Zusammenfassung englisch/deutsch - OvGU
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M.Sc.Arreba-TutusausPatricia ImpactofFLT3internaltandemduplications(FLT3-ITD)onfunctionalbiologyandsensitivitytotherapy dependingontheirlocation! ! Abstract ! Treatment of patients harboring internal tandem duplications within the FLT3 gene (FLT3-ITD) remainsaclinicalchallengeinacutemyeloidleukemia(AML)asthissubsetofleukemiashowshigh incidence of relapse, even after allogeneic stem-cell transplantation. A long-term goal in AML treatmentisthedesignofpersonalizedtherapiesrestrictedtodistinctrecurrentmutationsinorder to eliminate residual pre-leukemic and leukemic clones. Inhibitors of the FLT3-mutated receptor, known as tyrosine kinase inhibitors (TKIs), have proven activity in advanced clinical trials and an improvementinprogressionfreesurvivalwhencombinedwithchemotherapy.Foralongtime,ITD mutationshavebeenbelievedtoexclusivelyoccurwithinthejuxtamembranedomain(JMD)ofthe FLT3 receptor. However, a molecular subset of FLT3-ITD mutations located in the tyrosine kinase domain 1 (TKD1) has recently been defined in FLT3-ITD positive AML patients. In multivariable analyses, location of ITD mutations within the beta1-sheet of FLT3 (TKD1-ITD) was identified as an unfavorable prognostic factor for achievement of complete remission and overall survival, independently of other prognostic factors such as allelic ratio. Furthermore, previous work in our groupshowedthatTKD1-ITDmutationsconferredlesssensitivitytokinaseinhibitortherapyinvitro. ThepurposeofthisdissertationwastocharacterizethebiologyandthesensitivitytoFLT3-targeted therapyofadditionalFLT3-ITDmutationsdependingontheirlocationsite(JMDvs.TKD1)invitroand, forthefirsttime,invivo.Transformingpotentialandactivationofdownstreamsignalingnodeswere comparablebetweenpreviouslycharacterizedmutationsandnovelvariantsisolatedfromleukemia samples in vitro. However, TKD1-ITD mutations revealed reduced penetrance as well as prolonged onsetofleukemiadevelopmentwhencomparedtoJMD-ITDsinvivo.Furthermore,previousfindings couldberecapitulatedsinceTKD1-ITDsshowedlesssensitivitytoTKItreatmentinvivo.Lastly,geneexpressiondatafromhumanandmurinecellsharboringFLT3-ITDmutationsprovideddifferentially regulated gene-sets (JMD vs. TKD1), among which DNA damage and repair mechanisms were selectedaspotentialmediatorsofdrugsensitivity.Here,DNAdamagewasquantifiedinmurinecells suggesting increased DNA repair in TKD1-ITD mutants. Taken together, the present study provides evidence that location of ITD mutations within the FLT3 receptor tyrosine kinase may determine differentialoncogenicpotentialandsensitivitytotargetedtreatmentinpatients. ! ! M.Sc.Arreba-TutusausPatricia ImpactofFLT3internaltandemduplications(FLT3-ITD)onfunctionalbiologyandsensitivitytotherapy dependingontheirlocation! ! Zusammenfassung ! DieakutemyeloischeLeukämieisthäufigmitdemAuftretenvonMutationenimFLT3Genassoziiert. DiehäufigsteFormderFLT3-MutationisteineinterneTandemduplikation(ITD).DieBehandlungder AML mit FLT3-LŠngenmutation (ITD) bleibt eine klinische Herausforderung, da diese Art von Leukämie selbst nach allogener Stammzelltransplantation eine hohe Rückfallquote aufweist. FLT3Kinase-Inhibitoren besitzen nachgewiesene klinische Aktivität in klinischen Studien und können in Kombination mit Chemotherapie das Überleben der Patienten verbessern. So werden die FLT3Kinase –Inhibitoren Midostaurin (PKC412) und Quizartinib (AC220) derzeit in fortgeschrittenen klinischenStudieneingesetztundzeigeneinvielversprechendesklinischesAnsprechen. LangeZeitwurdegeglaubt,dassITDMutationenausschließlichinderJuxtamembran-Domäne(JMD) des FLT3-Rezeptors auftreten. Dadurch wird die autoinhibitorische Funktion der Domäne zerstört, waszueinemkonstitutivaktivenFLT3-RezeptorunddernachgeschaltetenSignalwegeführt.Kürzlich konntenwirnachweisen,dasseinsignifikanterAnteil(30%)derFLT3-ITDMutationeninderTyrosin- Kinase-Domäne 1 (TKD1) lokalisiert ist. In einer multivariablen Analyse wurde die Lage der ITDMutationim„beta1-Sheet“derTKD1alsnegativerprognostischerFaktorbeschrieben.DieserEinfluss war unabhängig von anderen unvorteilhaften prognostischen Faktoren wie z.B. der Allel-Last. In VordatenausunsererAbteilunghattensichHinweiseergeben,dassdieLokalisationvonFLT3-ITDsin der TKD1 mit einer geringeren Tyrosin-Kinase Inhibitor Sensitivität der betroffen Zellen vergesellschaftetseinkšnnte. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FLT3-ITD Mutationen (JMD vs. TKD1) in vitro untersuchtundzumerstenMalfunktionellinvivocharakterisiert.DasTransformationspotentialund dieAktivierungnachgelagerterSignalknoten,wiez.B.Stat5undErk1/2,warenvergleichbarzwischen den verschiedenen FLT3-ITD Varianten unabhŠngig von der Lage der FLT3-LŠngenmutation. Im Gegensatz zu JMD-ITDs zeigten TKD1-ITD Mutationen in vivo sowohl eine geringere Penetranz der Erkrankung als auch eine verzšgerte Leukämieentwicklung. Andererseits konnte die im Zellkulturmodell gezeigte geringere SensitivitŠt der TKD1-ITDs gegenŸber Kinase-Inhibitor Behandlung auch in vivo rekapituliert werden. Mit Hilfe von Gen-Expressionsanalysen konnten zwischenJMD-ITDundTKD1-ITDMutationendifferentiellregulierte‚Gene-Sets’identifiziertwerden. Hier zeigten sich vor allem DNA-Reparatur-assoziierte Gene dereguliert. Dieser Befund aus den Genexpressionsanalysen konnte in murinen Zelllinien nach Bestrahlung ebenfalls nachgewiesen werden.NachInduktionvonDNA-BruchzeigtenTKD1-ITDMutantenwenigerDoppelstrangbrücheim 1 M.Sc.Arreba-TutusausPatricia ImpactofFLT3internaltandemduplications(FLT3-ITD)onfunctionalbiologyandsensitivitytotherapy dependingontheirlocation! ! Vergleich zu JMD-ITD Mutationen, was auf ein vermehrtes Level an DNA-Reparaturmechanismen hinweisenkönnte. Zusammenfassend kšnnen unsere Untersuchungen erstmals funktionell belegen, dass die Lage der ITD Mutationen innerhalb der FLT3-Kinase das biologische Verhalten der betroffenen Zellen und derenSensitivitŠtgegenŸberKinase-InhibitorTherapiebeeinflusst. ! 2
