Zusammenfassung englisch/deutsch - OvGU

M.Sc.Arreba-TutusausPatricia
ImpactofFLT3internaltandemduplications(FLT3-ITD)onfunctionalbiologyandsensitivitytotherapy
dependingontheirlocation!
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Abstract
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Treatment of patients harboring internal tandem duplications within the FLT3 gene (FLT3-ITD)
remainsaclinicalchallengeinacutemyeloidleukemia(AML)asthissubsetofleukemiashowshigh
incidence of relapse, even after allogeneic stem-cell transplantation. A long-term goal in AML
treatmentisthedesignofpersonalizedtherapiesrestrictedtodistinctrecurrentmutationsinorder
to eliminate residual pre-leukemic and leukemic clones. Inhibitors of the FLT3-mutated receptor,
known as tyrosine kinase inhibitors (TKIs), have proven activity in advanced clinical trials and an
improvementinprogressionfreesurvivalwhencombinedwithchemotherapy.Foralongtime,ITD
mutationshavebeenbelievedtoexclusivelyoccurwithinthejuxtamembranedomain(JMD)ofthe
FLT3 receptor. However, a molecular subset of FLT3-ITD mutations located in the tyrosine kinase
domain 1 (TKD1) has recently been defined in FLT3-ITD positive AML patients. In multivariable
analyses, location of ITD mutations within the beta1-sheet of FLT3 (TKD1-ITD) was identified as an
unfavorable prognostic factor for achievement of complete remission and overall survival,
independently of other prognostic factors such as allelic ratio. Furthermore, previous work in our
groupshowedthatTKD1-ITDmutationsconferredlesssensitivitytokinaseinhibitortherapyinvitro.
ThepurposeofthisdissertationwastocharacterizethebiologyandthesensitivitytoFLT3-targeted
therapyofadditionalFLT3-ITDmutationsdependingontheirlocationsite(JMDvs.TKD1)invitroand,
forthefirsttime,invivo.Transformingpotentialandactivationofdownstreamsignalingnodeswere
comparablebetweenpreviouslycharacterizedmutationsandnovelvariantsisolatedfromleukemia
samples in vitro. However, TKD1-ITD mutations revealed reduced penetrance as well as prolonged
onsetofleukemiadevelopmentwhencomparedtoJMD-ITDsinvivo.Furthermore,previousfindings
couldberecapitulatedsinceTKD1-ITDsshowedlesssensitivitytoTKItreatmentinvivo.Lastly,geneexpressiondatafromhumanandmurinecellsharboringFLT3-ITDmutationsprovideddifferentially
regulated gene-sets (JMD vs. TKD1), among which DNA damage and repair mechanisms were
selectedaspotentialmediatorsofdrugsensitivity.Here,DNAdamagewasquantifiedinmurinecells
suggesting increased DNA repair in TKD1-ITD mutants. Taken together, the present study provides
evidence that location of ITD mutations within the FLT3 receptor tyrosine kinase may determine
differentialoncogenicpotentialandsensitivitytotargetedtreatmentinpatients.
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Zusammenfassung
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DieakutemyeloischeLeukämieisthäufigmitdemAuftretenvonMutationenimFLT3Genassoziiert.
DiehäufigsteFormderFLT3-MutationisteineinterneTandemduplikation(ITD).DieBehandlungder
AML mit FLT3-LŠngenmutation (ITD) bleibt eine klinische Herausforderung, da diese Art von
Leukämie selbst nach allogener Stammzelltransplantation eine hohe Rückfallquote aufweist. FLT3Kinase-Inhibitoren besitzen nachgewiesene klinische Aktivität in klinischen Studien und können in
Kombination mit Chemotherapie das Überleben der Patienten verbessern. So werden die FLT3Kinase –Inhibitoren Midostaurin (PKC412) und Quizartinib (AC220) derzeit in fortgeschrittenen
klinischenStudieneingesetztundzeigeneinvielversprechendesklinischesAnsprechen.
LangeZeitwurdegeglaubt,dassITDMutationenausschließlichinderJuxtamembran-Domäne(JMD)
des FLT3-Rezeptors auftreten. Dadurch wird die autoinhibitorische Funktion der Domäne zerstört,
waszueinemkonstitutivaktivenFLT3-RezeptorunddernachgeschaltetenSignalwegeführt.Kürzlich
konntenwirnachweisen,dasseinsignifikanterAnteil(30%)derFLT3-ITDMutationeninderTyrosin-
Kinase-Domäne 1 (TKD1) lokalisiert ist. In einer multivariablen Analyse wurde die Lage der ITDMutationim„beta1-Sheet“derTKD1alsnegativerprognostischerFaktorbeschrieben.DieserEinfluss
war unabhängig von anderen unvorteilhaften prognostischen Faktoren wie z.B. der Allel-Last. In
VordatenausunsererAbteilunghattensichHinweiseergeben,dassdieLokalisationvonFLT3-ITDsin
der TKD1 mit einer geringeren Tyrosin-Kinase Inhibitor Sensitivität der betroffen Zellen
vergesellschaftetseinkšnnte.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FLT3-ITD Mutationen (JMD vs. TKD1) in vitro
untersuchtundzumerstenMalfunktionellinvivocharakterisiert.DasTransformationspotentialund
dieAktivierungnachgelagerterSignalknoten,wiez.B.Stat5undErk1/2,warenvergleichbarzwischen
den verschiedenen FLT3-ITD Varianten unabhŠngig von der Lage der FLT3-LŠngenmutation. Im
Gegensatz zu JMD-ITDs zeigten TKD1-ITD Mutationen in vivo sowohl eine geringere Penetranz der
Erkrankung als auch eine verzšgerte Leukämieentwicklung. Andererseits konnte die im
Zellkulturmodell gezeigte geringere SensitivitŠt der TKD1-ITDs gegenŸber Kinase-Inhibitor
Behandlung auch in vivo rekapituliert werden. Mit Hilfe von Gen-Expressionsanalysen konnten
zwischenJMD-ITDundTKD1-ITDMutationendifferentiellregulierte‚Gene-Sets’identifiziertwerden.
Hier zeigten sich vor allem DNA-Reparatur-assoziierte Gene dereguliert. Dieser Befund aus den
Genexpressionsanalysen konnte in murinen Zelllinien nach Bestrahlung ebenfalls nachgewiesen
werden.NachInduktionvonDNA-BruchzeigtenTKD1-ITDMutantenwenigerDoppelstrangbrücheim
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Vergleich zu JMD-ITD Mutationen, was auf ein vermehrtes Level an DNA-Reparaturmechanismen
hinweisenkönnte.
Zusammenfassend kšnnen unsere Untersuchungen erstmals funktionell belegen, dass die Lage der
ITD Mutationen innerhalb der FLT3-Kinase das biologische Verhalten der betroffenen Zellen und
derenSensitivitŠtgegenŸberKinase-InhibitorTherapiebeeinflusst.
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