminierung der Mikrofilarien Antikörper im Plasma von BALB/c, wohingegen im Plasma von Igα-k.o. kein Antikörpertiter detektiert werden konnte. Die Eliminierung injizierter Mikrofilarien wird bei immunkompetenten, suszeptiblen Mäusestämmen folglich über Antikörper vermittelt. Abschließend lässt sich feststellen, dass die Hypothese einer von einem Gen mit mehreren Allelen vererbten Resistenz gegenüber Mikrofilarien von L. sigmodontis, bestätigt werden konnte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der MHC für den unterschiedlich schnellen Abbau von Mikrofilarien in suszeptiblen Stämmen verantwortlich ist. 96 __________________________________________________________________Diskussion 4.2 Genexpressionsanalysen Die Genexpressionsanalysen wurden durchgeführt, um eine Aussage über die Expressionsmuster bei einer Infektion mit L. sigmodontis machen zu können. Es sollten Expressionsmuster gefunden werden, die mit einer Mikrofilarieninjektion und mit einer Weibchenimplantation bei BALB/c assoziiert sind. Die Vergleichsexperimente mit scheininfizierten BALB/c wurden durchgeführt, um so Expressionsmuster zu finden, die mit der Behandlung der Mäuse assoziiert sind, und um diesen Background in der Analyse der durch L. sigmodontis induzierten Gene beurteilen zu können. Eingriffe wie Narkose und Operation, mit allen damit verbundenen Behandlungen, induzieren bereits eine Vielzahl von Genen (Stoeckert et al. 2002, Pritchard et al. 2001). Insgesamt waren durch einen Eingriff ohne Mikrofilarieninjektion (naiv) 312 Gene differentiell reguliert. Darunter waren bei scheininfizierten BALB/c gegenüber naiven doppelt so viele herauf- wie herunterregulierte Gene. Unter den heraufregulierten waren vor allem Gene, die in der Proteinbiosynthese aktiv sind, Transkriptionsfaktoren, Ionentransporter, Gene, die mit dem Metabolismus der Zelle und mit dem Zellzyklus assoziiert sind und Apoptose-Gene. Interessant war hierbei z.B. das bei Scheininfizierten heraufregulierte P53, welches bei Zellzyklus-Signalwegen eine antagonistische Rolle zu Akt (PKB-α) spielt. Akt ist eine Serin-Threonin-Kinase, die der Apoptose entgegenwirkt und das Überleben der Zelle unterstützt (Kim & Denkers 2006). Außerdem waren die Heat-Shock-Proteine Hspa8 und Hspa1 induziert. Heat-Shock-Proteine wurden ursprünglich bei Drosophila melanogaster gefunden und sind eine Gruppe sehr konservierter Proteine. Ihre Expression wird durch eine Vielzahl Stimuli hervorgerufen, so z.B. Temperatur oder oxidativer Stress. Viele Heat-ShockProteine spielen eine Rolle bei der intrazellulären Signalkaskade und können immunmodulatorischen wirken indem sie proinflammatorische Cytokine, Chemokine und Zelladhäsionsmoleküle in vielen Zelltypen aktivieren (Pockley 2003). Unter den herunterregulierten Genen waren vor allem Gene, die mit der Immunantwort und der Signaltransduktion assoziiert sind, außerdem Anti-Apoptose induzierende Gene. In Wundheilungsexperimenten mit Mäusen wurden in Genexpressionsanalysen ebenfalls Gene gefunden, die mit der innaten Immunantwort, der Apoptose und dem Zellzyklus assoziiert waren (Cooper et al. 2005). Die Ergebnisse dieser Genexpressionsanalysen zeigen, dass eine Scheininjektion Gene induziert, die mit der Wundheilung einhergehen. 97 Diskussion__________________________________________________________________ Insgesamt waren 258 Gene im Vergleich von infizierten und scheininfizierten BALB/c differentiell reguliert. Davon waren 225 Gene herauf- und 33 Gene herunterreguliert. Viele dieser Gene konnten auch durch Genexpressionanalysen in Infektionsexperimenten mit Porphyromonas gingivalis und BALB/c gefunden werden (Hart et al. 2004). Unter den heraufregulierten waren vor allem Gene, die mit dem Zellzyklus oder der Signaltransduktion assoziiert sind, Gene, die beim Transport und der enzymatischen Aktivität von Proteinen aktiv sind, Transkriptionsfaktoren und Ionentransporter. Außerdem waren Gene heraufreguliert, die die Immunantwort und die Apoptose induzieren. Auch hier kamen P53, einige Heat-ShockProteine und die Cyclin-D2-Kinase 1 (Cdkn1) vor, welche im Zellzyklus eine Rolle spielt und von P53 reguliert wird (Spitkovsky et al. 1995). Außerdem beinhaltete das Netzwerk noch Pten (phosphatase and tensin homolog), den immunmodulatorisch wirksame Transkriptionsfaktor Junb und den Rezeptor 1 für die Phosphatidylinositol-3-Kinase (Pik3r1). Diese Kombination exprimierter Gene, tritt auch bei der Autophagie auf, einem Prozess ähnlich der Apoptose, der auch bei immunologischen Prozessen eine Rolle spielt (Meley et al. 2006, Botti et al. 2006). Durch Autophagie verdaut die Zelle Eiweiße oder auch funktionsunfähige Zellorgane, um die Einzelteile als Bausstoffe wieder zu verwenden (Proikas-Cezanne et al. 2004). Unter den herunterregulierten waren vor allem Anti-Apoptose-Gene. In Experimenten mit dendritischen Zellen und Makrophagen, die mit verschiedenen Stadien von B. malayi inkubiert wurden, konnte gezeigt werden, dass Gene, die Apoptose-fördernd wirken, induziert werden, und dass insgesamt die Mehrheit der differentiell regulierten Gene, wie in den Experimenten dieser Arbeit, induziert war (Semnani & Nutman 2004). Im Gegensatz zu einer Scheininjektion sind hier also prozentual mehr Gene induziert als supprimiert. Außerdem spielen hier Gene, die mit der Immunantwort assoziiert sind eine Rolle, was bedeutet, dass die Mikrofilarien bereits zwei Stunden nach Injektion als Pathogene erkannt werden und eine Abwehrreaktion gegen diese eingeleitet wird, welche jedoch erst nach einsetzten der antikörpervermittelten Immunantwort erfolgreich ist. Zusammenfassend ergibt sich für den Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten und für den Vergleich von infizierten BALB/c versus scheininfizierten folgendes Bild. Es waren in diesen Genexpressionsanalysen 439 Gene differentiell reguliert. Davon traten 140 Gene in beiden Vergleichen als gemeinsam herauf- oder herunterreguliert auf. Diese Gene werden mit den biologischen Funktionen Apoptose, Immunantwort, 98 __________________________________________________________________Diskussion Metabolismus, Ionentransport, Signaltransduktion, Zellzyklus, Metabolismus, und dem Transport von Proteinen assoziiert. Ein solches Expressionsmuster konnte in Teilen auch in den Experimenten mit dendritischen Zellen im Mausmodell von Adarichev et al. (2005) gefunden werden. Analysiert man die in beiden Vergleichen vorkommenden 140 Gene zeigt sich, dass das Expressionslevel naiver BALB/c durch einen Eingriff ohne Infektion verändert wird, bei einer Infektion mit Mikrofilarien jedoch auf einem Level bleibt, das dem naiven Zustand gleicht (Abb. 4.1). Diese 140 Gene werden folglich nur durch eine Scheininjektion in ihrer Expression verändert. Die meisten Mausstämme sind resistent gegenüber Mikrofilarien von L. sigmodontis (Hoffmann et al. 1999). Somit könnte man annehmen, dass die Mikrofilarien die Expression beeinflussen und damit ein Milieu herstellen, welches ihr Überleben begünstigt und dem Status einer uninfizierten Maus gleicht. Besonders bei Helminthosen wie den Filariosen oder der Schistosomiasis, die durch chronische Verläufe gekennzeichnet sind, induzieren die Parasiten die Expression bestimmter Wirtsgene, um so ihr Überleben dauerhaft zu gewährleisten (Mentink-Kane et al. 2004). Auch bei anderen Parasitosen konnten Krankheitsverläufe mit definierten Expressionsmustern assoziiert werden. So spielen z.B. die Transkriptionsfaktoren T-bet (T-box expressed in T-cells), GATA-3, sowie Gene der SOCS-Familie (suppressor of cytokine signaling) eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Th-Zellen und sind während einer patenten lymphatischen Filariose genauso supprimiert wie der Transkriptionsfaktor Foxp3, welcher als einer der Hauptregulatoren der regulatorischen T-Zellen gilt (Babu et al. 2005). Ob Expressionsmuster, die bei einer Infektion gefunden werden, den Parasiten kontrollieren, oder ob sie protektiv vom Parasiten selbst induziert werden, ist bislang nicht eindeutig geklärt (Maizels et al. Expression Expression 2004). naiv Abb. 4.1: scheininfiziert infiziert naiv scheininfiziert infiziert Cluster der im Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten und infizierten BALB/c versus scheininfizierten in gleicher Weise differentiell regulierten Gene. 99 Diskussion__________________________________________________________________ Bei insgesamt 9 Genen konnte in unseren Versuchen eine gegenteilige Regulierung gefunden werden (Abb. 4.2). In das erste Cluster fallen 2 und in das zweite 7 Gene. Hier handelt sich um Gene, die durch eine Scheininfektion und die damit einhergehende Behandlung herauf- bzw. herunterreguliert werden. Dieser Effekt wird durch eine Infektion zusätzlich verstärkt. Durch eine Infektion supprimiert werden das mit Apoptose assoziierte Heat-Shock-Protein Hspa1b und das bei der Proteinfaltung involvierte Hsp105. Durch eine Infektion heraufreguliert werden die mit dem Zellzyklus assoziierten Cyclin-abhängige Kinase Cdkn1b und Gadd45g (growth arrest and DNA-damage-inducible 45 gamma), die enzymatisch aktiven Ptpn22 (protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22), Ugcg (UDP-glucose ceramide glucosyltransferase) und die Proteinkinase Prkwnk1, außerdem das mit der Proteinfaltung assoziierte Btbd3 (BTB (POZ) domain containing 3) und der bei Zelladhäsion involvierte Rezeptor Csf3r (colony stimulating factor 3 receptor), welcher auf Granulozyten exprimiert wird. Es wäre denkbar, dass diese Gene induziert werden, um die Eliminierung von Mikrofilarien einzuleiten, dieser Effekt jedoch bis zur Aktivierung der Expression Expression antikörpervermittelten Immunantwort ausbleibt. naiv Abb. 4.2: scheininfiziert infiziert naiv scheininfiziert infiziert Cluster der im Vergleich von naiven BALB/c versus scheininfizierten und infizierten BALB/c versus scheininfizierten gegenteilig differentiell regulierten Gene. Genexpression nach Weibchenimplantation und Mikrofilariengabe Implantiert man resistenten Mäusen adulte Weibchen und injiziert nach einer Woche zusätzlich Mikrofilarien, persistieren diese genau so lange wie in BALB/c, d. h. die Resistenz wird umgekehrt (Hoffmann et al. 2001). Bei suszeptiblen Mäusen kann durch Implantation adulter Weibchen keine Veränderung in der Geschwindigkeit der Mikrofilarämie durch eine zusätzliche Mikrofilarieninjektion beobachtet werden. Dieses Ergebnis wird auch durch die 100 __________________________________________________________________Diskussion Genexpressionsanalysen bestätigt, da nahezu keine differentiell regulierten Gene gefunden wurden, die mit der Implantation assoziierbar waren. Vergleicht man BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion mit BALB/c nur mit Mikrofilarieninjektion, findet man 125 Gene exprimiert, die auch im Vergleich von BALB/c mit Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c nur mit Mikrofilarieninjektion als differentiell exprimiert auftraten. Diese Gene stehen folglich mit dem Eingriff, also mit der Narkose, der Operation und all den damit verbundenen Behandlungen in Verbindung und sind nicht spezifisch für eine Implantation von adulten Weibchen. Die differentiell exprimierten Gene kamen aus den funktionellen Bereichen Antiproliferation, Apoptose, Chemotaxis, Immunantwort, Inflammation, Proteintransport und- Lyse, Signaltransduktion, Transkription, Zelladhäsion, -proliferation und –zyklus. Insbesondere findet man in beiden Analysen differentiell regulierte Gene wieder, die dem Gennetzwerk angehören, welches die T-Zell-Funktion beschreibt. Diese Gene sind folglich nicht mit der Weibchenimplantation assoziiert und werden unspezifisch durch Wundheilungsprozesse der Operation hervorgerufen. Ähnliche Expressionsmuster konnten auch Werner & Grose (2003) in Wundheilungsexperimenten beobachten. Der Vergleich von BALB/c nach Weibchenimplantation und Mikrofilarieninjektion versus BALB/c mit Scheinbehandlung und Mikrofilarieninjektion wurde durchgeführt, um Gene zu detektieren, die mit der Implantation von adulten L. sigmodontis-Weibchen assoziiert sind. Insgesamt waren nur 6 Gene in diesem Vergleich differentiell reguliert, welche nur schwer in einen funktionellen Zusammenhang zu bringen waren. Es handelte sich hier um die heraufregulierten Angptl4 (Angiopoietin-like 4) und den Transkriptionsfaktor Arntl (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like). Angptl4 ist ein Protein, welches Proliferation und Chemotaxis von Endothelzellen inhibiert (Ito et al. 2003). Dies untermauert die parasitologischen Befunde, die keinen Unterschied in der Mikrofilarämie bei einer Weibchenimplantation mit zusätzlicher Mikrofilarieninjektion zeigten. Denkbar wäre auch hier, wie in den Genexpressionsanalysen nur mit Mikrofilarien, dass L. sigmodontis in BALB/c bereits ein sein Überleben begünstigendes Milieu vorfindet und keine Änderung der Genexpression des Wirtes verursacht. Die Immunregulation von Parasiten ist ein globales Konzept, welches die Suppression und die Konversion der Wirtsantwort zum Vorteil des Parasiten einschließt (Lammie & Katz 1983, Graham et al. 2001). 101 Diskussion__________________________________________________________________ Genexpression humaner Makrophagen nach Stimulation mit unterschiedlichen Pathogenen Humane Makrophagen exprimierten nach Stimulation mit phylogenetisch weit voneinander entfernten Pathogenen nahezu keine gemeinsamen Gene, jedoch war IL-8 nach 2 und 8 Stunden Inkubation mit allen Pathogenen differentiell exprimiert. Nach einer Inkubation von 8 Stunden war IL-8 in allen Experimenten etwa doppelt so stark exprimiert wie nach 2 Stunden. Nach 18 Stunden war es immerhin noch bei HCMV, S. aureus und A. fumigatus gemeinsam differentiell exprimiert. IL-8 wird unspezifisch nach kurzer Zeit exprimiert und ist ein Infektionsmarker (Van Reeth 2000). IL-8 ist ein Chemokin der CXCFamilie und wird unter anderem durch Endothelzellen, Monozyten, Epithelzellen und Fibroblasten produziert. Ein wichtiger Angriffspunkt des Chemokins sind neutrophile Granulozyten. Die wesentlichen Wirkungen von IL-8 auf Granulozyten beinhalten die Förderung der Chemotaxis, die Stimulation der Expression von Adhäsionsmolekülen und die Aktivierung mit Freisetzung von Sauerstoffradikalen und Granula (Fibbe et al. 2000). Eine IL-8-Produktion kann in gesunden Geweben kaum gemessen werden, wohingegen in Gegenwart von proinflammatorischen Zytokinen, bakteriellen oder viralen Produkten und bei zellulärem Stress eine sehr starke Expression detektiert werden kann (Hoffmann et al. 2002). O’Riordan et al. konnten 2002 zeigen, dass es in Makrophagen innate Mechanismen gibt, die spezifisch zwischen Bakterien im Cytosol und in der Vakuole unterscheiden, was in unterschiedliche Immunantworten resultierte, wobei den hier verwendeten Pathogenen eine Aktivierung von IL-8 gemeinsam war. Betrachtet man die einzelnen Zeitpunkte, so ergibt sich, dass nach 2 Stunden zwar insgesamt 362 Gene, aber nur IL-8 gemeinsam reguliert war. Nach 8 Stunden waren 2244 Gene differentiell reguliert, wobei nur IL-8 und CCL4 (Chemokinligand 4) übereinstimmend in allen Vergleichen exprimiert waren. CCL4 wird von T- und B-Zellen, Monozyten und verschiedenen Tumor-Zell-Linien nach deren Aktivierung über z. B. Endotoxine von S. aureus produziert (Lipes et al. 1988). Nach 18 Stunden waren von den insgesamt 2862 Genen 6 durch alle Pathogene differentiell reguliert. Die beiden herunterregulierten Gene waren TGFBI (Tumor growth factor beta induced), welches bei der Zelladhäsion eine Rolle spielt und MT1K (Metallothionein 1K), das bisher ohne Funktion ist. Die heraufregulierten Gene waren CXCL2, welches mit Inflammation assoziiert wird, GBP1 (Guanylate binding protein 1), das zur Immunantwort gehört, VEGF (Vascular endothelial growth factor), welches mit 102 __________________________________________________________________Diskussion Apoptose assoziiert wird und DDIT4 (DNA-damage-inducible transcript 4), für welches bisher keine Funktion annotiert ist. Eine Induktion der Immunantwort und der Apoptose konnten auch Nau et al. (2003) in Experimenten mit Makrophagen und Gram-positiven bzw. –negativen Bakterien und Ricciardi-Castagnoli & Granucci (2002) in Genexpressionsanalysen von Makrophagen und dendritischen Zellen nach Inkubation mit Escherichia coli, Candida albicans und dem Influenzavirus finden. Außer IL-8 gab es kein Gen, welches gemeinsam von allen fünf Pathogenen reguliert wurde, was bestätigt, dass das Immunsystem im Laufe der Evolution unterschiedlichste Effektormechanismen entwickelt hat, um auf das breite Spektrum phylogenetisch weit voneinander entfernter Pathogene reagieren zu können (Chaussabel et al. 2003). Genexpressionsanalysen mit humanen Makrophagen, die mit Gram-positiven und Gramnegativen Bakterien inkubiert worden waren, zeigten zwar einheitlich die Aktivierung von Toll-Like-Rezeptoren und Transkriptionsfaktoren, jedoch auch spezifische Expressionsmuster wie die Aktivierung eines TLR-4-Liganden und IL-12 für gram-negative Bakterien. Grampositive Bakterien riefen kein spezifisches Muster hervor (Nau et al. 2003). Humane Makrophagen sind die Hauptzielzellen für HCMV, das über Rezeptoren in die Zielzellen gelangt, wo seine Replikation beginnt (Mocarski & Courcelle 2001). Eine Inkubation mit HCMV führte nach 8 und 18 Stunden zur Expression der meisten Gene. Das rezeptorvermittelte aktive Eindringen von HCMV in die Makrophagen erklärt die hohe Anzahl von exprimierten Genen. Im Gegensatz dazu zeigten Makrophagen, die mit L. sigmodontis inkubiert worden waren, über alle Zeitpunkte hinweg die niedrigste Expression von differentiell regulierten Genen, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass bei L. sigmodontis keine makrophagenvermittelte Phagozytose stattfindet. Die Auswertung der Heatmaps zeigte ebenfalls, dass nach einer Inkubation mit L. sigmodontis die Makrophagen zu allen drei Zeitpunkten ein ähnliches Expressionsmuster wie die Kontrollen zeigten. CVB und A. fumigatus werden von Makrophagen phagocytiert (Klingel et al. 2003, Braedel et al. 2004), was sich auch in der Anzahl der exprimierten Gene widerspiegelte, die über der nach Inkubation mit L. sigmodontis lag. Die Genexpressionsanalysen ergaben jedoch für CVB eine insgesamt schwächere Expression als für A. fumigatus. Die Heatmaps zeigten für A. fumigatus zu jedem Zeitpunkt eine starke Expression der bei Kontrollen schwach exprimierten Gene. Für CVB war dies so nur nach 2 Stunde zu finden. Nach 8 und 18 Stunden glich die Expression nach Inkubation mit CVB eher der der Kontrollen. S. aureus wird natürlicherweise auch von Makrophagen phagocytiert (Foster 2005), was sich in der 103 Diskussion__________________________________________________________________ Anzahl der exprimierten Gene nach 8 und 18 Stunden Inkubation widerspiegelte. Nach 8 und 18 Stunden waren hier viele Gene aus den Bereichen Immunantwort, Transkription und Apoptose induziert. Ein solches Expressionsmuster kam auch in Genexpressionsanalysen mit S. aureus, E. coli und C. albicans vor. Offensichtlich hatten die Pathogene einen inhibierenden Effekt auf unspezifische Immunzellen (Bukovsky et al. 2001). Die Schlussfolgerung der Genexpressionsanalysen ist, dass Pathogene, die von Makrophagen phagocytiert werden, mehr Gene in diesen induzieren, als Pathogene, die nicht von Makrophagen verdaut werden. Nau et al. fanden 2002 Gene aus den Bereichen Rezeptoraktivität, Signaltransduktion und Transkriptionsfaktoren in Versuchen mit Makrophagen nach Inkubation mit verschiedenen Bakterien exprimiert und schlossen daraus, dass die Makrophagen so auf die Interaktion mit dem Pathogen vorbereitet werden und die Immunantwort eingeleitet wird. Zwar konnten bei der Analyse der differentiell regulierten Gene in den Experimenten dieser Arbeit nahezu keine gemeinsamen Gene gefunden werden, jedoch waren auch hier Gene aus den funktionellen Bereichen Signaltransduktion, Transkription (NFkBIA), Zellzyklus und -wachstum, Inflammation und Immunantwort (IL1R1, IL-8, CCL3, CCL4, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, TGFB1, verschiedene Toll-Like-Rezeptoren, Tumor-Nekrose-Faktoren), Proteinfaltung und -lyse, Apoptose (BAX und APP), Ionentransport, Zelladhäsion, Metabolismus, Endocytose (AP1S1) und DNA-Replikation. Die Anzahl der differentiell regulierten Gene nahm zwar von 2 nach 18 Stunden zu, jedoch blieb die prozentuale Verteilung der oben genannten funktionellen Gruppen gleich. Ähnliche Expressionsmuster fanden auch Ricciardi-Castagnoli & Granucci (2002). Abschließend lässt sich feststellen, dass alle durchgeführten Genexpressionsanalysen zum besseren Verständnis der Vorgänge bei einer Infektion dienten und nicht dazu, einzelne Kandidatengene für Infektionsmodelle zu finden. Die gefundenen Expressionsmuster spiegeln das Zusammenspiel vieler Prozesse, die im Organismus stattfinden, wieder. 104 __________________________________________________________________Diskussion 4.3 Ausblick Durch weitere serielle Rückkreuzungen der verschiedenen Rückkreuzungen wird man höhere Generationen generieren können und somit auch die Kandidatenregion des Resistenz vermittelnden Bereiches eingrenzen. Zusätzlich werden weiterhin Genotypisierung und Mikrosatellitenanalysen durchgeführt werden, um den mfr weiter zu charakterisieren. In unserer Arbeitsgruppe wird bereits jetzt die Real-Time-PCR etabliert. Diese Technik ermöglicht es ebenfalls die Kandidatenregion weiter einzugrenzen. Außerdem sollte es im Laufe der Jahre möglich sein, viele Mausstämme im Hinblick auf den mfr zu untersuchen. Bereits 2007 werden die bedeutendsten 15 Inzuchtmausstämme sequenziert sein. Auch wenn die Genomik weiter an Bedeutung zunehmen wird, wird unser Tiermodell weiterhin den Vorteil des sehr raschen uns statistisch gesicherten Read-Outs haben. Bereits am Beispiel von Slc11a1 konnte gezeigt werden, dass es Gene gibt, die dem Organismus Resistenz gegen mehrere Pathogene vermitteln. Deshalb werden bereits jetzt in unserer Arbeitsgruppe Experimente zu Co-Infektionen mit Schistosoma mansoni (Hüpkes 2005), oder auch Plasmodium berghei ANKA durchgeführt. Zusätzliche Infektionsexperimente in unserem Mausmodell mit anderen Filarien könnten über die Bedeutung der Wolbachien für die innate Immunantwort Aufschluss geben. Bereits durchgeführte Experimente zeigten, dass Mikrofilarien von Brugia malayi in unseren resistenten Mäusen ebenso schnell abgebaut werden wie die von L. sigmodontis, während Acanthocheilonema viteae persistierte. Interessant wären hier folglich Versuche mit Loa loa, einer Filarie, deren Mikrofilarien bescheidet sind, jedoch keine Wolbachien besitzen. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell kann auch im Hinblick auf die Bekämpfung der Humanfilariosen und einer Vakzineentwicklung von großer Bedeutung sein. 105 Zusammenfassung____________________________________________________________ 5 Zusammenfassung Verschiedene Mäusestämme reagieren unterschiedlich auf injizierte Mikrofilarien von Litomosoides sigmodontis. Per Definition suszeptible Stämme sind jene, die bis zu vier Wochen für die Eliminierung injizierter Mikrofilarien benötigen, wie BALB/b und BALB/c. Die resistenten C57BL/6 und B10.D2 eliminieren Mikrofilarien in bis zu 7 Tagen, wohingegen DBA/1 nur einen Tag für die vollständige Eliminierung benötigen. Diese Resistenz ist genetisch bedingt und wird von einem Gen kodiert, welches aufgrund verschiedener Allele für den unterschiedlich schnellen Abbau verantwortlich ist. Die Inzuchtmausstämme und die verschiedenen Kreuzungen dieser Stämme wurden mit Mikrofilarien von L. sigmodontis infiziert und hinsichtlich parasitologischer Parameter untersucht. Die F1 aller Kreuzungen waren uniform resistent. Auch in späteren Generationen fanden sich Spaltungsverhältnisse nach Mendel für monogene Erbgänge wieder. Die Ergebnisse der Genotypisierung belegen die Ein-Gen- und die Allel-Hypothese, da die Genotypisierung von suszeptiblen und resistenten Tieren der unterschiedlichen Kreuzungen mit dem für BALB/c und DBA/1 etablierten D12Nds2-Marker grundsätzlich möglich ist und die Banden von C57BL/6 und B10.D2 untereinander zwar gleich lang, aber unterschiedlich zu DBA/1 sind. Die Genotypisierung der N7 (C57BL/6 x BALB/c) mithilfe polymorpher Mikrosatellitenmarker zeigte für 73 der 77 Marker eine Übereinstimmung mit BALB/c. Ein hoher Anteil homozygot vorliegender BALB/c-Allele wurde also durch siebenfaches Rückkreuzen erreicht. Die resistenten Tiere waren für den distalen Marker 5 auf Chromosom 12 heterozygot. In diesem Bereich liegt der postulierte Resistenzlocus. Diese Ergebnisse unterstützen die Ein-Gen-Hypothese und untermauern die Mikrosatellitenanalyse von Schumacher 2006, welche einen Bereich von 56 - 61 cM auf Chromosom 12 als Locus für das Resistenzgen beschreibt. Außerdem sollte der Einfluss unterschiedlicher MHC-Haplotypen auf die adaptive Phase der Immunantwort bei suszeptiblen Tieren untersucht werden. BALB/c und B10.D2 tragen den MHC-Haplotyp H-2d, BALB/b und C57BL/6 den MHC-Haplotyp H-2b. Der MHC-Haplotyp H2b der empfänglichen BALB/b verhält sich dominant gegenüber dem Haplotyp H2d der empfänglichen BALB/c, da alle F1-Nachkommen einer Kreuzung beider Stämme wie BALB/b bis zum Tag 15 mikrofilarienfrei waren. 106 ____________________________________________________________Zusammenfassung Stat4 spielt keine Rolle beim Abbau injizierter Mikrofilarien. Die Genotypisierung der Kreuzung von Stat4-k.o. mit homozygot resistenten Tieren zeigte, dass es Tiere gibt, die einen Stat4-Knockout tragen und heterozygote resistent sind. Diese Tiere waren auch phänotypisch resistent. Die Eliminierung injizierter Mikrofilarien wird bei immunkompetenten Mausstämmen über Antikörper vermittelt. Der Stamm Igα-k.o. ist nicht in der Lage Antikörper aufzubauen. Die die Mikrofilarien zirkulierten nach der ersten Injektion über 60 Tage und auch nach einer zweiten Injektion bis zum Tag 72. Zudem konnten keine Antikörper im Plasma von infizierten Igα-k.o. detektiert werden. Die Genexpressionsanalysen wurden an BALB/c mit Mikrofilarieninjektion und an BALB/c mit Weibchenimplantation durchgeführt. Durch eine Infektion mit diesen verschiedenen Stadien von L. sigmodontis werden Gene aus den funktionellen Bereichen Apoptose, Chemotaxis, Immunantwort, Inflammation, Proteintransport und- Lyse, Signaltransduktion, Transkription, Zelladhäsion, -proliferation und –zyklus heraufreguliert. Unter den herunterregulierten waren vor allem Anti-Apoptose-Gene. Diese Genexpressionsmuster finden sich in den unterschiedlichsten Infektionsmodellen wieder. Genexpressionsanalysen an humanen Makrophagen nach Inkubation mit mehreren phylogenetisch weit voneinander entfernten Pathogenen (HCMV, CVB, Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus und L. sigmodontis) wurden durchgeführt, um globale Genexpressionsmuster zu finden, die mit der schnellen, unspezifischen Immunantwort gegen Pathogene assoziiert sind. Gemeinsam war den unterschiedlich stimulierten Makrophagen die Expression von IL-8 nach 2 und 8 Stunden. Nach 18 Stunden war IL-8 noch durch 3 Pathogenen differentiell exprimiert. Zu jedem Zeitpunkt waren Gene aus den funktionellen Bereichen Zellzyklus, -wachstum, Inflammation und Immunantwort, Tumor-NekroseFaktoren und Transkriptionsfaktoren exprimiert. Außerdem waren Gene differentiell reguliert, die mit Apoptose, Proteinfaltung und –lyse, Ionentransport, Zelladhäsion, Metabolismus, Signalkaskade, Endocytose und DNA-Replikation assoziiert sind. 107 Literaturverzeichnis___________________________________________________________ 6 Literaturverzeichnis Adarichev, V. A., Vermes, C., Hanyecz, A., Mikecz, K., Bremer, E. G., Glant, T. T. (2005): Gene expression profiling in murine autoimmune arthritis during the initiation and progression of joint inflammation. Arthritis Research & Therapy. 7: 196-207 Akira, S., Takeda, K. & Kaisho, T. (2001): Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nature Immunology. 2: 675–680 Allen, J. E., Maizels, R. M. (1997): Th1–Th2: reliable paradigm or dangerous dogma? Immunology Today 18: 387–392 Allen, J. E., Daub, J., Guiliano, D., McDonnell, A., Lizotte-Waniewski, M., Taylor, D. W., Blaxter, M. 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Nebenfach: medizinische Mikrobiologie Diplomarbeit 05/2002 – 02/2003 am Institut für Tropenmedizin, Tübingen „Untersuchungen zur umweltbedingten Resistenz von Labormäusen gegen Mikrofilarien von Litomosoides sigmodontis (Filarioidea, Nematoda)“ Promotion 03/2003 – 09/2006 am Institut für Tropenmedizin, Tübingen „Untersuchungen zur innaten und adaptiven Immunantwort von Labormäusen gegen Litomosoides sigmodontis (Nematoda, Filarioidea). Vergleich der Genexpression in humanen Makrophagen nach Stimulationen mit Filarien und anderen infektiösen Pathogenen.“ Sonstiges 11/2002 Fortbildungsveranstaltung nach §15 Abs.4 Satz 2 GenTSV für Projektleiter und Beauftragte für die Biologische Sicherheit 12/2003 Vortrag im Rahmen des „Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene” in Philadelphia
