Methoden der Biochemie

Methoden der Biochemie
Sequenzieren
DNA-Sonden
Gel
Blots
Unbekannte DNA
Sequenzieren nach Sanger (1977)
Komplementärer Primer
Sequenzieren nach Sanger (1977)
4 Nucleotide
dGTP
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
dATP
dCTP
dTTP
dGTP
dATP
dCTP
dTTP
Sequenzieren nach Sanger (1977)
dGTP
dATP
dCTP
dTTP
Didesoxynucleotide
(radioaktiv markiert)
+ ddATP
+ ddGTP
+ ddCTP
Sequenzieren nach Sanger (1977)
+ ddTTP
Was passiert jetzt?
(alle nötigen Enzyme sind vorhanden)
Sequenzieren nach Sanger (1977)
Beispiel ddATP
Sequenzieren nach Sanger (1977)
PAGE
Sequenzieren nach Sanger (1977)
Fluoreszenmarker
Sequenzieren
Pyrosequenzierung
Sequenzieren; 2nd generation (2005)
(Flüssigphase / Emulsion / Solid state / Beads)
PostLight Sequencing
Wird eine oder mehrere Basen angehängt, führt dies zu einem pH-Abfall, der
detektiert werden kann.
Die Wells werden
nacheinander mit den
vier Basen versetzt und
wieder ausgewaschen
Sequenzieren; 3rd generation (2010)
PostLight Sequencing
Sequenzieren; 3rd generation (2010)
Nanopores & Nanoarrays
•
Die DNA wird mit Hilfe einer elektrischen Spannung durch eine Pore mit
dem Durchmesser von 1 nm gedrängt
•
Die Poren sind leitend oder befinden sich in einer Salzlösung
•
Beim Basendurchtritt tunneln Elektronen durch die Basen
•
Der Tunnelstrom kann gemessen werden
•
Für jede Base kann ein spezifischer Tunnelstrom gemessen werden
•
Momentane Probleme auf Grund der schnellen Sequenzierung:
 Fehlerrate
 Rechnerkapazität
Sequenzieren; 4th generation (in Bearbeitung)
Poren
α-Hämolysin
(Membranprotein)
Seitenansicht
Ansicht von oben
Sequenzieren; 4th generation (in Bearbeitung)
Poren
DNA-Polymerase
α-Hämolysin
Die DNA kommt von unten nach
oben.
Durch die Polymerase wird die
Lesegeschwindigkeit gebremst
Sequenzieren; 4th generation (in Bearbeitung)
Poren
Graphen
Sequenzieren; 4th generation (in Bearbeitung)
Poren
DNA-Transistor
Sequenzieren; 4th generation (in Bearbeitung)
Einige Zahlen zu Sequenzier-Geschwindigkeiten:
Human Genom* Projekt (Sanger-Methode):
2nd-Generation-Sequenziertechnik (2005):
3rd-Generation-Sequenziertechnik (2011):
Single Molecule Real-time Sequencing;
2nd generation-Technik (bis 2015):
• GATTACA ist nicht mehr weit…
Sequenzieren
11 Jahre (1990-2001) 2.7 Mia $
eine Woche
50‘000 $
eine Woche
10‘000 $
15 Minuten
100 $
DNA auf einem Chip
Zelle A
Zelle B
DNA-Sonden
RNA Isolation
Komplementäre
DNA Herstellung
Und Markierung
Hybridisieren
Visualisieren
DNA auf einem Chip
(Puls vom 29.8.2005)
DNA-Sonden
Molekulare Leuchttürme
Schlaufe
Analyt
Stamm
DNA-Sonden
SDS-PAGE
Proteingel
Gelkammer
Proteingel
Gefärbtes Gel
Proteingel
Acrylamidkonzentrationen
Proteingel
Beispiele
Proteingel
Blotting
 RNA-Blot
Northern Blotting
Western Blotting
 Protein-Blot
Eastern Blotting
 ??? Lipide?
Proteoglycane?
Native Proteine?
Edwin Southern Blotting
 DNA-Blot
Visualisieren?
Gene klonieren
TOOLBOX
Bakterium mit Plasmid
Zelle mit dem zu
vermehrenden
Gen
rekombinante DNA
kompetente Bakterien
rekombinante Bakterien
Selektion,
Identifizierung,
Klonierung
TOOLBOX
VEKTOREN:
Bacteriophage
• Plasmide
• Viren (Phagen, Adenoviren, Retroviren*)
• YAC‘s (Yeast Aritficial Chromosome)
• Retroviren enthalten RNA und das Enzym Reverse
Transcriptase
• Die Reverse Transcriptase schreibt in der Wirtszelle die
Viren-RNA
in DNA um
• Die Reverse Transcriptase wird in der Gentechnik
verwendet, um
Eukaryotische RNA in DNA umzuschreiben um diese von
Bakterien
*
Gene klonieren
Gene klonieren
TOOLBOX
RESTRIKTIONSENZYME:
• Bilden eifaches bakterielles
„Immunsystem“
• Sind in der Lage fremde
DNA zu zerschneiden
(eigene DNA durch Methylierung geschützt)
• Hinterlassen klebrige Enden
(Sticky Ends)
• Ca. 3‘000 bekannte RE
• Haben Erkennungs- und
Schnittsequenzen (meist
Egale Lage
Die Liebe ist Sieger; stets rege ist sie bei Leid.
Eine güldne, gute Tugend: Lüge nie!
Erika feuert nur untreue Fakire.
Ein Esel lese nie.
Ein Neger mit Gazelle zagt im Regen nie.
O Genie, der Herr ehre Dein Ego!
Trug Tim eine so helle Hose nie mit Gurt?
Bsp.: Eco R1
Gene klonieren
TOOLBOX
Ligase:
• Eines der Enzyme
der DNA-Replikaiton
Gene klonieren
TOOLBOX
Wirtsorganismen:
• Bakterien (Prokaryonten)
• Hefen (Eukaryonten mit Plasmiden)
• Hamsterzellen (Eukaryonten)
TOOLBOX
• ampR
• lacZ-Gen*
* Dieses Gen codiert für das Enzym β-Galactosidase
Selektion und Identifizierung 1
TOOLBOX
• X-Gal*Medium
mit
Ampicillin
• (β-Galactosidase baut X-Gal ab und produziert
dabei einen blauen Farbstoff)
• Ampicillin ist ein Antibiotikum
* 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
Selektion und Identifizierung 2
TOOLBOX
• DNASonde
(β-Galactosidase baut X-Gal ab und produziert
dabei einen blauen Farbstoff )
* 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
Selektion und Identifizierung 3
Bsp. Somatostatin (human)
TOOLBOX
• Promotor
• Operator
• Regulatorgen
Bsp. Insulin (human)
Polymerase Chain Reaction
TOOLBOX
• Taq-Polymerase