Der Elektronentransfer der Escherichia coli NADH:Ubichinon

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Der Elektronentransfer
der Escherichia coli
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
sowie die ESR-spektroskopische Charakterisierung
weiterer Metalloproteine
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
vorgelegt von
Diplom-Chemikerin
Katerina Henrike Dörner
Freiburg im Breisgau, 2010
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. Rolf Schubert
Referent:
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Korreferent:
Prof. Dr. Oliver Einsle
Tag der Verkündigung der Prüfung:
16.12.2010
Ein Teil der in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wurde in folgenden Artikeln
veröffentlicht:
Pohl, T., Bauer, T., Dörner, K., Stolpe, S., Sell, P., Zocher, G. & Friedrich, T. (2007) Ironsulfur cluster N7 of the NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) is essential for
stability but not involved in electron transfer. Biochemistry 46, 6588-6596.
Kohlstädt, M., Dörner, K., Labatzke, R., Koc, C., Hielscher, R., Schiltz, E., Einsle, O.,
Hellwig, P. & Friedrich, T. (2008) Heterologous production, isolation, characterization and
crystallization of a soluble fragment of the NADH:Ubiquinone Oxidoreductase (Complex I)
from Aquifex aeolicus. Biochemistry 47, 13036-13045.
Pohl, T., Schneider, D., Hielscher, R., Stolpe, S., Dörner, K., Kohlstädt, M., Böttcher, B.,
Hellwig, P. & Friedrich, T. (2008) Nucleotide-induced conformational changes in the
Escherichia coli NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I). Biochem. Soc. Trans. 36,
971-975.
Schneider, D., Pohl, T., Walter, J., Dörner, K., Kohlstädt, M., Berger, A., Spehr, V. &
Friedrich, T. (2008) Assembly of the Escherichia coli NADH:ubiquinone oxidoreductase
(complex I). Biochim. Biophys. Acta 1777, 735-739.
Kung, J. W., Löffler, C., Dörner, K., Heintz, D., Gallien, S., Van Dorsselaer, A., Friedrich, T.
und Boll, M. (2009) Identification and characterization of the tungsten-containing class of
benzoyl-coenzyme A reductases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17687–92.
Krätzer, C., Welte, C., Dörner, K., Friedrich, T. und Deppenmeier, U. (2010) Characterization
of methanoferrodoxin: a novel superoxide reductase. FEBS J., im Druck.
Folgender Artikel wurde eingereicht:
Morina, K., Schulte, M., Hubrich, F., Dörner, K., Steimle, S., Stolpe, S. und Friedrich, T.
(2010) Engineering the respiratory complex I to an energy-converting NADPH:ubiquinone
oxidoreductase.
INHALTSVERZEICHNIS
1. Zusammenfassung ..............................................................................................................1
2. Einleitung ...........................................................................................................................3
2.1. Das aerobe Elektronentransportsystem aus E. coli ........................................................3
2.2. Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) ....................................................5
2.2.1. Elektronentransfer im Komplex I ........................................................................ 11
2.2.2. Überproduktion des Komplex I und seiner Varianten in E. coli ........................... 15
2.3. Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransport ................................. 16
2.4. Die Microsecond Hyper-Quenching (MHQ)-Technik ................................................. 18
2.5. Weitere untersuchte Metalloproteine ..........................................................................22
2.5.1. Die Superoxid Reduktase aus Methanosarcina mazei ..........................................22
2.5.2 Die Benzoyl-CoA Reduktase aus Geobacter metallireducens ............................... 23
2.6. Ziel der Arbeit ...........................................................................................................24
3. Material und Methoden ..................................................................................................... 26
3.1 Bakterienstämme und Vektoren .................................................................................. 26
3.2 Oligonukleotide ..........................................................................................................29
3.3 Chemikalien................................................................................................................ 31
3.4 Medien, Puffer und Lösungen ..................................................................................... 34
3.5 Mikrobiologische Methoden ....................................................................................... 38
3.5.1 Bakterienanzucht .................................................................................................. 38
3.5.2. Herstellung von Glycerindauerkulturen ............................................................... 39
3.5.3. Herstellung elektrokompetenter Zellen ................................................................ 39
3.6. Molekularbiologische Methoden ................................................................................ 40
3.6.1. Plasmidpräparation .............................................................................................. 40
3.6.2. Restriktion von DNA .......................................................................................... 41
3.6.3. Polymerase Kettenreaktion (PCR) ....................................................................... 41
3.6.4. Transformation durch Elektroporation ................................................................. 43
3.6.5. λ-Red vermittelte Rekombination ........................................................................ 44
3.6.6. Agarose Gelelektrophorese.................................................................................. 44
3.7 Proteinchemische Methoden ....................................................................................... 45
3.7.1. Zellaufschluß und Präparation von Membranen ................................................... 45
3.7.2 Zuckergradientenzentrifugation ............................................................................ 45
3.7.3. Proteinpräparation ............................................................................................... 46
3.7.4. Größenausschluss-Chromatographie .................................................................... 47
3.7.5 Aktivitätsbestimmungen ....................................................................................... 48
3.7.6. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ......................................... 49
3.7.7. Proteinbestimmung ............................................................................................. 49
3.7.8. Microsecond Freeze-hyperquenching (MHQ) Technik ........................................ 50
3.7.9 ESR-Spektroskopie .............................................................................................. 51
4. Ergebnisse ........................................................................................................................ 52
4.1 Isolierung des Komplex I und des NADH Dehydrogenase Fragmentes ....................... 52
4.1.1. Isolierung des Komplex I .................................................................................... 52
4.1.2 Isolierung des NADH Dehydrogenase Fragmentes ............................................... 55
4.2. Die Reduktion der Fe-S-Zentren durch NADH ........................................................... 56
4.3 Die Bedeutung des Fe-S-Zentrums N1a ......................................................................65
4.3.1 Mutagenese des Bindemotivs des Fe-S-Zentrums N1a..........................................65
4.3.2. Komplex I vermittelte Aktivität der cytoplasmatischen Membranen aus den
Mutanten ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoECXA ....................................................... 68
4.3.3. Isolierung und Charakterisierung des Komplex I aus den Mutanten
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoECXA ......................................................................71
4.3.4. Isolierung und Charakterisierung des Komplex I aus den Mutanten
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoE CXS ......................................................................74
4.3.5 Eignung des Stammes AN387 Δnuo als Expressionsstamm .................................. 76
4.3.6. Eignung des Stammes BW25113Δnuo als Expressionsstamm.............................. 78
4.3.7. Charakterisierung der Alanin- und Serin-Varianten aus dem Stamm
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis................................................................................ 83
4.4 Die Bedeutung aromatischer Aminosäuren für den Elektronentransport im E. coli
Komplex I ........................................................................................................................ 86
4.4.1 Mutagenese zum Austausch der aromatischen Aminosäuren ................................ 88
4.4.2 Komplex I vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen aus den
Mutanten mir den ausgetauschten aromatischen Aminosäuren ......................................89
4.4.3 Stabilität der Komplex I Varianten W221YNuoG, W221YNuoG und F515NuoCD ........ 94
4.5 ESR-Spektroskopische Charakterisierung weiterer Proteine ....................................... 98
4.5.1. ESR-spektroskopische Charakterisierung einer Superoxid Reduktase
aus M. mazei ................................................................................................................. 98
4.5.2. ESR-spektroskopische Charakterisierung von BamBC aus Geobacter
metallireducens ........................................................................................................... 100
5. Diskussion ...................................................................................................................... 103
5.1 Die MHQ-Technik zur Beobachtung des Elektronentransfers innerhalb
des Komplex I aus E. coli ............................................................................................... 103
5.2. Die Bedeutung des Fe-S-Zentrum N1a ..................................................................... 105
5.3 Die mögliche Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransport im
Komplex I ...................................................................................................................... 108
5.4 Der Überexpressionsstamm BW25113 Δnuo pBADnuo nuoFHis ............................... 111
5.5 ESR-Spektroskopische Charakterisierung zwei weiterer Proteine .............................. 111
6. Literatur.......................................................................................................................... 113
Zusammenfassung
1. ZUSAMMENFASSUNG
Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, auch respiratorischer Komplex I genannt, ist ein
energiewandelnder Enzymkomplex der Atmungskette. Der Komplex I koppelt den
Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon mit einer Protonentranslokation über die
Cytoplasmamembran in Prokaryoten und die innere Membran der Mitochondrien in
Eukaryoten. Der Komplex I aus Escherichia coli setzt sich aus 13 Untereinheiten zusammen
und ist aus einem in der Membran eingebetteten, hydrophoben Arm und einem ins
Cytoplasma ragenden, peripheren Arm aufgebaut. Alle bisher bekannten Kofaktoren, ein
Flavinmononukleotid (FMN) und die neun Eisen-Schwefel (Fe-S)-Zentren N1a, N1b, N2, N3,
N4, N5, N6a, N6b und N7, liegen im peripheren Arm. Sieben der neun Fe-S-Zentren bilden
eine Elektronentransportkette zwischen dem FMN, das die Elektronen vom NADH aufnimmt,
und dem Elektronenakzeptor Ubichinon. Das zweikernige Fe-S-Zentrum N1a ist aufgrund
seiner Lage im Komplex nicht Teil der Elektronentransportkette. Es kann Elektronen
ausschließlich vom FMN aufnehmen und wird durch NADH reduziert. Seine Funktion im
Komplex I ist bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde durch Mutagenesestudien gezeigt,
dass N1a essentiell für die Stabilität des Komplex I ist. Der Austausch der Cysteine des
Bindemotivs von N1a gegen Alanine oder Serine führte jeweils zu einem instabilen
Komplex I.
Der Elektronentransfer innerhalb des E. coli Komplex I war das zentrale Thema dieser Arbeit.
Mittels der Microsecond-Hyperquenching Technik und Tieftemperatur ESR-Spektroskopie
wurde die Reduktion der einzelnen Fe-S-Zentren während der Reaktion des Komplex I mit
NADH in einem Zeitfenster von 100 µs bis 6 ms verfolgt. Ein Apparatur-bedingtes Artefakt
im spektralen Bereich der vierkernigen Fe-S-Zentren lässt nur die detaillierte Analyse der
Reduktionskinetik der zweikernigen Fe-S-Zentren N1a und N1b zu. Die Ergebnisse zeigen,
das N1a an der physiologischen Reaktion des Komplex I beteiligt ist. Sie unterstützen die
Vermutung, dass N1a durch die zeitweilige Aufnahme eines Elektrons eine mögliche
Radikalbildung am FMN vermindert und somit zum Schutz des Organismus vor gefährlichen
Radikalen beiträgt. Die Vermutung, dass das erste Elektron vom FMN über die
Elektronentransportkette auf das nahe der Ubichinonbindestelle gelegene N2 und das zweite
Elektron auf N1a übertragen wird, wurde in dieser Arbeit unterstützt.
1
Zusammenfassung
Desweiteren sollte die Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransfer im
Komplex I untersucht werden. Ist der Abstand zwischen zwei Redoxzentren kleiner als 14 Å,
wird eine direkte Elektronenübertragung mit ausreichend hohen Transferraten angenommen.
Bei größeren Abständen sind nach der hopping Theorie aromatische Aminosäuren über ihr лElektronensystem direkt am Elektronentransfer beteiligt. Im Komplex I liegen die Fe-SZentren N5 und N6a mehr als 14 Å voneinander entfernt und sind auf zwei verschiedenen
Modulen lokalisiert, aus denen der Komplex I evolutionär entstanden ist. Die hoppingTheorie schlägt drei konservierte, aromatische Aminosäuren vor, die an diesem
Transferschritt beteiligt sein können. In dieser Arbeit wurden die konservierten, aromatischen
Aminosäuren im E. coli Komplex I gegen Leucin und gegen die jeweils anderen aromatischen
Aminosäuren ausgetauscht. Der Einfluss dieses Austausches auf die Aktivität des Komplex I
wurde bestimmt. Die Ergebnisse unterstützen die hopping Theorie und lassen die Beteiligung
aromatischer Aminosäuren an dem Transferschritt zwischen N5 und N6a vermuten. Weitere
konservierte, aromatische Aminosäuren, die am Elektronentransfer zwischen Fe-S-Zentren
mit Abständen kleiner als 14 Å beteiligt sein sollen, wurden in dieser Arbeit ausgetauscht.
Eine Beteiligung am Elektronentransfer konnte aber experimentell nicht bestätigt werden.
Zwei weitere Metalloproteine wurden in der vorliegenden Arbeit ESR-spektroskopisch
charakterisiert. Das Protein MM0632 aus Methanosarcina mazei wird als Prototyp einer
neuen Klasse von Superoxid Reduktasen, die in anaeroben Organismen am Abbau von
reaktiven Sauersoffspezies beteiligt sind, vorgeschlagen. Durch ESR-Spektroskopie wurden
neben einem für die Enzymfamilie typischen [Fe(His)4(Cys)]-Zentrum erstmalig ein
vierkerniges Fe-S-Zentrum in einer Superoxid Reduktase nachgewiesen. Das Fragment
BamBC aus dem Proteinkomplex BamB-I aus Geobacter metallireducens ist ein Vertreter
einer neuen Klasse von Benzyl-CoA Reduktasen, die in anaeroben Organismen am Abbau
von aromatischen Verbindungen beteiligt sind. Durch ESR-Spektroskopie wurden in dieser
Arbeit neben einem Wolfram-Kofaktor ein dreikerniges und drei vierkernige Fe-S-Zentren
nachgewiesen.
2
Einleitung
2. EINLEITUNG
2.1. Das aerobe Elektronentransportsystem aus E. coli
Bei der oxidativen Phosphorylierung wird die im Katabolismus gewonnene Energie für den
Organismus in Form von ATP nutzbar gemacht. Die bei Glykolyse, Citratzyklus und
Fettsäureoxidation entstandenen energiereichen Reduktionsäquivalente NADH und FADH2
werden durch die Enzyme der Atmungskette oxidiert und die Elektronen in einer Reihe von
Redoxreaktionen auf Sauerstoff übertragen. Die membranständigen Enzyme der Atmungskette koppeln den Elektronentransfer mit dem Aufbau eines Protonengradienten über die
Membran. Die bei den Redoxreaktionen frei werdende Energie wird so in Form eines
Protonengradienten, auch protonenmotorische Kraft (PMK) genannt, gespeichert. Die durch
den Abbau des Gradienten gewonnene Energie wird für die Synthese von ATP durch die
ATP-Synthase und für andere energieverbrauchende Prozesse genutzt (Mitchell & Moyle,
1967). Die gemeinsame Arbeit der Enzyme der Atmungskette und der ATP-Synthase wird als
oxidative Phosphorylierung bezeichnet. Bei Eukaryoten sind die Atmungskettenkomplexe und
die ATP-Synthase in der inneren Membran der Mitochondrien, bei Prokaryoten in der
Cytoplasmamembran lokalisiert.
Escherichia coli ist ein gram-negatives, fakultativ anaerobes Enterobakterium (griech.:
„enteron“ Darm). Es ist in der Lage, seinen Energiebedarf über aerobe und anaerobe
Elektronentransportsysteme zu decken. Das aerobe System hat für die Wissenschaft große
Bedeutung, da Enzymkomplexe des bakteriellen Systems mit denen der Mitochondrien
verwandt sind (Calhoun et al., 1994; Friedrich & Scheide, 2000). Erkenntnisse über die
einfacher aufgebauten und im Labor leichter zugänglichen bakteriellen Proteine lassen sich
auf die mitochondrialen Enzyme übertragen und helfen, durch die humanen Enzyme
hervorgerufenen Dysfunktionen zu verstehen. Das aerobe Elektronentransportsystem aus E.
coli besteht im Wesentlichen aus zwei primären Dehydrogenasen, der NADH:Ubichinon
Oxidoreduktase (NADH Dehydrogenase Typ I, NDH I) und der alternative NADH
Dehydrogenase (NADH Dehydrogenase Typ II, NDH II) und den terminalen ChinolOxidasen, der Cytochrom bo3-Oxidase und der Cytochrom bd-Oxidase. Die Elektronen
werden dabei von NADH erst auf ein Chinon (Q) und dann auf Sauerstoff übertragen
(Abb. 2-1). Die in Analogie zum mitochondrialen Enzym auch als Komplex I bezeichnete
NDH I und die beiden terminalen Oxidasen sind energiewandelnde Enzyme, dabei ist die
3
Einleitung
Anzahl der pro Elektron transportierten Protonen bei der bo3-Oxidase doppelt so hoch wie bei
der Cytochrom bd-Oxidase (Anraku & Gennis, 1987; Weiss et al., 1991; Puustinen et al.,
1991;
Walker,
unterschiedlicher
1992;
Abb.
2-1).
Energieausbeute
Die
Kombination
ermöglichen
E.
von
coli
Enzymkomplexen
mit
abhängig
den
von
Wachstumsbedingungen einerseits eine optimierte ATP-Synthese und andererseits eine
schnelle Reoxidation des NADH. Unter aeroben Bedingungen sind hauptsächlich die
alternative Dehydrogenase und die bo3-Oxidase aktiv, unter mikroaeroben Bedingungen der
Komplex I und die bd-Oxidase (Unden et al, 2002).
Abbildung 2-1: Schematische Darstellung der aeroben Elektronentransportkette aus E. coli. Die
blauen Kästen stellen die primären Dehydrogenasen, die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH I)
und die alternative NADH Dehydrogenase (NDH II), die roten Kästen die beiden terminalen Oxidasen
dar. In gelb ist das lipophile Ubichinon gezeigt. Die Pfeile geben die Richtung der
Elektronenübertragung von NADH auf Sauerstoff (O2) an. In grün ist das für die NDH I spezifische
künstliche Substrat Desamino-NADH gekennzeichnet.
Die alternative NADH Dehydrogenase besitzt eine zehnfach geringere Affinität zu NADH als
der Komplex I und eine tausendfach geringere Affinität zu dem künstlichen Substrat
Desamino-NADH (d-NADH). Bei enzymatischen Tests mit E. coli Membranen bietet
d-NADH die Möglichkeit die Aktivitäten der beiden NADH Dehydrogenasen zu
unterscheiden (Matsushita et al, 1987).
4
Einleitung
2.2. Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I)
Die membranständige NADH:Ubichinon Oxidoreduktase ist der Haupteintrittspunkt von
Elektronen in die Atmungskette. Das Enzym katalysiert die Elektronenübertragung von
NADH auf Ubichinon (Q) und koppelt diesen Prozess mit dem Aufbau eines
Protongradienten. Pro übertragenenden Elektronenpaar werden vier Protonen von der
negativen Innenseite auf die positive Außenseite der Membran transportiert (Weiss et al,
1991; Walker, 1992). Gleichung 2-1 zeigt die Reaktionsgleichung des Komplexes, dabei
stehen
bzw.
für die Protonen auf der negativen Innenseite bzw. auf der positiven
Außenseite der Membran.
21
Die eukaryotische NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, auch Komplex I genannt, besteht aus
bis zu 45 Proteinuntereinheiten, hat eine Masse von etwa 1 MDa und enthält als Kofaktoren
ein FMN und acht Fe-S-Zentren (Hirst et al, 2003; Carroll et al, 2006). Die bakterielle
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) setzt sich in den meisten Organismen aus 14
Untereinheiten zusammen, hat eine Masse von etwa 500 kDa und enthält ein FMN und bis zu
zehn Eisen-Schwefel (Fe-S)-Zentren (Friedrich et al, 1995; Sazanov & Hinchliffe, 2006).
Homologe der 14 sogenannten Kernuntereinheiten wurden in bisher allen Organsimen mit
einer funktionellen NADH:Ubichinon Oxidoreduktase nachgewiesen (Friedrich & Scheide,
2000). Zudem besitzen der bakterielle und der mitochondriale Komplex I die gleichen
Kofaktoren für den Elektronentransport und werden durch die gleichen Hemmstoffe wie z.B.
Rotenon und Piericidin A gehemmt (Friedrich et al, 1994; Degli Esposti, 1998). Der für
Mutagenesestudien zugängliche bakterielle Komplex I stellt ein strukturell einfacheres Modell
für den mitochondrialen Komplex I dar. Dysfunktionen im Komplex I führen beim Menschen
zu neurodegenerativen Erkrankungen wie zum Beispiel der Parkinson´schen und
Alzheimerschen Erkrankung. (Lin & Beal, 2006; Rhein et al., 2009). Zudem ist der Komplex
I eine Quelle von reaktiven Sauerstoffspezies (engl.: reactive oxygen species; ROS) und somit
vermutlich am Alterungsprozess beteiligt (Galkin & Brandt, 2005; Kussmaul & Hirst, 2006;
Lin & Beal, 2006).
Der Komplex I aus E. coli ist auf dem 15„020 bp großen nuo-Operon (von NADH:Ubichinon
Oxidoreduktase) durch die Gene nuoA bis nuoN kodiert (Weidner et al., 1993). Die Gene
5
Einleitung
nuoC und nuoD sind fusioniert, so dass sich der E. coli Komplex I aus 13
Proteinuntereinheiten mit einer Gesamtmasse von 535 kDa zusammensetzt (Friedrich, 1998).
Aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ist bekannt, dass der Komplex I eine L-förmig
Überalles-Struktur besitzt: ein Arm ragt ins Cytoplasma, der andere ist in die Membran
eingebettet (Guenebaut et al., 1998). Dabei bilden die hydrophilen Untereinheiten NuoB,
NuoCD, NuoE, NuoF, NuoG und NuoI den peripheren Arm und die hydrophoben
Untereinheiten NuoA, NuoH, NuoJ, NuoK, NuoL, NuoM und NuoN den Membranarm. Alle
bisher bekannten Kofaktoren, das FMN und die neun Fe-S-Zentren N1a, N1b, N2, N3, N4,
N5, N6a, N6b und N7 liegen im peripheren Teil des Enzyms (Friedrich, 1998).
Erst 2010 wurden die ersten Kristallstrukturen des gesamten Komplex I veröffentlicht, die
Struktur des Komplex I aus Thermus thermophilus wurde bei einer Auflösung von 4.5 Å
bestimmt
(Efremov
et
al,
2010;
Abb.
2-2).
In
Übereinstimmung
mit
den
elektronenmikroskopischen Daten zeigt die Struktur einen etwa 180 Å langen Membranarm
aus 63 transmembranen Helices und einen senkrecht dazu angeordneten peripheren Arm, der
etwa 130 Å über die Membranebene herausragt. Die Struktur des peripheren Armes des
Enzyms aus dem gleichen Organismus wurde bereits 2006 mit einer Auflösung von 3.3 Å
gelöst (Sazanov & Hinchliffe, 2006, Abb. 2-2) und die Auflösung durch weitere Arbeiten auf
3.1 Å verbessert (Berrisford & Sazanov, 2009). Sie zeigt die sieben hydrophilen
Untereinheiten des bakteriellen Komplex I, die nach der T. themophilus Nomenklatur als
Nqo1 bis Nqo6 und Nqo9 bezeichnet werden. Die Struktur gibt Aufschluss über die Lage der
NADH-Bindestelle, des nicht-kovalent gebundenen FMN und der neun Fe-S-Zentren. Dabei
bilden sieben Fe-S-Zentren in der Reihenfolge N3 → N1b → N4 → N5 → N6a → N6b →
N2 eine Elektronenübertragungskette zwischen dem FMN in der NADH Bindestelle und einer
Position in der Nähe des Membranarms, an der die Ubichinonbindestelle vermutet wird. Die
beiden Fe-S-Zentren N1a und N7 liegen abseits dieser Kette (Kap. 2.2.1.). Die Struktur
enthält zusätzlich die hydrophile Untereinheit Nqo15. Homologe dieser Untereinheit sind
jedoch nur in sehr nahen Verwandten von T. thermophilus enthalten (Sazanov & Hinchliffe,
2006). Nqo15 gehört zu der Familie der Frataxine, die vermutlich die Assemblierung von FeS-Zentren unterstützen (Stemmler et al., 2010). Das Frataxin-Ortholog in E. coli ist CyaY und
kein struktureller Bestandteil des Komplex I. Die Deletion von cyaY hat in E. coli keinen
Effekt auf die Assemblierung und die Aktivität des Komplex I (Pohl et al., 2007a). Die
Verbindung des peripheren Arms mit dem Membranarm erfolgt über die Untereinheiten Nqo4
(NuoD-Domäne der Untereinheit NuoCD) und Nqo6 (NuoB) im hydrophilen Teil und
6
Einleitung
hauptsächlich durch Nqo8 (NuoH) im Membranarm. Die Untereinheiten Nqo7, 10 und 11
(NuoA, J, K) des Membranarms liegen in enger Nachbarschaft und sind vermutlich mit dem
N-Terminus von Nqo4 in Kontakt. Sie tragen damit auch zur Verbindung von peripheren Arm
und Membranarm bei. Die Elektronendichten in diesem Bereich waren jedoch nicht
ausreichend, um die Kontaktfläche strukturell zu bestimmen. Die Struktur enthält kein
gebundenes Ubichinon, die genaue Lage der Ubichinonbindestelle ist also unbekannt.
Vermutlich liegt sie in einem Hohlraum im Bereich der Kontaktfläche zwischen der
Untereinheit Nqo6 (NuoB) und Nqo4 (NuoD-Domäne der Untereinheit nuoCD). Diese
Vermutungen werden unterstützt durch die veränderte Inhibitorsensivität von Mutationen in
diesem Bereich des Komplex I aus Rhodobacter capsulatus und Yarrowia lipolytica (Prieur et
al., 2001; Fendel et al., 2008). Aus Abstandsmessungen mit einem Spin-markierten Komplex
I aus E. coli und einem ebenfalls markierten Decyl-Ubichinon mittels ESR-Spektroskopie
ergab sich ein Abstand von etwa 15 Å zwischen dem hydrophoben Alkylrest des Ubichinons
und des Fe-S-Zentrums N2 (Spatzal et al., 2010). Dies steht im Einklang mit der vermuteten
Position der Ubichinonbindestelle.
A)
B)
Nqo1
(NuoF)
Nqo3
(NuoG)
Nqo2
(NuoE)
Nqo5
(NuoC)
Nqo4
(NuoD)
Nqo2
Nqo3
FMN
Nqo1
Nqo15
Nqo9 (NuoI)
Nqo15
Nqo5
Nqo6 (NuoB)
Nqo9
Nqo8 (NuoH)
Nqo6
Nqo12
(NuoL)
Nqo13
(NuoM)
Nqo14
(NuoN)
Nqo7, 10, 11
(NuoA, J, K)
Nqo4
Abbildung 2-2: Kristallstruktur des Komplex I aus T. thermophilus. A) zeigt die Struktur des gesamten
Komplexes mit einer Auflösung von 4.5 Å (Efremov et al., 2010) und B) zeigt die Struktur des hydrophilen
Arms mit einer Auflösung von 3.3 Å (Sazanov & Hinchliffe, 2006). Die Untereinheiten sind farblich
unterschiedlich gekennzeichnet und nach der T. thermophilus Nomenklatur (E. coli Nomenklatur) benannt. Die
Fe-S-Zentren sind als gelb-rote Sphären gezeigt, das FMN in magenta, die vermutete Lage der
Ubichinonbindestelle ist mit einem Q gekennzeichnet.
7
Einleitung
Neben der Gesamtstruktur des T. thermophilus Komplex I wurde auch die Struktur des
Membranarms aus E. coli mit einer Auflösung von 3.9 Å gelöst (Efremov et al, 2010;
Abb. 2-3). Die E. coli Struktur wurde benutzt, um durch molecular replacement den
hydrophoben Teil der Gesamtstruktur aus T. themophilus zu lösen. Im Folgenden wird der
Membranarm anhand der E. coli Struktur beschrieben. Sie zeigt die sechs hydrophoben
Untereinheiten NuoA, NuoJ, NuoK, NuoL, NuoM, und NuoN. Die ebenfalls zu dem
Membranarm zählende Untereinheit NuoH fehlt in dem Kristall. Die Auflösung von 3.9 Å
lässt die Anordnung von insgesamt 55 transmebranen α-Helices erkennen, die sich über eine
Länge von 160 Å erstrecken. Die Höhe des Arms beträgt 40 Å, was der Dicke der
cytoplsmatischen Membran entspricht. Die Untereinheiten NuoL, M und N sind homolog
zueinander und werden jeweils aus 14 transmembranen Helices aufgebaut, vier Helices bilden
dabei einen Kern, der von den übrigen zehn Helices ringförmig umgeben ist. An den
homologen Positionen dieser Untereinheiten befinden sich jeweils zwei Helices, die auf
halber Höhe durch einen kurzen loop unterbrochen sind. Diese diskontinuierlichen Helices
werden als funktionell wichtiger Bestandteil für Transporterproteine und Kanäle angenommen
(Screpanti & Hunte, 2007). Es wird deshalb diskutiert, dass diese drei Untereinheiten für den
Protonentransport verantwortlich sind. Das steht im Einklang zu früheren Erkenntnissen, dass
NuoL, M und N homolog zu Untereinheiten der H+/Na+ bzw. H+/K+-Antiportern sind
(Friedrich & Scheide, 2000; Mathiesen & Hägerhäll, 2002). Die homologen Untereinheiten
wurden in der Struktur aufgrund von elektronenmikroskopischen Aufnahmen von
Subkomplexen ohne die Untereinheiten NuoL und NuoM zugeordnet (Baranova et al., 2007).
Die Aufnahmen zeigen, dass diese beiden Untereinheiten am distalen Ende des Membranarms
liegen. Auffallend ist eine lange α-Helix, die als HL bezeichnet wird. Sie erstreckt sich über
110 Å entlang des Membranarms und zeigt in der Mitte einen Knick. Sie wurde anhand von
Sequenzvergleichen der C-terminalen Domäne der distal gelegenen Untereinheit NuoL
zugeordnet und endet auf Höhe der Untereinheit NuoN mit einer weiteren transmembranen
Helix. Dieses ungewöhnliche Strukturmerkmal koppelt vermutlich den Elektronentransfer im
peripheren Arm mit der in mehr als 100 Å entfernt gelegenen Protonentranslokation im
Membranarm. Diese Vermutung wird durch eine E. coli Komplex I Variante, der die
Untereinheit NuoL fehlt, unterstützt (S. Steimle, pers. Mitteilung). Die Variante enthält alle
ESR-spektroskopisch detektierbaren Fe-S-Zentren, die NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktase Aktivität ist unverändert, aber die Protonentranslokation ist in etwa halbiert.
8
Einleitung
A)
NuoL
NuoM
NuoN
NuoA, J, K
B)
Abbildung 2-3: Kristallstruktur des Membranarms des Komplex I aus E. coli (Efremov et al., 2010). A)
zeigt die Seitenansicht in der Membranebene, B) die Aufsicht aus Richtung des peripheren Arms. Die einzelnen
Untereinheiten sind farblich markiert, die hydrophobe Untereinheit NuoH fehlt in der Struktur. Die
diskontinuierlichen Helices jeder Untereinheit sind orange und bei Kontakt mit der HL-Helix rot dargestellt.
Nur wenige Monate nach der Veröffentlichung des Gesamtstruktur des bakteriellen Komplex
I wurde die Gesamtstruktur des mitochondrialen Komplex I aus Y. lipolytica mit einer
Auflösung von 6.3 Å veröffentlicht (Hunte et al., 2010; Abb. 2-4). Auch in diesem
Organismus liegt der Komplex L-förmig vor. Der Membranarm hat eine Länge von 180 Å
und insgesamt 71 transmembrane α-Helices wurden modelliert. Der periphere Arm enthält
alle bekannten Fe-S-Zentren, deren Lage und deren Abstände denen im bakteriellen Komplex
ähneln. Im Membranarm wurden ebenfalls diskontinuierliche, transmembrane Helices
beschrieben. Außerdem wurde parallel zum Membranarm auf einer Länge von 60 Å eine
Elektronendichte beobachtet, die vermutlich einer α-Helix zuzuordnen ist und der langen HLHelix der Untereinheit NuoL des bakteriellen Komplex I entspricht. Das unterstützt die
Vermutung, dass diese Helix eine entscheidende Rolle bei der
Kopplung von
Elektronentransfer und Protonentranslokation spielt. Aufgrund dieser Daten wurde der
Mechanismus des Komplex I mit einer Dampflok verglichen (Efremov et al, 2010).
9
Einleitung
Abbildung 2-4: Kristallstruktur des Komplex I aus Y. lipolytica (Hunte et al., 2010). A) zeigt die
Elektronendichtekarte des Komplexes, die Lage der Fe-S-Zentren ist vergrößert dargestellt. B) zeigt das helikale
Model des Membranarms mit Blick auf die Membran, C) die seitliche Ansicht. Zur Orientierung ist die Lage der
Fe-S-Zentren angegeben. Die beiden Domänen des mitochondrialen Komplex I sind farblich unterschieden, die
lange Helix entlang des Arms ist in violett gezeigt.
Phylogenetische Studien zeigen, dass der Komplex I evolutionär aus einem NADH
Dehydrogenase Modul, einem Hydrogenasemodul und einem Transportermodul entstanden ist
(Friedrich & Weiss, 1997; Abb. 2-5). Durch Erhöhung des pH-Wertes und Wechsel des
Detergenz zerfällt der Komplex in drei Fragmente, das NADH Dehydrogenase Fragment, das
verbindende Fragment und das Membranfragment. Die Fragmente entsprechen in ihrer
Untereinheiten-Zusammensetzung in etwa derer der drei Module (Leif et al., 1995). Das
NADH Dehydrogenasemodul, das mit dem NADH Dehydrogenase Fragment identisch ist,
setzt sich aus den Untereinheiten NuoE, NuoF und NuoG zusammen und bildet den
Elektroneneingang des Enzyms. Es enthält die NADH-Bindestelle, das FMN und das
vierkernige Fe-S-Zentrum N3 auf der Untereinheit NuoF, das zweikernige Fe-S-Zentrum N1a
auf der Untereinheit NuoE sowie das zweikernige Zentrum N1b und die vierkernigen Fe-SZentren N4, N5 und N7 auf der Untereinheit NuoG. Homologe dieser Untereinheiten sind in
vielen, nicht energiewandelnden NAD(P)H abhängigen Hydrogenasen und Dehydrogenasen
zu finden (Friedrich et al., 1995; Tersteegen & Hedderich, 1999). Das Hydrogenase-Modul
setzt sich aus den Untereinheiten NuoB, NuoCD, NuoH, NuoI und NuoN zusammen, es
enthält die vierkernigen Fe-S-Zentren N6a, N6b und N2 und die Ubichinonbindestelle. Es ist
homolog zu multimeren, membranständigen Ni/Fe-Hydrogenasen, die als redoxgetriebene
10
Einleitung
Ionenpumpen arbeiten (Friedrich & Scheide, 2000). Die Untereinheiten NuoA, NuoJ, NuoK,
NuoL und NuoM bilden das Transportermodul, der Name ergibt sich aus der Homologie der
Untereinheiten NuoL und NuoM zu Untereinheiten der H+/Na+ bzw. H+/K+-Antiportern
(Friedrich & Scheide, 2000; Mathiesen & Hägerhäll, 2002).
Abbildung 2-5: Modularer Aufbau des Komplex I aus E. coli. Das NADH Dehydrogenase Modul ist in gelb
gezeigt, das Hydrogenase Modul in rot und das Transportemodul in blau. Die Lage der NADH- und
Ubichinonbindestelle und der Fe-S-Zentren und die Wege der Protonen sind angedeutet. Die Membran ist
schematisch in grau gezeigt.
2.2.1. Elektronentransfer im Komplex I
Seit der Veröffentlichung der Struktur des peripheren Arms aus T. thermophilus ist die Lage
der Fe-S-Zentren im Komplex I bekannt (Abb. 2-6). Die aus der Struktur ersichtlichen
Abstände zwischen den Kofaktoren lassen vermuten, dass die Fe-S-Zentren eine
Elektronentransportkette zwischen dem FMN, das die Elektronen vom NADH aufnimmt, und
der Ubichinonbindestelle bilden. Das Fe-S-Zentrum N7 liegt 20.5 Å von den anderen Zentren
entfernt und ist nicht Teil der Kette. Aus ESR-spektroskopischen Experimenten ist bekannt,
dass N7 durch das Substrat NADH nicht reduziert wird, was eine Beteiligung am
11
Einleitung
Elektronentransport unwahrscheinlich macht. Nur durch chemische Reduktion mit Dithionit
wurden ESR-Signale dieses Zentrums detektiert (Tab. 2-1). Mutagenesestudien am
Bindemotiv auf der Untereinheit NuoG haben gezeigt, dass N7 wichtig für die Stabilität des
Komplex I ist (Pohl et al., 2007b).
Abbildung 2-6: Lage der Fe-S-Zentren im peripheren Arm des Komplexes I aus T. thermophilus (PDB ID:
2FUG; Sazanov und Hinchliffe, 2006). Die Zentren sind als sphärische Kugeln dargestellt und anhand ihrer
ESR-Spektren zugeordnet. Angegeben sind die Abstände zwischen den Mittelpunkten bzw. zwischen den
Kanten (Werte in Klammern) der Fe-S-Zentren in Å. Die Pfeile markieren den angenommenen
Elektronenübertragungsweg.
Tabelle 2-1 gibt eine Übersicht über die durch ESR-Spektroskopie nachgewiesenen Fe-SZentren und ihrer Mittenpunktspotentiale des Komplex I aus E. coli. Die Signale der
zweikernigen Fe-S-Zentren N1a und N1b sind bei 40 K im ESR-Spektrum sichtbar, die
Signale der schneller relaxierenden vierkernigen Fe-S-Zentren werden bei 13 K detektiert.
Das auf der Untereinheit NuoG koordinierte Fe-S-Zentrum N5 wurde bisher nur in einem
rekombinanten Fragment des Komplexes nachgewiesen und ist vermutlich ein sehr schnell
relaxierendes Zentrum und damit ESR-spektroskopisch schwierig nachzuweisen (Nakamaru12
Einleitung
Ogiso et al., 2008). Im Komplex I aus Paracoccus denitrificans besitzt N5 ein
Mittenpunktspotential von -250 mV (Yano et al., 2003). Die beiden auf der Untereinheit NuoI
koordinierten Fe-S-Zentren N6a und N6b wurden im E. coli Komplex I UV-vis
spektroskopisch nachgewiesen, die Mittenpunktspotentiale liegen jeweils bei -270 mV
(Rasmussen et al., 2001). ESR-Spektren des verbindenden Fragmentes aus den Untereinheiten
NuoB, NuoCD und NuoI zeigen ein breites, axiales Signal (gx = 1.89, gy = 1.91 und gz = 2.09;
Rasmussen et al., 2001), das den Fe-S-Zentren N6a oder N6b zugeordnet wird (Ohnishi &
Nakamura-Ogiso, 2008). In einer weiteren Veröffentlichung wurde dieses Signal im gesamten
Komplex I aus E. coli nachgewiesen, die zugehörige Präparation ist jedoch nach Angaben der
Autoren mit der Succinat Dehydrogenase und einem weiteren Fe-S-Zentrum haltigen Protein
verunreinigt, die ebenfalls zu Signalen in dem betreffenden spektralen Bereich führten
(Belevich et al., 2007).
Tabelle 2-1: ESR-spektroskopisch nachgewiesene Fe-S-Zentren im Komplex I aus E. coli. Die Werte der
Mittenpunktspotentiale und die g-Werte wurden folgenden Veröffentlichungen entnommen: Leif et al, 1995;
Uhlmann & Friedrich 2005; Pohl et al., 2007b).
.
Fe-SZentrum
Koordinierende
Untereinheit
Mittenpunktpotential
[mV]
Feldposition
gx
gy
gz
N1a
NuoE
-330
1.92
1.96
2.00
N1b
NuoG
-230
1.94
1.94
2.03
N2
NuoB
-220*
1.91
1.91
2.05
N3
NuoG
-270
1.88
1.92
2.04
N4
NuoG
-270
1.89
1.93
2.09
N7
NuoG
~ -250
1.89
1.95
2.05
*Das Mittenpunktspotential von N2 ist pH-abhängig, dieser Wert wurde bei pH 7.0
gemessen (Flemming et al., 2006).
Die Zuordnung der Signale zu den einzelnen Fe-S-Zentren in dieser Arbeit und auch die
Benennung der Zentren in der Kristallstruktur erfolgten nach Ohnishi (Ohnishi, 1998; Ohnishi
& Nakamura-Ogiso, 2008). Seit einigen Jahren wird die Zuordnung intensiv diskutiert. Hirst
und Mitarbeiter schließen aus dem Vergleich der ESR-Signale der isolierten E. coli
Untereinheit NuoG im Vergleich zum Gesamtkomplex und aus Doppel-ElektronenElektronen-Resonanz (DEER)-spektroskopischen Experimenten, dass das dem auf NuoG
liegenden N4 zugeordnete Signal eigentlich dem auf NuoI liegenden N6a zuzuordnen ist. Das
13
Einleitung
nur in einem Fragment detektierte und dem Fe-S-Zentrum N5 auf der Untereinheit NuoG
zugeordnete Signal, ordnet diese Arbeitsgruppe dem Fe-S-Zentrum N4 zu (Yakovlev et al.,
2007; Roessler et al., 2010). Die genaue Zuordnung der Signale zu den einzelnen Fe-SZentren muss noch geklärt werden.
Aus der Lage und den Mittenpunktspotentialen der Kofaktoren lässt sich der wahrscheinliche
Weg der Elektronen durch den Komplex I ableiten. Das FMN nimmt zwei Elektronen vom
NADH auf und bildet einen Schalter zwischen dieser Zwei-Elektronenübertragung und den
Ein-Elektronenübertragungen auf die Fe-S-Zentren. Für die Abgabe des ersten Elektrons
(FMNH·/ FMNH2) liegt das Mittenpunktpotential bei -300 mV (Sled et al., 1994; Kussmaul
et al., 2006), damit wird das erste Elektron vermutlich auf N3 (-270 mV) und dann weiter
über die Kette auf N2 (-220mV) übertragen, eine Übertragung auf N1a ist wegen seines
niedrigen Mittenpotentials (-330 mV) unwahrscheinlich. Diese ist erst bei der Übertragung
des zweiten Elektrons möglich, da das Mittenpunktspotential des FMN/FMNH·-Paares bei
-390 mV liegt (Sled et al., 1994; Kussmaul et al., 2006). Vermutlich wird das zweite Elektron
dann von N1a über das FMN auf N3 übertragen, nachdem das Zentrum N3 reoxidiert wurde,
und durchläuft so auch die Kette bis N2. Diese zeitweilige Übertragung des Elektrons auf N1a
könnte die Bildung eines Radikals am FMN vermeiden. Die Funktion des N1a wäre also die
Verminderung der ROS-Bildung am Komplex I und damit hätte das Fe-S-Zentrum eine
wichtige Schutzfunktion für den Organismus gegen die Bildung der gefährlichen
Sauerstoffradikale. Es ist bekannt, dass der Komplex I für die Bildung von ROS
verantwortlich ist und das solvensexponierte FMN wird als ein Ort der Entstehung diskutiert
(Kussmaul & Hirst, 2006; Esterhazy et al., 2008; Berrisford & Sazanov, 2009).
Die Abstände zwischen den Kanten der einzelnen Fe-S-Zentren sind alle kleiner 14 Å und
liegen damit in einem Bereich, der eine direkte Elektronenübertragung zulässt (Page et al.,
1999). Eine Ausnahme bildet der Abstand zwischen den Zentren N5 und N6a (14 Å von
Kante zu Kante, 16.9 Å zwischen den Mittelpunkten), er liegt damit an der Grenze, die eine
direkte Elektronenübertragung wahrscheinlich macht (Kap. 2.3.). Grund für diesen großen
Abstand ist vermutlich die Tatsache, dass die beiden Zentren auf unterschiedlichen Modulen
liegen und dieser Übertragungsweg evolutionär aus der Anlagerung zweier Proteine
entstanden ist (Friedrich & Weiss, 1997).
14
Einleitung
Während dieser Arbeit wurden Kinetiken über die Elektronenübertragung innerhalb des
Komplex I aus E. coli veröffentlicht (Verkhovskaya et al., 2008). Es wurden Zeitkonstanten
von 90 µs für die Elektronenübertragung auf das Fe-S-Zentrum N1a und das am Ende der
Elektronentransportkette liegende N2 bestimmt, die einer Übertragung der Elektronen vom
ersten gebundenen NADH Molekül zugeordnet werden. Außerdem wurden Zeitkonstanten
von 1.2 ms für das zweikernige Fe-S-Zentrum N1b und das vierkernige Fe-S-Zentrum N6b
bestimmt. Diese wurden der Übertragung von einem zweiten NADH Molekül zugeordnet, das
gebunden wurde, nachdem NAD+ die Bindestelle verlassen hatte. Da aber keine Übertragung
der Elektronen auf ein in der Präparation vorliegendes Ubichinon detektiert wurde, ist
fraglich, ob tatsächlich die physiologische Reaktion beobachtet wurde.
2.2.2. Überproduktion des Komplex I und seiner Varianten in E. coli
Das Plasmid pBADnuo nuoFHis enthält das gesamte nuo-Operon und kodiert zudem ein
Hexahistidin-Affinitätspeptid (His-Tag) N-terminal an der Untereinheit NuoF (Pohl et al.,
2007c). Im Expressionstamm ANN0221 wurde auf dem Genom in das Gen nuoB eine nptIKassette, die eine Kanamycin Resistenz vermittelt, insertiert. Zudem ist das Gen ndh, das die
alternative NADH Dehydrogenase kodiert, durch eine tet-Kassette, die eine Tetracyclin
Resistenz vermittelt, ausgetauscht. Dieser Stamm ist also weder in der Lage, den Komplex I
noch die alternative Dehydrogenase zu produzieren (Spehr, 1996). Die Transformation des
Stammes ANN0221 mit dem Plasmid pBADnuo nuoFHis liefert ein System zur Überproduktion des Komplex I, der anschließend effizient mittels Affinitätschromatographie
gereinigt werden kann. Durch Einfügen von Mutationen in das Plasmid pBADnuo nuoFHis ist
es mit diesem System möglich, Varianten des Komplex I zu produzieren (Pohl et al., 2007c).
Aufgrund seiner Größe von mehr als 20 kbp ist es nicht möglich in das Plasmid pBADnuo
nuoFHis mittels der QuikChange Methode direkt Punktmutationen einzufügen. Aus diesem
Grund werden Mutationen erst in die einzelnen nuo-Gene die auf Plasmiden mit einer Größe
von 4-7 kbp liegen, eingefügt und die mutierten Gene dann mittels λ-Red vermittelter
Rekombination (Murphy, 1998; Datsenko & Wanner, 2000) in pBADnuo nuoFHis
eingebracht. Dafür werden Zellen des Stammes DH5αΔnuo (Pohl, 2008) verwendet. Diesen
Zellen fehlt das gesamte nuo-Operon im Genom, bei der Rekombination findet also nur ein
Strangaustausch mit der Zielsequenz auf dem Plasmid statt. Für die Selektion wird das nptI15
Einleitung
sacR-sacB Selektionssystem genutzt (Ried und Collmer, 1987). Das nptI Gen vermittelt eine
Kanamycin Resistenz und ist somit ein positiver Selektionsmarker. Das sacB-Gen aus Bacillus
subtilis kodiert für die Levansucrase, ein Enzym, das Saccharose in Levan umbaut. Levan
akkumuliert in den Zellen und führt zur Zelllyse (Gay et al., 1985). Gram-negative Bakterien, die
diesen negativen Selektionsmarker zusammen mit seinem Regulator sacR enthalten, können nicht
auf Saccharose-haltigen Medien wachsen. Nutzt man dieses Selektionssystem, um die Ausbeute
an gewünschten Mutationen pro Absatz zu erhöhen, sind zwei Rekombinationsschritte notwendig:
Im ersten Schritt wird das entsprechende nuo-Gen gegen die nptI-sacB-Kassette ausgetauscht
und
positive
Klone
auf
Kanamycin
haltigem
Medien
selektiert.
Im
zweiten
Rekombinationsschritt wird die nptI-sacB-Kassette durch das mutierte Gen ersetzt, die
Selektion erfolgt auf Saccharose-haltigem Medium.
2.3. Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransport
Der Elektronentransport in Proteinen ist für viele energiewandelnde, biologische Prozesse,
wie zum Beispiel der aeroben Atmung oder der Photosynthese, von essentieller Bedeutung.
Welche Rolle das Protein selbst dabei spielt, wird seit Mitte des 20. Jahrhunderts diskutiert
(Gray & Winkler, 2003). Prinzipiell unterscheidet man zwischen dem through-bond Transfer,
bei dem die Elektronen über б-Bindungen zwischen den Redoxzentren wandern, und dem
through-space Transfer, bei dem die Elektronen von Redoxzentrum zu Redoxzentrum
tunneln. Die Theorie des through-space Transfers hat sich zur Beschreibung der
Elektronenübertragung in Proteinen allgemein durchgesetzt. Ihr liegt die Marcus-Theorie zu
Grunde, die den Transfer von Elektronen zwischen einem Akzeptor und einem Donor
beschreibt, die nicht über eine chemische Bindung miteinander verbunden sind. Die
Wechselwirkungen der relevanten Molekülorbitale der einzelnen Kofaktoren sind also so
schwach, dass die Elektronen zum Tunneln gezwungen werden, das Protein bildet dabei
lediglich die Tunnelbarriere. Die Arbeitsgruppe von Dutton hat diese Theorie so weit
vereinfacht, dass die Übertragungsrate nur noch vom Abstand zwischen den beiden
Redoxzentren beschrieben wird. Die Elektronen werden nach diesen Berechnungen
unabhängig von der Proteinumgebung über eine Entfernung von bis zu 14 Å zwischen den
Redoxpartnern übertragen (Page et al., 1999). Ergänzend zu dieser Theorie wird diskutiert,
dass auch aromatische Aminosäuren der Proteine am Elektronentransport beteiligt sind. Diese
als hopping bezeichnete Theorie nimmt an, dass die Elektronen nicht nur auf den im Protein
16
Einleitung
koordinierten Redoxzentren lokalisiert sind, sondern zusätzlich in den л-Elektronensystemen
aromatischer Aminosäuren. Dadurch werden auch Elektronenübertragungen zwischen
Redoxzentren mit einem Abstand von mehr als 14 Å wahrscheinlich (Stubbe et al., 2003;
Shih et al., 2008; Wittekindt et al., 2009). In der Literatur sind mehrere Beispiele zu finden, in
denen die Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransport diskutiert wird. In
der Klasse I Ribonukleotid Reduktase aus E. coli aktiviert ein Cystein auf der Untereinheit α2
ein Tyrosylradikal auf der Untereinheit β2, das 35 Å entfernt liegt. Die Elektronen werden
über diese große Distanz vermutlich über ein Tryptophan und drei Tyrosinreste übertragen
(Rova et al., 1999; Stubbe et al., 2003; Seyedsayamdost et al., 2007; Bollinger, 2008). Ein
weiteres Beispiel ist ein modifiziertes Azurin aus Pseudomonas aeruginosa, in dem durch
Einfügen eines Tryptophanrestes die Elektronenübertragungsrate um das 300-fache gesteigert
wurde (Shih et al., 2008). Auch in der bakteriellen Cytochrom c Peroxidase weisen
strukturelle und spektroskopische Untersuchungen in Verbindung mit Mutagenese-Studien
daraufhin, dass ein Tryptophan am Elektronentransport zwischen zwei Häm-Gruppen beteiligt
ist (Dias et al., 2004; De Smet et al., 2006).
Die Elektronentransferraten der einzelnen Übertragungsschritte im Komplex I wurden sowohl
mit der Theorie des Tunnelns (Moser et al., 2006), als auch mit der Theorie des hoppings
(Wittekindt et al., 2009) berechnet. Nach Moser et al. erlauben die Abstände der einzelnen
Fe-S-Zentren ein direktes Tunneln der Elektronen mit Transferraten, die mit der experimentell
bestimmten Gesamtrate des Proteins im Bereich von 100 s-1 übereinstimmen. Nach Wittekindt
et al. lässt sich die experimentell bestimmte Transferrate des Gesamtprozesses nur unter
Beteiligung von aromatischen Aminosäuren erklären. Berechnungen unter Annahme des
through-space Mechanismus führten zu Transferraten zwischen den Fe-S-Zentren N5 und
N6a von 2.2 * 10-4 s-1, die nicht mit dem experimentellen Wert in Einklang zu bringen sind.
Werden jedoch konservierte, aromatische Aminosäuren als hopping-Partner zwischen den FeS-Zentren in die Rechnung miteinbezogen, erhöht sich die Transferrate für diesen Schritt auf
2 * 103 s-1. Aufgrund der Berechnungen und mit Hilfe der Struktur des hydrophilen Teils des
Komplex I aus T. thermophilus werden sieben, konservierte aromatische Aminosäuren als
hopping Partner vorgeschlagen (Wittekindt et al., 2009; Abb. 2-7), vier davon liegen
zwischen den Fe-S-Zentren N5 und N6a. Experimentelle Mutagenesestudien liegen zu diesem
Thema bisher nicht vor. Der in einem anderen Zusammenhang untersuchte Austausch des
konservierten Histidins zwischen N5 und N6a gegen ein Alanin im Komplex I
aus Y.
17
Einleitung
lipolytica führte zu einer 50%igen Erniedrigung der Aktivität des Komplex I im Vergleich
zum unveränderten Protein (Kashani-Poor et al., 2001).
Abbildung 2-7: Die Lage der Fe-S-Zentren des Komplex I und der nach der hopping Theorie
möglicherweise am Elektronentransport beteiligten aromatischen Aminosäuren. Die Fe-S-Zentren sind als
sphärische Kugeln dargestellt und die Aminosäuren nach der T. thermophilus Nomenklatur benannt (PDB ID:
2FUG; Sazanov und Hinchliffe, 2006). Die Pfeile markieren den angenommenen Elektronenübertragungsweg.
2.4. Die Microsecond Hyper-Quenching (MHQ)-Technik
Zum Verständnis biologischer Prozesse ist neben der Kenntnis der Struktur der beteiligten
Enzyme deren Reaktionskinetik von großer Bedeutung. Eine wichtige Voraussetzung für die
Untersuchung dieser Kinetik sind Versuchsaufbauten, die einen definierten Startzeitpunkt der
Reaktion durch schnelles Mischen von Enzym und Substrat garantieren und eine zum
Reaktionsstart zeitnahe Detektion oder ein Beenden der Reaktion zu einem definierten
18
Einleitung
Zeitpunkt
erlauben.
Bei
den
sogenannten
Strömungsverfahren
unterscheidet
man
grundsätzlich zwischen der Continous-Flow-, der Stopped-Flow- und Quenched-FlowMethode. Beim Continous-Flow Verfahren, dass im Jahre 1923 von Hartridge und Roughton
entwickelt wurde, treffen das Enzym und das Substrat in einer Mischungskammer aufeinander
und fließen anschließend in ein Beobachtungsröhrchen. Bei bekannter Fließgeschwindigkeit
entspricht die Ortskoordinate im Beobachtungsröhrchen der Zeitkoordinate der Reaktion
(DuBois, 1941). Bei dem zuerst von Chance (1943) beschriebenen und von Gibson und
Milnes (1964) weiterentwickelten Stopped-flow Verfahren werden die zu mischenden
Substanzen mit zwei Spritzen in die Mischungskammer und anschließend in die
Beobachtungskammer eingebracht. Eine dritte Spritze hinter der Beobachtungskammer, die
Stopp-Spritze, wird dadurch bis zu einem definierten Anschlag zurückgeschoben, daraufhin
bricht der Fluss ab und die Detektion wird gestartet (Chance, 1943; Gibson & Milnes, 1964).
Dieses Verfahren wurde über die Jahre weiterentwickelt, ist mit der UV/vis-, CD-, FTIR- und
Fluoreszens-Spektroskopie kombinierbar und findet heute eine breite Anwendung. Die
Totzeit der Apparaturen liegt bei etwa 1 ms, die eingesetzten Volumina bei 50 µL bis 1 mL.
Das Stopped-Flow Verfahren ist jedoch nur in Verbindung mit Detektionsverfahren mit
kurzer Ansprechzeit und Aufzeichnung der Daten in Echtzeit einsetzbar. Bei langsameren
Detektionsmethoden wie zum Beispiel der ESR-Spektroskopie findet das Quenched-Flow
Verfahren Anwendung. Die zu beobachtende Reaktion wird dabei chemisch, optisch oder
durch abruptes Einfrieren beendet und die Proben anschließend analysiert. Das Ansetzen
mehrerer Proben mit unterschiedlichen Reaktionszeiten ermöglicht die Verfolgung der
Intermediatsbildung während der Reaktion. Zur Charakterisierung der Reaktionskinetik von
Enzymen mit paramagnetischen Kofaktoren wie zum Beispiel Fe-S-Zentren bildet das Freeze
Quench Verfahren in Verbindung mit der ESR-Spektroskopie eine wichtige Methode, da sich
der Redoxzustand dieser Kofaktoren ESR-spektroskopisch nur bei Temperaturen unterhalb
80 K bestimmen lässt. Die erste Apparatur für das so genannte Rapid Freeze Quenching
wurde in den sechziger Jahren von Bay entwickelt. Am Ende eines dem continous flow
ähnlichem System werden die gemischten Substanzen durch eine Düse in eine Kryoflüssigkeit
(flüssiges Isopentan, -140°C) gespritzt und dadurch eingefroren. Durch Weiterentwicklung
dieses Verfahrens wurde ein zu beobachtender Reaktionszeitraum von 5 ms bis 5 s erreicht
(Ballou et al., 1974). Der Nachteil des Verfahrens ist die hohe Totzeit (5 ms) und die starke
Verdünnung der Probe in der Kryoflüssigkeit. Durch Veränderung zum Beispiel der
Mikromixergeometrie, der Flussgeschwindigkeit oder des Düsendurchmesser wurden die
Totzeiten weiter gesenkt werden (Shastry et al., 1998, Tanaka et al., 2003, Cherepanov & de
19
Einleitung
Vries 2004). Auch durch das Einfrieren der Probe auf mit flüssigem Stickstoff gekühlten
Metalloberflächen konnte die Totzeit weiter verringert werden (Tanaka et al., 2003; Lu et al.,
2005). Dieses cold-block freezing wurde schon im Rahmen der Elektronenmikrokopie als die
schnellste Methode zum Einfrieren von Proben diskutiert, innerhalb von einer Millisekunde
wird die Temperatur eines Tropfens mit mehr als 10 µM Durchmesser um 100 K gesenkt
(Robards and Steytr, 1985; Bald 1985). Zudem wurde durch das Einfrieren ohne die
Verwendung von Kryoflüssigkeit die Probenkonzentration gesteigert (Lu et al, 2005). Diese
Modifikationen führten zu Apparaturen mit Totzeiten unterhalb von 200 µs und wurde aus
diesem Grund Microsecond Hyperquenching (MHQ)-Technik genannt (Cherepanov & de
Vries, 2004).
Die in dieser Arbeit verwendete Apparatur wurde im Labor von Prof. Simon de Vries,
Technische Universität Delft, Niederlande, entwickelt und aufgebaut (Cherepanov & de
Vries, 2004; Wiertz et al., 2004; Abb. 2-8). In einer Unterdruckkammer befinden sich ein
Mikromixer und ein rotierender, mit Wolfram überzogener Aluminiumzylinder zum Sammeln
der Probe, der vor Versuchsbeginn mit flüssigen Sticksoff auf 78 K gekühlt wird. Die gesamte
Apparatur wird vor Beginn der Experimente mit einem mit Argon begasten Puffer gespült,
um die Sauerstoffkonzentration zu minimieren. Das Enzym und das Substrat werden mittels
zweier HPLC-Pumpen in den Mikromixer eingebracht, verlassen diesen durch eine Düse,
treffen auf den rotierenden Zylinder und werden dort eingefroren. Der Abstand zwischen
Mixerausgang und der Wolframoberfläche des Zylinders und damit die Flugzeiten kann
variiert werden und so die Reaktionszeiten der Probe verändert werden. Unmittelbar nach
dem Einfrieren der Probe auf der Zylinderoberfläche wird der Unterdruck in der Kammer
durch Einlassen von Sticksoff entfernt und der Zylinder mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
Anschließend wird die Probe mit einem gewöhnlichen Holzlöffel in flüssigem Sticksoff vom
Zylinder gesammelt. Für die ESR-Spektroskopie wird die Probe in flüssigem Stickstoff in ein
speziell präpariertes ESR-Röhrchen überführt. Der Boden des Röhrchens ist ein Filter aus
Polypropylen, durch den der flüssige Stickstoff entweichen kann.
20
Einleitung
Abbildung 2-8: Aufbau des Apparates der MHQ-Technik. Gezeigt sind der Mikromixer und der rotierende
Zylinder in der Unterdruckkammer. Während des Experiments sinkt der Mixer in den Rotor, so dass die Probe
auf die Zylinderwände trifft, diese Bewegung ist durch den Pfeil angedeutet. Außerhalb der Kammer befinden
sich die beiden HPLC-Pumpen, der mit Argon gespülte Puffervorrat, die loops für das Enzym (E) und sein
Substrat (S) und die Vakuumpumpe.
Abbildung 2-9 zeigt den Aufbau des tangentialen Mikromixers mit Kreuzgeometrie. Aus zwei
gegenüberliegenden Kanalausgängen strömt die Lösung mit dem Enzym und trifft in der
sogenannten pre-mixing Kammer auf die Lösung mit dem Substrat, die ebenfalls über zwei
gegenüberliegenden Kanälen in den Mixer gelangt. Die Probe wird durch eine trichterförmige
Düse mit einem Durchmesser von 20 oder 100 µm, abhängig von der angestrebten
Reaktionszeit, in die Unterdruckkammer mit dem gekühlten Zylinder entlassen und dabei
weiter durchmischt. Das pre-mixing-Volumen liegt bei 1 nL, das Mischungsvolumen in der
Düse bei 10 nL. Weitere spiralförmige Aufsätze auf dem Mixer können den Weg zwischen
Mixerausgang
und
Zylinder
verlängern
und
ermöglichen
somit
unterschiedliche
Reaktionszeiten im ms Bereich.
21
Einleitung
Abbildung 2-9: Aufbau des tangentialen Mikromixers mit Kreuzgeometrie (Cherepanov & de Vries,
2004). 1) zeigt den Mixer, 2) die Düse mit 20 µM Durchmesser und 3) die Messingschraube, die den Deckel des
Mixers bildet. Die zu mischenden Substanzen gelangen über Kanal A bzw. B in einer ABAB-Anordnung in den
Mixer.
Die Totzeit des Aufbaus wurde durch die Reaktion von Metmyoglobin mit Azid bei einer
Reaktionstemperatur von 10°C bestimmt. Die Mischungszeit beträgt weniger als 20 µs, die
minimale Transportzeit der Probe zwischen Mixer und der kalten Wolframoberfläche 25 µs
und die Einfrierzeit 40 µs. Daraus ergibt sich eine Totzeit von 85 µs. Die Reaktionszeiten
können in einem Bereich von 97 µs bis 60.9 ms mit definierten Zeitpunkten variiert werden
(Cherepanov & de Vries, 2004; Wiertz et al., 2004).
2.5. Weitere untersuchte Metalloproteine
2.5.1. Die Superoxid Reduktase aus Methanosarcina mazei
In aeroben Organismen besitzt die Superoxid Dismutase (SOD) eine Schlüsselrolle im Abbau
von ROS. Seit einigen Jahren ist bekannt, dass in anaeroben und mikroanaeroben Bakterien,
in denen keine SOD nachgewiesen werden konnte, die Superoxid Reduktase (SOR) am
Abbau von ROS beteiligt ist (Jenney et al., 1999). Die SOR katalysieren die Reduktion von
Superoxid zu Wasserstoffperoxid und wurden bisher in zwei Klassen unterteilt, die sich
insbesondere durch ihre Kofaktoren unterscheiden. Die Enzyme beider Klassen besitzen das
katalytisch aktive Zentrum [Fe(His4)(Cys)], während die Klasse I SOR zusätzlich ein
22
Einleitung
[Fe(Cys)4] binden. Das Gen mm0632 des strikt anaeroben und methanogenen Archaea M.
mazei kodiert für ein Protein, dass Superoxid Reduktase Aktivität zeigt (Krätzer et al., 2010).
Die Sequenz des Proteins MM0632 enthält das konservierte Bindemotiv für das
[Fe(His4)(Cys)]-Zentrum, während ein Bindemotiv für das [Fe(Cys) 4]-Zentrum fehlt.
Zusätzlich existieren ein Bindemotiv der Form Cys(X) 7CysXXCys und ein viertes Cystein in
dem im Vergleich zu den Klasse I und II SOR verlängerten C-Terminus des Proteins. Der
Gehalt an Eisen und anorganischem Schwefel im Protein lässt vermuten, dass neben dem
[Fe(His4)(Cys)]-Zentrum ein vierkerniges Fe-S-Zentrum im Protein koordiniert ist. Das
Protein MM0632 ist vermutlich der Vertreter einer dritten Klasse der SOR (Krätzer et al.,
2010).
2.5.2 Die Benzoyl-CoA Reduktase aus Geobacter metallireducens
Viele aerobe Bakterien nutzen aromatische Verbindungen als Kohlenstoffquelle, dabei wird
das stabile Ringsystem durch Oxygenasen unter Sauerstoffverbrauch abgebaut. Auch
anaerobe Organismen katabolisieren Aromaten, bei der Destabilisierung des aromatischen
Systems ist Benzyl-CoA (BCoA) ein häufig auftretendes Intermediat. In fakultativ anaeroben
Bakterien wie zum Beispiel Thauera aromatica katalysieren BCoA Reduktasen den
Elektronentransfer von Ferredoxin auf BCoA unter gleichzeitiger ATP-Hydrolyse. Diese
Reaktion
verläuft
vermutlich
ähnlich
wie
eine
Birch-Reduktion
und
führt
zur
Dearomatisierung des stabilen Ringsystems (Wischgoll et al., 2005; Kung et al., 2009). In
obligatorisch anaeroben Bakterien wird ein ATP unabhängiger Abbau von Aromaten
vermutet. Im Genom des anaeroben Bakteriums Geobacter metallireducens wurden die durch
Benzoat induzierbaren Gene bamB-I identifiziert und das Genprodukt, der BamBCDEFGHI
Komplex, als eine bisher nicht charakterisierte BCoA Reduktase vorgeschlagen (Wischgoll et
al., 2005). Der Komplex setzt sich aus verschiedenen Proteinkomponenten zusammen:
BamGHI zeigt Ähnlichkeit zu dem NADH Dehydrogenase Fragment des Komplex I, BamC
und BamF zu einzelnen Untereinheiten von Hydrogenasen und BamDE zu Heterodisulfid
Reduktasen. BamB zeigt hohe Sequenzähnlichkeiten zu Wolfram- oder Molybdän-haltigen
Aldehyd:Ferredoxin Oxidoreduktasen und trägt vermutlich das katalytische Zentrum. Die
anderen Proteine des Komplexes sind wahrscheinlich an der Aufnahme der Elektronen von
einem bisher unbekannten Donor und der Übertragung von Elektronen zu BamB beteiligt
(Wischgoll et al., 2005). Ein BamBC genanntes Fragment mit einer Größe von etwa 185 kDa
aus den Genprodukten BamB (73 kDa) und BamC (21 kDa) wurde anaerob isoliert und liegt
23
Einleitung
vermutlich in einer α2β2-Form vor. Die im BamB-I Komplex für die Aufnahme der
Elektronen zuständigen Proteine sind nicht mit dem isolierten Enzym assembliert, aus diesem
Grund wird die Aktivität des Enzyms über die vermutete Rückreaktion bestimmt. BamBC
katalysiert die Oxidation des Cyclohexa-1,5-dien-1-carboyl-CoA (Dienly-CoA) zu BCoA in
Anwesenheit eines Elektronenakzeptors und stellt den Prototyp einer neuen Klasse von BcoA
Reduktasen dar (Kung et al., 2009).
2.6. Ziel der Arbeit
Die Geschwindigkeit der NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktase Aktivität des isolierten E.
coli Komplex I beträgt etwa 50 s-1. Die Detektion des Redoxzustandes der einzelnen Fe-SZentren gelingt nur mittels Tieftemperatur ESR-Spektroskopie. Aus diesem Grund liegen
bisher kaum experimentelle Ergebnisse zur Kinetik des Elektronentransfers zwischen den FeS-Zentren des Komplex I vor. In dieser Arbeit sollte diese Kinetik mit Hilfe der MHQTechnik und Tieftemperatur-ESR-Spektroskopie im ms- bis µs-Bereich erfasst werden.
In der Literatur wird die Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransport in
Proteinen diskutiert. Berechnungen zur Folge soll auch im Komplex I nur unter Beteiligung
konservierter aromatischer Aminosäuren die experimentell bestimmte Transferrate des
Gesamtprozesses der Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon erreicht werden. In
dieser Arbeit sollten diese konservierten Aminosäuren im E. coli Komplex I gegen andere
aromatische Aminosäuren und Leucin ausgetauscht und der Einfluss dieses Austausches auf
die Aktivität des Enzym detektiert werden.
Die Funktion des Fe-S-Zentrums N1a für den Mechanismus des Komplex I ist bisher nicht
geklärt. Eine direkte Beteiligung an der Elektronentransportkette zwischen dem FMN und der
Ubichinonbindestelle ist aufgrund seiner Lage ausgeschlossen. Eine Vermutung ist, dass es
die Lebensdauer eines möglichen Flavinsemichinon-Radikals verkürzt und somit die
Produktion schädlicher ROS am Komplex I vermindert. In dieser Arbeit sollten die
Eigenschaften des Zentrums N1a durch Mutagenese seines Bindemotivs im E. coli Komplex I
verändert und die entsprechenden Varianten charakterisiert werden.
24
Einleitung
Ein weiteres Thema dieser Arbeit sollte die ESR-spektroskopische Charakterisierung zweier
Proteine sein, die vermutlich Vertreter einer jeweils neuen Klasse von Enzymen darstellen.
Das durch die Gene bamB und bamC kodierte Fragment BamBC aus G. metallireducens ist
Teil einer Benzoyl-Coenzym A Reduktase und damit an dem Abbau aromatischer
Verbindungen beteiligt. Das durch das Gen mm0632 kodierte Protein aus M. mazei ist
vermutlich eine Superoxid Reduktase und somit am Abbau von ROS beteiligt.
25
Material und Methoden
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Bakterienstämme und Vektoren
Die Tabellen 3-1 und 3-2 zeigen die in dieser Arbeit verwendeten E. coli Stämme bzw. die
verwendeten Vektoren.
Tabelle 3-1: Verzeichnis der verwendeten E. coli Stämme.
Stamm
Genotyp
AN387
Referenz
Wallace & Young, 1977
AN387Δnuo
AN387/Δnuo
Pohl, 2008
ANN0221
AN387/ ndh::tet nuoB::nptI
Spehr, 1996
BL21(DE3)
F– ompT hsdSB (rB – mB–) gal dcm (DE3)
Studier & Moffatt, 1986
BW25113
lacIq, rrnBT14, ΔlacZWj16, hsdR514,
Datsenko & Wanner, 2000
araBADAH33, ΔrhaBADLD78
BW25113Δnuo
BW25113/Δnuo
Vranas, M.
unveröffentl. Ergebnisse
DH5α (Electromax)
F– Φ80lacZΔM15 Δ lacZY A-argF) U169
Invitrogen
recA1 endA1 hsdR17 (rk – mk +) gal– phoA
supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1
DH5αΔnuo
DH5α/Δnuo
Pohl et al., 2007b
Tabelle 3-2: Verzeichnis der verwendeten Vektoren.
Vektor
Genotyp
Referenz
pBADnuo nuoFHis
camR, pACYC184 origin,
araCParaBAD, nuoA-N, His6-nuoF
Pohl et al., 2007c
pBADnuo nuoFHis
nuoCD::nptI-sacB
pBADnuo nuoFHis nuoCD::nptI-sacB
Morina, 2009
pBADnuo nuoFHis
nuoCD F515L
pBADnuo nuoFHis, nuoCD F515L
Morina, 2009
pBADnuo nuoFHis
nuoCD F515W
pBADnuo nuoFHis, nuoCD F515W
Morina, 2009
pBADnuo nuoFHis
nuoCD F515Y
pBADnuo nuoFHis, nuoCD F515Y
Morina, 2009
26
Material und Methoden
Tabelle 3-2, Fortsetzung.
pBADnuo nuoFHis
nuoCD H514L
pBADnuo nuoFHis, nuoCD H514L
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE::nptI-sacB
pBADnuo nuoFHis nuoE::nptI-sacB
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE C92A
pBADnuo nuoFHis, nuoE C92A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE C97A
pBADnuo nuoFHis, nuoE C97A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE C97S
pBADnuo nuoFHis, nuoE C97S
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE C133A
pBADnuo nuoFHis, nuoE C133A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE C133S
pBADnuo nuoFHis, nuoE C133S
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoE C137A
pBADnuo nuoFHis, nuoE C137A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoGbeg::nptI-sacB
pBADnuo nuoFHis nuoGbeg::nptI-sacB
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoG F35L
pBADnuo nuoFHis, nuoG F35L
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoG F35W
pBADnuo nuoFHis, nuoG F35W
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoG F35Y
pBADnuo nuoFHis, nuoG F35Y
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoG::nptI-sacB
pBADnuo nuoFHis nuoG::nptI-sacB
Pohl, 2008
pBADnuo nuoFHis
nuoG W221L
pBADnuo nuoFHis, nuoG W221L
Morina, 2009
pBADnuo nuoFHis
nuoG W221F
pBADnuo nuoFHis, nuoG W221F
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoG W221Y
pBADnuo nuoFHis, nuoG W221Y
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoI::nptI-sacB
pBADnuo nuoFHis, nuoI::nptI-sacB
Morina, 2009
pBADnuo nuoFHis
nuoI F101L
pBADnuo nuoFHis, nuoI F101L
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoI F101W
pBADnuo nuoFHis, nuoI F101W
diese Arbeit
pBADnuo nuoFHis
nuoI F101Y
pBADnuo nuoFHis, nuoI F101Y
diese Arbeit
pCA24N nuoE
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-nuoE
Kitagawa et al., 2005
pCA24N nuoE C92A
pCA24N nuoE C92A
diese Arbeit
27
Material und Methoden
Tabelle 3-2, Fortsetzung.
pCA24N nuoE C97A
pCA24N nuoE C97A
diese Arbeit
pCA24N nuoE C97S
pCA24N nuoE C97S
diese Arbeit
pCA24N nuoE C133A
pCA24N nuoE C133A
diese Arbeit
pCA24N nuoE C133S
pCA24N nuoE C133S
diese Arbeit
pCA24N nuoE C137A
pCA24N nuoE C137A
diese Arbeit
pCA24N nuoCDGFP
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac
His6-nuoCDGFP
Kitagawa et al., 2005
pCA24N nuoCDGFP H514L
pCA24N nuoCDGFP H514L
diese Arbeit
pCA24N nuoCDGFP F515L
pCA24N nuoCDGFP F515L
Morina, 2009
pCA24N nuoCDGFP F515W
pCA24N nuoCDGFP F515W
Morina, 2009
pCA24N nuoCDGFP F515Y
pCA24N nuoCDGFP F515Y
Morina, 2009
pCA24N nuoI
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac His6-nuoI
Kitagawa et al., 2005
pCA24N nuoI F101L
pCA24N nuoI F101L
Morina, 2009
pCA24N nuoI F101W
pCA24N nuoI F101W
Morina, 2009
pCA24N nuoI F101Y
pCA24N nuoI F101Y
Morina, 2009
pET11a nuoB-G nuoFSTII
ampR pBR322 origin, lacI-PT7-lac nuoB-G,
nuoF-StrepTagII
Bungert et al., 1999
pkD46
ampR , R101 origin, araC-ParaBAD
exo, bet, gam
Datsenko & Wanner,
2000
pUC25 nuoE´-G
ampR, pUC origin, nuoE´-G, nuoFStrepTagII
Kohlstädt, 2009
pUC25 nuoE´-G nuoG F35L
pUC25 nuoE´-G nuoG F35L
diese Arbeit
pUC25 nuoE´-G nuoG F35W
pUC25 nuoE´-G nuoG F35W
diese Arbeit
pUC25 nuoE´-G nuoG F35Y
pUC25 nuoE´-G nuoG F35Y
diese Arbeit
pUC25 nuoE´-G nuoG W221L
pUC25 nuoE´-G nuoG W221L
Morina, 2009
pUC25 nuoE´-G nuoG W221F
pUC25 nuoE´-G nuoG W221F
diese Arbeit
pUC25 nuoE´-G nuoG W221Y
pUC25 nuoE´-G nuoG W221Y
diese Arbeit
28
Material und Methoden
3.2 Oligonukleotide
Die Tabellen 3-3, 3-4 und 3-5 zeigen die in dieser Arbeit verwendeten DNA-Oligonukleotide.
Tabelle 3-3: Verzeichnis der verwendeten DNA-Oligonukleotide zur Einführung von
Punktmutationen mit der QuikChange Methode. Die neu generierten Codons sind fett gedruckt, die
ausgetauschten Basen sind kursiv und die neu eingefügten Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen
dargestellt. Das für die Mutagenese benötigte zweite DNA-Oligonukleotid hat die entsprechende
revers-komplementäre Sequenz.
Neue
Oligonukleotid
Sequenz
Schnittstelle
BauI
nuoCD H514L fwd
5´-GAAACCCTGATCACCCTGTTCCTGCAAGTCTC
GTGGGGTCC-3´
nuoCD F515L fwd
5´-GAAACCCTGATCACCCACTTGCTGCAAGTCTC
BauI
GTGGGGTCC-3´
nuoCD F515W fwd
5´-CTGATCACCCACTGGCTGCAAGTCTCGTGGG
BauI
GTC-3´
nuoCD F515Y fwd
5´-GAAACCCTGATCACCCACTATCTGCAAGTCTC
BauI
GTGGGGTCC-3´
nuoE C92A fwd
5´-GGTCGCCATGTGATCAGATATGCTGACAGCGT
BclI
GGTCTGTC-3´
nuoE C97A fwd
5´-GTGACAGCGTGGTCGCTCATATTAATGGTTATC
VspI
AGGGTATTCAGGCG-3´
nuoE C133A fwd
5´-CGCTGCTGCCAACTTGTGCACTGGGGAACTGT
Alw44I
GATAAAGGGC-3´
nuoE C137A fwd
5´-CTTGCTGCCTGGGGAACGCTGATAAGGGCCCA
ApaI
AACATGATGATCG-3´
nuoE C97S fwd
5´-GTGACAGCGTGGTCTCTCATATTAATGGTTAT
VspI
CAGGGTATTCAGGCG- 3´
nuoE C133S fwd
5´-CGCTGCTGCCAACTTGCTCCCTTGGGAACTGT
Eco130I
GATAAAGGGC- 3´
nuoG F35L fwd
5´-GTCTGTCTCTGGGCCTTGATATCCCTTACCTG
EcoRV
TGCTGGCATC-3´
nuoG F35W fwd
5´-GTCTGTCTCTGGGCCTTGATATCCCTTACTGG
EcoRV
TGCTGGCATC-3´
nuoG F35Y fwd
5´-GTCTGTCTCTGGGCCTTGATATCCCTTACTA
EcoRV
TTGCTGGCATC-3´
nuoG W221L fwd
5´-GCACTCCGAGCGTTATAACCGTAAACTGGATA
PsiI
TGCAGTTTGCGCCGAGC-3´
29
Material und Methoden
Tabelle 3-3 Fortsetzung.
nuoG W221F fwd
5´-GCACTCCGAGCGTTATAACCGTAAATTCGAT
PsiI
ATGCAGTTTGCGCCGAGC-3´
nuoG W221Y fwd
5´-GCACTCCGAGCGTTATAACCGTAAATACGA
PsiI
TATGCAGTTTGCGCCGAGC-3´
nuoI F101L fwd
5´-CTCACGCTGCATTTTGTGTGGTCTCTGCG
Eco31I
AAGAAGCCTGTC-3´
nuoI F101W fwd
5´-CTCACGCTGCATTTGGTGTGGTCTCTGCGA
Eco31I
AGAAGCCTGTC-3´
nuoI F101Y fwd
5´-CTCACGCTGCATTTACTGTGGTCTCTGCGAA
Eco31I
GAAGCCTGTC-3´
Tabelle 3-4: Verzeichnis der verwendeten DNA-Oligonukleotide zur Amplifikation von DNA
Fragmenten.
Oligonukleotid
Sequenz
nuoDfwd
5´-TGGGTGGTGGCGTTTCTGAC-3´
nuoDrev
5´-ATCGCCGCCGGAATTTGCTG-3´
nuoEfwd
5´-CACGAGAATC AACAACCACA AACCG-3´
nuoErev
5´-TTTATACCGC TCCAGCAGTT CAGG-3´
nuoGfwd
5´-GCGCACGACAACGTCTACTTC-3´
revBC2xxA (nuoGrev)
5´-GGGTAATGAAATCATCGCCACGAC -3´
nuoGbegfwd
5´-CGATTAACGCTCAGTCTC-3´
nuoGbegrev
5´-TTACGGTGGGTACGTTTG-3´
nuoIfwd
5´-TCTGGATGATCGGCCTGCAC-3´
nuoIrev
5´-TCGCCCTTATCTTTGCCGTC-3´
30
Material und Methoden
Tabelle 3-5: Verzeichnis der verwendeten DNA-Oligonukleotide zur Amplifikation von
Selektionskassetten für die λ-Red vermittelte Rekombination. Die zur Zielsequenz homologen
Sequenzen sind unterstrichen.
Oligonukleotid
Sequenz
nuoE::nptI-sacB fwd
5´-GCGTGAAGCGATCGAGCACGAGATGCACCACTACGAAG
ACCCGCGTGCGGTACCGGATCCGTCGACCTG-3´
nuoE::nptI-sacB rev
5´-GAGTGTCCTCATCGATCATCATGTTTGGCCCTTTATCACA
GTTCCCCAGGGAATTCCCCGGGGGATCCG-3´
nuoD::nptI-sacB fwd
5´-TCACCCGCTGACCACGCCGCCGCCGAAAGAGCGCA
CGCTGCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3´
nuoD::nptI-sacB rev
5´-CTTTGGTCGCCTCAATCATCTGGAAAGATTCATTGG
CAGGCATCACCGAATTCCCCGGGGGATCCG-3´
nuoGbeg::nptI-sacB fwd
5´-GAATACGAGGTCAACGGAGCGGACAACCTGCTGGA
AGCTTCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3´
nuoGbeg::nptI-sacB rev
5´-GAAATAAAGGTGCCATCGGAAGCCGGTGTCATACAGGA
CATCACCAGAATTCCCCGGGGGATCCG-3´
nuoI::nptI-sacB fwd
5´-CAGAAACCAAAGACGGTCGCTGGTACCCGGAATTTT
TCCGCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3´
nuoI::nptI-sacB rev
5´-GTATTCCCCCATTTCGAAATCCGGGGTTAACTGAAT
CGCCGTGGTCGGAATTCCCCGGGGGATCCG-3´
3.3 Chemikalien
Tabelle 3-6 zeigt die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien.
Tabelle 3-6: Verzeichnis der Chemikalien.
Chemikalie
Hersteller
Acrylamid
Gerbu
Agar
AppliChem
Agarose low EEO
AppliChem
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Grüssing
Ammoniumperoxodisuldat (APS)
Merck
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)
Grüssing
Ampicillin (AMP)
AppliChem
Antifoam 204
Sigma
L(+)-Arabinose
Roth
Bromphenolblau
Sigma
31
Material und Methoden
Tabelle 3-6, Fortsetzung.
BSA (Rinderserumalbumin)
Sigma
Chloramphenicol (CAM)
AppliChem
Coomassie Brilliant Blue R250
Merck
L-Cystein
Sigma
D-Desthiobiotin
IBA
2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzochinon (Decyl-Ubichinon)
Sigma
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Aus Institutdbeständen
1,4-Dithiothreitol (DTT)
Gerbu
DNAse I
AppliChem
dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Fermentas
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM)
AppliChem
E. coli polare Lipide (E. coli polar lipid extract)
Avanti
Eisen-Ammonium-Citrat
Merck
Essigsäure
Aus Institutsbeständen
Ethanol
Aus Institutsbeständen
Ethidiumbromid
Fluka
Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA)
Sigma
Glucose Monohydrat
Grüssing
Glycerin
Roth
Glycin
Riedel-de-Haën
Hefeextrakt
Hefewerke HH
HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure))
Sigma
Imidazol
AppliChem
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)
Gerbu
Kaliumacetat
Roth
Kaliumchlorid (KCl)
Merck
Kaliumcyanid (KCN)
Merck
Kaliumdihydrogenphosphat-Diydrat (KH2PO4·2H2O)
Merck
Kaliumhexacyanoferrat(III) (K3 [Fe(CN)]6 )
Fluka
Kaliumhydroxid (KOH)
Sigma
Kaliumiodid (KI)
Aus Institutsbeständen
Kanamycindisulfat (KAN)
Merck
Kupfersulfat (CuSO4)
Merck
Lysozym aus Hühnereiweiß
Fluka
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2·6H2O)
Merck
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4·7H2O)
Merck
32
Material und Methoden
Tabelle 3-6, Fortsetzung.
D-Mannitol
Sigma
2-Mercaptoethanol
Roth
2-Methybutan
Merck
Methylcyclohexan
Merck
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES)
AppliChem
Natriumchlorid (NaCl)
Grüssing
Natriumdithionit (Na2S2O4)
Merck
Natriumdodecylsulfat (SDS)
USB
Di-Natriumhydrogenposphat (Na2HPO4)
Merck
Natriumhydroxid (NaOH)
Riedel-de-Haën
Natrium-Kalium-Tartrat
Merck
Natriumphosphat Dodecahydrat (Na 3PO4·12 H2O)
Merck
Natriumsulfat (Na2SO4)
Merck
Nicotinamidadenin-Dinukleotid, Dinatriumsalz (NADH)
Roche
Desamino-Nicotinamidadenin-Dinukleotid, Dinatriumsalz (d-NADH)
Sigma
Pepton aus Casein (pankreatischer Verdau)
AppliChem
Phenylmethansulfonsäurefluorid (PMSF)
Merck
Piericidin A
Sigma
2-Propanol (Isopropanol)
Aus Institutsbeständen
Riboflavin
Sigma
RNase A
Fermentas
D(+)-Saccharose
Roth
Salzsäure (HCl)
Riedel-de-Haën
N,N,N,N„- Tetramethyldiamin (TEMED)
Sigma
Trichloressigsäure (TCA)
Merck
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)
AppliChem
TRIS-Borat
Merck
N-[Tris(hydroyxmethyl)-methyl]-glycin (Tricine)
Merck
33
Material und Methoden
3.4 Medien, Puffer und Lösungen
Die Tabellen 3-7 bis 3-12 zeigen die in dieser Arbeit verwendeten Nährmedien, Puffer und
Lösungen.
Tabelle 3-7: Verzeichnis der Medien für die Zellzucht.
Medium
Zusammensetzung
LB-Medium
LB-Platten
Pepton
1% (w/v)
NaCl
1% (w/v)
Hefeextrakt
0.5% (w/v)
LB-Medium mit
Agar
LB*-Medium
YP/SUC-Platten
Fermentermedium
Konzentration
2% (w/v)
LB-Medium mit
L-Cystein
0.5 mM
Eisen-Ammonium-Citrat
10 mg/L
Riboflavin
50 mg/L
(NH4)2SO4
100 mg/L
Pepton
1% (w/v)
Hefeextrakt
0.5% (w/v)
D(+)-Saccharose
10% (w/v)
Agar
2% (w/v)
Pepton
1% (w/v)
Hefeextrakt
0.5% (w/v)
Na3PO4
15 mM
Na2HPO4
10 mM
KH2PO4
25 mM
NH4Cl
50 mM
Na2SO4
5 mM
MgSO4
2 mM
Riboflavin
50 mg/mL
Eisen-Ammonium-Citrat
30 mg/mL
L-Cystein
0.5 mM
34
Material und Methoden
Tabelle 3-7, Fortsetzung.
Autoinduktionsmedium
SOC-Medium
Pepton
1% (w/v)
Hefeextrakt
0.5% (w/v)
Na2HPO4
25 mM
KH2PO4
25 mM
NH4Cl
50 mM
Na2SO4
5 mM
MgSO4
2 mM
D-Mannitol
0.5% (w/v)
L(+)-Arabinose
0.2% (w/v)
Glucose
0.05% (w/v)
Pepton
2% (w/v)
Hefeextrakt
0.5% (w/v)
NaCl
10 mM
KCl
2.5 mM
MgSO4
10 mM
MgCl2
10 mM
Glucose
20 mM
Tabelle 3-8: Verzeichnis der Antibiotika.
Antibiotikum
Stammlösung
Endkonzentration
Ampicillin (AMP)
50 mg/mL in H2O
100 µg/mL
Chloramphenicol (CAM)
34 mg/mL in Ethanol
170 µg/mL (flüssige Medien)
20 µg/mL (feste Medien)
Kanamycin (KAN)
50 mg/mL in H2O
50 µg/mL
35
Material und Methoden
Tabelle 3-9: Verzeichnis der Puffer für die Molekularbiologie.
Puffer
Zusammensetzung
Konzentration
P1
TRIS/HCl
50 mM, pH 8.0
EDTA
10 mM
RNase A
100 µg/mL
NaOH
0.2 M
SDS
1% (w/v)
P3
Kaliumacetat/Essigsäure
3 M, pH 5.5
TBE
TRIS-Borat
89 mM, pH 8.3
EDTA
1 mM
P2
Tabelle 3-10: Verzeichnis der Puffer für die Proteinchemie.
Puffer
Zusammensetzung
A-Puffer
MES/NaOH
50 mM, pH 6.0
NaCl
50 mM
ADDM-Puffer
B-Puffer
BDDM-Puffer
A-Puffer mit
DDM
0.1% (w/v)
MES/NaOH
50 mM, pH 6.0
NaCl
350 mM
B-Puffer mit
DDM
*
A -Puffer
MES-Puffer
Bindepuffer
Elutionspuffer
0.1% (w/v)
A-Puffer mit
MgCl2
5 mM
MES/NaOH
50 mM, pH 6.6
NaCl
50 mM
MES/NaOH
50 mM, pH 6.3
NaCl
200 mM
Imidazol
20 mM
DDM
0.1% (w/v)
MES/NaOH
50 mM, pH 6.3
NaCl
200 mM
Imidazol
500 mM
DDM
0.1% (w/v)
36
Material und Methoden
Tabelle 3-11: Verzeichnis der Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE nach Laemmli (1970).
Puffer
Zusammensetzung
Konzentration
Probenpuffer
TRIS/HCl
0.4 M, pH 6.8
SDS
4% (w/v)
Glycerin
12% (v/v)
Bromphenolblau
1% (w/v)
EDTA
2.5 mM
DTT
3.5 mM
TRIS/HCl
3% (w/v), pH 8.3
Glycin
14% (w/v)
SDS
0.5% (w/v)
TRIS/Acetat
124 mM, pH 6.8
SDS
0.1% (w/v)
TRIS/Acetat
175 mM, pH 8.8
SDS
0.04% (w/v)
Anoden- und Kathodenpuffer
Sammelgelpuffer
Trenngelpuffer
Tabelle 3-12: Verzeichnis der Puffer für die SDS-PAGE nach Schägger & von Jagow (1987).
Puffer
Zusammensetzung
Konzentration
Probenpuffer
TRIS/Acetat
0.4 M, pH 6.8
SDS
8% (w/v)
Glycerin
20% (w/v)
Coomassie Brilliant Blue R250
0.01% (w/v)
Mercaptoethanol
2% (w/v)
Anodenpuffer
TRIS/HCl
0.2 M, pH 8.9
Kathodenpuffer
TRIS/HCl
0.1 M, pH 8.25
Tricine
0.1 M
SDS
0.1% (w/v)
TRIS/HCl
750 mM, pH 8.45
SDS
0.1% (w/v)
TRIS/HCl
1 M, pH 8.45
SDS
0.1% (w/v)
Glycerin
10.5% (w/v)
Sammelgelpuffer
Trenngelpuffer
37
Material und Methoden
3.5 Mikrobiologische Methoden
3.5.1 Bakterienanzucht
Anzucht von Vorkulturen:
Zur Plasmidpräparation oder als Vorkultur wurde LB-Medium mit den entsprechenden
Antibiotika versetzt und mit einer Einzelkolonie oder in einer 1:10´000 (v/v) Verdünnung aus
einer Glycerindauerkultur angeimpft und bei 37°C für 14 - 16 h inkubiert. Stämme mit
temperatursensitiven Plasmiden wurden bei 30°C kultiviert.
Anzucht für die Membranpräparation:
Für die Membranpräparation wurden Zellen des Stammes BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis
in 0.4 L Autoinduktionsmedium mit dem entsprechenden Antibiotikum in 1 L
Erlenmeyerkolben mit Schikane bei 37°C und 160 Upm kultiviert. Das Wachstum wurde
durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) verfolgt. Am Ende der
exponentiellen Wachstumsphase wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 10´810·g (8´000
Upm, 10 min, 4°C, Rotor FiberLite F-10, RC-5C, Sorvall Instruments) geerntet, in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Wurden Zellen der Stämme ANN0221/pBADnuo nuoFHis, AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis
oder AN387nuo:nptI/pBADnuo nuoFHis verwendet, wurde diese in LB-Medium kultiviert und
episomal kodierte Gene bei einer OD600 von 0.1 – 0.3 mit 0.2% (w/v) L-Arabinose induziert.
Anzucht für die Komplex I-Präparation:
Um ausreichend Zellen für eine Komplex I-Präparation zu erhalten, wurden Zellen des E. coli
Stammes BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis in einem 10 L Fermenter (Braun Biotech,
Melsungen) aerob kultiviert. Hierzu wurden 10 L Autoinduktionsmedium mit 400 mL einer
Vorkultur angeimpft und bei 37°C unter Rühren (200 Upm) inkubiert. Die Zellen wurden am
Ende der exponentiellen Wachstumsphase durch Zentrifugation bei 10´810·g (8´000 Upm, 10
min, 4°C, Rotor FiberLite F-10, RC-5C, Sorvall Instruments) geerntet, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Wurden Zellen der Stämme ANN0221/pBADnuo nuoFHis oder AN387Δnuo/pBADnuo
nuoFHis verwendet, wurden diese in Fermentermedium kultiviert und episomal kodierte Gene
bei einer OD600 von 0.1 – 0.3 mit 0.2% (w/v) L-Arabinose induziert.
38
Material und Methoden
Größere Mengen des E. coli Stamms ANN0221/pBADnuo nuoFHis wurden durch Anzucht im
200 L Maßstab erhalten (Institut für Biologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). Hierzu
wurde 200 L Fermentermedium mit 200 mL 34 mg/mL Chloramphenicol in Ethanol versetzt,
mit 5 L einer Vorkultur angeimpft und bei 37°C unter Rühren (180 Upm) inkubiert. Die
Luftzufuhr wurde während der Anzucht linear von 10 auf 180 L/min erhöht. Nach 40 min
wurde die Expression des nuo-Operons durch Zusatz von 0.2% (w/v) L-Arabinose induziert.
Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurde die Temperatur auf 6°C abgesenkt und
die Zellen in einer Durchlaufzentrifuge bei 17´000·g (20´000 Upm, 1.5 L/min, 4°C, Typ Z41,
CEPA, Lahr) geerntet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Anzucht für die Präparation des NADH Dehydrogenase Fragmentes:
Der E. coli Stamm BL21(DE3)/pET11anuoB-G nuoFSTII wurde zur Überproduktion des
NADH Deyhydrogenase Fragments in einem Fermenter (Institut für Biologie, AlbertLudwigs-Universität Freiburg) aerob kultiviert. 200 L LB*-Medium wurden mit 400 mL 50
mg/mL Ampicillin versetzt, mit 5 L einer Vorkultur angeimpft und bei 37°C unter Rühren
(180 Upm) inkubiert. Die Luftzufuhr wurde während der Anzucht linear von 10 auf 180
L/min erhöht. Bei einer OD600 von 0.5 wurde mit 200 mL 0.4 M IPTG die Expression von
nuoB-G induziert. Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurde die Temperatur auf
6°C abgesenkt und die Zellen in einer Durchlaufzentrifuge bei 17´000·g (20´000 Upm, 1.5
L/min, 4°C, Typ Z41, CEPA, Lahr) geerntet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei
-80°C gelagert.
3.5.2. Herstellung von Glycerindauerkulturen
Für die Herstellung von Glycerindauerkulturen wurden 150 μL 80% (v/v) steriles Glycerin
vorgelegt, mit 250 μL einer E. coli Vorkultur vermischt und sofort in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Die Dauerkulturen wurden bei -80°C gelagert.
3.5.3. Herstellung elektrokompetenter Zellen
Zellen für die Elektroporation von Plasmid-DNA :
Für die Elektroporation von Plasmid-DNA wurde der zu transformierende Stamm bei 37°C in
LB-Medium aerob angezogen. Bei einer OD600 von 0.4 - 0.5 wurde die Kultur für 15 min auf
Eis gestellt und anschließend bei 4´500·g zentrifugiert (5´000 Upm, 10 min, 4°C, Rotor A-444, Centrifuge 5804R, Eppendorf). Das Sediment wurde in dem gleichen Volumen wie die
Ausgangskultur eiskaltem MilliQ H2O resuspendiert und erneut bei 4´500·g zentrifugiert
39
Material und Methoden
(5´000 Upm, 10 min, 4°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804R, Eppendorf). Dieser Waschschritt
wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden in 10% (v/v) eiskaltem Glycerin entsprechend
einer OD600 von 35 - 45 resuspendiert und direkt verwendet oder in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Zellen für die λ-Red vermittelte Rekombination:
Für die λ-Red vermittelte Rekombination wurde eine Vorkultur eines mit dem Plasmid
pKD46 transformierten E. coli Stamms angesetzt. 0.5 - 1.0 mL dieser Vorkultur wurde auf
100 mL LB-Medium mit Ampicillin übergeimpft und in einem 300 mL Erlenmeyerkolben mit
Schikane bei 30°C und 200 Upm inkubiert. Bei einer OD600 von 0.2 - 0.25 wurde die
Expression des Red-Operons durch Zusatz von 0.2% L-Arabinose induziert, die Kultur für
weitere 30 min inkubiert und für 15 min auf Eis gestellt. Anschließend wurde bei 4´500·g
zentrifugiert (5´000 Upm, 10 min, 2°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804R, Eppendorf), das
Sediment in 50 mL eiskaltem 10% (v/v) Glycerin resuspendiert und nochmals bei 4´500·g
zentrifugiert (5´000 Upm, 10 min, 4°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804R, Eppendorf). Dieser
Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Die Zellen wurden in 10% (v/v) eiskaltem Glycerin
entsprechend einer OD600 von 35 - 45 resuspendiert und direkt verwendet.
3.6. Molekularbiologische Methoden
3.6.1. Plasmidpräparation
Analytischer Maßstab:
Für die analytische Plasmid-Präparation wurden 2 - 4 mL einer E. coli Übernachtkultur bei
9´300·g zentrifugiert (10´000 Upm, 1 min, 20°C, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D,
Eppendorf) und die Zellen in 250 μL Puffer P1 resuspendiert. Zur Lyse wurde die Suspension
mit 250 μL Puffer P2 versetzt und für 4 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Lysat wurde
mit 250 μL Puffer P3 neutralisiert, 15 min auf Eis inkubiert und bei 20´800·g zentrifugiert
(14´000 Upm, 15 min, 4°C, Rotor F45-30-11, Centrifuge 5804R, Eppendorf). Der Überstand
wurde mit 750 μL Isopropanol versetzt und für 20 min bei -20°C inkubiert. Nach
Zentrifugation bei 20´800·g (14´000 Upm, 15 min, 4°C, Rotor F45-30-11, Centrifuge 5804R,
Eppendorf) wurde der Überstand verworfen, das Sediment bei 37°C getrocknet und in 25 μL
40
Material und Methoden
MilliQ H2O durch Schütteln gelöst (50°C, 1200 Upm, 15 min, Thermomixer compact,
Eppendorf).
Präparativer Maßstab:
Für die Präparation von mehr als 2 μg Plasmid-DNA wurde das Wizard® Plus SV Minipreps
Kit (Promega) nach Herstellerangaben verwendet. Zur Elution der DNA von der Säule wurde
auf 55°C erwärmtes MilliQ H2O verwendet.
3.6.2. Restriktion von DNA
Für die Restriktionsanalyse von Plasmiden wurden 200 - 500 ng DNA mit der benötigten
Menge an Restriktionsenzym (Fermentas) unter Zusatz des entsprechenden Puffers bei 37°C
inkubiert. Das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug in der Regel 20 μL. Die eingesetzte
Menge an Enzym und die Inkubationsdauer ergaben sich hierbei aus der Definition von 1
Unit, das der Menge an Enzym entspricht, die 1 μg λ-DNA in 1 h vollständig verdaut. Bei
einem präparativem Verdau von DNA wurde darauf geachtet, dass die DNA-Konzentration
im Ansatz 100 ng/μL nicht überstieg. Der Ansatz wurde über ein präparatives Agarosegel
aufgetrennt und mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up (Promega) nach
Herstellerangaben aufgereinigt. Bei der Restriktion zur Trennung von Konkatameren wurde
der Ansatz nach der Inkubation mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean up Kit (Promega)
gereinigt.
3.6.3. Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die PCR Ansätze wurden in dünnwandigen Reaktionsgefäßen (0.2 mL dünnwandige PCR
Gefäße,
Biozym)
auf
Eis
vermischt
und
nach
Erreichen
der
initialen
Denaturierungstemperatur in den Thermocycler (Mastercycler, Eppendorf) gestellt. DNAOligonukleotide „Primer“ einer Länge von mehr als 35 Nukleotiden wurden vom Hersteller
HPLC gereinigt bzw. bei einer Länge von mehr als 60 Nukleotiden PAGE gereinigt bestellt
(Operon). Es wurde darauf geachtet, dass die Schmelztemperatur der Primer mindestens 60°C
betrug (Primer Designer 5, Scientific & Educational Software) und dass die Primer am 3´Ende ein G oder C besaßen.
41
Material und Methoden
Präparative PCR :
Die Selektionskassetten für die λ-Red vermittelte Rekombination wurden mit einer
kommerziellen Mischung aus Taq und Pfu DNA-Polymerase hergestellt (Long PCR Enzyme
Mix, Fermentas). Ein 50 μL Ansatz enthielt 5 μL Long PCR Buffer + MgCl2, 10 - 20 ng
Templat-DNA, je 200 μM dNTPs, je 500 nM Primer und 2.5 U Long PCR Enzyme Mix. Das
PCR-Programm bestand aus einer initialen Denaturierung (95°C, 3 min), einem Zyklus (95°C,
30 s; 58°C, 30 s; 68°C, 1.5 min/kb; 25 Wiederholungen) und einer abschließenden Extension
(68°C, 10 min). Der PCR Ansatz wurde mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean up Kit
(Promega) nach Herstellerangaben aufgereinigt, wobei mit zusätzlichen 200 μL Membrane
Wash Solution gewaschen wurde und die DNA mit 25 μL MilliQ H2O (55°C) von der Säule
eluiert wurde.
Die DNA-Fragmente mit neu eingefügter Punktmutation wurden für die λ-Red vermittelte
Rekombination mittels Phusion-DNA-Polymerase (5 U/μL, Finnzymes) vervielfältigt. Ein 50
μL Ansatz enthielt 10 μL 1× Phusion HF-Puffer + MgCl2 (Finnzymes), 20-40 ng TemplatDNA, je 200 μM dNTPs, je 2 µM Primer und 2,5 U Phusion DNA Polymeras. Das PCRProgramm bestand aus einer initialen Denaturierung (94°C, 3 min), einem Zyklus (94°C, 20 s;
60°C, 30 s; 72°C, 20 s /kb; 25 Wiederholungen) und einer abschließenden Extension (72°C, 5
min). Der PCR-Ansatz wurde mit DpnI verdaut, um die methylierte Vorlage-DNA zu
zerstören. Hierfür wurde der Ansatz mit 10 μL Puffer Tango und 1 μL DpnI versetzt und 2 h
bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean
up Kit (Promega) nach Herstellerangaben gereinigt, wobei mit zusätzlichen 200 μL
Membrane Wash Solution gewaschen wurde und die DNA mit 25 μL MilliQ H2O (55°C) von
der Säule eluiert wurde.
Ortsgerichtete Mutagenese:
Zur Mutagenese von Vektor-DNA wurde die QuikChange® Methode angewandt. Für die
Mutagenese mittels Phusion DNA Polymerase (Finnzymes) enthielt der 50 μL Ansatz 10 μL
Phusion HF Puffer (Finnzymes), 20-50 ng Templat-DNA, je 200 μM dNTPs, je 160 nM
Primer und 1 U Phusion DNA Polymerase (Finnzymes). Das PCR-Programm bestand aus
einer initialen Denaturierung (98°C, 30 s) und einem Zyklus (98°C, 20 s; 55 - 72°C, 10 s;
72°C, 20 s/kb; 18 Wiederholungen).
42
Material und Methoden
Für die Mutagenes mittels Pfu-DNA-Polymerase (Promega) wurde ein Ansatz mit 40-45 ng
Vorlage-DNA, je 240 nM DNA-Oligonukleotide, 0.2 mM dNTP-Mix, 1×Pfu-Puffer und 3 U
Pfu-DNA-Polymerase
pipetiert.
Das
PCR-Programm
bestand
aus
einer
initialen
Denaturierung (95°C, 120 s) und einem Zyklus (95°C, 60 s; 55 - 58°C, 30 s; 72°C, 120 s/kb;
18 Wiederholungen).
Nach der Reaktion wurden 10 μL des Ansatzes zur Kontrolle entnommen und auf ein
Agarosegel aufgetragen. Der Ansatz wurde mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up
System (Promega) gereinigt und mit 30 μL MilliQ H2O eluiert. Das Eluat wurde mit DpnI
verdaut um die methylierte Templat-DNA zu zerstören. Hierfür wurde die DNA-Lösung mit
2.5 μL Puffer Tango und 1 μL DpnI versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei 37°C inkubiert, erneut
gereinigt und mit 25 μL MilliQ H2O eluiert. Zur Kontrolle wurden 4 μL dieser Lösung auf ein
Agarosegel aufgetragen. Mit 1 - 3 μL der gereinigten Probe wurden elektrokompetente DH5α
Zellen transformiert.
3.6.4. Transformation durch Elektroporation
50 μL frisch hergestellte oder auf Eis aufgetaute elektrokompetente Zellen (Kap. 3.5.3.)
wurden in einem 1.5 mL Reaktionsgefäß mit 0.5 - 5.0 μL DNA (0.1 - 20 ng) vermischt und in
eine eisgekühlte Elektroporationsküvette (d = 1 mm, Eppendorf) überführt. Die Zellen
wurden einem Spannungspuls mit einer Amplitude von 1„700 V ausgesetzt (Electroporator
2510, Eppendorf). Sollte die Dauer des Pulses 4.5 ms unterschreiten, wurde der Ansatz
verworfen. Andernfalls wurde der Ansatz sofort in 1 mL SOC-Medium aufgenommen, in ein
1.5 mL Reaktionsgefäß überführt und bei 37°C inkubiert (1 h, 750 Upm, Thermomixer
compact, Eppendorf). Zellen, die mit einem Vektor mit temperatursensitivem Replikon
transformiert wurden, wurden bei 30°C inkubiert (1 h, 750 Upm). Je nach Stamm wurden 100
μL des unverdünnten bzw. 1:10 - 1:10´000 (v/v) in LB-Medium verdünnten Ansatzes auf LBPlatten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen und für 16 h bei 37°C bzw. 20 24 h bei 30°C inkubiert.
43
Material und Methoden
3.6.5. λ-Red vermittelte Rekombination
50 μL frisch hergestellte elektrokompentente und induzierte Zellen (Kap. 3.5.3.) wurden in
einem eisgekühlten 1.5 mL Reaktionsgefäß mit bis zu 500 ng linearer DNA (bei etwa 4 kb)
und mit 25 - 50 ng Plasmid-DNA (bei etwa 21 kb) vermischt, für 1 min auf Eis inkubiert und
in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette (d = 1 mm, Eppendorf) überführt. Das molare
Verhältnis von Zellen zu Plasmid-DNA und zu linearer DNA sollte demnach 1:1:100
betragen. Die Zellen wurden einem Spannungspuls mit einer Amplitude von 1´700 V
ausgesetzt (Electroporator 2510, Eppendorf). Sollte der Spannungspuls 5.0 ms unterschreiten,
wurde der Ansatz verworfen. Andernfalls wurde der Ansatz sofort in 1 mL SOC-Medium
aufgenommen, in ein 1.5 mL Reaktionsgefäß überführt und bei 37°C inkubiert (1 h, 750 Upm,
Thermomixer compact, Eppendorf). Sollte auf Antibiotika-resistente Klone selektioniert
werden, so wurde der Transformationsansatz bei 9´300·g zentrifugiert (10´000 Upm, 1 min,
20°C, Rotor F45-24-11, Centrifuge 5415D, Eppendorf), der Überstand verworfen und das
Sediment in 100 μL LB-Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde auf LB-Platten mit
dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen und für 16 h bei 37°C inkubiert. Sollte
hingegen auf Saccharose-resistente Klone selektioniert werden, so wurden 200 μL des
Transformationsansatzes auf YP/SUC-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum
ausgestrichen und für 20 - 24 h bei 30°C inkubiert.
3.6.6. Agarose Gelelektrophorese
Die DNA-Lösung wurde mit 6X Loading Dye Solution (Fermentas) versetzt und auf das Gel
aufgetragen. Die DNA-Fragmente wurden in einem Gel aus 0.8% (w/v) Agarose in TBE
Puffer bei 6 - 9 V/cm für 30 - 40 min getrennt. Zur Visualisierung der DNA Banden enthielt
das Gel 200 ng/mL Ethidiumbromid. Die Fluoreszenz des DNA/Ethidiumbromid Komplexes
wurde auf einem Leuchtschirm bei 254 nm angeregt. Über einen Vergleich der Intensität der
DNA-Banden mit einem Standard wurde die Größe und Menge an DNA abgeschätzt. Dabei
wurden immer 500 ng DNA-Längenstandard (Lambda DNA/Eco130I (StyI) Marker, 16,
Fermentas) aufgetragen.
44
Material und Methoden
3.7 Proteinchemische Methoden
3.7.1. Zellaufschluß und Präparation von Membranen
Sämtliche Arbeitschritte wurden bei 4°C bzw. auf Eis ausgeführt. Mehr als 5 g noch
gefrorener E. coli Zellen wurden im Mixer (Stufe: High, 3 min, Waring) in A-Puffer (2-5
mL/g Bakterien-Feuchtmasse) mit 100 μM PMSF, 10 μg/mL DNase und 100 μg/mL Lysozym
zerkleinert und in einem Teflon-in-Glas-Homogenisator resuspendiert. Weniger als 5 g
gefrorener E. coli Zellen wurden in 25 mL A-Puffer mit 100 μM PMSF, 10 μg/mL DNAse
und 100 μg/mL Lysozym direkt in einem Teflon-in-Glas-Homogenisator resuspendiert. Die
Zellen wurden in einer French Press bei 110 MPa (17´000 Psi, French Pressure Cell, SLM
Aminco) aufgeschlossen, nicht-aufgeschlossene Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation
bei 30´590·g (10´000 Upm, Rotor A8.24, 20 min, RC-5 Centrifuge, Sorvall) sedimentiert und
der Überstand bei 250´000·g zentrifugiert (50´000 Upm, Rotor 60Ti, 1 h, Coulter-Optima LE80K Ultracentrifuge, Beckman). Der Überstand der Zentrifugation wurde als Cytosol und das
Sediment als Membranfraktion weiterverwendet.
3.7.2 Zuckergradientenzentrifugation
Sämtliche Arbeitschritte wurden bei 4°C bzw. auf Eis ausgeführt. Die Membranen wurden in
1 g/mL A*-Puffer, 50 μM PMSF mittels eines Teflon-in-Glas-Homogenisators resuspendiert.
1.5 mL der Membransuspension wurden mit 263 μL einer DDM-Stammlösung (20% (w/v) in
H2O) versetzt, der Ansatz für 15 min auf Eis inkubiert und dabei alle 5 min mit einem Teflonin-Glas-Homogenisator durchmischt. Anschließend wurde der Extrakt bei 150´000·g (30 Psi,
15 min, Rotor A-100, Airfuge, Beckman) zentrifugiert. 0.4 - 1.0 mL des Überstandes wurden
auf einen 12 mL Saccharosegradienten (5 - 30% (w/v) Saccharose in A*DDM mit 50 μM
PMSF) aufgetragen und bei 160´000·g zentrifugiert (36´000 Upm, 18 h, Rotor SW 41,
Coulter-Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman . Der Gradient wurde in 600 μL Portionen
fraktioniert und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der Fraktionen bestimmt.
45
Material und Methoden
3.7.3. Proteinpräparation
Sämtliche Arbeitschritte wurden bei 4°C bzw. auf Eis ausgeführt. Die Puffer für die
Chromatographie wurden direkt vor ihrer Verwendung mit 30 μM PMSF versetzt.
Isolierung des überproduzierten NADH-Dehydrogenase Fragments :
Das Cytosol aus 30-60 g Zellen des Stamms BL21(DE3)/pET11anuoB-G nuoFSTII wurde bei
einer Flussgeschwindigkeit von 8 mL/min auf eine in A-Puffer mit 5 mM DTT und 30 μM
PMSF äquilibrierte 60 mL Anionenaustausch-Chromatographiesäule (110 x 26 mm, Fractogel
EMD TMAE Hicap(M), Merck) aufgetragen und die Säule mit 60 mL des gleichen Puffers
gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen 300 mL Gradienten von 50 300 mM NaCl bei einer Flussgeschwindigkeit von 5 mL/min eluiert. Das Eluat wurde in 8 mL
Fraktionen gesammelt und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität bestimmt.
Fraktionen mit einer Aktivität von mehr als 10 μmol·min-1·mL-1 wurden vereinigt, durch
Ultrafiltration
(100
kDa
MWCO,
Amicon
Ultra-15,
Millipore)
auf
das
halbe
Ausgangsvolumen konzentriert und anschließend der pH-Wert mit 0.2 M NaOH auf 6.6
eingestellt. Das Konzentrat wurde mit 0.8 mL/min auf eine 10 mL AffinitätsChromatographiesäule (39 x 18 mm, Strep-Tactin Sepharose, IBA), die in MES-Puffer mit 5
mM DTT und 30 μM PMSF äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde bei der
gleichen Flussgeschwindigkeit mit MES-Puffer gewaschen, bis die Absorbanz des Eluats bei
280 nm auf den Wert des Puffers gesunken war. Das NADH Dehydrogenase Fragment wurde
bei einer Flussrate von 1 mL/min mit 2.5 mM D-Desthiobiotin in A-Puffer, 5 mM DTT, 30
μM PMSF eluiert. Das Protein wurde durch Ultrafiltration (100 kDa MWCO, Amicon Ultra15, Millipore) auf eine Konzentration von mehr als 10 mg/mL gebracht (4´000·g, 4°C, Rotor
A-4-44, Centrifuge 5804R, Eppendorf), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
Isolierung des Komplex I:
Die Membranen von etwa 25 - 35 g Zellen der Stämme ANN0221/pBADnuo nuoFHis oder
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis wurden in A*-Puffer (1 mL/g Membranen) mit 50 μM
PMSF mittels eines Teflon-in-Glas-Homogenisators resuspendiert. Mit einer DDMStammlösung (20% (w/v) in H2O) wurde eine DDM-Endkonzentration von 3% (w/v)
eingestellt, der Ansatz für 15 min auf Eis inkubiert und dabei alle 5 min mit einem Teflon-inGlas-Homogenisator durchmischt. Anschließend wurde der Extrakt mit A*-Puffer auf 64 mL
verdünnt und mit 250´000·g zentrifugiert (50´000 Upm, Rotor 60Ti, 15 min, Coulter-Optima
46
Material und Methoden
LE-80K Ultracentrifuge, Beckman). Der Überstand wurde mit 6 mL/min auf eine mit ADDMPuffer äquilibrierte 60 mL Anionenaustausch-Chromatographiesäule (110 x 26 mm, Fractogel
EMD TMAE Hicap(M), Merck) aufgetragen. Die Säule wurde bei einer Flussgeschwindigkeit
von 6 mL/min mit 60 mL ADDM-Puffer und 60 mL 33% BDDM-Puffer (150 mM NaCl)
gewaschen. Gebundene Proteine wurden mit einem linearen 75 mL Gradienten von 150 - 350
mM NaCl bei einer Flussgeschwindigkeit von 6 ml/min eluiert. Das Eluat wurde in 4 mL
Fraktionen gesammelt und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität bestimmt.
Fraktionen mit einer Aktivität von mehr als 10 μmol·min-1·mL-1 wurden vereinigt, mit
Elutionspuffer auf eine Imidazol-Endkonzentration von 20 mM eingestellt und mit 1 mL/min
auf eine in Bindepuffer äquilibrierte 15 mL Ni2+-IDA Affinitäts-Chromatographiesäule (20 x
48 mm, ProBond, Invitrogen) aufgetragen. Die Säule wurde bei einer Flussgeschwindigkeit
von 1 mL/min mit Bindepuffer gewaschen, bis die Absorbanz des Eluats bei 280 nm auf den
Wert des Puffers gesunken war. Die gebundenen Proteine wurden bei 1 mL/min mit einem
Stufengradienten von 25, 50, 75 und 100% Elutionspuffer (140, 260, 380 und 500 mM
Imidazol) eluiert. Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität, die ab einer
Imidazolkonzentration von 260 mM eluierten, wurden vereinigt und aufkonzentriert (100 kDa
MWCO, Amicon Ultra-15, Millipore, 4´000·g, 4°C, Rotor A-4-44, Centrifuge 5804R,
Eppendorf). Das Konzentrat wurde dreimal 1:10 mit ADDM-Puffer verdünnt und wieder
aufkonzentriert (100 kDa MWCO, Amicon Ultra-15, Millipore, 4´000·g, 4°C, Rotor A-4-44,
Centrifuge 5804R, Eppendorf), um die Imidazolkonzentration auf etwa 1 mM zu erniedrigen.
Anschließend wurde das Protein in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
3.7.4. Größenausschluss-Chromatographie
Um die Homogenität der Komplex I-Präparationen zu überprüfen, wurden mindestens 100 μL
Komplex I (300 µg in ADDM-Puffer) bei einer Flussrate von 0.5 mL/min auf eine mit ADDMPuffer äquilibrierte 24 mL Größenausschluss-Chromatographiesäule (10 x 300 mm, Superose
6 10/300 GL, GE Healthcare) aufgetragen und eluiert. Um die molekulare Masse der
Präparationen zu bestimmen, wurde die Säule mit Thyroglobulin (669 kDa), Ferritin (440
kDa), BSA (67 kDa), and RNase A (13.7 kDa) geeicht.
47
Material und Methoden
Für eine präparative Größenausschluss-Chromatographie wurden 250 µL Komplex I (1.5–2.5
mg in ADDM-Puffer) aufgetragen, 0.5 mL Fraktionen gesammelt und von diesen die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität bestimmt. Die vereinigten Fraktionen wurden
konzentriert (100 kDa MWCO, Amicon Ultra-15, Millipore, 4´000·g, 4°C, Rotor A-4-44,
Centrifuge 5804R, Eppendorf), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C
gelagert.
3.7.5 Aktivitätsbestimmungen
Bestimmung der (d-)NADH Oxidase Aktivität:
Die NADH und die desamino (d-)NADH Oxidase Aktivität cytoplasmatischer Membranen
wurde mit einer Clarke-Sauerstoffelektode (RE K1-1, Oxytec) bei 30°C gemessen. 5 - 10 μL
Membransuspension (200 - 600 μg Protein) wurden in 2 mL A*-Puffer vorgelegt und die
Reaktion durch Einspritzen von 5 μL 0.5 M (d-)NADH gestartet. Durch Zugabe von 20 μM
Piericidin A (10 mM in Ethanol) wurde die Reaktion gehemmt. Für die Berechnung der
Aktivität wurde von einer Sauerstoffkonzentration im Puffer von 237 μM (Weiss, 1970)
ausgegangen. Zur Eichung der Elektrode wurde das Signal des Sauerstoff-gesättigten Puffers
vor und nach Reduktion mit gesättigter Na2S2O4-Lösung aufgezeichnet.
Bestimmung der NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität:
Zur Bestimmung der artifiziellen NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität wurde etwa 20
pmol Enzym zum Testpuffer (50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, 1 mM K3[Fe(CN)6], 0.2
mM NADH, pH 6.0) gegeben und die Änderung der Absorbanz bei 410 nm, hervorgerufen
durch die Abnahme der [Fe(CN)6]3- Konzentration, verfolgt. Zur Berechnung der Aktivität
wurde ein molarer Extinktionskoeffizient
von ε410nm = 1 mM-1·cm-1 verwendet
(Friedrich et al., 1989).
Bestimmung der NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität:
Zur Messung der physiologischen Elektronentransferreaktion von Komplex I wurden 5 μg
Enzym (5 - 15 mg/mL in ADDM-Puffer) 1:1 (w/w) mit E. coli polaren Lipiden (10 mg/mL in
A-Puffer, 2% (w/v) DDM) vermischt und für 1 min auf Eis inkubiert (Stolpe & Friedrich,
2004). Das in Lipiden rekonstituierte Enzym wurde zu 60 μM Decyl-Ubichinon in 985 μL APuffer (30°C) gegeben und der Ansatz für 1 min unter Rühren inkubiert. Anschließend wurde
die Reaktion durch Zugabe von 15 μL 10 mM NADH gestartet und bei Bedarf durch Zugabe
von 20 μM Piericidin gehemmt. Die Aktivität wurde aus der zeitlichen Änderung der
48
Material und Methoden
Absorbanz bei 340 nm (ε340nm= 6.2 mM-1·cm-1, Hellma QS Küvetten, d = 1 cm; TIDAS II,
J&M) berechnet (Friedrich et al., 1994). Zur Bestimmung der Michaelis-Konstante KM und
der maximalen Aktivität wurde bei einer konstanten Decyl-Ubichinon Konzentration von 60
µM die NADH-Konzentration im Bereich von 5 bis 200 µM variiert und die Aktivitäten
gegen die NADH-Konzentration nach Hanes (1932) aufgetragen.
3.7.6. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Zusammensetzung einer Proteinprobe wurde mittels SDS-PAGE untersucht. Für eine
schnelle Auftrennung der Polypeptide (1h bei 30 mA) wurde ein diskontinuierliches
Gelsystem mit 4.9%igem Sammelgel und 16%igem Trenngel nach Laemmli (1970)
verwendet. Für eine verbesserte Auftrennung der Polypeptide wurde das diskontinuierliche
Gelsystem mit 3%igem Sammelgel und 10%igem Trenngel nach Schägger & von Jagow
(1987) verwendet. Hierbei ist jedoch die längere Laufzeit von etwa 2.5 h bei 30 mA zu
berücksichtigen.
Zur Probenvorbereitung wurden 50 - 100 μg Protein mit dem entsprechenden Laufpuffer
versetzt, für 30 min bei 30°C denaturiert und auf das Gel aufgetragen. Höhere Temperaturen
führen zur Aggregation der hydrophoben Proteine. Die Polypetide wurden bei konstanten 35
mA (EPS 600, Pharmacia Biotech) aufgetrennt, bis die Farbstoffbande die untere Gelkante
erreicht hatte. Die Proteinbanden wurden mit heißer Coomassie-Lösung (0.1 % (w/v)
Coomassie Brilliant Blue R250, 25% (v/v) Ethanol, 10% (v/v) Essigsäure) gefärbt und durch
anschließende Entfärbung des Hintergrunds mit 30% (v/v) Ethanol, 10% (v/v) Essigsäure
sichtbar gemacht.
3.7.7. Proteinbestimmung
Biuret-Methode:
Der Proteingehalt konzentrierter Proben wie z.B. der Membransuspensionen wurde nach der
Biuret-Methode (Gornall et al., 1949) bestimmt. Hierzu wurde die Proteinlösung mit 1 mL
6% (w/v) Trichloressigsäure versetzt und bei 20´800·g zentrifugiert (14´000 Upm, 1 min,
Rotor 45-30-11, Centrifuge 5804R, Eppendorf). Der Überstand wurde verworfen und das
Sediment mit 1 mL Biuret-Reagenz (0.2 M NaOH, 0.5% (w/v) Na-K-Tartrat, 0.3% (w/v)
CuSO4, 0.5% (w/v) KI) versetzt und für 30 min geschüttelt. Die Absorbanz wurde bei 546 nm
49
Material und Methoden
gemessen. Zur Korrektur gegen Störungen durch Lipide und Detergentien wurde der mit
einigen Körnchen KCN entfärbte Ansatz vermessen und die Differenzabsorbanz berechnet.
Die Eichgerade wurde mit 0 - 1 mg BSA ermittelt und jede Probe dreifach vermessen.
UV-spektroskopische Methode:
Es wurde die gegen reinen Puffer korrigierte Absorbanz des verdünnten aufgereinigten
Proteins bei 280 nm minus der bei 310 nm gemessen (TIDAS II, J&M). Die Korrektur wurde
aufgrund der Lichtstreuung durch das Protein und der Detergenzmizellen eingeführt. Zur
Berechnung der Konzentration gemäß des Lambert Beer´schen Gesetzes wurde der molare
Absorptionskoeffizient ε280nm und die molare Masse M aus der Aminosäuresequenz abgeleitet
(Gill & von Hippel, 1989). Für das NADH Dehydrogenase Fragment ergab sich ein ε280nm =
190 mM-1·cm-1und M = 170 kDa bzw. ε280nm = 781 mM-1·cm-1und M = 535 kDa für den
Komplex I.
3.7.8. Microsecond Freeze-hyperquenching (MHQ) Technik
Für die Aufnahme von Tieftemperatur ESR-Spektren zur Verfolgung der Reduktion des
Komplex I durch NADH im µs Bereich wurden die Proben mit der Microsecond Freezehyperquenching (MHQ) Technik angesetzt. Dazu wurde ein im Labor von Prof. Simon de
Vries (Department of Biotechnology, TU Delft, Niederlande) selbst entworfener
Versuchsaufbau in Zusammenarbeit
mit Herrn Marc Strampraad (Department of
Biotechnology, TU Delft) genutzt (Kap. 2.4). Für diese Untersuchungen wurden der Komplex
I oder das NADH Dehydrogenase Fragment mehrerer Präparationen jeweils vereinigt, die
Proteinkonzentration bestimmt, Portionen mit 1.0 bis 2.8 mg Protein in flüssigem Stickstoff
eingefroren und die Proben bis zu ihrer Verwendung bei -80°C gelagert. Zur Vorbereitung der
Proben für die MHQ Technik wurden die frisch aufgetauten Proteine bei 20´000·g
zentrifugiert (13´000 Upm, 2 min, 4°C, Rotor 45-30-11, Centrifuge 5804R, Eppendorf), um
eventuell denaturiertes Protein abzutrennen. 275 µL Komplex I (7-10 mg/mL, 14 -19 µM in
ADM-Puffer) oder 275 µL NADH Dehydrogenase Fragment (3.4 mg/mL, 20 µM in A-Puffer)
und 600 µL NADH (4 - 200 mM in ADM- bzw. A-Puffer) wurden auf zwei Injektionsschleifen
aufgetragen. Sollte der Komplex I in Lipide rekonstituiert werden, wurde das Enzym vor dem
Auftrag 1:1 (w/w) mit E. coli polaren Lipiden (20 mg/mL in A-Puffer, 2% (w/v) DDM)
vermischt und 1 min auf Eis inkubiert. Die für diese Proben verwendete NADH-Lösung
enthielt ebenfalls E. coli polare Lipide in der gleichen Konzentration. Zusätzlich wurde zu den
Komplex I Proben für eine weitere Messreihe 60 µM Piericidin A (10 mM in Ethanol)
50
Material und Methoden
gegeben, um die Kinetik des Elektronentransfers zu bestimmen. Um eine Probe vollständig zu
reduzieren, wurde die Proteinlösung vor dem Auftrag mit 5 µL 1 M NADH versetzt. Um eine
vollständig oxidierte Probe zu erhalten, wurden statt NADH 600 µL ADM- bzw. A-Puffer
aufgetragen. Durch Hochdruck Injektionsventile wurden die Protein- und die NADHLösungen mit zwei HPLC Pumpen bei einer Geschwindigleit von 1.8 bis 12 mL/min in einen
tangentialen Mikromixer in einer Niedrigdruckkammer (< 100 mbar) im Verhältnis 1:1
eingespritzt. Nach Austritt aus dem Mixer trafen die Proben in der Niedrigdruckkammer auf
die Wolframoberfläche eines mit flüssigem Stickstoff auf 77 K gekühlten rotierenden
Aluminiumzylinders und wurden so eingefroren. Die Flugzeit wurde dabei zwischen 63 µs
und 20.1 ms variiert, somit ergaben sich Reaktionszeiten von 97 µs bis 21.1 ms. Die
Niedrigdruckkammer wurde mit Stickstoff geflutet und der Zylinder sofort mit flüssigem
Stickkstoff gefüllt. Das Pulver wurde in flüssigem Stickstoff mit einem Holzlöffel von der
Zylinderoberfläche gesammelt und in speziell präparierten Plastikgefäßen in flüssigem
Stickstoff gelagert. Zur Herstellung von ESR-Proben wurde das Pulver in flüssigem Stickstoff
mit einem Trichter in ESR-Röhrchen überführt, deren Boden aus einem Polyethylenfilter
bestand.
3.7.9 ESR-Spektroskopie
Zur Charakterisierung von Fe-S-Zentren des isolierten Komplex I (5 mg/mL) wurden 300 µL
mit einigen Körnchen Na2S2O4 und 3 µL 1 M NADH reduziert und luftblasenfrei in ein EPR
Röhrchen überführt. Die Proben wurde
in einer Kältemischung (2-Methylbutan/
Methylcyclohexan 6:1 (v/v)) bei 150 K eingefroren und in flüssigen Stickstoff gelagert. Die
anderen Proben wurden wie oben beschrieben mittels MHQ hergestellt. Die Spektren wurden
bei 40 und 13 K mit einem EMX 6/1 ESR-Spektrometer (Bruker) und einem ESR-9 HeliumKryostaten (Oxford Instruments) aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.462 GHz,
die Modulationsamplitude 6 G und die Zeitkonstante 164 ms. Die mit der MHQ-Technik
angesetzten Proben wurden unter den gleichen Bedingungen vermessen. Wurden die Spektren
im Labor von Prof. Simon de Vries aufgenommen, betrug die Mikrowellenfrequenz 9.457
GHz und die Modulationsamplitude 10 G. Weitere Bedingungen der Messungen sind bei den
jeweiligen Abbildungen der Spektren vermerkt.
51
Ergebnisse
4. ERGEBNISSE
4.1 Isolierung des Komplex I und des NADH Dehydrogenase Fragmentes
4.1.1. Isolierung des Komplex I
Aus 35 g Zellen des E. coli Stammes ANN0221/pBADnuo nuoFHis wurden Membranen
präpariert und die darin befindlichen Proteine mit Dodecylmaltosid extrahiert. Mittels
Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel EMD Hicap und Affinitätschromatographie
an probond Ni2+-IDA wurde der Komplex I gereinigt, Abbildung 4-1 zeigt die zugehörigen
Elutionsprofile. Die Tabelle 4-1 gibt eine Übersicht über den Verlauf einer typischen
Präparation. Die Banden des SDS-Gel der gereinigten Proteine wurden anhand ihrer
apparenten molekularen Massen den Untereinheiten des Komplex I zugeordnet. Es wurden
sämtliche Untereinheiten in der Präparation nachgewiesen (Abb. 4-1).
Tabelle 4-1: Isolierung des E. coli Komplex I aus 35 g Zellen (Feuchtgewicht) des Stammes
ANN0221/pBADnuo nuoFHis.
Präparations-
Volumen
Protein
schritt
NADH/Ferricyanid
Ausbeute
Oxidoreduktase Aktivität
gesamt
spezifisch
[mL]
[mg]
[µmol·min-1]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
Membranen
22
1020
5106
6
100
Detergenzextrakt
29
980
4626
5
91
Fractogel EMD
71
241
2663
11
52
Probond Ni-IDA
14
7
784
121
15
52
Ergebnisse
A)
NaCl Konzentration [mM]
250
300
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
300
350
50
100
150
200
app. mol.
Masse [kDa]
85
1
2
NuoG
NuoCD
50
0
0
C)
250
Volumen [mL]
NuoF
NuoL
NuoM, N
25
B)
NuoH
NuoB, I
NuoE, J
Imidazol Konzentration [mM]
250
400
200
300
150
200
100
100
50
0
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
300
500
NuoA
NuoK
10
0
0
50
100
150
200
Volumen [mL]
Abbildung 4-1: Isolierung des Komplex I aus Zellen des E. coli Stammes ANN0221/pBADnuo nuoFHis.
Gezeigt sind die Elutionsprofile der Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel EMD Hicap (A) und
Affinitäts-Chromatographie an Pro Bond Ni2+ IDA (B) mit der Absorbanz bei 280 nm in schwarz, der
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in blau und der Lage des NaCl- bzw. Imidazol-Gradient in rot. C
zeigt das SDS-Gel nach Schägger & von Jagow (1987) der Präparation (Spur 2) mit dem Proteinstandard (Spur
1). Die Banden wurden anhand ihrer apparenten molekularen Massen den Komplex I-Untereinheiten zugeordnet.
300 µg des präparierten Proteins wurden auf eine Größenauschluß-Chromatographiesäule
aufgetragen, um die Homogenität der Präparation zu überprüfen. Das zugehörige
Elutionsprofil zeigt nur einen Gipfel im Massenbereich des Komplex I (Abb. 4-2). Einzelne
Präparationen zeigten jedoch einen zusätzlichen Elutionsgipfel im Bereich niedrigeren
Molekulargewichtes (Abb. 4-2). Die Fraktionen dieses Gipfels zeigten ebenfalls
NADH/Ferricyanid Oxidaseaktivität und nach einer SDS-PAGE hauptsächlich die Banden
des NADH Dehydrogenase Fragmentes (Daten nicht gezeigt). Das NADH Dehydrogenase
Fragment aus den Untereinheiten NuoE, NuoF und NuoG ist ein Zerfallsprodukt des Komplex
I. Es enthält die NADH-Bindestelle und das FMN und zeigt somit ebenfalls
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität. Da sich der His-tag des Komplex I N-terminal
an NuoF befindet, bindet auch das Fragment an die Affinitätssäule. In diesem Fall wurde die
Präparation durch eine präparative Größenausschluß-Chromatographie gereinigt und nur die
53
Ergebnisse
Fraktionen des Gipfels im höher molekularen Bereich vereinigt. Eine nachfolgende
analytische Größenausschluß-Chromatographie der vereinigten und konzentrierten Fraktionen
bestätigte die Homogenität des so gereinigten Komplex I (Daten nicht gezeigt).
B)
25
20
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
Absorbanz bei 280 nm [mAu]
A)
20
15
10
5
15
10
5
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Volumen [mL]
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Volumen [mL]
Abbildung 4-2: Homogenität der Komplex I Präparation. Gezeigt sind die Elutionsprofile der
Größenauschluss-Chromatographie einer homogenen Präparation (A) und einer Präparation, die teilweise in das
NADH Dehydrogenase Fragment zerfallen ist (B).
Die maximale NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktase Aktivität der Präparation wurde zu
2.6 ± 0.1 µmol·min-1·mg-1 bestimmt. Die Reaktion wird zu 90 % durch Piericidin A inhibiert.
Die Michaelis-Konstante KM zu NADH lag bei 13 ± 2 µM (Schulte, 2009). Die
enzymkinetischen Parameter liegen damit im Bereich der Literaturwerte (Stolpe, 2007; Pohl
et al., 2007c).
Im Verlaufe der Arbeit wurde der Expressionstamm gewechselt und der Komplex I im Stamm
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis überproduziert und aus diesem isoliert. Der Verlauf der
Präparationen entsprach dem Verlauf der Präparationen des Komplex I aus dem Stamm
ANN0221/pBADnuo nuoFHis (Kap. 4.3.6.).
54
Ergebnisse
4.1.2 Isolierung des NADH Dehydrogenase Fragmentes
Das NADH Dehydrogenase Fragment des Komplex I aus E. coli setzt sich aus den
Untereinheiten NuoE, NuoF und NuoG zusammen, enthält die NADH-Bindestelle, das FMN
und die Fe-S-Zentren N1a, N1b, N3, N4, N5 und N7. Es bildet damit den Elektroneneingang
des Komplexes. In dem Stamm BL21(DE)/pET11a nuoB-G nuoFSTII lässt sich dieses
hydrophile Fragment homolog überproduzieren und mittels Affinitätschromatographie an
StrepTactin aus dem Cytosol isolieren (Braun et al., 1998; Bungert et al., 1999). Aufgrund
seiner geringen Masse und seiner Löslichkeit ist das Fragment einfacher zu isolieren, im
Labor
leichter
zu
handhaben
und
bietet
somit
ein
gutes
System,
um
das
Elektroneneintrittsmodul des Komplex I zu charakterisieren.
Aus 35 g Zellen des Stammes BL21(DE3)/pET11a nuoB-G nuoFSTII wurde das Cytosol
präpariert
und
das
NADH
Dehydrogenase
Fragment
mittels
Anionenaustausch-
chromatographie an Fractogel EMD Hicap und Affinitätschromatographie an StrepTactin
Sepharose aufgereinigt. Die Tabelle 4-2 gibt eine Übersicht über den Verlauf der Präparation,
Abbildung 4-3 zeigt die zugehörigen Elutionsprofile und das SDS-Gel des gereinigten
Proteins. Die Proteinbanden des Gels wurden aufgrund ihrer apparenten molekularen Massen
den Untereinheiten NuoE, NuoF und NuoG zugeordnet. Die zusätzliche Bande unterhalb von
NuoG wird durch ein Abbauprodukt von NuoG hervorgerufen (Bungert et al., 1999).
Tabelle 4-2: Isolierung des NADH Dehydrogenase Fragmentes aus 35 g Zellen (Feuchtgewicht) des
Stammes BL21(DE3)/pET11a nuoB-G nuoFSTII.
Präparations-
Volumen
Protein
schritt
NADH/Ferricyanid
Ausbeute
Oxidoreduktase Aktivität
gesamt
spezifisch
[mL]
[mg]
[µmol·min-1]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
Cytosol
145
1595
10295
7
100
Fractogel EMD
110
440
5610
13
54
StrepTactin
17
6
984
164
10
55
Ergebnisse
A)
NaCl Konzentration [mM]
1000
250
800
200
600
150
400
100
200
50
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
1200
300
C)
app. mol.
Masse [kDa]
100.5
NuoG
49.5
NuoF
0
0
0
100
200
300
400
500
Volumen [mL]
B)
Absorbanz bei 280 nm [mAU]
1000
2000
800
1500
600
1000
400
500
200
0
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
1200
2500
18.6
NuoE
0
0
20
40
60
80
100
Volumen [mL]
Abbildung 4-3: Isolierung des NADH Dehydrogenase Fragmentes aus Zellen des E. coli Stammes
BL21(DE3)/pET11a
nuoB-G
nuoFSTII.
Gezeigt
sind
die
Elutionsprofile
der
Anionenaustausch-
Chromatographie an Fractogel EMD Hicap (A) und Affinitäts-Chromatographie an StrepTactin Sepharose (B)
mit der Absorbanz bei 280 nm in schwarz, der NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in blau und der Lage
des NaCl-Gradients in rot. C) zeigt das SDS-Gel nach Laemmli (1970) des gereinigten Fragments, die Banden
wurden anhand ihrer apparenten molekularen Massen NuoE, NuoF und NuoG zugeordnet.
4.2. Die Reduktion der Fe-S-Zentren durch NADH
Die katalytische Reaktion des Komplex I ist mit einer Elektronentransferrate von NADH auf
Ubichinon mit etwa 100 s-1 zu schnell, um die Elektronenübertragungsprozesse zwischen den
Fe-S-Zentren innerhalb des Enzyms durch Standardmessmethoden zu erfassen. Eine weitere
Schwierigkeit ist, dass die Reduktion der einzelnen Fe-S-Zentren nur durch ESRSpektroskopie und nur bei Temperaturen von weniger als 40K eindeutig bestimmt werden
kann. Aus diesen Gründen liegen bisher kaum Erkenntnisse über die Kinetik des
Elektronentransfers zwischen den Fe-S-Zentren vor. In dieser Arbeit sollte die im Labor von
Prof. Simon de Vries (Department of Biotechnology, TU Delft, Niederlande) entwickelte
56
Ergebnisse
Microsecond Freeze-hyperquenching (MHQ) Technik genutzt werden, die ein schnelles
Mischen von Enzym und Substrat in einem Mikromixer und ein augenblickliches Beenden
der Reaktion durch Einfrieren der Probe ermöglicht.
Zur Bestimmung der Reduktion der Fe-S-Zentren nach einem definierten Zeitpunkt mit der
MHQ-Technik werden mindestens 2 mg Komplex I benötigt. Die große Proteinmenge
resultiert daraus, dass etwa die Hälfte während des Verfahrens verloren geht (Prof. Simon de
Vries, pers. Mitteilung) und nur so ausreichend hohe Proteinkonzentrationen für die ESRSpektroskopie erreicht werden. Aus diesem Grund wurden mehrere Komplex I Präparationen
vereinigt, aliquotiert schockgefroren und bis zu ihrer Verwendung bei – 80 °C gelagert.
Für eine erste Datenreihe wurden jeweils 275 µL Komplex I (7.4 mg/ml in ADDM, 14 µM) und
600 µL NADH (4 mM in ADDM) in die beiden loops des MHQ-Aufbaus injiziert und
insgesamt acht Proben mit Reaktionszeiten zwischen 97 µs und 21.1 ms angesetzt. Zusätzlich
wurden ebenfalls mit dem MHQ-System eine oxidierte und eine vollreduzierte Probe
eingefroren. Die ESR-Spektren wurden in Zusammenarbeit mit Prof. S. de Vries in Delft
aufgenommen. Zum Vergleich wurde ein Aliquot mit NADH reduziert und vermessen, ohne
die MHQ-Technik anzuwenden (Abb. 4-4).
57
Ergebnisse
A)
B)
oxidiert
oxidiert
97 µs
97 µs
131 µs
131 µs
209 µs
209 µs
395 µs
395 µs
794 µs
794 µs
2.2 ms
6.0 ms
2.2 ms
21 ms
6.0 ms
reduziert
reduziert
N1a
N1b
N4
N1a
N1b
N2
N3
N1a
330
335
340
345
Magnetfeld [mT]
350
N2
355
320
330
340
350
N4
N3
360
Magnetfeld [mT]
Abbildung 4-4: ESR-Spektren des Komplex I zu verschiedenen Zeitpunkten nach Reduktion mit NADH
bei 40 K (A) und 13 K (B). Beim Ansetzen der Proben wurden Komplex I (14 µM) in ADDM-Puffer mit 4 mM
NADH gemischt und nach den angegebenen Reaktionszeiten eingefroren. Zum Vergleich sind die Spektren der
vollständig reduzierten Proben gezeigt, die mit bzw. ohne Verwendung der MHQ-Technik angesetzt wurden.
Die Spektren bei 40 K wurden mit einer Mikrowellenleistung von 5 mW und die Spektren bei 13 K mit einer
Leistung von 10 mW aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.457 GHz, die Modulationsamplitude 1
mT, die Zeitkonstante 164 ms und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min. Pro Spektrum wurden zwei
Scans aufgenommen.
Das intensive Signal im Bereich von g = 2.0 ist ein Artefakt, es tritt in allen Spektren der mit
der MHQ Technik angesetzten Proben einschließlich der oxidierten Probe auf. Dieses Signal
wurde auch in den Spektren anderer mit der MHQ Technik angesetzten Proteinproben
beobachtet. Der Ursprung dieses Signals ist nicht bekannt (Prof. S. de Vries, pers. Mitteilung).
Dieses Artefakt lässt eine Auswertung der gz-Werte der Signale der Fe-S-Zentren des
Komplex I nicht zu. Die Spektren der mit der MHQ Technik angesetzten, voll reduzierten
Probe zeigen im g x und gy Bereich jedoch die gleichen Signale wie das Vergleichsspektrum
der voll reduzierten Probe. Die gx und gy Werte der Zentren stimmen bei beiden Temperaturen
mit den Literaturwerten überein (Leif et al, 1995; Uhlmann & Friedrich 2005). Bei 40 K sieht
man das Signal von N1a (gx = 1.92 und gy = 1.96) und N1b (gx, gy = 1.94), bei 13 K zusätzlich
die Signale von N2 (gx, gy = 1.91), N3 (gx, gy = 1.88, 1.92) und N4 (gx, gy = 1.89, 1.93). Die
bei 40 K aufgenommen Spektren zeigen ab einer Reaktionszeit von 794 µs die Signale der Fe58
Ergebnisse
S-Zentren N1a und N1b, die Intensitäten der Signale nehmen mit steigender Reaktionszeit zu
und erreichen im Spektrum der Probe nach einer Reaktionszeit von 6 ms die Intensitäten der
Signale des voll reduzierten Spektrums. Die bei 13 K aufgenommen Spektren zeigen erst ab
dem Zeitpunkt von 2.2 ms die Signale der vierkernigen Fe-S-Zentren. Die Intensitäten der
Signale der vollreduzierten Probe wurden nach 6 ms Reaktionszeit erreicht.
Zusätzlich wurde eine Messreihe mit dem NADH Dehydrogenase Fragment aufgenommen,
dieses hydrophile Fragment enthält die NADH-Bindestelle, das FMN und die Fe-S-Zentren
N1a, N1b, N3, N4 und N5. Jeweils 275 µl des präparierten Fragmentes (3.4 mg/mL, 20 µM in
A-Puffer) und 600 µL NADH (5 mM in A-Puffer) wurden injiziert und zu insgesamt sieben
Zeitpunkten im Bereich zwischen 97 µs und 60.9 ms Proben angesetzt. Außerdem wurden
eine voll reduzierte und eine oxidierte Probe mit der MHQ-Technik eingefroren. Die ESRSpektren wurden in Zusammenarbeit mit Prof. S. de Vries in Delft bei 40 K (Abb. 4-5) und 13
K (Daten nicht gezeigt) aufgenommen.
oxidiert
97 µs
131 µs
198 µs
404 µs
794 µs
1.2 ms
2.2 ms
6 ms
21 ms
60.9 ms
reduziert
N1a
N1b
300
320
N1a
340
360
380
Magnetfeld [mT]
Abbildung 4-5: ESR-Spektren des NADH Dehydrogenase Fragmentes zu verschiedenen Zeitpunkten der
Reduktion mit NADH bei 40K. Das NADH Dehydrogenase Fragment (20 µM) in A-Puffer wurde mit 5 mM
NADH gemischt und nach den angegebenen Reaktionszeiten eingefroren. Zum Vergleich ist das Spektrum der
vollständig reduzierten Probe gezeigt, die unter Verwendung der MHQ-Technik angesetzt wurde. Die Spektren
wurden mit einer Mikrowellenleistung von 5 mW aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.44 GHz,
die Modulationsamplitude 0.6 mT, die Zeitkonstante 164 ms und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min.
Pro Spektrum wurden vier Scans aufgenommen.
59
Ergebnisse
Auch bei den Proben des NADH Dehydrogenase Fragmentes tritt das Artefakt im Bereich von
g = 2.0 auf. Somit ist auch in diesem Fall eine Auswertung der g z-Werte nicht möglich. Das
Spektrum der voll reduzierten Probe zeigt die Signale der beiden zweikernigen Zentren N1a
und N1b im gx und gy Bereich, die g-Werte stimmen mit den Literaturwerten überein (Braun
et al., 1998; Bungert et al, 1999). Die bei 13 K aufgenommenen Spektren des NADH
Dehydrogenase Fragments zeigten keine Signale. Die schon geringe Intensität der Signale bei
40 K lassen vermuten, dass die Proteinkonzentration der Proben zu gering war, um die
Signale bei 13 K zu detektieren. Im Gegensatz zu den Komplex I Proben zeigen die Spektren
des NADH Dehydrogenase Fragmentes schon ab einer Reaktionszeit von 131 µs Signale der
Fe-S-Zentren N1a und N1b und die Intensität dieser Signale ist zum Reaktionszeitpunkt von
404 µs schon deutlich erhöht. Auch in dieser Datenreihe nimmt mit steigender Reaktionszeit
die Intensität der Signale zu und nach 6 ms wird die Intensität der voll reduzierten Probe
erreicht. Aus den relativen Intensitäten des Signals bei g = 1.92 (N1a) und bei g = 1.94 (N1b)
lässt sich ablesen, dass die Reduktion des Fe-S-Zentrums N1a früher stattfindet als die des FeS-Zentrums N1b.
Die Komplex I Präparation enthält pro Enzym drei Moleküle Ubichinon (M. Kaufenstein,
pers. Mitteilung). Es ist also möglich, dass bei der Reaktion die Elektronen auf Ubichinon
übertragen werden. Das NADH Dehydrogenase Fragment enthält die Elektronentransportkette
nur bis zum Fe-S-Zentrum N5, die übrigen Fe-S-Zentren sowie die Ubichinonbindestelle
fehlen. Das Fragment nimmt also Elektronen vom NADH auf, kann diese im Gegensatz zum
Komplex I aber nicht auf einen Elektronenakzeptor abgeben. Möglicherweise ist das der
Grund für den unterschiedlichen Reduktionsgrad der Fe-S-Zentren im Komplex I und im
NADH Dehydrogenase Fragment zu gleichen Reaktionszeitpunkten. Um zu vermeiden, dass
die Elektronen im Komplex I über das Ubichinon abgegeben werden und somit ein „steady
state“ gemessen wird, sollten für eine weitere Datenreihe die Komplex I Proben mit dem
Inhibitor Piericidin A versetzt werden. Piericidin A bindet im Komplex I an der
Ubichinonbindestelle und verhindert damit die Bindung und die Reduktion des Ubichinons
(Friedrich et al., 1994). Damit wäre gewährleistet, dass die Elektronen des ersten gebundenen
NADH detektiert werden.
Vor der Aufnahme einer neuen Datenreihe sollte überprüft werden, ob eine Erhöhung der
NADH Konzentration Einfluss auf die Intensität der Signale der Fe-S-Zentren hat. Der KMWert zu NADH liegt für den E. coli Komplex I bei 10 µM (Stolpe, 2007; Pohl, 2008; vgl.
60
Ergebnisse
Kap. 4.1.1.). Die NADH Konzentration von 4 mM lag bei einem 400-fachen des KM-Wertes.
Damit sollte die Reaktion unabhängig von der NADH Konzentration sein. Bei den während
der Entstehung dieser Arbeit veröffentlichten Experimenten mit dem E. coli Komplex I in
einem ähnlichen Versuchsaufbau wurden bei gleicher Proteinkonzentration 200 mM NADH
eingesetzt (Verkhovskaya et al., 2008). Daher wurden das NADH Dehydrogenase Fragment
mit 4 mM und 200 mM NADH reduziert und Proben nach Reaktionszeiten von 97 µs und
794 µs eingefroren und vermessen. Dabei war die Intensität der Signale der mit 200 mM
NADH reduzierten Probe nach einer Reaktionszeit von 97 µs um das 4-fache gegenüber der
Probe mit 4 mM NADH erhöht. Die Probe nach 794 µs zeigte mit 200 mM NADH eine 1.5fach größere Signalintensität (Daten nicht gezeigt). Alle weiteren Proben wurden aus diesem
Grund mit 200 mM NADH angesetzt.
Um den Einfluß des Piericidin A auf die Kinetik des Komplex I zu messen, wurde je eine
Datenreihe von Proben mit und ohne Piericidin A angesetzt. Zusätzlich sollte der Komplex I
durch Rekonstitution in E. coli polare Lipide stabilisiert werden. Dazu wurde der Komplex I
im Verhältnis 1:1 (w/w) mit E. coli polaren Lipiden (20 mg/mL in A-Puffer, 2 % DDM (w/v))
inkubiert, so dass sich eine Proteinkonzentration von 8.4 mg/mL (16 µM) ergab. Die NADHLösung (Endkonzentration: 200 mM in ADDM) wurde auf die gleiche Lipidkonzentration
eingestellt. Vor dem Mischen der Proben in der MHQ-Apparatur wurden der rekonstituierte
Komplex I gegebenenfalls mit Piericidin A (Endkonzentration: 60 µM) versetzt und 1 min auf
Eis inkubiert. 275 µL des Komplex I Ansatzes und 600 µL der NADH-Lösung wurden
injiziert und insgesamt jeweils acht Proben mit und ohne Piericidin A angesetzt. Die
Reaktionszeiten wurden von 97 µs bis 21.1 ms variiert. Zusätzlich wurden eine oxidierte und
eine vollreduzierte Probe mit der MHQ-Technik eingefroren. Von den Proben wurden ESRSpektren bei 33 K (Abb. 4-6) und bei 11 K (Abb. 4-8) in Zusammenarbeit mit Prof. S. de
Vries in Delft aufgenommen.
61
Ergebnisse
B)
A)
oxidiert
oxidiert
97 µs
97 µs
131 µs
131 µs
198 µs
198 µs
404 µs
404 µs
794 µs
794 µs
1.2 ms
1.2 ms
2.2 ms
2.2 ms
6.0 ms
6.0 ms
21 ms
1.94
340
350
360
Magnetfeld [mT]
21 ms
1.92
370
1.94
340
350
360
1.92
370
Magnetfeld [mT]
Abbildung 4-6: ESR-Spektren des Komplex I in Lipiden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der
Reduktion mit NADH bei 40 K. A) zeigt die Spektren der Proben mit Piericidin A, B) die Spektren der Proben
ohne den Hemmstoff. In E. coli polare Lipide rekonstituierter Komplex I (16 µM) wurde mit 200 mM NADH
gemischt und nach den angegebenen Reaktionszeiten sind eingefroren. Die Spektren wurden mit einer
Mikrowellenleistung von 5 mW aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.457 GHz, die
Modulationsamplitude 1 mT, die Zeitkonstante 164 ms und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min. Pro
Spektrum wurden drei Scans aufgenommen.
Die bei 40 K aufgenommenen ESR-Spektren der Komplex I Proben mit und ohne Piericidin
A zeigen die für die Fe-S-Zentren N1a und N1b erwarteten Signale. Die Amplituden der
Signale bei gx = 1.92 (N1a) und gx,y = 1.94 (N1b) wurden jeweils gegen die Reaktionszeit
aufgetragen und an eine exponentielle Kurve angepasst (Abb. 4-7). Aus dieser Anpassung
ergeben sich für die Reduktion der Fe-S-Zentren die in der Tabelle 4-3 zusammengefassten
Zeitkonstanten τ, also die Zeitpunkte an denen die Fe-S-Zentren zu 63.2 % reduziert
vorliegen.
62
Ergebnisse
B)
1,0
1,0
0,8
0,8
Grad der Reduktion
Grad der Reduktion
A)
0,6
0,4
0,2
0,0
0,6
0,4
0,2
0,0
0
5000
10000
15000
20000
0
5000
10000
Zeit in µs
15000
20000
Zeit in µs
Abbildung 4-7: Kinetik der Reduktion der Fe-S-Zentren N1a und N1b. Gezeigt ist der Grad der Reduktion
der Fe-S-Zentren abgelesen aus den Amplituden der ESR-Signale zu den jeweiligen Zeitpunkten bei gx = 1.92
(N1a) in rot und bei gx,y = 1.94 (N1b) in schwarz. A) zeigt die Daten der Proben mit Piericidin A und B) zeigt die
Proben ohne Hemmstoff.
Tabelle 4-3: Zeitkonstanten τ der Reduktion der Fe-S-Zentren N1a und N1b. Die Werte ergeben sich aus
der Abbildung 4-7.
τ [ms]
Komplex I mit Piericidin A
N1a
(g = 1.92)
3.0
N1b
(g = 1.94)
4.3
Komplex I ohne Piericidin A
2.5
4.4
Die Zeitkonstanten τ geben Aufschluss über die Reihenfolge und die Geschwindigkeit der
Reduktion der einzelnen Fe-S-Zentren. Sowohl bei der Reaktion mit als auch ohne Piericidin
A wird zuerst
das Fe-S-Zentrum N1a reduziert. N1a ist
nicht
der Teil der
Elektronentransportkette zwischen dem FMN und der Ubichinonbindestelle, seine Lage im
Protein lässt nur eine Elektronenübertragung vom und zum FMN zu. Die ESR-Spektren
zeigen, dass N1a während der physiologischen Reaktion reduziert wird. Die Zeitkonstanten
der Reduktion des N1b, welches nach dem vierkernigen Fe-S-Zentrum N3 an der zweiten
Position der Elektronentransportkette liegt, sind unter beiden Bedingungen gleich. Die
Zeitkonstante der Reduktion des N1a ist in Anwesenheit des Inhibitors um 20% erhöht. Ob es
sich dabei um eine echte Abweichung handelt, ist nicht eindeutig, da die Bestimmung des
Reduktionsgrades der Fe-S-Zentren über die Amplituden der Signale stark fehlerbehaftet ist.
63
Ergebnisse
Um dies zu weiter zu klären, ist die Kenntnis der Zeitkonstanten der Reduktion des Fe-SZentrums N2, welches die Elektronen auf das Ubichinon überträgt, notwendig (siehe unten).
Die in dieser Arbeit bestimmten Zeitkonstanten der Reduktion der beiden zweikernigen Fe-SZentren des Komplex I sind deutlich höher, als die in einem ähnlichen Experiment
bestimmten Zeitkonstanten mit ~ 90 µs für N1a und ~ 1.2 ms für N1b (Verkhovskaya et al.,
2008). Nach Angaben der Autoren wurde die verwendete Mischungstechnik dem im Labor
von Prof. S. de Vries entwickelten Aufbau nachgebildet. Die Einfriertechnik wurde einem
dritten Freeze-quench Aufbau entnommen (Lin et al., 2003). Eine Charakterisierung der
Apparatur, also die Berechnung der Mischungszeit, der Flugzeit der Probe und der
Einfrierzeit liegt nicht vor. Es lässt sich also nicht beurteilen, ob die unterschiedlichen
Zeitkonstanten auf das Experiment an sich oder auf die unterschiedlichen Aufbauten
zurückzuführen sind. Das Abweichen der Werte um mehr als 2 ms aufgrund unterschiedlicher
Präparationen ist unwahrscheinlich.
B)
A)
oxidiert
oxidiert
97 µs
97 µs
131 µs
131 µs
198 µs
198 µs
404 µs
404 µs
794 µs
794 µs
1.2 ms
1.2 ms
2.2 ms
2.2 ms
6.0 ms
6.0 ms
21 ms
21 ms
N2
340
345
350
355
N2
N3, N4
360
Magnetfeld [mT]
365
340
345
350
N3, N4
355
360
365
Magnetfeld [mT]
Abbildung 4-8: ESR-Spektren des Komplex I in Lipiden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Reduktion
mit NADH bei 11 K. A) zeigt die Spektren der Proben mit Piericidin A, B) zeigt die Spektren der Proben ohne
den Hemmstoff. In E. coli polare Lipide rekonstituierter Komplex I (16 µM) wurde mit 200 mM NADH
gemischt und nach den angegebenen Reaktionszeiten eingefroren. Die Spektren wurden mit einer
Mikrowellenleistung von 5 mW aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.457 GHz, die
Modulationsamplitude 1 mT, die Zeitkonstante 164 ms und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min. Pro
Spektrum wurden drei Scans aufgenommen.
64
Ergebnisse
Eine kinetische Analyse der Reduktion der vierkernigen Fe-S-Zentren N2, N3 und N4 ist
aufgrund der Überlagerung der Signale und der fehlenden g z-Werte schwierig. Die bei 11 K
aufgenommen Spektren der Proben mit Piericidin A (Abb. 4-8) zeigen ab einem
Reaktionszeitpunkt von 404 µs ein Signal, dieses wird dem Fe-S-Zentrum N2 zugeordnet
(gx,y = 1.91). Die Spektren der Proben ohne den Hemmstoff zeigen das entsprechende Signal
erst ab einem Zeitpunkt von 794 µs. In den Spektren der Proben sowohl mit als auch ohne
Hemmstoff treten nach 1.2 ms zusätzliche Signale auf, die vermutlich durch N3 (g x = 1.88,
gy = 1.92) und N4 (gx = 1.89 gy = 1.93) hervorgerufen werden. Die späte Reduktion des N2 in
den Proben ohne Hemmstoff resultiert möglicherweise aus einer Übertragung der Elektronen
von N2 auf Ubichinon. Insgesamt ist aber der Verlauf der Reduktion der vierkernigen Fe-SZentren bei den Proben mit Hemmstoff ähnlich zu dem Verlauf der Proben ohne Hemmstoff.
Das lässt vermuten, dass der Unterschied der Zeitkonstanten der Reduktion des N1a der
Proben mit und ohne Piericidin A (Tab. 4-3) nicht signifikant ist.
Auch die Ergebnisse zum zeitlichen Verlauf der Reduktion des Fe-S-Zentrums N2
unterscheiden sich bezüglich der Zeitskala deutlich von den bisher veröffentlichten
Ergebnissen. Die in einem Experiment mit ähnlichem Aufbau bestimmte Zeitkonstante der
Reduktion des N2 betrug ~ 90 µs und nach Angaben der Autoren wurde ein geringer Anteil
erst nach 1 - 2 ms reduziert. Für die Reduktion des in dieser Veröffentlichung dem Fe-SZentrum N6b zugeordneten Signal wurde eine Zeitkonstante von ~ 1.2 ms bestimmt
(Verkhovskaya et al., 2008). Allerdings wurde dieses Fe-S-Zentrum bislang ESRspektroskopisch nicht eindeutig beschrieben (Rasmussen et al., 2001; Belevich et al., 2007;
Ohnishi & Nakamura-Ogiso, 2008). Die Reduktion der Fe-S-Zentren N3 und N4 wurde in der
Veröffentlichung von Verkhovskaya et al. nicht betrachtet.
4.3 Die Bedeutung des Fe-S-Zentrums N1a
4.3.1 Mutagenese des Bindemotivs des Fe-S-Zentrums N1a
Das Fe-S-Zentrum N1a wird im Komplex I aus E. coli von den vier Cysteinen C92, C97,
C133 und C137 auf der Untereinheit NuoE koordiniert. Um einen Komplex I ohne N1a oder
mit einer veränderten Umgebung des Fe-S-Zentrums zu erhalten, sollten diese Cysteine
jeweils gegen Alanine oder Serine ausgetauscht werden. Die Charakterisierung der daraus
resultierenden Varianten sollte Aufschluss über die Funktion des Fe-S-Zentrums geben. Es
65
Ergebnisse
wird vermutet, dass N1a durch zeitweilige Aufnahme eines Elektrons die Radikalbildung am
FMN verhindert und somit die Bildung von für den Organismus schädlichen reaktiven
Sauerstoffspezies am Komplex I vermindert. Alternativ könnte das Fe-S-Zentrum N1a ähnlich
wie das Fe-S-Zentrum N7 ein evolutionäres Relikt darstellen (Kap. 2.2.1.) und aus
strukturellen Gründen weiterhin im Komplex I vorliegen.
Das Plasmid pBADnuo nuoFHis, welches das gesamte nuo-Operon enthält, ist aufgrund seiner
Größe von mehr als 20 kbp für die Mutagenese nach der QuikChange Methode nicht direkt
zugänglich. Aus diesem Grund wurden die Punktmutationen in den Subklon pCA24NnuoE
eingefügt, der lediglich das Gen nuoE enthält. Das mutierte Gen wurde dann mittels λ-Red
vermittelter Rekombination in das Plasmid pBADnuo nuoFHis eingebracht. Dazu wird der
Stamm DH5Δnuo/pkD46 als Wirt benötigt. In diesen Zellen ist das nuo-Operon im Genom
deletiert, das Plasmid pkD46 kodiert für das Rekombinasesystem. Als Selektionsmarker
wurde die nptI-sacB-Kassette verwendet, die einerseits eine Kanamycin Resistenz vermittelt,
andererseits in saccharosehaltigen Medien zum Zelltod führt (Kap. 2.2.2).
Die bei der QuikChange Mutagenese mittels Phusion DNA Polymerase eingesetzten
Oligonukleotide sind in Tabelle 3-3 aufgeführt. Als Vorlage-DNA wurde das Plasmid
pCA24NnuoE genutzt. DH5α Zellen wurden mit dem Ansatz transformiert, einzelne Kolonien
auf LB-Platten mit Chloramphenicol kultiviert und die Plasmide isoliert. Der Erfolg der
ortsgerichtenen Mutagenese wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung bestätigt.
Mit Hilfe des Restriktionsenzyms BamHI wurde ein, das Gen nuoE enthaltendes, Fragment
aus dem Plasmid herausgeschnitten und nach präparativer Gelelektrophorese isoliert. Dieses
Fragment diente als Vorlage-DNA für die nachfolgende PCR zur Vervielfältigung des
mutierten Gens, das so für die λ-Red vermittelte Rekombination zur Verfügung stand. Die
Restriktion mit BamHI war notwendig, da das Plasmid pCA24NnuoE dieselbe Resistenz
vermittelt wie das Plasmid pBADnuo nuoFHis und somit bei der anschließenden
Rekombination stört. Bei PCR Ansätzen mit pCA24NnuoE als Vorlage-DNA war es nicht
gelungen, nur durch DpnI-Verdau den Ansatz vom Plasmid vollständig zu befreien.
Für die Rekombination wurde zuerst die Resistenzkassete nptI-sacB mit den Oligonukleotiden
nuoE::nptI-sacB fwd und nuoE::nptI-sacB rev und dem Plasmid pVO1100 als Vorlage-DNA
vervielfältig. In einem ersten Rekombinationsschritt wurde die Resistenzkassette in pBADnuo
nuoFHis eingefügt. Dazu wurden Zellen des Stammes DH5Δnuo/pkD46 mit 20 ng pBADnuo
66
Ergebnisse
nuoFHis
transformiert
und
anschließend
einzelne
Kolonien
auf
LB-Platten
mit
Chloramphenicol kultiviert. Aus 2 mL Vorkultur wurde die Plasmid-DNA isoliert. Der Erfolg
der Transformation wurde durch Restriktionsverdau bestätigt. Mit derselben Vorkultur wurde
LB-Medium angeimpft und elektrokompetente Zellen für die Rekombination hergestellt. Die
elektrokompetenten Zellen DH5Δnuo/pkD46 pBADnuo nuoFHis wurden mit 400 ng nptIsacB transformiert, einzelne Kolonien auf LB-Platten mit Kanamycin selektiert und die
Plasmid-DNA isoliert. Das Gel nach Restriktion des Ansatzes mit PvuI und CpoI (Abb. 4-9A)
zeigte die Banden sowohl des Plasmids pBADnuo nuoFHis nuoE::nptI-sacB und als auch die
des Plasmids pBADnuo nuoFHis (Tab. 4-4). Vermutlich bildeten sich während der
Rekombination lineare und zirkuläre Multimere aus den Sequenzen beider Plasmide, diese
Multimere
wurden
häufig
nach
dem
Rekombinationsschritt
zum
Einfügen
der
Resistenzkassette beobachtet (Pohl, 2008). Um diese zu trennen, wurden 320 ng des
Gemisches mit 8 U des Restriktionsenzyms SacI, das in beiden Plasmiden jeweils nur einmal
schneidet, verdaut. DH5α Zellen wurden mit dem Ansatz transformiert, einzelne Kolonien
kultiviert,
davon
Stammkulturen
angelegt
und
die
Plasmid-DNA
isoliert.
Nach
Restriktionsverdau zeigte das Agarosegel nur die Banden des Plasmids pBADnuo nuoFHis
nuoE::nptI-sacB (Abb. 4-9B, Tab. 4-4).
Tabelle 4-4: Erwartete Fragmentlängen nach Restriktion der Plasmide pBADnuo nuoFHis nuoE::nptIsacB und pBADnuo nuoFHis mit PvuI und CpoI.
pBADnuo nuoFHis nuoE::nptI-sacB
pBADnuo nuoFHis
[bp]
[bp]
12´690
12´690
8´903
5´898
1´078
1´078
844
844
613
365
365
343
343
67
Ergebnisse
A)
1
2
[kbp]
19329
6223
1489
B)
1
2
[kbp]
19329
6223
1489
Abbildung 4-9.: Restriktionsanalysen zum Nachweis des Plasmids pBADnuo nuoFHis nuoE::nptI-sacB.
Gezeigt ist die Plasmidpräparation nach der Rekombination (A, Spur 1) mit den Banden des Plasmidgemischs
(Tab. 4-4) und die Plasmidpräparation nach SacI-Verdau (B, Spur 1) mit den erwarteten Banden des pBADnuo
nuoFHis nuoE::nptI-sacB (Tab. 4-4). Spur 2 zeigt jeweils den DNA Längenstandard.
Im zweiten Rekombinationsschritt wurden elektrokompetente DH5αΔnuo/pKD46 Zellen mit
50 ng pBADnuo nuoFHis nuoE::nptI-sacB und 400 ng des mutierten Gens nuoE
kotransformiert, einzelne Kolonien auf YP/SUC-Platten mit Chloramphenicol kultiviert und die
Plasmid-DNA isoliert. Der Erfolg der Rekombination wurde durch Restriktionsverdau und
Sequenzierung bestätigt.
4.3.2. Komplex I vermittelte Aktivität der cytoplasmatischen Membranen aus den
Mutanten ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoECXA
Bei der Arbeit zu Teilen dieses Kapitels wurde Frau Elvira Friedrich im Rahmen ihrer
Diplomarbeit (2008) angeleitet. Elektrokompetente Zellen des Stammes ANN0221 wurde mit
den in Kapitel 4.3.1 beschriebenen Plasmiden transformiert und in LB-Medium mit
Chloramphenicol kultiviert. Die so generierten Überexpressionstämme wurden als
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoEC97A, nuoEC133A und nuoEC137A bezeichnet. Die
Mutanten und der Ausgangsstamm ANN0221/pBADnuo nuoFHis wurden in 400 mL LBMedium mit Chloramphenicol angezogen und episomal kodierte Gene bei einer OD 600 von
0.1 durch Induktion des araBAD-Promotors exprimiert (Abb. 4-10).
68
Ergebnisse
5
4
OD600
3
2
1
0
0
50
100
150
200
250
300
Zeit [min]
Abbildung 4-10: Wachstumskurven der Mutante ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoEC97A (-■-) und des
Ausgangsstammes ANN0221/pBADnuo nuoFHis (-▲-). Bei einer OD600 von 0.1 wurde mit Arabinose
induziert. Die Wachstumskurven der anderen Alanin-Mutanten zeigten den gleichen Verlauf.
Die Wachstumskurven der Mutanten und des Ausgangsstammes sind sehr ähnlich, es wird
jeweils eine OD600 von etwa 4.5 erreicht. Im Genom des Stammes ANN0221 ist im Genom
das Gen ndh der alternativen NADH Dehydrogenase inaktiviert, außerdem ist in das Gen
nuoB eine Kanamycin Resistenzkassette insertiert (Kap. 2.2.2.). Ohne das entsprechende
Plasmid ist dieser Stamm also weder in der Lage die alternative Dehydrogenase noch den
Komplex I zu produzieren, was zur Folge hat, dass die Zellen auch nach 300 min eine OD 600
von weniger als 0.3 erreichen (Spehr, 1996). Das Wachstum der Mutanten bis zu einer OD 600
von 4.5 zeigt an, das die episomal kodierten Gene exprimiert wurden und in den Mutanten ein
aktiver Komplex I vorliegt.
69
Ergebnisse
Tabelle 4-5: Komplex I-vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Alanin-Mutanten
und des Ausgangsstammes ANN0221/pBADnuo nuoFHis. Um den unterschiedlichen Komplex I-Gehalt in der
Membran
zu
berücksichtigen,
wurde
die
NADH
Oxidase
Aktivität
auf
die
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität normiert. PicA steht für Piericidin A.
Stamm
NADH/Ferricyanid
Oxidoredukatseaktivität
NADH Oxidase
Aktivtät
Inhibition
durch PicA
Normierte NADH
Oxidase Aktivität
[µmol·min-1·mg-1]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
[µmol·min-1·mg-1]
ANN0221/pBADnuo
nuoFHis
5.6
0.36
92
0.36
ANN0221/pBADnuo
nuoFHis nuoE C97A
3.3
0.27
94
0.46
ANN0221/pBADnuo
nuoFHis nuoE C133A
4.8
0.24
86
0.28
ANN0221/pBADnuo
nuoFHis nuoE C137A
3.8
0.23
88
0.34
Die Membranen der Mutanten wurden präpariert und deren NADH Oxidase und
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität bestimmt (Tab. 4-5). Die Membranen jeder
Mutante zeigten eine NADH Oxidase Aktivität, die durch Piericidin A fast vollständig
gehemmt wurde. Da die vom Komplex katalysierte Reaktion der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Elektronenübertragung in der aeroben E. coli Atmungskette ist
und da diesen Stämmen die alternative NADH Dehydrogenase fehlt, gibt die NADH Oxidase
Aktivität der Membranen Aufschluss über die Aktivität der verschiedenen Komplex I
Varianten. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität ist ein Maß für die Menge an
Komplex I in den Membranen. Berechnet man die NADH Oxidase Aktivität unter
Berücksichtigung der Menge des Komplex I in der Membran, erhält man die normierte
Aktivität, die für einen direkten Vergleich der verschiedenen Stämme geeignet ist. Die
normierten Aktivitäten der Membranen aus den Mutanten weichen um 6 bis 25 % von dem
Wert
des
Ausgangstammes
ab,
diese
Abweichung
liegt
im
Fehlerbereich
der
NADH/Ferricyanid Oxidoredukatse Aktivität. Die Elektronentransferrate des Komplex I aus
den rekombinanten Stämmen entspricht also in etwa der des unveränderten Enzyms.
70
Ergebnisse
4.3.3. Isolierung und Charakterisierung des Komplex I aus den Mutanten
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoECXA
Aus 25-50 g Zellen der Mutanten wurden die Membranen präpariert und die Proteine durch
Dodecylmaltosid aus den Membranen extrahiert. Durch Anionenaustausch-Chromatographie
und Affinitätschromatographie wurden die Varianten aufgereinigt. Der Verlauf der
Präparationen entsprach dem der Präparation aus dem Ausgangsstamm ANN0221/pBADnuo
nuoFHis und die SDS-Gele der einzelnen Präparationen zeigten das gleiche Bandenmuster
(Kap. 4.1.1.). Tabelle 4-6 gibt beispielhaft eine Übersicht der Präparation aus dem Stamm
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoE C137A.
Tabelle 4-6: Präparation des E. coli Komplex I aus 26 g Zellen (Feuchtgewicht) des Stammes
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoE C137A.
Präparations-
Volumen
Protein
schritt
NADH/Ferricyanid
Ausbeute
Oxidoreduktase Aktivität
gesamt
spezifisch
-1
[mL]
[mg]
[µmol·min ]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
Membranen
11
668
1725
3
100
Detergenzextrakt
30
634
1679
3
97
Fractogel EMD
28
99
851
9
49
Probond Ni-IDA
8
1.4
188
134
11
Um die Präparationen miteinander zu vergleichen, wurden die Gesamtaktivitäten in den
Membranen und die Ausbeute an Protein auf eine Ausgangsmenge von 30 g Zellen
(Feuchtgewicht) berechnet. Damit ergaben sich für die Mutanten eine Gesamtaktivität in den
Membranen von 1600 bis 2000 µmol·min-1 mit einer spezifischen Aktivität von 2.5 bis 3.5
µmol·min-1·mg-1. Für den Ausgangsstamm liegen die Werte im Bereich von 3500-4000
µmol·min-1 mit einer spezifischen Aktivität von 3.0 bis 6.0 µmol·min-1·mg-1 (Kap. 4.1.1.).
Die Präparationen lieferten eine Ausbeute von 1.6 bis 2.9 mg Protein mit einer spezifischen
Aktivität von 80-100 µmol·min-1·mg-1. Der Ausgangsstamm liefert 4.5 bis 6.0 mg Protein mit
einer spezifischen Aktivität von 100 bis 200 µmol·min-1·mg-1. Die Ausbeute der Präparation
aus den Mutanten ist also bei ähnlicher Aktivität in etwa halbiert.
71
Ergebnisse
Um einen möglichen Einfluss des mutierten Bindemotivs auf die Eigenschaften des Fe-SZentrums N1a nachzuweisen, wurden die mit NADH reduzierten Präparationen der Varianten
ESR-spektroskopisch charakterisiert.
Abbildung 4-11: ESR-Spektren der Komplex I Präparationen aus den Stämmen ANN0221/pBADnuo
nuoFHis nuoE C97A (A), nuoE C133A (B) und nuoE C137A (C) und aus dem Ausgangsstamm (D). Die
Präparationen wurden mit NADH reduziert und die Spektren bei 40 K und 2 mW aufgenommen. Die
Mikrowellenfrequenz betrug 9.462 GHz, die Modulationsamplitude 0.6 mT, die Zeitkonstante 164 ms und die
Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min.
Die Abbildung 4-11 zeigt die bei 40 K aufgenommenen Spektren des aus den Mutanten
isolierten Komplex I im Vergleich mit dem Spektrum des unveränderten Proteins. Alle
Spektren zeigen deutlich die Signale des Fe-S-Zentrums N1a bei den g-Werten gx,y,z = 1.92,
1.94 und 2.00. Auch das Verhältnis des N1a Signals zum Signal des Fe-S-Zentrums N1b
(gx.y,z = 1.94, 1.94, 2.03) ist bei allen Spektren gleich. Die unterschiedlichen Intensitäten der
einzelnen Spektren sind lediglich auf die unterschiedliche Proteinkonzentration der Proben
72
Ergebnisse
zurückzuführen. Auch die bei 13 K aufgenommen Spektren gleichen einander und zeigen die
Signale der im E. coli Komplex I nachweisbaren Fe-S-Zentren (Daten nicht gezeigt).
Aus diesen Resultaten ergeben zwei Möglichkeiten: Entweder führt der Austausch der
einzelnen Cysteine zu Alaninen zu keiner Veränderung des ESR-Signals von N1a oder das
Bindemotiv der aus den Mutanten isolierten Proteine ist unverändert und besteht weiterhin
aus den vier Cysteinen C92, C97, C133 und C137. Die folgenden Begründungen sollen
zeigen, dass vermutlich die zweite Möglichkeit zutreffend ist.
Mit dem Stamm ANN0221 und dem Plasmid pBADnuo nuoFHis liegt ein Expressionsystem
vor, in dem eine E. coli Komplex I-Variante überproduziert werden kann (Pohl, 2008). Ist die
Variante nicht stabil, ist dieses Expressionsystem für die Produktion der Varianten aber
vermutlich nicht geeignet. Im Laufe dieser Arbeit erhärtete sich der Verdacht, dass im Stamm
ANN0221/pBADnuo nuoFHis eine in trans Komplementation auftritt. Nicht funktionelle
episomal kodierte Proteinuntereinheiten werden durch chromosomal kodierte und somit
unveränderte, stabile Untereinheiten ersetzt. Dies ist für alle Untereinheiten mit Ausnahme
von NuoB möglich. Dieser Verdacht wurde durch das folgende Experiment bestätigt. Mit dem
Expressionsystem ANN0221/pBADnuo nuoF::nptI-sacB wurde ein stabiler Komplex I
produziert, der aus episomal und chromosomal kodierten Untereinheiten zusammengesetzt
sein muss, da im Genom nuoB und auf dem Plasmid nuoF inaktiviert wurde (Pohl, 2008). In
diesem Stamm stammt die Untereinheit NuoB von dem episomalen Gen und NuoF von dem
chromosomalen Gen. Das bedeutet, dass eine Mutation in nuoE zu einer instabilen
Untereinheit NuoE führen kann, die vermutlich bei der Produktion im Stamm ANN0221
durch die genomisch kodierte, unveränderte Untereinheit NuoE ersetzt werden würde. Die
ESR-Spektren zeigen in diesem Fall das Signal des N1a von der genomisch kodierten
Untereinheit NuoE mit dem nicht veränderten Bindemotiv. Die geringeren Ausbeuten der
Komplex I Präparationen aus den Mutanten im Vergleich zu der Präparation aus dem
Ausgangsstamm stehen im Einklang mit dieser Annahme. Die Produktion des Komplex I ist
abhängig vom Maß der Expression des Gens nuoE unter seinem natürlichen Promotor im
Genom und wird nicht durch die Expression über den effizienten araBAD Promoter auf dem
Plasmid bestimmt.
Die Möglichkeit, dass das mutierte Gen nuoE durch Rekombination mit der genomischen
DNA auf dem Plasmid gegen das nicht-mutierte Gen ausgetauscht wurde, wurde
73
Ergebnisse
ausgeschlossen. Während der Zellzucht wurden nach der Induktion und vor der Zellernte
Zellen entnommen und die Plasmid-DNA isoliert. Durch Restriktionsverdau wurde bestätigt,
dass weiterhin das mutiert Gen im Plasmid vorlag (Daten nicht gezeigt).
Auch der Vergleich mit der Literatur unterstützt die Vermutung, dass die ESR-Signale einem
N1a in nicht veränderter Umgebung zuzuordnen ist. Yano et al. (1994) haben im Bindemotiv
des Fe-S-Zentrums N1a des Komplex I in P. denitrificans die Cysteine einzeln gegen Alanine
ausgetauscht. Nach Überproduktion und Isolierung der hydrophilen Untereinheit Nqo2
wurden ESR-Spektren aufgenommen. Jeder Austausch eines einzelnen Cysteins führte zu
einer geringen Verschiebung der g-Werte, zu einer starken Verbreiterung der Signale und
teilweise zu zusätzlichen Signalen im Spektrum (Yano et al., 1994). Allerdings muss
berücksichtigt werden, dass es sich dabei um die Produktion einer einzelnen Untereinheit
handelt, deren Faltung sich von der im Gesamtkomplex deutlich unterscheiden kann.
4.3.4. Isolierung und Charakterisierung des Komplex I aus den Mutanten
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoE CXS
Wie im Kapitel 4.3.3. beschrieben, war es nicht gelungen, durch den Austausch der einzelnen
Cysteine des Bindemotivs des Fe-S-Zentrums N1a gegen Alanine stabile Komplex I
Varianten zu erhalten, die Untersuchungen über die Funktion von N1a ermöglichten. Aus
diesem Grund sollten die Cysteine einzeln gegen Serine ausgetauscht werden. Serin ist durch
die Hydroxylgruppe in der Lage, sich an der Koordination von Fe-S-Zentren zu beteiligen. In
der Literatur sind Proteinvarianten beschrieben, in denen durch Mutation eingefügte Serine
zweikernige
Fe-S-Zentren
koordinieren.
Dieser
Austausch
führte
zu
veränderten
spektroskopische Eigenschaften der Fe-S-Zentren und hatte eine Verschiebung des
Mittenpunktspotentials zur Folge (Fujinaga et al 1993, Werth et al, 1990). Es sollten
Komplex I Varianten hergestellt werden, die zwar noch das Fe-S-Zentrum N1a enthalten und
somit stabil sind, aber in denen das Mittenpunktspotential von N1a verschoben ist. Das könnte
zur Folge haben, dass N1a nicht mehr in der Lage ist, Elektronen vom FMN aufzunehmen
und dass diese Varianten Aufschluss darüber geben, ob N1a für die Verminderung der
Radikalbildung am FMN verantwortlich ist.
74
Ergebnisse
Bei der Arbeit zu Teilen dieses Kapitels wurde Herr Thomas Bayer im Rahmen seiner
Diplomarbeit (2008) angeleitet. Elektrokompetente Zellen des Stammes ANN0221 wurde mit
den in Kapitel 4.3.1 beschriebenen Plasmiden transformiert und in LB-Medium mit
Chloramphenicol kultiviert. Die so hergestellten Überexpressionstämme wurden als
ANN0221/pBADnuo nuoFHis nuoE C97S und nuoE C133S bezeichnet. Analog zu den im
Kapitel 4.3.2 beschriebenen Präparationen der Alanin-Varianten wurde der Komplex I aus
diesen Mutanten isoliert. Die Präparationen zeigten den gleichen Verlauf wie die der AlaninVarianten (Daten nicht gezeigt). Sie wurden mit NADH reduziert und ESR-Spektren bei 40 K
und 13 K aufgenommen (Daten nicht gezeigt). Auch diese Spektren zeigen deutlich das
Signal des Fe-S-Zentrums N1a bei g x,y,z = 1.92, 1.94 und 2.00. Das Verhältnis des N1a
Signals zum Signal des Fe-S-Zentrums N1b (gx,y,z = 1.94, 1.94, 2.03) entspricht dem des
unveränderten Komplex I. Auch die bei 13 K aufgenommen Spektren zeigen die Signale der
im E. coli Komplex I detektierbaren Fe-S-Zentren in den üblichen Verhältnissen und den
unveränderten Positionen.
Die unveränderten ESR-Signale des Fe-S-Zentrums N1a weisen darauf hin, dass die aus den
Mutanten isolierten Proteine das unveränderte Bindemotiv mit den vier Cysteinen C92, C97,
C133 und C137 enthalten und kein Serin an der Koordination beteiligt ist. Der Austausch
eines Thiol-Liganden gegen einen Hydroyxl-Liganden an dem zweikernigen Fe-S-Zentrum
sollte zur einer deutlichen Veränderung des ESR Signals führen (Fujinaga et al 1993, Werth
et al, 1990). Vermutlich führt der Austausch der Cysteine C97 und C133 jeweils gegen Serin
zu nicht stabilen Komplex I Varianten und das hat wahrscheinlich eine in trans
Komplementation in dem Stamm ANN0221 zur Folge. Es wird also statt einer Variante ein
Komplex I mit einer unveränderten, chromosomal kodierten Untereinheit NuoE produziert
(Kap. 4.3.3.). Um diese Fragestellung eindeutig beantworten zu können, muss ein
Expressionsystem gefunden werden, in dem eine in trans Komplementation ausgeschlossen
ist (Kap. 4.3.5 und 4.3.6).
75
Ergebnisse
4.3.5 Eignung des Stammes AN387 Δnuo als Expressionsstamm
Um die Problematik der in trans Komplementation im Stamm ANN0221 zu umgehen, sollte
die Eignung des Stammes AN387Δnuo (Pohl, 2008) als Expressionsstamm überprüft werden.
In diesem Stamm wurde das gesamte nuo-Operon aus dem Genom entfernt, bei
Überproduktion des Komplex I mit Hilfe des Plasmids pBADnuo nuoFHis ist eine in trans
Komplementation ausgeschlossen. Das Gen für die alternative Dehydrogenase ndh ist jedoch
vorhanden. Ein Wachstum der Zellen ist also auch möglich, wenn ein episomal kodierter,
nicht funktioneller Komplex I vorliegt.
Bei den Arbeiten zu diesem Kapitel wurde Herr Thomas Bayer im Rahmen seiner
Diplomarbeit (2008) angeleitet. Zellen des Stammes AN387Δnuo wurden mit dem Plasmid
pBADnuo nuoFHis transformiert, einzelne Kolonien in LB-Medium mit Chloramphenicol
kultiviert und der Erfolg der Transformation durch Restriktionsanalyse bestätigt.
Zellen der Stämme AN387, AN387Δnuo und AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis wurden in 400
mL LB-Medium angezogen, die Expression episomal kodierter Gene durch Zugabe von
Arabinose induziert und die Zellen bei Eintritt in die stationäre Phase geerntet. Dabei
erreichten die Stämme AN387 und AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis eine OD600 von 5 und der
Stamm AN387Δnuo eine OD600 von 2.5.
Die Membranen der drei Stämme wurden isoliert und deren NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktase Aktivität sowie (d-)NADH Oxidase Aktivität gemessen (Tab. 4-7). Zu der
NADH Oxidase Aktivität trägt neben dem Komplex I auch die alternative NADH
Dehydrogenase bei, während die d-NADH Oxidase Aktivität spezifisch vom Komplex I
vermittelt wird (Matsushita et al., 1987, Kap. 2.1).
76
Ergebnisse
Tabelle 4-7: (d-)NADH-abhängige Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Stämme AN387,
AN387Δnuo und AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis. Die d-NADH Oxidase Aktivtät wird größtenteils vom
Komplex I verursacht. Das Verhältnis der Oxidase Aktivitäten gibt den Anteil des Komplex I an der NADH
Oxidase Aktivität an.
Stamm
NADH/Ferricyanid
Oxidoredukatseaktivität
NADH Oxidase
Aktivtät
d-NADH
Oxidase
Aktivität
d-NADH/NADH
Oxidase Aktivität
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
AN387
14.1
0.35
0.19
54
AN387Δnuo
14.5
0.33
0.00
0
AN387Δnuo/
pBADnuo nuoFHis
12.4
0.34
0.13
38
Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität und die NADH Oxidase Aktivität der
Membranen ist in allen drei Stämmen in etwa gleich. Wie erwartet, ist die Komplex I
spezifische d-NADH Oxidase Aktivität im Stamm AN387Δnuo nicht messbar, da in diesem
Stamm
sämtliche
Komplex
I
Gene
fehlen.
Die
Membranen
des
Stammes
AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis zeigen eine ähnlich hohe d-NADH Oxidase Aktivität wie der
Ausgansstamm. Der episomal kodierte Komplex I wird auf dem gleichen Niveau produziert
wie der chromosomal kodierte Komplex I im Ausgangsstamm AN387.
Um die Stabilität und die Assemblierung des im Stamm AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis
produzierten Komplex I zu überprüfen, wurden die Proteine aus den Membranen mit
Dodecylmaltosid extrahiert und mittels Zuckergradientenzentrifugation aufgetrennt. Zum
Vergleich wurde auch der Membranextrakt aus dem Stamm AN387 aufgetragen. Die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität der Fraktionen des Gradienten wurden
bestimmt. Abbildung 4-12 zeigt die Aktivitätsprofile.
77
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
Ergebnisse
10
8
6
4
2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Fraktion
Abbildung 4-12.: Zuckergradientenzentrifugation der Detergenzextrakte aus Cytoplasmamembranen der
Stämme AN387 (-▲-) und AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis (-■-). Die Gradienten wurden mit 30 - 45 mg
Protein beladen und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivitäten auf 10 mg Proteinauftrag normiert.
Das Aktivitätsprofil des Zuckergradienten der Membranproteine aus dem Stamm AN387
zeigt zwei Aktivitätsmaxima. Das Maximum im hinteren Drittel ist dem Komplex I zu
zuordnen, die Aktivitäten im ersten Drittel des Gradienten der alternativen NADH
Dehydrogenase. Im hinteren Drittel des Gradienten des Membranextraktes aus dem Stamm
AN387Δnuo/pBADnuo nuoFHis wurde kaum Aktivität gemessen, es konnte also kein stabiler
Komplex I aus den Membranen herausgelöst werden. Dies steht im Einklang mit der erhöhten
Aktivität im ersten Drittel des Gradienten, die von der alternativen NADH Dehydrogenase
und vermutlich von Bruchstücken des Komplex I stammen. Somit ist der Stamm unter diesen
Bedingungen nicht als Überproduzent für den Komplex I geeignet.
4.3.6. Eignung des Stammes BW25113Δnuo als Expressionsstamm
Um zu untersuchen, ob der Stamm BW25113Δnuo (Vranas 2009, unveröffentliche
Ergebnisse), in dem ebenfalls das gesamte nuo-Operon auf dem Genom deletiert wurde, ein
geeignetes Expressionsystem darstellt, wurde er mit dem Plasmid pBADnuo nuoFHis
78
Ergebnisse
transformiert. Durch die vollständige Deletion des nuo-Operons auf dem Genom ist eine in
trans Komplementation, wie sie im Stamm ANN0221 auftrat (Kap. 4.3.3.) nicht möglich.
Bei den Arbeiten zu diesem Kapitel wurden Herr Marius Schulte und Frau Klaudia Morina im
Rahmen ihrer Diplomarbeiten (2009) angeleitet. Zellen des Stammes BW25113Δnuo wurden
mit dem Plasmid pBADnuo nuoFHis transformiert, einzelne Kolonien in LB-Medium mit
Chloramphenicol angezogen und der Erfolg der Transformation durch Restriktionsanalyse
bestätigt. Um eine ausreichende Zellmenge für die Isolierung des Komplex I zu erhalten,
wurden verschiedene Nährmedien für die Zellzucht ausprobiert. Die höchsten Ausbeuten
wurden mit dem Autoinduktionsmedium nach Studier et al. (2005) erreicht (Schulte 2009;
Morina 2009).
Für die Charakterisierung des Stammes BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis wurden Zellen in
400 mL Autoinduktionsmedium gezogen und bei Eintritt in die stationäre Phase geerntet.
Zum Vergleich wurden auch Zellen der Stämme BW25113 und BW25113Δnuo angezogen.
Dabei erreichten die Zellen des Stammes BW25113 eine OD600 von 9 und Zellen des
Stammes BW25113Δnuo und BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis eine OD600 von 6.5.
Die Membranen wurden präpariert und deren NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität
sowei (d-)NADH Oxidase Aktivität gemessen (Tab. 4-8).
Tabelle 4-8: (d-)NADH-abhängige Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Stämme BW25113,
BW25113Δnuo und BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis. Die d-NADH Oxidase Aktivtät wird größtenteils vom
Komplex I verursacht. Das Verhältnis der Oxidase Aktivitäten gibt den Anteil des Komplex I an der NADH
Oxidase Aktivität an.
Stamm
NADH/Ferricyanid
Oxidoredukatseaktivität
NADH Oxidase
Aktivtät
d-NADH
Oxidase
Aktivität
[µmol·min-1·mg-1]
dNADH/NADH
Oxidase
Aktivität
[%]
BW25113
8.9
0.50
0.08
16
BW25113Δnuo
18.0
1.55
0.01
1
BW25113Δnuo/
pBADnuo nuoFHis
4.6
0.56
0.34
61
79
Ergebnisse
Wie erwartet, zeigen die Membranen des Stammes BW25113Δnuo keine Komplex I
gekoppelte Aktivität.
Die NADH Oxidase
Aktivität
und die NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität dieser Membranen ist aber deutlich höher als in den anderen
Stämmen, das Fehlen des Komplex I wird vermutlich durch eine erhöhte Produktion der
alternativen NADH Dehydrogenase ausgeglichen. Diese besitzt eine wesentlich höhere
Umsatzrate als der Komplex I, was die hohe Aktivität erklärt. Die Membranen aus dem
Stamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis zeigen eine vierfach erhöhte d-NADH Oxidase
Aktivität im Vergleich zum Ausgangsstamm BW25113. Auch ist der Anteil des Komplex I an
der NADH Oxidase Aktivität im Stamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis deutlich höher als
im Ausgangsstamm. Das deutet darauf hin, dass der episomal kodierte Komplex I produziert
wird.
Um die Stabilität und die Assemblierung des im Stamm BW25113Δnuo/ pBADnuo nuoFHis
produzierten Komplex I zu überprüfen, wurden die Proteine aus den Membranen die Proteine
mit Dodecylmaltosid extrahiert und mittels Zuckergradientenzentrifugation aufgetrennt. Zum
Vergleich wurden auch die Membranextrakte der Stämme BW25113 und BW25113Δnuo
aufgetragen. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität der Fraktionen der Gradienten
wurden bestimmt. Abbildung 4-13 zeigt die Aktivitätsprofile.
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
5
4
3
2
1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Fraktion
Abbildung 4-13.: Zuckergradientenzentrifugation der Detergenzextrakte aus Cytoplasmamembranen der
Stämme BW25113 (-▲-),
BW25113Δnuo
(-■-) und BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis (-●-). Die
Gradienten wurden mit 30 - 45 mg Protein beladen und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivitäten auf
10 mg Proteinauftrag normiert.
80
Ergebnisse
Das Aktivitätsprofil des Zuckergradienten des Membranextraktes aus dem Stamm BW25113
zeigt das Maximum im Bereich um die Fraktion 14 des Komplex I sowie das
Aktivitätsmaximum im Bereich um die Fraktion 5 der alternativen NADH Dehydrogenase.
Das durch den Komplex I vermittelte Aktivitätsmaximum im hinteren Drittel des Gradienten
fehlt in den Membranen des Stammes BW25113Δnuo. Lediglich das Aktivitätsmaximum in
den Fraktionen der alternativen NADH Dehydrogenase ist nachzuweisen. Das Aktivitätsprofil
des Zuckergradienten des Stammes BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis zeigt beide
Aktivitätsmaxima. Die hohen Aktivitäten im Bereich um die Fraktion 14 zeigen, dass ein
vollständig assemblierter Komplex I überproduziert und stabil aus den Membranen extrahiert
wurde. Die erhöhte Aktivität in den Fraktionen 17-19 wird vermutlich durch eine Aggregation
des Komplex I hervorgerufen, die durch das eingefügte Affinitätspeptid hervorgerufen wird
(Pohl, 2008).
Um eine ausreichende Menge Zellen für eine Präparation zu erhalten, wurde der Stamm
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis in 10 L Autoinduktiosmedium angezogen. Die Ausbeute
betrug 85 g Zellen (Feuchtgewicht). Aus 38 g Zellen wurden die Membranen präpariert und
die
Proteine
mit
Dodecylmaltosid
aus
den
Membranen
herausgelöst.
Mittels
Anionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie wurde der Komplex I
aufgereinigt. Die Elutionsprofile zeigten den gleichen Verlauf wie die der in Kapitel 4.1.1.
beschriebenen Präparation des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo nuoFHis.
Tabelle 4-9 gibt eine Übersicht über die Präparation, die Abbildung 4-14 zeigt das SDS-Gel
der gereinigten Proteine. Die Banden des Gels wurden anhand ihrer apparenten molekularen
Massen den Untereinheiten des Komplex I zugeordnet. Es wurden sämtliche Untereinheiten
in der Präparation nachgewiesen.
81
Ergebnisse
Tabelle 4-9: Isolierung des E. coli Komplex I aus 25 g Zellen (Feuchtgewicht) des Stammes
BW25113 Δnuo/pBADnuo nuoFHis.
Präparations-
Volumen
Protein
NADH/Ferricyanid
schritt
Ausbeute
Oxidoreduktase Aktivität
gesamt
spezifisch
[mL]
[mg]
[µmol·min-1]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
Membranen
15
1248
2911
2
100
Detergenzextrakt
59
845
2790
3
96
Fractogel EMD
47
247
1857
8
64
Probond Ni-IDA
8
5
490
98
17
app. mol.
Masse [kDa]
1
2
NuoG
85
NuoCD
50
NuoF
NuoL
NuoM, N
25
NuoH
NuoB, I
NuoE, J
NuoA
NuoK
10
Abbildung 4-14: SDS-Gel der Präparation des Komplex I aus dem Stamm BW25113Δnuo/pBADnuo
nuoFHis. Die Banden wurden auf einem Gel nach Schägger & von Jagow (1987) aufgetrennt und anhand ihrer
apparenten molekularen Massen den Komplex I-Untereinheiten zugeordnet.
Mittels Größenausschlußchromatographie wurde die Homogenität der Präparation bestätigt
(Daten nicht gezeigt, Kap. 4.1.1.). Die maximale NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktase
Aktivität wurde zu 3.0 ± 0.1 µmol·min-1·mg-1 bestimmt und wird zu 90 % mit Piericidin A
inhibiert. Der KM-Wert zu NADH betrug 11 ± 1 µM (Horn, 2010). Die Werte entsprechen den
Werten der Präparation des Komplex I aus dem Stamm ANN0221/pBADnuo nuoFHis und
denen in der Literatur (Stolpe, 2007; Pohl et al., 2007b). Aus dem Stamm
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis wurde also ein stabiler und katalytisch aktiver Komplex I
82
Ergebnisse
isoliert, somit steht ein Expressionssystem zur Verfügung mit dem Komplex I Varianten
überproduziert werden können, da nur episomale nuo-Gene in diesem Stamm vorliegen.
4.3.7. Charakterisierung der Alanin- und Serin-Varianten aus dem Stamm
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis
Elektrokompetente Zellen des Stammes BW25113Δnuo wurden mit den in Kapitel 4.3.1
beschriebenen Plasmiden transformiert und in LB-Medium mit Chloramphenicol angezogen.
Die Überexpressionstämme wurden als BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoEC92A,
nuoEC97A, nuoEC133A, nuoEC137A sowie BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoEC97S
und C133S bezeichnet.
Die Mutanten und der Ausgangsstamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis wurden in 400 mL
Autoinduktionsmedium kultiviert und bei Eintritt in die stationäre Phase geerntet. Der Verlauf
der Wachstumskurven der Mutanten und des Ausgangsstammes waren gleich, es wurde
jeweils eine OD600 von etwa 5 erreicht.
Die Membranen wurden präpariert und deren Komplex I spezifische d-NADH Oxidase
Aktivität (Kap. 2.1) an der Sauerstoffelektrode bestimmt. Zudem wurden die dNADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität als Maß für die Menge an Komplex I in den
Membranen gemessen (Tab. 4-10).
83
Ergebnisse
Tabelle 4-10: d-NADH vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Alanin- und SerinMutanten und des Ausgangstammes BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis.
Plasmid in
BW25113Δnuo
d-NADH Oxidase
Aktivität
d-NADH/Ferricyanid
Oxidoredukatseaktivität
[µmol·min-1·mg-1]
pBADnuo nuoFHis
0.30
1.6
pBADnuo nuoFHis
nuoE C92A
0.08
0.5
pBADnuo nuoFHis
nuoE C97A
0.15
0.7
pBADnuo nuoFHis
nuoE C133A
0.09
0.4
pBADnuo nuoFHis
nuoE C137A
0.03
0.4
pBADnuo nuoFHis
nuoE C97S
0.10
0.5
pBADnuo nuoFHis
nuoE C133S
0.16
0.7
Da die vom Komplex katalysierte Reaktion der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der
Elektronenübertragung in der E. coli Atmungskette ist, gibt die d-NADH Oxidase Aktivität
der Membranen Aufschluss über die Aktivität der verschiedenen Komplex I Varianten.
Sowohl die d-NADH Oxidase Aktivität als auch die d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase
Aktivität der Membranen sind mit Ausnahme der Mutanten BW25113Δnuo/pBADnuo
nuoFHis nuoE C97A und C133S im Vergleich zum Ausgangsstamm jeweils um mehr als zwei
Drittel erniedrigt (Tab. 4-10). Das deutet darauf hin, dass in diesen Mutanten nur wenig oder
kein funktioneller Komplex I in den Membranen vorliegt. Die Membranen der Mutanten in
der das Cystein auf der Position C97 gegen ein Alanin bzw. das Cystein auf der Position
C133 gegen ein Serin ausgetauscht wurde, zeigen jeweils halb so große Aktivitäten wie der
Ausgangstamm. Vermutlich liegt ein funktioneller Komplex I in geringen Mengen vor.
Um die Stabilität und die Assemblierung der NuoE Varianten zu überprüfen, wurden die
Proteine
aus
den
Membranen
Zuckergradientenzentrifugation
mit
aufgetrennt.
Dodecylmaltosid
Die
extrahiert
NADH/Ferricyanid
und
mittels
Oxidoreduktase
Aktivität der Fraktionen des Gradienten wurde bestimmt. Abbildung 4-15 zeigt die
zugehörigen Aktivitätsprofile am Beispiel der Mutanten BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis
84
Ergebnisse
nuoE C137A und BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE C133S im Vergleich zum
Ausgansstamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis.
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
5
10
15
20
Fraktion
Abbildung 4-15.: Zuckergradientenzentrifugation der Detergenzextrakte aus Cytoplasmamembranen der
Stämme BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE C137A(-▲-), BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE
C133S (-●-) und zum Vergleich BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis (-■-). Die Gradienten wurden mit 15 - 25
mg Protein beladen und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivitäten auf 10 mg Proteinauftrag normiert.
Die Aktivitätsprofile der Zuckergradienten der Membranextrakte aus allen drei Stämmen
zeigen das Aktivitätsmaximum im Bereich von Fraktion 5 und 6, das der alternativen
Dehydrogenase zu zuordnen ist.
Der Membranextrakt
aus dem Ausgangsstamm
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis zeigt zusätzlich ein Maximum um die Fraktion 14, das
dem Komplex I zu zuordnen ist. Das Aktivitätsprofil des Zuckergradienten des
Membranextraktes aus dem Stamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE C137A zeigt ein
sehr kleines Aktivitätsmaximum im hinteren Drittel des Gradienten (Abb. 4-15), die Profile
der Extrakte aus den Stämmen BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE C92A bzw. C133A
zeigten den gleichen Verlauf (Daten nicht gezeigt). Aus den Membranen dieser drei Stämme
konnte kein stabiler Komplex I extrahiert werden. Das Aktivitätsprofil des Extraktes aus der
Mutante BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE C133S (Abb. 4-15) zeigt den gleichen
Verlauf wie die Extrakte aus den Stämmen BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoE C97A
bzw. C97S (Daten nicht gezeigt). Die geringe NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität in
den Fraktionen 12 bis 19 deutet darauf hin, dass die geringen Mengen der Varianten in den
Membranen
nach
der
Extraktion
nicht
mehr
stabil
waren.
Die
aus
der
Zuckergradientenzentrifugation gewonnen Ergebnisse stehen im Einklang mit den
85
Ergebnisse
Aktivitätsmessungen der Membranen der Mutanten und bestätigen die Vermutung, dass der
Austausch der das Fe-S-Zentrum N1a koordinierende Cysteine zu einem Stabilitätsverlust des
Komplex I führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Fe-S-Zentrum N1a essentiell für die
Stabilität des Komplex I aus E. coli ist. Der Austausch der N1a koordinierenden Cysteine
gegen Alanine oder Serine behindert entweder die Assemblierung des Komplex I oder führt
zu instabilen Komplex I Varianten.
4.4 Die Bedeutung aromatischer Aminosäuren für den Elektronentransport
im E. coli Komplex I
Im Komplex I bilden die sieben Fe-S-Zentren N3, N1b, N4, N5, N6a, N6b und N2 eine
Elektronentransportkette zwischen dem FMN, das die Elektronen vom NADH aufnimmt, und
der Ubichinonbindestelle (Sazanov & Hinchliffe, 2006). Die Elektronen werden über eine
Distanz von 80 Å übertragen und die experimentell bestimmte Elektronentransferrate für
diese Reaktion liegt bei mehr als 50 s-1. Der Übertragungsmechanismus der zu diesen
Transferraten führt, wird kontrovers diskutiert. Allgemein akzeptiert ist die Theorie von
Moser et al. (2006). Nach dieser Theorie sind die Elektronen ausschließlich auf den Fe-SZentren lokalisiert und tunneln von Zentrum zu Zentrum, das Protein bildet dabei nur eine
Tunnelbarriere. Mit ihren Berechnungen unter Einbezug der aus der Kristallstruktur des
Komplex I aus T. themophilus bekannten Abständen zwischen den Redoxzentren ergeben sich
Transferraten die mit experimentell bestimmten Werten in Einklang zu bringen sind. Eine
andere Theorie entwickelten Wittekindt et al. (2009) in Zusammenarbeit mit unserer
Arbeitsgruppe. Nach diesen Berechnungen sind die hohen Elektronentransferraten im
Komplex I nur mit der so genannten hopping Theorie zu erklären. Dabei sind die Elektronen
nicht nur auf den Fe-S-Zentren lokalisiert, sondern zusätzlich auf zwischen den Zentren
liegenden konservierten, aromatischen Aminosäuren. Die direkte Beteiligung des лElektronensystems aromatischer Aminosäuren am Elektronentransfer wurde auch für andere
Elektronentransportwege in der Literatur beschrieben (Kap. 2.3). Im Komplex I ist
insbesondere der Abstand zwischen den Mittelpunkten der Fe-S-Zentren N5 und N6a mit
mehr als 14 Å zu groß, als dass nach Berechnungen von Wittekindt et al. eine direkte
Elektronenübertragung zwischen diesen Zentren wahrscheinlich ist. Mit Hilfe der Struktur des
Komplex I aus T. thermophilus ergaben sich aus den Berechnungen sieben konservierte
86
Ergebnisse
Aminosäuren als hopping Kandidaten, vier davon liegen zwischen den Fe-S-Zentren N5 und
N6a. Im Komplex I aus E. coli sind sechs dieser konservierten aromatischen Aminosäuren zu
finden, die siebte liegt im Komplex I aus T. thermophilus auf der Proteinuntereinheit Nqo15,
die nicht konserviert ist (Sazanov & Hinchliffe, 2006; Pohl et al., 2007c; Kap. 2.2). In dieser
Arbeit sollten im E. coli Komplex I die konservierten aromatischen Aminosäuren (Tab. 4-11)
jeweils gegen andere aromatische Aminosäuren oder gegen Leucin ausgetauscht werden, um
ihren Einfluss auf die katalytische Reaktion des Komplex I zu detektieren. Leucin besitzt im
Gegensatz zu den aromatischen Aminosäuren kein л-Elektronensystem, dass am
Elektronentransport beteiligt sein kann, kommt den aromatischen Aminosäuren aber
strukturell am nächsten.
Tabelle 4-11: Aromatische Aminosäuren im E. coli Komplex I, die direkt am Elektronentransfer beteiligt
sein könnten. Angegeben sind der Transferschritt, die Aminosäuren in der Ein-Buchstaben-Schreibweise und
die Proteinuntereinheit, auf der die jeweilige Aminosäure liegt. Das Phenylalanins F397 ist nicht konserviert und
an der Position 101NuoI befindet sich in anderen Organismen ein F oder ein Y, alle anderen genannten
Aminosäuren sind konserviert.
Elektronentransferschritt
Aminosäure
N3→N1b
F397NuoF
N1b→N4
F35NuoG
N5→N6a
W221NuoG
H514NuoCD
F515NuoCD
N6b→N2
F101NuoI
87
Ergebnisse
4.4.1 Mutagenese zum Austausch der aromatischen Aminosäuren
Bei der Arbeit zu Teilen dieses Kapitels wurde Frau Klaudia Morina im Rahmen ihrer
Diplomarbeit (2009) angeleitet. Das Plasmid pBADnuo nuoFHis, welches das gesamte nuoOperon enthält, ist aufgrund seiner Größe von mehr als 20 kbp für die Mutagenese nach der
QuikChange
Methode nicht
direkt
zugänglich.
Aus
diesem Grund
wurden die
Punktmutationen zum Austausch der aromatischen Aminosäuren erst in Subklone mit einer
Größe von 5 bis 7 kbp, die jeweils nur ein bzw. drei Gene des Komplex enthalten, eingefügt.
Von diesen Subklonen wurden die mutierten Gene durch PCR vervielfältigt und mittels λ-Red
vermittelter Rekombination in das Plasmid pBADnuo nuoFHis eingebracht. Für die
Rekombination wurden Zellen des Stammes DH5Δnuo/pkD46 benutzt. In diesen Zellen ist
das nuo-Operon im Genom deletiert, das Plasmid pkD46 kodiert für das Rekombinasesystem.
Als Selektionsmarker wurde die nptI-sacB-Kassette verwendet, die einerseits eine Kanamycin
Resistenz vermittelt, andererseits in saccharosehaltigen Medien zum Zelltod führt (Kap.
2.2.2).
Die bei der QuikChange Methode eingesetzten Oligonukleotide sind der Tabelle 3-3 zu
entnehmen, als Vorlage-DNA dienten pUC25 nuoE´-G, pCA24NnuoCD oder pCA24NnuoI.
Bei der QuikChange zum Austausch der Aminosäure W221NuoG wurde die Phusion DNA
Polymerase eingesetzt, bei allen anderen Ansätzen die Pfu-DNA-Polymerase. DH5α Zellen
wurden mit dem jeweiligen Ansatz transformiert, einzelne Kolonien kultiviert und die
Plasmide isoliert. Der Erfolg der ortsgerichtenen Mutagenese wurde durch Restriktionsverdau
und Sequenzierung bestätigt. Durch eine PCR mit den so erhaltenen Subklonen als VorlageDNA und den in der Tabelle 3-4 aufgeführten Oligonukleotiden wurden die mutierten Gene
vervielfältig und standen somit für die Rekombination zur Verfügung.
In einem ersten Rekombinationsschritt wurden die zu mutierenden Gene auf dem Plasmid
pBADnuo nuoFHis gegen die Resistenz Kassette nptI-sacB ausgetauscht. Dazu wurden durch
PCR mit dem Plasmid pVO1100 als Vorlage-DNA und mit den in Tabelle 3-5 aufgeführten
Oligonukleotiden die Resistenzkassette vervielfältig und dabei mit homologen Bereichen zu
den
entsprechenden
Genen
versehen.
Elektrokompetente
Zellen
des
Stammes
DH5Δnuo/pkD46 wurden mit 50 ng pBADnuo nuoFHis und 300 ng nptI-sacB transfomiert,
einzelne Kolonien auf LB-Platten mit Kanamycin selektiert und die Plasmid-DNA isoliert.
Der Erfolg der Rekombination wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt. Zeigte die Analyse,
88
Ergebnisse
dass ein Gemisch aus dem pBADnuo nuoFHis mit und ohne nptIsacB Kassette vorlag, wurde
zur Trennung der Multimere ein SacI-Verdau durchgeführt und DH5α Zellen mit der
geschnittenen DNA transformiert (Kap. 4.3.1). So wurden die shuttle-Plasmide pBADnuo
nuoFHis nuoCD::nptI-sacB, pBADnuo nuoFHis nuoGbegin::nptI-sacB und pBADnuo nuoFHis
nuoI::nptI-sacB dargestellt. Das Plasmid pBADnuo nuoFHis nuoG::nptI-sacB stand bereits
zur Verfügung (Pohl, 2008). Im zweiten Rekombinationsschritt wurden elektrokompetenter
DH5Δnuo/pkD46 mit 50 ng des jeweiligen shuttle-Plasmids und 300-500 ng
der
amplifizierten, mutierten Gene transfomiert, einzelne Kolonien auf YP/SUC-Platten mit
Choramphenicol selektiert und die Plasmid-DNA isoliert. Der Erfolg der Rekombination
wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt.
4.4.2 Komplex I vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen aus
den Mutanten mir den ausgetauschten aromatischen Aminosäuren
Bei der Arbeit zu Teilen dieses Kapitels wurde Frau Annemarie Horn im Rahmen ihrer
Diplomarbeit (2010) angeleitet. Elektrokompetente Zellen des Stammes BW25113Δnuo
wurde mit den in Kapitel 4.3.1 beschriebenen Plasmiden transformiert, einzelne Kolonien in
LB-Medium mit Chloramphenicol kultiviert und Stammkulturen angelegt. Die Mutanten und
der
unveränderte
Stamm
BW25113Δnuo/pBADnuo
nuoFHis
wurden
in
400
mL
Autoinduktionsmedium mit Chloramphenicol kultiviert und bei Eintritt in die stationäre Phase
geerntet. Die Wachstumskurven der Mutanten und des Ausgangsstammes zeigten den
gleichen Verlauf, es wurde eine OD600 von 4.0 bis 6.0 erreicht.
Die Membranen der Mutanten wurden präpariert und deren (d-)NADH Oxidase Aktivität und
(d-)NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität, zur Bestimmung der Menge an Komplex I,
gemessen. Wird die d-NADH Oxidase Aktivität auf die Menge des Komplex I in den
Membranen bezogen, ermöglicht die so berechnete normierte d-NADH Oxidase Aktivität
einen direkten Vergleich der Komplex I Aktivitäten in den Mutanten. Die Tabellen 4-12 bis 414 zeigen die Ergebnisse eingeteilt nach den Transferschritten, an denen die jeweilige
aromatische Aminosäure beteiligt sein könnte.
Zwischen den Fe-S-Zentren N1b und N4 ist nach der hopping Theorie nur eine konservierte,
aromatische Aminosäure, das Phenylalanin F35NuoG, ein Kandidat für die Beteiligung am
Elektronentransport. Im T. thermophilus Komplex I liegt das Phenylalanins 6.4 Å von N1b
89
Ergebnisse
und 7.7 Å von N4 entfernt, während der Abstand zwischen den Kanten der beiden Fe-SZentren 10.7 Å (Abstand zwischen den Mittelpunkten: 13.9 Å) beträgt.
Tabelle 4-12: Komplex I-vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Mutanten
F35NuoG. Zum Vergleich wurden Membranen aus dem Ausgangsstamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis
vermessen. In die normierte d-NADH Oxidase Aktivität, auf die sich auch die Abweichung vom Ausgansstamm
bezieht, ist die d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität, ein Maß für die Menge an Komplex I in den
Membranen, miteinbezogen.
Plasmid in
BW25113Δnuo
d-NADH Oxidase
Aktivität
d-NADH/
Ferricyanid Oxidoredukatseaktivität
Normierte
d-NADH Oxidase
Aktivität
[µmol·min-1·mg-1]
pBADnuo nuoFHis
Vergleich
zum
Ausgangsstamm
[%]
0.25
1.6
0.25
-
pBADnuo nuoFHis
nuoG F35L
0.27
1.8
0.24
-4
pBADnuo nuoFHis
nuoG F35W
0.18
1.8
0.16
-36
pBADnuo nuoFHis
nuoG F35Y
0.23
1.2
0.31
+24
Wurde das Phenylalanin gegen ein Leucin ausgetauscht, ist die normierte d-NADH Oxidase
Aktivität der Membranen aus Mutante und Ausgangsstamm gleich. Der Austausch des
Phenylalanins gegen ein Tyrosin führt zwar zu einer Steigerung der normierten d-NADH
Oxidase Aktivität um 24%, diese liegt aber nur knapp oberhalb der Fehlergrenze der in diesen
Wert miteinbezogenen d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität. Der Austausch des
Phenylalanins gegen ein Tryptophan führt zu einer deutlichen Erniedrigung der normierten dNADH Oxidase Aktivität. Da der Austausch gegen Leucin, welches kein л--System zur
Aufnahme eines Elektrons besitzt, keinen Einfluss auf die Aktivität des Komplex I zeigt, wird
die verringerte Aktivität der Tryptophan-Variante vermutlich durch strukturelle Änderungen
hervorgerufen.
Vergleicht man die Sequenzen der Untereinheit NuoG und der homologen Untereinheit Nqo3
aus T. thermophilus, fällt auf, dass in E. coli im Gegensatz zu T. thermophilus ein Tyrosin in
direkter Nachbarschaft zum Phenylalanin F35 liegt (Abb. 4-16). Im T. thermophilus Komplex
I liegt an dieser Position ein Leucin mit einem Abstand von 4.1 Å zu N1b und 12.5 Å zu N4.
90
Ergebnisse
Es besteht also die Möglichkeit, dass in E.coli das Tyrosin an dieser Position am
Elektronentransferschritt beteiligt ist und somit der Austausch des F35 gegen ein Leucin zu
keiner messbaren Verminderung der d-NADH Oxidase Aktivität führt
25
E. coli
T. thermophilus
30
35
40
EACLSLGLDIPYFCWHPALGSVGAC
DAVFHAGYDVPLFCSEKHLSPIGAC
Abbildung 4-16: Sequenzvergleich von E. coli und T. thermophilus. Das als hopping Kandidat
vorgeschlagene Phenylalanin ist fett markiert, das zusätzliche Tyrosin in E. coli ist unterstrichen. Die
Nummerierung bezieht sich auf die E. coli Sequenz.
Ein weiterer Grund für die unveränderte Aktivität der Leucin-Mutante könnte auch die relativ
hohe Übertragungsrate zwischen den beiden Fe-S-Zentren auch ohne Beteiligung einer
aromatischen Aminosäure sein. Für die direkte Übertragung N1b → N4 wurde eine
Tranferrate von 4.7 s-1 berechnet, für die Übertragung N1b → F35 →N4 liegt sie nach der
hopping Theorie bei 6.5 x 105 s-1 (Wittekindt et al., 2009). Die maximale NADH:DecylUbichinon Oxidoreduktaseaktivität des in dieser Arbeit isolierten Komplex I aus E. coli
beträgt
3.0
µmol·min-1·mg-1,
damit
ergibt
sich
für
den
Gesamtprozess
der
Elektronenübertragung von NADH auf Decyl-Ubichinon eine Elektronentransferrate von
54 s-1. Die Transferrate des Übertragungsprozesses liegt ohne Beteiligung der aromatischen
Aminosäure in der gleichen Größenordnung, wie die experimentell bestimmte Transferrate
der Gesamtreaktion. Es ist möglich, dass die unterschiedlichen Transferraten mit oder ohne
Beteiligung des Phenylalanins im Rahmen dieser Aktivitätsmessung nicht erfasst werden
können.
Der Transferschritt zwischen den Fe-S-Zentren N5 und N6a
Der Abstand zwischen den Fe-S-Zentren N5 und N6a beträgt 14.0 Å von Kante zu Kante und
16.9 Å zwischen den Mittelpunkten. Zwischen diesen Zentren liegen im E. coli Komplex I
drei konservierte aromatische
Aminosäuren,
die nach der
hopping Theorie am
Elektronentransport beteiligt sein können. Das sind das Tryptophan W221 NuoG, das
Phenylalanin F515NuoCD und das Histidin H514NuoCD. Den Berechnungen zur Folge kann der
Elektronentransport dabei entweder über das W221NuoG und/oder das F515NuoCD erfolgen
und/oder nacheinander über das F515NuoCD und das H514NuoCD. Die Tabelle 4-13 zeigt die
91
Ergebnisse
Komplex I vermittelten Aktivitäten der Membranen, die aus den Mutanten isoliert wurden, in
denen diese Aminosäuren jeweils ausgetauscht wurden.
Tabelle 4-13: Komplex I-vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Mutanten mit
Austausch zwischen den Fe-S-Zentren N5 und N6a. Zum Vergleich wurden auch Membranen aus dem
Ausgangsstamm BW25113Δnuo pBADnuo nuoFHis vermessen. In die normierte d-NADH Oxidase Aktivität,
auf die sich die Abweichung vom Ausgangsstamm bezieht, ist die Menge der Komplex I Varianten in den
Membranen über die d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität miteinbezogen.
Plasmid in
BW25113Δnuo
d-NADH Oxidase
Aktivität
d-NADH/
Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
Normierte
d-NADH Oxidase
Aktivität
[µmol·min-1·mg-1]
pBADnuo nuoFHis
Vergleich
zum
Ausgangsstamm
[%]
0.25
1.6
0.25
-
pBADnuo nuoFHis
nuoCD H514L
0.22
1.5
0.23
-8
pBADnuo nuoFHis
nuoCD F515L
0.13
1.2
0.17
-32
pBADnuo nuoFHis
nuoCD F515W
0.19
1.2
0.25
0
pBADnuo nuoFHis
nuoCD F515Y
0.17
1.1
0.25
0
pBADnuo nuoFHis
nuoG W221L
0.15
1.4
0.17
-32
pBADnuo nuoFHis
nuoG W221F
0.26
1.8
0.23
-8
pBADnuo nuoFHis
nuoG W221Y
0.18
1.6
0.18
-28
Wurden die Positionen F515 und W221 gegen ein Leucin ausgetauscht, führte das jeweils zu
einer
deutlichen Verminderung der
normierten d-NADH Oxidase Aktivität. Die
Verminderung der Komplex I Aktivität wird also durch den Austausch des F515 bzw. W221
gegen das Leucin hervorgerufen. Das ist ein Hinweis darauf, dass diese Aminosäuren am
Elektronentransport beteiligt sind. Der Austausch des F515 gegen eine andere aromatische
Aminosäure und der Austausch des W221 durch Tryptophan hat keinen Einfluss auf die
normierte d-NADH Oxidase Aktivität. Die Membranen der Mutante in der das W221 gegen
92
Ergebnisse
ein Tyrosin ausgetauscht wurde, zeigen eine verminderte normierte d-NADH Oxidase
Aktivität. Die Abweichung von -28% liegt an der Fehlergrenze der dNADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität. Die normierte d-NADH Oxidase Aktivität der Membranen aus der
Mutante, in denen das Histidin H514 gegen ein Leucin ausgetauscht wurde, ist unverändert im
Vergleich zum Ausgangsstamm. Das kann einerseits bedeuten, dass das Histidin nicht am
Elektronentransport im Komplex I beteiligt ist. Eine andere Möglichkeit ist, dass das Histidin
im unveränderten Enzym am Elektronentransport beteiligt ist, aber dass das Fehlen des
Histidins in der Mutante zu keiner messbaren Beeinflussung des Elektronentransfers führt.
Die berechneten Elektronentransferraten der möglichen Wege N5 → F515 →H514 → N6a
und N5 → F515 → N6a liegen beide in der Größenordnung von 1„000 s -1 (Wittekindt et al.,
2009), das heißt auch ohne Beteiligung des H514 werden nach der Theorie ausreichend hohe
Übertragungsraten erreicht.
Zwischen den Fe-S-Zentren N6b und N2 ist nach der hopping Theorie nur eine konservierte,
aromatische Aminosäure, das Phenylalanin F101, ein Kandidat für die Beteiligung am
Elektronentransport. Im T. thermophilus Komplex I liegt das Phenylalanins 8.6 Å von N6b
und 5.6 Å von N2 entfernt, während der Abstand zwischen den beiden Fe-S-Zentren 10.5 Å
von Kante zu Kante (14.2 Å zwischen den Mittelpunkten) beträgt. Die normierte d-NADH
Oxidase Aktivität der Membranen ist jedoch in allen Mutanten, in denen dieses Phenlyalanin
ausgetauscht wurde, unverändert gegenüber dem Ausgangsstamm (Tab. 4-14). Entweder ist
diese Aminosäure nicht an der Elektronenübertragung beteiligt oder die Differenz der
Transferraten zwischen der direkten Elektronenübertragung zwischen den beiden Fe-SZentren und der Übertragung mit Beteiligung des F101 ist zu gering, um durch diese
Messungen erfasst zu werden.
93
Ergebnisse
Tabelle 4-14: Komplex I-vermittelte Aktivitäten der cytoplasmatischen Membranen der Mutanten
F101NuoI. Zum Vergleich wurden auch Membranen aus dem Ausgangsstamm BW25113Δnuo/pBADnuo
nuoFHis vermessen. In die normierte d-NADH Oxidase Aktivität, auf die sich die Abweichung vom
Ausgangsstamm bezieht, ist die Menge der Komplex I Varianten in den Membranen über die dNADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität miteinbezogen.
Plasmid in
BW25113Δnuo
d-NADH Oxidase
Aktivität
d-NADH/
Ferricyanid Oxidoredukatseaktivität
Normierte
d-NADH Oxidase
Aktivität
Vergleich
zum
Ausgangsstamm
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
-
pBADnuo nuoFHis
0.25
1.6
0.25
pBADnuo nuoFHis
nuoI F101L
0.22
1.1
0.32
+28
pBADnuo nuoFHis
nuoI F101W
0.23
1.5
0.25
0
pBADnuo nuoFHis
nuoI F101Y
0.21
1.3
0.26
+4
Für den Übertragungsschritt N6b → N2 ohne Beteiligung einer aromatischen Aminosäure
wurde eine Tranferrate von 100 s-1 berechnet, für die Übertragung N6b → F101 →N2 liegt
sie nach der hopping Theorie bei 3.6 x 105 s-1. Die experimentell bestimmte
Elektronentransferrate des Gesamtprozesses des in dieser Arbeit isolierten Komplex I aus E.
coli beträgt 54 s-1. Die Transferrate des Übertragungsprozesses ohne Beteiligung der
aromatischen Aminosäure liegt somit in der gleichen Größenordnung wie die experimentell
bestimmte Transferrate.
4.4.3 Stabilität der Komplex I Varianten W221YNuoG, W221Y NuoG und F515NuoCD
Der Austausch der Aminosäuren W221NuoG und F515NuoCD jeweils gegen Leucin führte zu
einer deutlichen Verminderung der Komplex I vermittelten Aktivtäten in den Membranen.
Um zu Überprüfen, ob diese Aktivitätsabnahme somit durch eine Instabilität der Komplex I
Varianten hervorgerufen wurde, wurden diese Varianten isoliert und charakterisiert.
94
Ergebnisse
Aus jeweils 40 g Zellen der Stämme BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoG F515L und
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoG W221L wurden die Membranen präpariert und die
Proteine durch Dodecylmaltosid aus den Membranen extrahiert. Mittels AnionenaustauschChromatographie und Affinitätschromatographie wurden analog zur Präparation aus dem
Ausgangstamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis die Komplex I Varianten gereinigt (Kap.
4.3.6.). Die Ausbeute der Präparation der Variante F515LNuoCD lag bei 2.5 mg mit einer
spezifischen NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität von 155 µmol·min-1·mg-1 und die
der
Variante
W221LNuoG
bei
1.7
mg
mit
einer
spezifischen
Aktivität
von
138 µmol·min-1·mg-1. Im Vergleich zur Präparation aus dem Ausgangstamm waren die
Ausbeuten um 50 bzw. 70% geringer, während die spezifische NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktase Aktivität in der gleichen Größenordnung lag.
Die Homogenität der Präparationen wurde mittels analytischer Größenausschluß-Chromatographie überprüft. Das Elutionsprofil der Variante F515LNuoCD zeigte neben dem Gipfel, der
dem Komplex I zugeordnet wird, einen weiteren Gipfel, der dem NADH Dehydrogenase
Fragment entspricht (Daten nicht gezeigt). Das NADH Dehydrogenase Fragment aus den
Untereinheiten NuoE, NuoF und NuoG enthält neben der NADH-Bindestelle und dem FMN
auch den His-tag N-terminal an NuoF. Wenn der Komplex I während der Präparation
teilweise in seine Fragmente zerfällt, bindet auch das NADH Dehydrogenase Fragment an die
Affinitätssäule und trägt ebenfalls zur NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität bei. Auch
die Präparation des unveränderten Komplex I ist häufig durch das NADH Dehydrogenase
Fragment verunreinigt. Dieses Fragment kann aber einfach mittels GrößenausschlußChromatographie abgetrennt werden (Kap. 4.1.1.). Aus diesem Grund wurde die gesamte
Präparation
der
Variante
F515LNuoCD
auf
eine
präparative
Größenausschluß-
Chromatographiesäule aufgetragen und von den Fraktionen die NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität bestimmt (Abb. 4-17).
95
Ergebnisse
A)
Absorbanz bei 280 nm [mAu]
60
150
50
40
100
30
20
50
10
0
0
5
10
15
20
25
30
Absorbanz bei 280 nm [mAu]
70
200
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
-1
-1
[µmol·min ·mg ]
B)
25
20
15
10
5
0
Volumen [mL]
5
10
15
20
25
Volumen [mL]
Abbildung 4-17: Größenausschlußchromatographie der Präparation der Komplex I Variante F515LNuoCD.
Gezeigt sind die präparative Größenausschlußchromatographie (A) und die anschließende analytische
Chromatographie (B). Die Absorbanz bei 280 nm ist als durchgezogene Linie und die NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der Fraktionen als Punkt/Strich Linie gezeigt.
Wie erwartet, zeigt das Elutionsprofil zwei Gipfel, die beide NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität aufwiesen. Die Fraktionen des Gipfels, der dem Komplex I
zugeordnet wird, wurden vereinigt und mittels analytischer Größenausschlußchromatographie
analysiert (Abb. 4-17). Das Elutionsprofil zeigt nur einen Gipfel im Größenbereich des
Komplex I, die gereinigte Variante F515LNuoCD ist also stabil und homogen.
Das Elutionsprofil der analytischen Größenausschluß-Chromatographie der präparierten
Variante W221LNuoG enthält ebenfalls die dem Komplex I und dem NADH Dehydrogenase
Fragment zugeordneten Gipfel (Abb. 4-18). Da der Gipfel im Größenbereich des NADH
Dehydrogenase Fragmentes aber wesentlich intensiver ist, ist die Komplex I Variante
vermutlich nicht stabil und zerfällt während der Präparation. Die Fraktionen des Gipfels im
Größenbereich des Komplex I wurden vereinigt und wieder auf eine GrößenauschlußChromatographiesäule aufgetragen, das zugehörige Elutionsprofil zeigte jedoch ebenfalls den
Gipfel des Zerfallsprodukt (Daten nicht gezeigt).
96
Ergebnisse
Absorbanz bei 280 nm [mAu]
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
5
10
15
20
25
Volumen [mL]
Abbildung 4-18: Größenausschlußchromatographie der Präparation der Komplex I Variante W221LNuoG.
Gezeigt ist die Absorbanz bei 280 nm.
Der Austausch des Tryptophans W221 gegen ein Leucin führt zur Destabilisierung des
Komplex I, diese Variante gibt keinen Aufschluss über eine mögliche Beteiligung des
Tryptophans
am
Elektronentransport.
Da
die
Membranen
der
Mutante
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoG W221Y, in der das Tryptophan gegen ein Tyrosin
ausgetauscht wurde, ebenfalls verminderte d-NADH Oxidase Aktivität im Vergleich zum
Ausgangsstamm zeigten, sollte die Stabilität der Variante W221Y NuoG überprüft werden. Dazu
wurden aus den Membranen der Mutante BW25113Δnuo pBADnuo nuoFHis nuoG W221Y die
Membranproteine extrahiert und mittels Zuckergradientenzentrifugation aufgetrennt. Zum
Vergleich wurde auch ein Membranextrakt des Ausgangsstammes aufgetragen. Die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivität der Fraktionen des Gradienten wurden
bestimmt. Abbildung 4-19 zeigt die Aktivitätsprofile.
NADH/Ferricyanid Oxido-1
-1
reduktaseaktivität [µmol min ml ]
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Fraktion
Abbildung 4-19.: Zuckergradientenzentrifugation der Detergenzextrakte aus Cytoplasmamembranen der
Stämme BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis nuoGW221Y (▲) und BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFHis (■).
Die Gradienten wurden mit 15 - 25 mg Protein beladen und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase Aktivitäten
auf 10 mg Proteinauftrag normiert.
97
Ergebnisse
Die Membranextrakte beider Stämme zeigen im Aktivitätsprofil des Zuckergradienten die
bekannten zwei Aktivitätsmaxima. Das Maximum um die Fraktionen 5 und 6 wird der
alternativen NADH Dehydrogenase zugeordnet, das Maximum um Fraktion 13 dem Komplex
I. Der Membranextrakt der Mutante enthält also die stabile Komplex I Variante W221Y NuoG.
Die Fraktionen 8-11 des Gradienten zeigen leicht erhöhte Aktivität im Vergleich zum
Ausgangstamm, die von dem NADH Dehydrogenase Fragment hervorgerufen werden könnte.
Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass ein Teil des aus den Membranen
herausgelösten Komplex I Variante zerfällt.
4.5 ESR-Spektroskopische Charakterisierung weiterer Proteine
4.5.1. ESR-spektroskopische Charakterisierung einer
aus M. mazei
Superoxid Reduktase
Das Protein MM0632 aus M. mazei hat eine Größe von 20 kDa, zeigt Superoxid Reduktase
(SOR) Aktivität und enthält pro mol Protein 5.7 mol Fe und 4.5 mol anorganischen Schwefel.
Die Sequenz des Proteins zeigt das Bindemotivs eines [Fe(His)4(Cys)]-Zentrums, dass in den
bisher bekannten SOR das aktive Zentrum bildet. Zusätzlich existieren ein Bindemotiv der
Form Cys(X)7CysXXCys und ein viertes Cystein in dem im Vergleich zu den bisher
bekannten SOR verlängerten C-Terminus des Proteins (Krätzer et al., 2010). In dieser Arbeit
sollte in Zusammenarbeit mit Christian Krätzer aus dem Arbeitskreis Prof. Deppenmeier
(Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie, Universität Bonn) die Kofaktoren von
MM0632 durch ESR-Spektroskopie charakterisiert werden. Die ESR-Proben wurden anaerob
von Christian Krätzer angesetzt. Es wurden ESR-Spektren des isolierten Enzyms (10 mg/mL
in 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 2.5 mM Desthiobiotin, 2.5 mM Dithioerythritol, pH 8) und
des mit einigen Körnchen Dithionit reduzierten Proteins aufgenommen (Abb. 4-20).
98
Ergebnisse
A
2.047
B
2.03
1.93
4.3
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
280
300
Magnetfeld [mT]
320
340
360
380
400
Magnetfeld [mT]
Abbildung 4-20: ESR-Spektren des Proteins MM0632. A zeigt das Differenzspektrum der Spektren der mit
Dithionit reduzierten Probe und des isolierten Enzyms aufgenommen bei 6 K und 10 mW. Pro Spektrum wurden
fünf scans aufgenommen, die Modulationsamplitude betrug 10 G. B Zeigt das Spektrum der mit Dithionit
reduzierten Probe aufgenommen bei 13 K und 10 mW mit einer Modulationsmaplitude von 0.6 mT. Die
Mikrowellenfrequenz betrug 9.46 GHz, die Zeitkonstante 0.164 s und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9
mT/min. Die angegeben Zahlen stehen für die entsprechenden g-Werte.
Das bei 13 K aufgenommene Spektrum der reduzierten Probe zeigt ein axiales Signal mit
gx,y= 1.93 und gz = 2.047 (Abb. 4-20, B), dessen Intensität mit steigender Temperatur
abnimmt und das nicht in den Spektren der oxidierten Probe beobachtet wurde (Daten nicht
gezeigt). Dieses Signal wird einem vierkernigen high-spin Fe-S-Zentrum zugeordnet. Es ist
bei g = 2.03 überlagert von einem zweiten Signal unbekannter Herkunft. Abbildung 4-20 (A)
zeigt das Differenzspektrum aus einem bei 6 K aufgenommenen Spektrum des isolierten, im
oxidierten Zustand vorliegenden Proteins und aus einem bei 6 K aufgenommen Spektrum der
reduzierten Probe. Es zeigt ein typisches Signal eines high spin (S = 5/2) Fe 3+-Zentrums bei g
= 4.3. Dieses Signal wurde dem [Fe(His)4(Cys)] Zentrum zugeordnet und wurde ebenfalls in
den SOR aus Pyrococcus furiosus (Clay et al., 2002) und Desulfovibrio vulgaris (Clay et al.,
2003) nachgewiesen. In Verbindung mit der Aminosäuresequenz und den Gehalt an Eisen und
anorganischem Sulfat wurden ein [Fe(His)4(Cys)]-Zentrum und ein vierkerniges Fe-SZentrum durch ESR-Spektroskopie als Kofaktoren in MM0632 nachgewiesen. Ein
zusätzliches Signal unbekannter Herkunft wurde detektiert und stammt möglicherweise von
einem low-spin S = ½ Fe3+, vermutlich lokalisiert im [Fe(His)4(Cys)]-Zentrum.
99
Ergebnisse
4.5.2. ESR-spektroskopische Charakterisierung von BamBC aus Geobacter
metallireducens
Das sauerstoffempfindliche Protein BamBC aus dem obligativ anaeroben Bakterium
G. metallireducens hat eine Größe von etwa 180 kDa und eine Untereinheitenzusammensetzung der Form α2β2. Es ist am Abbau von Aromaten beteiligt, indem es die
Reaktion von Benzoyl-CoA zu Dienyl-CoA katalysiert. Die Katalyse der Rückreaktion, also
die Umsetzung des Dienyl-CoA, wurde in Anwesenheit eines Elektronenakzeptors
nachgewiesen. Pro mol einer αβ-Einheit wurden 15.2 ± 0.6 mol Eisen und 12.7 ± 1.4 mol
anorgansicher Schwefel kolorimetrisch bestimmt und eine massenspektrometrische Analyse
ergab pro Einheit 0.9 W, 1.2 Zn und 2.1 Ca. UV-vis Spektren des isolierten Proteins zeigen
die Anwesenheit von Fe-S-Zentren (Kung et al., 2009). Die Sequenz von BamB enthält ein
Bindemotive für ein Wolfram-Kofaktor und ein vierkerniges Fe-S-Zentrum und die Sequenz
von BamC zeigt ebenfalls Bindemotive für Fe-S-Zentren (Wischgoll et al., 2005). In dieser
Arbeit sollte das Protein in Zusammenarbeit mit Herrn Johannes Kung aus der Arbeitsgruppe
von Prof. M. Boll (Institut für Biochemie, Universität Leipzig) durch ESR-Spektroskopie
charakterisiert werden. Die Proben wurden anaerob von Herrn Johannes Kung angesetzt. Es
wurden Spektren des isolierten Proteins (300 µM in 20 mM Triethanolamin/HCl, 5 mM
MgCl2, pH 7.8 und 5% PEG 4000 (w/v)) und zum Vergleich Spektren des mit Dienyl-CoA
(4.6 mM) oder Dithionit (4 mM) reduzierten Proteins vermessen.
Die bei 10 K aufgenommenen Spektren der Dienyl-CoA reduzierten Proben zeigen mehrere
überlagerte Signale (Abb. 4-21, A3), deren Intensität mir Erhöhung der Temperatur abnimmt
und welche nicht in den Spektren der oxidierten Probe detektiert wurden (Daten nicht
gezeigt). Diese Signale werden mehreren vierkernigen Fe-S-Zentren zugeordnet. Das bei 40 K
aufgenommene ESR-Spektrum des isolierten Proteins zeigt ein axiales Signal mit g x = 1.893
und gy,z = 1.986 (Abb. 4-21, B1) und das bei 80 K aufgenommene Spektrum der selben Probe
zeigt ein rhombisches Signal mit den gleichen gx und gy-Werten und einem g z-Wert von 2.013
(Abb. 4-21, B2). Diese Signale werden einem W(V)-Kofaktor zugeordnet und wurden nicht in
den Spektren der mit Dienyl-CoA reduzierten Probe beobachtet (Abb. 4-21, B3).
100
Ergebnisse
Abbildung 4-21: ESR-Spektren von BamBC. A1 zeigt ein Differenzspektrum aus einem bei 10 K und 20 mW
aufgenommen Spektrum und dem Spektrum B1 des isolierten Proteins, A2 zeigt das bei 20 K und 5 mW
aufgenommene Spektrum der mit Dithionit versetzten Probe und A3 zeigt das bei 10 K und 20 mW
aufgenommene Spektrum der mit Dienyl-CoA reduzierten Probe. B1 und B2 zeigen Spektren des isolierten
Enzyms aufgenommen bei 40 K bzw. 80 K und 5 mW. B3 zeigt das bei 40 K und 5 mW aufgenommene
Spektrum der mit Dienyl-CoA reduzierten Probe. Die angegeben Zahlen stehen für die entsprechenden g-Werte.
Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.46 GHz, die Modulationsamplitute 0.6 mT, die Zeitkonstante 0.164 s und die
Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min. Die Abbildung wurde Kung et al. (2009) entnommen und modifiziert.
Das Differenzspektrum aus einem bei 10 K aufgenommen Spektrum und dem bei 40 K
gemessenen Spektrum der oxidierten Probe zeigt zusätzlich das Signal eines dreikernigen FeS-Zentrums (Abb. 4-21, A3). Dieses Signal wurde nicht in den Spektren der mit Dienly-CoA
versetzten Probe beobachtet (Daten nicht gezeigt). In Verbindung mit den Informationen aus
den Aminosäuresequenzen und den Metallanalysen lässt sich aus den ESR-spektroskopsichen
Daten ableiten, das BamB einen Wolfram-Kofaktor und ein vierkerniges Fe-S-Zentrum
koordiniert, während auf BamC zwei vierkernige und ein dreikerniges Fe-S-Zentrum
gebunden sind. Die Spektren der mit Dithionit reduzierten Probe, zeigen das Signal des
W(V)-Kofaktors und in geringer Intensität das der vierkernigen Fe-S-Zentren (Abb. 4-21,
101
Ergebnisse
A2). Das Signal, das dem dreikernigen Fe-S-Zentrum zugeordnet wurde, wurde nicht
detektiert. Demnach wird das dreikerinige Fe-S-Zentrum durch Dithinoit reduziert, während
das Wolfram-Zentrum weiterhin oxidiert vorliegt. In der mit Dithionit versetzten Probe sind
die vierkernigen Fe-S-Zentren im Vergleich zu der mit Dienyl-CoA versetzten Probe nur zu
einem geringen Maß reduziert.
102
Diskussion
5. DISKUSSION
5.1 Die MHQ-Technik zur Beobachtung des Elektronentransfers innerhalb
des Komplex I aus E. coli
Zu verschiedenen Zeitpunkten der physiologischen Reaktion des isolierten Komplex I aus E.
coli wurde die Reduktion einzelner Fe-S-Zentren erfasst. Dazu wurde mit der MHQ-Technik
die Reaktion des Komplex I mit NADH zu Zeitpunkten im µs Bereich beendet und die Proben
durch Tieftemperatur ESR-Spektroskopie analysiert. Zunächst wurden durch Vorversuche mit
dem
Komplex
I
und
dem
NADH
Dehydrogenase
Fragment
die
geeigneten
Reaktionsbedingungen ermittelt. Die ESR-Spektren zeigen jeweils ein Apparatur-bedingtes
Artefakt im Bereich von g = 2.0, das die Auswertung der Signale der Fe-S-Zentren im gzBereich nicht zulässt. Gerade in diesem Bereich sind die Signale der vierkernigen Zentren N2,
N3 und N4 aufgelöst, somit ist die Analyse der Reduktionskinetik nur eingeschränkt möglich
(Kap. 4.2).
In der vorliegenden Arbeit wird die Zuordnung der ESR-Signale zu den einzelnen Fe-SZentren nach der Nomenklatur von Ohnishi vorgenommen (Ohnishi, 1998). Für die
zweikernigen Fe-S-Zentren wurden die Zeitkonstanten der Reduktion des N1a zu ~ 3.0 ms
und für die der Reduktion des N1b zu ~ 4.3 ms bestimmt (Tab. 4-3). Die Signale der
vierkernigen Fe-S-Zentren zeigen die Reduktion von N2 ab einem Reaktionszeitpunkt von
404 µs, während die Reduktion der Fe-S-Zentren N3 und N4 erst ab einem
Reaktionszeitpunkt von 1.2 ms detektiert wurde (Abb. 4-8). Diese Erkenntnisse stehen im
Einklang mit Ergebnissen einer Arbeit, die den Elektronentransfer innerhalb des Komplex I
aus E. coli mit der gleichen Methode untersucht hat (Verkhovskaya et al., 2008). Der Aufbau
zum Ansetzen der Proben unterscheidet sich hauptsächlich in der Einfriertechnik von der in
dieser Arbeit verwendeten Apparatur. Die Analyse der ESR-Signale ergab kürzere
Zeitkonstanten für die Reduktion der Fe-S-Zentren N1a und N2, während die Reduktion der
Fe-S-Zentren N1b und N6b langsamer verlief. Die Daten für die Reduktion des Fe-SZentrums N6b wurden durch Auswertung des Signals bei g x,y = 1.88 und gz = 2.09 erhalten.
Beiträge weiterer Fe-S-Zentren zu den Signalen der bei 10 K und 10 mW aufgenommenen
Spektren wurden von den Autoren ausgeschlossen (Verkhovskaya et al. 2008; Belevich et al.,
2007). Das Signal der bei 11 K und 10 mW aufgenommenen Spektren bei g = 1.88 wird den
Fe-S-Zentren N3 und N4 und das Signal bei g = 2.09 ebenfalls dem Zentrum N4 zugeordnet
103
Diskussion
(Leif et al., 1995; Kap. 2.2.1). Das Signal mit dem g-Wert 2.09 ist aufgrund des oben
genannten Artefakts jedoch nicht auswertbar. In beiden Arbeiten wird sowohl eine frühe
Reduktion des nahe des FMN und abseits der übrigen Fe-S-Zentren gelegenen N1a als auch
des nahe der Ubichinonbindestelle gelegenen N2 beobachtet. Auffallend ist jedoch der große
Unterschied der Zeitkonstanten der Reduktionen in beiden Experimente. Die von
Verkhovskaya et al. veröffentlichten Spektren der Proben zeigen ab dem ersten
aufgenommenen Reaktionszeitpunkt von 90 µs die Signale der Fe-S-Zentren N1a, N1b und
N2 und die Zeitkonstanten der Reduktion von N1a und N2 wurden zu ~ 90 µs bestimmt. In
der vorliegenden Arbeit zeigen die Spektren der Proben zu den Zeitpunkten von 97 µs und
131 µs keine Signale, erst ab 404 µs werden Signale des N1a bzw. N2 detektiert. Die
Zeitkonstante für die Reduktion von N1a wurde zu ~3.0 ms bestimmt.
Der Nachweis eines Semichinonradikals ist in beiden Arbeiten nicht gelungen. Radikale
führen in ESR-Spektren zu Signalen im Bereich von g = 2.0, genau in diesem Bereich wird
das oben genannte Artefakt beobachtet. Die Identifizierung eines Radikalsignals war in dieser
Arbeit somit nicht möglich. Auch in den Spektren der Arbeiten von Verkhovskaya et al.
wurde nach Angaben der Autoren ein Artefakt im gleichen Bereich beobachtet (Belevich et
al., 2009). Dies ist eine mögliche Erklärung, warum auch bei diesen Experimenten kein
Radikal detektiert wurde. Um sicher zu stellen, dass die Kinetik des Elektronentransfers des
Komplex I und nicht ein steady-sate erfasst wird, wurden in der vorliegenden Arbeit Proben
mit einem durch den Hemmstoff Piericidin A inhibierten Komplex I angesetzt. Das Piericidin
A blockiert die Ubichinonbindestelle und verhindert eine Übertragung der Elektronen auf das
in der Präparation vorliegende Ubichinon (Friedrich et al., 1994). Auf diese Weise wurde
sicher gestellt, dass die Elektronen der ersten Umsatzrate beobachtet wurden. Dabei
unterscheiden sich die aufgenommenen Spektren der Proben mit und ohne Hemmstoff jedoch
kaum. Auffällig ist, dass das Signal des Fe-S-Zentrums N2 in den Spektren der Proben ohne
Hemmstoff (794 µs) später detektiert wurde als in den Spektren der Proben mit dem
Hemmstoff (404 µs). Die spätere Detektion ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen,
dass in diesen Proben eine Übertragung auf das Ubichinon stattfindet. In Anwesenheit des
Hemmstoffes wird der Reduktionsgrad des N2 nur durch die Aufnahme von Elektronen
bestimmt, ohne Hemmstoff wird der Reduktionsgrad zusätzlich durch die Abgabe der
Elektronen an Ubichinon beeinflusst.
104
Diskussion
Die in dieser Arbeit gezeigten Spektren geben Aufschluss über die physiologische Reaktion
des Komplex I. Die Daten zeigen, dass das Fe-S-Zentrum N1a an der physiologischen
Reaktion beteiligt ist. Die von Verkhovskaya et al. getroffene Aussage, dass das erste
Elektron, eines von NADH auf das FMN übertragenen Elektronenpaares, auf N2 übertragen
wird und das zweite Elektron auf N1a, wird unterstützt. Die beinahe simultane Reduktion des
nahe des FMN gelegenen N1a und des am Ende der Elektronentransportkette gelegene N2
lassen diesen Schluss zu. Die große Abweichung in den Reduktionszeiten wird vermutlich
durch
apparative
Unterschiede
hervorgerufen.
Die
in
dieser
Arbeit
ermittelten
Geschwindigkeiten des Elektronentransports sind deutlich niedriger, liegen aber in einem
Bereich, der mit der experimentell bestimmten Geschwindigkeit des Gesamtprozesses
vereinbar ist. Weitere Experimente zu dieser Thematik sind in der Literatur
nicht
beschrieben. Diese Arbeit zeigt auch die Grenzen der eingesetzten Methode zur Analyse der
Reaktionskinetik der Fe-S-Zentren des Komplex I auf. Die Auswertung der ESR-Spektren des
Komplex I ist aufgrund der Anzahl und der Überlappung der Signale nicht trivial und wird
durch das Artefakt in den Spektren der MHQ-Proben deutlich erschwert. Aufgrund der
benötigten großen Menge Komplex I ist eine breite Anwendung der Methode zur
Charakterisierung von Komplex I Varianten nur eingeschränkt möglich.
5.2. Die Bedeutung des Fe-S-Zentrum N1a
In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass das zweikernige Fe-S-Zentrum N1a auf der
Untereinheit NuoE im Komplex I aus E. coli für die Stabilität des Proteins essentiell ist. Der
Austausch der einzelnen Cysteine gegen Alanine in den drei Positionen C92, C133 und C137
des Bindemotivs des Fe-S-Zentrums verhindert die Assemblierung des Komplex I in der
cytoplasmatischen Membran. Der Austausch auf der vierten Position C97 führt zwar zu einem
aktiven Komplex I in der Membran, dieser zerfiel jedoch nach der Extraktion des Proteins aus
der Membran. Der Austausch der Cysteine C97 und C133, jeweils eines an jedem Fe-Atom
von N1a, gegen Serin führte zum gleichen Effekt. Es wurden geringe Mengen an aktivem
Komplex I in der Membran detektiert, dieser war jedoch nach Detergenzextraktion nicht stabil
(Kap. 4.3.7.). Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde in einem weiteren Experiment in unserem
Arbeitskreis versucht, ein Fragment aus den Untereinheiten NuoE und NuoF aus A. aeolicus
ohne das Fe-S-Zentrum N1a heterolog in E. coli überzuproduzieren. Dafür wurde ein Plasmid
genutzt, in dem der Teil des Gens nuoE fehlt, der die C-terminale und damit die Fe-S105
Diskussion
Zentrum N1a koordinierende Domäne trägt. Das produzierte Protein bestand jedoch nur aus
der Untereinheit NuoF (Yao, 2010) und mittels ESR-Spektroskopie wurde gezeigt, dass das
Fe-S-Zentrum N3 in der Präparation fehlte (unveröffentliche Ergebnisse). Diese Daten lassen
vermuten, dass auch im Komplex I aus A. aeolicus die intakte N1a koordinierende Cterminale Domäne wichtig für die Stabilität des gesamten Komplex I ist. Sie unterstützt
vermutlich die Interaktion der N-terminalen Domäne der Untereinheit NuoE mit den anderen
Untereinheiten des Komplex I. In der Literatur liegen bisher wenige Erkenntnisse zur
strukturellen Bedeutung des Fe-S-Zentrums N1a vor. In der zu NuoE homologen Untereinheit
Nqo2 aus P. denitrificans wird N1a über das gleiche Bindemotiv wie in E. coli
(CX4CX35CX3C) koordiniert, die Cysteine dieses Motivs wurden ebenfalls gegen Alanine und
Serine ausgetauscht (Yano et al., 1994). Die varianten Untereinheiten wurden heterolog in E.
coli überproduziert, isoliert und die Menge an Eisen im Protein sowohl chemisch als auch
durch Spinquantifizierung mittels ESR-Spektroskopie bestimmt. Die chemisch bestimmte
Menge des Eisens pro mg Protein lag lediglich bei 12-27% und die durch Spinquantifizierung
bestimmte Menge bei 2 bis 5 % im Vergleich zum unveränderten Protein. Das Signal des N1a
in den ESR-Spektren war bei den varianten Proteinen verbreitert, die g-Werte leicht
verschoben und zum Teil traten zusätzliche Signale auf. Der Austausch der einzelnen
Cysteine im Bindemotiv hatte anscheinend keinen Einfluss auf die Stabilität der Untereinheit,
die Menge an koordinierten Eisen im Protein und die ESR-Spektren der Fe-S-Zentren waren
jedoch verändert (Yano et al., 1994). Die [2Fe-2S] Ferredoxine aus Clostridium pasteurianum
und A. aeolicus sind homolog zur C-terminalen, N1a tragenden Domäne der Untereinheit
NuoE und koordinieren das zweikernige Fe-S-Zentrum mit dem Bindemotiv CX12CX32CX3C
(Meyer, 2001). Der Austausch zwei dieser Cysteine gegen Alanine bzw. drei dieser Cysteine
jeweils gegen Serine im Ferredoxin aus C. pasteurianum führt zu einem stabilen Protein mit
dem gebunden Fe-S-Zentrum (Fujinaga et al., 1993; Golinelli et al., 1998). Zwei der
entsprechenden Serin-Varianten aus A. aeolicus wurden kristallisiert. Die Struktur mit einer
Auflösung von 1.25 Å bestätigte die Beteiligung der Serine an der Koordination des Fe-SZentrums und die Gesamtstruktur der varianten Proteine war gegenüber des unveränderten
Proteins nahezu unverändert (Yeh et al., 2002). Weitere Mutageneseexperimente haben
gezeigt, dass die Cysteine C24 und C60 in einem strukturell flexibleren Bereich des Proteins
liegen, während die übrigen, C11 und C56, von einem eher starren Proteinbereich umgeben
sind (Golinelli et al., 1998). Es wird vermutet, dass ein loop in der Nähe des Fe-S-Zentrums
das Zusammenspiel von flexibler und starrer Proteinumgebung und der starren Geometrie des
Fe-S-Zentrums ermöglicht und damit die Stabilität des Proteins gewährleistet (Yeh et al.,
106
Diskussion
2002). Dieser loop hat keine Entsprechung in der Untereinheit NuoE und seinen Homologen
(Yeh et al., 2000). Möglicherweise führt der Austausch der Cysteine im Bindemotiv zu
größeren strukturellen Veränderungen, die zwar die Produktion der Untereinheit zulassen, die
bei einer Überproduktion des gesamten Komplex I aus P. denitrificans die Assemblierung der
Untereinheiten aber verhindern würden. Der Sequenzvergleich von NuoE aus P. denitrificans,
A. aeolicus und E. coli zeigt, dass der C-Terminus von NuoE aus P. denitrificans um 69
Aminosäuren verlängert ist. Diese zusätzlichen Aminosäuren könnten die strukturelle
Flexibilität und damit die Stabilität der Varianten begünstigen. Interessant wäre in diesem
Zusammenhang, ob bei Mutagenese des Bindemotivs auch die Produktion des gesamten P.
denitrificans Komplex I möglich ist. Ein Austausch der Cysteine C92 und C137 gegen Serine
in der E. coli Untereinheit NuoE wurde nicht vorgenommen. Die Ergebnisse der in dieser
Arbeit charakterisierten Mutanten im Vergleich mit den Varianten aus P. denitrificans lassen
vermuten, dass auch diese Komplex I Varianten nicht stabil wären.
Im Komplex I bilden die sieben Fe-S-Zentren N3, N1b, N4, N5, N6a, N6b und N2 eine
Elektronentransportkette zwischen dem FMN, das die Elektronen vom NADH aufnimmt, und
dem Ubichinon als Elektronenakzeptor. Aufgrund seiner aus der Struktur des hydrophilen
Teils des Komplex I aus T. thermophilus bekannten Lage ist das Fe-S-Zentrums N1a nicht
Teil dieser Kette (Sazanov & Hinchliffe, 2006). ESR-Spektren des mit NADH reduzierten
Komplex I aus E. coli zeigen, dass Elektronen auf dieses Zentrum übertragen werden (Leif et
al., 1995; Verkhovskaya et al., 2008) Die in dieser Arbeit aufgenommenen Spektren zur
Verfolgung der Elektronenübertragung innerhalb des Komplex I zeigen, dass N1a auch
während der physiologischen Reaktion Elektronen aufnimmt (Kap. 5.1.). Es wird vermutet,
dass das Fe-S-Zentrum, durch die zeitweilige Aufnahme eines Elektrons, die Radikalbildung
beim
Umschalten
zwischen
der
Zweielektronenübertragung
des
NADH
auf
die
Einelektronenübertragung der Fe-S-Zentren am FMN vermeidet. Ob dies der Fall ist, lässt
sich durch den gewählten Ansatz nicht klären. Die aus den MHQ-Experimenten gewonnen
Ergebnisse lassen aber vermuten, dass N1a nicht nur strukturelle Bedeutung im Komplex I
hat.
107
Diskussion
5.3 Die mögliche Beteiligung
Elektronentransport im Komplex I
aromatischer
Aminosäuren
am
In dieser Arbeit wurde erstmals experimentell untersucht, ob aromatische Aminosäuren an der
Elektronenübertragung zwischen den Fe-S-Zentren im Komplex I beteiligt sind. Dazu wurden
aromatische Aminosäuren an fünf Positionen im Komplex I aus E. coli gegen die jeweils
anderen aromatischen Aminosäuren und gegen Leucin ausgetauscht und der Einfluss des
Austausches auf die Aktivität des Komplex I in den cytoplasmatischen Membranen ermittelt.
Die Positionen wurden aufgrund einer theoretischen Arbeit ausgewählt, in der für den
Elektronentransport im Komplex I ein hopping Mechanismus und in der unter Einbeziehung
der Struktur des Komplex I aus T. thermophilus sieben konservierte, aromatische
Aminosäuren als mögliche hopping Partner vorgeschlagen werden (Wittekindt et al., 2009).
Im E. coli Komplex I führte der Austausch des Phenylalanins F515NuoCD zwischen den Fe-SZentren N5 und N6a gegen Leucin zu einer stabilen Komplex I Variante, deren Aktivität in
der Membran um ein Drittel reduziert war, während ein Austausch gegen ein Tryptophan oder
ein Tyrosin die Aktivität nicht beeinflusste (Tab. 4-14 und Kap. 4.4.3.). Diese Messungen
unterstützen die Vermutung, dass die konservierte aromatische Aminosäure F515 am
Elektronentransport beteiligt ist. Der Austausch des Tryptophans W221 NuoG zwischen diesen
beiden Fe-S-Zentren gegen ein Tyrosin führte ebenfalls zu einer stabilen Komplex I Variante,
deren Aktivität in der Membran um knapp ein Drittel vermindert war. Der Austausch des
Tryptophans gegen Leucin führte zu einem instabilen Komplex I, während der Austausch
gegen ein Phenylalanin zu einem stabilen Komplex I führte und keinen Einfluss auf die
Aktivität des Komplex I zeigte (Tab. 4-14 und Kap. 4.4.3.). Die Eigenschaften der Varianten
W221LNuoG und W221FNuoG stehen im Einklang mit Ergebnissen zum E. coli Komplex I, die
in einem anderen Kontext veröffentlichen wurden. Der Austausch des W221NuoG gegen ein
Alanin führte zu keinem stabilen Komplex I, während der Austausch gegen ein Phenylalanin
die Stabilität und die Aktivität des Komplex I nicht beeinflusste (Nakamaru-Ogiso et al.,
2008). Eine Beteiligung der konservierten aromatischen Aminosäure W221 NuoG am
Elektronentransport kann demnach nicht ausgeschlossen werden. Nach der hopping Theorie
sind diese beiden Aminosäuren entweder seriell am Elektronentransport N5→ F515 → W221
→ N6a beteiligt, oder die Elektronen werden alternativ über die Wege N5 → W221 → N6a
oder N5→ F515→N6a übertragen (Wittekindt et al., 2009). Die Ergebnisse aus dieser Arbeit
unterstützen die serielle Beteiligung beider Aminosäuren oder die Annahme des
108
Diskussion
Phenylalanins F515 als alleinigen hopping Partner. Nach der Theorie ist die Beteiligung einer
dritten Aminosäure, des Histidin H514NuoCD, am Elektronentransport zwischen den beiden
Zentren möglich. Der Austausch dieser Aminosäure gegen Lecuin hatte jedoch keinen
Einfluss auf die Aktivität des Komplex I (Tab. 4-14). In Y. lipolytica wurde das zu H514NuoCD
homologe H384 gegen Alanin ausgetauscht. Dies führte zu einem um 70% geringeren Gehalt
des Komplex I in den Membranen und zu einer Halbierung der Komplex I vermittelten
Aktivität der Membranen (Kashani-Poor et al., 2001). Da im Komplex I aus Y. lipolytica an
den zu W221NuoG und F515NuoCD homologen Positionen ebenfalls ein Tryptophan und ein
Phenylalanin liegen, ist die verminderte Komplex I Aktivität dieser Alanin-Mutante
vermutlich auf strukturelle Gründe zurückzuführen.
Der Austausch einzelner Aminosäuren kann immer zu strukturellen Veränderungen führen.
Eine verminderte Aktivität der Varianten kann somit auch durch Änderung der Lage der
beiden
Fe-S-Zentren
zueinander
hervorgerufen
werden.
Um
diese
Möglichkeit
auszuschließen, wird die Kristallstruktur der Varianten benötigt. Die ist jedoch nicht trivial,
da schon die Struktur des unveränderten, hydrophilen Teils des Komplex I aus E. coli bisher
nicht verfügbar ist. Für eine Beteiligung aromatischer Aminosäuren an dem Transferschritt
zwischen den Fe-S-Zentren N5 und N6a spricht der große Abstand zwischen den Zentren von
16.9 Å zwischen den Mittelpunkten und 14.0 Å zwischen den Kanten. Nach der allgemein
anerkannten
through-space
Theorie
tunneln
Elektronen
innerhalb
einer
Elektronenübertragungskette in Proteinen zwischen Redoxzentren mit einem Abstand kleiner
als 14 Å (Page et al., 1999; Moser et al., 2006). Nach theoretischen Berechnungen von
Koslowski und Mitarbeitern liegt die berechnete Elektronentransferrate für die direkte
Übertragung zwischen den Fe-S-Zentren N5 und N6a bei 10-4 s-1 und ist damit um einige
Größenordnungen zu niedrig, um die experimentelle Elektronentransferrate von etwa 50 s -1
erklären zu können. Durch Beteiligung der aromatischen Aminosäuren werden nach der
hopping Theorie Transferraten im Bereich von 10 3 s-1 erreicht (Wittekindt et al., 2009.). Die
Beteiligung einer aromatischen Aminosäure an genau diesem Transferschritt ist zudem
wahrscheinlich, da die beiden Zentren auf zwei verschiedenen Modulen des Komplex I
lokalisiert sind. Die Elektronentransportkette entstand vermutlich evolutionär durch die
Anlagerung zweier Module (Kap. 2.2.), eine aromatische Aminosäure kann somit zur
Überbrückung des ungewöhnlich langen Elektronenübertragungsweg zwischen den beiden
Modulen dienen.
109
Diskussion
In dieser Arbeit wurden außerdem das konservierte Phenylalanin F35NuoG zwischen den Fe-SZentren N1b und N4 (Mittelpunktsabstand: 13.9 Å, Kantenabstand: 10.7 Å) und das
Phenylalanin F101NuoI zwischen den Fe-S-Zentren N6b und N2 (Mittelpunktsabstand: 14.2 Å,
Kantenabstand: 10.5 Å) ausgetauscht. Der Austausch des Phenylalanins F101NuoI gegen
Leucin, Tyrosin oder Tryptophan führte bei keiner Variante zu einer Veränderung der
Aktivität im Vergleich zum unveränderten Komplex I. Das gleiche gilt für den Austausch des
Phenylalanins F35NuoG gegen Leucin oder Tyrosin. Der Austausch des F35NuoG gegen ein
Tryptophan führte zu einer Aktivitätsverminderung, diese wird aber möglicherweise durch
strukturelle Veränderungen des größeren Restes hervorgerufen (Tab. 4-13 und 4-15). Im E.
coli Komplex I liegt in direkter Nachbarschaft zum F35NuoG ein Tyrosin, im Komplex I aus T.
thermophilus liegt an dieser Position ein Leucin. Möglicherweise ist im E. coli Komplex I das
Tyrosin anstelle des F35NuoG an der Elektronenübertragung beteiligt. Die Aktivitätsminderung
der Variante F35WNuoG wäre dann auf eine veränderte Position des Tyrosins aufgrund des
eingefügten Tryptophans an der Nachbarposition zu erklären. Die Ergebnisse zu den
Transferschritten N1b → N4 und N6b → N2 lassen zwei Möglichkeiten zu: Entweder sind
diese aromatischen Aminosäuren nicht am Elektronentransport beteiligt oder der Einfluss der
Beteiligung wird durch die in dieser Arbeit durchgeführten Messungen nicht erfasst. Die nach
Wittekindt et al. berechneten Elektronentransferraten für die direkte Übertragung zwischen
N1b und N4 (5 s-1) bzw. N6b und N2 (100 s-1) liegen nahe bzw. im Bereich der experimentell
bestimmten Elektronentransferrate für den Gesamtprozess des in dieser Arbeit präparierten
Komplex I (50 s-1). Auch ohne Beteiligung einer aromatischen Aminosäure können
möglicherweise ausreichend hohe Geschwindigkeiten erreicht werden. Die Transferraten der
direkten Übertragung werden in der theoretischen Arbeit als nicht ausreichend bezeichnet, da
dort für den Gesamtprozess von einer höheren Übertragungsrate (170 s-1) ausgegangen wird.
Dieser Wert ergab sich aus der Mittelung der Übertragungsraten des Komplex I aus
unterschiedlichen Präparationen aus verschiedenen Organismen, auch des mitochondrialen
Komplex I. Die Beteiligung der aromatischen Aminosäure F35NuoG und F101NuoCD führen bei
beiden Übertragungsschritten zu berechneten Elektronentransferraten im Bereich von 10 5 s-1.
Sowohl die berechneten Transferraten mit als auch ohne Beteiligung der aromatischen
Aminosäuren können mit der in dieser Arbeit gemessene Aktivität erklärt werden. Es bleibt
somit offen, ob aromatische Aminosäuren an diesen Übertragungsschritten beteiligt sind bzw.
ob eine Beteiligung zwischen den relativ nah beieinander liegenden Fe-S-Zentren notwendig
ist.
110
Diskussion
Die nach der hopping Theorie am Übertragungsschritt zwischen den Fe-S-Zentren N3 und
N1b
(Mittelpunktsabstandstand: 14.2 Å, Kantenabstand: 11.0 Å) beteiligte Aminosäure
F397NuoF wurde in dieser Arbeit nicht ausgetauscht. Diese Aminosäure ist nicht konserviert,
im Komplex I einiger Organismen befindet sich an dieser Position ein Isoleucin. Die
Abstände zwischen den Fe-S-Zentren lassen vermuten, dass auch in diesem Fall ein möglicher
Effekt des Austausches nicht durch die Aktivitätsmessung erfasst werden würde.
5.4 Der Überexpressionsstamm BW25113 Δnuo pBADnuo nuoFHis
Der Stamm ANN0221, der mit dem Plamsmid pBADnuo nuoFHis transformiert wurde, bietet
ein gutes System zu Überproduktion des Komplex I und seiner Varianten (Pohl et al., 2007b).
Da der Stamm ANN0221 aber zur in-trans-Komplementation fähig ist (Pohl, 2008), ist dieses
System für eine Produktion von nicht stabilen oder inaktiven Komplex I Varianten nicht
geeignet. In dieser Arbeit wurde im Rahmen der Mutagenesexperimente am Bindemotiv des
Fe-S-Zentrums N1a gezeigt, dass im Stamm ANN0221 die episomal kodierte und nicht
stabile Untereinheit NuoE durch eine chromosomal kodierte, stabile Untereinheit NuoE
ersetzt wurde (Kap. 4.3.3. und 4.3.7.). Die Kombination des Stamm BW25113Δnuo (M.
Vranas, unveröfftl. Ergebnisse) mit dem Plasmid pBADnuo nuoFHis als Produktionssystem
für den Komplex I wurde in dieser Arbeit charakterisiert und steht als System zur
Charakterisierung von Mutanten unabhängig der Eigenschaften der resultierenden Komplex I
Varianten zur Verfügung (Kap. 4.3.6.).
5.5 ESR-Spektroskopische Charakterisierung zwei weiterer Proteine
Das Protein MM0632 aus M. mazei ist der Vertreter einer neuen Klasse von Superoxid
Reduktasen (SOR), die in anaeroben Organsimen an dem Abbau von reaktiven
Sauerstoffspezies beteiligt ist (Krätzer et al., 2010). In dieser Arbeit wurde durch ESRSpektroskopie ein [Fe(His)4(Cys)]-Zentrum und eine vierkerniges Fe-S-Zentrum in dem
isolierten Enzym nachgewiesen. Das [Fe(His)4(Cys)]-Zentrum ist in allen bisher untersuchten
SOR der Klasse I und II enthalten, während das vierkerniges Fe-S-Zentrum erstmals in einem
Protein mit SOR-Aktivität nachgewiesen wurde (Krätzer et al., 2010; Clay et al., 2002; Clay
et al., 2003). Das Signal des vierkernigen Fe-S-Zentrums der Spektren des reduzierten
111
Diskussion
Enzyms ist von einem Signal unbekannter Herkunft überlagert. Eine Simulation des Signals
des Fe-S-Zentrums war aus diesem Grund bisher nicht möglich. Die Charakterisierung des
zusätzlichen Signals, welches möglicherweise durch eine
low-spin S = ½ Fe3+ Spezies
hervorgerufen wird, steht noch aus.
Das Protein BamBC aus G. metallireducens katalysiert die Reaktion von Dienyl-CoA zu
Benzoyl-CoA in Anwesenheit eines Elektronenakzeptors (Kung et al., 2009). In einer
kürzlich erschienen Veröffentlichung ist auch der Nachweise der Katalyse der Hinreaktion,
also die Reduktion des Benzyol-CoA, gelungen (Kung et al., 2010). Das BamBC stellt somit
den Vertreter einer neuen Klasse von Benzoyl-CoA Reduktasen dar, die eine ATPunabhängige Birch ähnliche Reduktion katalysieren (Wischgoll et al., 2005; Kung et al.,
2009). Die Ergebnisse der ESR-spektroskopischen Charakterisierung des Proteins in dieser
Arbeit in Verbindung mit Sequenzinformationen zeigen, dass dieses Protein einen WolframKofaktor, drei vierkernige Fe-S-Zentren und ein dreikerniges Fe-S-Zentrum koordiniert. Die
Reduktion der Kofaktoren durch Dienyl-CoA lassen eine Beteiligung an der physiologischen
Reaktion vermuten. Die Signale der vierkernigen Fe-S-Zentren sind in den Spektren
überlagert, eine Auflösung der einzelnen Signale ist bisher nicht gelungen.
112
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125
Danksagung
Bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Friedrich bedanke ich mich für die Bereitstellung des
interessanten Themas und die vielen Möglichkeiten bei der experimentellen Arbeit auch über das
eigene Labor hinaus. Ein herzliches Dankeschön für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die
geduldige Einführung in die ESR-Spektroskopie!
Bei Herrn Prof. Dr. Simon de Vries bedanke ich mich für die freundliche und hilfreiche Betreuung im
Labor in Delft und das Nutzen der MHQ-Apparatur. Bei Herrn Marc Strampraad für die wertvolle
Hilfe beim Sprayen. Mein Dank gilt allen Kooperationspartnern Prof. Dr. Matthias Boll, Prof. Dr.
Uwe Deppenmeier, Prof. Dr. Georg Fuchs, Nasser Gad„on, Christian Krätzer und Johannes Kung.
Bei Frau Helga Lay bedanke ich mich für die stets verlässliche Hilfe bei den vielen Alltagsproblemen
im Labor und Herrn Helmut Hamacher für die technische Unterstützung, beide hatten immer eine
Lösung parat. Bei Frau Dörte Thiel und Herrn Antonio Espin möchte ich für die unermüdliche Hilfe
nicht nur bei der langwierigen Proteinpräparation bedanken. An Frau Linda Williams und Frau
Angelika Massler vielen Dank für die freundliche Unterstützung bei allerlei bürokratischen Dingen.
Ein herzliches Dank auch an die im Rahmen dieser Arbeit betreuten Diplomanden Thomas Bayer,
Elvira Friedrich, Annemarie Horn, Klaudia Morina und Marius Schulte sowie die Bachelorstudentin
Isabella Straub und die studentische Hilfskraft Vanda Barros Pires. Gedankt sei auch den vielen
während dieser Arbeit betreuten Mitarbeiterpraktikanten.
Meinem Arbeitskreis danke ich für die freundschaftliche Atmosphäre und die schöne Zeit nicht nur im
Labor! Meinen langjährigen Mitstreitern Heiko Erhardt, Markus Kohlstädt, Thomas Pohl und Daniel
Schneider danke ich für die tatkräftige Unterstützung und stets heiteren Stunden bei der Arbeit. Zwar
keine langjährigen, aber natürlich ebenso angenehme Mitdoktoranden waren Udo Glessner, Ramona
Labatzke, Klaudia Morina, Marius Schulte, Stefan Steimle und Marta Vranas.
Meinen lieben Eltern kann ich nicht genug danken für ihre ausnahmslose Unterstützung in allen
Lebenslagen! Ich danke von Herzen Nele, Fabian, Annika, Leila, Christine und vor allem für die
Unterstützung im Endspurt Thomas.
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