Analytik von Folaten – neue Methoden und aktuelle Folgerungen

wissenschaft & forschung | Begutachtetes Original
Eingereicht: 21. 7. 2008
Akzeptiert: 24. 11. 2008
Die Folatzufuhr mit der Ernährung reicht in Deutschland nicht aus. Die Analytik
dieser Vitamingruppe erfordert dabei spezifische und empfindliche Verfahren,
um einerseits die Folatgehalte in Lebensmitteln richtig zu bestimmen, andererseits auch deren Bioverfügbarkeit sicher zu erfassen. Erst mit beiden Datengruppen sind eindeutige Ernährungsempfehlungen möglich. Der Einsatz von
mit stabilen (also nicht radioaktiven) Isotopen markierten Folaten verhilft hier
zu aussagekräftigen Analysewerten.
Analytik von Folaten – neue
Methoden und aktuelle Folgerungen
PD Dr. Michael
Rychlik
Lebensmittelchemikerin
Sabine Mönch
Lehrstuhl für Lebensmittelchemie
der Technischen
Universität
München
Lichtenbergstr. 4
85748 Garching
E-Mail: michael.
[email protected]
270
Die Vitamine der Folsäuregruppe sind im
Stoffwechsel vor allem an der Übertragung
von Methylgruppen beteiligt und erfüllen
wichtige Funktionen im Stoffwechsel der
Aminosäuren und Nukleinsäuren. Da die
Folate vom menschlichen Organismus
nicht selbst hergestellt werden können,
müssen sie mit der Nahrung zugeführt werden. Durch Ernährungserhebungen hat
sich aber herausgestellt, dass die Bevölkerung in Deutschland durchschnittlich nur
55 % der täglich empfohlenen Menge zu
sich nimmt. Dies ist insofern besorgniserregend, als dass ein Folatmangel mit einem
gehäuften Auftreten einer besonderen Art
von Missbildungen bei Neugeborenen, den
Neuralrohrdefekten, verbunden ist. Daneben mehren sich Anzeichen, die eine ungenügende Folatzufuhr mit der Anfälligkeit
für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Dickdarmkrebs und der Alzheimerschen Erkrankung in Verbindung bringen [1]. Aufgrund bisheriger Erkenntnisse wird allen
Frauen in gebärfähigem Alter empfohlen,
täglich 400 µg Folat durch Nahrungsergänzungsmittel oder folatreiche Lebensmittel
zu sich zu nehmen [2].
Da die Zufuhrempfehlungen häufig nur
unzureichend befolgt werden, werden in einigen Ländern Grundnahrungsmittel prinzipiell angereichert, so z. B. Weizenmehl in
den USA mit 140 µg/100 g Folsäure.
Zur Bestätigung der Folatgehalte in Lebensmitteln ist jedoch eine sichere Analytik
erforderlich, die einige Besonderheiten
aufweist.
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Bestimmung der Folate
in Lebensmitteln
Die Gruppe der Folate zeichnet sich durch
eine große Vielzahl an Verbindungen aus.
Neben den sog. Pteroylmonoglutamaten
liegen die Folate in Lebensmitteln überwiegend als Pteroylpolyglutamate vor, die
zwei bis sieben Glutamatreste im Molekül
enthalten können (쏆 Abbildung 1).
Pteroylmonoglutamate werden auch als
freie Folate bezeichnet, die ohne weitere Enzymbehandlung aus Lebensmitteln
durch Extraktion bestimmt werden können. Die Polyglutamate als Speicherform
der Folate müssen jedoch durch sog. Konjugasen in die Monoglutamate umgewandelt werden, da nur diese mit den meisten
Verfahren erfassbar sind. Inzwischen werden eine Vielzahl von Methoden verwendet, die sich in drei Kategorien einteilen lassen: die mikrobiologischen, die chemischinstrumentellen und die bioanalytischen
Bestimmungen.
Bei mikrobiologischen Methoden zeigen
Mikroorganismen exogene Folate in Lebensmittelextrakten an, da sie diese für das
Wachstum brauchen. Dabei werden auch
die Polyglutamate größtenteils erfasst. Häufig werden Lactobacillus casei-Kulturen verwendet, die eine Vielzahl von Folaten detektieren und sich somit als Standardmethode etabliert haben. Diese Bestimmung
weist aber den entscheidenden Nachteil
M
O
OH
HN
10
C
COOH
HN CH
N
CH2
5
N
6
CH2
7
8
H 2N
Abb. 1: Grundstruktur der
Folsäure (n=0) und deren
Variationen, die zu Lebensmittelfolaten führen
auf, dass eine Differenzierung der Vitamere nicht möglich ist. Zudem ist
sie langwierig, arbeitsintensiv und
sehr störanfällig. Auch können spezielle Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren eine Stimulation oder Hemmung der Mikroorganismen hervorrufen.
Die bioanalytischen Methoden verwenden Folatbindungsproteine (FBP),
die spezifisch an Folate binden. Es
werden entweder radioaktiv markierte Analyte (Radioassays) oder Enzyme (Enzymproteinbindungsassays)
genutzt und bei letzteren mit Hilfe
der Enzymkinetik die Konzentration
der zu bestimmenden Lösung ermittelt. Radioassays werden heute vorwiegend im klinischen Bereich zur
Bestimmung der Plasma- und Erythrozytenspiegel verwendet [3]. Für
Lebensmittelbestimmungen haben
diese Methoden nur eine geringe Bedeutung, da auch hier eine Differenzierung der einzelnen Vitamere nicht
möglich ist und zudem die FBPs unterschiedliche Affinitäten zu den einzelnen Vitameren zeigen.
Die chemisch-analytischen Methoden
besitzen gegenüber den vorher beschriebenen Methoden den Vorteil,
dass sie die einzelnen Folate unterscheiden können. Die selektivste Detektion der Folate über flüssigchromatographische Methoden ist die
Massenspektrometrie. Um Verluste
der labilen Folate während der Extraktion und Ionisationsstörungen
bei der Massenspektrometrie zu kompensieren, haben sich Stabilisotopenverdünnungsanalysen (SIVA) sowohl
N
N
O
COOH
C
HN CH
O
CH2
Variationsmöglichkeiten:
CH2
O
Oxidationsform des Pterinringes
C
M
Art und Verknüpfung mit C1-Resten
n
Zahl der Glutaminsäurereste
in der Bestimmung von Lebensmitteln [4] als auch in der Untersuchung
von Humanproben bewährt [5, 6].
Diese Methoden nutzen stabilisotopenmarkierte Folate als interne Standards, die vor der Extraktion dem
Lebensmittel in definierten Mengen
zugegeben werden. Durch massenspektrometrische Erfassung des Verhältnisses der stabilisotopenmarkierten zu den natürlich vorhandenen,
unmarkierten Vitameren im Lebensmittelextrakt kann auf die Konzentration der letzteren geschlossen werden. So ist eine selektive Bestimmung
der einzelnen Vitamere möglich und
Aufarbeitungsverluste können einfach kompensiert werden. Durch
SIVA (쏆 Tabelle 1) konnten grüne
Gemüse, Hülsenfrüchte, Hefe und
Leber als gute Folatquellen bestätigt
werden [7].
Analytik zur Erfassung
der Bioverfügbarkeit von
Folaten
Für Ernährungsempfehlungen zur
Vermeidung oben genannter Mangelerscheinugen ist nicht nur die
Kenntnis der Folatgehalte in Lebensmitteln, sondern auch deren Bioverfügbarkeit (BV) entscheidend. Darunter versteht man in der Ernährungswissenschaft klassischerweise
das Ausmaß und die Geschwindigkeit, mit der eine Substanz nach der
Zufuhr am Wirkort verfügbar wird.
Die am häufigsten eingesetzten Verfahren zur Erfassung der BV basieren
darauf, dass der betreffende Nährstoff nach seiner Verabreichung in
Blut oder Urin quantifiziert wird.
O
OH
n
Diese Studien können nach Kurzzeitoder Langzeitprotokollen ablaufen,
die im Anschluss an die Nährstoffgabe entweder kurzfristig die Änderung der Plasmaspiegelkurven oder
die Veränderung eines Markers für
die langfristige Speichersättigung erfassen.
Zur Ermittlung der Bioverfügbarkeit
steht eine Reihe von Verfahren zur
Auswahl. In verschiedenen Studien
konnte gezeigt werden, dass die sog.
Methode der AUC (area under the
curve) zur Bestimmung der Bioverfügbarkeit von Mikronährstoffen aus
Lebensmitteln geeignet ist [8]. Dabei
wird die postresorptive Blutspiegelkurve ermittelt und die Fläche unter
der Konzentrations-Zeit-Kurve bestimmt (쏆 Abbildung 2).
Für Folate ist damit die Bestimmung
der absoluten Bioverfügbarkeit schwer
möglich, da Folate stoffwechselbe-
μg/100g
SIVA
Eig. Messungen
MBA
Lit daten [7]
Spinat
96–159
143–338
Camembert
48–65
55–96
318
190–520
27–62
63
Mungobohnen
277
438–625
Vollkornbrot
7–58
39–51
Kartoffeln, roh
1,9–14,5
5–14
Bier
5,8–15,9
4–8
Weizenkeime
Brokkoli
Tab. 1: Folatgehalte einiger Lebensmittel,
ermittelt durch Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA) und mikrobiologische Bestimmung (MBA)
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쑺
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(Folatlösung = 100 %) ermittelt werden. Die Bestimmung der Bioverfügbarkeit von Folaten erfolgt dabei
meist durch Bestimmung des Plasma, Serum- und/oder Erythrozytenfolatspiegels.
40
35
30
nmol/L
25
20
15
AUC = area under the curve
10
5
0
0
2
4
6
8
10
12
Zeit in h
Abb. 2: Verlauf des Plasmafolatspiegels nach einmaliger Folatdosierung und schematische Darstellung der AUC zur Bestimmung
der Bioverfügbarkeit
die Spiegel der Körperflüssigkeiten
vermessen. Im Falle der Folate wird
im Plasma das 5-Methyltetrahydrofolat vermessen, das von uns durch
SIVA in Kombination mit LC-MS/MSKopplung erfasst wurde (쏆 Abbildung 3). Aus den berechneten AUCs
kann so die relative Bioverfügbarkeit
dingt in Körperflüssigkeiten und Geweben permanent vorhanden sind.
Zur Bestimmung der relativen Bioverfügbarkeit werden den Probanden
daher das Lebensmittel und in zeitlichem Abstand eine Folatlösung mit
möglichst identischem Vitamingehalt
oral oder intravenös verabreicht und
RT: 2,28
300000
μAU
250000
200000
UV (280 nm)
150000
100000
50000
0
Relative Intensität
100
RT: 11,93
SN: 804
O
OH
80
O
60
CH3
NH
N
HN
O
m/z 460 씮 312
NH
40
H 2N
20
N
N
H
O
HO
0
Relative Intensität
100
80
O
60
OH
D
CH3
NH
N
HN
RT: 11,91
SN: 1223
O
D
NH
O
m/z 464 씮 316
D
40
D
20
H 2N
N
3
4
N
H
HO
O
9
10
0
0
1
2
5
6
7
8
11
12
13
14
15
16
Zeit (min)
Abb. 3: LC-MS/MS-Chromatogramm einer Plasmaprobe. Unter der Spur des 5-Methyltetrahydrofolats diejenige des als Standard verwendeten, isotopenmarkierten 5-Methyltetrahydrofolats. UV: UV-Absorption
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In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Polyglutamatformen von Folaten schlechter verfügbar sind als die Monoglutamatformen
[9] und sich auch der Verzehr von
Weizenmehl mit Bestandteilen der
Kleie (Vollkornmehl) negativ auf die
Bioverfügbarkeit von Folaten auswirkt. Gut verfügbar hingegen sind
die Folate aus Spinat und weißem
Weizenmehl [10]. Weiter konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Monoglutamatformen der verschiedenen Vitamere unterschiedliche Bioverfügbarkeiten zeigen [11] und so
die Vitamerendifferenzierung bei der
Bestimmung der Lebensmittelfolate
zur Voraussage der Bioverfügbarkeit
wichtig ist.
Bewertung der Anreicherung von Lebensmitteln
mit Folsäure
Während in Europa noch mögliche
Varianten sowie die Vor- und Nachteile einer Zwangsanreicherung mit
synthetischer Folsäure diskutiert werden, gibt es aus Nordamerika bereits
Ergebnisse der seit 1998 laufenden
Supplementierung von Weizenmehl.
Dabei konnte gezeigt werden, dass innerhalb von fünf Jahren die durchschnittliche Folatzufuhr um ca.
200 µg pro Tag gesteigert [12] und
das Auftreten von Neuralrohrerkrankungen um bis zu 3,8 Fälle pro 1 000
Schwangerschaften gesenkt werden
konnte [13]. Fragen hinsichtlich der
möglichen Maskierung eines Vitamin-B12-Mangels sowie der Auswirkung des Auftretens der natürlicherweise nicht vorkommenden Folsäure
im Blutserum wurden jedoch noch
nicht hinreichend beantwortet. Zur
Verhinderung letzterer Nebenwirkungen befürworten manche Wissenschaftler eine Anreicherung mit dem
natürlich vorkommenden 5-Methyltetrahydrofolat. Daneben gibt es Ver-
suche, Folate auf natürliche Weise in
Lebensmitteln durch die sog. Biofortifikation anzureichern. Aktuelle Ansätze hierfür sind die Auswahl von folatreichen Hefen, Milchsäurebakterien oder die Keimung von Getreide
und anderen Samen.
Perspektiven
der Folatanalytik
Die Folatanalytik hat mit der Einführung der LC-MS sowie von isotopenmarkierten Folaten in den letzten
Jahren einen deutlichen Entwicklungssprung erfahren. Damit ist es zunehmend möglich, sichere Folatwerte in Lebensmitteln zu ermitteln.
Von einer fundierten Abstufung der
Bioverfügbarkeit der Lebensmittelfolate sind wir aber noch weit entfernt.
Die Annahmen der Bioverfügbarkeit
reichen von 50 % bis 100 %, wobei
viele nationale Gesellschaften (inklusive der DGE) die konservative Annahme von 50 % heranziehen. Dies
spiegelt sich in der Definition von Folatäquivalenten wider, bei denen Folsäure als Zusatz in Lebensmitteln mit
einer 80 % höheren Bioverfügbarkeit
gegenüber den natürlichen Lebensmittelfolaten angenommen wird. Es
hat sich inzwischen herausgestellt,
dass dies nicht pauschal gilt und wir
noch mehr Untersuchungen über die
Bioverfügbarkeit einzelner Lebensmittel und gemischter Diäten benötigen. Der tatsächliche Beitrag einzelner Lebensmittel für eine bessere Folatzufuhr wird somit erst mittelfristig
abschätzbar und kann anschließend
die Grundlage für bessere Ernährungsempfehlungen sein.
Literatur
왎
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Österreichische Gesellschaft für Ernährung, Schweizerische Gesellschaft
für Ernährungsforschung, Schweizerische Vereinigung für Ernährung:
D-A-CH-Referenzwerte für die Nähr-
stoffzufuhr. Umschau/Braus, Frankfurt (2000)
3. Arcot J, Shrestha A (2005) Folate:
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4. Freisleben A et al. (2003) Specific and
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10. Fenech M et al. (1999) Aleurone flour
is a rich source of bioavailable folate
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11. Gregory JF et al. (1992) Relative
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12. Quinlivan EP, Gregory JF (2003) Effect of food fortification on folic acid
intake in the United States. Am. J.
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13. De Wals P et al. (2007) Reduction in
neural-tube defects after folic acid fortification in Canada. New England
J. Med. 357: 135–142
Zusammenfassung
Eine unzureichende Folatzufuhr kann
zu Neuralrohrdefekten bei Neugeborenen führen und ist ein möglicher Risikofaktor für verschiedene Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Dickdarmkrebs und Alzheimersche Erkrankung. Die Analytik
dieser Vitamingruppe erfordert daher
spezifische und empfindliche Verfahren, um einerseits die Folatgehalte in
Lebensmitteln richtig zu bestimmen,
andererseits auch deren Bioverfügbarkeit sicher zu erfassen. Erst mit
beiden Datengruppen sind eindeutige
Ernährungsempfehlungen möglich.
Der Beitrag vergleicht die Vor- und
Nachteile der etablierten Methoden
zur Folatanalytik mit der neuen Methode der Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA).
Summary
Analysis of folates – new methods
and insights
Michael Rychlik, Sabine Mönch
Inadequate folate supply can lead to
neural tube defects in neonates and is
a possible risk factor for various diseases, including cardiovascular diseases, colon cancer and Alzheimer’s
disease. Analysis of this group of vitamins therefore necessitates specific
and sensitive procedures, which can
be used for both the reliable determination of the folate content in foods
and to record its bioavailability. Clear
recommendations on nutrition can
only be made if both these parameters
are known. The present article compares the advantages and disadvantages of the established methods
of folate analysis with the new method
of stable isotope dilution analysis
(SIDA).
Key words: folic acid, folate vitamers,
folate analysis, stable isotope dilution
analysist
Ernährungs Umschau 56 (2009)
S. 270–273
Ernährungs Umschau | 5/09
쎱
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