Pyrosequencing: Vor- und Nachteile, Anwendungsbeispiele
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Mutationsanalyse mittels Pyrosequencing® - Anwendungsbeispiele Gerlinde Winter ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Pyrosequencing Mostafa Ronaghi Pål Nyrén entwickelten die Pyrosequencing Technologie - vor ca. 10 Jahren - Biotage (Schweden) - seit 2 Jahren - Qiagen ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Pyrosequencing • Pyrosequencing ist eine Real-Time Sequenziermethode, bei der ein Sequenzierprimer entlang des DNA Stranges (Matrix) mit Hilfe der DNA Polymerase verlängert wird. ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Pyrosequencing • Schritt für Schritt wird jeweils eines der vier dNTP´s (Deoxyribonukleotidtriphosphate) in den Reaktionsansatz getropft. • Wenn ein Nukleotid eingebaut werden kann, wird das durch eine Kaskade von enzymatischen Reaktionen, entsprechend der Menge an freigesetztem Pyrophosphat (PPi), sichtbar gemacht. • Diese Methode vereint Detektion und Quantifizierung von genetischen Veränderungen in einem System. ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 PCR Amplifikation Streptavidin Sepharose Beads Forward Sequencing primer ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Qualitätskontrolle • Am Checkgel 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 6 PCR Effizienz, Mengen für das Pyrosequencing und Ergebnis abschätzen ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Immobilisieren des PCR Produkts mit Streptavidin Sepharose High Performance beads Die Lösung mit den Beads vorsichtig schütteln, bis sie homogen ist! Master mix: Streptavidin Seph. Beads 3µl Pyromark Binding Buffer 40µl High purity water 27µl ---------------------------------------------- ÖGP Frühjahrstagung Total volume 70µl PCR product 10µl 17.03. – 19.03.2011 Immobilisieren des PCR Produkts mit Streptavidin Sepharose High Performance beads • • • • 24 wells/ Lauf Volumen von 80µl/ well Platte verschließen 10 - 15min bei 1400rpm kreisförmig schütteln • Sofort nach dem Schütteln die Beads mit dem Filtertool ansaugen, bevor sie sedimentieren können! ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Isolierung von einzelsträngigem PCR Produkt Filter tool ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Isolierung von einzelsträngigem PCR Produkt Vakuum einschalten •aufnehmen der Beads 15 sec. •waschen •in 70% Ethanol 10 sec. •Denaturierungslösung 10 sec. •Waschpuffer 15 sec. •Das Vakuum abschalten bevor die Filterstifte mit den Beads in den Sequenzierprimer gestellt werden! Das Filtertool vorsichtig schütteln! ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Pyrosequencing Injektion von • Enzymen: DNA Polymerase ATP Sulfurylase Luciferase Apyrase • Substraten: Adenosine 5´Phosphosulfat (APS) Luciferin • Nukleotiden: A, C, G, T ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Pyrosequencing PyroMark Q24 ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Step 3: Pyrosequencing • Das erste Deoxyribonukleotid-triphosphat (dNTP) wird getropft. T T T T T TT • DNA Polymerase katalysiert den Einbau des dNTP´s im Anschluss an den Sequenzierprimer, wenn das Nukleotid komplementär zur Base am DNA Strang ist. • Bei jedem Einbau wird Pyrophosphat (PPi) freigesetzt, das der Menge an eingebauten Nukleotiden entspricht. ÖGP Frühjahrstagung T T T T T TT 17.03. – 19.03.2011 Pyrophosphat (PPi) wird freigesetzt PPi ATP Sulfurylase wandelt PPi in ATP um in Anwesenheit von APS (Adenosin 5`Phosphosulfat) Das resultierende ATP führt mit Hilfe der Luciferase zur Verwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, das erzeugt sichtbares Licht in Mengen, die proportional zur Menge an freigesetztem PPi sind. ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Das Licht wird durch CCD Sensoren detektiert und als Peak (Lichtsignal) im Pyrogram® dargestellt. Sequence to analyze: GTGGACAACCCCC G “dispensation order”: T G T A T GG A G A C T C AA T A CCCCC C C Die Peakhöhe ist direkt proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Pyrosequencing Apyrase baut kontinuierlich die nicht eingebauten Nukleotide und ATP ab ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Anwendung • Punktmutationen: die Zugabe der dNTP´s („dispensation order“) erfolgt sequentiell, zusätzlich werden die möglichen Varianten vor bzw. nach der Mutationsstelle getropft. • Insertionen und Deletionen: sehr aufwendig und nur anhand beschriebener Mutationen praktikabel! ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Dideoxy-Sequenzierung - Pyrosequencing • Dideoxy-Sequenzierung: große Leselänge Lesestart - abhängig vom Big dye Terminator Primerposition – sehr viele Möglichkeiten • Pyrosequencing: optimal ca.30 - max.100 Basen Lesestart - 1. Base nach dem Sequenzierprimer Primerposition - möglichst nahe an der Mutation ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Verteilung der Mutationen ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Verteilung der Mutationen ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Verteilung der Mutationen ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 EGFR Proben - kleine Biopsien ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 KRAS Mutationen: Codons 12, 13 und 61 KRAS Mutationen: Codons 12, 13 und 61 ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 KRAS - Mutationen Codon 12 G TAC G T TAC TGT Cys GTT Val AGT Ser GAT Asp CGT Arg GCT Ala 1. Base 2. Base ÖGP Frühjahrstagung Codon 13 - G T TGC Cys G C AC GAC Asp GCC Ala 1.Base 2.Base 17.03. – 19.03.2011 Erstellen eines KRAS Assays GGT GNT (N = A/ G/ T/ C) NGT ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Analyse von KRAS Mutationen Codon 12 – GGT Codon 13 – GGC WILDTYP ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Analyse von KRAS Mutationen Codon 12 – GGT > GAT Codon 13 – GGC GLY 12 ASP G 12 D ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Analyse von KRAS Mutationen Codon 12 – GGT > GCT Codon 13 – GGC GLY 12 Ala G 12 A ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Anwendung • Detektion und Quantifizierung genetischer Veränderungen in kurzen DNA Abschnitten • Geringe DNA Mengen (Biopsie) - 10ng DNA / Ansatz • Niedrige Tumorzellzahlen - bis 5% Tumorzellen • Sequenzierreaktion in +/- 30 Minuten für 24 Proben • Durch geschickte Dispensationorder – sämtliche Varianten abdecken • Auch eigene Tests mit Primerdesign-Software erstellen • Methylierungsanalysen • Bakterienidentifikation ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011 Vielen Dank! ÖGP Frühjahrstagung 17.03. – 19.03.2011
