Charakterisierung und Optimierung der Ligand-Rezeptor

Charakterisierung und Optimierung der Ligand-Rezeptor-Interaktion von
Oligosacchariden, Glycokonjugaten und Peptiden sowie deren Mimetika
We use an in-house developed NMR based technique, the so-called STD NMR
spectroscopy, to characterize ligand binding to protein receptors and to use this
information together with docking techniques to synthesize optimized ligands. The
STD NMR technique has been expanded to be also capable of analyzing binding of
ligands to membrane bound receptors in living cells: the so-called STDD NMR can
be used to analyze binding events of ligands with only about 30 pmols of receptor
protein present. In this way we have characterized and optimized ligands to protein
receptors involved in infectious diseases especially of receptors involved in infection
with HIV.
Prof. Dr. Bernd Meyer
Research topics: Glycoscience, Bioorganic Chemistry, NMR
Spectroscopy
Zusammenfassung
Meine Arbeitsgruppe beschäftigt sich
mit der Interaktion von Kohlenhydraten
und Glycokonjugaten mit Rezeptorproteinen und Enzymen. Hierzu haben
wir ein NMR basiertes Verfahren entwickelt, das so genannte STD NMR, mit
dem es möglich ist, die Wechselwirkung von Liganden mit Proteinen zu
beschreiben und verschiedene Parameter des Liganden zu untersuchen.
Unter anderem können wir das Bindungsepitop des Liganden am Protein
identifizieren, die Bindungskinetik
quantifizieren und auch herausfinden,
welche Moleküle aus einer Mischung
überhaupt mit einem Rezeptor wechselwirken. Durch den permanenten
Austausch zwischen gebundenem und
gelöstem Zustand werden in einem großen Bereich von Bindungsaffinitäten
die Liganden nach kurzer Kontaktzeit
mit dem Rezeptor wieder in Lösung
abgegeben. Dadurch können wir es
erreichen, dass die Information, wie ein
Ligand an das Rezeptorprotein bindet,
vielfach verstärkt wird, da während der
Messoperation viele Liganden diesen
Zyklus durchlaufen und dann in Lösung
ihre Information über den gebundenen
Zustand erhalten. Das führt dazu, dass
wir bei normaler Bindungskinetik nur
etwa 100 pmol des Rezeptors benötigen. Im optimalen Fall lassen sich diese
Experimente auf einem 700 MHz NMR
mit Cryoprobenkopf sogar mit 30 pmol
des Rezeptors durchführen. Der Ligand
liegt dann in einem etwa 100fachen
Überschuss vor. Als Ergebnis erhalten
wir die funktionellen Gruppen des
Liganden, die mit dem Protein in Interaktion stehen. In Optimierungsschritten
werden dann aus diesen Kohlenhydrat-,
Glycokonjugat- oder Peptidliganden
Substanzen optimiert und synthetisiert,
die in Kombination von Docking-Verfah-
ren und den Ergebnissen der STD
NMR Spektroskopie dazu führen, dass
innerhalb kurzer Zeit die Bindungsaffinität eines schwachen Liganden
drastisch verbessert werden kann. So
ist es uns unter anderem gelungen, für
den CD4 Rezeptor, der bei der HIV
Infektion eine wesentliche Rolle spielt,
einen Liganden innerhalb kurzer Zeit
von 6 mM durch Modifikationen auf
6 mM zu optimieren.
STD NMR Verfahren
Das STD NMR Verfahren kann, wie
oben bereits beschrieben, Liganden in
ihrer Interaktion mit einem Rezeptor
charakterisieren. Eine Besonderheit
des Verfahrens ist, dass wir das Protein
direkt nicht beobachten, sondern nur
die NMR Spektren der Liganden in
Lösung aufnehmen. Dadurch ergeben
sich viele Vorteile gegenüber den üblichen NMR-spektroskopischen Verfahren, die eine Charakterisierung des
Proteins erfordern. Dadurch wird das
STD NMR Verfahren (Sättigungs-Transfer-Differenz-NMR) sehr leistungsfähig
- auch bei sehr großen Proteinen, oder
Proteinaggregaten und insbesondere
bei membranständigen Proteinen.
Membranständige Proteine bilden etwa
80 Prozent der Targets, auf die die
momentan verfügbaren Medikamente
ausgerichtet
sind.
Die
Hauptsubstanzklasse, um die es hier geht,
sind die G-Protein gekoppelten Rezeptoren, die im Inneren der Zelle Signalkaskaden anschalten. Selbst diese GProtein gekoppelten Rezeptoren sind
mit Hilfe der STD-NMR-Spektroskopie
auf ihre Interaktionen mit Liganden hin
zu untersuchen. Es ist uns gelungen,
hierbei den CCR5-Rezeptor, der mit
dem HI-Virus eine Interaktion eingeht,
bevor eine humane Makrophagenzelle
Chemiedozententagung 2006
Institut für Organische Chemie
Universität Hamburg
Martin-Luther-King-Platz 6
20146 Hamburg
E-Mail: [email protected]
Telefon: +49-(0)40-42838-5913
Telefax: +49-(0)40-42838-2878
Beruflicher Werdegang:
1970-79 Studium der Chemie und
Promotion in Hamburg; 1979-80 Postdoc in Lyngby, Technical University of
Denmark; 1980-86 Habilitation an der
Universität Oldenburg; 1988 -1993
Assistant and Associate Professor,
Complex Carbohydrate Research
Center, University of Georgia; 19932001 C3-Professor an der Universität
Hamburg; seit 2001 C4-Professor an
der Universität Hamburg
infiziert wird, hinsichtlich seiner Wechselwirkung mit dem Rezeptor-Glycoprotein zu charakterisieren (vgl. unten).
Das STD-NMR-Verfahren basiert auf
einer Sättigung des Proteins, die selektiv nur Proteinsignale treffen darf. Hier-
47
zu wird die maximale Leistung auf ein
Proteinsignal selektiv eingestrahlt.
Diese Signale liegen typischer Weise
im Bereich von etwa -1 ppm oder, falls
die Liganden keine aromatischen Signale haben, auch im Bereich von etwa
8 – 10 ppm. Diese Einstrahlung führt
dazu, dass das Protein innerhalb von
wenigen Millisekunden vollständig
gesättigt wird. Wenn jetzt Liganden an
das Protein binden, führt das zu einer
Interaktion mit einem gesättigten Protein, das die Sättigung an den gebundenen Liganden ebenfalls mit einer
Zeitskala von etwa 10 – 20 Millisekunden weitergibt. Hier werden jetzt im
Liganden vorzugsweise die Protonen
gesättigt, die einen engen Kontakt mit
dem Protein haben. Nach Dissoziation
dieses Liganden in den gelösten
Zustand sind diese Signale normal im
NMR Spektrum als Signale eines kleinen Moleküls, jetzt aber mit variabler
Intensität, die durch die Sättigung, die
vom Protein übertragen worden ist, entstand. Während einer typischen Sättigungszeit von einigen Sekunden wird
üblicher Weise bei Verweildauern von
etlichen Millisekunden eines Liganden
eine Vielzahl von Liganden gesättigt.
Da diese Liganden die Sättigung in
Lösung erst langsam wieder verlieren
(mit der normalen T1-Relaxation), ist es
möglich, Sättigung im Liganden in
Lösung zu akkumulieren. Diese Akkumulierung ist besonders effizient, wenn
ein großer Überschuss des Liganden
vorhanden ist, da dann statistisch
gewährleistet ist, dass mit großer Wahrscheinlichkeit immer wieder ungesättigte Liganden in die Bindungstasche
hineingehen. Es ist uns dabei gelungen, so genannte STD Amplification
Factors bis zu 120 zu erhalten, das
heißt, dass die Proteinkonzentration um
den Faktor 120 im Ligandspektrum verstärkt worden ist, so dass wir mit sehr
geringen Proteinmengen auskommen
können. Typischer Weise sind bei 700
MHz im Cryoprobenkopf 30 pmol Protein notwendig, was in etwa nur einigen
Mikrogramm an Proteinmenge entspricht, um die Interaktion mit Liganden
zu charakterisieren.
Liganden können in etwa bis zu einer
Molmasse von einigen Kilodalton
haben, beim Protein gibt es keine Obergrenze hinsichtlich der Molmasse, allerdings eine Untergrenze, die besagt,
dass Proteine in etwa > 10 kDa sein
sollten. Das Protein sollte mindestens
um einen Faktor 10 größer sein als der
Ligand, das heißt, wenn große Liganden von einigen Kilodalton untersucht
werden sollten, muss auch das Protein
48
mindestens einige 10 Kilodalton Molmasse haben.
Selbst Proteine, die Membran-gebunden sind und in lebenden Zellen existieren, können mit einer Variante des STD
NMR Verfahrens, dem STDD Verfahren,
untersucht werden.
die Hauptbindungsaffinität an das
CCR5 tragen. Hierbei ist die Glycosylierung von besonderer Bedeutung, die
die Bindungsaffinität in etwa um den
Faktor 10 relativ zu der peptidischen
Struktur verbessert. Durch Kombination
von synthetischen Arbeiten, die den
Austausch von Zuckern und Aminosäuren zum Ziel hatten, und von STD-NMRUntersuchungen ist es uns gelungen,
eine Leitstruktur für die Interaktion des
GP120 mit dem CCR5 zu finden. Diese
Struktur hat im einfachen DockingModell eine interessante Wechselwirkung mit dem CCR5, das in seiner
N-terminalen Loop drei sulfatierte Tyrosine trägt.
Charakterisierung des Bindungsepitops des GP 120 aus dem HIV
mit humanen Rezeptoren
CD4 und CCR5
Mit Hilfe der STD-NMR-Spektroskopie
ist es uns gelungen, Liganden an die
beiden humanen Rezeptoren, die das
HIV benutzt, um humane Zellen zu infizieren, nämlich CD4 und CCR5 zu
untersuchen. Im Fall des CD4 ist es uns
gelungen, aus einem Leitpeptid, das
eine Bindungskonstante von 6 Millimolar hatte, ein Peptidomimetikum herzustellen, das sowohl in seinen proteolytischen Eigenschaften wesentlich besser
ist, als das Leitpeptid, als auch in der
Bindungskonstante um einen Faktor
1000 besser an das CD4 bindet und mit
6 Mikromolar eine interessante Struktur
darstellt. Zur Zeit sind wir dabei, durch
Kombination von STD-NMR- und
Docking-Untersuchungen diese Leitstruktur weiter in ihrem KD-Wert zu verbessern.
Literatur
[1] A Fast and Sensitive Method to Characterize Ligand Binding by Saturation Transfer
Difference NMR Spectra. M. Mayer & B.
Meyer, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 17841788 (1999); Angew. Chem. 111, 19021906 (1999).
[2] Detecting Binding Affinity to Immobilized
Receptor Proteins in Compound Libraries
by HR-MAS STD NMR. Jens Klein, Robert
Meinecke, Moriz Mayer & Bernd Meyer, J.
Am. Chem. Soc. 121, 5336-5337 (1999).
[3] Determination of the Binding Specificity of
an Integral Membrane Protein by STD
NMR: RGD Peptide Ligands’ Binding to
Integrin aIIbb3. Robert Meinecke and Bernd
Meyer, J. Med. Chem. 44, 3059-3065 (2001)
[3] Group Epitope Mapping (GEM) by STD
NMR to Identify Segments of a Ligand in
Direct Contact with a Protein Receptor.
Moriz Mayer and Bernd Meyer, J. Am.
Chem. Soc. 123, 6108-6117 (2001).
[4] NMR Spectroscopy Techniques for Screening and Identifying Ligand Binding to Protein Receptors, Bernd Meyer and Thomas
Peters, Angew. Chem. 2003, 42, 864– 890.
Die Interaktion des CCR5 mit dem HIV
lässt sich anhand von STD-NMRUntersuchungen und OberflächenPlasmonenresonanz (Biacore)-Messungen bestimmen und charakterisieren. Wir haben hierbei gezeigt, dass
Glycopeptide aus dem viralen GP120
Chemiedozententagung 2006
[5] A New Peptidomimetic HIV Entry Inhibitor
Directed Against the CD4 Binding Site for
the Viral GP120, Axel T. Neffe & Bernd
Meyer, Angew. Chemie 2004, 116, 2997 –
3000.
[6] Direct observation of ligand binding to
membrane proteins in living cells by STDD
NMR, Birgit Claasen, Marko Axmann,
Robert Meinecke & Bernd Meyer, J. Am.
Chem. Soc. (2005), 127, 916-919.