DNA-Analytik

DNA-Analytik
Dr. Holger Klapproth
DNA-Sequencing
Vom Genom zur Sequenz
Sequenziermethoden
•  Enzymatisch: Didesoxymethode nach Sänger
Markierte Primer
Markierte DNA-Stränge
4 Farbstoffe / eine Reaktion (ABI)
1 Farbstoff, vier Reaktionen (ALF)
radioaktiv
•  Chemisch: Maxam umd Gilbert, radioaktiv
•  Hochmodern pyrosequencing u.a. (auch enzym.)
Terminatornukleotide
O
CH3
HN
O
HO
P
OH
O
O
P
OH
O
O
P
O
O
5´
N
O
OH
2´
ddTTP
Terminatorfarbstoffe
O
CH3
2
HN
O
HO
P
OH
O
O
P
OH
O
O
P
O
O
5´
N
O
OH
2´
ddTTP
Cy5
Endlich: die Sequenz
Spezifikationen
•  bis zu 1000 Basen pro Lauf
•  heutzutage meist als Cycle-Sequenzing
•  Benötigt: Primer
Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Didesoxynukleotide (ddATP, ddCTP...)
•  Marker (z.B. Cy5-ddCTP, markierte Primer)
•  Enzyme: Taq-Polymerase, T7-DNA-Polymerase
Sänger Sequencing
von Estevezj (Eigenes Werk) [CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons
Next Generation Sequencing
Bsp.: Pyrosequenzing
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
sequencing by synthesis
Benötigt eine Einzelstrangvorlage
Der Komplementärstrang wird enzymatisch aufgebaut
Bei jedem Baseneinbau wird ein Molekül Pyrophosphat frei (PPi)
PPi wird von einem Enzym in ATP umgewandelt, das als Substrat für die
Luziferase dient -> Chemilumineszenz.
Adenosine 5´ phosphosulfate wird statt ATP zugegeben
Die anderen Basen werden einzeln zugegeben
Mit Apyrase werden nach jeden Schritt die verbliebenen dNTPs abgebaut
Es wird immer nur ein dNTP zugegeben. „Repeats“ geben stärkere Signale.
Schnell – aber nur für 300-500 bp geeignet